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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024086264
(43)【公開日】2024-06-27
(54)【発明の名称】核酸内グアニン塩基結合性蛍光色素
(51)【国際特許分類】
C09B 19/00 20060101AFI20240620BHJP
C07D 498/04 20060101ALI20240620BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20240620BHJP
【ＦＩ】
C09B19/00 CSP
C07D498/04 111
C12N15/11 Z ZNA
【審査請求】未請求
【請求項の数】2
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022201302
(22)【出願日】2022-12-16
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和３年度、国立研究開発法人科学技術振興機構、創発的研究支援事業 創発的研究支援、「革新的化学ツールによるＲＮＡ機能の制御と理解」委託研究、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】504157024
【氏名又は名称】国立大学法人東北大学
(74)【代理人】
【識別番号】100165179
【弁理士】
【氏名又は名称】田▲崎▼ 聡
(74)【代理人】
【識別番号】100188558
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100175824
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100152272
【弁理士】
【氏名又は名称】川越 雄一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100181722
【弁理士】
【氏名又は名称】春田 洋孝
(72)【発明者】
【氏名】鬼塚 和光
(72)【発明者】
【氏名】長澤 瞭佑
(72)【発明者】
【氏名】岩田 遼平
(72)【発明者】
【氏名】村瀬 裕貴
(72)【発明者】
【氏名】永次 史
【テーマコード（参考）】
4C072
【Ｆターム（参考）】
4C072AA01
4C072AA06
4C072BB02
4C072BB06
4C072CC03
4C072CC11
4C072EE07
4C072FF09
4C072GG07
4C072HH04
4C072HH07
4C072JJ03
4C072UU10
(57)【要約】
【課題】ＲＮＡやＤＮＡに対する選択性と結合力に優れる水素結合認識型の核酸内グアニン塩基結合性蛍光色素を提供する。
【解決手段】Ｘ－Ｙ－Ｚで表される化合物からなり、Ｘは１，３－ジアザフェノキサジン誘導体、Ｙはリンカー、Ｚは標識物質である、核酸内グアニン塩基結合性蛍光色素。
【選択図】なし
【解決手段】Ｘ－Ｙ－Ｚで表される化合物からなり、Ｘは１，３－ジアザフェノキサジン誘導体、Ｙはリンカー、Ｚは標識物質である、核酸内グアニン塩基結合性蛍光色素。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｘ－Ｙ－Ｚで表される化合物からなり、
Ｘは１，３－ジアザフェノキサジン誘導体、Ｙはリンカー、Ｚは標識物質である、核酸内グアニン塩基結合性蛍光色素。
Ｘは１，３－ジアザフェノキサジン誘導体、Ｙはリンカー、Ｚは標識物質である、核酸内グアニン塩基結合性蛍光色素。
【請求項2】
下記の化学式（１）または下記の化学式（２）で表される、請求項１に記載の核酸内グアニン塩基結合性蛍光色素。
（式中、Ｒは炭素数１～６の置換基を有していてもよいアルキル基、フェニル基、ベンジル基およびフェネチル基からなる群から選択されるいずれか１種であり、ｎ＝１～５の整数である。）
（式中、Ｒは炭素数１～６の置換基を有していてもよいアルキル基、フェニル基、ベンジル基およびフェネチル基からなる群から選択されるいずれか１種であり、ｎ＝１～５の整数である。）
【化1】
【化2】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、核酸内グアニン塩基結合性蛍光色素に関する。
【背景技術】
【0002】
リボ核酸（ＲＮＡ）やデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）に選択的に結合する蛍光分子は、ＲＮＡやＤＮＡの検出プローブとして生化学、分析化学、疾病診断分野等において極めて重要である。
【0003】
ＲＮＡ非存在またはＲＮＡ存在下において、ＯＦＦ／ＯＮ型蛍光応答を示す１，３－ジアザフェノキサジン誘導体（Ｇ－ｃｌａｍｐ）のダイマーが、Ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡに対してｎｍｏｌ／Ｌの結合力を示すことが知られている（例えば、非特許文献１参照）。Ｇ－ｃｌａｍｐのダイマーの蛍光応答は、Ｇ－ｃｌａｍｐにチアゾールオレンジ（ＴＯ）系の化合物をコンジュゲートさせた化合物（ＴＯ－Ｇ－ｃｌａｍｐ）よりも不明瞭である。
【0004】
ＤＮＡ中の８－オキソ－デオキシグアノシンを認識する蛍光プローブとしては、Ｇ－ｃｌａｍｐにリボースや塩基をコンジュゲートさせた構造を有するＧ－ｃｌａｍｐ誘導体が知られている（例えば、特許文献１参照）。
【0005】
ＲＮＡ二重鎖の溝に結合するペプチド核酸（ＰＮＡ）をベースとした骨格に、蛍光色素としてチアゾールオレンジを導入したプローブが知られている（例えば、特許文献２参照）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】国際公開第２０１２／０７７８００号
【特許文献2】特開２０２１－２３２９１号公報
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Ｍｕｒａｓｅ，Ｈｉｒｏｔａｋａ、Ｎａｇａｔｓｕｇｉ，Ｆｕｍｉ、“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ＲＮＡ ｈｉｇｈｅｒ－ｏｒｄｅｒ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｇｕａｎｉｎｅ－ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ｔｈｅ Ｇ－ｃｌａｍｐ”、Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２０１９年、第２９巻、第１１号、ｐ．１３２０－１３２４。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
しかしながら、ＲＮＡ検出プローブやＤＮＡ検出プローブとして一般的に使用される化合物は、ＲＮＡやＤＮＡに対する選択性と結合力に改善の余地があった。また、既存のプローブはほとんどがインターカレーターであり、蛍光指示薬競合置換アッセイの観点から、結合様式の多様化が求められていた。
【0009】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、ＲＮＡやＤＮＡに対する選択性と結合力に優れる水素結合認識型の核酸内グアニン塩基結合性蛍光色素を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明は、以下の態様を有する。
［１］Ｘ－Ｙ－Ｚで表される化合物からなり、
Ｘは１，３－ジアザフェノキサジン誘導体、Ｙはリンカー、Ｚは標識物質である、核酸内グアニン塩基結合性蛍光色素。
［１］Ｘ－Ｙ－Ｚで表される化合物からなり、
Ｘは１，３－ジアザフェノキサジン誘導体、Ｙはリンカー、Ｚは標識物質である、核酸内グアニン塩基結合性蛍光色素。
【0011】
［２］下記の化学式（１）または下記の化学式（２）で表される、［１］に記載の核酸内グアニン塩基結合性蛍光色素。
【0012】
【化1】
【0013】
【化2】
【発明の効果】
【0014】
本発明によれば、ＲＮＡやＤＮＡに対する選択性と結合力に優れる水素結合認識型の核酸内グアニン塩基結合性蛍光色素を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】実施例３において、化合物２３の蛍光滴定スペクトルを示す図である。
【図2】実施例３において、化合物２３の蛍光滴定スペクトルの強度比とＲＮＡの濃度との関係を示す図である。
【図3】比較例１において、化合物６０の蛍光滴定スペクトルを示す図である。
【図4】比較例１において、化合物６０の蛍光滴定スペクトルの強度比とＲＮＡの濃度との関係を示す図である。
【図5】実施例４において、ＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅを添加する前の細胞培養液の蛍光顕微鏡像を示す図である。
【図6】実施例４において、ＤＮａｓｅを添加した後の細胞培養液の蛍光顕微鏡像を示す図である。
【図7】実施例４において、ＲＮａｓｅを添加した後の細胞培養液の蛍光顕微鏡像を示す図である。
【図8】実施例５において、化合物６１の蛍光滴定スペクトルを示す図である。
【図9】実施例５において、化合物６１の蛍光滴定スペクトルの強度比とＲＮＡの濃度との関係を示す図である。
【図10】実施例６において、化合物６２の蛍光滴定スペクトルを示す図である。
【図11】実施例６において、化合物６２の蛍光滴定スペクトルの強度比とＲＮＡの濃度との関係を示す図である。
【図12】実施例７において、化合物６３の蛍光滴定スペクトルを示す図である。
【図13】実施例７において、化合物６３の蛍光滴定スペクトルの強度比とＲＮＡの濃度との関係を示す図である。
【図14】実施例８において、ＤＮａｓｅを添加する前の細胞培養液の蛍光顕微鏡像を示す図である。
【図15】実施例８において、ＤＮａｓｅを添加した後の細胞培養液の蛍光顕微鏡像を示す図である。
【図16】実施例９において、ＲＮａｓｅを添加する前の細胞培養液の蛍光顕微鏡像を示す図である。
【図17】実施例９において、ＲＮａｓｅを添加した後の細胞培養液の蛍光顕微鏡像を示す図である。
【図18】実施例１０において、ＲＮＡとしてｈｓａ－ｍｉｒ－４５２０－１（配列番号１）を用いた場合の蛍光滴定スペクトルを示す図である。
【図20】実施例１０において、ＤＮＡとしてｄｓ－ＤＮＡ（配列番号１２、配列番号１３）を用いた場合の蛍光滴定スペクトルを示す図である。
【図22】実施例１１において、ＲＮＡとしてｈｓａ－ｍｉｒ－４５２０－１（配列番号１）を用いた場合の蛍光滴定スペクトルを示す図である。
【図25】実施例１１において、ＤＮＡとしてｄｓ－ＤＮＡ（配列番号１２、配列番号１３）を用いた場合の蛍光滴定スペクトルを示す図である。
【図27】実施例１２において、化合物６４の蛍光滴定スペクトルを示す図である。
【図28】実施例１２において、化合物６４の蛍光滴定スペクトルの強度比とＲＮＡの濃度との関係を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0016】
本発明の核酸内グアニン塩基結合性蛍光色素の実施の形態について説明する。
なお、本実施の形態は、発明の趣旨をより良く理解させるために具体的に説明するものであり、特に指定のない限り、本発明を限定するものではない。
本実施の形態において、ＲＮＡ（リボ核酸）およびＤＮＡ（デオキシリボ核酸）のヌクレオチド配列は、５’末端側から３’末端側に向かって記載する。ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、ＲＮＡについては、Ａ＝アデニル酸、Ｃ＝シチジル酸、Ｇ＝グアニル酸、及びＵ＝ウリジル酸を用い、ＤＮＡについては、Ａ＝デオキシアデニル酸、Ｃ＝デオキシシチジル酸、Ｇ＝デオキシグアニル酸、およびＴ＝デオキシチミジル酸を用いて表す。
なお、本実施の形態は、発明の趣旨をより良く理解させるために具体的に説明するものであり、特に指定のない限り、本発明を限定するものではない。
本実施の形態において、ＲＮＡ（リボ核酸）およびＤＮＡ（デオキシリボ核酸）のヌクレオチド配列は、５’末端側から３’末端側に向かって記載する。ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、ＲＮＡについては、Ａ＝アデニル酸、Ｃ＝シチジル酸、Ｇ＝グアニル酸、及びＵ＝ウリジル酸を用い、ＤＮＡについては、Ａ＝デオキシアデニル酸、Ｃ＝デオキシシチジル酸、Ｇ＝デオキシグアニル酸、およびＴ＝デオキシチミジル酸を用いて表す。
【0017】
［核酸内グアニン塩基結合性蛍光色素］
本発明の一実施形態に係る核酸内グアニン塩基結合性蛍光色素は、Ｘ－Ｙ－Ｚで表される化合物からなる。前記Ｘは、１，３－ジアザフェノキサジン誘導体（Ｇ－ｃｌａｍｐ）である。前記Ｙは、リンカーである。前記Ｚは、標識物質である。
本発明の一実施形態に係る核酸内グアニン塩基結合性蛍光色素は、Ｘ－Ｙ－Ｚで表される化合物からなる。前記Ｘは、１，３－ジアザフェノキサジン誘導体（Ｇ－ｃｌａｍｐ）である。前記Ｙは、リンカーである。前記Ｚは、標識物質である。
【0018】
「Ｘ：１，３－ジアザフェノキサジン誘導体」
１，３－ジアザフェノキサジン誘導体は、下記の化学式（３）で表される化合物である。１，３－ジアザフェノキサジン誘導体は、水素結合を形成していない核酸中のグアニン（Ｇ）、特に、ＲＮＡヘアピンループ構造中のグアニン（Ｇ）やＤＮＡヘアピンループ構造中のグアニン（Ｇ）を認識して、選択的に結合する。
１，３－ジアザフェノキサジン誘導体は、下記の化学式（３）で表される化合物である。１，３－ジアザフェノキサジン誘導体は、水素結合を形成していない核酸中のグアニン（Ｇ）、特に、ＲＮＡヘアピンループ構造中のグアニン（Ｇ）やＤＮＡヘアピンループ構造中のグアニン（Ｇ）を認識して、選択的に結合する。
【0019】
【化3】
【0020】
上記の化学式（３）中、Ｙはリンカー、Ｚは標識物質からなる。
【0021】
「Ｙ：リンカー」
リンカーは、１，３－ジアザフェノキサジン誘導体と標識物質の間に介在し、１，３－ジアザフェノキサジン誘導体と標識物質を結合（架橋）する物質である。リンカーは、１，３－ジアザフェノキサジン誘導体の活性や、標識物質の活性には影響を及ぼさない。
リンカーは、１，３－ジアザフェノキサジン誘導体と標識物質の間に介在し、１，３－ジアザフェノキサジン誘導体と標識物質を結合（架橋）する物質である。リンカーは、１，３－ジアザフェノキサジン誘導体の活性や、標識物質の活性には影響を及ぼさない。
【0022】
リンカーとしては、１，３－ジアザフェノキサジン誘導体と標識物質を結合し、１，３－ジアザフェノキサジン誘導体および標識物質の活性に影響を及ぼさないものであれば特に限定されないが、例えば、－（Ｃ２Ｈ４－Ｏ）ｎ－Ｃ２Ｈ４－ＣＯＮＨ－（ＣＨ２）ｍ（ｎは１～５の整数であり、好ましくは３～４であり、より好ましくは３である。ｍは２～８の整数であり、好ましくは４～６である。）及び－（Ｃ２Ｈ４－Ｏ）ｎ－Ｃ２Ｈ４－トリアゾール－（ＣＨ２）ｍ（ｎは１～５の整数であり、好ましくは３～４であり、より好ましくは３である。ｍは２～８の整数であり、好ましくは４～６である。）が挙げられる。
【0023】
本実施形態の核酸内グアニン塩基結合性蛍光色素において、リンカーは、１，３－ジアザフェノキサジン誘導体および標識物質と等モル存在する。
【0024】
「標識物質」
標識物質としては、蛍光色素が挙げられる。
標識物質としては、標識物質としては、ＲＮＡに結合することで、蛍光性がオンになるライトアップ蛍光性を示すものであれば特に限定されないが、例えば、下記の化学式（４）で表されるチアゾールオレンジ（ＴＯ）系の化合物、または下記の化学式（５）で表されるチアゾールオレンジ（ＴＯ３）系の化合物が挙げられる。
標識物質としては、蛍光色素が挙げられる。
標識物質としては、標識物質としては、ＲＮＡに結合することで、蛍光性がオンになるライトアップ蛍光性を示すものであれば特に限定されないが、例えば、下記の化学式（４）で表されるチアゾールオレンジ（ＴＯ）系の化合物、または下記の化学式（５）で表されるチアゾールオレンジ（ＴＯ３）系の化合物が挙げられる。
【0025】
【化4】
【0026】
【化5】
【0027】
本実施形態の核酸内グアニン塩基結合性蛍光色素において、標識物質は、１，３－ジアザフェノキサジン誘導体およびリンカーと等モル存在する。
【0028】
リンカーは活性に影響を及ぼさないもの、標識物質はＲＮＡに結合することで、蛍光性がオンになるライトアップ蛍光性を示すものであれば特に限定されないが、本実施形態の核酸内グアニン塩基結合性蛍光色素は、下記の化学式（１）または下記の化学式（２）で表される化合物であることが好ましい。
【0029】
【化6】
【0030】
【化7】
【0031】
上記の化学式（１）または上記の化学式（２）において、結合力、選択性の観点から、ｎは１～５の整数であり、好ましくは３～４であり、より好ましくは３である。
本実施形態の核酸内グアニン塩基結合性蛍光色素は、下記の化学式（６）で表される化合物であってもよい。
本実施形態の核酸内グアニン塩基結合性蛍光色素は、下記の化学式（６）で表される化合物であってもよい。
【0032】
【化8】
【0033】
上記の化学式（６）において、結合力、選択性の観点から、ｎは１～５の整数であり、好ましくは３～４であり、より好ましくは３である。
上記の化学式（１）で表される化合物の具体例としては、下記の化学式（７）で表される化合物が挙げられる。化学式（７）中、Ｍｅはメチル基を表す。
上記の化学式（１）で表される化合物の具体例としては、下記の化学式（７）で表される化合物が挙げられる。化学式（７）中、Ｍｅはメチル基を表す。
【0034】
【化9】
【0035】
上記の化学式（２）で表される化合物の具体例としては、下記の化学式（８）で表される化合物が挙げられる。化学式（８）中、Ｍｅはメチル基を表す。
【0036】
【化10】
【0037】
本実施形態の核酸内グアニン塩基結合性蛍光色素は、下記の化学式（９）に示すように、１，３－ジアザフェノキサジン誘導体は、水素結合を形成していない核酸中のグアニン（Ｇ）、特に、ＲＮＡヘアピンループ構造中のグアニン（Ｇ）やＤＮＡヘアピンループ構造中のグアニン（Ｇ）を認識して、選択的に結合する。
【0038】
【化11】
【0039】
また、本実施形態の核酸内グアニン塩基結合性蛍光色素は、励起光を照射すると、チアゾールオレンジ系の化合物が蛍光を発する。
【0040】
本実施形態の核酸内グアニン塩基結合性蛍光色素が結合可能なＲＮＡとしては、例えば、ｈｓａ－ｍｉｒ－４５２０－１（配列番号１：ＣＣＡＡＡＵＣＡＧＡＡＡＡＧＧＡＵＵＵＧＧ）、ｈｓａ－ｍｉｒ－１２５ａ（配列番号２：ＣＵＧＵＧＡＧＧＡＣＡＵＣＣＡＧＧＧＵＣＡＣＡＧ）、ｈｓａ－ｍｉｒ－４２９１（配列番号３：ＡＧＣＵＧＧＧＵＧＧＡＧＧＣＡＧＡＧＣＵ）、ｈｓａ－ｍｉｒ－５２６ａ－１（配列番号４：ＵＣＵＧＵＵＧＣＵＵＧＡＡＡＧＡＡＧＡＧＡ）、ｈｓａ－ｍｉｒ－１０５－１（配列番号５：ＣＵＧＵＧＧＵＧＧＣＵＧＣＵＣＡＵＧＣＡＣＣＡＣＧＧ）、ｈｓａ－ｍｉｒ－１００（配列番号６：ＣＵＵＧＵＧＧＵＡＵＵＡＧＵＣＣＧＣＡＣＡＡＧ）、ｈｓａ－ｍｉｒ－５４８ｂａ（配列番号７：ＵＧＣＵＡＵＵＡＧＡＡＡＧＵＡＡＵＧＧＣＡ）、ｈｓａ－ｍｉｒ－６７８６（配列番号８：ＧＣＧＵＣＡＣＧＵＧＣＡＣＣＣＡＡＧＵＧＡＣＧＣ）、ｈｓａ－ｍｉｒ－２９９（配列番号９：ＣＡＵＡＣＡＵＵＵＵＧＡＡＵＡＵＧＵＡＵＧ）、ｈｓａ－ｍｉｒ－４７７３－１（配列番号１０：ＵＣＵＧＣＵＵＵＡＵＵＵＣＡＵＣＡＡＡＧＣＡＧＡ）、ｈｓａ－ｍｉｒ－４２８２（配列番号１１：ＵＵＵＡＧＵＡＵＧＣＣＡＣＡＵＵＵＣＵＡＡＡ）等が挙げられる。
【0041】
［核酸内グアニン塩基結合性蛍光色素の製造方法］
本実施形態の核酸内グアニン塩基結合性蛍光色素の製造方法は、実施例に示す通りである。
本実施形態の核酸内グアニン塩基結合性蛍光色素の製造方法は、実施例に示す通りである。
【0042】
本実施形態の核酸内グアニン塩基結合性蛍光色素によれば、水素結合を形成していないグアニン塩基を含むＲＮＡやＤＮＡに対する選択性と結合力に優れる核酸内グアニン塩基結合性蛍光色素を提供することができる。また、本実施形態の核酸内グアニン塩基結合性蛍光色素によれば、水素結合を形成していないグアニン塩基を含むＲＮＡまたはＤＮＡの検出限界がｎｍｏｌ／Ｌオーダーであり、従来のＲＮＡまたはＤＮＡの検出試薬よりも高感度に検出することができる。また、本実施形態の核酸内グアニン塩基結合性蛍光色素によれば、従来の細胞内ＲＮＡ検出試薬と蛍光の強度と結合選択性が同等以上であるため、細胞内ＲＮＡを選択的かつ高感度に検出できる。本実施形態の核酸内グアニン塩基結合性蛍光色素によれば、蛍光指示薬競合置換アッセイにおいて従来のＲＮＡまたはＤＮＡの検出試薬では検出できなかった化合物を検出でき、さらに非特異的な結合も見出すことができる。また、本実施形態の核酸内グアニン塩基結合性蛍光色素によれば、標識物質としては、蛍光色素を変えることにより、蛍光の波長、強さ、選択性を制御することができる。
【実施例0043】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0044】
［実施例１］
「核酸内グアニン塩基結合性蛍光色素の合成」
下記の式（１０）で表される反応により、化合物１１を合成した。
ジクロロメタン１９ｍＬ中に５－アミノ－１－ペンタノール（化合物１２）（１．０１ｇ、９．７５ｍｍｏｌ）を含む溶液に、トリエチルアミン（１．１ｇ、１１ｍｍｏｌ）を添加した。
得られた反応混合物を０℃に冷却し、二炭酸ジ－ｔｅｒｔ－ブチル（２．４ｇ、１１ｍｍｏｌ）を加えて攪拌した。
６分後、二炭酸ジ－ｔｅｒｔ－ブチを加えた反応混合物の温度を室温（２５℃）に上げて、２０時間撹拌した。
反応混合物に、水（５０ｍＬ）とクロロホルム（５０ｍＬ）を加え、有機層と水層を分離して、水層をクロロホルム（３０ｍＬ×３回）で抽出した。
有機層を合わせて、硫酸ナトリウムで乾燥させた。
溶液をろ過し、減圧下で濃縮した。
粗生成物（３．４８ｇ）をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝２／１から１／１から１／２）で精製して、化合物１１を無色油として得た（１．７４ｇ、収率８８％）。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲおよびＥＳＩ－ＨＲＭＳの測定データを以下に示す。
１Ｈ－ＮＭＲデータ（５００ＭＨｚ、溶媒：ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３９（２Ｈ，ｍ），１．４３（９Ｈ，ｓ），１．５１（２Ｈ，ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．５９（２Ｈ，ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），３．１２（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），３．６４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），４．５５（１Ｈ，ｂｒ ｓ）。
