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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024085386
(43)【公開日】2024-06-26
(54)【発明の名称】アデノウイルス定量用キット及びアデノウイルス定量方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/70 20060101AFI20240619BHJP
C12Q 1/6888 20180101ALI20240619BHJP
C12Q 1/6851 20180101ALI20240619BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20240619BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/70 ZNA
C12Q1/6888 Z
C12Q1/6851 Z
C12Q1/686 Z
【審査請求】有
【請求項の数】9
【出願形態】ＯＬ
【公開請求】
(21)【出願番号】P 2023195029
(22)【出願日】2023-11-16
(71)【出願人】
【識別番号】517448489
【氏名又は名称】合同会社Ｈ．Ｕ．グループ中央研究所
(74)【代理人】
【識別番号】110001047
【氏名又は名称】弁理士法人セントクレスト国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】二神 健
(72)【発明者】
【氏名】森 正敏
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA19
4B063QQ10
4B063QQ42
4B063QR08
4B063QR42
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS25
4B063QX01
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ＰＣＲによって、複数の型のアデノウイルスを同時に高精度で定量することが可能なアデノウイルス定量用キットを提供すること。
【解決手段】フォワードプライマー及びリバースプライマーを含み、前記フォワードプライマーが、それぞれ特定の配列である４種類の混合プライマーからなる群から選択される少なくとも１つを含み、かつ、特定の配列を有する混合プライマーであるリバースプライマーを含む、アデノウイルス定量用キットとする。
【選択図】なし
【解決手段】フォワードプライマー及びリバースプライマーを含み、前記フォワードプライマーが、それぞれ特定の配列である４種類の混合プライマーからなる群から選択される少なくとも１つを含み、かつ、特定の配列を有する混合プライマーであるリバースプライマーを含む、アデノウイルス定量用キットとする。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
複数の型のアデノウイルスを同時にＰＣＲで定量するための、フォワードプライマー及びリバースプライマーからなるプライマー対を含むキットであり、
前記フォワードプライマーが、
配列番号：１に記載の次の（１）：
５’－ＣＳＣＡＧＴＧＧＫＣＤＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…（１）
［（１）中、ＳはＧ又はＣを示し、ＫはＧ又はＴを示し、ＤはＡ又はＧ又はＴを示す。］で示される各ヌクレオチド配列を含むプライマーを含む混合プライマーＦ１、
配列番号：２に記載の次の（２）：
５’－ＣＧＣＡＧＴＧＧＫＣＤＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…（２）
［（２）中、ＫはＧ又はＴを示し、ＤはＡ又はＧ又はＴを示す。］
で示される各ヌクレオチド配列を含むプライマーを含む混合プライマーＦ２、
配列番号：３に記載の次の（３）：
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＫＣＤＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…（３）
［（３）中、ＫはＧ又はＴを示し、ＤはＡ又はＧ又はＴを示す。］
で示される各ヌクレオチド配列を含むプライマーを含む混合プライマーＦ３、及び
配列番号：４に記載の次の（４）：
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＫＣＤＴＡＣＡＴＧＣＡＹＡ－３’…（４）
［（４）中、ＫはＧ又はＴを示し、ＤはＡ又はＧ又はＴを示し、ＹはＴ又はＣを示す。］
で示される各ヌクレオチド配列を含むプライマーを含む混合プライマーＦ４
からなる群から選択される少なくとも１つを含み、かつ、
前記リバースプライマーが、
配列番号：５に記載の次の（５）：
５’－ＹＡＣＮＧＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＡＡＡＹ－３’…（５）
［（５）中、Ｙは互いに独立にＴ又はＣを示し、ＮはＡ又はＧ又はＣ又はＴを示す。］
で示される各ヌクレオチド配列を含むプライマーを含む混合プライマーＲ１を含む、
アデノウイルス定量用キット。
前記フォワードプライマーが、
配列番号：１に記載の次の（１）：
５’－ＣＳＣＡＧＴＧＧＫＣＤＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…（１）
［（１）中、ＳはＧ又はＣを示し、ＫはＧ又はＴを示し、ＤはＡ又はＧ又はＴを示す。］で示される各ヌクレオチド配列を含むプライマーを含む混合プライマーＦ１、
配列番号：２に記載の次の（２）：
５’－ＣＧＣＡＧＴＧＧＫＣＤＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…（２）
［（２）中、ＫはＧ又はＴを示し、ＤはＡ又はＧ又はＴを示す。］
で示される各ヌクレオチド配列を含むプライマーを含む混合プライマーＦ２、
配列番号：３に記載の次の（３）：
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＫＣＤＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…（３）
［（３）中、ＫはＧ又はＴを示し、ＤはＡ又はＧ又はＴを示す。］
で示される各ヌクレオチド配列を含むプライマーを含む混合プライマーＦ３、及び
配列番号：４に記載の次の（４）：
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＫＣＤＴＡＣＡＴＧＣＡＹＡ－３’…（４）
［（４）中、ＫはＧ又はＴを示し、ＤはＡ又はＧ又はＴを示し、ＹはＴ又はＣを示す。］
で示される各ヌクレオチド配列を含むプライマーを含む混合プライマーＦ４
からなる群から選択される少なくとも１つを含み、かつ、
前記リバースプライマーが、
配列番号：５に記載の次の（５）：
５’－ＹＡＣＮＧＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＡＡＡＹ－３’…（５）
［（５）中、Ｙは互いに独立にＴ又はＣを示し、ＮはＡ又はＧ又はＣ又はＴを示す。］
で示される各ヌクレオチド配列を含むプライマーを含む混合プライマーＲ１を含む、
アデノウイルス定量用キット。
【請求項2】
前記リバースプライマーが、
配列番号：６に記載の次の（６）：
５’－ＣＡＣＡＧＴＧＧＧＡＴＴＴＣＴＧＡＡＣ－３’…（６）
で示されるヌクレオチド配列を含むプライマーＲ２、
配列番号：７に記載の次の（７）：
５’－ＴＡＣＡＧＴＧＧＧＡＴＴＴＣＴＡＡＡＣ－３’…（７）
で示されるヌクレオチド配列を含むプライマーＲ３、及び
配列番号：８に記載の次の（８）：
５’－ＴＡＣＧＧＴＡＧＧＡＴＴＴＣＴＡＡＡＣ－３’…（８）
で示されるヌクレオチド配列を含むプライマーＲ４
からなる群から選択される少なくとも１つをさらに含む、請求項１に記載のアデノウイルス定量用キット。
配列番号：６に記載の次の（６）：
５’－ＣＡＣＡＧＴＧＧＧＡＴＴＴＣＴＧＡＡＣ－３’…（６）
で示されるヌクレオチド配列を含むプライマーＲ２、
配列番号：７に記載の次の（７）：
５’－ＴＡＣＡＧＴＧＧＧＡＴＴＴＣＴＡＡＡＣ－３’…（７）
で示されるヌクレオチド配列を含むプライマーＲ３、及び
配列番号：８に記載の次の（８）：
５’－ＴＡＣＧＧＴＡＧＧＡＴＴＴＣＴＡＡＡＣ－３’…（８）
で示されるヌクレオチド配列を含むプライマーＲ４
からなる群から選択される少なくとも１つをさらに含む、請求項１に記載のアデノウイルス定量用キット。
【請求項3】
各プライマーの長さが、それぞれ独立に、１９～２９塩基である、請求項１に記載のアデノウイルス定量用キット。
【請求項4】
プローブをさらに含み、
前記プローブが、
配列番号：９に記載の次の（９）：
５’－ＣＡＣＣＡＧＡＣＣＣＧＧＧＣＴＣＡＧＧＴＡＣＴＣＣ－３’…（９）
で示されるヌクレオチド配列又はその相補配列を含むプローブＰ１、及び
配列番号：１０に記載の次の（１０）：
５’－ＣＡＣＣＡＧＡＣＣＳＧＧＲＣＴＣＡＧＧＴＡＣＴＣＣ－３’…（１０）
［（１０）中、ＳはＧ又はＣを示し、ＲはＧ又はＡを示す。］
で示される各ヌクレオチド配列又はそれらの各相補配列を含むプローブを含む混合プローブＰ２
からなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項１に記載のアデノウイルス定量用キット。
前記プローブが、
配列番号：９に記載の次の（９）：
５’－ＣＡＣＣＡＧＡＣＣＣＧＧＧＣＴＣＡＧＧＴＡＣＴＣＣ－３’…（９）
で示されるヌクレオチド配列又はその相補配列を含むプローブＰ１、及び
配列番号：１０に記載の次の（１０）：
５’－ＣＡＣＣＡＧＡＣＣＳＧＧＲＣＴＣＡＧＧＴＡＣＴＣＣ－３’…（１０）
［（１０）中、ＳはＧ又はＣを示し、ＲはＧ又はＡを示す。］
で示される各ヌクレオチド配列又はそれらの各相補配列を含むプローブを含む混合プローブＰ２
からなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項１に記載のアデノウイルス定量用キット。
【請求項5】
前記プローブが、
配列番号：１１に記載の（１１）：
５’－ＣＡＣＧＡＧＧＣＣＧＧＧＡＣＴＣＡＧＧＴＡＣＴＣＣ－３’…（１１）
で示されるヌクレオチド配列又はその相補配列を含むプローブＰ３
をさらに含む、請求項４に記載のアデノウイルス定量用キット。
配列番号：１１に記載の（１１）：
５’－ＣＡＣＧＡＧＧＣＣＧＧＧＡＣＴＣＡＧＧＴＡＣＴＣＣ－３’…（１１）
で示されるヌクレオチド配列又はその相補配列を含むプローブＰ３
をさらに含む、請求項４に記載のアデノウイルス定量用キット。
【請求項6】
各プローブが、標識物質及び前記標識物質に由来するシグナルを抑制する物質を備える標識プローブである、請求項４に記載のアデノウイルス定量用キット。
【請求項7】
各プローブの長さが、それぞれ独立に、２５～３３塩基である、請求項４に記載のアデノウイルス定量用キット。
【請求項8】
試料中の複数の型のアデノウイルスを同時にＰＣＲで定量する方法であり、
試料中のアデノウイルスの標的ヌクレオチド配列を鋳型として、請求項１～７のうちのいずれか一項に記載のキットを用い、ポリメラーゼ連鎖反応により前記標的ヌクレオチド配列が増幅された増幅産物を得る増幅工程、及び
前記増幅産物を検出して前記アデノウイルスを定量する定量工程
を含む、アデノウイルス定量方法。
試料中のアデノウイルスの標的ヌクレオチド配列を鋳型として、請求項１～７のうちのいずれか一項に記載のキットを用い、ポリメラーゼ連鎖反応により前記標的ヌクレオチド配列が増幅された増幅産物を得る増幅工程、及び
前記増幅産物を検出して前記アデノウイルスを定量する定量工程
を含む、アデノウイルス定量方法。
【請求項9】
前記キットが請求項６に記載のキットであり、
前記増幅工程が、前記標識プローブがハイブリダイズした前記標的ヌクレオチド配列を鋳型とする工程であり、
前記定量工程において、前記増幅産物の検出が、前記標的ヌクレオチド配列の増幅に伴って分解された標識プローブの標識物質に由来するシグナルの検出である、
請求項８に記載のアデノウイルス定量方法。
前記増幅工程が、前記標識プローブがハイブリダイズした前記標的ヌクレオチド配列を鋳型とする工程であり、
前記定量工程において、前記増幅産物の検出が、前記標的ヌクレオチド配列の増幅に伴って分解された標識プローブの標識物質に由来するシグナルの検出である、
請求項８に記載のアデノウイルス定量方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、アデノウイルス定量用キット及びアデノウイルス定量方法に関し、より詳しくは、ヒトアデノウイルス定量用キット及びそれを用いたヒトアデノウイルス定量方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ヒトに感染するアデノウイルス（ＡｄＶ、ヒトアデノウイルス（ＨＡｄＶ））は、呼吸器疾患、眼疾患、消化器疾患等を引き起こすウイルスであり、現在、疾患毎にＡ～Ｇの７つの種に大きく分類され、１００以上の型が存在している。例えば、主にＢ種（Ｂ１種）の３型又は７型の感染によって急性呼吸器疾患が引き起こされ、特に７型によって重症肺炎が引き起こされ、髄膜炎、脳炎、心筋炎等が併発したり、発熱や咳等の症状が長引くことで重症になることが示唆されている。また、咽頭結膜熱（プール熱）は、特に３型によって乳幼児で発症することが多く、高熱及び微熱が４日程続き、かつての流行とされていた。さらに、例えば、主にＤ種の８型、１９型（１９ａ型とも称される）、３７型、５３型、５４型、５６型等の新型アデノウイルスによって流行性角結膜炎（ＥＫＣ）が引き起こされ、主にＢ種（Ｂ２種）の１１型によって出血性膀胱炎が引きこされ、主にＡ種の３１型やＦ種の４０型又は４１型によって胃腸炎が引き起こされる（非特許文献１、非特許文献２）。また、比較的稀ではあるが、Ｃ種（１型、２型、５型、６型等）によって肝炎が引き起こされることも報告されている（非特許文献３）。
【0003】
上述のように様々な疾患がアデノウイルスによって引き起こされるため、アデノウイルスの検出、定量はその診断に重要である。アデノウイルスを検出、定量する方法としては、リアルタイム定量ＰＣＲによる方法が迅速な方法として有用であり、例えば、国立感染症研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，ＮＩＩＤ）が推奨する方法（非特許文献１）や、アメリカ疾病予防管理センター（Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，ＣＤＣ）が推奨する方法（非特許文献４）が知られている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】花岡希ら，「病原体検出・検査マニュアル 腸管アデノウイルス（感染性胃腸炎）」，国立感染症研究所 感染症情報センター，２０２２年５月 Ｖｅｒ．２
【非特許文献2】国立感染症研究所，「アデノウイルス解説ページ－アデノウイルスの種類と病気」，［ｏｎ ｌｉｎｅ］，２０１４年１月２９日，［２０２３年７月１９日検索］，インターネット＜ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｉｉｄ．ｇｏ．ｊｐ／ｎｉｉｄ／ｊａ／ａｄｅｎｏ－ｐｆｃ－ｍ／２１１０－ｉｄｓｃ／４ｔｈ／４３２６－ａｄｅｎｏ－ｖｉｒｕｓ－ｐａｇｅ２．ｈｔｍｌ＞
【非特許文献3】恩田佳幸，「アデノウイルス肝炎について」，ＩＡＳＲ Ｖｏｌ．４２，２０２１年４月号，ｐ．７０
【非特許文献4】Ａｌｂｅｒｔ Ｈｅｉｍら，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７０，２００３年，ｐ．２２８－２３９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明者らがアデノウイルス定量方法について検討をおこなったところ、上記の国立感染症研究所が推奨する方法やアメリカ疾病予防管理センターが推奨する方法は複数の型のアデノウイルスを同時に検出することを目的とした方法であるが、これらの方法で得られる定量値は、アデノウイルスの型によっては、理論値から１００倍以上の差が認められることを見出した。他方、全ての型に対してそれぞれプライマー対を設計することで複数の型を高精度で定量することは可能となるが、このようなプライマー対はその数が膨大になることから実用的ではない。
【0006】
本発明は上記課題に鑑みてなされたものであり、ＰＣＲによって、複数の型のアデノウイルスを同時に高精度で定量することが可能なアデノウイルス定量用キット、及びそれを用いたアデノウイルス定量方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
本発明者らは、上記課題を解決すべく、複数のアデノウイルスの型と極めて膨大な数のプライマーとの組み合わせについて鋭意検討を行なった。その結果、フォワードプライマーとして特定の混合プライマーと、リバースプライマーとして特定の混合プライマーとの組み合わせを用いることにより、全ての型にそれぞれ対応するプライマー対を用いなくとも、多くの型のアデノウイルスに対して、理論値に十分に近い高精度の定量値を得られることを見出した。したがって、かかる特定の必要最小限のプライマーの組み合わせで複数の型のアデノウイルスをＰＣＲにより同時に高精度で定量することが可能となることを見出し、本発明を完成するに至った。
【0008】
すなわち、本発明は、アデノウイルス定量用キット及びそれを用いたアデノウイルス定量方法に関し、より詳しくは、以下を提供するものである。
［１］
複数の型のアデノウイルスを同時にＰＣＲで定量するための、フォワードプライマー及びリバースプライマーからなるプライマー対を含むキットであり、
前記フォワードプライマーが、
配列番号：１に記載の次の（１）：
５’－ＣＳＣＡＧＴＧＧＫＣＤＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…（１）
