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特開2024-8804永久凍土微生物のＤＮＡサンプルの取得方法およびＤＮＡの抽出と検出方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024008804
(43)【公開日】2024-01-19
(54)【発明の名称】永久凍土微生物のＤＮＡサンプルの取得方法およびＤＮＡの抽出と検出方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/689 20180101AFI20240112BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20240112BHJP
C12N 15/31 20060101ALN20240112BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/689 Z
C12Q1/686 Z ZNA
C12N15/31
【審査請求】有
【請求項の数】4
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023015861
(22)【出願日】2023-02-06
(31)【優先権主張番号】202210792689.0
(32)【優先日】2022-07-07
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】521275909
【氏名又は名称】中国科学院西北生態環境資源研究院
(71)【出願人】
【識別番号】523041344
【氏名又は名称】青欧生命科学高等研究院
(74)【代理人】
【識別番号】100095407
【弁理士】
【氏名又は名称】木村 満
(74)【代理人】
【識別番号】100132883
【弁理士】
【氏名又は名称】森川 泰司
(74)【代理人】
【識別番号】100148633
【弁理士】
【氏名又は名称】桜田 圭
(74)【代理人】
【識別番号】100147924
【弁理士】
【氏名又は名称】美恵 英樹
(72)【発明者】
【氏名】陳 生云
(72)【発明者】
【氏名】鄒 遠強
(72)【発明者】
【氏名】徐 静陽
(72)【発明者】
【氏名】施 一
(72)【発明者】
【氏名】呉 明輝
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ05
4B063QQ42
4B063QR08
4B063QR42
4B063QR55
4B063QR62
4B063QS25
4B063QX01
(57)【要約】 （修正有）
【課題】永久凍土微生物のＤＮＡサンプルの取得方法およびＤＮＡの抽出と検出方法を提供する。
【解決手段】定点多層ビットサンプリング法により青海チベット高原の永久凍土を無菌的にサンプリングし、永久凍土サンプルを選択し、段階加温法により解凍して微生物サンプルを取得し、ＰＢＳ緩衝液を加えて振とう－液体窒素凍結融解処理した後凍結融解懸濁液を得て、細菌分解－抽出－沈殿－洗浄および溶解によりＤＮＡサンプルを得、取得したＤＮＡサンプルをＭＤＡにより増幅して永久凍土微生物のＤＮＡを抽出し、蛍光法によりＤＮＡを定量的に分析する。本発明の解決策により、青海チベット高原の永久凍土微生物の全ＤＮＡ、特に活性層の下の永久凍土層の低バイオマス微生物ＤＮＡを効果的に抽出することができ、その検出を容易にして、青海チベット高原の永久凍土微生物のメタゲノミクスシーケンス研究に技術支援を提供することが可能である。
【選択図】図３
【解決手段】定点多層ビットサンプリング法により青海チベット高原の永久凍土を無菌的にサンプリングし、永久凍土サンプルを選択し、段階加温法により解凍して微生物サンプルを取得し、ＰＢＳ緩衝液を加えて振とう－液体窒素凍結融解処理した後凍結融解懸濁液を得て、細菌分解－抽出－沈殿－洗浄および溶解によりＤＮＡサンプルを得、取得したＤＮＡサンプルをＭＤＡにより増幅して永久凍土微生物のＤＮＡを抽出し、蛍光法によりＤＮＡを定量的に分析する。本発明の解決策により、青海チベット高原の永久凍土微生物の全ＤＮＡ、特に活性層の下の永久凍土層の低バイオマス微生物ＤＮＡを効果的に抽出することができ、その検出を容易にして、青海チベット高原の永久凍土微生物のメタゲノミクスシーケンス研究に技術支援を提供することが可能である。
【選択図】図３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
サンプリング：９月下旬から１０月上旬にかけて融解深度が最大となる青海チベット高原の永久凍土の活性層を選択し、定点多層ビットサンプリング法により永久凍土活性層と永久凍土層を無菌的にサンプリングし、サンプリングのとき、永久凍土サンプルを常に凍結状態かつ無菌状態に保ち、－８０℃条件下で保管し、前記永久凍土サンプルは活性層サンプルと永久凍土層サンプルを含むステップＳ１と、
微生物サンプルの取得：前記活性層サンプルおよび／または前記永久凍土層サンプルを選択し、段階加温法により解凍して微生物サンプルを取得し、前記段階加温法は、前記活性層サンプルおよび／または永久凍土サンプルを－８０℃で取出した後、－５０℃で３０分、－２０℃で３０分、－４℃で１時間、常温条件で１時間放置することを含むステップＳ２と、
微生物サンプル前処理：前記微生物サンプルをそれぞれ粉砕した後、ＰＢＳ緩衝液を加えて振とう－液体窒素凍結融解処理して凍結融解懸濁液を得るステップＳ３と、
改善されたＣＴＡＢ法によるＤＮＡサンプルの取得：前記凍結融解懸濁液を細菌分解－抽出－沈殿－洗浄および溶解してＤＮＡサンプルを得るステップＳ４と、
電気泳動検出：前記ＤＮＡサンプルを検出するステップＳ５と、
を主に含み、
前記ステップＳ１における前記定点多層ビットサンプリング法は、０～２０ｃｍ、２０～３５０ｃｍ、３５０～５００ｃｍ、５００～６００ｃｍ、６００～１０００ｃｍおよび１０００～１５００ｃｍの異なる深度の活性層と永久凍土層を順次選択してサンプリングし、そのうちに、深度０～３５０ｃｍのサンプルは前記活性層サンプルであり、他の深度層のサンプルは前記永久凍土層サンプルであり、独立した無菌容器内にそれぞれ保管し、
前記ステップＳ４における改善されたＣＴＡＢ法は、
（１）細菌分解：前記ステップＳ３の前記凍結融解懸濁液を高速遠心分離した後、上澄液を捨て、ＴＥ緩衝液を加えて沈殿懸濁液を得、ＳＤＳとプロテアーゼＫを加えて均一に混合し、３７℃で１時間保温してから、ＮａＣｌ溶液と６５℃予熱したＣＴＡＢ／ＮａＣｌ溶液を加えて均一に混合した後、６５℃で３０分間保温して分解サンプルを得るステップと、
（２）抽出：前記分解サンプルに等体積のＴｒｉｓ飽和フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール試薬を加えて均一に混合し、遠心分離して得られた上澄液に等体積のクロロホルムとイソアミルアルコール試薬を加えて抽出するステップと、
（３）沈殿：前記（２）のステップで抽出した上澄液にイソプロパノールを加えて遠心分離処理するステップと、
（４）洗浄・溶解：前記（３）のステップの遠心分離した沈殿物をエタノールで洗浄し、乾燥した後ｄｄＨ２ＯまたはｐＨ８．０のＴＥ緩衝液に溶解して、前記ＤＮＡサンプルを得るステップと、
を含む、ことを特徴とする永久凍土微生物のＤＮＡサンプルの取得方法。
微生物サンプルの取得：前記活性層サンプルおよび／または前記永久凍土層サンプルを選択し、段階加温法により解凍して微生物サンプルを取得し、前記段階加温法は、前記活性層サンプルおよび／または永久凍土サンプルを－８０℃で取出した後、－５０℃で３０分、－２０℃で３０分、－４℃で１時間、常温条件で１時間放置することを含むステップＳ２と、
微生物サンプル前処理：前記微生物サンプルをそれぞれ粉砕した後、ＰＢＳ緩衝液を加えて振とう－液体窒素凍結融解処理して凍結融解懸濁液を得るステップＳ３と、
改善されたＣＴＡＢ法によるＤＮＡサンプルの取得：前記凍結融解懸濁液を細菌分解－抽出－沈殿－洗浄および溶解してＤＮＡサンプルを得るステップＳ４と、
電気泳動検出：前記ＤＮＡサンプルを検出するステップＳ５と、
