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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024082819
(43)【公開日】2024-06-20
(54)【発明の名称】培地及び培地を用いる細胞の培養方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/07 20100101AFI20240613BHJP
【ＦＩ】
C12N5/07
【審査請求】未請求
【請求項の数】6
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022196945
(22)【出願日】2022-12-09
(71)【出願人】
【識別番号】000002288
【氏名又は名称】三洋化成工業株式会社
(72)【発明者】
【氏名】阪口 幸矢佳
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065BB04
4B065BC01
4B065CA60
(57)【要約】
【課題】 本発明の課題は、細胞接着性に優れる培地を提供することにある。
【解決手段】 アミンへの炭素数２～４のアルキレンオキサイド付加物を含有する培地であって、前記アミンへの炭素数２～４のアルキレンオキサイド付加物の濃度が、前記培地の体積に基づいて、０．１～１０００μｇ／ｍｌである培地。前記アミンは、炭素数１～２０のアミンであることが好ましい。また、前記炭素数２～４のアルキレンオキサイドは、プロピレンオキサイドであることが好ましい。
【選択図】なし
【解決手段】 アミンへの炭素数２～４のアルキレンオキサイド付加物を含有する培地であって、前記アミンへの炭素数２～４のアルキレンオキサイド付加物の濃度が、前記培地の体積に基づいて、０．１～１０００μｇ／ｍｌである培地。前記アミンは、炭素数１～２０のアミンであることが好ましい。また、前記炭素数２～４のアルキレンオキサイドは、プロピレンオキサイドであることが好ましい。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アミンへの炭素数２～４のアルキレンオキサイド付加物を含有する培地であって、
前記アミンへの炭素数２～４のアルキレンオキサイド付加物の濃度が、前記培地の体積に基づいて、０．１～１０００μｇ／ｍｌである培地。
前記アミンへの炭素数２～４のアルキレンオキサイド付加物の濃度が、前記培地の体積に基づいて、０．１～１０００μｇ／ｍｌである培地。
【請求項2】
前記アミンが、炭素数１～２０のアミンである請求項１に記載の培地。
【請求項3】
前記炭素数２～４のアルキレンオキサイドがプロピレンオキサイドである請求項１又は２に記載の培地。
【請求項4】
前記アミンへの炭素数２～４のアルキレンオキサイド付加物において、前記アミンが有する活性水素１モルに対する炭素数２～４のアルキレンオキサイドの平均付加モル数が０．１～１０モルである請求項１又は２に記載の培地。
【請求項5】
血清の含有量が、培地の体積に基づいて、１５体積％以下である請求項１又は２に記載の培地。
【請求項6】
請求項１又は２に記載の培地を用いる細胞の培養方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は培地及び培地を用いる細胞の培養方法に関する。
【背景技術】
【0002】
従来は、細胞培養用の培地としてＥａｇｌｅ’ｓ ＭＥＭ（ｍｉｎｉｍｕｍ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｍｅｄｉｕｍ）等のアミノ酸、ビタミン、無機塩および糖類等からなる基礎培地に、動物細胞増殖因子を添加した培養培地が知られている。この場合、動物細胞増殖因子としては、血清が一般的で、高価にもかかわらず必要量は多く、５～２０体積％程度添加する必要がある。
また、動物由来の因子の混入を嫌う用途では、血清以上に高価な既知の細胞成長因子やホルモン類等を含む細胞培養用の培地が注目されている（特許文献１）。しかし、上記の培地では、高価な上に培養での細胞増殖性が不十分であり、安全かつ比較的安価な細胞増殖性に繋がる細胞接着性の改善が求められていた。
また、動物由来の因子の混入を嫌う用途では、血清以上に高価な既知の細胞成長因子やホルモン類等を含む細胞培養用の培地が注目されている（特許文献１）。しかし、上記の培地では、高価な上に培養での細胞増殖性が不十分であり、安全かつ比較的安価な細胞増殖性に繋がる細胞接着性の改善が求められていた。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】特開２００８－２６３９５５号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明の課題は、細胞接着性に優れる培地を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0005】
本発明者らは、上記の課題を解決すべく鋭意検討した結果、本発明に到達した。
即ち本発明は、アミンへの炭素数２～４のアルキレンオキサイド付加物を含有する培地であって、前記アミンへの炭素数２～４のアルキレンオキサイド付加物の濃度が、前記培地の体積に基づいて、０．１～１０００μｇ／ｍｌである培地；前記の培地を用いる細胞の培養方法である。
