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▶ シアトル チルドレンズ ホスピタル ドゥーイング ビジネス アズ シアトル チルドレンズ リサーチ インスティテュートの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024083617
(43)【公開日】2024-06-21
(54)【発明の名称】二重特異性キメラ抗原受容体およびその治療的使用
(51)【国際特許分類】
C07K 19/00 20060101AFI20240614BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20240614BHJP
C07K 16/30 20060101ALI20240614BHJP
C07K 16/24 20060101ALI20240614BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240614BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240614BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240614BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20240614BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240614BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20240614BHJP
C12N 5/0789 20100101ALI20240614BHJP
C12N 5/0735 20100101ALI20240614BHJP
A61K 31/519 20060101ALI20240614BHJP
A61K 31/522 20060101ALI20240614BHJP
A61K 31/65 20060101ALI20240614BHJP
A61K 31/704 20060101ALI20240614BHJP
A61K 31/7068 20060101ALI20240614BHJP
A61K 31/7072 20060101ALI20240614BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20240614BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240614BHJP
A61K 38/00 20060101ALI20240614BHJP
A61K 38/43 20060101ALI20240614BHJP
A61K 38/45 20060101ALI20240614BHJP
A61K 38/46 20060101ALI20240614BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240614BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240614BHJP
A61K 47/68 20170101ALI20240614BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240614BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20240614BHJP
A61P 9/00 20060101ALI20240614BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240614BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240614BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20240614BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20240614BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240614BHJP
A61K 31/7076 20060101ALI20240614BHJP
C12N 9/12 20060101ALN20240614BHJP
C12N 9/06 20060101ALN20240614BHJP
C12N 15/113 20100101ALN20240614BHJP
C07K 16/12 20060101ALN20240614BHJP
C07K 16/10 20060101ALN20240614BHJP
【ＦＩ】
C07K19/00 ZNA
C07K14/705
C07K16/30
C07K16/24
C12N15/13
C12N15/62 Z
C12N15/63 Z
C12N7/01
C12N5/10
C12N5/0783
C12N5/0789
C12N5/0735
A61K31/519
A61K31/522
A61K31/65
A61K31/704
A61K31/7068
A61K31/7072
A61K35/12
A61K35/76
A61K38/00
A61K38/43
A61K38/45
A61K38/46
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61K45/00
A61K47/68
A61K48/00
A61P3/10
A61P9/00
A61P25/00
A61P29/00
A61P31/00
A61P37/06
A61P35/00
A61K31/7076
C12N9/12
C12N9/06 Z
C12N15/113 140Z
C07K16/12
C07K16/10
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024068180
(22)【出願日】2024-04-19
(62)【分割の表示】P 2021087300の分割
【原出願日】2013-02-13
(31)【優先権主張番号】61/598,216
(32)【優先日】2012-02-13
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】514204772
【氏名又は名称】シアトル チルドレンズ ホスピタル ドゥーイング ビジネス アズ シアトル チルドレンズ リサーチ インスティテュート
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(72)【発明者】
【氏名】イェンセン マイケル
(57)【要約】
【課題】癌細胞等での抗原消失エスケープ変異体の出現による免疫療法治療の失敗を防ぐ又は最小化する免疫療法の提供。
【解決手段】（ａ）少なくとも２つの異なる抗原に結合する抗原特異的単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントを含む抗原特異的標的指向領域、（ｂ）細胞外スペーサードメイン、（ｃ）膜貫通ドメイン、（ｄ）少なくとも１つの共刺激ドメイン、及び（ｅ）細胞内シグナル伝達ドメインを含む二重特異性キメラ抗原受容体であり、トランケート型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）等の治療用制御物質と共発現させる二重特異性キメラ抗原受容体の提供。
【選択図】図１
【解決手段】（ａ）少なくとも２つの異なる抗原に結合する抗原特異的単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントを含む抗原特異的標的指向領域、（ｂ）細胞外スペーサードメイン、（ｃ）膜貫通ドメイン、（ｄ）少なくとも１つの共刺激ドメイン、及び（ｅ）細胞内シグナル伝達ドメインを含む二重特異性キメラ抗原受容体であり、トランケート型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）等の治療用制御物質と共発現させる二重特異性キメラ抗原受容体の提供。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ａ．少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域、
ｂ．細胞外スペーサードメイン、
ｃ．膜貫通ドメイン、
ｄ．少なくとも１つの共刺激ドメイン、および
ｅ．細胞内シグナル伝達ドメイン
を含み、治療用制御物質と共発現される、二重特異性キメラ抗原受容体であって、
各抗原特異的標的指向領域が、抗原特異的単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントを含み、かつ異なる抗原に結合する、
二重特異性キメラ抗原受容体。
ｂ．細胞外スペーサードメイン、
ｃ．膜貫通ドメイン、
ｄ．少なくとも１つの共刺激ドメイン、および
ｅ．細胞内シグナル伝達ドメイン
を含み、治療用制御物質と共発現される、二重特異性キメラ抗原受容体であって、
各抗原特異的標的指向領域が、抗原特異的単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントを含み、かつ異なる抗原に結合する、
二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項2】
前記治療用制御物質が、トランケート型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、キサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ヒトカスパーゼ８、ヒトカスパーゼ９、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、リナマラーゼ／リナマリン／グルコースオキシダーゼ、デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／インドール－３－酢酸（ＩＡＡ）、γグルタミルシステインシンテターゼ、ＣＤ２０／αＣＤ２０、ＣＤ３４／チミジンキナーゼキメラ、ｄｏｘ依存カスパーゼ－２、変異チミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫＳＲ３９）、ＡＰ１９０３／Ｆａｓ系、キメラサイトカイン受容体（ＣＣＲ）、選択マーカー、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項１に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項3】
前記ＥＧＦＲｔが、ＥＧＦＲ特異的ｓｉＲＮＡ、小分子、抗ＥＧＦＲ抗体もしくはそのフラグメント、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数に結合する、請求項２に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項4】
前記選択マーカーが、ジヒドロキシ葉酸受容体（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＤＨＦＲ）、変異ＤＨＦＲ、メチル化－ＤＮＡ－タンパク質－システインメチルトランスフェラーゼ、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼＩＩ（ＩＭＤＨＰ２）、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項２に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項5】
前記ＣＣＲが、（ｉ）ＩＬ－７サイトカイン－リンカー－ＩＬ７Ｒα、（ｉｉ）ＩＬ－７サイトカイン－リンカー－ＩＬ－７Ｒαの細胞外ドメイン－ＩＬ－７Ｒαの膜貫通ドメイン－ＩＬ－２Ｒβの細胞質ドメイン、（ｉｉｉ）ＩＬ－７サイトカイン－リンカー－ＩＬ２Ｒβ、および（ｉｖ）それらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項２に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項6】
前記二重特異性キメラ抗原受容体および前記治療用制御物質が、切断可能なリンカーを介して連結されている、請求項１に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項7】
前記切断可能なリンカーが、自己切断型の切断可能なリンカーである、請求項６に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項8】
前記切断可能なリンカーが、２Ａリンカー、２Ａ様リンカー、またはその機能的等価物のうちのいずれか１つまたは複数である、請求項７に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項9】
前記細胞外スペーサードメインが、抗体のＦｃフラグメント、またはその機能的等価物、フラグメント、もしくは誘導体、抗体のヒンジ領域、またはその機能的等価物、フラグメント、もしくは誘導体、抗体のＣＨ２領域、抗体のＣＨ３領域、人工スペーサー配列、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項１に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項10】
前記細胞外スペーサードメインが、（ｉ）ＩｇＧ４のヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域、（ｉｉ）ＩｇＧ４のヒンジ領域、（ｉｉｉ）ＩｇＧ４のヒンジおよびＣＨ２領域、（ｉｖ）ＣＤ８αのヒンジ領域、（ｖ）ＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域、（ｖｉ）ＩｇＧ１のヒンジ領域、（ｖｉ）ＩｇＧ１のヒンジおよびＣＨ２領域、または（ｖｉｉ）それらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項９に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項11】
前記膜貫通ドメインが、Ｉ型膜貫通タンパク質の膜貫通領域、人工疎水性配列、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項１に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項12】
前記膜貫通ドメインが、Ｔ細胞受容体複合体のζ鎖の膜貫通ドメイン、ＣＤ２８、ＣＤ８α、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項１１に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項13】
前記共刺激ドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、Ｄａｐ１０、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ－Ｉ、ＴＮＦＲ－ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数に由来するシグナル伝達ドメインを含む、請求項１に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項14】
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ヒトＣＤ３ζ鎖、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃεＲＩ、Ｆｃ受容体の細胞質側末端、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する細胞質受容体、およびそれらの組み合わせのうちの１つまたは複数のシグナル伝達ドメインを含む、請求項１に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項15】
前記少なくとも２つの抗原特異的標的指向ドメインのそれぞれが、癌、炎症性疾患、神経障害、糖尿病、心血管系疾患、感染性疾患、自己免疫性疾患、およびそれらの組み合わせに対して特異的な抗原から成る群から独立して選択される抗原を標的とする、請求項１に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項16】
癌に特異的な前記抗原が、４－１ＢＢ、５Ｔ４、腺癌抗原、α－フェトプロテイン、ＢＡＦＦ、Ｂ－リンパ腫細胞、Ｃ２４２抗原、ＣＡ－１２５、炭酸脱水酵素９（ＣＡ－ＩＸ）、Ｃ－ＭＥＴ、ＣＣＲ４、ＣＤ１５２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２００、ＣＤ２２、ＣＤ２２１、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２８、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ３３、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＥＡ、ＣＮＴＯ８８８、ＣＴＬＡ－４、ＤＲ５、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３、ＦＡＰ、フィブロネクチンのエクストラドメイン－Ｂ、葉酸受容体１、ＧＤ２、ＧＤ３ガングリオシド、糖タンパク質７５、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＧＦ、ヒト細胞分散因子（ｓｃａｔｔｅｒ ｆａｃｔｏｒ）受容体キナーゼ、ＩＧＦ－１受容体、ＩＧＦ－Ｉ、ＩｇＧ１、Ｌ１－ＣＡＭ、ＩＬ－１３、ＩＬ－６、インスリン様成長因子Ｉ受容体、インテグリンα５β１、インテグリンαｖβ３、ＭＯＲＡｂ－００９、ＭＳ４Ａ１、ＭＵＣ１、ムチンＣａｎＡｇ、Ｎ－グリコリルノイラミン酸、ＮＰＣ－１Ｃ、ＰＤＧＦ－Ｒα、ＰＤＬ１９２、ホスファチジルセリン、前立腺癌細胞、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＮ、ＲＯＲ１、ＳＣＨ ９００１０５、ＳＤＣ１、ＳＬＡＭＦ７、ＴＡＧ－７２、テネイシンＣ、ＴＧＦβ２、ＴＧＦ－β、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦＲ－１、ＶＥＧＦＲ２、ビメンチン、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項１５に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項17】
前記少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域が、（ｉ）ＣＤ１９およびＣＤ２０、（ｉｉ）ＣＤ２０およびＬ１－ＣＡＭ、（ｉｉｉ）Ｌ１－ＣＡＭおよびＧＤ２、（ｉｖ）ＥＧＦＲおよびＬ１－ＣＡＭ、（ｖ）ＣＤ１９およびＣＤ２２、（ｖｉ）ＥＧＦＲおよびＣ－ＭＥＴ、（ｖｉｉ）ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２、（ｖｉｉｉ）Ｃ－ＭＥＴおよびＨＥＲ２、または（ｉｘ）ＥＧＦＲおよびＲＯＲ１に結合する、請求項１に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項18】
前記少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域が、ＣＤ１９およびＣＤ２０に結合する、請求項１に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項19】
炎症性疾患に特異的な前記抗原が、ＡＯＣ３（ＶＡＰ－１）、ＣＡＭ－３００１、ＣＣＬ１１（エオタキシン－１）、ＣＤ１２５、ＣＤ１４７（ベイシジン）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ２、ＣＤ２０、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２５（ＩＬ－２受容体のα鎖）、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ、ＩｇＥ、ＩｇＥ Ｆｃ領域、ＩＬ－１、ＩＬ－１２、ＩＬ－２３、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－６受容体、インテグリンα４、インテグリンα４β７、リャマ（Ｌａｍａ ｇｌａｍａ）、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ）、ＭＥＤＩ－５２８、ミオスタチン、ＯＸ－４０、ｒｈｕＭＡｂβ７、スクレロスシン（ｓｃｌｅｒｏｓｃｉｎ）、ＳＯＳＴ、ＴＧＦβ１、ＴＮＦ－α、ＶＥＧＦ－Ａ、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項１５に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項20】
神経障害に特異的な前記抗原が、βアミロイド、ＭＡＢＴ５１０２Ａ、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項１５に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項21】
糖尿病に特異的な前記抗原が、Ｌ－１β、ＣＤ３、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項１５に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項22】
心血管系疾患に特異的な前記抗原が、Ｃ５、心筋ミオシン、ＣＤ４１（インテグリンα－ＩＩｂ）、フィブリンＩＩ、β鎖、ＩＴＧＢ２（ＣＤ１８）、スフィンゴシン－１－ホスファート、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項１５に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項23】
感染性疾患に特異的な前記抗原が、炭疽毒素、ＣＣＲ５、ＣＤ４、クランピング因子Ａ、サイトメガロウイルス、サイトメガロウイルス糖タンパク質Ｂ、内毒素、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ－１、Ｈｓｐ９０、Ａ型インフルエンザ血球凝集素、リポテイコ酸、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、狂犬病ウイルス糖タンパク質、呼吸器合胞体ウイルス、ＴＮＦ－α、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項１５に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項24】
請求項１に記載の二重特異性キメラ抗原受容体と、治療用制御物質との組み合わせ。
【請求項25】
前記治療用制御物質が、トランケート型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、キサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ヒトカスパーゼ８、ヒトカスパーゼ９、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、リナマラーゼ／リナマリン／グルコースオキシダーゼ、デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／インドール－３－酢酸（ＩＡＡ）、γグルタミルシステインシンテターゼ、ＣＤ２０／αＣＤ２０、ＣＤ３４／チミジンキナーゼキメラ、ｄｏｘ依存カスパーゼ－２、変異チミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫＳＲ３９）、ＡＰ１９０３／Ｆａｓ系、キメラサイトカイン受容体（ＣＣＲ）、選択マーカー、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項２４に記載の組み合わせ。
【請求項26】
前記ＥＧＦＲｔが、ＥＧＦＲ特異的ｓｉＲＮＡ、小分子、抗ＥＧＦＲ抗体もしくはそのフラグメント、またはそれらの組み合わせのうちのいずれかのうちの１つまたは複数に結合する、請求項２５に記載の組み合わせ。
【請求項27】
前記選択マーカーが、ジヒドロキシ葉酸受容体（ＤＨＦＲ）、変異ＤＨＦＲ、メチル化－ＤＮＡ－タンパク質－システインメチルトランスフェラーゼ、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼＩＩ（ＩＭＤＨＰ２）、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項２５に記載の組み合わせ。
【請求項28】
前記ＣＣＲが、（ｉ）ＩＬ－７サイトカイン－リンカー－ＩＬ７Ｒα、（ｉｉ）ＩＬ－７サイトカイン－リンカー－ＩＬ－７Ｒαの細胞外ドメイン－ＩＬ－７Ｒαの膜貫通ドメイン－ＩＬ－２Ｒβの細胞質ドメイン、（ｉｉｉ）ＩＬ－７サイトカイン－リンカー－ＩＬ２Ｒβ、および（ｉｖ）それらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項２５に記載の組み合わせ。
【請求項29】
前記二重特異性キメラ抗原受容体および前記治療用制御物質が、切断可能なリンカーを介して連結されている、請求項２４に記載の組み合わせ。
【請求項30】
前記切断可能なリンカーが、自己切断型の切断可能なリンカーである、請求項２９に記載の組み合わせ。
【請求項31】
前記切断可能なリンカーが、２Ａリンカー、２Ａ様リンカー、またはその機能的等価物のうちのいずれか１つまたは複数である、請求項２９に記載の組み合わせ。
【請求項32】
請求項１に記載の二重特異性キメラ抗原受容体または請求項２４に記載の組み合わせをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項33】
請求項３２に記載のポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド。
【請求項34】
請求項３２に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項35】
請求項３２に記載のポリヌクレオチドを含む、ウイルス。
【請求項36】
ＲＮＡウイルスである、請求項３５に記載のウイルス。
【請求項37】
レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、またはヘルペスウイルスである、請求項３５に記載のウイルス。
【請求項38】
請求項３２に記載のポリヌクレオチド、請求項１に記載のキメラ抗原受容体、または請求項２４に記載の組み合わせを含む、遺伝子改変細胞。
【請求項39】
Ｔ－リンパ球（Ｔ細胞）である、請求項３８に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項40】
ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、またはそれらの組み合わせである、請求項３９に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項41】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、胚性幹細胞、または多能性幹細胞である、請求項３８に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項42】
ａ．請求項１に記載の二重特異性キメラ抗原受容体、請求項２４に記載の組み合わせ、請求項３２に記載のポリペプチド、請求項３４に記載のベクター、請求項３５に記載のウイルス、請求項３８に記載の遺伝子改変細胞、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数と、
ｂ．薬学的に許容される担体と
を含む、薬学的組成物。
ｂ．薬学的に許容される担体と
を含む、薬学的組成物。
【請求項43】
請求項４２に記載の薬学的組成物と、
治療用制御物質を発現する細胞の増殖を阻害するための、該治療用制御物質と生化学的に相互作用するように適合された組成物と
の組み合わせ。
治療用制御物質を発現する細胞の増殖を阻害するための、該治療用制御物質と生化学的に相互作用するように適合された組成物と
の組み合わせ。
【請求項44】
前記治療用制御物質と生化学的に相互作用するように適合された前記組成物が、ハーセプチン、メトトレキサート、セツキシマブ、チミジン類似体（例えばガンシクロビル）、（Ｅ）－５－（２－ブロモビニル）－２'－デオキシウリジン（ＢＶＤＵ）、５－フルロシトシン（ｆｌｕｒｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）（５－ＦＣ）、５－（アザリジン（ａｚａｒｉｄｉｎ）－１－イル）－２，４－ジニトロベンズアミド（ＣＢ１９５４）、６－チオグアニン、合成二量体化薬（ｄｉｍｅｒｉｚｉｎｇ ｄｒｕｇ）（例えば、ＡＰ１９０３）、リン酸フルダラビン、リナマリン（ｌｉｎ）、ヌクレオシド類似体（例えば、ＢＶＤＵ、ジフルオロデオキシシチジン（ｄＦｄＣ）、１－β－Ｄ－アラビノフラノシルチミン（アラ－Ｔ））、インドール－３－酢酸（ＩＡＡ）、ｌ－ブチオニン－Ｓ，Ｒ－スルホキシイミン（ＢＳＯ）、リツキシマブ（ＲＴＸ）、ドキシサイクリン、チロシンキナーゼ阻害剤、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数である、請求項４３に記載の組み合わせ。
【請求項45】
以下の工程を含む、キメラ抗原受容体を発現する一定量のＴ細胞を生成する方法：
（ｉ）請求項３４に記載のベクターを、１個または複数個のＴ細胞にトランスフェクトする工程、および
（ｉｉ）少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域によって標的とされる抗原を発現する細胞、少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域によって標的とされる組換え抗原を発現する細胞、またはキメラ抗原受容体に対する抗体を発現する細胞で、該１個または複数個のＴ細胞を刺激する工程であって、それによって該Ｔ細胞が、一定量のＴ細胞を生成するように増殖する、工程。
（ｉ）請求項３４に記載のベクターを、１個または複数個のＴ細胞にトランスフェクトする工程、および
（ｉｉ）少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域によって標的とされる抗原を発現する細胞、少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域によって標的とされる組換え抗原を発現する細胞、またはキメラ抗原受容体に対する抗体を発現する細胞で、該１個または複数個のＴ細胞を刺激する工程であって、それによって該Ｔ細胞が、一定量のＴ細胞を生成するように増殖する、工程。
【請求項46】
疾患の治療を必要とする対象における疾患を治療するための方法であって、
該方法が、
（ｉ）請求項４２に記載の組成物を提供する工程、および
（ｉｉ）治療的有効量の該組成物を、該疾患を治療するように該対象に投与する工程
を含み、
少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域がそれぞれ、抗原を標的とし、かつ少なくとも１つのそのような抗原が、該疾患と関連している、
該方法。
該方法が、
（ｉ）請求項４２に記載の組成物を提供する工程、および
（ｉｉ）治療的有効量の該組成物を、該疾患を治療するように該対象に投与する工程
を含み、
少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域がそれぞれ、抗原を標的とし、かつ少なくとも１つのそのような抗原が、該疾患と関連している、
該方法。
【請求項47】
ａ．少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域、
ｂ．細胞外スペーサードメイン、
ｃ．膜貫通ドメイン、
ｄ．少なくとも１つの共刺激ドメイン、および
ｅ．細胞内シグナル伝達ドメイン
を含み、トランケート型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）と共発現される、二重特異性キメラ抗原受容体であって、
各抗原特異的標的指向領域が、抗原特異的単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントを含み、かつ異なる抗原に結合する、
二重特異性キメラ抗原受容体。
ｂ．細胞外スペーサードメイン、
ｃ．膜貫通ドメイン、
ｄ．少なくとも１つの共刺激ドメイン、および
ｅ．細胞内シグナル伝達ドメイン
を含み、トランケート型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）と共発現される、二重特異性キメラ抗原受容体であって、
各抗原特異的標的指向領域が、抗原特異的単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントを含み、かつ異なる抗原に結合する、
二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項48】
チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、キサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ヒトカスパーゼ８、ヒトカスパーゼ９、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、リナマラーゼ／リナマリン／グルコースオキシダーゼ、デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／インドール－３－酢酸（ＩＡＡ）、γグルタミルシステインシンテターゼ、ＣＤ２０／αＣＤ２０、ＣＤ３４／チミジンキナーゼキメラ、ｄｏｘ依存カスパーゼ－２、変異チミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫＳＲ３９）、ＡＰ１９０３／Ｆａｓ系、キメラサイトカイン受容体（ＣＣＲ）、選択マーカー、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む治療用制御物質と共発現される、請求項４７に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項49】
前記ＥＧＦＲｔが、ＥＧＦＲ特異的ｓｉＲＮＡ、小分子、抗ＥＧＦＲ抗体もしくはそのフラグメント、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数に結合する、請求項４７に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項50】
前記選択マーカーが、ジヒドロキシ葉酸受容体（ＤＨＦＲ）、変異ＤＨＦＲ、メチル化－ＤＮＡ－タンパク質－システインメチルトランスフェラーゼ、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼＩＩ（ＩＭＤＨＰ２）、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項４８に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項51】
前記ＣＣＲが、（ｉ）ＩＬ－７サイトカイン－リンカー－ＩＬ７Ｒα、（ｉｉ）ＩＬ－７サイトカイン－リンカー－ＩＬ－７Ｒαの細胞外ドメイン－ＩＬ－７Ｒαの膜貫通ドメイン－ＩＬ－２Ｒβの細胞質ドメイン、（ｉｉｉ）ＩＬ－７サイトカイン－リンカー－ＩＬ２Ｒβ、および（ｉｖ）それらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項４８に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項52】
前記二重特異性キメラ抗原受容体および前記治療用制御物質が、切断可能なリンカーを介して連結されている、請求項４７に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項53】
前記切断可能なリンカーが、自己切断型の切断可能なリンカーである、請求項５２に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項54】
前記切断可能なリンカーが、２Ａリンカー、２Ａ様リンカー、またはその機能的等価物のうちのいずれか１つまたは複数である、請求項５２に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項55】
前記細胞外スペーサードメインが、抗体のＦｃフラグメント、またはその機能的等価物、フラグメント、もしくは誘導体、抗体のヒンジ領域、またはその機能的等価物、フラグメント、もしくは誘導体、抗体のＣＨ２領域、抗体のＣＨ３領域、人工スペーサー配列、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項４７に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項56】
前記細胞外スペーサードメインが、（ｉ）ＩｇＧ４のヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域、（ｉｉ）ＩｇＧ４のヒンジ領域、（ｉｉｉ）ＩｇＧ４のヒンジおよびＣＨ２領域、（ｉｖ）ＣＤ８αのヒンジ領域、（ｖ）ＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域、（ｖｉ）ＩｇＧ１のヒンジ領域、（ｖｉ）ＩｇＧ１のヒンジおよびＣＨ２領域、ならびに（ｖｉｉ）それらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項５５に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項57】
前記膜貫通ドメインが、Ｉ型膜貫通タンパク質の膜貫通領域、人工疎水性配列、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項４７に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項58】
前記膜貫通ドメインが、Ｔ細胞受容体複合体のζ鎖の膜貫通ドメイン、ＣＤ２８、ＣＤ８α、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項５７に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項59】
前記共刺激ドメインが、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、Ｄａｐ１０、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ－Ｉ、ＴＮＦＲ－ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数に由来するシグナル伝達ドメインを含む、請求項４７に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項60】
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ヒトＣＤ３ζ鎖、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃεＲＩ、Ｆｃ受容体の細胞質側末端、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する細胞質受容体、およびそれらの組み合わせのうちの１つまたは複数のシグナル伝達ドメインを含む、請求項４７に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項61】
前記少なくとも２つの抗原特異的標的指向ドメインのそれぞれが、癌、炎症性疾患、神経障害、糖尿病、心血管系疾患、感染性疾患、自己免疫性疾患、およびそれらの組み合わせに対して特異的な抗原から成る群から独立して選択される抗原を標的とする、請求項４７に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項62】
癌に特異的な前記抗原が、４－１ＢＢ、５Ｔ４、腺癌抗原、α－フェトプロテイン、ＢＡＦＦ、Ｂ－リンパ腫細胞、Ｃ２４２抗原、ＣＡ－１２５、炭酸脱水酵素９（ＣＡ－ＩＸ）、Ｃ－ＭＥＴ、ＣＣＲ４、ＣＤ１５２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２００、ＣＤ２２、ＣＤ２２１、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２８、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ３３、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＥＡ、ＣＮＴＯ８８８、ＣＴＬＡ－４、ＤＲ５、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３、ＦＡＰ、フィブロネクチンのエクストラドメイン－Ｂ、葉酸受容体１、ＧＤ２、ＧＤ３ガングリオシド、糖タンパク質７５、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＧＦ、ヒト細胞分散因子受容体キナーゼ、ＩＧＦ－１受容体、ＩＧＦ－Ｉ、ＩｇＧ１、Ｌ１－ＣＡＭ、ＩＬ－１３、ＩＬ－６、インスリン様成長因子Ｉ受容体、インテグリンα５β１、インテグリンαｖβ３、ＭＯＲＡｂ－００９、ＭＳ４Ａ１、ＭＵＣ１、ムチンＣａｎＡｇ、Ｎ－グリコリルノイラミン酸、ＮＰＣ－１Ｃ、ＰＤＧＦ－Ｒα、ＰＤＬ１９２、ホスファチジルセリン、前立腺癌細胞、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＮ、ＲＯＲ１、ＳＣＨ ９００１０５、ＳＤＣ１、ＳＬＡＭＦ７、ＴＡＧ－７２、テネイシンＣ、ＴＧＦβ２、ＴＧＦ－β、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦＲ－１、ＶＥＧＦＲ２、ビメンチン、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項６１に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項63】
前記少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域が、（ｉ）ＣＤ１９およびＣＤ２０、（ｉｉ）ＣＤ２０およびＬ１－ＣＡＭ、（ｉｉｉ）Ｌ１－ＣＡＭおよびＧＤ２、（ｉｖ）ＥＧＦＲおよびＬ１－ＣＡＭ、（ｖ）ＣＤ１９およびＣＤ２２、（ｖｉ）ＥＧＦＲおよびＣ－ＭＥＴ、（ｖｉｉ）ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２、（ｖｉｉｉ）Ｃ－ＭＥＴおよびＨＥＲ２、または（ｉｘ）ＥＧＦＲおよびＲＯＲ１に結合する、請求項４７に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項64】
前記少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域が、ＣＤ１９およびＣＤ２０に結合する、請求項４７に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項65】
炎症性疾患に特異的な前記抗原が、ＡＯＣ３（ＶＡＰ－１）、ＣＡＭ－３００１、ＣＣＬ１１（エオタキシン－１）、ＣＤ１２５、ＣＤ１４７（ベイシジン）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ２、ＣＤ２０、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２５（ＩＬ－２受容体のα鎖）、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ、ＩｇＥ、ＩｇＥ Ｆｃ領域、ＩＬ－１、ＩＬ－１２、ＩＬ－２３、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－６受容体、インテグリンα４、インテグリンα４β７、リャマ、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ）、ＭＥＤＩ－５２８、ミオスタチン、ＯＸ－４０、ｒｈｕＭＡｂβ７、スクレロスシン、ＳＯＳＴ、ＴＧＦβ１、ＴＮＦ－α、ＶＥＧＦ－Ａ、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項６１に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項66】
神経障害に特異的な前記抗原が、βアミロイド、ＭＡＢＴ５１０２Ａ、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項６１に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項67】
糖尿病に特異的な前記抗原が、Ｌ－１β、ＣＤ３、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項６１に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項68】
心血管系疾患に特異的な前記抗原が、Ｃ５、心筋ミオシン、ＣＤ４１（インテグリンα－ＩＩｂ）、フィブリンＩＩ、β鎖、ＩＴＧＢ２（ＣＤ１８）、スフィンゴシン－１－ホスファート、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項６１に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項69】
感染性疾患に特異的な前記抗原が、炭疽毒素、ＣＣＲ５、ＣＤ４、クランピング因子Ａ、サイトメガロウイルス、サイトメガロウイルス糖タンパク質Ｂ、内毒素、大腸菌、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ－１、Ｈｓｐ９０、Ａ型インフルエンザ血球凝集素、リポテイコ酸、緑膿菌、狂犬病ウイルス糖タンパク質、呼吸器合胞体ウイルス、ＴＮＦ－α、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項に６１記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項70】
請求項４７に記載の二重特異性キメラ抗原受容体と、ＥＧＦＲｔとの組み合わせ。
【請求項71】
前記ＥＧＦＲｔが、ＥＧＦＲ特異的ｓｉＲＮＡ、小分子、抗ＥＧＦＲ抗体もしくはそのフラグメント、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数に結合する、請求項７０に記載の組み合わせ。
【請求項72】
前記二重特異性キメラ抗原受容体および前記ＥＧＦＲｔが、切断可能なリンカーを介して連結されている、請求項７０に記載の組み合わせ。
【請求項73】
前記切断可能なリンカーが、自己切断型の切断可能なリンカーである、請求項７２に記載の組み合わせ。
【請求項74】
前記切断可能なリンカーが、２Ａリンカー、２Ａ様リンカー、またはその機能的等価物のうちのいずれか１つまたは複数である、請求項７２に記載の組み合わせ。
【請求項75】
請求項４７に記載の二重特異性キメラ抗原受容体または請求項７０に記載の組み合わせをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項76】
請求項７５に記載のポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド。
【請求項77】
請求項７５に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項78】
請求項７５に記載のポリヌクレオチドを含む、ウイルス。
【請求項79】
ＲＮＡウイルスである、請求項７８に記載のウイルス。
【請求項80】
レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、またはヘルペスウイルスである、請求項７８に記載のウイルス。
【請求項81】
請求項７５に記載のポリヌクレオチド、請求項４７に記載のキメラ抗原受容体、または請求項７０に記載の組み合わせを含む、遺伝子改変細胞。
【請求項82】
Ｔ－リンパ球（Ｔ細胞）である、請求項８１に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項83】
ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、またはそれらの組み合わせである、請求項８２に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項84】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、胚性幹細胞、または多能性幹細胞である、請求項８１に記載の遺伝子改変細胞。
【請求項85】
ａ．請求項４７に記載の二重特異性キメラ抗原受容体、請求項７０に記載の組み合わせ、請求項７６に記載のポリペプチド、請求項７７に記載のベクター、請求項７８に記載のウイルス、請求項８１に記載の遺伝子改変細胞、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数と、
ｂ．薬学的に許容される担体と
を含む、薬学的組成物。
ｂ．薬学的に許容される担体と
を含む、薬学的組成物。
【請求項86】
請求項８５に記載の薬学的組成物と、
ＥＧＦＲｔを発現する細胞の増殖を阻害するための、治療用制御物質と生化学的に相互作用するように適合された組成物と
の組み合わせ。
ＥＧＦＲｔを発現する細胞の増殖を阻害するための、治療用制御物質と生化学的に相互作用するように適合された組成物と
の組み合わせ。
【請求項87】
前記治療用制御物質と生化学的に相互作用するように適合された前記組成物が、ハーセプチン、メトトレキサート、セツキシマブ、チミジン類似体（例えばガンシクロビル）、（Ｅ）－５－（２－ブロモビニル）－２'－デオキシウリジン（ＢＶＤＵ）、５－フルロシトシン（５－ＦＣ）、５－（アザリジン－１－イル）－２，４－ジニトロベンズアミド（ＣＢ１９５４）、６－チオグアニン、合成二量体化薬（例えば、ＡＰ１９０３）、リン酸フルダラビン、リナマリン（ｌｉｎ）、ヌクレオシド類似体（例えば、ＢＶＤＵ、ジフルオロデオキシシチジン（ｄＦｄＣ）、１－β－Ｄ－アラビノフラノシルチミン（アラ－Ｔ））、インドール－３－酢酸（ＩＡＡ）、ｌ－ブチオニン－Ｓ，Ｒ－スルホキシイミン（ＢＳＯ）、リツキシマブ（ＲＴＸ）、ドキシサイクリン、チロシンキナーゼ阻害剤、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数である、請求項８６に記載の組み合わせ。
【請求項88】
以下の工程を含む、キメラ抗原受容体を発現する一定量のＴ細胞を生成する方法：
（ｉ）請求項７７に記載のベクターを、１個または複数個のＴ細胞にトランスフェクトする工程、および
（ｉｉ）少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域によって標的とされる抗原を発現する細胞、少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域によって標的とされる組換え抗原を発現する細胞、またはキメラ抗原受容体に対する抗体を発現する細胞で、該１個または複数個のＴ細胞を刺激する工程であって、それによって該Ｔ細胞が、一定量のＴ細胞を生成するように増殖する、工程。
（ｉ）請求項７７に記載のベクターを、１個または複数個のＴ細胞にトランスフェクトする工程、および
（ｉｉ）少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域によって標的とされる抗原を発現する細胞、少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域によって標的とされる組換え抗原を発現する細胞、またはキメラ抗原受容体に対する抗体を発現する細胞で、該１個または複数個のＴ細胞を刺激する工程であって、それによって該Ｔ細胞が、一定量のＴ細胞を生成するように増殖する、工程。
【請求項89】
疾患の治療を必要とする対象における疾患を治療するための方法であって、
該方法が、
（ｉ）請求項８５に記載の組成物を提供する工程、および
（ｉｉ）治療的有効量の該組成物を、該疾患を治療するように該対象に投与する工程
を含み、
少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域がそれぞれ、抗原を標的とし、かつ少なくとも１つのそのような抗原が、該疾患と関連している、
該方法。
該方法が、
（ｉ）請求項８５に記載の組成物を提供する工程、および
（ｉｉ）治療的有効量の該組成物を、該疾患を治療するように該対象に投与する工程
を含み、
少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域がそれぞれ、抗原を標的とし、かつ少なくとも１つのそのような抗原が、該疾患と関連している、
該方法。
【請求項90】
図４、９、または１１に記載される配列を含む、二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項91】
ａ．少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域、
ｂ．ＣＤ８αヒンジ細胞外スペーサードメイン、
ｃ．ＣＤ８α膜貫通ドメイン、
ｄ．４－１ＢＢ共刺激ドメイン、および
ｅ．ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン
を含み、トランケート型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）と共発現される、二重特異性キメラ抗原受容体であって、
各抗原特異的標的指向領域が、抗原特異的単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントを含み、かつ異なる抗原に結合し、
二重特異性キメラ抗原受容体およびＥＧＦＲｔが、Ｔ２Ａリンカーを介して連結されている、
二重特異性キメラ抗原受容体。
ｂ．ＣＤ８αヒンジ細胞外スペーサードメイン、
ｃ．ＣＤ８α膜貫通ドメイン、
ｄ．４－１ＢＢ共刺激ドメイン、および
ｅ．ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメイン
を含み、トランケート型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）と共発現される、二重特異性キメラ抗原受容体であって、
各抗原特異的標的指向領域が、抗原特異的単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントを含み、かつ異なる抗原に結合し、
二重特異性キメラ抗原受容体およびＥＧＦＲｔが、Ｔ２Ａリンカーを介して連結されている、
二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項92】
チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、キサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ヒトカスパーゼ８、ヒトカスパーゼ９、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、リナマラーゼ／リナマリン／グルコースオキシダーゼ、デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／インドール－３－酢酸（ＩＡＡ）、γグルタミルシステインシンテターゼ、ＣＤ２０／αＣＤ２０、ＣＤ３４／チミジンキナーゼキメラ、ｄｏｘ依存カスパーゼ－２、変異チミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫＳＲ３９）、ＡＰ１９０３／Ｆａｓ系、キメラサイトカイン受容体（ＣＣＲ）、選択マーカー、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む治療用制御物質と共発現される、請求項９１に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項93】
前記ＥＧＦＲｔが、ＥＧＦＲ特異的ｓｉＲＮＡ、小分子、抗ＥＧＦＲ抗体もしくはそのフラグメント、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数に結合する、請求項９１に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項94】
前記選択マーカーが、ジヒドロキシ葉酸受容体（ＤＨＦＲ）、変異ＤＨＦＲ、メチル化－ＤＮＡ－タンパク質－システインメチルトランスフェラーゼ、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼＩＩ（ＩＭＤＨＰ２）、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項９２に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項95】
前記ＣＣＲが、（ｉ）ＩＬ－７サイトカイン－リンカー－ＩＬ７Ｒα、（ｉｉ）ＩＬ－７サイトカイン－リンカー－ＩＬ－７Ｒαの細胞外ドメイン－ＩＬ－７Ｒαの膜貫通ドメイン－ＩＬ－２Ｒβの細胞質ドメイン、（ｉｉｉ）ＩＬ－７サイトカイン－リンカー－ＩＬ２Ｒβ、および（ｉｖ）それらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項９２に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項96】
前記少なくとも２つの抗原特異的標的指向ドメインのそれぞれが、癌、炎症性疾患、神経障害、糖尿病、心血管系疾患、感染性疾患、自己免疫性疾患、およびそれらの組み合わせに対して特異的な抗原から成る群から独立して選択される抗原を標的とする、請求項９１に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項97】
癌に特異的な前記抗原が、４－１ＢＢ、５Ｔ４、腺癌抗原、α－フェトプロテイン、ＢＡＦＦ、Ｂ－リンパ腫細胞、Ｃ２４２抗原、ＣＡ－１２５、炭酸脱水酵素９（ＣＡ－ＩＸ）、Ｃ－ＭＥＴ、ＣＣＲ４、ＣＤ１５２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２００、ＣＤ２２、ＣＤ２２１、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２８、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ３３、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＥＡ、ＣＮＴＯ８８８、ＣＴＬＡ－４、ＤＲ５、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３、ＦＡＰ、フィブロネクチンのエクストラドメイン－Ｂ、葉酸受容体１、ＧＤ２、ＧＤ３ガングリオシド、糖タンパク質７５、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＧＦ、ヒト細胞分散因子受容体キナーゼ、ＩＧＦ－１受容体、ＩＧＦ－Ｉ、ＩｇＧ１、Ｌ１－ＣＡＭ、ＩＬ－１３、ＩＬ－６、インスリン様成長因子Ｉ受容体、インテグリンα５β１、インテグリンαｖβ３、ＭＯＲＡｂ－００９、ＭＳ４Ａ１、ＭＵＣ１、ムチンＣａｎＡｇ、Ｎ－グリコリルノイラミン酸、ＮＰＣ－１Ｃ、ＰＤＧＦ－Ｒα、ＰＤＬ１９２、ホスファチジルセリン、前立腺癌細胞、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＮ、ＲＯＲ１、ＳＣＨ ９００１０５、ＳＤＣ１、ＳＬＡＭＦ７、ＴＡＧ－７２、テネイシンＣ、ＴＧＦβ２、ＴＧＦ－β、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦＲ－１、ＶＥＧＦＲ２、ビメンチン、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項９６に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項98】
前記少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域が、（ｉ）ＣＤ１９およびＣＤ２０、（ｉｉ）ＣＤ２０およびＬ１－ＣＡＭ、（ｉｉｉ）Ｌ１－ＣＡＭおよびＧＤ２、（ｉｖ）ＥＧＦＲおよびＬ１－ＣＡＭ、（ｖ）ＣＤ１９およびＣＤ２２、（ｖｉ）ＥＧＦＲおよびＣ－ＭＥＴ、（ｖｉｉ）ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２、（ｖｉｉｉ）Ｃ－ＭＥＴおよびＨＥＲ２、または（ｉｘ）ＥＧＦＲおよびＲＯＲ１に結合する、請求項９６に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項99】
前記少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域が、ＣＤ１９およびＣＤ２０に結合する、請求項９６に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項100】
炎症性疾患に特異的な前記抗原が、ＡＯＣ３（ＶＡＰ－１）、ＣＡＭ－３００１、ＣＣＬ１１（エオタキシン－１）、ＣＤ１２５、ＣＤ１４７（ベイシジン）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ２、ＣＤ２０、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２５（ＩＬ－２受容体のα鎖）、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ、ＩｇＥ、ＩｇＥ Ｆｃ領域、ＩＬ－１、ＩＬ－１２、ＩＬ－２３、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－６受容体、インテグリンα４、インテグリンα４β７、リャマ、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ）、ＭＥＤＩ－５２８、ミオスタチン、ＯＸ－４０、ｒｈｕＭＡｂβ７、スクレロスシン、ＳＯＳＴ、ＴＧＦβ１、ＴＮＦ－α、ＶＥＧＦ－Ａ、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項９６に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項101】
神経障害に特異的な前記抗原が、βアミロイド、ＭＡＢＴ５１０２Ａ、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項９６に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項102】
糖尿病に特異的な前記抗原が、Ｌ－１β、ＣＤ３、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項９６に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項103】
心血管系疾患に特異的な前記抗原が、Ｃ５、心筋ミオシン、ＣＤ４１（インテグリンα－ＩＩｂ）、フィブリンＩＩ、β鎖、ＩＴＧＢ２（ＣＤ１８）、スフィンゴシン－１－ホスファート、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項９６に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【請求項104】
感染性疾患に特異的な前記抗原が、炭疽毒素、ＣＣＲ５、ＣＤ４、クランピング因子Ａ、サイトメガロウイルス、サイトメガロウイルス糖タンパク質Ｂ、内毒素、大腸菌、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ－１、Ｈｓｐ９０、Ａ型インフルエンザ血球凝集素、リポテイコ酸、緑膿菌、狂犬病ウイルス糖タンパク質、呼吸器合胞体ウイルス、ＴＮＦ－α、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項９６に記載の二重特異性キメラ抗原受容体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、キメラ抗原受容体およびそれを使用する遺伝子改変細胞に関する。
【背景技術】
【0002】
現在の免疫療法は、癌細胞上の単一抗原を標的とするように設計されている。しかしながら、例えば、癌細胞は不安定であり、一部の細胞はもはや標的抗原を有していない場合がある。抗原消失エスケープ変異体（ａｎｔｉｇｅｎ ｌｏｓｓ ｅｓｃａｐｅ ｖａｒｉａｎｔ）と称されるこれらの細胞は、療法による破壊を回避し、成長し続け、野放しに蔓延し得る。ゆえに、当該技術分野において、癌および他の疾患における治療の失敗を防ぐか、または最小化する療法の必要性が存在する。
【発明の概要】
【0003】
一実施形態において、本発明は、（ａ）少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域、（ｂ）細胞外スペーサードメイン、（ｃ）膜貫通ドメイン、（ｄ）少なくとも１つの共刺激ドメイン、および（ｅ）細胞内シグナル伝達ドメインを含む、二重特異性キメラ抗原受容体を提供し、ここで、各抗原特異的標的指向領域は、抗原特異的単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントを含み、かつ異なる抗原に結合し、かつここで、その二重特異性キメラ抗原受容体は、治療用制御物質と共発現される。
【0004】
一実施形態において、本発明は、二重特異性キメラ抗原受容体および治療用制御物質の組み合わせをさらに提供し、ここで、その二重特異性キメラ抗原受容体は、（ａ）少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域、（ｂ）細胞外スペーサードメイン、（ｃ）膜貫通ドメイン、（ｄ）少なくとも１つの共刺激ドメイン、および（ｅ）細胞内シグナル伝達ドメインを含み、ここで、各抗原特異的標的指向領域は、抗原特異的単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントを含み、かつ異なる抗原に結合する。
【0005】
一実施形態において、本発明は、（ａ）少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域、（ｂ）細胞外スペーサードメイン、（ｃ）膜貫通ドメイン、（ｄ）少なくとも１つの共刺激ドメイン、および（ｅ）細胞内シグナル伝達ドメインを含む、二重特異性キメラ抗原受容体をさらに提供し、ここで、各抗原特異的標的指向領域は、抗原特異的単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントを含み、かつ異なる抗原に結合し、かつここで、その二重特異性キメラ抗原受容体は、トランケート型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）と共発現される。
【0006】
一実施形態において、本発明は、（ａ）少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域、（ｂ）ＣＤ８αヒンジ細胞外スペーサードメイン、（ｃ）ＣＤ８α膜貫通ドメイン、（ｄ）４－１ＢＢ共刺激ドメイン、および（ｖｉ）ＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む、二重特異性キメラ抗原受容体をさらに提供し、ここで、各抗原特異的標的指向領域は、抗原特異的単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントを含み、かつ異なる抗原に結合し、ここで、その二重特異性キメラ抗原受容体はＥＧＦＲｔと共発現され、かつここで、その二重特異性キメラ抗原受容体およびＥＧＦＲｔは、Ｔ２Ａリンカーを介して連結されている。
【0007】
一実施形態において、上述の二重特異性キメラ抗原受容体、二重特異性キメラ抗原受容体および治療用制御物質の組み合わせ、二重特異性キメラ抗原受容体をコードするポリペプチド、二重特異性キメラ抗原受容体を含むベクター、ウイルス、および遺伝子改変細胞、二重特異性キメラ抗原受容体および治療用制御物質の組み合わせを含むベクター、ウイルス、および遺伝子改変細胞、またはそれらの組み合わせと、薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物がまた提供される。
[本発明1001]
ａ．少なくとも2つの抗原特異的標的指向領域、
ｂ．細胞外スペーサードメイン、
ｃ．膜貫通ドメイン、
ｄ．少なくとも1つの共刺激ドメイン、および
ｅ．細胞内シグナル伝達ドメイン
を含み、治療用制御物質と共発現される、二重特異性キメラ抗原受容体であって、
各抗原特異的標的指向領域が、抗原特異的単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントを含み、かつ異なる抗原に結合する、
二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1002]
前記治療用制御物質が、トランケート型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、キサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ヒトカスパーゼ8、ヒトカスパーゼ9、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、リナマラーゼ／リナマリン／グルコースオキシダーゼ、デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／インドール－3－酢酸（ＩＡＡ）、γグルタミルシステインシンテターゼ、ＣＤ20／αＣＤ20、ＣＤ34／チミジンキナーゼキメラ、ｄｏｘ依存カスパーゼ－2、変異チミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫＳＲ39）、ＡＰ1903／Ｆａｓ系、キメラサイトカイン受容体（ＣＣＲ）、選択マーカー、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1001の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1003]
