(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024086621
(43)【公開日】2024-06-27
(54)【発明の名称】ＰＩＥＺＯ１阻害剤
(51)【国際特許分類】
A61K 31/415 20060101AFI20240620BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240620BHJP
A61P 7/00 20060101ALI20240620BHJP
A61P 7/06 20060101ALI20240620BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20240620BHJP
【ＦＩ】
A61K31/415
A61P43/00 111
A61P7/00
A61P7/06
A61P17/00
【審査請求】未請求
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023205145
(22)【出願日】2023-12-05
(31)【優先権主張番号】P 2022200642
(32)【優先日】2022-12-15
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り （１）掲載アドレス ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｅｎｋｙｏ．ｃｏ．ｊｐ／ｐｂｆ２０２３／ｃｏｎｔｅｎｔｓ／ｐｒｏｇｒａｍ．ｈｔｍｌ 掲載日 ２０２３年８月 （２）集会名 第２２回次世代を担う若手のためのファーマ・バイオフォーラム２０２３ 開催日 ２０２３年９月８日、９日
(71)【出願人】
【識別番号】507219686
【氏名又は名称】静岡県公立大学法人
(74)【代理人】
【識別番号】100205914
【弁理士】
【氏名又は名称】堀越 総明
(74)【代理人】
【識別番号】100162189
【弁理士】
【氏名又は名称】堀越 真弓
(72)【発明者】
【氏名】原 雄二
(72)【発明者】
【氏名】稲井 誠
(72)【発明者】
【氏名】鈴木 美希
【テーマコード（参考）】
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC36
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA51
4C086ZA89
4C086ZC41
(57)【要約】 （修正有）
【特許請求の範囲】
【請求項1】
一般式（Ｉ）で表されるピラゾール誘導体若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を含有することを特徴とするＰＩＥＺＯ１阻害剤。
［式（Ｉ）中、
Ｒ１は水素原子、ハロゲン原子、トリフルオロメチル基、炭素数１～３のアルコキシ基又は炭素数１～３のアルキル基を示し；
Ｒ２は水素原子、ハロゲン原子、トリフルオロメチル基又は炭素数１～３のアルコキシ基を示し；
Ｒ３は水素原子、ハロゲン原子、トリフルオロメチル基又は炭素数１～３のアルコキシ基を示すか、またはＲ４と互いに結合して－ＣＨ２－で示される基を示し；
Ｒ４は水素原子、炭素数１～３のアルキル基又は置換されていてもよいフェノキシ基を示すか、またはＲ３と互いに結合して－ＣＨ２－で示される基を示し；
Ｒ５は水素原子、トリフルオロメチル基、置換されていてもよいフェニル基、置換されていてもよいカルボン酸アミド基又は置換されていてもよいカルボン酸エステル基を示し；
Ｒ６は水素原子又はハロゲン原子を示し；
Ｒ７は水素原子、ハロゲン原子、炭素数１～３のアルコキシ基、置換されていてもよいスルホンアミド基又は置換されていてもよいカルボン酸アミド基を示す。］
【化1】
Ｒ１は水素原子、ハロゲン原子、トリフルオロメチル基、炭素数１～３のアルコキシ基又は炭素数１～３のアルキル基を示し；
Ｒ２は水素原子、ハロゲン原子、トリフルオロメチル基又は炭素数１～３のアルコキシ基を示し；
Ｒ３は水素原子、ハロゲン原子、トリフルオロメチル基又は炭素数１～３のアルコキシ基を示すか、またはＲ４と互いに結合して－ＣＨ２－で示される基を示し；
Ｒ４は水素原子、炭素数１～３のアルキル基又は置換されていてもよいフェノキシ基を示すか、またはＲ３と互いに結合して－ＣＨ２－で示される基を示し；
Ｒ５は水素原子、トリフルオロメチル基、置換されていてもよいフェニル基、置換されていてもよいカルボン酸アミド基又は置換されていてもよいカルボン酸エステル基を示し；
Ｒ６は水素原子又はハロゲン原子を示し；
Ｒ７は水素原子、ハロゲン原子、炭素数１～３のアルコキシ基、置換されていてもよいスルホンアミド基又は置換されていてもよいカルボン酸アミド基を示す。］
【請求項2】
式（Ｉ）中、
Ｒ１は水素原子、ハロゲン原子、トリフルオロメチル基、炭素数１～３のアルコキシ基又は炭素数１～３のアルキル基を示し；
Ｒ２は水素原子又はトリフルオロメチル基を示し；
Ｒ３は水素原子又は炭素数１～３のアルコキシ基を示すか、またはＲ４と互いに結合して－ＣＨ２－で示される基を示し；
Ｒ４は水素原子、炭素数１～３のアルキル基、水酸基で置換されたフェノキシ基を示すか、またはＲ３と互いに結合して－ＣＨ２－で示される基を示し；
Ｒ５は水素原子、トリフルオロメチル基、炭素数１～３のアルコキシ基で置換されたフェニル基、ピペリジン基で置換されたカルボン酸アミド基、又はカルボン酸エステル基を示し；
Ｒ６は水素原子又はハロゲン原子を示し；
Ｒ７は水素原子、ハロゲン原子、炭素数１～３のアルコキシ基、スルホンアミド基、又は炭素数２～４のアルケニル基で置換されたカルボン酸アミド基を示す、ことを特徴とする請求項１に記載のＰＩＥＺＯ１阻害剤。
Ｒ１は水素原子、ハロゲン原子、トリフルオロメチル基、炭素数１～３のアルコキシ基又は炭素数１～３のアルキル基を示し；
Ｒ２は水素原子又はトリフルオロメチル基を示し；
Ｒ３は水素原子又は炭素数１～３のアルコキシ基を示すか、またはＲ４と互いに結合して－ＣＨ２－で示される基を示し；
Ｒ４は水素原子、炭素数１～３のアルキル基、水酸基で置換されたフェノキシ基を示すか、またはＲ３と互いに結合して－ＣＨ２－で示される基を示し；
Ｒ５は水素原子、トリフルオロメチル基、炭素数１～３のアルコキシ基で置換されたフェニル基、ピペリジン基で置換されたカルボン酸アミド基、又はカルボン酸エステル基を示し；
Ｒ６は水素原子又はハロゲン原子を示し；
Ｒ７は水素原子、ハロゲン原子、炭素数１～３のアルコキシ基、スルホンアミド基、又は炭素数２～４のアルケニル基で置換されたカルボン酸アミド基を示す、ことを特徴とする請求項１に記載のＰＩＥＺＯ１阻害剤。
【請求項3】
式（Ｉ）中、
Ｒ１は水素原子、弗素原子又は塩素原子を示し；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ６は独立して水素原子を示し；
Ｒ５はトリフルオロメチル基を示し；
Ｒ７は炭素数１～３のアルコキシ基を示す、ことを特徴とする請求項１に記載のＰＩＥＺＯ１阻害剤。
Ｒ１は水素原子、弗素原子又は塩素原子を示し；
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ６は独立して水素原子を示し；
Ｒ５はトリフルオロメチル基を示し；
Ｒ７は炭素数１～３のアルコキシ基を示す、ことを特徴とする請求項１に記載のＰＩＥＺＯ１阻害剤。
【請求項4】
式（Ｉ）で表されるピラゾール誘導体は、以下式に示す化合物である、請求項１に記載のＰＩＥＺＯ１阻害剤。
【化2】
【請求項5】
ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルの活性化を抑制することを特徴とする請求項１～４のいずれか１項に記載のＰＩＥＺＯ１阻害剤。
【請求項6】
前記ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルの活性化が、ＰＩＥＺＯ１遺伝子の機能獲得型変異によるＰＩＥＺＯ１イオンチャネルの活性増強であることを特徴とする請求項５に記載のＰＩＥＺＯ１阻害剤。
【請求項7】
請求項１～４のいずれか１項に記載のＰＩＥＺＯ１阻害剤を有効成分として含有することを特徴とするＰＩＥＺＯ１イオンチャネルの活性化が関与する病態、症状又は疾患の予防、改善又は治療用組成物。
【請求項8】
前記ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルの活性化が、ＰＩＥＺＯ１遺伝子の機能獲得型変異によるＰＩＥＺＯ１イオンチャネルの活性増強であることを特徴とする請求項７に記載の組成物。
【請求項9】
下記式（ＩＩ）で表される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物。
【化3】
【請求項10】
下記式（ＩＩＩ）で表される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物。
【化4】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、機械受容イオンチャネルであるＰＩＥＺＯ１を特異的に阻害することのできる、新たなＰＩＥＺＯ１阻害剤に関する。
【背景技術】
【0002】
機械受容イオンチャネルＰＩＥＺＯ１は２０１０年に同定された、新しいタイプのイオンチャネルであり、細胞膜張力などの物理的な力（機械刺激）に応答して開口するＣａ２＋透過型カチオンチャネルである。ＰＩＥＺＯ１は約２５００ものアミノ酸残基からなり３量体を形成して機能すること、血管内皮、赤血球など様々な組織、器官における機械受容に関わっていることが報告されている。ＰＩＥＺＯ１は、当初、骨格筋では発現していないとされてきたが、本件発明者らは、ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルが骨格筋の再生機構に関与することを発見し（非特許文献１参照）、さらに、同イオンチャネルが膜脂質の動態により制御されること等を明らかにしている。
【0003】
このように、様々な組織、器官における機械受容に関与するＰＩＥＺＯ１イオンチャネルの生理的機能の解明のため、ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルを特異的に制御する化合物が求められている。そこで、ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルを特異的に活性化する化合物、すなわちＰＩＥＺＯ１活性化剤として、Ｙｏｄａ１（以下化学式１参照）やＪｅｄｉ１及びＪｅｄｉ２（以下化学式２参照）が提案され、研究開発の現場において用いられている。
【0004】
【化1】
【0005】
【化2】
【0006】
