特開 2024-85583 ｐ－クレゾール産生抑制剤、飲食物、及びその製造方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024085583

(43)【公開日】2024-06-27

(54)【発明の名称】ｐ－クレゾール産生抑制剤、飲食物、及びその製造方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 36/82 20060101AFI20240620BHJP

   A23L 33/105 20160101ALI20240620BHJP

   A61K 31/353 20060101ALI20240620BHJP

   A61P 39/02 20060101ALI20240620BHJP

   A61P 13/12 20060101ALI20240620BHJP

【ＦＩ】

A61K36/82

A23L33/105

A61K31/353

A61P39/02

A61P13/12

【審査請求】未請求

【請求項の数】8

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022200171

(22)【出願日】2022-12-15

【新規性喪失の例外の表示】新規性喪失の例外適用申請有り

(71)【出願人】

【識別番号】591014972

【氏名又は名称】株式会社 伊藤園

(71)【出願人】

【識別番号】514287742

【氏名又は名称】学校法人東京家政学院

(74)【代理人】

【識別番号】110000707

【氏名又は名称】弁理士法人市澤・川田国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】海野 知紀

(72)【発明者】

【氏名】一谷 正己

【テーマコード（参考）】

4B018

4C086

4C088

【Ｆターム（参考）】

4B018LB01

4B018LB08

4B018LB10

4B018LE01

4B018LE02

4B018LE05

4B018MD08

4B018MD59

4B018MD90

4B018ME14

4B018MF12

4C086AA02

4C086BA08

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZA81

4C086ZC37

4C088AB45

4C088AC05

4C088BA09

4C088BA14

4C088CA05

4C088NA14

4C088ZA81

4C088ZC37

(57)【要約】

【課題】安全性の高い天然物由来の成分を有効成分とし、尿毒症物質であるｐ－クレゾール量の生成を抑制し、生体内濃度を効果的に低減することができる、ｐ－クレゾール産生抑制剤を提供する。
【解決手段】茶カテキン、特にエピガロカテキンガレートを有効成分として含有する、ｐ－クレゾール産生抑制剤である。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

茶カテキンを有効成分として含有する、ｐ－クレゾール産生抑制剤。

【請求項2】

茶カテキンがエピガロカテキンガレートである、請求項１に記載のｐ－クレゾール産生抑制剤。

【請求項3】

体重１ｋｇ当たり１２．３５ｍｇ以上のエピガロカテキンガレートを経口投与する用である、請求項１に記載のｐ－クレゾール産生抑制剤。

【請求項4】

血漿中のｐ－クレゾール量を低下させることができる、請求項１に記載のｐ－クレゾール産生抑制剤。

【請求項5】

尿中のｐ－クレゾール量を低下させることができる、請求項１に記載のｐ－クレゾール産生抑制剤。

【請求項6】

茶カテキンが、Clostridiales目の占有率を低下させることに起因してｐ－クレゾールの産生を抑制することができる、請求項１に記載のｐ－クレゾール産生抑制剤。

【請求項7】

請求項１～６の何れか１項に記載のｐ－クレゾール産生抑制剤を含有する飲食物。

【請求項8】

請求項７に記載の飲食物の製造方法であって、茶を抽出して得られた茶抽出組成物を飲食物に添加することを特徴とする、飲食物の製造方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、腸内細菌が産生するチロシン由来の尿毒素の一種であるｐ－クレゾールの生体内濃度を低減させることができるｐ－クレゾール産生抑制剤、これを含んだ飲食物、及びその製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

尿毒素の蓄積が、慢性腎臓病、内皮機能障害、インスリン抵抗性、認知障害などの全身性疾患の発症と関連し、死亡率の上昇とクオリティー・オブ・ライフ（ＱＯＬ）の低下につながることが知られている。
フェノールとｐ－クレゾールは、腸内細菌によりアミノ酸のチロシンから産生される代表的な尿毒素である。これらは、血中に取り込まれた後、肝臓で硫酸抱合あるいはグルクロン酸抱合を受ける。
ｐ－クレシル硫酸は、慢性腎臓病患者における心血管疾患の潜在的要因であると考えられている。その作用機序としては、内皮細胞における炎症および酸化ストレスを誘発し、内皮機能不全および動脈硬化の一因となることと理解されている。
ｐ－クレシル硫酸の排泄は主に腎臓における尿細管輸送体系に依存しているが、慢性腎臓病患者では腎臓における排出が制限されるため、血液中に蓄積する。ｐ－クレシル硫酸は血漿タンパク質と高い親和性で結合するため、透析によって除去されにくい。慢性腎臓病患者においては腎機能を維持するだけでなく、腸内細菌によるｐ－クレゾールの産生を阻害することも、全身性疾患の発症予防の観点から有用な方法であるといえる。

【0003】

このように、慢性腎臓病患者においては、ｐ－クレゾールの生体内濃度を低下させることが要求される。
ｐ－クレゾールの産生を制御するいくつかの方法が評価されている。例えば、ある種のプロバイオティクス、プレバイオティクス、およびそれらの併用の使用は、ｐ－クレシル硫酸の血漿中濃度を低下させることに注目が集まっている。
一般に、プレバイオティクスおよびプロバイオティクスによる治療は、腸内細菌叢を調節することを目的としており、細菌の糖分解活性を増大させ、大腸におけるタンパク質分解活性を制限するという概念に基づいている。
腸内細菌によるｐ－クレゾールの産生を抑制させるための戦略は、慢性腎臓病の合併症を軽減するための代替治療として大きな有望性を示す。

【0004】

例えば特許文献１には、（－）－エピガロカテキン －３－Ｏ－ガレートを有効成分として含有することを特徴とする尿毒症物質低減用組成物が開示されている。
また、特許文献２には、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）を有効成分とする、高脂肪食摂取時の腸内細菌叢改善剤が開示されている。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開平４－３６０８３１号（特許第２６４９２９６号）