即ち本発明は、アミンへの炭素数２～４のアルキレンオキサイド付加物を含有する培地であって、前記アミンへの炭素数２～４のアルキレンオキサイド付加物の濃度が、前記培地の体積に基づいて、０．１～１０００μｇ／ｍｌである培地；前記の培地を用いる細胞の培養方法である。
【発明の効果】
【0006】
本発明の培地は、優れた細胞接着性を発揮する。
【発明を実施するための形態】
【0007】
本発明の培地は、アミンへの炭素数２～４のアルキレンオキサイド付加物を含有する。
アミンへの炭素数２～４のアルキレンオキサイド付加物は、１種を単独で用いても、２種以上を併用してもよい。
アミンへの炭素数２～４のアルキレンオキサイド付加物は、１種を単独で用いても、２種以上を併用してもよい。
【0008】
前記のアミンとしては、炭素数１～２０のアミン等が挙げられ、具体的には、炭素数１～２０の脂肪族アミン及び炭素数６～２０の芳香族アミン等が挙げられる。
炭素数１～２０の脂肪族アミンとしては、モノアミン（メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、ブチルアミン、ペンチルアミン、ヘキシルアミン、ドデシルアミン、２－アミノプロパノール、４－アミノブタノール、３－メトキシプロピルアミン、ジエチルアミン、ジプロピルアミン、ジブチルアミン、シクロヘキシルアミン）；
ジアミン［エチレンジアミン、１，２－ジアミノプロパン、ジアミノブタン、ジアミノペンタン、トリメチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、Ｎ－シクロヘキシル－１，３－プロパンジアミン、ジメチルアミノエチルアミン、エチルアミノエチルアミン、メチルアミノプロミルアミン、１，２－ビス（３－アミノプロポキシ）エタン、ピペラジン、ジシクロヘキシルメタンジアミン、イソホルンジアミン等］；
トリアミン［ジエチレントリアミン、Ｎ－（２－アミノエチル）ピペラジン、ビス（３－アミノプロピル）アミン、ビス（ヘキサメチレン）トリアミン、メチルイミノビスプロピルアミン、スペルミジン等］；
アミノ基を４個以上有するポリアミン（トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ペンタエチレンヘキサミン、ヘキサエチレンヘプタミン等）等が挙げられる。
炭素数６～２０の芳香族アミンとしては、モノアミン（アニリン、キシレンジアミン等）；
ポリアミン（フェニレンジアミン、トリレンジアミン、ジエチルトリレンジアミン、キシリレンジアミン、ジフェニルメタンジアミン、ジフェニルエーテルジアミン等）等が挙げられる。
前記のアミンは、１種を単独で用いても、２種以上を組み合わせても良い。
前記のアミンの内、基礎培地への溶解性及び細胞接着性の観点から好ましいのは、活性水素（窒素原子に結合した水素原子）を２個以上含むアミンであり、更に好ましいのは、活性水素（窒素原子に結合した水素原子）を３個以上含むアミンであり、特に好ましいのは活性水素（窒素原子に結合した水素原子）を４個以上含むアミンである。
炭素数１～２０の脂肪族アミンとしては、モノアミン（メチルアミン、エチルアミン、プロピルアミン、ブチルアミン、ペンチルアミン、ヘキシルアミン、ドデシルアミン、２－アミノプロパノール、４－アミノブタノール、３－メトキシプロピルアミン、ジエチルアミン、ジプロピルアミン、ジブチルアミン、シクロヘキシルアミン）；
ジアミン［エチレンジアミン、１，２－ジアミノプロパン、ジアミノブタン、ジアミノペンタン、トリメチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミン、Ｎ－シクロヘキシル－１，３－プロパンジアミン、ジメチルアミノエチルアミン、エチルアミノエチルアミン、メチルアミノプロミルアミン、１，２－ビス（３－アミノプロポキシ）エタン、ピペラジン、ジシクロヘキシルメタンジアミン、イソホルンジアミン等］；
トリアミン［ジエチレントリアミン、Ｎ－（２－アミノエチル）ピペラジン、ビス（３－アミノプロピル）アミン、ビス（ヘキサメチレン）トリアミン、メチルイミノビスプロピルアミン、スペルミジン等］；
アミノ基を４個以上有するポリアミン（トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ペンタエチレンヘキサミン、ヘキサエチレンヘプタミン等）等が挙げられる。
炭素数６～２０の芳香族アミンとしては、モノアミン（アニリン、キシレンジアミン等）；
ポリアミン（フェニレンジアミン、トリレンジアミン、ジエチルトリレンジアミン、キシリレンジアミン、ジフェニルメタンジアミン、ジフェニルエーテルジアミン等）等が挙げられる。
前記のアミンは、１種を単独で用いても、２種以上を組み合わせても良い。
前記のアミンの内、基礎培地への溶解性及び細胞接着性の観点から好ましいのは、活性水素（窒素原子に結合した水素原子）を２個以上含むアミンであり、更に好ましいのは、活性水素（窒素原子に結合した水素原子）を３個以上含むアミンであり、特に好ましいのは活性水素（窒素原子に結合した水素原子）を４個以上含むアミンである。
【0009】
前記の炭素数２～４のアルキレンオキサイドとしては、エチレンオキサイド、１，２－プロピレンオキサイド、１，３－プロピレンオキサイド、１，２－ブチレンオキサイド、１，３－ブチレンオキサイド、１，４－ブチレンオキサイド、２，３－ブチレンオキサイド等が挙げられる。
前記の炭素数２～４のアルキレンオキサイドの内、基礎培地への溶解性及び細胞接着性の観点から好ましいのは、エチレンオキシド、プロピレンオキサイド（１，２－プロピレンオキサイド、１，３－プロピレンオキサイド）であり、更に好ましいのは、プロピレンオキサイド（１，２－プロピレンオキサイド、１，３－プロピレンオキサイド）であり、特に好ましいのは１，２－プロピレンオキサイドである。
