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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024088561
(43)【公開日】2024-07-02
(54)【発明の名称】アミデーション反応のシミュレーション方法
(51)【国際特許分類】
G16B 5/00 20190101AFI20240625BHJP
C12Q 1/68 20180101ALN20240625BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20240625BHJP
【ＦＩ】
G16B5/00
C12Q1/68
C12N15/11 Z
【審査請求】有
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022203803
(22)【出願日】2022-12-20
(11)【特許番号】
(45)【特許公報発行日】2023-04-19
(71)【出願人】
【識別番号】517317624
【氏名又は名称】小俣 賢三
(74)【代理人】
【識別番号】100137338
【弁理士】
【氏名又は名称】辻田 朋子
(74)【代理人】
【識別番号】100196313
【弁理士】
【氏名又は名称】村松 大輔
(72)【発明者】
【氏名】小俣 賢三
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA11
4B063QA20
4B063QQ52
4B063QQ79
4B063QR51
4B063QS39
4B063QX01
(57)【要約】
【課題】 本発明は、アミデーション反応の反応場の周囲に存在する空隙構造に、理論的な整合性をもって当てはまる分子を配置したモデルを利用して、アミデーション反応をシミュレーション可能な技術を提供することを課題とする。
【解決手段】リボソームモデルにおけるアミデーション反応の反応場を取り囲んで存在する空隙に、ｔＲＮＡモデルのアンチコドンループ部及び／又はミミックモデルが配置されて構成されていることを特徴とするタンパク質合成系モデルを用いてアミデーション反応をコンピュータでシミュレーションする。
【選択図】図２２
【解決手段】リボソームモデルにおけるアミデーション反応の反応場を取り囲んで存在する空隙に、ｔＲＮＡモデルのアンチコドンループ部及び／又はミミックモデルが配置されて構成されていることを特徴とするタンパク質合成系モデルを用いてアミデーション反応をコンピュータでシミュレーションする。
【選択図】図２２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
リボソームによるタンパク質合成系をモデル化したタンパク質合成系モデルを用いてアミデーション反応をコンピュータでシミュレーションする方法であって、
前記タンパク質合成系モデルは、
リボソームの全部又は一部をモデル化したリボソームモデルと、
少なくともアンチコドンループ部の全部又は一部を含む、ｔＲＮＡをモデル化したｔＲＮＡモデル、及び／又は、前記アンチコドンループ部を模倣したミミックをモデル化したミミックモデルと、
アミノアシルｔＲＮＡの全部又は一部をモデル化したアミノアシルｔＲＮＡモデル、及び／又は、ペプチジルｔＲＮＡの全部又は一部をモデル化したペプチジルｔＲＮＡモデルと、
を要素として含み、
前記リボソームモデルにおけるアミデーション反応の反応場を取り囲んで存在する空隙に、前記アンチコドンループ部及び／又は前記ミミックモデルが配置され、
前記アミノアシルｔＲＮＡモデルを含む場合には、前記アミノアシルｔＲＮＡモデルは、前記リボソームモデルにおけるＡサイトに配置され、
前記ペプチジルｔＲＮＡモデルを含む場合には、前記ペプチジルｔＲＮＡモデルは、前記リボソームモデルにおけるＰサイトに配置されて、
構築されていることを特徴とする、アミデーション反応のシミュレーション方法。
前記タンパク質合成系モデルは、
リボソームの全部又は一部をモデル化したリボソームモデルと、
少なくともアンチコドンループ部の全部又は一部を含む、ｔＲＮＡをモデル化したｔＲＮＡモデル、及び／又は、前記アンチコドンループ部を模倣したミミックをモデル化したミミックモデルと、
アミノアシルｔＲＮＡの全部又は一部をモデル化したアミノアシルｔＲＮＡモデル、及び／又は、ペプチジルｔＲＮＡの全部又は一部をモデル化したペプチジルｔＲＮＡモデルと、
を要素として含み、
前記リボソームモデルにおけるアミデーション反応の反応場を取り囲んで存在する空隙に、前記アンチコドンループ部及び／又は前記ミミックモデルが配置され、
前記アミノアシルｔＲＮＡモデルを含む場合には、前記アミノアシルｔＲＮＡモデルは、前記リボソームモデルにおけるＡサイトに配置され、
前記ペプチジルｔＲＮＡモデルを含む場合には、前記ペプチジルｔＲＮＡモデルは、前記リボソームモデルにおけるＰサイトに配置されて、
構築されていることを特徴とする、アミデーション反応のシミュレーション方法。
【請求項2】
前記タンパク質合成系モデルは、前記空隙に、タンパク質合成に影響を与えるか又はそれが予測される化合物をモデル化した助剤モデルをさらに配置して構築されている、請求項１に記載のシミュレーション方法。
【請求項3】
前記タンパク質合成系モデルは、前記ｔＲＮＡモデルを含み、
前記リボソームモデルにおける前記空隙を形成する構造と、前記ｔＲＮＡモデルのアンチコドンループ部の構造が相補的となるように、前記空隙に前記アンチコドンループ部が配置されて構成される、請求項１又は２に記載のシミュレーション方法。
前記リボソームモデルにおける前記空隙を形成する構造と、前記ｔＲＮＡモデルのアンチコドンループ部の構造が相補的となるように、前記空隙に前記アンチコドンループ部が配置されて構成される、請求項１又は２に記載のシミュレーション方法。
【請求項4】
前記タンパク質合成系モデルは、これに含まれる各モデル要素を配置した構造を初期構造として、構造最適化計算によって最適化された構造を有する、請求項１又は２に記載のシミュレーション方法。
【請求項5】
前記タンパク質合成系モデルに含まれるモデル要素の１つ又は２つ以上は、構造解析で得られた３次元構造情報に基づき作成されたものである、請求項１又は２に記載のシミュレーション方法。
【請求項6】
前記アミノアシルｔＲＮＡモデルの３´末端に天然型アミノ酸ではないアミノ化合物が接続している、及び／又は、
前記ペプチジルｔＲＮＡモデルの３´末端に天然型アミノ酸ではない化合物がエステル結合により接続している、
請求項１又は２に記載のシミュレーション方法。
前記ペプチジルｔＲＮＡモデルの３´末端に天然型アミノ酸ではない化合物がエステル結合により接続している、
請求項１又は２に記載のシミュレーション方法。
【請求項7】