また、ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルを阻害する化合物としては、Ｇｄ３＋やクモ毒であるＧｓＭＴｘ－４が用いられている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Masaki TSUCHIYA, Yuji HARA et al., Nature Communications, Vol.9, Article number: 2049, 2018年, DOI: 10.1038/s41467-018-04436-w
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
しかしながら、ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルを特異的に活性化できるＹｏｄａ１等とは異なり、上述したＧｄ３＋やＧｓＭＴｘ－４は、機械受容イオンチャネル全般を阻害する作用を有するため、ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルを特異的に阻害することができない、という問題を有している。そして、現段階において、ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルを特異的に阻害できる阻害剤は報告されていない。
【0009】
したがって、本発明は上述した点に鑑みてなされたもので、その目的は、ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルを特異的に阻害するＰＩＥＺＯ１阻害剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者らは、ＰＩＥＺＯ１発現細胞を用いたＰＩＥＺＯ１イオンチャネル阻害因子の評価方法を確立し、この評価方法を用いて、東京大学創薬機構が所有する化合物ライブラリーより選択した約３３００もの化合物についてスクリーニングを行った。この結果、ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルを特異的に阻害する化合物を見出した。この知見に基づき、本発明を完成するに至った。
【0011】
上記課題を解決するため、本発明のＰＩＥＺＯ１阻害剤は、以下の一般式（Ｉ）で表されるピラゾール誘導体若しくはその塩、又はそれらの溶媒和物を含有し、式（Ｉ）中、Ｒ１は水素原子、ハロゲン原子、トリフルオロメチル基、炭素数１～３のアルコキシ基又は炭素数１～３のアルキル基を示し；Ｒ２は水素原子、ハロゲン原子、トリフルオロメチル基又は炭素数１～３のアルコキシ基を示し；Ｒ３は水素原子、ハロゲン原子、トリフルオロメチル基又は炭素数１～３のアルコキシ基を示すか、またはＲ４と互いに結合して－ＣＨ２－で示される基を示し；Ｒ４は水素原子、炭素数１～３のアルキル基又は置換されていてもよいフェノキシ基を示すか、またはＲ３と互いに結合して－ＣＨ２－で示される基を示し；Ｒ５は水素原子、トリフルオロメチル基、置換されていてもよいフェニル基、置換されていてもよいカルボン酸アミド基又は置換されていてもよいカルボン酸エステル基を示し；Ｒ６は水素原子又はハロゲン原子を示し；Ｒ７は水素原子、ハロゲン原子、炭素数１～３のアルコキシ基、置換されていてもよいスルホンアミド基又は置換されていてもよいカルボン酸アミド基を示している。
【0012】
【化3】
【0013】
上述の化合物を用いることにより、ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルを特異的に阻害することができる。これにより、ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルの生理的機能の解明のための研究開発や、ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルの活性化に伴う疾患や症状を改善、治療又は予防するための医薬にこれらの化合物を用いることができる。
【0014】
また、本発明のＰＩＥＺＯ１阻害剤は、上述した式（Ｉ）において、Ｒ１は水素原子、ハロゲン原子、トリフルオロメチル基、炭素数１～３のアルコキシ基又は炭素数１～３のアルキル基を示し；Ｒ２は水素原子又はトリフルオロメチル基を示し；Ｒ３は水素原子又は炭素数１～３のアルコキシ基を示すか、またはＲ４と互いに結合して－ＣＨ２－で示される基を示し；Ｒ４は水素原子、炭素数１～３のアルキル基、水酸基で置換されたフェノキシ基を示すか、またはＲ３と互いに結合して－ＣＨ２－で示される基を示し；Ｒ５は水素原子、トリフルオロメチル基、炭素数１～３のアルコキシ基で置換されたフェニル基、ピペリジン基で置換されたカルボン酸アミド基、又はカルボン酸エステル基を示し；Ｒ６は水素原子又はハロゲン原子を示し；Ｒ７は水素原子、ハロゲン原子、炭素数１～３のアルコキシ基、スルホンアミド基、又は炭素数２～４のアルケニル基で置換されたカルボン酸アミド基を示す化合物であることも好ましい。これにより、ＰＩＥＺＯ１阻害剤として好適な化合物が選択される。
【0015】
また、本発明のＰＩＥＺＯ１阻害剤は、上述した式（Ｉ）において、Ｒ１は水素原子、弗素原子又は塩素原子を示し；Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４及びＲ６は独立して水素原子を示し；Ｒ５はトリフルオロメチル基を示し；Ｒ７は炭素数１～３のアルコキシ基を示す化合物であることも好ましい。これにより、優れた阻害効果を有するＰＩＥＺＯ１阻害剤が得られる。
【0016】
また、本発明のＰＩＥＺＯ１阻害剤は、以下式に示す化合物であることも好ましい。これにより、ＰＩＥＺＯ１阻害作用を有する具体的な化合物が選択される。
【0017】
【化4】
【0018】
また、本発明のＰＩＥＺＯ１阻害剤は、ＰＩＥＺＯ１活性化を抑制することも好ましい。これにより、ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルの活性化を抑制することができる。
【0019】
さらに、本発明のＰＩＥＺＯ１阻害剤は、ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルの活性化が、ＰＩＥＺＯ１遺伝子の機能獲得型変異によるＰＩＥＺＯ１イオンチャネルの活性増強であることも好ましい。
【0020】
また、本発明のＰＩＥＺＯ１イオンチャネルの活性化が関与する病態、症状又は疾患の予防、改善又は治療用組成物は、上述したＰＩＥＺＯ１阻害剤を有効成分として含有する。これにより、ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルの活性化を阻害することによって、ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルの活性化に伴う病態、症状又は疾患を予防、改善又は治療することができる。
【0021】
さらに、上述した組成物において、ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルの活性化とは、ＰＩＥＺＯ１遺伝子の機能獲得型変異によるＰＩＥＺＯ１イオンチャネルの活性増強であることも好ましい。
【0022】
また、本発明は、下記式（ＩＩ）で表される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物である。式（ＩＩ）で表される化合物は、新規なピラゾール誘導体であり、ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルに対し、優れた阻害作用を有する。
【0023】
【化5】
【0024】
また、本発明は、下記式（ＩＩＩ）で表される化合物若しくはその塩又はそれらの溶媒和物である。式（ＩＩＩ）で表される化合物は、新規なピラゾール誘導体であり、ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルに対し、優れた阻害作用を有する。
【0025】
【化6】
【発明の効果】
【0026】
本発明によれば、以下のような優れた効果を有するＰＩＥＺＯ１阻害剤を提供することができる。
（１）ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルを特異的に阻害することができる。
（２）ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルの活性化や活性増強を抑制する作用を有する。
（３）ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルの活性化や活性増強に伴う病態、症状又は疾患を予防、改善又は治療することができる。
（１）ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルを特異的に阻害することができる。
（２）ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルの活性化や活性増強を抑制する作用を有する。
（３）ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルの活性化や活性増強に伴う病態、症状又は疾患を予防、改善又は治療することができる。
【図面の簡単な説明】
【0027】
【図1】実施例１における、ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルを阻害する化合物のスクリーニング結果を示すグラフである。
【図2】実施例２における、（ａ）ＳＣ－５６０のＰＩＥＺＯ１活性の阻害評価試験の結果を示すグラフ及び（ｂ）ＳＣ－５６０の濃度依存的なＰＩＥＺＯ１阻害効果を示すグラフである。
【図3】実施例３における、（ａ）ＣＯＸ－１阻害剤であるインドメタシンのＰＩＥＺＯ１活性の阻害評価試験の結果を示すグラフ及び（ｂ）インドメタシンとＤＭＳＯ（コントロール）のＰＩＥＺＯ１阻害レベルを示すグラフである。
【図4】実施例４における、マウス神経芽腫細胞株Ｎｅｕｒｏ２Ａを用いたときの（ａ）ＳＣ－５６０のＰＩＥＺＯ１活性の阻害評価試験の結果を示すグラフ及び（ｂ）ＳＣ－５６０の濃度依存的なＰＩＥＺＯ１阻害効果を示すグラフである。
【図5】実施例５における、（ａ）ＳＣ－５６０のストア作動性Ｃａ２＋チャネルの阻害評価試験の結果を示すグラフ及び（ｂ）ＳＣ－５６０とコントロール（添加なし）のストア作動性Ｃａ２＋チャネルの阻害レベルを示すグラフである。
【図6】実施例６における、（ａ）ＳＣ－５６０のＴＲＰＶ４チャネルの阻害評価試験の結果を示すグラフ及び（ｂ）ＳＣ－５６０とコントロール（添加なし）のＴＲＰＶ４チャネルの阻害レベルを示すグラフである。
【図7】実施例７における、（ａ）ＳＣ－５６０のＨｓＰＩＥＺＯ１活性の阻害評価試験の結果を示すグラフ及び（ｂ）ＳＣ－５６０とコントロール（ＤＭＳＯ）のＨｓＰＩＥＺＯ１阻害レベルを示すグラフである。
【図8】実施例８における、（ａ）ＳＣ－５６０のＪｅｄｉ２により活性化されたＰＩＥＺＯ１活性の阻害評価試験の結果を示すグラフ及び（ｂ）ＳＣ－５６０とコントロール（ＤＭＳＯ）のＪｅｄｉ２により活性化されたＰＩＥＺＯ１阻害レベルを示すグラフである。
