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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024085381
(43)【公開日】2024-06-26
(54)【発明の名称】ＮＴ３発現増強用組成物、および聴覚機能改善用組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 36/185 20060101AFI20240619BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240619BHJP
A61P 27/16 20060101ALI20240619BHJP
A61K 31/366 20060101ALI20240619BHJP
【ＦＩ】
A61K36/185
A61P43/00 107
A61P27/16
A61K31/366
【審査請求】未請求
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023181520
(22)【出願日】2023-10-23
(31)【優先権主張番号】P 2022199722
(32)【優先日】2022-12-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】593106918
【氏名又は名称】株式会社ファンケル
(74)【代理人】
【識別番号】110004152
【氏名又は名称】弁理士法人お茶の水内外特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】上野（坂井） 友美
(72)【発明者】
【氏名】山田 昌良
(72)【発明者】
【氏名】相原 幸音
【テーマコード（参考）】
4C086
4C088
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086CA01
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA34
4C086ZB22
4C088AB12
4C088AC01
4C088BA09
4C088BA10
4C088BA23
4C088BA32
4C088CA05
4C088CA06
4C088CA08
4C088NA14
4C088ZA34
4C088ZB22
(57)【要約】
【課題】アタンシ抽出物を有効成分として含有するＮＴ３の発現増強用組成物及び聴覚機能改善用組成物を提供することを課題とする。
【解決手段】アタンシの抽出物を有効成分として含有する、ＮＴ３の発現増強用組成物及び聴覚機能改善用組成物とする。
【選択図】図２
【解決手段】アタンシの抽出物を有効成分として含有する、ＮＴ３の発現増強用組成物及び聴覚機能改善用組成物とする。
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
アタンシの抽出物を有効成分として含有する、ＮＴ３の発現増強用組成物。
【請求項2】
アタンシの抽出物を有効成分として含有する、聴覚機能低下予防及び／又は改善用組成物。
【請求項3】
アタンシの抽出物を有効成分として含有する、加齢性難聴の予防及び／又は改善用組成物。
【請求項4】
アタンシの抽出物が水、アルコール類、水とアルコール類の混合溶媒による抽出物である請求項１～３のいずれかに記載の組成物。
【請求項5】
ブルセインＡ、ブルセインＤ、ブルサトールからなる群から選ばれる１以上を有効成分として含有する、ＮＴ３の発現増強用組成物。
【請求項6】
ブルセインＡ、ブルセインＤ、ブルサトールからなる群から選ばれる１以上を有効成分として含有する、聴覚機能低下予防及び／又は改善用組成物。
【請求項7】
ブルセインＡ、ブルセインＤ、ブルサトールからなる群から選ばれる１以上を有効成分として含有する、加齢性難聴の予防及び／又は改善用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＮＴ３発現増強用組成物、および聴覚機能改善作用を有する組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
内耳の有毛細胞や聴神経に障害が起こることで発症する聴力の低下を感音性難聴といい、加齢性難聴や騒音性難聴が該当する。加齢や、強大音に長期間曝されることで、聴覚の受容器である蝸牛内の有毛細胞や聴神経が損傷を受け、死滅することが聴力の低下を引き起こすが、これらの細胞は増殖性がなく、一度死滅すると再生しない。そのため、進行し、慢性化した聴力低下は不可逆的で回復が難しいと考えられている。
感音性難聴の治療、緩和には、発症した直後であれば、血流促進剤や代謝改善剤が有効である場合があるが、加齢性難聴の大半は加齢に伴いゆっくりと進行し、本人が気づかないうちに聞こえが悪くなっているケースである。現状、そのような慢性化した感音性難聴に対しては、有効な薬剤もない。聴力の改善が見込める有効な手段としては補聴器の装着だが、日本での補聴器普及率は低い。
還元型コエンザイムＱ１０の投与（非特許文献１）等により酸化ストレスを抑制することが、加齢性難聴に対する予防的な効果をもたらすという報告はあるものの、一度低下した聴力の回復が見込める報告はほとんどされていない。
感音性難聴の治療、緩和には、発症した直後であれば、血流促進剤や代謝改善剤が有効である場合があるが、加齢性難聴の大半は加齢に伴いゆっくりと進行し、本人が気づかないうちに聞こえが悪くなっているケースである。現状、そのような慢性化した感音性難聴に対しては、有効な薬剤もない。聴力の改善が見込める有効な手段としては補聴器の装着だが、日本での補聴器普及率は低い。
還元型コエンザイムＱ１０の投与（非特許文献１）等により酸化ストレスを抑制することが、加齢性難聴に対する予防的な効果をもたらすという報告はあるものの、一度低下した聴力の回復が見込める報告はほとんどされていない。
【0003】
Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ－３（ＮＴ３）は、ＮＧＦ（Ｎｅｒｖｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）ファミリーに属する神経栄養因子の１つである。ＮＴ３は主として中枢神経や末梢神経、シナプスで発現し、Ｔｒｋレセプターを通したシグナル伝達を行う。海馬や小脳などでは、ＮＴ３が絶えず産生され、神経細胞及びグリア細胞の生存と成長、神経新生の促進に関与することが知られている。
非特許文献２では、ＮＴ３がシナプスの興奮を促し、神経伝達の促進に作用することが報告されている。非特許文献３では、ＮＴ３が視細胞を光刺激などによるダメージから保護する作用があること、視細胞の分化や再生を促進する作用があることが報告されている。ＮＴ３は、網膜の支持細胞であるミュラー細胞に作用し、視細胞変性抑制作用が知られているｂＦＧＦの発現を増強する作用も報告されており、直接的にも間接的にも視細胞に保護的な作用をもたらす。網膜中でＮＴ３を産生する主要な細胞の１つにミュラー細胞がある。
非特許文献２では、ＮＴ３がシナプスの興奮を促し、神経伝達の促進に作用することが報告されている。非特許文献３では、ＮＴ３が視細胞を光刺激などによるダメージから保護する作用があること、視細胞の分化や再生を促進する作用があることが報告されている。ＮＴ３は、網膜の支持細胞であるミュラー細胞に作用し、視細胞変性抑制作用が知られているｂＦＧＦの発現を増強する作用も報告されており、直接的にも間接的にも視細胞に保護的な作用をもたらす。網膜中でＮＴ３を産生する主要な細胞の１つにミュラー細胞がある。
【0004】
中枢神経系や末梢神経系において、ＮＴ３の果たす役割について注目されている。音刺激の受容細胞である有毛細胞と聴神経間のリボンシナプスは音響障害や特定の薬剤、加齢によって減少し聴力が低下するが、非特許文献４では、マウスの蝸牛内細胞でＮＴ３を過剰発現させたところ、音響障害後に減少したリボンシナプスが再生し、蝸牛の機能と聴力が改善したことが報告されている。さらに、非特許文献５には、騒音障害によって消失したモルモット内耳のリボンシナプスが、ＮＴ３の投与によって再生したことが記載されている。さらに、非特許文献６、非特許文献７では、リボンシナプスの減少が、耳鳴りを引き起こす可能性が記載されている。また、アミノグリコシド系の抗生物質は有毛細胞障害を引き起こすことが知られているが、非特許文献８ではＮＴ３に同薬剤による難聴の予防効果があったことを示唆している。非特許文献９では、加齢に伴うＮＴ３の減少が加齢性難聴の発症に寄与し、ＮＴ３の補充がその治療法となる可能性が記載されている。
さらに、本出願人は、特許文献１において、トンカットアリの抽出物を有効成分として含有する、ＮＴ３の発現増強用組成物、聴覚機能低下予防及び／または改善用組成物を提案している。
さらに、本出願人は、特許文献１において、トンカットアリの抽出物を有効成分として含有する、ＮＴ３の発現増強用組成物、聴覚機能低下予防及び／または改善用組成物を提案している。
【0005】
アタンシ（Ｂｒｕｃｅａ ｊａｖａｎｉｃａ）は、中国、東南アジア、インドなどに自生するニガキ科の植物である。アタンシの種子は、解熱作用を有する漢方薬「鴉胆子」として用いられているが、その効果は強く、多量に服用すると嘔吐、腹痛、呼吸困難等の副作用を有することが知られている。特許文献２には、アタンシ、または他の植物の抽出物を有効成分とするアレルギー性疾患予防及び／又は治療剤が報告されている。しかし、アタンシの聴覚への作用はこれまで知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特開２０２１－４２１９８号公報
【特許文献2】特開２００６－３４２０７８号公報
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Ａｃｔａ Ｏｔｏ－Ｌａｒｙｎｇｏｌｏｇｉｃａ． ２０１０ Ｏｃｔ；１３０（１０）：１１５４－１１６２．
【非特許文献2】Ｎａｔｕｒｅ． １９９３ Ｍａｙ ２７；３６３（６４２７）：３５０－３．
【非特許文献3】Ｎｅｕｒｏｎ． ２０００ Ｍａｙ；２６（２）：５３３－４１．
【非特許文献4】Ｅｌｉｆｅ． ２０１４ Ｏｃｔ ２０；３．
【非特許文献5】Ｓｃｉ Ｒｅｐ． ２０１６ Ａｐｒ ２５；６：２４９０７．
【非特許文献6】ＰＬｏＳ Ｏｎｅ． ２０１３；８（３）：ｅ５７２４７．
【非特許文献7】Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ． ２００７ Ｍａｙ １５；８５（７）：１４８９－９８．
【非特許文献8】Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２０００ Ｊｕｎ ２０；９７（１３）：７５９７－６０２．
【非特許文献9】Ａｇｉｎｇ Ｃｅｌｌ ２０２２ Ｏｃｔ；２１（１０）：ｅ１３７０８．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明は、新規なＮＴ３の発現増強用組成物と、聴覚機能改善用組成物を提供することを課題とする。ここでいう聴覚機能の改善とは、聴力の改善、耳鳴りの軽減を含む聴覚機能全般の改善を指す。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明の課題を解決するための手段は、以下の通りである。
（１）アタンシの抽出物を有効成分として含有する、ＮＴ３の発現増強用組成物。
（２）アタンシの抽出物を有効成分として含有する、聴覚機能低下予防及び／又は改善用組成物。
（３）アタンシの抽出物を有効成分として含有する、加齢性難聴の予防及び／又は改善用組成物。
（４）アタンシの抽出物が水、アルコール類、水とアルコール類の混合溶媒による抽出物である（１）～（３）のいずれかに記載の組成物。
（５）アタンシの抽出物が、ブルセインＡ、ブルセインＤ、ブルサトールからなる群から選ばれる１以上を含有する抽出物である（１）～（３）のいずれかに記載の組成物。
（６）ブルセインＡ、ブルセインＤ、ブルサトールからなる群から選ばれる１以上を有効成分として含有する、ＮＴ３の発現増強用組成物。