を主に含み、
前記ステップＳ１における前記定点多層ビットサンプリング法は、０～２０ｃｍ、２０～３５０ｃｍ、３５０～５００ｃｍ、５００～６００ｃｍ、６００～１０００ｃｍおよび１０００～１５００ｃｍの異なる深度の活性層と永久凍土層を順次選択してサンプリングし、そのうちに、深度０～３５０ｃｍのサンプルは前記活性層サンプルであり、他の深度層のサンプルは前記永久凍土層サンプルであり、独立した無菌容器内にそれぞれ保管し、
前記ステップＳ４における改善されたＣＴＡＢ法は、
（１）細菌分解：前記ステップＳ３の前記凍結融解懸濁液を高速遠心分離した後、上澄液を捨て、ＴＥ緩衝液を加えて沈殿懸濁液を得、ＳＤＳとプロテアーゼＫを加えて均一に混合し、３７℃で１時間保温してから、ＮａＣｌ溶液と６５℃予熱したＣＴＡＢ／ＮａＣｌ溶液を加えて均一に混合した後、６５℃で３０分間保温して分解サンプルを得るステップと、
（２）抽出：前記分解サンプルに等体積のＴｒｉｓ飽和フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール試薬を加えて均一に混合し、遠心分離して得られた上澄液に等体積のクロロホルムとイソアミルアルコール試薬を加えて抽出するステップと、
（３）沈殿：前記（２）のステップで抽出した上澄液にイソプロパノールを加えて遠心分離処理するステップと、
（４）洗浄・溶解：前記（３）のステップの遠心分離した沈殿物をエタノールで洗浄し、乾燥した後ｄｄＨ２ＯまたはｐＨ８．０のＴＥ緩衝液に溶解して、前記ＤＮＡサンプルを得るステップと、
を含む、ことを特徴とする永久凍土微生物のＤＮＡサンプルの取得方法。
【請求項2】
請求項１に記載の永久凍土微生物のＤＮＡサンプルの取得方法により取得したＤＮＡサンプル、または従来のＣＴＡＢ法により取得したＤＮＡサンプルを用いてＭＤＡ増幅し、
前記ＭＤＡ増幅は、前記ＤＮＡサンプルを精製した後サンプル変性－ＭＤＡ増幅－１６Ｓ ｒＤＮＡ ＰＣＲ増幅してＰＣＲ産物を得ることを含み、
前記ＭＤＡ増幅のＭＤＡ増幅系は、ｄＮＴＰ、ＤＴＴ、Ｐｈｉ２９酵素、ＢＳＡおよび超純水を含み、前記ＰＣＲ産物をＭＤＡで増幅し、前記ＭＤＡ増幅系中の各成分と前記変性産物の体積パーセントはそれぞれｄＮＴＰ：ＤＴＴ：Ｐｈｉ２９酵素：ＢＳＡ：変性産物＝４：０．８：０．８～２：０～０．２：５～１０であり、
前記１６Ｓ ｒＤＮＡ ＰＣＲ増幅において、
フォワードプライマー（３４１－Ｆ）：５’－ＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ－３’、
リバースプライマー（９２６－Ｒ）：５’－ＣＣＧＴＣＡＡＴＴＣＣＴＴＴＲＡＧＴＴＴ－３’である、ことを特徴とする永久凍土微生物ＤＮＡの抽出方法。
前記ＭＤＡ増幅は、前記ＤＮＡサンプルを精製した後サンプル変性－ＭＤＡ増幅－１６Ｓ ｒＤＮＡ ＰＣＲ増幅してＰＣＲ産物を得ることを含み、
前記ＭＤＡ増幅のＭＤＡ増幅系は、ｄＮＴＰ、ＤＴＴ、Ｐｈｉ２９酵素、ＢＳＡおよび超純水を含み、前記ＰＣＲ産物をＭＤＡで増幅し、前記ＭＤＡ増幅系中の各成分と前記変性産物の体積パーセントはそれぞれｄＮＴＰ：ＤＴＴ：Ｐｈｉ２９酵素：ＢＳＡ：変性産物＝４：０．８：０．８～２：０～０．２：５～１０であり、
前記１６Ｓ ｒＤＮＡ ＰＣＲ増幅において、
フォワードプライマー（３４１－Ｆ）：５’－ＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ－３’、
リバースプライマー（９２６－Ｒ）：５’－ＣＣＧＴＣＡＡＴＴＣＣＴＴＴＲＡＧＴＴＴ－３’である、ことを特徴とする永久凍土微生物ＤＮＡの抽出方法。
【請求項3】
前記ＤＮＡサンプルをＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎゲル／ＰＣＲ産物精製キットで精製し、前記サンプル変性はＰＣＲ増幅器で行い変性産物を得る、ことを特徴とする請求項２に記載の永久凍土微生物ＤＮＡの抽出方法。
【請求項4】
請求項１に記載の永久凍土微生物のＤＮＡサンプルの取得方法で取得したＤＮＡサンプルを蛍光法で定量的に分析することを含む、ことを特徴とする永久凍土微生物ＤＮＡの検出方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、凍土微生物の核酸抽出の技術分野に関し、具体的には永久凍土微生物のＤＮＡサンプルの取得方法およびＤＮＡの抽出と検出方法に関する。
【背景技術】
【0002】
永久凍土は長年０℃以下の低温環境にあり、古代の活性細胞の広大な「貯蔵庫」であり、微生物が生存するためのユニークな生息地であり、氷点下での微生物の生存と成長を探るための理想的な場所である。近年、永久凍土環境から再生能力を有する巨大ＤＮＡウイルスおよび細菌を分離することが報告されており、微生物（細菌、古細菌、真菌およびウイルスなど）が何らかの形（例えば栄養成長が停止した休眠状態）で、永久凍土環境で長期生存できる。それらの代謝率は非常に低いが、決して休眠状態の「生存者」ではない。実際に、永久凍土微生物は炭素、窒素、硫黄などの地球化学的プロセスにも重要な役割を果たしている。しかし、気候の変化に伴い、永久凍土融解傾向が深刻化し、これまで凍土に蓄えられていた大量の微生物が分解される。しかしながら、永久凍土融解による炭素放出を正確に評価することは大きな課題となっており、微生物群集の反応や永久凍土層内の微生物の代謝メカニズム、特に多数存在する未知の微生物集団についての理解が不十分であることが原因の一つである。
【0003】
統計によると、中国永久凍土微生物細胞数は最大１０１０ 細胞／ｇと推定され、異なる研究領域によって大きな差があることが分かっている。関連する研究から得られた培養可能な微生物数は、凍土微生物細胞の総数のごく一部に過ぎないのである。例えば、青海チベット高原後背地の北麓河川流域の永久凍土では培養可能な微生物数が１０２～１０６ＣＦＵ／ｇ、総細胞数が１０７～１０９細胞／ｇである。この相違は、微生物自体の非培養性の特性（例えば「ピグミー」細胞）、不適切なサンプル前処理（例えば繰り返しの凍結融解）、および特別な培養条件を必要とする特別な微生物分類などに起因している。同時に、永久凍土微生物数は様々なアビオティック要素の影響を受けている。例えば、永久凍土の深度や年数が長くなると、永久凍土から生細胞を回収することが容易でなくなり、微生物数が減少する傾向がある。永久凍土微生物の遺伝学的研究が緊急に必要であることは明らかである。
【0004】
しかしながら、近頃、永久凍土微生物の多様性に関する研究は、主に南極と北極に集中しており、特にシベリアとカナダ北部の永久凍土地域の研究が最も盛んである。永久凍土には、細菌、古細菌、真菌、シアノバクテリア、ウイルスなど、豊富な微生物分類が存在し、未知の希少微生物や特別な微生物が多数含まれる。特にウイルスは、種の多様性という点で、まだ非常に理解が進んでいない。永久凍土に生息する原核微生物は、ウイルスの宿主となる。ウイルスは原核微生物群集の構成に影響を与えるだけでなく、宿主細胞を溶解し、原核微生物群集の増殖速度を低下させることによって、永久凍土における物質循環にさらに影響を与える。同時に、永久凍土の病原微生物は、再感染や遺伝子の伝達によりバイオセキュリティリスクを引き起こす可能性があることも注目すべき点である。人類は先史時代のウイルスに対して優れた防御力を持っておらず、群生する習性によってウイルスが極めて急速に拡散し、人間や動植物に影響を与え、生物学的・生態学的安全性を脅かす可能性があるため、永久凍土におけるウイルスＤＮＡの研究は非常に重要な意味を持っている。
【0005】