ＥＳＩ－ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１０Ｈ２２ＮＯ３＋、２０４．１５９４、ｆｏｕｎｄ ２０４．１５７８。
上記の測定データから、下記の式（１０）に示す化合物１１が得られていることが確認された。
「核酸内グアニン塩基結合性蛍光色素の合成」
下記の式（１０）で表される反応により、化合物１１を合成した。
ジクロロメタン１９ｍＬ中に５－アミノ－１－ペンタノール（化合物１２）（１．０１ｇ、９．７５ｍｍｏｌ）を含む溶液に、トリエチルアミン（１．１ｇ、１１ｍｍｏｌ）を添加した。
得られた反応混合物を０℃に冷却し、二炭酸ジ－ｔｅｒｔ－ブチル（２．４ｇ、１１ｍｍｏｌ）を加えて攪拌した。
６分後、二炭酸ジ－ｔｅｒｔ－ブチを加えた反応混合物の温度を室温（２５℃）に上げて、２０時間撹拌した。
反応混合物に、水（５０ｍＬ）とクロロホルム（５０ｍＬ）を加え、有機層と水層を分離して、水層をクロロホルム（３０ｍＬ×３回）で抽出した。
有機層を合わせて、硫酸ナトリウムで乾燥させた。
溶液をろ過し、減圧下で濃縮した。
粗生成物（３．４８ｇ）をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝２／１から１／１から１／２）で精製して、化合物１１を無色油として得た（１．７４ｇ、収率８８％）。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲおよびＥＳＩ－ＨＲＭＳの測定データを以下に示す。
１Ｈ－ＮＭＲデータ（５００ＭＨｚ、溶媒：ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．３９（２Ｈ，ｍ），１．４３（９Ｈ，ｓ），１．５１（２Ｈ，ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ），１．５９（２Ｈ，ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），３．１２（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），３．６４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．５Ｈｚ），４．５５（１Ｈ，ｂｒ ｓ）。
ＥＳＩ－ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１０Ｈ２２ＮＯ３＋、２０４．１５９４、ｆｏｕｎｄ ２０４．１５７８。
上記の測定データから、下記の式（１０）に示す化合物１１が得られていることが確認された。
【0045】
【化12】
【0046】
下記の式（１１）で表される反応により、化合物１３を合成した。
ヨウ素（２．６２ｇ、１０．３ｍｍｏｌ）を含むジクロロメタン（７．０ｍＬ）溶液に、トリフェニルホスフィン（３．３８ｇ、１２．９ｍｍｏｌ）とイミダゾール（０．８７７ｇ、１２．９ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。
得られた混合物に、化合物１１（１．７４ｇ、８．５６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１０ｍＬ）溶液を加え、次いで、混合物を室温（２５℃）に上げて、１５時間撹拌した。
混合物に、チオ硫酸ナトリウム水和物（５０ｍＬ）とジクロロメタン（５０ｍＬ）を加え、有機層と水層を分離して、水層をジクロロメタン（５０ｍＬ）で抽出した。
有機層を合わせて、飽和食塩水で洗浄した。
チオ硫酸ナトリウム水和物（５０ｍＬ）とブライン（５０ｍＬ）を加えて、硫酸ナトリウムで乾燥させた。
溶液をろ過し、減圧下で濃縮した。
粗生成物（６．４１ｇ）をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝８／１から４／１）で精製して、化合物１３を無色油として得た（２．２６ｇ、収率８４％）。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲおよびＥＳＩ－ＨＲＭＳの測定データを以下に示す。
１Ｈ－ＮＭＲデータ（４００ＭＨｚ、溶媒：ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．４１（２Ｈ，ｍ），１．４４（９Ｈ，ｓ），１．４９（２Ｈ，ｍ），１．８４（２Ｈ，ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），３．１２（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），３．１８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），４．５２（１Ｈ，ｂｒ ｓ）。
ＥＳＩ－ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１０Ｈ２０ＩＮＮａＯ２ ＋、３３６．０４２１、ｆｏｕｎｄ ３３６．０４２３。
上記の測定データから、下記の式（１１）に示す化合物１３が得られていることが確認された。
ヨウ素（２．６２ｇ、１０．３ｍｍｏｌ）を含むジクロロメタン（７．０ｍＬ）溶液に、トリフェニルホスフィン（３．３８ｇ、１２．９ｍｍｏｌ）とイミダゾール（０．８７７ｇ、１２．９ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。
得られた混合物に、化合物１１（１．７４ｇ、８．５６ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（１０ｍＬ）溶液を加え、次いで、混合物を室温（２５℃）に上げて、１５時間撹拌した。
混合物に、チオ硫酸ナトリウム水和物（５０ｍＬ）とジクロロメタン（５０ｍＬ）を加え、有機層と水層を分離して、水層をジクロロメタン（５０ｍＬ）で抽出した。
有機層を合わせて、飽和食塩水で洗浄した。
チオ硫酸ナトリウム水和物（５０ｍＬ）とブライン（５０ｍＬ）を加えて、硫酸ナトリウムで乾燥させた。
溶液をろ過し、減圧下で濃縮した。
粗生成物（６．４１ｇ）をカラムクロマトグラフィー（ヘキサン／酢酸エチル＝８／１から４／１）で精製して、化合物１３を無色油として得た（２．２６ｇ、収率８４％）。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲおよびＥＳＩ－ＨＲＭＳの測定データを以下に示す。
１Ｈ－ＮＭＲデータ（４００ＭＨｚ、溶媒：ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：１．４１（２Ｈ，ｍ），１．４４（９Ｈ，ｓ），１．４９（２Ｈ，ｍ），１．８４（２Ｈ，ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），３．１２（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），３．１８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），４．５２（１Ｈ，ｂｒ ｓ）。
ＥＳＩ－ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１０Ｈ２０ＩＮＮａＯ２ ＋、３３６．０４２１、ｆｏｕｎｄ ３３６．０４２３。
上記の測定データから、下記の式（１１）に示す化合物１３が得られていることが確認された。
【0047】
【化13】
【0048】
下記の式（１２）で表される反応により、化合物１４を合成した。
アセトニトリル（１２ｍＬ）に２－メチルベンゾチアゾール（化合物１５）（０．５０４ｇ、３．３８ｍｍｏｌ）を加えた溶液に、ヨードメタン（１．０ｇ、７．３ｍｍｏｌ）を加え、この混合物を２３時間還流した。混合物にさらにヨードメタン（０．９１ｇ、６．４ｍｍｏｌ）を加え、１７時間還流した。混合物を室温（２５℃）まで冷却した後、固体をろ過し、酢酸エチル（３０ｍＬ）で洗浄して、化合物１４を白色固体として得た（０．９１４ｇ、収率９３％）。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、およびＥＳＩ－ＨＲＭＳの測定データを以下に示す。
１Ｈ－ＮＭＲデータ（５００ＭＨｚ、溶媒：ＤＭＳＯ－ｄ６）δ（ｐｐｍ）：３．１７（３Ｈ，ｓ），４．２０（３Ｈ，ｓ），７．８１（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝０．８，７．８Ｈｚ），７．９０（２Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１．２，８．０Ｈｚ），８．２９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），８．４４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）。
ＥＳＩ－ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ９Ｈ１０ＮＳ＋、１６４．０５２８、ｆｏｕｎｄ １６４．０５３４。
上記の測定データから、下記の式（１２）で表される化合物１４が得られていることが確認された。
アセトニトリル（１２ｍＬ）に２－メチルベンゾチアゾール（化合物１５）（０．５０４ｇ、３．３８ｍｍｏｌ）を加えた溶液に、ヨードメタン（１．０ｇ、７．３ｍｍｏｌ）を加え、この混合物を２３時間還流した。混合物にさらにヨードメタン（０．９１ｇ、６．４ｍｍｏｌ）を加え、１７時間還流した。混合物を室温（２５℃）まで冷却した後、固体をろ過し、酢酸エチル（３０ｍＬ）で洗浄して、化合物１４を白色固体として得た（０．９１４ｇ、収率９３％）。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、およびＥＳＩ－ＨＲＭＳの測定データを以下に示す。
１Ｈ－ＮＭＲデータ（５００ＭＨｚ、溶媒：ＤＭＳＯ－ｄ６）δ（ｐｐｍ）：３．１７（３Ｈ，ｓ），４．２０（３Ｈ，ｓ），７．８１（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝０．８，７．８Ｈｚ），７．９０（２Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１．２，８．０Ｈｚ），８．２９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ），８．４４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．５Ｈｚ）。
ＥＳＩ－ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ９Ｈ１０ＮＳ＋、１６４．０５２８、ｆｏｕｎｄ １６４．０５３４。
上記の測定データから、下記の式（１２）で表される化合物１４が得られていることが確認された。
【0049】
【化14】
【0050】
下記の式（１３）で表される反応により、化合物１６を合成した。
化合物１３（２．１０ｇ、６．７１ｍｍｏｌ）およびキノリン（化合物１７）（０．７５ｇ、５．８ミリモル）を丸底フラスコに加えた。この混合物を１００℃で４時間撹拌した。混合物を室温（２５℃）に冷却した後、混合物にアセトニトリル（１３ｍＬ）とトリエチルアミン（０．５８ｇ、５．７ｍｍｏｌ）を加え、０℃に冷却した。二炭酸ジ－ｔｅｒｔ－ブチル（１．２ｇ、５．７ｍｍｏｌ）を撹拌溶液に０℃で加えた。１０分後、温度を室温（２５℃）に上げ、１７時間撹拌した。混合物を減圧下で濃縮し、ジエチルエーテル（３０ｍＬ）でろ過した。固体をジクロロメタン／メタノール＝９／１（５０ｍＬ）で溶解した。ジクロロメタン／メタノール洗浄液を濃縮し、乾燥して、化合物１６を赤色固体として得た（２．４４ｇ、収率８１％）。化合物１６をさらに精製することなく次の反応に使用した。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、およびＥＳＩ－ＨＲＭＳの測定データを以下に示す。
１Ｈ－ＮＭＲデータ（４００ＭＨｚ、溶媒：ＤＭＳＯ－ｄ６）δ（ｐｐｍ）：１．３５（９Ｈ，ｓ），１．４０（４Ｈ，ｍ），１．９７（２Ｈ，ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），２．９０（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），５．０４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），６．８０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），８．０６（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝０．４，７．６Ｈｚ），８．１１９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．６，８．４Ｈｚ），８．２８（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１．５，８．０Ｈｚ），８．４９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．４，８．２Ｈｚ），８．６３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），９．２９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），９．５４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．２，６．０Ｈｚ）。
ＥＳＩ－ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ－Ｈ］＋ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１９Ｈ２７Ｎ２Ｏ２ ＋、３１５．２０６７、ｆｏｕｎｄ ３１５．２０７５。
化合物１３（２．１０ｇ、６．７１ｍｍｏｌ）およびキノリン（化合物１７）（０．７５ｇ、５．８ミリモル）を丸底フラスコに加えた。この混合物を１００℃で４時間撹拌した。混合物を室温（２５℃）に冷却した後、混合物にアセトニトリル（１３ｍＬ）とトリエチルアミン（０．５８ｇ、５．７ｍｍｏｌ）を加え、０℃に冷却した。二炭酸ジ－ｔｅｒｔ－ブチル（１．２ｇ、５．７ｍｍｏｌ）を撹拌溶液に０℃で加えた。１０分後、温度を室温（２５℃）に上げ、１７時間撹拌した。混合物を減圧下で濃縮し、ジエチルエーテル（３０ｍＬ）でろ過した。固体をジクロロメタン／メタノール＝９／１（５０ｍＬ）で溶解した。ジクロロメタン／メタノール洗浄液を濃縮し、乾燥して、化合物１６を赤色固体として得た（２．４４ｇ、収率８１％）。化合物１６をさらに精製することなく次の反応に使用した。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、およびＥＳＩ－ＨＲＭＳの測定データを以下に示す。
１Ｈ－ＮＭＲデータ（４００ＭＨｚ、溶媒：ＤＭＳＯ－ｄ６）δ（ｐｐｍ）：１．３５（９Ｈ，ｓ），１．４０（４Ｈ，ｍ），１．９７（２Ｈ，ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），２．９０（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），５．０４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），６．８０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），８．０６（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝０．４，７．６Ｈｚ），８．１１９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝５．６，８．４Ｈｚ），８．２８（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１．５，８．０Ｈｚ），８．４９（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．４，８．２Ｈｚ），８．６３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），９．２９（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），９．５４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１．２，６．０Ｈｚ）。
ＥＳＩ－ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ－Ｈ］＋ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１９Ｈ２７Ｎ２Ｏ２ ＋、３１５．２０６７、ｆｏｕｎｄ ３１５．２０７５。
【0051】
【化15】
【0052】
下記の式（１４）で表される反応により、化合物１８を合成した。
化合物１６（２．６０ｍｍｏｌ）および化合物１４（０．８９７ｇ、３．０８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（２９ｍＬ）溶液にトリエチルアミン（３．２ｇ、３１ｍｍｏｌ）を加え、室温で１７時間撹拌した。この混合物を減圧下で濃縮し、ろ過し、ジエチルエーテル（６０ｍＬ）および水（３０ｍＬ）で洗浄した。得られた固体をジクロロメタン／メタノール＝２０／１（１００ｍＬ）で溶解し、ろ過した。ジクロロメタン／メタノール洗浄液を濃縮し、乾燥して、化合物１８を赤色固体として得た（１．４８ミリモル、収率４８％）。化合物１８をさらに精製することなく次の反応に使用した。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、およびＥＳＩ－ＨＲＭＳの測定データを以下に示す。
１Ｈ－ＮＭＲデータ（４００ＭＨｚ、溶媒：ＤＭＳＯ－ｄ６）δ（ｐｐｍ）：１．３２－１．４２（４Ｈ，ｍ），１．３５（９Ｈ，ｓ），１．８５（２Ｈ，ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），２．９０（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），４．０３（３Ｈ，ｓ），４．５９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），６．８０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），６．９４（１Ｈ，ｓ），７．３８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），７．４３（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝０．８，７．６Ｈｚ），７．６３（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１．１，７．８Ｈｚ），７．７６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．８０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），８．００（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１．２，７．８Ｈｚ），８．０６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝０．８，８．０Ｈｚ），８．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），８．６３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），８．８１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）。
ＥＳＩ－ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ－Ｉ］＋ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２８Ｈ３４Ｎ３Ｏ２Ｓ＋、４７６．２３６６、ｆｏｕｎｄ ４７６．２３６９。
化合物１６（２．６０ｍｍｏｌ）および化合物１４（０．８９７ｇ、３．０８ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（２９ｍＬ）溶液にトリエチルアミン（３．２ｇ、３１ｍｍｏｌ）を加え、室温で１７時間撹拌した。この混合物を減圧下で濃縮し、ろ過し、ジエチルエーテル（６０ｍＬ）および水（３０ｍＬ）で洗浄した。得られた固体をジクロロメタン／メタノール＝２０／１（１００ｍＬ）で溶解し、ろ過した。ジクロロメタン／メタノール洗浄液を濃縮し、乾燥して、化合物１８を赤色固体として得た（１．４８ミリモル、収率４８％）。化合物１８をさらに精製することなく次の反応に使用した。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、およびＥＳＩ－ＨＲＭＳの測定データを以下に示す。
１Ｈ－ＮＭＲデータ（４００ＭＨｚ、溶媒：ＤＭＳＯ－ｄ６）δ（ｐｐｍ）：１．３２－１．４２（４Ｈ，ｍ），１．３５（９Ｈ，ｓ），１．８５（２Ｈ，ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），２．９０（２Ｈ，ｑ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），４．０３（３Ｈ，ｓ），４．５９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），６．８０（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ），６．９４（１Ｈ，ｓ），７．３８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），７．４３（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝０．８，７．６Ｈｚ），７．６３（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１．１，７．８Ｈｚ），７．７６（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），７．８０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），８．００（１Ｈ，ｄｔ，Ｊ＝１．２，７．８Ｈｚ），８．０６（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝０．８，８．０Ｈｚ），８．１６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ），８．６３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），８．８１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ）。