【図9】実施例９で検討を行ったＳＣ－５６０類縁体化合物を示す図である。
【図10】実施例９で検討を行ったＳＣ－５６０類縁体化合物を示す図である。
【図12】実施例９における、ＳＣ－５６０、Ｄ４及びＤＭＳＯ（コントロール）のＰＩＥＺＯ１活性の阻害評価試験の結果を示すグラフである。
【図13】実施例１０における、ＰＩＥＺＯ１機能獲得型変異体によるＰＩＥＺＯ１活性の増強レベルを示すグラフである。
【図14】実施例１１におけるＰＩＥＺＯ１機能獲得型変異体Ｒ２４５６Ｈに対する、（ａ）ＳＣ－５６０及びコントロール（ＤＭＳＯ）のＰＩＥＺＯ１活性の阻害評価試験の結果を示すグラフ及び（ｂ）ＳＣ－５６０とＤＭＳＯのＰＩＥＺＯ１活性の阻害レベルを示すグラフである。
【図15】実施例１１における、（ａ）ＰＩＥＺＯ１機能獲得型変異体Ａ２０２０Ｔに対する、ＳＣ－５６０及びコントロール（ＤＭＳＯ）のＰＩＥＺＯ１活性の阻害評価試験の結果を示すグラフ、（ｂ）ＰＩＥＺＯ１機能獲得型変異体Ｔ２１２７Ｍに対する、ＳＣ－５６０及びコントロール（ＤＭＳＯ）のＰＩＥＺＯ１活性の阻害評価試験の結果を示すグラフ及び（ｃ）ＰＩＥＺＯ１機能獲得型変異体Ｍ２２２５Ｒに対する、ＳＣ－５６０及びコントロール（ＤＭＳＯ）のＰＩＥＺＯ１活性の阻害評価試験の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0028】
以下、本発明のＰＩＥＺＯ１阻害剤について詳細に説明する。本発明におけるＰＩＥＺＯ１とは、細胞膜張力などの物理的な力（機械刺激）に応答して開口するＣａ２＋透過型カチオンチャネルである。ＰＩＥＺＯ１は約２５００ものアミノ酸残基からなり３量体を形成して機能すること、血管内皮、赤血球、骨格筋など様々な組織、器官における機械受容に関わっていることが報告されている。
【0029】
本発明におけるＰＩＥＺＯ１阻害とは、ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルを阻害すること、すなわち、ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルによるイオン透過活性が抑制されることをいい、本発明のＰＩＥＺＯ１阻害剤を添加又は投与されない状態のコントロールと比較して、ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルによるイオン透過活性が抑制されていることを意味する。さらに、本発明におけるＰＩＥＺＯ１阻害剤は、ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルを特異的に阻害する機能を有すること、すなわち、ＰＩＥＺＯ１のイオン透過活性を特異的に抑制できることが好ましい。また、本発明におけるＰＩＥＺＯ１阻害剤は、ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルの活性化や活性増強を抑制できることが好ましく、例えば、ＰＩＥＺＯ１遺伝子の機能獲得型変異によるＰＩＥＺＯ１イオンチャネルの活性増強（活性亢進）を抑制できることが好ましい。
【0030】
本発明のＰＩＥＺＯ１阻害剤には、以下式（Ｉ）で表されるピラゾール誘導体が含まれる。本発明に係るピラゾール誘導体に係る化合物は塩であってもよく、薬理学的に許容される塩であることが好ましい。この化合物の薬理学的に許容される塩としては、酸又は塩基と形成される塩であればよく、特に限定されない。また、この化合物又はその塩は、溶媒和物であってもよく、特に限定されないが、例えば、水和物、エタノール等の有機溶媒和物が挙げられる。
【0031】
【化7】
【0032】
上述した化合物を表す式（Ｉ）中、Ｒ１で示される原子又は分子としては、水素原子、ハロゲン原子、トリフルオロメチル基、炭素数１～３のアルコキシ基又は炭素数１～３のアルキル基が挙げられる。このうち、ハロゲン原子としては、弗素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子が挙げられるが、阻害効果に優れる観点から、弗素原子又は塩素原子が好ましい。また、炭素数１～３のアルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基又はプロポキシ基等が挙げられるが、阻害効果の観点から、メトキシ基が好ましい。さらに、炭素数１～３のアルキル基としては、メチル基、エチル基又はプロピル基等が挙げられる。上述したＲ１で示される原子又は分子としては、阻害効果に特に優れる観点から、水素原子、弗素原子又は塩素原子が特に好ましい。
【0033】
次に、Ｒ２で示される原子又は分子としては、水素原子、ハロゲン原子、トリフルオロメチル基又は炭素数１～３のアルコキシ基が挙げられる。このうち、ハロゲン原子としては、弗素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子が挙げられる。また、炭素数１～３のアルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基又はプロポキシ基等が挙げられる。上述したＲ２で示される原子又は分子としては、阻害効果に優れる観点から、水素原子又はトリフルオロメチル基を選択することが好ましく、水素原子が特に好ましい。
【0034】
次に、Ｒ３で示される原子又は分子としては、水素原子、ハロゲン原子、トリフルオロメチル基又は炭素数１～３のアルコキシ基を示すか、またはＲ４と互いに結合して－ＣＨ２－で示される基が挙げられる。このうち、ハロゲン原子としては、弗素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子が挙げられる。また、炭素数１～３のアルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基又はプロポキシ基等が挙げられる。上述したＲ３で示される原子又は分子としては、阻害効果に優れる観点から、水素原子又は炭素数１～３のアルコキシ基を示すか、またはＲ４と互いに結合して－ＣＨ２－で示される基を選択することが好ましく、水素原子が特に好ましい。
【0035】
Ｒ４で示される原子又は分子としては、水素原子、炭素数１～３のアルキル基又は置換されていてもよいフェノキシ基を示すか、またはＲ３と互いに結合して－ＣＨ２－で示される基が挙げられる。このうち、炭素数１～３のアルキル基としては、メチル基、エチル基又はプロピル基等が挙げられる。また、置換されていてもよいフェノキシ基としては、無置換のフェノキシ基のほか、１つ以上の水酸基若しくは１つ以上のアルコキシ基で置換されたフェノキシ基等が挙げられる。上述したＲ４で示される原子又は分子としては、阻害効果に優れる観点から、水素原子、炭素数１～３のアルキル基、水酸基で置換されたフェノキシ基を示すか、またはＲ３と互いに結合して－ＣＨ２－で示される基を選択することがより好ましく、水素原子が特に好ましい。
【0036】
Ｒ５で示される原子又は分子としては、水素原子、トリフルオロメチル基、置換されていてもよいフェニル基、置換されていてもよいカルボン酸アミド基又は置換されていてもよいカルボン酸エステル基が挙げられる。このうち、置換されていてもよいフェニル基としては、無置換のフェニル基のほか、１つ以上の炭素数１～３のアルコキシ基で置換されたフェニル基が挙げられ、より具体的には、２つ以上のアルコキシ基で置換されたフェニル基が好ましく、２つのメトキシ基で置換されたフェニル基が特に好ましい。また、置換されていてもよいカルボン酸アミド基としては、無置換のカルボン酸アミド基のほか、ピペリジン基で置換されたカルボン酸アミド基が挙げられる。上述したＲ５で示される原子又は分子としては、阻害効果に優れる観点から、水素原子、トリフルオロメチル基、炭素数１～３のアルコキシ基で置換されたフェニル基、ピペリジン基で置換されたカルボン酸アミド基又はカルボン酸エステル基を選択することが好ましく、このうち、トリフルオロメチル基が特に好ましい。
【0037】
Ｒ６で示される原子又は分子としては、水素原子又はハロゲン原子が挙げられる。このうち、ハロゲン原子としては、弗素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子が挙げられる。上述したＲ６で示される原子としては、阻害効果に優れる観点から、水素原子が好ましく選択される。
【0038】
次に、Ｒ７で示される原子又は分子としては、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１～３のアルコキシ基、置換されていてもよいスルホンアミド基又は置換されていてもよいカルボン酸アミド基が挙げられる。ハロゲン原子としては、弗素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子が挙げられる。また、炭素数１～３のアルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基又はプロポキシ基等が挙げられるが、効果に優れる観点から、メトキシ基が特に好ましい。置換されていてもよいカルボン酸アミド基としては、無置換のカルボン酸アミド基のほか、炭素数２～４のアルケニル基で置換されたカルボン酸アミド基が挙げられる。上述したＲ６で示される原子又は分子としては、阻害効果に優れる観点から、水素原子、ハロゲン原子、炭素数１～３のアルコキシ基、スルホンアミド基又は炭素数２～４のあるアルケニル基で置換されたカルボン酸アミド基を選択することが好ましく、炭素数１～３のアルコキシ基を選択することが特に好ましい。
【0039】
また、上述の式（Ｉ）で表される化合物として、具体的には、以下式に示される化合物（Ｉａ）～（Ｉｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）が挙げられる。
【0040】
【化8】
【0041】
各式の化合物名は次の通りである。
式（Ｉａ）：５－（４－クロロフェニル）－１－（４－メトキシフェニル）－３－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ピラゾール（別名：ＳＣ－５６０）、
式（Ｉｂ）：１－（４－メトキシフェニル）－５－フェニル－３－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ピラゾール、
式（Ｉｃ）：５－（４－フルオロフェニル）－１－（４－メトキシフェニル）－３－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ピラゾール、
式（Ｉｄ）：５－（４－ブロモフェニル）－１－（４－メトキシフェニル）－３－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ピラゾール、
式（ＩＩ）：１－（４－メトキシフェニル）－３－（トリフルオロメチル）－５－（３－（トリフルオロメチル）フェニル）－１Ｈ－ピラゾール、