（７）ブルセインＡ、ブルセインＤ、ブルサトールからなる群から選ばれる１以上を有効成分として含有する、聴覚機能低下予防及び／又は改善用組成物。
（８）ブルセインＡ、ブルセインＤ、ブルサトールからなる群から選ばれる１以上を有効
成分として含有する、加齢性難聴の予防及び／又は改善用組成物。
（１）アタンシの抽出物を有効成分として含有する、ＮＴ３の発現増強用組成物。
（２）アタンシの抽出物を有効成分として含有する、聴覚機能低下予防及び／又は改善用組成物。
（３）アタンシの抽出物を有効成分として含有する、加齢性難聴の予防及び／又は改善用組成物。
（４）アタンシの抽出物が水、アルコール類、水とアルコール類の混合溶媒による抽出物である（１）～（３）のいずれかに記載の組成物。
（５）アタンシの抽出物が、ブルセインＡ、ブルセインＤ、ブルサトールからなる群から選ばれる１以上を含有する抽出物である（１）～（３）のいずれかに記載の組成物。
（６）ブルセインＡ、ブルセインＤ、ブルサトールからなる群から選ばれる１以上を有効成分として含有する、ＮＴ３の発現増強用組成物。
（７）ブルセインＡ、ブルセインＤ、ブルサトールからなる群から選ばれる１以上を有効成分として含有する、聴覚機能低下予防及び／又は改善用組成物。
（８）ブルセインＡ、ブルセインＤ、ブルサトールからなる群から選ばれる１以上を有効
成分として含有する、加齢性難聴の予防及び／又は改善用組成物。
【発明の効果】
【0010】
本発明により、アタンシの抽出物を有効成分とする、ＮＴ３の発現を増強し、さらに聴覚機能低下予防及び／又は聴覚機能改善用組成物が提供される。また、本発明によりブルセインＡ、ブルセインＤ、ブルサトールからなる群から選ばれる１以上を有効成分とする、ＮＴ３の発現を増強し、聴覚機能の低下予防及び／又は聴覚機能改善用組成物が提供される。本発明の組成物は、加齢性難聴の予防及び／又は改善剤として有用である。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】アタンシ抽出物と、ブルセインＡ、ブルセインＤ、ブルサトールのＨＰＬＣクロマトグラム。
【図2】アタンシ抽出物がＮＴ３の発現を増強することを示すグラフ。
【図3】アタンシの抽出物中に含まれるブルセインＡ、ブルセインＤ、ブルサトールがＮＴ３の発現を増強することを示すグラフ。
【図4】中耳腔に局所投与したアタンシ抽出物が、内耳組織のＮＴ３の発現を増強することを示すグラフ。
【図5】アタンシ抽出物が、トンカットアリ抽出物よりも内耳組織のＮＴ３の発現を増強することを示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本発明について具体的に説明する。
本発明は、ＮＴ３の発現増強用組成物、聴覚機能低下予防及び／又は改善用組成物、加齢性難聴の予防及び／又は改善用組成物に関する。以下、これらの組成物をまとめて本発明の組成物ともいう。
本発明の組成物は、アタンシの抽出物を含有する。本発明の組成物は、アタンシの抽出物を含有すること以外は特に制限されず、飲食品、医薬品、健康食品、動物用飼料等を包含する。
また、本発明でいう聴覚機能低下予防あるいは改善とは、感音性難聴による聴力の低下の予防及び／又は改善をいう。感音性難聴の種類は特に限定しないが、加齢性難聴、騒音性難聴、アミノグリコシド系抗生物質の副作用等による薬剤性難聴、音響性難聴（音響外傷）等がある。
本発明は、ＮＴ３の発現増強用組成物、聴覚機能低下予防及び／又は改善用組成物、加齢性難聴の予防及び／又は改善用組成物に関する。以下、これらの組成物をまとめて本発明の組成物ともいう。
本発明の組成物は、アタンシの抽出物を含有する。本発明の組成物は、アタンシの抽出物を含有すること以外は特に制限されず、飲食品、医薬品、健康食品、動物用飼料等を包含する。
また、本発明でいう聴覚機能低下予防あるいは改善とは、感音性難聴による聴力の低下の予防及び／又は改善をいう。感音性難聴の種類は特に限定しないが、加齢性難聴、騒音性難聴、アミノグリコシド系抗生物質の副作用等による薬剤性難聴、音響性難聴（音響外傷）等がある。
【0013】
本発明に用いられるアタンシ抽出物を得るための部位としては、特に限定されず、例えば、アタンシの果実、種子、幹、根等が挙げられ、果実と種子が好ましい。
アタンシの抽出物を得るための抽出溶媒としては、水、メタノール、エタノール、プロパノール等のアルコール類、アセトンやメチルエチルケトン等のケトン類、アセトニトリル等のニトリル類、テトラヒドロフランやジエチルエーテルなどのエーテル類、ジクロロメタンやクロロホルム等のハロゲン化炭化水素類、酢酸エチルや蟻酸エチルなどのエステル類、ヘキサン等の１種または２種以上を使用することができ、これらの中で、水、アルコール類、水とアルコール類の混合溶媒が好ましく、また、アルコール類としてはエタノールが好ましい。抽出方法は、特に制限されないが、熱水抽出法、二相溶媒分配法、分配高速クロマトグラフィー法等を用いることができる。
アタンシの抽出物を得るための抽出溶媒としては、水、メタノール、エタノール、プロパノール等のアルコール類、アセトンやメチルエチルケトン等のケトン類、アセトニトリル等のニトリル類、テトラヒドロフランやジエチルエーテルなどのエーテル類、ジクロロメタンやクロロホルム等のハロゲン化炭化水素類、酢酸エチルや蟻酸エチルなどのエステル類、ヘキサン等の１種または２種以上を使用することができ、これらの中で、水、アルコール類、水とアルコール類の混合溶媒が好ましく、また、アルコール類としてはエタノールが好ましい。抽出方法は、特に制限されないが、熱水抽出法、二相溶媒分配法、分配高速クロマトグラフィー法等を用いることができる。
【0014】
抽出温度は、通常、０～１００℃の範囲内であり、５～５０℃であることが好ましい。抽出溶媒量は、被抽出物に対して１～１００倍、好ましくは５～１０倍である。なお、本明細書において、「Ａ～Ｂ（Ａ、Ｂは数値）」との記載は、Ａ以上Ｂ以下を意味する。