［（１）中、ＳはＧ又はＣを示し、ＫはＧ又はＴを示し、ＤはＡ又はＧ又はＴを示す。］で示される各ヌクレオチド配列を含むプライマーを含む混合プライマーＦ１、
配列番号：２に記載の次の（２）：
５’－ＣＧＣＡＧＴＧＧＫＣＤＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…（２）
［（２）中、ＫはＧ又はＴを示し、ＤはＡ又はＧ又はＴを示す。］
で示される各ヌクレオチド配列を含むプライマーを含む混合プライマーＦ２、
配列番号：３に記載の次の（３）：
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＫＣＤＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…（３）
［（３）中、ＫはＧ又はＴを示し、ＤはＡ又はＧ又はＴを示す。］
で示される各ヌクレオチド配列を含むプライマーを含む混合プライマーＦ３、及び
配列番号：４に記載の次の（４）：
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＫＣＤＴＡＣＡＴＧＣＡＹＡ－３’…（４）
［（４）中、ＫはＧ又はＴを示し、ＤはＡ又はＧ又はＴを示し、ＹはＴ又はＣを示す。］
で示される各ヌクレオチド配列を含むプライマーを含む混合プライマーＦ４
からなる群から選択される少なくとも１つを含み、かつ、
前記リバースプライマーが、
配列番号：５に記載の次の（５）：
５’－ＹＡＣＮＧＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＡＡＡＹ－３’…（５）
［（５）中、Ｙは互いに独立にＴ又はＣを示し、ＮはＡ又はＧ又はＣ又はＴを示す。］
で示される各ヌクレオチド配列を含むプライマーを含む混合プライマーＲ１を含む、
アデノウイルス定量用キット。
［２］
前記リバースプライマーが、
配列番号：６に記載の次の（６）：
５’－ＣＡＣＡＧＴＧＧＧＡＴＴＴＣＴＧＡＡＣ－３’…（６）
で示されるヌクレオチド配列を含むプライマーＲ２、
配列番号：７に記載の次の（７）：
５’－ＴＡＣＡＧＴＧＧＧＡＴＴＴＣＴＡＡＡＣ－３’…（７）
で示されるヌクレオチド配列を含むプライマーＲ３、及び
配列番号：８に記載の次の（８）：
５’－ＴＡＣＧＧＴＡＧＧＡＴＴＴＣＴＡＡＡＣ－３’…（８）
で示されるヌクレオチド配列を含むプライマーＲ４
からなる群から選択される少なくとも１つをさらに含む、［１］に記載のアデノウイルス定量用キット。
［３］
各プライマーの長さが、それぞれ独立に、１９～２９塩基である、［１］又は［２］に記載のアデノウイルス定量用キット。
［４］
プローブをさらに含み、
前記プローブが、
配列番号：９に記載の次の（９）：
５’－ＣＡＣＣＡＧＡＣＣＣＧＧＧＣＴＣＡＧＧＴＡＣＴＣＣ－３’…（９）
で示されるヌクレオチド配列又はその相補配列を含むプローブＰ１、及び
配列番号：１０に記載の次の（１０）：
５’－ＣＡＣＣＡＧＡＣＣＳＧＧＲＣＴＣＡＧＧＴＡＣＴＣＣ－３’…（１０）
［（１０）中、ＳはＧ又はＣを示し、ＲはＧ又はＡを示す。］
で示される各ヌクレオチド配列又はそれらの各相補配列を含むプローブを含む混合プローブＰ２
からなる群から選択される少なくとも１つを含む、［１］～［３］のうちのいずれか一項に記載のアデノウイルス定量用キット。
［５］
前記プローブが、
配列番号：１１に記載の（１１）：
５’－ＣＡＣＧＡＧＧＣＣＧＧＧＡＣＴＣＡＧＧＴＡＣＴＣＣ－３’…（１１）
で示されるヌクレオチド配列又はその相補配列を含むプローブＰ３
をさらに含む、［４］に記載のアデノウイルス定量用キット。
［６］
各プローブが、標識物質及び前記標識物質に由来するシグナルを抑制する物質を備える標識プローブである、［４］又は［５］に記載のアデノウイルス定量用キット。
［７］
各プローブの長さが、それぞれ独立に、２５～３３塩基である、［４］～［６］のうちのいずれか一項に記載のアデノウイルス定量用キット。
［８］
試料中の複数の型のアデノウイルスを同時にＰＣＲで定量する方法であり、
試料中のアデノウイルスの標的ヌクレオチド配列を鋳型として、［１］～［７］のうちのいずれか一項に記載のキットを用い、ポリメラーゼ連鎖反応により前記標的ヌクレオチド配列が増幅された増幅産物を得る増幅工程、及び
前記増幅産物を検出して前記アデノウイルスを定量する定量工程
を含む、アデノウイルス定量方法。
［９］
前記キットが［６］又は［７］に記載のキットであり、
前記増幅工程が、前記標識プローブがハイブリダイズした前記アデノウイルスの標的ヌクレオチド配列を鋳型とする工程であり、
前記定量工程において、前記増幅産物の検出が、前記標的ヌクレオチド配列の増幅に伴って分解された標識プローブの標識物質に由来するシグナルの検出である、
［８］に記載のアデノウイルス定量方法。
［１］
複数の型のアデノウイルスを同時にＰＣＲで定量するための、フォワードプライマー及びリバースプライマーからなるプライマー対を含むキットであり、
前記フォワードプライマーが、
配列番号：１に記載の次の（１）：
５’－ＣＳＣＡＧＴＧＧＫＣＤＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…（１）
［（１）中、ＳはＧ又はＣを示し、ＫはＧ又はＴを示し、ＤはＡ又はＧ又はＴを示す。］で示される各ヌクレオチド配列を含むプライマーを含む混合プライマーＦ１、
配列番号：２に記載の次の（２）：
５’－ＣＧＣＡＧＴＧＧＫＣＤＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…（２）
［（２）中、ＫはＧ又はＴを示し、ＤはＡ又はＧ又はＴを示す。］
で示される各ヌクレオチド配列を含むプライマーを含む混合プライマーＦ２、
配列番号：３に記載の次の（３）：
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＫＣＤＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…（３）
［（３）中、ＫはＧ又はＴを示し、ＤはＡ又はＧ又はＴを示す。］
で示される各ヌクレオチド配列を含むプライマーを含む混合プライマーＦ３、及び
配列番号：４に記載の次の（４）：
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＫＣＤＴＡＣＡＴＧＣＡＹＡ－３’…（４）
［（４）中、ＫはＧ又はＴを示し、ＤはＡ又はＧ又はＴを示し、ＹはＴ又はＣを示す。］
で示される各ヌクレオチド配列を含むプライマーを含む混合プライマーＦ４
からなる群から選択される少なくとも１つを含み、かつ、
前記リバースプライマーが、
配列番号：５に記載の次の（５）：
５’－ＹＡＣＮＧＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＡＡＡＹ－３’…（５）
［（５）中、Ｙは互いに独立にＴ又はＣを示し、ＮはＡ又はＧ又はＣ又はＴを示す。］
で示される各ヌクレオチド配列を含むプライマーを含む混合プライマーＲ１を含む、
アデノウイルス定量用キット。
［２］
前記リバースプライマーが、
配列番号：６に記載の次の（６）：
５’－ＣＡＣＡＧＴＧＧＧＡＴＴＴＣＴＧＡＡＣ－３’…（６）
で示されるヌクレオチド配列を含むプライマーＲ２、
配列番号：７に記載の次の（７）：
５’－ＴＡＣＡＧＴＧＧＧＡＴＴＴＣＴＡＡＡＣ－３’…（７）
で示されるヌクレオチド配列を含むプライマーＲ３、及び
配列番号：８に記載の次の（８）：
５’－ＴＡＣＧＧＴＡＧＧＡＴＴＴＣＴＡＡＡＣ－３’…（８）
で示されるヌクレオチド配列を含むプライマーＲ４
からなる群から選択される少なくとも１つをさらに含む、［１］に記載のアデノウイルス定量用キット。
［３］
各プライマーの長さが、それぞれ独立に、１９～２９塩基である、［１］又は［２］に記載のアデノウイルス定量用キット。
［４］
プローブをさらに含み、
前記プローブが、
配列番号：９に記載の次の（９）：
５’－ＣＡＣＣＡＧＡＣＣＣＧＧＧＣＴＣＡＧＧＴＡＣＴＣＣ－３’…（９）
で示されるヌクレオチド配列又はその相補配列を含むプローブＰ１、及び
配列番号：１０に記載の次の（１０）：
５’－ＣＡＣＣＡＧＡＣＣＳＧＧＲＣＴＣＡＧＧＴＡＣＴＣＣ－３’…（１０）
［（１０）中、ＳはＧ又はＣを示し、ＲはＧ又はＡを示す。］
で示される各ヌクレオチド配列又はそれらの各相補配列を含むプローブを含む混合プローブＰ２
からなる群から選択される少なくとも１つを含む、［１］～［３］のうちのいずれか一項に記載のアデノウイルス定量用キット。
［５］
前記プローブが、
配列番号：１１に記載の（１１）：
５’－ＣＡＣＧＡＧＧＣＣＧＧＧＡＣＴＣＡＧＧＴＡＣＴＣＣ－３’…（１１）
で示されるヌクレオチド配列又はその相補配列を含むプローブＰ３
をさらに含む、［４］に記載のアデノウイルス定量用キット。
［６］
各プローブが、標識物質及び前記標識物質に由来するシグナルを抑制する物質を備える標識プローブである、［４］又は［５］に記載のアデノウイルス定量用キット。
［７］
各プローブの長さが、それぞれ独立に、２５～３３塩基である、［４］～［６］のうちのいずれか一項に記載のアデノウイルス定量用キット。
［８］
試料中の複数の型のアデノウイルスを同時にＰＣＲで定量する方法であり、
試料中のアデノウイルスの標的ヌクレオチド配列を鋳型として、［１］～［７］のうちのいずれか一項に記載のキットを用い、ポリメラーゼ連鎖反応により前記標的ヌクレオチド配列が増幅された増幅産物を得る増幅工程、及び
前記増幅産物を検出して前記アデノウイルスを定量する定量工程
を含む、アデノウイルス定量方法。
［９］
前記キットが［６］又は［７］に記載のキットであり、
前記増幅工程が、前記標識プローブがハイブリダイズした前記アデノウイルスの標的ヌクレオチド配列を鋳型とする工程であり、
前記定量工程において、前記増幅産物の検出が、前記標的ヌクレオチド配列の増幅に伴って分解された標識プローブの標識物質に由来するシグナルの検出である、
［８］に記載のアデノウイルス定量方法。
【発明の効果】
【0009】
本発明によれば、ＰＣＲによって、複数の型のアデノウイルスを同時に高精度で定量することが可能なアデノウイルス定量用キット、及びそれを用いたアデノウイルス定量方法を提供することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【0010】
以下、本発明をその好適な実施形態について、例を挙げて詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【0011】
＜アデノウイルス定量用キット＞
本発明は、複数の型のアデノウイルスを同時にＰＣＲで定量するための、フォワードプライマー及びリバースプライマーからなるプライマー対を含むキットであり、
前記フォワードプライマーが、
配列番号：１に記載の次の（１）：
５’－ＣＳＣＡＧＴＧＧＫＣＤＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…（１）
で示される各ヌクレオチド配列を含むプライマーを含む混合プライマーＦ１、
配列番号：２に記載の次の（２）：
５’－ＣＧＣＡＧＴＧＧＫＣＤＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…（２）
で示される各ヌクレオチド配列を含むプライマーを含む混合プライマーＦ２、
配列番号：３に記載の次の（３）：
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＫＣＤＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…（３）
で示される各ヌクレオチド配列を含むプライマーを含む混合プライマーＦ３、及び
配列番号：４に記載の次の（４）：
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＫＣＤＴＡＣＡＴＧＣＡＹＡ－３’…（４）
で示される各ヌクレオチド配列を含むプライマーを含む混合プライマーＦ４
からなる群から選択される少なくとも１つを含み、かつ、
前記リバースプライマーが、
配列番号：５に記載の次の（５）：
５’－ＹＡＣＮＧＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＡＡＡＹ－３’…（５）
で示される各ヌクレオチド配列を含むプライマーを含む混合プライマーＲ１を含む、
アデノウイルス定量用キット（本明細書中、場合により単に「本発明のキット」という）を提供する。
本発明は、複数の型のアデノウイルスを同時にＰＣＲで定量するための、フォワードプライマー及びリバースプライマーからなるプライマー対を含むキットであり、
前記フォワードプライマーが、
配列番号：１に記載の次の（１）：
５’－ＣＳＣＡＧＴＧＧＫＣＤＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…（１）
で示される各ヌクレオチド配列を含むプライマーを含む混合プライマーＦ１、
配列番号：２に記載の次の（２）：
５’－ＣＧＣＡＧＴＧＧＫＣＤＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…（２）
で示される各ヌクレオチド配列を含むプライマーを含む混合プライマーＦ２、
配列番号：３に記載の次の（３）：
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＫＣＤＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…（３）
で示される各ヌクレオチド配列を含むプライマーを含む混合プライマーＦ３、及び
配列番号：４に記載の次の（４）：
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＫＣＤＴＡＣＡＴＧＣＡＹＡ－３’…（４）
で示される各ヌクレオチド配列を含むプライマーを含む混合プライマーＦ４
からなる群から選択される少なくとも１つを含み、かつ、
前記リバースプライマーが、
配列番号：５に記載の次の（５）：
５’－ＹＡＣＮＧＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＡＡＡＹ－３’…（５）
で示される各ヌクレオチド配列を含むプライマーを含む混合プライマーＲ１を含む、
アデノウイルス定量用キット（本明細書中、場合により単に「本発明のキット」という）を提供する。
【0012】
本明細書中、ヌクレオチド配列中の「Ｓ」は、Ｇ又はＣを示し、「Ｒ」は、Ｇ又はＡを示し、「Ｋ」は、Ｇ又はＴを示し、「Ｄ」は、Ａ又はＧ又はＴを示し、「Ｙ」はＴ又はＣを示し、「Ｎ」はＡ又はＧ又はＣ又はＴを示す。
【0013】
（アデノウイルス）
本発明において「アデノウイルス」とは、より具体的には、アデノウイルス科マストアデノウイルス属に属するヒトアデノウイルスを示す。ヒトアデノウイルスの粒子は、エンベロープ（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）を有さない、直径７０～９０ｎｍの正２０面体構造であり、その内側に線状の二本鎖ＤＮＡを１本含む。ウイルス構造蛋白質は２５２個のカプソメア（ウイルス粒子を構成しているタンパク質の微小単位）から成り、カプソメアのうち１２個は、前記正２０面体の頂点にペントン（Ｐｅｎｔｏｎ）のペントンベースとして位置し、それ以外の２４０個は、ヘキソン（Ｈｅｘｏｎ）として前記正２０面体の面を構成する。ペントンは、ペントンベース及びペントンベースから放射線状に突出しているファイバーから成る。これらのペントンベース、ヘキソン、ファイバーは、それぞれ抗原決定基を有するカプシドタンパク質である。
本発明において「アデノウイルス」とは、より具体的には、アデノウイルス科マストアデノウイルス属に属するヒトアデノウイルスを示す。ヒトアデノウイルスの粒子は、エンベロープ（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）を有さない、直径７０～９０ｎｍの正２０面体構造であり、その内側に線状の二本鎖ＤＮＡを１本含む。ウイルス構造蛋白質は２５２個のカプソメア（ウイルス粒子を構成しているタンパク質の微小単位）から成り、カプソメアのうち１２個は、前記正２０面体の頂点にペントン（Ｐｅｎｔｏｎ）のペントンベースとして位置し、それ以外の２４０個は、ヘキソン（Ｈｅｘｏｎ）として前記正２０面体の面を構成する。ペントンは、ペントンベース及びペントンベースから放射線状に突出しているファイバーから成る。これらのペントンベース、ヘキソン、ファイバーは、それぞれ抗原決定基を有するカプシドタンパク質である。
【0014】
アデノウイルスには、現在、Ａ～Ｇの７種と、１１３の型が存在することが報告されており、それらの各カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列もそれぞれ公知である。これら複数の型のアデノウイルスのゲノムのうち、日本国内で特に重要な９０型までのゲノム配列のＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．及びその長さ（Ｇｅｎｏｍｅ ｌｅｎｇｔｈ）を、下記の表１～２に示す。表１～２の記載は、「Ａｓｈｒａｆａｌｉ Ｍ．Ｉｓｍａｌｉら，ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．９，２０１８年，ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｍｉｃｂ．２０１８．０２１７８」に記載のものであり、アデノウイルス型の欄に「ＨＡｄＶ－ＸＹ」の形式で示される表記において、Ｘで表されるアルファベットはアデノウイルスの種を、Ｙで表される数字はアデノウイルスの型を、それぞれ示す。
【0015】
【表1】
【0016】
【表2】
【0017】
