特開 2024-8240 末梢血単球の賦活化用組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024008240

(43)【公開日】2024-01-19

(54)【発明の名称】末梢血単球の賦活化用組成物

(51)【国際特許分類】

   A23L 33/135 20160101AFI20240112BHJP

   A61K 35/744 20150101ALI20240112BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20240112BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240112BHJP

   A23L 2/52 20060101ALI20240112BHJP

【ＦＩ】

A23L33/135

A61K35/744

A61P37/04

A61P43/00 107

A23L2/52

A23L2/00 F

【審査請求】未請求

【請求項の数】5

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022109945

(22)【出願日】2022-07-07

(71)【出願人】

【識別番号】000006884

【氏名又は名称】株式会社ヤクルト本社

(74)【代理人】

【識別番号】110000800

【氏名又は名称】デロイトトーマツ弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】内藤 智昭

(72)【発明者】

【氏名】堀 徹治

(72)【発明者】

【氏名】岩田 明

(72)【発明者】

【氏名】山本 真悠子

(72)【発明者】

【氏名】森川 真年

【テーマコード（参考）】

4B018

4B117

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B018MD86

4B018ME14

4B117LC04

4B117LK21

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC56

4C087CA09

4C087MA22

4C087MA52

4C087NA14

4C087ZB09

4C087ZB22

(57)【要約】

【課題】乳酸菌を利用して、末梢血単球の賦活化用組成物を提供する。
【解決手段】ラクチカゼイバチルス・パラカゼイに属する乳酸菌の生菌を有効成分として含有する末梢血単球の賦活化用組成物である。この組成物は、飲食品、医薬品、サプメント等、日常的に一般消費者の判断で摂取する形態としても利用しやすい。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ラクチカゼイバチルス・パラカゼイに属する乳酸菌の生菌を有効成分として含有する末梢血単球の賦活化用組成物。

【請求項2】

前記乳酸菌はラクチカゼイバチルス・パラカゼイ ＹＩＴ ９０２９（ＦＥＲＭ ＢＰ－１３６６）である、請求項１記載の末梢血単球の賦活化用組成物。

【請求項3】

前記乳酸菌が１日当たりに生菌数として２×１０^１０ｃｅｌｌｓ以上投与されるように用いられるものである、請求項１又は２記載の末梢血単球の賦活化用組成物。

【請求項4】

飲食品、医薬品、又はサプリメントの形態である、請求項１又は２記載の末梢血単球の賦活化用組成物。

【請求項5】

ラクチカゼイバチルス・パラカゼイに属する乳酸菌の生菌の、末梢血単球の賦活化用組成物の製造のための使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、乳酸菌を利用した末梢血単球の賦活化用組成物に関する。

【背景技術】

【0002】

単球は、末梢血中の白血球の一種であり、感染に対する防御の開始に重要な細胞である。例えば、細菌などの異物を貪食して、異物の一部を細胞表面に提示し、これがＴ細胞に認識されて感染に対する防御が開始される。また、腫瘍性疾患、感染症により減少することが知られており、感染症の症状の重症化にも関連すると考えられている。更に、肝障害や熱傷患者の予後不良に影響を与えるともいわれており、また、末梢血単球の賦活化と細菌性敗血症時の生存率が関連していることも知られている。近年では、単球を構成する細胞サブタイプの表現型や機能についての研究も盛んである（非特許文献１，２参照）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0003】

【非特許文献1】Pavithra Sampath, Kadar Moideen, Uma Devi Ranganathan, and Ramalingam Bethunaickan「Monocyte Subsets: Phenotypes and Function in Tuberculosis Infection」Front Immunol. 2018 Jul 30; 9: 1726. doi: 10.3389/fimmu.2018.01726. eCollection 2018.

【非特許文献2】Lisa B. Boyette, Camila Macedo, Kevin Hadi, Beth D. Elinoff, John T. Walters, Bala Ramaswami, Geetha Chalasani, Juan M. Taboas, Fadi G. Lakkis, and Diana M. Metes「Phenotype, function, and differentiation potential of human monocyte subsets」PLoS One. 2017 Apr 26; 12(4):e0176460. doi: 10.1371/journal.pone.0176460. eCollection 2017.