前記ＥＧＦＲｔが、ＥＧＦＲ特異的ｓｉＲＮＡ、小分子、抗ＥＧＦＲ抗体もしくはそのフラグメント、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数に結合する、本発明1002の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1004]
前記選択マーカーが、ジヒドロキシ葉酸受容体（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＤＨＦＲ）、変異ＤＨＦＲ、メチル化－ＤＮＡ－タンパク質－システインメチルトランスフェラーゼ、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼＩＩ（ＩＭＤＨＰ2）、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1002の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1005]
前記ＣＣＲが、（ｉ）ＩＬ－7サイトカイン－リンカー－ＩＬ7Ｒα、（ｉｉ）ＩＬ－7サイトカイン－リンカー－ＩＬ－7Ｒαの細胞外ドメイン－ＩＬ－7Ｒαの膜貫通ドメイン－ＩＬ－2Ｒβの細胞質ドメイン、（ｉｉｉ）ＩＬ－7サイトカイン－リンカー－ＩＬ2Ｒβ、および（ｉｖ）それらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1002の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1006]
前記二重特異性キメラ抗原受容体および前記治療用制御物質が、切断可能なリンカーを介して連結されている、本発明1001の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1007]
前記切断可能なリンカーが、自己切断型の切断可能なリンカーである、本発明1006の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1008]
前記切断可能なリンカーが、2Ａリンカー、2Ａ様リンカー、またはその機能的等価物のうちのいずれか1つまたは複数である、本発明1007の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1009]
前記細胞外スペーサードメインが、抗体のＦｃフラグメント、またはその機能的等価物、フラグメント、もしくは誘導体、抗体のヒンジ領域、またはその機能的等価物、フラグメント、もしくは誘導体、抗体のＣＨ2領域、抗体のＣＨ3領域、人工スペーサー配列、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1001の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1010]
前記細胞外スペーサードメインが、（ｉ）ＩｇＧ4のヒンジ、ＣＨ2、およびＣＨ3領域、（ｉｉ）ＩｇＧ4のヒンジ領域、（ｉｉｉ）ＩｇＧ4のヒンジおよびＣＨ2領域、（ｉｖ）ＣＤ8αのヒンジ領域、（ｖ）ＩｇＧ1のヒンジ、ＣＨ2、およびＣＨ3領域、（ｖｉ）ＩｇＧ1のヒンジ領域、（ｖｉ）ＩｇＧ1のヒンジおよびＣＨ2領域、または（ｖｉｉ）それらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1009の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1011]
前記膜貫通ドメインが、Ｉ型膜貫通タンパク質の膜貫通領域、人工疎水性配列、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1001の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1012]
前記膜貫通ドメインが、Ｔ細胞受容体複合体のζ鎖の膜貫通ドメイン、ＣＤ28、ＣＤ8α、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1011の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1013]
前記共刺激ドメインが、ＣＤ28、ＣＤ137（4－1ＢＢ）、ＣＤ134（ＯＸ40）、Ｄａｐ10、ＣＤ27、ＣＤ2、ＣＤ5、ＩＣＡＭ－1、ＬＦＡ－1、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ－Ｉ、ＴＮＦＲ－ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ30、ＣＤ40、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数に由来するシグナル伝達ドメインを含む、本発明1001の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1014]
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ヒトＣＤ3ζ鎖、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃεＲＩ、Ｆｃ受容体の細胞質側末端、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する細胞質受容体、およびそれらの組み合わせのうちの1つまたは複数のシグナル伝達ドメインを含む、本発明1001の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1015]
前記少なくとも2つの抗原特異的標的指向ドメインのそれぞれが、癌、炎症性疾患、神経障害、糖尿病、心血管系疾患、感染性疾患、自己免疫性疾患、およびそれらの組み合わせに対して特異的な抗原から成る群から独立して選択される抗原を標的とする、本発明1001の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1016]
癌に特異的な前記抗原が、4－1ＢＢ、5Ｔ4、腺癌抗原、α－フェトプロテイン、ＢＡＦＦ、Ｂ－リンパ腫細胞、Ｃ242抗原、ＣＡ－125、炭酸脱水酵素9（ＣＡ－ＩＸ）、Ｃ－ＭＥＴ、ＣＣＲ4、ＣＤ152、ＣＤ19、ＣＤ20、ＣＤ200、ＣＤ22、ＣＤ221、ＣＤ23（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ28、ＣＤ30（ＴＮＦＲＳＦ8）、ＣＤ33、ＣＤ4、ＣＤ40、ＣＤ44ｖ6、ＣＤ51、ＣＤ52、ＣＤ56、ＣＤ74、ＣＤ80、ＣＥＡ、ＣＮＴＯ888、ＣＴＬＡ－4、ＤＲ5、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ3、ＦＡＰ、フィブロネクチンのエクストラドメイン－Ｂ、葉酸受容体1、ＧＤ2、ＧＤ3ガングリオシド、糖タンパク質75、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ2／ｎｅｕ、ＨＧＦ、ヒト細胞分散因子（ｓｃａｔｔｅｒ ｆａｃｔｏｒ）受容体キナーゼ、ＩＧＦ－1受容体、ＩＧＦ－Ｉ、ＩｇＧ1、Ｌ1－ＣＡＭ、ＩＬ－13、ＩＬ－6、インスリン様成長因子Ｉ受容体、インテグリンα5β1、インテグリンαｖβ3、ＭＯＲＡｂ－009、ＭＳ4Ａ1、ＭＵＣ1、ムチンＣａｎＡｇ、Ｎ－グリコリルノイラミン酸、ＮＰＣ－1Ｃ、ＰＤＧＦ－Ｒα、ＰＤＬ192、ホスファチジルセリン、前立腺癌細胞、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＮ、ＲＯＲ1、ＳＣＨ 900105、ＳＤＣ1、ＳＬＡＭＦ7、ＴＡＧ－72、テネイシンＣ、ＴＧＦβ2、ＴＧＦ－β、ＴＲＡＩＬ－Ｒ1、ＴＲＡＩＬ－Ｒ2、腫瘍抗原ＣＴＡＡ16．88、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦＲ－1、ＶＥＧＦＲ2、ビメンチン、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1015の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1017]
前記少なくとも2つの抗原特異的標的指向領域が、（ｉ）ＣＤ19およびＣＤ20、（ｉｉ）ＣＤ20およびＬ1－ＣＡＭ、（ｉｉｉ）Ｌ1－ＣＡＭおよびＧＤ2、（ｉｖ）ＥＧＦＲおよびＬ1－ＣＡＭ、（ｖ）ＣＤ19およびＣＤ22、（ｖｉ）ＥＧＦＲおよびＣ－ＭＥＴ、（ｖｉｉ）ＥＧＦＲおよびＨＥＲ2、（ｖｉｉｉ）Ｃ－ＭＥＴおよびＨＥＲ2、または（ｉｘ）ＥＧＦＲおよびＲＯＲ1に結合する、本発明1001の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1018]
前記少なくとも2つの抗原特異的標的指向領域が、ＣＤ19およびＣＤ20に結合する、本発明1001の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1019]
炎症性疾患に特異的な前記抗原が、ＡＯＣ3（ＶＡＰ－1）、ＣＡＭ－3001、ＣＣＬ11（エオタキシン－1）、ＣＤ125、ＣＤ147（ベイシジン）、ＣＤ154（ＣＤ40Ｌ）、ＣＤ2、ＣＤ20、ＣＤ23（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ25（ＩＬ－2受容体のα鎖）、ＣＤ3、ＣＤ4、ＣＤ5、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ、ＩｇＥ、ＩｇＥ Ｆｃ領域、ＩＬ－1、ＩＬ－12、ＩＬ－23、ＩＬ－13、ＩＬ－17、ＩＬ－17Ａ、ＩＬ－22、ＩＬ－4、ＩＬ－5、ＩＬ－5、ＩＬ－6、ＩＬ－6受容体、インテグリンα4、インテグリンα4β7、リャマ（Ｌａｍａ ｇｌａｍａ）、ＬＦＡ－1（ＣＤ11ａ）、ＭＥＤＩ－528、ミオスタチン、ＯＸ－40、ｒｈｕＭＡｂβ7、スクレロスシン（ｓｃｌｅｒｏｓｃｉｎ）、ＳＯＳＴ、ＴＧＦβ1、ＴＮＦ－α、ＶＥＧＦ－Ａ、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1015の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1020]
神経障害に特異的な前記抗原が、βアミロイド、ＭＡＢＴ5102Ａ、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1015の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1021]
糖尿病に特異的な前記抗原が、Ｌ－1β、ＣＤ3、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1015の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1022]
心血管系疾患に特異的な前記抗原が、Ｃ5、心筋ミオシン、ＣＤ41（インテグリンα－ＩＩｂ）、フィブリンＩＩ、β鎖、ＩＴＧＢ2（ＣＤ18）、スフィンゴシン－1－ホスファート、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1015の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1023]
感染性疾患に特異的な前記抗原が、炭疽毒素、ＣＣＲ5、ＣＤ4、クランピング因子Ａ、サイトメガロウイルス、サイトメガロウイルス糖タンパク質Ｂ、内毒素、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ－1、Ｈｓｐ90、Ａ型インフルエンザ血球凝集素、リポテイコ酸、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、狂犬病ウイルス糖タンパク質、呼吸器合胞体ウイルス、ＴＮＦ－α、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1015の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1024]
本発明1001の二重特異性キメラ抗原受容体と、治療用制御物質との組み合わせ。
[本発明1025]
前記治療用制御物質が、トランケート型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、キサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ヒトカスパーゼ8、ヒトカスパーゼ9、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、リナマラーゼ／リナマリン／グルコースオキシダーゼ、デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／インドール－3－酢酸（ＩＡＡ）、γグルタミルシステインシンテターゼ、ＣＤ20／αＣＤ20、ＣＤ34／チミジンキナーゼキメラ、ｄｏｘ依存カスパーゼ－2、変異チミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫＳＲ39）、ＡＰ1903／Ｆａｓ系、キメラサイトカイン受容体（ＣＣＲ）、選択マーカー、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1024の組み合わせ。
[本発明1026]
前記ＥＧＦＲｔが、ＥＧＦＲ特異的ｓｉＲＮＡ、小分子、抗ＥＧＦＲ抗体もしくはそのフラグメント、またはそれらの組み合わせのうちのいずれかのうちの1つまたは複数に結合する、本発明1025の組み合わせ。
[本発明1027]
前記選択マーカーが、ジヒドロキシ葉酸受容体（ＤＨＦＲ）、変異ＤＨＦＲ、メチル化－ＤＮＡ－タンパク質－システインメチルトランスフェラーゼ、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼＩＩ（ＩＭＤＨＰ2）、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1025の組み合わせ。
[本発明1028]
前記ＣＣＲが、（ｉ）ＩＬ－7サイトカイン－リンカー－ＩＬ7Ｒα、（ｉｉ）ＩＬ－7サイトカイン－リンカー－ＩＬ－7Ｒαの細胞外ドメイン－ＩＬ－7Ｒαの膜貫通ドメイン－ＩＬ－2Ｒβの細胞質ドメイン、（ｉｉｉ）ＩＬ－7サイトカイン－リンカー－ＩＬ2Ｒβ、および（ｉｖ）それらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1025の組み合わせ。
[本発明1029]
前記二重特異性キメラ抗原受容体および前記治療用制御物質が、切断可能なリンカーを介して連結されている、本発明1024の組み合わせ。
[本発明1030]
前記切断可能なリンカーが、自己切断型の切断可能なリンカーである、本発明1029の組み合わせ。
[本発明1031]
前記切断可能なリンカーが、2Ａリンカー、2Ａ様リンカー、またはその機能的等価物のうちのいずれか1つまたは複数である、本発明1029の組み合わせ。
[本発明1032]
本発明1001の二重特異性キメラ抗原受容体または本発明1024の組み合わせをコードする、ポリヌクレオチド。
[本発明1033]
本発明1032のポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド。
[本発明1034]
本発明1032のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
[本発明1035]
本発明1032のポリヌクレオチドを含む、ウイルス。
[本発明1036]
ＲＮＡウイルスである、本発明1035のウイルス。
[本発明1037]
レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、またはヘルペスウイルスである、本発明1035のウイルス。
[本発明1038]
本発明1032のポリヌクレオチド、本発明1001のキメラ抗原受容体、または本発明1024の組み合わせを含む、遺伝子改変細胞。
[本発明1039]
Ｔ－リンパ球（Ｔ細胞）である、本発明1038の遺伝子改変細胞。
[本発明1040]
ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、またはそれらの組み合わせである、本発明1039の遺伝子改変細胞。
[本発明1041]
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、胚性幹細胞、または多能性幹細胞である、本発明1038の遺伝子改変細胞。
[本発明1042]
ａ．本発明1001の二重特異性キメラ抗原受容体、本発明1024の組み合わせ、本発明1032のポリペプチド、本発明1034のベクター、本発明1035のウイルス、本発明1038の遺伝子改変細胞、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数と、
ｂ．薬学的に許容される担体と
を含む、薬学的組成物。
[本発明1043]
本発明1042の薬学的組成物と、
治療用制御物質を発現する細胞の増殖を阻害するための、該治療用制御物質と生化学的に相互作用するように適合された組成物と
の組み合わせ。
[本発明1044]
前記治療用制御物質と生化学的に相互作用するように適合された前記組成物が、ハーセプチン、メトトレキサート、セツキシマブ、チミジン類似体（例えばガンシクロビル）、（Ｅ）－5－（2－ブロモビニル）－2'－デオキシウリジン（ＢＶＤＵ）、5－フルロシトシン（ｆｌｕｒｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）（5－ＦＣ）、5－（アザリジン（ａｚａｒｉｄｉｎ）－1－イル）－2，4－ジニトロベンズアミド（ＣＢ1954）、6－チオグアニン、合成二量体化薬（ｄｉｍｅｒｉｚｉｎｇ ｄｒｕｇ）（例えば、ＡＰ1903）、リン酸フルダラビン、リナマリン（ｌｉｎ）、ヌクレオシド類似体（例えば、ＢＶＤＵ、ジフルオロデオキシシチジン（ｄＦｄＣ）、1－β－Ｄ－アラビノフラノシルチミン（アラ－Ｔ））、インドール－3－酢酸（ＩＡＡ）、ｌ－ブチオニン－Ｓ，Ｒ－スルホキシイミン（ＢＳＯ）、リツキシマブ（ＲＴＸ）、ドキシサイクリン、チロシンキナーゼ阻害剤、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数である、本発明1043の組み合わせ。
[本発明1045]
以下の工程を含む、キメラ抗原受容体を発現する一定量のＴ細胞を生成する方法：
（ｉ）本発明1034のベクターを、1個または複数個のＴ細胞にトランスフェクトする工程、および
（ｉｉ）少なくとも2つの抗原特異的標的指向領域によって標的とされる抗原を発現する細胞、少なくとも2つの抗原特異的標的指向領域によって標的とされる組換え抗原を発現する細胞、またはキメラ抗原受容体に対する抗体を発現する細胞で、該1個または複数個のＴ細胞を刺激する工程であって、それによって該Ｔ細胞が、一定量のＴ細胞を生成するように増殖する、工程。
[本発明1046]
疾患の治療を必要とする対象における疾患を治療するための方法であって、
該方法が、
（ｉ）本発明1042の組成物を提供する工程、および
（ｉｉ）治療的有効量の該組成物を、該疾患を治療するように該対象に投与する工程
を含み、
少なくとも2つの抗原特異的標的指向領域がそれぞれ、抗原を標的とし、かつ少なくとも1つのそのような抗原が、該疾患と関連している、
該方法。
[本発明1047]
ａ．少なくとも2つの抗原特異的標的指向領域、
ｂ．細胞外スペーサードメイン、
ｃ．膜貫通ドメイン、
ｄ．少なくとも1つの共刺激ドメイン、および
ｅ．細胞内シグナル伝達ドメイン
を含み、トランケート型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）と共発現される、二重特異性キメラ抗原受容体であって、
各抗原特異的標的指向領域が、抗原特異的単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントを含み、かつ異なる抗原に結合する、
二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1048]
チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、キサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ヒトカスパーゼ8、ヒトカスパーゼ9、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、リナマラーゼ／リナマリン／グルコースオキシダーゼ、デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／インドール－3－酢酸（ＩＡＡ）、γグルタミルシステインシンテターゼ、ＣＤ20／αＣＤ20、ＣＤ34／チミジンキナーゼキメラ、ｄｏｘ依存カスパーゼ－2、変異チミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫＳＲ39）、ＡＰ1903／Ｆａｓ系、キメラサイトカイン受容体（ＣＣＲ）、選択マーカー、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む治療用制御物質と共発現される、本発明1047の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1049]
前記ＥＧＦＲｔが、ＥＧＦＲ特異的ｓｉＲＮＡ、小分子、抗ＥＧＦＲ抗体もしくはそのフラグメント、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数に結合する、本発明1047の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1050]
前記選択マーカーが、ジヒドロキシ葉酸受容体（ＤＨＦＲ）、変異ＤＨＦＲ、メチル化－ＤＮＡ－タンパク質－システインメチルトランスフェラーゼ、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼＩＩ（ＩＭＤＨＰ2）、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1048の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1051]
前記ＣＣＲが、（ｉ）ＩＬ－7サイトカイン－リンカー－ＩＬ7Ｒα、（ｉｉ）ＩＬ－7サイトカイン－リンカー－ＩＬ－7Ｒαの細胞外ドメイン－ＩＬ－7Ｒαの膜貫通ドメイン－ＩＬ－2Ｒβの細胞質ドメイン、（ｉｉｉ）ＩＬ－7サイトカイン－リンカー－ＩＬ2Ｒβ、および（ｉｖ）それらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1048の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1052]
前記二重特異性キメラ抗原受容体および前記治療用制御物質が、切断可能なリンカーを介して連結されている、本発明1047の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1053]
前記切断可能なリンカーが、自己切断型の切断可能なリンカーである、本発明1052の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1054]
前記切断可能なリンカーが、2Ａリンカー、2Ａ様リンカー、またはその機能的等価物のうちのいずれか1つまたは複数である、本発明1052の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1055]
前記細胞外スペーサードメインが、抗体のＦｃフラグメント、またはその機能的等価物、フラグメント、もしくは誘導体、抗体のヒンジ領域、またはその機能的等価物、フラグメント、もしくは誘導体、抗体のＣＨ2領域、抗体のＣＨ3領域、人工スペーサー配列、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1047の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1056]
前記細胞外スペーサードメインが、（ｉ）ＩｇＧ4のヒンジ、ＣＨ2、およびＣＨ3領域、（ｉｉ）ＩｇＧ4のヒンジ領域、（ｉｉｉ）ＩｇＧ4のヒンジおよびＣＨ2領域、（ｉｖ）ＣＤ8αのヒンジ領域、（ｖ）ＩｇＧ1のヒンジ、ＣＨ2、およびＣＨ3領域、（ｖｉ）ＩｇＧ1のヒンジ領域、（ｖｉ）ＩｇＧ1のヒンジおよびＣＨ2領域、ならびに（ｖｉｉ）それらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1055の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1057]
前記膜貫通ドメインが、Ｉ型膜貫通タンパク質の膜貫通領域、人工疎水性配列、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1047の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1058]
前記膜貫通ドメインが、Ｔ細胞受容体複合体のζ鎖の膜貫通ドメイン、ＣＤ28、ＣＤ8α、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1057の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1059]
前記共刺激ドメインが、ＣＤ28、ＣＤ137（4－1ＢＢ）、ＣＤ134（ＯＸ40）、Ｄａｐ10、ＣＤ27、ＣＤ2、ＣＤ5、ＩＣＡＭ－1、ＬＦＡ－1、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ－Ｉ、ＴＮＦＲ－ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ30、ＣＤ40、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数に由来するシグナル伝達ドメインを含む、本発明1047の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1060]
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ヒトＣＤ3ζ鎖、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃεＲＩ、Ｆｃ受容体の細胞質側末端、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する細胞質受容体、およびそれらの組み合わせのうちの1つまたは複数のシグナル伝達ドメインを含む、本発明1047の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1061]
前記少なくとも2つの抗原特異的標的指向ドメインのそれぞれが、癌、炎症性疾患、神経障害、糖尿病、心血管系疾患、感染性疾患、自己免疫性疾患、およびそれらの組み合わせに対して特異的な抗原から成る群から独立して選択される抗原を標的とする、本発明1047の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1062]
癌に特異的な前記抗原が、4－1ＢＢ、5Ｔ4、腺癌抗原、α－フェトプロテイン、ＢＡＦＦ、Ｂ－リンパ腫細胞、Ｃ242抗原、ＣＡ－125、炭酸脱水酵素9（ＣＡ－ＩＸ）、Ｃ－ＭＥＴ、ＣＣＲ4、ＣＤ152、ＣＤ19、ＣＤ20、ＣＤ200、ＣＤ22、ＣＤ221、ＣＤ23（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ28、ＣＤ30（ＴＮＦＲＳＦ8）、ＣＤ33、ＣＤ4、ＣＤ40、ＣＤ44ｖ6、ＣＤ51、ＣＤ52、ＣＤ56、ＣＤ74、ＣＤ80、ＣＥＡ、ＣＮＴＯ888、ＣＴＬＡ－4、ＤＲ5、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ3、ＦＡＰ、フィブロネクチンのエクストラドメイン－Ｂ、葉酸受容体1、ＧＤ2、ＧＤ3ガングリオシド、糖タンパク質75、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ2／ｎｅｕ、ＨＧＦ、ヒト細胞分散因子受容体キナーゼ、ＩＧＦ－1受容体、ＩＧＦ－Ｉ、ＩｇＧ1、Ｌ1－ＣＡＭ、ＩＬ－13、ＩＬ－6、インスリン様成長因子Ｉ受容体、インテグリンα5β1、インテグリンαｖβ3、ＭＯＲＡｂ－009、ＭＳ4Ａ1、ＭＵＣ1、ムチンＣａｎＡｇ、Ｎ－グリコリルノイラミン酸、ＮＰＣ－1Ｃ、ＰＤＧＦ－Ｒα、ＰＤＬ192、ホスファチジルセリン、前立腺癌細胞、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＮ、ＲＯＲ1、ＳＣＨ 900105、ＳＤＣ1、ＳＬＡＭＦ7、ＴＡＧ－72、テネイシンＣ、ＴＧＦβ2、ＴＧＦ－β、ＴＲＡＩＬ－Ｒ1、ＴＲＡＩＬ－Ｒ2、腫瘍抗原ＣＴＡＡ16．88、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦＲ－1、ＶＥＧＦＲ2、ビメンチン、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1061の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1063]
前記少なくとも2つの抗原特異的標的指向領域が、（ｉ）ＣＤ19およびＣＤ20、（ｉｉ）ＣＤ20およびＬ1－ＣＡＭ、（ｉｉｉ）Ｌ1－ＣＡＭおよびＧＤ2、（ｉｖ）ＥＧＦＲおよびＬ1－ＣＡＭ、（ｖ）ＣＤ19およびＣＤ22、（ｖｉ）ＥＧＦＲおよびＣ－ＭＥＴ、（ｖｉｉ）ＥＧＦＲおよびＨＥＲ2、（ｖｉｉｉ）Ｃ－ＭＥＴおよびＨＥＲ2、または（ｉｘ）ＥＧＦＲおよびＲＯＲ1に結合する、本発明1047の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1064]
前記少なくとも2つの抗原特異的標的指向領域が、ＣＤ19およびＣＤ20に結合する、本発明1047の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1065]
炎症性疾患に特異的な前記抗原が、ＡＯＣ3（ＶＡＰ－1）、ＣＡＭ－3001、ＣＣＬ11（エオタキシン－1）、ＣＤ125、ＣＤ147（ベイシジン）、ＣＤ154（ＣＤ40Ｌ）、ＣＤ2、ＣＤ20、ＣＤ23（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ25（ＩＬ－2受容体のα鎖）、ＣＤ3、ＣＤ4、ＣＤ5、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ、ＩｇＥ、ＩｇＥ Ｆｃ領域、ＩＬ－1、ＩＬ－12、ＩＬ－23、ＩＬ－13、ＩＬ－17、ＩＬ－17Ａ、ＩＬ－22、ＩＬ－4、ＩＬ－5、ＩＬ－5、ＩＬ－6、ＩＬ－6受容体、インテグリンα4、インテグリンα4β7、リャマ、ＬＦＡ－1（ＣＤ11ａ）、ＭＥＤＩ－528、ミオスタチン、ＯＸ－40、ｒｈｕＭＡｂβ7、スクレロスシン、ＳＯＳＴ、ＴＧＦβ1、ＴＮＦ－α、ＶＥＧＦ－Ａ、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1061の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1066]
神経障害に特異的な前記抗原が、βアミロイド、ＭＡＢＴ5102Ａ、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1061の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1067]
糖尿病に特異的な前記抗原が、Ｌ－1β、ＣＤ3、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1061の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1068]
心血管系疾患に特異的な前記抗原が、Ｃ5、心筋ミオシン、ＣＤ41（インテグリンα－ＩＩｂ）、フィブリンＩＩ、β鎖、ＩＴＧＢ2（ＣＤ18）、スフィンゴシン－1－ホスファート、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1061の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1069]
感染性疾患に特異的な前記抗原が、炭疽毒素、ＣＣＲ5、ＣＤ4、クランピング因子Ａ、サイトメガロウイルス、サイトメガロウイルス糖タンパク質Ｂ、内毒素、大腸菌、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ－1、Ｈｓｐ90、Ａ型インフルエンザ血球凝集素、リポテイコ酸、緑膿菌、狂犬病ウイルス糖タンパク質、呼吸器合胞体ウイルス、ＴＮＦ－α、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1061の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1070]
本発明1047の二重特異性キメラ抗原受容体と、ＥＧＦＲｔとの組み合わせ。
[本発明1071]
前記ＥＧＦＲｔが、ＥＧＦＲ特異的ｓｉＲＮＡ、小分子、抗ＥＧＦＲ抗体もしくはそのフラグメント、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数に結合する、本発明1070の組み合わせ。
[本発明1072]
前記二重特異性キメラ抗原受容体および前記ＥＧＦＲｔが、切断可能なリンカーを介して連結されている、本発明1070の組み合わせ。
[本発明1073]
前記切断可能なリンカーが、自己切断型の切断可能なリンカーである、本発明1072の組み合わせ。
[本発明1074]
前記切断可能なリンカーが、2Ａリンカー、2Ａ様リンカー、またはその機能的等価物のうちのいずれか1つまたは複数である、本発明1072の組み合わせ。
[本発明1075]
本発明1047の二重特異性キメラ抗原受容体または本発明1070の組み合わせをコードする、ポリヌクレオチド。
[本発明1076]
本発明1075のポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド。
[本発明1077]
本発明1075のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
[本発明1078]
本発明1075のポリヌクレオチドを含む、ウイルス。
[本発明1079]
ＲＮＡウイルスである、本発明1078のウイルス。
[本発明1080]
レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、またはヘルペスウイルスである、本発明1078のウイルス。
[本発明1081]
本発明1075のポリヌクレオチド、本発明1047のキメラ抗原受容体、または本発明1070の組み合わせを含む、遺伝子改変細胞。
[本発明1082]
Ｔ－リンパ球（Ｔ細胞）である、本発明1081の遺伝子改変細胞。
[本発明1083]
ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、またはそれらの組み合わせである、本発明1082の遺伝子改変細胞。
[本発明1084]
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、胚性幹細胞、または多能性幹細胞である、本発明1081の遺伝子改変細胞。
[本発明1085]
ａ．本発明1047の二重特異性キメラ抗原受容体、本発明1070の組み合わせ、本発明1076のポリペプチド、本発明1077のベクター、本発明1078のウイルス、本発明1081の遺伝子改変細胞、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数と、
ｂ．薬学的に許容される担体と
を含む、薬学的組成物。
[本発明1086]
本発明1085の薬学的組成物と、
ＥＧＦＲｔを発現する細胞の増殖を阻害するための、治療用制御物質と生化学的に相互作用するように適合された組成物と
の組み合わせ。
[本発明1087]
前記治療用制御物質と生化学的に相互作用するように適合された前記組成物が、ハーセプチン、メトトレキサート、セツキシマブ、チミジン類似体（例えばガンシクロビル）、（Ｅ）－5－（2－ブロモビニル）－2'－デオキシウリジン（ＢＶＤＵ）、5－フルロシトシン（5－ＦＣ）、5－（アザリジン－1－イル）－2，4－ジニトロベンズアミド（ＣＢ1954）、6－チオグアニン、合成二量体化薬（例えば、ＡＰ1903）、リン酸フルダラビン、リナマリン（ｌｉｎ）、ヌクレオシド類似体（例えば、ＢＶＤＵ、ジフルオロデオキシシチジン（ｄＦｄＣ）、1－β－Ｄ－アラビノフラノシルチミン（アラ－Ｔ））、インドール－3－酢酸（ＩＡＡ）、ｌ－ブチオニン－Ｓ，Ｒ－スルホキシイミン（ＢＳＯ）、リツキシマブ（ＲＴＸ）、ドキシサイクリン、チロシンキナーゼ阻害剤、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数である、本発明1086の組み合わせ。
[本発明1088]
以下の工程を含む、キメラ抗原受容体を発現する一定量のＴ細胞を生成する方法：
（ｉ）本発明1077のベクターを、1個または複数個のＴ細胞にトランスフェクトする工程、および
（ｉｉ）少なくとも2つの抗原特異的標的指向領域によって標的とされる抗原を発現する細胞、少なくとも2つの抗原特異的標的指向領域によって標的とされる組換え抗原を発現する細胞、またはキメラ抗原受容体に対する抗体を発現する細胞で、該1個または複数個のＴ細胞を刺激する工程であって、それによって該Ｔ細胞が、一定量のＴ細胞を生成するように増殖する、工程。
[本発明1089]
疾患の治療を必要とする対象における疾患を治療するための方法であって、
該方法が、
（ｉ）本発明1085の組成物を提供する工程、および
（ｉｉ）治療的有効量の該組成物を、該疾患を治療するように該対象に投与する工程
を含み、
少なくとも2つの抗原特異的標的指向領域がそれぞれ、抗原を標的とし、かつ少なくとも1つのそのような抗原が、該疾患と関連している、
該方法。
[本発明1090]
図4、9、または11に記載される配列を含む、二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1091]
ａ．少なくとも2つの抗原特異的標的指向領域、
ｂ．ＣＤ8αヒンジ細胞外スペーサードメイン、
ｃ．ＣＤ8α膜貫通ドメイン、
ｄ．4－1ＢＢ共刺激ドメイン、および
ｅ．ＣＤ3ζ細胞内シグナル伝達ドメイン
を含み、トランケート型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）と共発現される、二重特異性キメラ抗原受容体であって、
各抗原特異的標的指向領域が、抗原特異的単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントを含み、かつ異なる抗原に結合し、
二重特異性キメラ抗原受容体およびＥＧＦＲｔが、Ｔ2Ａリンカーを介して連結されている、
二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1092]
チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、キサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ヒトカスパーゼ8、ヒトカスパーゼ9、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、リナマラーゼ／リナマリン／グルコースオキシダーゼ、デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／インドール－3－酢酸（ＩＡＡ）、γグルタミルシステインシンテターゼ、ＣＤ20／αＣＤ20、ＣＤ34／チミジンキナーゼキメラ、ｄｏｘ依存カスパーゼ－2、変異チミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫＳＲ39）、ＡＰ1903／Ｆａｓ系、キメラサイトカイン受容体（ＣＣＲ）、選択マーカー、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む治療用制御物質と共発現される、本発明1091の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1093]
前記ＥＧＦＲｔが、ＥＧＦＲ特異的ｓｉＲＮＡ、小分子、抗ＥＧＦＲ抗体もしくはそのフラグメント、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数に結合する、本発明1091の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1094]
前記選択マーカーが、ジヒドロキシ葉酸受容体（ＤＨＦＲ）、変異ＤＨＦＲ、メチル化－ＤＮＡ－タンパク質－システインメチルトランスフェラーゼ、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼＩＩ（ＩＭＤＨＰ2）、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1092の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1095]
前記ＣＣＲが、（ｉ）ＩＬ－7サイトカイン－リンカー－ＩＬ7Ｒα、（ｉｉ）ＩＬ－7サイトカイン－リンカー－ＩＬ－7Ｒαの細胞外ドメイン－ＩＬ－7Ｒαの膜貫通ドメイン－ＩＬ－2Ｒβの細胞質ドメイン、（ｉｉｉ）ＩＬ－7サイトカイン－リンカー－ＩＬ2Ｒβ、および（ｉｖ）それらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1092の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1096]
前記少なくとも2つの抗原特異的標的指向ドメインのそれぞれが、癌、炎症性疾患、神経障害、糖尿病、心血管系疾患、感染性疾患、自己免疫性疾患、およびそれらの組み合わせに対して特異的な抗原から成る群から独立して選択される抗原を標的とする、本発明1091の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1097]
癌に特異的な前記抗原が、4－1ＢＢ、5Ｔ4、腺癌抗原、α－フェトプロテイン、ＢＡＦＦ、Ｂ－リンパ腫細胞、Ｃ242抗原、ＣＡ－125、炭酸脱水酵素9（ＣＡ－ＩＸ）、Ｃ－ＭＥＴ、ＣＣＲ4、ＣＤ152、ＣＤ19、ＣＤ20、ＣＤ200、ＣＤ22、ＣＤ221、ＣＤ23（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ28、ＣＤ30（ＴＮＦＲＳＦ8）、ＣＤ33、ＣＤ4、ＣＤ40、ＣＤ44ｖ6、ＣＤ51、ＣＤ52、ＣＤ56、ＣＤ74、ＣＤ80、ＣＥＡ、ＣＮＴＯ888、ＣＴＬＡ－4、ＤＲ5、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ3、ＦＡＰ、フィブロネクチンのエクストラドメイン－Ｂ、葉酸受容体1、ＧＤ2、ＧＤ3ガングリオシド、糖タンパク質75、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ2／ｎｅｕ、ＨＧＦ、ヒト細胞分散因子受容体キナーゼ、ＩＧＦ－1受容体、ＩＧＦ－Ｉ、ＩｇＧ1、Ｌ1－ＣＡＭ、ＩＬ－13、ＩＬ－6、インスリン様成長因子Ｉ受容体、インテグリンα5β1、インテグリンαｖβ3、ＭＯＲＡｂ－009、ＭＳ4Ａ1、ＭＵＣ1、ムチンＣａｎＡｇ、Ｎ－グリコリルノイラミン酸、ＮＰＣ－1Ｃ、ＰＤＧＦ－Ｒα、ＰＤＬ192、ホスファチジルセリン、前立腺癌細胞、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＮ、ＲＯＲ1、ＳＣＨ 900105、ＳＤＣ1、ＳＬＡＭＦ7、ＴＡＧ－72、テネイシンＣ、ＴＧＦβ2、ＴＧＦ－β、ＴＲＡＩＬ－Ｒ1、ＴＲＡＩＬ－Ｒ2、腫瘍抗原ＣＴＡＡ16．88、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦＲ－1、ＶＥＧＦＲ2、ビメンチン、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1096の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1098]
前記少なくとも2つの抗原特異的標的指向領域が、（ｉ）ＣＤ19およびＣＤ20、（ｉｉ）ＣＤ20およびＬ1－ＣＡＭ、（ｉｉｉ）Ｌ1－ＣＡＭおよびＧＤ2、（ｉｖ）ＥＧＦＲおよびＬ1－ＣＡＭ、（ｖ）ＣＤ19およびＣＤ22、（ｖｉ）ＥＧＦＲおよびＣ－ＭＥＴ、（ｖｉｉ）ＥＧＦＲおよびＨＥＲ2、（ｖｉｉｉ）Ｃ－ＭＥＴおよびＨＥＲ2、または（ｉｘ）ＥＧＦＲおよびＲＯＲ1に結合する、本発明1096の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1099]
前記少なくとも2つの抗原特異的標的指向領域が、ＣＤ19およびＣＤ20に結合する、本発明1096の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1100]
炎症性疾患に特異的な前記抗原が、ＡＯＣ3（ＶＡＰ－1）、ＣＡＭ－3001、ＣＣＬ11（エオタキシン－1）、ＣＤ125、ＣＤ147（ベイシジン）、ＣＤ154（ＣＤ40Ｌ）、ＣＤ2、ＣＤ20、ＣＤ23（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ25（ＩＬ－2受容体のα鎖）、ＣＤ3、ＣＤ4、ＣＤ5、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ、ＩｇＥ、ＩｇＥ Ｆｃ領域、ＩＬ－1、ＩＬ－12、ＩＬ－23、ＩＬ－13、ＩＬ－17、ＩＬ－17Ａ、ＩＬ－22、ＩＬ－4、ＩＬ－5、ＩＬ－5、ＩＬ－6、ＩＬ－6受容体、インテグリンα4、インテグリンα4β7、リャマ、ＬＦＡ－1（ＣＤ11ａ）、ＭＥＤＩ－528、ミオスタチン、ＯＸ－40、ｒｈｕＭＡｂβ7、スクレロスシン、ＳＯＳＴ、ＴＧＦβ1、ＴＮＦ－α、ＶＥＧＦ－Ａ、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1096の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1101]
神経障害に特異的な前記抗原が、βアミロイド、ＭＡＢＴ5102Ａ、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1096の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1102]
糖尿病に特異的な前記抗原が、Ｌ－1β、ＣＤ3、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1096の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1103]
心血管系疾患に特異的な前記抗原が、Ｃ5、心筋ミオシン、ＣＤ41（インテグリンα－ＩＩｂ）、フィブリンＩＩ、β鎖、ＩＴＧＢ2（ＣＤ18）、スフィンゴシン－1－ホスファート、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1096の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1104]
感染性疾患に特異的な前記抗原が、炭疽毒素、ＣＣＲ5、ＣＤ4、クランピング因子Ａ、サイトメガロウイルス、サイトメガロウイルス糖タンパク質Ｂ、内毒素、大腸菌、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ－1、Ｈｓｐ90、Ａ型インフルエンザ血球凝集素、リポテイコ酸、緑膿菌、狂犬病ウイルス糖タンパク質、呼吸器合胞体ウイルス、ＴＮＦ－α、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1096の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1001]
ａ．少なくとも2つの抗原特異的標的指向領域、
ｂ．細胞外スペーサードメイン、
ｃ．膜貫通ドメイン、
ｄ．少なくとも1つの共刺激ドメイン、および
ｅ．細胞内シグナル伝達ドメイン
を含み、治療用制御物質と共発現される、二重特異性キメラ抗原受容体であって、
各抗原特異的標的指向領域が、抗原特異的単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントを含み、かつ異なる抗原に結合する、
二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1002]
前記治療用制御物質が、トランケート型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、キサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ヒトカスパーゼ8、ヒトカスパーゼ9、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、リナマラーゼ／リナマリン／グルコースオキシダーゼ、デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／インドール－3－酢酸（ＩＡＡ）、γグルタミルシステインシンテターゼ、ＣＤ20／αＣＤ20、ＣＤ34／チミジンキナーゼキメラ、ｄｏｘ依存カスパーゼ－2、変異チミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫＳＲ39）、ＡＰ1903／Ｆａｓ系、キメラサイトカイン受容体（ＣＣＲ）、選択マーカー、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1001の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1003]
前記ＥＧＦＲｔが、ＥＧＦＲ特異的ｓｉＲＮＡ、小分子、抗ＥＧＦＲ抗体もしくはそのフラグメント、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数に結合する、本発明1002の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1004]
前記選択マーカーが、ジヒドロキシ葉酸受容体（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＤＨＦＲ）、変異ＤＨＦＲ、メチル化－ＤＮＡ－タンパク質－システインメチルトランスフェラーゼ、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼＩＩ（ＩＭＤＨＰ2）、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1002の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1005]
前記ＣＣＲが、（ｉ）ＩＬ－7サイトカイン－リンカー－ＩＬ7Ｒα、（ｉｉ）ＩＬ－7サイトカイン－リンカー－ＩＬ－7Ｒαの細胞外ドメイン－ＩＬ－7Ｒαの膜貫通ドメイン－ＩＬ－2Ｒβの細胞質ドメイン、（ｉｉｉ）ＩＬ－7サイトカイン－リンカー－ＩＬ2Ｒβ、および（ｉｖ）それらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1002の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1006]
前記二重特異性キメラ抗原受容体および前記治療用制御物質が、切断可能なリンカーを介して連結されている、本発明1001の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1007]
前記切断可能なリンカーが、自己切断型の切断可能なリンカーである、本発明1006の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1008]
前記切断可能なリンカーが、2Ａリンカー、2Ａ様リンカー、またはその機能的等価物のうちのいずれか1つまたは複数である、本発明1007の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1009]
前記細胞外スペーサードメインが、抗体のＦｃフラグメント、またはその機能的等価物、フラグメント、もしくは誘導体、抗体のヒンジ領域、またはその機能的等価物、フラグメント、もしくは誘導体、抗体のＣＨ2領域、抗体のＣＨ3領域、人工スペーサー配列、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1001の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1010]
前記細胞外スペーサードメインが、（ｉ）ＩｇＧ4のヒンジ、ＣＨ2、およびＣＨ3領域、（ｉｉ）ＩｇＧ4のヒンジ領域、（ｉｉｉ）ＩｇＧ4のヒンジおよびＣＨ2領域、（ｉｖ）ＣＤ8αのヒンジ領域、（ｖ）ＩｇＧ1のヒンジ、ＣＨ2、およびＣＨ3領域、（ｖｉ）ＩｇＧ1のヒンジ領域、（ｖｉ）ＩｇＧ1のヒンジおよびＣＨ2領域、または（ｖｉｉ）それらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1009の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1011]
前記膜貫通ドメインが、Ｉ型膜貫通タンパク質の膜貫通領域、人工疎水性配列、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1001の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1012]
前記膜貫通ドメインが、Ｔ細胞受容体複合体のζ鎖の膜貫通ドメイン、ＣＤ28、ＣＤ8α、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1011の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1013]
前記共刺激ドメインが、ＣＤ28、ＣＤ137（4－1ＢＢ）、ＣＤ134（ＯＸ40）、Ｄａｐ10、ＣＤ27、ＣＤ2、ＣＤ5、ＩＣＡＭ－1、ＬＦＡ－1、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ－Ｉ、ＴＮＦＲ－ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ30、ＣＤ40、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数に由来するシグナル伝達ドメインを含む、本発明1001の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1014]
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ヒトＣＤ3ζ鎖、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃεＲＩ、Ｆｃ受容体の細胞質側末端、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する細胞質受容体、およびそれらの組み合わせのうちの1つまたは複数のシグナル伝達ドメインを含む、本発明1001の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1015]
前記少なくとも2つの抗原特異的標的指向ドメインのそれぞれが、癌、炎症性疾患、神経障害、糖尿病、心血管系疾患、感染性疾患、自己免疫性疾患、およびそれらの組み合わせに対して特異的な抗原から成る群から独立して選択される抗原を標的とする、本発明1001の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1016]
癌に特異的な前記抗原が、4－1ＢＢ、5Ｔ4、腺癌抗原、α－フェトプロテイン、ＢＡＦＦ、Ｂ－リンパ腫細胞、Ｃ242抗原、ＣＡ－125、炭酸脱水酵素9（ＣＡ－ＩＸ）、Ｃ－ＭＥＴ、ＣＣＲ4、ＣＤ152、ＣＤ19、ＣＤ20、ＣＤ200、ＣＤ22、ＣＤ221、ＣＤ23（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ28、ＣＤ30（ＴＮＦＲＳＦ8）、ＣＤ33、ＣＤ4、ＣＤ40、ＣＤ44ｖ6、ＣＤ51、ＣＤ52、ＣＤ56、ＣＤ74、ＣＤ80、ＣＥＡ、ＣＮＴＯ888、ＣＴＬＡ－4、ＤＲ5、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ3、ＦＡＰ、フィブロネクチンのエクストラドメイン－Ｂ、葉酸受容体1、ＧＤ2、ＧＤ3ガングリオシド、糖タンパク質75、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ2／ｎｅｕ、ＨＧＦ、ヒト細胞分散因子（ｓｃａｔｔｅｒ ｆａｃｔｏｒ）受容体キナーゼ、ＩＧＦ－1受容体、ＩＧＦ－Ｉ、ＩｇＧ1、Ｌ1－ＣＡＭ、ＩＬ－13、ＩＬ－6、インスリン様成長因子Ｉ受容体、インテグリンα5β1、インテグリンαｖβ3、ＭＯＲＡｂ－009、ＭＳ4Ａ1、ＭＵＣ1、ムチンＣａｎＡｇ、Ｎ－グリコリルノイラミン酸、ＮＰＣ－1Ｃ、ＰＤＧＦ－Ｒα、ＰＤＬ192、ホスファチジルセリン、前立腺癌細胞、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＮ、ＲＯＲ1、ＳＣＨ 900105、ＳＤＣ1、ＳＬＡＭＦ7、ＴＡＧ－72、テネイシンＣ、ＴＧＦβ2、ＴＧＦ－β、ＴＲＡＩＬ－Ｒ1、ＴＲＡＩＬ－Ｒ2、腫瘍抗原ＣＴＡＡ16．88、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦＲ－1、ＶＥＧＦＲ2、ビメンチン、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1015の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1017]
前記少なくとも2つの抗原特異的標的指向領域が、（ｉ）ＣＤ19およびＣＤ20、（ｉｉ）ＣＤ20およびＬ1－ＣＡＭ、（ｉｉｉ）Ｌ1－ＣＡＭおよびＧＤ2、（ｉｖ）ＥＧＦＲおよびＬ1－ＣＡＭ、（ｖ）ＣＤ19およびＣＤ22、（ｖｉ）ＥＧＦＲおよびＣ－ＭＥＴ、（ｖｉｉ）ＥＧＦＲおよびＨＥＲ2、（ｖｉｉｉ）Ｃ－ＭＥＴおよびＨＥＲ2、または（ｉｘ）ＥＧＦＲおよびＲＯＲ1に結合する、本発明1001の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1018]
前記少なくとも2つの抗原特異的標的指向領域が、ＣＤ19およびＣＤ20に結合する、本発明1001の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1019]
炎症性疾患に特異的な前記抗原が、ＡＯＣ3（ＶＡＰ－1）、ＣＡＭ－3001、ＣＣＬ11（エオタキシン－1）、ＣＤ125、ＣＤ147（ベイシジン）、ＣＤ154（ＣＤ40Ｌ）、ＣＤ2、ＣＤ20、ＣＤ23（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ25（ＩＬ－2受容体のα鎖）、ＣＤ3、ＣＤ4、ＣＤ5、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ、ＩｇＥ、ＩｇＥ Ｆｃ領域、ＩＬ－1、ＩＬ－12、ＩＬ－23、ＩＬ－13、ＩＬ－17、ＩＬ－17Ａ、ＩＬ－22、ＩＬ－4、ＩＬ－5、ＩＬ－5、ＩＬ－6、ＩＬ－6受容体、インテグリンα4、インテグリンα4β7、リャマ（Ｌａｍａ ｇｌａｍａ）、ＬＦＡ－1（ＣＤ11ａ）、ＭＥＤＩ－528、ミオスタチン、ＯＸ－40、ｒｈｕＭＡｂβ7、スクレロスシン（ｓｃｌｅｒｏｓｃｉｎ）、ＳＯＳＴ、ＴＧＦβ1、ＴＮＦ－α、ＶＥＧＦ－Ａ、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1015の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1020]
神経障害に特異的な前記抗原が、βアミロイド、ＭＡＢＴ5102Ａ、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1015の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1021]
糖尿病に特異的な前記抗原が、Ｌ－1β、ＣＤ3、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1015の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1022]
心血管系疾患に特異的な前記抗原が、Ｃ5、心筋ミオシン、ＣＤ41（インテグリンα－ＩＩｂ）、フィブリンＩＩ、β鎖、ＩＴＧＢ2（ＣＤ18）、スフィンゴシン－1－ホスファート、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1015の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1023]
感染性疾患に特異的な前記抗原が、炭疽毒素、ＣＣＲ5、ＣＤ4、クランピング因子Ａ、サイトメガロウイルス、サイトメガロウイルス糖タンパク質Ｂ、内毒素、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ－1、Ｈｓｐ90、Ａ型インフルエンザ血球凝集素、リポテイコ酸、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、狂犬病ウイルス糖タンパク質、呼吸器合胞体ウイルス、ＴＮＦ－α、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1015の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1024]
本発明1001の二重特異性キメラ抗原受容体と、治療用制御物質との組み合わせ。
[本発明1025]
前記治療用制御物質が、トランケート型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、キサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ヒトカスパーゼ8、ヒトカスパーゼ9、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、リナマラーゼ／リナマリン／グルコースオキシダーゼ、デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／インドール－3－酢酸（ＩＡＡ）、γグルタミルシステインシンテターゼ、ＣＤ20／αＣＤ20、ＣＤ34／チミジンキナーゼキメラ、ｄｏｘ依存カスパーゼ－2、変異チミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫＳＲ39）、ＡＰ1903／Ｆａｓ系、キメラサイトカイン受容体（ＣＣＲ）、選択マーカー、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1024の組み合わせ。
[本発明1026]
前記ＥＧＦＲｔが、ＥＧＦＲ特異的ｓｉＲＮＡ、小分子、抗ＥＧＦＲ抗体もしくはそのフラグメント、またはそれらの組み合わせのうちのいずれかのうちの1つまたは複数に結合する、本発明1025の組み合わせ。
[本発明1027]
前記選択マーカーが、ジヒドロキシ葉酸受容体（ＤＨＦＲ）、変異ＤＨＦＲ、メチル化－ＤＮＡ－タンパク質－システインメチルトランスフェラーゼ、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼＩＩ（ＩＭＤＨＰ2）、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1025の組み合わせ。
[本発明1028]
前記ＣＣＲが、（ｉ）ＩＬ－7サイトカイン－リンカー－ＩＬ7Ｒα、（ｉｉ）ＩＬ－7サイトカイン－リンカー－ＩＬ－7Ｒαの細胞外ドメイン－ＩＬ－7Ｒαの膜貫通ドメイン－ＩＬ－2Ｒβの細胞質ドメイン、（ｉｉｉ）ＩＬ－7サイトカイン－リンカー－ＩＬ2Ｒβ、および（ｉｖ）それらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1025の組み合わせ。
[本発明1029]
前記二重特異性キメラ抗原受容体および前記治療用制御物質が、切断可能なリンカーを介して連結されている、本発明1024の組み合わせ。
[本発明1030]
前記切断可能なリンカーが、自己切断型の切断可能なリンカーである、本発明1029の組み合わせ。
[本発明1031]
前記切断可能なリンカーが、2Ａリンカー、2Ａ様リンカー、またはその機能的等価物のうちのいずれか1つまたは複数である、本発明1029の組み合わせ。
[本発明1032]
本発明1001の二重特異性キメラ抗原受容体または本発明1024の組み合わせをコードする、ポリヌクレオチド。
[本発明1033]
本発明1032のポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド。
[本発明1034]
本発明1032のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
[本発明1035]
本発明1032のポリヌクレオチドを含む、ウイルス。
[本発明1036]
ＲＮＡウイルスである、本発明1035のウイルス。
[本発明1037]
レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、またはヘルペスウイルスである、本発明1035のウイルス。
[本発明1038]
本発明1032のポリヌクレオチド、本発明1001のキメラ抗原受容体、または本発明1024の組み合わせを含む、遺伝子改変細胞。
[本発明1039]
Ｔ－リンパ球（Ｔ細胞）である、本発明1038の遺伝子改変細胞。
[本発明1040]
ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、またはそれらの組み合わせである、本発明1039の遺伝子改変細胞。
[本発明1041]
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、胚性幹細胞、または多能性幹細胞である、本発明1038の遺伝子改変細胞。
[本発明1042]
ａ．本発明1001の二重特異性キメラ抗原受容体、本発明1024の組み合わせ、本発明1032のポリペプチド、本発明1034のベクター、本発明1035のウイルス、本発明1038の遺伝子改変細胞、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数と、
ｂ．薬学的に許容される担体と
を含む、薬学的組成物。
[本発明1043]
本発明1042の薬学的組成物と、
治療用制御物質を発現する細胞の増殖を阻害するための、該治療用制御物質と生化学的に相互作用するように適合された組成物と
の組み合わせ。
[本発明1044]
前記治療用制御物質と生化学的に相互作用するように適合された前記組成物が、ハーセプチン、メトトレキサート、セツキシマブ、チミジン類似体（例えばガンシクロビル）、（Ｅ）－5－（2－ブロモビニル）－2'－デオキシウリジン（ＢＶＤＵ）、5－フルロシトシン（ｆｌｕｒｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）（5－ＦＣ）、5－（アザリジン（ａｚａｒｉｄｉｎ）－1－イル）－2，4－ジニトロベンズアミド（ＣＢ1954）、6－チオグアニン、合成二量体化薬（ｄｉｍｅｒｉｚｉｎｇ ｄｒｕｇ）（例えば、ＡＰ1903）、リン酸フルダラビン、リナマリン（ｌｉｎ）、ヌクレオシド類似体（例えば、ＢＶＤＵ、ジフルオロデオキシシチジン（ｄＦｄＣ）、1－β－Ｄ－アラビノフラノシルチミン（アラ－Ｔ））、インドール－3－酢酸（ＩＡＡ）、ｌ－ブチオニン－Ｓ，Ｒ－スルホキシイミン（ＢＳＯ）、リツキシマブ（ＲＴＸ）、ドキシサイクリン、チロシンキナーゼ阻害剤、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数である、本発明1043の組み合わせ。
[本発明1045]
以下の工程を含む、キメラ抗原受容体を発現する一定量のＴ細胞を生成する方法：
（ｉ）本発明1034のベクターを、1個または複数個のＴ細胞にトランスフェクトする工程、および
（ｉｉ）少なくとも2つの抗原特異的標的指向領域によって標的とされる抗原を発現する細胞、少なくとも2つの抗原特異的標的指向領域によって標的とされる組換え抗原を発現する細胞、またはキメラ抗原受容体に対する抗体を発現する細胞で、該1個または複数個のＴ細胞を刺激する工程であって、それによって該Ｔ細胞が、一定量のＴ細胞を生成するように増殖する、工程。
[本発明1046]
疾患の治療を必要とする対象における疾患を治療するための方法であって、
該方法が、
（ｉ）本発明1042の組成物を提供する工程、および
（ｉｉ）治療的有効量の該組成物を、該疾患を治療するように該対象に投与する工程
を含み、
少なくとも2つの抗原特異的標的指向領域がそれぞれ、抗原を標的とし、かつ少なくとも1つのそのような抗原が、該疾患と関連している、
該方法。
[本発明1047]
ａ．少なくとも2つの抗原特異的標的指向領域、
ｂ．細胞外スペーサードメイン、
ｃ．膜貫通ドメイン、
ｄ．少なくとも1つの共刺激ドメイン、および
ｅ．細胞内シグナル伝達ドメイン
を含み、トランケート型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）と共発現される、二重特異性キメラ抗原受容体であって、
各抗原特異的標的指向領域が、抗原特異的単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントを含み、かつ異なる抗原に結合する、
二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1048]
チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、キサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ヒトカスパーゼ8、ヒトカスパーゼ9、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、リナマラーゼ／リナマリン／グルコースオキシダーゼ、デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／インドール－3－酢酸（ＩＡＡ）、γグルタミルシステインシンテターゼ、ＣＤ20／αＣＤ20、ＣＤ34／チミジンキナーゼキメラ、ｄｏｘ依存カスパーゼ－2、変異チミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫＳＲ39）、ＡＰ1903／Ｆａｓ系、キメラサイトカイン受容体（ＣＣＲ）、選択マーカー、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む治療用制御物質と共発現される、本発明1047の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1049]