ＥＳＩ－ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ－Ｉ］＋ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２８Ｈ３４Ｎ３Ｏ２Ｓ＋、４７６．２３６６、ｆｏｕｎｄ ４７６．２３６９。
【0053】
【化16】
【0054】
下記の式（１５）で表される反応により、化合物１９を合成した。
ジクロロメタン（６７μＬ）に化合物１８（４８．５μｍｏｌ）を加えた溶液に、トリフルオロ酢酸（０．６０ｍＬ）を添加し、室温（２５℃）で３．５時間撹拌した。この混合物を減圧下で濃縮して、化合物１９（定量的収率）を赤色固体として得た。化合物１９をさらに精製することなく次の反応に使用した。
ジクロロメタン（６７μＬ）に化合物１８（４８．５μｍｏｌ）を加えた溶液に、トリフルオロ酢酸（０．６０ｍＬ）を添加し、室温（２５℃）で３．５時間撹拌した。この混合物を減圧下で濃縮して、化合物１９（定量的収率）を赤色固体として得た。化合物１９をさらに精製することなく次の反応に使用した。
【0055】
【化17】
【0056】
下記の式（１６）で表される反応により、化合物２０を合成した。
下記の式（１６）に示す化合物２１（５１．８ｍｇ，０．１１４ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１．０ｍＬ）溶液に、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２２．３ｍｇ，０．１７３ｍｍｏｌ）と１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－ベンゾトリアゾリウム３－オキシドヘキサフルオロホスファート（６２．８ｍｇ，０．１６６ｍｍｏｌ）を０℃で加え、撹拌した。この混合物に、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１．７ｍＬ）に化合物２２（４８．３ｍｇ，０．１７４ｍｍｏｌ）を溶かした溶液を加え、室温（２５℃）まで温め、１６時間撹拌した。この混合物を酢酸エチル（４０ｍＬ）で希釈し、飽和塩化アンモニウム水溶液（５ｍＬ×２）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５ｍＬ×２）およびブライン（５ｍＬ）、次いで、硫酸ナトリウムで乾燥させた。この溶液をろ過し、減圧下で濃縮した。粗生成物０．１１６ｇ）をカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝４０／１から３０／１から２０／１）で精製して、化合物２０を黄色の固体（６０．４ｍｇ、収率７４％）として得た。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、１３Ｃ－ＮＭＲおよびＥＳＩ－ＨＲＭＳの測定データを以下に示す。
１Ｈ－ＮＭＲデータ（６００ＭＨｚ、溶媒：ＭｅＯＤ）δ（ｐｐｍ）：１．４３（９Ｈ，ｓ），２．４６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），３．４０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），３．５４（４Ｈ，ｍ），３．６０（８Ｈ，ｍ），３．６８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），４．０３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），４．３８（２Ｈ，ｓ），５．１０（２Ｈ，ｓ），６．３８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），６．５６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４），６．７８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．２１（１Ｈ，ｓ），７．２９（５Ｈ，ｍ）。
１３Ｃ－ＮＭＲデータ（６００ＭＨｚ、溶媒：ＭｅＯＤ）δ（ｐｐｍ）：２７．０，３５．８，３９．２，３９．８，５１．３，６６．２，６６．５，６８．１，６９．１，６９．９，７０．０，７０．１，７０．２，８０．４，１０６．９，１０７．９，１１５．５，１２３．５，１２７．４，１２７．６，１２８．０，１２８．１，１３７．０，１４２．８，１４６．５，１５４．８，１５６．２，１５７．７，１６８．３，１７１．４。
ＥＳＩ－ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３５Ｈ４６Ｎ５Ｏ１１ ＋、７１２．３１８８、ｆｏｕｎｄ ７１２．３１８７。
下記の式（１６）に示す化合物２１（５１．８ｍｇ，０．１１４ｍｍｏｌ）のＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１．０ｍＬ）溶液に、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（２２．３ｍｇ，０．１７３ｍｍｏｌ）と１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－ベンゾトリアゾリウム３－オキシドヘキサフルオロホスファート（６２．８ｍｇ，０．１６６ｍｍｏｌ）を０℃で加え、撹拌した。この混合物に、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（１．７ｍＬ）に化合物２２（４８．３ｍｇ，０．１７４ｍｍｏｌ）を溶かした溶液を加え、室温（２５℃）まで温め、１６時間撹拌した。この混合物を酢酸エチル（４０ｍＬ）で希釈し、飽和塩化アンモニウム水溶液（５ｍＬ×２）、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液（５ｍＬ×２）およびブライン（５ｍＬ）、次いで、硫酸ナトリウムで乾燥させた。この溶液をろ過し、減圧下で濃縮した。粗生成物０．１１６ｇ）をカラムクロマトグラフィー（クロロホルム／メタノール＝４０／１から３０／１から２０／１）で精製して、化合物２０を黄色の固体（６０．４ｍｇ、収率７４％）として得た。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、１３Ｃ－ＮＭＲおよびＥＳＩ－ＨＲＭＳの測定データを以下に示す。
１Ｈ－ＮＭＲデータ（６００ＭＨｚ、溶媒：ＭｅＯＤ）δ（ｐｐｍ）：１．４３（９Ｈ，ｓ），２．４６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），３．４０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），３．５４（４Ｈ，ｍ），３．６０（８Ｈ，ｍ），３．６８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），４．０３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．１Ｈｚ），４．３８（２Ｈ，ｓ），５．１０（２Ｈ，ｓ），６．３８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），６．５６（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４），６．７８（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．２１（１Ｈ，ｓ），７．２９（５Ｈ，ｍ）。
１３Ｃ－ＮＭＲデータ（６００ＭＨｚ、溶媒：ＭｅＯＤ）δ（ｐｐｍ）：２７．０，３５．８，３９．２，３９．８，５１．３，６６．２，６６．５，６８．１，６９．１，６９．９，７０．０，７０．１，７０．２，８０．４，１０６．９，１０７．９，１１５．５，１２３．５，１２７．４，１２７．６，１２８．０，１２８．１，１３７．０，１４２．８，１４６．５，１５４．８，１５６．２，１５７．７，１６８．３，１７１．４。
ＥＳＩ－ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３５Ｈ４６Ｎ５Ｏ１１ ＋、７１２．３１８８、ｆｏｕｎｄ ７１２．３１８７。
【0057】
【化18】
【0058】
下記の式（１７）で表される反応により、化合物２３を合成した。
ジクロロメタン（５０μＬ）に化合物２４（１８．９ｍｇ、２６．６μｍｏｌ）を加えた溶液に、トリフルオロ酢酸（０．３０ｍＬ）を添加し、室温（２５℃）で７時間撹拌した。この混合物を減圧下で蒸発させて、残渣を得た。残渣をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（０．２０ｍＬ）に溶解し、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（３３．４ｍｇ，０．２５８ｍｍｏｌ）と１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－ベンゾトリアゾリウム３－オキシドヘキサフルオロホスファート（１５．２ｍｇ，４０．１μｍｏｌ）を０℃で加えて撹拌した。この混合物に、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（０．４０ｍＬ）に化合物１９（３７．９μｍｏｌ）を加えた溶液を加え、２０時間撹拌した。この混合物を減圧下で蒸発させて、赤色油残渣を得た。残留物にトリフルオロ酢酸（０．３５ｍＬ）およびチオアニソール（８２．７ｍｇ、０．６６６ｍｍｏｌ）を室温（２５℃）で２４時間添加した。その後、この混合物を減圧下で蒸発させて残渣を得た。残留物にジメチルスルホキシド（１．０ｍＬ）を添加し、ろ過し、逆相ＨＰＬＣによって精製して、化合物２３を赤色固体として得た（３工程、収率１．７％）。
ＨＰＬＣ条件；Ａ：蒸留水中の０．１％トリフルオロ酢酸、Ｂ：アセトニトリル中の０．１％トリフルオロ酢酸。Ｂ：０％→６０％（～２０分）→１００％（～２５分）→１００％（～３０分）
流量＝４ｍＬ／分。温度＝３５．０℃；ＵＶ＝２５４ｎｍ、Ｃ－１８カラム（ナカライテスク：ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８－ＡＲ－ＩＩ、１０ｍｍ×２５０ｍｍ）
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、１３Ｃ－ＮＭＲおよびＥＳＩ－ＨＲＭＳの測定データを以下に示す。
１Ｈ－ＮＭＲデータ（６００ＭＨｚ、溶媒：ＭｅＯＤ）δ（ｐｐｍ）：１．４８（２Ｈ，ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），１．５９（２Ｈ，ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），２．００（２Ｈ，ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），２．４２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），３．２２，（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），３．３９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），３．５４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），３．６０（１０Ｈ，ｍ），３．７１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），３．９８（３Ｈ，ｓ），４．２１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），４．３４（２Ｈ，ｓ），４．５９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），６．４１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），６．６０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），６．８２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．１６（１Ｈ，ｍ），７．１９（１Ｈ，ｓ），７．４２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），７．６１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．６６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．７５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．９０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．９９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），８．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），８．４３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），８．６５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）。
１３Ｃ－ＮＭＲデータ（１５０ＭＨｚ、溶媒：ＭｅＯＤ）δ（ｐｐｍ）：１５．８，１５．９，１６．０，２３．３，２８．４，２８．５，３２．７，３６．３，３８．４，３８．８，３９．２，５１．１，５４．６，５５．９，５６．１，５６．２，５６．４，６６．９，６９．０，６９．９，６９．９，７０．０，７０．２，１０８．４，１０８．７，１１２．３，１１５．９，１１７．６，１１７．９，１２２．３，１２３．７，１２４．４，１２４．５，１２４．８，１２５．２，１２６．８，１２７．７，１２８．１，１３３．２，１３７．５，１４０．６，１４２．９，１４３．６，１４９．５，１６０．７，１６８．１，１７２．６。
ＥＳＩ－ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ－ＣＦ３ＣＯＯ］＋ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ４６Ｈ５５Ｎ８Ｏ８ ＋、８７９．３８５、ｆｏｕｎｄ ８７９．３８３５。
ジクロロメタン（５０μＬ）に化合物２４（１８．９ｍｇ、２６．６μｍｏｌ）を加えた溶液に、トリフルオロ酢酸（０．３０ｍＬ）を添加し、室温（２５℃）で７時間撹拌した。この混合物を減圧下で蒸発させて、残渣を得た。残渣をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（０．２０ｍＬ）に溶解し、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（３３．４ｍｇ，０．２５８ｍｍｏｌ）と１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－ベンゾトリアゾリウム３－オキシドヘキサフルオロホスファート（１５．２ｍｇ，４０．１μｍｏｌ）を０℃で加えて撹拌した。この混合物に、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（０．４０ｍＬ）に化合物１９（３７．９μｍｏｌ）を加えた溶液を加え、２０時間撹拌した。この混合物を減圧下で蒸発させて、赤色油残渣を得た。残留物にトリフルオロ酢酸（０．３５ｍＬ）およびチオアニソール（８２．７ｍｇ、０．６６６ｍｍｏｌ）を室温（２５℃）で２４時間添加した。その後、この混合物を減圧下で蒸発させて残渣を得た。残留物にジメチルスルホキシド（１．０ｍＬ）を添加し、ろ過し、逆相ＨＰＬＣによって精製して、化合物２３を赤色固体として得た（３工程、収率１．７％）。
ＨＰＬＣ条件；Ａ：蒸留水中の０．１％トリフルオロ酢酸、Ｂ：アセトニトリル中の０．１％トリフルオロ酢酸。Ｂ：０％→６０％（～２０分）→１００％（～２５分）→１００％（～３０分）
流量＝４ｍＬ／分。温度＝３５．０℃；ＵＶ＝２５４ｎｍ、Ｃ－１８カラム（ナカライテスク：ＣＯＳＭＯＳＩＬ ５Ｃ１８－ＡＲ－ＩＩ、１０ｍｍ×２５０ｍｍ）
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、１３Ｃ－ＮＭＲおよびＥＳＩ－ＨＲＭＳの測定データを以下に示す。
１Ｈ－ＮＭＲデータ（６００ＭＨｚ、溶媒：ＭｅＯＤ）δ（ｐｐｍ）：１．４８（２Ｈ，ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ），１．５９（２Ｈ，ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ），２．００（２Ｈ，ｑｕｉｎｔｅｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ），２．４２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），３．２２，（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），３．３９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ），３．５４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），３．６０（１０Ｈ，ｍ），３．７１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ），３．９８（３Ｈ，ｓ），４．２１（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ），４．３４（２Ｈ，ｓ），４．５９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），６．４１（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），６．６０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），６．８２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），７．１６（１Ｈ，ｍ），７．１９（１Ｈ，ｓ），７．４２（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ），７．４７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），７．６１（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．６６（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．７５（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．９０（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），７．９９（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ），８．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），８．４３（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ），８．６５（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ）。
１３Ｃ－ＮＭＲデータ（１５０ＭＨｚ、溶媒：ＭｅＯＤ）δ（ｐｐｍ）：１５．８，１５．９，１６．０，２３．３，２８．４，２８．５，３２．７，３６．３，３８．４，３８．８，３９．２，５１．１，５４．６，５５．９，５６．１，５６．２，５６．４，６６．９，６９．０，６９．９，６９．９，７０．０，７０．２，１０８．４，１０８．７，１１２．３，１１５．９，１１７．６，１１７．９，１２２．３，１２３．７，１２４．４，１２４．５，１２４．８，１２５．２，１２６．８，１２７．７，１２８．１，１３３．２，１３７．５，１４０．６，１４２．９，１４３．６，１４９．５，１６０．７，１６８．１，１７２．６。
ＥＳＩ－ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ－ＣＦ３ＣＯＯ］＋ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ４６Ｈ５５Ｎ８Ｏ８ ＋、８７９．３８５、ｆｏｕｎｄ ８７９．３８３５。
【0059】
【化19】
【0060】
［実施例２］
「核酸内グアニン塩基結合性蛍光色素の合成」
下記の式（１８）で表される反応により、化合物３１を合成した。
化合物３２（０．２８ｍＬ、２．３６ｍｍｏｌ）に、アセトニトリル（７．２ｍＬ）を加えた後、６－ヨード－１－ヘキシン（１．０ｇ、４．８１ｍｍｏｌ）を加えて、２３時間加熱還流した。放冷後、濃縮して、酢酸エチル１０ｍＬを加え、吸引ろ過し、固体を酢酸エチル２０ｍＬで洗浄した。得られた固体を乾燥した後、黄土色粉末状の化合物３２を６３７ｍｇ（収率８０％）得た。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲおよびＥＳＩ－ＨＲＭＳの測定データを以下に示す。
１Ｈ－ＮＭＲデータ（４００ＭＨｚ、溶媒：ＤＭＳＯ－ｄ６）δ（ｐｐｍ）：９．５６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），９．３０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），８．６５（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），８．５１（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），８．３０（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），８．２１（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），８．０５（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），５．０９（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），２．８３（ｔ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１Ｈ），２．２５（ｄｔ，Ｊ＝２．８，７．２Ｈｚ，２Ｈ），２．１０－２．０２（ｍ，２Ｈ），１．６２－１．５５（ｍ，２Ｈ）。
