特開 2024-85747 組換えタンパク質産生細胞の培養方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024085747

(43)【公開日】2024-06-27

(54)【発明の名称】組換えタンパク質産生細胞の培養方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20240620BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20240620BHJP

   C12P 21/00 20060101ALI20240620BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240620BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240620BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240620BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10

C12M1/00 A

C12M1/00 C

C12P21/00 C

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

【審査請求】未請求

【請求項の数】9

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022200442

(22)【出願日】2022-12-15

(71)【出願人】

【識別番号】000010076

【氏名又は名称】ヤマハ発動機株式会社

(71)【出願人】

【識別番号】000238201

【氏名又は名称】扶桑薬品工業株式会社

(74)【代理人】

【識別番号】100115381

【弁理士】

【氏名又は名称】小谷 昌崇

(74)【代理人】

【識別番号】100127797

【弁理士】

【氏名又は名称】平田 晴洋

(72)【発明者】

【氏名】引地 裕一

(72)【発明者】

【氏名】原田 額郎

(72)【発明者】

【氏名】辻岡 一也

(72)【発明者】

【氏名】田原 寛

【テーマコード（参考）】

4B029

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B029AA02

4B029AA27

4B029BB11

4B029CC01

4B064AG01

4B064AG27

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA94X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA01

4B065BA21

4B065CA25

4B065CA44

(57)【要約】

【課題】組換えタンパク質産生量の高い細胞株を効率的に特定することが可能な培養方法を提供する。
【解決手段】組換えタンパク質産生細胞の培養方法は、微小サイズに区画された多数のマイクログリッド１２を備えた第１プレート１に対して、例えば抗体３を産生可能な単一細胞Ｃの多数個を液体培地ＬＡに含有させた細胞懸濁液２Ｌを注液し、多数のマイクログリッド１２のうちの少なくとも一部のマイクログリッド１２の各々に、液体培地ＬＡおよび一個の単一細胞Ｃを保持させる工程と、マイクログリッド１２内の液体培地ＬＡをゲル培地ＬＢに転換する工程と、マイクログリッド１２内の単一細胞Ｃに抗体産生期間を与える工程と、第１プレート１に、ゲル培地ＬＢ内の単一細胞Ｃが産生する抗体３と結合可能な検出用抗体４を含む液体を添加する工程と、を含む。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

微小サイズに区画された多数の収容部を備えたプレートに対して、組換えタンパク質を産生可能な単一細胞の多数個を培地に含有させた細胞懸濁液を注液し、前記多数の収容部のうちの少なくとも一部の収容部の各々に、培地および一個の単一細胞を保持させる工程と、
前記収容部内の培地をゲル化する工程と、
前記収容部内の前記単一細胞に組換えタンパク質産生期間を与える工程と、
前記プレートに、ゲル化した培地内の前記単一細胞が産生する組換えタンパク質と結合可能な検出用タンパク質を含む液体を添加する工程と、を含む、組換えタンパク質産生細胞の培養方法。

【請求項2】

請求項１に記載の組換えタンパク質産生細胞の培養方法において、
前記組換えタンパク質を産生可能な単一細胞が、抗体を産生可能な単一細胞であり、
前記検出用タンパク質が検出用抗体である、組換えタンパク質産生細胞の培養方法。

【請求項3】

請求項２に記載の組換えタンパク質産生細胞の培養方法において、
前記検出用抗体を反応させるトリガを与え、抗体産生量の多い単一細胞が保持された収容部を特定する工程をさらに含む、組換えタンパク質産生細胞の培養方法。

【請求項4】

請求項３に記載の組換えタンパク質産生細胞の培養方法において、
前記特定された収容部に保持された単一細胞をピッキングし、他の容器に移載する工程をさらに含む、組換えタンパク質産生細胞の培養方法。

【請求項5】

請求項３に記載の組換えタンパク質産生細胞の培養方法において、
前記抗体の産生期間において前記プレートを監視し、当該産生期間の当初から複数個の単一細胞が保持されていた前記収容部は、前記特定の対象から除外する、組換えタンパク質産生細胞の培養方法。

【請求項6】

請求項１～５のいずれか１項に記載の組換えタンパク質産生細胞の培養方法において、
前記収容部は、開口面積が１．０×１０^－３～１．０×１０^－１ｍｍ^２、容積が２．０×１０^－５～１．０×１０^－２ｍｍ^３の範囲から選ばれるサイズを有する、組換えタンパク質産生細胞の培養方法。

【請求項7】

請求項６に記載の組換えタンパク質産生細胞の培養方法において、
前記プレートは、当該プレートの比較的大サイズの領域を区分する大区画部と、この大区画部の内側をさらに細区分する小区画部とを含み、
前記小区画部が前記収容部である、組換えタンパク質産生細胞の培養方法。

【請求項8】

請求項２～５のいずれか１項に記載の組換えタンパク質産生細胞の培養方法において、
アルギン酸塩を含む培地が、前記プレートに注液される、組換えタンパク質産生細胞の培養方法。

【請求項9】

請求項２～５のいずれか１項に記載の組換えタンパク質産生細胞の培養方法において、
前記単一細胞に遺伝子を導入して抗体産生能を付与する工程を含み、
前記遺伝子を導入した単一細胞を通常培地で所定期間培養した後、前記通常培地を前記単一細胞の培養に適した選択培地に置換する、組換えタンパク質産生細胞の培養方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、組換えタンパク質を産生する細胞を培養する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ウィルス感染細胞やがん細胞などの異物の抗原に特異的に結合して前記異物を除去する効能を有する抗体医薬品の開発に当たっては、抗体を産生可能な細胞の培養が不可欠である。細胞の培養方法としては、種々の先行技術が存在する。例えば特許文献１には、スフェロイドの培養技術ではあるが、アルギン酸のゲルを用いた培養方法が開示されている。