前記ＥＧＦＲｔが、ＥＧＦＲ特異的ｓｉＲＮＡ、小分子、抗ＥＧＦＲ抗体もしくはそのフラグメント、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数に結合する、本発明1047の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1050]
前記選択マーカーが、ジヒドロキシ葉酸受容体（ＤＨＦＲ）、変異ＤＨＦＲ、メチル化－ＤＮＡ－タンパク質－システインメチルトランスフェラーゼ、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼＩＩ（ＩＭＤＨＰ2）、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1048の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1051]
前記ＣＣＲが、（ｉ）ＩＬ－7サイトカイン－リンカー－ＩＬ7Ｒα、（ｉｉ）ＩＬ－7サイトカイン－リンカー－ＩＬ－7Ｒαの細胞外ドメイン－ＩＬ－7Ｒαの膜貫通ドメイン－ＩＬ－2Ｒβの細胞質ドメイン、（ｉｉｉ）ＩＬ－7サイトカイン－リンカー－ＩＬ2Ｒβ、および（ｉｖ）それらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1048の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1052]
前記二重特異性キメラ抗原受容体および前記治療用制御物質が、切断可能なリンカーを介して連結されている、本発明1047の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1053]
前記切断可能なリンカーが、自己切断型の切断可能なリンカーである、本発明1052の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1054]
前記切断可能なリンカーが、2Ａリンカー、2Ａ様リンカー、またはその機能的等価物のうちのいずれか1つまたは複数である、本発明1052の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1055]
前記細胞外スペーサードメインが、抗体のＦｃフラグメント、またはその機能的等価物、フラグメント、もしくは誘導体、抗体のヒンジ領域、またはその機能的等価物、フラグメント、もしくは誘導体、抗体のＣＨ2領域、抗体のＣＨ3領域、人工スペーサー配列、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1047の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1056]
前記細胞外スペーサードメインが、（ｉ）ＩｇＧ4のヒンジ、ＣＨ2、およびＣＨ3領域、（ｉｉ）ＩｇＧ4のヒンジ領域、（ｉｉｉ）ＩｇＧ4のヒンジおよびＣＨ2領域、（ｉｖ）ＣＤ8αのヒンジ領域、（ｖ）ＩｇＧ1のヒンジ、ＣＨ2、およびＣＨ3領域、（ｖｉ）ＩｇＧ1のヒンジ領域、（ｖｉ）ＩｇＧ1のヒンジおよびＣＨ2領域、ならびに（ｖｉｉ）それらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1055の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1057]
前記膜貫通ドメインが、Ｉ型膜貫通タンパク質の膜貫通領域、人工疎水性配列、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1047の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1058]
前記膜貫通ドメインが、Ｔ細胞受容体複合体のζ鎖の膜貫通ドメイン、ＣＤ28、ＣＤ8α、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1057の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1059]
前記共刺激ドメインが、ＣＤ28、ＣＤ137（4－1ＢＢ）、ＣＤ134（ＯＸ40）、Ｄａｐ10、ＣＤ27、ＣＤ2、ＣＤ5、ＩＣＡＭ－1、ＬＦＡ－1、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ－Ｉ、ＴＮＦＲ－ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ30、ＣＤ40、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数に由来するシグナル伝達ドメインを含む、本発明1047の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1060]
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ヒトＣＤ3ζ鎖、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃεＲＩ、Ｆｃ受容体の細胞質側末端、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する細胞質受容体、およびそれらの組み合わせのうちの1つまたは複数のシグナル伝達ドメインを含む、本発明1047の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1061]
前記少なくとも2つの抗原特異的標的指向ドメインのそれぞれが、癌、炎症性疾患、神経障害、糖尿病、心血管系疾患、感染性疾患、自己免疫性疾患、およびそれらの組み合わせに対して特異的な抗原から成る群から独立して選択される抗原を標的とする、本発明1047の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1062]
癌に特異的な前記抗原が、4－1ＢＢ、5Ｔ4、腺癌抗原、α－フェトプロテイン、ＢＡＦＦ、Ｂ－リンパ腫細胞、Ｃ242抗原、ＣＡ－125、炭酸脱水酵素9（ＣＡ－ＩＸ）、Ｃ－ＭＥＴ、ＣＣＲ4、ＣＤ152、ＣＤ19、ＣＤ20、ＣＤ200、ＣＤ22、ＣＤ221、ＣＤ23（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ28、ＣＤ30（ＴＮＦＲＳＦ8）、ＣＤ33、ＣＤ4、ＣＤ40、ＣＤ44ｖ6、ＣＤ51、ＣＤ52、ＣＤ56、ＣＤ74、ＣＤ80、ＣＥＡ、ＣＮＴＯ888、ＣＴＬＡ－4、ＤＲ5、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ3、ＦＡＰ、フィブロネクチンのエクストラドメイン－Ｂ、葉酸受容体1、ＧＤ2、ＧＤ3ガングリオシド、糖タンパク質75、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ2／ｎｅｕ、ＨＧＦ、ヒト細胞分散因子受容体キナーゼ、ＩＧＦ－1受容体、ＩＧＦ－Ｉ、ＩｇＧ1、Ｌ1－ＣＡＭ、ＩＬ－13、ＩＬ－6、インスリン様成長因子Ｉ受容体、インテグリンα5β1、インテグリンαｖβ3、ＭＯＲＡｂ－009、ＭＳ4Ａ1、ＭＵＣ1、ムチンＣａｎＡｇ、Ｎ－グリコリルノイラミン酸、ＮＰＣ－1Ｃ、ＰＤＧＦ－Ｒα、ＰＤＬ192、ホスファチジルセリン、前立腺癌細胞、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＮ、ＲＯＲ1、ＳＣＨ 900105、ＳＤＣ1、ＳＬＡＭＦ7、ＴＡＧ－72、テネイシンＣ、ＴＧＦβ2、ＴＧＦ－β、ＴＲＡＩＬ－Ｒ1、ＴＲＡＩＬ－Ｒ2、腫瘍抗原ＣＴＡＡ16．88、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦＲ－1、ＶＥＧＦＲ2、ビメンチン、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1061の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1063]
前記少なくとも2つの抗原特異的標的指向領域が、（ｉ）ＣＤ19およびＣＤ20、（ｉｉ）ＣＤ20およびＬ1－ＣＡＭ、（ｉｉｉ）Ｌ1－ＣＡＭおよびＧＤ2、（ｉｖ）ＥＧＦＲおよびＬ1－ＣＡＭ、（ｖ）ＣＤ19およびＣＤ22、（ｖｉ）ＥＧＦＲおよびＣ－ＭＥＴ、（ｖｉｉ）ＥＧＦＲおよびＨＥＲ2、（ｖｉｉｉ）Ｃ－ＭＥＴおよびＨＥＲ2、または（ｉｘ）ＥＧＦＲおよびＲＯＲ1に結合する、本発明1047の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1064]
前記少なくとも2つの抗原特異的標的指向領域が、ＣＤ19およびＣＤ20に結合する、本発明1047の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1065]
炎症性疾患に特異的な前記抗原が、ＡＯＣ3（ＶＡＰ－1）、ＣＡＭ－3001、ＣＣＬ11（エオタキシン－1）、ＣＤ125、ＣＤ147（ベイシジン）、ＣＤ154（ＣＤ40Ｌ）、ＣＤ2、ＣＤ20、ＣＤ23（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ25（ＩＬ－2受容体のα鎖）、ＣＤ3、ＣＤ4、ＣＤ5、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ、ＩｇＥ、ＩｇＥ Ｆｃ領域、ＩＬ－1、ＩＬ－12、ＩＬ－23、ＩＬ－13、ＩＬ－17、ＩＬ－17Ａ、ＩＬ－22、ＩＬ－4、ＩＬ－5、ＩＬ－5、ＩＬ－6、ＩＬ－6受容体、インテグリンα4、インテグリンα4β7、リャマ、ＬＦＡ－1（ＣＤ11ａ）、ＭＥＤＩ－528、ミオスタチン、ＯＸ－40、ｒｈｕＭＡｂβ7、スクレロスシン、ＳＯＳＴ、ＴＧＦβ1、ＴＮＦ－α、ＶＥＧＦ－Ａ、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1061の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1066]
神経障害に特異的な前記抗原が、βアミロイド、ＭＡＢＴ5102Ａ、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1061の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1067]
糖尿病に特異的な前記抗原が、Ｌ－1β、ＣＤ3、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1061の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1068]
心血管系疾患に特異的な前記抗原が、Ｃ5、心筋ミオシン、ＣＤ41（インテグリンα－ＩＩｂ）、フィブリンＩＩ、β鎖、ＩＴＧＢ2（ＣＤ18）、スフィンゴシン－1－ホスファート、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1061の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1069]
感染性疾患に特異的な前記抗原が、炭疽毒素、ＣＣＲ5、ＣＤ4、クランピング因子Ａ、サイトメガロウイルス、サイトメガロウイルス糖タンパク質Ｂ、内毒素、大腸菌、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ－1、Ｈｓｐ90、Ａ型インフルエンザ血球凝集素、リポテイコ酸、緑膿菌、狂犬病ウイルス糖タンパク質、呼吸器合胞体ウイルス、ＴＮＦ－α、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1061の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1070]
本発明1047の二重特異性キメラ抗原受容体と、ＥＧＦＲｔとの組み合わせ。
[本発明1071]
前記ＥＧＦＲｔが、ＥＧＦＲ特異的ｓｉＲＮＡ、小分子、抗ＥＧＦＲ抗体もしくはそのフラグメント、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数に結合する、本発明1070の組み合わせ。
[本発明1072]
前記二重特異性キメラ抗原受容体および前記ＥＧＦＲｔが、切断可能なリンカーを介して連結されている、本発明1070の組み合わせ。
[本発明1073]
前記切断可能なリンカーが、自己切断型の切断可能なリンカーである、本発明1072の組み合わせ。
[本発明1074]
前記切断可能なリンカーが、2Ａリンカー、2Ａ様リンカー、またはその機能的等価物のうちのいずれか1つまたは複数である、本発明1072の組み合わせ。
[本発明1075]
本発明1047の二重特異性キメラ抗原受容体または本発明1070の組み合わせをコードする、ポリヌクレオチド。
[本発明1076]
本発明1075のポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド。
[本発明1077]
本発明1075のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
[本発明1078]
本発明1075のポリヌクレオチドを含む、ウイルス。
[本発明1079]
ＲＮＡウイルスである、本発明1078のウイルス。
[本発明1080]
レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、またはヘルペスウイルスである、本発明1078のウイルス。
[本発明1081]
本発明1075のポリヌクレオチド、本発明1047のキメラ抗原受容体、または本発明1070の組み合わせを含む、遺伝子改変細胞。
[本発明1082]
Ｔ－リンパ球（Ｔ細胞）である、本発明1081の遺伝子改変細胞。
[本発明1083]
ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、またはそれらの組み合わせである、本発明1082の遺伝子改変細胞。
[本発明1084]
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、胚性幹細胞、または多能性幹細胞である、本発明1081の遺伝子改変細胞。
[本発明1085]
ａ．本発明1047の二重特異性キメラ抗原受容体、本発明1070の組み合わせ、本発明1076のポリペプチド、本発明1077のベクター、本発明1078のウイルス、本発明1081の遺伝子改変細胞、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数と、
ｂ．薬学的に許容される担体と
を含む、薬学的組成物。
[本発明1086]
本発明1085の薬学的組成物と、
ＥＧＦＲｔを発現する細胞の増殖を阻害するための、治療用制御物質と生化学的に相互作用するように適合された組成物と
の組み合わせ。
[本発明1087]
前記治療用制御物質と生化学的に相互作用するように適合された前記組成物が、ハーセプチン、メトトレキサート、セツキシマブ、チミジン類似体（例えばガンシクロビル）、（Ｅ）－5－（2－ブロモビニル）－2'－デオキシウリジン（ＢＶＤＵ）、5－フルロシトシン（5－ＦＣ）、5－（アザリジン－1－イル）－2，4－ジニトロベンズアミド（ＣＢ1954）、6－チオグアニン、合成二量体化薬（例えば、ＡＰ1903）、リン酸フルダラビン、リナマリン（ｌｉｎ）、ヌクレオシド類似体（例えば、ＢＶＤＵ、ジフルオロデオキシシチジン（ｄＦｄＣ）、1－β－Ｄ－アラビノフラノシルチミン（アラ－Ｔ））、インドール－3－酢酸（ＩＡＡ）、ｌ－ブチオニン－Ｓ，Ｒ－スルホキシイミン（ＢＳＯ）、リツキシマブ（ＲＴＸ）、ドキシサイクリン、チロシンキナーゼ阻害剤、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数である、本発明1086の組み合わせ。
[本発明1088]
以下の工程を含む、キメラ抗原受容体を発現する一定量のＴ細胞を生成する方法：
（ｉ）本発明1077のベクターを、1個または複数個のＴ細胞にトランスフェクトする工程、および
（ｉｉ）少なくとも2つの抗原特異的標的指向領域によって標的とされる抗原を発現する細胞、少なくとも2つの抗原特異的標的指向領域によって標的とされる組換え抗原を発現する細胞、またはキメラ抗原受容体に対する抗体を発現する細胞で、該1個または複数個のＴ細胞を刺激する工程であって、それによって該Ｔ細胞が、一定量のＴ細胞を生成するように増殖する、工程。
[本発明1089]
疾患の治療を必要とする対象における疾患を治療するための方法であって、
該方法が、
（ｉ）本発明1085の組成物を提供する工程、および
（ｉｉ）治療的有効量の該組成物を、該疾患を治療するように該対象に投与する工程
を含み、
少なくとも2つの抗原特異的標的指向領域がそれぞれ、抗原を標的とし、かつ少なくとも1つのそのような抗原が、該疾患と関連している、
該方法。
[本発明1090]
図4、9、または11に記載される配列を含む、二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1091]
ａ．少なくとも2つの抗原特異的標的指向領域、
ｂ．ＣＤ8αヒンジ細胞外スペーサードメイン、
ｃ．ＣＤ8α膜貫通ドメイン、
ｄ．4－1ＢＢ共刺激ドメイン、および
ｅ．ＣＤ3ζ細胞内シグナル伝達ドメイン
を含み、トランケート型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）と共発現される、二重特異性キメラ抗原受容体であって、
各抗原特異的標的指向領域が、抗原特異的単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメントを含み、かつ異なる抗原に結合し、
二重特異性キメラ抗原受容体およびＥＧＦＲｔが、Ｔ2Ａリンカーを介して連結されている、
二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1092]
チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、キサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ヒトカスパーゼ8、ヒトカスパーゼ9、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、リナマラーゼ／リナマリン／グルコースオキシダーゼ、デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／インドール－3－酢酸（ＩＡＡ）、γグルタミルシステインシンテターゼ、ＣＤ20／αＣＤ20、ＣＤ34／チミジンキナーゼキメラ、ｄｏｘ依存カスパーゼ－2、変異チミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫＳＲ39）、ＡＰ1903／Ｆａｓ系、キメラサイトカイン受容体（ＣＣＲ）、選択マーカー、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む治療用制御物質と共発現される、本発明1091の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1093]
前記ＥＧＦＲｔが、ＥＧＦＲ特異的ｓｉＲＮＡ、小分子、抗ＥＧＦＲ抗体もしくはそのフラグメント、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数に結合する、本発明1091の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1094]
前記選択マーカーが、ジヒドロキシ葉酸受容体（ＤＨＦＲ）、変異ＤＨＦＲ、メチル化－ＤＮＡ－タンパク質－システインメチルトランスフェラーゼ、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼＩＩ（ＩＭＤＨＰ2）、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1092の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1095]
前記ＣＣＲが、（ｉ）ＩＬ－7サイトカイン－リンカー－ＩＬ7Ｒα、（ｉｉ）ＩＬ－7サイトカイン－リンカー－ＩＬ－7Ｒαの細胞外ドメイン－ＩＬ－7Ｒαの膜貫通ドメイン－ＩＬ－2Ｒβの細胞質ドメイン、（ｉｉｉ）ＩＬ－7サイトカイン－リンカー－ＩＬ2Ｒβ、および（ｉｖ）それらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1092の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1096]
前記少なくとも2つの抗原特異的標的指向ドメインのそれぞれが、癌、炎症性疾患、神経障害、糖尿病、心血管系疾患、感染性疾患、自己免疫性疾患、およびそれらの組み合わせに対して特異的な抗原から成る群から独立して選択される抗原を標的とする、本発明1091の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1097]
癌に特異的な前記抗原が、4－1ＢＢ、5Ｔ4、腺癌抗原、α－フェトプロテイン、ＢＡＦＦ、Ｂ－リンパ腫細胞、Ｃ242抗原、ＣＡ－125、炭酸脱水酵素9（ＣＡ－ＩＸ）、Ｃ－ＭＥＴ、ＣＣＲ4、ＣＤ152、ＣＤ19、ＣＤ20、ＣＤ200、ＣＤ22、ＣＤ221、ＣＤ23（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ28、ＣＤ30（ＴＮＦＲＳＦ8）、ＣＤ33、ＣＤ4、ＣＤ40、ＣＤ44ｖ6、ＣＤ51、ＣＤ52、ＣＤ56、ＣＤ74、ＣＤ80、ＣＥＡ、ＣＮＴＯ888、ＣＴＬＡ－4、ＤＲ5、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ3、ＦＡＰ、フィブロネクチンのエクストラドメイン－Ｂ、葉酸受容体1、ＧＤ2、ＧＤ3ガングリオシド、糖タンパク質75、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ2／ｎｅｕ、ＨＧＦ、ヒト細胞分散因子受容体キナーゼ、ＩＧＦ－1受容体、ＩＧＦ－Ｉ、ＩｇＧ1、Ｌ1－ＣＡＭ、ＩＬ－13、ＩＬ－6、インスリン様成長因子Ｉ受容体、インテグリンα5β1、インテグリンαｖβ3、ＭＯＲＡｂ－009、ＭＳ4Ａ1、ＭＵＣ1、ムチンＣａｎＡｇ、Ｎ－グリコリルノイラミン酸、ＮＰＣ－1Ｃ、ＰＤＧＦ－Ｒα、ＰＤＬ192、ホスファチジルセリン、前立腺癌細胞、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＮ、ＲＯＲ1、ＳＣＨ 900105、ＳＤＣ1、ＳＬＡＭＦ7、ＴＡＧ－72、テネイシンＣ、ＴＧＦβ2、ＴＧＦ－β、ＴＲＡＩＬ－Ｒ1、ＴＲＡＩＬ－Ｒ2、腫瘍抗原ＣＴＡＡ16．88、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦＲ－1、ＶＥＧＦＲ2、ビメンチン、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1096の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1098]
前記少なくとも2つの抗原特異的標的指向領域が、（ｉ）ＣＤ19およびＣＤ20、（ｉｉ）ＣＤ20およびＬ1－ＣＡＭ、（ｉｉｉ）Ｌ1－ＣＡＭおよびＧＤ2、（ｉｖ）ＥＧＦＲおよびＬ1－ＣＡＭ、（ｖ）ＣＤ19およびＣＤ22、（ｖｉ）ＥＧＦＲおよびＣ－ＭＥＴ、（ｖｉｉ）ＥＧＦＲおよびＨＥＲ2、（ｖｉｉｉ）Ｃ－ＭＥＴおよびＨＥＲ2、または（ｉｘ）ＥＧＦＲおよびＲＯＲ1に結合する、本発明1096の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1099]
前記少なくとも2つの抗原特異的標的指向領域が、ＣＤ19およびＣＤ20に結合する、本発明1096の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1100]
炎症性疾患に特異的な前記抗原が、ＡＯＣ3（ＶＡＰ－1）、ＣＡＭ－3001、ＣＣＬ11（エオタキシン－1）、ＣＤ125、ＣＤ147（ベイシジン）、ＣＤ154（ＣＤ40Ｌ）、ＣＤ2、ＣＤ20、ＣＤ23（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ25（ＩＬ－2受容体のα鎖）、ＣＤ3、ＣＤ4、ＣＤ5、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ、ＩｇＥ、ＩｇＥ Ｆｃ領域、ＩＬ－1、ＩＬ－12、ＩＬ－23、ＩＬ－13、ＩＬ－17、ＩＬ－17Ａ、ＩＬ－22、ＩＬ－4、ＩＬ－5、ＩＬ－5、ＩＬ－6、ＩＬ－6受容体、インテグリンα4、インテグリンα4β7、リャマ、ＬＦＡ－1（ＣＤ11ａ）、ＭＥＤＩ－528、ミオスタチン、ＯＸ－40、ｒｈｕＭＡｂβ7、スクレロスシン、ＳＯＳＴ、ＴＧＦβ1、ＴＮＦ－α、ＶＥＧＦ－Ａ、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1096の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1101]
神経障害に特異的な前記抗原が、βアミロイド、ＭＡＢＴ5102Ａ、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1096の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1102]
糖尿病に特異的な前記抗原が、Ｌ－1β、ＣＤ3、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1096の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1103]
心血管系疾患に特異的な前記抗原が、Ｃ5、心筋ミオシン、ＣＤ41（インテグリンα－ＩＩｂ）、フィブリンＩＩ、β鎖、ＩＴＧＢ2（ＣＤ18）、スフィンゴシン－1－ホスファート、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1096の二重特異性キメラ抗原受容体。
[本発明1104]
感染性疾患に特異的な前記抗原が、炭疽毒素、ＣＣＲ5、ＣＤ4、クランピング因子Ａ、サイトメガロウイルス、サイトメガロウイルス糖タンパク質Ｂ、内毒素、大腸菌、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ－1、Ｈｓｐ90、Ａ型インフルエンザ血球凝集素、リポテイコ酸、緑膿菌、狂犬病ウイルス糖タンパク質、呼吸器合胞体ウイルス、ＴＮＦ－α、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか1つまたは複数を含む、本発明1096の二重特異性キメラ抗原受容体。
【図面の簡単な説明】
【0008】
例となる実施形態が、参照図面中に例示されている。本明細書に開示される実施形態および図面は、限定ではなく例示であると考えられることが意図される。
【0009】
【図1】本発明の一実施形態に従う、本発明のキメラ抗原受容体の略図を示す。ＡＳＴＲは抗原特異的標的指向領域であり、Ｌはリンカーであり、ＥＳＤは細胞外スペーサードメインであり、ＴＭは膜貫通ドメインであり、ＣＳＤは共刺激ドメインであり、ＩＳＤは細胞内シグナル伝達ドメインである。
【図2】本発明の一実施形態に従う、（ａ）抗ＣＤ１９ｘＣＤ２０ ＣＡＲの成分、および（ｂ）ｅｐＨＩＶ－７ レンチウイルスベクタートランスファープラスミドにパッケージ化された完全ｃＤＮＡを示す。
【図3】本発明の一実施形態に従う、二重特異性ＣＡＲ ＣＤ１９ｓｃＦｖ－Ｇｌｙ４Ｓｅｒ１リンカー－ＣＤ２０ｓｃＦｖ－ＩｇＧ４ヒンジ－ＣＤ２８ｔｍ－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７の核酸配列を示す。
【図4-1】本発明の一実施形態に従う、二重特異性ＣＡＲ ＣＤ１９ｓｃＦｖ－Ｇｌｙ４Ｓｅｒ１リンカー－ＣＤ２０ｓｃＦｖ－ＩｇＧ４ヒンジ－ＣＤ２８ｔｍ－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７の核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
【図5】本発明の一実施形態に従う、ＣＤ１９ｓｃＦｖ－Ｇｌｙ４Ｓｅｒ１リンカー－ＣＤ２０ｓｃＦｖ－ＩｇＧ４ヒンジ－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ２８ｇｇ－ＣＤ３ζ導入遺伝子構築物を示す。
【図6】本発明の一実施形態に従う、外因性γｃ非依存性成長を支持するためのＣγＣＲプラットフォームの発生を示す。（ａ）野生型対キメラサイトカイン受容体の概略図。ＩＬ－７Ｒα構成的サイトカイン受容体（ＣγＣＲ７）は、（Ｇ４Ｓ）２リンカーを介して完全長ヒトＩＬ－７Ｒα鎖につながれたヒトＩＬ－７サイトカインから成る。ＩＬ－２Ｒβ構成的サイトカイン受容体（ＣγＣＲ２）は、ＩＬ－７Ｒα細胞内シグナル伝達ドメインがヒトＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒβ細胞質ドメインで置換されていることを除いて、ＣγＣＲ７と同一である。（ｂ）発現構築物ＣγＣＲ－Ｔ２Ａ－ＣＤ１９ｔの図。
【図7】本発明の一実施形態に従う、本発明の一実施形態、すなわち、ＩｇＧ４のヒンジ領域、ＣＤ２８の膜貫通ドメイン、４－１ＢＢの共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζの細胞質ドメインを含む主鎖ＣＡＲの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
【図8】本発明の一実施形態に従う、本発明の一実施形態、すなわち、ＧＭＣＳＦＲｓｓ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ－Ｇｌｙ４Ｓｅｒリンカー－ＣＤ２０ｓｃＦｖ－ｈｕＩｇＧヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３－ＣＤ２８ｔｍ／ＣＤ２８ｃｙｔｏ－４１ＢＢ－ＣＤ３ζの核酸配列を示す。ＧＭＣＳＦＲｓｓは、ＧＭＣＳＦＲ由来のシグナル配列である。
【図9-1】本発明の一実施形態に従う、本発明の一実施形態、すなわち、ＧＭＣＳＦＲｓｓ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ－Ｇｌｙ４Ｓｅｒリンカー－ＣＤ２０ｓｃＦｖ－ｈｕＩｇＧヒンジ／ＣＨ２／ＣＨ３－ＣＤ２８ｔｍ／ＣＤ２８ｃｙｔｏ－４１ＢＢ－ＣＤ３ζの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。ＧＭＣＳＦＲｓｓは、ＧＭＣＳＦＲ由来のシグナル配列である。
【図10】本発明の一実施形態に従う、本発明の一実施形態、すなわち、ＧＭＣＳＦＲｓｓ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ－Ｇｌｙ４Ｓｅｒリンカー－ＣＤ２０ｓｃＦｖ－ＣＤ８αヒンジ－ＣＤ８αｔｍ－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔの核酸配列を示す。ＧＭＣＳＦＲｓｓは、ＧＭＣＳＦＲ由来のシグナル配列である。
【図11-1】本発明の一実施形態に従う、本発明の一実施形態、すなわち、ＧＭＣＳＦＲｓｓ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ－Ｇｌｙ４Ｓｅｒリンカー－ＣＤ２０ｓｃＦｖ－ＣＤ８αヒンジ－ＣＤ８αｔｍ－４１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。ＧＭＣＳＦＲｓｓは、ＧＭＣＳＦＲ由来のシグナル配列である。
【図12】本発明の一実施形態に従う、本発明の一実施形態、すなわち、Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔの核酸配列を示す。
【図13-1】本発明の一実施形態に従う、本発明の一実施形態、すなわち、Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔの核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本明細書に引用されるすべての参照物は、完全に明記されるかのように、参照することによりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。別途定義されない限り、本明細書で使用される技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３ｒｄ ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ ２００１）、Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５ｔｈ ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ ２００１）、およびＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ ２００１）は、当業者に本出願において使用される用語の多くの一般的な指針を提供する。
【0011】
当業者は、本発明の実践において使用され得る、明細書に記載されるものと類似または同等の多くの方法および材料を理解するであろう。実際に、本発明は、記載の方法および材料には全く限定されない。本発明の目的に対して、以下の用語が下記に定義される。
【0012】
本明細書に記載の発明は、キメラ抗原受容体を提供する。キメラ抗原受容体は、免疫特異性を遺伝子改変細胞に移植する改変受容体である。単一のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が多重抗原に対する特異性を持つことによって、様々な利益を達成することができ、とりわけ、１患者あたり多数種のＴ細胞生成物を作製することと比べて労力が著しく減少することが挙げられる。
【0013】
定義
キメラ抗原受容体の成分
本明細書で使用される場合、「抗原特異的標的指向領域」（ＡＳＴＲ）は、特定の抗原を標的とするＣＡＲの領域を指す。本発明のＣＡＲは、少なくとも２つの異なる抗原を標的とする少なくとも２つの標的指向領域を含む。一実施形態において、ＣＡＲは、少なくとも３つ以上の異なる抗原を標的とする３つ以上の標的指向領域を含む。ＣＡＲ上の標的指向領域は、細胞外である。いくつかの実施形態において、抗原特異的標的指向領域は、抗体またはその機能的等価物またはそのフラグメントまたはその誘導体を含み、標的指向領域のそれぞれは、異なる抗原を標的とする。標的指向領域は、そのそれぞれが標的抗原に特異的である、完全長重鎖、Ｆａｂフラグメント、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント、二価単鎖抗体、またはダイアボディを含み得る。しかしながら、そのそれぞれが本発明の様々な実施形態において使用され得る、結合サイトカイン（サイトカイン受容体を有する細胞の認識をもたらす）、アフィボディ、天然型受容体由来のリガンド結合ドメイン、（例えば、腫瘍細胞上の）受容体の溶解性タンパク質／ペプチドリガンド、ペプチド、および免疫応答を促すためのワクチン等の多数の代替物が存在する。実際に、当業者に理解されるように、高い親和性で所与の抗原に結合するほぼすべての分子が、抗原特異的標的指向領域として使用され得る。
キメラ抗原受容体の成分
本明細書で使用される場合、「抗原特異的標的指向領域」（ＡＳＴＲ）は、特定の抗原を標的とするＣＡＲの領域を指す。本発明のＣＡＲは、少なくとも２つの異なる抗原を標的とする少なくとも２つの標的指向領域を含む。一実施形態において、ＣＡＲは、少なくとも３つ以上の異なる抗原を標的とする３つ以上の標的指向領域を含む。ＣＡＲ上の標的指向領域は、細胞外である。いくつかの実施形態において、抗原特異的標的指向領域は、抗体またはその機能的等価物またはそのフラグメントまたはその誘導体を含み、標的指向領域のそれぞれは、異なる抗原を標的とする。標的指向領域は、そのそれぞれが標的抗原に特異的である、完全長重鎖、Ｆａｂフラグメント、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント、二価単鎖抗体、またはダイアボディを含み得る。しかしながら、そのそれぞれが本発明の様々な実施形態において使用され得る、結合サイトカイン（サイトカイン受容体を有する細胞の認識をもたらす）、アフィボディ、天然型受容体由来のリガンド結合ドメイン、（例えば、腫瘍細胞上の）受容体の溶解性タンパク質／ペプチドリガンド、ペプチド、および免疫応答を促すためのワクチン等の多数の代替物が存在する。実際に、当業者に理解されるように、高い親和性で所与の抗原に結合するほぼすべての分子が、抗原特異的標的指向領域として使用され得る。
【0014】
本明細書で使用される場合、「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」または「ＣＡＲｓ」は、抗原特異性を細胞（例えば、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、またはそれらの組み合わせ等のＴ細胞）に移植する改変受容体を指す。ＣＡＲはまた、人工Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、またはキメラ免疫受容体としても知られる。本発明のＣＡＲは、少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、１つまたは複数の共刺激ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む。２つ以上の抗原特異的標的指向領域は、少なくとも２つの異なる抗原を標的とし、直列に配列され、リンカー配列によって分離され得る。一実施形態において、細胞外スペーサードメインは任意である。別の実施形態において、ＣＡＲは、二重特異性ＣＡＲである。二重特異性ＣＡＲは、２つの異なる抗原に特異的である。
【0015】
本明細書で使用される場合、「共刺激ドメイン」（ＣＳＤ）は、メモリー細胞の増殖、生存、および／または発生を増強するＣＡＲの部分を指す。本発明のＣＡＲは、１つまたは複数の共刺激ドメインを含み得る。各共刺激ドメインは、例えば、ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバー、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、Ｄａｐ１０、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ－Ｉ、ＴＮＦＲ－ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、またはそれらの組み合わせのいずれか１つまたは複数の共刺激ドメインを含む。（例えば、他のタンパク質由来の）他の共刺激ドメインが、当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。
【0016】
本明細書で使用される場合、「細胞外スペーサードメイン」（ＥＳＤ）は、抗原特異的標的指向領域と膜貫通ドメインとの間の親水性領域を指す。いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲは、細胞外スペーサードメインを含む。他の実施形態において、本発明のＣＡＲは、細胞外スペーサードメインを含まない。その細胞外スペーサードメインは、抗体のＦｃフラグメント、またはそのフラグメントもしくは誘導体、抗体のヒンジ領域、またはそのフラグメントもしくは誘導体、抗体のＣＨ２領域、抗体のＣＨ３領域、人工スペーサー配列、またはそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。細胞外スペーサードメインの例には、ＣＤ８αヒンジ、ならびに、例えばＧｌｙ３程小さくてもよい、ポリペプチドから作製される人工スペーサー、またはＩｇＧ（ヒトＩｇＧ４等）のＣＨ１およびＣＨ３ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、細胞外スペーサードメインは、（ｉ）ＩｇＧ４のヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域、（ｉｉ）ＩｇＧ４のヒンジ領域、（ｉｉｉ）ＩｇＧ４のヒンジおよびＣＨ２、（ｉｖ）ＣＤ８αのヒンジ領域、（ｖ）ＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域、（ｖｉ）ＩｇＧ１のヒンジ領域、または（ｖｉ）ＩｇＧ１のヒンジおよびＣＨ２領域のいずれか１つまたは複数である。他の細胞外スペーサードメインが当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。
【0017】
本明細書で使用される場合、「細胞内シグナル伝達ドメイン」（ＩＳＤ）または「細胞質ドメイン」は、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞にその特殊化された機能を実施するように指示する、ＣＡＲの部分を指す。エフェクター機能シグナルを伝達するドメインの例には、Ｔ細胞受容体複合体のζ鎖またはそのホモログのいずれか（例えば、η鎖、ＦｃεＲ１γおよびβ鎖、ＭＢ１（Ｉｇα）鎖、Ｂ２９（Ｉｇβ）鎖等）、ヒトＣＤ３ζ鎖、ＣＤ３ポリペプチド（Δ、δ、およびε）、ｓｙｋファミリーチロシンキナーゼ（Ｓｙｋ、ＺＡＰ７０等）、ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ（Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ等）、ならびにＣＤ２、ＣＤ５、およびＣＤ２８等のＴ細胞伝達に関与する他の分子が挙げられるが、これらに限定されない。他の細胞内シグナル伝達ドメインが当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。
【0018】
本明細書で使用される場合、「リンカー」（Ｌ）または「リンカードメイン」または「リンカー領域」は、本発明のＣＡＲのドメイン／領域のいずれかを一緒に連結する、約１～１００アミノ酸の長さのオリゴまたはポリペプチド領域を指す。リンカーは、隣接するタンパク質ドメインが互いに自由に動くように、グリシンおよびセリンのようなフレキシブル残基で構成され得る。２つの隣接するドメインが互いに立体的に干渉しないことを確実にすることが望ましい場合、より長いリンカーが使用され得る。リンカーは、切断可能であってもよく、または切断可能でなくてもよい。切断可能なリンカーの例には、２Ａリンカー（例えば、Ｔ２Ａ）、２Ａ様リンカー、またはそれらの機能的等価物、およびそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施形態において、リンカーには、ピコルナウイルス２Ａ様リンカー、ブタテッショウウイルス（Ｐ２Ａ）のＣＨＹＳＥＬ配列、ゾセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａ）ウイルス（Ｔ２Ａ）、またはそれらの組み合わせ、変異体、および機能的等価物が挙げられる。他の実施形態において、リンカー配列は、２Ａグリシンと２Ｂプロリンとの間に切断をもたらす、Ａｓｐ－Ｖａｌ／Ｉｌｅ－Ｇｌｕ－Ｘ－Ａｓｎ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ（２Ａ）－Ｐｒｏ（２Ｂ）モチーフを含んでもよい。他のリンカーが当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。
【0019】
本明細書で使用される場合、「膜貫通ドメイン」（ＴＭＤ）は、細胞膜を横断するＣＡＲの領域を指す。本発明のＣＡＲの膜貫通ドメインは、膜貫通タンパク質（例えば、Ｉ型膜貫通タンパク質）、人工疎水性配列、またはそれらの組み合わせの膜貫通領域である。他の膜貫通ドメインが当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。
【0020】
その他
本明細書で使用される場合、「抗原消失エスケープ変異体」は、標的抗原の発現の低減または消失を示す細胞を指し、それらの抗原は、本発明のＣＡＲによって標的とされる。
本明細書で使用される場合、「抗原消失エスケープ変異体」は、標的抗原の発現の低減または消失を示す細胞を指し、それらの抗原は、本発明のＣＡＲによって標的とされる。
【0021】
本明細書で使用される場合、「Ｂ細胞関連疾患」は、Ｂ細胞免疫不全、自己免疫性疾患、ならびに／またはＢ細胞と関連している過剰／無制御細胞増殖（リンパ腫および／もしくは白血病を含む）を含む。本発明の二重特異性ＣＡＲが治療手段として使用され得る、そのような疾患の例には、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糖尿病、関節リウマチ（ＲＡ）、反応性関節炎、多発性硬化症（ＭＳ）、尋常性天疱瘡、セリアック病、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、自己免疫性甲状腺疾患、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症、プレＢ急性リンパ芽球性白血病、全身性エリテマトーデス、分類不能型免疫不全、慢性リンパ性白血病、選択的ＩｇＡ欠乏および／またはＩｇＧサブクラス欠乏と関連している疾患、Ｂ細胞系リンパ腫（ホジキンリンパ腫および／または非ホジキンリンパ腫）、胸腺腫を伴う免疫不全、一過性低ガンマグロブリン血症および／または高ＩｇＭ症候群、ならびにＥＢＶ媒介性リンパ増殖性疾患等のウイルス媒介性Ｂ細胞疾患、およびＢ細胞が病態生理に関与する慢性感染症が挙げられるが、これらに限定されない。
【0022】
「有益な結果」には、疾患状態の重症度を緩和するか、もしくは軽減する、疾患状態が悪化するのを防ぐ、疾患状態を治癒する、疾患状態を発症するのを防ぐ、患者が疾患状態を発症する機会を低減する、および患者の寿命もしくは寿命の予想値を伸ばすことが含まれるが、これらには全く限定されない。
【0023】
「癌」および「癌性」とは、典型的には、制御されていない細胞成長によって特徴付けられる、哺乳動物における生理的状態を指すか、または述べる。癌の例には、Ｂ細胞リンパ腫（ホジキンリンパ腫および／または非ホジキンリンパ腫）、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、肺癌、肝細胞癌、胃癌、膵臓癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、尿路の癌、甲状腺癌、腎癌、癌腫、黒色腫、頭頸部癌、脳癌、ならびにアンドロゲン依存性前立腺癌およびアンドロゲン非依存性前立腺癌を含むがこれらに限定されない前立腺癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【0024】
本明細書で使用される場合、「共発現」は、２つ以上の遺伝子の同時の発現を指す。遺伝子は、例えば、単一のタンパク質または単一のポリペプチド鎖としてのキメラタンパク質をコードする核酸であり得る。例えば、本発明のＣＡＲは、治療用制御物質（例えば、トランケート型上皮成長因子（ＥＧＦＲｔ））と共発現され得、ＣＡＲは、第１のポリヌクレオチド鎖でコードされ、治療用制御物質は、第２のポリヌクレオチド鎖でコードされる。一実施形態において、第１および第２のポリヌクレオチド鎖は、切断可能なリンカーをコードする核酸配列によって連結される。ＣＡＲおよび治療用制御物質系をコードするポリヌクレオチドは、ＩＲＥＳ配列によって連結される。代替的に、ＣＡＲおよび治療用制御物質は、リンカーを介して連結されていないが、代わりに例えば、２つの異なるベクターによってコードされている、２つの異なるポリヌクレオチドによってコードされる。さらに、本発明のＣＡＲは、治療用制御物質およびＣＣＲ、治療用制御物質およびＤＨＦＲ（例えば、変異ＤＨＦＲ）、または治療用制御物質およびＣＣＲおよびＤＨＦＲ（例えば、変異ＤＨＦＲ）と共発現され得る。ＣＡＲ、治療用制御物質、およびＣＣＲは、共発現され、それぞれ、第１、第２、および第３のポリヌクレオチド配列によってコードされ得、その第１、第２、および第３のポリヌクレオチド配列はＩＲＥＳ配列または切断可能なリンカーコードする配列を介して連結される。代替的に、これらの配列は、リンカーを介して連結されないが、代わりに例えば、別々のベクターによってコードされる。ＣＡＲ、治療用制御物質、およびＤＨＦＲ（例えば、変異ＤＨＦＲ）は、共発現され、第１、第２、および第４のポリヌクレオチド配列によってコードされ得、それぞれ、その第１、第２、および第４のポリヌクレオチド配列はＩＲＥＳ配列を介して、または切断可能なリンカーコードする配列を介して連結される。代替的に、これらの配列は、リンカーを介して連結されないが、代わりに例えば、別々のベクターによってコードされる。ＣＡＲ、治療用制御物質、ＣＣＲ、およびＤＨＦＲ（例えば、変異ＤＨＦＲ）は、共発現され、それぞれ、第１、第２、第３、および第４のポリヌクレオチド配列によってコードされ得、その第１、第２、第３、および第４のポリヌクレオチド配列はＩＲＥＳ配列または切断可能なリンカーコードする配列を介して連結される。代替的に、これらの配列は、リンカーを介して連結されないが、代わりに例えば、別々のベクターによってコードされる。前述の配列が別々のベクターによってコードされる場合、これらのベクターは、同時に、または連続してトランスフェクトされ得る。
【0025】
本明細書で使用される場合、「状態」、「疾患状態（ｄｉｓｅａｓｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）」、「疾患」、および「疾患状態（ｄｉｓｅａｓｅ ｓｔａｔｅ）」は、患部細胞が、例えば、患部細胞上の特異抗原に対する抗体を発現する本発明のＣＡＲによって標的とされ得る、生理学的状態を含む。標的とされ得る抗原の例には、Ｂ細胞（ＣＤ１９およびＣＤ２０）上で発現される抗原、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、胚細胞性腫瘍、芽細胞腫上で発現される抗原、種々の免疫細胞上で発現される抗原、ならびに種々の血液疾患、自己免疫性疾患、および／または炎症性疾患と関連している細胞上で発現される抗原が挙げられるが、これらに限定されない。
【0026】
本明細書で使用される場合、「遺伝子修飾細胞によって標的とされる疾患」は、治療的に有益な結果を実現するように遺伝子修飾細胞が患部細胞または健常な細胞を標的とするかどうかに関係なく、本発明の遺伝子修飾細胞によって、任意の疾患における任意の手段に関与する任意の細胞が標的とされることを包含する。遺伝子修飾細胞には、遺伝子修飾Ｔ細胞、ＮＫ細胞、造血幹細胞、多能性胚性幹細胞、または胚性幹細胞が含まれるが、これらに限定されない。遺伝子修飾細胞は、本発明のＣＡＲを発現し、そのＣＡＲは、標的細胞の表面上で発現される抗原のいずれかを標的とし得る。標的とされ得る抗原の例には、Ｂ細胞上で発現される抗原、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、胚細胞性腫瘍、および芽細胞腫上で発現される抗原、種々の免疫細胞上で発現される抗原、ならびに種々の血液疾患、自己免疫性疾患、および／または炎症性疾患と関連している細胞上で発現される抗原が挙げられるが、これらに限定されない。標的とされ得る他の抗原が当業者に明白であり、それらの代替の実施形態に関連して本発明のＣＡＲによって標的とされ得る。
【0027】
「エフェクター機能」は、分化した細胞の特殊化された機能を指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカインの分泌を含む、細胞溶解活性またはヘルパー活性であり得る。
【0028】
本明細書で使用される場合、「遺伝子修飾細胞」、「再配向細胞（ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｅｌｌ）」、「遺伝子改変細胞」、または「修飾細胞」は、本発明のＣＡＲを発現する細胞を指す。
【0029】
本明細書で使用される場合、「免疫細胞」は、抗原提示細胞、Ｂ細胞、好塩基球、細胞傷害性Ｔ細胞、樹状細胞、好酸球、顆粒球、ヘルパーＴ細胞、白血球、リンパ球、マクロファージ、マスト細胞、メモリー細胞、単球、ナチュラルキラー細胞、好中球、貪食細胞、形質細胞、およびＴ細胞を含むが、これらに限定されない、哺乳類免疫系の細胞を指す。
【0030】
本明細書で使用される場合、「免疫応答」は、先天免疫、体液性免疫、細胞性免疫、免疫、炎症反応、後天（適応）免疫、自己免疫、および／または過活動免疫（ｏｖｅｒａｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）を含むが、これらに限定されない、免疫を指す。
【0031】
本明細書で使用される場合、「哺乳類」は、限定されることなく、ヒトおよび非ヒト霊長動物、例えばチンパンジーおよび他の類人猿ならびにサル種；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、およびウマ等の家畜動物；イヌおよびネコ等の飼育哺乳動物；マウス、ラット、モルモット等の齧歯動物を含む実験動物を含む、哺乳綱の任意のメンバーを指す。この用語は、特定の年齢または性別を示さない。このため、成体および新生児の対象、ならびに胎児は、雄性または雌性にかかわらず、本用語の範囲内に含まれることが意図される。
【0032】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ（相補ＤＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（小ヘアピンＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）、ｓｎｏＲＮＡ（核小体低分子ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ、および／またはｔＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない。
【0033】
本明細書で使用される場合、「裸のＤＮＡ」は、発現に適切な配向で好適な発現ベクター内にクローン化されたＣＡＲをコードするＤＮＡを指す。使用され得るウイルスベクターには、ＳＩＮレンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、泡沫状ウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ハイブリッドベクター、および／またはプラスミドトランスポゾン（例えば、ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙトランスポゾンシステム）もしくはインテグラーゼ系のベクターシステムが含まれるが、これらに限定されない。本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る他のベクターが、当業者に明白である。
【0034】
本明細書で使用される場合、「単鎖可変フラグメント」、「単鎖抗体可変フラグメント」、または「ｓｃＦｖ」抗体は、リンカーペプチドで結合された重鎖および軽鎖のみの可変領域を含む、抗体の形態を指す。
【0035】
本明細書で使用される場合、「標的細胞」は、一疾患に関与し、本発明の遺伝子修飾細胞（遺伝子修飾Ｔ細胞、ＮＫ細胞、造血幹細胞、多能性幹細胞、および胚性幹細胞が挙げられるが、これらに限定されない）によって標的とされ得る細胞を指す。他の標的細胞が当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。
【0036】
「Ｔ細胞」および「Ｔリンパ球」という用語は、互いに交換可能であり、本明細書において同義的に使用される。例には、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【0037】
本明細書で使用される場合、「治療剤」は、例えば、疾患を、治療する、阻害する、防ぐ、その影響を軽減する、その重症度を低減する、発症の可能性を低減する、その進行を緩徐にする、および／またはそれを治癒するために使用される薬剤を指す。治療剤によって標的とされる疾患には、限定されないが、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、胚細胞性腫瘍、芽細胞腫が含まれ、種々の免疫細胞上で発現される抗原、ならびに種々の血液疾患、自己免疫性疾患、および／または炎症性疾患と関連している細胞上で発現される抗原が含まれる。
【0038】
本明細書で使用される場合、「治療用制御物質」は、細胞増殖を制御する、細胞選択（例えば、本発明のキメラ抗原受容体を発現する細胞を選択する）を促進する、細胞トラッキングを促進する、またはそれらの組み合わせを行う作用物質を指す。１つの実施形態において、細胞増殖を制御することとは、細胞増殖を促進するように細胞増殖を上方制御することを含む。別の実施形態において、細胞増殖を制御することとは、細胞増殖を減少させるか、または阻害するように細胞増殖を下方制御することを含む。いくつかの実施形態において、治療用制御物質として役立つ作用物質は、治療的利点をもたらし得る二重特異性キメラ抗原受容体を発現する細胞の濃縮を促進し得る。
【0039】
本明細書で使用される場合、「形質導入」は、ウイルスベクターを使用した、外来核酸の細胞内への導入を指す。
【0040】
本明細書で使用される場合、「トランスフェクション」は、組換えＤＮＡ技術を使用した、外来核酸の細胞内への導入を指す。「形質転換」という用語は、「外来」（すなわち、外因性または細胞外）遺伝子、ＤＮＡ、またはＲＮＡ配列の、宿主細胞への導入を意味し、その導入遺伝子または配列によってコードされるタンパク質または酵素等の望ましい物質を産生させるように、宿主細胞にその導入遺伝子または配列を発現させるようにする。導入遺伝子または配列はまた、「クローン化された」または「外来」遺伝子または配列と呼ばれてもよく、細胞の遺伝子機構によって使用される、開始、停止、プロモーター、シグナル、分泌、または他の配列等の制御性または調節配列を含み得る。遺伝子または配列は、非機能性配列または機能不明の配列を含み得る。導入ＤＮＡまたはＲＮＡを受容しかつ発現する宿主細胞は、「形質転換され」ており、「形質転換体」または「クローン」である。宿主細胞に導入されるＤＮＡまたはＲＮＡは、その宿主細胞と同じ属もしくは種の細胞、または異なる属もしくは種の細胞を含む、任意の源に由来し得る。
【0041】
本明細書で使用される場合、「治療」および「治療する」は、そこで対象が、たとえその治療が最終的に不成功であったとしても、標的とされる病態を防ぐか、もしくは鈍化（緩和）させる、病態を防ぐ、有益な結果を探究するか、もしくは得る、あるいは個体のその状態を発症する可能性を低下させることを目的とした、治療的処置および予防的もしくは予防手段の両方を指す。治療を必要とする者には、既にその状態を有している者、ならびにその状態を有し易い者、またはその状態が防がれるべき者が含まれる。
【0042】
本明細書で使用される場合、「腫瘍」は、悪性または良性にかかわらず、すべての腫瘍細胞の成長および増殖、ならびにすべての前癌性および癌性細胞および組織を指す。
【0043】
本明細書で使用される場合、「ベクター」、「クローニングベクター」、および「発現ベクター」は、媒介物であって、これにより、宿主を形質転換しかつ導入配列の発現（例えば、転写および翻訳）を促進するように、ポリヌクレオチド配列（例えば、外来遺伝子）が宿主細胞に導入され得る、媒介物を指す。ベクターには、プラスミド、ファージ、ウイルス等が含まれる。
【0044】
本発明の説明
キメラ抗原受容体
いかなる前提によっても限定されることは望まないが、本発明のキメラ抗原受容体（例えば、二重特異性ＣＡＲ）は、例えば、単一の抗原が標的とされる場合、種々の療法の経過中に生じ得る抗原消失エスケープ変異体の成長による従来の治療的失敗を克服し得ると考えられる。したがって、本発明は、とりわけ、ＣＡＲをコードする核酸配列およびアミノ酸配列、ＣＡＲを含むベクター、ＣＡＲを含むウイルス、ＣＡＲを含む遺伝子修飾細胞（再配向細胞）、ならびにそれらを作製し使用する方法を対象とする。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは二重特異性ＣＡＲである。他の実施形態において、ＣＡＲは、３つ以上の異なる抗原を標的とし、結合する。
キメラ抗原受容体
いかなる前提によっても限定されることは望まないが、本発明のキメラ抗原受容体（例えば、二重特異性ＣＡＲ）は、例えば、単一の抗原が標的とされる場合、種々の療法の経過中に生じ得る抗原消失エスケープ変異体の成長による従来の治療的失敗を克服し得ると考えられる。したがって、本発明は、とりわけ、ＣＡＲをコードする核酸配列およびアミノ酸配列、ＣＡＲを含むベクター、ＣＡＲを含むウイルス、ＣＡＲを含む遺伝子修飾細胞（再配向細胞）、ならびにそれらを作製し使用する方法を対象とする。いくつかの実施形態において、ＣＡＲは二重特異性ＣＡＲである。他の実施形態において、ＣＡＲは、３つ以上の異なる抗原を標的とし、結合する。
【0045】
一般的な実施形態において、本発明は、ＣＡＲ（例えば、二重特異性ＣＡＲ）、ＣＡＲ（例えば、二重特異性ＣＡＲ）をコードする核酸配列、ＣＡＲ（例えば、二重特異性ＣＡＲ）をコードする核酸を含むベクター、ＣＡＲ（例えば、二重特異性ＣＡＲ）をコードする核酸配列を含むウイルス、ＣＡＲ（例えば、二重特異性ＣＡＲ）を発現する宿主細胞（遺伝子修飾細胞等）、ＣＡＲ（例えば、二重特異性ＣＡＲ）および治療用制御物質の組み合わせ、ならびにＣＡＲ（例えば、二重特異性ＣＡＲ）を治療剤として作製し、使用する方法に関する。
【0046】
本発明のＣＡＲは、少なくとも２つの異なる抗原を標的とする。ＣＡＲ（二重特異性ＣＡＲ等）は、治療用制御物質、例えば、トランケート型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）、キメラサイトカイン受容体（ＣＣＲ）、および／またはジヒドロキシ葉酸受容体（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｆｏｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＤＨＦＲ）（例えば、変異ＤＨＦＲ）と共発現される。ＣＡＲおよび治療用制御物質をコードするポリヌクレオチドは、ＩＲＥＳ配列を介して、または切断可能なリンカーをコードするポリヌクレオチド配列を介して、連結され得る。本発明のＣＡＲは、それらが細胞内で発現され、次にその細胞が、少なくとも１つの抗原特異的標的指向領域と相互作用する少なくとも１つの分子の存在、例えば抗原の存在に応じて増殖し得るように、構築される。
【0047】
いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲとともに使用するための治療用制御物質は、トランケート型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、キサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ヒトカスパーゼ８、ヒトカスパーゼ９、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、リナマラーゼ／リナマリン／グルコースオキシダーゼ、デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／インドール－３－酢酸（ＩＡＡ）、γグルタミルシステインシンテターゼ、ＣＤ２０／αＣＤ２０、ＣＤ３４／チミジンキナーゼキメラ、ｄｏｘ依存カスパーゼ－２、変異チミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫＳＲ３９）、またはＡＰ１９０３／Ｆａｓ系のうちのいずれか１つまたは複数を含む。一実施形態において、本発明のＣＡＲは、切断可能なリンカーまたはＩＲＥＳ配列を介してＥＧＦＲｔに連結される。別の実施形態において、二重特異性ＣＡＲは、切断可能なリンカーまたはＩＲＥＳ配列を介してＥＧＦＲｔに連結される。
【0048】
本明細書に記載のＣＡＲは、単一のポリペプチド鎖として合成され得、少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域、細胞外スペーサードメイン、膜貫通ドメイン、１つまたは複数の共刺激ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。この実施形態において、抗原特異的標的指向領域はＮ末端にあり、直列に配列され、リンカーペプチドによって分離されている。抗原特異的標的指向領域は、膜貫通ドメインに連結される細胞外スペーサードメインに連結される。膜貫通ドメインは、共刺激ドメインに連結される。共刺激ドメインは、Ｃ末端の細胞内シグナル伝達ドメインに連結される。１つを超える共刺激ドメインが使用される場合、複数の共刺激ドメインは、そのＮ末端で膜貫通ドメインと、およびそのＣ末端で細胞内シグナル伝達ドメインと直列に配列され得る。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、Ｉ型膜貫通タンパク質としてＣＡＲを細胞表面に方向付けるＮ末端シグナル配列をさらに含み得る。抗原特異的標的指向領域は、細胞外に面していてよく、細胞内シグナル伝達ドメインは細胞質内であってよい。
【0049】
図１は、本発明のキメラ抗原受容体の略図を示す。
【0050】
一実施形態において、ＣＡＲ中の細胞外スペーサードメインは任意である。そのようなＣＡＲにおいて、抗原特異的標的指向領域はＮ末端にあり、直列に配列され、リンカーペプチドによって分離されている。抗原特異的標的指向領域は、膜貫通ドメインに連結され得る。膜貫通ドメインは、共刺激ドメインに連結され得る。共刺激ドメインは、Ｃ末端の細胞内シグナル伝達ドメインに連結され得る。１つを超える共刺激ドメインが使用される場合、複数の共刺激ドメインは、直列に配列され得、そのＮ末端に膜貫通ドメイン、およびそのＣ末端に細胞内シグナル伝達ドメインがある。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、Ｉ型膜貫通タンパク質としてＣＡＲを細胞表面に方向付けるＮ末端シグナル配列をさらに含み得る。抗原特異的標的指向領域は、細胞外に面していてよく、細胞内シグナル伝達ドメインは細胞質内であってよい。
【0051】
キメラ抗原受容体の抗原特異的標的指向領域
本発明のＣＡＲは、いくつかの（２つ以上、３つ以上等）異なる抗原を標的とし得る。一実施形態において、ＣＡＲは二重特異性ＣＡＲであり、２つの異なる抗原を標的とする。上述のように、ＣＡＲの抗原特異的標的指向領域は、直列に配列され得、リンカーペプチドによって分離され得る。ＣＡＲによって標的とされる抗原は、単一の患部細胞（癌性Ｂ細胞等）上の抗原、またはそれぞれが疾患に寄与する別々の細胞上で発現される抗原であり得る。ＣＡＲによって標的とされる抗原は、疾患に直接的または間接的のいずれかで関与する抗原である。
本発明のＣＡＲは、いくつかの（２つ以上、３つ以上等）異なる抗原を標的とし得る。一実施形態において、ＣＡＲは二重特異性ＣＡＲであり、２つの異なる抗原を標的とする。上述のように、ＣＡＲの抗原特異的標的指向領域は、直列に配列され得、リンカーペプチドによって分離され得る。ＣＡＲによって標的とされる抗原は、単一の患部細胞（癌性Ｂ細胞等）上の抗原、またはそれぞれが疾患に寄与する別々の細胞上で発現される抗原であり得る。ＣＡＲによって標的とされる抗原は、疾患に直接的または間接的のいずれかで関与する抗原である。
【0052】
二重特異性ＣＡＲにおいて、少なくとも２つの異なる抗原特異的抗体またはそのフラグメントもしくはその誘導体は、抗原特異的標的指向領域内にクローン化され得る。抗体は、任意の、しかし少なくとも２つの別個の最適な抗原に特異的であり得る。抗原に特異的な抗体は、抗体のＦａｂフラグメントまたは抗体の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）であり得る。
【0053】
例えば、図２は、ＣＤ１９およびＣＤ２０に特異的なＣＡＲを描写する本発明の一実施形態を示す。当業者によく知られている方法を使用して、複数の、少なくとも２つの異なる抗原に特異的なｓｃＦｖは、以下に記載される遺伝子修飾細胞によって標的とされ得る細胞上で標的抗原が発現される限り、ＩｇＧ４－ＣＤ２８－ζドメインの上流に（すなわち、Ｎ末端に）クローン化される。そのような技術が文献において完全に説明される。（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ，"Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ"（１９８９）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ［Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）］、Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ．Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ［Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｉｓ，ｅｄ．（１９９４））］、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ－ＩＩＩ［Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）］、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ ｅｄ．１９８４）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８５）］、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４）］、Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６）］、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ［ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）］、Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ（１９８４）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｐｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ ａｎｄ Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，ｅｄｓ．，１９９１）、Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、ならびにＡｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ等の学術誌における研究書）。