前記の炭素数２～４のアルキレンオキサイドの内、基礎培地への溶解性及び細胞接着性の観点から好ましいのは、エチレンオキシド、プロピレンオキサイド（１，２－プロピレンオキサイド、１，３－プロピレンオキサイド）であり、更に好ましいのは、プロピレンオキサイド（１，２－プロピレンオキサイド、１，３－プロピレンオキサイド）であり、特に好ましいのは１，２－プロピレンオキサイドである。
【0010】
前記のアミンが有する活性水素（窒素原子に結合した水素原子）１モルに対する炭素数２～４のアルキレンオキサイドの平均付加モル数は、細胞毒性及び細胞接着性の観点から、０．１～１０モルであることが好ましい。
前記アミンが水酸基を有する場合、炭素数２～４のアルキレンオキサイドは、窒素原子に結合した水素原子だけでなく、水酸基に付加していても良い。
アミンへの炭素数２～４のアルキレンオキサイド付加物が有する窒素原子の重量割合は、細胞接着性及び細胞毒性の観点から、アミンへの炭素数２～４のアルキレンオキサイド付加物の重量を基準として、１～４０重量％であることが好ましく、１～２０重量％であることが更に好ましく、３～１０重量％であることが特に好ましい。
前記アミンが水酸基を有する場合、炭素数２～４のアルキレンオキサイドは、窒素原子に結合した水素原子だけでなく、水酸基に付加していても良い。
アミンへの炭素数２～４のアルキレンオキサイド付加物が有する窒素原子の重量割合は、細胞接着性及び細胞毒性の観点から、アミンへの炭素数２～４のアルキレンオキサイド付加物の重量を基準として、１～４０重量％であることが好ましく、１～２０重量％であることが更に好ましく、３～１０重量％であることが特に好ましい。
【0011】
前記アミンへの炭素数２～４のアルキレンオキサイド付加物の含有量は、細胞接着性の観点から、前記の培地の体積に対して、０．１～１０００μｇ／ｍｌである。
また、細胞毒性及び細胞接着性の観点から、前記アミンへの炭素数２～４のアルキレンオキサイド付加物の含有量は、前記の培地の体積に基づいて、１０～１０００μｇ／ｍｌであることが好ましく、５０～１０００μｇ／ｍｌであることが更に好ましい。
また、細胞毒性及び細胞接着性の観点から、前記アミンへの炭素数２～４のアルキレンオキサイド付加物の含有量は、前記の培地の体積に基づいて、１０～１０００μｇ／ｍｌであることが好ましく、５０～１０００μｇ／ｍｌであることが更に好ましい。
【0012】
前記のアミンへの炭素数２～４のアルキレンオキサイド付加物は、水溶性であることが好ましい。
なお、本明細書において、水溶性とは、２５℃の水１００ｇに少なくとも０．１ｇ溶解することを意味する。
なお、本明細書において、水溶性とは、２５℃の水１００ｇに少なくとも０．１ｇ溶解することを意味する。
【0013】
培地中には、必要に応じて、細胞増殖因子を含有させることができる。細胞増殖因子を含有させることにより、細胞増殖性をさらに高めることができる。
細胞増殖因子としては、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、上皮細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、インシュリン様増殖因子、血管内皮増殖因子、神経成長因子、幹細胞因子、白血病阻害因子、骨形成因子、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子、神経栄養因子、結合組織成長因子、アンジオポエチン、サイトカイン、インターロイキン、アドレナモジュリン及びナトリウム利尿ペプチド等の生理活性ペプチドが含まれる。これらのうち、適用できる細胞の範囲が広く、細胞増殖性が高い観点から、上皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、インシュリン様増殖因子及び骨形成因子が好ましく、さらに好ましくは上皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子及びインシュリン様増殖因子である。
細胞増殖因子を使用する場合、細胞増殖因子の含有量は細胞増殖因子の種類によって異なるが、培地の体積に基づいて、１０－９～１０４ｎｇ／ｍｌが好ましく、さらに好ましくは１０－７～１００ｎｇ／ｍｌ、特に好ましくは１０－５～１ｎｇ／ｍｌである。
細胞増殖因子としては、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、上皮細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、血小板由来増殖因子、インシュリン様増殖因子、血管内皮増殖因子、神経成長因子、幹細胞因子、白血病阻害因子、骨形成因子、ヘパリン結合上皮細胞増殖因子、神経栄養因子、結合組織成長因子、アンジオポエチン、サイトカイン、インターロイキン、アドレナモジュリン及びナトリウム利尿ペプチド等の生理活性ペプチドが含まれる。これらのうち、適用できる細胞の範囲が広く、細胞増殖性が高い観点から、上皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子、インシュリン様増殖因子及び骨形成因子が好ましく、さらに好ましくは上皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、トランスフォーミング増殖因子及びインシュリン様増殖因子である。
細胞増殖因子を使用する場合、細胞増殖因子の含有量は細胞増殖因子の種類によって異なるが、培地の体積に基づいて、１０－９～１０４ｎｇ／ｍｌが好ましく、さらに好ましくは１０－７～１００ｎｇ／ｍｌ、特に好ましくは１０－５～１ｎｇ／ｍｌである。
【0014】
培地には、さらに抗菌剤（アンホテリシンＢ、ゲンタマイシン、ペニシリン及びストレプトマイシン等）を含有させることができる。抗菌剤を含有させる場合、この含有量は抗菌剤の種類によって異なるが、培地の体積に基づいて、０．０１～１０７μｇ／ｍｌが好ましく、さらに好ましくは０．１～１０６μｇ／ｍｌ、特に好ましくは１～１０５μｇ／ｍｌである。
【0015】
本発明の培地は、血清を含有していても良いが、動物由来の因子の混入低減、細胞接着性、細胞増殖性の観点から、血清の含有量は、培地の体積（ｍｌ）に基づいて、１５体積％以下であることが好ましく、更に好ましくは１０体積％以下であり、特に好ましくは５体積％以下であり、最も好ましくは１体積％以下である。
【0016】
本発明の培地の製造方法としては、培地（基礎培地、血清入り培地、低血清培地、無血清培地等、栄養源としてＬ－グルタミン等を含有）に、アミンへの炭素数２～４のアルキレンオキサイド付加物を投入し、混合して含有させることができ、例えば以下の方法が挙げられる。
ガラス製容器、マグネチックスターラー及び回転子を使用し、常温（２５℃±１０）、常圧（１ａｔｍ）下で培地（基礎培地、血清入り培地、低血清培地、無血清培地等）を撹拌させながら、アミンへの炭素数２～４のアルキレンオキサイド付加物を投入する。特に限定しないが、マグネチックスターラーの回転数は１０～２００ｒｐｍが好ましい。アミンへの炭素数２～４のアルキレンオキサイド付加物を投入後、さらに１時間撹拌を続ける。次にクリーンベンチ内でディスポーザブルメンブレンフィルターユニット（商品名：ＤＩＳＭＩＣ－２５ｃｓ、孔径：０．４５μｍ、アドバンテック東洋（株）製）を用いろ過滅菌する。
ガラス製容器、マグネチックスターラー及び回転子を使用し、常温（２５℃±１０）、常圧（１ａｔｍ）下で培地（基礎培地、血清入り培地、低血清培地、無血清培地等）を撹拌させながら、アミンへの炭素数２～４のアルキレンオキサイド付加物を投入する。特に限定しないが、マグネチックスターラーの回転数は１０～２００ｒｐｍが好ましい。アミンへの炭素数２～４のアルキレンオキサイド付加物を投入後、さらに１時間撹拌を続ける。次にクリーンベンチ内でディスポーザブルメンブレンフィルターユニット（商品名：ＤＩＳＭＩＣ－２５ｃｓ、孔径：０．４５μｍ、アドバンテック東洋（株）製）を用いろ過滅菌する。
【0017】
本発明の培地を使用した細胞培養方法としては、例えば、組織培養用フラスコに培地を投入し、細胞液を細胞濃度が１万～１００万個／ｍｌとなるように分散させ、二酸化炭素（ＣＯ２）濃度５体積％、３７℃の条件下で１時間～２０日間、必要に応じて１日毎に培地交換しなら培養をおこなう。
【0018】
本発明の培地で培養できる細胞（ＣＥ）としては細胞であれば制限がないが、本発明の培地を用いると細胞増殖性が高いため、医薬品等の有用物質生産や治療等に用いられる哺乳動物由来の正常細胞、哺乳動物由来の株化細胞及び昆虫細胞が適している。
哺乳動物由来の正常細胞としては、皮膚に関与する細胞（上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞及び平滑筋細胞等）、血管に関与する細胞（血管内皮細胞、平滑筋細胞及び線維芽細胞等）、筋肉に関与する細胞（筋肉細胞等）、脂肪に関与する細胞（脂肪細胞等）、神経に関与する細胞（神経細胞等）、肝臓に関与する細胞（肝細胞等）、膵臓に関与する細胞（膵ラ島細胞等）、腎臓に関与する細胞（腎上皮細胞、近位尿細管上皮細胞及びメサンギウム細胞等）、肺・気管支に関与する細胞（上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞及び平滑筋細胞等）、目に関与する細胞（視細胞、角膜上皮細胞及び角膜内皮細胞等）、前立腺に関与する細胞（上皮細胞、間質細胞及び平滑筋細胞等）、骨に関与する細胞（骨芽細胞、骨細胞及び破骨細胞等）、軟骨に関与する細胞（軟骨芽細胞及び軟骨細胞等）、歯に関与する細胞（歯根膜細胞及び骨芽細胞等）、血液に関与する細胞（白血球及び赤血球等）、及び幹細胞｛例えば、骨髄未分化間葉系幹細胞、骨格筋幹細胞、造血系幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞（ｏｖａｌ ｃｅｌｌ、ｓｍａｌｌ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ等）、脂肪組織幹細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、表皮幹細胞、腸管幹細胞、精子幹細胞、胚生殖幹（ＥＧ）細胞、膵臓幹細胞（膵管上皮幹細胞等）、白血球系幹細胞、リンパ球系幹細胞、角膜系幹細胞、前駆細胞（脂肪前駆細胞、血管内皮前駆細胞、軟骨前駆細胞、リンパ球系前駆細胞、ＮＫ前駆細胞等）等｝等が挙げられる。
