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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024082527
(43)【公開日】2024-06-20
(54)【発明の名称】心不全の治療及び／又は予防用医薬組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20240613BHJP
A61P 9/04 20060101ALI20240613BHJP
A61K 31/4704 20060101ALI20240613BHJP
A61K 31/444 20060101ALI20240613BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240613BHJP
A61K 31/7105 20060101ALI20240613BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20240613BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20240613BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20240613BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00
A61P9/04
A61K31/4704
A61K31/444
A61K39/395 D
A61K31/7105
A61K31/713
C12N15/113 Z ZNA
C07K16/18
【審査請求】未請求
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022196440
(22)【出願日】2022-12-08
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り （その１） ウェブサイトの掲載日 ２０２２年９月９日 ウェブサイトのアドレス ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃ－ｌｉｎｋａｇｅ．ｃｏ．ｊｐ／ｊｏｃｓ２０２２／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃ－ｌｉｎｋａｇｅ．ｃｏ．ｊｐ／ｊｏｃｓ２０２２／ｐｒｏｇｒａｍ．ｈｔｍｌ （その２） ウェブサイトの掲載日 ２０２２年９月１３日 ウェブサイトのアドレス ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃ－ｌｉｎｋａｇｅ．ｃｏ．ｊｐ／ｊｏｃｓ２０２２／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃ－ｌｉｎｋａｇｅ．ｃｏ．ｊｐ／ｊｏｃｓ２０２２／ｄｏｃ／ａｂｓｔｒａｃｔ．ｐｄｆ？２２０９２００８３４ ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃ－ｌｉｎｋａｇｅ．ｃｏ．ｊｐ／ｊｏｃｓ２０２２／ｄｏｃ／ａｂｓｔｒａｃｔ．ｐｄｆ？２２０９１４１４３９ （その３） 開催日 ２０２２年９月１７日（開催期間：２０２２年９月１７日～２０２２年９月１８日） オンデマンド配信：２０２２年９月２２日～２０２２年１０月６日 集会名、開催場所 第５回日本腫瘍循環器学会学術集会（Ｗｅｂ開催）
(71)【出願人】
【識別番号】504177284
【氏名又は名称】国立大学法人滋賀医科大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】扇田 久和
(72)【発明者】
【氏名】佐藤 朗
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA17
4C084NA14
4C084ZA361
4C085AA13
4C085EE01
4C086AA01
4C086BC17
4C086BC28
4C086EA16
4C086GA08
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA36
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA75
4H045EA20
(57)【要約】
【課題】心不全の治療及び／又は予防用医薬組成物を提供する。
【解決手段】Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９ヘテロダイマー阻害薬を含む、心不全の治療及び／又は予防用医薬組成物。
【選択図】なし
【解決手段】Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９ヘテロダイマー阻害薬を含む、心不全の治療及び／又は予防用医薬組成物。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９ヘテロダイマー阻害薬を含む、心不全の治療及び／又は予防用医薬組成物。
【請求項2】
前記心不全が、アントラサイクリン系抗腫瘍薬誘発性心不全である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
前記アントラサイクリン系抗腫瘍薬が、ドキソルビシン又はその薬理学的に許容される塩である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項4】
前記Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９ヘテロダイマー阻害薬が、Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９ヘテロダイマー阻害作用を有する低分子化合物、中分子化合物、抗体、抗体断片、及び核酸からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１～３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項5】
前記Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９ヘテロダイマー阻害薬が、パキニモド、ラキニモド、タスキニモド、ロキニメックス、及びＡＢＲ－２３８９０１からなる群から選択される少なくとも１種の低分子化合物である、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項6】
前記Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９ヘテロダイマー阻害薬が、Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９ヘテロダイマーに対して抗原結合活性を有する抗体又はその抗体断片である、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項7】
前記Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９ヘテロダイマー阻害薬が、Ｓ１００Ａ８及び／又はＳ１００Ａ９に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はアンチセンス核酸である、請求項４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、心不全の治療及び／又は予防用医薬組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
ドキソルビシンなどのアントラサイクリン系抗腫瘍薬は大腸がんを含む消化器系のがんや乳がんなどに対する抗腫瘍薬として多くのがん患者に投与されている。しかし、アントラサイクリン系抗腫瘍薬の重大な副作用として、用量依存的に心筋障害を引き起こすことが知られている。この副作用予防のため、がん患者に対する例えばドキソルビシンの累積投与量は原則５００ｍｇ／ｍ２体表面積に制限されており、その他のアントラサイクリン系抗腫瘍薬もドキソルビシン換算で累積投与量が制限されているものがほとんどである。その結果、ドキソルビシンなどのアントラサイクリン系抗腫瘍薬に対する反応性が良好ながん症例においても、投与中止となってしまうことがある。また、一旦心筋障害を発症した患者の治療は難渋することがしばしばである。アントラサイクリン系抗腫瘍薬によって誘発される心不全は不可逆的であり、まだ根本的な治療法が存在しない。