本発明においてＰＣＲにより増幅されるアデノウイルスの標的ヌクレオチド配列（検出部位）は、アデノウイルスのヘキソンのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の一部である。この検出部位の典型的ヌクレオチド配列は、Ｃ種２型では、ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｏ．：ＡＣ＿０００００７で示される３５９３７塩基のうちの少なくとも第１８８５７～１８９８９塩基（１３３塩基）を含む領域である。この検出部位のヌクレオチド配列は型毎に異なり、全１１３の型において、本発明に係るプライマー及びプローブの設計位置の配列がいずれも共通するもので分類すると、少なくとも２１種類存在する。各型のアデノウイルスの標的ヌクレオチド配列は、それぞれ、上記の表１～２に示した各ゲノム配列のうち、上記の典型的ヌクレオチド配列に対応する部位である。前記典型的ヌクレオチド配列に「対応する」部位とは、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ ａｔ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等を用いて（例えば、パラメータ：デフォルト値（すなわち初期設定値））、ヌクレオチド配列を整列させた際に、上記典型的ヌクレオチド配列と同列になる範囲のことである。
【0018】
本発明によれば、多くの型のアデノウイルスを同時に高精度で定量することができるが、同時に定量するアデノウイルスの型として好ましくは、１，２，５，６，５７，１０４；３；４；７，１６，６６；８，５４，７２，１０１；１１，３５，７７，７８；１２；１４，５５，７９；１８；９，１０，１３，１５，１７，１９，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３２，３３，３６，３７，３８，３９，４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８，４９，５１，５３，５６，６０，６２，６３，６４，６５，６７，６９，７０，７１，７４，７５，８１，８２，８３，８４，８５，８６，８７，８８，８９，９１，９２，９３，９４，９５，９６，９７，９８，９９，１００，１０２，１０３，１０７，１１１，１１３；２０；２１，５０，７６；３１；３４；４０；４１；５２；５８，５９；６１；６８；７３型であり、より好ましくは、１，２，５，６，５７，１０４；３；４；７，１６，６６；８，５４，７２，１０１；１１，３５，７７，７８；１４，５５，７９；１８；９，１０，１３，１５，１７，１９，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３２，３３，３６，３７，３８，３９，４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８，４９，５１，５３，５６，６０，６２，６３，６４，６５，６７，６９，７０，７１，７４，７５，８１，８２，８３，８４，８５，８６，８７，８８，８９，９１，９２，９３，９４，９５，９６，９７，９８，９９，１００，１０２，１０３，１０７，１１１，１１３；２１，５０，７６；３４；４１型であり、さらに好ましくは、１，２，５，６，５７，１０４；３；４；７，１６，６６；８，５４，７２，１０１；１１，３５，７７，７８；１４，５５，７９；１８；９，１０，１３，１５，１７，１９，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３２，３３，３６，３７，３８，３９，４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８，４９，５１，５３，５６，６０，６２，６３，６４，６５，６７，６９，７０，７１，７４，７５，８１，８２，８３，８４，８５，８６，８７，８８，８９，９１，９２，９３，９４，９５，９６，９７，９８，９９，１００，１０２，１０３，１０７，１１１，１１３；２１，５０，７６；３４型である。
【0019】
（プライマー対）
本発明のキットは、フォワードプライマー及びリバースプライマーからなるプライマー対を含む。
本発明のキットは、フォワードプライマー及びリバースプライマーからなるプライマー対を含む。
【0020】
本発明において「プライマー」は、ＰＣＲにおいて、前記標的ヌクレオチド配列にアニーリングし、ＤＮＡ複製の起点となるオリゴヌクレオチドであり、１種のヌクレオチドのみ（例えば、ＤＮＡのみ）で構成されるオリゴヌクレオチドであっても、複数のヌクレオチド（例えば、ＤＮＡとＲＮＡ）から構成されるキメラオリゴヌクレオチドであってもよいが、好ましくはＤＮＡのみから構成されるオリゴヌクレオチドである。
【0021】
本発明において、各プライマーを構成する「ヌクレオチド」は、下記の各配列に示すとおり、通常、ＤＮＡ（アデニン、シトシン、グアニン、ウラシル）であるが、塩基対結合を形成し得る限り、他の天然ヌクレオチド（ＲＮＡ）であってもよく、非天然ヌクレオチド（人工ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ）であってもよい。非天然ヌクレオチドとしては、例えば、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ)、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、モルホリノ核酸、トリシクロ－ＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）、２’－Ｏ－メチル化核酸、２’－ＭＯＥ（２’－Ｏ－メトキシエチル）化核酸、２’－ＡＰ（２’－Ｏ－アミノプロピル）化核酸、２’－フルオロ化核酸、２’Ｆ‐アラビノ核酸（２'－Ｆ－ＡＮＡ）、ＢＮＡ（ＬＮＡ等の架橋化核酸（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）が挙げられる。このようなオリゴヌクレオチドは、当業者であれば公知の方法を適宜選択することにより調製することができ、例えば、市販の核酸自動合成機を用いて合成し、必要に応じて逆相カラム等を用いて精製することにより調製することができる。
【0022】
また、本発明において「フォワードプライマー」とは、前記標的ヌクレオチド配列のアンチセンス配列にアニーリングして、ポリメラーゼによる５’末端から３’末端への伸長反応の起点を与えるオリゴヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ）であり、「リバースプライマー」とは、センス配列にアニーリングして、ポリメラーゼによる５’末端から３’末端への伸長反応の起点を与えるオリゴヌクレオチド（好ましくはＤＮＡ）である。
【0023】
本発明に係るプライマー対において、これを構成するフォワードプライマー及びリバースプライマーはそれぞれ複数存在する。かかるフォワードプライマー及びリバースプライマーを構成する各プライマーの長さとしては、互いに同じであっても異なっていてもよく、それぞれ独立に、１９～２９塩基であることが好ましく、２１～２７塩基であることがより好ましい。特にフォワードプライマーを構成する各プライマーの長さとしては、それぞれ独立に、２１～２９塩基であることが好ましく、２３～２７塩基であることがさらに好ましい。また、特にリバースプライマーを構成する各プライマーの長さとしては、それぞれ独立に、１９～２７塩基であることが好ましく、２１～２５塩基であることがさらに好ましい。また、各プライマーのＴｍ値としては、通常、５０～７０℃であることが好ましく、５５～６５℃であることがより好ましい。さらに、各プライマーのＧＣ含有量としては、通常、４０～６０％であることが好ましく、４５～５５％であることがより好ましい。
【0024】
〔フォワードプライマー〕
本発明に係るフォワードプライマーは、下記の混合プライマーＦ１、混合プライマーＦ２、混合プライマーＦ３、及び混合プライマーＦ４からなる群から選択される少なくとも１つを含む。
本発明に係るフォワードプライマーは、下記の混合プライマーＦ１、混合プライマーＦ２、混合プライマーＦ３、及び混合プライマーＦ４からなる群から選択される少なくとも１つを含む。
【0025】
混合プライマーＦ１は、例えば、配列番号：１に記載の次の（１）：
５’－ＣＳＣＡＧＴＧＧＫＣＤＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…（１）
で示される１２種類のヌクレオチド配列をそれぞれ含む１２種類のプライマーからなる混合プライマーである。かかる混合プライマーＦ１は、すなわち、次のＦ１－１～Ｆ１－１２：
５’－ＣＧＣＡＧＴＧＧＧＣＡＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ１－１、配列番号：２３
５’－ＣＧＣＡＧＴＧＧＧＣＧＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ１－２、配列番号：２４
５’－ＣＧＣＡＧＴＧＧＧＣＴＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ１－３、配列番号：２５
５’－ＣＧＣＡＧＴＧＧＴＣＡＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ１－４、配列番号：２６
５’－ＣＧＣＡＧＴＧＧＴＣＧＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ１－５、配列番号：２７
５’－ＣＧＣＡＧＴＧＧＴＣＴＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ１－６、配列番号：２８
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＧＣＡＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ１－７、配列番号：２９
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＧＣＧＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ１－８、配列番号：３０
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＧＣＴＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ１－９、配列番号：３１
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＴＣＡＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ１－１０、配列番号：３２
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＴＣＧＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ１－１１、配列番号：３３
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＴＣＴＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ１－１２、配列番号：３４
のヌクレオチド配列をそれぞれ含む１２種類のプライマーの組み合わせからなる混合プライマーである。混合プライマーＦ１において、各プライマーの混合比としては、互いに等量であることが好ましい。
５’－ＣＳＣＡＧＴＧＧＫＣＤＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…（１）
で示される１２種類のヌクレオチド配列をそれぞれ含む１２種類のプライマーからなる混合プライマーである。かかる混合プライマーＦ１は、すなわち、次のＦ１－１～Ｆ１－１２：
５’－ＣＧＣＡＧＴＧＧＧＣＡＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ１－１、配列番号：２３
５’－ＣＧＣＡＧＴＧＧＧＣＧＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ１－２、配列番号：２４
５’－ＣＧＣＡＧＴＧＧＧＣＴＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ１－３、配列番号：２５
５’－ＣＧＣＡＧＴＧＧＴＣＡＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ１－４、配列番号：２６
５’－ＣＧＣＡＧＴＧＧＴＣＧＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ１－５、配列番号：２７
５’－ＣＧＣＡＧＴＧＧＴＣＴＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ１－６、配列番号：２８
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＧＣＡＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ１－７、配列番号：２９
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＧＣＧＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ１－８、配列番号：３０
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＧＣＴＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ１－９、配列番号：３１
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＴＣＡＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ１－１０、配列番号：３２
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＴＣＧＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ１－１１、配列番号：３３
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＴＣＴＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ１－１２、配列番号：３４
のヌクレオチド配列をそれぞれ含む１２種類のプライマーの組み合わせからなる混合プライマーである。混合プライマーＦ１において、各プライマーの混合比としては、互いに等量であることが好ましい。
【0026】
混合プライマーＦ１としては、構成する各プライマーが上記（１）で示されるヌクレオチド配列を含んでいればよく、上記プライマーの好ましい条件を満たすように、それぞれ独立に、５’末端及び／又は３’末端に複数の塩基（好ましくは３塩基以内、より好ましくは２塩基以内）が付加していてもよい。このような混合プライマーＦ１としては、例えば、配列番号：１２に記載のヌクレオチド配列：
５’－ＧＣＣＳＣＡＧＴＧＧＫＣＤＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡＴＣ－３’
で示される１２種類のプライマーの組み合わせからなる混合プライマーであることが好ましい。なお、これら１２種類のプライマーにおいて、（１）で示されるヌクレオチド配列の範囲の具体的配列は、それぞれ、上述のＦ１－１～Ｆ１－１２に示したとおりである。
５’－ＧＣＣＳＣＡＧＴＧＧＫＣＤＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡＴＣ－３’
で示される１２種類のプライマーの組み合わせからなる混合プライマーであることが好ましい。なお、これら１２種類のプライマーにおいて、（１）で示されるヌクレオチド配列の範囲の具体的配列は、それぞれ、上述のＦ１－１～Ｆ１－１２に示したとおりである。
【0027】
混合プライマーＦ２は、例えば、配列番号：２に記載の次の（２）：
５’－ＣＧＣＡＧＴＧＧＫＣＤＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…（２）
で示される６種類のヌクレオチド配列をそれぞれ含む６種類のプライマーからなる混合プライマーである。かかる混合プライマーＦ２は、すなわち、次のＦ２－１～Ｆ２－６：
５’－ＣＧＣＡＧＴＧＧＧＣＡＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ２－１、配列番号：２３
５’－ＣＧＣＡＧＴＧＧＧＣＧＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ２－２、配列番号：２４
５’－ＣＧＣＡＧＴＧＧＧＣＴＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ２－３、配列番号：２５
５’－ＣＧＣＡＧＴＧＧＴＣＡＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ２－４、配列番号：２６
５’－ＣＧＣＡＧＴＧＧＴＣＧＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ２－５、配列番号：２７
５’－ＣＧＣＡＧＴＧＧＴＣＴＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ２－６、配列番号：２８
のヌクレオチド配列をそれぞれ含む６種類のプライマーの組み合わせからなる混合プライマーである。混合プライマーＦ２において、各プライマーの混合比としては、互いに等量であることが好ましい。
５’－ＣＧＣＡＧＴＧＧＫＣＤＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…（２）
で示される６種類のヌクレオチド配列をそれぞれ含む６種類のプライマーからなる混合プライマーである。かかる混合プライマーＦ２は、すなわち、次のＦ２－１～Ｆ２－６：
５’－ＣＧＣＡＧＴＧＧＧＣＡＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ２－１、配列番号：２３
５’－ＣＧＣＡＧＴＧＧＧＣＧＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ２－２、配列番号：２４