哺乳動物由来の正常細胞としては、皮膚に関与する細胞（上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞及び平滑筋細胞等）、血管に関与する細胞（血管内皮細胞、平滑筋細胞及び線維芽細胞等）、筋肉に関与する細胞（筋肉細胞等）、脂肪に関与する細胞（脂肪細胞等）、神経に関与する細胞（神経細胞等）、肝臓に関与する細胞（肝細胞等）、膵臓に関与する細胞（膵ラ島細胞等）、腎臓に関与する細胞（腎上皮細胞、近位尿細管上皮細胞及びメサンギウム細胞等）、肺・気管支に関与する細胞（上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞及び平滑筋細胞等）、目に関与する細胞（視細胞、角膜上皮細胞及び角膜内皮細胞等）、前立腺に関与する細胞（上皮細胞、間質細胞及び平滑筋細胞等）、骨に関与する細胞（骨芽細胞、骨細胞及び破骨細胞等）、軟骨に関与する細胞（軟骨芽細胞及び軟骨細胞等）、歯に関与する細胞（歯根膜細胞及び骨芽細胞等）、血液に関与する細胞（白血球及び赤血球等）、及び幹細胞｛例えば、骨髄未分化間葉系幹細胞、骨格筋幹細胞、造血系幹細胞、神経幹細胞、肝幹細胞（ｏｖａｌ ｃｅｌｌ、ｓｍａｌｌ ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ等）、脂肪組織幹細胞、胚性幹（ＥＳ）細胞、表皮幹細胞、腸管幹細胞、精子幹細胞、胚生殖幹（ＥＧ）細胞、膵臓幹細胞（膵管上皮幹細胞等）、白血球系幹細胞、リンパ球系幹細胞、角膜系幹細胞、前駆細胞（脂肪前駆細胞、血管内皮前駆細胞、軟骨前駆細胞、リンパ球系前駆細胞、ＮＫ前駆細胞等）等｝等が挙げられる。
【0019】
哺乳動物由来の株化細胞としては、３Ｔ３細胞、Ａ５４９細胞、ＡＨ１３０細胞、Ｂ９５－８細胞、ＢＨＫ細胞、ＢＯＳＣ２３細胞、ＢＳ－Ｃ－１細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２細胞、Ｃ－６細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＶ－１細胞、Ｆ９細胞、ＦＬ細胞、ＦＬ５－１細胞、ＦＭ３Ａ細胞、Ｇ－３６１細胞、ＧＰ＋Ｅ－８６細胞、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２細胞、Ｈ４－ＩＩ－Ｅ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥｐ－２細胞、ＨＬ－６０細胞、ＨＴＣ細胞、ＨＵＶＥＣ細胞、ＩＭＲ－３２細胞、ＩＭＲ－９０細胞、Ｋ５６２細胞、ＫＢ細胞、Ｌ細胞、Ｌ５１７８Ｙ細胞、Ｌ－９２９細胞、ＭＡ１０４細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞、Ｎ１８細胞、Ｎａｍａｌｗａ細胞、ＮＧ１０８－１５細胞、ＮＲＫ細胞、ＯＣ１０細胞、ＯＴＴ６０５０細胞、Ｐ３８８細胞、ＰＡ１２細胞、ＰＡ３１７細胞、ＰＣ－１２細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＰＧ１３細胞、ＱＧＨ細胞、Ｒａｊｉ細胞、ＲＰＭＩ－１７８８細胞、ＳＧＥ１細胞、Ｓｐ２／Ｏ－Ａｇ１４細胞、ＳＴ２細胞、ＴＨＰ－１細胞、Ｕ－９３７細胞、Ｖ７９細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨＴ－１０８０細胞、ＷＩ－３８細胞、ψ２細胞及びψＣＲＥ細胞等が挙げられる｛細胞培養の技術（日本組織培養学会編集、株式会社朝倉書店発行、１９９９年）｝。
【0020】
昆虫細胞としては、カイコ細胞（ＢｍＮ細胞及びＢｏＭｏ細胞等）、クワコ細胞、サクサン細胞、シンジュサン細胞、ヨトウガ細胞（Ｓｆ９細胞及びＳｆ２１細胞等）、クワゴマダラヒトリ細胞、ハマキムシ細胞、ショウジョウバエ細胞、センチニクバエ細胞、ヒトスジシマカ細胞、アゲハチョウ細胞、ワモンゴキブリ細胞及びイラクサキンウワバ細胞（Ｔｎ－５細胞、ＨＩＧＨ ＦＩＶＥ細胞及びＭＧ１細胞等）等が挙げられる｛昆虫バイオ工場（木村滋 編著、株式会社工業調査会 発行、２０００年）｝。
これらの細胞のうち、医薬品等の有用物質生産や治療等の観点から、哺乳動物由来の正常細胞及び哺乳動物由来の株化細胞が好ましい。そして、治療に有用な点で、さらに好ましくは平滑筋細胞、肝細胞、骨芽細胞、上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞及び幹細胞が好ましく、特に好ましくは上皮細胞である。また、医薬品等の有用物質生産に有用な点で、さらに好ましくは３Ｔ３細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｌ－９２９細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨＴ－１０８０細胞及びＷＩ－３８細胞、特に好ましくはＭＤＣＫ細胞、ＶＥＲＯ細胞及びＨＴ－１０８０細胞である。
これらの細胞のうち、医薬品等の有用物質生産や治療等の観点から、哺乳動物由来の正常細胞及び哺乳動物由来の株化細胞が好ましい。そして、治療に有用な点で、さらに好ましくは平滑筋細胞、肝細胞、骨芽細胞、上皮細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞及び幹細胞が好ましく、特に好ましくは上皮細胞である。また、医薬品等の有用物質生産に有用な点で、さらに好ましくは３Ｔ３細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｌ－９２９細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨＴ－１０８０細胞及びＷＩ－３８細胞、特に好ましくはＭＤＣＫ細胞、ＶＥＲＯ細胞及びＨＴ－１０８０細胞である。
【0021】
培地に分散させる細胞の濃度（個／ｍＬ）としては特に制限はないが、培地１ｍＬ当たり、１００～１億が好ましく、さらに好ましくは１０００～１千万、特に好ましくは１万～１００万である。