【0003】
マウスに対してドキソルビシンを投与して心筋症及び心不全を誘発させた報告は存在する（非特許文献１）。しかしながら、マウスなどのげっ歯類を含む小動物では心拍数などの血行動態はヒトと大きく異なっている。そのため、これらの動物モデルをそのまま心不全治療開発の動物モデルとして使用していくには無理がある。
【0004】
本発明者らは、この問題の解決を目的に、まず非ヒト霊長類であるカニクイザルを用いてドキソルビシン誘発心不全モデルを開発した（特許文献１）。特許文献１では、ドキソルビシンの一回の投与量を調節（最初２ｍｇ静注→３ｍｇ→４ｍｇと順次増量）して投与することで安定的に心不全を発症するカニクイザルの動物モデルを作製することを報告している。
【0005】
このようなドキソルビシン誘発心不全の治療薬の候補としては、例えば、特許文献２及び３に報告されている。
【0006】
特許文献２では、アントラサイクリン誘発性心毒性の治療方法であって、有効量のラパチニブおよび／またはラパマイシンを、それを必要とする対象に投与し、それによってアントラサイクリン誘発性心毒性を治療することを含む方法が報告されている。
【0007】
特許文献３では、ポリアミン又はそれらの薬学的に許容される塩を有効成分として含有する、アントラサイクリン系抗腫瘍薬の投与４日後以降に発現又は残存する心毒性を軽減する心臓保護薬が報告されている。
【0008】
しかしながら、特許文献２及び３の実施例では、治療薬の効果をマウスを用いて確認されているのみであり、特許文献２及び３で提案されている治療薬のヒトにおける有効性は不明である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【特許文献1】特開２０２１－１０３１１号公報
【特許文献2】特表２０１５－５２６４７１号公報
【特許文献3】特許第６３６８９６３号公報
【非特許文献】
【0010】
【非特許文献1】Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，ｖｏｌ．１８，ｎｏ．１１，１６３９－１６４２（２０１２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
本発明は、心不全の治療及び／又は予防用医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、本発明者らが開発した非ヒト霊長類であるカニクイザルのドキソルビシン誘発心不全モデルを用いて心臓での遺伝子発現変化を解析したところ、Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９の遺伝子発現が有意に上昇しており、シグナルパスウェイ解析の結果と合わせて、これらの遺伝子の発現上昇が最も強く心機能低下に関連していることを見出した。そして、ドキソルビシン誘発心不全カニクイザルの心臓では、心筋組織に浸潤してきた好中球でＳ１００Ａ８／Ａ９が強発現していたことから、Ｓ１００Ａ８／Ａ９とその受容体との結合を阻害する薬剤であるパキニモドの効果を検証した。その結果、ドキソルビシンによる心不全を劇的に抑制することができるという知見を得た。パキニモドを含むＳ１００Ａ８／Ａ９阻害薬のドキソルビシン誘発心不全に対する効果については、これまで全く検討されていない。
【0013】
本発明は、これら知見に基づき、更に検討を重ねて完成されたものであり、次の医薬組成物を提供するものである。
【0014】
項１．Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９ヘテロダイマー阻害薬を含む、心不全の治療及び／又は予防用医薬組成物。
項２．前記心不全が、アントラサイクリン系抗腫瘍薬誘発性心不全である、項１に記載の医薬組成物。
項３．前記アントラサイクリン系抗腫瘍薬が、ドキソルビシン又はその薬理学的に許容される塩である、項２に記載の医薬組成物。
項４．前記Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９ヘテロダイマー阻害薬が、Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９ヘテロダイマー阻害作用を有する低分子化合物、中分子化合物、抗体、抗体断片、及び核酸からなる群から選択される少なくとも１種である、項１～３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
項５．前記Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９ヘテロダイマー阻害薬が、パキニモド、ラキニモド、タスキニモド、ロキニメックス、及びＡＢＲ－２３８９０１からなる群から選択される少なくとも１種の低分子化合物である、項４に記載の医薬組成物。
項６．前記Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９ヘテロダイマー阻害薬が、Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９ヘテロダイマーに対して抗原結合活性を有する抗体又はその抗体断片である、項４に記載の医薬組成物。
項７．前記Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９ヘテロダイマー阻害薬が、Ｓ１００Ａ８及び／又はＳ１００Ａ９に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はアンチセンス核酸である、項４に記載の医薬組成物。
項２．前記心不全が、アントラサイクリン系抗腫瘍薬誘発性心不全である、項１に記載の医薬組成物。
項３．前記アントラサイクリン系抗腫瘍薬が、ドキソルビシン又はその薬理学的に許容される塩である、項２に記載の医薬組成物。
項４．前記Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９ヘテロダイマー阻害薬が、Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９ヘテロダイマー阻害作用を有する低分子化合物、中分子化合物、抗体、抗体断片、及び核酸からなる群から選択される少なくとも１種である、項１～３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
項５．前記Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９ヘテロダイマー阻害薬が、パキニモド、ラキニモド、タスキニモド、ロキニメックス、及びＡＢＲ－２３８９０１からなる群から選択される少なくとも１種の低分子化合物である、項４に記載の医薬組成物。
項６．前記Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９ヘテロダイマー阻害薬が、Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９ヘテロダイマーに対して抗原結合活性を有する抗体又はその抗体断片である、項４に記載の医薬組成物。
項７．前記Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９ヘテロダイマー阻害薬が、Ｓ１００Ａ８及び／又はＳ１００Ａ９に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はアンチセンス核酸である、項４に記載の医薬組成物。
【発明の効果】
【0015】
本発明の医薬組成物は、心不全、特にアントラサイクリン系抗腫瘍薬誘発性心不全を治療及び予防することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】心組織におけるＳ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９の発現量を示す図である。（左）コントロール群とドキソルビシン投与群のｑＰＣＲの結果のグラフ（値は平均±ＳＤ）、＊Ｐ＜０．０５ ｖｓ． Ｃｏｎｔｒｏｌ、（右）心組織での共免疫染色の写真。Ｅｌａｓｔａｓｅ：好中球マーカー、ＣＤ６８：マクロファージマーカー。スケールバー（上）：１００μｍ、スケールバー（下）：４０μｍ。