【0003】

培養した細胞の中から、抗体産生量の高い細胞を特定するスクリーニングが必要となる。特許文献２には、多数のウェル内で培養されている細胞に光を照射し、ウェルから発生する蛍光量に基づいて抗体産生量を評価するスクリーニング方法が開示されている。しかし、汎用のウェルに細胞を播種して培養し、蛍光量を求める方法では、スクリーニングを効率的に行うことが難しい場合があった。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特表２０２１－５１１０７８号公報

【特許文献2】特許第６４６１５８０号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

本発明の目的は、組換えタンパク質産生量の多い細胞株を効率的に特定することが可能な組換えタンパク質産生細胞の培養方法を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明の一局面に係る組換えタンパク質産生細胞の培養方法は、微小サイズに区画された多数の収容部を備えたプレートに対して、組換えタンパク質を産生可能な単一細胞の多数個を培地に含有させた細胞懸濁液を注液し、前記多数の収容部のうちの少なくとも一部の収容部の各々に、培地および一個の単一細胞を保持させる工程と、前記収容部内の培地をゲル化する工程と、前記収容部内の前記単一細胞に組換えタンパク質産生期間を与える工程と、前記プレートに、ゲル化した培地内の前記単一細胞が産生する組換えタンパク質と結合可能な検出用タンパク質を含む液体を添加する工程と、を含む。

【0007】

この態様によれば、一個の単一細胞を一つの収容部に保持させた後、当該収容部内の培地がゲル化される。ゲル化により、一つの収容部内に一つの単一細胞が閉じ込められた状態を形成できる。この状態で、前記単一細胞を所定の組換えタンパク質産生期間だけ培養することで、収容部毎に細胞増殖ならびに組換えタンパク質産生を行わせることができる。そして、プレートに検出用タンパク質を添加することで、収容部単位で組換えタンパク質産生量を評価できる。培地のゲル化によって単一細胞の浮遊が抑止されているので、検出用タンパク質が多く検出される収容部には、組換えタンパク質産生能が高い細胞株が保持されていることになる。このように、上記の態様によれば、収容部単位で単一細胞の培養、組換えタンパク質産生ならびに組換えタンパク質産生量の検出が可能となるので、組換えタンパク質産生量の多い細胞株を効率的に特定することが可能となる。

【0008】

上記の培養方法において、前記組換えタンパク質を産生可能な単一細胞が、抗体を産生可能な単一細胞であり、前記検出用タンパク質が検出用抗体であることが望ましい。

【0009】

この態様によれば、収容部単位で単一細胞の培養、抗体産生ならびに抗体産生量の検出が可能となるので、抗体産生量の多い細胞株を効率的に特定できる。

【0010】

上記の培養方法において、前記検出用抗体を反応させるトリガを与え、抗体産生量の多い単一細胞が保持された収容部を特定する工程をさらに含むことが望ましい。

【0011】

この態様によれば、例えばプレートに光を照射して検出用抗体を蛍光させるといったトリガを与え、蛍光度合い等に基づいて収容部単位で検出用抗体の量を検出するだけで、抗体産生量の多い細胞株を特定できる。

【0012】

上記の培養方法において、前記特定された収容部に保持された単一細胞をピッキングし、他の容器に移載する工程をさらに含んでいても良い。

【0013】

この態様によれば、高抗体産生細胞株をピッキングして他の容器に移載することで、例えば当該細胞株をさらに培養し、多量の抗体を産生させることが可能となる。

【0014】

上記の培養方法において、前記抗体の産生期間において前記プレートを監視し、当該産生期間の当初から複数個の単一細胞が保持されていた前記収容部は、前記特定の対象から除外することが望ましい。

【0015】

細胞懸濁液をプレートに注液すると、多数の収容部のうち、確率論的に概ね一定の割合で一個の単一細胞だけを保持した収容部が発現する。残りの収容部は、単一細胞を保持していない無保持収容部か、あるいは複数個の単一細胞を保持する過保持収容部となる。前記過保持収容部には、高抗体産生細胞株と非産生または低抗体産生細胞株とが混在している可能性がある。上記の態様によれば、前記過保持収容部が特定の対象から除外されるので、抗体産生量の多い単一細胞が保持された収容部を正確に特定することができる。

【0016】

上記の培養方法において、前記収容部は、開口面積が１．０×１０^－３～１．０×１０^－１ｍｍ^２、容積が２．０×１０^－５～１．０×１０^－２ｍｍ^３の範囲から選ばれるサイズを有することが望ましい。

【0017】

この態様によれば、単一細胞の培養領域を十分に微小化でき、限られたプレート面積で多量の単一細胞の独立的な培養が可能となる。従って、培養の効率化、抗体産生量評価の効率化を図ることができる。

【0018】

上記の培養方法において、前記プレートは、当該プレートの比較的大サイズの領域を区分する大区画部と、この大区画部の内側をさらに細区分する小区画部とを含み、前記小区画部が前記収容部であることが望ましい。

【0019】

この態様によれば、大区画部の単位で細胞種や培養液を変更する等の活用が可能となり、培養の多様化を図ることが可能となる。

【0020】

上記の培養方法において、アルギン酸塩を含む培地が、前記プレートに注液されることが望ましい。

【0021】

アルギン酸塩を含む培地は、例えばカルシウムイオンやマグネシウムイオンを添加することで、俊敏にゲル化する性質がある。従って、上記の態様によれば、ゲル化の工程を迅速に完遂することができる。

【0022】

上記の培養方法において、前記単一細胞に遺伝子を導入して抗体産生能を付与する工程を含み、前記遺伝子を導入した単一細胞を通常培地で所定期間培養した後、前記通常培地を前記単一細胞の培養に適した選択培地に置換することが望ましい。