５’－ＣＧＣＡＧＴＧＧＧＣＴＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ２－３、配列番号：２５
５’－ＣＧＣＡＧＴＧＧＴＣＡＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ２－４、配列番号：２６
５’－ＣＧＣＡＧＴＧＧＴＣＧＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ２－５、配列番号：２７
５’－ＣＧＣＡＧＴＧＧＴＣＴＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ２－６、配列番号：２８
のヌクレオチド配列をそれぞれ含む６種類のプライマーの組み合わせからなる混合プライマーである。混合プライマーＦ２において、各プライマーの混合比としては、互いに等量であることが好ましい。
【0028】
混合プライマーＦ２としては、構成する各プライマーが上記（２）で示されるヌクレオチド配列を含んでいればよく、上記プライマーの好ましい条件を満たすように、それぞれ独立に、５’末端及び／又は３’末端に複数の塩基（好ましくは３塩基以内、より好ましくは２塩基以内）が付加していてもよい。このような混合プライマーＦ２としては、例えば、配列番号：１３に記載のヌクレオチド配列：
５’－ＧＣＣＧＣＡＧＴＧＧＫＣＤＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡＴＣ－３’
で示される６種類のプライマーの組み合わせからなる混合プライマーであることが好ましい。なお、これら６種類のプライマーにおいて、（２）で示されるヌクレオチド配列の範囲の具体的配列は、それぞれ、上述のＦ２－１～Ｆ２－６に示したとおりである。
５’－ＧＣＣＧＣＡＧＴＧＧＫＣＤＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡＴＣ－３’
で示される６種類のプライマーの組み合わせからなる混合プライマーであることが好ましい。なお、これら６種類のプライマーにおいて、（２）で示されるヌクレオチド配列の範囲の具体的配列は、それぞれ、上述のＦ２－１～Ｆ２－６に示したとおりである。
【0029】
混合プライマーＦ３は、例えば、配列番号：３に記載の次の（３）：
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＫＣＤＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…（３）
で示される６種類のヌクレオチド配列をそれぞれ含む６種類のプライマーからなる混合プライマーである。かかる混合プライマーＦ３は、すなわち、次のＦ３－１～Ｆ３－６：
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＧＣＡＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ３－１、配列番号：２９
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＧＣＧＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ３－２、配列番号：３０
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＧＣＴＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ３－３、配列番号：３１
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＴＣＡＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ３－４、配列番号：３２
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＴＣＧＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ３－５、配列番号：３３
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＴＣＴＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ３－６、配列番号：３４
のヌクレオチド配列をそれぞれ含む６種類のプライマーの組み合わせからなる混合プライマーである。混合プライマーＦ３において、各プライマーの混合比としては、互いに等量であることが好ましい。
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＫＣＤＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…（３）
で示される６種類のヌクレオチド配列をそれぞれ含む６種類のプライマーからなる混合プライマーである。かかる混合プライマーＦ３は、すなわち、次のＦ３－１～Ｆ３－６：
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＧＣＡＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ３－１、配列番号：２９
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＧＣＧＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ３－２、配列番号：３０
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＧＣＴＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ３－３、配列番号：３１
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＴＣＡＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ３－４、配列番号：３２
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＴＣＧＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ３－５、配列番号：３３
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＴＣＴＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ３－６、配列番号：３４
のヌクレオチド配列をそれぞれ含む６種類のプライマーの組み合わせからなる混合プライマーである。混合プライマーＦ３において、各プライマーの混合比としては、互いに等量であることが好ましい。
【0030】
混合プライマーＦ３としては、構成する各プライマーが上記（３）で示されるヌクレオチド配列を含んでいればよく、上記プライマーの好ましい条件を満たすように、それぞれ独立に、５’末端及び／又は３’末端に複数の塩基（好ましくは３塩基以内、より好ましくは２塩基以内）が付加していてもよい。このような混合プライマーＦ３としては、例えば、配列番号：１４に記載のヌクレオチド配列：
５’－ＧＣＣＣＣＡＧＴＧＧＫＣＤＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡＴＣ－３’
で示される６種類のプライマーの組み合わせからなる混合プライマーであることが好ましい。なお、これら６種類のプライマーにおいて、（３）で示されるヌクレオチド配列の範囲の具体的配列は、それぞれ、上述のＦ３－１～Ｆ３－６に示したとおりである。
５’－ＧＣＣＣＣＡＧＴＧＧＫＣＤＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡＴＣ－３’
で示される６種類のプライマーの組み合わせからなる混合プライマーであることが好ましい。なお、これら６種類のプライマーにおいて、（３）で示されるヌクレオチド配列の範囲の具体的配列は、それぞれ、上述のＦ３－１～Ｆ３－６に示したとおりである。
【0031】
混合プライマーＦ４は、例えば、配列番号：４に記載の次の（４）：
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＫＣＤＴＡＣＡＴＧＣＡＹＡ－３’…（４）
で示される１２種類のヌクレオチド配列をそれぞれ含む１２種類のプライマーからなる混合プライマーである。かかる混合プライマーＦ４は、すなわち、次のＦ４－１～Ｆ４－１２：
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＧＣＡＴＡＣＡＴＧＣＡＴＡ－３’…Ｆ４－１、配列番号：３５
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＧＣＡＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ４－２、配列番号：２９
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＧＣＧＴＡＣＡＴＧＣＡＴＡ－３’…Ｆ４－３、配列番号：３６
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＧＣＧＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ４－４、配列番号：３０
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＧＣＴＴＡＣＡＴＧＣＡＴＡ－３’…Ｆ４－５、配列番号：３７
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＧＣＴＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ４－６、配列番号：３１
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＴＣＡＴＡＣＡＴＧＣＡＴＡ－３’…Ｆ４－７、配列番号：３８
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＴＣＡＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ４－８、配列番号：３２
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＴＣＧＴＡＣＡＴＧＣＡＴＡ－３’…Ｆ４－９、配列番号：３９
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＴＣＧＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ４－１０、配列番号：３３
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＴＣＴＴＡＣＡＴＧＣＡＴＡ－３’…Ｆ４－１１、配列番号：４０
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＴＣＴＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ４－１２、配列番号：３４
のヌクレオチド配列をそれぞれ含む１２種類のプライマーの組み合わせからなる混合プライマーである。混合プライマーＦ４において、各プライマーの混合比としては、互いに等量であることが好ましい。
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＫＣＤＴＡＣＡＴＧＣＡＹＡ－３’…（４）
で示される１２種類のヌクレオチド配列をそれぞれ含む１２種類のプライマーからなる混合プライマーである。かかる混合プライマーＦ４は、すなわち、次のＦ４－１～Ｆ４－１２：
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＧＣＡＴＡＣＡＴＧＣＡＴＡ－３’…Ｆ４－１、配列番号：３５
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＧＣＡＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ４－２、配列番号：２９
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＧＣＧＴＡＣＡＴＧＣＡＴＡ－３’…Ｆ４－３、配列番号：３６
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＧＣＧＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ４－４、配列番号：３０
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＧＣＴＴＡＣＡＴＧＣＡＴＡ－３’…Ｆ４－５、配列番号：３７
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＧＣＴＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ４－６、配列番号：３１
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＴＣＡＴＡＣＡＴＧＣＡＴＡ－３’…Ｆ４－７、配列番号：３８
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＴＣＡＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ４－８、配列番号：３２
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＴＣＧＴＡＣＡＴＧＣＡＴＡ－３’…Ｆ４－９、配列番号：３９
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＴＣＧＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ４－１０、配列番号：３３
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＴＣＴＴＡＣＡＴＧＣＡＴＡ－３’…Ｆ４－１１、配列番号：４０
５’－ＣＣＣＡＧＴＧＧＴＣＴＴＡＣＡＴＧＣＡＣＡ－３’…Ｆ４－１２、配列番号：３４
のヌクレオチド配列をそれぞれ含む１２種類のプライマーの組み合わせからなる混合プライマーである。混合プライマーＦ４において、各プライマーの混合比としては、互いに等量であることが好ましい。
【0032】
混合プライマーＦ４としては、構成する各プライマーが上記（４）で示されるヌクレオチド配列を含んでいればよく、上記プライマーの好ましい条件を満たすように、それぞれ独立に、５’末端及び／又は３’末端に複数の塩基（好ましくは３塩基以内、より好ましくは２塩基以内）が付加していてもよい。このような混合プライマーＦ４としては、例えば、配列番号：１５に記載のヌクレオチド配列：
５’－ＧＣＣＣＣＡＧＴＧＧＫＣＤＴＡＣＡＴＧＣＡＹＡＴＣ－３’
で示される１２種類のプライマーの組み合わせからなる混合プライマーであることが好ましい。なお、これら１２種類のプライマーにおいて、（４）で示されるヌクレオチド配列の範囲の具体的配列は、それぞれ、上述のＦ４－１～Ｆ４－１２に示したとおりである。
５’－ＧＣＣＣＣＡＧＴＧＧＫＣＤＴＡＣＡＴＧＣＡＹＡＴＣ－３’
で示される１２種類のプライマーの組み合わせからなる混合プライマーであることが好ましい。なお、これら１２種類のプライマーにおいて、（４）で示されるヌクレオチド配列の範囲の具体的配列は、それぞれ、上述のＦ４－１～Ｆ４－１２に示したとおりである。
【0033】
本発明に係るフォワードプライマーとしては、混合プライマーＦ１であることが特に好ましい。なお、混合プライマーＦ２及び混合プライマーＦ３は混合プライマーＦ１に含まれるため、混合プライマーＦ２及び／又は混合プライマーＦ３と混合プライマーＦ１とはいずれか一方であってよい。
【0034】
〔リバースプライマー〕
本発明に係るリバースプライマーは、下記の混合プライマーＲ１を含む。また、本発明に係るリバースプライマーとしては、下記のプライマーＲ２、プライマーＲ３、及びプライマーＲ４からなる群から選択される少なくとも１つをさらに含むことが好ましい。
本発明に係るリバースプライマーは、下記の混合プライマーＲ１を含む。また、本発明に係るリバースプライマーとしては、下記のプライマーＲ２、プライマーＲ３、及びプライマーＲ４からなる群から選択される少なくとも１つをさらに含むことが好ましい。
【0035】
混合プライマーＲ１は、例えば、配列番号：５に記載の次の（５）：
５’－ＹＡＣＮＧＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＡＡＡＹ－３’…（５）
で示される１６種類のヌクレオチド配列をそれぞれ含む１６種類のプライマーからなる混合プライマーである。かかる混合プライマーＲ１は、すなわち、次のＲ１－１～Ｒ１－１６：
５’－ＴＡＣＡＧＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＡＡＡＴ－３’…Ｒ１－１、配列番号：４１
５’－ＴＡＣＡＧＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＡＡＡＣ－３’…Ｒ１－２、配列番号：４２
５’－ＴＡＣＧＧＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＡＡＡＴ－３’…Ｒ１－３、配列番号：４３
５’－ＴＡＣＧＧＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＡＡＡＣ－３’…Ｒ１－４、配列番号：４４