【図2】ドキソルビシン投与後の心臓と肝臓でのＳ１００Ａ８／９の発現比較を行った結果を示す写真である。上：心臓、下：肝臓
【図3】Ｓ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９ヘテロ複合体阻害薬パキニモドによるドキソルビシン誘発心筋障害の抑制作用を示すグラフである。ドキソルビシン（ｎ＝３）、ドキソルビシン＋パキニモド（ｎ＝１）
【発明を実施するための形態】
【0017】
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
【0018】
本発明において「核酸」とはＲＮＡ又はＤＮＡを意味する。本発明において「遺伝子」とは、特に言及しない限り、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ（センス鎖又はアンチセンス鎖）、及びそれらの断片が含まれる。また、本発明において「遺伝子」とは、特に言及しない限り、調節領域、コード領域、エクソン、及びイントロンを区別することなく示すものとする。
【0019】
本明細書において、「Ｓ１００Ａ８」、「Ｓ１００Ａ９」とは記載する場合は、タンパク質又は遺伝子を意味するものとし、タンパク質として解釈することが適切な場合はタンパク質を、遺伝子として解釈することが適切な場合は遺伝子を意味するものとする。
【0020】
本発明において、「核酸」、「ヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は同義であって、これらはＤＮＡ及びＲＮＡの両方を含み、２本鎖であっても１本鎖であってもよい。
【0021】
本発明の心不全の治療及び／又は予防用医薬組成物は、Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９ヘテロダイマー阻害薬を含むことを特徴とする。
【0022】
本明細書において、「Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９」のことを「Ｓ１００Ａ８／Ａ９」と称することもある。
【0023】
心不全とは、心臓が悪いために、息切れやむくみが起こり、だんだん悪くなり、生命を縮める病気であり、例えば、心筋梗塞、弁膜症、心筋症、不整脈、虚血性心疾患、先天性心疾患等の心臓の疾患により引き起こされるもの、高血圧等により負担がかかった状態が続くことで引き起こされるもの、抗腫瘍薬により誘発されるものなどが挙げられる。また、心不全は、急性心筋梗塞や過度なストレスにより、急激に心臓の働きが悪くなる「急性心不全」と、心不全の状態が慢性的に続く「慢性心不全」とに分けられる。本発明において、心不全とは特に限定されない。
【0024】
本発明における心不全としては、アントラサイクリン系抗腫瘍薬誘発性心不全であることが好ましい。アントラサイクリン系抗腫瘍薬としては、特に限定されず、例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ミトキサントロン、エピルビシンなどが挙げられ、中でも、ドキソルビシン及びダウノルビシンが好ましく、ドキソルビシンがより好ましい。
【0025】
アントラサイクリン系抗腫瘍薬には、アントラサイクリン系抗腫瘍薬の塩、水和物、溶媒和、結晶多形なども包含される。
【0026】
アントラサイクリン系抗腫瘍薬の薬理学的に許容される塩としては、特に限定されず、例えば、ナトリウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、アルミニウム塩等の無機塩基との塩；メチルアミン、エチルアミン、エタノールアミン等の有機塩基との塩；リジン、オルニチン、アルギニン等の塩基性アミノ酸との塩及びアンモニウム塩が挙げられる。当該塩は、酸付加塩であってもよく、かかる塩としては、具体的には、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の鉱酸；ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、リンゴ酸、酒石酸、フマル酸、コハク酸、乳酸、マレイン酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸等の有機酸；アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸との酸付加塩が挙げられる。
【0027】
アントラサイクリン系抗腫瘍薬は、入手可能な市販品を使用することができる。
【0028】
アントラサイクリン系抗腫瘍薬の投与経路は、特に限定されず、適宜選択でき、例えば、動脈内投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、筋肉内投与、経直腸投与、経口投与などが挙げられる。中でも好ましくは静脈内投与である。
【0029】
アントラサイクリン系抗腫瘍薬の投与方法は、特に制限されず、当業者に公知の方法により行うことができる。
【0030】
アントラサイクリン系抗腫瘍薬の剤型の種類としては、経口薬として錠剤、丸剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、細粒剤、軟又は硬カプセル剤、フィルムコーティング剤、舌下剤、ペレット剤、ペースト剤などが、非経口薬として注射剤、坐剤などが挙げられ、投与経路等に応じて最適な剤型を選択することができる。
【0031】
アントラサイクリン系抗腫瘍薬の投与により、心不全を発症したことを確認する方法としては、特に限定されず、公知の方法を採用することができ、例えば、心臓超音波法、Ｘ線撮影法、磁気共鳴断層撮影法（ＭＲＩ）などが挙げられる。
【0032】
Ｓ１００タンパク質は、細胞種特異的に発現し、２つのＥＦ－ｈａｎｄを持つカルシウム結合タンパク質であり、現在までに２０種類のサブファミリーが確認されている。Ｓ１００Ａ８（ＭＲＰ８、ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ Ａ）は、カルシウム結合タンパク質Ｓ１００ファミリーの１つであり、通常はＳ１００Ａ９（ＭＲＰ１４、ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ Ｂ）と共発現する。Ｓ１００Ａ８／Ａ９複合体（Ｃａｌｐｒｏｔｅｃｔｉｎ）は、炎症時、体液に蓄積してリウマチ様関節炎、嚢胞性繊維症、クローン病、潰瘍性大腸炎、アレルギー性皮膚炎、感染などのヒトの慢性炎症性疾患の発症に関与すると考えられている。
【0033】
Ｓ１００Ａ８／Ａ９複合体は、例えば肺から分泌され、遠隔のがん細胞を誘引する機能、そしてがん細胞の定着と増殖に適した免疫抑制の環境を肺につくる機能を有する。Ｓ１００Ａ８／Ａ９の受容体群として、ＥＭＭＰＲＩＮ（エンプリン）、ＮＰＴＮα（ｎｅｕｒｏｐｌａｓｔｉｎ－α）、ＮＰＴＮβ、ＭＣＡＭ（Ｍ－ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、ＡＬＣＡＭ、ＲＡＧＥ、ＴＬＲ４などが公知である。
【0034】
本発明において「Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９ヘテロダイマー阻害薬」とは、Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９ヘテロダイマーの機能を阻害できる化合物全般を意味し、そのような化合物としては、例えば、Ｓ１００Ａ８及び／又はＳ１００Ａ９の発現を阻害又は抑制する化合物、Ｓ１００Ａ８及び／又はＳ１００Ａ９の機能若しくは活性を阻害又は低下させる化合物、Ｓ１００Ａ８及び／又はＳ１００Ａ９の受容体への結合を阻害又は低下させる化合物などが挙げられる。「Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９ヘテロダイマー阻害薬」は、Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９の一方を阻害する化合物であってもよいし、又はＳ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９の両方を阻害する化合物であってもよい。