細胞の個数の計数方法は公知の方法が使用でき、例えば、クリスタルバイオレットを用いた細胞核計数法で測定することができる｛細胞培養の技術（日本組織培養学会編集、株式会社朝倉書店発行、１９９９年）｝。
細胞の個数の計数方法は公知の方法が使用でき、例えば、クリスタルバイオレットを用いた細胞核計数法で測定することができる｛細胞培養の技術（日本組織培養学会編集、株式会社朝倉書店発行、１９９９年）｝。
【0022】
上記細胞を培養する場合の細胞培養用担体は、特に制限無く利用でき、例えば、マルチウエルプレ－ト、シャーレ、組織培養用フラスコ、ロ－ラ－ボトル、マイクロキャリア（ビーズ）、フィルム、不織布、多孔質粒子及びホロ－ファイバ－等が用いられる。これらのうち好ましくはマイクロキャリア（ビーズ）、フィルム、マルチウェルプレ－ト、シャーレ、組織培養用フラスコ及びローラーボトルであり、特に好ましくは、組織培養用フラスコ、マイクロキャリア（ビーズ）及びマルチウェルプレ－トである。
【0023】
培養条件としては、特に制限は無く、二酸化炭素（ＣＯ２）濃度１～２０体積％、５～４５℃で１時間～１００日間、必要に応じて１～１０日毎に培地交換しなら培養する条件等が適用できる。好ましい条件としては、ＣＯ２濃度３～１０体積％、３０～４０℃、１時間～２０日間、１～３日毎に培地交換しながら培養する条件である。
【実施例0024】
以下本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
尚、以下において部は重量部を表す。
尚、以下において部は重量部を表す。
【0025】
＜製造例１：アミンへのアルキレンオキサイド付加物の製造例＞
［エチレンジアミンへのＰＯ４モル付加物（Ｘ－１）の合成］
撹拌機、加熱冷却装置及び滴下ボンベを備えた耐圧反応容器に、エチレンジアミン６０部（１モル部）を投入し、窒素置換後密閉し、－０．０９７ＭＰａ（ゲージ圧）の減圧下、１３０℃に昇温し、ＰＯ２３２部（４モル部）を圧力が０．３ＭＰａ（ゲージ圧）を超えないように調整しながら、５時間かけて滴下した。滴下終了後、１３０℃で１時間熟成し、エチレンジアミンへのＰＯ４モル付加物（Ｘ－１）を得た。
［エチレンジアミンへのＰＯ４モル付加物（Ｘ－１）の合成］
撹拌機、加熱冷却装置及び滴下ボンベを備えた耐圧反応容器に、エチレンジアミン６０部（１モル部）を投入し、窒素置換後密閉し、－０．０９７ＭＰａ（ゲージ圧）の減圧下、１３０℃に昇温し、ＰＯ２３２部（４モル部）を圧力が０．３ＭＰａ（ゲージ圧）を超えないように調整しながら、５時間かけて滴下した。滴下終了後、１３０℃で１時間熟成し、エチレンジアミンへのＰＯ４モル付加物（Ｘ－１）を得た。
【0026】
＜製造例２＞
［シクロヘキシルアミンへのＰＯ２モル付加物（Ｘ－２）の合成］
製造例１において、エチレンジアミン６０部（１モル部）をシクロヘキシルアミン９９部（１モル部）に、ＰＯ２３２部（４モル部）をＰＯ１１６部（２モル部）に変更した以外は製造例１と同様にして、シクロヘキシルアミンへのＰＯ２モル付加物（Ｘ－２）を得た。
［シクロヘキシルアミンへのＰＯ２モル付加物（Ｘ－２）の合成］
製造例１において、エチレンジアミン６０部（１モル部）をシクロヘキシルアミン９９部（１モル部）に、ＰＯ２３２部（４モル部）をＰＯ１１６部（２モル部）に変更した以外は製造例１と同様にして、シクロヘキシルアミンへのＰＯ２モル付加物（Ｘ－２）を得た。
【0027】
＜製造例３＞
［エチレンジアミンへのＥＯ４モル付加物（Ｘ－３）の合成］
製造例１において、ＰＯ２３２部（４モル部）をＥＯ１７６部（４モル部）に変更した以外は製造例１と同様にして、エチレンジアミンへのＥＯ４モル付加物（Ｘ－３）を得た。
［エチレンジアミンへのＥＯ４モル付加物（Ｘ－３）の合成］
製造例１において、ＰＯ２３２部（４モル部）をＥＯ１７６部（４モル部）に変更した以外は製造例１と同様にして、エチレンジアミンへのＥＯ４モル付加物（Ｘ－３）を得た。
【0028】
＜製造例４＞
［キシレンジアミンへのＥＯ２モル付加物（Ｘ－４）の合成］
製造例１において、エチレンジアミン６０部（１モル部）をキシレンジアミン１３６部（１モル部）に、ＰＯ２３２部（４モル部）をＥＯ８８部（２モル部）に変更した以外は製造例１と同様にして、エチレンジアミンへのＥＯ２モル付加物（Ｘ－４）を得た。
［キシレンジアミンへのＥＯ２モル付加物（Ｘ－４）の合成］
製造例１において、エチレンジアミン６０部（１モル部）をキシレンジアミン１３６部（１モル部）に、ＰＯ２３２部（４モル部）をＥＯ８８部（２モル部）に変更した以外は製造例１と同様にして、エチレンジアミンへのＥＯ２モル付加物（Ｘ－４）を得た。
【0029】
＜製造例５＞
［キシレンジアミンへのＥＯ４モル付加物（Ｘ－５）の合成］
製造例１において、エチレンジアミン６０部（１モル部）をキシレンジアミン１３６部（１モル部）に、ＰＯ２３２部（４モル部）をＥＯ１７６部（４モル部）に変更した以外は製造例１と同様にして、キシレンジアミンへのＥＯ４モル付加物（Ｘ－５）を得た。
［キシレンジアミンへのＥＯ４モル付加物（Ｘ－５）の合成］
製造例１において、エチレンジアミン６０部（１モル部）をキシレンジアミン１３６部（１モル部）に、ＰＯ２３２部（４モル部）をＥＯ１７６部（４モル部）に変更した以外は製造例１と同様にして、キシレンジアミンへのＥＯ４モル付加物（Ｘ－５）を得た。
【0030】
＜製造例６＞
［ドデシルアミンへのＥＯ１５モル付加物（Ｘ－６）の合成］