ＥＳＩ－ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ－Ｉ］＋ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１５Ｈ１６Ｎ＋，２１０．１２７７，ｆｏｕｎｄ ２１０．１２８７。
「核酸内グアニン塩基結合性蛍光色素の合成」
下記の式（１８）で表される反応により、化合物３１を合成した。
化合物３２（０．２８ｍＬ、２．３６ｍｍｏｌ）に、アセトニトリル（７．２ｍＬ）を加えた後、６－ヨード－１－ヘキシン（１．０ｇ、４．８１ｍｍｏｌ）を加えて、２３時間加熱還流した。放冷後、濃縮して、酢酸エチル１０ｍＬを加え、吸引ろ過し、固体を酢酸エチル２０ｍＬで洗浄した。得られた固体を乾燥した後、黄土色粉末状の化合物３２を６３７ｍｇ（収率８０％）得た。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲおよびＥＳＩ－ＨＲＭＳの測定データを以下に示す。
１Ｈ－ＮＭＲデータ（４００ＭＨｚ、溶媒：ＤＭＳＯ－ｄ６）δ（ｐｐｍ）：９．５６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），９．３０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），８．６５（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），８．５１（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），８．３０（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），８．２１（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），８．０５（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），５．０９（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），２．８３（ｔ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１Ｈ），２．２５（ｄｔ，Ｊ＝２．８，７．２Ｈｚ，２Ｈ），２．１０－２．０２（ｍ，２Ｈ），１．６２－１．５５（ｍ，２Ｈ）。
ＥＳＩ－ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ－Ｉ］＋ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１５Ｈ１６Ｎ＋，２１０．１２７７，ｆｏｕｎｄ ２１０．１２８７。
【0061】
【化20】
【0062】
下記の式（１９）で表される反応により、化合物３３を合成した。
化合物３４（４９．９ｍｇ、０．１１１ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（０．７ｍＬ）を加え、０℃で攪拌した後、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（２９．０μＬ、０．６６６ｍｍｏｌ）、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－ベンゾトリアゾリウム３－オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）（６２．９ｍｇ、０．１６６ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解させた化合物３５（４０．８ｍｇ、０．１８７ｍｍｏｌ）を加え室温（２５℃）に昇温した。２４時間攪拌後、酢酸エチル４０ｍＬで希釈し、飽和塩化アンモニウム水溶液５ｍＬで２回、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液５ｍＬで２回、飽和食塩水５ｍＬで２回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後濃縮した。黄色の粗精製物７１．０ｍｇをシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製した。目的物である黄色固体化合物３３を４７．７ｍｇ（収率６６％）得た。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲおよびＥＳＩ－ＨＲＭＳの測定データを以下に示す。
１Ｈ－ＮＭＲデータ（４００ＭＨｚ、溶媒：ＤＭＳＯ－ｄ６）δ（ｐｐｍ）：７．２２－７．３４（ｍ，５Ｈ），７．００（ｓ，１Ｈ），６．９０（ｓ，１Ｈ），６．７４（ｑ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１６．０Ｈｚ，２Ｈ），６．３８（ｑ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１６．０Ｈｚ，２Ｈ），５．１１（ｓ，１Ｈ），５．０７（ｓ，１Ｈ），４．７５（ｓ，１Ｈ），４．３６（ｓ，１Ｈ），４．００－３．９５（ｍ，２Ｈ），３．６７－３．５６（ｍ，１４Ｈ），３．４７（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），３．３９（ｔ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，２Ｈ）。
ＥＳＩ－ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３０Ｈ３７Ｎ８Ｏ９ ＋，６５３．２６７８， ｆｏｕｎｄ ６５３．２６８５。
化合物３４（４９．９ｍｇ、０．１１１ｍｍｏｌ）とＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（０．７ｍＬ）を加え、０℃で攪拌した後、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）（２９．０μＬ、０．６６６ｍｍｏｌ）、１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－ベンゾトリアゾリウム３－オキシドヘキサフルオロホスファート（ＨＢＴＵ）（６２．９ｍｇ、０．１６６ｍｍｏｌ）、ＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解させた化合物３５（４０．８ｍｇ、０．１８７ｍｍｏｌ）を加え室温（２５℃）に昇温した。２４時間攪拌後、酢酸エチル４０ｍＬで希釈し、飽和塩化アンモニウム水溶液５ｍＬで２回、飽和炭酸水素ナトリウム水溶液５ｍＬで２回、飽和食塩水５ｍＬで２回洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥後濃縮した。黄色の粗精製物７１．０ｍｇをシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製した。目的物である黄色固体化合物３３を４７．７ｍｇ（収率６６％）得た。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲおよびＥＳＩ－ＨＲＭＳの測定データを以下に示す。
１Ｈ－ＮＭＲデータ（４００ＭＨｚ、溶媒：ＤＭＳＯ－ｄ６）δ（ｐｐｍ）：７．２２－７．３４（ｍ，５Ｈ），７．００（ｓ，１Ｈ），６．９０（ｓ，１Ｈ），６．７４（ｑ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１６．０Ｈｚ，２Ｈ），６．３８（ｑ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１６．０Ｈｚ，２Ｈ），５．１１（ｓ，１Ｈ），５．０７（ｓ，１Ｈ），４．７５（ｓ，１Ｈ），４．３６（ｓ，１Ｈ），４．００－３．９５（ｍ，２Ｈ），３．６７－３．５６（ｍ，１４Ｈ），３．４７（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），３．３９（ｔ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，２Ｈ）。
ＥＳＩ－ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３０Ｈ３７Ｎ８Ｏ９ ＋，６５３．２６７８， ｆｏｕｎｄ ６５３．２６８５。
【0063】
【化21】
【0064】
下記の式（２０）で表される反応により、化合物３６を合成した。
化合物３３（１２．２ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ）に、トリフルオロ酢酸（０．２５ｍＬ）とチオアニソール（５９ｍｇ、０．４７５ｍｍｏｌ）とを加えて、室温（２５℃）で１９時間攪拌した後、メタノール１０ｍＬで希釈した。ヘキサン１０ｍＬで２回洗浄して濃縮して得た粗。精製物２３．４ｍｇをアミノシリカゲルカラムに通し、化合物３６を含む黄色液体化合物を７．５ｍｇ得た。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲおよびＥＳＩ－ＨＲＭＳの測定データを以下に示す。
１Ｈ－ＮＭＲデータ（４００ＭＨｚ、溶媒：ＤＭＳＯ－ｄ６）δ（ｐｐｍ）：８．１９（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３８（ｓ，１Ｈ），６．７９（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），６．６０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．４４（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），４．２４（ｓ，２Ｈ），３．８９（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），３．２３（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），２．８６（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ）。
ＥＳＩ－ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２２Ｈ３１Ｎ８Ｏ７ ＋，５１９．２３１０， ｆｏｕｎｄ ５１９．２３１７。
化合物３３（１２．２ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ）に、トリフルオロ酢酸（０．２５ｍＬ）とチオアニソール（５９ｍｇ、０．４７５ｍｍｏｌ）とを加えて、室温（２５℃）で１９時間攪拌した後、メタノール１０ｍＬで希釈した。ヘキサン１０ｍＬで２回洗浄して濃縮して得た粗。精製物２３．４ｍｇをアミノシリカゲルカラムに通し、化合物３６を含む黄色液体化合物を７．５ｍｇ得た。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲおよびＥＳＩ－ＨＲＭＳの測定データを以下に示す。
１Ｈ－ＮＭＲデータ（４００ＭＨｚ、溶媒：ＤＭＳＯ－ｄ６）δ（ｐｐｍ）：８．１９（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３８（ｓ，１Ｈ），６．７９（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），６．６０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．４４（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），４．２４（ｓ，２Ｈ），３．８９（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），３．２３（ｄ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，２Ｈ），２．８６（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，２Ｈ）。
ＥＳＩ－ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］＋ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２２Ｈ３１Ｎ８Ｏ７ ＋，５１９．２３１０， ｆｏｕｎｄ ５１９．２３１７。
【0065】
【化22】
【0066】
下記の式（２１）で表される反応により、化合物３７を合成した。
化合物３８（４９９ｍｇ、３．３４ｍｍｏｌ）に、アセトニトリル（１２ｍＬ）を加えた後、ヨードメタン（０．４２ｍＬ、６．７５ｍｍｏｌ）を加え、１９時間加熱還流した。ヨードメタン（０．４２ｍＬ、６．７５ｍｍｏｌ）を追加し、３時間加熱還流し、放冷した後、吸引ろ過し、酢酸エチル３０ｍＬで洗浄した。乾燥後、緑白色粉末状の化合物３７を７７４ｍｇ（収率８０％）得た。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲおよびＥＳＩ－ＨＲＭＳの測定データを以下に示す。
１Ｈ－ＮＭＲデータ（４００ＭＨｚ、溶媒：ＤＭＳＯ－ｄ６）δ（ｐｐｍ）：８．４４（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），８．３０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．９０（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．８１（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），４．２０（ｓ，３Ｈ），３．１７（ｓ，３Ｈ）。
ＥＳＩ－ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ－Ｉ］＋ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ９Ｈ１０ＮＳ＋，１６４．０５２８， ｆｏｕｎｄ １６４．０５３８。
化合物３８（４９９ｍｇ、３．３４ｍｍｏｌ）に、アセトニトリル（１２ｍＬ）を加えた後、ヨードメタン（０．４２ｍＬ、６．７５ｍｍｏｌ）を加え、１９時間加熱還流した。ヨードメタン（０．４２ｍＬ、６．７５ｍｍｏｌ）を追加し、３時間加熱還流し、放冷した後、吸引ろ過し、酢酸エチル３０ｍＬで洗浄した。乾燥後、緑白色粉末状の化合物３７を７７４ｍｇ（収率８０％）得た。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲおよびＥＳＩ－ＨＲＭＳの測定データを以下に示す。
１Ｈ－ＮＭＲデータ（４００ＭＨｚ、溶媒：ＤＭＳＯ－ｄ６）δ（ｐｐｍ）：８．４４（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），８．３０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．９０（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．８１（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），４．２０（ｓ，３Ｈ），３．１７（ｓ，３Ｈ）。
ＥＳＩ－ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ－Ｉ］＋ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ９Ｈ１０ＮＳ＋，１６４．０５２８， ｆｏｕｎｄ １６４．０５３８。
【0067】
【化23】
【0068】
下記の式（２２）で表される反応により、化合物３９を合成した。
化合物３８（５０９ｍｇ、３．４１ｍｍｏｌ）に、アセトニトリル（１２ｍＬ）を加えた後、臭化ベンジル（０．６０ｍＬ、５．０５ｍｍｏｌ）を加え、４７時間加熱還流した。放冷後、吸引ろ過し、酢酸エチル３０ｍＬで洗浄した。乾燥後、緑白色粉末状の化合物３９を６６５ｍｇ（収率６１％）得た。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲおよびＥＳＩ－ＨＲＭＳの測定データを以下に示す。
１Ｈ－ＮＭＲデータ（４００ＭＨｚ、溶媒：ＤＭＳＯ－ｄ６）δ（ｐｐｍ）：８．５０（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），８．２０（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．８７－７．７８（ｍ，２Ｈ），７．４３－７．３２（ｍ，５Ｈ），６．０９（ｓ，２Ｈ），３．２７（ｓ，３Ｈ）。
ＥＳＩ－ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ－Ｂｒ］＋ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１５Ｈ１４ＮＳ＋，２４０．０８４１， ｆｏｕｎｄ ２４０．０８５２。
化合物３８（５０９ｍｇ、３．４１ｍｍｏｌ）に、アセトニトリル（１２ｍＬ）を加えた後、臭化ベンジル（０．６０ｍＬ、５．０５ｍｍｏｌ）を加え、４７時間加熱還流した。放冷後、吸引ろ過し、酢酸エチル３０ｍＬで洗浄した。乾燥後、緑白色粉末状の化合物３９を６６５ｍｇ（収率６１％）得た。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲおよびＥＳＩ－ＨＲＭＳの測定データを以下に示す。
１Ｈ－ＮＭＲデータ（４００ＭＨｚ、溶媒：ＤＭＳＯ－ｄ６）δ（ｐｐｍ）：８．５０（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ），８．２０（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．８７－７．７８（ｍ，２Ｈ），７．４３－７．３２（ｍ，５Ｈ），６．０９（ｓ，２Ｈ），３．２７（ｓ，３Ｈ）。
ＥＳＩ－ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ－Ｂｒ］＋ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１５Ｈ１４ＮＳ＋，２４０．０８４１， ｆｏｕｎｄ ２４０．０８５２。
【0069】
【化24】
【0070】
下記の式（２３）で表される反応により、化合物４０を合成した。
化合物３８（５００ｍｇ、３．３５ｍｍｏｌ）に、２－ブロモエチルベンゼン（０．６８ｍＬ、５．０３ｍｍｏｌ）を加え、１５０℃で１９時間攪拌した。放冷後、酢酸エチルを２ｍＬ加えて固体を砕き、吸引ろ過し、酢酸エチル３０ｍＬで洗浄した。乾燥後、白色～茶色粉末状の化合物４０を７６３ｍｇ（収率６８％）得た。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲおよびＥＳＩ－ＨＲＭＳの測定データを以下に示す。
１Ｈ－ＮＭＲデータ（４００ＭＨｚ、溶媒：ＤＭＳＯ－ｄ６）δ（ｐｐｍ）：８．５０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），８．３３（ｄ，Ｊ＝８．Ｈｚ，１Ｈ），７．８７（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．８０（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．２９－７．１（ｍ，５Ｈ），４．９９（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），３．２２（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），２．９２（ｓ，３Ｈ）。
ＥＳＩ－ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ－Ｂｒ］＋ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１６Ｈ１６ＮＳ＋，２５４．０９９８， ｆｏｕｎｄ ２５４．１００９。
化合物３８（５００ｍｇ、３．３５ｍｍｏｌ）に、２－ブロモエチルベンゼン（０．６８ｍＬ、５．０３ｍｍｏｌ）を加え、１５０℃で１９時間攪拌した。放冷後、酢酸エチルを２ｍＬ加えて固体を砕き、吸引ろ過し、酢酸エチル３０ｍＬで洗浄した。乾燥後、白色～茶色粉末状の化合物４０を７６３ｍｇ（収率６８％）得た。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲおよびＥＳＩ－ＨＲＭＳの測定データを以下に示す。
１Ｈ－ＮＭＲデータ（４００ＭＨｚ、溶媒：ＤＭＳＯ－ｄ６）δ（ｐｐｍ）：８．５０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），８．３３（ｄ，Ｊ＝８．Ｈｚ，１Ｈ），７．８７（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．８０（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．２９－７．１（ｍ，５Ｈ），４．９９（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），３．２２（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），２．９２（ｓ，３Ｈ）。
ＥＳＩ－ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ－Ｂｒ］＋ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ１６Ｈ１６ＮＳ＋，２５４．０９９８， ｆｏｕｎｄ ２５４．１００９。
【0071】
【化25】
【0072】
下記の式（２４）で表される反応により、化合物４１を合成した。
化合物３７（１０４ｍｇ、０．３５６ｍｍｏｌ）に、化合物２（Ｋ）（１００ｍｇ、０．２９７ｍｍｏｌ）を加え、メタノール（１０．８ｍＬ）を加えた後、トリエチルアミン（０．４１ｍＬ、２．９７ｍｍｏｌ）を加えて５０℃で攪拌したところ、赤色溶液となった。２３時間後、濃縮しアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製を行なった。目的とする化合物４１を含む暗赤色固体の粗精製物を１５．３ｍｇ得た。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲおよびＥＳＩ－ＨＲＭＳの測定データを以下に示す。