【0035】
Ｓ１００Ａ８／Ａ９ヘテロダイマー阻害薬としては、例えば、Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９ヘテロダイマー阻害作用を有する、低分子化合物、中分子化合物、抗体、抗体断片、核酸などが挙げられる。Ｓ１００Ａ８／Ａ９ヘテロダイマー阻害薬は、１種単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。
【0036】
Ｓ１００Ａ８／Ａ９ヘテロダイマー阻害作用を有する低分子化合物としては、分子量が１０００程度以下の化合物が挙げられ、例えば、パキニモド（Ｐａｑｕｉｎｉｍｏｄ、ＡＢＲ－２５７５７）、ラキニモド（Ｌａｑｕｉｎｉｍｏｄ、ＡＢＲ－２１５０６２）、タスキニモド（Ｔａｓｑｕｉｎｉｍｏｄ）、ロキニメックス（Ｒｏｑｕｉｎｉｍｅｘ、ＡＢＲ－２１２６１６）、ＡＢＲ－２３８９０１などが挙げられる。
【0037】
Ｓ１００Ａ８／Ａ９ヘテロダイマー阻害作用を有する中分子化合物としては、分子量が１０００～３０００程度の化合物が挙げられ、例えば、Ｓ１００Ａ８／Ａ９ヘテロダイマー阻害作用を有するペプチドなどが挙げられる。
【0038】
Ｓ１００Ａ８／Ａ９ヘテロダイマー阻害薬としては、Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９ヘテロダイマー阻害作用を有する抗体又は抗体断片を使用することができる。Ｓ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９ヘテロダイマーに対して抗原結合活性を有する抗体の抗体断片としては、例えば、Ｆｄ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ）２、Ｆ（ａｂ’）２、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）、テトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）、ミニボディなどが挙げられる。抗体としては、マウス、ラット、ウシ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモット等の動物由来のものが挙げられる。抗体のアイソタイプは特に制限されず、アイソタイプとしては、例えば、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭが挙げられる。また、抗体は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいずれであってもよく、好ましくはモノクローナル抗体であり、また、抗体は、ヒト化抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）などであってもよい。抗体は、公知の方法により製造することが可能であり、例えば、抗体をコードする核酸を含有する発現ベクターを構築し、当該核酸を導入した形質転換体を培養することや、抗体を産生するハイブリドーマを培養することなどにより生産することができる。
【0039】
Ｓ１００Ａ８／Ａ９ヘテロダイマー阻害作用を有する核酸としては、例えば、Ｓ１００Ａ８及び／又はＳ１００Ａ９（遺伝子及び／又はそれの転写産物）に対するｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）、ｄｓＲＮＡ（ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ）、アンチセンス核酸などが挙げられる。また、このようなｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンス核酸としては、これらを発現する発現ベクターを使用することもできる。
【0040】
ｓｉＲＮＡとは、標的遺伝子のｍＲＮＡのヌクレオチド配列又はその部分配列（標的ヌクレオチド配列）と相補的な配列を有するＲＮＡとその相補鎖とからなる２本鎖オリゴＲＮＡである。また、ヘアピンループ部分を介して、標的ヌクレオチド配列に相補的な配列（第１の配列）と、その相補配列（第２の配列）とが連結された一本鎖ＲＮＡであって、ヘアピンループ型の構造をとることにより、第１の配列が第２の配列と２重鎖構造を形成するＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）や、第１の配列と第２の配列の２重鎖構造の両末端をループ構造で閉環状にしたダンベル型の核酸もｓｉＲＮＡに含まれる。
【0041】
ｓｉＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖の一方又は双方の５’末端又は３’末端にオーバーハングを有していてもよい。オーバーハングとは、センス鎖及び／又はアンチセンス鎖の末端における１～数個（例えば、１、２、３個）の塩基の付加により形成されるものである。ｓｉＲＮＡの塩基長は、ＲＮＡ干渉を誘導できる限り特に制限されず、例えば、片側鎖として１０～５０塩基、１５～３０塩基、又は２１～２７塩基である。
【0042】
ｓｉＲＮＡは、Ｓ１００Ａ８及び／又はＳ１００Ａ９をコードするｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡであって、当該ｍＲＮＡの塩基配列の情報を基に設計することが可能であり、ＲＮＡ干渉を誘導できる限り配列は特に限定されない。ｓｉＲＮＡは、公知の手法を用いて、化学的に合成すること、又は遺伝子組換え技術を用いて産生することができる。
【0043】
ｄｓＲＮＡは、ＲＮＡｉ効果を有するものであり、通常、Ｓ１００Ａ８又はＳ１００Ａ９のｍＲＮＡにおける連続する任意のＲＮＡ領域と同一の配列からなるセンスＲＮＡ、及び該センスＲＮＡに相補的な配列からなるアンチセンスＲＮＡからなるｄｓＲＮＡである。上記「連続する任意のＲＮＡ領域」の長さは、通常２０～３０塩基であり、好ましくは２１～２３塩基である。
【0044】
ｍｉＲＮＡは、ヘアピン様構造のＲＮＡ前駆体として転写され、ＲＮａｓｅ ＩＩＩ切断活性を有するｄｓＲＮＡ切断酵素により切断され、ＲＩＳＣと称するタンパク質複合体に取り込まれ、ｍＲＮＡの翻訳抑制に関与する１５～２５塩基の非コーディングＲＮＡを意味する。本発明におけるｍｉＲＮＡには、当該ｍｉＲＮＡの前駆体（ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ）も包含する。
【0045】
アンチセンス核酸の配列は、標的遺伝子又はその一部と相補的な配列であることが望ましいが、遺伝子の発現を有効に抑制できる限り、完全に相補的である必要はなく、標的遺伝子の転写産物に対して、好ましくは９０％以上の相補性、より好ましくは９５％以上の相補性を有していればよい。アンチセンス核酸を用いて標的遺伝子の発現を効果的に抑制するため、アンチセンス核酸の長さは１５塩基以上が好ましい。さらに、非特異的な影響を回避するため標的遺伝子の異なる配列に相補的な複数のアンチセンス核酸を用いるのが好ましい。アンチセンス核酸としては、標的遺伝子の翻訳領域だけでなく非翻訳領域の配列のアンチセンス配列を含む核酸も、本発明におけるアンチセンス核酸に含まれる。
【0046】
Ｓ１００Ａ８／Ａ９ヘテロダイマー阻害薬は、フリーの状態又は塩の状態で使用することができる。塩としては、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、アルミニウム等の無機塩基との塩；メチルアミン、エチルアミン、エタノールアミン等の有機塩基との塩；リジン、アルギニン、オルニチン等の塩基性アミノ酸との塩及びアンモニウム塩が挙げられる。当該塩は、酸付加塩であってもよく、かかる塩としては、例えば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の鉱酸；ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸等の有機酸；アスパラギン酸、グルタミン酸等の酸性アミノ酸等との酸付加塩が挙げられる。また、Ｓ１００Ａ８／Ａ９ヘテロダイマー阻害薬にはその水和物、溶媒和物や結晶多形なども含まれる。