アタンシ抽出物は、公知の方法により、精製することができる。例えば、不溶物を濾過、遠心分離、デカンテ－ション等により除去した後、必要に応じて脱色、脱臭の目的で活性炭、活性白土、シリカゲル、活性アルミナ合成樹脂等の吸着剤や、溶剤分画、逆浸透膜、イオン交換体等によって分画、精製、濃縮することができる。ただし、アタンシ抽出物は、ブルセインＡ、ブルセインＤ、ブルサトールからなる群から選ばれる１以上を含有することが好ましく、２以上を含有することがより好ましく、３種とも含有することが最も好ましい。
得られた抽出液は、抽出液そのまま、濃縮した抽出エキス、あるいは、減圧濃縮、スプレ－ドライまたは凍結乾燥等の方法で粉末化したものを使用することができる。
アタンシ抽出物は、公知の方法により、精製することができる。例えば、不溶物を濾過、遠心分離、デカンテ－ション等により除去した後、必要に応じて脱色、脱臭の目的で活性炭、活性白土、シリカゲル、活性アルミナ合成樹脂等の吸着剤や、溶剤分画、逆浸透膜、イオン交換体等によって分画、精製、濃縮することができる。ただし、アタンシ抽出物は、ブルセインＡ、ブルセインＤ、ブルサトールからなる群から選ばれる１以上を含有することが好ましく、２以上を含有することがより好ましく、３種とも含有することが最も好ましい。
得られた抽出液は、抽出液そのまま、濃縮した抽出エキス、あるいは、減圧濃縮、スプレ－ドライまたは凍結乾燥等の方法で粉末化したものを使用することができる。
【0015】
アタンシの抽出物は、蝸牛有毛細胞と聴神経間のリボンシナプスの保護および再生を促進して、感音性難聴による聴力の低下を予防及び／又は改善する。本発明の組成物をヒトに投与する場合は、経口投与が好ましく、具体的には、飲食品、医薬品、サプリメント等の健康食品として使用可能である。したがって当該症状若しくは疾患を予防、改善又は治療するための食品・飲料、医薬部外品、医薬品等として使用可能である。
【0016】
アタンシの抽出物を食品・飲料として使用する場合、例えば、果汁飲料、炭酸飲料、茶系飲料、乳飲料、アルコール飲料、清涼飲料等の飲料、ゼリー状食品や各種スナック類、焼き菓子、ケーキ類、チョコレート、ガム、飴、スープ類等、あらゆる食品・飲料形態とすることができる。
また、アタンシの抽出物を含有する組成物をサプリメントや医薬品として使用する場合、例えば、錠剤、顆粒剤等の経口用固形成形剤、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤として利用することができる。その他、外用剤として使用することができる。
また、アタンシの抽出物を含有する組成物をサプリメントや医薬品として使用する場合、例えば、錠剤、顆粒剤等の経口用固形成形剤、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤として利用することができる。その他、外用剤として使用することができる。
【0017】
アタンシの抽出物を医薬品やサプリメントの製剤とする場合は、アタンシの抽出物を一般的な製造法により、直接又は製剤上許容し得る担体とともに混合、分散した後、所望の形態に加工することによって、容易に得ることができる。この場合、本発明に用いられる抽出物の他に、かかる形態に一般的に用いられる植物油、動物油等の油性基剤、鎮痛消炎剤、鎮痛剤、殺菌消毒剤、収斂剤、ホルモン剤、ビタミン類、保湿剤、紫外線吸収剤、アルコール類、キレート剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、増粘剤、色素、香料等を本発明の効果を妨害しない範囲で適宜配合することができる。
【0018】
本発明のアタンシの抽出物を含有する組成物は、特に限定されるものではないが、例えば、アタンシ抽出物の固形分を、全組成の０．００００１～９９．５質量％の範囲で含有される組成物とする。本発明の組成物におけるアタンシ抽出物の含有量（固形分）は、１質量％以上８０質量％以下が好ましい。
本発明のアタンシの抽出物を含有する組成物がブルセインＡを含有する場合、アタンシ抽出物中のブルセインＡの含有率は０．０１質量％～５．０質量％であることが好ましく、０．０５質量％以上がより好ましく、０．２質量％以上がさらに好ましく、また、３．０質量％以下がより好ましい。
本発明のアタンシの抽出物を含有する組成物がブルセインＤを含有する場合、アタンシ抽出物中のブルセインＤの含有率は０．０１質量％～１０．０質量％であることが好ましく、０．０５質量％以上がより好ましく、１．０質量％以上がさらに好ましく、また、５．０質量％以下がより好ましい。
本発明のアタンシの抽出物を含有する組成物がブルサトールを含有する場合、アタンシ抽出物中のブルサトールの含有率は０．０１質量％～１０．０質量％であることが好ましく、０．１質量％以上がより好ましく、１．０質量％以上がさらに好ましく、また、５．０質量％以下がより好ましい。
本発明のアタンシの抽出物を含有する組成物がブルセインＡを含有する場合、アタンシ抽出物中のブルセインＡの含有率は０．０１質量％～５．０質量％であることが好ましく、０．０５質量％以上がより好ましく、０．２質量％以上がさらに好ましく、また、３．０質量％以下がより好ましい。
本発明のアタンシの抽出物を含有する組成物がブルセインＤを含有する場合、アタンシ抽出物中のブルセインＤの含有率は０．０１質量％～１０．０質量％であることが好ましく、０．０５質量％以上がより好ましく、１．０質量％以上がさらに好ましく、また、５．０質量％以下がより好ましい。
本発明のアタンシの抽出物を含有する組成物がブルサトールを含有する場合、アタンシ抽出物中のブルサトールの含有率は０．０１質量％～１０．０質量％であることが好ましく、０．１質量％以上がより好ましく、１．０質量％以上がさらに好ましく、また、５．０質量％以下がより好ましい。
【実施例0019】
実施例、試験例を示し、本発明についてさらに説明する。以下、特に明記しない限り、％は質量％を意味する。
内耳細胞は一般的に実験使用が困難である。ミュラー細胞は網膜中に存在するグリア系の細胞で、内耳でＮＴ３を発現する支持細胞と性質として類似点があることから、スクリーニングはミュラー細胞を代替細胞として用いて実施した。