【特許文献2】特開２０１８－１８４３６３号

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本発明の目的は、安全性の高い天然物由来の成分を有効成分とし、腸内細菌が産生するチロシン由来の尿毒素の一種であるｐ－クレゾール量の産生を抑制し、生体内濃度を効果的に低減することができる、ｐ－クレゾール産生抑制剤を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0007】

［１］本発明の第１の態様は、茶カテキンを有効成分として含有する、ｐ－クレゾール産生抑制剤である。
［２］本発明の第２の態様は、前記第１の態様において、茶カテキンがエピガロカテキンガレートである、ｐ－クレゾール産生抑制剤である。

【0008】

［３］本発明の第３の態様は、前記第１又は第２の態様において、体重１ｋｇ当たり１２．３５ｍｇ以上のエピガロカテキンガレートを経口投与する用である、ｐ－クレゾール産生抑制剤である。

【0009】

［４］本発明の第４の態様は、前記第１～第３の何れか１の態様において、血漿中のｐ－クレゾール量を低下させることができる、ｐ－クレゾール産生抑制剤である。
［５］本発明の第５の態様は、前記第１～第４の何れか１の態様において、尿中のｐ－クレゾール量を低下させることができる、ｐ－クレゾール産生抑制剤である。
［６］本発明の第６の態様は、前記第１～第５の何れか１の態様において、前記茶カテキンが、Clostridiales目の占有率を低下させることに起因してｐ－クレゾールの産生を抑制することができる、ｐ－クレゾール産生抑制剤である。

【0010】

［７］本発明の第７の態様は、前記第１～第６の何れか１の態様におけるｐ－クレゾール産生抑制剤を含有する飲食物である。

【0011】

［８］本発明の第８の態様は、前記第７の態様における飲食物の製造方法であって、茶を抽出して得られた茶抽出組成物を飲食物に添加することを特徴とする、飲食物の製造方法である。

【発明の効果】

【0012】

本発明が提案するｐ－クレゾール産生抑制剤によれば、慢性腎臓病患者におけるｐ－クレゾールの産生を抑制し生体内濃度を低下させることができる。これにより、生体内にｐ－クレゾール濃度の増加により引き起こされる様々な病態、疾患、症状の発生、悪化のリスクを低減させることが可能となる。
また、本発明が提案するｐ－クレゾール産生抑制剤の有効成分は、緑茶に含有されている茶カテキンであるから、安全性に優れたものである。
よって、腎不全患者のクオリティー・オブ・ライフ（ＱＯＬ）改善に大きく寄与するものである。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】ＥＧＣＧ加水分解物をタンナーゼ処理し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）での分析結果を示したグラフである。

【図2】実験１で採取した尿中のフェノール及びｐ－クレゾール濃度を示したグラフである。

【図3】実験１で採取した血漿中のフェノール及びｐ－クレゾール濃度を示したグラフである。

【図4】実験１で採取した尿中のフェノール，ｐ－クレゾールに関する遊離型，グルクロン酸抱合型，硫酸抱合型の比率を示したグラフである。

【図5】実験２で採取した尿中のフェノール及びｐ－クレゾール濃度を示したグラフである。

【図6】実験２で採取した血漿中のフェノール及びｐ－クレゾールの濃度を示したグラフである。

【図7】実験２で採取した盲腸内容物中のｐ－クレゾール濃度と、血漿中のｐ－クレゾール濃度との関係を示したグラフである。

【図8】実験２で採取した糞中の門レベルの菌叢組成を示したグラフである。

【図9】実験２で採取した糞中の門レベルの細菌について、各種飼料を投与した後の相対割合を示したグラフである。

【図10】実験２で採取した糞の腸内細菌叢について，ＰＣ１とＰＣ２を対比させた主成分分析の結果を示したグラフである。

【図11】実験２で採取した糞中の目レベルの菌叢組成を示したグラフである。

【図12】実験２で採取した糞中の目レベルの細菌について、各種飼料を投与した後の相対割合を示したグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0014】

次に、実施の形態例に基づいて本発明を説明する。但し、本発明が次に説明する実施形態に限定されるものではない。

【0015】

＜本発明クレゾール産生抑制剤＞
本発明の実施形態の一例に係るｐ－クレゾール産生抑制剤（「本発明クレゾール産生抑制剤」と称する）は、茶カテキンを有効成分として含有するものである。

【0016】

本発明において「茶カテキンを有効成分とする」とは、本発明クレゾール産生抑制剤の作用が阻害しなければ、その他の成分、すなわち、茶カテキン以外の成分を含んでいてもよい、という意を包含するものである。

【0017】

（茶カテキン）
有効成分である茶カテキンとは、茶から抽出されるカテキン及びそれが熱異性化してなるカテキンを包含する意であり、具体的には（－）カテキン（Ｃ）、（－）カテキンガレート（ＣＧ）、（－）ガロカテキン（ＧＣ）、（－）ガロカテキンガレート（ＧＣＧ）、（－）エピカテキン（ＥＣ）、（－）エピカテキンガレート（ＥＣＧ）、（－）エピガロカテキン（ＥＧＣ）、（－）エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）からなる群から選ばれる一種、又は、二種以上の組み合わせからなる共重合体、又は、これら二種以上の組み合わせからなる混合物を挙げることができる。