青海チベット高原は低・中緯度から高緯度にかけて世界最大の永久凍土分布域であり、その永久凍土開発の特徴は、厚い活動層、頻繁な浅い凍結融解現象、深い永久凍土埋没、高温、低い氷量、安定性の低さなどである。これまで、高地の永久凍土に生息する微生物に関する研究は少なく、特にウイルスに関する研究は、基本的に「ブラインドボックス」である。核酸は、遺伝情報の担い手として、遺伝子発現の物質的基盤となっている。生物の成長、発達、生殖において非常に重要な役割を担っている。専門家は、将来、チベット高原の厚さ１０ｍ以下の永久凍土が消失し、永久凍土中の古代ウイルスが放出される可能性があると予測しているが、永久凍土中のウイルスＤＮＡに関する研究はほとんどないのが現状である。同時に、核酸配列決定に基づくマクロゲノムシーケンスは、微生物生態研究において最も重要な方法論の一つとなっており、現在、微生物群集（細菌、真菌、古細菌、ウイルスなど）の構造組成、多様性および機能特性を明らかにする最高の技術ツールとなっている。核酸の抽出と核酸サンプルの品質は、綿密な分析の成功と結果の信頼性に直接関係する。「Ｌａｒｇｅ‐ｓｃａｌｅ ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ａｎｄ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃａｒｂｏｎ ｒｅｌｅａｓｅ ａｆｔｅｒ ｐｅｒｍａｆｒｏｓｔ ｔｈａｗ（永久凍土融解後の微生物応答とそれに伴う炭素放出に関する大規模な証拠）」、Ｐｒｉｍａｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｒｔｉｃｌｅｓ、２０２０年１２月、Ｙｏｎｇｌｉａｎｇ Ｃｈｅｎらは、青海チベット高原の２４のサンプルサイトから永久凍土の活性層を大規模にサンプリングし（サンプリング深度１．５～３．５ｍ）、マクロゲノム技術（機能的遺伝子マイクロアレイとＩｌｌｕｍｉｎａＭｉＳｅｑシーケンス）を用いて、永久凍土融解（永久凍土サンプルを５℃で１１日間培養）が微生物の分類と機能コミュニティーに及ぼす影響を、特に次のようにして明らかにしたことを発表している。微生物分解時の永久凍土炭素と気候のフィードバックの方向性と強度の関係を構築するために、研究対象と同じ期間、高い活性を持つ微生物を得ることを目的に、ハイスループット・シーケンスを用いて細菌と真菌の分類学的多様性を検討した。しかし、永久凍土層からハイスループットなシーケンシングでＤＮＡ配列を得ることは困難であり、これは主に、一方では活動層の下の深い永久凍土層のサンプルが入手することが困難であり、他方では微生物のバイオマスや核酸量が少なく抽出しにくく、現在のハイスループットシーケンシングの基本要件を満たしていないためである。
【0006】
このため、本発明では、永久凍土層の微生物を研究対象として、青海チベット高原の永久凍土から低バイオマスサンプルを取得し、核酸抽出する技術を提案し、永久凍土層の微生物生態の研究に貢献することを目的としている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
これに鑑み、本発明の目的は、永久凍土微生物のＤＮＡサンプルの取得方法およびＤＮＡの抽出と検出方法を提供し、永久凍土の異なる深度の微生物を研究対象として選択し、改善されたＣＴＡＢ法により永久凍土層内の微生物のＤＮＡサンプルを取得し、ＭＤＡ増幅の方法により全ＤＮＡを抽出し、蛍光法により定量的に分析して、その後のマクロゲノムライブラリー構築と配列決定に十分な量のＤＮＡを得ることができる。
【課題を解決するための手段】
【0008】
上記の目的を達成するために、本発明は以下の技術的解決策を提供する。
【0009】
本発明が提供する永久凍土層の土壌微生物サンプルの取得方法および核酸抽出方法は、
サンプリング：９月下旬から１０月上旬にかけて融解深度が最大となる青海チベット高原の永久凍土の活性層を選択し、定点多層ビットサンプリング法により永久凍土活性層と永久凍土層を無菌的にサンプリングし、サンプリングのとき、永久凍土サンプルを常に凍結状態と無菌状態に保ち、－８０℃条件下で保管し、前記永久凍土サンプルは活性層サンプルと永久凍土層サンプルを含むステップＳ１と、
微生物サンプルの取得：前記活性層サンプルおよび／または前記永久凍土層サンプルを選択し、段階加温法により解凍して前記微生物サンプルを取得するステップＳ２と、
微生物サンプル前処理：前記微生物サンプルをそれぞれ粉砕した後、ＰＢＳ緩衝液を加えて振とう－液体窒素凍結融解処理して凍結融解懸濁液を得るステップＳ３と、
改善されたＣＴＡＢ法によるＤＮＡサンプルの取得：前記凍結融解懸濁液を細菌分解－抽出－沈殿－洗浄および溶解してＤＮＡサンプルを得るステップＳ４と、
電気泳動検出：前記ＤＮＡサンプルを検出するステップＳ５と、を含む。
サンプリング：９月下旬から１０月上旬にかけて融解深度が最大となる青海チベット高原の永久凍土の活性層を選択し、定点多層ビットサンプリング法により永久凍土活性層と永久凍土層を無菌的にサンプリングし、サンプリングのとき、永久凍土サンプルを常に凍結状態と無菌状態に保ち、－８０℃条件下で保管し、前記永久凍土サンプルは活性層サンプルと永久凍土層サンプルを含むステップＳ１と、
微生物サンプルの取得：前記活性層サンプルおよび／または前記永久凍土層サンプルを選択し、段階加温法により解凍して前記微生物サンプルを取得するステップＳ２と、
微生物サンプル前処理：前記微生物サンプルをそれぞれ粉砕した後、ＰＢＳ緩衝液を加えて振とう－液体窒素凍結融解処理して凍結融解懸濁液を得るステップＳ３と、
改善されたＣＴＡＢ法によるＤＮＡサンプルの取得：前記凍結融解懸濁液を細菌分解－抽出－沈殿－洗浄および溶解してＤＮＡサンプルを得るステップＳ４と、
電気泳動検出：前記ＤＮＡサンプルを検出するステップＳ５と、を含む。
【0010】
さらに、ステップＳ１では、前記定点・異なる深度の多層ビットサンプリング法は、０～２０ｃｍ、２０～３５０ｃｍ、３５０～５００ｃｍ、５００～６００ｃｍ、６００～１０００ｃｍおよび１０００～１５００ｃｍの異なる深度の活性層と永久凍土層を順次選択してサンプリングし、そのうちに、深度０～３５０ｃｍのサンプルは前記活性層サンプルであり、他の深度層のサンプルは前記永久凍土層サンプルであり、独立した無菌容器内にそれぞれ保管する。
【0011】
さらに、ステップＳ２では、前記段階加温法は、前記永久凍土を－８０℃で取出した後、－５０℃で３０分、－２０℃で３０分、－４℃で１時間、常温条件で１時間放置することを含む。
【0012】
さらに、ステップＳ４では、改善されたＣＴＡＢ法は、以下のステップを含む。
（１）細菌分解：ステップＳ３の前記凍結融解懸濁液を高速遠心分離した後、上澄液を捨て、ＴＥ緩衝液を加えて沈殿懸濁液を得、ＳＤＳとプロテアーゼＫを加えて均一に混合し、再加予熱したＣＴＡＢ／ＮａＣｌ溶液を加えて均一に混合し、保温して分解サンプルを得、前記分解液はＳＤＳ、プロテアーゼＫを含む。
（２）抽出：前記分解サンプルに等体積のＴｒｉｓ飽和フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール試薬を加えて均一に混合し、遠心分離して得られた上澄液に等体積のクロロホルムとイソアミルアルコール試薬を加えて抽出する。
（３）沈殿：ステップ（２）で抽出した上澄液にイソプロパノールを加えて遠心分離処理する。
（４）洗浄・溶解：ステップ（３）の遠心分離した沈殿物をエタノールで洗浄し、乾燥した後ｄｄＨ２ＯまたはｐＨ８．０のＴＥ緩衝液に溶解して、前記ＤＮＡサンプルを得る。
（１）細菌分解：ステップＳ３の前記凍結融解懸濁液を高速遠心分離した後、上澄液を捨て、ＴＥ緩衝液を加えて沈殿懸濁液を得、ＳＤＳとプロテアーゼＫを加えて均一に混合し、再加予熱したＣＴＡＢ／ＮａＣｌ溶液を加えて均一に混合し、保温して分解サンプルを得、前記分解液はＳＤＳ、プロテアーゼＫを含む。
（２）抽出：前記分解サンプルに等体積のＴｒｉｓ飽和フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール試薬を加えて均一に混合し、遠心分離して得られた上澄液に等体積のクロロホルムとイソアミルアルコール試薬を加えて抽出する。
（３）沈殿：ステップ（２）で抽出した上澄液にイソプロパノールを加えて遠心分離処理する。
（４）洗浄・溶解：ステップ（３）の遠心分離した沈殿物をエタノールで洗浄し、乾燥した後ｄｄＨ２ＯまたはｐＨ８．０のＴＥ緩衝液に溶解して、前記ＤＮＡサンプルを得る。
【0013】