式（ＩＩＩ）：１－（４－メトキシフェニル）－３－（トリフルオロメチル）－５－（４－（トリフルオロメチル）フェニル）－１Ｈ－ピラゾール、
式（Ｉｅ）：４－［５－（４－メチルフェニル）－３－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ピラゾール－１－イル］ベンゼンスルホンアミド（別名：ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ）、
式（Ｉｆ）：エチル１－（４－（ジアリルカルバモイル）フェニル）－１，４－ジヒドロインデノ［１，２－ｃ］ピラゾール－３－カルボキシレート
式（Ｉｇ）：３，５－ビス（２，４－ジメトキシフェニル）－１－フェニル－１Ｈ－ピラゾール
式（Ｉｈ）：２－［（１，５－ジフェニル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）オキシ］フェノール
式（Ｉｉ）：５－（４－クロロフェニル）－１－（２，４－ジクロロフェニル）－４－メチル－Ｎ－１－ピペリジニル－１Ｈ－ピラゾール－３－カルボキサミド塩酸塩（別名：Ｒｉｍｏｎａｂａｎｔ）
式（Ｉａ）：５－（４－クロロフェニル）－１－（４－メトキシフェニル）－３－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ピラゾール（別名：ＳＣ－５６０）、
式（Ｉｂ）：１－（４－メトキシフェニル）－５－フェニル－３－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ピラゾール、
式（Ｉｃ）：５－（４－フルオロフェニル）－１－（４－メトキシフェニル）－３－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ピラゾール、
式（Ｉｄ）：５－（４－ブロモフェニル）－１－（４－メトキシフェニル）－３－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ピラゾール、
式（ＩＩ）：１－（４－メトキシフェニル）－３－（トリフルオロメチル）－５－（３－（トリフルオロメチル）フェニル）－１Ｈ－ピラゾール、
式（ＩＩＩ）：１－（４－メトキシフェニル）－３－（トリフルオロメチル）－５－（４－（トリフルオロメチル）フェニル）－１Ｈ－ピラゾール、
式（Ｉｅ）：４－［５－（４－メチルフェニル）－３－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ピラゾール－１－イル］ベンゼンスルホンアミド（別名：ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ）、
式（Ｉｆ）：エチル１－（４－（ジアリルカルバモイル）フェニル）－１，４－ジヒドロインデノ［１，２－ｃ］ピラゾール－３－カルボキシレート
式（Ｉｇ）：３，５－ビス（２，４－ジメトキシフェニル）－１－フェニル－１Ｈ－ピラゾール
式（Ｉｈ）：２－［（１，５－ジフェニル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）オキシ］フェノール
式（Ｉｉ）：５－（４－クロロフェニル）－１－（２，４－ジクロロフェニル）－４－メチル－Ｎ－１－ピペリジニル－１Ｈ－ピラゾール－３－カルボキサミド塩酸塩（別名：Ｒｉｍｏｎａｂａｎｔ）
【0042】
なお、各式で表される化合物のうち、式（ＩＩ）及び式（ＩＩＩ）に示す化合物が今回、新規化合物として発見された。
【0043】
また、各式で表わされる化合物のうち、特に薬理活性の点から好ましい化合物としては、式（Ｉｃ）に示す５－（４－フルオロフェニル）－１－（４－メトキシフェニル）－３－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ピラゾールや式（Ｉａ）に示す５－（４－クロロフェニル）－１－（４－メトキシフェニル）－３－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ピラゾール（別名：ＳＣ－５６０）のほか、式（Ｉｂ）に示す１－（４－メトキシフェニル）－５－フェニル－３－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ピラゾールを挙げることができ、後述する実施例でも示すように、式（Ｉｃ）に示す５－（４－フルオロフェニル）－１－（４－メトキシフェニル）－３－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ピラゾールが特に好ましい。
【0044】
なお、本発明のピラゾール誘導体に係る化合物には、置換基の結合位置又は不斉炭素原子により立体異性体が存在する場合があるが、本発明には全ての立体異性体が含まれ得る。
【0045】
上述した式（Ｉ）に示す化合物並びに式（Ｉａ）～（Ｉｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）に示すピラゾール誘導体に係る化合物は、ピラゾール合成法に係る公知の合成方法で製造することができる。
【0046】
一例として、式（Ｉｂ）に示す化合物、１－（４－メトキシフェニル）－５－フェニル－３－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ピラゾールは、エタノール反応溶媒中、４，４，４－トリフルオロ－１－フェニルブタン－１，３－ジオンと（４－メトキシフェニル）ヒドラジン塩酸塩を加熱環流することで合成することができる。
【0047】
また、一例として、式（Ｉｃ）に示す化合物、５－（４－フルオロフェニル）－１－（４－メトキシフェニル）－３－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ピラゾールは、エタノール反応溶媒中、４，４，４－トリフルオロ－１－（４－フルオロフェニル）ブタン－１，３－ジオンと（４－メトキシフェニル）ヒドラジン塩酸塩を加熱環流することで合成することができる。
【0048】
また、一例として、式（Ｉｄ）に示す化合物、５－（４－ブロモフェニル）－１－（４－メトキシフェニル）－３－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ピラゾールは、エタノール反応溶媒中、１－（４－ブロモフェニル）－４，４，４－トリフルオロブタン－１，３－ジオンと（４－メトキシフェニル）ヒドラジン塩酸塩を加熱環流することで合成することができる。
【0049】
また、一例として、式（ＩＩ）に示す化合物、１－（４－メトキシフェニル）－３－（トリフルオロメチル）－５－（３－（トリフルオロメチル）フェニル）－１Ｈ－ピラゾールは、エタノール反応溶媒中、４，４，４－トリフルオロ－１－（３－（トリフルオロメチル）フェニル）ブタン－１，３－ジオンと（４－メトキシフェニル）ヒドラジン塩酸塩を加熱環流することで合成することができる。
【0050】
また、一例として、式（ＩＩＩ）に示す化合物、１－（４－メトキシフェニル）－３－（トリフルオロメチル）－５－（４－（トリフルオロメチル）フェニル）－１Ｈ－ピラゾールは、エタノール反応溶媒中、４，４，４－トリフルオロ－１－（４－（トリフルオロメチル）フェニル）ブタン－１，３－ジオンと（４－メトキシフェニル）ヒドラジン塩酸塩を加熱環流することで合成することができる。
【0051】
本発明のＰＩＥＺＯ１阻害剤は、上述した式（Ｉ）で表されるピラゾール誘導体を含むものであって、ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルを阻害する作用を有する。また、本明細書において、ＰＩＥＺＯ１阻害作用とＰＩＥＺＯ１アンタゴニスト作用とは同義である。本発明のＰＩＥＺＯ１阻害剤は、ＰＩＥＺＯ１イオンチャネル生理的機能の解明等を目的とした研究用試薬として用いることができる。本発明に係るＰＩＥＺＯ１阻害剤の使用濃度としては、適用する細胞、ＰＩＥＺＯ１の発現量、環境中に存在する又は添加される成分の影響や目標とする阻害効果に応じて適宜調整可能であるが、一例として、５ｎＭ～１０ｍＭ程度とすることが好ましく、０．１μＭ～１００μＭ程度とすることがより好ましく、１μＭ～１０μＭ程度とすることが特に好ましい。
【0052】
また、本発明のＰＩＥＺＯ１阻害剤は、ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルの活性化が関与する病態、症状又は疾患の予防、改善又は治療に用いることができる。この「ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルの活性化」には、ＰＩＥＺＯ１遺伝子の機能獲得型変異によるＰＩＥＺＯ１イオンチャネルの活性増強（活性亢進）が含まれる。ここでの治療や病態の改善には、これらの疾患や病態に対する予防や予後の処置も含まれる。ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルの活性化が関与する病態、症状又は疾患には、遺伝子性溶血性貧血、皮膚の痒み（掻痒感）等が広く含まれ、特に、脱水型遺伝性有口赤血球症、機械刺激による掻痒又はこれらに関連する症状又は疾患が含まれる。本発明のＰＩＥＺＯ１阻害剤は、これらの病態、症状又は疾患の一つ又は複数に対する治療や改善、症状や病態の抑制や予防等に用いられる。本発明のＰＩＥＺＯ１阻害剤は、ヒト又は動物のための医薬品、医薬部外品及び食品として用いることができる。食品には、サプリメント、健康食品、機能性食品、特定保健用食品等も含まれる。
【0053】
本発明のＰＩＥＺＯ１阻害剤を医薬品又は医薬部外品として用いる場合には、従来慣用されている方法により種々の形態に調製することができる。この場合、通常製剤用の薬理学的に許容される担体や賦形剤、滑沢剤、分散剤、崩壊剤、緩衝剤、溶剤、増量剤、保存剤、香料又は安定化剤など、医薬品の添加剤として許容されている添加剤を用いて製剤化することができる。さらに、この化合物のバイオアベイラビリティーや安定性を向上させるために、マイクロカプセル、リポソーム製剤、微粉末化又はシクロデキストリン等を用いた包接化などの製剤技術を含むドラッグデリバリーシステムを用いることもできる。
【0054】
本発明のＰＩＥＺＯ１阻害剤を経口投与製剤として用いる場合には、錠剤、顆粒剤、カプセル剤又は内服用液剤等の形態で用いることができるが、消化管からの吸収に適した形態で用いることが好ましい。また、流通性、保存性などの理由により所望される形態での製剤を提供する場合にも従来の製剤技術を用いることができる。また、外用剤等の非経口投与剤として用いる場合には、クリーム、軟膏、貼付剤などの経皮吸収剤のほか、注射剤および坐剤等の形態とすることができる。また、流通性や保存性などの理由から固形製剤を使用時に適当な溶剤で溶解してから用いることもでき、液剤および半固形剤の形態で提供することも従来の製剤技術により可能である。本発明のＰＩＥＺＯ１阻害剤の投与量又は有効摂取量は、目標とする治療効果、投与方法、投与対象及び剤形によって変化するため、特に限定されない。