１Ｈ－ＮＭＲデータ（４００ＭＨｚ、溶媒：ＤＭＳＯ－ｄ６）δ（ｐｐｍ）：８．９７（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），８．６６（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．７４－７．６２（ｍ，４Ｈ），７．４６（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．３２（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ），６．７１（ｓ，１Ｈ），４．６１（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），３．９９（ｓ，３Ｈ），３．１１（ｓ，１Ｈ），２．３２－２．２９（ｍ，２Ｈ），２．０８－２．０６（ｍ，２Ｈ），２．０１－１．９７（ｍ，２Ｈ）。
ＥＳＩ－ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ－Ｉ］＋ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２４Ｈ２３Ｎ２Ｓ＋，３７１．１５７６， ｆｏｕｎｄ ３７１．１５３９。
化合物３７（１０４ｍｇ、０．３５６ｍｍｏｌ）に、化合物２（Ｋ）（１００ｍｇ、０．２９７ｍｍｏｌ）を加え、メタノール（１０．８ｍＬ）を加えた後、トリエチルアミン（０．４１ｍＬ、２．９７ｍｍｏｌ）を加えて５０℃で攪拌したところ、赤色溶液となった。２３時間後、濃縮しアミノシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製を行なった。目的とする化合物４１を含む暗赤色固体の粗精製物を１５．３ｍｇ得た。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲおよびＥＳＩ－ＨＲＭＳの測定データを以下に示す。
１Ｈ－ＮＭＲデータ（４００ＭＨｚ、溶媒：ＤＭＳＯ－ｄ６）δ（ｐｐｍ）：８．９７（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），８．６６（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．７４－７．６２（ｍ，４Ｈ），７．４６（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．３２（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ），６．７１（ｓ，１Ｈ），４．６１（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），３．９９（ｓ，３Ｈ），３．１１（ｓ，１Ｈ），２．３２－２．２９（ｍ，２Ｈ），２．０８－２．０６（ｍ，２Ｈ），２．０１－１．９７（ｍ，２Ｈ）。
ＥＳＩ－ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ－Ｉ］＋ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ２４Ｈ２３Ｎ２Ｓ＋，３７１．１５７６， ｆｏｕｎｄ ３７１．１５３９。
【0073】
【化26】
【0074】
下記の式（２５）で表される反応により、化合物４２を合成した。
化合物３９（１１４．５ｍｇ、０．３５８ｍｍｏｌ）に、化合物３１（１００．５ｍｇ、０．２９８ｍｍｏｌ）を加え、メタノール（１９ｍＬ）を加えた後、トリエチルアミン（０．４２ｍＬ、３．０１ｍｍｏｌ）を加えて、４０℃で２２時間攪拌した。化合物３９のみが消失したため、９（７６．１ｍｇ、０．２３８ｍｍｏｌ）を追加し、４０℃で２４時間攪拌した後、反応を停止した。濃縮し、水（２０ｍＬ）、ジエチルエーテル（２０ｍＬ）の順で固体を洗浄した後、ジクロロメタンを加え、不溶物をろ別した。ろ液を濃縮し、アミノシリカゲルクロマトグラフィーにより精製を行なった。目的とする化合物４２を含む暗赤色固体の粗精製物を１３．８ｍｇ得た。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲおよびＥＳＩ－ＨＲＭＳの測定データを以下に示す。
１Ｈ－ＮＭＲデータ（４００ＭＨｚ、溶媒：ＤＭＳＯ－ｄ６）δ（ｐｐｍ）：９．２１（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），８．１３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．７７（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ），７．５７（ｔ，Ｊ＝１４．８Ｈｚ，１Ｈ），７．５１（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．４４（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），７．４０－７．３７（ｍ，２Ｈ），７．３４－７．３１（ｍ，５Ｈ），６．６（ｓ， １Ｈ），４．７１（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），２．２９（ｄｔ，Ｊ＝２．４，６．８Ｈｚ，２Ｈ），２．０６（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），１．９４（ｔ，Ｊ２．８ Ｈｚ，１Ｈ），１．７５－１．６８（ｍ，４Ｈ）。
ＥＳＩ－ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ－Ｂｒ］＋ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３０Ｈ２７Ｎ２Ｓ＋，４４７．１８８９， ｆｏｕｎｄ ４４７．１８８５。
化合物３９（１１４．５ｍｇ、０．３５８ｍｍｏｌ）に、化合物３１（１００．５ｍｇ、０．２９８ｍｍｏｌ）を加え、メタノール（１９ｍＬ）を加えた後、トリエチルアミン（０．４２ｍＬ、３．０１ｍｍｏｌ）を加えて、４０℃で２２時間攪拌した。化合物３９のみが消失したため、９（７６．１ｍｇ、０．２３８ｍｍｏｌ）を追加し、４０℃で２４時間攪拌した後、反応を停止した。濃縮し、水（２０ｍＬ）、ジエチルエーテル（２０ｍＬ）の順で固体を洗浄した後、ジクロロメタンを加え、不溶物をろ別した。ろ液を濃縮し、アミノシリカゲルクロマトグラフィーにより精製を行なった。目的とする化合物４２を含む暗赤色固体の粗精製物を１３．８ｍｇ得た。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲおよびＥＳＩ－ＨＲＭＳの測定データを以下に示す。
１Ｈ－ＮＭＲデータ（４００ＭＨｚ、溶媒：ＤＭＳＯ－ｄ６）δ（ｐｐｍ）：９．２１（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），８．１３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．７７（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ），７．５７（ｔ，Ｊ＝１４．８Ｈｚ，１Ｈ），７．５１（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．４４（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），７．４０－７．３７（ｍ，２Ｈ），７．３４－７．３１（ｍ，５Ｈ），６．６（ｓ， １Ｈ），４．７１（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），２．２９（ｄｔ，Ｊ＝２．４，６．８Ｈｚ，２Ｈ），２．０６（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），１．９４（ｔ，Ｊ２．８ Ｈｚ，１Ｈ），１．７５－１．６８（ｍ，４Ｈ）。
ＥＳＩ－ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ－Ｂｒ］＋ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３０Ｈ２７Ｎ２Ｓ＋，４４７．１８８９， ｆｏｕｎｄ ４４７．１８８５。
【0075】
【化27】
【0076】
下記の式（２６）で表される反応により、化合物４３を合成した。
化合物４０（１１９．６ｍｇ、０．３５８ｍｍｏｌ）に、化合物３１（１００．１ｍｇ、０．２９７ｍｍｏｌ）を加え、メタノール（１９ｍＬ）を加えた後、トリエチルアミン（０．４２ｍＬ、３．０１ｍｍｏｌ）を加えて室温（２５℃）で２６時間攪拌したが、原料がかなり残っていたため、加熱還流して１７時間攪拌した。溶液を濃縮し、水（２０ｍＬ）、ジエチルエーテル（２０ｍＬ）の順で固体を洗浄した後、ジクロロメタンを加え不溶物をろ別した。ろ液を濃縮し暗赤色固体を１３１．９ｍｇ得た。このうち４０．２ｍｇをアミノシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、目的とする化合物４３を含む暗赤色固体の粗精製物を３．２ｍｇ得た。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲおよびＥＳＩ－ＨＲＭＳの測定データを以下に示す。
１Ｈ－ＮＭＲデータ（４００ＭＨｚ、溶媒：ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：９．０４（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），８．１６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．８０（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），７．７２（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．６５（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．４４（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３８（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３０－７．１２（ｍ，７Ｈ），６．４４（ｓ１Ｈ），４．６８（ｍ，４Ｈ），３．２５（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，４Ｈ），２．３１（ｍ，２Ｈ），２．０８（ｍ，２Ｈ），１．９７（ｔ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１Ｈ），１．７３（ｍ，２Ｈ）。
ＥＳＩ－ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ－Ｂｒ］＋ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３１Ｈ２９Ｎ２Ｓ＋，４６１．２０４６， ｆｏｕｎｄ ４６１．２０３９。
化合物４０（１１９．６ｍｇ、０．３５８ｍｍｏｌ）に、化合物３１（１００．１ｍｇ、０．２９７ｍｍｏｌ）を加え、メタノール（１９ｍＬ）を加えた後、トリエチルアミン（０．４２ｍＬ、３．０１ｍｍｏｌ）を加えて室温（２５℃）で２６時間攪拌したが、原料がかなり残っていたため、加熱還流して１７時間攪拌した。溶液を濃縮し、水（２０ｍＬ）、ジエチルエーテル（２０ｍＬ）の順で固体を洗浄した後、ジクロロメタンを加え不溶物をろ別した。ろ液を濃縮し暗赤色固体を１３１．９ｍｇ得た。このうち４０．２ｍｇをアミノシリカゲルクロマトグラフィーにより精製し、目的とする化合物４３を含む暗赤色固体の粗精製物を３．２ｍｇ得た。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲおよびＥＳＩ－ＨＲＭＳの測定データを以下に示す。
１Ｈ－ＮＭＲデータ（４００ＭＨｚ、溶媒：ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：９．０４（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），８．１６（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．８０（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），７．７２（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．６５（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．４４（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３８（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３０－７．１２（ｍ，７Ｈ），６．４４（ｓ１Ｈ），４．６８（ｍ，４Ｈ），３．２５（ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，４Ｈ），２．３１（ｍ，２Ｈ），２．０８（ｍ，２Ｈ），１．９７（ｔ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１Ｈ），１．７３（ｍ，２Ｈ）。
ＥＳＩ－ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ－Ｂｒ］＋ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ３１Ｈ２９Ｎ２Ｓ＋，４６１．２０４６， ｆｏｕｎｄ ４６１．２０３９。
【0077】
【化28】
【0078】
下記の式（２７）で表される反応により、化合物４４を合成した。
化合物４１（２．９９ｍｇ、６．０μｍｏｌ）に、ジメチルスルホキシド（１００μＬ）、化合物３６（３．１１ｍｇ、６．０μｍｏｌ）、トリス［（１－ベンジル－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル］アミン（１．３ｍｇ、２．４μｍｏｌ）、アスコルビン酸ナトリウム（３．０ｍｇ、１５μｍｏｌ）、水（１００μＬ）、硫酸銅五水和物（０．６ｍｇ、２．４μｍｏｌ）を加えて攪拌し、３７℃で２２時間反応させた後、ジメチルスルホキシド３００μＬで希釈した。テフロン（登録商標）系フィルターで不溶物を除き、ＨＰＬＣにより精製を行なった。目的とする化合物４４を０．８６９μｍｏｌ得た。収量はマレイン酸を用いた定量ＮＭＲにより決定した。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、１３Ｃ－ＮＭＲおよびＥＳＩ－ＨＲＭＳの測定データを以下に示す。
１Ｈ－ＮＭＲデータ（６００ＭＨｚ、溶媒：ＤＭＳＯ－ｄ６）δ（ｐｐｍ）：８．７８（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），８．６２（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），８．１９（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），８．１４（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），８．０４（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．９８（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，３Ｈ），７．７９（ｔ，＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），７．７５（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．６１（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．４２（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．３７（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），６．９１（ｓ，１Ｈ），６．８０（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），６．６４（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），６．４５（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），４．６３（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），４．４５（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，３Ｈ），４．２４（ｓ，２Ｈ），４．１３（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），４．０１（ｓ，３Ｈ），３．７７（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，３Ｈ），３．２２（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），２．６８（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），１．９１（ｍ，２Ｈ），１．６９（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ）。
１３Ｃ－ＮＭＲデータ（１５１ＭＨｚ、溶媒：ＤＭＳＯ－ｄ６）δ（ｐｐｍ）：１６７．２，１６０．１，１４８．６，１４６．１，１４４．４，１４０．５，１３７．０，１３３．３，１２８．２，１２６．８，１２５．８，１２４．５，１２４．３，１２３．９，１２２．９，１２２．３，１２２．３，１１８．１，１１３．０，１０７．９，８８．１，６９．７，６９．６，６９．６，６９．０，６８．８，５３．９，５０．７，４９．２，３３．８，２８．４，２６．０，２４．５。
ＥＳＩ－ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］２＋ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ４６Ｈ５４Ｎ１０Ｏ７Ｓ２＋ ４４５．１９４４， ｆｏｕｎｄ ４４５．１９６７。
化合物４１（２．９９ｍｇ、６．０μｍｏｌ）に、ジメチルスルホキシド（１００μＬ）、化合物３６（３．１１ｍｇ、６．０μｍｏｌ）、トリス［（１－ベンジル－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル］アミン（１．３ｍｇ、２．４μｍｏｌ）、アスコルビン酸ナトリウム（３．０ｍｇ、１５μｍｏｌ）、水（１００μＬ）、硫酸銅五水和物（０．６ｍｇ、２．４μｍｏｌ）を加えて攪拌し、３７℃で２２時間反応させた後、ジメチルスルホキシド３００μＬで希釈した。テフロン（登録商標）系フィルターで不溶物を除き、ＨＰＬＣにより精製を行なった。目的とする化合物４４を０．８６９μｍｏｌ得た。収量はマレイン酸を用いた定量ＮＭＲにより決定した。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、１３Ｃ－ＮＭＲおよびＥＳＩ－ＨＲＭＳの測定データを以下に示す。
１Ｈ－ＮＭＲデータ（６００ＭＨｚ、溶媒：ＤＭＳＯ－ｄ６）δ（ｐｐｍ）：８．７８（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），８．６２（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），８．１９（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，１Ｈ），８．１４（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），８．０４（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．９８（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，３Ｈ），７．７９（ｔ，＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），７．７５（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．６１（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．４２（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．３７（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），６．９１（ｓ，１Ｈ），６．８０（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），６．６４（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），６．４５（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），４．６３（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），４．４５（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，３Ｈ），４．２４（ｓ，２Ｈ），４．１３（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），４．０１（ｓ，３Ｈ），３．７７（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，３Ｈ），３．２２（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），２．６８（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），１．９１（ｍ，２Ｈ），１．６９（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ）。