【0023】

この態様によれば、原因は突き止められていないものの、抗体産生能を有する単一細胞を良好に増殖させることができる。

【発明の効果】

【0024】

本発明によれば、組換えタンパク質の産生量の多い細胞株を効率的に特定することが可能な培養方法を提供することができる。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1】図１は、本発明の実施形態に係る抗体産生細胞の培養方法の工程フローを示す図である。

【図2】図２（Ａ）は、第１プレートの構造を示す拡大図付きの平面図、図２（Ｂ）は、図２（Ａ）のＩＩＢ－ＩＩＢ線断面図である。

【図3】図３は、第１プレートへ細胞を播種する状況を示す模式的な断面図である。

【図4】図４は、マイクログリッド内の培地をゲル化する工程を示す模式的な断面図である。

【図5】図５は、単一細胞に抗体産生期間を与える第１次培養の工程を示す模式的な断面図である。

【図6】図６（Ａ）は、第１プレートへ検出用抗体を含有する液体培地を添加した状況を、図６（Ｂ）は洗浄の状況を各々示す模式的な断面図である。

【図7】図７（Ａ）、（Ｂ）は、抗体産生量の多い単一細胞が保持されたマイクログリッドを特定する工程を示す平面図である。

【図8】図８（Ａ）は、吸引チップによる単一細胞のピッキングの状況を示す模式的な断面図、図８（Ｂ）は、ピッキングした単一細胞を第２プレートへ移載する工程を示す模式図である。

【図9】図９は、吸引チップから第２プレートへ単一細胞を吐出し、マイクログリッドに当該単一細胞を保持させる工程を示す模式的な断面図である。

【図10】図１０は、培地吸引により極小培養環境を確立する工程を示す模式的な断面図である。

【図11】図１１は、マイクログリッドの開口部を封止液で封止した状況を示す模式的な断面図である。

【図12】図１２は、第２プレートでの第２次培養における単一細胞の増殖状況を示す画像である。

【図13】図１３は、比較例の培養方法を用いた単一細胞の増殖状況の画像である。

【図14】図１４は、比較例の培養方法を用いた単一細胞の増殖状況の画像である。

【発明を実施するための形態】

【0026】

以下、本発明に係る組換えタンパク質産生細胞の培養方法の実施形態を、図面に基づいて詳細に説明する。本発明で培養対象とされるのは、組換えタンパク質を産生する単一細胞である。以下に示す実施形態では、組換えタンパク質産生細胞の一例として、ＣＨＯ細胞やＢ細胞のような、抗体医薬品製造での使用や抗体産生が期待される単一細胞（Ｓｉｎｇｌｅ Ｃｅｌｌ）を例示する。本実施形態で示す培養方法は、大略的には、準備した単一細胞を一定期間培養した上で抗体産生能に優れる単一細胞を選別し、当該単一細胞をさらに培養して増殖させることで、抗体を大量に産生させる方法である。

【0027】

［培養工程の全体フロー］
先ず、本実施形態に係る抗体産生細胞の培養方法の全体フローを、図１に示す工程フローを参照して説明する。本実施形態の培養方法は、順次実施される工程Ｓ１～工程Ｓ９を含む。最初に、所定の手法を用いて抗体を産生可能な単一細胞を大量に作成する（工程Ｓ１）。次に、作成した単一細胞を、培地と共に多数の細胞収容部を備えた第１プレート１（図２）へ播種する（工程Ｓ２）。そして、培地をゲル化（図４）した上で、前記細胞収容部内で単一細胞を所定日数培養する第１次培養を行う（工程Ｓ３／図５）。

【0028】

第１次培養の後、前記単一細胞が産生する抗体と結合する検出用抗体を添加し（図６）、高抗体産生細胞株を特定するスクリーニング（図７）を行う（工程Ｓ４）。特定された高抗体産生細胞株を吸引チップ２３でピッキングし、多数の細胞収容部を備えた第２プレート５へ移動する（工程Ｓ５／図８）。そして、吸引チップ２３から液体培地を張った第２プレート５へ、ピッキングした高抗体産生細胞株である単一細胞を吐出する（工程Ｓ６／図９）。

【0029】

続いて、第２プレート５から液体培地を吸引して、単一細胞を個々の細胞収容部内で培養する極小培養環境、すなわち培養エリアが極めて小さい培養環境を確立する（工程Ｓ７／図１０）。さらに、第２プレート５の上面を、培地の蒸発防止用の封止液で封止する（工程Ｓ８／図１１）。しかる後、前記細胞収容部内で単一細胞を所定日数培養する第２次培養を行う（工程Ｓ９／図１２）。以下、上記の工程Ｓ１～Ｓ９の各々について詳述する。

【0030】

［工程Ｓ１；抗体産生単一細胞の作成］
工程Ｓ１では、例えば培養対象の単一細胞に所定の遺伝子を導入することで、当該単一細胞に抗体産生能を付与する。単一細胞としては免疫細胞のＢ細胞を例示でき、産生する抗体としては単一種類のＢ細胞が作るモノクロナール抗体を例示できる。遺伝子の導入は、例えばトランスフェクション等の化学的手法、エレクトロポレーション等の物理的手法、あるいはウィルスベクター等の生物学的手法により行うことができる。遺伝子を導入した単一細胞は、例えば通常の培養培地にて２日間培養し、その後に前記培養培地を培養対象の単一細胞に適した選択培地に置換する手法を採用することが望ましい。もちろん、遺伝子導入の後、直ちに選択培地で単一細胞を培養しても良い。