【0055】
次に、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明は、これらの実施例によってなんら限定されるものではない。
【実施例0056】
［実施例１］
１．ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルを阻害する化合物のスクリーニング（１）
本実施例では、ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルを阻害する化合物の探索を行った。スクリーニング対象には、東京大学創薬機構が所有する化合物ライブラリー「Ｖａｌｉｄａｔｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｌｉｂｒａｒｙ」を選択した。同ライブラリーは既存薬：約１５００サンプル、既知薬理活性試薬：約１８００の合計約３３００サンプルから構成されている。本実施例におけるスクリーニング方法としては、本件発明者らが構築したＰＩＥＺＯ１イオンチャネル阻害因子の評価方法を用いた。評価方法は具体的には次の通りである。
１．ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルを阻害する化合物のスクリーニング（１）
本実施例では、ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルを阻害する化合物の探索を行った。スクリーニング対象には、東京大学創薬機構が所有する化合物ライブラリー「Ｖａｌｉｄａｔｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｌｉｂｒａｒｙ」を選択した。同ライブラリーは既存薬：約１５００サンプル、既知薬理活性試薬：約１８００の合計約３３００サンプルから構成されている。本実施例におけるスクリーニング方法としては、本件発明者らが構築したＰＩＥＺＯ１イオンチャネル阻害因子の評価方法を用いた。評価方法は具体的には次の通りである。
【0057】
数千種類の化合物のスクリーニングを迅速かつ容易に行うため、マイクロプレートリーダーと９６ウェルプレートを用い、Ｃａ２＋プローブによる細胞内へのＣａ２＋流入を指標にしてＰＩＥＺＯ１活性を評価する方法を構築した。使用する細胞には、ＰＩＥＺＯ１を安定して発現する細胞であって、プレートに十分に接着し、測定範囲にて鋭利な変化を示すＣａ２＋プローブを有する細胞が求められる。そのため、ｐＭＸｓ－ｐｕｒｏウイルスベクターを用いて、マウス筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２にカルシウムプローブＧＣａＭＰ６ｓを安定発現させた細胞株を樹立した。このＧＣａＭＰ６ｓ安定発現Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞株を黒色の９６ｗｅｌｌプレート（平底タイプ、ｇｒｅｉｎｅｒ）に３×１０４ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように播種し、ＣＯ２通気下、３７℃で一晩インキュベートした。
【0058】
各ウェル内の培地を１８０μＬの２Ｃａ２＋－ＨＢＳに交換した後、５～１０分静置した後にマイクロプレートリーダー（テカン社製品、型番：ＩＮＦＩＮＩＴＥ ２００Ｆ ＰＲＯ）を用いて測光（４回／１５秒間隔）した。なお、２Ｃａ２＋－ＨＢＳの組成は、１０７ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１１．５ｍＭ グルコース、１．２ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ ＣａＣｌ２であり、ｐＨ＝７．４にＮａＯＨで調整している。
【0059】
次に、化合物ライブラリー「Ｖａｌｉｄａｔｅｄ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｌｉｂｒａｒｙ」の各化合物について、２Ｃａ２＋－ＨＢＳを加えてよく混合した後、各化合物の最終濃度が５μＭとなるように、各ウェルに２０μＬずつ添加した。５～１０分静置した後にマイクロプレートリーダーを用いて測光（４回／１５秒間隔）した。この各化合物の添加前後において、蛍光強度が大きく変化した化合物はスクリーニング対象から除外した。
【0060】
上述の各化合物が添加されたウェルプレートに対し、ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルを特異的に活性化させるＹｏｄａ１を添加し、Ｙｏｄａ１による活性化が阻害されるかどうかを評価した。具体的には、８連のマイクロピペットを用いて６６μＭのＹｏｄａ１（型番：５５８６、Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製品）を最終濃度６μＭとなるように、ウェルに２０μＬ静かに添加した。他方、コントロールとして、Ｙｏｄａ１の替わりに２Ｃａ２＋－ＨＢＳをウェルに２０μＬ静かに添加した。その後、マイクロプレートリーダーを用いて、再度測光（１２回、１５秒間隔）を行った。上述の操作を９６ｗｅｌｌの２列（１６ｗｅｌｌ）ずつ順に行った。
【0061】
結果を図１のグラフに示す。横軸は化合物ＩＤを、縦軸は蛍光強度Ｆ／Ｆ０を示す。Ｆ／Ｆ０＝刺激後（Ｙｏｄａ１添加後）の蛍光強度Ｆ／刺激前（Ｙｏｄａ１添加前）の蛍光強度Ｆ０、である。Ｙｏｄａ１の添加により、ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルが活性化されてＧＣａＭＰ６ｓの蛍光強度が大きく増加するところ、その増加割合が小さい化合物は、ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルの活性化を抑制する可能性を有する。本実施例では、蛍光強度Ｆ／Ｆ０が３倍以下に抑制された化合物をヒット化合物とした。この結果より、３０種のヒット化合物を得た。
【0062】
［実施例２］
２．ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルを阻害する化合物のスクリーニング（２）
本実施例では、実施例１で得た３０種のヒット化合物のＰＩＥＺＯ１阻害効果について、より詳細な検討を行った。本実施例におけるスクリーニング方法には、実施例１で用いた方法とは異なり、マウス筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２の野生型細胞を用い、カルシウムプローブとしてＦｕｒａ２を用いた。また、実験系としてガラスボトムディッシュ上に播種したＣ２Ｃ１２細胞に各化合物を添加して細胞内カルシウムイメージングを行い、ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルへの効果を検討した。評価方法は具体的には次の通りである。
２．ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルを阻害する化合物のスクリーニング（２）
本実施例では、実施例１で得た３０種のヒット化合物のＰＩＥＺＯ１阻害効果について、より詳細な検討を行った。本実施例におけるスクリーニング方法には、実施例１で用いた方法とは異なり、マウス筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２の野生型細胞を用い、カルシウムプローブとしてＦｕｒａ２を用いた。また、実験系としてガラスボトムディッシュ上に播種したＣ２Ｃ１２細胞に各化合物を添加して細胞内カルシウムイメージングを行い、ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルへの効果を検討した。評価方法は具体的には次の通りである。
【0063】
マウス筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２の野生型細胞（ＡＴＣＣ）をガラスボトムディッシュ（１４４ｍｍ径、ポリリジンコート、松浪硝子工業株式会社製品）に４×１０４ｃｅｌｌｓとなるように播種し、ＣＯ２通気下、３７℃で一晩インキュベートした。培地にはＤＭＥＭ培地に１０％ＦＢＳ、５％ペニシリン－ストレプトマイシン、２ｍＭのＬ－グルタミン溶液を添加した培地を用いた。
【0064】
測定開始１時間前に、培地をＦｕｒａ２（型番：Ｆｕｒａ２－ＡＭ、株式会社同仁化学研究所製品）を１０μＭ含むＤＭＥＭに替え、３７℃で１時間インキュベートした。その後、Ｆｕｒａ２含有ＤＭＥＭを除去し、５００μＬの２Ｃａ２＋－ＨＢＳ（実施例１で用いたものと同様の組成、ｐＨからなる）で洗い流した後、２５０μＬの２Ｃａ２＋－ＨＢＳに細胞を浸した。
【0065】
次に、測定開始の１分前に、各ヒット化合物の２Ｃａ２＋－ＨＢＳ溶液（ヒット化合物濃度：２０μＭ）を各ヒット化合物の最終濃度が５μＭとなるように、ディッシュに２５０μＬ添加した。他方、コントロールとして、ヒット化合物の替わりにＤＭＳＯを用いた。その後、後述する測定条件にて測定を開始した。測定開始から６分後に、同ディッシュにＰＩＥＺＯ１イオンチャネルを特異的に活性化させるＹｏｄａ１を添加し、先に添加されたヒット化合物によってＹｏｄａ１による活性化が阻害されるかどうかを調べた。具体的には、Ｙｏｄａ１の２Ｃａ２＋－ＨＢＳ溶液（Ｙｏｄａ１濃度：１０μＭ）をＹｏｄａ１の最終濃度が５μＭとなるように、ディッシュに５００μＬ添加した。
【0066】
測定は落射顕微鏡で行い、合計１２分間の測定を行った。励起波長は３４０ｎｍ及び３８０ｎｍとし、いずれも露出時間は６００μ秒、１０秒間隔で測定を行った。
【0067】
この結果、図２（ａ）に示すように、「ＳＣ－５６０」と呼ばれているピラゾール誘導体、５－（４－クロロフェニル）－１－（４－メトキシフェニル）－３－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ピラゾール（上述の式（Ｉａ）に化学構造式を示す）に顕著なＰＩＥＺＯ１イオンチャネル活性の阻害効果が確認された。図２（ａ）のグラフの横軸は測定時間（分）、縦軸のＦｕｒａ２ Ｒａｔｉｏは励起波長３４０ｎｍでの蛍光強度／励起波長３８０ｎｍでの蛍光強度の値を示す。
【0068】
そこで、ＳＣ－５６０の添加濃度とＰＩＥＺＯ１阻害効果との関係を調べるべく、上述した評価方法において、ディッシュに添加するＳＣ－５６０の２Ｃａ２＋－ＨＢＳ溶液をＳＣ－５６０の最終濃度が１μＭ、３μＭ、５μＭ、１０μＭとなるように添加した以外は、上述と同様の試験を行った。結果を図２（ｂ）のグラフに示す。図２（ｂ）のグラフの横軸はＳＣ－５６０の濃度、縦軸のΔＲａｔｉｏは励起波長３４０ｎｍでの蛍光強度／励起波長３８０ｎｍでの蛍光強度の値であって、Ｙｏｄａ１添加後の測定時間（測定開始から６～１２分）における最大値から、Ｙｏｄａ１添加前の測定時間（測定開始から０～２分）における平均値を減じた値を示している。
【0069】