１３Ｃ－ＮＭＲデータ（１５１ＭＨｚ、溶媒：ＤＭＳＯ－ｄ６）δ（ｐｐｍ）：１６７．２，１６０．１，１４８．６，１４６．１，１４４．４，１４０．５，１３７．０，１３３．３，１２８．２，１２６．８，１２５．８，１２４．５，１２４．３，１２３．９，１２２．９，１２２．３，１２２．３，１１８．１，１１３．０，１０７．９，８８．１，６９．７，６９．６，６９．６，６９．０，６８．８，５３．９，５０．７，４９．２，３３．８，２８．４，２６．０，２４．５。
ＥＳＩ－ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］２＋ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ４６Ｈ５４Ｎ１０Ｏ７Ｓ２＋ ４４５．１９４４， ｆｏｕｎｄ ４４５．１９６７。
【0079】
【化29】
【0080】
下記の式（２８）で表される反応により、化合物４５を合成した。
化合物３１（４．８ｍｇ、９μｍｏｌ）に、ジメチルスルホキシド（１５０μＬ）、化合物３６（４．７ｍｇ、９μｍｏｌ）、アスコルビン酸ナトリウム（４．５ｍｇ、２２．５μｍｏｌ）、水（３００μＬ）、トリス［（１－ベンジル－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル］アミン（１．９ｍｇ、３．６μｍｏｌ）硫酸銅五水和物（０．９ｍｇ、３．６μｍｏｌ）を加え攪拌し、３７℃で２４時間反応させた後、ジメチルスルホキシド３００μＬで希釈した。テフロン（登録商標）系フィルターで不溶物を除き、ＨＰＬＣにより精製を行なった。目的とする化合物４５を１．７８μｍｏｌ得た。収量はマレイン酸を用いた定量ＮＭＲにより決定した。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、１３Ｃ－ＮＭＲおよびＥＳＩ－ＨＲＭＳの測定データを以下に示す。
１Ｈ－ＮＭＲデータ（６００ＭＨｚ、溶媒：ＤＭＳＯ－ｄ６）δ（ｐｐｍ）：８．６８（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），８．５３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），８．１６，（ｔ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），８．０９（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），８．０８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．９６（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），７．７９（ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．７２（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．５９（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．４４（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ），７．３７（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．３３（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．３０（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），６．９８（ｓ，１Ｈ），６．８０（ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．６６（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），６．４６（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），５．９５（ｓ，２Ｈ），４．６５（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），４．４６（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２Ｈ），４．２６（ｓ，２Ｈ），４．１４（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），３．７８（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２Ｈ），２．６７（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．９０（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．６９（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ）。
１３Ｃ－ＮＭＲデータ（１５１ＭＨｚ、溶媒：ＤＭＳＯ－ｄ６）δ（ｐｐｍ）：１６７．２，１５９．６，１４８．８，１４６．１，１４４．６，１４０．４，１３７．０，１３５．２，１３３．４，１２９．０，１２７．９，１２６．７，１２５．４，１２４．７，１２４．３，１２３．８，１２３．１，１２２．３，１１８．３，１１３．０，１０８．５，８８．２，６９．７，６９．６，６９．６，６９．５，６９．０，６８．８，５４．１，４９．２，４８．７，４２．１，２８．４，２５．９，２４．４。
ＥＳＩ－ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］２＋ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ５２Ｈ５８Ｎ１０Ｏ７Ｓ２＋ ４８３．２１００， ｆｏｕｎｄ ４８３．２１１４。
化合物３１（４．８ｍｇ、９μｍｏｌ）に、ジメチルスルホキシド（１５０μＬ）、化合物３６（４．７ｍｇ、９μｍｏｌ）、アスコルビン酸ナトリウム（４．５ｍｇ、２２．５μｍｏｌ）、水（３００μＬ）、トリス［（１－ベンジル－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル］アミン（１．９ｍｇ、３．６μｍｏｌ）硫酸銅五水和物（０．９ｍｇ、３．６μｍｏｌ）を加え攪拌し、３７℃で２４時間反応させた後、ジメチルスルホキシド３００μＬで希釈した。テフロン（登録商標）系フィルターで不溶物を除き、ＨＰＬＣにより精製を行なった。目的とする化合物４５を１．７８μｍｏｌ得た。収量はマレイン酸を用いた定量ＮＭＲにより決定した。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、１３Ｃ－ＮＭＲおよびＥＳＩ－ＨＲＭＳの測定データを以下に示す。
１Ｈ－ＮＭＲデータ（６００ＭＨｚ、溶媒：ＤＭＳＯ－ｄ６）δ（ｐｐｍ）：８．６８（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），８．５３（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），８．１６，（ｔ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），８．０９（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），８．０８（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．９６（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，３Ｈ），７．７９（ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．７２（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．５９（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．４４（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，３Ｈ），７．３７（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．３３（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．３０（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），６．９８（ｓ，１Ｈ），６．８０（ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．６６（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），６．４６（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），５．９５（ｓ，２Ｈ），４．６５（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），４．４６（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２Ｈ），４．２６（ｓ，２Ｈ），４．１４（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），３．７８（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２Ｈ），２．６７（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．９０（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．６９（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ）。
１３Ｃ－ＮＭＲデータ（１５１ＭＨｚ、溶媒：ＤＭＳＯ－ｄ６）δ（ｐｐｍ）：１６７．２，１５９．６，１４８．８，１４６．１，１４４．６，１４０．４，１３７．０，１３５．２，１３３．４，１２９．０，１２７．９，１２６．７，１２５．４，１２４．７，１２４．３，１２３．８，１２３．１，１２２．３，１１８．３，１１３．０，１０８．５，８８．２，６９．７，６９．６，６９．６，６９．５，６９．０，６８．８，５４．１，４９．２，４８．７，４２．１，２８．４，２５．９，２４．４。
ＥＳＩ－ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］２＋ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ５２Ｈ５８Ｎ１０Ｏ７Ｓ２＋ ４８３．２１００， ｆｏｕｎｄ ４８３．２１１４。
【0081】
【化30】
【0082】
下記の式（２９）で表される反応により、化合物４６を合成した。
化合物４３（９．６ｍｇ、１８μｍｏｌ）とジメチルスルホキシド（３００μＬ）、化合物３６（９．３ｍｇ、１８μｍｏｌ）、アスコルビン酸ナトリウム（９．０ｍｇ、４５μｍｏｌ）、水（３００μＬ）、硫酸銅五水和物（１．８ｍｇ、７．２μｍｏｌ）を加え攪拌し、３７℃で２０時間反応させたのち、ジメチルスルホキシド３００μＬで希釈した。テフロン（登録商標）系フィルターで不溶物を除き、ＨＰＬＣにより精製を行なった。目的化合物４６を２．１６μｍｏｌ得た。収量はマレイン酸を用いた定量ＮＭＲにより決定した。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、１３Ｃ－ＮＭＲおよびＥＳＩ－ＨＲＭＳの測定データを以下に示す。
１Ｈ－ＮＭＲデータ（６００ＭＨｚ、溶媒：ＤＭＳＯ－ｄ６）δ（ｐｐｍ）：８．５８（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），８．５０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），８．１９（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），８．１２，（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．９８（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．７６（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．６７（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５４（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．３９（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．２３（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．１８（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．０９（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），６．８１（ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．７３（ｓ，１Ｈ），６．６４（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），６．４６（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），４．８８（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），４．６１（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），４．４５（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２Ｈ），４．２５（ｓ，２Ｈ），３．７７（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２Ｈ），３．２１（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．１５（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），２．６８（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．９０（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．６９（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ）。
１３Ｃ－ＮＭＲデータ（１５１ＭＨｚ、溶媒：ＤＭＳＯ－ｄ６）δ（ｐｐｍ）：１６７．３，１５９．７，１４８．６，１４６．２，１４４．３，１３９．９，１３７．６，１３７．１，１３３．４，１２９．２，１２８．５，１２８．３，１２６．８，１２５．９，１２４．７，１２４．２，１２３．８，１２２．９，１２２．４，１１８．２，１１３．２，１０８．０，８８．３，６９．７，６９．７，６９．６，６９．６，６９．０，６８．８，５４．０，４９．３，４７．１，３２．９，２８．５，２６．０，２４．５。
ＥＳＩ－ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ－Ｂｒ＋Ｈ］２＋ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ５３Ｈ６０Ｎ１０Ｏ７Ｓ２＋ ４９０．２１７８， ｆｏｕｎｄ ４９０．２１９７。
化合物４３（９．６ｍｇ、１８μｍｏｌ）とジメチルスルホキシド（３００μＬ）、化合物３６（９．３ｍｇ、１８μｍｏｌ）、アスコルビン酸ナトリウム（９．０ｍｇ、４５μｍｏｌ）、水（３００μＬ）、硫酸銅五水和物（１．８ｍｇ、７．２μｍｏｌ）を加え攪拌し、３７℃で２０時間反応させたのち、ジメチルスルホキシド３００μＬで希釈した。テフロン（登録商標）系フィルターで不溶物を除き、ＨＰＬＣにより精製を行なった。目的化合物４６を２．１６μｍｏｌ得た。収量はマレイン酸を用いた定量ＮＭＲにより決定した。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、１３Ｃ－ＮＭＲおよびＥＳＩ－ＨＲＭＳの測定データを以下に示す。
１Ｈ－ＮＭＲデータ（６００ＭＨｚ、溶媒：ＤＭＳＯ－ｄ６）δ（ｐｐｍ）：８．５８（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），８．５０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），８．１９（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），８．１２，（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．９８（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），７．８１（ｓ，１Ｈ），７．７６（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．６７（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．５４（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．３９（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．２３（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．１８（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．０９（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），６．８１（ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．７３（ｓ，１Ｈ），６．６４（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），６．４６（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），４．８８（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），４．６１（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），４．４５（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２Ｈ），４．２５（ｓ，２Ｈ），３．７７（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２Ｈ），３．２１（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，２Ｈ），３．１５（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），２．６８（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．９０（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．６９（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ）。
１３Ｃ－ＮＭＲデータ（１５１ＭＨｚ、溶媒：ＤＭＳＯ－ｄ６）δ（ｐｐｍ）：１６７．３，１５９．７，１４８．６，１４６．２，１４４．３，１３９．９，１３７．６，１３７．１，１３３．４，１２９．２，１２８．５，１２８．３，１２６．８，１２５．９，１２４．７，１２４．２，１２３．８，１２２．９，１２２．４，１１８．２，１１３．２，１０８．０，８８．３，６９．７，６９．７，６９．６，６９．６，６９．０，６８．８，５４．０，４９．３，４７．１，３２．９，２８．５，２６．０，２４．５。
ＥＳＩ－ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ－Ｂｒ＋Ｈ］２＋ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ５３Ｈ６０Ｎ１０Ｏ７Ｓ２＋ ４９０．２１７８， ｆｏｕｎｄ ４９０．２１９７。
【0083】
【化31】
【0084】
下記の式（３０）で表される反応により、化合物４７を合成した。
レピジン（化合物４８）（３４４ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）を溶解したアセトニトリル（７．３ｍＬ）を、６－ヨードヘキス－１－イン（６００ｍｇ、２．８８ｍｍｏｌ）に加えた。この混合物を還流して１４時間攪拌した。その後、６－ヨードヘキス－１－イン（４００ｍｇ、１．９２ｍｍｏｌ）を加え、還流して３時間攪拌した。次に、混合物を室温（２５℃）に冷却し、溶媒を吸引して除去した。粗精製物に酢酸エチル（１０ｍＬ）を加えて超音波処理した後、固形物が得られた。その固形物をろ過し、酢酸エチルで洗浄した後、真空乾燥し、黄土色粉末状の化合物４７を８０３ｍｇ（収率９５％）得た。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲの測定データを以下に示す。
１Ｈ－ＮＭＲデータ（４００ＭＨｚ、溶媒：ＤＭＳＯ－ｄ６）δ（ｐｐｍ）：９．４１（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），８．６１（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），８．５５（ｄｄ，Ｊ＝１．２，８．４Ｈｚ，１Ｈ），８．２７（ｄｔ，Ｊ＝２．４，７．２Ｈｚ，１Ｈ），８．０８（ｍ，２Ｈ），５．０３（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），３．０１（ｓ，３Ｈ），２．８１（ｔ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１Ｈ），２．２４（ｄｔ，Ｊ＝２．４，７．２Ｈｚ，２Ｈ），２．０７－２．０１（ｍ，２Ｈ），１．６０－１．５２（ｍ，２Ｈ）。