さらに、前記沈殿懸濁液にＳＤＳ、プロテアーゼＫを加えて均一に混合し、３７℃で１時間保温してから、ＮａＣｌ溶液と６５℃予熱したＣＴＡＢ／ＮａＣｌ溶液を加えて均一に混合した後、６５℃で３０分間保温する。前記Ｔｒｉｓ飽和フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール混合液の体積比は２５：２４：１であり、前記クロロホルムとイソアミルアルコール混合液の体積比は２４：１である。
【0014】
本発明の別の目的を達成するために、本発明は、永久凍土微生物ＤＮＡの抽出方法をさらに提供し、上記技術的解決策により取得したＤＮＡサンプルまたは従来のＣＴＡＢで取得したＤＮＡサンプルをＭＤＡで増幅し、大量の微生物の全ＤＮＡ、特に永久凍土層の全ＤＮＡを得て、その後のマクロゲノムライブラリー構築と配列決定に使用できる。
【0015】
前記ＭＤＡ増幅は、前記ＤＮＡサンプルを精製した後サンプル変性－ＭＤＡ増幅－ＰＣＲ増幅を行ってＰＣＲ産物を得ることを含む。
【0016】
さらに、前記ＤＮＡサンプルをＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎゲル／ＰＣＲ産物精製キットで精製し、前記サンプル変性はＰＣＲ増幅器で行い、変性産物を得る。
【0017】
さらに、前記ＭＤＡ増幅のＭＤＡ増幅系は、ｄＮＴＰ、ＤＴＴ、Ｐｈｉ２９酵素、ＢＳＡおよび超純水を含み、前記ＰＣＲ産物をＭＤＡで増幅する。前記ＭＤＡ増幅系中の各成分と前記変性産物の体積パーセントはそれぞれｄＮＴＰ：ＤＴＴ：Ｐｈｉ２９酵素：ＢＳＡ：変性産物＝４：０．８：０．８～２：０～０．２：５～１０である。
【0018】
さらに、前記１６ＳｒＤＮＡ ＰＣＲ増幅において、フォワードプライマー（３４１－Ｆ）：５’－ＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ－３’、リバースプライマー（９２６－Ｒ）：５’－ＣＣＧＴＣＡＡＴＴＣＣＴＴＴＲＡＧＴＴＴ－３’である。
【0019】
上記解決策で得られたＤＮＡサンプルを蛍光法で定量的に分析した結果、改善されたＣＴＡＢで十分な量のＤＮＡサンプルを得、または従来のＣＴＡＢ法にＭＤＡ増幅を組み合わせる方法でも十分な量の永久凍土中のＤＮＡを抽出することができる。永久凍土のＤＮＡを抽出した後、その後の検出に十分な量のＤＮＡサンプルを得、配列決定などを含む本分野の既知方法により検出することができる。
【発明の効果】
【0020】
本発明は、以下の有益な技術的効果を有する。
１．本発明の技術的解決策により、青海チベット高原の凍土微生物のＤＮＡ、特に活性層の下の永久凍土層の低バイオマス永久凍土微生物の全ＤＮＡを抽出することができ、青海チベット高原の微生物細菌、古細菌、真菌、シアノバクテリア、ウイルスなどの微生物の遺伝子配列研究に技術支援を提供するだけでなく、青海チベット高原の永久凍土内の集団研究を積極的に誘導する効果もある。
１．本発明の技術的解決策により、青海チベット高原の凍土微生物のＤＮＡ、特に活性層の下の永久凍土層の低バイオマス永久凍土微生物の全ＤＮＡを抽出することができ、青海チベット高原の微生物細菌、古細菌、真菌、シアノバクテリア、ウイルスなどの微生物の遺伝子配列研究に技術支援を提供するだけでなく、青海チベット高原の永久凍土内の集団研究を積極的に誘導する効果もある。
【0021】
２．本発明の技術的解決策により、青海チベット高原に特有の微生物分類ゲノムを明らかにし、その後のマクロゲノムライブラリー構築と配列決定に技術支援を提供し、特に永久凍土層が徐々に融解する前に、青海チベット高原凍土層中の古細菌、特に古ウイルスのＤＮＡの研究を実現する。
【0022】
３．永久凍土層中の未知の特定微生物のＤＮＡを取得・抽出する方法であり、この方法は、極めて特異性が高く、簡単な操作で、輸送・保管時に永久凍土層の微生物がもたらす汚染を低減する。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【図1】本発明の実施例１におけるＤＮＡサンプルの電気泳動検出の電気泳動ゲル図である。
【図2】本発明の実施例２におけるＤＮＡサンプルの電気泳動検出の電気泳動ゲル図である。
【図3】本発明の実施例２におけるＭＤＡ増幅後のＤＮＡ電気泳動検出の電気泳動ゲル図である。
【発明を実施するための形態】
【0024】
本発明の実施例の目的、技術的解決策および利点をより明確にするために、以下、本発明の実施例中の図面を参照して、本発明の実施例中の技術的解決策を明確かつ完全に説明するが、説明される実施例は本発明の一部の実施例に過ぎず、すべての実施例ではない。
【0025】
青海チベット高原の永久凍土は活性層と永久凍土層を含み、活性層の厚さは一般に０～３５０ｃｍであり、３５０ｃｍ以下は永久凍土層である。本発明の研究対象は永久凍土層の土壌微生物であり、永久凍土層サンプルは長年氷結状態のサンプルである。
【0026】
サンプリング：９月下旬から１０月上旬にかけて融解深度が最大となる青海チベット高原の永久凍土の活性層を選択するため、本発明ではその時期を選んで青海チベット高原の永久凍土の活性層と永久凍土層をサンプリングする。
【0027】
サンプリング方法：定点多層ビットサンプリング法により無菌的にサンプリングし、サンプリングのとき永久凍土サンプルを常に凍結状態と無菌状態に保ち、取得した異なる深度の前記永久凍土サンプルを独立した無菌容器内にそれぞれ保管し、－２０℃条件下で輸送・保管して－８０℃条件下で保管する。
【0028】
さらに、異なる深度の定点多層ビットサンプリング法とは、ある選択した草地被覆下の１地点に対して同一断面、異なる深度で複数点サンプリングし、サンプリング深度は活性層表層（０～２０ｃｍ）、活性層下層（２０～３５０ｃｍ）および永久凍土層表層（３５０～５００ｃｍ）、中層（５００～６００ｃｍ）と下層（６００～１５００ｃｍ）を含み、サンプリングして凍土サンプルを得て番号をつける。サンプリングのとき、サンプルを常に凍結かつ無菌状態に保ち、サンプリング工具も絶対に無菌状態にする必要がある。異なる深さのサンプリング層では、減菌ナイフで土壌外面の１ｃｍの部分を切り落とし、これらのサンプルを直ちに無菌サンプルバッグやアルミボックスなどの容器に入れ、密封して番号を付け、－２０℃冷蔵庫に迅速に保管して保存試験場に輸送し、－８０℃超低温冷蔵庫に保管して、その後の分析に使用する。
【0029】
サンプリングのとき、０～２０ｃｍの活性層表層サンプルを無菌シャベルまたは無菌ナイフで直接取り出して無菌サンプルバッグや無菌アルミボックスなどの容器に入れる。２０～３５０ｃｍ活性層下層サンプルは、ハンドトレンチまたは携帯用ソイルオーガー（オーガーロッド内径約４．５ｃｍ）により採取された。３５０ｃｍ以下の永久凍土層サンプルは、専門の機械式パワーオーガー（オーガーロッド内径１０～２０ｃｍ）により採取された。
【0030】
以下の実施例と比較例の試験対象は、活性層サンプルおよび／または永久凍土層サンプルを含む。
【0031】
（実施例１）
本実施例は活性層サンプルと永久凍土層サンプルを選択してＤＮＡを抽出し、具体的に以下のステップを含む。
１．サンプル前処理
活性層サンプルと永久凍土層サンプルを－８０℃冷蔵庫から取り出して段階加温法により解凍し、活性層サンプルと異なる断面深度の永久凍土層サンプルを後処理し、まずすべてのサンプルを粉砕し、塊状サンプルをできるだけ破砕し、活性層サンプルと永久凍土層サンプルをランダムに混合した後、混合後の活性層サンプルと永久凍土層サンプルを１０ＸＰＢＳ緩衝液で十分に洗浄し、ボルテックスで１０分間振とうした後、緩衝液に沈殿した砂を除去し、緩衝液中の土壌懸濁液を保留してＰＢＳ緩衝液を加え、振とう－液体窒素凍結融解処理を行って凍結融解懸濁液を得、そのＤＮＡを抽出する。
本実施例は活性層サンプルと永久凍土層サンプルを選択してＤＮＡを抽出し、具体的に以下のステップを含む。
１．サンプル前処理
活性層サンプルと永久凍土層サンプルを－８０℃冷蔵庫から取り出して段階加温法により解凍し、活性層サンプルと異なる断面深度の永久凍土層サンプルを後処理し、まずすべてのサンプルを粉砕し、塊状サンプルをできるだけ破砕し、活性層サンプルと永久凍土層サンプルをランダムに混合した後、混合後の活性層サンプルと永久凍土層サンプルを１０ＸＰＢＳ緩衝液で十分に洗浄し、ボルテックスで１０分間振とうした後、緩衝液に沈殿した砂を除去し、緩衝液中の土壌懸濁液を保留してＰＢＳ緩衝液を加え、振とう－液体窒素凍結融解処理を行って凍結融解懸濁液を得、そのＤＮＡを抽出する。