【0054】
１つの実施形態において、各抗原特異的標的指向領域は、抗原特異性を与えるのにＶＨドメイン単独で十分である場合（「単一ドメイン抗体」）、ＶＨ、ＣＨ１、ヒンジ、ならびにＣＨ２およびＣＨ３（Ｆｃ）Ｉｇドメインを有する完全長ＩｇＧ重鎖（標的抗原に特異的）を含む。完全長ＩｇＧ重鎖は、適切な膜貫通ドメインを介して、共刺激ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインに連結され得る。完全に活性である抗原特異的標的指向領域を生成するためにＶＨおよびＶＬドメインの両方が必要な場合、ＶＨ含有ＣＡＲおよび完全長ラムダ軽鎖（ＩｇＬ）の両方が、活性の抗原特異的標的指向領域を生成するために細胞に導入される。一実施形態において、細胞外スペーサードメインは、抗原特異的結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に連結され得る。細胞には、治療に関連した成果をもたらすことができる、Ｔ－リンパ球（Ｔ細胞）、ナチュラルキラー細胞、造血幹細胞、および／または多能性胚性／誘導性幹細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【0055】
別の実施形態において、ＣＡＲの各抗原特異的標的指向領域は、それぞれが異なる標的抗原に特異的である、少なくとも２つの単鎖抗体可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。ｓｃＦｖは、その中で１つの可変ドメイン（ＶＨまたはＶＬ）のＣ末端がポリペプチドリンカーを介して、他方（それぞれ、ＶＬまたはＶＨ）のＮ末端につながれており、ｓｃＦｖは、抗原の結合または結合の特異性を著しく破壊することなく発達してきた。（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ ｃｏｍｐｏｓｅｄ ｏｆ ａｎｔｉ－Ｔａｃ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ ａｎｄ ａ ｔｒｕｎｃａｔｅｄ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ ｔｏｘｉｎ．１９９０ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８７：９４９１、Ｂｅｄｚｙｋ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｉｇｈ ａｆｆｉｎｉｔｙ ａｎｔｉ－ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ．１９９０ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５：１８６１５）。リンカーは、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に、またはＶＨのＣ末端をＶＬのＮ末端に結合する。これらのｓｃＦｖは、自然抗体の重鎖および軽鎖中にある定常領域（Ｆｃ）を欠く。少なくとも２つの異なる抗原に特異的なｓｃＦｖは、直列に配列され、膜貫通ドメインを介して共刺激ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインに連結される。一実施形態において、細胞外スペーサードメインは、抗原特異的結合領域と膜貫通ドメインとの間に連結され得る。
【0056】
別の態様において、各ｓｃＦｖフラグメントは、重鎖の定常ドメインのすべて、または一部に融合され得る。少なくとも２つの異なる抗原に特異的な、結果として生じる抗原特異的標的指向領域は、膜貫通ドメインを介して共刺激ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインに結合される。一実施形態において、細胞外スペーサードメインは、抗原特異的結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に連結され得る。
【0057】
さらなる実施形態において、ＣＡＲの各抗原特異的標的指向領域は、二価（ｄｉｖａｌｅｎｔ）（または二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ））単鎖可変フラグメント（ｄｉ－ｓｃＦｖ、ｂｉ－ｓｃＦｖ）を含む。ｄｉ－ｓｃＦＶを含むＣＡＲにおいて、各抗原に特異的な２つのｓｃＦｖは、直列ｓｃＦｖをもたらす２つのＶＨおよび２つのＶＬ領域をもつ単一ペプチド鎖を生成することによって、一緒に連結される。（Ｘｉｏｎｇ，Ｃｈｅｎｇ－Ｙｉ；Ｎａｔａｒａｊａｎ，Ａ；Ｓｈｉ，ＸＢ；Ｄｅｎａｒｄｏ，ＧＬ；Ｄｅｎａｒｄｏ，ＳＪ（２００６）．"Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｎｔｉ－ＭＵＣ－１ ｍｕｌｔｉｍｅｒ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉ－ｓｃＦｖ ｕｎｐａｉｒｅｄ ｃｙｓｔｅｉｎｅ ｌｏｃａｔｉｏｎ ｏｎ ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ"．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ １９（８）：３５９－３６７、Ｋｕｆｅｒ，Ｐｅｔｅｒ；Ｌｕｔｔｅｒｂuｓｅ，Ｒａｌｆ；Ｂａｅｕｅｒｌｅ，Ｐａｔｒｉｃｋ Ａ．（２００４）．"Ａ ｒｅｖｉｖａｌ ｏｆ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ"．Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２（５）：２３８－２４４）。少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域を含むＣＡＲは、２つの抗原のそれぞれに特異的な２つのｓｃＦｖを発現することになる。少なくとも２つの異なる抗原に特異的な、結果として生じる抗原特異的標的指向領域は、膜貫通ドメインを介して共刺激ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインに結合される。一実施形態において、細胞外スペーサードメインは、抗原特異的結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に連結され得る。
【0058】
さらなる実施形態において、ＣＡＲの各抗原特異的標的指向領域は、ダイアボディを含む。ダイアボディにおいて、ｓｃＦｖは、２つの可変領域が一緒に折り重なるには短すぎるリンカーペプチドを用いて作製され、ｓｃＦｖを二量体化させる。さらにより短いリンカー（１つまたは２つのアミノ酸）は、三量体、いわゆるトリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｙ）またはトリボディ（ｔｒｉｂｏｄｙ）の形成をもたらす。テトラボディ（Ｔｅｔｒａｂｏｄｙ）もまた使用され得る。
【0059】
本発明のＣＡＲを作製するために、２つ以上の個々の抗原特異的標的指向領域は、単一のタンパク質分子上で共有結合的または非共有結合的のいずれかで互いに結合される。オリゴまたはポリペプチドリンカー、Ｆｃヒンジまたは膜ヒンジ領域は、これらのドメインを互いに結合するために使用され得る。本発明のＣＡＲは、異なる組み合わせでともに結合される異なる抗原特異的標的指向領域のうちの２つ以上を含み得る。例えば、免疫グロブリン配列（例えば、ｓｃＦｖおよび／または単一ドメイン抗体）を含む２つ以上の抗原特異的標的指向領域は、互いに連結され得る。
【0060】
キメラ抗原受容体の抗原特異的標的指向領域の標的
いくつかの実施形態において、ＣＡＲ（例えば、二重特異性ＣＡＲ）の抗原特異的標的指向領域は、癌、炎症性疾患、神経障害、糖尿病、心血管系疾患、感染性疾患、またはそれらの組み合わせに特異的な抗原を標的とする。本発明のＣＡＲ（例えば、二重特異性ＣＡＲ）によって標的とされ得る抗原の例には、Ｂ細胞上で発現される抗原、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、胚細胞性腫瘍、芽細胞腫上で発現される抗原、種々の免疫細胞上で発現される抗原、ならびに種々の血液疾患、自己免疫性疾患、および／または炎症性疾患と関連している細胞上で発現される抗原が挙げられるが、これらに限定されない。少なくとも２つの異なる標的抗原に特異的な本発明のＣＡＲは、発現細胞のエフェクター機能を両標的抗原のいずれかに向け直すことが可能であり得る。構築物のこの特徴は、例えば、遺伝的に不安定なＢ細胞系悪性腫瘍を、単一の抗原特異性を使用して標的とする際の、抗原消失エスケープ変異体の問題を克服し得る。
いくつかの実施形態において、ＣＡＲ（例えば、二重特異性ＣＡＲ）の抗原特異的標的指向領域は、癌、炎症性疾患、神経障害、糖尿病、心血管系疾患、感染性疾患、またはそれらの組み合わせに特異的な抗原を標的とする。本発明のＣＡＲ（例えば、二重特異性ＣＡＲ）によって標的とされ得る抗原の例には、Ｂ細胞上で発現される抗原、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、胚細胞性腫瘍、芽細胞腫上で発現される抗原、種々の免疫細胞上で発現される抗原、ならびに種々の血液疾患、自己免疫性疾患、および／または炎症性疾患と関連している細胞上で発現される抗原が挙げられるが、これらに限定されない。少なくとも２つの異なる標的抗原に特異的な本発明のＣＡＲは、発現細胞のエフェクター機能を両標的抗原のいずれかに向け直すことが可能であり得る。構築物のこの特徴は、例えば、遺伝的に不安定なＢ細胞系悪性腫瘍を、単一の抗原特異性を使用して標的とする際の、抗原消失エスケープ変異体の問題を克服し得る。
【0061】
本発明のＣＡＲ（例えば、二重特異性ＣＡＲ）によって標的とされ得る癌に特異的な抗原には、４－１ＢＢ、５Ｔ４、腺癌抗原、α－フェトプロテイン、ＢＡＦＦ、Ｂ－リンパ腫細胞、Ｃ２４２抗原、ＣＡ－１２５、炭酸脱水酵素９（ＣＡ－ＩＸ）、Ｃ－ＭＥＴ、ＣＣＲ４、ＣＤ１５２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２００、ＣＤ２２、ＣＤ２２１、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２８、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ３３、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＥＡ、ＣＮＴＯ８８８、ＣＴＬＡ－４、ＤＲ５、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３、ＦＡＰ、フィブロネクチンのエクストラドメイン－Ｂ、葉酸受容体１、ＧＤ２、ＧＤ３ガングリオシド、糖タンパク質７５、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＧＦ、ヒト細胞分散因子（ｓｃａｔｔｅｒ ｆａｃｔｏｒ）受容体キナーゼ、ＩＧＦ－１受容体、ＩＧＦ－Ｉ、ＩｇＧ１、Ｌ１－ＣＡＭ、ＩＬ－１３、ＩＬ－６、インスリン様成長因子Ｉ受容体、インテグリンα５β１、インテグリンαｖβ３、ＭＯＲＡｂ－００９、ＭＳ４Ａ１、ＭＵＣ１、ムチンＣａｎＡｇ、Ｎ－グリコリルノイラミン酸、ＮＰＣ－１Ｃ、ＰＤＧＦ－Ｒα、ＰＤＬ１９２、ホスファチジルセリン、前立腺癌細胞、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＮ、ＲＯＲ１、ＳＣＨ ９００１０５、ＳＤＣ１、ＳＬＡＭＦ７、ＴＡＧ－７２、テネイシンＣ、ＴＧＦβ２、ＴＧＦ－β、ＴＲＡＩＬ－Ｒ１、ＴＲＡＩＬ－Ｒ２、腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦＲ－１、ＶＥＧＦＲ２、またはビメンチンのうちのいずれか１つまたは複数が含まれるが、これらに限定されない。癌に特異的な他の抗原が当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。上記抗原を標的とするＣＡＲの例には、二重特異性ＣＡＲ、ＥＧＦＲｔと共発現される二重特異性ＣＡＲ、ＥＧＦＲｔおよびＣＣＲと共発現される二重特異性ＣＡＲ、ＥＧＦＲｔおよびＤＨＦＲ（例えば、変異ＤＨＦＲ）と共発現される二重特異性ＣＡＲ、またはＥＧＦＲｔおよびＣＤＲおよびＤＨＦＲ（例えば変異ＤＨＦＲ）と共発現される二重特異性ＣＡＲが挙げられるが、これらに限定されない。
【0062】
いくつかの実施形態において、二重特異性キメラ抗原受容体は、少なくとも２つの異なる抗原を標的とし、結合する。本発明の二重特異性ＣＡＲによって結合される少なくとも２つの抗原の対の例には、ＣＤ１９およびＣＤ２０、ＣＤ１９およびＣＤ２２、ＣＤ２０およびＬ１－ＣＡＭ、Ｌ１－ＣＡＭおよびＧＤ２、ＥＧＦＲおよびＬ１－ＣＡＭ、ＥＧＦＲおよびＣ－ＭＥＴ、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２、Ｃ－ＭＥＴおよびＨＥＲ２、ならびにＥＧＦＲおよびＲＯＲ１が挙げられるが、これらに限定されない。癌に特異的な抗原の他の対が当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。さらに他の実施形態において、二重特異性キメラ抗原受容体は、ＣＤ１９およびＣＤ２０を標的とする。上記抗原を標的とするＣＡＲの例には、二重特異性ＣＡＲ、ＥＧＦＲｔと共発現される二重特異性ＣＡＲ、ＥＧＦＲｔおよびＣＣＲと共発現される二重特異性ＣＡＲ、ＥＧＦＲｔおよびＤＨＦＲ（例えば、変異ＤＨＦＲ）と共発現される二重特異性ＣＡＲ、またはＥＧＦＲｔおよびＣＤＲおよびＤＨＦＲ（例えば変異ＤＨＦＲ）と共発現される二重特異性ＣＡＲが挙げられるが、これらに限定されない。
【0063】
本発明のＣＡＲによって標的とされ得る炎症性疾患に特異的な抗原には、ＡＯＣ３（ＶＡＰ－１）、ＣＡＭ－３００１、ＣＣＬ１１（エオタキシン－１）、ＣＤ１２５、ＣＤ１４７（ベイシジン）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ２、ＣＤ２０、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２５（ＩＬ－２受容体のα鎖）、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－γ、ＩｇＥ、ＩｇＥ Ｆｃ領域、ＩＬ－１、ＩＬ－１２、ＩＬ－２３、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－６受容体、インテグリンα４、インテグリンα４β７、リャマ（Ｌａｍａ ｇｌａｍａ）、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ）、ＭＥＤＩ－５２８、ミオスタチン、ＯＸ－４０、ｒｈｕＭＡｂβ７、スクレロスシン（ｓｃｌｅｒｏｓｃｉｎ）、ＳＯＳＴ、ＴＧＦβ１、ＴＮＦ－α、またはＶＥＧＦ－Ａのうちのいずれか１つまたは複数が含まれるが、これらに限定されない。炎症性疾患に特異的な他の抗原が当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。上記抗原を標的とするＣＡＲの例には、二重特異性ＣＡＲ、ＥＧＦＲｔと共発現される二重特異性ＣＡＲ、ＥＧＦＲｔおよびＣＣＲと共発現される二重特異性ＣＡＲ、ＥＧＦＲｔおよびＤＨＦＲ（例えば、変異ＤＨＦＲ）と共発現される二重特異性ＣＡＲ、またはＥＧＦＲｔおよびＣＤＲおよびＤＨＦＲ（例えば変異ＤＨＦＲ）と共発現される二重特異性ＣＡＲが挙げられるが、これらに限定されない。
【0064】
本発明のＣＡＲによって標的とされ得る神経障害に特異的な抗原には、βアミロイドまたはＭＡＢＴ５１０２Ａのいずれか１つまたは複数が含まれるが、これらに限定されない。神経障害に特異的な他の抗原が当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。上記抗原を標的とするＣＡＲの例には、二重特異性ＣＡＲ、ＥＧＦＲｔと共発現される二重特異性ＣＡＲ、ＥＧＦＲｔおよびＣＣＲと共発現される二重特異性ＣＡＲ、ＥＧＦＲｔおよびＤＨＦＲ（例えば、変異ＤＨＦＲ）と共発現される二重特異性ＣＡＲ、またはＥＧＦＲｔおよびＣＤＲおよびＤＨＦＲ（例えば変異ＤＨＦＲ）と共発現される二重特異性ＣＡＲが挙げられるが、これらに限定されない。
【0065】
本発明のＣＡＲによって標的とされ得る糖尿病に特異的な抗原には、Ｌ－１βまたはＣＤ３のいずれか１つまたは複数が含まれるが、これらに限定されない。糖尿病または他の代謝障害に特異的な他の抗原が当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。上記抗原を標的とするＣＡＲの例には、二重特異性ＣＡＲ、ＥＧＦＲｔと共発現される二重特異性ＣＡＲ、ＥＧＦＲｔおよびＣＣＲと共発現される二重特異性ＣＡＲ、ＥＧＦＲｔおよびＤＨＦＲ（例えば、変異ＤＨＦＲ）と共発現される二重特異性ＣＡＲ、またはＥＧＦＲｔおよびＣＤＲおよびＤＨＦＲ（例えば変異ＤＨＦＲ）と共発現される二重特異性ＣＡＲが挙げられるが、これらに限定されない。
【0066】
本発明のＣＡＲによって標的とされ得る心血管系疾患に特異的な抗原には、Ｃ５、心筋ミオシン、ＣＤ４１（インテグリンα－ＩＩｂ）、フィブリンＩＩ、β鎖、ＩＴＧＢ２（ＣＤ１８）、およびスフィンゴシン－１－ホスファートのうちのいずれか１つまたは複数が含まれるが、これらに限定されない。心血管系疾患に特異的な他の抗原が当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。上記抗原を標的とするＣＡＲの例には、二重特異性ＣＡＲ、ＥＧＦＲｔと共発現される二重特異性ＣＡＲ、ＥＧＦＲｔおよびＣＣＲと共発現される二重特異性ＣＡＲ、ＥＧＦＲｔおよびＤＨＦＲ（例えば、変異ＤＨＦＲ）と共発現される二重特異性ＣＡＲ、またはＥＧＦＲｔおよびＣＤＲおよびＤＨＦＲ（例えば変異ＤＨＦＲ）と共発現される二重特異性ＣＡＲが挙げられるが、これらに限定されない。
【0067】
本発明のＣＡＲによって標的とされ得る感染性疾患に特異的な抗原には、炭疽毒素、ＣＣＲ５、ＣＤ４、クランピング因子Ａ、サイトメガロウイルス、サイトメガロウイルス糖タンパク質Ｂ、内毒素、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ－１、Ｈｓｐ９０、Ａ型インフルエンザ血球凝集素、リポテイコ酸、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、狂犬病ウイルス糖タンパク質、呼吸器合胞体ウイルス、およびＴＮＦ－αのうちのいずれか１つまたは複数が含まれるが、これらに限定されない。感染性疾患に特異的な他の抗原が当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。上記抗原を標的とするＣＡＲの例には、二重特異性ＣＡＲ、ＥＧＦＲｔと共発現される二重特異性ＣＡＲ、ＥＧＦＲｔおよびＣＣＲと共発現される二重特異性ＣＡＲ、ＥＧＦＲｔおよびＤＨＦＲ（例えば、変異ＤＨＦＲ）と共発現される二重特異性ＣＡＲ、またはＥＧＦＲｔおよびＣＤＲおよびＤＨＦＲ（例えば変異ＤＨＦＲ）と共発現される二重特異性ＣＡＲが挙げられるが、これらに限定されない。
【0068】
標的抗原のさらなる例には、特異的なまたは増幅された様式で癌細胞上に見出される表面タンパク質（例えば、Ｂ細胞リンパ腫におけるＩＬ－１４受容体、ＣＤ１９、ＣＤ２０、およびＣＤ４０、様々な癌腫におけるルイスＹおよびＣＥＡ抗原、乳癌および結腸直腸癌におけるＴａｇ７２抗原、肺癌におけるＥＧＦ－Ｒ、ヒト乳癌および卵巣癌においてしばしば増幅されている葉酸結合タンパク質およびＨＥＲ－２タンパク質）、またはウイルスタンパク質（例えば、ＨＩＶのｇｐ１２０およびｇｐ４１エンベロープタンパク質、Ｂ型およびＣ型肝炎ウイルス由来のエンベロープタンパク質、ヒトサイトメガロウイルスの糖タンパク質Ｂおよび他のエンベロープ糖タンパク質、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス等のオンコウイルス由来のエンベロープタンパク質）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のＣＡＲの他の潜在的標的は、リガンドがＨＩＶｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質である場合、ＣＤ４、ならびに他のウイルス受容体、例えばヒトライノウイルスの受容体であるＩＣＡＭ、およびポリオウイルスの関連受容体分子を含む。
【0069】
本発明のＣＡＲのさらなる標的は、Ｂ細胞関連疾患に関与する抗原を含む。本発明のＣＡＲのなおさらなる標的が当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。
【0070】
キメラ抗原受容体の共刺激ドメイン
本発明のＣＡＲはまた、共刺激ドメインを含む。このドメインは、細胞増殖、細胞生存、およびメモリー細胞の発生を増強し得る。本発明のＣＡＲは、１つまたは複数の共刺激ドメインを含み得る。各共刺激ドメインは、例えば、ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバー、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、Ｄａｐ１０、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ－１、ＴＮＦＲ－ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数の共刺激ドメインを含む。他のタンパク質由来の共刺激ドメインがまた、本発明のＣＡＲとともに使用され得る。さらなる共刺激ドメインが当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。ＣＡＲが１つを超える共刺激ドメインを含む場合、これらのドメインは直列に配列され、任意にリンカーによって分離され得る。
本発明のＣＡＲはまた、共刺激ドメインを含む。このドメインは、細胞増殖、細胞生存、およびメモリー細胞の発生を増強し得る。本発明のＣＡＲは、１つまたは複数の共刺激ドメインを含み得る。各共刺激ドメインは、例えば、ＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバー、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、Ｄａｐ１０、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ－１、ＴＮＦＲ－ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数の共刺激ドメインを含む。他のタンパク質由来の共刺激ドメインがまた、本発明のＣＡＲとともに使用され得る。さらなる共刺激ドメインが当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。ＣＡＲが１つを超える共刺激ドメインを含む場合、これらのドメインは直列に配列され、任意にリンカーによって分離され得る。
【0071】
キメラ抗原受容体の細胞外スペーサードメイン
本発明のＣＡＲは、細胞外スペーサードメインをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、このドメインは、適切なタンパク質フォールディングを促進する。細胞外スペーサードメインは、抗原特異的標的指向領域および膜貫通ドメインに付着される親水性領域を含む。細胞外スペーサードメインには、抗体のＦｃフラグメント、またはそのフラグメントもしくは誘導体、抗体のヒンジ領域、またはそのフラグメントもしくは誘導体、抗体のＣＨ２領域、抗体のＣＨ３領域、人工スペーサー配列、またはそれらの組み合わせが含まれ得るが、これらに限定されない。細胞外スペーサードメインの例には、ＣＤ８αヒンジ、Ｇｌｙ３等のポリペプチドから作製される人工スペーサー、またはＩｇＧ（ヒトＩｇＧ４等）のＣＨ１、ＣＨ３ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。具体的に、細胞外スペーサードメインは、（ｉ）ＩｇＧ４のヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域、（ｉｉ）ＩｇＧ４のヒンジ領域、（ｉｉｉ）ＩｇＧ４のヒンジおよびＣＨ２、（ｉｖ）ＣＤ８αのヒンジ領域、（ｖ）ＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域、（ｖｉ）ＩｇＧ１のヒンジ領域、もしくは（ｖｉ）ＩｇＧ１のヒンジおよびＣＨ２、またはそれらの組み合わせであり得る。さらなる細胞外スペーサードメインが当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。
本発明のＣＡＲは、細胞外スペーサードメインをさらに含み得る。いくつかの実施形態において、このドメインは、適切なタンパク質フォールディングを促進する。細胞外スペーサードメインは、抗原特異的標的指向領域および膜貫通ドメインに付着される親水性領域を含む。細胞外スペーサードメインには、抗体のＦｃフラグメント、またはそのフラグメントもしくは誘導体、抗体のヒンジ領域、またはそのフラグメントもしくは誘導体、抗体のＣＨ２領域、抗体のＣＨ３領域、人工スペーサー配列、またはそれらの組み合わせが含まれ得るが、これらに限定されない。細胞外スペーサードメインの例には、ＣＤ８αヒンジ、Ｇｌｙ３等のポリペプチドから作製される人工スペーサー、またはＩｇＧ（ヒトＩｇＧ４等）のＣＨ１、ＣＨ３ドメインが挙げられるが、これらに限定されない。具体的に、細胞外スペーサードメインは、（ｉ）ＩｇＧ４のヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域、（ｉｉ）ＩｇＧ４のヒンジ領域、（ｉｉｉ）ＩｇＧ４のヒンジおよびＣＨ２、（ｉｖ）ＣＤ８αのヒンジ領域、（ｖ）ＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域、（ｖｉ）ＩｇＧ１のヒンジ領域、もしくは（ｖｉ）ＩｇＧ１のヒンジおよびＣＨ２、またはそれらの組み合わせであり得る。さらなる細胞外スペーサードメインが当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。
【0072】
キメラ抗原受容体の膜貫通ドメイン
本発明のＣＡＲはまた、膜貫通ドメインを含み得る。膜貫通ドメインは、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型膜貫通タンパク質のいずれかを含む、膜貫通ドメインを有する任意のタンパク質に由来する膜貫通配列を含み得る。本発明のＣＡＲの膜貫通ドメインはまた、人工疎水性配列を含み得る。本発明のＣＡＲの膜貫通ドメインは、二量体化しないように選択され得る。さらなる膜貫通ドメインが当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。
本発明のＣＡＲはまた、膜貫通ドメインを含み得る。膜貫通ドメインは、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型膜貫通タンパク質のいずれかを含む、膜貫通ドメインを有する任意のタンパク質に由来する膜貫通配列を含み得る。本発明のＣＡＲの膜貫通ドメインはまた、人工疎水性配列を含み得る。本発明のＣＡＲの膜貫通ドメインは、二量体化しないように選択され得る。さらなる膜貫通ドメインが当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。
【0073】
キメラ抗原受容体の細胞内シグナル伝達ドメイン
本発明のＣＡＲはまた、細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。このドメインは、細胞質内であってもよく、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞にその特殊化された機能を実施するように指示し得る。細胞内シグナル伝達ドメインの例には、Ｔ細胞受容体のζ鎖またはそのホモログのいずれか（例えば、η鎖、ＦｃεＲ１γおよびβ鎖、ＭＢ１（Ｉｇα）鎖、Ｂ２９（Ｉｇβ）鎖等）、ＣＤ３ポリペプチド（Δ、δ、およびε）、ｓｙｋファミリーチロシンキナーゼ（Ｓｙｋ、ＺＡＰ７０等）、ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ（Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ等）、ならびにＣＤ２、ＣＤ５、およびＣＤ２８等のＴ細胞伝達に関与する他の分子が挙げられるが、これらに限定されない。具体的に、細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３ζ鎖、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃεＲＩ、Ｆｃ受容体の細胞質側末端、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する細胞質受容体、またはそれらの組み合わせであり得る。さらなる細胞内シグナル伝達ドメインが当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。
本発明のＣＡＲはまた、細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。このドメインは、細胞質内であってもよく、エフェクター機能シグナルを伝達し、細胞にその特殊化された機能を実施するように指示し得る。細胞内シグナル伝達ドメインの例には、Ｔ細胞受容体のζ鎖またはそのホモログのいずれか（例えば、η鎖、ＦｃεＲ１γおよびβ鎖、ＭＢ１（Ｉｇα）鎖、Ｂ２９（Ｉｇβ）鎖等）、ＣＤ３ポリペプチド（Δ、δ、およびε）、ｓｙｋファミリーチロシンキナーゼ（Ｓｙｋ、ＺＡＰ７０等）、ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ（Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ等）、ならびにＣＤ２、ＣＤ５、およびＣＤ２８等のＴ細胞伝達に関与する他の分子が挙げられるが、これらに限定されない。具体的に、細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３ζ鎖、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃεＲＩ、Ｆｃ受容体の細胞質側末端、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する細胞質受容体、またはそれらの組み合わせであり得る。さらなる細胞内シグナル伝達ドメインが当業者に明白であり、本発明の代替の実施形態に関連して使用され得る。
【0074】
キメラ抗原受容体におけるリンカー
いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲの２つ以上の成分は、１つまたは複数のリンカーによって分離される。例えば、少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域を含むＣＡＲにおいて、ＣＡＲ上の第１の標的指向領域は、ＣＡＲ上の第２の標的指向領域からリンカーを介して分離され得る。さらに、ＣＡＲは、リンカーを介して治療用制御物質に連結され得る。リンカーは、本発明のＣＡＲのドメイン／領域のいずれかを一緒に連結する、約１～１００アミノ酸の長さのオリゴまたはポリペプチド領域である。いくつかの実施形態において、リンカーは、例えば、５～１２アミノ酸の長さ、５～１５アミノ酸の長さ、または５～２０アミノ酸の長さであり得る。リンカーは、隣接するタンパク質ドメインが互いに自由に動くように、グリシンおよびセリンのようなフレキシブル残基で構成され得る。例えば、１００アミノ酸よりも長い、より長いリンカーが、本発明の代替の実施形態に関連して使用されてもよく、例えば、２つの隣接するドメインが互いに立体的に干渉しないことを確実にするために選択され得る。本発明において使用され得るリンカーの例には、２Ａリンカー（例えば、Ｔ２Ａ）、２Ａ様リンカー、またはその機能的等価物が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態において、本発明のＣＡＲの２つ以上の成分は、１つまたは複数のリンカーによって分離される。例えば、少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域を含むＣＡＲにおいて、ＣＡＲ上の第１の標的指向領域は、ＣＡＲ上の第２の標的指向領域からリンカーを介して分離され得る。さらに、ＣＡＲは、リンカーを介して治療用制御物質に連結され得る。リンカーは、本発明のＣＡＲのドメイン／領域のいずれかを一緒に連結する、約１～１００アミノ酸の長さのオリゴまたはポリペプチド領域である。いくつかの実施形態において、リンカーは、例えば、５～１２アミノ酸の長さ、５～１５アミノ酸の長さ、または５～２０アミノ酸の長さであり得る。リンカーは、隣接するタンパク質ドメインが互いに自由に動くように、グリシンおよびセリンのようなフレキシブル残基で構成され得る。例えば、１００アミノ酸よりも長い、より長いリンカーが、本発明の代替の実施形態に関連して使用されてもよく、例えば、２つの隣接するドメインが互いに立体的に干渉しないことを確実にするために選択され得る。本発明において使用され得るリンカーの例には、２Ａリンカー（例えば、Ｔ２Ａ）、２Ａ様リンカー、またはその機能的等価物が挙げられるが、これらに限定されない。
【0075】
治療用制御物質
治療用制御物質は、細胞増殖を制御するか、細胞選択（例えば、本発明のキメラ抗原受容体を発現する細胞を選択する）を促進するか、またはそれらの組み合わせを行う。１つの実施形態において、細胞増殖を制御することとは、細胞増殖を促進するように細胞増殖を上方制御することを含む。別の実施形態において、細胞増殖を制御することとは、細胞増殖を減少させるか、または阻害するように細胞増殖を下方制御することを含む。いくつかの実施形態において、治療用制御物質として役立つ作用物質は、治療的利点をもたらし得る二重特異性キメラ抗原受容体を発現する細胞の濃縮を促進し得る。いくつかの実施形態において、治療用制御物質として役立つ作用物質は、追加の組成物と生化学的に相互作用することができ、その治療用制御物質の機能が制御されるようになる。例えば、ＥＧＦＲｔ（治療用制御物質）は、セツキシマブと生化学的に相互作用することができ、選択、トラッキング、細胞アブレーション、またはそれらの組み合わせにおけるＥＧＦＲｔの機能が制御されるようになる。
治療用制御物質は、細胞増殖を制御するか、細胞選択（例えば、本発明のキメラ抗原受容体を発現する細胞を選択する）を促進するか、またはそれらの組み合わせを行う。１つの実施形態において、細胞増殖を制御することとは、細胞増殖を促進するように細胞増殖を上方制御することを含む。別の実施形態において、細胞増殖を制御することとは、細胞増殖を減少させるか、または阻害するように細胞増殖を下方制御することを含む。いくつかの実施形態において、治療用制御物質として役立つ作用物質は、治療的利点をもたらし得る二重特異性キメラ抗原受容体を発現する細胞の濃縮を促進し得る。いくつかの実施形態において、治療用制御物質として役立つ作用物質は、追加の組成物と生化学的に相互作用することができ、その治療用制御物質の機能が制御されるようになる。例えば、ＥＧＦＲｔ（治療用制御物質）は、セツキシマブと生化学的に相互作用することができ、選択、トラッキング、細胞アブレーション、またはそれらの組み合わせにおけるＥＧＦＲｔの機能が制御されるようになる。
【0076】
治療用制御物質の例には、トランケート型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）、チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ニトロレダクターゼ、キサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ヒトカスパーゼ８、ヒトカスパーゼ９、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、リナマラーゼ／リナマリン／グルコースオキシダーゼ、デオキシリボヌクレオシドキナーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／インドール－３－酢酸（ＩＡＡ）、γグルタミルシステインシンテターゼ、ＣＤ２０／αＣＤ２０、ＣＤ３４／チミジンキナーゼキメラ、ｄｏｘ依存カスパーゼ－２、変異チミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫＳＲ３９）、ＡＰ１９０３／Ｆａｓ系、キメラサイトカイン受容体（ＣＣＲ）、選択マーカー、およびそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、治療用制御物質は、二重特異性キメラ抗原受容体と共発現される。
【0077】
治療用制御物質の機能を制御する薬剤の例には、ハーセプチン、メトトレキサート、セツキシマブ、チミジン類似体（例えばガンシクロビル）、（Ｅ）－５－（２－ブロモビニル）－２'－デオキシウリジン（ＢＶＤＵ）、５－フルロシトシン（ｆｌｕｒｏｃｙｔｏｓｉｎｅ）（５－ＦＣ）、５－（アザリジン（ａｚａｒｉｄｉｎ）－１－イル）－２，４－ジニトロベンズアミド（ＣＢ１９５４）、６－チオグアニン、合成二量体化薬（ｄｉｍｅｒｉｚｉｎｇ ｄｒｕｇ）（例えば、ＡＰ１９０３）、リン酸フルダラビン、リナマリン（ｌｉｎ）、ヌクレオシド類似体（例えば、ＢＶＤＵ、ジフルオロデオキシシチジン（ｄＦｄＣ）、１－β－Ｄ－アラビノフラノシルチミン（アラ－Ｔ））、インドール－３－酢酸（ＩＡＡ）、ｌ－ブチオニン－Ｓ，Ｒ－スルホキシイミン（ＢＳＯ）、リツキシマブ（ＲＴＸ）、ドキシサイクリン、チロシンキナーゼ阻害剤、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数が挙げられるが、これらに限定されない。これらの薬剤は、治療用制御物質の使用前、使用中、または使用後に投与され得る。
【0078】
上述のように、本発明のＣＡＲは、単一ポリペプチド鎖として合成され得る。ＣＡＲが二重特異性ＣＡＲの場合、そのＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列は、例えば、Ｎ末端からＣ末端方向で以下の配置であり得る：Ｎ末端シグナル配列－抗原特異的標的指向領域１－リンカー－抗原特異的標的指向領域２－細胞外スペーサードメイン－膜貫通ドメイン－共刺激ドメイン－細胞内シグナル伝達ドメイン。一実施形態において、そのようなＣＡＲは、２つ以上の共刺激ドメインを含み得る。
【0079】
代替的に、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列は、Ｎ末端からＣ末端方向で以下の配置であり得る：Ｎ末端シグナル配列－抗原特異的標的指向領域１－リンカー－抗原特異的標的指向領域２－膜貫通ドメイン－共刺激ドメイン－細胞内シグナル伝達ドメイン。一実施形態において、そのようなＣＡＲは、２つ以上の共刺激ドメインを含み得る。
【0080】
ＣＡＲが２つを超える抗原特異的標的指向領域を含む場合、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列は、Ｎ末端からＣ末端方向で以下の配置であり得る：Ｎ末端シグナル配列－抗原特異的標的指向領域１－リンカー－抗原特異的標的指向領域２－リンカー－（抗原特異的標的指向領域）ｎ－膜貫通ドメイン－共刺激ドメイン－細胞内シグナル伝達ドメイン。そのようなＣＡＲは、細胞外スペーサードメインをさらに含み得る。各抗原特異的標的指向領域は、リンカーによって分離され得る。一実施形態において、そのようなＣＡＲは、２つ以上の共刺激ドメインを含み得る。
【0081】
本発明は、細胞外スペーサードメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む、本発明の例となるＣＡＲの主鎖の核酸配列を提供する。具体的には、ＣＡＲの例となる主鎖は、Ｎ末端からＣ末端の方向で、ＩｇＧ４ヒンジ－ＣＤ２８ｔｍ－４１ＢＢ－ＣＤ３ζを含み得、細胞外スペーサードメインはＩｇＧ４ヒンジ領域であり、膜貫通ドメインはＣＤ２８由来の膜貫通領域であり、共刺激ドメインは４－１ＢＢ由来であり、細胞内シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζ鎖由来である（図７）。少なくとも２つ以上の抗原特異的標的指向領域は、ＩｇＧ４ヒンジに対してＮ末端に挿入され得る。
【0082】
本発明は、ＣＡＲがＣＤ１９およびＣＤ２０に特異的である、本発明の例となる実施形態の核酸配列を提供する。１つの実施形態において、二重特異性抗ＣＤ１９ｘＣＤ２０ ＣＡＲをコードする配列が、図３、８、または１０に示される。別の実施形態において、二重特異性抗ＣＤ１９ｘＣＤ２０ ＣＡＲをコードする配列が、図４、９、または１１に示される。この例となる実施形態において、二重特異性ＣＡＲはＣＤ１９およびＣＤ２０に特異的なｓｃＦｖを含み、各ｓｃＦｖは、リンカーによって分離されており、膜貫通ドメインを介して共刺激ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインへと結合される細胞外スペーサードメインに結合されている。例となるＣＡＲは１組のｓｃＦｖ配列を示したが、ＣＤ１９およびＣＤ２０に特異的な任意のｓｃＦｖが使用され得る。特定の実施形態において、ＣＤ１９およびＣＤ２０に特異的な二重特異性ＣＡＲは、ＣＤ１９ｓｃＦｖ－Ｇｌｙ４Ｓｅｒリンカー－ＣＤ２０ｓｃＦｖ－ＩｇＧ４－ヒンジ－ＣＤ２８ｔｍ－４１ＢＢ（ｃｙｔｏ）－ζ（ｃｙｔｏ）であり、図３および４に示される配列によってコードされる。この二重特異性ＣＡＲは、Ｇｌｙ４Ｓｅｒリンカーによって連結されたＣＤ１９およびＣＤ２０に特異的な単鎖Ｆｖフラグメント、ＩｇＧ４ヒンジ細胞外スペーサードメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、４１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζ鎖由来の細胞質ドメインを含む。
【0083】
別の実施形態において、ＣＤ１９およびＣＤ２０に特異的な二重特異性ＣＡＲは、ＣＤｌ９ｓｃＦｖ－Ｇｌｙ４ｓｅｒリンカー－ＣＤ２０ｓｃＦｖ－ｈｕｌｇＧ４－ヒンジＣＨ２ＣＨ３－ＣＤ２８ｔｍ／ｃｙｔｏ－４１ＢＢ－ζを含む（図９～１０）。この二重特異性ＣＡＲは、Ｇｌｙ４Ｓｅｒリンカーによって連結されたＣＤ１９およびＣＤ２０に特異的な単鎖Ｆｖフラグメント、ヒトＩｇＧ４ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３細胞外スペーサードメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ共刺激ドメイン、ならびにＣＤ３ζ鎖由来の細胞質ドメインを含む。
【0084】
さらなる実施形態において、ＣＤ１９およびＣＤ２０に特異的な二重特異性ＣＡＲは、ＣＤ１９－Ｇｌｙ４ｓｅｒリンカー－ＣＤ２０ｓｃＦｖ－ＣＤ８αヒンジ－ＣＤ８αＴＭ－４１ＢＢ共刺激－ζｃｙｔｏ（図１１～１２）である。この二重特異性ＣＡＲは、Ｇｌｙ４Ｓｅｒリンカーによって連結されたＣＤ１９およびＣＤ２０に特異的な単鎖Ｆｖフラグメント、ＣＤ８αヒンジ細胞外スペーサードメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、４１ＢＢ共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζ鎖由来の細胞質ドメインを含む。
【0085】
トランケート型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）
ヒト上皮成長因子受容体（ｈｕＥＧＦＲ）（ヒトにおけるＥＧＦＲ；ＥｒｂＢ－１、ＨＥＲ１）は、造血およびリンパ球新生系の細胞によって発現されることがない、成長因子受容体のＥｒｂＢファミリーの受容体チロシンキナーゼである。リガンド（ＥＧＦ、ＴＧＦ－α）結合は、受容体チロシンキナーゼ不活性単量体の活性ホモ二量体への移行の結果として、ＥＧＦＲのＮ末端細胞外ドメインＩおよびＩＩ内で生じる。
ヒト上皮成長因子受容体（ｈｕＥＧＦＲ）（ヒトにおけるＥＧＦＲ；ＥｒｂＢ－１、ＨＥＲ１）は、造血およびリンパ球新生系の細胞によって発現されることがない、成長因子受容体のＥｒｂＢファミリーの受容体チロシンキナーゼである。リガンド（ＥＧＦ、ＴＧＦ－α）結合は、受容体チロシンキナーゼ不活性単量体の活性ホモ二量体への移行の結果として、ＥＧＦＲのＮ末端細胞外ドメインＩおよびＩＩ内で生じる。
【0086】
ＥＧＦＲの細胞外ドメインＩＩＩは、抗体（例えば、セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ）、ＩｇＧ１キメラ抗体）の結合部位を含む。ヒトＥＧＦＲは、例えば、細胞外ドメインＩＩＩ、ＩＶ、またはそれらの組み合わせ内に無傷の抗体結合部位（例えば、セツキシマブ結合部位）を保持する一方、ドメインＩおよびＩＩの除去、ならびにその細胞質側末端の欠失によるシグナル伝達活性が欠けていることによって、リガンド（ＥＧＦ、ＴＧＦ－α）に結合できなくなり得ると考えられる（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ－ｅｎｃｏｄｅｄ ｃｅｌｌ ｓｕｒｆａｃｅ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ｉｎ ｖｉｖｏ ｔｒａｃｋｉｎｇ，ａｎｄ ａｂｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｃｅｌｌｓ Ｂｌｏｏｄ １１８（５）１２５５－１２６３）。
【0087】
本明細書に記載のトランケート型ＥＧＦＲｔポリペプチドは、細胞ベースの療法の遺伝子改変のために少なくとも３つの使用法を有する：エクスビボ細胞精製、インビボ細胞トラッキング、および細胞アブレーション。一実施形態において、治療用制御物質として本発明のＣＡＲと使用するためのＥＧＦＲｔは、ＥＧＦＲ特異的ｓｉＲＮＡ、ＥＧＦＲを標的とする小分子、抗ＥＧＦＲ抗体、またはそれらの組み合わせのうちのいずれか１つまたは複数に結合する。別の実施形態において、ＥＧＦＲｔは、図１２もしくは１３に示される配列、または図１２もしくは１３に示される配列と約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、もしくは約９５％相同である配列を含む。
【0088】
本発明の一実施形態において、ｈｕＥＧＦＲｔは、ＣＡＲを発現する細胞を精製するか（例えば、エクスビボ細胞精製）、ＣＡＲを発現する細胞をトラッキングするか（例えば、インビトロもしくはインビボ細胞トラッキング）、または必要に応じて細胞アブレーションを誘起することによって、ＣＡＲを発現する細胞を制御する（例えば、インビボもしくはインビトロもしくはエクスビボ）ように、本発明のＣＡＲと共発現され得る。１つの実施形態において、ＣＡＲは、二重特異性ＣＡＲである。
【0089】
キメラサイトカイン受容体（ＣＣＲ）
養子免疫療法における外因性γｃサイトカインの使用の限界に基づき、本発明は、内因性γｃサイトカインシグナル伝達機構を持つＴ細胞を提供する。強制構成的キメラサイトカイン受容体ＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒβ（ＣγＣＲ２）およびＩＬ－７Ｒα（ＣγＣＲ７）受容体シグナルの有用性を比較した。以下に記載されるように、キメラサイトカイン受容体は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の生存、残存、およびインビボ生着を改善する能力を有する。
養子免疫療法における外因性γｃサイトカインの使用の限界に基づき、本発明は、内因性γｃサイトカインシグナル伝達機構を持つＴ細胞を提供する。強制構成的キメラサイトカイン受容体ＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒβ（ＣγＣＲ２）およびＩＬ－７Ｒα（ＣγＣＲ７）受容体シグナルの有用性を比較した。以下に記載されるように、キメラサイトカイン受容体は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の生存、残存、およびインビボ生着を改善する能力を有する。
【0090】
したがって、本発明の一実施形態において、本発明のＣＡＲは、ＣＣＲと共発現され得る。例えば、二重特異性ＣＡＲは、ＥＧＦＲｔおよびＣＣＲと共発現され得る。代替的に、二重特異性ＣＡＲは、ＣＣＲと共発現され得る。キメラサイトカイン受容体の例には、ＩＬ－７サイトカイン－リンカー－ＩＬ７Ｒα、ＩＬ－７サイトカイン－リンカー－ＩＬ－７Ｒαの細胞外ドメイン－ＩＬ－７Ｒαの膜貫通ドメイン－ＩＬ－２Ｒβの細胞質ドメイン、ＩＬ－７サイトカイン－リンカー－ＩＬ２Ｒβが挙げられるが、これらに限定されない。
【0091】
ＩＬ－７サイトカイン－リンカー－ＩＬ７Ｒαを含むＣＣＲは、ＩＬ－７サイトカインのＮ末端に結合されたＮ末端シグナル配列を含み、ＩＬ－７サイトカインはリンカーを介してＩＬ－７Ｒα（ＩＬ－７受容体のα鎖）の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインに連結されている。
【0092】
ＩＬ－７サイトカイン－リンカー－ＩＬ－７Ｒαの細胞外ドメイン－ＩＬ－７Ｒαの膜貫通ドメイン－ＩＬ－２Ｒβの細胞質ドメインを含むＣＣＲは、ＩＬ－７サイトカインのＮ末端に結合されたＮ末端シグナル配列を含み、ＩＬ－７サイトカインはリンカーを介してＩＬ－７Ｒαの細胞外ドメインおよび膜貫通ドメイン、ならびにＩＬ－２Ｒβ（ＩＬ－２受容体のβ鎖）の細胞質ドメインに連結されている。
【0093】
ＩＬ－７サイトカイン－リンカー－ＩＬ２Ｒβを含むＣＣＲは、ＩＬ－７サイトカインのＮ末端に結合されたＮ末端シグナル配列を含み、ＩＬ－７サイトカインはリンカーを介してＩＬ－２Ｒβの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインに連結されている。
【0094】
ジヒドロキシ葉酸受容体（ＤＨＦＲ）
治療用導入遺伝子と、リンパ球毒性（ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｃ）薬物に対する抵抗性を与える薬物抵抗性導入遺伝子とを共発現するためのＴ細胞の遺伝子修飾は、インビボおよびエクスビボの両方で治療用細胞を選択する機会を提供する。変異したヒト酵素導入遺伝子である、ジヒドロ葉酸レダクターゼ二重変異体（ＤＨＦＲＦＳ；Ｌ２２Ｆ、Ｆ３１Ｓ）は、改変されたＴ細胞にメトトレキサート（ＭＴＸ）に対する抵抗性を与え、Ｂ細胞系腫瘍細胞を特異的に標的とするＣＤ１９特異性キメラ抗原受容体（ＣＤ１９ＣＡＲ）を共発現する細胞の選択を可能にする。
治療用導入遺伝子と、リンパ球毒性（ｌｙｍｐｈｏｔｏｘｉｃ）薬物に対する抵抗性を与える薬物抵抗性導入遺伝子とを共発現するためのＴ細胞の遺伝子修飾は、インビボおよびエクスビボの両方で治療用細胞を選択する機会を提供する。変異したヒト酵素導入遺伝子である、ジヒドロ葉酸レダクターゼ二重変異体（ＤＨＦＲＦＳ；Ｌ２２Ｆ、Ｆ３１Ｓ）は、改変されたＴ細胞にメトトレキサート（ＭＴＸ）に対する抵抗性を与え、Ｂ細胞系腫瘍細胞を特異的に標的とするＣＤ１９特異性キメラ抗原受容体（ＣＤ１９ＣＡＲ）を共発現する細胞の選択を可能にする。
【0095】
一実施形態において、本発明のＣＡＲ（例えば二重特異性ＣＡＲ）は、ＤＨＦＲ（例えば、変異ＤＨＦＲ）と共発現され得る。さらなる実施形態において、二重特異性ＣＡＲは、ＥＧＦＲｔ、ＣＣＲ、およびＤＨＦＲ（変異ＤＨＦＲを含む）と共発現され得る。代替的に、二重特異性ＣＡＲは、ＥＧＦＲｔおよびＤＨＦＲ（変異ＤＨＦＲを含む）と共発現され得る。
【0096】
本発明のＣＡＲとともに使用され得る他の選択マーカーには、メチル化－ＤＮＡ－タンパク質－システインメチルトランスフェラーゼ（ＭＤＭＴ）、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼＩＩ（ＩＭＤＨＰ２）、またはそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。ＭＤＭＴは、細胞を化学療法に対して抵抗性にし、ゆえに化学療法とＴ細胞療法との相乗作用が望ましい場合に使用され得る。
【0097】
本発明のＣＡＲをコードするベクターがまた本明細書に提供される。ＣＡＲをコードするベクターはまたＥＧＦＲｔもコードする。いくつかの実施形態において、ＣＡＲおよびＥＧＦＲｔをコードするベクターはまた、ＣＣＲまたはＤＨＦＲ（例えば、変異ＤＨＦＲ）もコードする。他の実施形態において、ＣＡＲおよびＥＧＦＲｔをコードするベクターはまた、ＣＣＤおよびＤＨＦＲ（例えば、変異ＤＨＦＲ）もコードする。いくつかの特定の実施形態において、ベクターは、二重特異性ＣＡＲおよびＥＧＦＲｔ、二重特異性ＣＡＲおよびＥＧＦＲｔおよびＣＣＲ、二重特異性ＣＡＲおよびＥＧＦＲｔおよびＤＨＦＲ（例えば、変異ＤＨＦＲ）、または二重特異性ＣＡＲおよびＥＧＦＲｔおよびＣＣＲおよびＤＨＦＲ（例えば、変異ＤＨＦＲ）をコードし得る。本発明のＣＡＲを発現するために使用され得るベクターには、レンチウイルスベクター、γレトロウイルスベクター、泡沫状ウイルスベクター、ＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター、改変ハイブリッドウイルス、裸のＤＮＡ（Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ、Ｐｉｇｇｙｂａｋ等のトランスポゾン媒介ベクター、Ｐｈｉ３１等のインテグラーゼが含まれるが、これらに限定されない）が含まれるが、これらに限定されない。
【0098】
本発明の一例となる実施形態において、本明細書に開示されるＣＤ１９およびＣＤ２０に特異的な二重特異性ＣＡＲは、図５に例示されるように、レンチウイルスベクターによって発現される。
【0099】
本発明の遺伝子改変細胞
本発明はまた、本発明のＣＡＲを含みかつ安定して発現する遺伝子改変細胞を提供する。遺伝子改変細胞によって発現されるＣＡＲは、少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、１つまたは複数の共刺激ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列はまた、Ｎ末端シグナル配列も含み得る。一実施形態において、ＣＡＲは二重特異性ＣＡＲである。少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域、細胞外スペーサードメイン、膜貫通ドメイン、１つまたは複数の共刺激ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインのそれぞれは上述されている。抗原特異的標的指向ドメインは、ＭＨＣ非拘束的な様式で、その様式ではＴ細胞受容体によって通常は結合されない抗原に特異的に結合することが可能である。
本発明はまた、本発明のＣＡＲを含みかつ安定して発現する遺伝子改変細胞を提供する。遺伝子改変細胞によって発現されるＣＡＲは、少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、１つまたは複数の共刺激ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列はまた、Ｎ末端シグナル配列も含み得る。一実施形態において、ＣＡＲは二重特異性ＣＡＲである。少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域、細胞外スペーサードメイン、膜貫通ドメイン、１つまたは複数の共刺激ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインのそれぞれは上述されている。抗原特異的標的指向ドメインは、ＭＨＣ非拘束的な様式で、その様式ではＴ細胞受容体によって通常は結合されない抗原に特異的に結合することが可能である。
【0100】
一実施形態において、本発明のＣＡＲ（例えば、二重特異性ＣＡＲ）を発現する遺伝子改変細胞は、ＥＧＦＲｔを共発現する。さらなる実施形態において、ＣＡＲ（例えば、二重特異性ＣＡＲ）を発現する遺伝子改変細胞は、ＥＧＦＲｔおよびＣＣＲを共発現する。さらなる実施形態において、ＣＡＲ（例えば、二重特異性ＣＡＲ）を発現する遺伝子改変細胞は、ＥＧＦＲｔおよびＤＨＦＲ（例えば、変異ＤＨＦＲ）を共発現する。別の実施形態において、ＣＡＲ（例えば、二重特異性ＣＡＲ）を発現する遺伝子改変細胞は、ＥＧＦＲｔ、ＣＣＲ、およびＤＨＦＲ（例えば、変異ＤＨＦＲ）を共発現する。
【0101】
遺伝子改変細胞は、少なくとも２つの異なる標的抗原に特異的な、少なくとも２つの抗原特異的標的指向領域を有するＣＡＲを発現する。１つの実施形態において、抗原特異的標的指向領域は、標的特異的抗体またはそれらの機能的等価物もしくはフラグメントもしくは誘導体を含む。抗原特異的抗体は、抗体のＦａｂフラグメントまたは抗体の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）であり得る。
【0102】
本発明のＣＡＲを含みかつ発現し得る遺伝子改変細胞には、治療に関連した成果をもたらすことができる、Ｔ－リンパ球（Ｔ細胞）、ナイーブＴ細胞（ＴＮ）、メモリーＴ細胞（例えば、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリー細胞（ＴＥＭ））、ナチュラルキラー細胞、造血幹細胞および／または多能性胚性／誘導性幹細胞が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、遺伝子改変細胞は自家細胞である。例として、本発明の個々のＴ細胞は、ＣＤ４＋／ＣＤ８－、ＣＤ４－／ＣＤ８＋、ＣＤ４－／ＣＤ８－、またはＣＤ４＋／ＣＤ８＋であり得る。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋／ＣＤ８－およびＣＤ４－／ＣＤ８＋細胞の混合群、または単一クローンの一群であり得る。本発明のＣＤ４＋Ｔ細胞は、標的抗原を発現する細胞（例えば、ＣＤ２０＋および／またはＣＤ１９＋腫瘍細胞）とインビトロで共培養された場合、ＩＬ－２、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、および他のＴ細胞エフェクターサイトカインを産生し得る。本発明のＣＤ８＋Ｔ細胞は、抗原特異的標的細胞とインビトロで共培養された場合、その標的細胞を溶解し得る。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ６２Ｌ＋ナイーブ細胞、ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ＋セントラルメモリー細胞、ＣＤ６２Ｌ－エフェクターメモリー細胞、またはそれらの組み合わせうちのいずれか１つまたは複数であり得る。（Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｖｉｒｕｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００９ ２１（２）２２４－２３２）。
【0103】
遺伝子修飾細胞は、本発明のＣＡＲをコードするＤＮＡを細胞に安定してトランスフェクトすることによって産生され得る。本発明のＣＡＲ（例えば、二重特異性ＣＡＲ）をコードするＤＮＡはまた、ＥＧＦＲｔ、ＣＣＲ、および／またはＤＨＦＲ（例えば、変異ＤＨＦＲ）もコードし得る。１つの実施形態において、第１のポリヌクレオチドはＣＡＲ（例えば、二重特異性ＣＡＲ）をコードし、ＩＲＥＳ配列または切断可能なリンカーをコードするポリヌクレオチドを介して、ＥＧＦＲｔをコードする第２のポリヌクレオチドに連結される。別の実施形態において、第１のポリヌクレオチドはＣＡＲ（例えば、二重特異性ＣＡＲ）をコードし、ＩＲＥＳ配列または切断可能なリンカーをコードするポリヌクレオチドを介して、ＥＧＦＲｔをコードする第２のポリヌクレオチドに連結され、第１もしくは第２のポリヌクレオチドは、同様にＩＲＥＳ配列または切断可能なリンカーをコードするポリヌクレオチドを介して、ＣＣＲまたはＤＨＦＲ（例えば、変異ＤＨＦＲ）をコードする第３のポリヌクレオチドに連結される。さらなる実施形態において、第１のポリヌクレオチドはＣＡＲ（例えば、二重特異性ＣＡＲ）をコードし、ＩＲＥＳ配列または切断可能なリンカーをコードするポリヌクレオチドを介して、ＥＧＦＲｔをコードする第２のポリヌクレオチドに連結され、第１および第２のポリヌクレオチドは、ＩＲＥＳ配列または切断可能なリンカーをコードするポリヌクレオチドを介して、ＣＣＲをコードする第３のポリヌクレオチドおよびＤＨＦＲ（例えば、変異ＤＨＦＲ）をコードする第４のポリヌクレオチドに連結される。ウイルスベクターは一般的に異種遺伝子を細胞（例えば、Ｔ細胞）に運ぶために使用される。遺伝子修飾細胞を生成するために使用され得るウイルスベクターの例には、ＳＩＮレンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、泡沫状ウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、および／またはプラスミドトランスポゾン（例えば、ｓｌｅｅｐｉｎｇ ｂｅａｕｔｙトランスポゾンシステム）が挙げられるが、これらに限定されない。
【0104】
種々の方法は、本発明のＣＡＲを発現する安定したトランスフェクタントを生成する。１つの実施形態において、細胞に安定してトランスフェクトしかつ細胞を向け直す方法は、裸のＤＮＡを使用するエレクトロポレーションによるものである。裸のＤＮＡを使用することによって、再配向細胞を生成するために必要とされる時間は、著しく減少され得る。本発明のＣＡＲをコードする裸のＤＮＡを使用して細胞を遺伝子改変するためのさらなる方法には、（例えば、リン酸カルシウム、デンドリマー、リポソーム、および／もしくは陽イオンポリマーを使用する）化学形質転換法、非化学形質転換法（例えば、エレクトロポレーション、光学形質転換、遺伝子エレクトロトランスファー、および／もしくはハイドロダイナミックデリバリー）、ならびに／または粒子ベースの方法（例えば、遺伝子銃を使用するインペールフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）および／もしくはマグネトフェクション（ｍａｇｎｅｔｏｆｅｃｔｉｏｎ））が含まれるが、これらに限定されない。単一の統合された非再配列ベクターおよびＣＡＲの発現の存在を示すトランスフェクトされた細胞は、エクスビボで拡大され得る。１つの実施形態において、エクスビボでの拡大のために選択された細胞はＣＤ８＋であり、抗原特異的標的細胞を特異的に認識しかつ溶解する能力を示す。
【0105】
ウイルス形質導入法もまた、本発明のＣＡＲを発現する再配向細胞を生成するために使用され得る。本発明の二重特異性ＣＡＲを発現する遺伝子修飾細胞を生成するために使用され得る細胞型には、治療に関連した成果をもたらすことができるＴリンパ球（Ｔ細胞）、ナチュラルキラー細胞、造血幹細胞、および／または多能性胚性／誘導性幹細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【0106】
適切な条件下での抗原によるＴ細胞の刺激は、細胞の増殖（拡大）および／またはＩＬ－２の産生をもたらす。本発明のＣＡＲを含む細胞は、１つまたは複数の抗原の、ＣＡＲの抗原特異的標的指向領域への結合に応答して、数を拡大する。本発明はまた、ＣＡＲを発現する細胞を作製しかつ拡大させる方法を提供する。その方法は、ＣＡＲを発現するベクターを細胞にトランスフェクトするか、または形質導入することと、該細胞を、受容体に対する標的抗原、組換え標的抗原、または抗体を発現する細胞で刺激することとを含み、前記細胞は、Ｔ細胞を作製しかつ拡大させるように増殖する。一実施形態において、細胞は、治療に関連した成果をもたらすことができる、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、または多能性胚性／誘導性幹細胞のうちのいずれか１つまたは複数であり得る。
【0107】
一例となる実施形態において、本発明の遺伝子改変細胞は、ＣＤ１９およびＣＤ２０抗原に特異的な二重特異性ＣＡＲを発現する。さらなる実施形態において、遺伝子改変Ｔ細胞は、二重特異性ＣＡＲ ＣＤｌ９ｓｃＦｖ－Ｇｌｙ４ｓｅｒ－リンカー－ＣＤ２０ｓｃＦｖ－ｈｕｌｇＧ４－ヒンジ－ＣＤ２８－４１ＢＢ（ｃｙｔｏ）－ζ（ｃｙｔｏ）、またはＣＤｌ９ｓｃＦｖ－Ｇｌｙ４ｓｅｒ－リンカー－ＣＤ２０ｓｃＦｖ－ｈｕｌｇＧ４－ヒンジＣＨ２ＣＨ３－ＣＤ２８ｔｍ／ｃｙｔｏ－ζ、またはＣＤ１９－Ｇｌｙ４ｓｅｒリンカー－ＣＤ２０ｓｃＦｖ－ＣＤ８αヒンジ－ＣＤ８αＴＭ－４１ＢＢ共刺激－ζｃｙｔｏを発現する。
【0108】
一例となる実施形態において、本発明は、ＣＤ１９特異的およびＣＤ２０特異的ＣＡＲを発現するＴ細胞を作製しかつ拡大させる方法を提供する。その方法は、レンチウイルスを使用して、ＣＤ１９およびＣＤ２０二重特異性ＣＡＲを発現するベクターを、ＣＤ３ｘＣＤ２８ビーズ刺激精製セントラルメモリーＴ細胞（末梢血由来のＴ細胞等）に形質導入することと、ｒｈｕＩＬ－２および／またはＩＬ－１５の存在下でＴ細胞を成長させることと、Ｔ細胞を、ＣＤ１９＋およびＣＤ２０＋細胞、組換えＣＤ１９およびＣＤ２０、または受容体に対する抗体で再度刺激することとを含み、Ｔ細胞は、ＣＤ１９特異的およびＣＤ２０特異的Ｔ細胞を作製しかつ拡大させるように増殖する。
【0109】
本発明の治療方法
本発明のＣＡＲを使用して、抗原消失エスケープ変異体から生じる治療の失敗を克服し、既存の療法に対する抵抗性を低減し、および／または本ＣＡＲによって標的とされる抗原と関連している疾患を治療することができる。
本発明のＣＡＲを使用して、抗原消失エスケープ変異体から生じる治療の失敗を克服し、既存の療法に対する抵抗性を低減し、および／または本ＣＡＲによって標的とされる抗原と関連している疾患を治療することができる。
【0110】
したがって、本発明はまた、本発明のＣＡＲによって標的とされる抗原と関連している疾患の治療を必要とする対象における、該疾患を治療するための方法も提供する。その方法は、本発明のＣＡＲを含む組成物を提供すること、ならびに有効量のその組成物を、対象における抗原と関連している疾患を治療するように投与することを含む。
【0111】
本発明はまた、抗原消失エスケープ変異体から生じる治療の失敗を克服することを必要とする対象における疾患状態（例えば、Ｂ細胞疾患）において、該治療の失敗を克服するための方法も提供する。その方法は、本発明のＣＡＲを含む組成物を提供すること、ならびに有効量のその組成物を、対象における抗原と関連している疾患を治療するように投与することを含む。
【0112】
いくつかの実施形態において、その組成物は、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、ＣＡＲを含むタンパク質、またはＣＡＲを含む遺伝子修飾細胞を含む。別の実施形態において、組成物の遺伝子修飾細胞は、治療に関連した成果をもたらすことができるＴリンパ球（Ｔ細胞）、ナイーブＴ細胞（ＴＮ）、メモリーＴ細胞（例えば、セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ）、エフェクターメモリー細胞（ＴＥＭ））、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、または多能性胚性／誘導性幹細胞であり、それらは本発明のＣＡＲを発現する。本発明の組成物は、単独で、または既存の療法と併せて投与され得る。他の療法が併せて使用される場合、本発明の組成物は、他の既存の療法と同時に、または連続して投与され得る。
【0113】
薬学的組成物
種々の実施形態において、本発明は、薬学的に許容される賦形剤および治療的有効量の本発明のＣＡＲ（例えば、二重特異性ＣＡＲ）を含む、薬学的組成物を提供する。組成物中の本発明のＣＡＲは、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、ＣＡＲを含むタンパク質、またはＣＡＲを含む遺伝子修飾細胞のいずれか１つまたは複数であり得る。本組成物は、ＥＧＦＲｔ、ＣＣＲ、および／もしくはＤＨＦＲ（例えば、変異ＤＨＦＲ）をコードするポリヌクレオチド、ＥＧＦＲｔ、ＣＣＲ、および／もしくはＤＨＦＲを含みＣＡＲと共発現されるタンパク質、またはＣＡＲを発現しかつＥＧＦＲｔ、ＣＣＲおよび／もしくはＤＨＦＲを共発現する遺伝子修飾細胞をさらに含み得る。「薬学的に許容される賦形剤」は、概して安全、非毒性、および望ましい薬学的組成物の調製において有用である賦形剤を意味し、獣医学的使用、ならびにヒトへの薬学的使用に許容される賦形剤を含む。そのような賦形剤は、固体、液体、半固体、またはエアロゾル組成物の場合には気体であり得る。
種々の実施形態において、本発明は、薬学的に許容される賦形剤および治療的有効量の本発明のＣＡＲ（例えば、二重特異性ＣＡＲ）を含む、薬学的組成物を提供する。組成物中の本発明のＣＡＲは、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、ＣＡＲを含むタンパク質、またはＣＡＲを含む遺伝子修飾細胞のいずれか１つまたは複数であり得る。本組成物は、ＥＧＦＲｔ、ＣＣＲ、および／もしくはＤＨＦＲ（例えば、変異ＤＨＦＲ）をコードするポリヌクレオチド、ＥＧＦＲｔ、ＣＣＲ、および／もしくはＤＨＦＲを含みＣＡＲと共発現されるタンパク質、またはＣＡＲを発現しかつＥＧＦＲｔ、ＣＣＲおよび／もしくはＤＨＦＲを共発現する遺伝子修飾細胞をさらに含み得る。「薬学的に許容される賦形剤」は、概して安全、非毒性、および望ましい薬学的組成物の調製において有用である賦形剤を意味し、獣医学的使用、ならびにヒトへの薬学的使用に許容される賦形剤を含む。そのような賦形剤は、固体、液体、半固体、またはエアロゾル組成物の場合には気体であり得る。
【0114】
種々の実施形態において、本発明に従う薬学的組成物は、任意の投与経路を介する送達用に製剤化され得る。「投与経路」とは、エアロゾル、経鼻、経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、吸入、経粘膜、経皮、非経口、埋め込み型ポンプ、連続注入、局所適用、カプセル、および／または注射を含むが、これらに限定されない、当該技術分野で既知の任意の投与経路を指し得る。
【0115】
本発明に従う薬学的組成物はまた、任意の薬学的に許容される担体を含有してもよい。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、ある組織、臓器、または身体の部分から、別の組織、臓器、または身体の部分へと関心対象の化合物を運ぶか、または輸送することに関与する、薬学的に許容される材料、組成物、または媒介物を指す。例えば、担体は、液体もしくは固体フィラー、希釈剤、賦形剤、溶媒、もしくはカプセル封入材料、またはそれらの組み合わせであり得る。担体の各成分は、それが製剤の他の成分と適合性がなければならないという点で、「薬学的に許容され」なければならない。それはまた、その治療的利益を過度に上回る、毒性、過敏、アレルギー反応、免疫原性、または任意の他の合併症の危険性を有してはならないという意味で、それが接触し得る任意の組織または臓器と接触する使用に適していなければならない。