５’－ＴＡＣＣＧＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＡＡＡＴ－３’…Ｒ１－５、配列番号：４５
５’－ＴＡＣＣＧＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＡＡＡＣ－３’…Ｒ１－６、配列番号：４６
５’－ＴＡＣＴＧＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＡＡＡＴ－３’…Ｒ１－７、配列番号：４７
５’－ＴＡＣＴＧＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＡＡＡＣ－３’…Ｒ１－８、配列番号：４８
５’－ＣＡＣＡＧＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＡＡＡＴ－３’…Ｒ１－９、配列番号：４９
５’－ＣＡＣＡＧＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＡＡＡＣ－３’…Ｒ１－１０、配列番号：５０
５’－ＣＡＣＧＧＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＡＡＡＴ－３’…Ｒ１－１１、配列番号：５１
５’－ＣＡＣＧＧＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＡＡＡＣ－３’…Ｒ１－１２、配列番号：５２
５’－ＣＡＣＣＧＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＡＡＡＴ－３’…Ｒ１－１３、配列番号：５３
５’－ＣＡＣＣＧＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＡＡＡＣ－３’…Ｒ１－１４、配列番号：５４
５’－ＣＡＣＴＧＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＡＡＡＴ－３’…Ｒ１－１５、配列番号：５５
５’－ＣＡＣＴＧＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＡＡＡＣ－３’…Ｒ１－１６、配列番号：５６
のヌクレオチド配列をそれぞれ含む１６種類のプライマーの組み合わせからなる混合プライマーである。混合プライマーＲ１において、各プライマーの混合比としては、互いに等量であることが好ましい。
５’－ＹＡＣＮＧＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＡＡＡＹ－３’…（５）
で示される１６種類のヌクレオチド配列をそれぞれ含む１６種類のプライマーからなる混合プライマーである。かかる混合プライマーＲ１は、すなわち、次のＲ１－１～Ｒ１－１６：
５’－ＴＡＣＡＧＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＡＡＡＴ－３’…Ｒ１－１、配列番号：４１
５’－ＴＡＣＡＧＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＡＡＡＣ－３’…Ｒ１－２、配列番号：４２
５’－ＴＡＣＧＧＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＡＡＡＴ－３’…Ｒ１－３、配列番号：４３
５’－ＴＡＣＧＧＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＡＡＡＣ－３’…Ｒ１－４、配列番号：４４
５’－ＴＡＣＣＧＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＡＡＡＴ－３’…Ｒ１－５、配列番号：４５
５’－ＴＡＣＣＧＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＡＡＡＣ－３’…Ｒ１－６、配列番号：４６
５’－ＴＡＣＴＧＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＡＡＡＴ－３’…Ｒ１－７、配列番号：４７
５’－ＴＡＣＴＧＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＡＡＡＣ－３’…Ｒ１－８、配列番号：４８
５’－ＣＡＣＡＧＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＡＡＡＴ－３’…Ｒ１－９、配列番号：４９
５’－ＣＡＣＡＧＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＡＡＡＣ－３’…Ｒ１－１０、配列番号：５０
５’－ＣＡＣＧＧＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＡＡＡＴ－３’…Ｒ１－１１、配列番号：５１
５’－ＣＡＣＧＧＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＡＡＡＣ－３’…Ｒ１－１２、配列番号：５２
５’－ＣＡＣＣＧＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＡＡＡＴ－３’…Ｒ１－１３、配列番号：５３
５’－ＣＡＣＣＧＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＡＡＡＣ－３’…Ｒ１－１４、配列番号：５４
５’－ＣＡＣＴＧＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＡＡＡＴ－３’…Ｒ１－１５、配列番号：５５
５’－ＣＡＣＴＧＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＡＡＡＣ－３’…Ｒ１－１６、配列番号：５６
のヌクレオチド配列をそれぞれ含む１６種類のプライマーの組み合わせからなる混合プライマーである。混合プライマーＲ１において、各プライマーの混合比としては、互いに等量であることが好ましい。
【0036】
混合プライマーＲ１としては、構成する各プライマーが上記（５）で示されるヌクレオチド配列を含んでいればよく、上記プライマーの好ましい条件を満たすように、それぞれ独立に、５’末端及び／又は３’末端に複数の塩基（好ましくは３塩基以内、より好ましくは２塩基以内）が付加していてもよい。このような混合プライマーＲ１としては、例えば、配列番号：１６に記載のヌクレオチド配列：
５’－ＧＣＹＡＣＮＧＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＡＡＡＹＴＴ－３’
で示される１６種類のプライマーの組み合わせからなる混合プライマーであることが好ましい。なお、これら１６種類のプライマーにおいて、（５）で示されるヌクレオチド配列の範囲の具体的配列は、それぞれ、上述のＲ１－１～Ｒ１－１６に示したとおりである。
５’－ＧＣＹＡＣＮＧＴＧＧＧＧＴＴＴＣＴＡＡＡＹＴＴ－３’
で示される１６種類のプライマーの組み合わせからなる混合プライマーであることが好ましい。なお、これら１６種類のプライマーにおいて、（５）で示されるヌクレオチド配列の範囲の具体的配列は、それぞれ、上述のＲ１－１～Ｒ１－１６に示したとおりである。
【0037】
プライマーＲ２は、配列番号：６に記載の次の（６）：
５’－ＣＡＣＡＧＴＧＧＧＡＴＴＴＣＴＧＡＡＣ－３’…（６）
で示されるヌクレオチド配列を含むプライマーである。プライマーＲ２としては、上記（６）で示されるヌクレオチド配列を含んでいればよく、上記プライマーの好ましい条件を満たすように、５’末端及び／又は３’末端に複数の塩基（好ましくは３塩基以内、より好ましくは２塩基以内）が付加していてもよい。このようなプライマーＲ２としては、例えば、配列番号：１７に記載のヌクレオチド配列：
５’－ＧＣＣＡＣＡＧＴＧＧＧＡＴＴＴＣＴＧＡＡＣＴＴ－３’
で示されるプライマーが好ましい。
５’－ＣＡＣＡＧＴＧＧＧＡＴＴＴＣＴＧＡＡＣ－３’…（６）
で示されるヌクレオチド配列を含むプライマーである。プライマーＲ２としては、上記（６）で示されるヌクレオチド配列を含んでいればよく、上記プライマーの好ましい条件を満たすように、５’末端及び／又は３’末端に複数の塩基（好ましくは３塩基以内、より好ましくは２塩基以内）が付加していてもよい。このようなプライマーＲ２としては、例えば、配列番号：１７に記載のヌクレオチド配列：
５’－ＧＣＣＡＣＡＧＴＧＧＧＡＴＴＴＣＴＧＡＡＣＴＴ－３’
で示されるプライマーが好ましい。
【0038】
プライマーＲ３は、配列番号：７に記載の次の（７）：
５’－ＴＡＣＡＧＴＧＧＧＡＴＴＴＣＴＡＡＡＣ－３’…（７）
で示されるヌクレオチド配列を含むプライマーである。プライマーＲ３としては、上記（７）で示されるヌクレオチド配列を含んでいればよく、上記プライマーの好ましい条件を満たすように、５’末端及び／又は３’末端に複数の塩基（好ましくは３塩基以内、より好ましくは２塩基以内）が付加していてもよい。このようなプライマーＲ３としては、例えば、配列番号：１８に記載のヌクレオチド配列：
５’－ＧＣＴＡＣＡＧＴＧＧＧＡＴＴＴＣＴＡＡＡＣＴＴ－３’
で示されるプライマーが好ましい。
５’－ＴＡＣＡＧＴＧＧＧＡＴＴＴＣＴＡＡＡＣ－３’…（７）
で示されるヌクレオチド配列を含むプライマーである。プライマーＲ３としては、上記（７）で示されるヌクレオチド配列を含んでいればよく、上記プライマーの好ましい条件を満たすように、５’末端及び／又は３’末端に複数の塩基（好ましくは３塩基以内、より好ましくは２塩基以内）が付加していてもよい。このようなプライマーＲ３としては、例えば、配列番号：１８に記載のヌクレオチド配列：
５’－ＧＣＴＡＣＡＧＴＧＧＧＡＴＴＴＣＴＡＡＡＣＴＴ－３’
で示されるプライマーが好ましい。
【0039】
プライマーＲ４は、配列番号：８に記載の次の（８）：
５’－ＴＡＣＧＧＴＡＧＧＡＴＴＴＣＴＡＡＡＣ－３’…（８）
で示されるヌクレオチド配列を含むプライマーである。プライマーＲ４としては、上記（８）で示されるヌクレオチド配列を含んでいればよく、上記プライマーの好ましい条件を満たすように、５’末端及び／又は３’末端に複数の塩基（好ましくは３塩基以内、より好ましくは２塩基以内）が付加していてもよい。このようなプライマーＲ４としては、例えば、配列番号：１９に記載のヌクレオチド配列：
５’－ＧＣＴＡＣＧＧＴＡＧＧＡＴＴＴＣＴＡＡＡＣＴＴ－３’
で示されるプライマーが好ましい。
５’－ＴＡＣＧＧＴＡＧＧＡＴＴＴＣＴＡＡＡＣ－３’…（８）
で示されるヌクレオチド配列を含むプライマーである。プライマーＲ４としては、上記（８）で示されるヌクレオチド配列を含んでいればよく、上記プライマーの好ましい条件を満たすように、５’末端及び／又は３’末端に複数の塩基（好ましくは３塩基以内、より好ましくは２塩基以内）が付加していてもよい。このようなプライマーＲ４としては、例えば、配列番号：１９に記載のヌクレオチド配列：
５’－ＧＣＴＡＣＧＧＴＡＧＧＡＴＴＴＣＴＡＡＡＣＴＴ－３’
で示されるプライマーが好ましい。
【0040】
本発明に係るリバースプライマーとしては、混合プライマーＲ１とプライマーＲ２との組み合わせ、又は、混合プライマーＲ１、プライマーＲ２、プライマーＲ３、及びプライマーＲ４の組み合わせであることが特に好ましい。
【0041】
（プローブ）
本発明において「プローブ」は、ＰＣＲのうち、リアルタイムＰＣＲにおいて、前記標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズし、プライマーの伸長に伴ってポリメラーゼの５’→３’エクソヌクレアーゼにより分解されるオリゴヌクレオチドであり、１種のヌクレオチドのみ（例えば、ＤＮＡのみ）で構成されるオリゴヌクレオチドであっても、複数のヌクレオチド（例えば、ＤＮＡとＲＮＡ）から構成されるキメラオリゴヌクレオチドであってもよいが、好ましくはＤＮＡのみから構成されるオリゴヌクレオチドである。本発明において、各プローブを構成する「ヌクレオチド」としては、上記の各プライマーを構成するヌクレオチドとして述べたものと同様である。
本発明において「プローブ」は、ＰＣＲのうち、リアルタイムＰＣＲにおいて、前記標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズし、プライマーの伸長に伴ってポリメラーゼの５’→３’エクソヌクレアーゼにより分解されるオリゴヌクレオチドであり、１種のヌクレオチドのみ（例えば、ＤＮＡのみ）で構成されるオリゴヌクレオチドであっても、複数のヌクレオチド（例えば、ＤＮＡとＲＮＡ）から構成されるキメラオリゴヌクレオチドであってもよいが、好ましくはＤＮＡのみから構成されるオリゴヌクレオチドである。本発明において、各プローブを構成する「ヌクレオチド」としては、上記の各プライマーを構成するヌクレオチドとして述べたものと同様である。
【0042】
本発明において、プローブは複数存在してもよい。この場合、各プローブの長さとしては、互いに同じであっても異なっていてもよく、それぞれ独立に、２５～３３塩基であることが好ましく、２７～３１塩基であることがより好ましい。また、前記プローブのＴｍ値としては、通常、６０～８０℃であることが好ましく、６５～７５℃であることがより好ましい。
【0043】
本発明に係るプローブは、下記のプローブＰ１及び混合プローブＰ２からなる群から選択される少なくとも１つを含む。また、本発明に係るプローブとしては、下記のプローブＰ３をさらに含むことが好ましい。
【0044】
プローブＰ１は、配列番号：９に記載の次の（９）：
５’－ＣＡＣＣＡＧＡＣＣＣＧＧＧＣＴＣＡＧＧＴＡＣＴＣＣ－３’…（９）
で示されるヌクレオチド配列又はその相補配列を含むプローブである。プローブＰ１としては、上記（９）で示されるヌクレオチド配列を含んでいればよく、上記プローブの好ましい条件を満たすように、５’末端及び／又は３’末端に複数の塩基（好ましくは３塩基以内、より好ましくは２塩基以内）が付加していてもよい。このようなプローブＰ１としては、例えば、配列番号：２０に記載のヌクレオチド配列：
５’－ＴＧＣＡＣＣＡＧＡＣＣＣＧＧＧＣＴＣＡＧＧＴＡＣＴＣＣＧＡ－３’
又はその相補配列で示されるプローブが好ましい。
５’－ＣＡＣＣＡＧＡＣＣＣＧＧＧＣＴＣＡＧＧＴＡＣＴＣＣ－３’…（９）
で示されるヌクレオチド配列又はその相補配列を含むプローブである。プローブＰ１としては、上記（９）で示されるヌクレオチド配列を含んでいればよく、上記プローブの好ましい条件を満たすように、５’末端及び／又は３’末端に複数の塩基（好ましくは３塩基以内、より好ましくは２塩基以内）が付加していてもよい。このようなプローブＰ１としては、例えば、配列番号：２０に記載のヌクレオチド配列：
５’－ＴＧＣＡＣＣＡＧＡＣＣＣＧＧＧＣＴＣＡＧＧＴＡＣＴＣＣＧＡ－３’
又はその相補配列で示されるプローブが好ましい。
【0045】
混合プローブＰ２は、配列番号：１０に記載の次の（１０）：
５’－ＣＡＣＣＡＧＡＣＣＳＧＧＲＣＴＣＡＧＧＴＡＣＴＣＣ－３’…（１０）
で示される各ヌクレオチド配列又はそれらの各相補配列を含むプローブを含む混合プローブである。
５’－ＣＡＣＣＡＧＡＣＣＳＧＧＲＣＴＣＡＧＧＴＡＣＴＣＣ－３’…（１０）
で示される各ヌクレオチド配列又はそれらの各相補配列を含むプローブを含む混合プローブである。
【0046】
混合プローブＰ２は、例えば、上記（１０）で示される４種類のヌクレオチド配列をそれぞれ含む４種類のプローブ又は当該４種類のヌクレオチド配列の相補配列をそれぞれ含む４種類のプローブからなる混合プローブである。かかる混合プローブＰ２は、すなわち、次のＰ２－１～Ｐ２－４：
５’－ＣＡＣＣＡＧＡＣＣＧＧＧＧＣＴＣＡＧＧＴＡＣＴＣＣ…Ｐ２－１、配列番号：５７
５’－ＣＡＣＣＡＧＡＣＣＧＧＧＡＣＴＣＡＧＧＴＡＣＴＣＣ…Ｐ２－２、配列番号：５８
５’－ＣＡＣＣＡＧＡＣＣＣＧＧＧＣＴＣＡＧＧＴＡＣＴＣＣ…Ｐ２－３、配列番号：９
５’－ＣＡＣＣＡＧＡＣＣＣＧＧＡＣＴＣＡＧＧＴＡＣＴＣＣ…Ｐ２－４、配列番号：５９
のヌクレオチド配列をそれぞれ含む４種類のプローブの組み合わせ又は前記ヌクレオチド配列の相補配列をそれぞれ含む４種類のプローブの組み合わせからなる混合プローブである。混合プローブＰ２において、各プローブの混合比としては、互いに等量であることが好ましい。
５’－ＣＡＣＣＡＧＡＣＣＧＧＧＧＣＴＣＡＧＧＴＡＣＴＣＣ…Ｐ２－１、配列番号：５７
５’－ＣＡＣＣＡＧＡＣＣＧＧＧＡＣＴＣＡＧＧＴＡＣＴＣＣ…Ｐ２－２、配列番号：５８
５’－ＣＡＣＣＡＧＡＣＣＣＧＧＧＣＴＣＡＧＧＴＡＣＴＣＣ…Ｐ２－３、配列番号：９
５’－ＣＡＣＣＡＧＡＣＣＣＧＧＡＣＴＣＡＧＧＴＡＣＴＣＣ…Ｐ２－４、配列番号：５９
のヌクレオチド配列をそれぞれ含む４種類のプローブの組み合わせ又は前記ヌクレオチド配列の相補配列をそれぞれ含む４種類のプローブの組み合わせからなる混合プローブである。混合プローブＰ２において、各プローブの混合比としては、互いに等量であることが好ましい。
【0047】
混合プローブＰ２としては、構成する各プローブが上記（１０）で示されるヌクレオチド配列を含んでいればよく、上記プローブの好ましい条件を満たすように、それぞれ独立に、５’末端及び／又は３’末端に複数の塩基（好ましくは３塩基以内、より好ましくは２塩基以内）が付加していてもよい。このような混合プローブＰ２としては、例えば、配列番号：２１に記載のヌクレオチド配列：
５’－ＴＧＣＡＣＣＡＧＡＣＣＳＧＧＲＣＴＣＡＧＧＴＡＣＴＣＣＧＡ－３’
で示される４種類のプローブの組み合わせ又はそれらの相補配列で示される４種類のプローブの組み合わせからなる混合プローブであることが好ましい。なお、これら４種類のプローブにおいて、（１０）で示されるヌクレオチド配列の範囲の具体的配列は、それぞれ、上述のＰ２－１～Ｐ２－４に示したとおりである。
５’－ＴＧＣＡＣＣＡＧＡＣＣＳＧＧＲＣＴＣＡＧＧＴＡＣＴＣＣＧＡ－３’
で示される４種類のプローブの組み合わせ又はそれらの相補配列で示される４種類のプローブの組み合わせからなる混合プローブであることが好ましい。なお、これら４種類のプローブにおいて、（１０）で示されるヌクレオチド配列の範囲の具体的配列は、それぞれ、上述のＰ２－１～Ｐ２－４に示したとおりである。
【0048】
プローブＰ３は、配列番号：１１に記載の（１１）：
５’－ＣＡＣＧＡＧＧＣＣＧＧＧＡＣＴＣＡＧＧＴＡＣＴＣＣ－３’…（１１）