【0047】
本発明の医薬組成物におけるＳ１００Ａ８／Ａ９ヘテロダイマー阻害薬の含量は、例えば、医薬組成物全量中０．００１～１００質量％であり得る。当該範囲の上限又は下限は、例えば、０．０１質量％、０．１質量％、１質量％、５質量％、１０質量％、２０質量％、３０質量％、４０質量％、５０質量％、６０質量％、７０質量％、８０質量％、９０質量％、９５質量％、９９質量％、９９．９質量％である。
【0048】
本発明の医薬組成物には、Ｓ１００Ａ８／Ａ９ヘテロダイマー阻害薬以外にも、必要に応じて、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、懸濁化剤、増粘剤、抗酸化剤、吸収促進剤、ｐＨ調節剤、保存剤、防腐剤、安定化剤、界面活性剤、甘味剤、矯味剤、香料等の薬学的に許容される成分を適宜配合することができる。
【0049】
賦形剤としては、例えば、乳糖、白糖、精製白糖、Ｄ－マンニトール、Ｄ－ソルビトール、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、デキストリン、結晶セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、軽質無水ケイ酸、タルク、カオリン等が挙げられる。
【0050】
結合剤としては、例えば、α化デンプン、ゼラチン、アラビアゴム、メチルセルロース、エチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、結晶セルロース、白糖、精製白糖、プルラン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。
【0051】
崩壊剤としては、例えば、乳糖、白糖、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースカルシウム、クロスカルメロースナトリウム、カルボキシメチルスターチナトリウム、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、アルギン酸、クロスポビドン等が挙げられる。
【0052】
滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、タルク、ポリエチレングリコール等が挙げられる。
【0053】
着色剤としては、例えば、三二酸化鉄、黄色三二酸化鉄、褐色酸化鉄、黒酸化鉄、酸化チタン等が挙げられる。
【0054】
懸濁化剤としては、例えば、ポリソルベート、ポリエチレングリコール、グリセリン等が挙げられる。
【0055】
医薬組成物の製剤形態としては、例えば、タブレット(素錠、糖衣錠、発泡錠、フィルムコート錠、チュアブル錠、トローチ剤などを含む)、カプセル剤、丸剤、粉末剤(散剤)、顆粒剤、細粒剤、液剤、懸濁液、乳濁液、ペースト、シロップ、注射剤(使用時に、蒸留水又はアミノ酸輸液や電解質輸液等の輸液に配合して液剤として調製する場合を含む)などの形態が挙げられる。これらの製剤は、常法に従って製造することができる。
【0056】
本発明の医薬組成物の投与方法は特に限定されず、例えば、動脈内投与、静脈内投与、皮下投与、腹腔内投与、筋肉内投与、経直腸投与、経口投与などにより行うことができる。
【0057】
本発明の医薬組成物は、ヒトを含む哺乳動物に対して投与される。
【0058】
本発明の医薬組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、症状などの種々の条件に応じて適宜決定することができる。
【0059】
本発明の医薬組成物は、心不全（特に、アントラサイクリン系抗腫瘍薬誘発性心不全、ドキソルビシン又はその薬理学的に許容される塩による誘発性心不全）の予防及び／又は治療に有用である。
【0060】
なお、本明細書において「含む」とは、「本質的にからなる」と、「からなる」をも包含する（Ｔｈｅ ｔｅｒｍ “ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ” ｉｎｃｌｕｄｅｓ “ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ” ａｎｄ “ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ．”）。また、本発明は、本明細書に説明した構成要件を任意の組み合わせを全て包含する。
【0061】
また、上述した本発明の各実施形態について説明した各種特性（性質、構造、機能等）は、本発明に包含される主題を特定するにあたり、どのように組み合わせられてもよい。すなわち、本発明には、本明細書に記載される組み合わせ可能な各特性のあらゆる組み合わせからなる主題が全て包含される。
【実施例0062】
以下、本発明を更に詳しく説明するため実施例を挙げる。しかし、本発明はこれら実施例等になんら限定されるものではない。
【0063】
・実験方法
＜コントロールサル及びドキソルビシン投与サル心臓からのＲＮＡ抽出＞
１）５～１０ｍｍ角に切り分けた心臓組織２～３片を液体窒素で凍結した。
２）凍結組織を凍結破砕装置クライオプレス（株式会社マイクロテック・ニチオン）で凍結粉末化した。
３）凍結粉末を素早く１ｍＬのＴｒｉｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社 カタログ番号１５５９６０２６）に投入した。
４）回転式ホモジナイザー（ＰＲＯ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製 Ｍｏｄｅｌ Ｐｒｏ ２００）で室温、２分間のミキサーを行い細分化した。
５）クロロホルム（富士フイルム和光純薬株式会社 カタログ番号０３８－０２６０６）を０．４ｍＬ加えて、室温３０秒間ボルテックスした。
６）４℃、１０，０００ｒｐｍ、１０分間遠心した。
７）上清約０．６ｍＬを別のチューブに移し、０．８ｍＬのイソプロパノール（富士フイルム和光純薬株式会社 カタログ番号１６６－０４８３１）を加えた。
８）室温３０秒間ボルテックス後、室温で１０分静置した。
９）４℃、１５，０００ｒｐｍ、１０分間遠心した。
１０）７０％エタノール（９９．５％エタノール（富士フイルム和光純薬株式会社 カタログ番号０５７－００４５１）をＤＥＰＣ処理水（富士フイルム和光純薬株式会社 カタログ番号３１４－９０２０５）で７：３に希釈したもの）で１回洗浄した。
１１）ＲＮＡペレットをＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標） ＲＮＡ ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｙ－Ｎａｇａｌ社 カタログ番号７４０９５５．５０）のＲＡ１ ｂｕｆｆｅｒ ３５０μＬ［β－メルカプトエタノール（ナカライテスク株式会社 カタログ番号２１４－１８） ３．５μＬ含有］に溶かした。
１２）スピンカラムＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｆｉｌｔｅｒにサンプルを移して、室温１１，０００ｘｇ １分間の遠心によりＲＮＡを含むＲＡ１溶液をろ過した。
１３）ろ過したＲＡ１溶液に対して、３５０μＬの７０％エタノールを加えて混合した。
１４）この混合液をＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ カラムに入れて、室温１１，０００ｘｇ ３０秒間遠心した（下層のチューブに溜まった廃液は捨てた）。
１５）カラムにＭｅｍｂｒａｎｅ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ３５０μＬを加えて、室温１１，０００ｘｇ ３０秒間遠心した。
１６）カラムに９５μＬのＤＮａｓｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅを加えて、室温で１５分間静置した。
１７）カラムに２００μＬ Ｂｕｆｆｅｒ ＲＡＷ２を加えて、室温１１，０００ｘｇ ３０秒間遠心することでカラムを洗浄した（下層のチューブに溜まった廃液は捨てた）。