【0032】
この場合、段階加温法による解凍は、活性層サンプルおよび／または永久凍土サンプルを－８０℃で取り出して、－５０℃で３０分、－２０℃で３０分、－４℃で１時間、常温条件下で１時間放置して段階的に解凍する方法である。
【0033】
２．ＤＮＡ抽出
改善されたＣＴＡＢ抽出法によりゲノムＤＮＡを抽出し、具体的には以下のステップを含む。
（１）細菌分解：得られた凍結融解懸濁液を１５０００ｒ／分で高速遠心分離し、上澄液を捨て、９．０ｍＬのＴＥ懸濁液を加えて沈殿懸濁液を得、１．０ｍＬの１０％ＳＤＳ、１００μＬの２０ｍｇ／ｍＬ（または粉末１ｍｇ）プロテアーゼＫを加え、均一に混合して３７℃で１時間保温する。次に、１．５ｍＬの５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを加え、均一に混合し、その後、１．５ｍＬの６５℃予熱したＣＴＡＢ／ＮａＣｌ溶液を加えて均一に混合し、６５℃で３０分間保温する。このステップでは、ＳＤＳは細菌の細胞壁を溶解し、プロテアーゼＫはタンパク質成分を除去し、ＣＴＡＢは多糖類成分を除去する。
改善されたＣＴＡＢ抽出法によりゲノムＤＮＡを抽出し、具体的には以下のステップを含む。
（１）細菌分解：得られた凍結融解懸濁液を１５０００ｒ／分で高速遠心分離し、上澄液を捨て、９．０ｍＬのＴＥ懸濁液を加えて沈殿懸濁液を得、１．０ｍＬの１０％ＳＤＳ、１００μＬの２０ｍｇ／ｍＬ（または粉末１ｍｇ）プロテアーゼＫを加え、均一に混合して３７℃で１時間保温する。次に、１．５ｍＬの５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌを加え、均一に混合し、その後、１．５ｍＬの６５℃予熱したＣＴＡＢ／ＮａＣｌ溶液を加えて均一に混合し、６５℃で３０分間保温する。このステップでは、ＳＤＳは細菌の細胞壁を溶解し、プロテアーゼＫはタンパク質成分を除去し、ＣＴＡＢは多糖類成分を除去する。
【0034】
（２）抽出：等体積のＴｒｉｓ飽和フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）を加え、均一に混合し、室温で５～１０分間放置し、５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上澄液を清潔な遠心分離管に移す。さらに、等体積クロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で抽出し、上澄液を清潔な管に移す。
【0035】
（３）沈殿：等体積のイソプロパノールを加え、均一に混合し、室温で１０分間放置した後、５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。
【0036】
（４）洗浄：沈殿物を７５％のエタノールで洗浄する。
【0037】
（５）溶解：乾燥後、ｄｄＨ２ＯまたはｐＨ８．０のＴＥ緩衝液に溶解する。
【0038】
３．ＤＮＡ検出
アガロースゲルを用いて得られた永久凍土微生物ＤＮＡの核酸検出を行い、ＤＬ２０００をマーカーとして使用する。
アガロースゲルを用いて得られた永久凍土微生物ＤＮＡの核酸検出を行い、ＤＬ２０００をマーカーとして使用する。
【0039】
具体的には、１．５％のアガロースゲルを調製し、２５分間冷却し、固化後ゲルコームを除去し、ゲルをゲルトレイとともに取り出して電気泳動装置に入れ、電気泳動検出のために３μＬの増幅ＰＣＲ産物を取り、ＰＣＲ産物を泳動バッファーに混合し滴下サンプリングし、同時に３μＬのＤＬ１０００ ＤＮＡマーカーをスポットし、２００Ｖで１７分間電気泳動した。電気泳動の後１５分間ＥＢ（エチジウムブロマイド）染色した後、ゲルイメージングを行い、５００フラグメント領域のバンドを確認する。電気泳動ゲル図が図１に示される。
【0040】
Ｑｕｂｉｔ蛍光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて得られたＤＮＡを定量し、結果が表１に示される。その内の、番号１～５は活性層サンプルであり、５以上は永久凍土層サンプルである。
【0041】
【表1】
【0042】
図１と表１に示す結果から分かるように、ほとんどのサンプルが約２０Ｋのフラグメント領域に明確なバンドを持ち、表面のほとんどの活性層土壌微生物サンプルは一定量のＤＮＡを抽出することができる。サンプルＢ７を除いて、全ＤＮＡの量は０．１μｇ以上で、最大１．５μｇであり、明らかに、本実施例の技術的解決策は十分な量のＤＮＡを得、その後のマクロゲノムライブラリー構築と配列決定に使用することができる。全ＤＮＡ取得量のデータは、永久凍土中の微生物分布の不均一性をさらに証明する。本実施例のサンプル選択は定点サンプリングであるため、複数点サンプリングの後にサンプルを混合してＤＮＡを抽出することにより、より高いレベルの全ＤＮＡ量を得ることが予測される。
【0043】
同時に、試験の結果から、活性層の微生物含有量と活性は両方とも永久凍土層より高いことが推測される。
【0044】
（実施例２）
本実施例は、永久凍土層サンプルを選択してＤＮＡを抽出する。具体的には、以下のステップを含む。
１．サンプル前処理
永久凍土層サンプル（サンプル番号が表２に示される）を-８０℃冷蔵庫から取り出して段階加温法により解凍し、まず永久凍土層サンプルを粉砕し、塊状サンプルを可能な限り破砕し、異なる深度の永久凍土層サンプルと均一に混合した後、２０ｇを秤量し後処理を行い、その後１０ＸＰＢＳ緩衝液でサンプルを十分に洗浄し、ボルテックスで１０分間振とうした後、緩衝液に沈殿した砂を除去し、緩衝液中の土壌懸濁液を保留してＤＮＡを抽出する。
本実施例は、永久凍土層サンプルを選択してＤＮＡを抽出する。具体的には、以下のステップを含む。
１．サンプル前処理
永久凍土層サンプル（サンプル番号が表２に示される）を-８０℃冷蔵庫から取り出して段階加温法により解凍し、まず永久凍土層サンプルを粉砕し、塊状サンプルを可能な限り破砕し、異なる深度の永久凍土層サンプルと均一に混合した後、２０ｇを秤量し後処理を行い、その後１０ＸＰＢＳ緩衝液でサンプルを十分に洗浄し、ボルテックスで１０分間振とうした後、緩衝液に沈殿した砂を除去し、緩衝液中の土壌懸濁液を保留してＤＮＡを抽出する。
【0045】
本実施例中の段階加温法の手順は実施例１と同じである。
【0046】
２．ＤＮＡ抽出
従来のＣＴＡＢ抽出法でゲノムＤＮＡを抽出し、具体的に以下のステップを含み、得られた土壌懸濁液を遠心分離し（１５０００ｒ／分）、上澄液を捨て、９．０ｍＬのＴＥ懸濁液を沈殿物に加え、１ｍＬの１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００、０．５ｍＬの１％ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅおよび１０ｍＬの０．１％ ＳＤＳを含むＲＩＰＡ分解液を加え、均一に混合し、３７℃で１時間保温し、１．５ｍＬの５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ溶液を加え、均一に混合し、１．５ｍＬの６５℃予熱した ＣＴＡＢ／ＮａＣｌ溶液を加え、均一に混合し、６５℃で２０分間保温する。等体積のＴｒｉｓ飽和フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）を加え、均一に混合し、室温で５～１０分間放置し、５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄液を清潔な遠心分離管に移す。等体積のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で抽出し、上澄液を清潔な管に移す。等体積のイソプロパノールを加え、均一に混合し、室温で１０分間放置する。５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。沈殿物を７５％のエタノールで洗浄する。乾燥後、ｄｄＨ２ＯまたはｐＨ８．０ ＴＥに溶解する。