撹拌機、加熱冷却装置及び滴下ボンベを備えた耐圧反応容器に、ｎ－ドデシルアミン１８５部（１モル部）を投入し、窒素置換後密閉し、減圧下（－０．０９７ＭＰａ）、９５℃に昇温し、ＥＯ８８部（２モル部）を圧力が０．３ＭＰａを超えないように調整しながら、９０～１１０℃の範囲で４時間かけて滴下した。滴下終了後、９５℃で３０分間熟成し、室温まで冷却した。次いでテトラメチルアンモニウムヒドロキシド２５％水溶液３．２部を空気が混入しないように投入し、９５℃に昇温し同温で１時間減圧下（－０．０９７ＭＰａ）脱水した。温度を７０℃に下げた後、ＥＯ６６０部（１５モル部）を圧力が０．２ＭＰａを超えないように調整しながら、７０～９０℃の範囲で３時間かけて滴下した。滴下終了後、７０℃で３０分間熟成させ、１５０～１７０℃に昇温後、同温で触媒の加熱分解物を３時間かけて減圧（－０．０９７ＭＰａ）除去し、ドデシルアミンへのＥＯ１５モル付加物（Ｘ－６）を得た。
［ドデシルアミンへのＥＯ１５モル付加物（Ｘ－６）の合成］
撹拌機、加熱冷却装置及び滴下ボンベを備えた耐圧反応容器に、ｎ－ドデシルアミン１８５部（１モル部）を投入し、窒素置換後密閉し、減圧下（－０．０９７ＭＰａ）、９５℃に昇温し、ＥＯ８８部（２モル部）を圧力が０．３ＭＰａを超えないように調整しながら、９０～１１０℃の範囲で４時間かけて滴下した。滴下終了後、９５℃で３０分間熟成し、室温まで冷却した。次いでテトラメチルアンモニウムヒドロキシド２５％水溶液３．２部を空気が混入しないように投入し、９５℃に昇温し同温で１時間減圧下（－０．０９７ＭＰａ）脱水した。温度を７０℃に下げた後、ＥＯ６６０部（１５モル部）を圧力が０．２ＭＰａを超えないように調整しながら、７０～９０℃の範囲で３時間かけて滴下した。滴下終了後、７０℃で３０分間熟成させ、１５０～１７０℃に昇温後、同温で触媒の加熱分解物を３時間かけて減圧（－０．０９７ＭＰａ）除去し、ドデシルアミンへのＥＯ１５モル付加物（Ｘ－６）を得た。
【0031】
＜水溶性試験＞
製造例１～６で製造したアミンへのアルキレンオキサイド付加物（Ｘ－１）～（Ｘ－６）を０．１ｇ測り取り、２５℃の水１００ｇ入れて、溶解するか目視にて確認した。
透明の場合は水溶性、白濁や濁りを確認した場合は非水溶性とした。製造例１～６で製造したアミンへのアルキレンオキサイド付加物（Ｘ－１）～（Ｘ－６）は全て水溶性であった。
製造例１～６で製造したアミンへのアルキレンオキサイド付加物（Ｘ－１）～（Ｘ－６）を０．１ｇ測り取り、２５℃の水１００ｇ入れて、溶解するか目視にて確認した。
透明の場合は水溶性、白濁や濁りを確認した場合は非水溶性とした。製造例１～６で製造したアミンへのアルキレンオキサイド付加物（Ｘ－１）～（Ｘ－６）は全て水溶性であった。
【0032】
＜製造例７＞
＜基本培地１の調整＞
Ｅ－ＭＥＭ培地［商品名：Ｅ－ＭＥＭ（Ｌ－グルタミン、フェノールレッド含有）、富士フイルム和光純薬（株）製］４４９ｍｌ、抗菌剤溶液｛商品名：Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ＆ＡｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎＢ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製、抗菌剤溶液１ｍｌあたりｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ５０００μｇ及びａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ１２５μｇを含有｝１ｍｌ、血清５０ｍｌ（商品名：Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ，ｑｕａｌｉｆｉｅｄ，ｈｅａｔ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）をクリーンベンチ内で混合し、５００ｍｌの基本培地１を得た。
＜基本培地１の調整＞
Ｅ－ＭＥＭ培地［商品名：Ｅ－ＭＥＭ（Ｌ－グルタミン、フェノールレッド含有）、富士フイルム和光純薬（株）製］４４９ｍｌ、抗菌剤溶液｛商品名：Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ＆ＡｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎＢ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製、抗菌剤溶液１ｍｌあたりｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ５０００μｇ及びａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ１２５μｇを含有｝１ｍｌ、血清５０ｍｌ（商品名：Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ，ｑｕａｌｉｆｉｅｄ，ｈｅａｔ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製）をクリーンベンチ内で混合し、５００ｍｌの基本培地１を得た。
【0033】
＜製造例８＞
＜基本培地２の調整＞