これらの結果によれば、マウス筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２細胞において、ＳＣ－５６０は同化合物を添加した際に細胞内へのカルシウム流入は生じず、さらに濃度依存的に内在性ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルの活性化を阻害することが確認された。このことから、ＳＣ－５６０は直接的にＰＩＥＺＯ１を阻害している可能性が見出された。
【0070】
［実施例３］
３．ＳＣ－５６０によるＰＩＥＺＯ１阻害効果の特異性の検討（１）
「ＳＣ－５６０」と呼ばれているピラゾール誘導体、５－（４－クロロフェニル）－１－（４－メトキシフェニル）－３－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ピラゾールは、ＣＯＸ－１（シクロオキシゲナーゼ１）の阻害剤として知られており、以下表１の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）に示すように、ＣＯＸ－１を選択的に阻害する。このことから、実施例２で得られたＳＣ－５６０のＰＩＥＺＯ１阻害効果は、ＣＯＸ－１阻害依存的に生じている可能性を有する。そこで、ＣＯＸ－１選択的阻害剤である、以下表１に示すインドメタシンを添加した際のＰＩＥＺＯ１イオンチャネル活性への影響を検討し、ＣＯＸ－１阻害がＰＩＥＺＯ１イオンチャネル活性に与える影響を調べた。
３．ＳＣ－５６０によるＰＩＥＺＯ１阻害効果の特異性の検討（１）
「ＳＣ－５６０」と呼ばれているピラゾール誘導体、５－（４－クロロフェニル）－１－（４－メトキシフェニル）－３－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ピラゾールは、ＣＯＸ－１（シクロオキシゲナーゼ１）の阻害剤として知られており、以下表１の５０％阻害濃度（ＩＣ５０）に示すように、ＣＯＸ－１を選択的に阻害する。このことから、実施例２で得られたＳＣ－５６０のＰＩＥＺＯ１阻害効果は、ＣＯＸ－１阻害依存的に生じている可能性を有する。そこで、ＣＯＸ－１選択的阻害剤である、以下表１に示すインドメタシンを添加した際のＰＩＥＺＯ１イオンチャネル活性への影響を検討し、ＣＯＸ－１阻害がＰＩＥＺＯ１イオンチャネル活性に与える影響を調べた。
【0071】
【表1】
【0072】
実施例２の評価方法において、ディッシュに添加するＳＣ－５６０に替えて、インドメタシンの２Ｃａ２＋－ＨＢＳ溶液をインドメタシンの最終濃度が５μＭとなるように添加した以外は、実施例２と同様の試験を行った。結果を図３に示す。図３（ａ）のグラフの横軸は測定時間（分）、縦軸のＦｕｒａ２ Ｒａｔｉｏは励起波長３４０ｎｍでの蛍光強度／励起波長３８０ｎｍでの蛍光強度の値を示す。図３（ｂ）のグラフの縦軸のΔＲａｔｉｏは励起波長３４０ｎｍでの蛍光強度／励起波長３８０ｎｍでの蛍光強度の値であって、Ｙｏｄａ１添加後の測定時間（測定開始から６～１２分）における最大値から、Ｙｏｄａ１添加前の測定時間（測定開始から０～２分）における平均値を減じた値を示している。
【0073】
これらの結果によれば、ＣＯＸ－１阻害剤であるインドメタシンには、ＳＣ－５６０とは異なり、有意なＰＩＥＺＯ１イオンチャネル阻害効果はないことが明らかとなった。この結果から、ＳＣ－５６０によるＰＩＥＺＯ１イオンチャネル阻害はＣＯＸ－１阻害に依存するものではないことが示された。
【0074】
［実施例４］
４．ＳＣ－５６０によるＰＩＥＺＯ１阻害効果の特異性の検討（２）
上述した実施例１～３での評価では、マウス筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２細胞を用いているところ、他の種類の細胞においてもＳＣ－５６０の添加によりＰＩＥＺＯ１イオンチャネル活性の阻害が確認されるかどうか、検討を行った。Ｃ２Ｃ１２細胞と同様に内在的にＰＩＥＺＯ１を発現するマウス神経芽腫細胞株Ｎｅｕｒｏ２Ａを用いて試験を行った。試験方法としては、実施例２の評価方法において、マウス筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２細胞に替えて、マウス神経芽腫細胞株Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞をガラスボトムディッシュに播種した以外は、実施例２と同様の試験を行った。結果を図４に示す。図４（ａ）のグラフの横軸は測定時間（分）、縦軸のＦｕｒａ２ Ｒａｔｉｏは励起波長３４０ｎｍでの蛍光強度／励起波長３８０ｎｍでの蛍光強度の値を示す。図４（ｂ）のグラフの横軸はＳＣ－５６０の濃度、縦軸のΔＲａｔｉｏは励起波長３４０ｎｍでの蛍光強度／励起波長３８０ｎｍでの蛍光強度の値であって、Ｙｏｄａ１添加後の測定時間（測定開始から６～１２分）における最大値から、Ｙｏｄａ１添加前の測定時間（測定開始から０～２分）における平均値を減じた値を示している。
４．ＳＣ－５６０によるＰＩＥＺＯ１阻害効果の特異性の検討（２）
上述した実施例１～３での評価では、マウス筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２細胞を用いているところ、他の種類の細胞においてもＳＣ－５６０の添加によりＰＩＥＺＯ１イオンチャネル活性の阻害が確認されるかどうか、検討を行った。Ｃ２Ｃ１２細胞と同様に内在的にＰＩＥＺＯ１を発現するマウス神経芽腫細胞株Ｎｅｕｒｏ２Ａを用いて試験を行った。試験方法としては、実施例２の評価方法において、マウス筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２細胞に替えて、マウス神経芽腫細胞株Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞をガラスボトムディッシュに播種した以外は、実施例２と同様の試験を行った。結果を図４に示す。図４（ａ）のグラフの横軸は測定時間（分）、縦軸のＦｕｒａ２ Ｒａｔｉｏは励起波長３４０ｎｍでの蛍光強度／励起波長３８０ｎｍでの蛍光強度の値を示す。図４（ｂ）のグラフの横軸はＳＣ－５６０の濃度、縦軸のΔＲａｔｉｏは励起波長３４０ｎｍでの蛍光強度／励起波長３８０ｎｍでの蛍光強度の値であって、Ｙｏｄａ１添加後の測定時間（測定開始から６～１２分）における最大値から、Ｙｏｄａ１添加前の測定時間（測定開始から０～２分）における平均値を減じた値を示している。
【0075】
これらの結果によれば、マウス神経芽腫細胞株Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞においても、ＳＣ－５６０は同化合物を添加した際に細胞内へのカルシウム流入は生じず、さらに濃度依存的に内在性ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルの活性化を阻害することが確認された。このことから、ＳＣ－５６０によるＰＩＥＺＯ１イオンチャネル活性の阻害効果は、細胞種に特異的なものでないことが示された。
【0076】
［実施例５］
５．ＳＣ－５６０によるＰＩＥＺＯ１阻害効果の特異性の検討（３）
ＳＣ－５６０のＰＩＥＺＯ１イオンチャネルへの阻害効果の特異性を検討するため、ＳＣ－５６０が他のイオンチャネルの活性を阻害するかどうか、検討を行った。マウス筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２細胞に内在的に発現しているＣａ２＋チャネルとして、ストア作動性Ｃａ２＋チャネルに着目し、ＳＣ－５６０によって同チャネル活性が阻害されるかどうか、検討を行った。
５．ＳＣ－５６０によるＰＩＥＺＯ１阻害効果の特異性の検討（３）
ＳＣ－５６０のＰＩＥＺＯ１イオンチャネルへの阻害効果の特異性を検討するため、ＳＣ－５６０が他のイオンチャネルの活性を阻害するかどうか、検討を行った。マウス筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２細胞に内在的に発現しているＣａ２＋チャネルとして、ストア作動性Ｃａ２＋チャネルに着目し、ＳＣ－５６０によって同チャネル活性が阻害されるかどうか、検討を行った。
【0077】
ストア作動性Ｃａ２＋チャネルの活性は、小胞体Ｃａ２＋ポンプＳＥＲＣＡ（ｓａｒｃｏｐｌａｓｍｉｃ／ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ Ｃａ２＋ ＡＴＰａｓｅ）を阻害するタプシガルギンの添加と、Ｃａ２＋を含まないＨＢＳ（以下、０Ｃａ２＋－ＨＢＳという）を灌流して小胞体内のＣａ２＋を枯渇させた後に、２Ｃａ２＋－ＨＢＳを灌流することで測定することができる。なお、０Ｃａ２＋－ＨＢＳの組成は、１０７ｍＭ ＮａＣｌ、６ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１１．５ｍＭ グルコース、１．２ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ ＥＧＴＡであり、ｐＨ＝７．４にＮａＯＨで調整している。
【0078】
実施例２の評価方法において、Ｆｕｒａ２を含むＤＭＥＭでマウス筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２をインキュベートした後、２Ｃａ２＋－ＨＢＳで灌流して測定を開始した。測定開始から２分後に２Ｃａ２＋－ＨＢＳを止めて０Ｃａ２＋－ＨＢＳの灌流を行い、測定開始から４分後にタプシガルギンとＳＣ－５６０を０Ｃａ２＋－ＨＢＳに添加して灌流した。その後、測定開始から１２分後にタプシガルギンとＳＣ－５６０を添加した０Ｃａ２＋－ＨＢＳの灌流に替えて、ＳＣ－５６０を添加した２Ｃａ２＋－ＨＢＳの灌流を行った。
【0079】
結果を図５に示す。図５（ａ）のグラフの横軸は測定時間（分）、縦軸のＦｕｒａ２ Ｒａｔｉｏは励起波長３４０ｎｍでの蛍光強度／励起波長３８０ｎｍでの蛍光強度の値を示す。図５（ｂ）のグラフの縦軸のΔＲａｔｉｏは励起波長３４０ｎｍでの蛍光強度／励起波長３８０ｎｍでの蛍光強度の値であって、２Ｃａ２＋－ＨＢＳ灌流後の測定時間（測定開始から１２～２０分）における最大値から、薬剤添加前の測定時間（測定開始から０～２分）における平均値を減じた値を示している。ＳＥＲＣＡ阻害剤であるタプシガルギン灌流時以降、ＳＣ－５６０を１０μＭで灌流液に含有させた場合でも、通常のストア作動性Ｃａ２＋チャネルの活性と変化はみられなかった。このことから、ＳＣ－５６０は、ストア作動性Ｃａ２＋チャネルの活性を阻害しないことが明らかとなった。
【0080】
［実施例６］
６．ＳＣ－５６０によるＰＩＥＺＯ１阻害効果の特異性の検討（４）
ＳＣ－５６０のＰＩＥＺＯ１イオンチャネルへの阻害効果の特異性を検討するため、ＳＣ－５６０がＴＲＰＶ４チャネル活性を阻害するかどうか、検討を行った。ＴＲＰＶ４チャネルも機械刺激に応答するチャネルであるところ、本実施例においてはＴＲＰＶ４チャネル活性化剤であるＧＳＫ－１０１６７９０Ａによる活性化の阻害効果について検討を行った。