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

従来、乳酸菌による末梢血中の単球に向けた機能性発現については、明らかではなかった。

【0005】

本発明の目的は、乳酸菌を利用して、末梢血中の単球に向けた機能性組成物を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明者らは、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイに属する乳酸菌が、末梢血中の単球を有効に賦活化させ得ることを見出し、本発明を完成するに至った。

【0007】

すなわち、本発明は、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイに属する乳酸菌の生菌を有効成分として含有する末梢血単球の賦活化用組成物を提供するものである。

【0008】

上記組成物においては、前記乳酸菌はラクチカゼイバチルス・パラカゼイ ＹＩＴ ９０２９（ＦＥＲＭ ＢＰ－１３６６）であることが好ましい。

【0009】

上記組成物においては、前記乳酸菌が１日当たりに生菌数として２×１０^１０ｃｅｌｌｓ以上投与されるように用いられるものであることが好ましい。

【0010】

上記組成物においては、飲食品、医薬品、又はサプリメントの形態であることが好ましい。

【0011】

一方、別の観点からは、本発明は、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイに属する乳酸菌の生菌の、末梢血単球の賦活化用組成物の製造のための使用を提供するものである。

【発明の効果】

【0012】

本発明によれば、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイに属する乳酸菌の生菌を有効成分として含有する末梢血単球の賦活化用組成物が提供される。この組成物は、飲食品、医薬品、サプメント等、日常的に一般消費者の判断で摂取する形態としても利用しやすい。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】ヒト試験の概要を示す図表である。

【図2】ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に含まれる単球（Ｍｏ）と樹状細胞（ｃＤＣ）ならびにそれらの細胞サブセット（樹状細胞についてはｐＤＣ、ｃＤＣ１、ｃＤＣ２、単球についてはｃＭｏ、ｉＭｏ、ｎｃＭｏ）の構成を示す説明図である。

【図3】フローサイトメトリー解析においてヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に含まれる細胞サブセットを検出するためのゲーティング戦略を示す説明図である。

【図4】乳酸菌（ＬｃＳ菌）を摂取した試験群と摂取しない対照群との間で、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に含まれる単球の細胞サブセット（ｃＭｏ、ｉＭｏ、ｎｃＭｏ）がＰＢＭＣ生細胞に占める割合、及びその占有率をサンプルとしたＰＢＭＣ細胞数に乗じて算出される細胞数について比較した結果を示す図表である。

【図5】乳酸菌（ＬｃＳ菌）を摂取した試験群と摂取しない対照群との間で、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に含まれる単球（Ｍｏ）と樹状細胞（ｃＤＣ）ならびにそれらの細胞サブセット（単球ＭｏについてはｃＭｏ、樹状細胞についてはｃＤＣ２）におけるＣＤ４０の発現強度を比較した結果を示す図表である。

【発明を実施するための形態】

【0014】

本発明にかかる組成物は、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）に属する乳酸菌の生菌を含有するものである。乳酸菌としては、特に限定されないが、例えばラクチカゼイバチルス・パラカゼイ ＹＩＴ ９０２９ （旧分類：ラクトバチルス・カゼイ ＹＩＴ ９０２９）（ＦＥＲＭ ＢＰ－１３６６）が好ましい。乳酸菌は１種類を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。なお、下記に示す２０２０年４月発行学術誌にもあるとおり、従来ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属していた乳酸菌について、その菌属が細分化され、ならびに菌種の一部において属名が変更されることになった。

【0015】

（乳酸菌の再分類について）
・Zheng et al.,「A taxonomic note on the genus Lactobacillus : Description of 23 novel genera, emended description of the genus Lactobacillus Beijerinck 1901, and union of Lactobacillaceae and Leuconostocaceae.」Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2020 Apr; 70(4):2782-2858 DOI 10.1099/ijsem.0.004107