１８）カラムに６００μＬ Ｂｕｆｆｅｒ ＲＡ３を加えて、室温１１，０００ｘｇ ３０秒間遠心することで、カラムを洗浄した（下層のチューブを捨てて、新しいチューブにカラムをセットした）。
１９）カラムに２５０μＬ Ｂｕｆｆｅｒ ＲＡ３を加えて、室温１１，０００ｘｇ ２分間遠心することで、カラムを洗浄した。
２０）カラムを新しいチューブに設置して、ＲＮａｓｅ非含有水を６０μＬカラムに加えて、１１，０００ｘｇ １分間遠心することで、下層のチューブに精製ＲＮＡ溶液を抽出した。
＜コントロールサル及びドキソルビシン投与サル心臓からのＲＮＡ抽出＞
１）５～１０ｍｍ角に切り分けた心臓組織２～３片を液体窒素で凍結した。
２）凍結組織を凍結破砕装置クライオプレス（株式会社マイクロテック・ニチオン）で凍結粉末化した。
３）凍結粉末を素早く１ｍＬのＴｒｉｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社 カタログ番号１５５９６０２６）に投入した。
４）回転式ホモジナイザー（ＰＲＯ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製 Ｍｏｄｅｌ Ｐｒｏ ２００）で室温、２分間のミキサーを行い細分化した。
５）クロロホルム（富士フイルム和光純薬株式会社 カタログ番号０３８－０２６０６）を０．４ｍＬ加えて、室温３０秒間ボルテックスした。
６）４℃、１０，０００ｒｐｍ、１０分間遠心した。
７）上清約０．６ｍＬを別のチューブに移し、０．８ｍＬのイソプロパノール（富士フイルム和光純薬株式会社 カタログ番号１６６－０４８３１）を加えた。
８）室温３０秒間ボルテックス後、室温で１０分静置した。
９）４℃、１５，０００ｒｐｍ、１０分間遠心した。
１０）７０％エタノール（９９．５％エタノール（富士フイルム和光純薬株式会社 カタログ番号０５７－００４５１）をＤＥＰＣ処理水（富士フイルム和光純薬株式会社 カタログ番号３１４－９０２０５）で７：３に希釈したもの）で１回洗浄した。
１１）ＲＮＡペレットをＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標） ＲＮＡ ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｙ－Ｎａｇａｌ社 カタログ番号７４０９５５．５０）のＲＡ１ ｂｕｆｆｅｒ ３５０μＬ［β－メルカプトエタノール（ナカライテスク株式会社 カタログ番号２１４－１８） ３．５μＬ含有］に溶かした。
１２）スピンカラムＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｆｉｌｔｅｒにサンプルを移して、室温１１，０００ｘｇ １分間の遠心によりＲＮＡを含むＲＡ１溶液をろ過した。
１３）ろ過したＲＡ１溶液に対して、３５０μＬの７０％エタノールを加えて混合した。
１４）この混合液をＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ カラムに入れて、室温１１，０００ｘｇ ３０秒間遠心した（下層のチューブに溜まった廃液は捨てた）。
１５）カラムにＭｅｍｂｒａｎｅ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ ３５０μＬを加えて、室温１１，０００ｘｇ ３０秒間遠心した。
１６）カラムに９５μＬのＤＮａｓｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅを加えて、室温で１５分間静置した。
１７）カラムに２００μＬ Ｂｕｆｆｅｒ ＲＡＷ２を加えて、室温１１，０００ｘｇ ３０秒間遠心することでカラムを洗浄した（下層のチューブに溜まった廃液は捨てた）。
１８）カラムに６００μＬ Ｂｕｆｆｅｒ ＲＡ３を加えて、室温１１，０００ｘｇ ３０秒間遠心することで、カラムを洗浄した（下層のチューブを捨てて、新しいチューブにカラムをセットした）。
１９）カラムに２５０μＬ Ｂｕｆｆｅｒ ＲＡ３を加えて、室温１１，０００ｘｇ ２分間遠心することで、カラムを洗浄した。
２０）カラムを新しいチューブに設置して、ＲＮａｓｅ非含有水を６０μＬカラムに加えて、１１，０００ｘｇ １分間遠心することで、下層のチューブに精製ＲＮＡ溶液を抽出した。
【0064】
＜ＲＮＡ－ｓｅｑ＞
１）上記の精製ＲＮＡ溶液を用いてＴｒｕＳｅｑ ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ ｓａｍｐｌｅ ｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社 カタログ番号２００２０５９５）によりＬｉｂｒａｒｙを作製した。
２）Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ３０００ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いて、１００－ｂａｓｅ ｓｉｎｇｌｅ－ｅｎｄ ｍｏｄｅにてシークエンスを行った。
３）シークエンス結果を、以下の３種類のソフトウェア（ＴｏｐＨａｔ ｖ２．０．１３、Ｂｏｗｔｉｅ２ ｖｅｒ． ２．２．３ 及びＳＡＭｔｏｏｌｓ ｖｅｒ． ０．１．１９）を用いて、カニクイザルのゲノム情報（ｔｈｅ Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（ｍａｃＦａｓ５））に照らし合わせて、読まれたシークエンスを決定した。
４）Ｔｈｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｐｅｒ ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ ｅｘｏｎ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｍａｐｐｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（ＦＰＫＭｓ）の算出は、Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．２．１．を用いて行った。
１）上記の精製ＲＮＡ溶液を用いてＴｒｕＳｅｑ ｓｔｒａｎｄｅｄ ｍＲＮＡ ｓａｍｐｌｅ ｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社 カタログ番号２００２０５９５）によりＬｉｂｒａｒｙを作製した。
２）Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ３０００ ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いて、１００－ｂａｓｅ ｓｉｎｇｌｅ－ｅｎｄ ｍｏｄｅにてシークエンスを行った。
３）シークエンス結果を、以下の３種類のソフトウェア（ＴｏｐＨａｔ ｖ２．０．１３、Ｂｏｗｔｉｅ２ ｖｅｒ． ２．２．３ 及びＳＡＭｔｏｏｌｓ ｖｅｒ． ０．１．１９）を用いて、カニクイザルのゲノム情報（ｔｈｅ Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｇｅｎｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（ｍａｃＦａｓ５））に照らし合わせて、読まれたシークエンスを決定した。
４）Ｔｈｅ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｐｅｒ ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ ｅｘｏｎ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｍａｐｐｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ（ＦＰＫＭｓ）の算出は、Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ ｖｅｒｓｉｏｎ ２．２．１．を用いて行った。
【0065】
＜ＲＮＡ－ｓｅｑ後の解析＞
１）シークエンス情報に対して、ＱＩＡＧＥＮ ＩＮＧＥＮＵＩＴＹ ＰＡＴＨＷＡＹ ＡＮＡＬＹＳＩＳ（ＩＰＡ）にアクセスし、その画面上で解析を行った。