半経験的分子軌道法又は非経験的分子軌道法によりアミデーション反応をシミュレーションする、請求項１又は２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、コンピュータを用いたシミュレーション方法に関する。
【背景技術】
【0002】
タンパク質の合成工場であるリボソームの巨大な分子構造は、Ｘ線構造解析によって明らかにされている（非特許文献１～８）。しかし、そこから得られる情報は、ペプチド化機構の詳細な解明には極めて不十分なものであった。
【0003】
ペプチド化の中心反応はアミデーションであるが、Ｘ線解析された構造では、アミデーション反応の反応場の周囲には多くの空隙構造が見られることを本発明者は見出した。この空隙は、本来存在すべき反応の必須成分が、Ｘ線解析に用いた結晶構造から散逸してしまったことを示唆している。その結果、反応機構を解明するために必要な情報が失われてしまったものと推察される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】R. M. Voorhees, A. Weixlbaumer, D. Loakes, A. C. Kelley, & V. Ramakrishnan: Insights Into Substrate Stabilization from Snapshots of the Peptidyl Transferase Center of the Intact 70S Ribosome. Nat. Struct. Mol. Biol. 16, 528-533 (2009) DOI: 10.1038/nsmb.1577
【非特許文献2】M. Selmer, et al.: Structure of the 70S Ribosome Complexed with mRNA and tRNA. Science. 313, 1935-1942 (2006) DOI: 10.1126/science.1131127
【非特許文献3】N. Ban, P. Nissen, J. Hansen, P. B. Moore, & T. A. Steitz.: The Complete Atomic Structure of the Large Ribosomal Subunit at 2.4 A Resolution. Science. 289, 905-920 (2000) DOI: 10.1126/science.289.5481.905
【非特許文献4】V. Ramakrishnan: Ribosome Structure and the Mechanism of Translation. Cell. 108, 557-572 (2002) DOI: 10.1016/S0092-8674(02)00619-0
【非特許文献5】B. T. Wimberly, et al.: Structure of the 30S Ribosomal Subunit. Nature. 407, 327-339 (2000) DOI: 10.1038/35030006
【非特許文献6】M. M. Yusupov, et al.: Crystal Structure of the Ribosome at 5.5 A Resolution. Science. 292, 883-896 (2001) DOI: 10.1126/science.1060089
【非特許文献7】B. S. Schuwirth, et al. : Structures of the Bacterial Ribosome at 3.5 A Resolution. Science. 310, 827-834 (2005) DOI: 10.1126/science.1117230
【非特許文献8】J. Harms, et al.: High Resolution Structure of the Large Ribosomal Subunit from a Mesophilic Eubacterium. Cell. 107, 679-688 (2001) DOI: 10.1016/S0092-8674(01)00546-3
【非特許文献9】H. Gao, et al.: Study of the Structural Dynamics of the E. coli 70S Ribosome using Real-space Refinement. Cell. 113, 789-801 (2003) DOI: https://doi.org/10.1016/S0092-8674(03)00427-6
【非特許文献10】H. Stark, M. V. Rodnina, H. J. Wieden, F. Zemlin, W. Wintermeyer, & M. van Heel: Ribosome Interactions of Aminoacyl-tRNA and Elongation Factor Tu in the Codon-recognition Complex. Nat. Struct. Biol. 9, 849-854 (2002) DOI: 10.1038/nsb859
【非特許文献11】S. T. Gregory, J. F. Carr, & A.E. Dahlberg.: A Signal Relay between Ribosomal Protein S12 and Elongation Factor EF-Tu during Decoding of mRNA. RNA. 15, 208-214 (2009) DOI: 10.1261/rna.1355709.
【非特許文献12】M. Johansson, E. Bouakaz, M. Lovmar, & M. Ehrenberg.: The Kinetics of Ribosomal Peptidyl Transfer Revisited. Mol. Cell. 30, 589-598 (2008) DOI: 10.1016/j.molcel.2008.04.010
【非特許文献13】P. Nissen, J. Hansen, N. Ban, P.B. Moore, & T. A. Steitz.: The Structural Basis of Ribosome Activity in Peptide Bond Synthesis. Science. 289, 920-930 (2000) DOI: 10.1126/science.289.5481.920
【非特許文献14】G. W. Muth, L. Ortoleva-Donnelly, & S. A. Strobel: A Single Adenosine with a Neutral pKa in the Ribosomal Peptidyl Transferase Center. