(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024082735
(43)【公開日】2024-06-20
(54)【発明の名称】アダプター骨格蛋白質、酵素複合体、及び光合成生物
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20240613BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240613BHJP
C12N 15/60 20060101ALI20240613BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20240613BHJP
C07K 14/33 20060101ALI20240613BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240613BHJP
C12N 9/88 20060101ALI20240613BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00
C12N15/62 Z ZNA
C12N15/60
C12N15/31
C07K14/33
C12N1/21
C12N9/88
【審査請求】未請求
【請求項の数】6
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022196790
(22)【出願日】2022-12-09
(71)【出願人】
【識別番号】599002043
【氏名又は名称】学校法人 名城大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000497
【氏名又は名称】弁理士法人グランダム特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】神藤 定生
【テーマコード（参考）】
4B050
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B050CC03
4B050CC05
4B050DD02
4B050EE10
4B050LL05
4B065AA01X
4B065AA26X
4B065AB01
4B065AC09
4B065AC14
4B065AC20
4B065BA02
4B065CA46
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA11
4H045DA89
4H045EA61
4H045FA74
(57)【要約】
【課題】ＡＣＣ合成酵素及びＡＣＣ酸化酵素を高度に集積化する。
【解決手段】アダプター骨格蛋白質は、ＡＣＣ合成酵素サブユニットが結合するコヘシンドメインＣＡＣＳと、第１結合ドメインと、を含む第１の骨格蛋白質を保持するとともに、ＡＣＣ酸化酵素サブユニットが結合するコヘシンドメインＣＡＣＯと、第２結合ドメインと、を含む第２の骨格蛋白質を保持する。前記アダプター骨格蛋白質は、コヘシンドメインＣ３及びドックリンドメインＤ３のいずれかである第３結合ドメインと、コヘシンドメインＣ４及びドックリンドメインＤ４のいずれかである第４結合ドメインと、を含み、前記第３結合ドメインと前記第１結合ドメインとを介したコヘシン－ドックリン結合によって前記第１の骨格蛋白質を保持し、前記第４結合ドメインと前記第２結合ドメインを介したコヘシン－ドックリン結合によって前記第２の骨格蛋白質を保持する。
【選択図】図１
【解決手段】アダプター骨格蛋白質は、ＡＣＣ合成酵素サブユニットが結合するコヘシンドメインＣＡＣＳと、第１結合ドメインと、を含む第１の骨格蛋白質を保持するとともに、ＡＣＣ酸化酵素サブユニットが結合するコヘシンドメインＣＡＣＯと、第２結合ドメインと、を含む第２の骨格蛋白質を保持する。前記アダプター骨格蛋白質は、コヘシンドメインＣ３及びドックリンドメインＤ３のいずれかである第３結合ドメインと、コヘシンドメインＣ４及びドックリンドメインＤ４のいずれかである第４結合ドメインと、を含み、前記第３結合ドメインと前記第１結合ドメインとを介したコヘシン－ドックリン結合によって前記第１の骨格蛋白質を保持し、前記第４結合ドメインと前記第２結合ドメインを介したコヘシン－ドックリン結合によって前記第２の骨格蛋白質を保持する。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
第１の骨格蛋白質を保持するとともに、第２の骨格蛋白質を保持するアダプター骨格蛋白質であって、
前記第１の骨格蛋白質は、ＡＣＣ合成酵素サブユニットが結合するコヘシンドメインＣＡＣＳと、コヘシンドメインＣ１及びドックリンドメインＤ１のいずれかである第１結合ドメインと、を含み、
前記第２の骨格蛋白質は、ＡＣＣ酸化酵素サブユニットが結合するコヘシンドメインＣＡＣＯと、コヘシンドメインＣ２及びドックリンドメインＤ２のいずれかである第２結合ドメインと、を含み、
前記アダプター骨格蛋白質は、
コヘシンドメインＣ３及びドックリンドメインＤ３のいずれかである第３結合ドメインと、コヘシンドメインＣ４及びドックリンドメインＤ４のいずれかである第４結合ドメインと、を含み、
前記第３結合ドメインと前記第１結合ドメインとを介したコヘシン－ドックリン結合によって前記第１の骨格蛋白質を保持し、
前記第４結合ドメインと前記第２結合ドメインを介したコヘシン－ドックリン結合によって前記第２の骨格蛋白質を保持する、アダプター骨格蛋白質。
前記第１の骨格蛋白質は、ＡＣＣ合成酵素サブユニットが結合するコヘシンドメインＣＡＣＳと、コヘシンドメインＣ１及びドックリンドメインＤ１のいずれかである第１結合ドメインと、を含み、
前記第２の骨格蛋白質は、ＡＣＣ酸化酵素サブユニットが結合するコヘシンドメインＣＡＣＯと、コヘシンドメインＣ２及びドックリンドメインＤ２のいずれかである第２結合ドメインと、を含み、
前記アダプター骨格蛋白質は、
コヘシンドメインＣ３及びドックリンドメインＤ３のいずれかである第３結合ドメインと、コヘシンドメインＣ４及びドックリンドメインＤ４のいずれかである第４結合ドメインと、を含み、
前記第３結合ドメインと前記第１結合ドメインとを介したコヘシン－ドックリン結合によって前記第１の骨格蛋白質を保持し、
前記第４結合ドメインと前記第２結合ドメインを介したコヘシン－ドックリン結合によって前記第２の骨格蛋白質を保持する、アダプター骨格蛋白質。
【請求項2】
ＡＣＣ合成酵素とドックリンドメインＤＡＣＳとを含むＡＣＣ合成酵素サブユニットと、
前記ドックリンドメインＤＡＣＳが結合するコヘシンドメインＣＡＣＳと、コヘシンドメインＣ１及びドックリンドメインＤ１のいずれかである第１結合ドメインと、を含む第１の骨格蛋白質と、
ＡＣＣ酸化酵素とドックリンドメインＤＡＣＯとを含むＡＣＣ酸化酵素サブユニットと、
前記ドックリンドメインＤＡＣＯが結合するコヘシンドメインＣＡＣＯと、コヘシンドメインＣ２及びドックリンドメインＤ２のいずれかである第２結合ドメインと、を含む第２の骨格蛋白質と、
コヘシンドメインＣ３及びドックリンドメインＤ３のいずれかである第３結合ドメインと、コヘシンドメインＣ４及びドックリンドメインＤ４のいずれかである第４結合ドメインと、を含む第３の骨格蛋白質と、を備え、
前記第３の骨格蛋白質は、
前記第３結合ドメインと前記第１結合ドメインとを介したコヘシン－ドックリン結合によって前記第１の骨格蛋白質を保持し、
前記第４結合ドメインと前記第２結合ドメインを介したコヘシン－ドックリン結合によって前記第２の骨格蛋白質を保持する、酵素複合体。
前記ドックリンドメインＤＡＣＳが結合するコヘシンドメインＣＡＣＳと、コヘシンドメインＣ１及びドックリンドメインＤ１のいずれかである第１結合ドメインと、を含む第１の骨格蛋白質と、
ＡＣＣ酸化酵素とドックリンドメインＤＡＣＯとを含むＡＣＣ酸化酵素サブユニットと、
前記ドックリンドメインＤＡＣＯが結合するコヘシンドメインＣＡＣＯと、コヘシンドメインＣ２及びドックリンドメインＤ２のいずれかである第２結合ドメインと、を含む第２の骨格蛋白質と、
コヘシンドメインＣ３及びドックリンドメインＤ３のいずれかである第３結合ドメインと、コヘシンドメインＣ４及びドックリンドメインＤ４のいずれかである第４結合ドメインと、を含む第３の骨格蛋白質と、を備え、
前記第３の骨格蛋白質は、
前記第３結合ドメインと前記第１結合ドメインとを介したコヘシン－ドックリン結合によって前記第１の骨格蛋白質を保持し、
前記第４結合ドメインと前記第２結合ドメインを介したコヘシン－ドックリン結合によって前記第２の骨格蛋白質を保持する、酵素複合体。
【請求項3】
ＡＣＣ合成酵素サブユニット数に対するＡＣＣ酸化酵素サブユニット数の比率（ＡＣＣ酸化酵素サブユニット数／ＡＣＣ合成酵素サブユニット数）が３以上である、請求項２に記載の酵素複合体。
【請求項4】
コヘシンドメインＣ５及びドックリンドメインＤ５のいずれかである第５結合ドメインと、コヘシンドメインＣ６及びドックリンドメインＤ６のいずれかである第６結合ドメインと、を含む第４の骨格蛋白質、を更に備え、
前記第３の骨格蛋白質は、前記第４結合ドメインと前記第５結合ドメインを介したコヘシン－ドックリン結合によって前記第４の骨格蛋白質を保持し、
前記第４の骨格蛋白質は、前記第６結合ドメインと前記第２結合ドメインを介したコヘシン－ドックリン結合によって前記第２の骨格蛋白質を保持する、請求項２又は請求項３に記載の酵素複合体。
前記第３の骨格蛋白質は、前記第４結合ドメインと前記第５結合ドメインを介したコヘシン－ドックリン結合によって前記第４の骨格蛋白質を保持し、
前記第４の骨格蛋白質は、前記第６結合ドメインと前記第２結合ドメインを介したコヘシン－ドックリン結合によって前記第２の骨格蛋白質を保持する、請求項２又は請求項３に記載の酵素複合体。
【請求項5】
ＭＴＡ分解酵素とドックリンドメインＤＭＴＡＮとを含むＭＴＡ分解酵素サブユニットを更に備え、
前記第１の骨格蛋白質は、前記ドックリンドメインＤＭＴＡＮが結合するコヘシンドメインＣＭＴＡＮを更に含む、請求項２又は請求項３に記載の酵素複合体。
前記第１の骨格蛋白質は、前記ドックリンドメインＤＭＴＡＮが結合するコヘシンドメインＣＭＴＡＮを更に含む、請求項２又は請求項３に記載の酵素複合体。
【請求項6】
請求項２又は請求項３に記載の酵素複合体を産生するように形質転換した光合成生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、アダプター骨格蛋白質、酵素複合体、及び光合成生物に関するものである。
【背景技術】
【0002】
特許文献１は、セルロース結合蛋白質に由来する蛋白質担体上に、コヘシン－ドックリン間の特異的結合性を利用して、逐次反応に関与する酵素群をワンセットで結合させた酵素配列複合体を開示する。
【0003】
特許文献２は、嫌気性微生物由来のコヘシン－ドックリン結合を利用したエチレン生成人工酵素複合体ＳＯＣ２を開示する。エチレン生成人工酵素複合体ＳＯＣ２は、骨格蛋白質と、当該骨格蛋白質に結合したＡＣＣ合成酵素サブユニットと、当該骨格蛋白質に結合したＡＣＣ酸化酵素サブユニットと、を含んでいる。そして、エチレン生成人工酵素複合体ＳＯＣ２によれば、ＳＡＭ（Ｓ－アデノシル－Ｌ－メチオニン）を基質として、ＡＣＣ（１－アミノシクロプロパンカルボン酸）を生成し、更にエチレン（Ｃ２Ｈ４）を生成し得ることが確認されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0004】
【特許文献1】特開２０００－１５７２８２号公報
【特許文献2】特開２０１３－０７４８１４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
しかし、特許文献１及び特許文献２に記載の技術は、酵素群を直列に配列した酵素複合体に留まる。エチレン産生能を更に向上するために、ＡＣＣ合成酵素及びＡＣＣ酸化酵素を高度に集積化することが望まれる。
【0006】
本開示は、上記従来の実情に鑑みてなされたものであって、ＡＣＣ合成酵素及びＡＣＣ酸化酵素を高度に集積化することを解決すべき課題としている。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本開示のアダプター骨格蛋白質は、
第１の骨格蛋白質を保持するとともに、第２の骨格蛋白質を保持するアダプター骨格蛋白質であって、
前記第１の骨格蛋白質は、ＡＣＣ合成酵素サブユニットが結合するコヘシンドメインＣＡＣＳと、コヘシンドメインＣ１及びドックリンドメインＤ１のいずれかである第１結合ドメインと、を含み、
前記第２の骨格蛋白質は、ＡＣＣ酸化酵素サブユニットが結合するコヘシンドメインＣＡＣＯと、コヘシンドメインＣ２及びドックリンドメインＤ２のいずれかである第２結合ドメインと、を含み、
前記アダプター骨格蛋白質は、
コヘシンドメインＣ３及びドックリンドメインＤ３のいずれかである第３結合ドメインと、コヘシンドメインＣ４及びドックリンドメインＤ４のいずれかである第４結合ドメインと、を含み、
前記第３結合ドメインと前記第１結合ドメインとを介したコヘシン－ドックリン結合によって前記第１の骨格蛋白質を保持し、
前記第４結合ドメインと前記第２結合ドメインを介したコヘシン－ドックリン結合によって前記第２の骨格蛋白質を保持する。
第１の骨格蛋白質を保持するとともに、第２の骨格蛋白質を保持するアダプター骨格蛋白質であって、
前記第１の骨格蛋白質は、ＡＣＣ合成酵素サブユニットが結合するコヘシンドメインＣＡＣＳと、コヘシンドメインＣ１及びドックリンドメインＤ１のいずれかである第１結合ドメインと、を含み、
前記第２の骨格蛋白質は、ＡＣＣ酸化酵素サブユニットが結合するコヘシンドメインＣＡＣＯと、コヘシンドメインＣ２及びドックリンドメインＤ２のいずれかである第２結合ドメインと、を含み、
前記アダプター骨格蛋白質は、
コヘシンドメインＣ３及びドックリンドメインＤ３のいずれかである第３結合ドメインと、コヘシンドメインＣ４及びドックリンドメインＤ４のいずれかである第４結合ドメインと、を含み、
前記第３結合ドメインと前記第１結合ドメインとを介したコヘシン－ドックリン結合によって前記第１の骨格蛋白質を保持し、
前記第４結合ドメインと前記第２結合ドメインを介したコヘシン－ドックリン結合によって前記第２の骨格蛋白質を保持する。
【0008】
このアダプター骨格蛋白質によれば、第１の骨格蛋白質を保持するとともに、第２の骨格蛋白質を保持して、ＡＣＣ合成酵素（ＡＣＳ）と、ＡＣＣ酸化酵素（ＡＣＯ）を高度に集積化できる。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】酵素複合体ＳＯＣ６を模式的に示す図である。
【図2】大腸菌形質転換ベクターｐＥＴ－Ｓｃａ１の概念図である。
【図3】大腸菌形質転換ベクターｐＥＴ－Ｓｃａ２の概念図である。
【図4】大腸菌形質転換ベクターｐＥＴ－Ｓｃａ３の概念図である。
【図5】Ｓｃａ１とＡＣＣ合成酵素サブユニットの結合試験の結果を示す写真である。
【図6】Ｓｃａ１とＭＴＡ分解酵素サブユニットの結合試験の結果を示す写真である。
【図7】Ｓｃａ１とＳｃａ３の結合試験の結果を示す写真である。
【図8】Ｓｃａ２とＡＣＣ酸化酵素サブユニットの結合試験の結果を示す写真である。
【図9】Ｓｃａ２とＳｃａ３の結合試験の結果を示す写真である。
【図10】酵素複合体ＳＯＣ２９を模式的に示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本開示における好ましい実施の形態を説明する。
本開示の酵素複合体は、
ＡＣＣ合成酵素とドックリンドメインＤＡＣＳとを含むＡＣＣ合成酵素サブユニットと、
前記ドックリンドメインＤＡＣＳが結合するコヘシンドメインＣＡＣＳと、コヘシンドメインＣ１及びドックリンドメインＤ１のいずれかである第１結合ドメインと、を含む第１の骨格蛋白質と、
ＡＣＣ酸化酵素とドックリンドメインＤＡＣＯとを含むＡＣＣ酸化酵素サブユニットと、
前記ドックリンドメインＤＡＣＯが結合するコヘシンドメインＣＡＣＯと、コヘシンドメインＣ２及びドックリンドメインＤ２のいずれかである第２結合ドメインと、を含む第２の骨格蛋白質と、
コヘシンドメインＣ３及びドックリンドメインＤ３のいずれかである第３結合ドメインと、コヘシンドメインＣ４及びドックリンドメインＤ４のいずれかである第４結合ドメインと、を含む第３の骨格蛋白質と、を備え、
前記第３の骨格蛋白質は、
前記第３結合ドメインと前記第１結合ドメインとを介したコヘシン－ドックリン結合によって前記第１の骨格蛋白質を保持し、
前記第４結合ドメインと前記第２結合ドメインを介したコヘシン－ドックリン結合によって前記第２の骨格蛋白質を保持する。
本開示の酵素複合体は、
ＡＣＣ合成酵素とドックリンドメインＤＡＣＳとを含むＡＣＣ合成酵素サブユニットと、
前記ドックリンドメインＤＡＣＳが結合するコヘシンドメインＣＡＣＳと、コヘシンドメインＣ１及びドックリンドメインＤ１のいずれかである第１結合ドメインと、を含む第１の骨格蛋白質と、
ＡＣＣ酸化酵素とドックリンドメインＤＡＣＯとを含むＡＣＣ酸化酵素サブユニットと、
前記ドックリンドメインＤＡＣＯが結合するコヘシンドメインＣＡＣＯと、コヘシンドメインＣ２及びドックリンドメインＤ２のいずれかである第２結合ドメインと、を含む第２の骨格蛋白質と、
コヘシンドメインＣ３及びドックリンドメインＤ３のいずれかである第３結合ドメインと、コヘシンドメインＣ４及びドックリンドメインＤ４のいずれかである第４結合ドメインと、を含む第３の骨格蛋白質と、を備え、
前記第３の骨格蛋白質は、
前記第３結合ドメインと前記第１結合ドメインとを介したコヘシン－ドックリン結合によって前記第１の骨格蛋白質を保持し、
前記第４結合ドメインと前記第２結合ドメインを介したコヘシン－ドックリン結合によって前記第２の骨格蛋白質を保持する。
【0011】
この酵素複合体によれば、ＡＣＣ合成酵素（ＡＣＳ）と、ＡＣＣ酸化酵素（ＡＣＯ）を高度に集積化できる。このため、ＡＣＣ合成酵素と、ＡＣＣ酸化酵素の高効率な酵素反応を実現でき、エチレン生産能の向上が期待できる。
【0012】
本開示の酵素複合体において、ＡＣＣ合成酵素サブユニット数に対するＡＣＣ酸化酵素サブユニット数の比率（ＡＣＣ酸化酵素サブユニット数／ＡＣＣ合成酵素サブユニット数）が３以上であるとよい。ＡＣＣ合成酵素サブユニット数に対するＡＣＣ酸化酵素サブユニット数の比率が３以上であれば、より一層のエチレン生産能の向上が期待できる。
【0013】
本開示の酵素複合体において、コヘシンドメインＣ５及びドックリンドメインＤ５のいずれかである第５結合ドメインと、コヘシンドメインＣ６及びドックリンドメインＤ６のいずれかである第６結合ドメインと、を含む第４の骨格蛋白質、を更に備え、前記第３の骨格蛋白質は、少なくとも前記第４結合ドメインと前記第５結合ドメインを介したコヘシン－ドックリン結合によって前記第４の骨格蛋白質を保持し、前記第４の骨格蛋白質は、少なくとも前記第６結合ドメインと前記第２結合ドメインを介したコヘシン－ドックリン結合によって前記第２の骨格蛋白質を保持してもよい。この構成によれば、ＡＣＣ合成酵素と、ＡＣＣ酸化酵素をより高度に集積化できる。
【0014】
本開示の酵素複合体において、ＭＴＡ分解酵素とドックリンドメインＤＭＴＡＮとを含むＭＴＡ分解酵素サブユニットを更に備え、前記第１の骨格蛋白質は、前記ドックリンドメインＤＭＴＡＮが結合するコヘシンドメインＣＭＴＡＮを更に含んでもよい。メチルチオアデノシンをＭＴＡとも称する。この構成によれば、ＭＴＡ分解酵素（ＭＴＡＮ）によって、ＡＣＣ合成酵素の触媒反応時に阻害物質として作用し得るメチルチオアデノシン（ＭＴＡ）を分解することができる。よって、ＡＣＣ合成能の低下を抑制でき、エチレン生産能の向上に寄与できる。
【0015】
本開示の光合成生物は、上記の酵素複合体を産生するように形質転換した光合成生物であってもよい。この構成によれば、エチレン生産に有用な人工酵素複合体を産生する光合成生物を提供できる。当該光合成生物は、体内に存在するＳＡＭを利用して、人工酵素複合体によってエチレンを生産すると考えられる。よって、光合成可能な細菌や藻類に化石資源の使用等により排出された二酸化炭素を有用な資源であるエチレンに変換させるという、環境への負荷を軽減する物質循環を構築し得る。
【0016】
以下、本実施形態を詳しく説明する。なお、本明細書において、数値範囲について「～」を用いた記載では、特に断りがない限り、下限値及び上限値を含むものとする。例えば、「１０～２０」という記載では、下限値である「１０」、上限値である「２０」のいずれも含むものとする。すなわち、「１０～２０」は、「１０以上２０以下」と同じ意味である。
【0017】
１．酵素複合体ＳＯＣ６
図１に示すように、酵素複合体ＳＯＣ６は、ＡＣＣ合成酵素サブユニットと、第１の骨格蛋白質と、ＡＣＣ酸化酵素サブユニットと、第２の骨格蛋白質と、第３の骨格蛋白質と、を備える。第３の骨格蛋白質がアダプター骨格蛋白質に相当する。本実施形態の酵素複合体ＳＯＣ６は、ＭＴＡ分解酵素サブユニットを更に備えている。以下、ＡＣＣ合成酵素サブユニットをＡＣＳ－ＤＡＣＳとも称する。第１の骨格蛋白質をＳｃａ１とも称する。ＡＣＣ酸化酵素サブユニットをＡＣＯ－ＤＡＣＯとも称する。第２の骨格蛋白質をＳｃａ２とも称する。第３の骨格蛋白質をＳｃａ３とも称する。ＭＴＡ分解酵素サブユニットをＭＴＡＮ－ＤＭＴＡＮとも称する。
図１に示すように、酵素複合体ＳＯＣ６は、ＡＣＣ合成酵素サブユニットと、第１の骨格蛋白質と、ＡＣＣ酸化酵素サブユニットと、第２の骨格蛋白質と、第３の骨格蛋白質と、を備える。第３の骨格蛋白質がアダプター骨格蛋白質に相当する。本実施形態の酵素複合体ＳＯＣ６は、ＭＴＡ分解酵素サブユニットを更に備えている。以下、ＡＣＣ合成酵素サブユニットをＡＣＳ－ＤＡＣＳとも称する。第１の骨格蛋白質をＳｃａ１とも称する。ＡＣＣ酸化酵素サブユニットをＡＣＯ－ＤＡＣＯとも称する。第２の骨格蛋白質をＳｃａ２とも称する。第３の骨格蛋白質をＳｃａ３とも称する。ＭＴＡ分解酵素サブユニットをＭＴＡＮ－ＤＭＴＡＮとも称する。
【0018】
酵素複合体ＳＯＣ６は、１個の第１の骨格蛋白質、２個の第２の骨格蛋白質、１個の第３の骨格蛋白質を備えることによって、１個のＡＣＣ合成酵素サブユニット、４個のＡＣＣ酸化酵素サブユニット、１個のＭＴＡ分解酵素サブユニットの合計６個の酵素サブユニットを集積化できる。また、酵素複合体ＳＯＣ６は、コヘシン－ドックリン結合によって複合化されている。コヘシン－ドックリン結合は非常に強い結合親和性と高い結合特異性を有する。酵素複合体ＳＯＣ６は、結合特異性を有するコヘシン－ドックリン結合を複数組み合わせて用いることで、酵素の逐次的な反応に適した酵素サブユニットの数、配置を実現できる。
【0019】
（１）コヘシン－ドックリン結合
コヘシン－ドックリン結合を構成するコヘシンドメインとドックリンドメインは特に限定されない。コヘシンドメインはセルロソームのスキャフォールディンに含まれているドメインとして知られている。ドックリンドメインはセルロソームに含まれているドメインとして知られている。本開示のコヘシンドメインとドックリンドメインは、公知のセルロソームに由来するもの、将来明らかにされるセルロソームに由来するもの、及びこれらの修飾／改変体であってコヘシン－ドックリンの特異的結合性を維持するものを利用することができる。コヘシンドメインとドックリンドメインとしては、例えば、嫌気性細菌、嫌気性糸状菌が生産するセルロソームに由来するコヘシンドメインとドックリンドメインが挙げられる。コヘシンドメインとドックリンドメインの結合特異性を実現するために、同種の嫌気性細菌、嫌気性糸状菌等に由来するコヘシンドメインとドックリンドメインを採用することが好ましい。
コヘシン－ドックリン結合を構成するコヘシンドメインとドックリンドメインは特に限定されない。コヘシンドメインはセルロソームのスキャフォールディンに含まれているドメインとして知られている。ドックリンドメインはセルロソームに含まれているドメインとして知られている。本開示のコヘシンドメインとドックリンドメインは、公知のセルロソームに由来するもの、将来明らかにされるセルロソームに由来するもの、及びこれらの修飾／改変体であってコヘシン－ドックリンの特異的結合性を維持するものを利用することができる。コヘシンドメインとドックリンドメインとしては、例えば、嫌気性細菌、嫌気性糸状菌が生産するセルロソームに由来するコヘシンドメインとドックリンドメインが挙げられる。コヘシンドメインとドックリンドメインの結合特異性を実現するために、同種の嫌気性細菌、嫌気性糸状菌等に由来するコヘシンドメインとドックリンドメインを採用することが好ましい。
【0020】
嫌気性細菌として、Acetivibrio cellulolyticus、Bacteroides cellulosolvens、Butyrivibrio fibrisolvens、Clostridium acetobutylicum、Clostridium cellulovorans、Clostridium cellobioparum、Clostridium cellulolyticum、Clostridium josui、Clostridium papyrosolvens、Clostridium thermocellum、Ruminococcus albus、Ruminococcus flavefaciens、Ruminococcus succinogenesを例示することができる。嫌気性糸状菌としてNeocallimastrix frontalis、Neocallimastrix particiarum、Orpomyces sp.、Piromyces sp.を例示することができる。嫌気性細菌が生産するセルロソームに由来するコヘシンドメインがより好ましく、Clostridium thermocellum、Acetivibrio cellulolyticus、Ruminococcus flavefaciens、Clostridium josuiが生産するセルロソームに由来するコヘシンドメインとドックリンドメインが特に好ましい。
【0021】
また、同じ菌種由来のコヘシンドメインとドックリンドメインの組み合わせを複数採用する場合には、コヘシンドメインとドックリンドメインの種類を適宜選択することによって、結合特異性を有するコヘシン－ドックリン結合を複数構成できる。例えば、同じ菌種由来のコヘシンドメインとドックリンドメインの複数の組み合わせとして、以下の組み合わせが挙げられる。
＜Ruminococcus flavefaciens＞
FD-1 ScaC cohesinと、FD-1 Group3 dockerinの組み合わせ。
FD-1 ScaA cohesin1と、FD-1 Group1 dockerinの組み合わせ。
＜Clostridium thermocellum＞
CipA cohesin 3と、Cel48S Dockerinの組み合わせ。
SdbA typeII cohesinと、CipA typeII Dockerinの組み合わせ。
＜Ruminococcus flavefaciens＞
FD-1 ScaC cohesinと、FD-1 Group3 dockerinの組み合わせ。
FD-1 ScaA cohesin1と、FD-1 Group1 dockerinの組み合わせ。
＜Clostridium thermocellum＞
CipA cohesin 3と、Cel48S Dockerinの組み合わせ。
SdbA typeII cohesinと、CipA typeII Dockerinの組み合わせ。
【0022】
以下、ＡＣＣ合成酵素サブユニット、ＡＣＣ酸化酵素サブユニット、ＭＴＡ分解酵素サブユニットについて説明してから、第１の骨格蛋白質、第２の骨格蛋白質、第３の骨格蛋白質について説明する。
【0023】
（２）ＡＣＣ合成酵素サブユニット（ＡＣＳ－ＤＡＣＳ）
ＡＣＣ合成酵素サブユニットは、ＡＣＣ合成酵素とドックリンドメインＤＡＣＳとを含む。ＡＣＣ合成酵素サブユニットは、ＡＣＣ合成酵素の触媒作用が阻害されない限り、形質転換やベクターの構築等に利用した配列が残っていても良い。
ＡＣＣ合成酵素サブユニットは、ＡＣＣ合成酵素とドックリンドメインＤＡＣＳとを含む。ＡＣＣ合成酵素サブユニットは、ＡＣＣ合成酵素の触媒作用が阻害されない限り、形質転換やベクターの構築等に利用した配列が残っていても良い。
【0024】
ＡＣＣ合成酵素は、ＳＡＭを基質とし、ＡＣＣを生成する酵素である限り特に限定されない。公知のＡＣＣ合成酵素、将来明らかにされるＡＣＣ合成酵素、及びこれらの修飾／改変体であってＳＡＭを基質とし、ＡＣＣを生成する酵素を利用することができる。また、ＳＡＭを基質としＡＣＣを生成する反応以外の反応を触媒する多機能酵素も利用することができる。植物に由来するＡＣＣ合成酵素が好ましく、トマト、ポプラ、ヤエナリ、シロイヌナズナ、イネ、ジャガイモ、エンドウ、コムギ、タバコ、メロン、セイヨウナシ、キウイフルーツ、カーネーション、ゼラニウム、ラン、ペチュニア又はヒマワリに由来するＡＣＣ合成酵素がより好ましく、トマトに由来するＡＣＣ合成酵素が特に好ましい。
【0025】
ドックリンドメインＤＡＣＳは、後述するコヘシンドメインＣＡＣＳと特異的に結合できれば、特に限定されない。ドックリンドメインＤＡＣＳは、酵素複合体ＳＯＣ６を安定的に複合化する観点から、コヘシンドメインＣＡＣＯ、コヘシンドメインＣＭＴＡＮ、コヘシンドメインＣ１、コヘシンドメインＣ３、コヘシンドメインＣ４（Ｃ４－１，Ｃ４－２）とは特異的に結合しないことが好ましい。
【0026】
ＡＣＣ合成酵素サブユニットに含まれるＡＣＣ合成酵素の数は、特に限定されない。ＡＣＣ合成酵素サブユニットに含まれるＡＣＣ合成酵素の数は、１～３であることが好ましく、１～２であることがより好ましく、１であることが更に好ましい。ＡＣＣ合成酵素サブユニットに含まれるドックリンドメインＤＡＣＳの数は、例えば１つである。
【0027】
ＡＣＣ合成酵素サブユニットにおける、ＡＣＣ合成酵素とドックリンドメインＤＡＣＳは直接連結されて良いし、ＡＣＣ合成酵素とドックリンドメインＤＡＣＳ間にリンカーを介在させても良い。ＡＣＣ合成酵素サブユニットにＡＣＣ合成酵素が複数含まれる場合、ＡＣＣ合成酵素同士はリンカーを介して連結することが好ましい。リンカーを介在させることでＡＣＣ合成酵素の自由度が確保できると考えられる。リンカーを介在させる場合、リンカーは、酵素複合体ＳＯＣ６に含まれる酵素の逐次的な反応を維持できるものであることが好ましい。リンカーはアミノ酸配列が好ましい。リンカーをアミノ酸配列とし、ＡＣＣ合成酵素サブユニットの一部としてＡＣＣ合成酵素及びドックリンドメインＤＡＣＳと共に翻訳させる実施形態がより好ましい。リンカーがアミノ酸配列で構成される場合、リンカーを構成するアミノ酸数は５～１５個であることが好ましく、６～１２個であることがより好ましく、７～９個であることが特に好ましい。また、セルロソームに含まれるドックリンネイティブのリンカーを使用することも好ましい。
【0028】
（３）ＡＣＣ酸化酵素サブユニット（ＡＣＯ－ＤＡＣＯ）
ＡＣＣ酸化酵素サブユニットは、ＡＣＣ酸化酵素とドックリンドメインＤＡＣＯとを含む。ＡＣＣ酸化酵素サブユニットは、ＡＣＣ酸化酵素の触媒作用が阻害されない限り、形質転換やベクターの構築等に利用した配列が残っていても良い。
ＡＣＣ酸化酵素サブユニットは、ＡＣＣ酸化酵素とドックリンドメインＤＡＣＯとを含む。ＡＣＣ酸化酵素サブユニットは、ＡＣＣ酸化酵素の触媒作用が阻害されない限り、形質転換やベクターの構築等に利用した配列が残っていても良い。
【0029】
ＡＣＣ酸化酵素は、ＡＣＣを基質とし、エチレンを生成する酵素である限り特に限定されない。公知のＡＣＣ酸化酵素、将来明らかにされるＡＣＣ酸化酵素、及びこれらの修飾／改変体であってＡＣＣを基質とし、エチレンを生成する酵素を利用することができる。また、ＡＣＣを基質としエチレンを生成する反応以外の反応を触媒する多機能酵素も利用することができる。植物に由来するＡＣＣ酸化酵素が好ましく、トマト、キュウリ、バナナ、パッションフリーツ、カーネーション、又はセイヨウナシに由来するＡＣＣ酸化酵素がより好ましく、トマトに由来するＡＣＣ酸化酵素が特に好ましい。
【0030】
ドックリンドメインＤＡＣＯは、後述するコヘシンドメインＣＡＣＯと特異的に結合できれば、特に限定されない。ドックリンドメインＤＡＣＯは、酵素複合体ＳＯＣ６を安定的に複合化する観点から、コヘシンドメインＣＡＣＳ、コヘシンドメインＣＭＴＡＮ、コヘシンドメインＣ１、コヘシンドメインＣ３、コヘシンドメインＣ４（Ｃ４－１，Ｃ４－２）とは特異的に結合しないことが好ましい。
【0031】
ＡＣＣ酸化酵素サブユニットに含まれるＡＣＣ酸化酵素の数は、特に限定されない。ＡＣＣ酸化酵素サブユニットに含まれるＡＣＣ酸化酵素の数は、１～３であることが好ましく、１～２であることがより好ましく、１であることが更に好ましい。ＡＣＣ酸化酵素サブユニットに含まれるドックリンドメインＤＡＣＯの数は、例えば１つである。
【0032】
ＡＣＣ酸化酵素サブユニットにおける、ＡＣＣ酸化酵素とドックリンドメインＤＡＣＯは直接連結されて良いし、ＡＣＣ酸化酵素とドックリンドメインＤＡＣＯ間にリンカーを介在させても良い。ＡＣＣ酸化酵素サブユニットにＡＣＣ酸化酵素が複数含まれる場合、ＡＣＣ酸化酵素同士はリンカーを介して連結することが好ましい。リンカーを介在させることでＡＣＣ酸化酵素の自由度が確保できると考えられる。リンカーを介在させる場合、リンカーは、酵素複合体ＳＯＣ６に含まれる酵素の逐次的な反応を維持できるものであることが好ましい。リンカーはアミノ酸配列が好ましい。リンカーをアミノ酸配列とし、ＡＣＣ酸化酵素サブユニットの一部としてＡＣＣ酸化酵素及びドックリンドメインＤＡＣＯと共に翻訳させる実施形態がより好ましい。リンカーがアミノ酸配列で構成される場合、リンカーを構成するアミノ酸数は５～１５個であることが好ましく、６～１２個であることがより好ましく、７～９個であることが特に好ましい。また、セルロソームに含まれるドックリンネイティブのリンカーを使用することも好ましい。
【0033】
（４）ＭＴＡ分解酵素サブユニット（ＭＴＡＮ－ＤＭＴＡＮ）
ＭＴＡ分解酵素サブユニットは、ＭＴＡ分解酵素とドックリンドメインＤＭＴＡＮとを含む。ＭＴＡ分解酵素サブユニットは、ＭＴＡ分解酵素の触媒作用が阻害されない限り、形質転換やベクターの構築等に利用した配列が残っていても良い。
ＭＴＡ分解酵素サブユニットは、ＭＴＡ分解酵素とドックリンドメインＤＭＴＡＮとを含む。ＭＴＡ分解酵素サブユニットは、ＭＴＡ分解酵素の触媒作用が阻害されない限り、形質転換やベクターの構築等に利用した配列が残っていても良い。
【0034】
ＭＴＡ分解酵素は、ＭＴＡをメチルチオリボースへ加水分解させる酵素である限り特に限定されない。ＭＴＡは、ＳＡＭからＡＣＣが合成される際の反応副産物として生成され得る。公知のＭＴＡ分解酵素、将来明らかにされるＭＴＡ分解酵素、及びこれらの修飾／改変体であってＭＴＡをメチルチオリボースへ加水分解させる酵素を利用することができる。植物に由来するＭＴＡ分解酵素が好ましく、シロイヌナズナに由来するＭＴＡ分解酵素がより好ましい。
【0035】
ドックリンドメインＤＭＴＡＮは、後述するコヘシンドメインＣＭＴＡＮと特異的に結合できれば、特に限定されない。ドックリンドメインＤＭＴＡＮは、酵素複合体ＳＯＣ６を安定的に複合化する観点から、コヘシンドメインＣＡＣＳ、コヘシンドメインＣＡＣＯ、コヘシンドメインＣ１、コヘシンドメインＣ３、コヘシンドメインＣ４（Ｃ４－１，Ｃ４－２）とは特異的に結合しないことが好ましい。
【0036】
ＭＴＡ分解酵素サブユニットに含まれるＭＴＡ分解酵素の数は、特に限定されない。ＭＴＡ分解酵素サブユニットに含まれるＭＴＡ分解酵素の数は、１～３であることが好ましく、１～２であることがより好ましく、１であることが更に好ましい。ＡＣＣ合成酵素サブユニットに含まれるドックリンドメインＤＭＴＡＮの数は、例えば１つである。
【0037】
ＭＴＡ分解酵素サブユニットにおける、ＭＴＡ分解酵素とドックリンドメインＤＭＴＡＮは直接連結されて良いし、ＭＴＡ分解酵素とドックリンドメインＤＭＴＡＮ間にリンカーを介在させても良い。ＭＴＡ分解酵素サブユニットにＭＴＡ分解酵素が複数含まれる場合、ＭＴＡ分解酵素同士はリンカーを介して連結することが好ましい。リンカーを介在させることでＭＴＡ分解酵素の自由度が確保できると考えられる。リンカーを介在させる場合、リンカーは、酵素複合体ＳＯＣ６に含まれる酵素の逐次的な反応を維持できるものであることが好ましい。リンカーはアミノ酸配列が好ましい。リンカーをアミノ酸配列とし、ＭＴＡ分解酵素サブユニットの一部としてＭＴＡ分解酵素及びドックリンドメインＤＭＴＡＮと共に翻訳させる実施形態がより好ましい。リンカーがアミノ酸配列で構成される場合、リンカーを構成するアミノ酸数は５～１５個であることが好ましく、６～１２個であることがより好ましく、７～９個であることが特に好ましい。また、セルロソームに含まれるドックリンネイティブのリンカーを使用することも好ましい。
【0038】
（５）第１の骨格蛋白質（Ｓｃａ１）
第１の骨格蛋白質は、ドックリンドメインＤＡＣＳが結合するコヘシンドメインＣＡＣＳと、コヘシンドメインＣ１及びドックリンドメインＤ１のいずれかである第１結合ドメインと、を含む。本実施形態の第１の骨格蛋白質Ｓｃａ１は、後述するドックリンドメインＤＭＴＡＮが結合するコヘシンドメインＣＭＴＡＮを更に含んでいる。
第１の骨格蛋白質は、ドックリンドメインＤＡＣＳが結合するコヘシンドメインＣＡＣＳと、コヘシンドメインＣ１及びドックリンドメインＤ１のいずれかである第１結合ドメインと、を含む。本実施形態の第１の骨格蛋白質Ｓｃａ１は、後述するドックリンドメインＤＭＴＡＮが結合するコヘシンドメインＣＭＴＡＮを更に含んでいる。
【0039】
コヘシンドメインＣＡＣＳは、ドックリンドメインＤＡＣＳと特異的に結合できれば、特に限定されない。コヘシンドメインＣＡＣＳは、酵素複合体ＳＯＣ６を安定的に複合化する観点から、ドックリンドメインＤＡＣＯ、ドックリンドメインＤＭＴＡＮ、ドックリンドメインＤ２、ドックリンドメインＤ３とは特異的に結合しないことが好ましい。
【0040】
第１結合ドメインは、コヘシン－ドックリン結合によって第３の骨格蛋白質に保持される結合ドメインである。図１のように、第１結合ドメインとしてコヘシンドメインＣ１を含んでいる場合には、後述する第３の骨格蛋白質の第３結合ドメインとして、コヘシンドメインＣ１と結合するドックリンドメインＤ３を採用する。他方、第１の骨格蛋白質Ｓｃａ１が、第１結合ドメインとしてドックリンドメインＤ１を含む場合には、後述する第３の骨格蛋白質の第３結合ドメインとして、ドックリンドメインＤ１と結合するコヘシンドメインＣ３を採用すればよい。以下、第１結合ドメインとしてコヘシンドメインＣ１を含んでいる場合について説明して、ドックリンドメインＤ１を含んでいる場合についての説明を省略する。
【0041】
コヘシンドメインＣ１は、ドックリンドメインＤ３と特異的に結合できれば、特に限定されない。コヘシンドメインＣ１は、酵素複合体ＳＯＣ６を安定的に複合化する観点から、ドックリンドメインＤＡＣＯ、ドックリンドメインＤＭＴＡＮ、ドックリンドメインＤ２、ドックリンドメインＤ３とは特異的に結合しないことが好ましい。
【0042】
コヘシンドメインＣＭＴＡＮは、ドックリンドメインＤＭＴＡＮと特異的に結合できれば、特に限定されない。コヘシンドメインＣＭＴＡＮは、酵素複合体ＳＯＣ６を安定的に複合化する観点から、ドックリンドメインＤＡＣＳ、ドックリンドメインＤＡＣＯ、ドックリンドメインＤ２、ドックリンドメインＤ３とは特異的に結合しないことが好ましい。
【0043】
第１の骨格蛋白質に含まれるコヘシンドメインＣＡＣＳの数は、特に限定されない。第１の骨格蛋白質に含まれるコヘシンドメインＣＡＣＳの数は、１～３であることが好ましく、１～２であることがより好ましく、１であることが更に好ましい。第１の骨格蛋白質に含まれるコヘシンドメインＣＭＴＡＮの数は、特に限定されない。第１の骨格蛋白質に含まれるコヘシンドメインＣＭＴＡＮの数は、１～３であることが好ましく、１～２であることがより好ましく、１であることが更に好ましい。第１の骨格蛋白質に含まれるコヘシンドメインＣ１の数は、例えば１つである。
【0044】
第１の骨格蛋白質における、コヘシンドメインＣＡＣＳと、コヘシンドメインＣＭＴＡＮと、コヘシンドメインＣ１の並び順は特に限定されない。これらの並び順は、コヘシンドメインＣ１が端にあることが好ましく、コヘシンドメインＣＡＣＳ、コヘシンドメインＣＭＴＡＮ、コヘシンドメインＣ１の順がより好ましい。
【0045】
第１の骨格蛋白質における、各コヘシンドメインは直接連結されて良いし、隣り合うコヘシンドメイン間にリンカーを介在させても良い。コヘシンドメインＣＡＣＳ、コヘシンドメインＣＭＴＡＮ、コヘシンドメインＣ１の順に並ぶ場合において、コヘシンドメインＣＡＣＳとコヘシンドメインＣＭＴＡＮはリンカーを介して連結することが好ましい。リンカーを介在させることで、ＡＣＣ合成酵素と、ＭＴＡ分解酵素の自由度が確保できると考えられる。リンカーを介在させる場合、リンカーは、酵素複合体ＳＯＣ６に含まれる酵素の逐次的な反応を維持できるものであることが好ましい。リンカーはアミノ酸配列が好ましい。リンカーをアミノ酸配列とし、第１の骨格蛋白質の一部としてコヘシンドメインＣＡＣＳ、コヘシンドメインＣＭＴＡＮ、コヘシンドメインＣ１と共に翻訳させる実施形態がより好ましい。隣り合うコヘシンドメインＣＡＣＳとコヘシンドメインＣＭＴＡＮのリンカーがアミノ酸配列で構成される場合、リンカーを構成するアミノ酸数は７～１７個であることが好ましく、８～１４個であることがより好ましく、９～１１個であることが特に好ましい。隣り合うコヘシンドメインＣＭＴＡＮとコヘシンドメインＣ１のリンカーがアミノ酸配列で構成される場合、リンカーを構成するアミノ酸数は１２～２１個であることが好ましく、１３～１９個であることがより好ましく、１４～１６個であることが特に好ましい。また、セルロソームに含まれるネイティブのリンカーを使用することも好ましい。
【0046】
（６）第２の骨格蛋白質（Ｓｃａ２）
第２の骨格蛋白質は、ドックリンドメインＤＡＣＯが結合するコヘシンドメインＣＡＣＯと、コヘシンドメインＣ２及びドックリンドメインＤ２のいずれかである第２結合ドメインと、を含む。
第２の骨格蛋白質は、ドックリンドメインＤＡＣＯが結合するコヘシンドメインＣＡＣＯと、コヘシンドメインＣ２及びドックリンドメインＤ２のいずれかである第２結合ドメインと、を含む。
【0047】
コヘシンドメインＣＡＣＯは、ドックリンドメインＤＡＣＯと特異的に結合できれば、特に限定されない。コヘシンドメインＣＡＣＯは、酵素複合体ＳＯＣ６を安定的に複合化する観点から、ドックリンドメインＤＡＣＳ、ドックリンドメインＤＭＴＡＮ、ドックリンドメインＤ２、ドックリンドメインＤ３とは特異的に結合しないことが好ましい。
【0048】
第２結合ドメインは、コヘシン－ドックリン結合によって第３の骨格蛋白質に保持される結合ドメインである。図１のように、第２結合ドメインとしてドックリンドメインＤ２を含んでいる場合には、後述する第３の骨格蛋白質の第４結合ドメインとして、ドックリンドメインＤ２と結合するコヘシンドメインＣ４（Ｃ４－１，Ｃ４－２）を採用する。他方、第２の骨格蛋白質Ｓｃａ２が、第２結合ドメインとしてコヘシンドメインＣ２を含む場合には、後述する第３の骨格蛋白質の第４結合ドメインとして、コヘシンドメインＣ２と結合するドックリンドメインＤ４を採用すればよい。以下、第２結合ドメインとしてドックリンドメインＤ２を含んでいる場合について説明して、コヘシンドメインＣ２を含んでいる場合についての説明を省略する。
【0049】
ドックリンドメインＤ２は、コヘシンドメインＣ４（Ｃ４－１，Ｃ４－２）と特異的に結合できれば、特に限定されない。ドックリンドメインＤ２は、酵素複合体ＳＯＣ６を安定的に複合化する観点から、コヘシンドメインＣＡＣＳ、コヘシンドメインＣＡＣＯ、コヘシンドメインＣＭＴＡＮ、コヘシンドメインＣ１、コヘシンドメインＣ３とは特異的に結合しないことが好ましい。コヘシンドメインＤ２として、同じ種のセルロソームのスキャフォールディンに含まれる複数のコヘシンドメインにそれぞれ結合できるドックリンドメインであることが好ましく、例えば、Ruminococcus flavefaciensに由来するドックリンドメインを採用できる。
【0050】
第２の骨格蛋白質に含まれるコヘシンドメインＣＡＣＯの数は、特に限定されない。第２の骨格蛋白質に含まれるコヘシンドメインＣＡＣＯの数は、１～５であることが好ましく、１～４であることがより好ましく、２～３であることが更に好ましい。第２の骨格蛋白質に含まれるドックリンドメインＤ２の数は、例えば１つである。
【0051】
第２の骨格蛋白質における、コヘシンドメインＣＡＣＯとドックリンドメインＤ２は直接連結されて良いし、コヘシンドメインＣＡＣＯとドックリンドメインＤ２間にリンカーを介在させても良い。第２の骨格蛋白質にコヘシンドメインＣＡＣＯが複数含まれる場合、コヘシンドメインＣＡＣＯ同士はリンカーを介して連結することが好ましい。リンカーを介在させることでＡＣＣ酸化酵素の自由度が確保できると考えられる。リンカーを介在させる場合、リンカーは、酵素複合体ＳＯＣ６に含まれる酵素の逐次的な反応を維持できるものであることが好ましい。リンカーはアミノ酸配列が好ましい。リンカーをアミノ酸配列とし、第２の骨格蛋白質の一部としてコヘシンドメインＣＡＣＯ及びドックリンドメインＤ２と共に翻訳させる実施形態がより好ましい。リンカーがアミノ酸配列で構成される場合、リンカーを構成するアミノ酸数は１～７個であることが好ましく、１～５個であることがより好ましく、１～３個であることが特に好ましい。また、セルロソームに含まれるドックリンネイティブのリンカーを使用することも好ましい。
【0052】
（７）第３の骨格蛋白質（Ｓｃａ３）
本開示の第３の骨格蛋白質は、第１の骨格蛋白質を保持するとともに、第２の骨格蛋白質を保持するアダプター骨格蛋白質である。第３の骨格蛋白質は、コヘシンドメインＣ３及びドックリンドメインＤ３のいずれかである第３結合ドメインと、コヘシンドメインＣ４及びドックリンドメインＤ４のいずれかである第４結合ドメインと、を含む。酵素複合体ＳＯＣ６では、第３結合ドメインとしてドックリンドメインＤ３を採用し、第４結合ドメインとしてコヘシンドメインＣ４（Ｃ４－１，Ｃ４－２）を採用する。
本開示の第３の骨格蛋白質は、第１の骨格蛋白質を保持するとともに、第２の骨格蛋白質を保持するアダプター骨格蛋白質である。第３の骨格蛋白質は、コヘシンドメインＣ３及びドックリンドメインＤ３のいずれかである第３結合ドメインと、コヘシンドメインＣ４及びドックリンドメインＤ４のいずれかである第４結合ドメインと、を含む。酵素複合体ＳＯＣ６では、第３結合ドメインとしてドックリンドメインＤ３を採用し、第４結合ドメインとしてコヘシンドメインＣ４（Ｃ４－１，Ｃ４－２）を採用する。
【0053】
第３の骨格蛋白質は、第３結合ドメインと第１結合ドメインとを介したコヘシン－ドックリン結合によって第１の骨格蛋白質を保持する。第３結合ドメインと第１結合ドメインは、コヘシン－ドックリン結合によって直接連結されてもよく、コヘシン－ドックリン結合によって間接的に連結されてもよい。図１の酵素複合体ＳＯＣ６は、第３結合ドメインであるドックリンドメインＤ３と第１結合ドメインであるコヘシンドメインＣ１が、コヘシン－ドックリン結合によって直接連結される。
【0054】
第３の骨格蛋白質は、第４結合ドメインと第２結合ドメインを介したコヘシン－ドックリン結合によって第２の骨格蛋白質を保持する。第４結合ドメインと第２結合ドメインは、コヘシン－ドックリン結合によって直接連結されてもよく、コヘシン－ドックリン結合によって間接的に連結されてもよい。図１の酵素複合体ＳＯＣ６は、第４結合ドメインであるコヘシンドメインＣ４（Ｃ４－１，Ｃ４－２）と第２結合ドメインであるドックリンドメインＤ２が、コヘシン－ドックリン結合によって直接連結される。
【0055】
ドックリンドメインＤ３は、コヘシンドメインＣ１と特異的に結合できれば、特に限定されない。ドックリンドメインＤ３は、酵素複合体ＳＯＣ６を安定的に複合化する観点から、コヘシンドメインＣＡＣＳ、コヘシンドメインＣＡＣＯ、コヘシンドメインＣＭＴＡＮ、コヘシンドメインＣ４（Ｃ４－１，Ｃ４－２）とは特異的に結合しないことが好ましい。
【0056】
コヘシンドメインＣ４は、ドックリンドメインＤ２と特異的に結合できれば、特に限定されない。本実施形態では、コヘシンドメインＣ４として、一部に異なるアミノ酸配列を有するコヘシンドメインＣ４－１とコヘシンドメインＣ４－２を例示する。コヘシンドメインＣ４－１とコヘシンドメインＣ４－２を区別しない場合には、単にコヘシンドメインＣ４とも称する。コヘシンドメインＣ４－１，Ｃ４－２は、酵素複合体ＳＯＣ６を安定的に複合化する観点から、ドックリンドメインＤＡＣＳ、ドックリンドメインＤＡＣＯ、ドックリンドメインＤＭＴＡＮ、ドックリンドメインＤ３とは特異的に結合しないことが好ましい。コヘシンドメインＣ４－１，Ｃ４－２として、同じ種のセルロソームのスキャフォールディンに含まれるコヘシンドメインが好ましく、例えば、Ruminococcus flavefaciensに由来するコヘシンドメインを採用できる。
【0057】
第３の骨格蛋白質に含まれるドックリンドメインＤ３の数は、特に限定されない。第３の骨格蛋白質に含まれるドックリンドメインＤ３の数は、１～３であることが好ましく、１～２であることがより好ましく、１であることが更に好ましい。
【0058】
第３の骨格蛋白質に含まれるコヘシンドメインＣ４の数は、特に限定されない。第３の骨格蛋白質に含まれるコヘシンドメインＣ４の数は、１～４であることが好ましく、１～３であることがより好ましく、２であることが更に好ましい。
【0059】
第３の骨格蛋白質における、ドックリンドメインＤ３とコヘシンドメインＣ４はリンカーを介して連結することが好ましい。第３の骨格蛋白質にコヘシンドメインＣ４が複数含まれる場合、コヘシンドメインＣ４同士はリンカーを介して連結することが好ましい。リンカーを介在させることで、第１の骨格蛋白質と第２の骨格蛋白質、及び／又は、第２の骨格蛋白質同士を干渉させることなく保持できると考えられる。リンカーを介在させる場合、リンカーは、酵素複合体ＳＯＣ６に含まれる酵素の逐次的な反応を維持できるものであることが好ましい。リンカーはアミノ酸配列が好ましい。リンカーをアミノ酸配列とし、第３の骨格蛋白質の一部としてドックリンドメインＤ３とコヘシンドメインＣ４と共に翻訳させる実施形態がより好ましい。リンカーがアミノ酸配列で構成される場合、リンカーを構成するアミノ酸数は８～２１個であることが好ましく、９～１９個であることがより好ましく、１２～１７個であることが特に好ましい。また、セルロソームに含まれるドックリンネイティブのリンカーを使用することも好ましい。
【0060】
２．酵素複合体ＳＯＣ２９
図１０に示すように、酵素複合体ＳＯＣ２９は、ＡＣＣ合成酵素サブユニットと、第１の骨格蛋白質と、ＡＣＣ酸化酵素サブユニットと、第２の骨格蛋白質と、第３の骨格蛋白質と、第４の骨格蛋白質と、を備える。第３の骨格蛋白質又は第４の骨格蛋白質は、アダプター骨格蛋白質に相当する。以下の説明では、第３の骨格蛋白質がアダプター骨格蛋白質に相当するとして、コヘシン－ドックリン結合の態様について説明する。また、本実施形態の酵素複合体ＳＯＣ２９は、ＭＴＡ分解酵素サブユニットを更に備えている。
図１０に示すように、酵素複合体ＳＯＣ２９は、ＡＣＣ合成酵素サブユニットと、第１の骨格蛋白質と、ＡＣＣ酸化酵素サブユニットと、第２の骨格蛋白質と、第３の骨格蛋白質と、第４の骨格蛋白質と、を備える。第３の骨格蛋白質又は第４の骨格蛋白質は、アダプター骨格蛋白質に相当する。以下の説明では、第３の骨格蛋白質がアダプター骨格蛋白質に相当するとして、コヘシン－ドックリン結合の態様について説明する。また、本実施形態の酵素複合体ＳＯＣ２９は、ＭＴＡ分解酵素サブユニットを更に備えている。
【0061】
酵素複合体ＳＯＣ２９は、１個の第１の骨格蛋白質、９個の第２の骨格蛋白質、１個の第３の骨格蛋白質、３個の第４の骨格蛋白質、を備えることによって、１個のＡＣＣ合成酵素サブユニット、２７個のＡＣＣ酸化酵素サブユニット、１個のＭＴＡ分解酵素サブユニットの合計２９個の酵素サブユニットを集積化できる。酵素複合体ＳＯＣ２９は、第２の骨格蛋白質と第３の骨格蛋白質との間に、第４の骨格蛋白質が介在している点で、酵素複合体ＳＯＣ６と相違する。酵素複合体ＳＯＣ２９は、第４の骨格蛋白質を介在させることで、並列した第２の骨格蛋白質の群を第３の骨格蛋白質に接続できる。このため、ＡＣＣ酸化酵素をより一層高度に集積化できる。
【0062】
酵素複合体ＳＯＣ２９は、酵素複合体ＳＯＣ６と同様のＡＣＣ合成酵素サブユニット、第１の骨格蛋白質、ＡＣＣ酸化酵素サブユニット、第２の骨格蛋白質、ＭＴＡ分解酵素サブユニットを備えている。コヘシン－ドックリン結合、各酵素サブユニット、第１の骨格蛋白質、第２の骨格蛋白質については酵素複合体ＳＯＣ６の説明をそのまま適用する。
【0063】
（１）第３の骨格蛋白質（Ｓｃａ３）
第３の骨格蛋白質は、コヘシンドメインＣ３及びドックリンドメインＤ３のいずれかである第３結合ドメインと、コヘシンドメインＣ４及びドックリンドメインＤ４のいずれかである第４結合ドメインと、を含む。酵素複合体ＳＯＣ２９では、図１０のように、第３結合ドメインとしてドックリンドメインＤ３を採用し、第４結合ドメインとしてコヘシンドメインＣ４（Ｃ４－３）を採用する。
第３の骨格蛋白質は、コヘシンドメインＣ３及びドックリンドメインＤ３のいずれかである第３結合ドメインと、コヘシンドメインＣ４及びドックリンドメインＤ４のいずれかである第４結合ドメインと、を含む。酵素複合体ＳＯＣ２９では、図１０のように、第３結合ドメインとしてドックリンドメインＤ３を採用し、第４結合ドメインとしてコヘシンドメインＣ４（Ｃ４－３）を採用する。
【0064】
第３の骨格蛋白質は、第３結合ドメインと第１結合ドメインとを介したコヘシン－ドックリン結合によって第１の骨格蛋白質を保持する。第３結合ドメインと第１結合ドメインは、コヘシン－ドックリン結合によって直接連結されてもよく、コヘシン－ドックリン結合によって間接的に連結されてもよい。図１０の酵素複合体ＳＯＣ２９は、第３結合ドメインであるドックリンドメインＤ３と第１結合ドメインであるコヘシンドメインＣ１が、コヘシン－ドックリン結合によって直接連結される。
【0065】
第３の骨格蛋白質は、第４結合ドメインと第２結合ドメインを介したコヘシン－ドックリン結合によって第２の骨格蛋白質を保持する。第４結合ドメインと第２結合ドメインは、コヘシン－ドックリン結合によって直接連結されてもよく、コヘシン－ドックリン結合によって間接的に連結されてもよい。図１０の酵素複合体ＳＯＣ２９は、第４結合ドメインであるコヘシンドメインＣ４（Ｃ４－３）と第２結合ドメインであるドックリンドメインＤ２が、第４骨格蛋白質を介在したコヘシン－ドックリン結合によって間接的に連結される。すなわち、コヘシンドメインＣ４（Ｃ４－３）が第４骨格蛋白質のドックリンドメインＤ５とコヘシン－ドックリン結合によって連結され、第４骨格蛋白質のコヘシンドメインＣ４（Ｃ４－３）とドックリンドメインＤ２が連結される。
【0066】
ドックリンドメインＤ３は、コヘシンドメインＣ１と特異的に結合できれば、特に限定されない。ドックリンドメインＤ３は、酵素複合体ＳＯＣ２９を安定的に複合化する観点から、コヘシンドメインＣＡＣＳ、コヘシンドメインＣＡＣＯ、コヘシンドメインＣＭＴＡＮ、コヘシンドメインＣ４（Ｃ４－３）、コヘシンドメインＣ６とは特異的に結合しないことが好ましい。
【0067】
コヘシンドメインＣ４（Ｃ４－３）は、ドックリンドメインＤ５と特異的に結合できれば、特に限定されない。コヘシンドメインＣ４（Ｃ４－３）は、酵素複合体ＳＯＣ２９を安定的に複合化する観点から、ドックリンドメインＤＡＣＳ、ドックリンドメインＤＡＣＯ、ドックリンドメインＤＭＴＡＮ、ドックリンドメインＤ２、ドックリンドメインＤ３とは特異的に結合しないことが好ましい。
【0068】
第３の骨格蛋白質に含まれるドックリンドメインＤ３の数は、特に限定されない。第３の骨格蛋白質に含まれるドックリンドメインＤ３の数は、１～３であることが好ましく、１～２であることがより好ましく、１であることが更に好ましい。
【0069】
第３の骨格蛋白質に含まれるコヘシンドメインＣ４の数は、特に限定されない。第３の骨格蛋白質に含まれるコヘシンドメインＣ４の数は、１～５であることが好ましく、２～４であることがより好ましく、３であることが更に好ましい。
【0070】
第３の骨格蛋白質における、ドックリンドメインＤ３とコヘシンドメインＣ４はリンカーを介して連結することが好ましい。第３の骨格蛋白質にコヘシンドメインＣ４が複数含まれる場合、コヘシンドメインＣ４同士はリンカーを介して連結することが好ましい。リンカーを介在させることで、第１の骨格蛋白質と第４の骨格蛋白質、及び／又は、第４の骨格蛋白質同士を干渉させることなく保持できると考えられる。リンカーを介在させる場合、リンカーは、酵素複合体ＳＯＣ２９に含まれる酵素の逐次的な反応を維持できるものであることが好ましい。リンカーはアミノ酸配列が好ましい。リンカーをアミノ酸配列とし、第３の骨格蛋白質の一部としてドックリンドメインＤ３とコヘシンドメインＣ４と共に翻訳させる実施形態がより好ましい。リンカーがアミノ酸配列で構成される場合、リンカーを構成するアミノ酸数は８～２１個であることが好ましく、９～１９個であることがより好ましく、１２～１７個であることが特に好ましい。また、セルロソームに含まれるドックリンネイティブのリンカーを使用することも好ましい。
【0071】
（２）第４の骨格蛋白質（Ｓｃａ４）
第４の骨格蛋白質は、コヘシンドメインＣ５及びドックリンドメインＤ５のいずれかである第５結合ドメインと、コヘシンドメインＣ６及びドックリンドメインＤ６のいずれかである第６結合ドメインと、を含む。酵素複合体ＳＯＣ２９では、図１０のように、第５結合ドメインとしてドックリンドメインＤ５を採用し、第６結合ドメインとしてコヘシンドメインＣ６を採用する。
第４の骨格蛋白質は、コヘシンドメインＣ５及びドックリンドメインＤ５のいずれかである第５結合ドメインと、コヘシンドメインＣ６及びドックリンドメインＤ６のいずれかである第６結合ドメインと、を含む。酵素複合体ＳＯＣ２９では、図１０のように、第５結合ドメインとしてドックリンドメインＤ５を採用し、第６結合ドメインとしてコヘシンドメインＣ６を採用する。
【0072】
ドックリンドメインＤ５は、コヘシンドメインＣ４（Ｃ４－３）と特異的に結合できれば、特に限定されない。ドックリンドメインＤ５は、酵素複合体ＳＯＣ２９を安定的に複合化する観点から、コヘシンドメインＣＡＣＳ、コヘシンドメインＣＡＣＯ、コヘシンドメインＣＭＴＡＮ、コヘシンドメインＣ１、コヘシンドメインＣ６とは特異的に結合しないことが好ましい。
【0073】
第４の骨格蛋白質は、第６結合ドメインと第２結合ドメインを介したコヘシン－ドックリン結合によって第２の骨格蛋白質を保持する。第６結合ドメインと第２結合ドメインは、コヘシン－ドックリン結合によって直接連結されてもよく、コヘシン－ドックリン結合によって間接的に連結されてもよい。図１０の酵素複合体ＳＯＣ２９は、第６結合ドメインであるコヘシンドメインＣ６と第２結合ドメインであるドックリンドメインＤ２が、コヘシン－ドックリン結合によって直接連結される。
【0074】
コヘシンドメインＣ６は、ドックリンドメインＤ２と特異的に結合できれば、特に限定されない。コヘシンドメインＣ６は、酵素複合体ＳＯＣ２９を安定的に複合化する観点から、ドックリンドメインＤＡＣＳ、ドックリンドメインＤＡＣＯ、ドックリンドメインＤＭＴＡＮ、ドックリンドメインＤ３、ドックリンドメインＤ５とは特異的に結合しないことが好ましい。
【0075】
第４の骨格蛋白質に含まれるドックリンドメインＤ５の数は、特に限定されない。第４の骨格蛋白質に含まれるドックリンドメインＤ５の数は、１～３であることが好ましく、１～２であることがより好ましく、１であることが更に好ましい。
【0076】
第４の骨格蛋白質に含まれるコヘシンドメインＣ６の数は、特に限定されない。第４の骨格蛋白質に含まれるコヘシンドメインＣ６の数は、１～５であることが好ましく、２～４であることがより好ましく、３であることが更に好ましい。
【0077】
第４の骨格蛋白質における、ドックリンドメインＤ５とコヘシンドメインＣ６はリンカーを介して連結することが好ましい。第４の骨格蛋白質にコヘシンドメインＣ６が複数含まれる場合、コヘシンドメインＣ６同士はリンカーを介して連結することが好ましい。リンカーを介在させることで、第３の骨格蛋白質と第２の骨格蛋白質、及び／又は、第２の骨格蛋白質同士を干渉させることなく保持できると考えられる。リンカーを介在させる場合、リンカーは、酵素複合体ＳＯＣ２９に含まれる酵素の逐次的な反応を維持できるものであることが好ましい。リンカーはアミノ酸配列が好ましい。リンカーをアミノ酸配列とし、第４の骨格蛋白質の一部としてドックリンドメインＤ５とコヘシンドメインＣ６と共に翻訳させる実施形態がより好ましい。リンカーがアミノ酸配列で構成される場合、リンカーを構成するアミノ酸数は８～２１個であることが好ましく、９～１９個であることがより好ましく、１２～１７個であることが特に好ましい。また、セルロソームに含まれるドックリンネイティブのリンカーを使用することも好ましい。
【0078】
３．ＡＣＣ合成酵素サブユニット数に対するＡＣＣ酸化酵素サブユニット数の比率
酵素複合体に含まれる、ＡＣＣ合成酵素サブユニット数に対するＡＣＣ酸化酵素サブユニット数の比率（ＡＣＣ酸化酵素サブユニット数／ＡＣＣ合成酵素サブユニット数）は、特に限定されない。ＡＣＣ合成酵素サブユニット数に対するＡＣＣ酸化酵素サブユニット数の比率は、３以上であることが好ましく、４以上、５以上、７以上、１０以上、１５以上、２０以上、２５以上、２７以上であってもよい。ＡＣＣ合成酵素サブユニット数に対するＡＣＣ酸化酵素サブユニット数の比率の上限値は、エチレンの生産が阻害されない限り特に限定されない。ＡＣＣ合成酵素サブユニット数に対するＡＣＣ酸化酵素サブユニット数の比率の上限値は、例えば３００以下、２００以下、１００以下、５０以下、４０以下、３０以下であってもよい。例えば、酵素複合体ＳＯＣ６のＡＣＣ合成酵素サブユニット数に対するＡＣＣ酸化酵素サブユニット数の比率は、４である。酵素複合体ＳＯＣ２９のＡＣＣ合成酵素サブユニット数に対するＡＣＣ酸化酵素サブユニット数の比率は、２７である。
酵素複合体に含まれる、ＡＣＣ合成酵素サブユニット数に対するＡＣＣ酸化酵素サブユニット数の比率（ＡＣＣ酸化酵素サブユニット数／ＡＣＣ合成酵素サブユニット数）は、特に限定されない。ＡＣＣ合成酵素サブユニット数に対するＡＣＣ酸化酵素サブユニット数の比率は、３以上であることが好ましく、４以上、５以上、７以上、１０以上、１５以上、２０以上、２５以上、２７以上であってもよい。ＡＣＣ合成酵素サブユニット数に対するＡＣＣ酸化酵素サブユニット数の比率の上限値は、エチレンの生産が阻害されない限り特に限定されない。ＡＣＣ合成酵素サブユニット数に対するＡＣＣ酸化酵素サブユニット数の比率の上限値は、例えば３００以下、２００以下、１００以下、５０以下、４０以下、３０以下であってもよい。例えば、酵素複合体ＳＯＣ６のＡＣＣ合成酵素サブユニット数に対するＡＣＣ酸化酵素サブユニット数の比率は、４である。酵素複合体ＳＯＣ２９のＡＣＣ合成酵素サブユニット数に対するＡＣＣ酸化酵素サブユニット数の比率は、２７である。
【0079】
ＡＣＣ酸化酵素のＶｍａｘ値は、ＡＣＣ合成酵素のＶｍａｘ値の２７０分の１程度であるとされる。このため、ＳＡＭを基質としてエチレンを生成する逐次反応において、ＡＣＣ酸化酵素による触媒反応が律速段階であると考えられる。また、本願発明者は、１個のＡＣＣ合成酵素サブユニットと１個のＡＣＣ酸化酵素サブユニットを含む酵素複合体ＳＯＣ２と、１個のＡＣＣ合成酵素サブユニットと２個のＡＣＣ酸化酵素サブユニットと１個のＭＴＡ分解酵素サブユニットを含む酵素複合体ＳＯＣ４を用いた先導研究から、ＡＣＣ酸化酵素サブユニットを１個増やすことで、エチレン生産効率を１．７倍高められるという知見を得ている。このため、ＡＣＣ合成酵素サブユニット数に対するＡＣＣ酸化酵素サブユニット数の比率を上記のようにすることで、より効率的にエチレン生産能を向上できる。
【0080】
４．データベースの参照
既に、多数のセルロソーム生産微生物においてコヘシンドメイン及びドックリンドメインのアミノ酸配列及びＤＮＡ配列が決定されている。また、多数のＡＣＣ合成酵素及びＡＣＣ酸化酵素においてアミノ酸配列及びＤＮＡ配列が決定されている。それらの配列は例えばＧｅｎＢａｎｋ、ＥＢＩ、ＤＤＢＪ等で確認することができる。解読された配列についてはライブラリークローンを利用することができるものもある。
既に、多数のセルロソーム生産微生物においてコヘシンドメイン及びドックリンドメインのアミノ酸配列及びＤＮＡ配列が決定されている。また、多数のＡＣＣ合成酵素及びＡＣＣ酸化酵素においてアミノ酸配列及びＤＮＡ配列が決定されている。それらの配列は例えばＧｅｎＢａｎｋ、ＥＢＩ、ＤＤＢＪ等で確認することができる。解読された配列についてはライブラリークローンを利用することができるものもある。
【0081】
データベースに登録されたＤＮＡ配列は、コドン頻度等を形質転換体に最適化して利用してもよい。最適化されたＤＮＡ配列のＤＮＡ断片は、人工合成して利用することができる。
【0082】
５．改変体
酵素複合体に含まれるコヘシンドメイン、ドックリンドメイン、ＡＣＣ合成酵素、ＡＣＣ酸化酵素、ＭＴＡ分解酵素は、公知の天然由来の物の他、上述した本開示の酵素複合体に必要な機能を維持した改変体を含む概念である。当該改変体はアミノ酸配列の改変体を含む。例えば、後述の実施例で使用したコヘシンドメイン、ドックリンドメイン、ＡＣＣ合成酵素、ＡＣＣ酸化酵素、ＭＴＡ分解酵素と比較して８０％配列が保持された改変体であり、好ましくは９０％配列が保持された改変体であり、より好ましくは９５％配列が保持された改変体であり、更に好ましくは９９％配列が保持された改変体である。当該改変体は、糖鎖などによって修飾されて良い。
酵素複合体に含まれるコヘシンドメイン、ドックリンドメイン、ＡＣＣ合成酵素、ＡＣＣ酸化酵素、ＭＴＡ分解酵素は、公知の天然由来の物の他、上述した本開示の酵素複合体に必要な機能を維持した改変体を含む概念である。当該改変体はアミノ酸配列の改変体を含む。例えば、後述の実施例で使用したコヘシンドメイン、ドックリンドメイン、ＡＣＣ合成酵素、ＡＣＣ酸化酵素、ＭＴＡ分解酵素と比較して８０％配列が保持された改変体であり、好ましくは９０％配列が保持された改変体であり、より好ましくは９５％配列が保持された改変体であり、更に好ましくは９９％配列が保持された改変体である。当該改変体は、糖鎖などによって修飾されて良い。
【0083】
６．光合成生物
本開示において形質転換され得る光合成生物は、例えば、光合成細菌及び藻類である。
本開示において形質転換され得る光合成生物は、例えば、光合成細菌及び藻類である。
【0084】
光合成生物は、上述の酵素複合体を産生するように形質転換したものである。好ましくは、発現ベクター等を用いて上述の酵素複合体を産生するように形質転換した光合成生物である。
【0085】
上述の酵素複合体を産生するように形質転換され得る光合成細菌として、シアノバクテリア、紅色細菌、緑色硫黄細菌、緑色非硫黄細菌、ヘリオバクテリア等を例示することができる。当該光合成細菌はシアノバクテリアであることが好ましい。シアノバクテリアとして、Synechococcus、Dactylococcopsis、Merismopedia、Chroococcus、Gloeocapsa、Aphanothece、Microcystis、Aphanocapsa、Coelosphaerium、Gomphosphaeria、Myxosarcina、Oscillatoria、Phormidium、Lyngbya、Spirulina、Anabaena、Anabenopsis、Nostoc、Cylindrospermum、Scytonema、Gloeotrichia、Dichothrix、Hapalosiphon、Fischerella、Stigonema等に属する菌を例示することができ、Synechococcus属の菌が好ましい。
【0086】
上述の酵素複合体を産生するように形質転換され得る藻類として、原核生物であるシアノバクテリア（藍藻）（cyanobacteria）から、真核生物である灰色植物門（灰色藻）（Glaucophyta）、紅色植物門（紅藻）（Rhodophyta）、緑色植物門（クロレラ、緑藻を含む）（Chlorophyta）、クリプト植物門（クリプト藻）（Ｃryptophyta）、ハプト植物門（ハプト藻）（Haptophyta）、不等毛植物門（珪藻を含む不等毛藻）（Heterokontophyta）、渦鞭毛植物門（渦鞭毛藻）（Dinophyta）、ユーグレナ植物門（ユーグレナ藻）（Euglenophyta）、クロララクニオン植物門（クロララクニオン藻）（Chlorarachniophyta）に分類される様々な単細胞生物及び多細胞生物を例示することができる。好ましくはシアノバクテリア、緑藻、紅藻、灰色藻であり、より好ましくはシアノバクテリアである。好ましいシアノバクテリアは上述と同様である。
【0087】
本開示において、従来の分類の通り、シアノバクテリアは光合成細菌に該当し、かつ、藻類にも該当する。
【0088】
上述の酵素複合体の産生は光合成生物が備える蛋白質生産機能を利用することで実現される。上述の酵素複合体を産生するように光合成生物を形質転換する方法は特に限定されず、公知の方法を利用できる。例えば、ファージやプラスミド等のベクターを用いる方法、ヒートショック法、パーティクルガン法、エレクトロポーレーション法等を利用することができる。形質転換は、例えば、ゲノムに上記酵素複合体をコードする遺伝子を導入しても良い。本開示の光合成生物を、エチレン産生能力を維持したまま継代できるように形質転換することが好ましい。生物由来のＤＮＡ配列、上記した改変体をコードするＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ等を適宜使用することができる。ベクターを使用する場合、その種類は特に限定されない。具体的なプラスミドベクターとして、例えば、pET、pTrcHis2、pUC119、pBR322、pBluescript II KS+、pYES2、pAUR123、pQE-Tri、pGEM-3Z、pGEX、pMAL、pRI909、pRI910、pBI221、pBI121、ｐNCMO2、pBI101、pIG121Hm、pTrc99A、pKK223、pA1－11、pXT1、pRc/CMV、pRc/RSV、pcDNA I/Neo、p3×FLAG-CMV-14、pCAT3、pcDNA3.1、pCMV等のベクターが例示される。
【0089】
形質転換の際、例えば、各骨格蛋白質、各酵素サブユニットをコードする遺伝子を一連に連結して光合成生物に導入しても良いし、各骨格蛋白質、各酵素サブユニットをコードする各遺伝子を独立したプロモーター配置下、あるいは別々の手法やベクターを利用してそれぞれ導入しても良い。形質転換における導入する遺伝子と手法の組み合わせは限定されない。
【0090】
（１）光合成生物の培養
本開示の光合成生物は、二酸化炭素を取り込み、エチレンを産生する。即ち、本開示の光合成生物を培養することでエチレンを産生することができる。
本開示の光合成生物は、二酸化炭素を取り込み、エチレンを産生する。即ち、本開示の光合成生物を培養することでエチレンを産生することができる。
【0091】
上記形質転換され得る光合成生物は原核生物、真核生物の別を問わず自らの代謝においてＳＡＭを生産すると考えられる。よって、当該光合成生物は本願発明者が発案した物質循環を実現するのに適切な生物である。本開示の光合成生物の体内に存在するＳＡＭを利用し、人工酵素複合体によってエチレンが産生されると考えられる。
【0092】
本開示の光合成生物の培養においては、上記形質転換され得る光合成生物について公知の各種の培地、培養方法を採用することができる。培地形状としては液体培地が好ましい。培地としては、例えば、ＢＧ－１１培地、海水が好ましい。淡水を培地とする場合、排水等から転用される無機栄養素を含む培地でもよい。
【0093】
また、培地への添加物として、例えば、アスコルビン酸、ＡＣＣ、ＳＡＭ、メチオニンが好ましい。
【0094】
例えば、培地のｐＨは６．５～９．５であることが好ましく、７．０～８．５であることが好ましく、７．０～８．０であることがより好ましい。
【0095】
例えば、本開示の光合成生物の培養においては、二酸化炭素を培地に供給することが好ましい。供給の態様は培地の形状に合わせて適宜選択可能であり限定されないが、気体又は二酸化炭素を含有する液体による供給が好ましく、バブリングによる供給がより好ましい。二酸化炭素を排出する設備からの排気を用いることも好ましい。二酸化炭素を排出する設備として例えば化学プラント、発電所等がある。
【0096】
継続的に本開示の光合成生物を培養する場合、当該光合成生物の継代には公知の各種の手法を採用することができる。
【0097】
また、本開示の光合成生物の古い世代を培地から回収する場合、当該光合成生物が担体に担持されていると回収が容易となる。当該担体として、例えば、鉄鋼スラグ、ハニカム、ビーズ等を使用することができる。担体への本開示の光合成生物の担持は、当該担体と光合成生物の組み合わせに応じて公知の各種の手法を採用することができる。
【実施例0098】
以下、本開示の実施例を説明する。本開示の技術的範囲は以下の実施例に限定されない。万が一、以下の実施例の記載と配列表で配列の記載に齟齬が生じる場合、本実施例の配列の記載が優先する。ＤＮＡ配列は５’末端から３’末端に向けて記載する。アミノ酸配列はＮ末端からＣ末端に向けて記載する。
【0099】
１．ＳＯＣ６の設計
図１に、後述する酵素複合体ＳＯＣ６の概念図を示す。ＳＯＣ６のコヘシンドメインとドックリンドメインは以下の通りである。なお、括弧内に、当該ドメインのＤＮＡ配列の表記を示す。
＜ＡＣＳ－ＤＡＣＳ＞
ＤＡＣＳ：Clostridium thermocellum Cel48S Dockerin
＜ＡＣＯ－ＤＡＣＯ＞
ＤＡＣＯ：Acetivibrio cellulolyticus ScaB Dockerin
＜ＭＴＡＮ－ＤＭＴＡＮ＞
ＤＭＴＡＮ：Clostridium josui Cel8A Dockerin
＜Ｓｃａ１＞
Ｃ１：Ruminococcus flavefaciens FD-1 ScaC cohesin (RfScaCCohOPT2)
ＣＭＴＡＮ：Clostridium josui CipA Cohesin (CjCipACoh)
ＣＡＣＳ：Clostridium thermocellum CipA cohesin 3 (CtCipACoh3)
＜Ｓｃａ２＞
ＣＡＣＯ：Acetivibrio cellulolyticus ScaC Cohesin 3 (AcScaCCoh)
ＣＡＣＯ：Acetivibrio cellulolyticus ScaC Cohesin 3 (AcScaCCohOPT)
Ｄ２：Ruminococcus flavefaciens FD-1 Group1 dockerin (RfGroup1Doc)
＜Ｓｃａ３＞
Ｃ４－２：Ruminococcus flavefaciens FD-1 ScaB cohesin1 (RfScaBCoh1)
Ｃ４－１：Ruminococcus flavefaciens FD-1 ScaA cohesin1 (RfScaAcoh1)
Ｄ３：Ruminococcus flavefaciens FD-1 Group3 dockerin (RfGroup3Doc)
図１に、後述する酵素複合体ＳＯＣ６の概念図を示す。ＳＯＣ６のコヘシンドメインとドックリンドメインは以下の通りである。なお、括弧内に、当該ドメインのＤＮＡ配列の表記を示す。
＜ＡＣＳ－ＤＡＣＳ＞
ＤＡＣＳ：Clostridium thermocellum Cel48S Dockerin
＜ＡＣＯ－ＤＡＣＯ＞
ＤＡＣＯ：Acetivibrio cellulolyticus ScaB Dockerin
＜ＭＴＡＮ－ＤＭＴＡＮ＞
ＤＭＴＡＮ：Clostridium josui Cel8A Dockerin
＜Ｓｃａ１＞
Ｃ１：Ruminococcus flavefaciens FD-1 ScaC cohesin (RfScaCCohOPT2)
ＣＭＴＡＮ：Clostridium josui CipA Cohesin (CjCipACoh)
ＣＡＣＳ：Clostridium thermocellum CipA cohesin 3 (CtCipACoh3)
＜Ｓｃａ２＞
ＣＡＣＯ：Acetivibrio cellulolyticus ScaC Cohesin 3 (AcScaCCoh)
ＣＡＣＯ：Acetivibrio cellulolyticus ScaC Cohesin 3 (AcScaCCohOPT)
Ｄ２：Ruminococcus flavefaciens FD-1 Group1 dockerin (RfGroup1Doc)
＜Ｓｃａ３＞
Ｃ４－２：Ruminococcus flavefaciens FD-1 ScaB cohesin1 (RfScaBCoh1)
Ｃ４－１：Ruminococcus flavefaciens FD-1 ScaA cohesin1 (RfScaAcoh1)
Ｄ３：Ruminococcus flavefaciens FD-1 Group3 dockerin (RfGroup3Doc)
【0100】
２．ＳＯＣ６用の大腸菌用ベクターの構築
（１）ＡＣＳ－ＤＡＣＳの発現ベクター（ｐＥＴ－ＡＣＣＳ－Ｃｔｄｏｃ）の構築
ＡＣＣ合成酵素（ＡＣＳ）は、特許文献２（特開２０１３－７４８１４）に記載の配列の遺伝子断片を用いた。
ドックリンドメインＤＡＣＳは、Clostridium thermocellum由来ゲノムＤＮＡをテンプレートＤＮＡとし、ＰＣＲ法によりリンカー配列＋ドックリンドメインＤＡＣＳの配列を含む遺伝子断片（アクセッション番号：Ｌ０６９４２）を増幅させた。
（１）ＡＣＳ－ＤＡＣＳの発現ベクター（ｐＥＴ－ＡＣＣＳ－Ｃｔｄｏｃ）の構築
ＡＣＣ合成酵素（ＡＣＳ）は、特許文献２（特開２０１３－７４８１４）に記載の配列の遺伝子断片を用いた。
ドックリンドメインＤＡＣＳは、Clostridium thermocellum由来ゲノムＤＮＡをテンプレートＤＮＡとし、ＰＣＲ法によりリンカー配列＋ドックリンドメインＤＡＣＳの配列を含む遺伝子断片（アクセッション番号：Ｌ０６９４２）を増幅させた。
【0101】
ＡＣＣ合成酵素を含む遺伝子断片とドックリンドメインＤＡＣＳを含む遺伝子断片を、特許文献２と同様の手法にてキメラ化し、ＤＮＡ断片を増幅した。当該ＤＮＡ断片を、ｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）へＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法を用いて導入し、発現ベクターであるｐＥＴ－ＡＣＣＳ－Ｃｔｄｏｃを得た。
【0102】
（２）ＡＣＯ－ＤＡＣＯの発現ベクター（ｐＥＴ－ＡＣＣＯ－Ａｃｄｏｃ）の構築
ＡＣＣ酸化酵素（ＡＣＯ）は、特許文献２（特開２０１３－７４８１４）に記載の配列の遺伝子断片を用いた。
ドックリンドメインＤＡＣＯは、特許文献２（特開２０１３－７４８１４）に記載の配列の遺伝子断片を用いた。
ＡＣＣ酸化酵素（ＡＣＯ）は、特許文献２（特開２０１３－７４８１４）に記載の配列の遺伝子断片を用いた。
ドックリンドメインＤＡＣＯは、特許文献２（特開２０１３－７４８１４）に記載の配列の遺伝子断片を用いた。
【0103】
ＡＣＣ酸化酵素を含む遺伝子断片とドックリンドメインＤＡＣＯを含む遺伝子断片を、特許文献２と同様の手法にてキメラ化し、ＤＮＡ断片を増幅した。当該ＤＮＡ断片を、ｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）へＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法を用いて導入し、発現ベクターであるｐＥＴ－ＡＣＣＯ－Ａｃｄｏｃを得た。
【0104】
（３）ＭＴＡＮ－ＤＭＴＡＮの発現ベクター（ｐＥＴ－ＡｔＭＴＡＮ２－ＣｊＤｏｃ）の構築
理研ＢＲＣより提供されたシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）由来ｃＤＮＡクローン（ｐｄａ２０２６５）をテンプレートＤＮＡとし、ＰＣＲ法によりＭＴＡ分解酵素を含む遺伝子断片を増幅させた。
理研ＢＲＣより提供されたシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）由来ｃＤＮＡクローン（ｐｄａ２０２６５）をテンプレートＤＮＡとし、ＰＣＲ法によりＭＴＡ分解酵素を含む遺伝子断片を増幅させた。
【0105】
Clostridium josui由来ゲノムＤＮＡをテンプレートＤＮＡとし、ＰＣＲ法によりリンカー配列＋ドックリンドメインＤＭＴＡＮの配列を含む遺伝子断片を増幅させた。
【0106】
ＭＴＡ分解酵素を含む遺伝子断片とドックリンドメインＤＭＴＡＮを含む遺伝子断片を、特許文献２と同様の手法にてキメラ化し、ＤＮＡ断片を増幅した。当該キメラ化したＤＮＡ断片を、ｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）へＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法を用いて導入し、発現ベクターであるｐＥＴ－ＡｔＭＴＡＮ２－ＣｊＤｏｃを得た。
【0107】
ｐＥＴ－ＡｔＭＴＡＮ２－ＣｊＤｏｃの開始コドン（ATG）から終止コドンまで（TAA）までを含むＤＮＡ配列は下記配列番号１の通りである。５’末端側の最初の下線部分がＭＴＡ分解酵素、続く下線なしの部分がリンカー、続く第２の下線部分がドックリンドメインＤＭＴＡＮ（Clostridium josui Cel8A Dockerin）をコードする。
配列番号１：atgggcagcagccatcatcatcatcatcacagcagcggcctggtgccgcgcggcagccatatggctagcATGGAAGGTGTTATGGGTCAGGTAGAGAAACGGCCGATTTCTACCATCGTCTTCATCGTTGCTATGCAAAAGGAAGCTCAGCCTCTGATCAACAGATTACGCCTCGTTGAAGAAGTTAATACTCCGTTTCCAAAAGAGGTGACTTGGATTATGTTTAAGGGAATGTATAAAGACTTGAACATCAATATAGTGTGTCCTGGAAAAGATTCAACTCTTGGGGTTGAGAGTGTTGGCACAGTTCCTGCATCACTCGTGACTTATGCTTCCATTCTAGCAATTCAACCAGACTTAATCATTAATGCGGGAACCGCTGGTGGCTTTAAGGCCAAAGGAGCATGTATTAGCGATGTTTATGTTGTCTCTACTGTTGCTTTCCATGACAGAAGAATACCTGTTCCTGTCCTTGATATATATGGTGTTGGTATGCGGAACACCTTCCCCACACCCAACCTTATAAAGGAGCTGAACCTAAAGGTGGGAAGATTATCCACTGGCGATTCTATGGATATGTCTCCACATGACGAAGAATCCATCACAGCAAATGATGCTACAGTTAAAGATATGGAGGGAGCAGCAGTGGCCTATGTGGCTGATATCTTTAAAGTGCCTACGATTCTAATAAAAGGTGTGACTGATATTGTGGATGGCAATAGACCAACTTCTGAAGAATTTTTGGAGAACTTAGCTGCAGTCACTGCCAAACTTGATGAGTCACTTACCAAAGTGATTGACTTCATCAGTGGGAAATGTCTCTCAGACCTCAGCTCTCAACCACAGCAAGGTTTAAAAGGCGATGTCAATAATGATGGTGCTATAGATGCCCTTGATATTGCTGCGCTCAAGAAGGCTATTTTGACTCAATCAACTTCTAATATTAATTTAACAAATGCTGATATGAATAATGACGGAAATATTGATGCCATTGATTTTGCTCAGCTAAAAGTTAAACTGCTCAATTAAGGATCCgaattcgagctccgtcgacaagcttgcggccgcactcgagcaccaccaccaccaccactgagatc
配列番号１：atgggcagcagccatcatcatcatcatcacagcagcggcctggtgccgcgcggcagccatatggctagcATGGAAGGTGTTATGGGTCAGGTAGAGAAACGGCCGATTTCTACCATCGTCTTCATCGTTGCTATGCAAAAGGAAGCTCAGCCTCTGATCAACAGATTACGCCTCGTTGAAGAAGTTAATACTCCGTTTCCAAAAGAGGTGACTTGGATTATGTTTAAGGGAATGTATAAAGACTTGAACATCAATATAGTGTGTCCTGGAAAAGATTCAACTCTTGGGGTTGAGAGTGTTGGCACAGTTCCTGCATCACTCGTGACTTATGCTTCCATTCTAGCAATTCAACCAGACTTAATCATTAATGCGGGAACCGCTGGTGGCTTTAAGGCCAAAGGAGCATGTATTAGCGATGTTTATGTTGTCTCTACTGTTGCTTTCCATGACAGAAGAATACCTGTTCCTGTCCTTGATATATATGGTGTTGGTATGCGGAACACCTTCCCCACACCCAACCTTATAAAGGAGCTGAACCTAAAGGTGGGAAGATTATCCACTGGCGATTCTATGGATATGTCTCCACATGACGAAGAATCCATCACAGCAAATGATGCTACAGTTAAAGATATGGAGGGAGCAGCAGTGGCCTATGTGGCTGATATCTTTAAAGTGCCTACGATTCTAATAAAAGGTGTGACTGATATTGTGGATGGCAATAGACCAACTTCTGAAGAATTTTTGGAGAACTTAGCTGCAGTCACTGCCAAACTTGATGAGTCACTTACCAAAGTGATTGACTTCATCAGTGGGAAATGTCTCTCAGACCTCAGCTCTCAACCACAGCAAGGTTTAAAAGGCGATGTCAATAATGATGGTGCTATAGATGCCCTTGATATTGCTGCGCTCAAGAAGGCTATTTTGACTCAATCAACTTCTAATATTAATTTAACAAATGCTGATATGAATAATGACGGAAATATTGATGCCATTGATTTTGCTCAGCTAAAAGTTAAACTGCTCAATTAAGGATCCgaattcgagctccgtcgacaagcttgcggccgcactcgagcaccaccaccaccaccactgagatc
【0108】
（４）Ｓｃａ１の発現ベクター（ｐＥＴ－Ｓｃａ１）の構築
図２は、ｐＥＴ－Ｓｃａ１の概念図である。ｐＥＴ－Ｓｃａ１を構築するために、コヘシンドメインＣ１の配列を含む遺伝子断片、コヘシンドメインＣＭＴＡＮの配列を含む遺伝子断片、及びコヘシンドメインＣＡＣＳの配列を含む遺伝子断片を得た。
図２は、ｐＥＴ－Ｓｃａ１の概念図である。ｐＥＴ－Ｓｃａ１を構築するために、コヘシンドメインＣ１の配列を含む遺伝子断片、コヘシンドメインＣＭＴＡＮの配列を含む遺伝子断片、及びコヘシンドメインＣＡＣＳの配列を含む遺伝子断片を得た。
【0109】
コヘシンドメインＣ１の配列を含む遺伝子断片は次のようにして得た。Ruminococcus flavefaciens FD-1のゲノムＤＮＡにおける、ScaC cohesinの配列を光合成細菌及び大腸菌用にコドン頻度を最適化し、人工合成した。最適化した配列をRfScaCCohOPT2とも称する。人工合成したＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法を用いてｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）へ導入し、発現ベクターであるｐＥＸ－ＳｃａＣＣｏｈを得た。
【0110】
ｐＥＸ－ＳｃａＣＣｏｈをテンプレートとして、下記配列番号２及び配列番号３に記載のプライマーを用いたＰＣＲ法によりコヘシンドメインＣ１の配列を含む遺伝子断片を増幅させた。
配列番号２：GGATCCGCAGGCGAAACAGTGCAGATTTCCG（pETSca1J1-Fwdとも称する。）
配列番号３：CTTATAACAGTAGCCTGATCGGGAG（pETSca1J2-Revとも称する。）
配列番号２：GGATCCGCAGGCGAAACAGTGCAGATTTCCG（pETSca1J1-Fwdとも称する。）
配列番号３：CTTATAACAGTAGCCTGATCGGGAG（pETSca1J2-Revとも称する。）
【0111】
コヘシンドメインＣＭＴＡＮの配列を含む遺伝子断片は、次のようにして得た。Clostridium josuiのゲノムＤＮＡにおける、CipA Cohesinの配列を光合成細菌及び大腸菌用にコドン頻度を最適化し、人工合成した。人工合成したＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法を用いてpUCへ導入し、発現ベクターであるｐＵＣ３０３－ＳＯＣ４Ｂを得た。
【0112】
ｐＵＣ３０３－ＳＯＣ４Ｂをテンプレートとして、下記配列番号４及び配列番号５に記載のプライマーを用いてコヘシンドメインＣＭＴＡＮの配列を含む遺伝子断片を増幅させた。
配列番号４：GGCTACTGTTATAAGTCCAGATCC（pETSca1J2-Fwdとも称する。）
配列番号５：TTGCATTGGATCCGCGACCCATTC（pETSca1J3-Revとも称する。）
配列番号４：GGCTACTGTTATAAGTCCAGATCC（pETSca1J2-Fwdとも称する。）
配列番号５：TTGCATTGGATCCGCGACCCATTC（pETSca1J3-Revとも称する。）
【0113】
コヘシンドメインＣＡＣＳの配列を含む遺伝子断片は、次のようにして得た。Clostridium thermocellum由来ゲノムＤＮＡをテンプレートＤＮＡとし、ＰＣＲ法によりリンカー配列＋コヘシンドメインＣＡＣＳ（CipA Cohesin3）の配列を含むＤＮＡ断片を増幅させた。増幅させたＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法を用いてpUCへ導入し、発現ベクターであるｐＵＣ３０３－ＳＯＣ４Ｂを得た。
【0114】
ｐＵＣ３０３－ＳＯＣ４Ｂをテンプレートとして、下記配列番号６及び配列番号７に記載のプライマーを用いてコヘシンドメインＣＡＣＳの配列を含む遺伝子断片を増幅させた。
配列番号６：GGCTACTGTTATAAGTCCAGATCC（pETSca1J3-Fwdとも称する。）
配列番号７：TTGCATTGGATCCGCGACCCATTC（pETSca1J4-Revとも称する。）
配列番号６：GGCTACTGTTATAAGTCCAGATCC（pETSca1J3-Fwdとも称する。）
配列番号７：TTGCATTGGATCCGCGACCCATTC（pETSca1J4-Revとも称する。）
【0115】
さらに、ｐＥＴ－Ｓｃａ１を構築するために、下記配列番号８及び配列番号９に記載のプライマーを用いてＰＣＲ法によりｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）の全長を増幅した。
配列番号８：ACAACATAAGGATCCGAATTCGAGCTCCGTC（pETSca1J4-Fwdとも称する。）
配列番号９：TTCGCCTGCGGATCCGCGACCCATTTGCTGTC（pETSca1J1-Revとも称する。）
配列番号８：ACAACATAAGGATCCGAATTCGAGCTCCGTC（pETSca1J4-Fwdとも称する。）
配列番号９：TTCGCCTGCGGATCCGCGACCCATTTGCTGTC（pETSca1J1-Revとも称する。）
【0116】
コヘシンドメインＣ１の配列を含む遺伝子断片、コヘシンドメインＣＭＴＡＮの配列を含む遺伝子断片、コヘシンドメインＣＡＣＳの配列を含む遺伝子断片、及びｐＥＴ２８ａの全長の断片について、In-Fusion Snap Assembly Master Mix User Manualに記載されている方法による連結を試みた。しかし、４つの断片を用いた試験では、目的のｐＥＴ－Ｓｃａ１が得られなかったため、予めコヘシンドメインＣ１の配列を含む遺伝子断片と、コヘシンドメインＣＭＴＡＮの配列を含む遺伝子断片をドッキングＰＣＲにより連結し、コヘシンドメインＣ１の配列とコヘシンドメインＣＭＴＡＮの配列を含む遺伝子断片を得た。
【0117】
ドッキングＰＣＲには、コヘシンドメインＣ１の配列（RfScaCCohOPT2）を含む遺伝子断片と、コヘシンドメインＣＭＴＡＮの配列（CjCipACoh）を含む遺伝子断片との間に25bpのオーバーラップ領域を持つように設計したプライマーを用いた。コヘシンドメインＣ１の配列を含む遺伝子断片の増幅には、下記配列番号１０及び配列番号１１のプライマーを用いた。
配列番号１０：GGATCCGCAGGCGAAACAGTGCAGATTTCCG（pETSca1J1-Fwdとも称する。）
配列番号１１：CAACATGTTTTGGGCGCATGAAGGC（pETSca1DockingJ2-Revとも称する。）
コヘシンドメインＣＭＴＡＮの配列（CjCipACoh）を含む遺伝子断片の増幅には、下記配列番号１２及び配列番号１３のプライマーを用いた。
配列番号１２：GATCAGGCTACTGTTATAAGTCCAGATCCTACAAATG（pETSca1DockingJ2-Fwdとも称する。）
配列番号１３：TTGCATTGGATCCGCGACCCATTC（pETSca1J3-Revとも称する。）
配列番号１０：GGATCCGCAGGCGAAACAGTGCAGATTTCCG（pETSca1J1-Fwdとも称する。）
配列番号１１：CAACATGTTTTGGGCGCATGAAGGC（pETSca1DockingJ2-Revとも称する。）
コヘシンドメインＣＭＴＡＮの配列（CjCipACoh）を含む遺伝子断片の増幅には、下記配列番号１２及び配列番号１３のプライマーを用いた。
配列番号１２：GATCAGGCTACTGTTATAAGTCCAGATCCTACAAATG（pETSca1DockingJ2-Fwdとも称する。）
配列番号１３：TTGCATTGGATCCGCGACCCATTC（pETSca1J3-Revとも称する。）
【0118】
コヘシンドメインＣ１の配列とコヘシンドメインＣＭＴＡＮの配列を含む遺伝子断片、コヘシンドメインＣＡＣＳの配列を含む遺伝子断片、及びｐＥＴ２８ａの全長の断片の３つの断片を、In-Fusion Snap Assembly Master Mix User Manualに記載されている方法により連結し、ｐＥＴ－Ｓｃａ１を得た。
【0119】
ｐＥＴ－Ｓｃａ１の開始コドン（ATG）から終止コドンまで（TAA）までのＤＮＡ配列は下記配列番号１４の通りである。５’末端側の最初の下線なしの部分がpET28由来の配列、最初の下線部分がコヘシンドメインＣ１（RfScaCCohOPT2）、続く第２の下線なしの部分が第１のリンカー（アミノ酸数１４）、続く第２の下線部分がコヘシンドメインＣＭＴＡＮ（CjCipACoh）、続く第３の下線なしの部分が第２のリンカー（アミノ酸数１０）、続く第３の下線部分がコヘシンドメインＣＡＣＳ（CtCipACoh3）をコードする。
配列番号１４：ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCGCAGGCGAAACAGTGCAGATTTCCGCCAGCAATGCGGAGGCAAAGGCAGGTGATCAGTTCGAGGTGAAGGTGTCTTTGGCTGATGTTCCAAGTACCGGAATCCAGGGTATCGACTTTGCTGTTACTTACGACAACACAGTAGTGACAATCGACAAGATCACAGTAGGGGAGATTGCTGACACGAAGGCAGCTTCCAGTGATCAGACTGCATCACTTCTGCCCACATTCGATGTGTCTATTCAGAACAGTGAGGGCTATAGCAGTGTTATCTGGTCTACAGCAGTGGAAGATTCATCATACTGGATCAGCAAGGACGGTGTGTTATGTACAATCACAGGTACAGTGTCAAGCAATGCTAAGCCTGGTGCAGAATCACCTATCAAGCTTGAAGCAGTCAAGCGTGAGACATATGTCGGCTCCGGTACAGACAACAGCAGTATCAGTGCAGGTTATTCTGCAAACGATAAGGCTGTAAAGTACACAGTCAAGGCAACAAACGGTAAGATATCTGTTCCTTCAGCAGAAGTAACAACCACCAAGGCTCCCGATCAGGCTACTGTTATAAGTCCAGATCCTACAAATGCTCTTAAAGTAACAGTAGGAACAGCAGAAGGTAATGTTGGAGAAACAGTAACAGTTCCTGTTACATTTGCTGATGTAGCAAAAGTAAACAACGTAGGAACATGTAACTTCTATCTTGCATATGATGCAAGTCTTTTGGATGTAGTATCAGTAGATGCAGGTCCAATAGTTAAGAATGCAGCAGTAAACTTCTCAAGCAGTGCAAGCAACGGAACAATCAGCTTCCTGTTCTTGGATAACACAATCACTGACGAATTGATTACTTCAGATGGTGTGTTTGCAAATATCACATTCAAATTAAAGAATGTATCAACTAAAACAACAACACCAATAACCTTCAAAGACGGAGGAGCATTTGGTGACGGTACTATGTCAAAGATAACTACAGTTATCAAGACAAACGGTAGTGTAACAATTATTCCTGGTGACCCAGAACCTACAGAAGATCTTAACGTAGCAGTAGGAATGGGTCGCGGATCCAATGCAATAAAGATTAAGGTGGACACAGTAAATGCAAAACCGGGAGACACAGTAAATATACCTGTAAGATTCAGTGGTATACCATCCAAGGGAATAGCAAACTGTGACTTTGTATACAGCTATGACCCGAATGTACTTGAGATAATAGAGATAAAACCGGGAGAATTGATAGTTGACCCGAATCCTGACAAGAGCTTTGATACTGCAGTATATCCTGACAGAAAGATAATAGTATTCCTGTTTGCAGAAGACAGCGGAACAGGAGCGTATGCAATAACTAAAGACGGAGTATTTGCTACGATAGTAGCGAAAGTAAAATCCGGAGCACCTAACGGACTCAGTGTAATCAAATTTGTAGAAGTAGGCGGATTTGCGAACAATGACCTTGTAGAACAGAGGACACAGTTCTTTGACGGTGGAGTAAATGTTGGAGATACAACATAA
配列番号１４：ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCGCAGGCGAAACAGTGCAGATTTCCGCCAGCAATGCGGAGGCAAAGGCAGGTGATCAGTTCGAGGTGAAGGTGTCTTTGGCTGATGTTCCAAGTACCGGAATCCAGGGTATCGACTTTGCTGTTACTTACGACAACACAGTAGTGACAATCGACAAGATCACAGTAGGGGAGATTGCTGACACGAAGGCAGCTTCCAGTGATCAGACTGCATCACTTCTGCCCACATTCGATGTGTCTATTCAGAACAGTGAGGGCTATAGCAGTGTTATCTGGTCTACAGCAGTGGAAGATTCATCATACTGGATCAGCAAGGACGGTGTGTTATGTACAATCACAGGTACAGTGTCAAGCAATGCTAAGCCTGGTGCAGAATCACCTATCAAGCTTGAAGCAGTCAAGCGTGAGACATATGTCGGCTCCGGTACAGACAACAGCAGTATCAGTGCAGGTTATTCTGCAAACGATAAGGCTGTAAAGTACACAGTCAAGGCAACAAACGGTAAGATATCTGTTCCTTCAGCAGAAGTAACAACCACCAAGGCTCCCGATCAGGCTACTGTTATAAGTCCAGATCCTACAAATGCTCTTAAAGTAACAGTAGGAACAGCAGAAGGTAATGTTGGAGAAACAGTAACAGTTCCTGTTACATTTGCTGATGTAGCAAAAGTAAACAACGTAGGAACATGTAACTTCTATCTTGCATATGATGCAAGTCTTTTGGATGTAGTATCAGTAGATGCAGGTCCAATAGTTAAGAATGCAGCAGTAAACTTCTCAAGCAGTGCAAGCAACGGAACAATCAGCTTCCTGTTCTTGGATAACACAATCACTGACGAATTGATTACTTCAGATGGTGTGTTTGCAAATATCACATTCAAATTAAAGAATGTATCAACTAAAACAACAACACCAATAACCTTCAAAGACGGAGGAGCATTTGGTGACGGTACTATGTCAAAGATAACTACAGTTATCAAGACAAACGGTAGTGTAACAATTATTCCTGGTGACCCAGAACCTACAGAAGATCTTAACGTAGCAGTAGGAATGGGTCGCGGATCCAATGCAATAAAGATTAAGGTGGACACAGTAAATGCAAAACCGGGAGACACAGTAAATATACCTGTAAGATTCAGTGGTATACCATCCAAGGGAATAGCAAACTGTGACTTTGTATACAGCTATGACCCGAATGTACTTGAGATAATAGAGATAAAACCGGGAGAATTGATAGTTGACCCGAATCCTGACAAGAGCTTTGATACTGCAGTATATCCTGACAGAAAGATAATAGTATTCCTGTTTGCAGAAGACAGCGGAACAGGAGCGTATGCAATAACTAAAGACGGAGTATTTGCTACGATAGTAGCGAAAGTAAAATCCGGAGCACCTAACGGACTCAGTGTAATCAAATTTGTAGAAGTAGGCGGATTTGCGAACAATGACCTTGTAGAACAGAGGACACAGTTCTTTGACGGTGGAGTAAATGTTGGAGATACAACATAA
【0120】
（５）Ｓｃａ２の発現ベクター（ｐＥＴ－Ｓｃａ２）の構築
図３は、ｐＥＴ－Ｓｃａ２の概念図である。ｐＥＴ－Ｓｃａ２を構築するために、第１のコヘシンドメインＣＡＣＯの配列と第２のコヘシンドメインＣＡＣＯの配列を含む遺伝子断片、及びドックリンドメインＤ２の配列を含む遺伝子断片を得た。
図３は、ｐＥＴ－Ｓｃａ２の概念図である。ｐＥＴ－Ｓｃａ２を構築するために、第１のコヘシンドメインＣＡＣＯの配列と第２のコヘシンドメインＣＡＣＯの配列を含む遺伝子断片、及びドックリンドメインＤ２の配列を含む遺伝子断片を得た。
【0121】
第１のコヘシンドメインＣＡＣＯの配列と第２のコヘシンドメインＣＡＣＯの配列を含む遺伝子断片は次のようにして得た。Acetivibrio cellulolyticusのゲノムＤＮＡにおける、ScaC Cohesin 3の配列を光合成細菌及び大腸菌用にコドン頻度を最適化し、人工合成した。人工合成したＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法を用いてpUCへ導入し、発現ベクターであるｐＵＣ３０３－ＳＯＣ４Ｂを得た。
【0122】
ｐＵＣ３０３－ＳＯＣ４Ｂをテンプレートとして、下記配列番号１５及び配列番号１６に記載のプライマーを用いて第１のコヘシンドメインＣＡＣＯの配列と第２のコヘシンドメインＣＡＣＯの配列を含む遺伝子断片を増幅させた。
配列番号１５：GGATCCGATTTACAGGTTGACATTG（pETSca2J1-Fwdとも称する。）
配列番号１６：CTGTAAATCGGATCCGCGACCCATTTGCTGTCCAC（pETSca2J2-Revとも称する。）
配列番号１５：GGATCCGATTTACAGGTTGACATTG（pETSca2J1-Fwdとも称する。）
配列番号１６：CTGTAAATCGGATCCGCGACCCATTTGCTGTCCAC（pETSca2J2-Revとも称する。）
【0123】
ドックリンドメインＤ２の配列を含む遺伝子断片は次のようにして得た。Ruminococcus flavefaciens FD-1のゲノムＤＮＡにおける、Group1 dockerinの配列を光合成細菌及び大腸菌用にコドン頻度を最適化し、人工合成した。人工合成したＤＮＡ断片を、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法を用いてｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）へ導入し、発現ベクターであるｐＥＸ－Ｄｏｃ１Ａを得た。
【0124】
ｐＥＸ－Ｄｏｃ１Ａをテンプレートとして、下記配列番号１７及び配列番号１８に記載のプライマーを用いてドックリンドメインＤ２の配列を含む遺伝子断片を増幅させた。
配列番号１７：ACACCGCCCGTTCAGTCGGAGGAGGCTGTTC（pETSca2J2-Fwdとも称する。）
配列番号１８：GGATCCTTATGTAGGAGCGGGCTCCACCGGCTG（pETSca2J3-Revとも称する。）
配列番号１７：ACACCGCCCGTTCAGTCGGAGGAGGCTGTTC（pETSca2J2-Fwdとも称する。）
配列番号１８：GGATCCTTATGTAGGAGCGGGCTCCACCGGCTG（pETSca2J3-Revとも称する。）
【0125】
さらに、ｐＥＴ－Ｓｃａ２を構築するために、ＰＣＲ法によりｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）の全長を増幅した。
【0126】
第１のコヘシンドメインＣＡＣＯの配列と第２のコヘシンドメインＣＡＣＯの配列を含む遺伝子断片、及びドックリンドメインＤ２の配列を含む遺伝子断片、及びｐＥＴ２８ａの全長の断片を、In-Fusion Snap Assembly Master Mix User Manualに記載されている方法で連結し、ｐＥＴ－Ｓｃａ２を得た。
【0127】
ｐＥＴ－Ｓｃａ２の開始コドン（ATG）から終止コドンまで（TAA）までのＤＮＡ配列は下記配列番号１９の通りである。５’末端側の最初の下線なしの部分がpET28由来の配列、最初の下線部分がコヘシンドメインＣＡＣＯ（AcScaCCoh）、続く第２の下線なしの部分が第１のリンカー（アミノ酸数２）、続く第２の下線部分がコヘシンドメインＣＡＣＯ（AcScaCCohOPT）、続く第３の下線なしの部分が第２のリンカー（アミノ酸数１５）、続く第３の下線部分がドックリンドメインＤ２（RfGroup1Doc）をコードする。
配列番号１９：ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCGATTTACAGGTTGACATTGGAAGTACTAGTGGAAAAGCAGGTAGTGTTGTTAGTGTACCTATAACATTTACTAATGTACCTAAATCAGGTATCTATGCTCTAAGTTTTAGAACAAATTTCGACCCACAAAAGGTAACTGTAGCAAGTATAGATGCTGGCTCACTGATTGAAAATGCTTCTGATTTTACTACTTATTATAATAATGAAAATGGTTTTGCATCAATGACGTTTGAAGCCCCAGTTGATAGAGCTAGAATCATAGATAGTGATGGTGTATTTGCAACCATTAACTTTAAAGTTAGTGATAGTGCCAAAGTAGGTGAACTTTACAATATTACTACTAATAGTGCATATACTTCATTCTATTATTCTGGAACTGATGAAATCAAAAATGTTGTTTACAATGATGGAAAAATTGAGGTAATTGCATCGGTACCGGATCTCCAGGTCGACATTGGCTCCACCTCTGGGAAAGCCGGGTCTGTGGTGTCGGTCCCGATTACCTTCACCAACGTGCCGAAAAGCGGGATCTATGCCCTGAGCTTCCGTACGAACTTTGACCCCCAAAAGGTCACCGTGGCGTCCATTGATGCCGGCTCCTTGATCGAAAACGCGAGCGACTTCACCACGTACTACAACAACGAGAACGGCTTTGCCTCGATGACCTTCGAAGCGCCCGTCGATCGAGCCCGCATTATCGACAGCGATGGCGTCTTTGCGACGATCAACTTCAAGGTGAGCGATAGCGCGAAAGTCGGCGAACTGTACAACATCACGACCAACAGCGCCTATACGTCGTTCTACTACTCGGGCACAGACGAGATCAAGAACGTGGTGTACAACGACGGCAAGATTGAGGTCATTGCGTCGGTACCGACAAACACACCGACAAACACACCGCCCGTTCAGTCGGAGGAGGCTGTTCAGAAGTTCCCGGGTGATGCTAACTGCGACGGAATCGTCGATATTTCGGATGCAGTACTCATTATGCAGACTATGGCTAATCCAAGCAAATATCAGATGACCGACAAAGGCAGAATAAACGCTGACGTTACCGGTAACAGCGACGGAGTGACAGTTCTCGATGCACAGTTCATCCAGAGCTATTGTCTGGGACTTGTGGAACTTCCGCCTGTTGAATATGTGAACGTGACGAAACAGCCGGTGGAGCCCGCTCCTACATAA
配列番号１９：ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCGATTTACAGGTTGACATTGGAAGTACTAGTGGAAAAGCAGGTAGTGTTGTTAGTGTACCTATAACATTTACTAATGTACCTAAATCAGGTATCTATGCTCTAAGTTTTAGAACAAATTTCGACCCACAAAAGGTAACTGTAGCAAGTATAGATGCTGGCTCACTGATTGAAAATGCTTCTGATTTTACTACTTATTATAATAATGAAAATGGTTTTGCATCAATGACGTTTGAAGCCCCAGTTGATAGAGCTAGAATCATAGATAGTGATGGTGTATTTGCAACCATTAACTTTAAAGTTAGTGATAGTGCCAAAGTAGGTGAACTTTACAATATTACTACTAATAGTGCATATACTTCATTCTATTATTCTGGAACTGATGAAATCAAAAATGTTGTTTACAATGATGGAAAAATTGAGGTAATTGCATCGGTACCGGATCTCCAGGTCGACATTGGCTCCACCTCTGGGAAAGCCGGGTCTGTGGTGTCGGTCCCGATTACCTTCACCAACGTGCCGAAAAGCGGGATCTATGCCCTGAGCTTCCGTACGAACTTTGACCCCCAAAAGGTCACCGTGGCGTCCATTGATGCCGGCTCCTTGATCGAAAACGCGAGCGACTTCACCACGTACTACAACAACGAGAACGGCTTTGCCTCGATGACCTTCGAAGCGCCCGTCGATCGAGCCCGCATTATCGACAGCGATGGCGTCTTTGCGACGATCAACTTCAAGGTGAGCGATAGCGCGAAAGTCGGCGAACTGTACAACATCACGACCAACAGCGCCTATACGTCGTTCTACTACTCGGGCACAGACGAGATCAAGAACGTGGTGTACAACGACGGCAAGATTGAGGTCATTGCGTCGGTACCGACAAACACACCGACAAACACACCGCCCGTTCAGTCGGAGGAGGCTGTTCAGAAGTTCCCGGGTGATGCTAACTGCGACGGAATCGTCGATATTTCGGATGCAGTACTCATTATGCAGACTATGGCTAATCCAAGCAAATATCAGATGACCGACAAAGGCAGAATAAACGCTGACGTTACCGGTAACAGCGACGGAGTGACAGTTCTCGATGCACAGTTCATCCAGAGCTATTGTCTGGGACTTGTGGAACTTCCGCCTGTTGAATATGTGAACGTGACGAAACAGCCGGTGGAGCCCGCTCCTACATAA
【0128】
（６）Ｓｃａ３の発現ベクター（ｐＥＴ－Ｓｃａ３）の構築
図４は、ｐＥＴ－Ｓｃａ３の概念図である。ｐＥＴ－Ｓｃａ３を構築するために、コヘシンドメインＣ４－２の配列を含む遺伝子断片、コヘシンドメインＣ４－１の配列を含む遺伝子断片、及びドックリンドメインＤ３の配列を含む遺伝子断片を得た。
図４は、ｐＥＴ－Ｓｃａ３の概念図である。ｐＥＴ－Ｓｃａ３を構築するために、コヘシンドメインＣ４－２の配列を含む遺伝子断片、コヘシンドメインＣ４－１の配列を含む遺伝子断片、及びドックリンドメインＤ３の配列を含む遺伝子断片を得た。
【0129】
コヘシンドメインＣ４－２の配列を含む遺伝子断片は次のようにして得た。Ruminococcus flavefaciens FD-1のゲノムＤＮＡにおける、ScaB cohesin1の配列を光合成細菌及び大腸菌用にコドン頻度を最適化し、人工合成した。人工合成したＤＮＡ断片を、ｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）へＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法を用いて導入し、発現ベクターであるｐＥＸ－ＳｃａＢｃｏｈを得た。
【0130】
ｐＥＸ－ＳｃａＢｃｏｈをテンプレートとして、下記配列番号２０及び配列番号２１に記載のプライマーを用いてコヘシンドメインＣ４－２の配列を含む遺伝子断片を増幅させた。
配列番号２０：CGGATCCGGAGTGCTGGATGTTGCTGCG（pETSca3J1-Fwdとも称する。）
配列番号２１：GTTGTTGTGAGTATCGTTAGTTCCCTTAAC（pETSca3J2-Revとも称する。）
配列番号２０：CGGATCCGGAGTGCTGGATGTTGCTGCG（pETSca3J1-Fwdとも称する。）
配列番号２１：GTTGTTGTGAGTATCGTTAGTTCCCTTAAC（pETSca3J2-Revとも称する。）
【0131】
コヘシンドメインＣ４－１の配列を含む遺伝子断片は次のようにして得た。Ruminococcus flavefaciens FD-1のゲノムＤＮＡにおける、ScaA cohesin1の配列を光合成細菌及び大腸菌用にコドン頻度を最適化し、人工合成した。人工合成したＤＮＡ断片を、ｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）へＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法を用いて導入し、発現ベクターであるｐＥＸ－ＳｃａＡｃｏｈを得た。
【0132】
ｐＥＸ－ＳｃａＡｃｏｈをテンプレートとして、下記配列番号２２及び配列番号２３に記載のプライマーを用いてコヘシンドメインＣ４－１の配列を含む遺伝子断片を増幅させた。
配列番号２２：GATACTCACAACAACTGCTGCTACAACATC（pETSca3J2-Fwdとも称する。）
配列番号２３：CGTATACTGTTGTAGCAGGCTGTGGAGCTG（pETSca3J3-Revとも称する。）
配列番号２２：GATACTCACAACAACTGCTGCTACAACATC（pETSca3J2-Fwdとも称する。）
配列番号２３：CGTATACTGTTGTAGCAGGCTGTGGAGCTG（pETSca3J3-Revとも称する。）
【0133】
ドックリンドメインＤ３の配列を含む遺伝子断片は次のようにして得た。Ruminococcus flavefaciens FD-1のゲノムＤＮＡにおける、Group3 dockerinの配列を光合成細菌及び大腸菌用にコドン頻度を最適化し、人工合成した。人工合成したＤＮＡ断片を、ｐＥＴ２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）へＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法を用いて導入し、発現ベクターであるｐＥＸ－Ｇｒｏｕｐ３ｄｏｃを得た。
【0134】
ｐＥＸ－Ｇｒｏｕｐ３ｄｏｃをテンプレートとして、下記配列番号２４及び配列番号２５に記載のプライマーを用いてドックリンドメインＤ３の配列を含む遺伝子断片を増幅させた。
配列番号２４：GATACTCACAACAACTGCTGCTACAACATC（pETSca3J3-Fwdとも称する。）
配列番号２５：GGATCCTTATTCAACCGGGAGAGTTTTGCG（pETSca1J4-Revとも称する。）
配列番号２４：GATACTCACAACAACTGCTGCTACAACATC（pETSca3J3-Fwdとも称する。）
配列番号２５：GGATCCTTATTCAACCGGGAGAGTTTTGCG（pETSca1J4-Revとも称する。）
【0135】
さらに、ｐＥＴ－Ｓｃａ３を構築するために、下記配列番号２６及び配列番号２７に記載のプライマーを用いてＰＣＲ法によりｐＥＴ２８ａの全長を増幅した。
配列番号２６：GTTGAATAAGGATCCGAATTCGAGCTCCGTC（pETSca3J4-Fwdとも称する。）
配列番号２７：GGATCCTTATTCAACCGGGAGAGTTTTGCG（pETSca3J1-Revとも称する。）
配列番号２６：GTTGAATAAGGATCCGAATTCGAGCTCCGTC（pETSca3J4-Fwdとも称する。）
配列番号２７：GGATCCTTATTCAACCGGGAGAGTTTTGCG（pETSca3J1-Revとも称する。）
【0136】
コヘシンドメインＣ４－２の配列を含む遺伝子断片、コヘシンドメインＣ４－１の配列を含む遺伝子断片、及びドックリンドメインＤ３の配列を含む遺伝子断片、及びｐＥＴ２８ａの全長の断片について、In-Fusion Snap Assembly Master Mix User Manualに記載されている方法による連結を試みた。しかし、４つの断片を用いた試験では、目的のｐＥＴ－Ｓｃａ３が得られなかったため、予めコヘシンドメインＣ４－２の配列を含む遺伝子断片、コヘシンドメインＣ４－１の配列を含む遺伝子断片をドッキングＰＣＲにより連結し、コヘシンドメインＣ４－２の配列とコヘシンドメインＣ４－１の配列を含む遺伝子断片を得た。
【0137】
ドッキングＰＣＲには、コヘシンドメインＣ４－２の配列（RfScaBCoh1）を含む遺伝子断片と、コヘシンドメインＣ４－１の配列（RfScaACoh1）を含む遺伝子断片との間に15bpのオーバーラップ領域を持つように設計したプライマーを用いた。コヘシンドメインＣ４－２の配列（RfScaBCoh1）を含む遺伝子断片の増幅には、下記配列番号２８及び配列番号２９のプライマーを用いた。
配列番号２８：CGGATCCGGAGTGCTGGATGTTGCTGCG（pETSca3J1-Fwdとも称する。）
配列番号２９：CAGCAGTTGTTGTGAGTATCGTTAGTTCCCTTAACAGC（pETSca3DockingJ2-Revとも称する。）
コヘシンドメインＣ４－１の配列（RfScaACoh1）を含む遺伝子断片の増幅には、下記配列番号３０及び配列番号３１のプライマーを用いた。
配列番号３０：CTAACGATACTCACAACAACTGCTGCTACAACATC（pETSca3DockingJ2-Fwdとも称する。）
配列番号３１：CGTATACTGTTGTAGCAGGCTGTGGAGCTG（pETSca3J3-Revとも称する。）
配列番号２８：CGGATCCGGAGTGCTGGATGTTGCTGCG（pETSca3J1-Fwdとも称する。）
配列番号２９：CAGCAGTTGTTGTGAGTATCGTTAGTTCCCTTAACAGC（pETSca3DockingJ2-Revとも称する。）
コヘシンドメインＣ４－１の配列（RfScaACoh1）を含む遺伝子断片の増幅には、下記配列番号３０及び配列番号３１のプライマーを用いた。
配列番号３０：CTAACGATACTCACAACAACTGCTGCTACAACATC（pETSca3DockingJ2-Fwdとも称する。）
配列番号３１：CGTATACTGTTGTAGCAGGCTGTGGAGCTG（pETSca3J3-Revとも称する。）
【0138】
コヘシンドメインＣ４－２の配列とコヘシンドメインＣ４－１の配列を含む遺伝子断片、ドックリンドメインＤ３の配列を含む遺伝子断片、及びｐＥＴ２８ａの全長の断片の３つの断片を、In-Fusion Snap Assembly Master Mix User Manualに記載されている方法により連結し、ｐＥＴ－Ｓｃａ３を得た。
【0139】
ｐＥＴ－Ｓｃａ３の開始コドン（ATG）から終止コドンまで（TAA）までのＤＮＡ配列は下記配列番号３２の通りである。５’末端側の最初の下線なしの部分がpET28由来の配列及びその他の配列（アミノ酸数１４）、最初の下線部分がコヘシンドメインＣ４－２（RfScaBcoh1）、続く第２の下線なしの部分が第１のリンカー（アミノ酸数１６）、続く第２の下線部分がコヘシンドメインＣ４－１（RfScaAcoh1）、続く第３の下線なしの部分が第２のリンカー（アミノ酸数１３）、続く第３の下線部分がドックリンドメインＤ３（RfGroup3Doc）をコードする。
配列番号３２：ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCGGAGTGCTGGATGTTGCTGCGAATAAGACAGCTGGTGAGGATGTAGTCTTCGATTTCGGTAAATGGACAGCTAATGCAGGCGAAACCATTGATGTTGACGTGTTTGTGGACACTCAGGGTAAAGCCGTGTCTGCTATGGATGTCAGATTCCAGATCGATTCACCTCTTAAGATCACGGCGATGGAAAAAGAGGCACCTGCATTCAACACGACCGCAATGGTAAACCTTTCTAATCTGGGTCTTAACTTTAAATCACTCAGCGATAAAGGCGAACCTCTTACGCCGATAAACAATGAGCCTGTGTTCATGTTAGCGGTTGAGGTTCCTGCAAATACGCCTTCCGGTGATTATAAAATTGGTTTCGGTGACAAGTGTGAGGTTCACAAGAGCAACGATGGTTCCAAGTATTCAACCGCTGCAATCAACGGCGTGATCCTGTTAAGGGAACTAACGATACTCACAACAACTGCTGCTACAACATCAGCTCAGCCTGTTGCTAATGCAGACGTGATCTTCGACTTCGGTAACTACGAAGCTAAAGCTGGCGAAGAGGTTCAGGTCGACGTGACTGTCGATTCCAAGAACAAAGCAATTTCTGCTATGGACGTTGTGTTCGCAATTGACTCACCTCTTACCATCGATGAGATTGACAAAGAATCACTTGCATTCAAAACCACAGCTATGACCAACATGGCTATTCTCGGTGCAAACTTCAAATCACTCGACGACAAAGGCGAGCCACTCGTACCTACCAAGGATCCTGTGTTCACGTTATATGTCACAGTTCCTGCTACAACGCCTGATGGTGTATACAATGTCGGCTTCGGCAAGAAATGCGAAGTACATAAAAGCAACGATGGTTCTAAGTACTCATCAACAGCTATCAACGGTAAGATCAAAGTTGGTAACCCTGTTGATGATCCAACAACATCTGCTACAACAGCTCCACAGCCTGCTACAACAGTATACGGCGACCTTGACGGTGACGGCGAGGTTGACGTGTTCGATCTCATCCTCATGAGAAAAGCTGTCGAAAACGGCGATACAGAGCGTTTTGAAGCGGCTGACCTCAACTGCGACGGCGTGATTGACTCCGATGATCTCACATATCACAGCGAGTATCTCCACGGCATACGCAAAACTCTCCCGGTTGAATAA
配列番号３２：ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCGGAGTGCTGGATGTTGCTGCGAATAAGACAGCTGGTGAGGATGTAGTCTTCGATTTCGGTAAATGGACAGCTAATGCAGGCGAAACCATTGATGTTGACGTGTTTGTGGACACTCAGGGTAAAGCCGTGTCTGCTATGGATGTCAGATTCCAGATCGATTCACCTCTTAAGATCACGGCGATGGAAAAAGAGGCACCTGCATTCAACACGACCGCAATGGTAAACCTTTCTAATCTGGGTCTTAACTTTAAATCACTCAGCGATAAAGGCGAACCTCTTACGCCGATAAACAATGAGCCTGTGTTCATGTTAGCGGTTGAGGTTCCTGCAAATACGCCTTCCGGTGATTATAAAATTGGTTTCGGTGACAAGTGTGAGGTTCACAAGAGCAACGATGGTTCCAAGTATTCAACCGCTGCAATCAACGGCGTGATCCTGTTAAGGGAACTAACGATACTCACAACAACTGCTGCTACAACATCAGCTCAGCCTGTTGCTAATGCAGACGTGATCTTCGACTTCGGTAACTACGAAGCTAAAGCTGGCGAAGAGGTTCAGGTCGACGTGACTGTCGATTCCAAGAACAAAGCAATTTCTGCTATGGACGTTGTGTTCGCAATTGACTCACCTCTTACCATCGATGAGATTGACAAAGAATCACTTGCATTCAAAACCACAGCTATGACCAACATGGCTATTCTCGGTGCAAACTTCAAATCACTCGACGACAAAGGCGAGCCACTCGTACCTACCAAGGATCCTGTGTTCACGTTATATGTCACAGTTCCTGCTACAACGCCTGATGGTGTATACAATGTCGGCTTCGGCAAGAAATGCGAAGTACATAAAAGCAACGATGGTTCTAAGTACTCATCAACAGCTATCAACGGTAAGATCAAAGTTGGTAACCCTGTTGATGATCCAACAACATCTGCTACAACAGCTCCACAGCCTGCTACAACAGTATACGGCGACCTTGACGGTGACGGCGAGGTTGACGTGTTCGATCTCATCCTCATGAGAAAAGCTGTCGAAAACGGCGATACAGAGCGTTTTGAAGCGGCTGACCTCAACTGCGACGGCGTGATTGACTCCGATGATCTCACATATCACAGCGAGTATCTCCACGGCATACGCAAAACTCTCCCGGTTGAATAA
【0140】
３．形質転換体（大腸菌）における組換えタンパク質の発現
上記の「２．ＳＯＣ６用の大腸菌用ベクターの構築」にて取得した各発現ベクターを用いて、発現用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）株コンピテントセル、Agilent Technologies社製）を形質転換させて、各タンパク質を発現する形質転換体を得た。形質転換はすべてのベクターにおいてヒートショック法で行った。
上記の「２．ＳＯＣ６用の大腸菌用ベクターの構築」にて取得した各発現ベクターを用いて、発現用大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株（Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）株コンピテントセル、Agilent Technologies社製）を形質転換させて、各タンパク質を発現する形質転換体を得た。形質転換はすべてのベクターにおいてヒートショック法で行った。
【0141】
得られた大腸菌を培養し、以下の条件で陰イオン交換クロマトグラフィー法により精製した。精製により得られたタンパク質は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析で、各目的タンパク質の推定分子量付近にほぼ単一のバンドとしてあらわれた。
Device：NGC Chromatography System（Bio-Rad社製）
Column：EnrichQ
Flow rate:1 ml/min
BufferA:50 mM Tris-HCl(8.5)
BufferB:BufferA+1 MNaCl
Device：NGC Chromatography System（Bio-Rad社製）
Column：EnrichQ
Flow rate:1 ml/min
BufferA:50 mM Tris-HCl(8.5)
BufferB:BufferA+1 MNaCl
【0142】
ｐＥＴ－ＡＣＣＳ－Ｃｔｄｏｃから発現するタンパク質（本開示のＡＣＣ合成酵素サブユニットに該当する。）のアミノ酸配列は下記配列番号３３の通りである。Ｎ末端側の最初の下線なしの部分がｐＥＴ２８ａ由来の配列、続く下線部分がＡＣＣ合成酵素、続く第２の下線なしの部分がリンカー、続く第２の下線部分（Ｃ末端まで）がドックリンドメインＤＡＣＳを示す。
配列番号３３：MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGSGFEIAKTNSILSKLATNEEHGENSPYFDGWKAYDSDPFHPLKNPNGVIQMGLAENQLCLDLIEDWIKRNPKGSICSEGIKSFKAIANFQDYHGLPEFRRAIAKFMEKTRGGRVRFDPERVVMAGGATGANETIIFCLADPGDAFLVPSPYYPAFNRDLRWRTGVQLIPIHCESSNNFKITSKAVKEAYENAQKSNIKVKGLILTNPSNPLGTTLDKDTLKSVLSFTNQHNIHLVCDEIYAATVFDTPQFVSIAEILDEQEMTYCNKDLVHIVYSLSKDMGLPGFRVGIIYSFNDDVVNCARKMSSFGLVSTQTQYFLAAMLSDEKFVDNFLRESAMRLGKRHKHFTNGLEEVGIKCLKNNAGLFCWMDLRPLLRESTFDSEMSLWRVIINDVKLNFSPGSSFECQEPGWFRVCFANMDDGTVDIALARIRRFVGVEKSGDKSSSMEKKQQWKKNNLRLSFSKRMYDESVLSPLSSPIPPSPLVRTYKVPGTPSTKLYGDVNDDGKVNSTDAVALKRYVLRSGISINTDNADLNEDGRVNSTDLGILKRYILKEIDTLPYKN
配列番号３３：MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGSGFEIAKTNSILSKLATNEEHGENSPYFDGWKAYDSDPFHPLKNPNGVIQMGLAENQLCLDLIEDWIKRNPKGSICSEGIKSFKAIANFQDYHGLPEFRRAIAKFMEKTRGGRVRFDPERVVMAGGATGANETIIFCLADPGDAFLVPSPYYPAFNRDLRWRTGVQLIPIHCESSNNFKITSKAVKEAYENAQKSNIKVKGLILTNPSNPLGTTLDKDTLKSVLSFTNQHNIHLVCDEIYAATVFDTPQFVSIAEILDEQEMTYCNKDLVHIVYSLSKDMGLPGFRVGIIYSFNDDVVNCARKMSSFGLVSTQTQYFLAAMLSDEKFVDNFLRESAMRLGKRHKHFTNGLEEVGIKCLKNNAGLFCWMDLRPLLRESTFDSEMSLWRVIINDVKLNFSPGSSFECQEPGWFRVCFANMDDGTVDIALARIRRFVGVEKSGDKSSSMEKKQQWKKNNLRLSFSKRMYDESVLSPLSSPIPPSPLVRTYKVPGTPSTKLYGDVNDDGKVNSTDAVALKRYVLRSGISINTDNADLNEDGRVNSTDLGILKRYILKEIDTLPYKN
【0143】
ｐＥＴ－ＡＣＣＯ－Ａｃｄｏｃから発現するタンパク質（本開示のＡＣＣ酸化酵素サブユニットに該当する。）のアミノ酸配列は下記配列番号３４の通りである。Ｎ末端側の最初の下線なしの部分がｐＥＴ２８ａ由来の配列、続く下線部分がＡＣＣ酸化酵素、続く第２の下線なしの部分がリンカー、続く第２の下線部分（Ｃ末端まで）がドックリンドメインＤＡＣＯを示す。
配列番号３４：MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGSENFPIINLENLNGDERAKTMEMIKDACENWGFFELVNHGIPHEVMDTVEKLTKGHYKKCMEQRFKELVASKGLEAVQAEVTDLDWESTFFLRHLPTSNISQVPDLDEEYREVMRDFAKRLEKLAEELLDLLCENLGLEKSYLKNAFYGSKGPNFGTKVSNYPPCPKPDLIKGLRAHTDAGGIILLFQDDKVSGLQLLKDEQWIDVPPMRHSIVVNLGDQLEVITNGKYKSVMHRVIAQTDGTRMSLASFYNPGNDAVIYPAPSLIEESKQVYPKFVFDDYMKLYAGLKFQPKEPRFEAMKAMEANVELVDQIASALITPPGTKFIYGDVDGNGSVRINDAVLIRDYVLGKINEFPYEYGMLAADVDGNGSIKINDAVLVRDYVLGKIFLFPVEEKEE
配列番号３４：MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGSENFPIINLENLNGDERAKTMEMIKDACENWGFFELVNHGIPHEVMDTVEKLTKGHYKKCMEQRFKELVASKGLEAVQAEVTDLDWESTFFLRHLPTSNISQVPDLDEEYREVMRDFAKRLEKLAEELLDLLCENLGLEKSYLKNAFYGSKGPNFGTKVSNYPPCPKPDLIKGLRAHTDAGGIILLFQDDKVSGLQLLKDEQWIDVPPMRHSIVVNLGDQLEVITNGKYKSVMHRVIAQTDGTRMSLASFYNPGNDAVIYPAPSLIEESKQVYPKFVFDDYMKLYAGLKFQPKEPRFEAMKAMEANVELVDQIASALITPPGTKFIYGDVDGNGSVRINDAVLIRDYVLGKINEFPYEYGMLAADVDGNGSIKINDAVLVRDYVLGKIFLFPVEEKEE
【0144】
ｐＥＴ－ＡｔＭＴＡＮ２－ＣｊＤｏｃから発現するタンパク質（本開示のＭＴＡ分解酵素サブユニットに該当する。）のアミノ酸配列は下記配列番号３５の通りである。Ｎ末端側の最初の下線なしの部分がｐＥＴ２８ａ由来の配列、続く下線部分がＭＴＡ分解酵素、続く第２の下線なしの部分がリンカー、続く第２の下線部分（Ｃ末端まで）がドックリンドメインＤＭＴＡＮを示す。
配列番号３５：MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMEGVMGQVEKRPISTIVFIVAMQKEAQPLINRLRLVEEVNTPFPKEVTWIMFKGMYKDLNINIVCPGKDSTLGVESVGTVPASLVTYASILAIQPDLIINAGTAGGFKAKGACISDVYVVSTVAFHDRRIPVPVLDIYGVGMRNTFPTPNLIKELNLKVGRLSTGDSMDMSPHDEESITANDATVKDMEGAAVAYVADIFKVPTILIKGVTDIVDGNRPTSEEFLENLAAVTAKLDESLTKVIDFISGKCLSDLSSQPQQGLKGDVNNDGAIDALDIAALKKAILTQSTSNINLTNADMNNDGNIDAIDFAQLKVKLLN
配列番号３５：MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMEGVMGQVEKRPISTIVFIVAMQKEAQPLINRLRLVEEVNTPFPKEVTWIMFKGMYKDLNINIVCPGKDSTLGVESVGTVPASLVTYASILAIQPDLIINAGTAGGFKAKGACISDVYVVSTVAFHDRRIPVPVLDIYGVGMRNTFPTPNLIKELNLKVGRLSTGDSMDMSPHDEESITANDATVKDMEGAAVAYVADIFKVPTILIKGVTDIVDGNRPTSEEFLENLAAVTAKLDESLTKVIDFISGKCLSDLSSQPQQGLKGDVNNDGAIDALDIAALKKAILTQSTSNINLTNADMNNDGNIDAIDFAQLKVKLLN
【0145】
ｐＥＴ－Ｓｃａ１から発現するタンパク質（本開示の第１の骨格蛋白質に該当する。）のアミノ酸配列は下記配列番号３６の通りである。Ｎ末端側の最初の下線なしの部分がｐＥＴ２８ａ由来の配列、続く下線部分がコヘシンドメインＣ１（RfScaCCohOPT2由来の配列）、続く第２の下線なしの部分が第１のリンカー（アミノ酸数１４）、続く第２の下線部分がコヘシンドメインＣＭＴＡＮ（CjCipACoh由来の配列）、続く第３の下線なしの部分が第２のリンカー（アミノ酸数１０）、続く第３の下線部分がコヘシンドメインＣＡＣＳ（CtCipACoh3由来の配列）を示す。
配列番号３６：MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGSAGETVQISASNAEAKAGDQFEVKVSLADVPSTGIQGIDFAVTYDNTVVTIDKITVGEIADTKAASSDQTASLLPTFDVSIQNSEGYSSVIWSTAVEDSSYWISKDGVLCTITGTVSSNAKPGAESPIKLEAVKRETYVGSGTDNSSISAGYSANDKAVKYTVKATNGKISVPSAEVTTTKAPDQATVISPDPTNALKVTVGTAEGNVGETVTVPVTFADVAKVNNVGTCNFYLAYDASLLDVVSVDAGPIVKNAAVNFSSSASNGTISFLFLDNTITDELITSDGVFANITFKLKNVSTKTTTPITFKDGGAFGDGTMSKITTVIKTNGSVTIIPGDPEPTEDLNVAVGMGRGSNAIKIKVDTVNAKPGDTVNIPVRFSGIPSKGIANCDFVYSYDPNVLEIIEIKPGELIVDPNPDKSFDTAVYPDRKIIVFLFAEDSGTGAYAITKDGVFATIVAKVKSGAPNGLSVIKFVEVGGFANNDLVEQRTQFFDGGVNVGDTT
配列番号３６：MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGSAGETVQISASNAEAKAGDQFEVKVSLADVPSTGIQGIDFAVTYDNTVVTIDKITVGEIADTKAASSDQTASLLPTFDVSIQNSEGYSSVIWSTAVEDSSYWISKDGVLCTITGTVSSNAKPGAESPIKLEAVKRETYVGSGTDNSSISAGYSANDKAVKYTVKATNGKISVPSAEVTTTKAPDQATVISPDPTNALKVTVGTAEGNVGETVTVPVTFADVAKVNNVGTCNFYLAYDASLLDVVSVDAGPIVKNAAVNFSSSASNGTISFLFLDNTITDELITSDGVFANITFKLKNVSTKTTTPITFKDGGAFGDGTMSKITTVIKTNGSVTIIPGDPEPTEDLNVAVGMGRGSNAIKIKVDTVNAKPGDTVNIPVRFSGIPSKGIANCDFVYSYDPNVLEIIEIKPGELIVDPNPDKSFDTAVYPDRKIIVFLFAEDSGTGAYAITKDGVFATIVAKVKSGAPNGLSVIKFVEVGGFANNDLVEQRTQFFDGGVNVGDTT
【0146】
ｐＥＴ－Ｓｃａ２から発現するタンパク質（本開示の第２の骨格蛋白質に該当する。）のアミノ酸配列は下記配列番号３７の通りである。Ｎ末端側の最初の下線なしの部分がｐＥＴ２８ａ由来の配列、続く下線部分がコヘシンドメインＣＡＣＯ（AcScaCCoh由来の配列）、続く第２の下線なしの部分が第１のリンカー（アミノ酸数２）、続く第２の下線部分がコヘシンドメインＣＡＣＯ（AcScaCCohOPT由来の配列）、続く第３の下線なしの部分が第２のリンカー（アミノ酸数１５）、続く第３の下線部分がドックリンドメインＤ２（RfGroup1Doc由来の配列）を示す。
配列番号３７：MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGSDLQVDIGSTSGKAGSVVSVPITFTNVPKSGIYALSFRTNFDPQKVTVASIDAGSLIENASDFTTYYNNENGFASMTFEAPVDRARIIDSDGVFATINFKVSDSAKVGELYNITTNSAYTSFYYSGTDEIKNVVYNDGKIEVIASVPDLQVDIGSTSGKAGSVVSVPITFTNVPKSGIYALSFRTNFDPQKVTVASIDAGSLIENASDFTTYYNNENGFASMTFEAPVDRARIIDSDGVFATINFKVSDSAKVGELYNITTNSAYTSFYYSGTDEIKNVVYNDGKIEVIASVPTNTPTNTPPVQSEEAVQKFPGDANCDGIVDISDAVLIMQTMANPSKYQMTDKGRINADVTGNSDGVTVLDAQFIQSYCLGLVELPPVEYVNVTKQPVEPA
配列番号３７：MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGSDLQVDIGSTSGKAGSVVSVPITFTNVPKSGIYALSFRTNFDPQKVTVASIDAGSLIENASDFTTYYNNENGFASMTFEAPVDRARIIDSDGVFATINFKVSDSAKVGELYNITTNSAYTSFYYSGTDEIKNVVYNDGKIEVIASVPDLQVDIGSTSGKAGSVVSVPITFTNVPKSGIYALSFRTNFDPQKVTVASIDAGSLIENASDFTTYYNNENGFASMTFEAPVDRARIIDSDGVFATINFKVSDSAKVGELYNITTNSAYTSFYYSGTDEIKNVVYNDGKIEVIASVPTNTPTNTPPVQSEEAVQKFPGDANCDGIVDISDAVLIMQTMANPSKYQMTDKGRINADVTGNSDGVTVLDAQFIQSYCLGLVELPPVEYVNVTKQPVEPA
【0147】
ｐＥＴ－Ｓｃａ３から発現するタンパク質（本開示の第３の骨格蛋白質に該当する。）のアミノ酸配列は下記配列番号３８の通りである。Ｎ末端側の最初の下線なしの部分がｐＥＴ２８ａ由来の配列及びその他の配列、続く下線部分がコヘシンドメインＣ４－２（RfScaBcoh1由来の配列）、続く第２の下線なしの部分が第１のリンカー（アミノ酸数１６）、続く第２の下線部分がコヘシンドメインＣ４－１（RfScaAcoh1由来の配列）、続く第３の下線なしの部分が第２のリンカー（アミノ酸数１３）、続く第３の下線部分がドックリンドメインＤ３（RfGroup3Doc由来の配列）を示す。
配列番号３８：MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGSGVLDVAANKTAGEDVVFDFGKWTANAGETIDVDVFVDTQGKAVSAMDVRFQIDSPLKITAMEKEAPAFNTTAMVNLSNLGLNFKSLSDKGEPLTPINNEPVFMLAVEVPANTPSGDYKIGFGDKCEVHKSNDGSKYSTAAINGVILLRELTILTTTAATTSAQPVANADVIFDFGNYEAKAGEEVQVDVTVDSKNKAISAMDVVFAIDSPLTIDEIDKESLAFKTTAMTNMAILGANFKSLDDKGEPLVPTKDPVFTLYVTVPATTPDGVYNVGFGKKCEVHKSNDGSKYSSTAINGKIKVGNPVDDPTTSATTAPQPATTVYGDLDGDGEVDVFDLILMRKAVENGDTERFEAADLNCDGVIDSDDLTYHSEYLHGIRKTLPVE
配列番号３８：MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMASMTGGQQMGRGSGVLDVAANKTAGEDVVFDFGKWTANAGETIDVDVFVDTQGKAVSAMDVRFQIDSPLKITAMEKEAPAFNTTAMVNLSNLGLNFKSLSDKGEPLTPINNEPVFMLAVEVPANTPSGDYKIGFGDKCEVHKSNDGSKYSTAAINGVILLRELTILTTTAATTSAQPVANADVIFDFGNYEAKAGEEVQVDVTVDSKNKAISAMDVVFAIDSPLTIDEIDKESLAFKTTAMTNMAILGANFKSLDDKGEPLVPTKDPVFTLYVTVPATTPDGVYNVGFGKKCEVHKSNDGSKYSSTAINGKIKVGNPVDDPTTSATTAPQPATTVYGDLDGDGEVDVFDLILMRKAVENGDTERFEAADLNCDGVIDSDDLTYHSEYLHGIRKTLPVE
【0148】
４．Ｓｃａ１とＡＣＣ合成酵素サブユニット（ＡＣＳ－ＤＡＣＳ）の結合試験
精製したＳｃａ１とＡＣＳ－ＤＡＣＳを等モルで混合した。その後、Ｎａｔｉｖｅ－ＰＡＧＥ法により、Ｓｃａ１とＡＣＳ－ＤＡＣＳが結合していることを確認した。図５において、Ｎｏ．３はＳｃａ１とＡＣＳ－ＤＡＣＳを混合したサンプルである。Ｎｏ．１は、Ｎｏ．３と同量のＳｃａ１のみのサンプルであり、Ｎｏ．２はＮｏ．３と同量のＡＣＳ－ＤＡＣＳのみのサンプルである。Ｎｏ．３（Ｓｃａ１とＡＣＳ－ＤＡＣＳを混合したサンプル）は、Ｎｏ．１（Ｓｃａ１のみ）と、Ｎｏ．２（ＡＣＳ－ＤＡＣＳのみ）から、矢印の位置にバンドが移動しており、Ｓｃａ１とＡＣＳ－ＤＡＣＳが複合体を形成することが確認できた。
精製したＳｃａ１とＡＣＳ－ＤＡＣＳを等モルで混合した。その後、Ｎａｔｉｖｅ－ＰＡＧＥ法により、Ｓｃａ１とＡＣＳ－ＤＡＣＳが結合していることを確認した。図５において、Ｎｏ．３はＳｃａ１とＡＣＳ－ＤＡＣＳを混合したサンプルである。Ｎｏ．１は、Ｎｏ．３と同量のＳｃａ１のみのサンプルであり、Ｎｏ．２はＮｏ．３と同量のＡＣＳ－ＤＡＣＳのみのサンプルである。Ｎｏ．３（Ｓｃａ１とＡＣＳ－ＤＡＣＳを混合したサンプル）は、Ｎｏ．１（Ｓｃａ１のみ）と、Ｎｏ．２（ＡＣＳ－ＤＡＣＳのみ）から、矢印の位置にバンドが移動しており、Ｓｃａ１とＡＣＳ－ＤＡＣＳが複合体を形成することが確認できた。
【0149】
５．Ｓｃａ１とＭＴＡ分解酵素サブユニット（ＭＴＡＮ－ＤＭＴＡＮ）の結合試験
精製したＳｃａ１とＭＴＡＮ－ＤＭＴＡＮを１：１５（Ｓｃａ１：ＭＴＡＮ－ＤＭＴＡＮ）のモル比で混合した。その後、Ｎａｔｉｖｅ－ＰＡＧＥ法により、Ｓｃａ１とＭＴＡＮ－ＤＭＴＡＮが結合していることを確認した。図６において、Ｎｏ．３はＳｃａ１とＭＴＡＮ－ＤＭＴＡＮを混合したサンプルである。Ｎｏ．１は、Ｎｏ．３と同量のＳｃａ１のみのサンプルであり、Ｎｏ．２はＮｏ．３と同量のＭＴＡＮ－ＤＭＴＡＮのみのサンプルである。Ｎｏ．３（Ｓｃａ１とＭＴＡＮ－ＤＭＴＡＮを混合したサンプル）は、Ｎｏ．１（Ｓｃａ１のみ）と、Ｎｏ．２（ＭＴＡＮ－ＤＭＴＡＮのみ）から、矢印の位置にバンドが移動しており、Ｓｃａ１とＭＴＡＮ－ＤＭＴＡＮが複合体を形成することが確認できた。
精製したＳｃａ１とＭＴＡＮ－ＤＭＴＡＮを１：１５（Ｓｃａ１：ＭＴＡＮ－ＤＭＴＡＮ）のモル比で混合した。その後、Ｎａｔｉｖｅ－ＰＡＧＥ法により、Ｓｃａ１とＭＴＡＮ－ＤＭＴＡＮが結合していることを確認した。図６において、Ｎｏ．３はＳｃａ１とＭＴＡＮ－ＤＭＴＡＮを混合したサンプルである。Ｎｏ．１は、Ｎｏ．３と同量のＳｃａ１のみのサンプルであり、Ｎｏ．２はＮｏ．３と同量のＭＴＡＮ－ＤＭＴＡＮのみのサンプルである。Ｎｏ．３（Ｓｃａ１とＭＴＡＮ－ＤＭＴＡＮを混合したサンプル）は、Ｎｏ．１（Ｓｃａ１のみ）と、Ｎｏ．２（ＭＴＡＮ－ＤＭＴＡＮのみ）から、矢印の位置にバンドが移動しており、Ｓｃａ１とＭＴＡＮ－ＤＭＴＡＮが複合体を形成することが確認できた。