ＱＩＡＧＥＮ社のＩＰＡツールの情報は下記ＵＲＬを参照。
ｈｔｔｐｓ：／／ｄｉｇｉｔａｌｉｎｓｉｇｈｔｓ．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ／ｊａ／ｑｉａｇｅｎ－ｉｐａ／
２）ＱＩＡＧＥＮ ＩＰＡのうち、Ｕｐｓｔｒｅａｍ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ Ａｎａｌｙｓｉｓを用いて解析した。
１）シークエンス情報に対して、ＱＩＡＧＥＮ ＩＮＧＥＮＵＩＴＹ ＰＡＴＨＷＡＹ ＡＮＡＬＹＳＩＳ（ＩＰＡ）にアクセスし、その画面上で解析を行った。
ＱＩＡＧＥＮ社のＩＰＡツールの情報は下記ＵＲＬを参照。
ｈｔｔｐｓ：／／ｄｉｇｉｔａｌｉｎｓｉｇｈｔｓ．ｑｉａｇｅｎ．ｃｏｍ／ｊａ／ｑｉａｇｅｎ－ｉｐａ／
２）ＱＩＡＧＥＮ ＩＰＡのうち、Ｕｐｓｔｒｅａｍ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒ Ａｎａｌｙｓｉｓを用いて解析した。
【0066】
＜ドキソルビシン投与方法＞
１）１週目の月曜日と木曜日にドキソルビシン（ＬＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社 Ｄ－４０００）をカニクイザル１個体当たり１回２ｍｇ／５ｍＬ生理食塩水の溶液にして静注した。
２）２週目は、月曜日に採血及び血圧測定、心エコー検査を行った。
３）１）と２）の２週間のプログラムを１セットとし、このセットを繰り返し継続した。
４）ドキソルビシンの投与量は、総投与量が５０ｍｇを超えたら１個体当たり１回３ｍｇに増やした。
１）１週目の月曜日と木曜日にドキソルビシン（ＬＣ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社 Ｄ－４０００）をカニクイザル１個体当たり１回２ｍｇ／５ｍＬ生理食塩水の溶液にして静注した。
２）２週目は、月曜日に採血及び血圧測定、心エコー検査を行った。
３）１）と２）の２週間のプログラムを１セットとし、このセットを繰り返し継続した。
４）ドキソルビシンの投与量は、総投与量が５０ｍｇを超えたら１個体当たり１回３ｍｇに増やした。
【0067】
＜ｑＰＣＲ解析＞
１）ＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒ（東洋紡株式会社 カタログ番号ＦＳＱ－２０１）を用いて、組織より抽出したＲＮＡ（総量 ２μｇ）からｃＤＮＡ（２０μＬ）を作製した。
２）ｑＰＣＲ１反応あたり、上記のｃＤＮＡ ２μＬを使い、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標） ４８０ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉマスターｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社 カタログ番号０４０７５１６００１）を用いてｑＰＣＲを行った。ｑＰＣＲに使用した機器は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ ｓｙｓｔｅｍ ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社 型式０５０１５２７８００１）である。ｑＰＣＲに用いたプライマーの配列を以下に記す。ＧＡＰＤＨは内部コントロールとして増幅するものである。
Ｓ１００Ａ８ Ｆｏｒｗａｒｄ：ＴＴＧＡＣＣＧＡＴＣＴＧＧＡＧＡＡＡＧＣ（配列番号１）
Ｓ１００Ａ８ Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＣＧＧＴＧＴＴＧＡＴＧＴＣＣＡＡＣＴＣＴＴ（配列番号２）
Ｓ１００Ａ９ Ｆｏｒｗａｒｄ：ＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＡＡＡＧＡＴＣＴＧＣ（配列番号３）
Ｓ１００Ａ９ Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＡＴＣＣＴＣＧＴＧＣＡＴＣＴＴＣＴＣＧＴ（配列番号４）
ＧＡＰＤＨ Ｆｏｒｗａｒｄ：ＣＣＴＧＴＴＣＧＡＣＡＧＴＣＡＧＣＣＧ（配列番号５）
ＧＡＰＤＨ Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＣＧＡＣＣＡＡＡＴＣＣＧＴＴＧＡＣＴＣＣ（配列番号６）
１）ＲｅｖｅｒＴｒａＡｃｅ ｑＰＣＲ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｒｅｍｏｖｅｒ（東洋紡株式会社 カタログ番号ＦＳＱ－２０１）を用いて、組織より抽出したＲＮＡ（総量 ２μｇ）からｃＤＮＡ（２０μＬ）を作製した。
２）ｑＰＣＲ１反応あたり、上記のｃＤＮＡ ２μＬを使い、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標） ４８０ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｉマスターｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社 カタログ番号０４０７５１６００１）を用いてｑＰＣＲを行った。ｑＰＣＲに使用した機器は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０ ｓｙｓｔｅｍ ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社 型式０５０１５２７８００１）である。ｑＰＣＲに用いたプライマーの配列を以下に記す。ＧＡＰＤＨは内部コントロールとして増幅するものである。
Ｓ１００Ａ８ Ｆｏｒｗａｒｄ：ＴＴＧＡＣＣＧＡＴＣＴＧＧＡＧＡＡＡＧＣ（配列番号１）
Ｓ１００Ａ８ Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＣＧＧＴＧＴＴＧＡＴＧＴＣＣＡＡＣＴＣＴＴ（配列番号２）
Ｓ１００Ａ９ Ｆｏｒｗａｒｄ：ＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＡＡＡＧＡＴＣＴＧＣ（配列番号３）
Ｓ１００Ａ９ Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＡＴＣＣＴＣＧＴＧＣＡＴＣＴＴＣＴＣＧＴ（配列番号４）
ＧＡＰＤＨ Ｆｏｒｗａｒｄ：ＣＣＴＧＴＴＣＧＡＣＡＧＴＣＡＧＣＣＧ（配列番号５）
ＧＡＰＤＨ Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＣＧＡＣＣＡＡＡＴＣＣＧＴＴＧＡＣＴＣＣ（配列番号６）
【0068】
＜免疫組織染色法＞
１）凍結組織より厚さ１０μｍの薄切切片を作製した。
２）４％パラホルムアルデヒド（ナカライテスク株式会社 カタログ番号２６１２６－２５）溶液に、薄切切片を１５分間浸して組織を固定した。
３）薄切切片をリン酸バッファー溶液（ＰＢＳ）で３回洗浄後、０．２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０／ＰＢＳ溶液に１５分間切片を浸した。ＰＢＳの組成は、１３７ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、８．１ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、２．６８ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、１．４７ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４である。
４）薄切切片をＰＢＳで３回洗浄後、５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：ナカライテスク株式会社 カタログ番号０１８５９－４７）／ＰＢＳ溶液に浸し１時間ブロッキングを行なった。
５）一次抗体を５％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液に１：２００で希釈した。この一次抗体を含む溶液に薄切切片を浸し、４℃で一晩反応させた。