【0018】

上記カテキンの中でＥＣ、ＥＧＣ、ＥＣＧ及びＥＧＣＧは、天然物、特に茶葉中に多く含有されているから、従来公知の方法或いは今後公知となる方法によって抽出及び精製などによって得ることができる。
他方、これらのエピマーであるＣ、ＧＣ、ＣＧ及び ＧＣＧは、茶葉を含めて天然植物中にはほとんど存在しないが、ＥＣ、ＥＧＣ、ＥＣＧ及びＥＧＣＧのそれぞれ或いはこれら二種類以上の組み合わせからなる混合物を加熱処理することにより熱異性化（エピマー化）させて得ることができる。例えば、精製したＥＣ、ＥＧＣ、ＥＣＧ及びＥＧＣＧのそれぞれ或いはこれら二種類以上の組合わせからなる混合物、例えば茶の抽出液や浸出液などを、好ましくはｐＨ５～６に調整した上で、８０℃以上の加熱処理することによりカテキンの熱異性化を促してＣ、ＧＣ、ＣＧ及びＧＣＧの含有濃度を高め、このような加熱処理後物からＣ、ＧＣ、ＣＧ及びＧＣＧのそれぞれ或いはこれら二種類以上の組み合わせからなる混合物を分離・精製して得ることができる。
この際、カテキンを熱異性化（エピマー化）させるための加熱処理としては、カテキンを含有する溶液（カテキン溶液）を少なくとも８０℃以上に加熱処理する必要がある。例えば、１００℃×１５分間加熱、１１５℃×２０分間加熱、１２０℃×３～３０分間加熱、１２３℃×１０分間加熱、１３１℃×３０秒間加熱、１３３℃×４５秒間のいずれにおいてもカテキンの熱異性化が認められている。
カテキン溶液をｐＨ５～６に調整した上で加熱処理するのが好ましいとするのは、ｐＨ４．５以下ではカテキンはほとんど熱異性化しないことが報告されているためである（末松伸一ら、：日食工誌、３９，１７８（１９９２））。

【0019】

なお、カテキンの分離・精製方法は、従来公知の方法或いは今後公知となる方法によって行えばよい。例えば、茶の抽出液を、例えば水－アセトニトリル－リン酸の混合液を移動相とした逆相ＨＰＬＣにかけ、アセトニトリル濃度でグラジエントをかけることによってそれぞれ分離できることが知られている。

【0020】

（エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ））
本発明クレゾール産生抑制剤の有効成分としては、上記茶カテキンの中でも、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）が最も好適である。

【0021】

ＥＧＣＧは、緑茶に含まれるカテキン類の中でも最も含有割合の高いカテキンであり、エピガロカテキンと没食子酸とのエステルである。
なお、ＥＧＣＧは、ＥＧＣＧの薬学的に許容可能な塩であってもよい。例えば、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、カルシウム等のアルカリ土類金属とＥＧＣＧとの塩、ＥＧＣＧのアンモニウム塩等の４級アンモニウム塩などを挙げることができる。
また、ＥＧＣＧは、生体内においてＥＧＣＧを放出するプロドラッグであってもよい。

【0022】

（本発明クレゾール産生抑制剤の投与方法）
本発明クレゾール産生抑制剤は、経口投与剤または非経口投与剤（筋肉注射、静脈注射、皮下投与、直腸投与、経皮投与、経鼻投与など）として使用することができ、それぞれの投与に適した配合及び剤型とするのが好ましい。

【0023】

＜本発明クレゾール産生抑制組成物＞
本発明の実施形態の一例に係るｐ－クレゾール産生抑制組成物（「本発明クレゾール産生抑制組成物」と称する）、すなわち、ｐ－クレゾール産生抑制作用を有する組成物は、茶カテキンを含有する組成物である。

【0024】

本発明クレゾール産生抑制組成物において、茶カテキン、特にＥＧＣＧの含有量は、本発明クレゾール産生抑制組成物１００質量部に対して１０～１００質量部であるのが好ましく、中でも３０質量部以上或いは９０質量部以下、その中でも４０質量部以上或いは５０質量部以下、その中でも７０質量部以上或いは８０質量部以下であるのがさらに好ましい。

【0025】

本発明クレゾール産生抑制組成物における茶カテキンは、Ｃ、ＣＧ、ＧＣ、ＧＣＧ、ＥＣ、ＥＣＧ、ＥＧＣ又はＥＧＣＧの純品であってもよいし、また、これらのうちの２種類以上の混合物であってもよいし、また、茶カテキンを含む組成物であってもよい。

【0026】

前記茶カテキンを含む組成物としては、例えば、緑茶の抽出物やその精製物などを挙げることができる。具体的な一例としては、緑茶を熱水抽出処理して得た抽出物を、水と低・高濃度アルコールを使って吸着カラムにて分離し乾燥させ、茶ポリフェノール濃度を約８５～９９．５％に調製してなる緑茶抽出物を例示することができる。例えば、「テアフラン９０Ｓ（商品名；伊藤園社製）」などは好ましい例である。このテアフラン９０Ｓは、カテキン類の総量に対するエステル型カテキン類の量が５０～９０質量％であり、ＥＧＣＧの量がカテキン総量の４０～９０質量％であり、カフェイン含有量が同じくカテキン総量に対して０～２質量％である。

【0027】

＜効果＞
本発明クレゾール産生抑制剤及び本発明クレゾール産生抑制組成物を体内に摂取することにより、Clostridiales目の占有率を低下させることに起因してｐ－クレゾールの産生を抑制することができ、ｐ－クレゾールの生体内濃度、特に血漿中のｐ－クレゾール量、尿中のｐ－クレゾール量を低下させることができる。
よって、例えば慢性腎臓病患者や、内皮機能障害、インスリン抵抗性、認知障害などの症状のある方に対して、本発明クレゾール産生抑制剤又は本発明クレゾール産生抑制組成物を投与することにより、ｐ－クレゾールの産生を抑制し生体内濃度を低下させることができ、ｐ－クレゾール濃度の上昇によって引き起こされる様々な病態、疾患、症状の発生、悪化のリスクを低減させることが可能となる。
本発明クレゾール産生抑制剤及び本発明クレゾール産生抑制組成物は、慢性腎臓病患者のクオリティー・オブ・ライフ（ＱＯＬ）改善に大きく寄与するものである。

【0028】

＜形態＞
本発明クレゾール産生抑制剤及び本発明クレゾール産生抑制組成物は、例えば、経口投与剤としての医薬品、医薬部外品、栄養補助食品（サプリメント）、飲食物などとして提供することができる。