【0150】
６．Ｓｃａ１とＳｃａ３の結合試験
精製したＳｃａ１とＳｃａ３を等モルで混合した。その後、Ｎａｔｉｖｅ－ＰＡＧＥ法により、Ｓｃａ１とＳｃａ３が結合していることを確認した。図７において、Ｎｏ．３はＳｃａ１とＳｃａ３を混合したサンプルである。Ｎｏ．１は、Ｎｏ．３と同量のＳｃａ１のみのサンプルであり、Ｎｏ．２はＮｏ．３と同量のＳｃａ３のみのサンプルである。Ｎｏ．３（Ｓｃａ１とＳｃａ３を混合したサンプル）は、Ｎｏ．１（Ｓｃａ１のみ）と、Ｎｏ．２（Ｓｃａ３のみ）から、矢印の位置にバンドが移動しており、Ｓｃａ１とＳｃａ３が複合体を形成することが確認できた。
精製したＳｃａ１とＳｃａ３を等モルで混合した。その後、Ｎａｔｉｖｅ－ＰＡＧＥ法により、Ｓｃａ１とＳｃａ３が結合していることを確認した。図７において、Ｎｏ．３はＳｃａ１とＳｃａ３を混合したサンプルである。Ｎｏ．１は、Ｎｏ．３と同量のＳｃａ１のみのサンプルであり、Ｎｏ．２はＮｏ．３と同量のＳｃａ３のみのサンプルである。Ｎｏ．３（Ｓｃａ１とＳｃａ３を混合したサンプル）は、Ｎｏ．１（Ｓｃａ１のみ）と、Ｎｏ．２（Ｓｃａ３のみ）から、矢印の位置にバンドが移動しており、Ｓｃａ１とＳｃａ３が複合体を形成することが確認できた。
【0151】
７．Ｓｃａ２とＡＣＣ酸化酵素サブユニット（ＡＣＯ－ＤＡＣＯ）の結合試験
精製したＳｃａ２とＡＣＯ－ＤＡＣＯを１：２（Ｓｃａ２：ＡＣＯ－ＤＡＣＯ）のモル比で混合した。その後、Ｎａｔｉｖｅ－ＰＡＧＥ法により、Ｓｃａ２とＡＣＯ－ＤＡＣＯが結合していることを確認した。図８において、Ｎｏ．３はＳｃａ２とＡＣＯ－ＤＡＣＯを混合したサンプルである。Ｎｏ．１は、Ｎｏ．３と同量のＡＣＯ－ＤＡＣＯのみのサンプルであり、Ｎｏ．２はＮｏ．３と同量のＳｃａ２のみのサンプルである。Ｎｏ．３（Ｓｃａ２とＡＣＯ－ＤＡＣＯを混合したサンプル）は、Ｎｏ．１（ＡＣＯ－ＤＡＣＯのみ）と、Ｎｏ．２（Ｓｃａ２のみ）から、矢印の位置にバンドが移動しており、Ｓｃａ２とＡＣＯ－ＤＡＣＯが複合体を形成することが確認できた。
また、ゲルろ過クロマトグラフィーによる結合試験によって、Ｓｃａ２ １ｍｏｌに対してＡＣＯ－ＤＡＣＯがほぼ２ｍｏｌの割合で結合することが確認できた。
精製したＳｃａ２とＡＣＯ－ＤＡＣＯを１：２（Ｓｃａ２：ＡＣＯ－ＤＡＣＯ）のモル比で混合した。その後、Ｎａｔｉｖｅ－ＰＡＧＥ法により、Ｓｃａ２とＡＣＯ－ＤＡＣＯが結合していることを確認した。図８において、Ｎｏ．３はＳｃａ２とＡＣＯ－ＤＡＣＯを混合したサンプルである。Ｎｏ．１は、Ｎｏ．３と同量のＡＣＯ－ＤＡＣＯのみのサンプルであり、Ｎｏ．２はＮｏ．３と同量のＳｃａ２のみのサンプルである。Ｎｏ．３（Ｓｃａ２とＡＣＯ－ＤＡＣＯを混合したサンプル）は、Ｎｏ．１（ＡＣＯ－ＤＡＣＯのみ）と、Ｎｏ．２（Ｓｃａ２のみ）から、矢印の位置にバンドが移動しており、Ｓｃａ２とＡＣＯ－ＤＡＣＯが複合体を形成することが確認できた。
また、ゲルろ過クロマトグラフィーによる結合試験によって、Ｓｃａ２ １ｍｏｌに対してＡＣＯ－ＤＡＣＯがほぼ２ｍｏｌの割合で結合することが確認できた。
【0152】
８．Ｓｃａ２とＳｃａ３の結合試験
精製したＳｃａ２とＳｃａ３を等モルで混合した。その後、Ｎａｔｉｖｅ－ＰＡＧＥ法により、Ｓｃａ２とＳｃａ３が結合していることを確認した。図９において、Ｎｏ．９はＳｃａ２とＳｃａ３を混合したサンプルである。Ｎｏ．７は、Ｎｏ．９と同量のＳｃａ２のみのサンプルであり、Ｎｏ．８はＮｏ．３と同量のＳｃａ３のみのサンプルである。Ｎｏ．９（Ｓｃａ２とＳｃａ３を混合したサンプル）は、Ｎｏ．７（Ｓｃａ２のみ）と、Ｎｏ．８（Ｓｃａ３のみ）から、矢印の位置にバンドが移動しており、Ｓｃａ２とＳｃａ３が複合体を形成することが確認できた。
精製したＳｃａ２とＳｃａ３を等モルで混合した。その後、Ｎａｔｉｖｅ－ＰＡＧＥ法により、Ｓｃａ２とＳｃａ３が結合していることを確認した。図９において、Ｎｏ．９はＳｃａ２とＳｃａ３を混合したサンプルである。Ｎｏ．７は、Ｎｏ．９と同量のＳｃａ２のみのサンプルであり、Ｎｏ．８はＮｏ．３と同量のＳｃａ３のみのサンプルである。Ｎｏ．９（Ｓｃａ２とＳｃａ３を混合したサンプル）は、Ｎｏ．７（Ｓｃａ２のみ）と、Ｎｏ．８（Ｓｃａ３のみ）から、矢印の位置にバンドが移動しており、Ｓｃａ２とＳｃａ３が複合体を形成することが確認できた。
【0153】
９．酵素複合体の作製及びシアノバクテリアの形質転換
結合特異性を有するコヘシン－ドックリン結合を組み合わせて酵素複合体を作製できること、シアノバクテリアを形質転換して、酵素複合体を産生する光合成生物を得られることは、特許文献２（特開２０１３－０７４８１４号公報）、参考文献１：Jindou, S., et al., Engineered platform for bioethylene production by a cyanobacterium expressing a chimeric complex of plant enzymes. ACS Synth Biol, 2014. 3(7): p. 487-96.、参考文献２：神藤 定生（名城大学）、酵素複合体を導入したシアノバクテリアによるバイオエチレン生産の相乗機構の解明と大量生産の研究、公益財団法人 日比科学技術振興財団 研究報告書、平成２６年にて報告されている。本開示において、特許文献２、参考文献１、参考文献２の内容も参酌でき、これらの内容は本明細書に組み込まれる。
結合特異性を有するコヘシン－ドックリン結合を組み合わせて酵素複合体を作製できること、シアノバクテリアを形質転換して、酵素複合体を産生する光合成生物を得られることは、特許文献２（特開２０１３－０７４８１４号公報）、参考文献１：Jindou, S., et al., Engineered platform for bioethylene production by a cyanobacterium expressing a chimeric complex of plant enzymes. ACS Synth Biol, 2014. 3(7): p. 487-96.、参考文献２：神藤 定生（名城大学）、酵素複合体を導入したシアノバクテリアによるバイオエチレン生産の相乗機構の解明と大量生産の研究、公益財団法人 日比科学技術振興財団 研究報告書、平成２６年にて報告されている。本開示において、特許文献２、参考文献１、参考文献２の内容も参酌でき、これらの内容は本明細書に組み込まれる。
【0154】
１０．ＳＯＣ６のまとめ
上記の実施例より、Ｓｃａ３が、ドックリンドメインＤ３とコヘシンドメインＣ１とを介したコヘシン－ドックリン結合によってＳｃａ１を保持することを確認できた。また、Ｓｃａ３が、コヘシンドメインＣ４（Ｃ４－１，Ｃ４－２）とドックリンドメインＤ２とを介したコヘシン－ドックリン結合によってＳｃａ２を保持することが確認できた。
また、上記の実施例より、ＡＣＳ－ＤＡＣＳ、ＡＣＯ－ＤＡＣＯ、ＭＴＡＮ－ＤＭＴＡＮ、Ｓｃａ１、Ｓｃａ２、Ｓｃａ３を得ることができた。これらのタンパク質を用いて、酵素複合体ＳＯＣ６を構築できる。
上記の実施例より、Ｓｃａ３が、ドックリンドメインＤ３とコヘシンドメインＣ１とを介したコヘシン－ドックリン結合によってＳｃａ１を保持することを確認できた。また、Ｓｃａ３が、コヘシンドメインＣ４（Ｃ４－１，Ｃ４－２）とドックリンドメインＤ２とを介したコヘシン－ドックリン結合によってＳｃａ２を保持することが確認できた。
また、上記の実施例より、ＡＣＳ－ＤＡＣＳ、ＡＣＯ－ＤＡＣＯ、ＭＴＡＮ－ＤＭＴＡＮ、Ｓｃａ１、Ｓｃａ２、Ｓｃａ３を得ることができた。これらのタンパク質を用いて、酵素複合体ＳＯＣ６を構築できる。
【0155】
１１．ＳＯＣ２９の設計
図８に、酵素複合体ＳＯＣ２９の概念図を示す。ＳＯＣ６からの変更点は、主に次の点である。Ｓｃａ２のコヘシンドメインＣＡＣＯ（AcScaCCoh）を１個追加し、計３個にする。Ｓｃａ３のコヘシンドメインＣ４（Ｃ４－１，Ｃ４－２）を、３つの後述するコヘシンドメインＣ４（Ｃ４－３）に変更する。新たに、Ｓｃａ３とＳｃａ２との間に介在するＳｃａ４を追加する。Ｓｃａ４は、３個のコヘシンドメインＣ６と、１個のドックリンドメインＤ５を含む。ＳＯＣ２９のコヘシンドメインとドックリンドメインにおいて、ＳＯＣ６からの主な変更は以下の通りである。
＜Ｓｃａ３＞
Ｃ４－３：Clostridium thermocellum SdbA typeII cohesion
＜Ｓｃａ４＞
Ｃ６：Ruminococcus flavefaciens FD-1 ScaB cohesin1
Ｄ５：Clostridium thermocellum CipA typeII Dockerin
図８に、酵素複合体ＳＯＣ２９の概念図を示す。ＳＯＣ６からの変更点は、主に次の点である。Ｓｃａ２のコヘシンドメインＣＡＣＯ（AcScaCCoh）を１個追加し、計３個にする。Ｓｃａ３のコヘシンドメインＣ４（Ｃ４－１，Ｃ４－２）を、３つの後述するコヘシンドメインＣ４（Ｃ４－３）に変更する。新たに、Ｓｃａ３とＳｃａ２との間に介在するＳｃａ４を追加する。Ｓｃａ４は、３個のコヘシンドメインＣ６と、１個のドックリンドメインＤ５を含む。ＳＯＣ２９のコヘシンドメインとドックリンドメインにおいて、ＳＯＣ６からの主な変更は以下の通りである。
＜Ｓｃａ３＞
Ｃ４－３：Clostridium thermocellum SdbA typeII cohesion
＜Ｓｃａ４＞
Ｃ６：Ruminococcus flavefaciens FD-1 ScaB cohesin1
Ｄ５：Clostridium thermocellum CipA typeII Dockerin
【0156】
酵素複合体ＳＯＣ２９の第２の骨格蛋白質Ｓｃａ２のアミノ酸配列は下記配列番号３９の通りである。Ｎ末端側の最初の下線部分がコヘシンドメインＣＡＣＯ（RAcScaCCoh由来の配列）、続く下線なしの部分が第１のリンカー（アミノ酸数２）、続く第２の下線部分がコヘシンドメインＣＡＣＯ（RAcScaCCoh由来の配列）、続く第２の下線なしの部分が第２のリンカー（アミノ酸数２）、続く第３の下線部分がコヘシンドメインＣＡＣＯ（RAcScaCCoh由来の配列）、続く第３の下線なしの部分が第３のリンカー（アミノ酸数１５）、続く第４の下線部分がドックリンドメインＤ２（RfGroup1Doc由来の配列）を示す。
配列番号３９：DLQVDIGSTSGKAGSVVSVPITFTNVPKSGIYALSFRTNFDPQKVTVASIDAGSLIENASDFTTYYNNENGFASMTFEAPVDRARIIDSDGVFATINFKVSDSAKVGELYNITTNSAYTSFYYSGTDEIKNVVYNDGKIEVIASVPDLQVDIGSTSGKAGSVVSVPITFTNVPKSGIYALSFRTNFDPQKVTVASIDAGSLIENASDFTTYYNNENGFASMTFEAPVDRARIIDSDGVFATINFKVSDSAKVGELYNITTNSAYTSFYYSGTDEIKNVVYNDGKIEVIASVPDLQVDIGSTSGKAGSVVSVPITFTNVPKSGIYALSFRTNFDPQKVTVASIDAGSLIENASDFTTYYNNENGFASMTFEAPVDRARIIDSDGVFATINFKVSDSAKVGELYNITTNSAYTSFYYSGTDEIKNVVYNDGKIEVIASVPTNTPTNTPPVQSEEAVQKFPGDANCDGIVDISDAVLIMQTMANPSKYQMTDKGRINADVTGNSDGVTVLDAQFIQSYCLGLVELPPVEYVNVTKQPVEPA
配列番号３９：DLQVDIGSTSGKAGSVVSVPITFTNVPKSGIYALSFRTNFDPQKVTVASIDAGSLIENASDFTTYYNNENGFASMTFEAPVDRARIIDSDGVFATINFKVSDSAKVGELYNITTNSAYTSFYYSGTDEIKNVVYNDGKIEVIASVPDLQVDIGSTSGKAGSVVSVPITFTNVPKSGIYALSFRTNFDPQKVTVASIDAGSLIENASDFTTYYNNENGFASMTFEAPVDRARIIDSDGVFATINFKVSDSAKVGELYNITTNSAYTSFYYSGTDEIKNVVYNDGKIEVIASVPDLQVDIGSTSGKAGSVVSVPITFTNVPKSGIYALSFRTNFDPQKVTVASIDAGSLIENASDFTTYYNNENGFASMTFEAPVDRARIIDSDGVFATINFKVSDSAKVGELYNITTNSAYTSFYYSGTDEIKNVVYNDGKIEVIASVPTNTPTNTPPVQSEEAVQKFPGDANCDGIVDISDAVLIMQTMANPSKYQMTDKGRINADVTGNSDGVTVLDAQFIQSYCLGLVELPPVEYVNVTKQPVEPA
【0157】
酵素複合体ＳＯＣ２９の第３の骨格蛋白質Ｓｃａ３のアミノ酸配列は下記配列番号４０の通りである。Ｎ末端側の最初の下線部分がコヘシンドメインＣ４－３（Clostridium thermocellum SdbA typeII cohesion由来の配列）、続く下線なしの部分が第１のリンカー（アミノ酸数１６）、続く第２の下線部分がコヘシンドメインＣ４－３（Clostridium thermocellum SdbA typeII cohesion由来の配列）、続く下線なしの部分が第２のリンカー（アミノ酸数１６）、続く第３の下線部分がコヘシンドメインＣ４－３（Clostridium thermocellum SdbA typeII cohesion由来の配列）、続く第３の下線なしの部分が第３のリンカー（アミノ酸数１３）、続く第４の下線部分がドックリンドメインＤ３（RfGroup3Doc由来の配列）を示す。
配列番号４０：ARADKASSIELKFDRNKGEVGDILIGTVRINNIKNFAGFQVNIVYDPKVLMAVDPETGKEFTSSTFPPGRTVLKNNAYGPIQIADNDPEKGILNFALAYSYIAGYKETGVAEESGIIAKIGFKILQKKSTAVKFQDTLSMPGAISGTQLFDWDGEVITGYEVIQPDVLSLGDEPYETPGTDIPISDNPAATPSSTPSVTPSPEVKPTQTPSPLLRELTILARADKASSIELKFDRNKGEVGDILIGTVRINNIKNFAGFQVNIVYDPKVLMAVDPETGKEFTSSTFPPGRTVLKNNAYGPIQIADNDPEKGILNFALAYSYIAGYKETGVAEESGIIAKIGFKILQKKSTAVKFQDTLSMPGAISGTQLFDWDGEVITGYEVIQPDVLSLGDEPYETPGTDIPISDNPAATPSSTPSVTPSPEVKPTQTPSPLLRELTILARADKASSIELKFDRNKGEVGDILIGTVRINNIKNFAGFQVNIVYDPKVLMAVDPETGKEFTSSTFPPGRTVLKNNAYGPIQIADNDPEKGILNFALAYSYIAGYKETGVAEESGIIAKIGFKILQKKSTAVKFQDTLSMPGAISGTQLFDWDGEVITGYEVIQPDVLSLGDEPYETPGTDIPISDNPAATPSSTPSVTPSPEVKPTQTPSPLLRELTILEVYGDLDGDGEVDVFDLILMRKAVENGDTERFEAADLNCDGVIDSDDLTYHSEYLHGIRKTLPVE
配列番号４０：ARADKASSIELKFDRNKGEVGDILIGTVRINNIKNFAGFQVNIVYDPKVLMAVDPETGKEFTSSTFPPGRTVLKNNAYGPIQIADNDPEKGILNFALAYSYIAGYKETGVAEESGIIAKIGFKILQKKSTAVKFQDTLSMPGAISGTQLFDWDGEVITGYEVIQPDVLSLGDEPYETPGTDIPISDNPAATPSSTPSVTPSPEVKPTQTPSPLLRELTILARADKASSIELKFDRNKGEVGDILIGTVRINNIKNFAGFQVNIVYDPKVLMAVDPETGKEFTSSTFPPGRTVLKNNAYGPIQIADNDPEKGILNFALAYSYIAGYKETGVAEESGIIAKIGFKILQKKSTAVKFQDTLSMPGAISGTQLFDWDGEVITGYEVIQPDVLSLGDEPYETPGTDIPISDNPAATPSSTPSVTPSPEVKPTQTPSPLLRELTILARADKASSIELKFDRNKGEVGDILIGTVRINNIKNFAGFQVNIVYDPKVLMAVDPETGKEFTSSTFPPGRTVLKNNAYGPIQIADNDPEKGILNFALAYSYIAGYKETGVAEESGIIAKIGFKILQKKSTAVKFQDTLSMPGAISGTQLFDWDGEVITGYEVIQPDVLSLGDEPYETPGTDIPISDNPAATPSSTPSVTPSPEVKPTQTPSPLLRELTILEVYGDLDGDGEVDVFDLILMRKAVENGDTERFEAADLNCDGVIDSDDLTYHSEYLHGIRKTLPVE
【0158】
酵素複合体ＳＯＣ２９の第４の骨格蛋白質Ｓｃａ４のアミノ酸配列は下記配列番号４１の通りである。Ｎ末端側の最初の下線部分がコヘシンドメインＣ６（RfScaBcoh1由来の配列）、続く下線なしの部分が第１のリンカー（アミノ酸数１６）、続く第２の下線部分がコヘシンドメインＣ６（RfScaBcoh1由来の配列）、続く下線なしの部分が第２のリンカー（アミノ酸数１６）、続く第３の下線部分がコヘシンドメインＣ６（RfScaBcoh1由来の配列）、続く下線なしの部分が第３のリンカー（アミノ酸数１３）、続く第４の下線部分がドックリンドメインＤ５（Clostridium thermocellum CipA typeII Dockerin由来の配列）を示す。
配列番号４１：VVFDFGKWTANAGETIDVDVFVDTQGKAVSAMDVRFQIDSPLKITAMEKEAPAFNTTAMVNLSNLGLNFKSLSDKGEPLTPINNEPVFMLAVEVPANTPSGDYKIGFGDKCEVHKSNDGSKYSTAAINGVILLRELTILTTTAATTSVVFDFGKWTANAGETIDVDVFVDTQGKAVSAMDVRFQIDSPLKITAMEKEAPAFNTTAMVNLSNLGLNFKSLSDKGEPLTPINNEPVFMLAVEVPANTPSGDYKIGFGDKCEVHKSNDGSKYSTAAINGVILLRELTILTTTAATTSAQPVANADVIFDFGNYEAKAGEEVQVDVTVDSKNKAISAMDVVFAIDSPLTIDEIDKESLAFKTTAMTNMAILGANFKSLDDKGEPLVPTKDPVFTLYVTVPATTPDGVYNVGFGKKCEVHKSNDGSKYSSTAINGKIKVGNPVDDPTTSATTAPQPATTGDIVKDNSINLLDVAEVIRCFNATKGSANYVEELDINRNGAINMQDIMIVHKHFGATSSDYDAQ
配列番号４１：VVFDFGKWTANAGETIDVDVFVDTQGKAVSAMDVRFQIDSPLKITAMEKEAPAFNTTAMVNLSNLGLNFKSLSDKGEPLTPINNEPVFMLAVEVPANTPSGDYKIGFGDKCEVHKSNDGSKYSTAAINGVILLRELTILTTTAATTSVVFDFGKWTANAGETIDVDVFVDTQGKAVSAMDVRFQIDSPLKITAMEKEAPAFNTTAMVNLSNLGLNFKSLSDKGEPLTPINNEPVFMLAVEVPANTPSGDYKIGFGDKCEVHKSNDGSKYSTAAINGVILLRELTILTTTAATTSAQPVANADVIFDFGNYEAKAGEEVQVDVTVDSKNKAISAMDVVFAIDSPLTIDEIDKESLAFKTTAMTNMAILGANFKSLDDKGEPLVPTKDPVFTLYVTVPATTPDGVYNVGFGKKCEVHKSNDGSKYSSTAINGKIKVGNPVDDPTTSATTAPQPATTGDIVKDNSINLLDVAEVIRCFNATKGSANYVEELDINRNGAINMQDIMIVHKHFGATSSDYDAQ
【0159】
１２．実施例の効果
本実施例によれば、第１の骨格蛋白質を保持するとともに、第２の骨格蛋白質を保持して、ＡＣＣ合成酵素（ＡＣＳ）と、ＡＣＣ酸化酵素（ＡＣＯ）を高度に集積化できるアダプター骨格蛋白質（第３の骨格蛋白質）を提供できた。本実施例によれば、ＡＣＣ合成酵素及びＡＣＣ酸化酵素を高度に集積化した酵素複合体を得ることができる。また、本実施例の酵素複合体を用いた光合成生物によれば、エチレン産生能を向上できる。
本実施例によれば、第１の骨格蛋白質を保持するとともに、第２の骨格蛋白質を保持して、ＡＣＣ合成酵素（ＡＣＳ）と、ＡＣＣ酸化酵素（ＡＣＯ）を高度に集積化できるアダプター骨格蛋白質（第３の骨格蛋白質）を提供できた。本実施例によれば、ＡＣＣ合成酵素及びＡＣＣ酸化酵素を高度に集積化した酵素複合体を得ることができる。また、本実施例の酵素複合体を用いた光合成生物によれば、エチレン産生能を向上できる。
【0160】
本開示は上記で詳述した実施例に限定されず、本開示の範囲で様々な変形又は変更が可能である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】