６．ＳＣ－５６０によるＰＩＥＺＯ１阻害効果の特異性の検討（４）
ＳＣ－５６０のＰＩＥＺＯ１イオンチャネルへの阻害効果の特異性を検討するため、ＳＣ－５６０がＴＲＰＶ４チャネル活性を阻害するかどうか、検討を行った。ＴＲＰＶ４チャネルも機械刺激に応答するチャネルであるところ、本実施例においてはＴＲＰＶ４チャネル活性化剤であるＧＳＫ－１０１６７９０Ａによる活性化の阻害効果について検討を行った。
【0081】
実施例２の評価方法において、マウス筋芽細胞株Ｃ２Ｃ１２細胞にＴＲＰＶ４を一過性発現させた。実施例２で用いたＹｏｄａ１に替えてＧＳＫ－１０１６７９０Ａの最終濃度が１００ｎＭとなるように添加した以外は、実施例２と同様にして試験を行った。
【0082】
結果を図６に示す。図６（ａ）のグラフの横軸は測定時間（分）、縦軸のＦｕｒａ２ Ｒａｔｉｏは励起波長３４０ｎｍでの蛍光強度／励起波長３８０ｎｍでの蛍光強度の値を示す。図６（ｂ）のグラフの縦軸のΔＲａｔｉｏは励起波長３４０ｎｍでの蛍光強度／励起波長３８０ｎｍでの蛍光強度の値であって、ＧＳＫ－１０１６７９０Ａ添加後の測定時間（測定開始から６～１２分）における最大値から、ＧＳＫ－１０１６７９０Ａ添加前の測定時間（測定開始から０～２分）における平均値を減じた値を示している。この結果より、ＳＣ－５６０はＴＲＰＶ４チャネルの活性化を阻害しないことが示された。
【0083】
［実施例７］
７．ＳＣ－５６０によるＰＩＥＺＯ１阻害効果の特異性の検討（５）
上述した実施例においては、内在性のマウスＰＩＥＺＯ１に対するＳＣ－５６０の阻害効果を確認した。そこで、他のＰＩＥＺＯ１ホモログでも同様な阻害効果を示すのかを検証するため、ヒトＰＩＥＺＯ１（ＨｓＰＩＥＺＯ１）に対するＳＣ－５６０の阻害効果の検討を行った。
７．ＳＣ－５６０によるＰＩＥＺＯ１阻害効果の特異性の検討（５）
上述した実施例においては、内在性のマウスＰＩＥＺＯ１に対するＳＣ－５６０の阻害効果を確認した。そこで、他のＰＩＥＺＯ１ホモログでも同様な阻害効果を示すのかを検証するため、ヒトＰＩＥＺＯ１（ＨｓＰＩＥＺＯ１）に対するＳＣ－５６０の阻害効果の検討を行った。
【0084】
試験には、Ｃ２Ｃ１２細胞のＰｉｅｚｏ１ノックアウト細胞を用いた。実施例２の評価方法において、Ｃ２Ｃ１２細胞のＰｉｅｚｏ１ノックアウト細胞にＨｓＰＩＥＺＯ１を一過的に発現させた以外は、実施例２と同様にして試験を行った。
【0085】
結果を図７に示す。図７（ａ）のグラフの横軸は測定時間（分）、縦軸のＦｕｒａ２ Ｒａｔｉｏは励起波長３４０ｎｍでの蛍光強度／励起波長３８０ｎｍでの蛍光強度の値を示す。図７（ｂ）のグラフの縦軸のΔＲａｔｉｏは励起波長３４０ｎｍでの蛍光強度／励起波長３８０ｎｍでの蛍光強度の値であって、Ｙｏｄａ１添加後の測定時間（測定開始から６～１２分）における最大値から、Ｙｏｄａ１添加前の測定時間（測定開始から０～２分）における平均値を減じた値を示している。この結果より、ＳＣ－５６０はＨｓＰＩＥＺＯ１のイオンチャネル活性を阻害することが示された。このことから、ＳＣ－５６０はｍｏｕｓｅＰＩＥＺＯ１だけでなく、ＨｓＰＩＥＺＯ１も阻害すること、内在性のチャネルだけでなく、一過的発現系においても阻害効果を示すことが明らかとなった。
【0086】
［実施例８］
８．ＳＣ－５６０によるＰＩＥＺＯ１阻害効果の特異性の検討（６）
上述した実施例においては、主にＹｏｄａ１により活性化されたＰＩＥＺＯ１イオンチャネルの阻害効果について検討を行ってきたが、ＳＣ－５６０がＹｏｄａ１に対する競合阻害剤という可能性も残る。この可能性について検証するため、他の種類のＰＩＥＺＯ１活性化剤である「Ｊｅｄｉ２」に対してもＳＣ－５６０が阻害効果を示すのか検討を行った。
８．ＳＣ－５６０によるＰＩＥＺＯ１阻害効果の特異性の検討（６）
上述した実施例においては、主にＹｏｄａ１により活性化されたＰＩＥＺＯ１イオンチャネルの阻害効果について検討を行ってきたが、ＳＣ－５６０がＹｏｄａ１に対する競合阻害剤という可能性も残る。この可能性について検証するため、他の種類のＰＩＥＺＯ１活性化剤である「Ｊｅｄｉ２」に対してもＳＣ－５６０が阻害効果を示すのか検討を行った。
【0087】
Ｊｅｄｉ２はＨＥＫ２９３Ｔ細胞に一過性発現させたｍｏｕｓｅＰＩＥＺＯ１に対する活性化のみが報告されているため、本実施例においては、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に一過性発現させたｍｏｕｓｅＰＩＥＺＯ１に対するＳＣ－５６０の阻害効果を確認する試験を行った。実施例２で用いたＹｏｄａ１に替えてＪｅｄｉ２の最終濃度が１ｍＭとなるように添加した以外は、実施例２と同様にして試験を行った。
【0088】
結果を図８に示す。図８（ａ）のグラフの横軸は測定時間（分）、縦軸のＦｕｒａ２ Ｒａｔｉｏは励起波長３４０ｎｍでの蛍光強度／励起波長３８０ｎｍでの蛍光強度の値を示す。図８（ｂ）のグラフの縦軸のΔＲａｔｉｏは励起波長３４０ｎｍでの蛍光強度／励起波長３８０ｎｍでの蛍光強度の値であって、Ｊｅｄｉ２添加後の測定時間（測定開始から６～１２分）における最大値から、Ｊｅｄｉ２添加前の測定時間（測定開始から０～２分）における平均値を減じた値を示している。この結果より、ＳＣ－５６０はＪｅｄｉ２によるＰＩＥＺＯ１活性化も阻害することが示された。Ｙｏｄａ１とＪｅｄｉ２とは、異なる作用機序・作用部位を持つことが既に報告されていることから、ＳＣ－５６０はこれら２つの競合阻害剤ではなく、アロステリックにＰＩＥＺＯ１に作用する阻害剤であることが推察される。
【0089】
［実施例９］
９．ＳＣ－５６０類縁体化合物のＰＩＥＺＯ１阻害効果の検討
ＳＣ－５６０はＰＩＥＺＯ１イオンチャネル阻害剤であることが確認されたため、ＳＣ－５６０類縁体化合物のＰＩＥＺＯ１阻害効果について検討を行った。検討を行った化合物を図９及び図１０に示す。このうち、Ｄ１～Ｄ８に示す化合物については本発明者が化学合成を行って得たサンプルを用いて試験を行い、Ｔ１～Ｔ２４に示す化合物については、東京大学創薬機構が所有する化合物ライブラリーから提供を受けたサンプルを用いて試験を行った。
９．ＳＣ－５６０類縁体化合物のＰＩＥＺＯ１阻害効果の検討
ＳＣ－５６０はＰＩＥＺＯ１イオンチャネル阻害剤であることが確認されたため、ＳＣ－５６０類縁体化合物のＰＩＥＺＯ１阻害効果について検討を行った。検討を行った化合物を図９及び図１０に示す。このうち、Ｄ１～Ｄ８に示す化合物については本発明者が化学合成を行って得たサンプルを用いて試験を行い、Ｔ１～Ｔ２４に示す化合物については、東京大学創薬機構が所有する化合物ライブラリーから提供を受けたサンプルを用いて試験を行った。
【0090】
Ｄ１～Ｄ８に示す化合物は、次のようにして得た。Ｄ１：１－（４－メトキシフェニル）－５－（ｐ－トリル）－３－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ピラゾールは、エタノール反応溶媒中、４，４，４－トリフルオロ－１－（ｐ－トリル）ブタン－１，３－ジオンと（４－メトキシフェニル）ヒドラジン塩酸塩を加熱環流することで合成した。Ｄ２：１－（４－メトキシフェニル）－５－フェニル－３－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ピラゾールは、エタノール反応溶媒中、４，４，４－トリフルオロ－１－フェニルブタン－１，３－ジオンと（４－メトキシフェニル）ヒドラジン塩酸塩を加熱環流することで合成した。Ｄ３：１，５－ビス（４－メトキシフェニル）－３－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ピラゾールは、エタノール反応溶媒中、４，４，４－トリフルオロ－１－（４－メトキシフェニル）ブタン－１，３－ジオンと（４－メトキシフェニル）ヒドラジン塩酸塩を加熱環流することで合成した。Ｄ４：５－（４－フルオロフェニル）－１－（４－メトキシフェニル）－３－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ピラゾールは、エタノール反応溶媒中、４，４，４－トリフルオロ－１－（４－フルオロフェニル）ブタン－１，３－ジオンと（４－メトキシフェニル）ヒドラジン塩酸塩を加熱環流することで合成した。Ｄ５：５－（４－ブロモフェニル）－１－（４－メトキシフェニル）－３－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ピラゾールは、エタノール反応溶媒中、１－（４－ブロモフェニル）－４，４，４－トリフルオロブタン－１，３－ジオンと（４－メトキシフェニル）ヒドラジン塩酸塩を加熱環流することで合成した。
【0091】
Ｄ６：１－（４－メトキシフェニル）－３－（トリフルオロメチル）－５－（３－（トリフルオロメチル）フェニル）－１Ｈ－ピラゾールは、次のようにして合成した。
【0092】
【化9】
【0093】
４，４，４－トリフルオロ－１－（３－（トリフルオロメチル）フェニル）ブタン－１，３－ジオン（７１．１ｍｇ、０．２５０ｍｍｏｌ）をエタノール（１ｍＬ）に溶かし、（４－メトキシフェニル）ヒドラジン塩酸塩（５１．５ｍｇ、０．２９５ｍｍｏｌ）を加え１１時間加熱環流した。溶媒を減圧留去後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製することで，１－（４－メトキシフェニル）－５－）－３－（トリフルオロメチル）－５－（３－（トリフルオロメチル）フェニル）－１Ｈ－ピラゾール（７７．９ｍｇ、収率８１％）を無色油状物として得た。
【0094】
Ｄ７：１－（４－メトキシフェニル）－３－（トリフルオロメチル）－５－（４－（トリフルオロメチル）フェニル）－１Ｈ－ピラゾールは、次のようにして合成した。
【0095】
【化10】
【0096】
４，４，４－トリフルオロ－１－（４－（トリフルオロメチル）フェニル）ブタン－１，３－ジオン（６７．７ｍｇ、０．２３８ｍｍｏｌ）をエタノール（１ｍＬ）に溶かし、（４－メトキシフェニル）ヒドラジン塩酸塩（５０．８ｍｇ，０．２９１ｍｍｏｌ）を加え１１時間加熱環流した。溶媒を減圧留去後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製することで、１－（４－メトキシフェニル）－５－）－３－（トリフルオロメチル）－５－（４－（トリフルオロメチル）フェニル）－１Ｈ－ピラゾール（８９．８ｍｇ，収率９８％）を無色油状物として得た。
【0097】
Ｄ８：１－（４－メトキシフェニル）－３－（トリフルオロメチル）－５－（２－（トリフルオロメチル）フェニル）－１Ｈ－ピラゾールは、次のようにして合成した。
【0098】
【化11】
【0099】
４，４，４－トリフルオロ－１－（２－（トリフルオロメチル）フェニル）ブタン－１，３－ジオン（７１．５ｍｇ、０．２５２ｍｍｏｌ）をエタノール（１ｍＬ）に溶かし、（４－メトキシフェニル）ヒドラジン塩酸塩（５１．０ｍｇ，０．２９２ｍｍｏｌ）を加え１１時間加熱環流した。溶媒を減圧留去後、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにて精製することで、１－（４－メトキシフェニル）－５－）－３－（トリフルオロメチル）－５－（２－（トリフルオロメチル）フェニル）－１Ｈ－ピラゾール（７９．９ｍｇ、収率８２％）を無色油状物として得た。