で示されるヌクレオチド配列又はその相補配列を含むプローブである。プローブＰ３としては、上記（１１）で示されるヌクレオチド配列を含んでいればよく、上記プローブの好ましい条件を満たすように、５’末端及び／又は３’末端に複数の塩基（好ましくは３塩基以内、より好ましくは２塩基以内）が付加していてもよい。このようなプローブＰ３としては、例えば、配列番号：２２に記載のヌクレオチド配列：
５’－ＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＧＧＧＡＣＴＣＡＧＧＴＡＣＴＣＣＧＡ－３’
又はその相補配列で示されるプローブが好ましい。
５’－ＣＡＣＧＡＧＧＣＣＧＧＧＡＣＴＣＡＧＧＴＡＣＴＣＣ－３’…（１１）
で示されるヌクレオチド配列又はその相補配列を含むプローブである。プローブＰ３としては、上記（１１）で示されるヌクレオチド配列を含んでいればよく、上記プローブの好ましい条件を満たすように、５’末端及び／又は３’末端に複数の塩基（好ましくは３塩基以内、より好ましくは２塩基以内）が付加していてもよい。このようなプローブＰ３としては、例えば、配列番号：２２に記載のヌクレオチド配列：
５’－ＴＧＣＡＣＧＡＧＧＣＣＧＧＧＡＣＴＣＡＧＧＴＡＣＴＣＣＧＡ－３’
又はその相補配列で示されるプローブが好ましい。
【0049】
本発明に係るプローブとしては、プローブＰ１とプローブＰ３との組み合わせであることが特に好ましい。なお、プローブＰ１は混合プローブＰ２に含まれるため、プローブＰ１とプローブＰ２とはいずれか一方であってよい。
【0050】
本発明に係るプローブとしては、標識物質及び前記標識物質に由来するシグナルを抑制する物質が結合した標識プローブであるであることが好ましい。前記「シグナル」には、例えば、呈色（発色）、消光、反射光、発光、蛍光等が含まれ、肉眼で確認できるものの他、シグナルの種類に応じた検出方法・装置によって確認できるものも含まれる。
【0051】
前記標識物質とそのシグナルを抑制する物質との組み合わせとしては、例えば、蛍光（シグナル）を発する蛍光色素と、蛍光共鳴エネルギー転移によって前記蛍光を抑制するクエンチャーとの組み合わせが挙げられる。この組み合わせでは、同一プローブに前記蛍光色素と前記クエンチャーとが結合されて近接していると、前記蛍光色素の蛍光は蛍光共鳴エネルギー転移により抑制され、他方、プローブが分解されて両者が離隔すると、抑制が解除されて蛍光が発せられる。そのため、ＰＣＲにおいて標的ヌクレオチドにハイブリダイズしたプローブがプライマーの伸長反応、すなわち増幅産物の増量に伴って分解されることで、増幅産物の量に比例して前記蛍光色素に由来する蛍光強度も増大する。よって、かかる蛍光強度を測定することで目的の増幅産物の量を測定することができる。
【0052】
前記蛍光色素としては、例えば、カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、６－カルボキシ－２’，４’，７’，４，７－ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、テトラクロロフルオレセイン（ＴＥＴ）、カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）、６－カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）、６－カルボキシ－４’，５’－ジクロロ－２’，７’－ジメトキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、Ｃｙ（例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５）、４，７，２’－トリクロロ－７’－フェニル－６－カルボキシフルオレセイン（ＶＩＣ）が挙げられ、これらのうちの１種であっても２種以上であってもよい。前記クエンチャーとしては、カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）、６－カルボキシテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）等のローダミン系蛍光色素；Ｂｌａｃｋ Ｈｏｌｅ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（例えば、ＢＨＱ１、ＢＨＱ２、ＢＨＱ３）、Ｉｏｗａ Ｂｌａｃｋ（例えば、ＩＢＲＱ、ＩＢＦＱ）、４－（４－ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（ＤＡＢＣＹＬ）、４－［［２－クロロ－４－ニトロ－フェニル］－アゾ］－アニリン等のＮＦＱ（Ｎｏｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）が挙げられ、これらのうちの１種であっても２種以上であってもよい。
【0053】
前記標識プローブとしては、プローブの一方の端（好ましくは５’末端）に前記蛍光物質が連結され、他方の端（好ましくは３’末端）に前記クエンチャーが連結されたものであることが好ましい。プローブと前記蛍光物質及び前記クエンチャーとの結合は、ヌクレオチドに直接結合していてもよく、他の物質を介して間接的に結合していてもよい。また、前記標識プローブとしては、ＭＧＢ（ｍｉｎｏｒ ｇｒｏｏｖｅ ｂｉｎｄｅｒ）等で修飾されたものであってもよい。このような標識プローブは、当業者であれば公知の方法を適宜選択することにより調製することができる。
【0054】
（その他）
本発明のキットとしては、他に、定量ＰＣＲ、より好ましくはリアルタイムＰＣＲに用いるための他の試薬等をさらに含んでいてもよい。例えば、本発明のキットには、後述するポリメラーゼ、及びその他のＰＣＲ反応用試薬（基質（ｄＮＴＰ）、イオン又はそれらを供するための塩、緩衝液、添加剤）、及び当該キットの使用説明書を適宜含んでいてもよい。また、本発明のキットが前記プローブを含む場合、当該キットとしては、当該プローブに結合させるための標識物質（好ましくは蛍光色素）、前記標識物質に由来するシグナルを抑制する物質（好ましくはクエンチャー）、及び前記標識物質に由来するシグナルを検出するための試薬をさらに含んでいてもよい。また、ＰＣＲの増幅産物の検出方法によっては、これを展開するための担体（例えば、電気泳動方法におけるポリアクリルアミドゲル、核酸クロマト法におけるクロマト用試験紙）及び溶媒、蛍光物質（例えば、インターカレーション法におけるインターカレーター）も、本発明のキットに含まれ得る。さらに、増幅された増幅産物が標的ヌクレオチド配列を鋳型とするものであることを確認するための、ＤＮＡ分子量マーカー及び陽性コントロール等や、下記の本発明の方法に用いるための、検量線作成のための標準試料、検体採取器具、ＤＮＡ抽出試薬等も本発明のキットに含めることができる。
本発明のキットとしては、他に、定量ＰＣＲ、より好ましくはリアルタイムＰＣＲに用いるための他の試薬等をさらに含んでいてもよい。例えば、本発明のキットには、後述するポリメラーゼ、及びその他のＰＣＲ反応用試薬（基質（ｄＮＴＰ）、イオン又はそれらを供するための塩、緩衝液、添加剤）、及び当該キットの使用説明書を適宜含んでいてもよい。また、本発明のキットが前記プローブを含む場合、当該キットとしては、当該プローブに結合させるための標識物質（好ましくは蛍光色素）、前記標識物質に由来するシグナルを抑制する物質（好ましくはクエンチャー）、及び前記標識物質に由来するシグナルを検出するための試薬をさらに含んでいてもよい。また、ＰＣＲの増幅産物の検出方法によっては、これを展開するための担体（例えば、電気泳動方法におけるポリアクリルアミドゲル、核酸クロマト法におけるクロマト用試験紙）及び溶媒、蛍光物質（例えば、インターカレーション法におけるインターカレーター）も、本発明のキットに含まれ得る。さらに、増幅された増幅産物が標的ヌクレオチド配列を鋳型とするものであることを確認するための、ＤＮＡ分子量マーカー及び陽性コントロール等や、下記の本発明の方法に用いるための、検量線作成のための標準試料、検体採取器具、ＤＮＡ抽出試薬等も本発明のキットに含めることができる。
【0055】
＜アデノウイルス定量方法＞
本発明は、試料中の複数の型のアデノウイルスを同時にＰＣＲで定量する方法であり、
試料中のアデノウイルスの標的ヌクレオチド配列を鋳型として、前記本発明のキットを用い、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により前記アデノウイルスの標的ヌクレオチド配列が増幅された増幅産物を得る増幅工程、及び
前記増幅産物を検出して前記アデノウイルスを定量する定量工程
を含む、アデノウイルス定量方法（本明細書中、場合により単に「本発明の方法」という）も提供する。
本発明は、試料中の複数の型のアデノウイルスを同時にＰＣＲで定量する方法であり、
試料中のアデノウイルスの標的ヌクレオチド配列を鋳型として、前記本発明のキットを用い、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により前記アデノウイルスの標的ヌクレオチド配列が増幅された増幅産物を得る増幅工程、及び
前記増幅産物を検出して前記アデノウイルスを定量する定量工程
を含む、アデノウイルス定量方法（本明細書中、場合により単に「本発明の方法」という）も提供する。
【0056】
（試料）
本発明において、「試料」は、前記標的ヌクレオチド配列を含有し得る限り、特に制限されないが、例えば、脊椎動物から分離した試料（例えば次の検体：細胞、組織、器官、個体及びその抽出液；唾液、鼻腔吸引液、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、うがい液、鼻汁、涙、汗、尿、喀痰、気管支肺胞洗浄液、血液、血清、血漿、髄液、リンパ液、精液、羊水等の体液；糞便）、培養液、環境中の水（河川、湖沼、港湾、水路、地下水、浄水、下水、排水等）や土壌等を、目的に応じて適宜用いることができる。前記脊椎動物としては、ヒト及び動物（例えば、チンパンジーやサル等の霊長類；牛、豚、馬、ニワトリ、ネコ、イヌ等の家畜、家禽や愛玩動物；シカ、イノシシ、アライグマ、イタチ、ネズミ、ハト等の野生動物や野鳥）が挙げられる。これらの中でも、本発明に係る試料としては、前記脊椎動物であるヒトから分離した検体であることが好ましい。
本発明において、「試料」は、前記標的ヌクレオチド配列を含有し得る限り、特に制限されないが、例えば、脊椎動物から分離した試料（例えば次の検体：細胞、組織、器官、個体及びその抽出液；唾液、鼻腔吸引液、鼻腔拭い液、咽頭拭い液、うがい液、鼻汁、涙、汗、尿、喀痰、気管支肺胞洗浄液、血液、血清、血漿、髄液、リンパ液、精液、羊水等の体液；糞便）、培養液、環境中の水（河川、湖沼、港湾、水路、地下水、浄水、下水、排水等）や土壌等を、目的に応じて適宜用いることができる。前記脊椎動物としては、ヒト及び動物（例えば、チンパンジーやサル等の霊長類；牛、豚、馬、ニワトリ、ネコ、イヌ等の家畜、家禽や愛玩動物；シカ、イノシシ、アライグマ、イタチ、ネズミ、ハト等の野生動物や野鳥）が挙げられる。これらの中でも、本発明に係る試料としては、前記脊椎動物であるヒトから分離した検体であることが好ましい。
【0057】
本発明に係る試料としては、前記試料をそのまま用いてもよいが、試料の種類に応じて、適宜粉砕や凍結等の処理がなされたものであっても、希釈液で適宜希釈又は懸濁したものであっても、ＤＮＡ抽出処理がなされたものであってもよい。前記希釈液としては、例えば、水；生理食塩水；ナトリウムリン酸バッファー、Ｔｒｉｓ緩衝液、リン酸緩衝液、グッド緩衝液等の緩衝液が挙げられる。前記ＤＮＡ抽出方法としては、前記試料の種類に応じて、適宜公知の方法やそれに準じた方法を特に制限されず採用することができる。このようなＤＮＡ抽出方法としては、例えば、ボイル法、アルカリボイル法、ＳＤＳフェノール法、ｂｏｉｌ－ｓｐｉｎ法、ｂｌｏｏｄ－ＰＵＲＥ法等が挙げられ、また、市販のＤＮＡ抽出キットを適宜用いてもよい。さらに、前記試料としては、例えば、フェノール抽出、クロマトグラフィー、イオン交換、ゲル電気泳動、密度に依存した遠心分離等により精製したものであってもよい。
【0058】
（鋳型）
本発明において「鋳型」とは、下記のＰＣＲの伸長工程における相補鎖合成の基となるヌクレオチドを意味し、前記標的ヌクレオチド配列を含む鎖及びその相補鎖を示す。本発明において、ＰＣＲに供される鋳型としては、ポリヌクレオチドの形態であればよく、前記試料に含まれ得る標的ヌクレオチド配列を含むＤＮＡそのものであっても、前記試料から抽出（及び必要に応じて精製）したＤＮＡを鋳型として合成したＲＮＡであっても、これらの断片であっても、これらの全部又は一部が修飾されたものであっても、その全部又は一部に非天然型のヌクレオチドや特定の配列を含むものであってもよい。そのため本発明に係る試料としては、これらの各ポリヌクレオチドを含む試料としてもよい。
本発明において「鋳型」とは、下記のＰＣＲの伸長工程における相補鎖合成の基となるヌクレオチドを意味し、前記標的ヌクレオチド配列を含む鎖及びその相補鎖を示す。本発明において、ＰＣＲに供される鋳型としては、ポリヌクレオチドの形態であればよく、前記試料に含まれ得る標的ヌクレオチド配列を含むＤＮＡそのものであっても、前記試料から抽出（及び必要に応じて精製）したＤＮＡを鋳型として合成したＲＮＡであっても、これらの断片であっても、これらの全部又は一部が修飾されたものであっても、その全部又は一部に非天然型のヌクレオチドや特定の配列を含むものであってもよい。そのため本発明に係る試料としては、これらの各ポリヌクレオチドを含む試料としてもよい。
【0059】
（増幅工程）
本発明の方法では、増幅工程において、前記試料中のアデノウイルスの標的ヌクレオチド配列を鋳型として、前記本発明のキットを用い、ポリメラーゼ連鎖反応により前記アデノウイルスの標的ヌクレオチド配列が増幅された増幅産物を得る。
本発明の方法では、増幅工程において、前記試料中のアデノウイルスの標的ヌクレオチド配列を鋳型として、前記本発明のキットを用い、ポリメラーゼ連鎖反応により前記アデノウイルスの標的ヌクレオチド配列が増幅された増幅産物を得る。
【0060】
「ポリメラーゼ連鎖反応（本明細書中、場合により単に「ＰＣＲ」と称する）」は、温度変化を繰り返すことにより、前記鋳型を増幅させる方法である。本発明においてより具体的には、前記フォワードプライマー及びリバースプライマーを前記標的ヌクレオチド配列（鋳型）にアニーリングさせるための「アニーリング工程」、前記各プライマーを起点としてポリメラーゼにより標的ヌクレオチド配列の相補鎖の伸長反応を行なう「伸長工程」、及び前記伸長工程によって合成された標的ヌクレオチド配列を含む二本鎖を熱変性により解離させ一本鎖とする「熱変性工程」の３工程からなるサイクルで構成される。このサイクルを複数回繰り返すことで、前記標的ヌクレオチド配列が増幅された増幅産物が得られる。なお、最初の１サイクル目のアニーリング工程に先立っては、前記フォワードプライマー及びリバースプライマーをアニーリングさせるために、前記標的ヌクレオチド配列を含む二本鎖を熱変性により解離させる工程（Ｉｎｉｔｉａｌ ｄｅｎａｔｕｒｅ）を含むことが好ましく、最後のサイクルにおける最後の熱変性工程は含まないことが好ましい。
【0061】
前記アニーリング工程における温度としては、前記フォワードプライマー及びリバースプライマーと前記標的ヌクレオチド配列との間でアニーリングが生じ、維持できる温度であれば特に制限はなく、非特異的な増幅産物を抑制するという観点から、好ましくは２５～６５℃であるが、より好ましくは５０～６０℃である。その保持時間は特に限定されないが、好ましくは１～６０秒間、より好ましくは３０～６０秒間である。また、アニーリング温度は全てのサイクルで同一温度であっても、異なっていてもよい。
【0062】
前記伸長工程における温度としては、相補鎖が合成できる温度であれば特に制限はなく、通常５０～８０℃であるが、好ましくは５０～６０℃であり、アニーリング温度と同一温度であることがさらに好ましい。その保持時間は特に限定されないが、好ましくは１～６０秒間、より好ましくは３０～６０秒間である。また、伸長温度は全てのサイクルで同一温度であっても、異なっていてもよい。
【0063】
前記熱変性工程における温度としては、二本鎖を解離できる温度であれば特に制限はなく、通常８０～１００℃であるが、好ましくは９０～１００℃ある。その保持時間は特に限定されないが、好ましくは１～３０秒間、より好ましくは１０～２０秒間である。また、熱変性温度は全てのサイクルで同一温度であっても、異なっていてもよい。
【0064】
前記サイクルの回数としては、検出方法に応じてその方法で検出できる程度に標的ヌクレオチド配列を増幅できる限り特に制限はないが、通常１０～５０サイクルであり、好ましくは２０～４５サイクルである。
【0065】
このようなＰＣＲにおける反応液には、ＰＣＲを行なうために必須な組成、すなわちＤＮＡを増幅するために必要な組成が含まれていれば、その組成は特に限定されない。例えば、前記反応液に含まれるものとしては、上記のプライマー対及び必要に応じてプローブ；ポリメラーゼ；ｄＮＴＰ等の基質；２価イオン（例えば、マグネシウムイオン、カルシウムイオン）及び１価イオン（例えば、ナトリウムイオン、カリウムイオン）又はこれらを供するための塩（例えば、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、塩化マグネシウム）及び緩衝液（例えば、トリス塩酸バッファー、リン酸バッファー）が挙げられる。また、前記反応液としては、有機溶媒（例えば、エタノール、メタノール、アセトン）、有機酸（例えば、ギ酸、酢酸、安息香酸）、界面活性剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）、アミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸、リジン、トリプトファン）、糖（例えば、グルコース、キシロース、ガラクトース）、ジメチルスルホキシド、ベタイン、ＤＮＡ結合タンパク質等の添加剤をさらに含んでいてもよい。
【0066】