【0031】

［工程Ｓ２；第１プレートへの細胞播種］
工程Ｓ２では、工程Ｓ１で作成した単一細胞を、第１次培養を行うために培養プレートへ播種する。図２（Ａ）は、前記培養プレートの一例としての第１プレート１（プレート）の構造を示す拡大図付きの平面図、図２（Ｂ）は、図２（Ａ）のＩＩＢ－ＩＩＢ線断面図である。第１プレート１は、平板状の基材の片面にマトリクス配列された凹部からなるグリッド１１と、個々のグリッド１１内にマトリクス配列された微小サイズの凹部からなるマイクログリッド１２（収容部）とを含む。

【0032】

グリッド１１は、第１プレート１の比較的大サイズの領域を区分する大区画部である。図２では、縦横のグリッド板で区画された上面視で矩形のグリッド１１を例示している。これに代えて、上面視で円形のウェル型のグリッド１１をハニカム状またはマトリクス状に配列した構造としても良い。マイクログリッド１２は、個々のグリッド１１の内側をさらに細区分する小区画部である。マイクログリッド１２は、グリッド１１の底板上に形成され、グリッド１１を区画するグリッド板よりも低い側板で区画された、上面視で矩形の凹部である。このマイクログリッド１２も、上面視で円形のウェル型としても良い。

【0033】

マイクログリッド１２は、単一細胞を保持する収容部となる。マイクログリッド１２のサイズの一例を挙げると、一辺が２００μｍ、深さが１００μｍである。第１プレート１は、このような微小サイズに区画された多数の収容部を備えたプレートである。マイクログリッド１２は、微小な培養空間を形成できるサイズに設定することが望ましく、例えば開口面積が４．０×１０^－２～１．０×１０^－１ｍｍ^２、容積が４．０×１０^－３～１．０×１０^－２ｍｍ^３の範囲から選ばれるサイズ、より望ましくは開口面積が１．０×１０^－３～１．０×１０^－１ｍｍ^２、容積が２．０×１０^－５～１．０×１０^－２ｍｍ^３の範囲から選ばれるサイズに設定することができる。

【0034】

図３は、第１プレート１へ単一細胞Ｃを播種する状況を示す模式的な断面図である。播種に際しては、工程Ｓ１で作成された、抗体を産生可能な単一細胞Ｃの多数個を液体培地ＬＡに含有させた細胞懸濁液２Ｌが準備される。細胞懸濁液２Ｌは分注容器２１に収容され、第１プレート１の各グリッド１１に対して注液される。この注液により、グリッド１１内の多数のマイクログリッド１２のうち、少なくとも一部のマイクログリッド１２には、液体培地ＬＡおよび一個の単一細胞Ｃが保持される。もちろん、複数個の単一細胞Ｃが入り込んでしまったり、単一細胞Ｃが保持されなかったりするマイクログリッド１２も生じる。例えば、一つのグリッド１１に４７５個のマイクログリッド１２が存在する場合に、当該グリッド１１に４００個の単一細胞を播種すると、確率論的には約１／３のマイクログリッド１２が、一個の単一細胞Ｃを保持するグリッドとなる。

【0035】

細胞懸濁液２Ｌには、液体培地ＬＡに加え、当該液体培地ＬＡを固定化するゲル材が配合される。液体培地ＬＡとしては、水性媒体に無機塩、ブドウ糖、アミノ酸等の成長因子と、抗生物質、成長促進因子などの添加成分とを含む通常の培養液を用いて良い。例えば、ＣＨ１５０培地（ジーメップ株式会社商品名）を、液体培地ＬＡとして好適に用いることができる。ゲル材としては、液体培地ＬＡを固定化可能である限りにおいて特に制限はないが、アルギン酸塩を用いることが望ましい。アルギン酸塩を含ませた液体培地ＬＡは、例えばカルシウムイオンやマグネシウムイオンを含むゲル化剤を添加することで、俊敏にゲル化する性質があるので、後続のゲル化の工程を迅速に完遂することができる利点がある。

【0036】

［工程Ｓ３；第１次培養］
工程Ｓ３は、マイクログリッド１２内の液体培地ＬＡをゲル化させた上で、マイクログリッド１２内で単一細胞Ｃを一定期間培養し、当該単一細胞に抗体産生期間を与える工程である。図４は、マイクログリッド１２の拡大断面図であって、マイクログリッド１２内の液体培地ＬＡをゲル化する工程を示す模式図である。各々のマイクログリッド１２は、底板１２１と側板１２２とにより区画されている。

【0037】

アルギン酸塩を含む液体培地ＬＡを第１プレート１に注液した後、ゲル化剤が添加される。ゲル化剤としては、例えばＣａＣｌ_２を用いることができる。ゲル化剤の添加により、マイクログリッド１２内の液体培地ＬＡはゲル培地ＬＢとなる。マイクログリッド１２内の単一細胞Ｃは、ゲル培地ＬＢにより固定化されることになる。ゲル培地ＬＢの高さは、側板１２２の頂部１２３と同じ高さ、あるいは若干低い高さに調整されることが望ましい。これにより、一つのマイクログリッド１２のゲル培地ＬＢ内に一つの単一細胞Ｃが閉じ込められた状態を形成できる。なお、ゲル培地ＬＢの高さが、頂部１２３よりも若干高い位置にあっても良いし、隣接するマイクログリッド１２のゲル培地ＬＢ同士が連なっていても良い。

【0038】

図５は、単一細胞に抗体産生期間を与える第１次培養の工程を示す模式的な断面図である。ゲル化剤を添加して一定時間（例えば３０分）静置し、液体培地ＬＡをゲル培地ＬＢに転換させた後、第１プレート１には液体培地ＬＡが注液される。つまり、ゲル培地ＬＢを備えたマイクログリッド１２の上方が液体培地ＬＡで覆われる。この状態で、単一細胞Ｃを所定の抗体産生期間だけ第１次培養することで、マイクログリッド１２毎に単一細胞Ｃに細胞増殖ならびに抗体産生を行わせることができる。第１プレート１の上面にはカメラ１３が配置されている。第１次培養の期間中、第１プレート１のマイクログリッド１２は、カメラ１３によって撮像され、状態監視が行われる。第１次培養の期間は、例えば４日～８日程度である。