【0016】

本明細書では再分類以降の新分類の表記で示すものとする。また、旧分類においてラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）又はラクトバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）に分類されていた乳酸菌のなかで、新たにラクチカゼイバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）として分類され得るものは、本願のラクチカゼイバチルス・パラカゼイ（Ｌａｃｔｉｃａｓｅｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｐａｒａｃａｓｅｉ）に含まれるものとする。

【0017】

上記乳酸菌は、冷蔵や冷凍で保存管理している凍結乾燥物、凍結状態、冷蔵状態などの菌体含有物や、購入した菌体含有製剤などから、一般的な乳酸菌の培養手段により乳酸菌を増殖させて、所望の菌数となるように適宜調製することが可能である。乳酸菌の培養のための培地としては、限定されないが、ＭＲＳ培地、ＬＢＳ培地、ＢＣＰ培地、ＩＬＳ培地、変法ＩＬＳ培地、ＧＡＭ培地などを例示することができる。そのような栄養培地を含む平型寒天培地上に菌体の少量を塗布して２５～３７℃の温度環境下において１～３日間静置培養したり、あるいは液体培地中に菌体の少量を添加して、懸濁後、２５～３７℃の温度環境下において１～３日間静置培養したりするなどにより、上記乳酸菌を所望の菌数になるまで増殖させることができる。培養形態としては、静置培養以外にも、撹拌培養、振盪培養、中和培養などが挙げられる。培養後には、遠心分離等により集菌して培養液を除いたり、これに水等を添加して懸濁したうえ再度遠心分離等かけて洗浄したりして、その菌体を、本発明にかかる組成物中に含有せしめるようにすればよい。あるいは培養に使用した培養液を含む形態で、本発明にかかる組成物中に含有せしめてもよい。

【0018】

ただし、上記乳酸菌は生菌の形態で使用する。ここで「生菌」とは、ＭＲＳ培地等の適当な栄養培地を含む寒天培地上に、菌体の希釈懸濁液を撒いたときに、至適温度である、例えば、２５℃～３７℃の温度環境下において、その乳酸菌のコロニーが形成することをいう。そのコロニーの形成数に希釈倍率を乗じて元の菌体懸濁液中に含まれる乳酸菌の生菌数を求めることができる。生菌数の測定には、上記方法に限られず、光岡の方法（光岡知足著「腸内菌の世界」、叢文社、東京、ｐ５３－６５）等、その他常法的に行われている測定方法を利用してもよい。また、後述する実施例においては、試料に予め生菌のＤＮＡにアクセスできないプロピジウムモノアジド（ＰＭＡ）で処理して定量的ＰＣＲを行う方法により、糞便中の特定の乳酸菌の生菌数を測定したが、生菌数の測定にはそのようなＰＭＡ-ｑＰＣＲ法を利用してもよい。

【0019】

本発明にかかる組成物中の上記乳酸菌の含有量は、特に制限はない。例えば、乳酸菌の生菌数にして、本発明にかかる組成物の乾燥物の状態における総質量の１ｇ中に２×１０^１０ｃｅｌｌｓ以上であってよく、２×１０^１０ｃｅｌｌｓ以上３×１０^１1ｃｅｌｌｓ以下であってよく、５×１０^１０ｃｅｌｌｓ以上３×１０^１1ｃｅｌｌｓ以下であってよく、１×１０^１1ｃｅｌｌｓ以上３×１０^１1ｃｅｌｌｓ以下であってよい。これによれば一日当たりに望まれる摂取量を摂取しやすい。また、一般に乳酸菌を含有する製剤の剤形としては、液状製剤、ゲル状製剤、凍結乾燥製剤等の形態が知られており、そのような乳酸菌を含有する製剤自体が、本発明にかかる上記乳酸菌を含有する組成物を構成してもよい。

【0020】

また、上記乳酸菌は、各種の食品素材や製剤素材等ととともに、適宜、飲食品、医薬品、サプリメント等の形態に調製し、これを本発明にかかる組成物となしてもよい。そのような形態への調製は、飲食品の製造上の公知の手段、ないしは医薬品又はサプリメントの製剤上の公知の手段などによって、行うことができる。