従来のＣＴＡＢ抽出法でゲノムＤＮＡを抽出し、具体的に以下のステップを含み、得られた土壌懸濁液を遠心分離し（１５０００ｒ／分）、上澄液を捨て、９．０ｍＬのＴＥ懸濁液を沈殿物に加え、１ｍＬの１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００、０．５ｍＬの１％ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅおよび１０ｍＬの０．１％ ＳＤＳを含むＲＩＰＡ分解液を加え、均一に混合し、３７℃で１時間保温し、１．５ｍＬの５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ溶液を加え、均一に混合し、１．５ｍＬの６５℃予熱した ＣＴＡＢ／ＮａＣｌ溶液を加え、均一に混合し、６５℃で２０分間保温する。等体積のＴｒｉｓ飽和フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）を加え、均一に混合し、室温で５～１０分間放置し、５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄液を清潔な遠心分離管に移す。等体積のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で抽出し、上澄液を清潔な管に移す。等体積のイソプロパノールを加え、均一に混合し、室温で１０分間放置する。５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。沈殿物を７５％のエタノールで洗浄する。乾燥後、ｄｄＨ２ＯまたはｐＨ８．０ ＴＥに溶解する。
【0047】
３．ＤＮＡ検出
アガロースゲルで得られた土壌微生物ＤＮＡの核酸検出を行い、ＤＬ２０００をマーカーとして使用する。具体的な方法は実施例１と同じである。得られた電気泳動ゲル図が図２に示される。
アガロースゲルで得られた土壌微生物ＤＮＡの核酸検出を行い、ＤＬ２０００をマーカーとして使用する。具体的な方法は実施例１と同じである。得られた電気泳動ゲル図が図２に示される。
【0048】
Ｑｕｂｉｔ蛍光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）によりＤＮＡを定量し、結果が表２に示される。
【表2】
【0049】
図２に示すように、図には明確なＤＮＡバンドが見られず、従来のＣＴＡＢ法による永久凍土層サンプル中の微生物のＤＮＡ抽出では、十分な量のＤＮＡが得られないことがわかる。
【0050】
表２の結果から、この方法により抽出されたＤＮＡ量が、基本的に０．０３μｇ以下と極めて少量であることがわかる。
【0051】
４．ＭＤＡ増幅抽出法
ステップ２で従来のＣＴＡＢ抽出法により抽出されたＤＮＡをＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ゲル／ＰＣＲ産物精製キットで抽出したＤＮＡサンプルを精製する。ＭＤＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で精製後のＤＮＡを増幅し、反応を以下に反映させる。
ステップ２で従来のＣＴＡＢ抽出法により抽出されたＤＮＡをＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ゲル／ＰＣＲ産物精製キットで抽出したＤＮＡサンプルを精製する。ＭＤＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で精製後のＤＮＡを増幅し、反応を以下に反映させる。
【0052】
（１）サンプル変性：ＰＣＲ増幅器でサンプルを変性させる。
その内に、変性系（１０μＬ）が表３に示される。
その内に、変性系（１０μＬ）が表３に示される。
【0053】
【表3】
【0054】
ＰＣＲ手順は、第１ステップ：９５℃－５分、第２ステップ：９５℃－３０秒、第３ステップ：７５℃－３０秒、第４ステップ：５０℃－３０秒、第５ステップ：７５℃－２０分、第６ステップ：４℃－∞分である。その内、第２ステップ～第５ステップを２０回繰り返して実行する。
【0055】
（２）ＭＤＡ増幅
ＭＤＡの増幅系（４５μＬ）は表４に示される。
ＭＤＡの増幅系（４５μＬ）は表４に示される。
【0056】
【表4】
【0057】
ＰＣＲ手順は、
３０℃、２４ｈである。
３０℃、２４ｈである。
【0058】
（３）Ｑｕｂｉｔ蛍光光度計によりＲＣＡ後のＰＣＲ産物を定量的に分析する（表５を参照）。
【0059】
【表5】
【0060】
（４）１６Ｓ ｒＤＮＡ ＰＣＲ増幅：１μＬのＲＣＡ後のＰＣＲ産物を１０倍に希釈して１６Ｓ ｒＤＮＡ増幅のテンプレートとする。フォワードプライマー（３４１－Ｆ）：５’－ＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ－３’、リバースプライマー（９２６－Ｒ）：５’－ＣＣＧＴＣＡＡＴＴＣＣＴＴＴＲＡＧＴＴＴ－３’である。
【0061】
ＰＣＲの増幅系（２５μＬ）が表６に示される。
【0062】
【表6】
【0063】
ＰＣＲ増幅手順は、第１ステップ：９４℃－４分、第２ステップ：９４℃－３０秒、第３ステップ：６５～５６℃－４０秒、第４ステップ：７２℃－１分３０秒、第５ステップ：９４℃－３０秒、第６ステップ：５７℃－４０秒、第７ステップ：７２℃－１分３０秒、第８ステップ：７２℃－１０分、第９ステップ：４℃－∞分である。その内、第２ステップ－第４ステップを２０回繰り返して実行し、第５ステップ－第７ステップを１０回繰り返して実行する。
【0064】
２４時間ＰＣＲ増幅した後、アガロースゲル電気泳動を行う（図３を参照）。図３と表５の結果から分かるように、１回のＭＤＡ増幅した後、大量の微生物の全ＤＮＡを得ることができ、その後のマクロゲノムライブラリー構築と配列決定に利用することができる。
【0065】
上記試験結果から分かるように、従来のＣＴＡＢ抽出法で得られたＤＮＡサンプル条件に基づくＭＤＡで得られた増幅産物は必要十分であり、実施例１の改善されたＣＴＡＢで抽出してＭＤＡ増幅を行うとより十分な量のＤＮＡを得ることができる。
【0066】
（実施例３）
本実施例と実施例２とは、ＭＤＡ増幅系の点で相違する。本実施例で用いる増幅系が表７に示される。本実施例では、Ｐｈｉ２９酵素の添加量を増加し、１回のＭＤＡ増幅した後、大量の微生物の全ＤＮＡを得ることができ、全体として実施例２よりもやや優れ、いずれも１μｇ以上であり（表８を参照）、その後のマクロゲノムライブラリー構築と配列決定に利用することができる。
本実施例と実施例２とは、ＭＤＡ増幅系の点で相違する。本実施例で用いる増幅系が表７に示される。本実施例では、Ｐｈｉ２９酵素の添加量を増加し、１回のＭＤＡ増幅した後、大量の微生物の全ＤＮＡを得ることができ、全体として実施例２よりもやや優れ、いずれも１μｇ以上であり（表８を参照）、その後のマクロゲノムライブラリー構築と配列決定に利用することができる。
【0067】
【表7】
【0068】
【表8】
【0069】
（実施例４）
本実施例と実施例２とは、ＭＤＡ増幅系の点で相違する。本実施例で用いる増幅系は表９に示される。本実施例では、Ｐｈｉ２９酵素の添加量を増加し、１回のＭＤＡ増幅した後、大量の微生物の全ＤＮＡを得た。Ｑｕｂｉｔ蛍光光度計による検出結果から分かるように、全体として実施例２よりもやや優れ、いずれも１μｇ以上であり（表１０を参照）、その後のマクロゲノムライブラリー構築と配列決定に利用することができる。
本実施例と実施例２とは、ＭＤＡ増幅系の点で相違する。本実施例で用いる増幅系は表９に示される。本実施例では、Ｐｈｉ２９酵素の添加量を増加し、１回のＭＤＡ増幅した後、大量の微生物の全ＤＮＡを得た。Ｑｕｂｉｔ蛍光光度計による検出結果から分かるように、全体として実施例２よりもやや優れ、いずれも１μｇ以上であり（表１０を参照）、その後のマクロゲノムライブラリー構築と配列決定に利用することができる。