無血清培地［商品名：ＶＰ－ＳＦＭ、インビトロジェン（株）製］１０００ｍｌ、抗菌剤溶液｛商品名：Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ＆ＡｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎＢ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製、抗菌剤溶液１ｍｌあたりｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ５０００μｇ及びａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ１２５μｇを含有｝２ｍｌ、２００ｍＭのＬ－グルタミン液（商品名：ＧｌｕｔａＭＡＸTM－Ｉ、インビトロジェン（株）製）２０ｍｌをクリーンベンチ内で混合し、１０２２ｍｌの基本培地２を得た。
＜基本培地２の調整＞
無血清培地［商品名：ＶＰ－ＳＦＭ、インビトロジェン（株）製］１０００ｍｌ、抗菌剤溶液｛商品名：Ｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ＆ＡｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎＢ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ社製、抗菌剤溶液１ｍｌあたりｇｅｎｔａｍｉｃｉｎ５０００μｇ及びａｍｐｈｏｔｅｒｉｃｉｎ Ｂ１２５μｇを含有｝２ｍｌ、２００ｍＭのＬ－グルタミン液（商品名：ＧｌｕｔａＭＡＸTM－Ｉ、インビトロジェン（株）製）２０ｍｌをクリーンベンチ内で混合し、１０２２ｍｌの基本培地２を得た。
【0034】
＜実施例１～２０及び比較例１～４：培地の調製＞
表１に記載の種類のアミンへのアルキレンオキサイド付加物を、最終的に得られる培地の体積に対して、表１に記載の濃度となるように、表１に記載の種類の基本培地に配合し、混合することで、実施例１～２０、比較例１～４の培地を作製した。
表１に記載の種類のアミンへのアルキレンオキサイド付加物を、最終的に得られる培地の体積に対して、表１に記載の濃度となるように、表１に記載の種類の基本培地に配合し、混合することで、実施例１～２０、比較例１～４の培地を作製した。
【0035】
実施例１～２０、比較例１～４で製造した培地を用いて、以下の方法で細胞を培養し、細胞接着性を評価した。
実施例１～１６及び比較例１～４の培地を０．１ｍｌ／穴となるように、マルチウェルプレート［商品名：組織培養用マイクロプレート（付着性細胞用）、９６ｗｅｌｌ、平底、ＩＷＡＫＩ（株）製］に投入した。
次に予めプレ培養したＶＥＲＯ細胞（大日本住友製薬（株）製）を細胞濃度が１０万個／ｍｌになるように各々の培地に播種した。３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％のＣＯ２インキュベーターの中で３時間培養を行った。
培養３時間目に各々の培地を吸引除去し、ＰＢＳ２００μｌ／穴を投入、吸引除去を２回実施し、基本培地（９０μｌ／穴）及び生細胞数測定試薬Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔ Ｒｅａｇｅｎｔ ＳＦ（ナカライテクス（株）製、１０μｌ／穴）を投入し、３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％のＣＯ２インキュベーターの中で１．５時間静置した。１．５時間後、プレートリーダー（富士フイルム和光純薬（株）製）を用いて、４９２ｎｍ（参考波長６２０ｎｍ）の吸光度を測定した。
アミンへのアルキレンオキサイド付加物を添加しない基本培地を用いて試験した際の吸光度の測定値（比較例３又は４）を吸光度（ブランク）とし、それぞれで測定した吸光度を吸光度（ブランク）で除し１００掛けた値を表１に示した。吸光度が高いほど、細胞接着性に優れることを示す。
実施例１～１６及び比較例１～４の培地を０．１ｍｌ／穴となるように、マルチウェルプレート［商品名：組織培養用マイクロプレート（付着性細胞用）、９６ｗｅｌｌ、平底、ＩＷＡＫＩ（株）製］に投入した。
次に予めプレ培養したＶＥＲＯ細胞（大日本住友製薬（株）製）を細胞濃度が１０万個／ｍｌになるように各々の培地に播種した。３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％のＣＯ２インキュベーターの中で３時間培養を行った。
培養３時間目に各々の培地を吸引除去し、ＰＢＳ２００μｌ／穴を投入、吸引除去を２回実施し、基本培地（９０μｌ／穴）及び生細胞数測定試薬Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔ Ｒｅａｇｅｎｔ ＳＦ（ナカライテクス（株）製、１０μｌ／穴）を投入し、３７℃、二酸化炭素ガス濃度５容量％のＣＯ２インキュベーターの中で１．５時間静置した。１．５時間後、プレートリーダー（富士フイルム和光純薬（株）製）を用いて、４９２ｎｍ（参考波長６２０ｎｍ）の吸光度を測定した。
アミンへのアルキレンオキサイド付加物を添加しない基本培地を用いて試験した際の吸光度の測定値（比較例３又は４）を吸光度（ブランク）とし、それぞれで測定した吸光度を吸光度（ブランク）で除し１００掛けた値を表１に示した。吸光度が高いほど、細胞接着性に優れることを示す。
【0036】
【表1】
【産業上の利用可能性】
【0037】
本発明の培地は、優れた細胞接着性を発揮するため、細胞の増殖性に優れるという利点がある。
従って、細胞増殖因子（血清等）に頼らず、細胞の増殖性を向上することが期待できる。
従って、細胞増殖因子（血清等）に頼らず、細胞の増殖性を向上することが期待できる。