【0039】

図６（Ａ）は、第１次培養から数日が経過した状態を模式的に示す図である。ここでは、マイクログリッド１２内の単一細胞Ｃが抗体３を産生した状態を示している。第１次培養の期間中には、液体培地ＬＡの交換作業が行われる。交換用の液体培地ＬＡには、ゲル培地ＬＢ内の単一細胞Ｃが産生する抗体３と結合可能な検出用抗体４が含有されている。図６（Ａ）は、第１プレート１へ検出用抗体４を含有する液体培地ＬＡが添加され、その検出用抗体４の一部が抗体３と結合した状態を示している。

【0040】

液体培地ＬＡの交換は、第１プレート１へ既に注液されている液体培地ＬＡを吸液し、新たに検出用抗体４入りの液体培地ＬＡを注液する洗浄の態様で行われる。図６（Ｂ）は前記洗浄の状況を示す模式的な断面図である。まず、図５に示した初回の液体培地ＬＡが、図略の吸引チップで吸引される。その後、検出用抗体４入りの交換用液体培地ＬＡが調製される。交換用液体培地ＬＡは培地供給チップ２２に保持され、図６（Ｂ）に示すようにマイクログリッド１２のゲル培地ＬＢの上へ注液される。このような洗浄は、第１次培養の期間中に１～３回程度行われる。

【0041】

交換用液体培地ＬＡにおける検出用抗体４の希釈率は、抗体３と結合できない過剰分が生じ過ぎない範囲に選定することが望ましい。過剰に検出用抗体４を含有していると、ゲル培地ＬＢの上層の液体培地ＬＡ中に多くの検出用抗体４が浮遊し、個々の単一細胞Ｃの抗体３の産生量を正確に評価できないことがある。

【0042】

［工程Ｓ４；高抗体産生細胞株のスクリーニング］
工程Ｓ４は、工程Ｓ３で添加した検出用抗体４を反応させるトリガを与え、抗体産生量の多い単一細胞Ｃが保持されたマイクログリッド１２を特定する工程である。本実施形態では、前記トリガとして第１プレート１に光を照射し、検出用抗体４を蛍光させる例を示す。抗体３の産生量が多い単一細胞Ｃが保持されたマイクログリッド１２では、それらの抗体３に結合する検出用抗体４も多くなり、蛍光度合いが大きくなる。従って、マイクログリッド１２単位で検出用抗体４の蛍光度合いを評価するだけで、抗体産生量の多い細胞株を特定できる。

【0043】

図７（Ａ）、（Ｂ）は、抗体産生量の多い単一細胞Ｃが保持されたマイクログリッド１２を特定する工程を示す平面図である。図７（Ａ）は、抗体産生期間である第１次培養の初期段階における、マイクログリッド１２での単一細胞Ｃの保持状況を示している。マトリクス配列されたマイクログリッド１２には、ｎ行ｍ列のアドレスが付与されている。ｎ行ｍ列のマイクログリッド１２のうち、ｎ１ｍ４のグリッドＧ１、ｎ２ｍ１のグリッドＧ２、ｎ２ｍ３のグリッドＧ３、ｎ３ｍ３のグリッドＧ４およびｎ５ｍ４のグリッドＧ５には、それぞれ一個の単一細胞Ｃが保持されている。ｎ４ｍ１のグリッドＧ６には、第１次培養の当初から複数個（２個）の単一細胞Ｃが保持されている。

【0044】

図７（Ｂ）は、第１次培養の終了後の状態を示している。グリッドＧ４を除いて、単一細胞Ｃは増殖している。また、図７（Ｂ）は、図略の光源から所定波長の光を第１プレート１に照射し、検出用抗体４から蛍光ＦＬを発生させた状態を示している。グリッドＧ３およびグリッドＧ５では、マイクログリッド１２の開口面積を上回る程度の発光面積の蛍光ＦＬが発生しており、抗体産生量の多い単一細胞Ｃが培養されていることが判る。一方、グリッドＧ１については、単一細胞Ｃは４個に増殖しているものの、マイクログリッド１２の開口面積に対して小さい発光面積の蛍光ＦＬしか発生していない。グリッドＧ２、Ｇ４の蛍光ＦＬも小さい。

【0045】

抗体産生量の多少は、マイクログリッド１２毎の蛍光ＦＬの発生度合いによって評価される。評価指標としては、例えば（１）蛍光ＦＬの発生範囲、（２）蛍光ＦＬの平均輝度、（３）蛍光ＦＬの最大輝度、を例示できる。蛍光ＦＬの発生範囲は、マイクログリッド１２の開口面積に対して、そのマイクログリッド１２から発生している蛍光ＦＬの発光面積の占める割合である。図７（Ｂ）の例では、グリッドＧ３、Ｇ５の蛍光ＦＬは、各々のマイクログリッド１２の開口面積を上回る発光面積を有しており、高抗体産生量と評価される。一方、グリッドＧ１、Ｇ２、Ｇ４の蛍光ＦＬの発光面積は狭く、これらの抗体産生量は低評価となる。このような蛍光ＦＬの発生範囲をベースとして、平均輝度および最大輝度がさらに考慮される。平均輝度および最大輝度がより高いグリッドの抗体産生量は高評価となる。ここでは、グリッドＧ３、Ｇ５が「高抗体産生細胞株が保持されたマイクログリッド１２」として特定され得る。