【0029】

この際、本発明クレゾール産生抑制剤及び本発明クレゾール産生抑制組成物の形態としては、例えば液剤、錠剤、散剤、顆粒、糖衣錠、カプセル、懸濁液、乳剤、丸剤などの形態を挙げることができる。例えば経口投与剤用としては液剤、錠剤、散剤、顆粒、糖衣錠、カプセル、懸濁液、乳剤、丸剤などの形態に調製することができ、非経口投与剤用としては注射剤、アンプル剤、直腸投与剤、油脂性坐剤、水溶性坐剤などの形態に調製することができる。

【0030】

本発明クレゾール産生抑制剤及び本発明クレゾール産生抑制組成物は、医薬品、医薬部外品、栄養補助食品に通常用いられている添加剤、例えば賦形剤、増量剤、結合剤、湿潤化剤、崩壊剤、表面活性剤、潤滑剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤などを含有することが可能である。また、例えばでん粉、ゼラチン、炭酸マグネシウム、合成ケイ酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたはその塩、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、シロップ、ワセリン、グリセリン、エタノール、プロピレングリコール－クエン酸、塩化ナトリウム、亜硫酸ソーダ、リン酸ナトリウムなどの無毒性の添加剤を配合することも可能である。
なお、医薬部外品として調製する場合には、例えば瓶ドリンク飲料等の飲用形態、或いはタブレット、カプセル、顆粒等の形態とすることにより、より一層摂取し易くすることができる。

【0031】

本発明クレゾール産生抑制剤は、医薬品のほか、医薬部外品、薬理効果を備えた健康食品・健康飲料・特定保健用食品・機能性食品、食品添加剤、その他ヒト以外の動物に対する薬剤や餌、餌用添加剤などとして提供することもできる。
例えば、医薬部外品として調製し、これを瓶ドリンク飲料等の飲用形態、或いはタブレット、カプセル、顆粒等の形態とすることにより、より一層摂取し易くすることができる。

【0032】

本発明クレゾール産生抑制剤には、酸化防止剤、乳化剤、保存料、ｐＨ調整剤、香料、調味料、甘味料、酸味料、品質安定剤等の添加剤を単独、あるいは併用して配合してもよい。例えば、酸化防止剤としてはビタミンＣ、ビタミンＥ、システインなどを用いることができ、特にビタミンＣを０．００５～０．０５重量％含有するのがよい。また、例えば甘味料としてはぶどう糖、果糖、異性化液糖、フラクトオリゴ糖、乳化オリゴ糖、大豆オリゴ糖、サイクロデキストリン、アスパルテーム、ラカンカエキスなどを用いることができる。

【0033】

中でも、本発明クレゾール産生抑制剤及び本発明クレゾール産生抑制組成物を、飲食物として提供する場合、特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品，いわゆる健康食品（機能性食品、健康補助食品）、清涼飲料水などとして提供することができる。但し、これらに限定するものではない。
この際、カテキン類が有する機能性についての表示を付した飲食物とすることも可能である。

【0034】

飲食物として好ましい形態は、例えば飴、ゼリー、錠菓、飲料、スープ、麺、煎餅、和菓子、冷菓、焼き菓子等を挙げることができる。好ましくは、果汁飲料、野菜ジュース、果物野菜ジュース、茶飲料（緑茶飲料を含む）、コーヒー飲料、スポーツドリンク等の容器詰飲料である。

【0035】

＜必要摂取量及び含有量＞
本発明クレゾール産生抑制剤の有効成分である茶カテキン、特にＥＧＣＧの濃度は、医薬品であれば、ＥＧＣＧを、乾燥質量換算で０．００１～１質量％、中でも０．０１質量％以上或いは０．５質量％以下の割合で配合するのが好ましく、飲食品であれば、ＥＧＣＧを０．００１～１質量％、中でも０．０１質量％以上或いは０．５質量％以下の割合で配合するのが好ましい。特に飲料の形態とする場合、通常飲用されるお茶の１．４倍～８倍の濃度に調製するのが好ましい。

【0036】

本発明クレゾール産生抑制剤の有効成分の摂取量又は投与量は、上記の効果を得るためには、医薬品であれば、体重１ｋｇ当たり１２．３５ｍｇ以上のＥＧＣＧを経口投与するのが好ましい。
なお、摂取回数又は投与回数は、特に限定されない。目安としては、１日１～３回を想定することができ、必要に応じて摂取回数を増減してもよい。

【0037】

＜安全性＞
本発明クレゾール産生抑制剤及び本発明クレゾール産生抑制組成物の有効成分は、長年に渡って人類が経口摂取している成分であるから、安全性は食経験の観点から保証されていると言える。

【0038】

＜語句の説明＞
本発明において「Ｘ～Ｙ」（Ｘ，Ｙは任意の数字）と表現する場合、特にことわらない限り「Ｘ以上Ｙ以下」の意と共に、「好ましくはＸより大きい」或いは「好ましくはＹより小さい」の意も包含する。
また、「Ｘ以上」（Ｘは任意の数字）或いは「Ｙ以下」（Ｙは任意の数字）と表現した場合、「Ｘより大きいことが好ましい」或いは「Ｙ未満であることが好ましい」旨の意図も包含する。

【実施例0039】

以下に本発明を実施例によってさらに具体的に説明する。ただし、本発明は実施例に限定されるものではない。
下記実施例において「％」は、特に言及しなければ「質量％」を示す。

【0040】

＜材料および方法＞
（化学物質）
フェノール、ｐ－クレゾール、p－クロロフェノールは、富士フィルム和光純薬株式会社(大阪，日本)から購入した。
Helix pomatia由来のβ‐グルクロニダーゼとアワビ内臓由来のスルファターゼは、シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社(東京、日本)から購入した。
ＥＧＣＧは、DSMニュートリションジャパン株式会社(東京、日本)から購入した。