【0070】
【表9】
【0071】
【表10】
【0072】
（実施例５）
実施例２と比較すると、本実施例では、ｐｈｉ２９酵素の投入量を増加し、ＭＤＡ増幅テンプレートとする変性産物の投入量を減少し、酵素を十分に活用し、より多くのＭＤＡ産物を得ることができ、取得した全ＤＮＡ量が増加した。
実施例２と比較すると、本実施例では、ｐｈｉ２９酵素の投入量を増加し、ＭＤＡ増幅テンプレートとする変性産物の投入量を減少し、酵素を十分に活用し、より多くのＭＤＡ産物を得ることができ、取得した全ＤＮＡ量が増加した。
【0073】
【表11】
【0074】
【表12】
【0075】
（実施例６）
本実施例と実施例２とはＭＤＡ増幅系の点で相違する。本実施例で用いる増幅系が表１３に示される。本実施例では、ＢＳＡを添加しておらず、１回のＭＤＡ増幅した後、一定量の全ＤＮＡを得ることができ、Ｑｕｂｉｔ蛍光光度計による検出結果から分かるように、全体として実施例２よりも低く（表１４を参照）、基本的に、その後のマクロゲノムライブラリー構築と配列決定に利用することができる。
本実施例と実施例２とはＭＤＡ増幅系の点で相違する。本実施例で用いる増幅系が表１３に示される。本実施例では、ＢＳＡを添加しておらず、１回のＭＤＡ増幅した後、一定量の全ＤＮＡを得ることができ、Ｑｕｂｉｔ蛍光光度計による検出結果から分かるように、全体として実施例２よりも低く（表１４を参照）、基本的に、その後のマクロゲノムライブラリー構築と配列決定に利用することができる。
【0076】
【表13】
【0077】
【表14】
【0078】
（実施例７）
本実施例と実施例１とは、永久凍土サンプルを直接解凍する点で相違し、永久凍土サンプルを－８０℃で取り出して、－２０℃で３０分間放置した後直接に常温条件下で１時間放置することにより解凍する。
本実施例と実施例１とは、永久凍土サンプルを直接解凍する点で相違し、永久凍土サンプルを－８０℃で取り出して、－２０℃で３０分間放置した後直接に常温条件下で１時間放置することにより解凍する。
【0079】
本実施例の技術的解決策によれば、取得したＤＮＡ量が基本的に０．５μｇ以上であり、効果が実施例１の加温方法よりも低いが、依然として十分な量のＤＮＡを得ることができる。明らかに、サンプル解凍の条件は、永久凍土層内の微生物を休眠状態から活性化させることに影響を及ぼす。
【0080】
（比較例１）
本比較例は実施例１とは、本比較例では永久凍土サンプルを直接解凍する点で相違し、永久凍土サンプルを－８０℃で取り出して、常温条件下で１時間放置して解凍する。
本比較例は実施例１とは、本比較例では永久凍土サンプルを直接解凍する点で相違し、永久凍土サンプルを－８０℃で取り出して、常温条件下で１時間放置して解凍する。
【0081】
本比較例の技術的解決策によれば、抽出したＤＮＡ量が実施例１よりもはるかに少なく、基本的に０．５μｇ未満である。明らかに、青海チベット高原の永久凍土内の微生物を抽出する場合、サンプルの直接解凍は有利な方法ではない。
【0082】
（比較例２）
本比較例と実施例２とは、本比較例では、ＭＤＡの増幅系の点で相違するが、具体的に表１５を参照する。
本比較例と実施例２とは、本比較例では、ＭＤＡの増幅系の点で相違するが、具体的に表１５を参照する。
【0083】
【表15】
【0084】
本比較例の技術的解決策によれば、ＭＤＡ増幅した後ＤＮＡを抽出すると十分な量のＤＮＡが得られず、基本的に０．５μｇ未満である。
【0085】
上記実施例１と実施例２の結果から分かるように、従来のＣＴＡＢ法で青海チベット高原の永久凍土内の微生物ＤＮＡを直接抽出することができず、改善されたＣＴＡＢ法で一定量のＤＮＡ量を直接取得することができる。
【0086】
永久凍土の前処理はＤＮＡの抽出量にある程度影響を与え、通常の土壌処理方法と異なり、本発明の実施例１、実施例７は比較例１と比較すると、段階加温法の加温方式が直接解凍の加温方法よりも顕著に優れる。
【0087】
実際に、本発明のＭＤＡ増幅方法は、従来のＣＴＡＢ法で増幅した後大量の全ＤＮＡを取得することができ、試験により比較して試験条件を最適化することにより、この解決策は実行可能であり、永久凍土層のサンプルの全ＤＮＡを抽出した後、その後のマクロゲノムライブラリー構築と配列決定に利用することができる。
【0088】
実施例３～６と比較例２はそれぞれＭＤＡ増幅系における異なる酵素含有量の全ＤＮＡ抽出量に対する影響を示し、結果から分かるように、Ｐｈｉ２９酵素の添加量が０．５μＬ／４５μＬ未満であると、十分な量のＤＮＡを得ることができない。添加量が０．８～２μＬ／４５μＬであると、いずれも十分な量のＤＮＡを得ることができる。Ｐｈｉ２９酵素の添加量が２μＬよりも大きい場合にも、抽出条件が達成され得るが、コスト削減の観点から、０．８～２μＬ／４５μＬのＰｈｉ２９酵素とする場合抽出されたＤＮＡは、その後のマクロゲノムライブラリー構築と配列決定に十分である。
【0089】
なお、通常の土壌に比べて、青海チベット高原の永久凍土中の微生物量と活性が比較的低いので、環境汚染が永久凍土微生物に及ぼす干渉が大きいことに留意する必要がある。目標ＤＮＡ抽出率を上げると同時に、環境微生物による低バイオマスサンプルの核酸汚染を避けるために、サンプル前処理と核酸抽出はバイオセーフティキャビネットを備えた核酸抽出室やウルトラクリーンルームで行われることが望ましい。さらに、実施例および比較例の試験のとき、ブランクサンプルのサンプリング及び前処理とともに、バイオセーフティキャビネット又はウルトラクリーンルーム内で、ネガティブコントロール（鋳型なしコントロール）として実施することが望ましいが、これは当業者の日常業務であり、先行技術に従って実施することができるので、説明が繰り返さない。同時に、永久凍土の微生物量が少なく非均一性を有するため、解凍後の永久凍土サンプルを十分に均一に混合した後、活性層は１０ｇ以上、永久凍土層は少なくとも２０ｇ以上を秤量する。通常の土壌に比べて、永久凍土中の微生物集団は、異なる、より多くの未知細菌／群を有し、かつその微生物の活性と微生物量が非常に少なく、長年休眠状態にあり、本発明の技術目的を達成するために、通常土壌を処理する従来手段では高いＤＮＡ量が得られないので、サンプル量を増加し、サンプル処理と抽出条件を最適化して、適量なゲノムＤＮＡを得る必要がある。
【0090】
本発明の技術的解決策によれば、５００ｃｍ以下の深層の永久凍土層の微生物のＤＮＡを抽出し、青海チベット高原の微生物細菌、古細菌、真菌、シアノバクテリア、ウイルスなどの微生物の遺伝子配列研究に技術支援を提供し、さらに青海チベット高原の永久凍土内の集団の研究を積極的に誘導する効果もあり、永久凍土層の生物多様性を明らかにする上でさらなる技術支援を提供し、高原の永久凍土微生物の理解が極めて不十分な中で、特に古ウイルスに関する研究に大きな促進作用を果たす。
【0091】
以上は、本発明の好ましい実施例に過ぎず、本発明の保護範囲はこれに限定されず、当業者であれば、本発明に様々な置換や変更を加えることができる。本発明の精神および原則内で、通常の置換や、同じ機能を達成するように本発明の原理および精神から逸脱することなくこれらの実施例に加えられた変形、修正、置換、統合およびパラメータ変更は、すべて本発明の保護範囲に含まれる。
【0092】
（付記）
（付記１）
サンプリング：９月下旬から１０月上旬にかけて融解深度が最大となる青海チベット高原の永久凍土の活性層を選択し、定点多層ビットサンプリング法により永久凍土活性層と永久凍土層を無菌的にサンプリングし、サンプリングのとき、永久凍土サンプルを常に凍結状態かつ無菌状態に保ち、－８０℃条件下で保管し、前記永久凍土サンプルは活性層サンプルと永久凍土層サンプルを含むステップＳ１と、
微生物サンプルの取得：前記活性層サンプルおよび／または前記永久凍土層サンプルを選択し、段階加温法により解凍して微生物サンプルを取得し、前記段階加温法は、前記活性層サンプルおよび／または永久凍土サンプルを－８０℃で取出した後、－５０℃で３０分、－２０℃で３０分、－４℃で１時間、常温条件で１時間放置することを含むステップＳ２と、