【0046】

なお、抗体産生期間の当初から複数個の単一細胞Ｃが保持されていたグリッドＧ６は、前記特定の対象から除外される。一つのマイクログリッド１２に複数個の単一細胞Ｃが保持されてしまった過保持グリッドでは、高抗体産生細胞株と非産生または低抗体産生細胞株とが混在している可能性がある。この場合、後者を後の工程Ｓ５でピッキングしてしまうことが生じ得る。このため、第１次培養の当初からカメラ１３（図５）で第１プレート１を監視し、グリッドＧ６のような過保持グリッドは、たとえ発生度合いの高い蛍光ＦＬを発生していても、抗体産生量の評価対象から除外される。これにより、抗体産生量の多い単一細胞Ｃが保持されたマイクログリッド１２を正確に特定することができる。

【0047】

［工程Ｓ５；高抗体産生細胞株のピッキング］
工程Ｓ５では、先の工程Ｓ４で高抗体産生量の多いグリッドとして特定されたマイクログリッド１２に収容された単一細胞Ｃを吸引チップ２３でピッキングし、これを第２プレート５へ移動する。すなわち、ピッキングは、マイクログリッド１２単位で行われる。図８（Ａ）は、吸引チップ２３による単一細胞Ｃのピッキングの状況を示す模式的な断面図、図８（Ｂ）は、ピッキングした単一細胞Ｃを第２プレート５へ移載する工程を示す模式図である。

【0048】

吸引チップ２３は、下端に単一細胞Ｃの吸引および吐出を行う先端開口２３Ｔを備える。図８（Ａ）に示すように、吸引チップ２３の先端開口２３Ｔが吸引ターゲットの単一細胞Ｃに対してＸＹ方向に位置合わせされ、先端開口２３Ｔがマイクログリッド１２内へ進入するよう吸引チップ２３が下降される。その後、先端開口２３Ｔに負圧を発生させることで、吸引ターゲットの単一細胞Ｃがゲル培地ＬＢと共に吸引チップ２３内に吸引される。単一細胞ＣのＸＹ座標は、カメラ１３（図５）による第１プレート１の撮影画像に基づき求めることができる。この吸引チップ２３による吸引では、高抗体産生量と特定された一つのマイクログリッド１２に存在する全ての単一細胞Ｃを１ターンの吸引動作で吸引させても良いし、一部を吸引させても良い。

【0049】

図８（Ｂ）に示すように、吸引チップ２３はヘッドユニット６のヘッド６１に装着される。ヘッドユニット６は、図略のガイドレールに沿って水平方向（ＸＹ方向）へ移動可能なユニットである。ヘッド６１は、ヘッドユニット６の本体に昇降可能に取り付けられ、吸引チップ２３が装着される下端部を有している。ヘッドユニット６の本体内には、ヘッド６１の前記下端部に、負圧および正圧を発生させるための機構が内蔵されている。

【0050】

ヘッドユニット６のＸＹ移動により、吸引チップ２３の先端開口２３Ｔと吸引ターゲットの単一細胞Ｃとの位置合わせが行われる。吸引ターゲットの単一細胞Ｃを保持しているマイクログリッド１２に対する先端開口２３Ｔの進退は、ヘッド６１の昇降により実現される。先端開口２３Ｔから単一細胞Ｃの吸引または吐出は、ヘッド６１の前記下端部に負圧または正圧を発生させることで実現される。第１プレート１において、吸引ターゲットの単一細胞Ｃを各ヘッド６１に装着された吸引チップ２３で吸引させたら、ヘッドユニット６が第２次培養を行う第２プレート５（他の容器）の上空へ移動される。以上のような細胞ピッキング並びに細胞移動を自動的に行う装置として、例えばＣＥＬＬ ＨＡＮＤＬＥＲ（ヤマハ発動機株式会社商品名）を好適に用いることができる。このような自動化装置に代えて、作業者がマイクロピペットなどの細胞吸引・吐出具を用いて、細胞ピッキング並びに細胞移動をマニュアル操作で実行する態様としても良い。

【0051】

［工程Ｓ６；第２プレートへの細胞吐出］
工程Ｓ６は、工程Ｓ５において吸引チップ２３でピッキングした単一細胞Ｃを、第２プレート５の所定の収容部へ保持させる工程である。図９は、工程Ｓ６の前記吐出により、第２プレート５へ単一細胞Ｃを保持させる工程を示す模式的な断面図である。工程Ｓ６は、予め第２プレート５へ所定量の液体培地を注液する工程と、第１プレート１でピッキングした単一細胞Ｃを第２プレート５へ吐出させる工程とを含む。

【0052】

第２プレート５は、上面に開口部を有する複数の収容部を備えた容器である。第２プレート５としては、先に図２に基づいて説明した第１プレート１と同様の構造を備えるプレートを用いることができる。図９では、第２プレート５の比較的大サイズの領域を区分するグリッド５１と、このグリッド５１の内側をさらに細区分するマイクログリッド５２とを備える第２プレート５を例示している。各マイクログリッド５２が、単一細胞Ｃを保持する前記収容部である。図９に示されているのは、一つのグリッド５１の断面図である。グリッド５１は、底面を形成するグリッド底板５１１と、側面を形成するグリッド側板５１２とを有している。各マイクログリッド５２は、共通のグリッド底板５１１と、個々の側面を形成する側板５２１とで区画されている。

【0053】

単一細胞Ｃを保持する収容部となるマイクログリッド５２は、第１プレート１のマイクログリッド１２と同様なサイズを有していることが望ましい。すなわち、マイクログリッド５２は、微小な培養空間を形成できるサイズに設定することが望ましく、例えば開口面積が４．０×１０^－２１．０×１０^－１ｍｍ^２、容積が４．０×１０^－３～１．０×１０^－２ｍｍ^３の範囲から選ばれるサイズ、より望ましくは開口面積が１．０×１０^－３～１．０×１０^－１ｍｍ^２、容積が２．０×１０^－５～１．０×１０^－２ｍｍ^３の範囲から選ばれるサイズに設定することができる。