６）薄切切片をＰＢＳで３回洗浄した。
７）二次抗体を５％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液に１：５００で希釈した。この二次抗体溶液を含む溶液に薄切切片を浸し、１時間室温で反応させた。
８）薄切切片をＰＢＳで３回洗浄した。
９）ＤＡＰＩ（富士フイルム和光純薬株式会社 カタログ番号３４０－０７９７１）（希釈比１：２０）を含む蛍光染色用の封入剤ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ社 カタログ番号Ｈ－１００００）で薄切切片を封入した。
１０）薄切切片を共焦点レーザー走査顕微鏡ＴＣＳ ＳＰ８Ｘ（Ｌｅｉｃａ社）もしくはＦＶ１０００－Ｄ（オリンパス株式会社）で観察した。
使用した一次抗体は下記の通りである。
抗Ｓ１００Ａ８／９抗体（Ａｂｃａｍ社 カタログ番号ａｂ２２５０６）
抗好中球エラスターゼ抗体（Ａｂｃａｍ社 カタログ番号ａｂ６８６７２）
抗ＣＤ６８抗体（Ａｂｃａｍ社 カタログ番号ａｂ１２５２１２）
使用した二次抗体は下記の通りである。
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社 カタログ番号Ａ１１００８）
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社 カタログ番号Ａ１１００１）
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５５５ ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社 カタログ番号Ａ３１５７２）
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５５５ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社 カタログ番号Ａ２１４２２）
１）凍結組織より厚さ１０μｍの薄切切片を作製した。
２）４％パラホルムアルデヒド（ナカライテスク株式会社 カタログ番号２６１２６－２５）溶液に、薄切切片を１５分間浸して組織を固定した。
３）薄切切片をリン酸バッファー溶液（ＰＢＳ）で３回洗浄後、０．２％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０／ＰＢＳ溶液に１５分間切片を浸した。ＰＢＳの組成は、１３７ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、８．１ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、２．６８ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ、１．４７ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４である。
４）薄切切片をＰＢＳで３回洗浄後、５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ：ナカライテスク株式会社 カタログ番号０１８５９－４７）／ＰＢＳ溶液に浸し１時間ブロッキングを行なった。
５）一次抗体を５％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液に１：２００で希釈した。この一次抗体を含む溶液に薄切切片を浸し、４℃で一晩反応させた。
６）薄切切片をＰＢＳで３回洗浄した。
７）二次抗体を５％ＢＳＡ／ＰＢＳ溶液に１：５００で希釈した。この二次抗体溶液を含む溶液に薄切切片を浸し、１時間室温で反応させた。
８）薄切切片をＰＢＳで３回洗浄した。
９）ＤＡＰＩ（富士フイルム和光純薬株式会社 カタログ番号３４０－０７９７１）（希釈比１：２０）を含む蛍光染色用の封入剤ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂ社 カタログ番号Ｈ－１００００）で薄切切片を封入した。
１０）薄切切片を共焦点レーザー走査顕微鏡ＴＣＳ ＳＰ８Ｘ（Ｌｅｉｃａ社）もしくはＦＶ１０００－Ｄ（オリンパス株式会社）で観察した。
使用した一次抗体は下記の通りである。
抗Ｓ１００Ａ８／９抗体（Ａｂｃａｍ社 カタログ番号ａｂ２２５０６）
抗好中球エラスターゼ抗体（Ａｂｃａｍ社 カタログ番号ａｂ６８６７２）
抗ＣＤ６８抗体（Ａｂｃａｍ社 カタログ番号ａｂ１２５２１２）
使用した二次抗体は下記の通りである。
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社 カタログ番号Ａ１１００８）
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社 カタログ番号Ａ１１００１）
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５５５ ｄｏｎｋｅｙ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社 カタログ番号Ａ３１５７２）
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ５５５ ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社 カタログ番号Ａ２１４２２）
【0069】
＜パキニモドの投与方法＞
パキニモド（Ｍｅｄｃｈｅｍｅｘｐｒｅｓｓ社 ＨＹ－１００４４２）は、上記の＜ドキソルビシン投与方法＞のプログラムにおける毎週月曜日と木曜日に、１個体当たり１回０．５ｍｇ／３ｍｌ生理食塩水の溶液を経鼻的に２５ｃｍ程度挿入した胃管チューブを通して行った。
パキニモド（Ｍｅｄｃｈｅｍｅｘｐｒｅｓｓ社 ＨＹ－１００４４２）は、上記の＜ドキソルビシン投与方法＞のプログラムにおける毎週月曜日と木曜日に、１個体当たり１回０．５ｍｇ／３ｍｌ生理食塩水の溶液を経鼻的に２５ｃｍ程度挿入した胃管チューブを通して行った。
【0070】
・結果
カニクイザルのコントロール群（ｎ＝２）及びドキソルビシン投与群（ｎ＝３）の心筋組織サンプルの有意な遺伝子発現変化の同定と機能解析を行った。有意差を持って発現変動した上位遺伝子について、Ｐａｔｈｗａｙ解析を行い、Ｐａｔｈｗａｙ解析を総合して推定される上流原因因子の結果を表１に示す。表１から上位１位と２位の遺伝子がそれぞれＳ１００Ａ９とＳ１００Ａ８であった。Ｓ１００Ａ８とＳ１００Ａ９は分泌タンパク質であり、ヘテロダイマーを形成して細胞への作用を発揮する。
カニクイザルのコントロール群（ｎ＝２）及びドキソルビシン投与群（ｎ＝３）の心筋組織サンプルの有意な遺伝子発現変化の同定と機能解析を行った。有意差を持って発現変動した上位遺伝子について、Ｐａｔｈｗａｙ解析を行い、Ｐａｔｈｗａｙ解析を総合して推定される上流原因因子の結果を表１に示す。表１から上位１位と２位の遺伝子がそれぞれＳ１００Ａ９とＳ１００Ａ８であった。Ｓ１００Ａ８とＳ１００Ａ９は分泌タンパク質であり、ヘテロダイマーを形成して細胞への作用を発揮する。
【0071】
【表1】
【0072】
図１に心組織のｑＰＣＲと共免疫染色の結果を示す。図１から、ドキソルビシン投与群において心組織でＳ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９が共に高発現していることが分かる。さらに、心筋組織に浸潤してきた好中球においてＳ１００Ａ８及びＳ１００Ａ９が主に発現していることが分かる。
【0073】
【0074】
図３にＳ１００Ａ８／Ｓ１００Ａ９ヘテロ複合体阻害薬パキニモドをドキソルビシン誘発心筋障害に対して投与した結果を示す。パキニモドは、Ｓ１００Ａ８／９の受容体（ＲＡＧＥ／ＴＬＲ４）への結合を阻害することが報告されたキノリン系化合物である。図３から、パキニモドを併用投与することにより、ドキソルビシンの累積投与量が５００ｍｇ／ｍ２を越えても心機能が保たれており、心不全死することはなかった。
【0075】
この結果から、Ｓ１００Ａ８とＳ１００Ａ９のヘテロ複合体阻害薬パキニモドの投与は、ドキソルビシンによる心筋障害に対して保護作用を示した。
【図1】
【図2】
【図3】
【配列表】