レピジン（化合物４８）（３４４ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）を溶解したアセトニトリル（７．３ｍＬ）を、６－ヨードヘキス－１－イン（６００ｍｇ、２．８８ｍｍｏｌ）に加えた。この混合物を還流して１４時間攪拌した。その後、６－ヨードヘキス－１－イン（４００ｍｇ、１．９２ｍｍｏｌ）を加え、還流して３時間攪拌した。次に、混合物を室温（２５℃）に冷却し、溶媒を吸引して除去した。粗精製物に酢酸エチル（１０ｍＬ）を加えて超音波処理した後、固形物が得られた。その固形物をろ過し、酢酸エチルで洗浄した後、真空乾燥し、黄土色粉末状の化合物４７を８０３ｍｇ（収率９５％）得た。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲの測定データを以下に示す。
１Ｈ－ＮＭＲデータ（４００ＭＨｚ、溶媒：ＤＭＳＯ－ｄ６）δ（ｐｐｍ）：９．４１（ｄ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），８．６１（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），８．５５（ｄｄ，Ｊ＝１．２，８．４Ｈｚ，１Ｈ），８．２７（ｄｔ，Ｊ＝２．４，７．２Ｈｚ，１Ｈ），８．０８（ｍ，２Ｈ），５．０３（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），３．０１（ｓ，３Ｈ），２．８１（ｔ，Ｊ＝２．８Ｈｚ，１Ｈ），２．２４（ｄｔ，Ｊ＝２．４，７．２Ｈｚ，２Ｈ），２．０７－２．０１（ｍ，２Ｈ），１．６０－１．５２（ｍ，２Ｈ）。
【0085】
【化32】
【0086】
下記の式（３１）で表される反応により、化合物４９を合成した。
化合物５０（４３．６ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を溶解したメタノール（１．０ｍＬ）に、化合物４７（３５．１ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（２０．２ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を加えた。その混合物を、５０℃で１２時間撹拌した後、溶媒を蒸発させて除去した。粗精製物を加温したエタノールで再結晶させた。得られた固形物をろ過し、冷却したエタノールで洗浄し、真空乾燥し、濃紫色粉末状の化合物４９を２２．９ｍｇ（収率４４％）得た。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲの測定データを以下に示す。
１Ｈ－ＮＭＲデータ（４００ＭＨｚ、溶媒：ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：８．６９（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），８．３３（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．８６（ｔ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ，１Ｈ），７．６９（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．６０（ｄｄ，Ｊ＝７．２，８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．５１（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．３２（ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．１６（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．０９（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．０３（ｄ，Ｊ＝１３．６Ｈｚ，１Ｈ），６．５６（ｄ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ，１Ｈ），４．５２（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），３．７２（ｓ，３Ｈ），２．３０（ｄｔ，Ｊ＝６．８，２．４Ｈｚ，２Ｈ），２．０５（ｍ，２Ｈ），１．９７（ｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），１．７０（ｍ，２Ｈ）。
化合物５０（４３．６ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を溶解したメタノール（１．０ｍＬ）に、化合物４７（３５．１ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）とトリエチルアミン（２０．２ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）を加えた。その混合物を、５０℃で１２時間撹拌した後、溶媒を蒸発させて除去した。粗精製物を加温したエタノールで再結晶させた。得られた固形物をろ過し、冷却したエタノールで洗浄し、真空乾燥し、濃紫色粉末状の化合物４９を２２．９ｍｇ（収率４４％）得た。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲの測定データを以下に示す。
１Ｈ－ＮＭＲデータ（４００ＭＨｚ、溶媒：ＣＤＣｌ３）δ（ｐｐｍ）：８．６９（ｄ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，１Ｈ），８．３３（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．８６（ｔ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ，１Ｈ），７．６９（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．６０（ｄｄ，Ｊ＝７．２，８．４Ｈｚ，２Ｈ），７．５１（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），７．３２（ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．１６（ｔ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．０９（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ），７．０３（ｄ，Ｊ＝１３．６Ｈｚ，１Ｈ），６．５６（ｄ，Ｊ＝１２．４Ｈｚ，１Ｈ），４．５２（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ），３．７２（ｓ，３Ｈ），２．３０（ｄｔ，Ｊ＝６．８，２．４Ｈｚ，２Ｈ），２．０５（ｍ，２Ｈ），１．９７（ｔ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，１Ｈ），１．７０（ｍ，２Ｈ）。
【0087】
【化33】
【0088】
下記の式（３２）で表される反応により、化合物５１を合成した。
化合物３６（２．３ｍｇ、４．４μｍｏｌ）を溶解したジメチルスルホキシド（７３μＬ）に、化合物４９（２．３ｍｇ、４．４μｍｏｌ）、トリス［（１－ベンジル－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル］アミン（１．０ｍｇ、１．８μｍｏｌ）、水（７３μＬ）、Ｌ－アスコルビン酸ナトリウム（２．２ｍｇ、１１μｍｏｌ）、硫酸銅（ＩＩ）五水和物（０．５ｍｇ、１．８μｍｏｌ）を加えた。その混合物を３７℃で２３時間撹拌した後、ジメチルスルホキシド（３００μＬ）と水（１００μＬ）で希釈し、ろ過した。ろ液を、逆相ＨＰＬＣによって精製し、暗い青色の粉末状の化合物５１を１．１μｍｏｌ（収率２５％）得た。収率は、標準物質としてマレイン酸を用いた定量ＮＭＲによって決定した。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、１３Ｃ－ＮＭＲおよびＥＳＩ－ＨＲＭＳの測定データを以下に示す。
１Ｈ－ＮＭＲデータ（６００ＭＨｚ、溶媒：ＤＭＳＯ－ｄ６）δ（ｐｐｍ）：８．４５（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），８．４０（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），８．１９（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），８．１４（ｄ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ，１Ｈ），８．０７（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），７．９９（ｓ，２Ｈ），７．９４（ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．８８，（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．８３（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．８０（ｓ，１Ｈ），７．６９（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．６０（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．５０（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．４３（ｓ，１Ｈ），７．３２（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．１０（ｄ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ，１Ｈ），６．８２（ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．６５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．４８（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），４．５８（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），４．４５（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２Ｈ），４．２５（ｓ，２Ｈ），４．１４（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），３．７８（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，３Ｈ），３．７３（ｓ，３Ｈ），２．６８（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．８８（ｍ，２Ｈ），１．６９（ｍ，２Ｈ）。
１３Ｃ－ＮＭＲデータ（１５１ＭＨｚ、溶媒：ＤＭＳＯ－ｄ６）δ（ｐｐｍ）：１６７．３１６１．７，１５８．０，１５４．１，１５０．４，１４６．２，１４３．９，１４２．５，１４２．３，１４２．０，１３７．９，１３３．４，１２７．７，１２６．７，１２５．６，１２５．２，１２４．７，１２４．３，１２３．２，１２２．６，１２２．３，１１７．９，１１２．６，１０９．６，１０９．３，１０８．５，９８．９，６９．７，６９．６，６９．６，６９．６，６９．０，６８．８，５３．８，５０．７，４９．２，３３．０，２８．５，２６．０，２４．５。
ＥＳＩ－ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］２＋ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ４８Ｈ５６Ｎ１０Ｏ７Ｓ２＋ ４５８．２０２２， ｆｏｕｎｄ ４５８．２０５３。
化合物３６（２．３ｍｇ、４．４μｍｏｌ）を溶解したジメチルスルホキシド（７３μＬ）に、化合物４９（２．３ｍｇ、４．４μｍｏｌ）、トリス［（１－ベンジル－１Ｈ－１，２，３－トリアゾール－４－イル）メチル］アミン（１．０ｍｇ、１．８μｍｏｌ）、水（７３μＬ）、Ｌ－アスコルビン酸ナトリウム（２．２ｍｇ、１１μｍｏｌ）、硫酸銅（ＩＩ）五水和物（０．５ｍｇ、１．８μｍｏｌ）を加えた。その混合物を３７℃で２３時間撹拌した後、ジメチルスルホキシド（３００μＬ）と水（１００μＬ）で希釈し、ろ過した。ろ液を、逆相ＨＰＬＣによって精製し、暗い青色の粉末状の化合物５１を１．１μｍｏｌ（収率２５％）得た。収率は、標準物質としてマレイン酸を用いた定量ＮＭＲによって決定した。
得られた化合物の１Ｈ－ＮＭＲ、１３Ｃ－ＮＭＲおよびＥＳＩ－ＨＲＭＳの測定データを以下に示す。
１Ｈ－ＮＭＲデータ（６００ＭＨｚ、溶媒：ＤＭＳＯ－ｄ６）δ（ｐｐｍ）：８．４５（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），８．４０（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），８．１９（ｔ，Ｊ＝６．０Ｈｚ，１Ｈ），８．１４（ｄ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ，１Ｈ），８．０７（ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ，１Ｈ），７．９９（ｓ，２Ｈ），７．９４（ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），７．８８，（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．８３（ｄ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．８０（ｓ，１Ｈ），７．６９（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．６０（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．５０（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ），７．４３（ｓ，１Ｈ），７．３２（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，１Ｈ），７．１０（ｄ，Ｊ＝１３．２Ｈｚ，１Ｈ），６．８２（ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．６５（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），６．４８（ｔ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，２Ｈ），４．５８（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），４．４５（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２Ｈ），４．２５（ｓ，２Ｈ），４．１４（ｔ，Ｊ＝４．８Ｈｚ，２Ｈ），３．７８（ｔ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，３Ｈ），３．７３（ｓ，３Ｈ），２．６８（ｔ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，２Ｈ），１．８８（ｍ，２Ｈ），１．６９（ｍ，２Ｈ）。
１３Ｃ－ＮＭＲデータ（１５１ＭＨｚ、溶媒：ＤＭＳＯ－ｄ６）δ（ｐｐｍ）：１６７．３１６１．７，１５８．０，１５４．１，１５０．４，１４６．２，１４３．９，１４２．５，１４２．３，１４２．０，１３７．９，１３３．４，１２７．７，１２６．７，１２５．６，１２５．２，１２４．７，１２４．３，１２３．２，１２２．６，１２２．３，１１７．９，１１２．６，１０９．６，１０９．３，１０８．５，９８．９，６９．７，６９．６，６９．６，６９．６，６９．０，６８．８，５３．８，５０．７，４９．２，３３．０，２８．５，２６．０，２４．５。
ＥＳＩ－ＨＲＭＳ（ｍ／ｚ）：［Ｍ＋Ｈ］２＋ ｃａｌｃｄ ｆｏｒ Ｃ４８Ｈ５６Ｎ１０Ｏ７Ｓ２＋ ４５８．２０２２， ｆｏｕｎｄ ４５８．２０５３。
【0089】
【化34】
【0090】
［実施例３］
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にＲＮＡ（０～０．２４μｍｏｌ／Ｌ）を添加したときの上記化合物２３（１０ｎｍｏｌ／Ｌ）の蛍光滴定スペクトルと、蛍光滴定からの解離定数（ＫＤ）を算出した。ＲＮＡとしては、ｈｓａ－ｍｉｒ－４５２０－１（配列番号１）、ｈｓａ－ｍｉｒ－１２５ａ（配列番号２）、ｈｓａ－ｍｉｒ－４２９１（配列番号３）、ｈｓａ－ｍｉｒ－５２６ａ－１（配列番号４）、ｈｓａ－ｍｉｒ－１０５－１（配列番号５）、ｈｓａ－ｍｉｒ－１００（配列番号６）、ｈｓａ－ｍｉｒ－５４８ｂａ（配列番号７）、ｈｓａ－ｍｉｒ－６７８６（配列番号８）、ｈｓａ－ｍｉｒ－２９９（配列番号９）、ｈｓａ－ｍｉｒ－４７７３－１（配列番号１０）、ｈｓａ－ｍｉｒ－４２８２（配列番号１１）を用いた。
蛍光滴定スペクトルの測定には、日本分光株式会社製の分光蛍光光度計ＦＰ－６５００またはＦＰ－８３００を用いた。
蛍光滴定スペクトルの測定条件を、励起波長（λｅｘ）：５０７ｎｍ、蛍光波長（λｅｍ）：５３０ｎｍ、温度：２０℃とした。
結果を図１、図２および表１に示す。図１は、化合物２３の蛍光滴定スペクトルを示す図である。図２は、化合物２３の蛍光滴定スペクトルの強度比とＲＮＡの濃度との関係を示す図である。
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にＲＮＡ（０～０．２４μｍｏｌ／Ｌ）を添加したときの上記化合物２３（１０ｎｍｏｌ／Ｌ）の蛍光滴定スペクトルと、蛍光滴定からの解離定数（ＫＤ）を算出した。ＲＮＡとしては、ｈｓａ－ｍｉｒ－４５２０－１（配列番号１）、ｈｓａ－ｍｉｒ－１２５ａ（配列番号２）、ｈｓａ－ｍｉｒ－４２９１（配列番号３）、ｈｓａ－ｍｉｒ－５２６ａ－１（配列番号４）、ｈｓａ－ｍｉｒ－１０５－１（配列番号５）、ｈｓａ－ｍｉｒ－１００（配列番号６）、ｈｓａ－ｍｉｒ－５４８ｂａ（配列番号７）、ｈｓａ－ｍｉｒ－６７８６（配列番号８）、ｈｓａ－ｍｉｒ－２９９（配列番号９）、ｈｓａ－ｍｉｒ－４７７３－１（配列番号１０）、ｈｓａ－ｍｉｒ－４２８２（配列番号１１）を用いた。
蛍光滴定スペクトルの測定には、日本分光株式会社製の分光蛍光光度計ＦＰ－６５００またはＦＰ－８３００を用いた。
蛍光滴定スペクトルの測定条件を、励起波長（λｅｘ）：５０７ｎｍ、蛍光波長（λｅｍ）：５３０ｎｍ、温度：２０℃とした。
結果を図１、図２および表１に示す。図１は、化合物２３の蛍光滴定スペクトルを示す図である。図２は、化合物２３の蛍光滴定スペクトルの強度比とＲＮＡの濃度との関係を示す図である。
【0091】
［比較例１］
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にＲＮＡ（０～１μｍｏｌ／Ｌ）を添加したときの下記の化学式（３３）で表される化合物６０（１０ｎｍｏｌ／Ｌ）の蛍光滴定スペクトルと、蛍光滴定からの解離定数（ＫＤ）を算出した。ＲＮＡとしては、実施例３と同じものを用いた。
蛍光滴定スペクトルの測定は、実施例３と同様に行った。
結果を図３、図４および表１に示す。図３は、化合物６０の蛍光滴定スペクトルを示す図である。図４は、化合物６０の蛍光滴定スペクトルの強度比とＲＮＡの濃度との関係を示す図である。
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にＲＮＡ（０～１μｍｏｌ／Ｌ）を添加したときの下記の化学式（３３）で表される化合物６０（１０ｎｍｏｌ／Ｌ）の蛍光滴定スペクトルと、蛍光滴定からの解離定数（ＫＤ）を算出した。ＲＮＡとしては、実施例３と同じものを用いた。
蛍光滴定スペクトルの測定は、実施例３と同様に行った。
結果を図３、図４および表１に示す。図３は、化合物６０の蛍光滴定スペクトルを示す図である。図４は、化合物６０の蛍光滴定スペクトルの強度比とＲＮＡの濃度との関係を示す図である。
【0092】
【化35】
【0093】
【表1】
【0094】
表１に示す結果から、化合物２３と化合物６０では、解離定数（ＫＤ）が約３桁異なることが分かった。化合物２３は、結合強度が高いことが分かった。
【0095】
［実施例４］
１×１０４のＨｅＬａ細胞を培養し、２４時間後、培地（Ｄ－ＭＥＭ）を除去、４％ＰＦＡ／ＰＢＳ溶液１００μＬを添加して細胞を浸した。室温（２５℃）で５分間インキュベート、ＰＢＳ（－）で細胞を３回洗浄した。１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／ＰＢＳ溶液 １００μＬを添加して細胞を浸し、室温（２５℃）で２０分間インキュベートした。ＰＢＳ（－）で細胞を３回洗浄、化合物２３（０．１μｍｏｌ／Ｌ）を含む染色溶液を添加して細胞を浸した。さらに、培養液にデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）またはリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）を添加した。光を遮断して５分間インキュベート後、蛍光顕微鏡で観察を行った。
図５は、ＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅを添加する前の前記培養液の蛍光顕微鏡像を示す。図６は、ＤＮａｓｅを添加した後の前記培養液の蛍光顕微鏡像を示す。図７は、ＲＮａｓｅを添加した後の前記培養液の蛍光顕微鏡像を示す。
図５～図７に示す結果から、化合物２３は、細胞質および核小体のＲＮＡの蛍光染色もできることが分かった。化合物２３は、従来の蛍光色素よりもＲＮＡに対する選択性と結合力が高いことが分かった。
１×１０４のＨｅＬａ細胞を培養し、２４時間後、培地（Ｄ－ＭＥＭ）を除去、４％ＰＦＡ／ＰＢＳ溶液１００μＬを添加して細胞を浸した。室温（２５℃）で５分間インキュベート、ＰＢＳ（－）で細胞を３回洗浄した。１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／ＰＢＳ溶液 １００μＬを添加して細胞を浸し、室温（２５℃）で２０分間インキュベートした。ＰＢＳ（－）で細胞を３回洗浄、化合物２３（０．１μｍｏｌ／Ｌ）を含む染色溶液を添加して細胞を浸した。さらに、培養液にデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）またはリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）を添加した。光を遮断して５分間インキュベート後、蛍光顕微鏡で観察を行った。
図５は、ＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅを添加する前の前記培養液の蛍光顕微鏡像を示す。図６は、ＤＮａｓｅを添加した後の前記培養液の蛍光顕微鏡像を示す。図７は、ＲＮａｓｅを添加した後の前記培養液の蛍光顕微鏡像を示す。