前記ＰＣＲに用いられる「ポリメラーゼ」は、前記鋳型に応じてＤＮＡポリメラーゼ及び逆転写酵素から選択できるが、本発明においては前記鋳型がＤＮＡであって前記ポリメラーゼがＤＮＡポリメラーゼであることが好ましい。前記ＤＮＡポリメラーゼとしては、前記標的ヌクレオチド配列に対してＤＮＡからなる相補鎖を合成する活性を有するもの（ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）であれば特に制限されず、天然型であっても人工的に改変されたポリメラーゼであってもよく、また、常温性、中温姓、耐熱性のいずれであってもよい。これらの中でも、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであることが好ましく、５’→３’エクソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼであることがより好ましい。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、Ｐｏｌ型ＤＮＡポリメラーゼが挙げられ、より具体的には、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【0067】
（定量工程）
本発明の方法では、定量工程において、前記増幅産物（すなわち、標的ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を検出し、検出した増幅産物の量に基づいて前記試料中に含まれるアデノウイルス量を定量する。
本発明の方法では、定量工程において、前記増幅産物（すなわち、標的ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド）を検出し、検出した増幅産物の量に基づいて前記試料中に含まれるアデノウイルス量を定量する。
【0068】
前記増幅産物は、例えば、ＰＣＲ終了後、二本鎖ＤＮＡである増幅産物に蛍光色素（例えば、エチジウムブロマイド、Ｓｙｂｅｒ Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯ６３等）をインターカレートして検出、測定される蛍光強度を指標として、前記増幅産物を検出、定量することができる。また、ＰＣＲ終了後の反応液をそのままアガロースゲル電気泳動することによっても前記増幅産物を検出、定量することができる。また、ＰＣＲでは核酸の合成によって核酸基質が大量に消費され、副産物であるピロリン酸イオンが共存するマグネシウムイオンと反応してピロリン酸マグネシウムとなり、反応液が肉眼でも確認できる程に白濁する。したがってこの白濁を、ＰＣＲ終了後の濁度として、光学的に観察可能な測定機器（例えば、６００～７００ｎｍの吸光度変化を測定可能な通常の分光光度計）を用いて確認することで、間接的に前記増幅産物を検出、定量することも可能である。さらに、ＰＣＲ反応液に金属指示薬であるカルセインを添加して、増幅反応の進行に伴う金属イオン濃度の変化（＝蛍光の変化）を前記増幅産物の量の変化として検出することもできる。
【0069】
また、前記ＰＣＲ（増幅工程）と前記増幅産物の検出（定量工程）とをリアルタイムで行なう、すなわちＰＣＲとしてリアルタイムＰＣＲ（「リアルタイム定量ＰＣＲ」ともいう）を行なうことにより、前記検出及び定量を同時に行なうことができる。このようなリアルタイムＰＣＲ法としては、例えば、インターカレーション法（いわゆるＳｙｂｅｒ Ｇｒｅｅｎ法）に代表される、蛍光色素（例えば、エチジウムブロマイド、Ｓｙｂｅｒ Ｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯ６３等）の存在下でＰＣＲを行なう方法や、標識物質を結合させたオリゴヌクレオチドプローブを用いる方法（例えば、プローブ法（５’－ヌクレアーゼ法、いわゆるＴａｑＭａｎプローブ法）；標的ヌクレオチド配列と結合すると当該配列中のグアニン塩基と蛍光色素とが近接し、グアニン塩基の消光作用によって蛍光色素の蛍光強度が減少するプローブを用いる方法（いわゆるＱプローブ法））；ＲＮＡ及びＤＮＡからなるキメラプローブとＲＮａｓｅＨとを組み合わせたサイクリングプローブ法；前記ピロリン酸マグネシウムによる白濁の検出をＰＣＲ反応中の濁度上昇量として経時的に検出する方法が挙げられる。
【0070】
これらの中でも、本発明の方法に係るＰＣＲとしてはリアルタイムＰＣＲであることが好ましく、非特異反応が特に抑制される観点から、プローブ法であることがより好ましく、この場合、上記標識プローブを前記オリゴヌクレオチドプローブとして用いることが特に好ましい。このような方法としてより具体的には、前記増幅工程が、前記標識プローブがアニーリングした前記標的ヌクレオチド配列を鋳型とする工程であり、前記定量工程において、前記増幅産物の検出が、前記標的ヌクレオチド配列の増幅に伴って分解された標識プローブの標識物質に由来するシグナルの検出である方法が挙げられる。
【0071】
これにより、例えば、前記標識プローブが同一プローブに前記蛍光色素と前記クエンチャーとが結合されたプローブである場合、前記伸長工程、すなわち前記増幅産物の増量に伴って前記標的ヌクレオチドにハイブリダイズしたプローブが分解されるため、前記蛍光色素に由来する蛍光強度を測定することでこれに比例する前記増幅産物の量を測定することができる。なおこの場合、前記増幅工程、すなわち前記ＰＣＲの１サイクル分と、前記定量工程、すなわち増幅産物の検出（上記の場合、蛍光強度の測定）とは、ＰＣＲのサイクル回数分繰り返されるが、ＰＣＲの全サイクルにおいて毎回増幅産物の検出を行なっても、複数サイクル毎に増幅産物の検出を行なってもよい。
【0072】
リアルタイムＰＣＲにおいては、測定されるシグナル（上記の場合、蛍光色素に由来する蛍光強度）とサイクル数とから増幅曲線が得られる。そのため、コピー数が既知の鋳型を含む標準試料についてリアルタイムＰＣＲを行なって得られた増幅曲線において、指数関数的に増幅が起こる領域で一定の増幅産物量（上記の場合、蛍光強度）になるサイクル数（Ｔｈｒｅｓｈｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ、Ｃｔ値）と前記標準試料中の鋳型コピー数とから検量線を作成する。また、定量対象の試料についても同様にＣｔ値を求めることにより、この値と前記検量線とから同試料中の鋳型コピー数、すなわちアデノウイルスの標的ヌクレオチド配列の量、つまりはアデノウイルスの量を定量することができる。このときの標準試料としては、例えば、本発明の方法に係る標的ヌクレオチド配列とＰＣＲ効率が同等である観点から、下記の実施例に記載のコントロールＤＮＡ（配列番号：６６に記載のヌクレオチド配列）を既知のコピー数で含む試料を好適に用いることができるが、これに限定されるものではない。
【0073】
本発明の方法によれば、複数の型のアデノウイルスを同時に高精度で検出することができるため、前記試料に含まれるアデノウイルスの型に関わらず、これを全型に共通の１つの基準で定量することができる。本発明の方法でアデノウイルスが定量された試料については、本発明の方法をアデノウイルスを含む試料のスクリーニング方法として、さらに各型に特異的な方法（例えば、各型に特異的なプライマーセットを用いたＰＣＲ等）を行なうことによって、その型を特定してもよい。また、例えば、本発明の方法でアデノウイルスが定量された試料がヒトから採取された検体である場合、得られたアデノウイルスの量は、そのヒトがアデノウイルスに感染しているか否かの診断の指標とすることができる。そのため、本発明の方法は、医師による診断のためにアデノウイルスの量を定量する方法、当該アデノウイルスの量を医師に提示する方法、又はアデノウイルスの検査方法とも表現することができる。
【実施例0074】
以下、実施例及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0075】
＜標的ヌクレオチド配列＞
サンプルＤＮＡとして、１，２，３，４，５，６，７，８，１１，１２，１４，１６，１８，１９，２０，２１，３１，３４，３７，４０，４１，５２，５８，６１，６８，７３型のアデノウイルスの各ヘキソン遺伝子のヌクレオチド配列（それぞれ、各全ゲノム配列のうちの第１８７５７～１９０８９塩基：３３３塩基）からなる二本鎖ＤＮＡをそれぞれ人工合成し、下記の各リアルタイムＰＣＲの鋳型とした。また、コントロールＤＮＡ（ＩＣ：ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ）として、配列番号：６６に記載のヌクレオチド配列からなる二本鎖ＤＮＡを人工合成し、下記の各リアルタイムＰＣＲの鋳型とした。
サンプルＤＮＡとして、１，２，３，４，５，６，７，８，１１，１２，１４，１６，１８，１９，２０，２１，３１，３４，３７，４０，４１，５２，５８，６１，６８，７３型のアデノウイルスの各ヘキソン遺伝子のヌクレオチド配列（それぞれ、各全ゲノム配列のうちの第１８７５７～１９０８９塩基：３３３塩基）からなる二本鎖ＤＮＡをそれぞれ人工合成し、下記の各リアルタイムＰＣＲの鋳型とした。また、コントロールＤＮＡ（ＩＣ：ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ）として、配列番号：６６に記載のヌクレオチド配列からなる二本鎖ＤＮＡを人工合成し、下記の各リアルタイムＰＣＲの鋳型とした。
【0076】
＜プローブ、プライマー＞
下記の表３に示すフォワードプライマー、表４に示すリバースプライマー、及び表５に示すプローブをそれぞれ人工合成して、下記の各リアルタイムＰＣＲに用いた。表３～５中、Ｆ－ＩＣ、Ｒ－ＩＣ、及びＰ－ＩＣは、上記のコントロールＤＮＡ（ＩＣ）に対するプライマー及びプローブである。また、表３～４中、ｃｏｍｐ．Ｆ２は、同配列で示される４種類のヌクレオチド配列をそれぞれ含む４種類のプライマーからなる混合プライマーであり、ｃｏｍｐ．Ｆ３は、同配列で示される１２種類のヌクレオチド配列をそれぞれ含む１２種類のプライマーからなる混合プライマーであり、ｃｏｍｐ．Ｒ２は、同配列で示される４種類のヌクレオチド配列をそれぞれ含む４種類のプライマーからなる混合プライマーであり、ｃｏｍｐ．Ｒ３は、同配列で示される８種類のヌクレオチド配列をそれぞれ含む８種類のプライマーからなる混合プライマーである。表３においてはｃｏｍｐ．Ｆ１と配列が異なる塩基、表４においてはｃｏｍｐ．Ｒ１と配列が異なる塩基、表５においてはＰ１と配列が異なる塩基をそれぞれ太字で示す。なお、各プローブにおいて、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３の５’末にはそれぞれＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）を、３’末にはＦＡＭのクエンチャーとしてＴＡＭＲＡ（６－カルボキシテトラメチルローダミン）を、それぞれ結合させ、Ｐ－ＩＣの５’末にはＶＩＣを、３’末にはＭＧＢ及びＶＩＣのクエンチャーとしてＴＡＭＲＡを、それぞれ結合させた。
下記の表３に示すフォワードプライマー、表４に示すリバースプライマー、及び表５に示すプローブをそれぞれ人工合成して、下記の各リアルタイムＰＣＲに用いた。表３～５中、Ｆ－ＩＣ、Ｒ－ＩＣ、及びＰ－ＩＣは、上記のコントロールＤＮＡ（ＩＣ）に対するプライマー及びプローブである。また、表３～４中、ｃｏｍｐ．Ｆ２は、同配列で示される４種類のヌクレオチド配列をそれぞれ含む４種類のプライマーからなる混合プライマーであり、ｃｏｍｐ．Ｆ３は、同配列で示される１２種類のヌクレオチド配列をそれぞれ含む１２種類のプライマーからなる混合プライマーであり、ｃｏｍｐ．Ｒ２は、同配列で示される４種類のヌクレオチド配列をそれぞれ含む４種類のプライマーからなる混合プライマーであり、ｃｏｍｐ．Ｒ３は、同配列で示される８種類のヌクレオチド配列をそれぞれ含む８種類のプライマーからなる混合プライマーである。表３においてはｃｏｍｐ．Ｆ１と配列が異なる塩基、表４においてはｃｏｍｐ．Ｒ１と配列が異なる塩基、表５においてはＰ１と配列が異なる塩基をそれぞれ太字で示す。なお、各プローブにおいて、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３の５’末にはそれぞれＦＡＭ（カルボキシフルオレセイン）を、３’末にはＦＡＭのクエンチャーとしてＴＡＭＲＡ（６－カルボキシテトラメチルローダミン）を、それぞれ結合させ、Ｐ－ＩＣの５’末にはＶＩＣを、３’末にはＭＧＢ及びＶＩＣのクエンチャーとしてＴＡＭＲＡを、それぞれ結合させた。
【0077】
【表3】
【0078】
【表4】
【0079】
【表5】
【0080】
（比較例１／ＣＤＣ法）
従来の複数の型のアデノウイルスを同時に定量する方法である、アメリカ疾病予防管理センター（Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ：ＣＤＣ）が推奨する方法（以下、「ＣＤＣ法」と称する）と同様の方法でリアルタイムＰＣＲを行なった。すなわち、プライマー及びプローブとしてｃｏｍｐ．Ｆ１、ｃｏｍｐ．Ｒ１、及びＰ１を組み合わせ（非特許文献４に記載のプライマー及びプローブの組み合わせ）、１，２，３，４，５，６，７，８，１１，１４，１６，１８，１９，２１，３４，３７，４１型の１７種類の型のアデノウイルスのサンプルＤＮＡをそれぞれ鋳型として、リアルタイムＰＣＲを行なった。先ず、次の組成：
（反応液／１反応あたり（１５μＬ））
・ＴａｑＰａｔｈ ＰｒｏＡｍｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ：１２．５０μＬ
（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）
・Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ（ＤＷ）：１．４０μＬ
（ニッポンジーン社）
・コントロールＤＮＡ（１０００ ｃｏｐｙ／μＬ）：０．１０μＬ
・プライマー・プローブミックス：１．０μＬ
（プライマー・プローブミックス）
・ｃｏｍｐ．Ｆ１：０．５μＭ
・ｃｏｍｐ．Ｒ１：０．５μＭ
・Ｐ１：０．１μＭ
・Ｆ－ＩＣ：０．１μＭ
・Ｒ－ＩＣ：０．１μＭ
・Ｐ－ＩＣ：０．１μＭ
となるように反応液を調製した。調製した反応液は９６ウェルプレートに１５μＬ／ウェルで分注し、各サンプルＤＮＡを１０μＬ（１００００ ｃｏｐｙ／ウェル）加えて全量を２５μＬに調製した。
従来の複数の型のアデノウイルスを同時に定量する方法である、アメリカ疾病予防管理センター（Ｃｅｎｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ：ＣＤＣ）が推奨する方法（以下、「ＣＤＣ法」と称する）と同様の方法でリアルタイムＰＣＲを行なった。すなわち、プライマー及びプローブとしてｃｏｍｐ．Ｆ１、ｃｏｍｐ．Ｒ１、及びＰ１を組み合わせ（非特許文献４に記載のプライマー及びプローブの組み合わせ）、１，２，３，４，５，６，７，８，１１，１４，１６，１８，１９，２１，３４，３７，４１型の１７種類の型のアデノウイルスのサンプルＤＮＡをそれぞれ鋳型として、リアルタイムＰＣＲを行なった。先ず、次の組成：
（反応液／１反応あたり（１５μＬ））
・ＴａｑＰａｔｈ ＰｒｏＡｍｐ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ：１２．５０μＬ
（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）
・Ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ Ｗａｔｅｒ（ＤＷ）：１．４０μＬ
（ニッポンジーン社）
・コントロールＤＮＡ（１０００ ｃｏｐｙ／μＬ）：０．１０μＬ
・プライマー・プローブミックス：１．０μＬ
（プライマー・プローブミックス）
・ｃｏｍｐ．Ｆ１：０．５μＭ
・ｃｏｍｐ．Ｒ１：０．５μＭ
・Ｐ１：０．１μＭ
・Ｆ－ＩＣ：０．１μＭ
・Ｒ－ＩＣ：０．１μＭ
・Ｐ－ＩＣ：０．１μＭ
となるように反応液を調製した。調製した反応液は９６ウェルプレートに１５μＬ／ウェルで分注し、各サンプルＤＮＡを１０μＬ（１００００ ｃｏｐｙ／ウェル）加えて全量を２５μＬに調製した。
【0081】
次いで、プレートをリアルタイムＰＣＲ装置にセットし、次のＰＣＲ条件：
（ＰＣＲ条件）
ステップ１
（Ｉｎｉｔｉａｌ ｄｅｎａｔｕｒｅ）９５℃、５分：１サイクル
ステップ２
（熱変性工程）９５℃、１５秒→（アニーリング工程／伸長工程）６０℃、１分：４５サイクル
でリアルタイムＰＣＲを行ない、アニーリング工程／伸長工程でＦＡＭ及びＶＩＣに由来する蛍光強度をそれぞれ検出した。
（ＰＣＲ条件）
ステップ１
（Ｉｎｉｔｉａｌ ｄｅｎａｔｕｒｅ）９５℃、５分：１サイクル
ステップ２
（熱変性工程）９５℃、１５秒→（アニーリング工程／伸長工程）６０℃、１分：４５サイクル
でリアルタイムＰＣＲを行ない、アニーリング工程／伸長工程でＦＡＭ及びＶＩＣに由来する蛍光強度をそれぞれ検出した。
【0082】
検出された各蛍光強度から、人工合成した２型のアデノウイルスのヘキソン遺伝子のヌクレオチド配列を５、１０、１００、１０００、１００００、１０００００ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔとなるように調整し、これをスタンダードとして作成した検量線の結果より、検出された各コントロールＤＮＡの定量値（ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔ）を算出した。結果を下記の表６に示す。また、表６には、各コントロールＤＮＡの定量値間の平均値（ＡＶＧ．）、標準偏差（ＳＤ．）及び変動係数（ＣＶ％）を合わせて示す。
【0083】
さらに、理論値を１００００ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔとして「定量値／理論値」を算出し、次の基準：
Ａ：定量値／理論値が０．１以上（定量値が１０００以上）
Ｂ：定量値／理論値が０．０５以上０．１未満（定量値が５００以上１０００未満）
Ｃ：定量値／理論値が０．０１以上０．０５未満（定量値が１００以上５００未満）
Ｄ：定量値／理論値が０．０１未満（定量値が１００未満）
に基づいて評価した。評価結果を表６に合わせて示す。評価は、Ｄでは実用不可、Ｃ以上で実用可として、ＡからＣの順に感度が優れることを示す。