微生物サンプル前処理：前記微生物サンプルをそれぞれ粉砕した後、ＰＢＳ緩衝液を加えて振とう－液体窒素凍結融解処理して凍結融解懸濁液を得るステップＳ３と、
改善されたＣＴＡＢ法によるＤＮＡサンプルの取得：前記凍結融解懸濁液を細菌分解－抽出－沈殿－洗浄および溶解してＤＮＡサンプルを得るステップＳ４と、
電気泳動検出：前記ＤＮＡサンプルを検出するステップＳ５と、
を主に含み、
前記ステップＳ１における前記定点多層ビットサンプリング法は、０～２０ｃｍ、２０～３５０ｃｍ、３５０～５００ｃｍ、５００～６００ｃｍ、６００～１０００ｃｍおよび１０００～１５００ｃｍの異なる深度の活性層と永久凍土層を順次選択してサンプリングし、そのうちに、深度０～３５０ｃｍのサンプルは前記活性層サンプルであり、他の深度層のサンプルは前記永久凍土層サンプルであり、独立した無菌容器内にそれぞれ保管し、
前記ステップＳ４における改善されたＣＴＡＢ法は、
（１）細菌分解：前記ステップＳ３の前記凍結融解懸濁液を高速遠心分離した後、上澄液を捨て、ＴＥ緩衝液を加えて沈殿懸濁液を得、ＳＤＳとプロテアーゼＫを加えて均一に混合し、３７℃で１時間保温してから、ＮａＣｌ溶液と６５℃予熱したＣＴＡＢ／ＮａＣｌ溶液を加えて均一に混合した後、６５℃で３０分間保温して分解サンプルを得るステップと、
（２）抽出：前記分解サンプルに等体積のＴｒｉｓ飽和フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール試薬を加えて均一に混合し、遠心分離して得られた上澄液に等体積のクロロホルムとイソアミルアルコール試薬を加えて抽出するステップと、
（３）沈殿：前記（２）のステップで抽出した上澄液にイソプロパノールを加えて遠心分離処理するステップと、
（４）洗浄・溶解：前記（３）のステップの遠心分離した沈殿物をエタノールで洗浄し、乾燥した後ｄｄＨ２ＯまたはｐＨ８．０のＴＥ緩衝液に溶解して、前記ＤＮＡサンプルを得るステップと、
を含む、ことを特徴とする永久凍土微生物のＤＮＡサンプルの取得方法。
（付記１）
サンプリング：９月下旬から１０月上旬にかけて融解深度が最大となる青海チベット高原の永久凍土の活性層を選択し、定点多層ビットサンプリング法により永久凍土活性層と永久凍土層を無菌的にサンプリングし、サンプリングのとき、永久凍土サンプルを常に凍結状態かつ無菌状態に保ち、－８０℃条件下で保管し、前記永久凍土サンプルは活性層サンプルと永久凍土層サンプルを含むステップＳ１と、
微生物サンプルの取得：前記活性層サンプルおよび／または前記永久凍土層サンプルを選択し、段階加温法により解凍して微生物サンプルを取得し、前記段階加温法は、前記活性層サンプルおよび／または永久凍土サンプルを－８０℃で取出した後、－５０℃で３０分、－２０℃で３０分、－４℃で１時間、常温条件で１時間放置することを含むステップＳ２と、
微生物サンプル前処理：前記微生物サンプルをそれぞれ粉砕した後、ＰＢＳ緩衝液を加えて振とう－液体窒素凍結融解処理して凍結融解懸濁液を得るステップＳ３と、
改善されたＣＴＡＢ法によるＤＮＡサンプルの取得：前記凍結融解懸濁液を細菌分解－抽出－沈殿－洗浄および溶解してＤＮＡサンプルを得るステップＳ４と、
電気泳動検出：前記ＤＮＡサンプルを検出するステップＳ５と、
を主に含み、
前記ステップＳ１における前記定点多層ビットサンプリング法は、０～２０ｃｍ、２０～３５０ｃｍ、３５０～５００ｃｍ、５００～６００ｃｍ、６００～１０００ｃｍおよび１０００～１５００ｃｍの異なる深度の活性層と永久凍土層を順次選択してサンプリングし、そのうちに、深度０～３５０ｃｍのサンプルは前記活性層サンプルであり、他の深度層のサンプルは前記永久凍土層サンプルであり、独立した無菌容器内にそれぞれ保管し、
前記ステップＳ４における改善されたＣＴＡＢ法は、
（１）細菌分解：前記ステップＳ３の前記凍結融解懸濁液を高速遠心分離した後、上澄液を捨て、ＴＥ緩衝液を加えて沈殿懸濁液を得、ＳＤＳとプロテアーゼＫを加えて均一に混合し、３７℃で１時間保温してから、ＮａＣｌ溶液と６５℃予熱したＣＴＡＢ／ＮａＣｌ溶液を加えて均一に混合した後、６５℃で３０分間保温して分解サンプルを得るステップと、
（２）抽出：前記分解サンプルに等体積のＴｒｉｓ飽和フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール試薬を加えて均一に混合し、遠心分離して得られた上澄液に等体積のクロロホルムとイソアミルアルコール試薬を加えて抽出するステップと、
（３）沈殿：前記（２）のステップで抽出した上澄液にイソプロパノールを加えて遠心分離処理するステップと、
（４）洗浄・溶解：前記（３）のステップの遠心分離した沈殿物をエタノールで洗浄し、乾燥した後ｄｄＨ２ＯまたはｐＨ８．０のＴＥ緩衝液に溶解して、前記ＤＮＡサンプルを得るステップと、
を含む、ことを特徴とする永久凍土微生物のＤＮＡサンプルの取得方法。
【0093】
（付記２）
付記１に記載の永久凍土微生物のＤＮＡサンプルの取得方法により取得したＤＮＡサンプル、または従来のＣＴＡＢ法により取得したＤＮＡサンプルを用いてＭＤＡ増幅し、
前記ＭＤＡ増幅は、前記ＤＮＡサンプルを精製した後サンプル変性－ＭＤＡ増幅－１６Ｓ ｒＤＮＡ ＰＣＲ増幅してＰＣＲ産物を得ることを含み、
前記ＭＤＡ増幅のＭＤＡ増幅系は、ｄＮＴＰ、ＤＴＴ、Ｐｈｉ２９酵素、ＢＳＡおよび超純水を含み、前記ＰＣＲ産物をＭＤＡで増幅し、前記ＭＤＡ増幅系中の各成分と前記変性産物の体積パーセントはそれぞれｄＮＴＰ：ＤＴＴ：Ｐｈｉ２９酵素：ＢＳＡ：変性産物＝４：０．８：０．８～２：０～０．２：５～１０であり、
前記１６Ｓ ｒＤＮＡ ＰＣＲ増幅において、
フォワードプライマー（３４１－Ｆ）：５’－ＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ－３’、
リバースプライマー（９２６－Ｒ）：５’－ＣＣＧＴＣＡＡＴＴＣＣＴＴＴＲＡＧＴＴＴ－３’である、ことを特徴とする永久凍土微生物ＤＮＡの抽出方法。
付記１に記載の永久凍土微生物のＤＮＡサンプルの取得方法により取得したＤＮＡサンプル、または従来のＣＴＡＢ法により取得したＤＮＡサンプルを用いてＭＤＡ増幅し、
前記ＭＤＡ増幅は、前記ＤＮＡサンプルを精製した後サンプル変性－ＭＤＡ増幅－１６Ｓ ｒＤＮＡ ＰＣＲ増幅してＰＣＲ産物を得ることを含み、
前記ＭＤＡ増幅のＭＤＡ増幅系は、ｄＮＴＰ、ＤＴＴ、Ｐｈｉ２９酵素、ＢＳＡおよび超純水を含み、前記ＰＣＲ産物をＭＤＡで増幅し、前記ＭＤＡ増幅系中の各成分と前記変性産物の体積パーセントはそれぞれｄＮＴＰ：ＤＴＴ：Ｐｈｉ２９酵素：ＢＳＡ：変性産物＝４：０．８：０．８～２：０～０．２：５～１０であり、
前記１６Ｓ ｒＤＮＡ ＰＣＲ増幅において、
フォワードプライマー（３４１－Ｆ）：５’－ＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ－３’、
リバースプライマー（９２６－Ｒ）：５’－ＣＣＧＴＣＡＡＴＴＣＣＴＴＴＲＡＧＴＴＴ－３’である、ことを特徴とする永久凍土微生物ＤＮＡの抽出方法。
【0094】
（付記３）
前記ＤＮＡサンプルをＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎゲル／ＰＣＲ産物精製キットで精製し、前記サンプル変性はＰＣＲ増幅器で行い変性産物を得る、ことを特徴とする付記２に記載の永久凍土微生物ＤＮＡの抽出方法。
前記ＤＮＡサンプルをＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎゲル／ＰＣＲ産物精製キットで精製し、前記サンプル変性はＰＣＲ増幅器で行い変性産物を得る、ことを特徴とする付記２に記載の永久凍土微生物ＤＮＡの抽出方法。
【0095】
（付記４）
付記１に記載の永久凍土微生物のＤＮＡサンプルの取得方法で取得したＤＮＡサンプルを蛍光法で定量的に分析することを含む、ことを特徴とする永久凍土微生物ＤＮＡの検出方法。
付記１に記載の永久凍土微生物のＤＮＡサンプルの取得方法で取得したＤＮＡサンプルを蛍光法で定量的に分析することを含む、ことを特徴とする永久凍土微生物ＤＮＡの検出方法。
【図1】
【図2】
【図3】
【配列表】