【0021】

飲食品としては、限定されないが、例えば、ハム、ソーセージ等の食肉加工食品、かまぼこ、ちくわ等の水産加工食品、パン、菓子、バター、粉乳、水、果汁、牛乳、清涼飲料、茶飲料等の飲料などが挙げられる。

【0022】

飲食品としては、更に、上記乳酸菌を含有する、発酵乳飲料、発酵豆乳飲料、発酵果汁飲料、発酵野菜汁飲料等の発酵飲食品などが挙げられる。特には、発酵乳飲料が好ましく例示され得る。上記発酵飲食品の製造は常法に従えばよいが、例えば、上記発酵乳飲食品を製造する場合には、殺菌した乳培地に上記乳酸菌を単独又は他の微生物と同時に接種培養し、これを均質化処理して発酵乳ベースを得る。次に別途調製したシロップ溶液を添加混合し、ホモゲナイザー等で均質化し、更にフレーバーを添加して最終製品に仕上げればよい。このようにして得られる発酵乳飲食品は、シロップ（甘味料）を含有しないプレーンタイプ、ソフトタイプ、フルーツフレーバータイプ、固形状、液状等のいずれの形態の製品とすることもできる。

【0023】

上記発酵乳飲料等の発酵飲食品には、例えば、シロップ等の甘味料、乳化剤、増粘（安定）剤、各種ビタミン等を任意に配合することができる。甘味料としては、例えば、グルコース、ショ糖、フルクトース、果糖ブドウ糖液糖、ブドウ糖果糖液糖、パラチノース、トレハロース、ラクトース、キシロース、麦芽糖、蜂蜜、糖蜜等の糖類、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、ラクチトール、パラチニット、還元水飴、還元麦芽糖水飴等の糖アルコール、アスパルテーム、ソーマチン、スクラロース、アセスルファムＫ、ステビア等の高甘味度甘味料などが挙げられる。また、乳化剤としては、例えば、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリグリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、レシチンなどが挙げられる。また、増粘（安定）剤としては、寒天、ゼラチン、カラギーナン、グァーガム、キサンタンガム、ペクチン、ローカストビーンガム、ジェランガム、カルボキシメチルセルロース、大豆多糖類、アルギン酸プロピレングリコールなどが挙げられる。この他にも、ビタミンＡ、ビタミンＢ類、ビタミンＣ、ビタミンＥ類等のビタミン類、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、鉄、マンガン等のミネラル分、クエン酸、乳酸、酢酸、リンゴ酸、酒石酸、グルコン酸等の酸味料、クリーム、バター、サワークリーム等の乳脂肪、ヨーグルト系、ベリー系、オレンジ系、花梨系、シソ系、シトラス系、アップル系、ミント系、グレープ系、アプリコット系、ペア系、カスタードクリーム系、ピーチ系、メロン系、バナナ系、トロピカル系、ハーブ系、紅茶系、コーヒー系等のフレーバー類、ハーブエキス、黒糖エキスなどを配合してもよい。

【0024】

また、入手可能な飲食品の市販品を本発明にかかる組成物として利用することに、特に制限はない。例えば、株式会社ヤクルト本社が製造し、上記乳酸菌を含有する飲料製品として、「Ｙａｋｕｌｔ（ヤクルト）１０００」、「Ｙ１０００」、「ヤクルト４００」等のヤクルト類などが市販されているので、それらを好適に利用することができる。特には、生きた乳酸菌を多く含有するヤクルト類を利用することがより好ましい。

【0025】

医薬品やサプリメントとして、その製剤の剤形としては、限定されないが、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の固形剤、溶液剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、凍結乾燥製剤等が挙げられる。この場合、必要に応じて、製剤担体として、例えば、グルコース、乳糖、ショ糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水などを適宜添加することができる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤、賦形剤等の慣用の添加剤を、適宜添加することができる。