【0116】
本発明に従う薬学的組成物はまた、経口投与用にカプセルに封入されるか、錠剤化されるか、または乳剤もしくはシロップに調製されてもよい。薬学的に許容される固形もしくは液体担体が、組成物を増強するか、もしくは安定させるために、または組成物の調製を促進するために添加され得る。液体担体には、シロップ、落花生油、オリーブ油、グリセリン、生理食塩水、アルコール、および水が含まれる。固形担体には、デンプン、ラクトース、硫酸カルシウム、二水和物、白土、ステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸、タルク、ペクチン、アカシア、寒天、またはゼラチンが含まれる。担体にはまた、単独で、または蝋とともに、モノステアリン酸グリセリンもしくはジステアリン酸グリセリン等の持続放出材料も含まれる。
【0117】
薬学的調製物は、必要に応じて、錠剤形成のための製粉、混合、造粒、および加圧、または硬性ゼラチンカプセル形成のための製粉、混合、および充填に関与する薬学の従来の技術に従って作製される。液体担体を使用する場合、調製物は、シロップ、エリキシル剤、乳剤、または水性もしくは非水性懸濁液の形態である。そのような液体製剤は、直接経口投与または軟性ゼラチンカプセル内に充填されて投与されてもよい。
【0118】
本発明に従う薬学的組成物は、治療的有効量で送達され得る。正確な治療的有効量は、所与の対象における治療の有効性の観点において最も効果的な結果をもたらす組成物の量である。この量は、治療化合物の特性（活性度、薬物動態、薬力学、および生物学的利用能を含む）、対象の生理的状態（年齢、性別、疾患タイプおよび段階、全身健康状態、所与の投薬量に対する応答性、および薬物療法のタイプを含む）、製剤物中の薬学的に許容される担体の性質、ならびに投与経路を含むが、これらに限定されない、様々な要因に応じて異なる。臨床および薬理学分野の技術者は、通例の実験方法を通して、例えば、化合物の投与に対する対象の反応を監視し、それに応じて投薬量を調整することによって治療的有効量を決定することができる。さらなるガイダンスは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄ．２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ ＰＡ，ＵＳＡ）（２０００）を参照されたい。
【実施例0119】
特許請求される発明をより良く例示するために以下の実施例が提供され、本発明の範囲を限定するとは解釈されない。特定の材料が言及される範囲に関して、それは単に例示の目的であり、本発明を限定するとは意図されない。当業者は、独創的な能力を行使させることなく、かつ本発明の範囲から逸脱することなく、同等の手段または反応物を開発し得る。
【0120】
実施例１
図１は、本発明の二重特異性キメラ抗原受容体の略図である。本発明の一例となる実施形態において、図２は、二重特異性抗ＣＤ１９ｘ抗ＣＤ２０二重特異性ＣＡＲの成分を示す。図２はまた、ｅｐＨＩＶ－７レンチウイルスベクタートランスファープラスミドにパッケージ化された完全ｃＤＮＡの概略図も示す。図３および４は、一例となる二重特異性ＣＡＲ、すなわち、ＧＭＣＳＦｓｓ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ－Ｇｌｙ４Ｓｅｒ１リンカー－ＣＤ２０ｓｃＦｖ－ＩｇＧ４ヒンジ－ＣＤ２８ｔｍ－４１ＢＢζ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７の核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
図１は、本発明の二重特異性キメラ抗原受容体の略図である。本発明の一例となる実施形態において、図２は、二重特異性抗ＣＤ１９ｘ抗ＣＤ２０二重特異性ＣＡＲの成分を示す。図２はまた、ｅｐＨＩＶ－７レンチウイルスベクタートランスファープラスミドにパッケージ化された完全ｃＤＮＡの概略図も示す。図３および４は、一例となる二重特異性ＣＡＲ、すなわち、ＧＭＣＳＦｓｓ－ＣＤ１９ｓｃＦｖ－Ｇｌｙ４Ｓｅｒ１リンカー－ＣＤ２０ｓｃＦｖ－ＩｇＧ４ヒンジ－ＣＤ２８ｔｍ－４１ＢＢζ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７の核酸配列およびアミノ酸配列を示す。
【0121】
実施例２
図５は、本発明の例となるＣＡＲのベクター構築物、すなわち、ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ＣＤ２０ｓｃＦｖ－ＩｇＧ４－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ２８共刺激－ＣＤ３ζ導入遺伝子構築物を示す概略図である。過去にＧｉｂｓｏｎらによって記述されたワンステップ等温ＤＮＡアセンブリ法を使用して、ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ＣＤ２０ｓｃＦｖ－ＩｇＧ４－ＣＤ２８ｔｍＣＤ２８共刺激－ＣＤ３ζ導入遺伝子を構築した（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｕｐｔｏ ｓｅｖｅｒａｌ ｈｉｎｄｒｅｄ ｋｉｌｏｂａｓｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００９；６：３４３－３４５）。ＣＤ１９ ｓｃＦｖ構築物のＶＬおよびＶＨドメインを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、以前に記述されたＣＤ１９ＣＡＲ－ＣＤ２８－ζ導入遺伝子から配列決定した。Ｓｃｈｍｉｔｚ Ｎ，Ｄｒｅｇｅｒ Ｐ，Ｇｌａｓｓ Ｂ，Ｓｕｒｅｄａ Ａ．Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｌｙｍｐｈｏｍａ：ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ．２００７；９２（１１）：１５３３－１５４８）。以前に記述されたＣＤ２０Ｒ－ＣＤ２８－ζ導入遺伝子を使用して、スプライス重複（ｓｐｌｉｃｅｄ－ｏｖｅｒｌａｐ）ポリメラーゼ連鎖反応によって、ＣＤ２０ ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬドメインを構築した（Ｍｉｃｈａｅｌ Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＣＤ２０ ｉｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｓｃＦｖＦｃ：ｚｅｔａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｔ－ｃｅｌｌｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ＣＤ２０＋ ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１９９８；４：７５－８３）。ＣＤ１９ ｓｃＦｖおよびＣＤ２０ ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬドメインを以前に記述されたように１８残基リンカーペプチドに連結した。ＰＣＲによってＣＤ１９Ｒ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ導入遺伝子を使用して、ＩｇＧ４－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ２８共刺激ドメインを配列決定した。以前に記述されたＣＤ１９Ｒ－ＣＤ２８－ζ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７プラスミド（Ｓｅｉｔａｒｏ Ｔｅｒａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ１９－ＣＡＲ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＣＤ８＋ Ｔ－ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｖｉｒｕｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｅｎｔｒａｌ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ－ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ．Ｏｃｔ．２６，２０１１）からのＣＤ１９Ｒ－ＣＤ２８部分のＮｈｅＩおよびＲｓｒＩＩの制限消化によって、ＣＤ３ζ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７レンチウイルスデスティネーションベクターを調製した。制限消化されたζ－ｅｐＨＩＶ７デスティネーションベクター、ならびに５'末端に３０ｂｐ重複を含むそれぞれに対するプライマーを有する、ＣＤ１９ｓｃＦｖ、ＣＤ２０ｓｃＦｖ、およびＩｇＧ４－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ２８共刺激－ＤＮＡフラグメントを使用して、ワンステップ等温ギブソンＤＮＡアセンブリ法によって、最終ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ＣＤ２０ｓｃＦｖ－ＩｇＧ４－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ２８共刺激－ＣＤ３ζ構築物を構築した。
図５は、本発明の例となるＣＡＲのベクター構築物、すなわち、ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ＣＤ２０ｓｃＦｖ－ＩｇＧ４－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ２８共刺激－ＣＤ３ζ導入遺伝子構築物を示す概略図である。過去にＧｉｂｓｏｎらによって記述されたワンステップ等温ＤＮＡアセンブリ法を使用して、ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ＣＤ２０ｓｃＦｖ－ＩｇＧ４－ＣＤ２８ｔｍＣＤ２８共刺激－ＣＤ３ζ導入遺伝子を構築した（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｕｐｔｏ ｓｅｖｅｒａｌ ｈｉｎｄｒｅｄ ｋｉｌｏｂａｓｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００９；６：３４３－３４５）。ＣＤ１９ ｓｃＦｖ構築物のＶＬおよびＶＨドメインを、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、以前に記述されたＣＤ１９ＣＡＲ－ＣＤ２８－ζ導入遺伝子から配列決定した。Ｓｃｈｍｉｔｚ Ｎ，Ｄｒｅｇｅｒ Ｐ，Ｇｌａｓｓ Ｂ，Ｓｕｒｅｄａ Ａ．Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｉｎ ｌｙｍｐｈｏｍａ：ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｕｓ．Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ．２００７；９２（１１）：１５３３－１５４８）。以前に記述されたＣＤ２０Ｒ－ＣＤ２８－ζ導入遺伝子を使用して、スプライス重複（ｓｐｌｉｃｅｄ－ｏｖｅｒｌａｐ）ポリメラーゼ連鎖反応によって、ＣＤ２０ ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬドメインを構築した（Ｍｉｃｈａｅｌ Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＣＤ２０ ｉｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔａｒｇｅｔ ｆｏｒ ｓｃＦｖＦｃ：ｚｅｔａ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｔ－ｃｅｌｌｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ＣＤ２０＋ ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｍａｒｒｏｗ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１９９８；４：７５－８３）。ＣＤ１９ ｓｃＦｖおよびＣＤ２０ ｓｃＦｖのＶＨおよびＶＬドメインを以前に記述されたように１８残基リンカーペプチドに連結した。ＰＣＲによってＣＤ１９Ｒ－ＣＤ２８－ＣＤ３ζ導入遺伝子を使用して、ＩｇＧ４－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ２８共刺激ドメインを配列決定した。以前に記述されたＣＤ１９Ｒ－ＣＤ２８－ζ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７プラスミド（Ｓｅｉｔａｒｏ Ｔｅｒａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤ１９－ＣＡＲ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＣＤ８＋ Ｔ－ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｖｉｒｕｓ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｅｎｔｒａｌ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ－ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ．Ｏｃｔ．２６，２０１１）からのＣＤ１９Ｒ－ＣＤ２８部分のＮｈｅＩおよびＲｓｒＩＩの制限消化によって、ＣＤ３ζ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔ＿ｅｐＨＩＶ７レンチウイルスデスティネーションベクターを調製した。制限消化されたζ－ｅｐＨＩＶ７デスティネーションベクター、ならびに５'末端に３０ｂｐ重複を含むそれぞれに対するプライマーを有する、ＣＤ１９ｓｃＦｖ、ＣＤ２０ｓｃＦｖ、およびＩｇＧ４－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ２８共刺激－ＤＮＡフラグメントを使用して、ワンステップ等温ギブソンＤＮＡアセンブリ法によって、最終ＣＤ１９ｓｃＦｖ－ＣＤ２０ｓｃＦｖ－ＩｇＧ４－ＣＤ２８ｔｍ－ＣＤ２８共刺激－ＣＤ３ζ構築物を構築した。
【0122】
（表１）二重特異性ＣＡＲ ｅｐＨＩＶ－７トランスファープラスミド中の調節エレメント
【0123】
実施例３
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に抗ＣＤ１９ｘＣＤ２０ＣＡＲ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔ ｅｐＨＩＶ－７トランスファープラスミドまたは抗ＣＤ２０ｘＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔ ｅｐＨＩＶ－７トランスファープラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞をビオチン化抗Ｆｃ抗体およびストレプトアビジンＰＥ（ＳＡ－ＰＥ）で染色し、次いで上記２つのＣＡＲの発現の検出のために、フローサイトメトリー解析に供した。抗ＣＤ１９ｘＣＤ２０ ＣＡＲおよび抗ＣＤ２０ｘＣＤ１９ ＣＡＲの両方が、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞上で発現された。
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に抗ＣＤ１９ｘＣＤ２０ＣＡＲ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔ ｅｐＨＩＶ－７トランスファープラスミドまたは抗ＣＤ２０ｘＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔ ｅｐＨＩＶ－７トランスファープラスミドをトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞をビオチン化抗Ｆｃ抗体およびストレプトアビジンＰＥ（ＳＡ－ＰＥ）で染色し、次いで上記２つのＣＡＲの発現の検出のために、フローサイトメトリー解析に供した。抗ＣＤ１９ｘＣＤ２０ ＣＡＲおよび抗ＣＤ２０ｘＣＤ１９ ＣＡＲの両方が、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞上で発現された。
【0124】
ｅｐＨＩＶ－７トランスファープラスミドは、上記２つの二重特異性ＣＡＲとＥＧＦＲｔを共発現した。ビオチン化抗ＥＧＦＲ抗体／ＳＡ－ＰＥ染色およびフローサイトメトリー解析の組み合わせを使用して、同じくトランスフェクトされた細胞上でＥＧＦＲｔ共発現を検出した。
【0125】
実施例４
初代ヒト末梢血由来Ｔ細胞をＯＫＴ３で活性化し、次いで、単一特異性抗ＣＤ１９ ＣＡＲ、単一特異性抗ＣＤ２０ ＣＡＲ、または二重特異性抗ＣＤ１９ｘＣＤ２０ ＣＡＲ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔ ｅｐＨＩＶ７レンチウイルスベクターを用いて、レンチウイルスによる（ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｌｙ）形質導入を行った。ｅｐＨＩＶ７レンチウイルスベクターもまた、単一特異性抗ＣＤ１９ ＣＡＲ、単一特異性抗ＣＤ２０ ＣＡＲ、または二重特異性抗ＣＤ１９ｘＣＤ２０とともに、ＥＧＦＲｔをコードした。このようにして、ＣＡＲを発現する細胞はＥＧＦＲｔを共発現した。トランスフェクトされた細胞をビオチン化抗ＥＧＦＲ抗体およびＳＡ－ＰＥで染色し、次いで、ＥＧＦＲｔ発現および単一特異性または二重特異性ＣＡＲの共発現の検出のために、フローサイトメトリー解析に供した。単一特異性抗ＣＤ１９ ＣＡＲをトランスフェクトされた細胞のうち５１％がＥＧＦＲｔを発現し、単一特異性抗ＣＤ２０ ＣＡＲをトランスフェクトされた細胞のうち３８．５％がＥＧＦＲｔを発現し、二重特異性抗ＣＤ１９ｘＣＤ２０ ＣＡＲをトランスフェクトされた細胞のうち６３．８％がＥＧＦＲｔを発現した。
初代ヒト末梢血由来Ｔ細胞をＯＫＴ３で活性化し、次いで、単一特異性抗ＣＤ１９ ＣＡＲ、単一特異性抗ＣＤ２０ ＣＡＲ、または二重特異性抗ＣＤ１９ｘＣＤ２０ ＣＡＲ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔ ｅｐＨＩＶ７レンチウイルスベクターを用いて、レンチウイルスによる（ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｌｙ）形質導入を行った。ｅｐＨＩＶ７レンチウイルスベクターもまた、単一特異性抗ＣＤ１９ ＣＡＲ、単一特異性抗ＣＤ２０ ＣＡＲ、または二重特異性抗ＣＤ１９ｘＣＤ２０とともに、ＥＧＦＲｔをコードした。このようにして、ＣＡＲを発現する細胞はＥＧＦＲｔを共発現した。トランスフェクトされた細胞をビオチン化抗ＥＧＦＲ抗体およびＳＡ－ＰＥで染色し、次いで、ＥＧＦＲｔ発現および単一特異性または二重特異性ＣＡＲの共発現の検出のために、フローサイトメトリー解析に供した。単一特異性抗ＣＤ１９ ＣＡＲをトランスフェクトされた細胞のうち５１％がＥＧＦＲｔを発現し、単一特異性抗ＣＤ２０ ＣＡＲをトランスフェクトされた細胞のうち３８．５％がＥＧＦＲｔを発現し、二重特異性抗ＣＤ１９ｘＣＤ２０ ＣＡＲをトランスフェクトされた細胞のうち６３．８％がＥＧＦＲｔを発現した。
【0126】
トランスフェクトされた細胞におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体もまた、ＦＩＴＣ結合抗ＴＣＲαおよび抗ＴＣＲβ抗体染色ならびにフローサイトメトリー解析を使用して、同じくトランスフェクトされた細胞内で検出された。
【0127】
実施例５
ＣＤ１９、もしくはＣＤ２０、またはＣＤ１９およびＣＤ２０の両方を発現するようにＨ９細胞を遺伝子修飾した。細胞を抗ＣＤ１９および抗ＣＤ２０抗体で染色し、次いでＣＤ１９およびＣＤ２０の発現を検出するために、フローサイトメトリー解析に供した。サイトメトリー解析は、ＣＤ１９＋ＣＤ２０－、ＣＤ１９－ＣＤ２０＋、およびＣＤ１９＋ＣＤ２０＋Ｈ９細胞の所望の発現プロファイルを確認した、すなわち、遺伝子改変されたＨ９細胞は、ＣＤ１９もしくはＣＤ２０、またはＣＤ１９およびＣＤ２０の両方を発現し、それによって、抗原陰性抗原消失エスケープ変異体を含む癌標的細胞を刺激した。後に記述されるように、これらの細胞株はその後、ＣＡＲ発現Ｔ細胞株を刺激するために標的細胞として使用され、標的細胞を死滅させるエフェクター細胞として作用した。
ＣＤ１９、もしくはＣＤ２０、またはＣＤ１９およびＣＤ２０の両方を発現するようにＨ９細胞を遺伝子修飾した。細胞を抗ＣＤ１９および抗ＣＤ２０抗体で染色し、次いでＣＤ１９およびＣＤ２０の発現を検出するために、フローサイトメトリー解析に供した。サイトメトリー解析は、ＣＤ１９＋ＣＤ２０－、ＣＤ１９－ＣＤ２０＋、およびＣＤ１９＋ＣＤ２０＋Ｈ９細胞の所望の発現プロファイルを確認した、すなわち、遺伝子改変されたＨ９細胞は、ＣＤ１９もしくはＣＤ２０、またはＣＤ１９およびＣＤ２０の両方を発現し、それによって、抗原陰性抗原消失エスケープ変異体を含む癌標的細胞を刺激した。後に記述されるように、これらの細胞株はその後、ＣＡＲ発現Ｔ細胞株を刺激するために標的細胞として使用され、標的細胞を死滅させるエフェクター細胞として作用した。
【0128】
同様に、ＳＵＰ－Ｂ１５およびＤＨＬ－６細胞株中のＣＤ１９およびＣＤ２０発現の内在レベルを抗ＣＤ１９ＡＰＣおよび抗ＣＤ２０ＰＥ染色ならびにフローサイトメトリー解析を使用して分析した。ＳＵＰ－Ｂ１５細胞株は、高レベルのＣＤ１９および低レベルのＣＤ２０（ゆえに、ＣＤ１９＋ＣＤ２０－）を発現し、かつＤＨＬ－１６細胞株は、高レベルのＣＤ２０および低レベルのＣＤ１９（ゆえに、ＣＤ１９－ＣＤ２０＋）を発現した。
【0129】
実施例６
４時間のクロム放出アッセイを使用してエフェクター細胞による標的細胞の溶解を測定した。エフェクター細胞は、単一特異性抗ＣＤ１９ ＣＡＲ、単一特異性抗ＣＤ２０ ＣＡＲ、または二重特異性抗ＣＤ１９ｘＣＤ２０ ＣＡＲを発現するために、レンチウイルスによって形質導入された初代ヒトＴ細胞である。二重特異性抗ＣＤ１９ｘＣＤ２０ＣＡＲエフェクターＴ細胞は、ＣＤ１９＋ＣＤ２０－Ｈ９細胞、ＣＤ１９－ＣＤ２０＋Ｈ９細胞、ＣＤ１９＋ＣＤ２０＋Ｈ９細胞、およびＳＵＰ－Ｂ１５細胞を含む、ＣＤ１９＋ＣＤ２０－、ＣＤ１９－ＣＤ２０＋、およびＣＤ１９＋ＣＤ２０＋標的細胞のすべてを効果的に溶解した。１：１、３：１、１０：１、および３０：１の比率のエフェクター対標的において、それぞれ約２５％、４５％、５０％、および６０％の標的細胞が溶解された。
４時間のクロム放出アッセイを使用してエフェクター細胞による標的細胞の溶解を測定した。エフェクター細胞は、単一特異性抗ＣＤ１９ ＣＡＲ、単一特異性抗ＣＤ２０ ＣＡＲ、または二重特異性抗ＣＤ１９ｘＣＤ２０ ＣＡＲを発現するために、レンチウイルスによって形質導入された初代ヒトＴ細胞である。二重特異性抗ＣＤ１９ｘＣＤ２０ＣＡＲエフェクターＴ細胞は、ＣＤ１９＋ＣＤ２０－Ｈ９細胞、ＣＤ１９－ＣＤ２０＋Ｈ９細胞、ＣＤ１９＋ＣＤ２０＋Ｈ９細胞、およびＳＵＰ－Ｂ１５細胞を含む、ＣＤ１９＋ＣＤ２０－、ＣＤ１９－ＣＤ２０＋、およびＣＤ１９＋ＣＤ２０＋標的細胞のすべてを効果的に溶解した。１：１、３：１、１０：１、および３０：１の比率のエフェクター対標的において、それぞれ約２５％、４５％、５０％、および６０％の標的細胞が溶解された。
【0130】
対照的に、単一特異性ＣＡＲ発現Ｔ細胞株は、単一特異性ＣＡＲエフェクター細胞から逃れる抗原陰性抗原消失エスケープ変異体を溶解することができない。抗ＣＤ１９ ＣＡＲエフェクターＴ細胞は、ＣＤ１９－ＣＤ２０＋標的を溶解することができず、抗ＣＤ２０ ＣＡＲエフェクターＴ細胞は、ＣＤ１９＋ＣＤ２０－標的を溶解することができなかった。
【0131】
実施例７
二重特異性ＣＡＲ発現ＣＤ４濃縮Ｔ細胞は、ＣＤ１９＋ＣＤ２０－Ｈ９細胞、ＣＤ１９－ＣＤ２０＋Ｈ９細胞、ＣＤ１９＋ＣＤ２０＋Ｈ９細胞、およびＳＵＰ－Ｂ１５細胞を含む、ＣＤ１９＋ＣＤ２０－、ＣＤ１９－ＣＤ２０＋、およびＣＤ１９＋ＣＤ２０＋標的細胞による刺激に応じたサイトカイン分泌（インターフェロンγ（ＩＦＮ－ｇ、ＩＦＮ－γ））に対して活性化された。ＩＦＮ－γ量を、共培養の２４時間後にＴ細胞および標的細胞の培養上清のサイトカインビーズアレイによって測定した。活性化された二重特異性ＣＡＲ発現ＣＤ４濃縮Ｔ細胞は、全タイプの標的細胞による刺激に応じて少なくとも２５００ｐｇ／ｍｌ ＩＮＦ－ｇを分泌した。対照的に、単一特異性ＣＡＲ発現Ｔ細胞株は、単一特異性ＣＡＲエフェクター細胞から逃れる抗原陰性抗原消失エスケープ変異体による刺激に応じて、サイトカインＩＮＦ－ｇ分泌に対して活性化されなかった。ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＤ１９－ＣＤ２０＋標的細胞との共培養の際にＩＧＮ－γを分泌することができず、ＣＤ２０ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＤ１９＋ＣＤ２０－標的細胞との共培養の際にＩＧＮ－γを分泌することができなかった。
インビトロでの刺激アッセイ
二重特異性ＣＡＲ発現ＣＤ４濃縮Ｔ細胞は、ＣＤ１９＋ＣＤ２０－Ｈ９細胞、ＣＤ１９－ＣＤ２０＋Ｈ９細胞、ＣＤ１９＋ＣＤ２０＋Ｈ９細胞、およびＳＵＰ－Ｂ１５細胞を含む、ＣＤ１９＋ＣＤ２０－、ＣＤ１９－ＣＤ２０＋、およびＣＤ１９＋ＣＤ２０＋標的細胞による刺激に応じたサイトカイン分泌（インターフェロンγ（ＩＦＮ－ｇ、ＩＦＮ－γ））に対して活性化された。ＩＦＮ－γ量を、共培養の２４時間後にＴ細胞および標的細胞の培養上清のサイトカインビーズアレイによって測定した。活性化された二重特異性ＣＡＲ発現ＣＤ４濃縮Ｔ細胞は、全タイプの標的細胞による刺激に応じて少なくとも２５００ｐｇ／ｍｌ ＩＮＦ－ｇを分泌した。対照的に、単一特異性ＣＡＲ発現Ｔ細胞株は、単一特異性ＣＡＲエフェクター細胞から逃れる抗原陰性抗原消失エスケープ変異体による刺激に応じて、サイトカインＩＮＦ－ｇ分泌に対して活性化されなかった。ＣＤ１９ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＤ１９－ＣＤ２０＋標的細胞との共培養の際にＩＧＮ－γを分泌することができず、ＣＤ２０ ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＤ１９＋ＣＤ２０－標的細胞との共培養の際にＩＧＮ－γを分泌することができなかった。
インビトロでの刺激アッセイ
【0132】
実施例８
以下の実施例は、Ｔ２Ａ配列を介してトランケート型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）に連結されたＣＤ１９特異性キメラ抗原受容体を説明する。ＥＧＦＲｔは、他のキメラ抗原受容体、例えば、二重特異性キメラ抗原受容体に連結され、それと共発現され得る。
以下の実施例は、Ｔ２Ａ配列を介してトランケート型上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲｔ）に連結されたＣＤ１９特異性キメラ抗原受容体を説明する。ＥＧＦＲｔは、他のキメラ抗原受容体、例えば、二重特異性キメラ抗原受容体に連結され、それと共発現され得る。
【0133】
出願人は、ビオチン化セツキシマブを使用する免疫磁気精製、フローサイトメトリーおよび免疫組織化学による細胞トラッキング、ならびに全身性セツキシマブ投与後のインビボでの細胞アブレーションのための、形質導入Ｔ細胞によって発現されたそのようなトランケート型ＥＧＦＲ（ｈｕＥＧＦＲｔ）の有用性を示した。この例となる実施形態において、ＥＧＦＲｔのドメインＩおよびＩＩは除去されたが、ドメインＩＩＩおよびＩＶは保持された。
【0134】
ＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔ－ｅｐＨＩＶ７レンチウイルス構築物は、示されるように（１）ＣＤ１９特異的ＦＭＣ６３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のＶＨおよびＶＬ遺伝子断片、ＩｇＧ４ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３、共刺激分子ＣＤ２８の膜貫通および細胞質シグナル伝達ドメイン、ならびにＣＤ３ζ鎖の細胞質ドメインから成るキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）配列（Ｋｏｗｏｌｉｋ ＣＫ．ｅｔ ａｌ．，ＣＤ２８ ｃｏｓｔｉｍｕａｔｉｏｎ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ａ ＣＤ１９－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｉｎ ｖｉｖｏ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ａｎｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ａｄｏｐｔｉｖｅｌｙ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００６，６６（２２）：１０９９５－１１００４）；（２）自己切断型のＴ２Ａ配列（Ｓｚｙｍｃｚａｋ ＡＬ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉ－ｇｅｎｅ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ｖｉｖｏ ｕｓｉｎｇ ａ "ｓｅｌｆ－ｃｌｅａｖｉｎｇ"２Ａ ｐｅｐｔｉｄｅ－ｂａｓｅｄ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２００４；２２（５）５８９－５９４）；ならびに（３）トランケート型ＥＧＦＲ配列を含む。
【0135】
レンチウイルス形質導入後のｈｕＥＧＦＲｔ＋ヒトＴ細胞の免疫磁気濃縮
ｈｕＥＧＦＲｔ＋細胞の免疫磁気選択またはＦＡＣＳ選別のいずれかに対してビオチン化セツキシマブを使用した。出願人らは、ＣＤ１９ＣＡＲおよびｈｕＥＧＦＲｔの共発現を指示する、自己不活性化レンチウイルスによって形質導入されたヒトＴ細胞の免疫磁気選択のために、市販の抗ビオチンマイクロビーズと併せてビオチン化セツキシマブを使用した。
ｈｕＥＧＦＲｔ＋細胞の免疫磁気選択またはＦＡＣＳ選別のいずれかに対してビオチン化セツキシマブを使用した。出願人らは、ＣＤ１９ＣＡＲおよびｈｕＥＧＦＲｔの共発現を指示する、自己不活性化レンチウイルスによって形質導入されたヒトＴ細胞の免疫磁気選択のために、市販の抗ビオチンマイクロビーズと併せてビオチン化セツキシマブを使用した。
【0136】
ＰＢＭＣまたは精製セントラルメモリー（ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＴＣＭ）またはエフェクターメモリー（ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ６２Ｌ＋ＴＥＭ）Ｔ細胞サブセットを抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズで刺激し、次いで、レンチウイルスベクターによって形質導入して初代ヒトＴ細胞株のパネルを生成した；その２．６％～４０％はｈｕＥＧＦＲｔおよびＣＡＲを発現した。選択されていない細胞をビオチン化セツキシマブおよび抗ビオチンマイクロビーズで標識し、次いで、その９０％がｈｕＥＧＦＲｔおよびＣＡＲを発現する選択された細胞集団を一貫して得るように分離した。
【0137】
選択されていないＴ細胞および選択された画分をビオチン化－セツキシマブおよびＰＥ結合ストレプトアビジンまたはＰＥ結合抗ビオチンＡｂのいずれかで染色し、次いで、フローサイトメトリー解析に供した。ＣＤ１９ＣＡＲ＋ＥＧＦＲｔ＋細胞の選択を、ＯＫＴ３芽細胞の形質導入の３日後（３８％から９８％に濃縮された）、または形質導入エフェクターメモリーＣＤ６２ＬＣＤ４５ＲＯ＋由来細胞の急速拡大の１サイクル後（２０％から９６％に濃縮された）、形質導入ＣＭＶｐｐ６５特異的ＴＣＭ由来細胞の急速拡大の３サイクル後（１２％から９１％に濃縮された）、もしくは形質導入ＣＤ８＋ＴＣＭ由来細胞の急速拡大の２サイクル後（３％から９７％に濃縮された）のいずれかで実施した。ＣＤ１９ＣＡＲ＋ＥＧＦＲｔ＋ＩＭＰＤＨ２ｄｍ＋細胞の選択を、形質導入ＴＣＭ由来細胞の急速拡大の１サイクル後（２５から９２％に濃縮された）に実施した。
【0138】
レンチウイルスベクターに含まれるＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ２Ａ－ＥＧＦＲｔ－ＩＭＰＤＨ２ｄｍ構築物は、ＣＤ１９特異的ＣＤ２８共刺激ＣＡＲ（ＣＤ１９ＣＡＲ）のコドン最適化配列部分、続いて自己切断可能Ｔ２Ａ、ならびに選択マーカーｈｕＥＧＦＲｔおよびＩＭＰＤＨ２ｄｍ（ミコフェノラート２７の添加に応じて細胞生存を可能にさせるイノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ２遺伝子の二重変異体）を、伸長因子１プロモーター配列（ＥＦ－１ｐ）、ＧＭ－ＣＳＦ受容体α鎖シグナル配列（ＧＭＣＳＦＲｓｓ）、および３ヌクレオチド停止コドンとともに含む。
【0139】
ＯＫＴ３媒介性の拡大に供される、選択されていない形質導入Ｔ細胞の培養物において、免疫磁気選択の前にｈｕＥＧＦＲｔ－細胞のｈｕＥＧＦＲｔ＋細胞を上回る増殖優位性を観察した。しかしながら、免疫磁気選択後、ｈｕＥＧＦＲｔ発現のレベルおよび発現細胞の頻度は、ＯＫＴ３ベースの拡大１４の１４日間サイクルの３回連続した期間にわたって、安定したまままであった。免疫磁気選択後のＥＧＦＲｔ＋細胞の拡大倍率は、選択されていない培養物におけるｈｕＥＧＦＲｔ＋細胞のものよりも有意に増強された。
【0140】
これらのデータは、ｈｕＥＧＦＲｔが形質導入ヒトＴ細胞に独特である細胞表面マーカーとして役立つことができ、その後の、ＣＡＲも発現する安定したｈｕＥＧＦＲｔ発現細胞集団の、セツキシマブベースの免疫磁気精製を可能にすることを示す。
【0141】
フローサイトメトリーおよび免疫組織化学を使用する養子移入ｈｕＥＧＦＲｔ＋Ｔ細胞のトラッキング
養子移入Ｔ細胞の生着をトラッキングするためのｈｕＥＧＦＲｔの有用性を試験するために、出願人らは、ＣＤ１９ＣＡＲ＋ＥＧＦＲｔ＋ヒトＴ細胞を移植されたＮＯＤ／Ｓｃｉｄ ＩＬ－２ＲγＣｎｕｌｌマウスから血液および骨髄標本を収集した。
養子移入Ｔ細胞の生着をトラッキングするためのｈｕＥＧＦＲｔの有用性を試験するために、出願人らは、ＣＤ１９ＣＡＲ＋ＥＧＦＲｔ＋ヒトＴ細胞を移植されたＮＯＤ／Ｓｃｉｄ ＩＬ－２ＲγＣｎｕｌｌマウスから血液および骨髄標本を収集した。
【0142】
まず、固定していない末梢血および骨髄単核細胞試料をビオチン化セツキシマブおよびＰＥ結合ストレプトアビジンで染色した後、フローサイトメトリー解析に供した。ヒトＣＤ４５＋Ｔ細胞生着のレベル（２０％～２５％）は、ＥＧＦＲｔ陰性もしくは陽性Ｔ細胞のいずれかを投与された動物において同様であったが、ヒトＣＤ４５およびＥＧＦＲについての二重染色は、ｈｕＥＧＦＲｔ＋（すなわち、導入遺伝子を発現する）ヒトＴ細胞を、それらのｈｕＥＧＦＲｔ陰性カウンターパートから分離することを可能にした。
【0143】
次に、出願人らは、ＥＧＦＲ特異的診断キットを使用して、標準パラフィン包埋の固定組織標本が、ｈｕＥＧＦＲｔ＋Ｔ細胞浸潤の検出に適しているかどうかを特定しようと試みた。出願人らは、移植マウスからのパラフィン包埋した大腿骨の免疫組織化学的分析を実施し、骨髄中のｈｕＥＧＦＲｔ＋細胞を検出した。これらのデータは、養子移入Ｔ細胞の頻度および組織分布の数量化のためのトラッキングマーカーとして役立つｈｕＥＧＦＲｔの有用性を支持する。
【0144】
ｈｕＥＧＦＲｔに結合するセツキシマブは、ヒトＴ細胞をＡＤＣＣに対して感作する
細胞表面選択／トラッキングマーカーの有用な特徴は、インビボでの細胞アブレーションのための標的として役立つその能力である。出願人らは、Ｔ細胞上でｈｕＥＧＦＲｔに結合されたセツキシマブがインビトロでｈｕＥＧＦＲｔ＋Ｔ細胞のＡＤＣＣを活性化する度合い、ならびにセツキシマブ投与がＮＯＤ／ｓｃｉｄマウス中の養子移入ｈｕＥＧＦＲｔ＋Ｔ細胞の生着を減弱し得るかどうかを評価した。
細胞表面選択／トラッキングマーカーの有用な特徴は、インビボでの細胞アブレーションのための標的として役立つその能力である。出願人らは、Ｔ細胞上でｈｕＥＧＦＲｔに結合されたセツキシマブがインビトロでｈｕＥＧＦＲｔ＋Ｔ細胞のＡＤＣＣを活性化する度合い、ならびにセツキシマブ投与がＮＯＤ／ｓｃｉｄマウス中の養子移入ｈｕＥＧＦＲｔ＋Ｔ細胞の生着を減弱し得るかどうかを評価した。
【0145】
標的細胞として５１Ｃｒ標識化ｈｕＥＧＦＲｔ＋Ｔ細胞、およびエフェクターとしてヒトＧＭ－ＣＳＦ活性化新鮮ＰＢＭＣを共培養した。次いで、セツキシマブの添加は、ｈｕＥＧＦＲｔ＋Ｔ細胞をエフェクターによるＡＤＣＣ細胞溶解に対して特異的に感作した。ｈｕＥＧＦＲｔ＋Ｔ細胞の溶解を４時間のクロム放出アッセイによって測定し、結果は、セツキシマブ添加が溶解を、５０：１、２５：１、５：１、および１：１のエフェクター対標的（エフェクター：標的）比率で、それぞれ、５％未満から約５０％、４５％、４０％、および１５％著しく増大させたことを示した。
【0146】
対照的に、このアッセイにおいて、ＣＤ２０特異的ｍＡｂリツキサンの添加は、ｈｕＥＧＦＲｔ＋Ｔ細胞のＡＤＣＣの誘起に対して効果を有さなかった。
【0147】
出願人らは次に、オートクリンＩＬ－２を分泌しかつホタルルシフェラーゼバイオフォトニック（ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃ）レポーターを発現するように、さらに修飾されたｈｕＥＧＦＲｔ＋ＣＴＬＬ－２マウスのＴ細胞を誘導し、これらのｆｆＬｕｃ＋ｈｕＥＧＦＲｔ＋ＣＴＬＬ－２細胞を、静脈内注射を介してＮＯＤ／ｓｃｉｄマウスに養子移入し、それらにその後セツキシマブまたはリツキサンを与えた。移入されたＣＴＬＬ－２のインビボでの生着は、インビボバイオフォトニックイメージングによって測定されたように、Ｅｒｂｉｔｕｘ（毎日腹腔内に１ｍｇ）を与えたマウスにおいて有意に阻害された（９７％、Ｐ＜０．０５）。ｆｆＬｕｃ＋ｈｕＥＧＦＲｔ＋ＣＴＬＬ－２細胞のセツキシマブ媒介性の消失は、４～６日間の間に生じた。これらのデータは、ｈｕＥＧＦＲｔ＋Ｔ細胞を受けた患者に対する治療用制御物質としてのセツキシマブ投与の使用を支持する。
【0148】
実施例９
本実施例は、内因性γｃサイトカインシグナル伝達機構を持つＴ細胞を説明し、キメラサイトカイン受容体（ＣＣＲ）であるＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒβ（ＣγＣＲ２）およびＩＬ－７Ｒα（ＣγＣＲ７）が、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の生存、残存、およびインビボ生着を改善する能力を有することを示す。トランケート型ＣＤ１９抗原（ＣＤ１９ｔ）を、細胞表面上のＣγＣＲの発現を示すように、Ｔ２Ａリンカーを介してＣγＣＲに連結した。本明細書に記載のキメラサイトカイン受容体は、本明細書に記載の二重特異性ＣＡＲ等の、本発明のキメラ抗原受容体に連結され得る。
本実施例は、内因性γｃサイトカインシグナル伝達機構を持つＴ細胞を説明し、キメラサイトカイン受容体（ＣＣＲ）であるＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒβ（ＣγＣＲ２）およびＩＬ－７Ｒα（ＣγＣＲ７）が、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の生存、残存、およびインビボ生着を改善する能力を有することを示す。トランケート型ＣＤ１９抗原（ＣＤ１９ｔ）を、細胞表面上のＣγＣＲの発現を示すように、Ｔ２Ａリンカーを介してＣγＣＲに連結した。本明細書に記載のキメラサイトカイン受容体は、本明細書に記載の二重特異性ＣＡＲ等の、本発明のキメラ抗原受容体に連結され得る。
【0149】
細胞内因性でリガンド非依存性のγｃサイトカインプラットフォームを生じるために、出願人らは、１０個のアミノ酸によってＩＬ－７Ｒαの細胞外ドメインにつながれたＩＬ－７サイトカインから成るキメラγｃサイトカイン受容体（ＣγＣＲ）を作製した。ＩＬ－７Ｒシグナルを与えるＣγＣＲを作製するために、ＩＬ－７サイトカインを完全長ＩＬ－７Ｒα鎖につないだ（ＣγＣＲ７）。ＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒβシグナルを提供するＣγＣＲは、ＩＬ－７サイトカインを、ＩＬ－２／ＩＬ－１５Ｒβの細胞質ドメインと融合されたＩＬ－７Ｒαの細胞外および膜貫通ドメインにつなぐことによって作製した（ＣγＣＲ２）。これらの単鎖キメラ受容体は、シグナル伝達のために内因性γｃ鎖を必要とすることが予想される。
【0150】
構築物を次いで、ＣγＣＲ導入遺伝子の後に、自己切断可能なＴ２Ａ配列、および細胞質トランケート型ＣＤ１９抗原（ＣＤ１９ｔ）が続くように生成した。ＣγＣＲおよびＣＤ１９ｔは、単一転写物として発現され、翻訳後に、２つの別々の１型膜タンパク質ＣγＣＲ（Ｔ２Ａ）およびＣＤ１９ｔをもたらすようにＴ２Ａ自己切断型ペプチドのＣ末端で切断される。単一転写物からの２つのタンパク質の発現に基づく、ＣγＣＲ（Ｔ２Ａ）対ＣＤ１９ｔ発現の比率は１：１であり、したがって、細胞表面ＣＤ１９ｔは、ＣγＣＲ細胞表面発現のしるしである。レンチウイルス形質導入およびこれら構築物の発現は次いで、ジャーカット細胞株およびＮＫ－９２細胞株の両方において見られるように、表面ＣＤ１９ｔ発現によって測定され得る。
【0151】
ＩＬ－７Ｒαの細胞外ドメインから１～１２６個のアミノ酸を欠失しているトランケート型ＩＬ－７ＲαにつながれたＩＬ－７サイトカインを有する第３のＣγＣＲもまた作製した（ＣγＣＲ７ｔ）。内因性γｃ鎖とのＣγＣＲ７ｔ二量体形成の分子モデルが、シグナル伝達に必須である。ＩＬ－７Ｒαの細胞外ドメインの１～１２６個のアミノ酸の欠失は、ＣγＣＲ７ｔを非機能性にする。
【0152】
トランケート型ＣγＣＲ７発現は、サイトカイン非依存性細胞成長について機能的にシグナル伝達または支持しない。フローサイトメトリーは、レンチ形質導入ジャーカット（９５％ ＣＤ１９ｔ＋ＣγＣＲ７ｔ＋）およびテフ細胞株（９７％ ＣＤ１９ｔ＋ＣγＣＲ７ｔ＋）上の細胞表面ＣＤ１９ｔを検出した。ＣγＣＲ７ｔ発現ジャーカット細胞株でのＳＴＡＴ５リン酸化のウエスタンブロット分析は、非形質導入対照ジャーカット細胞株と比較して、リン酸化ＳＴＡＴ５の明らかな増加を検出しなかった。陽性対照ＯＫＴ３刺激ＰＢＭＣを５０Ｕ／ｍｌ ＩＬ－２および１０ｎｇ／ｍｌ ＩＬ－１５中で培養し、Ｋ５６２は、増加したリン酸化ＳＴＡＴ５の活性化を示した。したがって、２０日間培養されたＣγＣＲ７ｔ形質導入ＣＴＬの拡大および生存能はなお、サイトカインに左右された。
【0153】
ＣγＣＲ２およびＣγＣＲ７等の機能的ＣγＣＲが、外因性サイトカインの不在下でＣＤ８＋ヒト初代Ｔ細胞の成長を支持し得るかを判定するために、本発明者らは各ＣγＣＲを発現するＣＴＬの拡大を測定した。ＣγＣＲ７ｔを発現するヒト初代Ｔ細胞は、外因性サイトカインの不在下では拡大できなかった。ＣγＣＲ２およびＣγＣＲ７の両方が、それぞれ５Ｕ／ｍｌおよび０．５Ｕ／ｍｌ ＩＬ－２中で培養された親の細胞のものと同様の手法において、生存能の維持によってＣＤ８＋Ｔ細胞の生存および増殖を支持することが可能であった。ＣγＣＲ２＋対ＣγＣＲ７＋ＣＴＬについて測定された全細胞拡大の増加は、細胞周期のＧ１、Ｓ、Ｇ２、およびＭ相に存在する核抗原タンパク質であるＫｉ６７の発現の増加と相関する（すなわち、ＣγＣＲ７に対する２６のＭＦＩ対ＣγＣＲ２に対する５２のＭＦＩ）。ＩＬ－２およびＩＬ－７シグナル伝達に応答して誘発される主要な抗アポトーシス性タンパク質である、より高度なＢｃｌ－２の発現が、ＣγＣＲ７＋対ＣγＣＲ２＋ＣＴＬにおいて観察され、ヒト初代Ｔ細胞の生存を維持するＣγＣＲ７の能力を支持した。このデータを合わせると、両方のＣγＣＲがサイトカイン非依存性Ｔ細胞生存能および拡大を支持するが、ＣγＣＲ７がエフェクターＣＤ８＋ＣＴＬの生存を維持する間、ＣγＣＲ２は増殖優位性を提供することが示唆される。
【0154】
ＣγＣＲを発現するＣＤ８＋Ｔ細胞は、インビボでのサイトカイン非依存性生着を示す
本発明者の研究所およびその他による研究は、ＮＯＤ／Ｓｃｉｄ ＩＬ－２ＲγＣｎｕｌｌマウスにおけるヒトＣＴＬの生着が、ヒトＩＬ－１５またはＩＬ－２の外因性投与に依存することを示す。この依存性を克服すべくＣＴＬにおけるＣγＣＲ発現の可能性を試験するために、親のエフェクターＴ細胞、ＣγＣＲ７＋ＣＴＬ、およびＣγＣＲ２＋ＣＴＬを外因性サイトカイン投与の不存在下で免疫不全ＮＯＤ／Ｓｃｉｄ ＩＬ－２ＲγＣｎｕｌｌマウスの尾静脈に注入した。８日目、１７日目、２４日目、および４８日目に１群あたり少なくとも４匹のマウスを収集し、血液および骨髄中のＴ細胞レベルを分析することによって全生着を比較した。
本発明者の研究所およびその他による研究は、ＮＯＤ／Ｓｃｉｄ ＩＬ－２ＲγＣｎｕｌｌマウスにおけるヒトＣＴＬの生着が、ヒトＩＬ－１５またはＩＬ－２の外因性投与に依存することを示す。この依存性を克服すべくＣＴＬにおけるＣγＣＲ発現の可能性を試験するために、親のエフェクターＴ細胞、ＣγＣＲ７＋ＣＴＬ、およびＣγＣＲ２＋ＣＴＬを外因性サイトカイン投与の不存在下で免疫不全ＮＯＤ／Ｓｃｉｄ ＩＬ－２ＲγＣｎｕｌｌマウスの尾静脈に注入した。８日目、１７日目、２４日目、および４８日目に１群あたり少なくとも４匹のマウスを収集し、血液および骨髄中のＴ細胞レベルを分析することによって全生着を比較した。
【0155】
血液中では、ＣγＣＲ２＋ＣＴＬは、ＣγＣＲ７＋ＣＴＬおよび親の細胞と比較して、非常に著しい（Ｐ＜０．００７）外因性サイトカイン非依存性生着を有した。骨髄中では、ＣγＣＲ７＋ＣＴＬ（Ｐ＜０．０３）およびＣγＣＲ２＋ＣＴＬ（Ｐ＜０．０００５）の両方が、親の細胞と比較して著しい外因性サイトカイン非依存性生着を有した。ＣγＣＲ２＋ＣＴＬは、ＣγＣＲ７＋ＣＴＬと比較してより高い生着を有した。これは、ＣγＣＲ７＋ＣＴＬおよびＣγＣＲ２＋ＣＴＬの両方が外因性サイトカイン非依存性生着を支持することができるが、細胞の全割合が異なったことを示す。血液は、骨髄と比較して、ＣγＣＲ２＋ＣＴＬのより高い割合の生着を支持した。骨髄は、長期間にわたるＣγＣＲ７＋ＣＴＬの生着を支持した。重要なことには、細胞がいずれの群においても４８日目には血液および骨髄中にもはや存在しなかったように、生着は無限ではなかった。
【0156】
細胞内因性γｃサイトカインシグナルは、養子移入ＣＴＬの支持のための外因性サイトカイン投与の必要性に取って代わることができる。細胞内因性サイトカイン受容体を提供することで、養子免疫療法（養子移入ＣＴＬの長期残存）の主要な限界を克服することができる。これは、外因性サイトカインの投与の必要性を排除することができ、内因性細胞型に対する毒性およびバイスタンダー効果を低減することができる。
【0157】
実施例１０
本実施例は、ＥＧＦＲｔおよびＤＨＦＲに連結されたＣＤ１９キメラ抗原受容体が、メトトレキサートによって制御され得ることを示す。本明細書に記載の方法を使用して、本明細書に記載のジヒドロキシ葉酸受容体は、本発明の二重特異性キメラ抗原受容体に連結され得る。
本実施例は、ＥＧＦＲｔおよびＤＨＦＲに連結されたＣＤ１９キメラ抗原受容体が、メトトレキサートによって制御され得ることを示す。本明細書に記載の方法を使用して、本明細書に記載のジヒドロキシ葉酸受容体は、本発明の二重特異性キメラ抗原受容体に連結され得る。
【0158】
出願人らは、より低い毒性の薬学的利用可能な薬物メトトレキサート（ＭＴＸ）によってＴ細胞の選択を可能にし得るヒトジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｈＤＨＦＲ）変異体を使用する、ヒト選択性（ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ）導入遺伝子を開発した。ＭＴＸは、チミジル酸ヌクレオチドの新規合成に必須の主要な酵素であるＤＨＦＲの競合的阻害を通して、その抗増殖性効果を発揮する。
【0159】
本実施例において、出願人らは、ＣＤ１９特異性キメラ抗原受容体（ＣＤ１９発現腫瘍を標的とするためのＣＤ１９ＣＡＲ）を共発現する初代ヒトＴ細胞の、ＤＨＦＲＦＳ（ｈＤＨＦＲ Ｌ２２Ｆ／Ｆ３１Ｓ変異体）媒介性インビトロ選択の可能性を評価した。このストラテジーにおいて、本発明者らは、形質導入されたＴ細胞の混合群の、リンパ球毒性薬物ＭＴＸへの曝露は、非形質導入Ｔ細胞の排除およびＤＨＦＲＦＳ／ＣＤ１９ＣＡＲ Ｔ細胞の選択的拡大をもたらすはずであり、総じて、共発現Ｔ細胞はＴ細胞群の抗腫瘍効果を増大すると仮定した。ここで、出願人らは、遺伝子修飾Ｔ細胞のＤＨＦＲＦＳ媒介性選択が、ＣＤ１９ＣＡＲ治療的導入遺伝子発現を強制し、かつ臨床的に達成可能な濃度のＭＴＸ（例えば、０．１μＭ ＭＴＸ）の存在下でＣＡＲ＋安定組込み体の誘導を可能にしたことを示す。
【0160】
潜在的治療有用性のためのｈＤＨＦＲＦＳ選択アプローチをもたらすために、出願人らは、リボソームスキップＴ２Ａ配列によってそれぞれが分離されているＣＤ１９特異性キメラ抗原受容体（ＣＤ１９ＣＡＲ）およびトラッキングマーカー（ｈｕＥＧＦＲｔ）としてのトランケート型ヒトＥＧＦＲポリペプチドと併せて、ｈＤＨＦＲＦＳを共発現するレンチウイルスベクターを設計した。
【0161】
ＣＴＬＬ２ Ｔ細胞に、まずこのＣＤ１９ＣＡＲ－ｈｕＥＧＦＲｔ－ｈＤＨＦＲＦＳレンチウイルスベクターを形質導入し、そのＭＴＸに対する抵抗性を評価した。レンチ形質導入の１０日後、細胞の７～８％がＣＤ１９ＣＡＲおよびｈｕＥＧＦＲｔ発現に対して陽性であった。
【0162】
ＭＴＸの不在下において、非形質導入および形質導入ＣＴＬＬ２細胞が、等しい割合で拡大した（それぞれ、２１および２７倍）。ＭＴＸ（０～０．１μＭ）で８日間のインキュベーション後、８０％の生存を有する７倍拡大が、形質導入細胞において観察され、一方、非形質導入ＣＴＬＬ２細胞の０．０５μＭ以上のＭＴＸへの曝露は、非形質導入ＣＴＬＬ２細胞の拡大および生存能に対して強い阻害をもたらした。
【0163】
異なる濃度のＭＴＸでの培養物における８日後の形質導入ＣＴＬＬ２細胞のｈｕＥＧＦＲｔ発現レベルの評価は、導入遺伝子発現ｈｕＥＧＦＲｔ＋細胞の著しいＭＴＸ媒介性濃縮をさらに明らかにした（０．０１、０．０２５、０．０５、および０．１μＭのＭＴＸで、それぞれ４９％、９３％、９８．５％、９９％）。
【0164】
選択されたＣＴＬＬ２細胞にとって耐性であり得るＭＴＸの最高用量をさらに特徴付けるために、０．１μＭ ＭＴＸで８日間培養された形質導入ＣＴＬＬ２細胞を広範囲のＭＴＸ濃度（最大０．７５μＭ）で置き換えた。これらの、形質導入されかつ事前にＭＴＸ選択された細胞は、最大０．２５μＭのＭＴＸ濃度で９０～１００倍拡大することが可能であり、それはＭＴＸの不在下での非形質導入対照ＣＴＬＬ２の拡大と等しかった。
【0165】
出願人らは、初代ヒトＴ細胞に、同じＣＤ１９ＣＡＲ－ｈｕＥＧＦＲｔ－ｈＤＨＦＲＦＳレンチウイルスベクターを形質導入した。精製ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞を、それらの養子移入後の残存の可能性に基づいて開始群として使用した。形質導入の１０日後、これらのＴ細胞を異なる濃度のＭＴＸで培養し、経時的な細胞数および生存能を評価した。１０日後、形質導入および非形質導入Ｔ細胞は、ＭＴＸの不在下では同等に（８０倍）拡大した。さらに、たとえ０．１μＭのＭＴＸであっても、形質導入Ｔ細胞は６３％の生存能を維持し、一方、非形質導入初代ヒトＴ細胞は、０．０２５μＭほどの低いＭＴＸ濃度で開始したが、生存能および拡大倍率の両方の強い阻害を示した。
【0166】
異なる濃度のＭＴＸでの培養物における１０日後の形質導入Ｔ細胞のフローサイトメトリー評価は、導入遺伝子発現細胞の著しいＭＴＸ媒介性濃縮を明らかにした（例えば、０．０２５μＭ ＭＴＸは、約５４％ ＣＤ１９ＣＡＲ＋および７９％ ＥＧＦＲｔ＋に濃縮した；０．０５μＭ ＭＴＸは、約７６％ ＣＤ１９ＣＡＲ＋および８９％ ＥＧＦＲｔ＋に濃縮した）。
【0167】
培養物の６日目対１０日目におけるＣＤ１９ＣＡＲおよびＥＧＦＲｔ発現の比較は、経時的な、このＭＴＸ／ＤＨＦＲＦＳ媒介性選択の安定した進行を明らかにした（０日目：１８％ ＣＤ１９ＣＡＲ＋、２８％ ＥＧＦＲｔ＋；６日目：４８％ ＣＤ１９ＣＡＲ＋、７１％ ＥＧＦＲｔ＋；１０日目：７０％ ＣＤ１９ＣＡＲ＋、８８％ ＥＧＦＲｔ＋）。
【0168】
本明細書に引用されるすべての参照物は、完全に明記されるかのように参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。別途定義されない限り、本明細書で使用される技術および科学用語は、本発明がそこに属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３ｒｄ ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ ２００１）、Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５ｔｈ ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ ２００１）、およびＳａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ ２００１）は、当業者に本出願において使用される用語の多くの一般的な指針を提供する。
【0169】
当業者は、本明細書に記載されるものと類似または同等の本発明の実践において使用され得る多くの方法および材料を理解するであろう。実際に、本発明は、記載の方法および材料には全く限定されない。本発明の目的に対して、以下の用語が下記に定義される。
【0170】
これらの記述は、上記の実施形態を直接説明するが、当業者は、本明細書に示され、説明される特定の実施形態の修正および／または変形を考えてもよいことを理解されたい。本記述の範囲内である任意のそのような修正または変形は、同様にその中に含まれることが意図される。具体的に言及されない限り、本明細書および特許請求の範囲の単語および語句は、通常の、および当出願分野における当業者に慣用的な意味において使用されることが、発明者の意図である。
【0171】
特許申請書提出時において、出願人に既知である本発明の種々の実施形態の前述の説明は、提案されており、例示および説明の目的を意図している。本説明は、包括的であるか、または本発明を開示される正確な形式に限定することを意図せず、多くの修正および変形が、上記の教示の観点から可能である。記載の本実施形態は、本発明の原理およびその実用的な用途の説明、ならびに他の当業者が種々の実施形態において、および企図される特定の使用に適した種々の修正を伴って本発明を利用できるようにするのに役立つ。したがって、本発明は、本発明を実行するために開示される特定の実施形態に限定されないことが意図される。
【0172】
本発明の特定の実施形態が示され説明されたが、本明細書の教示に基づいて、本発明およびそのより広範な態様から逸脱することなく変更および修正がなされることが可能であることが当業者にとって明白である。概して、本明細書で使用される用語は、概して「限定されない」用語（例えば、用語「含んでいる」は、「含んでいるがこれに限定されない」として解釈されるべきであり、用語「有する」は、「少なくとも有する」として解釈されるべきであり、用語「含む」は「含むがこれに限定されない」として解釈されるべきである等）として意図されることが当業者には理解されるであろう。
【0173】
配列情報
SEQUENCE LISTING
<110> Seattle Children's Hospital d/b/a Seattle Children's
Research Institute
<120> Bispecific Chimeric Antigen Receptors and Therapeutic Uses
Thereof
<150> US 61/598,216
<151> 2012-02-13
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3273
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GMCSFRss-CD19scFv-Gly4Ser1linker-CD20scFv-IgG4Hinge-CD28tm-41BB-C
D3zeta-T2A-EGFRt_epHIV7
<400> 1
atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60
atccccatga cccagaccac ctccagcctg agcgccagcc tgggcgaccg ggtgaccatc 120
agctgccggg ccagccagga catcagcaag tacctgaact ggtatcagca gaagcccgac 180
ggcaccgtca agctgctgat ctaccacacc agccggctgc acagcggcgt gcccagccgg 240
tttagcggca gcggctccgg caccgactac agcctgacca tctccaacct ggaacaggaa 300
gatatcgcca cctacttttg ccagcagggc aacacactgc cctacacctt tggcggcgga 360
acaaagctgg aaatcaccgg cagcacctcc ggcagcggca agcctggcag cggcgagggc 420
agcaccaagg gcgaggtgaa gctgcaggaa agcggccctg gcctggtggc ccccagccag 480
agcctgagcg tgacctgcac cgtgagcggc gtgagcctgc ccgactacgg cgtgagctgg 540
atccggcagc cccccaggaa gggcctggaa tggctgggcg tgatctgggg cagcgagacc 600
acctactaca acagcgccct gaagagccgg ctgaccatca tcaaggacaa cagcaagagc 660
caggtgttcc tgaagatgaa cagcctgcag accgacgaca ccgccatcta ctactgcgcc 720
aagcactact actacggcgg cagctacgcc atggactact ggggccaggg caccagcgtg 780
accgtgagca gcggaggtgg tggatccgag gtgcagctgc agcagtctgg ggctgagctg 840
gtgaagcctg gggcctcagt gaagatgtcc tgcaaggctt ctggctacac atttaccagt 900
tacaatatgc actgggtaaa gcagacacct ggacagggcc tggaatggat tggagctatt 960
tatccaggaa atggtgatac ttcctacaat cagaagttca aaggcaaggc cacattgact 1020
gcagacaaat cctccagcac agcctacatg cagctcagca gcctgacatc tgaggactct 1080
gcggactatt actgtgcaag atctaattat tacggtagta gctactggtt cttcgatgtc 1140
tggggcgcag ggaccacggt caccgtctcc tcaggcagta ctagcggtgg tggctccggg 1200
ggcggttccg gtgggggcgg cagcagcgac attgtgctga cccaatctcc agctatcctg 1260
tctgcatctc caggggagaa ggtcacaatg acttgcaggg ccagctcaag tgtaaattac 1320
atggactggt accagaagaa gccaggatcc tcccccaaac cctggattta tgccacatcc 1380
aacctggctt ctggagtccc tgctcgcttc agtggcagtg ggtctgggac ctcttactct 1440
ctcacaatca gcagagtgga ggctgaagat gctgccactt attactgcca gcagtggagt 1500
tttaatccac ccacgttcgg aggggggacc aagctggaaa taaaagagag caagtacgga 1560
ccgccctgcc ccccttgccc tatgttctgg gtgctggtgg tggtcggagg cgtgctggcc 1620
tgctacagcc tgctggtcac cgtggccttc atcatctttt gggtgaaacg gggcagaaag 1680
aaactcctgt atatattcaa acaaccattt atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa 1740
gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa gaagaaggag gatgtgaact gcgggtgaag 1800
ttcagcagaa gcgccgacgc ccctgcctac cagcagggcc agaatcagct gtacaacgag 1860
ctgaacctgg gcagaaggga agagtacgac gtcctggata agcggagagg ccgggaccct 1920
gagatgggcg gcaagcctcg gcggaagaac ccccaggaag gcctgtataa cgaactgcag 1980
aaagacaaga tggccgaggc ctacagcgag atcggcatga agggcgagcg gaggcggggc 2040
aagggccacg acggcctgta tcagggcctg tccaccgcca ccaaggatac ctacgacgcc 2100
ctgcacatgc aggccctgcc cccaaggctc gagggcggcg gagagggcag aggaagtctt 2160
ctaacatgcg gtgacgtgga ggagaatccc ggccctagga tgcttctcct ggtgacaagc 2220
cttctgctct gtgagttacc acacccagca ttcctcctga tcccacgcaa agtgtgtaac 2280
ggaataggta ttggtgaatt taaagactca ctctccataa atgctacgaa tattaaacac 2340
ttcaaaaact gcacctccat cagtggcgat ctccacatcc tgccggtggc atttaggggt 2400
gactccttca cacatactcc tcctctggat ccacaggaac tggatattct gaaaaccgta 2460
aaggaaatca cagggttttt gctgattcag gcttggcctg aaaacaggac ggacctccat 2520
gcctttgaga acctagaaat catacgcggc aggaccaagc aacatggtca gttttctctt 2580
gcagtcgtca gcctgaacat aacatccttg ggattacgct ccctcaagga gataagtgat 2640
ggagatgtga taatttcagg aaacaaaaat ttgtgctatg caaatacaat aaactggaaa 2700
aaactgtttg ggacctccgg tcagaaaacc aaaattataa gcaacagagg tgaaaacagc 2760
tgcaaggcca caggccaggt ctgccatgcc ttgtgctccc ccgagggctg ctggggcccg 2820
gagcccaggg actgcgtctc ttgccggaat gtcagccgag gcagggaatg cgtggacaag 2880
tgcaaccttc tggagggtga gccaagggag tttgtggaga actctgagtg catacagtgc 2940
cacccagagt gcctgcctca ggccatgaac atcacctgca caggacgggg accagacaac 3000
tgtatccagt gtgcccacta cattgacggc ccccactgcg tcaagacctg cccggcagga 3060
gtcatgggag aaaacaacac cctggtctgg aagtacgcag acgccggcca tgtgtgccac 3120
ctgtgccatc caaactgcac ctacggatgc actgggccag gtcttgaagg ctgtccaacg 3180
aatgggccta agatcccgtc catcgccact gggatggtgg gggccctcct cttgctgctg 3240
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Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
gcc ttt ctg ctg atc ccc atg acc cag acc acc tcc agc ctg agc gcc 96
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala
20 25 30
agc ctg ggc gac cgg gtg acc atc agc tgc cgg gcc agc cag gac atc 144
Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile
35 40 45
agc aag tac ctg aac tgg tat cag cag aag ccc gac ggc acc gtc aag 192
Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys
50 55 60
ctg ctg atc tac cac acc agc cgg ctg cac agc ggc gtg ccc agc cgg 240
Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg
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ttt agc ggc agc ggc tcc ggc acc gac tac agc ctg acc atc tcc aac 288
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn
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ctg gaa cag gaa gat atc gcc acc tac ttt tgc cag cag ggc aac aca 336
Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr
100 105 110
ctg ccc tac acc ttt ggc ggc gga aca aag ctg gaa atc acc ggc agc 384
Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser
115 120 125
acc tcc ggc agc ggc aag cct ggc agc ggc gag ggc agc acc aag ggc 432
Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly
130 135 140
gag gtg aag ctg cag gaa agc ggc cct ggc ctg gtg gcc ccc agc cag 480
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
145 150 155 160
agc ctg agc gtg acc tgc acc gtg agc ggc gtg agc ctg ccc gac tac 528
Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
165 170 175
ggc gtg agc tgg atc cgg cag ccc ccc agg aag ggc ctg gaa tgg ctg 576
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu
180 185 190
ggc gtg atc tgg ggc agc gag acc acc tac tac aac agc gcc ctg aag 624
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
195 200 205
agc cgg ctg acc atc atc aag gac aac agc aag agc cag gtg ttc ctg 672
Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
210 215 220
aag atg aac agc ctg cag acc gac gac acc gcc atc tac tac tgc gcc 720
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
225 230 235 240
aag cac tac tac tac ggc ggc agc tac gcc atg gac tac tgg ggc cag 768
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
245 250 255
ggc acc agc gtg acc gtg agc agc gga ggt ggt gga tcc gag gtg cag 816
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
260 265 270
ctg cag cag tct ggg gct gag ctg gtg aag cct ggg gcc tca gtg aag 864
Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys
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tat cca gga aat ggt gat act tcc tac aat cag aag ttc aaa ggc aag 1008
Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys
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Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu
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agc agc ctg aca tct gag gac tct gcg gac tat tac tgt gca aga tct 1104
Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser
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Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys
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Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
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aga agg gaa gag tac gac gtc ctg gat aag cgg aga ggc cgg gac cct 1920
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Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
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Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Met Leu Leu
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Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys
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Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys
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Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly
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Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile
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Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp
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Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser
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Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp
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Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr
885 890 895
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Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile
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Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys
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His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp
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Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys
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Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu
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Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr
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tgc aca gga cgg gga cca gac aac tgt atc cag tgt gcc cac tac att 3024
Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile
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gac ggc ccc cac tgc gtc aag acc tgc ccg gca gga gtc atg gga 3069
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1010 1015 1020
gaa aac aac acc ctg gtc tgg aag tac gca gac gcc ggc cat gtg 3114
Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val
1025 1030 1035
tgc cac ctg tgc cat cca aac tgc acc tac gga tgc act ggg cca 3159
Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro
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Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile
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Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala
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Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys
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Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg
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100 105 110
Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser
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Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
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Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
165 170 175
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu
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Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
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Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
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Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys
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Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu
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Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser
355 360 365
Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser
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Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met Asp Trp Tyr Gln Lys Lys Pro
435 440 445
Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser
450 455 460
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser
465 470 475 480
Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
485 490 495
Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
500 505 510
Glu Ile Lys Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Met
515 520 525
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
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Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys
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Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
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Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
595 600 605
Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
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Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
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Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Met Leu Leu
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Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro Ala Phe Leu
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gag agc aag tac gga ccg ccc tgc ccc cct tgc cct atg ttc tgg gtg 48
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Met Phe Trp Val
1 5 10 15
ctg gtg gtg gtc gga ggc gtg ctg gcc tgc tac agc ctg ctg gtc acc 96
Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr
20 25 30
gtg gcc ttc atc atc ttt tgg gtg aaa cgg ggc aga aag aaa ctc ctg 144
Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu
35 40 45
tat ata ttc aaa caa cca ttt atg aga cca gta caa act act caa gag 192
Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu
50 55 60
gaa gat ggc tgt agc tgc cga ttt cca gaa gaa gaa gaa gga gga tgt 240
Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys
65 70 75 80
gaa ctg cgg gtg aag ttc agc aga agc gcc gac gcc cct gcc tac cag 288
Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln
85 90 95
cag ggc cag aat cag ctg tac aac gag ctg aac ctg ggc aga agg gaa 336
Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
100 105 110
gag tac gac gtc ctg gat aag cgg aga ggc cgg gac cct gag atg ggc 384
Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
115 120 125
ggc aag cct cgg cgg aag aac ccc cag gaa ggc ctg tat aac gaa ctg 432
Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
130 135 140
cag aaa gac aag atg gcc gag gcc tac agc gag atc ggc atg aag ggc 480
Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
145 150 155 160
gag cgg agg cgg ggc aag ggc cac gac ggc ctg tat cag ggc ctg tcc 528
Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
165 170 175
acc gcc acc aag gat acc tac gac gcc ctg cac atg cag gcc ctg ccc 576
Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
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cca agg 582
Pro Arg
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 6
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Met Phe Trp Val
1 5 10 15
Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr
20 25 30
Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu
35 40 45
Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu
50 55 60
Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys
65 70 75 80
Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln
85 90 95
Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
100 105 110
Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
115 120 125
Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
130 135 140
Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
145 150 155 160
Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
165 170 175
Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
180 185 190
Pro Arg
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atccccgaca tccagatgac ccagaccacc tccagcctga gcgccagcct gggcgaccgg 120
gtgaccatca gctgccgggc cagccaggac atcagcaagt acctgaactg gtatcagcag 180
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cccagccggt ttagcggcag cggctccggc accgactaca gcctgaccat ctccaacctg 300
gaacaggaag atatcgccac ctacttttgc cagcagggca acacactgcc ctacaccttt 360
ggcggcggaa caaagctgga aatcaccggc agcacctccg gcagcggcaa gcctggcagc 420
ggcgagggca gcaccaaggg cgaggtgaag ctgcaggaaa gcggccctgg cctggtggcc 480
cccagccaga gcctgagcgt gacctgcacc gtgagcggcg tgagcctgcc cgactacggc 540
gtgagctgga tccggcagcc ccccaggaag ggcctggaat ggctgggcgt gatctggggc 600
agcgagacca cctactacaa cagcgccctg aagagccggc tgaccatcat caaggacaac 660
agcaagagcc aggtgttcct gaagatgaac agcctgcaga ccgacgacac cgccatctac 720
tactgcgcca agcactacta ctacggcggc agctacgcca tggactactg gggccagggc 780
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gctgagctgg tgaagcctgg ggcctcagtg aagatgtcct gcaaggcttc tggctacaca 900
tttaccagtt acaatatgca ctgggtaaag cagacacctg gacagggcct ggaatggatt 960
ggagctattt atccaggaaa tggtgatact tcctacaatc agaagttcaa aggcaaggcc 1020
acattgactg cagacaaatc ctccagcaca gcctacatgc agctcagcag cctgacatct 1080
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ttcgatgtct ggggcgcagg gaccacggtc accgtctcct caggcagtac tagcggtggt 1200
ggctccgggg gcggttccgg tgggggcggc agcagcgaca ttgtgctgac ccaatctcca 1260
gctatcctgt ctgcatctcc aggggagaag gtcacaatga cttgcagggc cagctcaagt 1320
gtaaattaca tggactggta ccagaagaag ccaggatcct cccccaaacc ctggatttat 1380
gccacatcca acctggcttc tggagtccct gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc 1440
tcttactctc tcacaatcag cagagtggag gctgaagatg ctgccactta ttactgccag 1500
cagtggagtt ttaatccacc cacgttcgga ggggggacca agctggaaat aaaagagagc 1560
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100 105 110
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Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
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Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
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aac aac tac aag acc acc cct ccc gtg ctg gac agc gac ggc agc ttc 2112
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
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aac gtc ttt agc tgc agc gtg atg cac gag gcc ctg cac aac cac tac 2208
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
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Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val
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Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His
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Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys
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Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr
485 490 495
Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly
500 505 510
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro
515 520 525
Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
530 535 540
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
545 550 555 560
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
565 570 575
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
580 585 590
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
595 600 605
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
610 615 620
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
625 630 635 640
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
645 650 655
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
660 665 670
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
675 680 685
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
690 695 700
Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
705 710 715 720
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
725 730 735
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met Phe Trp Val Leu
740 745 750
Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val
755 760 765
Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His
770 775 780
Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys
785 790 795 800
His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
805 810 815
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
820 825 830
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
835 840 845
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
850 855 860
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
865 870 875 880
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
885 890 895
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
900 905 910
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
915 920 925
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
930 935 940
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
945 950 955 960
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
965 970
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<211> 3402
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GMCSFRss-CD19scFv-Gly4serlinker-CD20scFv-CD8alphaHinge-CD8alphaTM
-41BB-CD3Zeta-T2A-EGFRt
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atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60
atccccgaca tccagatgac ccagaccacc tccagcctga gcgccagcct gggcgaccgg 120
gtgaccatca gctgccgggc cagccaggac atcagcaagt acctgaactg gtatcagcag 180
aagcccgacg gcaccgtcaa gctgctgatc taccacacca gccggctgca cagcggcgtg 240
cccagccggt ttagcggcag cggctccggc accgactaca gcctgaccat ctccaacctg 300
gaacaggaag atatcgccac ctacttttgc cagcagggca acacactgcc ctacaccttt 360
ggcggcggaa caaagctgga aatcaccggc agcacctccg gcagcggcaa gcctggcagc 420
ggcgagggca gcaccaaggg cgaggtgaag ctgcaggaaa gcggccctgg cctggtggcc 480
cccagccaga gcctgagcgt gacctgcacc gtgagcggcg tgagcctgcc cgactacggc 540
gtgagctgga tccggcagcc ccccaggaag ggcctggaat ggctgggcgt gatctggggc 600
agcgagacca cctactacaa cagcgccctg aagagccggc tgaccatcat caaggacaac 660
agcaagagcc aggtgttcct gaagatgaac agcctgcaga ccgacgacac cgccatctac 720
tactgcgcca agcactacta ctacggcggc agctacgcca tggactactg gggccagggc 780
accagcgtga ccgtgagcag cggaggtggt ggatccgagg tgcagctgca gcagtctggg 840
gctgagctgg tgaagcctgg ggcctcagtg aagatgtcct gcaaggcttc tggctacaca 900
tttaccagtt acaatatgca ctgggtaaag cagacacctg gacagggcct ggaatggatt 960
ggagctattt atccaggaaa tggtgatact tcctacaatc agaagttcaa aggcaaggcc 1020
acattgactg cagacaaatc ctccagcaca gcctacatgc agctcagcag cctgacatct 1080
gaggactctg cggactatta ctgtgcaaga tctaattatt acggtagtag ctactggttc 1140
ttcgatgtct ggggcgcagg gaccacggtc accgtctcct caggcagtac tagcggtggt 1200
ggctccgggg gcggttccgg tgggggcggc agcagcgaca ttgtgctgac ccaatctcca 1260
gctatcctgt ctgcatctcc aggggagaag gtcacaatga cttgcagggc cagctcaagt 1320
gtaaattaca tggactggta ccagaagaag ccaggatcct cccccaaacc ctggatttat 1380
gccacatcca acctggcttc tggagtccct gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc 1440
tcttactctc tcacaatcag cagagtggag gctgaagatg ctgccactta ttactgccag 1500
cagtggagtt ttaatccacc cacgttcgga ggggggacca agctggaaat aaaagagagc 1560
aagtacggac cgccctgccc cccttgccct aagcctacca ccacccctgc ccctagacct 1620
ccaacacccg ccccaacaat cgccagccag cctctgtctc tgaggcccga ggcttgtaga 1680
ccagctgctg gcggagccgt gcacaccaga ggactggatt tcgcctgcga catctacatc 1740
tgggcccctc tggccggcac atgtggcgtg ctgctgctga gcctcgtgat caccaagcgg 1800
ggcagaaaga aactgctgta catctttaag cagcccttca tgcggcccgt gcagaccacc 1860
caggaagagg acggctgctc ctgcagattc cccgaggaag aagaaggcgg ctgcgagctg 1920
agagtgaagt tcagcagatc cgccgacgcc cctgcctacc agcagggaca gaaccagctg 1980
tacaacgagc tgaacctggg cagacgggaa gagtacgacg tgctggacaa gcggagaggc 2040
cgggaccctg agatgggcgg aaagcccaga agaaagaacc cccaggaagg cctgtataac 2100
gaactgcaga aagacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggaatgaa gggcgagcgg 2160
agaagaggca agggccacga tggcctgtac cagggcctga gcaccgccac caaggacacc 2220
tatgacgccc tgcacatgca ggccctgcct ccaagactcg agggcggcgg agagggcaga 2280
ggaagtcttc taacatgcgg tgacgtggag gagaatcccg gccctaggat gcttctcctg 2340
gtgacaagcc ttctgctctg tgagttacca cacccagcat tcctcctgat cccacgcaaa 2400
gtgtgtaacg gaataggtat tggtgaattt aaagactcac tctccataaa tgctacgaat 2460
attaaacact tcaaaaactg cacctccatc agtggcgatc tccacatcct gccggtggca 2520
tttaggggtg actccttcac acatactcct cctctggatc cacaggaact ggatattctg 2580
aaaaccgtaa aggaaatcac agggtttttg ctgattcagg cttggcctga aaacaggacg 2640
gacctccatg cctttgagaa cctagaaatc atacgcggca ggaccaagca acatggtcag 2700
ttttctcttg cagtcgtcag cctgaacata acatccttgg gattacgctc cctcaaggag 2760
ataagtgatg gagatgtgat aatttcagga aacaaaaatt tgtgctatgc aaatacaata 2820
aactggaaaa aactgtttgg gacctccggt cagaaaacca aaattataag caacagaggt 2880
gaaaacagct gcaaggccac aggccaggtc tgccatgcct tgtgctcccc cgagggctgc 2940
tggggcccgg agcccaggga ctgcgtctct tgccggaatg tcagccgagg cagggaatgc 3000
gtggacaagt gcaaccttct ggagggtgag ccaagggagt ttgtggagaa ctctgagtgc 3060
atacagtgcc acccagagtg cctgcctcag gccatgaaca tcacctgcac aggacgggga 3120
ccagacaact gtatccagtg tgcccactac attgacggcc cccactgcgt caagacctgc 3180
ccggcaggag tcatgggaga aaacaacacc ctggtctgga agtacgcaga cgccggccat 3240
gtgtgccacc tgtgccatcc aaactgcacc tacggatgca ctgggccagg tcttgaaggc 3300
tgtccaacga atgggcctaa gatcccgtcc atcgccactg ggatggtggg ggccctcctc 3360
ttgctgctgg tggtggccct ggggatcggc ctcttcatgt ga 3402
<210> 11
<211> 3402
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GMCSFRss-CD19scFv-Gly4serlinker-CD20scFv-CD8alphaHinge-CD8alphaTM
-41BB-CD3Zeta-T2A-EGFRt
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(3402)
<400> 11
atg ctg ctg ctg gtg acc agc ctg ctg ctg tgc gag ctg ccc cac ccc 48
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
gcc ttt ctg ctg atc ccc gac atc cag atg acc cag acc acc tcc agc 96
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser
20 25 30
ctg agc gcc agc ctg ggc gac cgg gtg acc atc agc tgc cgg gcc agc 144
Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
35 40 45
cag gac atc agc aag tac ctg aac tgg tat cag cag aag ccc gac ggc 192
Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly
50 55 60
acc gtc aag ctg ctg atc tac cac acc agc cgg ctg cac agc ggc gtg 240
Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val
65 70 75 80
ccc agc cgg ttt agc ggc agc ggc tcc ggc acc gac tac agc ctg acc 288
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr
85 90 95
atc tcc aac ctg gaa cag gaa gat atc gcc acc tac ttt tgc cag cag 336
Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln
100 105 110
ggc aac aca ctg ccc tac acc ttt ggc ggc gga aca aag ctg gaa atc 384
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
115 120 125
acc ggc agc acc tcc ggc agc ggc aag cct ggc agc ggc gag ggc agc 432
Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser
130 135 140
acc aag ggc gag gtg aag ctg cag gaa agc ggc cct ggc ctg gtg gcc 480
Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala
145 150 155 160
ccc agc cag agc ctg agc gtg acc tgc acc gtg agc ggc gtg agc ctg 528
Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu
165 170 175
ccc gac tac ggc gtg agc tgg atc cgg cag ccc ccc agg aag ggc ctg 576
Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu
180 185 190
gaa tgg ctg ggc gtg atc tgg ggc agc gag acc acc tac tac aac agc 624
Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser
195 200 205
gcc ctg aag agc cgg ctg acc atc atc aag gac aac agc aag agc cag 672
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln
210 215 220
gtg ttc ctg aag atg aac agc ctg cag acc gac gac acc gcc atc tac 720
Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr
225 230 235 240
tac tgc gcc aag cac tac tac tac ggc ggc agc tac gcc atg gac tac 768
Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
245 250 255
tgg ggc cag ggc acc agc gtg acc gtg agc agc gga ggt ggt gga tcc 816
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
260 265 270
gag gtg cag ctg cag cag tct ggg gct gag ctg gtg aag cct ggg gcc 864
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
275 280 285
tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct ggc tac aca ttt acc agt tac 912
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
290 295 300
aat atg cac tgg gta aag cag aca cct gga cag ggc ctg gaa tgg att 960
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
305 310 315 320
gga gct att tat cca gga aat ggt gat act tcc tac aat cag aag ttc 1008
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
325 330 335
aaa ggc aag gcc aca ttg act gca gac aaa tcc tcc agc aca gcc tac 1056
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
340 345 350
atg cag ctc agc agc ctg aca tct gag gac tct gcg gac tat tac tgt 1104
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Asp Tyr Tyr Cys
355 360 365
gca aga tct aat tat tac ggt agt agc tac tgg ttc ttc gat gtc tgg 1152
Ala Arg Ser Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp
370 375 380
ggc gca ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca ggc agt act agc ggt ggt 1200
Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Gly
385 390 395 400
ggc tcc ggg ggc ggt tcc ggt ggg ggc ggc agc agc gac att gtg ctg 1248
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Asp Ile Val Leu
405 410 415
acc caa tct cca gct atc ctg tct gca tct cca ggg gag aag gtc aca 1296
Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr
420 425 430
atg act tgc agg gcc agc tca agt gta aat tac atg gac tgg tac cag 1344
Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met Asp Trp Tyr Gln
435 440 445
aag aag cca gga tcc tcc ccc aaa ccc tgg att tat gcc aca tcc aac 1392
Lys Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn
450 455 460
ctg gct tct gga gtc cct gct cgc ttc agt ggc agt ggg tct ggg acc 1440
Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
465 470 475 480
tct tac tct ctc aca atc agc aga gtg gag gct gaa gat gct gcc act 1488
Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr
485 490 495
tat tac tgc cag cag tgg agt ttt aat cca ccc acg ttc gga ggg ggg 1536
Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly
500 505 510
acc aag ctg gaa ata aaa gag agc aag tac gga ccg ccc tgc ccc cct 1584
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro
515 520 525
tgc cct aag cct acc acc acc cct gcc cct aga cct cca aca ccc gcc 1632
Cys Pro Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala
530 535 540
cca aca atc gcc agc cag cct ctg tct ctg agg ccc gag gct tgt aga 1680
Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg
545 550 555 560
cca gct gct ggc gga gcc gtg cac acc aga gga ctg gat ttc gcc tgc 1728
Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys
565 570 575
gac atc tac atc tgg gcc cct ctg gcc ggc aca tgt ggc gtg ctg ctg 1776
Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu
580 585 590
ctg agc ctc gtg atc acc aag cgg ggc aga aag aaa ctg ctg tac atc 1824
Leu Ser Leu Val Ile Thr Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile
595 600 605
ttt aag cag ccc ttc atg cgg ccc gtg cag acc acc cag gaa gag gac 1872
Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp
610 615 620
ggc tgc tcc tgc aga ttc ccc gag gaa gaa gaa ggc ggc tgc gag ctg 1920
Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
625 630 635 640
aga gtg aag ttc agc aga tcc gcc gac gcc cct gcc tac cag cag gga 1968
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
645 650 655
cag aac cag ctg tac aac gag ctg aac ctg ggc aga cgg gaa gag tac 2016
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
660 665 670
gac gtg ctg gac aag cgg aga ggc cgg gac cct gag atg ggc gga aag 2064
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
675 680 685
ccc aga aga aag aac ccc cag gaa ggc ctg tat aac gaa ctg cag aaa 2112
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
690 695 700
gac aag atg gcc gag gcc tac agc gag atc gga atg aag ggc gag cgg 2160
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
705 710 715 720
aga aga ggc aag ggc cac gat ggc ctg tac cag ggc ctg agc acc gcc 2208
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
725 730 735
acc aag gac acc tat gac gcc ctg cac atg cag gcc ctg cct cca aga 2256
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
740 745 750
ctc gag ggc ggc gga gag ggc aga gga agt ctt cta aca tgc ggt gac 2304
Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp
755 760 765
gtg gag gag aat ccc ggc cct agg atg ctt ctc ctg gtg aca agc ctt 2352
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu
770 775 780
ctg ctc tgt gag tta cca cac cca gca ttc ctc ctg atc cca cgc aaa 2400
Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys
785 790 795 800
gtg tgt aac gga ata ggt att ggt gaa ttt aaa gac tca ctc tcc ata 2448
Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile
805 810 815
aat gct acg aat att aaa cac ttc aaa aac tgc acc tcc atc agt ggc 2496
Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly
820 825 830
gat ctc cac atc ctg ccg gtg gca ttt agg ggt gac tcc ttc aca cat 2544
Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His
835 840 845
act cct cct ctg gat cca cag gaa ctg gat att ctg aaa acc gta aag 2592
Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys
850 855 860
gaa atc aca ggg ttt ttg ctg att cag gct tgg cct gaa aac agg acg 2640
Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr
865 870 875 880
gac ctc cat gcc ttt gag aac cta gaa atc ata cgc ggc agg acc aag 2688
Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys
885 890 895
caa cat ggt cag ttt tct ctt gca gtc gtc agc ctg aac ata aca tcc 2736
Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser
900 905 910
ttg gga tta cgc tcc ctc aag gag ata agt gat gga gat gtg ata att 2784
Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile
915 920 925
tca gga aac aaa aat ttg tgc tat gca aat aca ata aac tgg aaa aaa 2832
Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys
930 935 940
ctg ttt ggg acc tcc ggt cag aaa acc aaa att ata agc aac aga ggt 2880
Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly
945 950 955 960
gaa aac agc tgc aag gcc aca ggc cag gtc tgc cat gcc ttg tgc tcc 2928
Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser
965 970 975
ccc gag ggc tgc tgg ggc ccg gag ccc agg gac tgc gtc tct tgc cgg 2976
Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg
980 985 990
aat gtc agc cga ggc agg gaa tgc gtg gac aag tgc aac ctt ctg gag 3024
Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu
995 1000 1005
ggt gag cca agg gag ttt gtg gag aac tct gag tgc ata cag tgc 3069
Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys
1010 1015 1020
cac cca gag tgc ctg cct cag gcc atg aac atc acc tgc aca gga 3114
His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
1025 1030 1035
cgg gga cca gac aac tgt atc cag tgt gcc cac tac att gac ggc 3159
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly
1040 1045 1050
ccc cac tgc gtc aag acc tgc ccg gca gga gtc atg gga gaa aac 3204
Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn
1055 1060 1065
aac acc ctg gtc tgg aag tac gca gac gcc ggc cat gtg tgc cac 3249
Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His
1070 1075 1080
ctg tgc cat cca aac tgc acc tac gga tgc act ggg cca ggt ctt 3294
Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu
1085 1090 1095
gaa ggc tgt cca acg aat ggg cct aag atc ccg tcc atc gcc act 3339
Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr
1100 1105 1110
ggg atg gtg ggg gcc ctc ctc ttg ctg ctg gtg gtg gcc ctg ggg 3384
Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly
1115 1120 1125
atc ggc ctc ttc atg tga 3402
Ile Gly Leu Phe Met
1130
<210> 12
<211> 1133
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 12
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly
50 55 60
Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr
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Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln
100 105 110
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
115 120 125
Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser
130 135 140
Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala
145 150 155 160
Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu
165 170 175
Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu
180 185 190
Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser
195 200 205
Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln
210 215 220
Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
260 265 270
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
275 280 285
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
290 295 300
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
305 310 315 320
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
325 330 335
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
340 345 350
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Asp Tyr Tyr Cys
355 360 365
Ala Arg Ser Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp
370 375 380
Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Gly
385 390 395 400
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Asp Ile Val Leu
405 410 415
Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr
420 425 430
Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met Asp Trp Tyr Gln
435 440 445
Lys Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn
450 455 460
Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
465 470 475 480
Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr
485 490 495
Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly
500 505 510
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro
515 520 525
Cys Pro Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala
530 535 540
Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg
545 550 555 560
Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys
565 570 575
Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu
580 585 590
Leu Ser Leu Val Ile Thr Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile
595 600 605
Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp
610 615 620
Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
625 630 635 640
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
645 650 655
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
660 665 670
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
675 680 685
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
690 695 700
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
705 710 715 720
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
725 730 735
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
740 745 750
Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp
755 760 765
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu
770 775 780
Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys
785 790 795 800
Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile
805 810 815
Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly
820 825 830
Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His
835 840 845
Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys
850 855 860
Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr
865 870 875 880
Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys
885 890 895
Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser
900 905 910
Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile
915 920 925
Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys
930 935 940
Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly
945 950 955 960
Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser
965 970 975
Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg
980 985 990
Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu
995 1000 1005
Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys
1010 1015 1020
His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
1025 1030 1035
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly
1040 1045 1050
Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn
1055 1060 1065
Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His
1070 1075 1080
Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu
1085 1090 1095
Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr
1100 1105 1110
Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly
1115 1120 1125
Ile Gly Leu Phe Met
1130
<210> 13
<211> 1146
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T2A-EGFRt
<400> 13
ctcgagggcg gcggagaggg cagaggaagt cttctaacat gcggtgacgt ggaggagaat 60
cccggcccta ggatgcttct cctggtgaca agccttctgc tctgtgagtt accacaccca 120
gcattcctcc tgatcccacg caaagtgtgt aacggaatag gtattggtga atttaaagac 180
tcactctcca taaatgctac gaatattaaa cacttcaaaa actgcacctc catcagtggc 240
gatctccaca tcctgccggt ggcatttagg ggtgactcct tcacacatac tcctcctctg 300
gatccacagg aactggatat tctgaaaacc gtaaaggaaa tcacagggtt tttgctgatt 360
caggcttggc ctgaaaacag gacggacctc catgcctttg agaacctaga aatcatacgc 420
ggcaggacca agcaacatgg tcagttttct cttgcagtcg tcagcctgaa cataacatcc 480
ttgggattac gctccctcaa ggagataagt gatggagatg tgataatttc aggaaacaaa 540
aatttgtgct atgcaaatac aataaactgg aaaaaactgt ttgggacctc cggtcagaaa 600
accaaaatta taagcaacag aggtgaaaac agctgcaagg ccacaggcca ggtctgccat 660
gccttgtgct cccccgaggg ctgctggggc ccggagccca gggactgcgt ctcttgccgg 720
aatgtcagcc gaggcaggga atgcgtggac aagtgcaacc ttctggaggg tgagccaagg 780
gagtttgtgg agaactctga gtgcatacag tgccacccag agtgcctgcc tcaggccatg 840
aacatcacct gcacaggacg gggaccagac aactgtatcc agtgtgccca ctacattgac 900
ggcccccact gcgtcaagac ctgcccggca ggagtcatgg gagaaaacaa caccctggtc 960
tggaagtacg cagacgccgg ccatgtgtgc cacctgtgcc atccaaactg cacctacgga 1020
tgcactgggc caggtcttga aggctgtcca acgaatgggc ctaagatccc gtccatcgcc 1080
actgggatgg tgggggccct cctcttgctg ctggtggtgg ccctggggat cggcctcttc 1140
atgtga 1146
<210> 14
<211> 1146
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T2A-EGFRt
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1146)
<400> 14
ctc gag ggc ggc gga gag ggc aga gga agt ctt cta aca tgc ggt gac 48
Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp
1 5 10 15
gtg gag gag aat ccc ggc cct agg atg ctt ctc ctg gtg aca agc ctt 96
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu
20 25 30
ctg ctc tgt gag tta cca cac cca gca ttc ctc ctg atc cca cgc aaa 144
Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys
35 40 45
gtg tgt aac gga ata ggt att ggt gaa ttt aaa gac tca ctc tcc ata 192
Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile
50 55 60
aat gct acg aat att aaa cac ttc aaa aac tgc acc tcc atc agt ggc 240
Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly
65 70 75 80
gat ctc cac atc ctg ccg gtg gca ttt agg ggt gac tcc ttc aca cat 288
Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His
85 90 95
act cct cct ctg gat cca cag gaa ctg gat att ctg aaa acc gta aag 336
Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys
100 105 110
gaa atc aca ggg ttt ttg ctg att cag gct tgg cct gaa aac agg acg 384
Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr
115 120 125
gac ctc cat gcc ttt gag aac cta gaa atc ata cgc ggc agg acc aag 432
Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys
130 135 140
caa cat ggt cag ttt tct ctt gca gtc gtc agc ctg aac ata aca tcc 480
Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser
145 150 155 160
ttg gga tta cgc tcc ctc aag gag ata agt gat gga gat gtg ata att 528
Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile
165 170 175
tca gga aac aaa aat ttg tgc tat gca aat aca ata aac tgg aaa aaa 576
Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys
180 185 190
ctg ttt ggg acc tcc ggt cag aaa acc aaa att ata agc aac aga ggt 624
Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly
195 200 205
gaa aac agc tgc aag gcc aca ggc cag gtc tgc cat gcc ttg tgc tcc 672
Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser
210 215 220
ccc gag ggc tgc tgg ggc ccg gag ccc agg gac tgc gtc tct tgc cgg 720
Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg
225 230 235 240
aat gtc agc cga ggc agg gaa tgc gtg gac aag tgc aac ctt ctg gag 768
Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu
245 250 255
ggt gag cca agg gag ttt gtg gag aac tct gag tgc ata cag tgc cac 816
Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His
260 265 270
cca gag tgc ctg cct cag gcc atg aac atc acc tgc aca gga cgg gga 864
Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly
275 280 285
cca gac aac tgt atc cag tgt gcc cac tac att gac ggc ccc cac tgc 912
Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys
290 295 300
gtc aag acc tgc ccg gca gga gtc atg gga gaa aac aac acc ctg gtc 960
Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val
305 310 315 320
tgg aag tac gca gac gcc ggc cat gtg tgc cac ctg tgc cat cca aac 1008
Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn
325 330 335
tgc acc tac gga tgc act ggg cca ggt ctt gaa ggc tgt cca acg aat 1056
Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn
340 345 350
ggg cct aag atc ccg tcc atc gcc act ggg atg gtg ggg gcc ctc ctc 1104
Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu
355 360 365
ttg ctg ctg gtg gtg gcc ctg ggg atc ggc ctc ttc atg tga 1146
Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
370 375 380
<210> 15
<211> 381
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 15
Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu
20 25 30
Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys
35 40 45
Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile
50 55 60
Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly
65 70 75 80
Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His
85 90 95
Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys
100 105 110
Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr
115 120 125
Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys
130 135 140
Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser
145 150 155 160
Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile
165 170 175
Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys
180 185 190
Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly
195 200 205
Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser
210 215 220
Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg
225 230 235 240
Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu
245 250 255
Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His
260 265 270
Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly
275 280 285
Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys
290 295 300
Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val
305 310 315 320
Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn
325 330 335
Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn
340 345 350
Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu
355 360 365
Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
370 375 380
SEQUENCE LISTING
<110> Seattle Children's Hospital d/b/a Seattle Children's
Research Institute
<120> Bispecific Chimeric Antigen Receptors and Therapeutic Uses
Thereof
<150> US 61/598,216
<151> 2012-02-13
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3273
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GMCSFRss-CD19scFv-Gly4Ser1linker-CD20scFv-IgG4Hinge-CD28tm-41BB-C
D3zeta-T2A-EGFRt_epHIV7
<400> 1
atgctgctgc tggtgaccag cctgctgctg tgcgagctgc cccaccccgc ctttctgctg 60
atccccatga cccagaccac ctccagcctg agcgccagcc tgggcgaccg ggtgaccatc 120
agctgccggg ccagccagga catcagcaag tacctgaact ggtatcagca gaagcccgac 180
ggcaccgtca agctgctgat ctaccacacc agccggctgc acagcggcgt gcccagccgg 240
tttagcggca gcggctccgg caccgactac agcctgacca tctccaacct ggaacaggaa 300
gatatcgcca cctacttttg ccagcagggc aacacactgc cctacacctt tggcggcgga 360
acaaagctgg aaatcaccgg cagcacctcc ggcagcggca agcctggcag cggcgagggc 420
agcaccaagg gcgaggtgaa gctgcaggaa agcggccctg gcctggtggc ccccagccag 480
agcctgagcg tgacctgcac cgtgagcggc gtgagcctgc ccgactacgg cgtgagctgg 540
atccggcagc cccccaggaa gggcctggaa tggctgggcg tgatctgggg cagcgagacc 600
acctactaca acagcgccct gaagagccgg ctgaccatca tcaaggacaa cagcaagagc 660
caggtgttcc tgaagatgaa cagcctgcag accgacgaca ccgccatcta ctactgcgcc 720
aagcactact actacggcgg cagctacgcc atggactact ggggccaggg caccagcgtg 780
accgtgagca gcggaggtgg tggatccgag gtgcagctgc agcagtctgg ggctgagctg 840
gtgaagcctg gggcctcagt gaagatgtcc tgcaaggctt ctggctacac atttaccagt 900
tacaatatgc actgggtaaa gcagacacct ggacagggcc tggaatggat tggagctatt 960
tatccaggaa atggtgatac ttcctacaat cagaagttca aaggcaaggc cacattgact 1020
gcagacaaat cctccagcac agcctacatg cagctcagca gcctgacatc tgaggactct 1080
gcggactatt actgtgcaag atctaattat tacggtagta gctactggtt cttcgatgtc 1140
tggggcgcag ggaccacggt caccgtctcc tcaggcagta ctagcggtgg tggctccggg 1200
ggcggttccg gtgggggcgg cagcagcgac attgtgctga cccaatctcc agctatcctg 1260
tctgcatctc caggggagaa ggtcacaatg acttgcaggg ccagctcaag tgtaaattac 1320
atggactggt accagaagaa gccaggatcc tcccccaaac cctggattta tgccacatcc 1380
aacctggctt ctggagtccc tgctcgcttc agtggcagtg ggtctgggac ctcttactct 1440
ctcacaatca gcagagtgga ggctgaagat gctgccactt attactgcca gcagtggagt 1500
tttaatccac ccacgttcgg aggggggacc aagctggaaa taaaagagag caagtacgga 1560
ccgccctgcc ccccttgccc tatgttctgg gtgctggtgg tggtcggagg cgtgctggcc 1620
tgctacagcc tgctggtcac cgtggccttc atcatctttt gggtgaaacg gggcagaaag 1680
aaactcctgt atatattcaa acaaccattt atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa 1740
gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa gaagaaggag gatgtgaact gcgggtgaag 1800
ttcagcagaa gcgccgacgc ccctgcctac cagcagggcc agaatcagct gtacaacgag 1860
ctgaacctgg gcagaaggga agagtacgac gtcctggata agcggagagg ccgggaccct 1920
gagatgggcg gcaagcctcg gcggaagaac ccccaggaag gcctgtataa cgaactgcag 1980
aaagacaaga tggccgaggc ctacagcgag atcggcatga agggcgagcg gaggcggggc 2040
aagggccacg acggcctgta tcagggcctg tccaccgcca ccaaggatac ctacgacgcc 2100
ctgcacatgc aggccctgcc cccaaggctc gagggcggcg gagagggcag aggaagtctt 2160
ctaacatgcg gtgacgtgga ggagaatccc ggccctagga tgcttctcct ggtgacaagc 2220
cttctgctct gtgagttacc acacccagca ttcctcctga tcccacgcaa agtgtgtaac 2280
ggaataggta ttggtgaatt taaagactca ctctccataa atgctacgaa tattaaacac 2340
ttcaaaaact gcacctccat cagtggcgat ctccacatcc tgccggtggc atttaggggt 2400
gactccttca cacatactcc tcctctggat ccacaggaac tggatattct gaaaaccgta 2460
aaggaaatca cagggttttt gctgattcag gcttggcctg aaaacaggac ggacctccat 2520
gcctttgaga acctagaaat catacgcggc aggaccaagc aacatggtca gttttctctt 2580
gcagtcgtca gcctgaacat aacatccttg ggattacgct ccctcaagga gataagtgat 2640
ggagatgtga taatttcagg aaacaaaaat ttgtgctatg caaatacaat aaactggaaa 2700
aaactgtttg ggacctccgg tcagaaaacc aaaattataa gcaacagagg tgaaaacagc 2760
tgcaaggcca caggccaggt ctgccatgcc ttgtgctccc ccgagggctg ctggggcccg 2820
gagcccaggg actgcgtctc ttgccggaat gtcagccgag gcagggaatg cgtggacaag 2880
tgcaaccttc tggagggtga gccaagggag tttgtggaga actctgagtg catacagtgc 2940
cacccagagt gcctgcctca ggccatgaac atcacctgca caggacgggg accagacaac 3000
tgtatccagt gtgcccacta cattgacggc ccccactgcg tcaagacctg cccggcagga 3060
gtcatgggag aaaacaacac cctggtctgg aagtacgcag acgccggcca tgtgtgccac 3120
ctgtgccatc caaactgcac ctacggatgc actgggccag gtcttgaagg ctgtccaacg 3180
aatgggccta agatcccgtc catcgccact gggatggtgg gggccctcct cttgctgctg 3240
gtggtggccc tggggatcgg cctcttcatg tga 3273
<210> 2
<211> 3273
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GMCSFRss-CD19scFv-Gly4Ser1linker-CD20scFv-IgG4Hinge-CD28tm-41BB-C
D3zeta-T2A-EGFRt_epHIV7
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(3273)
<400> 2
atg ctg ctg ctg gtg acc agc ctg ctg ctg tgc gag ctg ccc cac ccc 48
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
gcc ttt ctg ctg atc ccc atg acc cag acc acc tcc agc ctg agc gcc 96
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala
20 25 30
agc ctg ggc gac cgg gtg acc atc agc tgc cgg gcc agc cag gac atc 144
Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile
35 40 45
agc aag tac ctg aac tgg tat cag cag aag ccc gac ggc acc gtc aag 192
Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys
50 55 60
ctg ctg atc tac cac acc agc cgg ctg cac agc ggc gtg ccc agc cgg 240
Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg
65 70 75 80
ttt agc ggc agc ggc tcc ggc acc gac tac agc ctg acc atc tcc aac 288
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn
85 90 95
ctg gaa cag gaa gat atc gcc acc tac ttt tgc cag cag ggc aac aca 336
Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr
100 105 110
ctg ccc tac acc ttt ggc ggc gga aca aag ctg gaa atc acc ggc agc 384
Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser
115 120 125
acc tcc ggc agc ggc aag cct ggc agc ggc gag ggc agc acc aag ggc 432
Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly
130 135 140
gag gtg aag ctg cag gaa agc ggc cct ggc ctg gtg gcc ccc agc cag 480
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
145 150 155 160
agc ctg agc gtg acc tgc acc gtg agc ggc gtg agc ctg ccc gac tac 528
Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
165 170 175
ggc gtg agc tgg atc cgg cag ccc ccc agg aag ggc ctg gaa tgg ctg 576
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu
180 185 190
ggc gtg atc tgg ggc agc gag acc acc tac tac aac agc gcc ctg aag 624
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
195 200 205
agc cgg ctg acc atc atc aag gac aac agc aag agc cag gtg ttc ctg 672
Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
210 215 220
aag atg aac agc ctg cag acc gac gac acc gcc atc tac tac tgc gcc 720
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
225 230 235 240
aag cac tac tac tac ggc ggc agc tac gcc atg gac tac tgg ggc cag 768
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
245 250 255
ggc acc agc gtg acc gtg agc agc gga ggt ggt gga tcc gag gtg cag 816
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
260 265 270
ctg cag cag tct ggg gct gag ctg gtg aag cct ggg gcc tca gtg aag 864
Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys
275 280 285
atg tcc tgc aag gct tct ggc tac aca ttt acc agt tac aat atg cac 912
Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His
290 295 300
tgg gta aag cag aca cct gga cag ggc ctg gaa tgg att gga gct att 960
Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile
305 310 315 320
tat cca gga aat ggt gat act tcc tac aat cag aag ttc aaa ggc aag 1008
Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys
325 330 335
gcc aca ttg act gca gac aaa tcc tcc agc aca gcc tac atg cag ctc 1056
Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu
340 345 350
agc agc ctg aca tct gag gac tct gcg gac tat tac tgt gca aga tct 1104
Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser
355 360 365
aat tat tac ggt agt agc tac tgg ttc ttc gat gtc tgg ggc gca ggg 1152
Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly
370 375 380
acc acg gtc acc gtc tcc tca ggc agt act agc ggt ggt ggc tcc ggg 1200
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly
385 390 395 400
ggc ggt tcc ggt ggg ggc ggc agc agc gac att gtg ctg acc caa tct 1248
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser
405 410 415
cca gct atc ctg tct gca tct cca ggg gag aag gtc aca atg act tgc 1296
Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys
420 425 430
agg gcc agc tca agt gta aat tac atg gac tgg tac cag aag aag cca 1344
Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met Asp Trp Tyr Gln Lys Lys Pro
435 440 445
gga tcc tcc ccc aaa ccc tgg att tat gcc aca tcc aac ctg gct tct 1392
Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser
450 455 460
gga gtc cct gct cgc ttc agt ggc agt ggg tct ggg acc tct tac tct 1440
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser
465 470 475 480
ctc aca atc agc aga gtg gag gct gaa gat gct gcc act tat tac tgc 1488
Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
485 490 495
cag cag tgg agt ttt aat cca ccc acg ttc gga ggg ggg acc aag ctg 1536
Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
500 505 510
gaa ata aaa gag agc aag tac gga ccg ccc tgc ccc cct tgc cct atg 1584
Glu Ile Lys Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Met
515 520 525
ttc tgg gtg ctg gtg gtg gtc gga ggc gtg ctg gcc tgc tac agc ctg 1632
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
530 535 540
ctg gtc acc gtg gcc ttc atc atc ttt tgg gtg aaa cgg ggc aga aag 1680
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys
545 550 555 560
aaa ctc ctg tat ata ttc aaa caa cca ttt atg aga cca gta caa act 1728
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
565 570 575
act caa gag gaa gat ggc tgt agc tgc cga ttt cca gaa gaa gaa gaa 1776
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
580 585 590
gga gga tgt gaa ctg cgg gtg aag ttc agc aga agc gcc gac gcc cct 1824
Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
595 600 605
gcc tac cag cag ggc cag aat cag ctg tac aac gag ctg aac ctg ggc 1872
Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
610 615 620
aga agg gaa gag tac gac gtc ctg gat aag cgg aga ggc cgg gac cct 1920
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
625 630 635 640
gag atg ggc ggc aag cct cgg cgg aag aac ccc cag gaa ggc ctg tat 1968
Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
645 650 655
aac gaa ctg cag aaa gac aag atg gcc gag gcc tac agc gag atc ggc 2016
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
660 665 670
atg aag ggc gag cgg agg cgg ggc aag ggc cac gac ggc ctg tat cag 2064
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
675 680 685
ggc ctg tcc acc gcc acc aag gat acc tac gac gcc ctg cac atg cag 2112
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
690 695 700
gcc ctg ccc cca agg ctc gag ggc ggc gga gag ggc aga gga agt ctt 2160
Ala Leu Pro Pro Arg Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu
705 710 715 720
cta aca tgc ggt gac gtg gag gag aat ccc ggc cct agg atg ctt ctc 2208
Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Met Leu Leu
725 730 735
ctg gtg aca agc ctt ctg ctc tgt gag tta cca cac cca gca ttc ctc 2256
Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro Ala Phe Leu
740 745 750
ctg atc cca cgc aaa gtg tgt aac gga ata ggt att ggt gaa ttt aaa 2304
Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys
755 760 765
gac tca ctc tcc ata aat gct acg aat att aaa cac ttc aaa aac tgc 2352
Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys
770 775 780
acc tcc atc agt ggc gat ctc cac atc ctg ccg gtg gca ttt agg ggt 2400
Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly
785 790 795 800
gac tcc ttc aca cat act cct cct ctg gat cca cag gaa ctg gat att 2448
Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile
805 810 815
ctg aaa acc gta aag gaa atc aca ggg ttt ttg ctg att cag gct tgg 2496
Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp
820 825 830
cct gaa aac agg acg gac ctc cat gcc ttt gag aac cta gaa atc ata 2544
Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile
835 840 845
cgc ggc agg acc aag caa cat ggt cag ttt tct ctt gca gtc gtc agc 2592
Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser
850 855 860
ctg aac ata aca tcc ttg gga tta cgc tcc ctc aag gag ata agt gat 2640
Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp
865 870 875 880
gga gat gtg ata att tca gga aac aaa aat ttg tgc tat gca aat aca 2688
Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr
885 890 895
ata aac tgg aaa aaa ctg ttt ggg acc tcc ggt cag aaa acc aaa att 2736
Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile
900 905 910
ata agc aac aga ggt gaa aac agc tgc aag gcc aca ggc cag gtc tgc 2784
Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys
915 920 925
cat gcc ttg tgc tcc ccc gag ggc tgc tgg ggc ccg gag ccc agg gac 2832
His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp
930 935 940
tgc gtc tct tgc cgg aat gtc agc cga ggc agg gaa tgc gtg gac aag 2880
Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys
945 950 955 960
tgc aac ctt ctg gag ggt gag cca agg gag ttt gtg gag aac tct gag 2928
Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu
965 970 975
tgc ata cag tgc cac cca gag tgc ctg cct cag gcc atg aac atc acc 2976
Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr
980 985 990
tgc aca gga cgg gga cca gac aac tgt atc cag tgt gcc cac tac att 3024
Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile
995 1000 1005
gac ggc ccc cac tgc gtc aag acc tgc ccg gca gga gtc atg gga 3069
Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly
1010 1015 1020
gaa aac aac acc ctg gtc tgg aag tac gca gac gcc ggc cat gtg 3114
Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val
1025 1030 1035
tgc cac ctg tgc cat cca aac tgc acc tac gga tgc act ggg cca 3159
Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro
1040 1045 1050
ggt ctt gaa ggc tgt cca acg aat ggg cct aag atc ccg tcc atc 3204
Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile
1055 1060 1065
gcc act ggg atg gtg ggg gcc ctc ctc ttg ctg ctg gtg gtg gcc 3249
Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala
1070 1075 1080
ctg ggg atc ggc ctc ttc atg tga 3273
Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
1085 1090
<210> 3
<211> 1090
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 3
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala
20 25 30
Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile
35 40 45
Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys
50 55 60
Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg
65 70 75 80
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn
85 90 95
Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr
100 105 110
Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser
115 120 125
Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly
130 135 140
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
145 150 155 160
Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
165 170 175
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu
180 185 190
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
195 200 205
Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
210 215 220
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
225 230 235 240
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
245 250 255
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln
260 265 270
Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys
275 280 285
Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn Met His
290 295 300
Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile
305 310 315 320
Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys
325 330 335
Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu
340 345 350
Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser
355 360 365
Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly
370 375 380
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly
385 390 395 400
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser
405 410 415
Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys
420 425 430
Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met Asp Trp Tyr Gln Lys Lys Pro
435 440 445
Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser
450 455 460
Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser
465 470 475 480
Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys
485 490 495
Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
500 505 510
Glu Ile Lys Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Met
515 520 525
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
530 535 540
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Lys Arg Gly Arg Lys
545 550 555 560
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
565 570 575
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
580 585 590
Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
595 600 605
Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
610 615 620
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
625 630 635 640
Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
645 650 655
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
660 665 670
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
675 680 685
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
690 695 700
Ala Leu Pro Pro Arg Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu
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Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Met Leu Leu
725 730 735
Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro Ala Phe Leu
740 745 750
Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys
755 760 765
Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys
770 775 780
Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly
785 790 795 800
Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile
805 810 815
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835 840 845
Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser
850 855 860
Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp
865 870 875 880
Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr
885 890 895
Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile
900 905 910
Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys
915 920 925
His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp
930 935 940
Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys
945 950 955 960
Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu
965 970 975
Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr
980 985 990
Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile
995 1000 1005
Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly
1010 1015 1020
Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val
1025 1030 1035
Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro
1040 1045 1050
Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile
1055 1060 1065
Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala
1070 1075 1080
Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
1085 1090
<210> 4
<211> 582
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 180
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 240
gaactgcggg tgaagttcag cagaagcgcc gacgcccctg cctaccagca gggccagaat 300
cagctgtaca acgagctgaa cctgggcaga agggaagagt acgacgtcct ggataagcgg 360
agaggccggg accctgagat gggcggcaag cctcggcgga agaaccccca ggaaggcctg 420
tataacgaac tgcagaaaga caagatggcc gaggcctaca gcgagatcgg catgaagggc 480
gagcggaggc ggggcaaggg ccacgacggc ctgtatcagg gcctgtccac cgccaccaag 540
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<211> 582
<212> DNA
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<223> IgG4hinge-CD28tm-41BB-CD3Zeta
<220>
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gag agc aag tac gga ccg ccc tgc ccc cct tgc cct atg ttc tgg gtg 48
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1 5 10 15
ctg gtg gtg gtc gga ggc gtg ctg gcc tgc tac agc ctg ctg gtc acc 96
Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr
20 25 30
gtg gcc ttc atc atc ttt tgg gtg aaa cgg ggc aga aag aaa ctc ctg 144
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35 40 45
tat ata ttc aaa caa cca ttt atg aga cca gta caa act act caa gag 192
Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu
50 55 60
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Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys
65 70 75 80
gaa ctg cgg gtg aag ttc agc aga agc gcc gac gcc cct gcc tac cag 288
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85 90 95
cag ggc cag aat cag ctg tac aac gag ctg aac ctg ggc aga agg gaa 336
Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
100 105 110
gag tac gac gtc ctg gat aag cgg aga ggc cgg gac cct gag atg ggc 384
Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
115 120 125
ggc aag cct cgg cgg aag aac ccc cag gaa ggc ctg tat aac gaa ctg 432
Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
130 135 140
cag aaa gac aag atg gcc gag gcc tac agc gag atc ggc atg aag ggc 480
Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
145 150 155 160
gag cgg agg cgg ggc aag ggc cac gac ggc ctg tat cag ggc ctg tcc 528
Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
165 170 175
acc gcc acc aag gat acc tac gac gcc ctg cac atg cag gcc ctg ccc 576
Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
180 185 190
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<210> 6
<211> 194
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 6
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Met Phe Trp Val
1 5 10 15
Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr
20 25 30
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35 40 45
Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu
50 55 60
Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys
65 70 75 80
Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln
85 90 95
Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
100 105 110
Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
115 120 125
Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu
130 135 140
Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly
145 150 155 160
Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
165 170 175
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180 185 190
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<213> Artificial Sequence
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atccccgaca tccagatgac ccagaccacc tccagcctga gcgccagcct gggcgaccgg 120
gtgaccatca gctgccgggc cagccaggac atcagcaagt acctgaactg gtatcagcag 180
aagcccgacg gcaccgtcaa gctgctgatc taccacacca gccggctgca cagcggcgtg 240
cccagccggt ttagcggcag cggctccggc accgactaca gcctgaccat ctccaacctg 300
gaacaggaag atatcgccac ctacttttgc cagcagggca acacactgcc ctacaccttt 360
ggcggcggaa caaagctgga aatcaccggc agcacctccg gcagcggcaa gcctggcagc 420
ggcgagggca gcaccaaggg cgaggtgaag ctgcaggaaa gcggccctgg cctggtggcc 480
cccagccaga gcctgagcgt gacctgcacc gtgagcggcg tgagcctgcc cgactacggc 540
gtgagctgga tccggcagcc ccccaggaag ggcctggaat ggctgggcgt gatctggggc 600
agcgagacca cctactacaa cagcgccctg aagagccggc tgaccatcat caaggacaac 660
agcaagagcc aggtgttcct gaagatgaac agcctgcaga ccgacgacac cgccatctac 720
tactgcgcca agcactacta ctacggcggc agctacgcca tggactactg gggccagggc 780
accagcgtga ccgtgagcag cggaggtggt ggatccgagg tgcagctgca gcagtctggg 840
gctgagctgg tgaagcctgg ggcctcagtg aagatgtcct gcaaggcttc tggctacaca 900
tttaccagtt acaatatgca ctgggtaaag cagacacctg gacagggcct ggaatggatt 960
ggagctattt atccaggaaa tggtgatact tcctacaatc agaagttcaa aggcaaggcc 1020
acattgactg cagacaaatc ctccagcaca gcctacatgc agctcagcag cctgacatct 1080
gaggactctg cggactatta ctgtgcaaga tctaattatt acggtagtag ctactggttc 1140
ttcgatgtct ggggcgcagg gaccacggtc accgtctcct caggcagtac tagcggtggt 1200
ggctccgggg gcggttccgg tgggggcggc agcagcgaca ttgtgctgac ccaatctcca 1260
gctatcctgt ctgcatctcc aggggagaag gtcacaatga cttgcagggc cagctcaagt 1320
gtaaattaca tggactggta ccagaagaag ccaggatcct cccccaaacc ctggatttat 1380
gccacatcca acctggcttc tggagtccct gctcgcttca gtggcagtgg gtctgggacc 1440
tcttactctc tcacaatcag cagagtggag gctgaagatg ctgccactta ttactgccag 1500
cagtggagtt ttaatccacc cacgttcgga ggggggacca agctggaaat aaaagagagc 1560
aagtacggac cgccctgccc cccttgccct gcccccgagt tcctgggcgg acccagcgtg 1620
ttcctgttcc cccccaagcc caaggacacc ctgatgatca gccggacccc cgaggtgacc 1680
tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagat cccgaggtcc agttcaattg gtacgtggac 1740
ggcgtggaag tgcacaacgc caagaccaag cccagagagg aacagttcaa cagcacctac 1800
cgggtggtgt ctgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa agaatacaag 1860
tgcaaggtgt ccaacaaggg cctgcccagc agcatcgaaa agaccatcag caaggccaag 1920
ggccagcctc gcgagcccca ggtgtacacc ctgcctccct cccaggaaga gatgaccaag 1980
aaccaggtgt ccctgacctg cctggtgaag ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag 2040
tgggagagca acggccagcc tgagaacaac tacaagacca cccctcccgt gctggacagc 2100
gacggcagct tcttcctgta cagccggctg accgtggaca agagccggtg gcaggaaggc 2160
aacgtcttta gctgcagcgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagagc 2220
ctgagcctgt ccctgggcaa gatgttctgg gtgctggtgg tggtgggcgg ggtgctggcc 2280
tgctacagcc tgctggtgac agtggccttc atcatctttt gggtgcggag caagcggagc 2340
agaggcggcc acagcgacta catgaacatg acccccagac ggcctggccc cacccggaag 2400
cactaccagc cctacgcccc acccagggac tttgccgcct acagaagcaa acggggcaga 2460
aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca tttatgagac cagtacaaac tactcaagag 2520
gaagatggct gtagctgccg atttccagaa gaagaagaag gaggatgtga actgcgggtg 2580
aagttcagca gaagcgccga cgcccctgcc taccagcagg gccagaatca gctgtacaac 2640