【0041】

ＥＧＣＧ加水分解物(ＥＧＣと没食子酸(ＧＡ)の混合物)を、以前の手順に従い、ＥＧＣＧの酵素加水分解により調製した。
麹菌由来のタンナーゼ（０．９％(w/w)）、グルコース（９９．０％）、及びイノシトール（０．１％）からなる酵素調製物(タンナーゼ‐KTFHR、キッコーマン株式会社、千葉、日本)１ｇをＥＧＣＧの水溶液(１０ｇ／Ｌ)に添加し、３７℃で６０分間インキュベートした。反応混合物を凍結乾燥した。タンナーゼ処理後のＥＧＣＧの消失は高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)で確認した(図１)。ＥＧＣとＧＡを除いて、新しく発生したピ－クは検出されなかった。

【0042】

（動物と食餌）
最初の実験(実験１)では、合計１２匹の雄ＩＣＲマウス(４週齢)を東京実験動物株式会社(東京、日本)から購入し、自動的に制御された１２時間明暗サイクルの室内で、２２℃の温度環境のもと，ステンレススの代謝ケージで３日間馴化した。馴化期間中、マウスにAIN93G配合飼料を与えた。その後、体重により４群(各群n =３)に分け、それぞれの飼料;対照飼料（control）、０．０５％ (ｗ／ｗ)ＥＧＣＧ飼料、０．１％ＥＧＣＧ飼料、または０．２％ＥＧＣＧ飼料を与えた(表Ｓ１)。実験食と水道水は２週間自由に摂取させた。実験期間を通じて糞を採取し、実験の最後の２日間は尿を採取した。

【0043】

糞は凍結乾燥し、－４０℃で保存した。
高濃度の二酸化炭素を吸入させた後、直ちに腹部静脈から血液を採取した。
血しょうは２０００×ｇで１０分間遠心分離後、－４０℃でプラスチックマイクロチューブに保存した。盲腸を切除し、盲腸内容物を採取し、使用まで－４０℃で保存した。

【0044】

次の実験(実験２)では、同じブリーダーから計１２匹の雄ＩＣＲマウスを再度購入した。３日間の馴化期間の後、マウスを３群(各群n＝４)に分け、それぞれの飼料:対照飼料（control）、ＥＧＣＧ飼料、またはＥＧＣ＋ＧＡ飼料(表Ｓ１)を２週間与えた。実験１と同様に糞尿を採取した。実験の最終日に血液および盲腸の内容物を採取した。
なお、実験はすべて東京家政学院大学動物実験委員会の承認を得た。

【0045】

【表S1】

【0046】

（尿、血漿及び盲腸内容物中のフェノール及びｐ－クレゾールの分析）
冷凍保存した尿を解凍し、蒸留水で５０倍に希釈した。
フェノール及びｐ－クレゾール(遊離型、硫酸型及びグルクロン酸抱合型の合計)の総量の測定には、まず希釈尿試料５０μＬを３７℃で０．１Ｍ酢酸緩衝液(ｐＨ５．０)０．１ｍＬ中のスルファターゼ溶液２０単位と２時間反応させ、次に、５ｍＭ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ６．８)０．９ｍＬ中のβ-グルクロニダーゼ溶液１００単位を３７℃で１５分間反応させた。グルクロン酸抱合体については、希釈尿試料(５０μＬ)を同じリン酸緩衝液０．９ｍＬ中のβ-グルクロニダーゼ溶液１００単位のみで３７℃，１５分間反応させた。遊離型については、希釈した尿試料に対する酵素処理を行わなかった。

【0047】

内部標準物質として０．５ｍＭのp－クロロフェノール溶液１０μＬを加えた後、反応混合物を、水１ｍＬ、メタノール１ｍＬ、及び水１ｍＬで再びプレコンディショニングしたポリマーベースの固相抽出(ＳＰＥ)カートリッジ(Strata-X、粒子径３３μｍ、フェノメネックス社製)に直接供した。カートリッジを水１ｍＬ及び２０％(v/v)メタノール水溶液１ｍＬで洗浄した後、フェノール及びｐ－クレゾールをメタノール１ｍＬで順次溶出した。０.４５μｍろ過膜を通過後、得られたろ液１０μＬをデュアルポンプ(LC-20AD)、オートサンプラー(SIL-10A)、カラムオーブン(CTO-20A)、蛍光検出器 (RF-20A)及びシステムコントローラ(SCL-10A)からなるＨＰＬＣシステム(島津製作所社製)に注入した。
分離には分析カラム(Unison UK-3C₁₈,100mm×4.6mm i.d.、Imtakt,Co.,京都,日本)を用いた。
蛍光検出器は励起波長２７０ｎｍ、発光波長３０５ｎｍに設定した。
溶媒Ａ(メタノール－水、２５：７５ｖ／ｖ)と溶媒Ｂ(メタノール)の割合を変えて勾配溶出を行い、流量は１ｍＬ/minとした。移動相組成は１００％溶媒Ａ(０％溶媒Ｂ)で開始し、その後、溶媒Ｂの比を１５分間で５０％まで直線的に増加させ、続いて２分間で溶媒Ｂを７０％までさらに増加させた。次いで、組成を２分間かけて初期条件に戻し、次の測定を行った。
測定値は尿中クレアチニン濃度当たりとして補正した。尿中クレアチニン濃度はJaffe法により測定した。

【0048】

（血漿）
冷凍保存した血漿を解凍し、血漿５０μＬに０．１Ｍ酢酸緩衝液(ｐＨ５．０)０．１ｍＬを加え，２０単位のスルファターゼによって３７℃，２時間反応させた後、５ｍＭの塩化ナトリウムを含む０．１Ｍリン酸緩衝液(ｐＨ６．８)０．９ｍＬを加え，１００単位のβ-グルクロニダーゼによって３７℃，１５分間反応させた。その後のＳＰＥおよびＨＰＬＣ測定は、尿の場合と同じ手順で行った。