【0026】

本発明にかかる組成物として、入手可能な医薬品やサプリメントの市販品を利用することに、特に制限はない。例えば、株式会社ヤクルト本社が製造し、上記乳酸菌を含有する製品として、「ヤクルトＢＬ整腸薬」などが市販されているので、それらを好適に利用することができる。

【0027】

本発明にかかる組成物は、有効成分としてラクチカゼイバチルス・パラカゼイに属する乳酸菌の生菌を含有するので、後述する実施例で示されるように、末梢血中の単球や樹状細胞のＣＤ４０の発現を増強する効果に優れている。よって、例えば、末梢血中の単球を賦活化したい対象者に、その末梢血単球の賦活化の目的で用いられ得る。

【0028】

また、既往研究によると、末梢血単球のＣＤ４０の発現強化は、細菌性敗血症時の生存率の上昇に寄与すると考えられる（Kenji Sugimoto, Cecile Galle, Jean-Charles Preiser, Jacques Creteur, Jean-Louis Vincent, Olivier Pradier「Monocyte CD40 expression in severe sepsis」Shock. 2003 Jan;19(1):24-7.）。また、ヒト末梢血単球はインビトロで活性化Ｔ細胞の自発的細胞死を抑制し、これにＣＤ４０が関与していることが報告されている。活性化Ｔ細胞のアポトーシスの抑制は、感染症などにおいて起こるネクローシス／ネクロトーシスの抑制につながる。そのため、末梢血単球のＣＤ４０の発現強化は傷害関連分子の漏出やサイトカインストーム発生の抑止につながると考えられている（K Sakata , A Sakata, L Kong, N Vela-Roch, N Talal, H Dang「Monocyte rescue of human T cells from apoptosis is CD40/CD154 dependent」Scand J Immunol. 1999 Nov;50(5):479-84.）。また、ＣＤ４０の発現強化は単球から樹状細胞への分化・成熟を促すものと考えられている（Michelle Rosenzwajg, Frederic Jourquin, Ludovic Tailleux, Jean Claude Gluckman「CD40 ligation and phagocytosis differently affect the differentiation of monocytes into dendritic cells」J Leukoc Biol. 2002 Dec;72(6):1180-9.）。よって、ある実施態様では、本発明にかかる組成物は、末梢血単球のＣＤ４０の発現を増強する作用効果に基づいた、特定の症状の改善や予防の目的で用いられ得る。あるいは、例えば、特定の状況の前後に一定期間投与することで、症状の発症を抑えたたり、症状を改善したりする目的で用いられ得る。また、一般に健常者に分類される対象者にも適用され得る。健常者に適用することで、末梢血単球の活性の低下や劣化に起因して生じる症状の発症リスクを低減することができる。

【0029】

本発明にかかる組成物の投与形態は、対象者が生きた乳酸菌を体内に摂取するようにすればよく、特に制限はないが、摂取した乳酸菌が腸に生きたまま到達するようにすることが好ましい。よって、例えば経口的摂取であることが好ましい。摂取量は、特に制限はない。上記乳酸菌が、１日当たりに菌数として２×１０^１０ｃｅｌｌｓ以上投与されるように用いられればよい。摂取量は、１日当たりに菌数として２×１０^１０ｃｅｌｌｓ以上３×１０^１1ｃｅｌｌｓ以下であってよく、５×１０^１０ｃｅｌｌｓ以上３×１０^１1ｃｅｌｌｓ以下であってよく、１×１０^１1ｃｅｌｌｓ以上３×１０^１1ｃｅｌｌｓ以下であってよい。また、上記乳酸菌においては、その食経験から長期摂取しても安全であることが認められることから、例えば、１週間、２週間、３週間、１ヵ月間、２ヵ月間、３ヵ月間、４ヵ月間、５ヵ月間、６ヵ月間、７ヵ月間、８ヵ月間、９ヵ月間、１０ヵ月間、１１カ月間、１年間、２年間、３年間、４年間、５年間などの期間にわたり投与されるように用いられてもよい。