内耳細胞は一般的に実験使用が困難である。ミュラー細胞は網膜中に存在するグリア系の細胞で、内耳でＮＴ３を発現する支持細胞と性質として類似点があることから、スクリーニングはミュラー細胞を代替細胞として用いて実施した。
【0020】
（１）初代ミュラー細胞の調製
初代ミュラー細胞は次の方法で調製した。７日齢のＳＤラット１０匹から網膜を単離した。単離した網膜は、ＰＢＳ（－）で５倍希釈したトリプシン－ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ Ｔ３９２４）にＤＮａｃｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）を終濃度１００ｎｇ／ｍｌで添加した溶液１０ｍＬ中で、３７℃で３０分間静置した。ピペッティング操作により網膜組織を分散させ、２，４００ｒｐｍ、室温で５分間遠心した。上清を吸引除去した後、１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｓｅｒａ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）を含むＤＭＥＭ－Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）２５ｍＬに縣濁した。懸濁液を７０μＭのセルストレーナー（ＦＡＬＣＯＮ）に通した後、細胞数を計測し、４．２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度になるよう希釈した。Ｔ－７５細胞培養用フラスコ（住友ベークライト）に１０ｍＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した（培養０日目）。培養３日目に、培地を吸引除去し、新しい培地２０ｍＬに交換し、再び３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。培養７日目に、Ｗｅｉ－Ｔａｏ Ｓｏｎｇらの方法（Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２０１３；６（６）：７７８－７８４）に準じて、ミュラー細胞を純化した。培養８日目に、ミュラー細胞を剥がし、２．５×１０５ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度になるよう縣濁し、４８ｗｅｌｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ（ＳＵＭＩＬＯＮ）に４００μＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。
初代ミュラー細胞は次の方法で調製した。７日齢のＳＤラット１０匹から網膜を単離した。単離した網膜は、ＰＢＳ（－）で５倍希釈したトリプシン－ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ Ｔ３９２４）にＤＮａｃｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）を終濃度１００ｎｇ／ｍｌで添加した溶液１０ｍＬ中で、３７℃で３０分間静置した。ピペッティング操作により網膜組織を分散させ、２，４００ｒｐｍ、室温で５分間遠心した。上清を吸引除去した後、１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｓｅｒａ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）を含むＤＭＥＭ－Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）２５ｍＬに縣濁した。懸濁液を７０μＭのセルストレーナー（ＦＡＬＣＯＮ）に通した後、細胞数を計測し、４．２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度になるよう希釈した。Ｔ－７５細胞培養用フラスコ（住友ベークライト）に１０ｍＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した（培養０日目）。培養３日目に、培地を吸引除去し、新しい培地２０ｍＬに交換し、再び３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。培養７日目に、Ｗｅｉ－Ｔａｏ Ｓｏｎｇらの方法（Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２０１３；６（６）：７７８－７８４）に準じて、ミュラー細胞を純化した。培養８日目に、ミュラー細胞を剥がし、２．５×１０５ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度になるよう縣濁し、４８ｗｅｌｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ（ＳＵＭＩＬＯＮ）に４００μＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。
【0021】
（２）アタンシ抽出物の調製
和方医薬研究所株式会社より入手したアタンシ（Ｂｒｕｃｅａ ｊａｖａｎｉｃａ）の種子を含む果実をミキサーで粉砕し、その粉末１０ｇを高圧溶媒抽出装置にて、熱水、２０％、５０％、７０％および１００％エタノール（９９．５％）溶液各４５ｍＬで抽出した。
各抽出液をロータリーエバポレーターで溶媒除去し、熱水抽出物を１０００ｍｇ、２０％エタノール抽出物を７９０ｍｇ、５０％エタノール抽出物を３１０ｍｇ、７０％エタノール抽出物を１８０ｍｇ、１００％エタノール抽出物を６６０ｍｇ得た。
和方医薬研究所株式会社より入手したアタンシ（Ｂｒｕｃｅａ ｊａｖａｎｉｃａ）の種子を含む果実をミキサーで粉砕し、その粉末１０ｇを高圧溶媒抽出装置にて、熱水、２０％、５０％、７０％および１００％エタノール（９９．５％）溶液各４５ｍＬで抽出した。