【0049】

（盲腸内容物）
解凍した盲腸内容物の一部に４容量の蒸留水に加え，ホモジネートを調製した。ホモジネート(０．１ｍＬ)をメタノール０．４ｍＬに混和した後、２０００×ｇ、４℃で１０分間遠心分離した。上澄液(０．４ｍＬ)を水３．６ｍＬで希釈し、上記の方法に従ってＳＰＥ及びＨＰＬＣ測定を進めた。

【0050】

（16SrRNA遺伝子アンプリコン配列決定）
前記実験で採取した糞からＤＮＡを抽出し、
16S rRNA遺伝子のV3-V4領域を、汎用プライマー341F(5'-CCTACGGGAGGCAGCAG-3')および805R(5'-GGACTACCAGGGTATCTAAT-3')を用い，ＰＣＲによって増幅した。
MiSeq試薬キットバージョン3(Illumina,Inc.、カリフォルニア州サンディエゴ)を用いたMiseqシ－クエンシングシステム上で、600bpサイクルランに修飾したペアードエンドを用いてシ－クエンシングを行った。
配列の質をチェックし、配列類似性でクラスタリングして分類単位(OTU)解析を行った。微生物同定は，データベースNGS‐DB‐BA 16.0(テクノスルガラボ株式会社)を用いて行った。

【0051】

（統計解析）
０．５未満のＰ値を有意であるとみなした。
前記実験１では、Dunnett検定により統計解析を行い、対照群との差を比較した。データが正規の分布が認められなかった場合は、Dunnの検定を採用した。
前記実験２では、一元配置分散分析を用いて統計量を算出した後、Tukey検定を行った。微生物叢量の比較は、Dunn検定によった。統計解析はすべてGraphPad Prismバージョン9.03(GraphPad Software,カリフォルニア州サンディエゴ)を用いた。

【0052】

＜結果＞
（食物摂取量と体重）
実験１、実験２ともに、２週間の給餌期間において、摂餌量、乾燥糞質量に有意差は認められなかった(表１)。最終体重にも有意差はなかったが、０．２％ＥＧＣＧ投与マウスの盲腸内容物重量は統計学的に有意な増加を示した。

【0053】

【表1】

【0054】

（用量依存的な作用）
フェノール及びｐ－クレゾールの抱合体は、スルファターゼ及びβ-グルクロニダーゼによる酵素加水分解により元の形態に変換し、フェノール及びｐ－クレゾールの尿中及び血漿中濃度は、それらの遊離型及び硫酸/グルクロン酸抱合体の総濃度として測定した。対照群では、尿中に排泄されたｐ－クレゾールの平均量がフェノールの４倍であった(図２)。
ＥＧＣＧの飼料添加は、両化合物の尿中排泄を用量依存的に減少させ、０．２％ＥＧＣＧ飼料を与えたマウスの尿中にはほとんど検出されなかった。
Dunnett検定の結果、０．２％ＥＧＣＧ群は、尿中のフェノール及びｐ－クレゾールが、対照群と比較して統計学的に有意な減少を示した(いずれもｐ＜０．０５)。

【0055】

また、ｐ－クレゾールの血漿中濃度もフェノールより高かった(図３)。
ｐ－クレゾールの平均血漿濃度は、対照群で９．３±２．２μＭ、０．２％ＥＧＣＧ群で０．２±０．１μＭであり、統計学的に有意差が認められた(ｐ＜０．０５)。血漿中フェノール濃度はＥＧＣＧの添加に伴い低下傾向を示したが、統計学的有意差には至らなかった。

【0056】

（硫酸抱合型とグルクロン酸抱合型の比率）
遊離型のフェノールとｐ－クレゾールは酵素による加水分解反応を行わずに測定した。尿中フェノール及びｐ－クレゾールの総量に対する遊離型の割合はごくわずかであった(図４)。グルクロン酸抱合型の量は，グルクロニダーゼ処理後に得られたデータから遊離型のデータを差し引いて算出した。
また、グルクロニダーゼ＋スルファターゼ処理後に得られたデータから、遊離型及びグルクロン酸抱合型を差し引いて硫酸抱合型の量を算出した。
対照群では、尿中のフェノールの硫酸抱合体が優勢であり、全濃度の７７％を占めていた。しかし、ｐ－クレゾールの硫酸抱合型は４５％、グルクロン酸抱合型は５１％と、フェノールにおけるそれぞれの割合とは異なる傾向を示した。
ＥＧＣＧを０．０５％および０．１％添加した飼料を与えたマウスは、ＥＧＣＧの添加量にかかわらず、総尿中濃度に対する硫酸抱合型またはグルクロン酸抱合型の割合は、対照飼料を与えたマウスとほぼ一致していた(表２)。

【0057】

【表2】

【0058】

実験２では、０．２％のＥＧＣＧの食餌添加によりｐ－クレゾールの尿中排泄が減少し(ｐ＜０．００１)、実験１と同様の結果が再現されたが、この効果はＥＧＣＧをタンナーゼで加水分解することにより完全に失われた(図５)。
ＥＧＣＧとその加水分解物(ＥＧＣとＧＡの等モル混合物)の間で、ｐ－クレゾールの尿中濃度に統計的有意差があった(ｐ＜０．０００１)。一方、フェノールの尿中濃度に関しては、群間で有意差を示さなかった。
このような結果は血漿中濃度に関しても一貫して現れた。対照飼料、ＥＧＣＧ飼料、およびＥＧＣ＋ＧＡ飼料を与えたマウスの血漿中のｐ－クレゾール濃度は、それぞれ１０．８±５．２μＭ、０．２±０．１μＭ、および１２．４±８．０μＭであった(図６)。
ＥＧＣＧ群は他の群よりも有意に低かった(対照群に対してｐ＜０．０５およびＥＧＣ＋ＧＡ群に対してｐ＜０．０１)。血漿中フェノール濃度に関しては，群間で有意差は認められなかった。