【0100】
上述のようにして得た、Ｄ１～Ｄ８に示す化合物及びＴ１～Ｔ２４に示す化合物について、Ｙｏｄａ１の添加を測定開始から５分後とした以外は、実施例２と同様の評価方法にて試験を行った。結果を図１１及び図１２に示す。図１１のグラフの縦軸のΔＲａｔｉｏは、励起波長３４０ｎｍでの蛍光強度／励起波長３８０ｎｍでの蛍光強度の値であって、Ｙｏｄａ１添加後の測定時間（測定開始から５～１２分）における最大値から、Ｙｏｄａ１添加前の測定時間（測定開始から０～２分）における平均値を減じた値を示している。図１２のグラフの横軸は測定時間（分）、縦軸のΔＲａｔｉｏは励起波長３４０ｎｍでの蛍光強度／励起波長３８０ｎｍでの蛍光強度の値であって、各測定時間における値から、Ｙｏｄａ１添加前の測定時間（測定開始から０～２分）における平均値を減じた値を示している。
【0101】
これらの結果によれば、ＳＣ－５６０よりもＰＩＥＺＯ１阻害効果が高い化合物として、Ｄ４：５－（４－フルオロフェニル）－１－（４－メトキシフェニル）－３－（トリフルオロメチル）－１Ｈ－ピラゾールが見出された。また、Ｄ２、Ｄ５～Ｄ７、Ｔ２、Ｔ４、Ｔ１３、Ｔ１６及びＴ２１に係る化合物も高いＰＩＥＺＯ１阻害効果が示された。
【0102】
［実施例１０］
１０．ＰＩＥＺＯ１機能獲得型変異に対するＳＣ－５６０の作用効果の検討（１）
ＰＩＥＺＯ１は様々な生命現象に関わるイオンチャネルであり、ＰＩＥＺＯ１遺伝子の変異により、疾患が惹起される。たとえば、ＰＩＥＺＯ１遺伝子の機能獲得型変異により、赤血球の形態・機能異常を表現型とする脱水遺伝性有口赤血球症が発症する。また、ＰＩＥＺＯ１遺伝子の機能喪失型変異では、新生児全身性リンパ低形成症の発症が報告されている。そこで、以下実施例では、ＰＩＥＺＯ１遺伝子の機能獲得型変異によるチャネル活性増強に対しても、ＳＣ－５６０が阻害効果を示すのかどうか検討を行った。
１０．ＰＩＥＺＯ１機能獲得型変異に対するＳＣ－５６０の作用効果の検討（１）
ＰＩＥＺＯ１は様々な生命現象に関わるイオンチャネルであり、ＰＩＥＺＯ１遺伝子の変異により、疾患が惹起される。たとえば、ＰＩＥＺＯ１遺伝子の機能獲得型変異により、赤血球の形態・機能異常を表現型とする脱水遺伝性有口赤血球症が発症する。また、ＰＩＥＺＯ１遺伝子の機能喪失型変異では、新生児全身性リンパ低形成症の発症が報告されている。そこで、以下実施例では、ＰＩＥＺＯ１遺伝子の機能獲得型変異によるチャネル活性増強に対しても、ＳＣ－５６０が阻害効果を示すのかどうか検討を行った。
【0103】
まず、野生型のヒトＰＩＥＺＯ１又は機能獲得型変異を有するヒトＰＩＥＺＯ１をそれぞれ発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を作製し、カルシウムプローブとしてＦｕｒａ２を用いて、Ｙｏｄａ１によるＰＩＥＺＯ１イオンチャネル活性化のレベルをカルシウムイメージング法で測定した。試験方法は具体的には次の通りである。
【0104】
野生型のヒトＰＩＥＺＯ１又は機能獲得型変異を有するヒトＰＩＥＺＯ１を発現する細胞については、トランスフェクション試薬を用いて各遺伝子をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に遺伝子導入することにより作製した。機能獲得型変異のヒトＰＩＥＺＯ１遺伝子としては、点変異がＡ２０２０Ｔ、Ｒ２４５６Ｈ、Ｔ２１２７Ｍ及びＭ２２２５Ｒの４種類の遺伝子を用いた。より詳細には、１００μＬのＤＭＥＭ培地（富士フィルム和光純薬株式会社）に３μＬのトランスフェクション試薬（Lipofectamine 2000 transfection reagent、サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を混和し、さらに野生型のｈｕｍａｎ ＰＩＥＺＯ１発現プラスミド又は機能獲得型点変異ｈｕｍａｎ ＰＩＥＺＯ１発現プラスミド（Ａ２０２０Ｔ、Ｒ２４５６Ｈ、Ｔ２１２７Ｍ又はＭ２２２５Ｒ）を１０００ｎｇ混和した。この溶液を２０分間インキュベートした後、この溶液にカルシウム非含有無血清培地を加えて全量１０００μＬのトランスフェクション培地とした。この培地を用いて、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を３５ｍｍのセルカルチャーディッシュ（型番３５３００１、コーニング社）にて４時間培養し、トランスフェクションを行った。トランスフェクション培地にて４時間培養したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、３５ｍｍガラスボトムディッシュ（型番Ｄ１１５３１Ｈ、松浪硝子工業株式会社）に播種し、低カルシウム培地でＣＯ２通気下、３７℃の炭酸ガスインキュベーターで培養した。カルシウムイメージング法には、トランスフェクション開始から４８時間以上経過した細胞を用いた。
【0105】
測定開始４０分前に、培地をＦｕｒａ２（型番：Ｆｕｒａ２－ＡＭ、株式会社同仁化学研究所製品）を１０μＭ含むＤＭＥＭに替え、３７℃で４０分間インキュベートした。その後、Ｆｕｒａ２含有ＤＭＥＭを除去し、５００μＬの２Ｃａ２＋－ＨＢＳ（実施例１で用いたものと同様の組成、ｐＨからなる）で洗い流した後、２５０μＬの２Ｃａ２＋－ＨＢＳに細胞を浸し、測定を開始した。次に、測定開始から５分後に、同ディッシュにＰＩＥＺＯ１イオンチャネルを特異的に活性化させるＹｏｄａ１を添加し、Ｙｏｄａ１によるＰＩＥＺＯ１イオンチャネル活性化のレベルを測定した。具体的には、Ｙｏｄａ１の２Ｃａ２＋－ＨＢＳ溶液（Ｙｏｄａ１濃度：１０μＭ）をＹｏｄａ１の最終濃度が５μＭとなるように、ディッシュに２５０μＬ添加した。
【0106】
測定は、倒立蛍光顕微鏡（Ａｘｉｏ Ｏｂｓｅｒｖｅｒ Ｚ１、カールツァイス株式会社）で行い、波長３４０ｎｍ及び３８０ｎｍの励起光に対する波長５１０ｎｍの蛍光強度を測定した。測定は１０秒毎に１２分間のタイムラプスで行った。露出時間は波長３４０ｎｍ、３８０ｎｍともに５００ｍｓとした。
【0107】
結果を図１３に示す。図１３（ａ）のグラフの横軸は測定時間（分）、縦軸のＦｕｒａ２ Ｒａｔｉｏは励起波長３４０ｎｍでの蛍光強度／励起波長３８０ｎｍでの蛍光強度の値を示す。図１３（ｂ）のグラフの縦軸のΔＲａｔｉｏは励起波長３４０ｎｍでの蛍光強度／励起波長３８０ｎｍでの蛍光強度の値であって、Ｙｏｄａ１添加後の測定時間（測定開始から５～１２分）における最大値から、Ｙｏｄａ１添加前の測定時間（測定開始から０～５分）における平均値を減じた値を示している。この結果より、Ａ２０２０Ｔ、Ｒ２４５６Ｈ、Ｔ２１２７Ｍ及びＭ２２２５Ｒの機能獲得型点変異を有するＰＩＥＺＯ１イオンチャネルは、４種とも野生型（図１３中「ＷＴ」で示す）のＰＩＥＺＯ１と比較して、Ｙｏｄａ１の添加によるＰＩＥＺＯ１イオンチャネル活性化のレベルが顕著に増強することが示された。
【0108】
［実施例１１］
１１．ＰＩＥＺＯ１機能獲得型変異に対するＳＣ－５６０の作用効果の検討（２）
実施例１０で作製した機能獲得型変異を有するヒトＰＩＥＺＯ１を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いて、機能獲得型変異によるＰＩＥＺＯ１イオンチャネルの活性増強に対する、ＳＣ－５６０の作用効果を調べた。
１１．ＰＩＥＺＯ１機能獲得型変異に対するＳＣ－５６０の作用効果の検討（２）
実施例１０で作製した機能獲得型変異を有するヒトＰＩＥＺＯ１を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いて、機能獲得型変異によるＰＩＥＺＯ１イオンチャネルの活性増強に対する、ＳＣ－５６０の作用効果を調べた。
【0109】
実施例１０の評価方法において、測定開始から２分後にＳＣ－５６０を最終濃度１０μＭにて添加した以外は、実施例１０と同様の試験を行った。より詳細には、測定開始から２分後に、ＳＣ－５６０の２Ｃａ２＋－ＨＢＳ溶液（ＳＣ－５６０濃度：２０μＭ）をＳＣ－５６０の最終濃度が１０μＭとなるようにディッシュに２５０μＬ添加した。他方、コントロールとして、ＳＣ－５６０の替わりにＤＭＳＯを用いた。測定開始から５分後に、同ディッシュにＹｏｄａ１及びＳＣ－５６０含有２Ｃａ２＋－ＨＢＳ溶液をＹｏｄａ１の最終濃度が５μＭ、ＳＣ－５６０の最終濃度が１０μＭとなるようにディッシュに５００μＬ添加した。
【0110】
結果を図１４及び図１５に示す。図１４はＲ２４５６Ｈの機能獲得型点変異を有するＰＩＥＺＯ１についての結果であり、図１５（ａ）はＡ２０２０Ｔの機能獲得型点変異を有するＰＩＥＺＯ１、図１５（ｂ）はＴ２１２７Ｍの機能獲得型点変異を有するＰＩＥＺＯ１、図１５（ｃ）はＭ２２２５Ｒの機能獲得型点変異を有するＰＩＥＺＯ１についての結果である。図１４（ａ）、図１５（ａ）、図１５（ｂ）及び図１５（ｃ）のグラフの横軸は測定時間（分）、縦軸のＦｕｒａ２ Ｒａｔｉｏは励起波長３４０ｎｍでの蛍光強度／励起波長３８０ｎｍでの蛍光強度の値を示す。図１４（ｂ）のグラフの縦軸のΔＲａｔｉｏは励起波長３４０ｎｍでの蛍光強度／励起波長３８０ｎｍでの蛍光強度の値であって、Ｙｏｄａ１添加後の測定時間（測定開始から５～１２分）における最大値から、Ｙｏｄａ１添加前の測定時間（測定開始から０～５分）における平均値を減じた値を示している。
【0111】
図１４に示されるように、Ｒ２４５６Ｈの機能獲得型点変異を有するＰＩＥＺＯ１イオンチャネルは、野生型（図１４中「ＷＴ」で示す）のＰＩＥＺＯ１と比較して、Ｙｏｄａ１の添加によるＰＩＥＺＯ１イオンチャネル活性化のレベルが有意に増強した。これに対し、ＳＣ－５６０は、Ｒ２４５６Ｈの機能獲得型変異によるＰＩＥＺＯ１イオンチャネルの活性増強を有意に抑制し、野生型のレベルまでＰＩＥＺＯ１活性を抑制することを示した。また、図１５（ａ）～図１５（ｃ）によれば、Ａ２０２０Ｔの機能獲得型変異、Ｔ２１２７Ｍの機能獲得型変異及びＭ２２２５Ｒの機能獲得型点変異によるＰＩＥＺＯ１イオンチャネルの活性増強についても、ＳＣ－５６０はＰＩＥＺＯ１活性を抑制することを示した。これらの結果から、ＳＣ－５６０は、機能獲得型変異によるＰＩＥＺＯ１イオンチャネルを阻害する効果を有することが明らかとなった。
【0112】
本発明は、上記の実施形態又は実施例に限定されるものでなく、特許請求の範囲に記載された発明の要旨を逸脱しない範囲内での種々、設計変更した形態も技術的範囲に含むものである。
【産業上の利用可能性】
【0113】
本発明は、ＰＩＥＺＯ１イオンチャネルを特異的に阻害することができるＰＩＥＺＯ１阻害剤を提供するものであり、基礎研究分野のみならず、医薬等の分野の産業において幅広く役立つものである。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