各抽出液をロータリーエバポレーターで溶媒除去し、熱水抽出物を１０００ｍｇ、２０％エタノール抽出物を７９０ｍｇ、５０％エタノール抽出物を３１０ｍｇ、７０％エタノール抽出物を１８０ｍｇ、１００％エタノール抽出物を６６０ｍｇ得た。
【0022】
得られた各抽出物のうち、特にＮＴ３遺伝子発現増強作用の高かったアタンシ熱水抽出物とアタンシ２０％エタノール抽出物について、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により以下の条件で分析した。この時、Ｉｎｔ Ｊ Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１３，８，８５－９２．にてアタンシに含有が報告されている成分である、ブルセインＡ、ブルセインＤおよびブルサトールの標準品と保持時間・紫外可視吸収スペクトルの一致を確認し、熱水抽出物および２０％エタノール抽出物中にこれらの成分が含有されることを確認した。また、アタンシ抽出物には、トンカットアリ抽出物に含まれる有効成分である、ユーリコマノン（Ｅｕｒｙｃｏｍａｎｏｎｅ）およびその類縁体は含まれていなかった。ＨＰＬＣクロマトグラムを図１に示す。
【0023】
（ＨＰＬＣ条件）
移動相 Ａ液：０．１％ギ酸水溶液
Ｂ液：アセトニトリル
グラジエント Ｂ ｃｏｎｃ．：１０％→５５％→５５％（０分→３０分→３５分）
流速 １ｍＬ／ｍｉｎ
カラム Ｃａｐｃｅｌｌｐａｋ Ｃ１８ ＵＧ１２０ ４．６×１５０ｍｍ、φ５μｍ（大阪ソーダ）
カラム温度 ４０℃
検出 ＰＤＡ Ｍａｘ－ｐｌｏｔ（２１０－４００ｎｍ）
移動相 Ａ液：０．１％ギ酸水溶液
Ｂ液：アセトニトリル
グラジエント Ｂ ｃｏｎｃ．：１０％→５５％→５５％（０分→３０分→３５分）
流速 １ｍＬ／ｍｉｎ
カラム Ｃａｐｃｅｌｌｐａｋ Ｃ１８ ＵＧ１２０ ４．６×１５０ｍｍ、φ５μｍ（大阪ソーダ）
カラム温度 ４０℃
検出 ＰＤＡ Ｍａｘ－ｐｌｏｔ（２１０－４００ｎｍ）
【0024】
＜アタンシ抽出物中の有効成分の同定＞
上記（２）アタンシ抽出物の調製で得られたアタンシ２０％エタノール抽出物７９０ｍｇを水で溶解し、固相抽出カートリッジＨｙｐｅｒＳｅｐＣ１８ １０ｇ（Ｔｈｅｒｍｏ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に供し、水で洗浄後、１０％、２０％、３０％、５０％および
１００％メタノール溶液の順に各３００ｍＬで溶出・分画した。
２０％、３０％、５０％メタノール溶出画分をさらに分取高速液体クロマトグラフィーにより分離・精製した。
分取後の各画分についてＮＴ３遺伝子発現増強作用を評価した結果、特に高い活性を示した３画分について、高速液体クロマトグラフィーにて保持時間・紫外可視吸収スペクトル及び高分解能ＥＳＩ－ＴＯＦＭＳにおける精密質量・フラグメントおよび推定組成式を確認したところ、市販標準品のブルセインＡ（ＣＡＹＭＡＮ社（製品番号：２９９３６））、ブルセインＤ（ＢＬＤ Ｐｈａｒｍ社（製品番号：ＢＤ２３９２６４）およびブルサトール（シグマ社（製品番号：ＳＬＣ１８６８）の結果と一致しており、これら３成分と同定した。結果を表１に示す。
上記（２）アタンシ抽出物の調製で得られたアタンシ２０％エタノール抽出物７９０ｍｇを水で溶解し、固相抽出カートリッジＨｙｐｅｒＳｅｐＣ１８ １０ｇ（Ｔｈｅｒｍｏ
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に供し、水で洗浄後、１０％、２０％、３０％、５０％および
１００％メタノール溶液の順に各３００ｍＬで溶出・分画した。
２０％、３０％、５０％メタノール溶出画分をさらに分取高速液体クロマトグラフィーにより分離・精製した。
分取後の各画分についてＮＴ３遺伝子発現増強作用を評価した結果、特に高い活性を示した３画分について、高速液体クロマトグラフィーにて保持時間・紫外可視吸収スペクトル及び高分解能ＥＳＩ－ＴＯＦＭＳにおける精密質量・フラグメントおよび推定組成式を確認したところ、市販標準品のブルセインＡ（ＣＡＹＭＡＮ社（製品番号：２９９３６））、ブルセインＤ（ＢＬＤ Ｐｈａｒｍ社（製品番号：ＢＤ２３９２６４）およびブルサトール（シグマ社（製品番号：ＳＬＣ１８６８）の結果と一致しており、これら３成分と同定した。結果を表１に示す。
【表1】
【0025】
＜実施例１．アタンシ抽出物によるＮＴ３の発現増強作用＞
ラット初代ミュラー細胞でのＮＴ３遺伝子発現に対するアタンシ抽出物の作用について、以下の方法で検討した。
上記（２）アタンシ抽出物の調製で得られた各アタンシ抽出物はＤＭＳＯで溶解し使用した。培養９日目の初代ミュラー細胞の培地を全量除去し、１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ－Ｆ１２培地４００μＬに交換し、３７℃、５％ＣＯ２で９０分間培養することで血清飢餓状態に置いた。各アタンシ抽出物を図２に表示した濃度になるように添加し、９０分間培養後に上清を除去し、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い添付の説明書に従ってＲＮＡを調製した。ＲＮＡ調製の際、ＤＮａｓｅ Ｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、ゲノムＤＮＡの除去を行った。調製した適正量のＲＮＡを、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて添付の説明書に従いｃＤＮＡを作製した。
ラット初代ミュラー細胞でのＮＴ３遺伝子発現に対するアタンシ抽出物の作用について、以下の方法で検討した。