【0054】

単一細胞Ｃの吐出に先立ち、第２プレート５には所定量の液体培地ＬＡが投入される。液体培地ＬＡの投入量は、図９に示すように、マイクログリッド５２を区画する側板５２１の頂部５２２よりも上方に液面が達する量である。換言すると、マイクログリッド５２の上面開口部よりも上方に液面が位置する量の液体培地ＬＡが、予め第２プレート５のグリッド５１に注液される。なお、各マイクログリッド５２の頂部５２２は同じ高さ位置にある。

【0055】

その後、吸引チップ２３から、高抗体産生細胞株であるとして選別された一つのマイクログリッド１２分の単一細胞Ｃが、第２プレート５へ吐出される。この吐出は、図９に示すように、吸引チップ２３の先端開口２３Ｔをグリッド５１の開口に対向させ、先端開口２３Ｔに正の吐出圧を発生させることで実現される。もちろん、先端開口２３Ｔをグリッド５１内の液体培地ＬＡの上層部に突入させて前記吐出を行っても良いし、先端開口２３Ｔをマイクログリッド５２の内部まで進入させて前記吐出を行っても良い。この吐出により、一つのグリッド５１が備える複数のマイクログリッド５２のうち、少なくとも一部のマイクログリッド５２に１個または複数個の単一細胞Ｃが保持される。

【0056】

［工程Ｓ７；培地吸引による極小培養環境の確立］
工程Ｓ７は、第２プレート５の液体培地ＬＡを吸引して、マイクログリッド５２単位で独立した単一細胞Ｃの培養環境を確立する工程である。ここで確立される培養環境は、培養エリアが極めて小さい培養環境である。図１０は、工程Ｓ７の動作を示す模式的な断面図である。図１０では、吸液チップ２４により、グリッド５１内の液体培地ＬＡが吸引されている様子が示されている。

【0057】

吸液チップ２４による前記吸引は、図９の状態から、グリッド５１の液体培地ＬＡの液面が、マイクログリッド５２の側板５２１の頂部５２２が露出した状態となるまで行われる。すなわち、液体培地ＬＡの液面が、マイクログリッド５２の開口部５２Ｈの高さ位置と略一致するまで、グリッド５１の液体培地ＬＡが除去される。このような吸引により、一つのマイクログリッド５２内の液体培地ＬＡと他のマイクログリッド５２内の液体培地ＬＡとが混ざり合うことが無くなる。つまり、個々のマイクログリッド５２内の液体培地ＬＡからなる、単一細胞Ｃのための培養エリアが極めて小さい培養環境が形成される。一つのマイクログリッド５２内の液体培地ＬＡの量は、例えば４ナノリットルである。

【0058】

広大な培養環境に１個～１０個程度の少数の単一細胞Ｃを投入する極少培養環境では、当該単一細胞Ｃは増殖し難い。例えば、図１０において側板５２１を取り除いてマイクログリッド５２の区画を無くしたグリッド５１に液体培地ＬＡを注液し、単一細胞Ｃを投入して所定の培養期間を与えても、当該単一細胞Ｃは増殖し難い。一方、液体培地ＬＡが４ナノリットル程度の培養環境に１個～１０個程度の単一細胞Ｃを投入して培養すると、細胞同士が隣接し易いことも相俟って、当該単一細胞Ｃの増殖が促進される傾向が出る。工程Ｓ６の細胞吐出では、液体培地ＬＡの液面が開口部５２Ｈよりも上位にある方が、１回の吐出動作でマイクログリッド５２に単一細胞Ｃを保持させ得るので好都合である。その後の工程Ｓ７で培地吸引を行うことにより、マイクログリッド５２単位で隔離された、少数の単一細胞Ｃの培養・増殖に適した培養環境を確立することができる。

【0059】

［工程Ｓ８；マイクログリッドの封止］
工程Ｓ８は、封止液７を第２プレート５に注液して、マイクログリッド５２の開口部５２Ｈの上方を封止する工程である。図１１は、マイクログリッド５２の開口部５２Ｈが、封止液７で封止された状況を示す模式的な断面図である。封止液７の下面は、マイクログリッド５２の側板５２１の頂部５２２に接し、開口部５２Ｈを塞いでいる。すなわち、封止液７によって、液体培地ＬＡおよび単一細胞Ｃが一つのマイクログリッド５２内に閉じ込められた状態となっている。封止液７としては、例えば軽質流動パラフィン等からなる胚培養オイルを用いることができる。

【0060】

封止液７として求められる機能は、マイクログリッド５２内の液体培地ＬＡの蒸発防止機能である。液体培地ＬＡは水分を含むので、封止液７が存在しない場合は前記水分が蒸発してしまう。このため、工程Ｓ９の第２次培養の期間中に、マイクログリッド５２内の液体培地ＬＡの量が減少ないしは枯渇する、浸透圧やｐＨなどの培地状態が変化するなどの不具合が生じる。蒸発防止機能を有する封止液７によって開口部５２Ｈを封止することにより、第２次培養期間中における液体培地ＬＡの蒸発を抑制できる。

【0061】

封止液７の他の望ましい機能は、通気性である。通気性を有する封止液７であれば、マイクログリッド５２の開口部５２Ｈを封止しても、当該マイクログリッド５２内の液体培地ＬＡを大気と連通させることができる。従って、マイクログリッド５２内の単一細胞Ｃの培養環境を健全に維持できる。上掲の胚培養オイルは、前記蒸発防止の機能と前記通気性との双方を備えているので、封止液７として好適である。胚培養オイル以外に、少なくとも蒸発防止機能を有する他の液体、半液体（ゲル）を封止液７として用いても良い。言うまでもないが、液体培地ＬＡよりも比重が軽いことは必要である。