【0059】

（フェノール及びｐ－クレゾールの盲腸内容物中における含有量）
盲腸内容物の湿重量当たりの遊離型フェノール及びｐ－クレゾールの濃度を表３に示す。
実験１及び実験２のいずれにおいても、０．２％ＥＧＣＧ飼料を与えたマウスの盲腸内容物にはｐ－クレゾールがほとんど含まれておらず、対照群との間に統計学的有意差が認められた(実験１でｐ＜０．０５、実験２でｐ＜０．０１)。これに対し、ＥＧＣＧ加水分解物(ＥＧＣとＧＡの等モル混合物) は、ｐ－クレゾールの盲腸内容物中の含有量にほとんど影響を及ぼさなかった。
図７は、盲腸内容物中のｐ－クレゾールの含有量が、その血漿濃度と密接に相関していたことを示している。
このように、腸内細菌が生息している盲腸内容物中のｐ－クレゾール濃度が低下していたことから、ｐ－クレゾールの合成阻害に関してＥＧＣＧの構造的優位性が認められた。
フェノールの場合、実験１では用量依存的な減少が見られたが、ＥＧＣＧを食餌に添加しても実験２では統計学的有意差には至らなかった。

【0060】

【表3】

【0061】

実験２において得られた対照マウスにおける糞中の微生物組成は、４つの主要な門(Firmicutes、Bacteroidetes、Actinobacteria、Proteobacteria)が対照マウスの糞便中の配列の９８．２％を占めていた(図８)。
対照群のすべてのマウスで、Firmicutes門が最も多かった。
飼料に０．２％のＥＧＣＧを添加すると、対照群と比較してFirmicutesの相対量が有意に減少したが(ｐ＜０．０５)、ＥＧＣ＋ＧＡを配合した飼料では影響がなかった(図９)。
acteroidetes門およびVerrucomicrobia門は逆に増加した(いずれもｐ＜０．０５)が、ＥＧＣＧ加水分解物の場合、実際的な影響はなかった。主成分分析(ＰＣＡ)は、対照飼料及びＥＧＣ＋ＧＡ飼料を給餌したマウスの門分類学的プロファイルは、近傍に位置し、ＥＧＣＧ飼料を給餌したマウスとは異なったプロファイルをもたらした(図１０)。

【0062】

レベルでは、対照群の糞便から１２目の細菌群が検出され、そのうち９６．３％がClostridiales、Lactobacillales、Erysipelotrichales、Bacteroidales、Bifidobacteriales、Eggerthellales、Enterobacteralesに属するものであった(図１１)。
シ－クエンスの上位５位の実験群間の比較を図１２に示す。
ＧＣＧ群では、Firmicutes門のメンバーであるClostridiales目の相対的な存在量が低減した一方、Bacteroidetes門のメンバーであるBacteroidales目は増加し、対照群との間に有意差が認められた(Clostridialesについてｐ＜０．０１、Bacteroidalesについてｐ＜０．０５)。Firmicutes門に属するLactobacillales目とErysipelotrichales目は有意差を示さなかったが、Verrucomicrobialesの相対的な存在比はＥＧＣＧ群で急激に増加した。

【0063】

＜考察＞
最近の研究では、ポリフェノールに富む食品は、腸内細菌叢を変化させ，そのことによって腸内細菌が産生する代謝物についても増加もしくは抑制に働くとして、多くの注目を集めている。いったん経口摂取されると、ポリフェノールの一部は大腸に到達し、そこで多様な細菌と直接接触する。ポリフェノールによる細菌群の組成変化の結果として、代謝物の産生増加または産生抑制される可能性がある。短鎖脂肪酸は腸内細菌の代謝産物の一例である。緑茶ポリフェノールは腸内での産生を抑制するが、紅茶ポリフェノールは逆にそれらを増加させる。しかし、緑茶ポリフェノールがフェノールとｐ－クレゾールの産生に影響を及ぼすかどうかについては検討されていなかった。ここでは、健常マウスの尿および血漿ｐ－クレゾール濃度に対する緑茶中の主要ポリフェノール、ＥＧＣＧの効果を評価した。

【0064】

尿中及び血漿中のフェノール及びｐ－クレゾールは大部分が抱合型からなることはよく知られている。本研究では、フェノール及びｐ－クレゾールの抱合体をスルファターゼ及びβ‐グルクロニダーゼにより加水分解して元の形に戻し、次いで固相抽出法により化合物を精製した。
実験１では、食餌に添加されたＥＧＣＧの量に応じて、尿および血漿中のｐ－クレゾール濃度が低下した。この結果は、ＥＧＣＧがｐ－クレゾールの細菌産生の抑制に有益な効果を有するという直接的証拠といえる。特に、盲腸が腸内細菌による尿毒素を産生する主要な臓器の１つであることを考慮すると、０．２％ＥＧＣＧ群でｐ－クレゾールの盲腸内容物における含有量が有意に減少したという知見は、理論を裏付ける決定的な証拠となりうる。ＥＧＣＧは腸管腔内でのｐ－クレゾール産生を低下させることによりｐ－クレゾールの血漿中および尿中濃度を低下させたと考えるのが妥当である。

【0065】

グルクロン酸抱合と硫酸抱合のそれぞれの比を評価するために、β－グルクロニダーゼのみで加水分解した後に得られたデータから遊離型を差し引いてｐ－クレシルグルクロニド（グルクロン酸抱合型のｐ－クレゾール）の尿中濃度を計算した。また、総濃度から遊離型およびグルクロン酸抱合型の濃度を差し引いてｐ－クレシル硫酸（硫酸抱合型のｐ－クレゾール）の濃度を算出した。p－クレシルグルクロニドとｐ－クレシル硫酸は齧歯類でほぼ同等に認められることが報告されている。本研究の実験１でも同様であり、対照群のマウスから採取した尿において，グルクロン酸抱合型および硫酸抱合型の割合がほぼ等しいことが示された。０．１％ＥＧＣＧ飼料を与えたマウスの尿も対照群のマウスと同様のバランスのとれた割合を維持したことから、ＥＧＣＧが肝臓におけるｐ－クレゾールの抱合反応にほとんど影響を及ぼさなかったと考えるのは妥当といえる。