上記（２）アタンシ抽出物の調製で得られた各アタンシ抽出物はＤＭＳＯで溶解し使用した。培養９日目の初代ミュラー細胞の培地を全量除去し、１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ－Ｆ１２培地４００μＬに交換し、３７℃、５％ＣＯ２で９０分間培養することで血清飢餓状態に置いた。各アタンシ抽出物を図２に表示した濃度になるように添加し、９０分間培養後に上清を除去し、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い添付の説明書に従ってＲＮＡを調製した。ＲＮＡ調製の際、ＤＮａｓｅ Ｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、ゲノムＤＮＡの除去を行った。調製した適正量のＲＮＡを、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて添付の説明書に従いｃＤＮＡを作製した。
【0026】
ＮＴ３の遺伝子発現量はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｔａｑｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙを用いて、次の方法で定量した。
１μＬのｃＤＮＡとラットＮＴ３転写産物のＴａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅ、Ｔａｑｍａｎ
Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを所定の割合で混合し、計１０μＬとなるようにＰＣＲ ｇｒａｄｅ ｗａｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し混合したものを反応液とした。
調製した反応液は、Ｑｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ５（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、［（９５℃、２０秒）→（９５℃、１秒）→（６０℃、２０秒）］×４０サイクルの反応条件で測定を行った。
内在性コントロールにはラットＧａｐＤＨ Ｔａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅを用い、上記と同様の反応条件で測定を行った。測定により得られたＣｔ値からＧａｐＤＨを内部標準としてΔΔＣｔ法により、各サンプルの相対的遺伝子発現量を求めた。
使用したＴａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅの製品情報、仕様は以下のとおりである。
ＧａｐＤＨ：Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ａｓｓａｙ ＩＤ：Ｒｎ０１４６２６６２＿ｇ１
ＮＴ３：Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ａｓｓａｙ ＩＤ：Ｒｎ００５７９
２８０＿ｍ１
１μＬのｃＤＮＡとラットＮＴ３転写産物のＴａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅ、Ｔａｑｍａｎ
Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを所定の割合で混合し、計１０μＬとなるようにＰＣＲ ｇｒａｄｅ ｗａｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し混合したものを反応液とした。
調製した反応液は、Ｑｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ５（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、［（９５℃、２０秒）→（９５℃、１秒）→（６０℃、２０秒）］×４０サイクルの反応条件で測定を行った。
内在性コントロールにはラットＧａｐＤＨ Ｔａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅを用い、上記と同様の反応条件で測定を行った。測定により得られたＣｔ値からＧａｐＤＨを内部標準としてΔΔＣｔ法により、各サンプルの相対的遺伝子発現量を求めた。
使用したＴａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅの製品情報、仕様は以下のとおりである。
ＧａｐＤＨ：Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ａｓｓａｙ ＩＤ：Ｒｎ０１４６２６６２＿ｇ１
ＮＴ３：Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ａｓｓａｙ ＩＤ：Ｒｎ００５７９
２８０＿ｍ１
【0027】
＜実施例２．アタンシ含有化合物によるＮＴ３発現増強作用＞
アタンシ抽出物に含まれるブルセインＡ、ブルセインＤ、ブルサトールについて、ＮＴ３遺伝子発現増強作用を、以下の方法で試験した。
＜被験物質の調製＞
ブルセインＡは ＣＡＹＭＡＮ社（製品番号：２９９３６）から入手し、ＤＭＳＯに溶解して使用した。ブルセインＤはＢＬＤ Ｐｈａｒｍ社（製品番号：ＢＤ２３９２６４）から入手し、ＤＭＳＯに溶解して使用した。ブルサトールは、シグマ社（製品番号：ＳＬＣ１８６８）から入手し、ＤＭＳＯに溶解して使用した。
アタンシ抽出物に含まれるブルセインＡ、ブルセインＤ、ブルサトールについて、ＮＴ３遺伝子発現増強作用を、以下の方法で試験した。
＜被験物質の調製＞
ブルセインＡは ＣＡＹＭＡＮ社（製品番号：２９９３６）から入手し、ＤＭＳＯに溶解して使用した。ブルセインＤはＢＬＤ Ｐｈａｒｍ社（製品番号：ＢＤ２３９２６４）から入手し、ＤＭＳＯに溶解して使用した。ブルサトールは、シグマ社（製品番号：ＳＬＣ１８６８）から入手し、ＤＭＳＯに溶解して使用した。
【0028】
＜アタンシ含有化合物によるＮＴ３発現増強作用＞
先述の方法で、ラット初代ミュラー細胞を調製しＮＴ３遺伝子発現増強作用の評価を実施した。ブルセインＡ、ブルセインＤ、ブルサトールは図３に表した濃度になるように添加した。
先述の方法で、ラット初代ミュラー細胞を調製しＮＴ３遺伝子発現増強作用の評価を実施した。ブルセインＡ、ブルセインＤ、ブルサトールは図３に表した濃度になるように添加した。
【0029】
・結果