【0062】

封止液７の層が形成されることで、工程Ｓ７で確立した極小培養環境を第２次培養期間中において維持できるようになる。すなわち、マイクログリッド５２内の液体培地ＬＡの蒸発が防止されるだけでなく、外気に含まれる異物、例えば微小な塵埃やカビの胞子、細菌などがマイクログリッド５２内へ侵入することを抑止できる。また、マイクログリッド５２内で培養されている単一細胞Ｃが発する活性物質の拡散を防止し、単一細胞Ｃの増殖を促進できる利点もある。

【0063】

［工程Ｓ９；第２次培養］
工程Ｓ９は、図１１の通り封止液７でマイクログリッド５２の開口部５２Ｈを封止した状態で、所定の培養期間だけ単一細胞Ｃの培養を行う工程である。つまり、工程Ｓ４で高抗体産生細胞株として特定された単一細胞Ｃを、さらに所定期間だけ第２次培養して増殖させることで、抗体３を多量に産生させる工程である。第２次培養の期間中、成長因子を含む液体培地がグリッド５１に補填される。

【0064】

図１２は、第２プレート５での第２次培養における、単一細胞Ｃの増殖状況を示す画像である。図中の「Ｄａｙ１」は、第２次培養の開始から１日目の状態を意味する。図１２では、一つのグリッド５１が備えるマイクログリッド５２の一部の、第２次培養の開始から１日目、４日目、５日目、６日目、８日目、１１日目および１８日目の画像が示されている。複数のマイクログリッド５２のうち、注目グリッドＧＡにおける単一細胞Ｃの変異状況を見ると、日を追う毎に増殖していることが判る。なお、１１日目～１８日目の間で急激に注目グリッドＧＡの周囲の単一細胞Ｃも増殖しているのは、単純に培養日数が長いことに加え、前記液体培地の補填の際に注目グリッドＧＡから増殖した単一細胞Ｃが隣接するグリッドに入り込んだことも要因である。

【0065】

図１３および図１４は、比較例の培養方法を用いた単一細胞の増殖状況の画像である。図１３は、工程Ｓ７の培地吸引（図１０）を行わず、且つ、工程Ｓ８の胚培養オイルによる封止（図１１）を行わない状態、つまり工程Ｓ６の細胞吐出（図９）の後、直ちに第２次培養を行うようにした、比較例１の画像である。図１３では、第２次培養の開始から１日目、６日目および１１日目の画像が示されている。複数のマイクログリッド５２のうちの注目グリッドＧＡ１における単一細胞Ｃの増殖状況を見ると、１日目～１１日目の間で有意な増殖は生じていないことが判る。

【0066】

図１４は、工程Ｓ７の培地吸引（図１０）を行わずに、工程Ｓ８の胚培養オイルによる封止を行った状態、つまり工程Ｓ６の細胞吐出（図９）の後、液体培地ＬＡの液面が頂部５２２よりも高い位置にある状態で封止液７を注液し、第２次培養を行った比較例２の画像である。図１４でも、第２次培養の開始から１日目、６日目および１１日目の画像が示されている。複数のマイクログリッド５２のうちの注目グリッドＧＡ２における単一細胞Ｃの増殖状況を見ると、１日目～１１日目の間で有意な増殖は生じていないことが判る。

【0067】

［作用効果］
以上説明した本実施形態に係る抗体産生細胞の培養方法によれば、次のような作用効果を奏する。先ず、工程Ｓ５のピッキング前の第１次培養において、一個の単一細胞Ｃを第１プレート１の一つのマイクログリッド１２に保持させた後、当該マイクログリッド１２内の液体培地ＬＡがゲル化される。液体培地ＬＡのゲル化により、一つのマイクログリッド１２内に一つの単一細胞Ｃが閉じ込められた状態を形成できる。この状態で、単一細胞Ｃを所定の抗体産生期間だけ第１次培養することで、マイクログリッド１２毎に細胞増殖ならびに抗体３の産生を行わせることができる。そして、第１プレート１に検出用抗体４を添加することで、マイクログリッド１２単位で抗体産生量を評価できる。培地のゲル化によって単一細胞Ｃの浮遊が抑止されているので、検出用抗体４が多く検出されるマイクログリッド１２には、高抗体産生細胞株が保持されていることになる。このように、マイクログリッド１２単位で単一細胞Ｃの培養、抗体３の産生ならびに抗体産生量の検出が可能となるので、抗体産生量の高い細胞株を効率的に特定することができる。

【0068】

次に工程Ｓ５のピッキング後の第２次培養においては、第２プレート５のマイクログリッド５２に単一細胞Ｃを保持させた後、液体培地ＬＡを除去して封止液７で開口部５２Ｈを封止する。これにより、マイクログリッド５２内の液体培地ＬＡの蒸発を防ぎつつ、マイクログリッド５２単位で閉じられた極めて小さい培養環境を構築できる。狭小な培養領域で単一細胞Ｃを培養することで、当該単一細胞Ｃの増殖が促進される。従って、優れた抗体産生能を有する単一細胞Ｃをピッキングして上記の通り第２次培養することで、単一細胞Ｃの増殖の効率化を図ることができ、ひいては抗体３を多量に産生させることができる。

【符号の説明】

【0069】

Ｃ 単一細胞
ＬＡ 液体培地
ＬＢ ゲル培地
１ 第１プレート（プレート）
１１ グリッド（大区画部）
１２ マイクログリッド（収容部／小区画部）
２Ｌ 細胞懸濁液
２３ 吸引チップ
３ 抗体
４ 検出用抗体
５ 第２プレート（他の容器）

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】