図５～図７に示す結果から、化合物２３は、細胞質および核小体のＲＮＡの蛍光染色もできることが分かった。化合物２３は、従来の蛍光色素よりもＲＮＡに対する選択性と結合力が高いことが分かった。
【0096】
［実施例５］
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にＲＮＡ（０～０．５μｍｏｌ／Ｌ）を添加したときの、上記の化学式（２）で表される化合物において、Ｒがメチル基である下記の化学式（３４）で表される化合物６１（１０ｎｍｏｌ／Ｌ）の蛍光滴定スペクトルと、蛍光滴定からの解離定数（ＫＤ）を算出した。ＲＮＡまたはＤＮＡとしては、ｈｓａ－ｍｉｒ－４５２０－１（配列番号１）、ｈｓａ－ｍｉｒ－１２５ａ（配列番号２）、ｈｓａ－ｍｉｒ－４２９１（配列番号３）、ｈｓａ－ｍｉｒ－１００（配列番号６）、ｈｓａ－ｍｉｒ－２９９（配列番号９）、ｈｓａ－ｍｉｒ－４７７３－１（配列番号１０）、ＤＤ－ＲＮＡ（配列番号１４：ＣＧＣＧＡＡＵＵＣＧＣＧ、配列番号１５：ＣＧＣＧＡＡＵＵＣＧＣＧ）、ＤＤ－ＤＮＡ（配列番号１６：ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＧＣＧ、配列番号１７：ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＧＣＧ）を用いた。
蛍光滴定スペクトルの測定は、実施例３と同様に行った。
結果を図８、図９および表２に示す。図８は、化合物６１の蛍光滴定スペクトルを示す図である。図９は、化合物６１の蛍光滴定スペクトルの強度比とＲＮＡの濃度との関係を示す図である。
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にＲＮＡ（０～０．５μｍｏｌ／Ｌ）を添加したときの、上記の化学式（２）で表される化合物において、Ｒがメチル基である下記の化学式（３４）で表される化合物６１（１０ｎｍｏｌ／Ｌ）の蛍光滴定スペクトルと、蛍光滴定からの解離定数（ＫＤ）を算出した。ＲＮＡまたはＤＮＡとしては、ｈｓａ－ｍｉｒ－４５２０－１（配列番号１）、ｈｓａ－ｍｉｒ－１２５ａ（配列番号２）、ｈｓａ－ｍｉｒ－４２９１（配列番号３）、ｈｓａ－ｍｉｒ－１００（配列番号６）、ｈｓａ－ｍｉｒ－２９９（配列番号９）、ｈｓａ－ｍｉｒ－４７７３－１（配列番号１０）、ＤＤ－ＲＮＡ（配列番号１４：ＣＧＣＧＡＡＵＵＣＧＣＧ、配列番号１５：ＣＧＣＧＡＡＵＵＣＧＣＧ）、ＤＤ－ＤＮＡ（配列番号１６：ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＧＣＧ、配列番号１７：ＣＧＣＧＡＡＴＴＣＧＣＧ）を用いた。
蛍光滴定スペクトルの測定は、実施例３と同様に行った。
結果を図８、図９および表２に示す。図８は、化合物６１の蛍光滴定スペクトルを示す図である。図９は、化合物６１の蛍光滴定スペクトルの強度比とＲＮＡの濃度との関係を示す図である。
【0097】
【化36】
【0098】
【表2】
【0099】
表２に示す結果から、化合物６１は、水素結合を形成していないグアニン塩基を含むＲＮＡへの結合強度・選択性が高いことが分かった。
【0100】
［実施例６］
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にＲＮＡ（０～０．５μｍｏｌ／Ｌ）を添加したときの、上記の化学式（２）で表される化合物において、Ｒがベンジル基である下記の化学式（３５）で表される化合物６２（１０ｎｍｏｌ／Ｌ）の蛍光滴定スペクトルと、蛍光滴定からの解離定数（ＫＤ）を算出した。ＲＮＡまたはＤＮＡとしては、実施例５と同じものを用いた。
蛍光滴定スペクトルの測定は、実施例３と同様に行った。
結果を図１０、図１１および表３に示す。図１０は、化合物６２の蛍光滴定スペクトルを示す図である。図１１は、化合物６２の蛍光滴定スペクトルの強度とＲＮＡの濃度との関係を示す図である。
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にＲＮＡ（０～０．５μｍｏｌ／Ｌ）を添加したときの、上記の化学式（２）で表される化合物において、Ｒがベンジル基である下記の化学式（３５）で表される化合物６２（１０ｎｍｏｌ／Ｌ）の蛍光滴定スペクトルと、蛍光滴定からの解離定数（ＫＤ）を算出した。ＲＮＡまたはＤＮＡとしては、実施例５と同じものを用いた。
蛍光滴定スペクトルの測定は、実施例３と同様に行った。
結果を図１０、図１１および表３に示す。図１０は、化合物６２の蛍光滴定スペクトルを示す図である。図１１は、化合物６２の蛍光滴定スペクトルの強度とＲＮＡの濃度との関係を示す図である。
【0101】
【化37】
【0102】
【表3】
【0103】
表３に示す結果から、化合物６２は、水素結合を形成していないグアニン塩基を含むＲＮＡへの結合強度・選択性が高いことが分かった。
【0104】
［実施例７］
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にＲＮＡ（０～０．５μｍｏｌ／Ｌ）を添加したときの、上記の化学式（２）で表される化合物において、Ｒがフェネチル基である下記の化学式（３６）で表される化合物６３（１０ｎｍｏｌ／Ｌ）の蛍光滴定スペクトルと、蛍光滴定からの解離定数（ＫＤ）を算出した。ＲＮＡまたはＤＮＡとしては、実施例５と同じものを用いた。
蛍光滴定スペクトルの測定は、実施例３と同様に行った。
結果を図１２、図１３および表４に示す。図１２は、化合物６３の蛍光滴定スペクトルを示す図である。図１３は、化合物６３の蛍光滴定スペクトルの強度比とＲＮＡの濃度との関係を示す図である。
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にＲＮＡ（０～０．５μｍｏｌ／Ｌ）を添加したときの、上記の化学式（２）で表される化合物において、Ｒがフェネチル基である下記の化学式（３６）で表される化合物６３（１０ｎｍｏｌ／Ｌ）の蛍光滴定スペクトルと、蛍光滴定からの解離定数（ＫＤ）を算出した。ＲＮＡまたはＤＮＡとしては、実施例５と同じものを用いた。
蛍光滴定スペクトルの測定は、実施例３と同様に行った。
結果を図１２、図１３および表４に示す。図１２は、化合物６３の蛍光滴定スペクトルを示す図である。図１３は、化合物６３の蛍光滴定スペクトルの強度比とＲＮＡの濃度との関係を示す図である。
【0105】
【化38】
【0106】
【表4】
【0107】
表４に示す結果から、化合物６３は、水素結合を形成していないグアニン塩基を含むＲＮＡへの結合強度・選択性が高いことが分かった。
【0108】
［実施例８］
１×１０４のＨｅＬａ細胞を培養し、２４時間後、培地（Ｄ－ＭＥＭ）を除去、４％ＰＦＡ／ＰＢＳ溶液１００μＬを添加して細胞を浸した。室温（２５℃）で５分間インキュベート、ＰＢＳ（－）で細胞を３回洗浄した。１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／ＰＢＳ溶液 １００μＬを添加して細胞を浸し、室温（２５℃）で２０分間インキュベートした。ＰＢＳ（－）で細胞を３回洗浄、化合物６３（１μｍｏｌ／Ｌ）を含む染色溶液を添加して細胞を浸した。さらに、培養液にデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）を添加した。光を遮断して５分間インキュベート後、蛍光顕微鏡で観察を行った。
図１４は、ＤＮａｓｅを添加する前の前記培養液の蛍光顕微鏡像を示す。図１５は、ＤＮａｓｅを添加した後の前記培養液の蛍光顕微鏡像を示す。
図１４および図１５に示す結果から、化合物６３は、細胞質および核小体のＲＮＡの蛍光染色もできることが分かった。化合物６３は、従来の蛍光色素よりもＲＮＡに対する結合力が高いことが分かった。
１×１０４のＨｅＬａ細胞を培養し、２４時間後、培地（Ｄ－ＭＥＭ）を除去、４％ＰＦＡ／ＰＢＳ溶液１００μＬを添加して細胞を浸した。室温（２５℃）で５分間インキュベート、ＰＢＳ（－）で細胞を３回洗浄した。１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／ＰＢＳ溶液 １００μＬを添加して細胞を浸し、室温（２５℃）で２０分間インキュベートした。ＰＢＳ（－）で細胞を３回洗浄、化合物６３（１μｍｏｌ／Ｌ）を含む染色溶液を添加して細胞を浸した。さらに、培養液にデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）を添加した。光を遮断して５分間インキュベート後、蛍光顕微鏡で観察を行った。
図１４は、ＤＮａｓｅを添加する前の前記培養液の蛍光顕微鏡像を示す。図１５は、ＤＮａｓｅを添加した後の前記培養液の蛍光顕微鏡像を示す。
図１４および図１５に示す結果から、化合物６３は、細胞質および核小体のＲＮＡの蛍光染色もできることが分かった。化合物６３は、従来の蛍光色素よりもＲＮＡに対する結合力が高いことが分かった。
【0109】
［実施例９］
１×１０４のＨｅＬａ細胞を培養し、２４時間後、培地（Ｄ－ＭＥＭ）を除去、４％ＰＦＡ／ＰＢＳ溶液１００μＬを添加して細胞を浸した。室温（２５℃）で５分間インキュベート、ＰＢＳ（－）で細胞を３回洗浄した。１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／ＰＢＳ溶液 １００μＬを添加して細胞を浸し、室温（２５℃）で２０分間インキュベートした。ＰＢＳ（－）で細胞を３回洗浄、化合物６３（１μｍｏｌ／Ｌ）を含む染色溶液を添加して細胞を浸した。さらに、培養液にリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）を添加した。光を遮断して５分間インキュベート後、蛍光顕微鏡で観察を行った。
図１６は、ＲＮａｓｅを添加する前の前記培養液の蛍光顕微鏡像を示す。図１７は、ＲＮａｓｅを添加した後の前記培養液の蛍光顕微鏡像を示す。
図１６および図１７に示す結果から、化合物６３は、細胞質および核小体のＲＮＡの蛍光染色もできることが分かった。化合物６３は、従来の蛍光色素よりもＲＮＡに対する選択性が高いことが分かった。
１×１０４のＨｅＬａ細胞を培養し、２４時間後、培地（Ｄ－ＭＥＭ）を除去、４％ＰＦＡ／ＰＢＳ溶液１００μＬを添加して細胞を浸した。室温（２５℃）で５分間インキュベート、ＰＢＳ（－）で細胞を３回洗浄した。１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／ＰＢＳ溶液 １００μＬを添加して細胞を浸し、室温（２５℃）で２０分間インキュベートした。ＰＢＳ（－）で細胞を３回洗浄、化合物６３（１μｍｏｌ／Ｌ）を含む染色溶液を添加して細胞を浸した。さらに、培養液にリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）を添加した。光を遮断して５分間インキュベート後、蛍光顕微鏡で観察を行った。
図１６は、ＲＮａｓｅを添加する前の前記培養液の蛍光顕微鏡像を示す。図１７は、ＲＮａｓｅを添加した後の前記培養液の蛍光顕微鏡像を示す。
図１６および図１７に示す結果から、化合物６３は、細胞質および核小体のＲＮＡの蛍光染色もできることが分かった。化合物６３は、従来の蛍光色素よりもＲＮＡに対する選択性が高いことが分かった。
【0110】
［実施例１０］
９５μＬの緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸、ｐＨ７．０、２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、８０ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ）に、ジメチルスルホキシド（４μＬ）と化合物２３のジメチルスルホキシド溶液（１μＬ、１０ｐｍｏｌ）を加え、混合溶液を調製した。この混合溶液の蛍光滴定スペクトルを３回測定し、その結果から、蛍光強度の標準偏差を算出した。
混合溶液をＲＮＡまたＤＮＡで滴定し、蛍光強度の変化を観察した。蛍光滴定スペクトルの測定は、実施例３と同様に行った。
得られた蛍光滴定スペクトルのデータから、以下に示す式（Ａ）によって蛍光強度の標準偏差を算出した。
ＤＬ＝３．３ｓ／ａ （Ａ）
式（Ａ）において、ＤＬは検出限界、ｓはＲＮＡまたはＤＮＡが存在しない場合のサンプルの標準偏差（ＳＤ）、ａは蛍光強度の変化とＲＮＡまたはＤＮＡ濃度との間の線形回帰の勾配を示す。
ＲＮＡとしてｈｓａ－ｍｉｒ－４５２０－１（配列番号１）を用いた場合の蛍光滴定スペクトルを図１８に示す。また、図１８に示す蛍光滴定スペクトルに基づいて検出限界を算出した結果を図１９に示す。
図１９に示す結果から、検出限界は０．１２ｎｍｏｌ／Ｌ（１．０ｎｇ／ｍＬ）であった。
ＤＮＡとしてｄｓ－ＤＮＡ（配列番号１２：ＧＣＧＣＴＧＣＣＡＧ、配列番号１３：ＣＴＧＧＣＡＧＣＧＣ；配列番号１３は配列番号１２の相補ＤＮＡである。）を用いた場合の蛍光滴定スペクトルを図２０に示す。また、図２０に示す蛍光滴定スペクトルに基づいて検出限界を算出した結果を図２１に示す。
図２１に示す結果から、検出限界は３．８ｎｍｏｌ／Ｌ（２８ｎｇ／ｍＬ）であった。
図１９および図２１において、Ｆは観測された蛍光強度、Ｆ０はＲＮＡまたはＤＮＡが存在しない場合の蛍光強度を示す。
９５μＬの緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸、ｐＨ７．０、２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、８０ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ）に、ジメチルスルホキシド（４μＬ）と化合物２３のジメチルスルホキシド溶液（１μＬ、１０ｐｍｏｌ）を加え、混合溶液を調製した。この混合溶液の蛍光滴定スペクトルを３回測定し、その結果から、蛍光強度の標準偏差を算出した。
混合溶液をＲＮＡまたＤＮＡで滴定し、蛍光強度の変化を観察した。蛍光滴定スペクトルの測定は、実施例３と同様に行った。
得られた蛍光滴定スペクトルのデータから、以下に示す式（Ａ）によって蛍光強度の標準偏差を算出した。
ＤＬ＝３．３ｓ／ａ （Ａ）
式（Ａ）において、ＤＬは検出限界、ｓはＲＮＡまたはＤＮＡが存在しない場合のサンプルの標準偏差（ＳＤ）、ａは蛍光強度の変化とＲＮＡまたはＤＮＡ濃度との間の線形回帰の勾配を示す。
ＲＮＡとしてｈｓａ－ｍｉｒ－４５２０－１（配列番号１）を用いた場合の蛍光滴定スペクトルを図１８に示す。また、図１８に示す蛍光滴定スペクトルに基づいて検出限界を算出した結果を図１９に示す。
図１９に示す結果から、検出限界は０．１２ｎｍｏｌ／Ｌ（１．０ｎｇ／ｍＬ）であった。
ＤＮＡとしてｄｓ－ＤＮＡ（配列番号１２：ＧＣＧＣＴＧＣＣＡＧ、配列番号１３：ＣＴＧＧＣＡＧＣＧＣ；配列番号１３は配列番号１２の相補ＤＮＡである。）を用いた場合の蛍光滴定スペクトルを図２０に示す。また、図２０に示す蛍光滴定スペクトルに基づいて検出限界を算出した結果を図２１に示す。
図２１に示す結果から、検出限界は３．８ｎｍｏｌ／Ｌ（２８ｎｇ／ｍＬ）であった。
図１９および図２１において、Ｆは観測された蛍光強度、Ｆ０はＲＮＡまたはＤＮＡが存在しない場合の蛍光強度を示す。
【0111】
［実施例１１］
９５μＬの緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸、ｐＨ７．０、２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、８０ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ）に、ジメチルスルホキシド（４μＬ）と化合物６２のジメチルスルホキシド溶液（１μＬ、１０ｐｍｏｌ）を加え、混合溶液を調製した。この混合溶液の蛍光滴定スペクトルを３回測定し、その結果から、蛍光強度の標準偏差を算出した。
混合溶液をＲＮＡまたＤＮＡで滴定し、蛍光強度の変化を観察した。蛍光滴定スペクトルの測定は、実施例３と同様に行った。
得られた蛍光滴定スペクトルのデータから、実施例１０と同様にして、蛍光強度の標準偏差を算出した。
ＲＮＡとしてｈｓａ－ｍｉｒ－４５２０－１（配列番号１）を用いた場合の蛍光滴定スペクトルを図２２に示す。また、図２２に示す蛍光滴定スペクトルに基づいて検出限界を算出した結果を図２３および図２４に示す。
図２３および図２４に示す結果から、検出限界は０．３５ｎｍｏｌ／Ｌ（３．０ｎｇ／ｍＬ）であった。
ＤＮＡとしてｄｓ－ＤＮＡ（配列番号１２、配列番号１３）を用いた場合の蛍光滴定スペクトルを図２５に示す。また、図２５に示す蛍光滴定スペクトルに基づいて検出限界を算出した結果を図２６に示す。
図２６に示す結果から、二本鎖ＤＮＡでは蛍光応答は観測されず、水素結合を形成しないグアニンに対する高い選択性が示された。
図２３、図２４および図２６において、Ｆは観測された蛍光強度、Ｆ０はＲＮＡまたはＤＮＡが存在しない場合の蛍光強度を示す。
９５μＬの緩衝液（２０ｍｍｏｌ／Ｌ リン酸、ｐＨ７．０、２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、８０ｍｍｏｌ／Ｌ ＫＣｌ）に、ジメチルスルホキシド（４μＬ）と化合物６２のジメチルスルホキシド溶液（１μＬ、１０ｐｍｏｌ）を加え、混合溶液を調製した。この混合溶液の蛍光滴定スペクトルを３回測定し、その結果から、蛍光強度の標準偏差を算出した。
混合溶液をＲＮＡまたＤＮＡで滴定し、蛍光強度の変化を観察した。蛍光滴定スペクトルの測定は、実施例３と同様に行った。
得られた蛍光滴定スペクトルのデータから、実施例１０と同様にして、蛍光強度の標準偏差を算出した。
ＲＮＡとしてｈｓａ－ｍｉｒ－４５２０－１（配列番号１）を用いた場合の蛍光滴定スペクトルを図２２に示す。また、図２２に示す蛍光滴定スペクトルに基づいて検出限界を算出した結果を図２３および図２４に示す。
図２３および図２４に示す結果から、検出限界は０．３５ｎｍｏｌ／Ｌ（３．０ｎｇ／ｍＬ）であった。
ＤＮＡとしてｄｓ－ＤＮＡ（配列番号１２、配列番号１３）を用いた場合の蛍光滴定スペクトルを図２５に示す。また、図２５に示す蛍光滴定スペクトルに基づいて検出限界を算出した結果を図２６に示す。
図２６に示す結果から、二本鎖ＤＮＡでは蛍光応答は観測されず、水素結合を形成しないグアニンに対する高い選択性が示された。
図２３、図２４および図２６において、Ｆは観測された蛍光強度、Ｆ０はＲＮＡまたはＤＮＡが存在しない場合の蛍光強度を示す。
【0112】
［実施例１２］
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にＲＮＡ（０～０．５μｍｏｌ／Ｌ）を添加したときの、上記の化学式（６）で表される化合物において、Ｒがメチル基である下記の化学式（３７）で表される化合物６４（１０ｎｍｏｌ／Ｌ）の蛍光滴定スペクトルと、蛍光滴定からの解離定数（ＫＤ）を算出した。ＲＮＡとしては、ｈｓａ－ｍｉｒ－４５２０－１（配列番号１）を用いた。
蛍光滴定スペクトルの測定には、日本分光株式会社製の分光蛍光光度計ＦＰ－６５００またはＦＰ－８３００を用いた。
蛍光滴定スペクトルの測定条件を、励起波長（λｅｘ）：６３３ｎｍ、蛍光波長（λｅｍ）：６５４ｎｍ、温度：２０℃とした。
結果を図２７および図２８に示す。図２７は、化合物６４の蛍光滴定スペクトルを示す図である。図２８は、化合物６４の蛍光滴定スペクトルの強度比とＲＮＡの濃度との関係を示す図である。
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にＲＮＡ（０～０．５μｍｏｌ／Ｌ）を添加したときの、上記の化学式（６）で表される化合物において、Ｒがメチル基である下記の化学式（３７）で表される化合物６４（１０ｎｍｏｌ／Ｌ）の蛍光滴定スペクトルと、蛍光滴定からの解離定数（ＫＤ）を算出した。ＲＮＡとしては、ｈｓａ－ｍｉｒ－４５２０－１（配列番号１）を用いた。
蛍光滴定スペクトルの測定には、日本分光株式会社製の分光蛍光光度計ＦＰ－６５００またはＦＰ－８３００を用いた。
蛍光滴定スペクトルの測定条件を、励起波長（λｅｘ）：６３３ｎｍ、蛍光波長（λｅｍ）：６５４ｎｍ、温度：２０℃とした。
結果を図２７および図２８に示す。図２７は、化合物６４の蛍光滴定スペクトルを示す図である。図２８は、化合物６４の蛍光滴定スペクトルの強度比とＲＮＡの濃度との関係を示す図である。
【0113】
【化39】
【0114】
【0115】
［実施例１３］
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にＲＮＡ（０．１μｍｏｌ／Ｌ）とテスト化合物（５μｍｏｌ／Ｌ、ＬＯＰＡＣ（登録商標）１２８０、Ａｌｄｒｉｃｈ社）を添加したときの、上記の化学式（２）で表される化合物において、Ｒがベンジル基である上記の化学式（３５）で表される化合物６２（０．１μｍｏｌ／Ｌ）の蛍光変化を測定した。蛍光の測定には、テカンジャパン株式会社製のマルチ検出モードプレートリーダー ＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標） Ｆ２００ ＰＲＯを用いた。ＲＮＡは、ｈｓａ－ｍｉｒ－２２１（配列番号１８：ＵＣＡＧＣＡＵＵＵＣＵＧＵＧＵＵＣＧＵＵＡＧＧＣＡＡＣＡＧＧＣＵＧＡ）を用いた。また、比較実験として、上記の化学式（３８）で表される既知のＴＯ－ＰＲＯ－１を用いて同様の実験を行った。テスト化合物存在下で蛍光強度が大きく減少したものをヒット化合物とすると、表に示すようにＴＯ－ＰＲＯ－１ではヒットしなかった化合物を１種類見出した。さらに、化合物６２とＴＯ－ＰＲＯ－１の結合位置が違うため、両方がヒットした１１種類の化合物は非特異的な結合であることが示唆される。
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）にＲＮＡ（０．１μｍｏｌ／Ｌ）とテスト化合物（５μｍｏｌ／Ｌ、ＬＯＰＡＣ（登録商標）１２８０、Ａｌｄｒｉｃｈ社）を添加したときの、上記の化学式（２）で表される化合物において、Ｒがベンジル基である上記の化学式（３５）で表される化合物６２（０．１μｍｏｌ／Ｌ）の蛍光変化を測定した。蛍光の測定には、テカンジャパン株式会社製のマルチ検出モードプレートリーダー ＴＥＣＡＮ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標） Ｆ２００ ＰＲＯを用いた。ＲＮＡは、ｈｓａ－ｍｉｒ－２２１（配列番号１８：ＵＣＡＧＣＡＵＵＵＣＵＧＵＧＵＵＣＧＵＵＡＧＧＣＡＡＣＡＧＧＣＵＧＡ）を用いた。また、比較実験として、上記の化学式（３８）で表される既知のＴＯ－ＰＲＯ－１を用いて同様の実験を行った。テスト化合物存在下で蛍光強度が大きく減少したものをヒット化合物とすると、表に示すようにＴＯ－ＰＲＯ－１ではヒットしなかった化合物を１種類見出した。さらに、化合物６２とＴＯ－ＰＲＯ－１の結合位置が違うため、両方がヒットした１１種類の化合物は非特異的な結合であることが示唆される。
【0116】
【化40】
【0117】
【表5】
【0118】
【表6】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【配列表】