【0066】

茶ポリフェノールは２つの主なクラスに分けられる。１つはガロイル部分を有するカテキンであり、もう１つはガロイル部分を有さないカテキンである。
ロイル型と非ガロイル型の構造活性相関を明らかにするために、次に別の動物実験を行った(実験２)。マウスは、０．２％ 濃度のＥＧＣＧを含む食餌、またはＥＧＣとＧＡの等モル調整物(ＥＧＣＧの酵素的加水分解により調製)を含む食餌のいずれかを摂取させた。その結果、０．２％ＥＧＣＧ飼料を給餌したマウスは対照飼料と比較して尿および血漿中のｐ－クレゾール濃度が著しく低かったが、ＥＧＣ＋ＧＡ飼料を給餌したマウスは対照飼料を摂取させた群と同等程度のｐ－クレゾールを尿中に排泄することが明らかとなった。この結果は、フラバン‐３‐オールの構造へのガロイル部分の有無が重要な役割を果たすことを意味する。

【0067】

チロシンは腸内の細菌によって４-ヒドロキシフェニル酢酸に代謝された後、４-ヒドロキシフェニル酢酸デカルボキシラーゼ(4-Hpd)によってｐ－クレゾールに変換される。
近の研究では－クロストリジウム目の一員であるBlautia ydrogenotrophica、Clostridium ifficile、Romboutsia ituseburensis(NCBI分類データベースによるEubacterialesの異型同義語)、およびCoriobacteriales目の一員であるOlsenella liが主要なｐ－クレゾール産生菌として同定された。
これら４種のｐ－クレゾール産生菌は4-Hpdのホモログを保有している。また、Amarettiらは－クロストリジウム目の仲間であるLachnospiraceae科およびRuminococcaceae科がｐ－クレゾールの産生に関連性があることを見出した。この知見に照らして－クロストリジウム目に属する細菌が腸内でｐ－クレゾールを産生するのに主要な役割を果たしていることを予測することは妥当であると思われる。ＥＧＣＧの摂取がｐ－クレゾール産生菌に効果を誘発するかどうかを見出すために、分類学的カテゴリーに基づいて細菌組成変化も測定した。その結果、飼料中に０．２％のＥＧＣＧを添加すると、Firmicutes門の相対量が有意に減少した。Firmicutes門を構成する主要メンバーのうち、ＥＧＣＧ摂取の結果、Clostridiales目のみが統計的に有意な減少を示した。Lactobacillales目とErysipelotrichales目の相対量はＥＧＣＧによって影響されなかった。このことは、摂取したＥＧＣＧの一部が大腸に到達し－クロストリジウム目の存在量を減少させ、結果的にｐ－クレゾール産生を抑制したことを説明している。しかし、ＥＧＣＧが細菌の4‐Hpdの直接阻害を介して酵素反応を妨害するかどうかはまだ分かっていない。

【0068】

フェノール産生能を有する多種多様な細菌が腸内に生息していることが明らかになっている。また、チロシンからフェノールを効果的に生産する能力のある、Clostridiales、Fusobacteriales、及びEnterobacteralesに属するいくつかのタイプのバクテリアを同定されている。これらはそれぞれFirmicutes門、Fusobacteria門、Proteobacteria門に系統発生的に分類される。上記のように、ＥＧＣＧはFirmicutes門の相対的な存在量を減少させることができたが、Proteobacteriaについては逆の傾向を示した。このようにフェノール生産菌は多様であることから、ＥＧＣＧはそれ自体ではフェノールの尿中及び血漿中濃度を有意に低下させることはできなかったと考えられた。フェノール産生菌に対するＥＧＣＧの役割を調べるためのより詳細な研究が必要である。

【0069】

ポリフェノールを多く含む植物エキスの摂取は、ある種の尿毒素の産生を制御する可能性がある。例えば、赤ワインとブドウ果汁エキスの混合物を４日間摂取すると、結腸における微生物のタンパク質発酵が抑制し，アミノ酸代謝の変化、特に尿中ｐ－クレゾールの減少がもたらされた。
別の研究では－クランベリー乾燥エキス(１日量１０００ｍｇ)を２カ月間補給しても、非透析慢性腎臓病患者のｐ－クレシル硫酸の血漿中濃度は低下しなかった。
本研究は、マウスを用いた実験モデルにおいて腸内細菌によるｐ－クレゾール産生に及ぼす緑茶ポリフェノールの有益な効果の可能性を実証した。ＥＧＣＧの飼料添加は、糞便微生物叢におけるｐ－クレゾール産生菌の存在量の減少に伴い、尿中および血漿中ｐ－クレゾール濃度に対して強い減少効果を示した。実験期間を通しての摂餌量に基づいて、０．２％ＥＧＣＧ群のＥＧＣＧの１日消費量はマウスの３０５ｍｇ／ｋｇ体重と計算された。これは１２．３５ｍｇ／ｋｇでヒト相当量に換算できた。すなわち、体重１ｋｇ当たり１２．３５ｍｇ以上のＥＧＣＧを経口摂取すれば、有効であると推定される。より多くの量のＥＧＣＧが大腸に到達するのを助ける効率的な方法が考案されれば、ＥＧＣＧの投与量をある程度減らすことが可能になるはずである。
腸内細菌によるｐ－クレゾールの産生が慢性腎臓病患者における心血管死亡の有意なリスクと関連していることを考慮すると、ＥＧＣＧは本疾患の治療の薬剤候補となる可能性がある。本研究では、尿毒素制御に焦点を当てて、異なる観点から有益な健康効果を検討した。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】