gagctgaacc tgggcagaag ggaagagtac gacgtcctgg ataagcggag aggccgggac 2700
cctgagatgg gcggcaagcc tcggcggaag aacccccagg aaggcctgta taacgaactg 2760
cagaaagaca agatggccga ggcctacagc gagatcggca tgaagggcga gcggaggcgg 2820
ggcaagggcc acgacggcct gtatcagggc ctgtccaccg ccaccaagga tacctacgac 2880
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<211> 2910
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Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
gcc ttt ctg ctg atc ccc gac atc cag atg acc cag acc acc tcc agc 96
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser
20 25 30
ctg agc gcc agc ctg ggc gac cgg gtg acc atc agc tgc cgg gcc agc 144
Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
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cag gac atc agc aag tac ctg aac tgg tat cag cag aag ccc gac ggc 192
Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly
50 55 60
acc gtc aag ctg ctg atc tac cac acc agc cgg ctg cac agc ggc gtg 240
Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val
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ccc agc cgg ttt agc ggc agc ggc tcc ggc acc gac tac agc ctg acc 288
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr
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Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln
100 105 110
ggc aac aca ctg ccc tac acc ttt ggc ggc gga aca aag ctg gaa atc 384
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
115 120 125
acc ggc agc acc tcc ggc agc ggc aag cct ggc agc ggc gag ggc agc 432
Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser
130 135 140
acc aag ggc gag gtg aag ctg cag gaa agc ggc cct ggc ctg gtg gcc 480
Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala
145 150 155 160
ccc agc cag agc ctg agc gtg acc tgc acc gtg agc ggc gtg agc ctg 528
Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu
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ccc gac tac ggc gtg agc tgg atc cgg cag ccc ccc agg aag ggc ctg 576
Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu
180 185 190
gaa tgg ctg ggc gtg atc tgg ggc agc gag acc acc tac tac aac agc 624
Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser
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gcc ctg aag agc cgg ctg acc atc atc aag gac aac agc aag agc cag 672
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gtg ttc ctg aag atg aac agc ctg cag acc gac gac acc gcc atc tac 720
Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr
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tac tgc gcc aag cac tac tac tac ggc ggc agc tac gcc atg gac tac 768
Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
245 250 255
tgg ggc cag ggc acc agc gtg acc gtg agc agc gga ggt ggt gga tcc 816
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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gag gtg cag ctg cag cag tct ggg gct gag ctg gtg aag cct ggg gcc 864
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
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tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct ggc tac aca ttt acc agt tac 912
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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aat atg cac tgg gta aag cag aca cct gga cag ggc ctg gaa tgg att 960
Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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gga gct att tat cca gga aat ggt gat act tcc tac aat cag aag ttc 1008
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
325 330 335
aaa ggc aag gcc aca ttg act gca gac aaa tcc tcc agc aca gcc tac 1056
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
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atg cag ctc agc agc ctg aca tct gag gac tct gcg gac tat tac tgt 1104
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Asp Tyr Tyr Cys
355 360 365
gca aga tct aat tat tac ggt agt agc tac tgg ttc ttc gat gtc tgg 1152
Ala Arg Ser Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp
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ggc gca ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca ggc agt act agc ggt ggt 1200
Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Gly
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Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Asp Ile Val Leu
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acc caa tct cca gct atc ctg tct gca tct cca ggg gag aag gtc aca 1296
Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr
420 425 430
atg act tgc agg gcc agc tca agt gta aat tac atg gac tgg tac cag 1344
Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met Asp Trp Tyr Gln
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Lys Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn
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ctg gct tct gga gtc cct gct cgc ttc agt ggc agt ggg tct ggg acc 1440
Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr
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Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr
485 490 495
tat tac tgc cag cag tgg agt ttt aat cca ccc acg ttc gga ggg ggg 1536
Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly
500 505 510
acc aag ctg gaa ata aaa gag agc aag tac gga ccg ccc tgc ccc cct 1584
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro
515 520 525
tgc cct gcc ccc gag ttc ctg ggc gga ccc agc gtg ttc ctg ttc ccc 1632
Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
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ccc aag ccc aag gac acc ctg atg atc agc cgg acc ccc gag gtg acc 1680
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
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tgg tac gtg gac ggc gtg gaa gtg cac aac gcc aag acc aag ccc aga 1776
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
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gag gaa cag ttc aac agc acc tac cgg gtg gtg tct gtg ctg acc gtg 1824
Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
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Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
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Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
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Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu
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Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
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tac ccc agc gac atc gcc gtg gag tgg gag agc aac ggc cag cct gag 2064
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
675 680 685
aac aac tac aag acc acc cct ccc gtg ctg gac agc gac ggc agc ttc 2112
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
690 695 700
ttc ctg tac agc cgg ctg acc gtg gac aag agc cgg tgg cag gaa ggc 2160
Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly
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aac gtc ttt agc tgc agc gtg atg cac gag gcc ctg cac aac cac tac 2208
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
725 730 735
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Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys Met Phe Trp Val Leu
740 745 750
gtg gtg gtg ggc ggg gtg ctg gcc tgc tac agc ctg ctg gtg aca gtg 2304
Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val
755 760 765
gcc ttc atc atc ttt tgg gtg cgg agc aag cgg agc aga ggc ggc cac 2352
Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His
770 775 780
agc gac tac atg aac atg acc ccc aga cgg cct ggc ccc acc cgg aag 2400
Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys
785 790 795 800
cac tac cag ccc tac gcc cca ccc agg gac ttt gcc gcc tac aga agc 2448
His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
805 810 815
aaa cgg ggc aga aag aaa ctc ctg tat ata ttc aaa caa cca ttt atg 2496
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
820 825 830
aga cca gta caa act act caa gag gaa gat ggc tgt agc tgc cga ttt 2544
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
835 840 845
cca gaa gaa gaa gaa gga gga tgt gaa ctg cgg gtg aag ttc agc aga 2592
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
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agc gcc gac gcc cct gcc tac cag cag ggc cag aat cag ctg tac aac 2640
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
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gag ctg aac ctg ggc aga agg gaa gag tac gac gtc ctg gat aag cgg 2688
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
885 890 895
aga ggc cgg gac cct gag atg ggc ggc aag cct cgg cgg aag aac ccc 2736
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
900 905 910
cag gaa ggc ctg tat aac gaa ctg cag aaa gac aag atg gcc gag gcc 2784
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
915 920 925
tac agc gag atc ggc atg aag ggc gag cgg agg cgg ggc aag ggc cac 2832
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
930 935 940
gac ggc ctg tat cag ggc ctg tcc acc gcc acc aag gat acc tac gac 2880
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
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Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser
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Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
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Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly
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Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val
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Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr
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Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln
100 105 110
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
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Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser
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Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala
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Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu
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Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu
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Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser
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Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr
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Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
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Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
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Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
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Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Asp Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Ser Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp
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Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Gly
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Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Asp Ile Val Leu
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Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met Asp Trp Tyr Gln
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Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr
485 490 495
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530 535 540
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545 550 555 560
Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn
565 570 575
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agcaagagcc aggtgttcct gaagatgaac agcctgcaga ccgacgacac cgccatctac 720
tactgcgcca agcactacta ctacggcggc agctacgcca tggactactg gggccagggc 780
accagcgtga ccgtgagcag cggaggtggt ggatccgagg tgcagctgca gcagtctggg 840
gctgagctgg tgaagcctgg ggcctcagtg aagatgtcct gcaaggcttc tggctacaca 900
tttaccagtt acaatatgca ctgggtaaag cagacacctg gacagggcct ggaatggatt 960
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acattgactg cagacaaatc ctccagcaca gcctacatgc agctcagcag cctgacatct 1080
gaggactctg cggactatta ctgtgcaaga tctaattatt acggtagtag ctactggttc 1140
ttcgatgtct ggggcgcagg gaccacggtc accgtctcct caggcagtac tagcggtggt 1200
ggctccgggg gcggttccgg tgggggcggc agcagcgaca ttgtgctgac ccaatctcca 1260
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tcttactctc tcacaatcag cagagtggag gctgaagatg ctgccactta ttactgccag 1500
cagtggagtt ttaatccacc cacgttcgga ggggggacca agctggaaat aaaagagagc 1560
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gaactgcaga aagacaagat ggccgaggcc tacagcgaga tcggaatgaa gggcgagcgg 2160
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attaaacact tcaaaaactg cacctccatc agtggcgatc tccacatcct gccggtggca 2520
tttaggggtg actccttcac acatactcct cctctggatc cacaggaact ggatattctg 2580
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gtggacaagt gcaaccttct ggagggtgag ccaagggagt ttgtggagaa ctctgagtgc 3060
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Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser
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ctg agc gcc agc ctg ggc gac cgg gtg acc atc agc tgc cgg gcc agc 144
Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
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Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly
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acc gtc aag ctg ctg atc tac cac acc agc cgg ctg cac agc ggc gtg 240
Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val
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Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala
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ccc agc cag agc ctg agc gtg acc tgc acc gtg agc ggc gtg agc ctg 528
Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu
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210 215 220
gtg ttc ctg aag atg aac agc ctg cag acc gac gac acc gcc atc tac 720
Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr
225 230 235 240
tac tgc gcc aag cac tac tac tac ggc ggc agc tac gcc atg gac tac 768
Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
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tgg ggc cag ggc acc agc gtg acc gtg agc agc gga ggt ggt gga tcc 816
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
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tca gtg aag atg tcc tgc aag gct tct ggc tac aca ttt acc agt tac 912
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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aat atg cac tgg gta aag cag aca cct gga cag ggc ctg gaa tgg att 960
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Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
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Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
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Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Asp Tyr Tyr Cys
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acc caa tct cca gct atc ctg tct gca tct cca ggg gag aag gtc aca 1296
Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr
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atg act tgc agg gcc agc tca agt gta aat tac atg gac tgg tac cag 1344
Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met Asp Trp Tyr Gln
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tat tac tgc cag cag tgg agt ttt aat cca ccc acg ttc gga ggg ggg 1536
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acc aag ctg gaa ata aaa gag agc aag tac gga ccg ccc tgc ccc cct 1584
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Cys Pro Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala
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cca aca atc gcc agc cag cct ctg tct ctg agg ccc gag gct tgt aga 1680
Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg
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cca gct gct ggc gga gcc gtg cac acc aga gga ctg gat ttc gcc tgc 1728
Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys
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Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu
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ctg agc ctc gtg atc acc aag cgg ggc aga aag aaa ctg ctg tac atc 1824
Leu Ser Leu Val Ile Thr Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile
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ttt aag cag ccc ttc atg cgg ccc gtg cag acc acc cag gaa gag gac 1872
Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp
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Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
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aga gtg aag ttc agc aga tcc gcc gac gcc cct gcc tac cag cag gga 1968
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
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cag aac cag ctg tac aac gag ctg aac ctg ggc aga cgg gaa gag tac 2016
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
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gac gtg ctg gac aag cgg aga ggc cgg gac cct gag atg ggc gga aag 2064
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
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ccc aga aga aag aac ccc cag gaa ggc ctg tat aac gaa ctg cag aaa 2112
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
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gac aag atg gcc gag gcc tac agc gag atc gga atg aag ggc gag cgg 2160
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
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aga aga ggc aag ggc cac gat ggc ctg tac cag ggc ctg agc acc gcc 2208
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
725 730 735
acc aag gac acc tat gac gcc ctg cac atg cag gcc ctg cct cca aga 2256
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
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ctc gag ggc ggc gga gag ggc aga gga agt ctt cta aca tgc ggt gac 2304
Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp
755 760 765
gtg gag gag aat ccc ggc cct agg atg ctt ctc ctg gtg aca agc ctt 2352
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu
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ctg ctc tgt gag tta cca cac cca gca ttc ctc ctg atc cca cgc aaa 2400
Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys
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gtg tgt aac gga ata ggt att ggt gaa ttt aaa gac tca ctc tcc ata 2448
Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile
805 810 815
aat gct acg aat att aaa cac ttc aaa aac tgc acc tcc atc agt ggc 2496
Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly
820 825 830
gat ctc cac atc ctg ccg gtg gca ttt agg ggt gac tcc ttc aca cat 2544
Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His
835 840 845
act cct cct ctg gat cca cag gaa ctg gat att ctg aaa acc gta aag 2592
Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys
850 855 860
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Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr
865 870 875 880
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Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys
885 890 895
caa cat ggt cag ttt tct ctt gca gtc gtc agc ctg aac ata aca tcc 2736
Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser
900 905 910
ttg gga tta cgc tcc ctc aag gag ata agt gat gga gat gtg ata att 2784
Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile
915 920 925
tca gga aac aaa aat ttg tgc tat gca aat aca ata aac tgg aaa aaa 2832
Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys
930 935 940
ctg ttt ggg acc tcc ggt cag aaa acc aaa att ata agc aac aga ggt 2880
Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly
945 950 955 960
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Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser
965 970 975
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Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg
980 985 990
aat gtc agc cga ggc agg gaa tgc gtg gac aag tgc aac ctt ctg gag 3024
Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu
995 1000 1005
ggt gag cca agg gag ttt gtg gag aac tct gag tgc ata cag tgc 3069
Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys
1010 1015 1020
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His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
1025 1030 1035
cgg gga cca gac aac tgt atc cag tgt gcc cac tac att gac ggc 3159
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly
1040 1045 1050
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Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn
1055 1060 1065
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Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His
1070 1075 1080
ctg tgc cat cca aac tgc acc tac gga tgc act ggg cca ggt ctt 3294
Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu
1085 1090 1095
gaa ggc tgt cca acg aat ggg cct aag atc ccg tcc atc gcc act 3339
Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr
1100 1105 1110
ggg atg gtg ggg gcc ctc ctc ttg ctg ctg gtg gtg gcc ctg ggg 3384
Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly
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Ile Gly Leu Phe Met
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
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Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser
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Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
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Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly
50 55 60
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65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln
100 105 110
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
115 120 125
Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser
130 135 140
Thr Lys Gly Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala
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Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu
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Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu
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Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser
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210 215 220
Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr
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Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
260 265 270
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
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Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
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Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
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Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Asp Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Ser Asn Tyr Tyr Gly Ser Ser Tyr Trp Phe Phe Asp Val Trp
370 375 380
Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Thr Ser Gly Gly
385 390 395 400
Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Asp Ile Val Leu
405 410 415
Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr
420 425 430
Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Met Asp Trp Tyr Gln
435 440 445
Lys Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn
450 455 460
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Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr
485 490 495
Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Phe Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly
500 505 510
Thr Lys Leu Glu Ile Lys Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro
515 520 525
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530 535 540
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820 825 830
Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His
835 840 845
Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys
850 855 860
Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr
865 870 875 880
Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys
885 890 895
Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser
900 905 910
Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile
915 920 925
Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys
930 935 940
Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly
945 950 955 960
Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser
965 970 975
Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg
980 985 990
Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu
995 1000 1005
Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys
1010 1015 1020
His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
1025 1030 1035
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly
1040 1045 1050
Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn
1055 1060 1065
Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His
1070 1075 1080
Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu
1085 1090 1095
Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr
1100 1105 1110
Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly
1115 1120 1125
Ile Gly Leu Phe Met
1130
<210> 13
<211> 1146
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T2A-EGFRt
<400> 13
ctcgagggcg gcggagaggg cagaggaagt cttctaacat gcggtgacgt ggaggagaat 60
cccggcccta ggatgcttct cctggtgaca agccttctgc tctgtgagtt accacaccca 120
gcattcctcc tgatcccacg caaagtgtgt aacggaatag gtattggtga atttaaagac 180
tcactctcca taaatgctac gaatattaaa cacttcaaaa actgcacctc catcagtggc 240
gatctccaca tcctgccggt ggcatttagg ggtgactcct tcacacatac tcctcctctg 300
gatccacagg aactggatat tctgaaaacc gtaaaggaaa tcacagggtt tttgctgatt 360
caggcttggc ctgaaaacag gacggacctc catgcctttg agaacctaga aatcatacgc 420
ggcaggacca agcaacatgg tcagttttct cttgcagtcg tcagcctgaa cataacatcc 480
ttgggattac gctccctcaa ggagataagt gatggagatg tgataatttc aggaaacaaa 540
aatttgtgct atgcaaatac aataaactgg aaaaaactgt ttgggacctc cggtcagaaa 600
accaaaatta taagcaacag aggtgaaaac agctgcaagg ccacaggcca ggtctgccat 660
gccttgtgct cccccgaggg ctgctggggc ccggagccca gggactgcgt ctcttgccgg 720
aatgtcagcc gaggcaggga atgcgtggac aagtgcaacc ttctggaggg tgagccaagg 780
gagtttgtgg agaactctga gtgcatacag tgccacccag agtgcctgcc tcaggccatg 840
aacatcacct gcacaggacg gggaccagac aactgtatcc agtgtgccca ctacattgac 900
ggcccccact gcgtcaagac ctgcccggca ggagtcatgg gagaaaacaa caccctggtc 960
tggaagtacg cagacgccgg ccatgtgtgc cacctgtgcc atccaaactg cacctacgga 1020
tgcactgggc caggtcttga aggctgtcca acgaatgggc ctaagatccc gtccatcgcc 1080
actgggatgg tgggggccct cctcttgctg ctggtggtgg ccctggggat cggcctcttc 1140
atgtga 1146
<210> 14
<211> 1146
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> T2A-EGFRt
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1146)
<400> 14
ctc gag ggc ggc gga gag ggc aga gga agt ctt cta aca tgc ggt gac 48
Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp
1 5 10 15
gtg gag gag aat ccc ggc cct agg atg ctt ctc ctg gtg aca agc ctt 96
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu
20 25 30
ctg ctc tgt gag tta cca cac cca gca ttc ctc ctg atc cca cgc aaa 144
Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys
35 40 45
gtg tgt aac gga ata ggt att ggt gaa ttt aaa gac tca ctc tcc ata 192
Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile
50 55 60
aat gct acg aat att aaa cac ttc aaa aac tgc acc tcc atc agt ggc 240
Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly
65 70 75 80
gat ctc cac atc ctg ccg gtg gca ttt agg ggt gac tcc ttc aca cat 288
Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His
85 90 95
act cct cct ctg gat cca cag gaa ctg gat att ctg aaa acc gta aag 336
Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys
100 105 110
gaa atc aca ggg ttt ttg ctg att cag gct tgg cct gaa aac agg acg 384
Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr
115 120 125
gac ctc cat gcc ttt gag aac cta gaa atc ata cgc ggc agg acc aag 432
Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys
130 135 140
caa cat ggt cag ttt tct ctt gca gtc gtc agc ctg aac ata aca tcc 480
Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser
145 150 155 160
ttg gga tta cgc tcc ctc aag gag ata agt gat gga gat gtg ata att 528
Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile
165 170 175
tca gga aac aaa aat ttg tgc tat gca aat aca ata aac tgg aaa aaa 576
Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys
180 185 190
ctg ttt ggg acc tcc ggt cag aaa acc aaa att ata agc aac aga ggt 624
Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly
195 200 205
gaa aac agc tgc aag gcc aca ggc cag gtc tgc cat gcc ttg tgc tcc 672
Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser
210 215 220
ccc gag ggc tgc tgg ggc ccg gag ccc agg gac tgc gtc tct tgc cgg 720
Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg
225 230 235 240
aat gtc agc cga ggc agg gaa tgc gtg gac aag tgc aac ctt ctg gag 768
Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu
245 250 255
ggt gag cca agg gag ttt gtg gag aac tct gag tgc ata cag tgc cac 816
Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His
260 265 270
cca gag tgc ctg cct cag gcc atg aac atc acc tgc aca gga cgg gga 864
Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly
275 280 285
cca gac aac tgt atc cag tgt gcc cac tac att gac ggc ccc cac tgc 912
Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys
290 295 300
gtc aag acc tgc ccg gca gga gtc atg gga gaa aac aac acc ctg gtc 960
Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val
305 310 315 320
tgg aag tac gca gac gcc ggc cat gtg tgc cac ctg tgc cat cca aac 1008
Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn
325 330 335
tgc acc tac gga tgc act ggg cca ggt ctt gaa ggc tgt cca acg aat 1056
Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn
340 345 350
ggg cct aag atc ccg tcc atc gcc act ggg atg gtg ggg gcc ctc ctc 1104
Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu
355 360 365
ttg ctg ctg gtg gtg gcc ctg ggg atc ggc ctc ttc atg tga 1146
Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
370 375 380
<210> 15
<211> 381
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic Construct
<400> 15
Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu
20 25 30
Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys
35 40 45
Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile
50 55 60
Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly
65 70 75 80
Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His
85 90 95
Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys
100 105 110
Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr
115 120 125
Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys
130 135 140
Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser
145 150 155 160
Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile
165 170 175
Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys
180 185 190
Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly
195 200 205
Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser
210 215 220
Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg
225 230 235 240
Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu
245 250 255
Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His
260 265 270
Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly
275 280 285
Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys
290 295 300
Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val
305 310 315 320
Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn
325 330 335
Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn
340 345 350
Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu
355 360 365
Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
370 375 380
【図1】
【図2】
【図3】
【図4-1】
【図4-2】
【図4-3】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9-1】
【図9-2】
【図9-3】
【図9-4】
【図10】
【図11-1】
【図11-2】
【図11-3】
【図11-4】
【図12】
【図13-1】
【図13-2】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-05-16
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
明細書に記載された発明。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】