測定結果を図２、３に示す。
図２に示すように、ラット初代ミュラー細胞において、アタンシ抽出物はいずれも、ＮＴ３の遺伝子発現を増強した。図３に示すようにアタンシ抽出物に含まれる、ブルセインＡ、ブルセインＤ、ブルサトールは、ＮＴ３の遺伝子発現を増強した。このことから、アタンシ抽出物は、優れたＮＴ３発現増強能を備えることが確認できた。
測定結果を図２、３に示す。
図２に示すように、ラット初代ミュラー細胞において、アタンシ抽出物はいずれも、ＮＴ３の遺伝子発現を増強した。図３に示すようにアタンシ抽出物に含まれる、ブルセインＡ、ブルセインＤ、ブルサトールは、ＮＴ３の遺伝子発現を増強した。このことから、アタンシ抽出物は、優れたＮＴ３発現増強能を備えることが確認できた。
【0030】
＜実施例３．ｉｎ ｖｉｖｏ試験１＞
アタンシ抽出物のＮＴ３発現増強作用について動物試験を行い、内耳組織での有効性を確認した。中耳腔（鼓室内）に局所投与した薬剤や物質が内耳へ移行することは良く知られている。アタンシ抽出物の内耳組織における作用を、アタンシ抽出物の中耳への局所投与を用いた次の方法で検証した。
（１）試験方法
１）７週齢Ｗｉｓｔａｒラット雄（日本エスエルシー）を１週間飼育部屋で順化飼育後、試験に供した。
アタンシ抽出物のＮＴ３発現増強作用について動物試験を行い、内耳組織での有効性を確認した。中耳腔（鼓室内）に局所投与した薬剤や物質が内耳へ移行することは良く知られている。アタンシ抽出物の内耳組織における作用を、アタンシ抽出物の中耳への局所投与を用いた次の方法で検証した。
（１）試験方法
１）７週齢Ｗｉｓｔａｒラット雄（日本エスエルシー）を１週間飼育部屋で順化飼育後、試験に供した。
【0031】
２）試験動物は、１群４匹を使用した。
イソフルラン吸入麻酔後、鼓膜を目視できるまで外耳を切開し、マイクロシリンジを用いて、片側の中耳内にコントロールとして生理食塩水（大塚製薬）４０μＬを投与し、切開部を縫合した。その後、同様の方法により、逆側の中耳内に１０ｍｇ／ｍＬおよび１００ｍｇ／ｍｌの濃度で生理食塩水に溶解させたアタンシの２０％エタノール抽出物を４０μＬ投与した。
イソフルラン吸入麻酔後、鼓膜を目視できるまで外耳を切開し、マイクロシリンジを用いて、片側の中耳内にコントロールとして生理食塩水（大塚製薬）４０μＬを投与し、切開部を縫合した。その後、同様の方法により、逆側の中耳内に１０ｍｇ／ｍＬおよび１００ｍｇ／ｍｌの濃度で生理食塩水に溶解させたアタンシの２０％エタノール抽出物を４０μＬ投与した。
【0032】
３）投与後、麻酔下で１０分静置し、飼育ケージに戻した。投与４時間後に頸椎脱臼により安楽死させた後、蝸牛組織を単離し、氷冷したＴＲＩｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；１５５９６０１８）５００μＬに直ちに浸しホモジナイザーで組織を破砕し、これを蝸牛組織のＲＮＡ発現解析試料として、－８０℃で保存した。
【0033】
４）－８０℃で一時凍結保存したサンプルを、室温で解凍した。解凍後、室温で５分静置し、次いで各サンプルにクロロホルム１００μＬを添加し、１５秒間ボルテックスミキサーで混合した後、室温で３分静置した。その後各サンプルを４℃、１２，０００Ｇで１５分間遠心し、水相を新しいチューブに回収した。
【0034】
５）その後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い添付の説明書に従ってＲＮＡを精製した。ＲＮＡ精製の際、ＤＮａｓｅＩＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、ゲノムＤＮＡの除去を行った。精製したＲＮＡはＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて添付の説明書に従いｃＤＮＡを作製した。
【0035】
６）実施例１に記載の方法で、ＮＴ３の相対的遺伝子発現量を定量した。
【0036】
（２）結果
試験結果を図４に示す。
図４に示すように、ラット中耳に投与したアタンシ抽出物は、内耳組織のＮＴ３の発現を増強した。
以上の試験結果から、アタンシ抽出物は、内耳組織においても、ＮＴ３の発現を増強することによって聴覚機能を改善する作用を有することが明らかである。
試験結果を図４に示す。
図４に示すように、ラット中耳に投与したアタンシ抽出物は、内耳組織のＮＴ３の発現を増強した。
以上の試験結果から、アタンシ抽出物は、内耳組織においても、ＮＴ３の発現を増強することによって聴覚機能を改善する作用を有することが明らかである。
【0037】
＜実施例４．ｉｎ ｖｉｖｏ試験２＞
本出願人は、特許文献１（特開２０２１－４２１９８号公報）において、トンカットアリの抽出物を有効成分として含有する、ＮＴ３の発現増強用組成物、聴覚機能低下予防及び／または改善用組成物を提案している。
アタンシ抽出物とトンカットアリ抽出物との比較試験を行った。
１０ｍｇ／ｍＬの濃度で生理食塩水に溶解させたアタンシの２０％エタノール抽出物とトンカットアリ抽出物とを用いた以外は、実施例３と同様にしてＮＴ３の相対的遺伝子発現量を定量した。なお、トンカットアリ抽出物は、市販品（アスク薬品株式会社、「トンカットアリ乾燥エキス Ｐｈｙｓｔａ：登録商標」、製品番号０１２．１０５）を試験に用いた。
本出願人は、特許文献１（特開２０２１－４２１９８号公報）において、トンカットアリの抽出物を有効成分として含有する、ＮＴ３の発現増強用組成物、聴覚機能低下予防及び／または改善用組成物を提案している。
アタンシ抽出物とトンカットアリ抽出物との比較試験を行った。
１０ｍｇ／ｍＬの濃度で生理食塩水に溶解させたアタンシの２０％エタノール抽出物とトンカットアリ抽出物とを用いた以外は、実施例３と同様にしてＮＴ３の相対的遺伝子発現量を定量した。なお、トンカットアリ抽出物は、市販品（アスク薬品株式会社、「トンカットアリ乾燥エキス Ｐｈｙｓｔａ：登録商標」、製品番号０１２．１０５）を試験に用いた。
【0038】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