【実施例0030】

以下実施例を挙げて本発明について更に具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。なお、以下では、ラクチカゼイバチルス・パラカゼイ ＹＩＴ ９０２９（ＦＥＲＭ ＢＰ－１３６６）のことを「ＬｃＳ菌」と称する。

【0031】

〔１．被験飲料〕
試験飲料としては、ＬｃＳ菌を生菌で含む乳酸菌飲料製品（「Ｙａｋｕｌｔ（ヤクルト）１０００」、株式会社ヤクルト本社）を用いた。対照飲料としては、ＬｃＳ菌を含まない以外は試験飲料と同じ原料からなる未発酵乳飲料を用いた。表１には、被験飲料の組成を示す。

【0032】

【表1】

【0033】

〔２．ヒト試験〕
図１に示す試験スケジュールによりランダム化比較試験を実施した。具体的には、募集に応じた３０～４０代の健常オフィスワーカー１２名（男性、平均年齢：４３．３±４．８）について、ＢＭＩ、血液指標、１週間の在宅日数、１日あたりの睡眠時間が均等になるように２群に分け、一方の群には試験飲料を、他方の群には対照飲料を、それぞれ１日１本４週間にわたって飲用してもらった。飲用前、飲用３日目、１０日目、及び２８日目に、医師の問診のもとに被検者の健康状態を確認してから各１８ｍＬの採血を行った。

【0034】

〔３．血液処理〕
冷蔵輸送された血液を室温に戻した後、１７ｍＬに等量の生理食塩水と混合した。得られた血液希釈液のうち半量１７ｍＬを単核球単離のための密度勾配培地「Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ」（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）１５ｍＬ上に重層した（５０ｍＬの遠心管２本／１サンプル）。室温下に８００×ｇ、緩減速の条件で３０分間遠心分離後、中間層を末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）として回収した。回収した細胞に２％ＦＢＳ／ＰＢＳを添加して、４℃、４６０×ｇで１０分間遠心分離し、上清を除去した。ＰＢＭＣの沈渣をＤ－ＰＢＳに再懸濁して細胞数をカウント後、細胞懸濁液を遠心分離して上清を除去し、２％ＦＢＳ／ＰＢＳで２×１０^７ｃｅｌｌｓ／ｍＬとした。

【0035】

〔４．フローサイトメトリー用サンプル処理〕
血液処理で得られたＰＢＭＣのうち、１．１×１０^７ｃｅｌｌｓのＰＢＭＣをＤ－ＰＢＳで洗浄後、Ｄ－ＰＢＳで１００倍希釈した生死判定試薬「Ｚｏｍｂｉｅ－Ａｑｕａ」（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）２７５ μＬに懸濁し、氷上で１５分間静置した。更に、Ｄ－ＰＢＳで1０倍希釈したＦＣブロック試薬「ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ」（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）２７５μＬを添加し、攪拌後氷上で１５分間静置した。反応後、細胞懸濁液を５０μＬ（約１×１０^６ｃｅｌｌｓ）ずつ９６ウエルＶボトムプレートに分注し、別途、各抗体の組み合わせ及び希釈倍率で調製した抗体希釈液を、それぞれのウエルに同量ずつ加え、混合した。プレートの蓋をして氷上で３０分間静置後、２％ＦＢＳ／ＰＢＳを各ウエルに２５０μＬずつ加えた。その後、４℃、４６０×ｇで５分間遠心分離し、上清を除去した。細胞を固定するため、ＦｌｕｏｒｏＦｉｘ Ｂｕｆｆｅｒを各ウエルに２００μＬずつ加えて細胞を懸濁し、室温で遮光し３０分間反応させた。遠心洗浄後、２％ＦＢＳ／ＰＢＳを各ウエルに２００μＬずつ加え、４℃で保存した。