Ａ：定量値／理論値が０．１以上（定量値が１０００以上）
Ｂ：定量値／理論値が０．０５以上０．１未満（定量値が５００以上１０００未満）
Ｃ：定量値／理論値が０．０１以上０．０５未満（定量値が１００以上５００未満）
Ｄ：定量値／理論値が０．０１未満（定量値が１００未満）
に基づいて評価した。評価結果を表６に合わせて示す。評価は、Ｄでは実用不可、Ｃ以上で実用可として、ＡからＣの順に感度が優れることを示す。
【0084】
（実施例１、比較例２）
プライマー・プローブミックスを次の組成：
（プライマー・プローブミックス）
・Ｆ２：０．５μＭ
・Ｒ１：０．５μＭ
・Ｐ１：０．１μＭ
・Ｆ－ＩＣ：０．１μＭ
・Ｒ－ＩＣ：０．１μＭ
・Ｐ－ＩＣ：０．１μＭ
として反応液を調製し、１，２，３，４，５，６，７，８，１１，１４，１６，１８，１９，２１，３４，３７型の１６種類の型のアデノウイルスのサンプルＤＮＡをそれぞれ鋳型としたこと以外は比較例１と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行なった（実施例１）。また、Ｒ１に代えてｃｏｍｐ．Ｒ１を用いたこと以外は実施例１と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行なった（比較例２）。得られた各コントロールＤＮＡの定量値（ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔ）、その平均値（ＡＶＧ．）、標準偏差（ＳＤ．）及び変動係数（ＣＶ％）、並びに、評価結果を表６にそれぞれ示す。
プライマー・プローブミックスを次の組成：
（プライマー・プローブミックス）
・Ｆ２：０．５μＭ
・Ｒ１：０．５μＭ
・Ｐ１：０．１μＭ
・Ｆ－ＩＣ：０．１μＭ
・Ｒ－ＩＣ：０．１μＭ
・Ｐ－ＩＣ：０．１μＭ
として反応液を調製し、１，２，３，４，５，６，７，８，１１，１４，１６，１８，１９，２１，３４，３７型の１６種類の型のアデノウイルスのサンプルＤＮＡをそれぞれ鋳型としたこと以外は比較例１と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行なった（実施例１）。また、Ｒ１に代えてｃｏｍｐ．Ｒ１を用いたこと以外は実施例１と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行なった（比較例２）。得られた各コントロールＤＮＡの定量値（ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔ）、その平均値（ＡＶＧ．）、標準偏差（ＳＤ．）及び変動係数（ＣＶ％）、並びに、評価結果を表６にそれぞれ示す。
【0085】
（実施例２、比較例３～５）
プライマー・プローブミックスを次の組成：
（プライマー・プローブミックス）
・Ｆ３：０．５μＭ
・Ｒ１：０．５μＭ
・Ｐ１：０．１μＭ
・Ｆ－ＩＣ：０．１μＭ
・Ｒ－ＩＣ：０．１μＭ
・Ｐ－ＩＣ：０．１μＭ
として反応液を調製したこと以外は比較例１と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行なった（実施例２）。また、Ｒ１に代えてｃｏｍｐ．Ｒ１又はｃｏｍｐ．Ｒ２を用いたこと以外は実施例２と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行なった（比較例３～４）。さらに、Ｒ１に代えてｃｏｍｐ．Ｒ３を用い、Ｐ１に代えてＰ２を用いたこと以外は実施例２と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行なった（比較例５）。得られた各コントロールＤＮＡの定量値（ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔ）、その平均値（ＡＶＧ．）、標準偏差（ＳＤ．）及び変動係数（ＣＶ％）、並びに、評価結果を下記の表７にそれぞれ示す。
プライマー・プローブミックスを次の組成：
（プライマー・プローブミックス）
・Ｆ３：０．５μＭ
・Ｒ１：０．５μＭ
・Ｐ１：０．１μＭ
・Ｆ－ＩＣ：０．１μＭ
・Ｒ－ＩＣ：０．１μＭ
・Ｐ－ＩＣ：０．１μＭ
として反応液を調製したこと以外は比較例１と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行なった（実施例２）。また、Ｒ１に代えてｃｏｍｐ．Ｒ１又はｃｏｍｐ．Ｒ２を用いたこと以外は実施例２と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行なった（比較例３～４）。さらに、Ｒ１に代えてｃｏｍｐ．Ｒ３を用い、Ｐ１に代えてＰ２を用いたこと以外は実施例２と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行なった（比較例５）。得られた各コントロールＤＮＡの定量値（ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔ）、その平均値（ＡＶＧ．）、標準偏差（ＳＤ．）及び変動係数（ＣＶ％）、並びに、評価結果を下記の表７にそれぞれ示す。
【0086】
（実施例３、比較例６）
Ｆ２に代えてＦ４を用いたこと以外は実施例１と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行なった（実施例３）。また、Ｒ１に代えてｃｏｍｐ．Ｒ１を用いたこと以外は実施例３と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行なった（比較例６）。得られた各コントロールＤＮＡの定量値（ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔ）、その平均値（ＡＶＧ．）、標準偏差（ＳＤ．）及び変動係数（ＣＶ％）、並びに、評価結果を下記の表８にそれぞれ示す。
Ｆ２に代えてＦ４を用いたこと以外は実施例１と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行なった（実施例３）。また、Ｒ１に代えてｃｏｍｐ．Ｒ１を用いたこと以外は実施例３と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行なった（比較例６）。得られた各コントロールＤＮＡの定量値（ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔ）、その平均値（ＡＶＧ．）、標準偏差（ＳＤ．）及び変動係数（ＣＶ％）、並びに、評価結果を下記の表８にそれぞれ示す。
【0087】
（比較例７、８）
Ｆ３に代えてｃｏｍｐ．Ｆ２又はｃｏｍｐ．Ｆ３を用いたこと以外は実施例２と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行なった（比較例７、８）。得られた各コントロールＤＮＡの定量値（ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔ）、その平均値（ＡＶＧ．）、標準偏差（ＳＤ．）及び変動係数（ＣＶ％）、並びに、評価結果を表８にそれぞれ示す。
Ｆ３に代えてｃｏｍｐ．Ｆ２又はｃｏｍｐ．Ｆ３を用いたこと以外は実施例２と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行なった（比較例７、８）。得られた各コントロールＤＮＡの定量値（ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔ）、その平均値（ＡＶＧ．）、標準偏差（ＳＤ．）及び変動係数（ＣＶ％）、並びに、評価結果を表８にそれぞれ示す。
【0088】
【表6】
【0089】
【表7】
【0090】
【表8】
【0091】
表６に示したように、従来のＣＤＣ法（比較例１）では、複数の型（特に、３、１８、３４、４１型）において定量値が理論値と大きくかけ離れて著しく低くなり、多くの型のアデノウイルスを同時に定量することが困難であることが確認された。他方、表６～８に示したように、本発明の方法（例えば、実施例１～３）によれば、試験を実施した１６又は１７種類の全ての型において理論値に十分に近い定量値を得られ、多くの型を同時に高精度で定量できることが確認された。また、これら本発明の方法以外のプライマー及びプローブの組み合わせ（例えば、比較例２～８）では、プライマー及びプローブが本発明と一部重複していても、少なくとも１以上の型で定量値が理論値と大きくかけ離れて著しく低くなり、本発明のプライマー及びプローブの組み合わせのみが、複数の型のアデノウイルスを同時に高精度で定量できる必要最小限の組み合わせであることが確認された。
【0092】
（実施例４）
プライマー・プローブミックスを次の組成：
（プライマー・プローブミックス）
・Ｆ２：０．５μＭ
・Ｒ１：０．５μＭ
・Ｒ２：０．５μＭ
・Ｐ１：０．１μＭ
・Ｆ－ＩＣ：０．１μＭ
・Ｒ－ＩＣ：０．１μＭ
・Ｐ－ＩＣ：０．１μＭ
として反応液を調製したこと以外は比較例１と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行なった（実施例４）。得られた各コントロールＤＮＡの定量値（ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔ）及び評価結果を下記の表９にそれぞれ示す。
プライマー・プローブミックスを次の組成：
（プライマー・プローブミックス）
・Ｆ２：０．５μＭ
・Ｒ１：０．５μＭ
・Ｒ２：０．５μＭ
・Ｐ１：０．１μＭ
・Ｆ－ＩＣ：０．１μＭ
・Ｒ－ＩＣ：０．１μＭ
・Ｐ－ＩＣ：０．１μＭ
として反応液を調製したこと以外は比較例１と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行なった（実施例４）。得られた各コントロールＤＮＡの定量値（ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔ）及び評価結果を下記の表９にそれぞれ示す。
【0093】
（実施例５－１、５－２）
Ｆ２に代えてＦ３を用いたこと以外は実施例４と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行なった（実施例５－１）。また、プライマー・プローブミックスを次の組成：
（プライマー・プローブミックス）
・Ｆ３：０．５μＭ
・Ｒ１：０．２５０μＭ
・Ｒ２：０．２５０μＭ
・Ｐ１：０．１μＭ
・Ｆ－ＩＣ：０．１μＭ
・Ｒ－ＩＣ：０．１μＭ
・Ｐ－ＩＣ：０．１μＭ
として反応液を調製したこと以外は実施例５－１と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行なった（実施例５－２）。得られた各コントロールＤＮＡの定量値（ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔ）及び評価結果を表９にそれぞれ示す。
Ｆ２に代えてＦ３を用いたこと以外は実施例４と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行なった（実施例５－１）。また、プライマー・プローブミックスを次の組成：
（プライマー・プローブミックス）
・Ｆ３：０．５μＭ
・Ｒ１：０．２５０μＭ
・Ｒ２：０．２５０μＭ
・Ｐ１：０．１μＭ
・Ｆ－ＩＣ：０．１μＭ
・Ｒ－ＩＣ：０．１μＭ
・Ｐ－ＩＣ：０．１μＭ
として反応液を調製したこと以外は実施例５－１と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行なった（実施例５－２）。得られた各コントロールＤＮＡの定量値（ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔ）及び評価結果を表９にそれぞれ示す。
【0094】
（実施例６、７、８－１）
プライマー・プローブミックスを次の組成：
（プライマー・プローブミックス）
・Ｆ２：０．５μＭ
・Ｒ１：０．５μＭ
・Ｒ２：０．５μＭ
・Ｒ３：０．５μＭ
・Ｒ４：０．５μＭ
・Ｐ１：０．１μＭ
・Ｆ－ＩＣ：０．１μＭ
・Ｒ－ＩＣ：０．１μＭ
・Ｐ－ＩＣ：０．１μＭ
として反応液を調製したこと以外は比較例１と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行なった（実施例６）。また、Ｐ１に代えてＰ２を用いたこと以外は実施例６と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行なった（実施例７）。さらに、Ｆ２に代えてＦ１を用いたこと以外は実施例６と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行なった（実施例８－１）。得られた各コントロールＤＮＡの定量値（ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔ）及び評価結果を表９にそれぞれ示す。
プライマー・プローブミックスを次の組成：
（プライマー・プローブミックス）
・Ｆ２：０．５μＭ
・Ｒ１：０．５μＭ
・Ｒ２：０．５μＭ
・Ｒ３：０．５μＭ
・Ｒ４：０．５μＭ
・Ｐ１：０．１μＭ
・Ｆ－ＩＣ：０．１μＭ
・Ｒ－ＩＣ：０．１μＭ
・Ｐ－ＩＣ：０．１μＭ
として反応液を調製したこと以外は比較例１と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行なった（実施例６）。また、Ｐ１に代えてＰ２を用いたこと以外は実施例６と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行なった（実施例７）。さらに、Ｆ２に代えてＦ１を用いたこと以外は実施例６と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行なった（実施例８－１）。得られた各コントロールＤＮＡの定量値（ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔ）及び評価結果を表９にそれぞれ示す。
【0095】
（実施例８－２）
実施例８－１と同じ条件で、１，２，３，４，５，６，７，８，１１，１２，１４，１６，１８，１９，２０，２１，３１，３４，３７，４０，４１，５２，５８，６１，６８，７３型の２６種類の型のアデノウイルスのサンプルＤＮＡをそれぞれ鋳型として、リアルタイムＰＣＲを行なった。得られた各コントロールＤＮＡの定量値（ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔ）及び評価結果を表９にそれぞれ示す。
実施例８－１と同じ条件で、１，２，３，４，５，６，７，８，１１，１２，１４，１６，１８，１９，２０，２１，３１，３４，３７，４０，４１，５２，５８，６１，６８，７３型の２６種類の型のアデノウイルスのサンプルＤＮＡをそれぞれ鋳型として、リアルタイムＰＣＲを行なった。得られた各コントロールＤＮＡの定量値（ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔ）及び評価結果を表９にそれぞれ示す。
【0096】
（実施例９）
プライマー・プローブミックスを次の組成：
（プライマー・プローブミックス）
・Ｆ１：０．５μＭ
・Ｍｉｘ Ｒｖ：０．５μＭ
・Ｍｉｘプローブ：０．１μＭ
・Ｆ－ＩＣ：０．１μＭ
・Ｒ－ＩＣ：０．１μＭ
・Ｐ－ＩＣ：０．１μＭ
（Ｍｉｘ Ｒｖ）
・Ｒ１：１００μＭ
・Ｒ２：１００μＭ
・Ｒ３：１００μＭ
・Ｒ４：１００μＭ
（Ｍｉｘプローブ）
・Ｐ１：１００μＭ
・Ｐ３：１００μＭ
として反応液を調製したこと以外は実施例８－２と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行なった。得られた各コントロールＤＮＡの定量値（ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔ）及び評価結果を表９にそれぞれ示す。
プライマー・プローブミックスを次の組成：
（プライマー・プローブミックス）
・Ｆ１：０．５μＭ
・Ｍｉｘ Ｒｖ：０．５μＭ
・Ｍｉｘプローブ：０．１μＭ
・Ｆ－ＩＣ：０．１μＭ
・Ｒ－ＩＣ：０．１μＭ
・Ｐ－ＩＣ：０．１μＭ
（Ｍｉｘ Ｒｖ）
・Ｒ１：１００μＭ
・Ｒ２：１００μＭ
・Ｒ３：１００μＭ
・Ｒ４：１００μＭ
（Ｍｉｘプローブ）
・Ｐ１：１００μＭ
・Ｐ３：１００μＭ
として反応液を調製したこと以外は実施例８－２と同様にしてリアルタイムＰＣＲを行なった。得られた各コントロールＤＮＡの定量値（ｃｏｐｙ／ｔｅｓｔ）及び評価結果を表９にそれぞれ示す。
【0097】
【表9】
【0098】
表９に示したように、リバースプライマーとして、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４をさらに用いることにより、定量値としてより理論値に近く、かつ、各型間のばらつきがより少ない結果が得られた。また、プライマー濃度を変えたり（実施例５－１、５－２）、プローブとしてＰ１及びＰ２のいずれのプローブを用いても（実施例７）上記と同様の結果が得られた。さらに、アデノウイルスの型を２６種類とした場合に５２型で若干評価の低い結果が得られた（実施例８－２）が、プライマー及びプローブとして、Ｆ１、Ｒ１～Ｒ４、Ｐ１、Ｐ３を組み合わせて用いることにより（実施例９）、全ての型において特に高評価の定量値が得られた。特に、この組み合わせでは上記５２型に加えて、比較例で評価が低い傾向にあった３、７、８、１８、１９、３４、３７、４１型を漏れなくより高精度で検出できることが確認された。
【産業上の利用可能性】
【0099】
以上説明したように、本発明によれば、ＰＣＲによって、複数の型のアデノウイルスを同時に高精度で定量することが可能なアデノウイルス定量用キット、及びそれを用いたアデノウイルス定量方法を提供することが可能となる。そのため、型の種類に拠らずどの型も同精度でアデノウイルスを検出することができ、例えば、試料に含まれるアデノウイルスの型が未知であっても、当該アデノウイルスを全ての型で共通の単一基準に基づいて同時に、かつ容易に、検出、定量することができる。
【配列表】