【0036】

〔５．フローサイトメトリー解析〕
サンプル処理の翌日、抗体染色した細胞懸濁液をよくピペッティングして、フローサイトメーター「ＣｙｔｏＦｌｅｘＳ」（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ社）に供した。ここでゲーティング戦略としては、図２に示すとおり、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）には単球（Ｍо）と樹状細胞（ｃＤＣ）が含まれており、更にそれらのサブセットとして、樹状細胞についてはｐＤＣ、ｃＤＣ１、ｃＤＣ２、単球についてはｃＭｏ、ｉＭｏ、ｎｃＭｏが存在するため、次のとおりとした。すなわち、図３に示すとおり、死細胞を除外した後（生細胞ゲート）、解析対象外であるＴ細胞（ＣＤ３）、Ｂ細胞（ＣＤ１９及びＣＤ２０）、ＮＫ細胞（ＣＤ５６）ならびに顆粒球（ＣＤ６６ｂ）の全マーカー（Ｌｉｎｅａｇｅ）陰性かつヒト主要組織適合遺伝子複合体（ＨＬＡ－ＤＲ）陽性の細胞集団にゲートを設定した。次いで、単球サブセットを分離するため、ＣＤ１６及びＣＤ１４で展開し、単球をｃＭｏ（ＣＤ１４^＋ＣＤ１６^－）、ｉＭｏ（ＣＤ１４^＋ＣＤ１６^＋）、及びｎｃＭｏ（ＣＤ１４^ｌｏＣＤ１６^＋）の３サブセットに分離した。また、樹状細胞サブセットを分離するため、ＣＤ１４^－ＣＤ１６^－の細胞集団にゲートを設定し、Ｌｉｎｅａｇｅ及びＨＬＡ－ＤＲで再度展開してＬｉｎｅａｇｅ陰性かつＨＬＡ－ＤＲ陽性の細胞集団を厳密に分離した。当該細胞集団をＣＤ１１ｃ及びＣＤ３０３で展開し、ｐＤＣ（ＣＤ１１ｃ^－ＣＤ３０３^＋）を分離した。一方、ＣＤ１１ｃ^＋ＣＤ３０３^－細胞集団はＣＤ１４１及びＣＤ１ｃで展開し、ｃＤＣ１（ＣＤ１４１^＋ＣＤ１ｃ^－）とｃＤＣ２（ＣＤ１４１^－ＣＤ１ｃ^＋）に分離した。データはＬｉｎｅａｇｅ陰性かつＨＬＡ－ＤＲ陽性の細胞集団のゲートが３０，０００イベントに達するか又は取得時間が１８０秒に達するまで集積した。取得したデータは、ソフトウエア「ＦｌｏｗＪｏ」（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用して解析し、活性化マーカー及びアイソタイプコントロールのシグナル強度の平均値（ＭＦＩ：Ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）の比を、サブセット毎に算出した。

【0037】

〔６．統計解析〕
各測定値について飲用前をベースラインとして変化量を算出し、基本統計量（平均値、標準偏差）を求めた。その変化量の群間差についてマンホイットニーのＵ検定を用いて有意差を求め、ｐ＜０．０５を有意とした。

【0038】

〔７．結果〕
（１）図４に示されるとおり、ＬｃＳ菌の生菌を含有する試験飲料を飲用した試験群は、その試験飲料の飲用によって、単球を構成する細胞サブセットのうちｉＭｏやｎｃＭｏのＰＢＭＣ生細胞に占める割合が対照群に比べて有意に増加した。
（２）図５に示されるとおり、ＬｃＳ菌の生菌を含有する試験飲料を飲用した試験群は、その試験飲料の飲用によって、単球（ＭоとｃＭｏ）及び樹状細胞（ｃＤＣとｃＤＣ２）でのＣＤ４０の発現強度が対照群に比べて有意に高かった。

【0039】

以上の結果によると、末梢血単球が、ＬｃＳ菌の生菌の摂取による機能性発現のための標的細胞のひとつであると考えられた。また、末梢血単球に発現しているＣＤ４０が、その作用機序における標的分子であることが示唆された。さらに、ＬｃＳ菌の生菌の摂取により、末梢血単球に発現しているＣＤ４０だけでなく樹状細胞に発現しているＣＤ４０の発現強度も増強することが確認された。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】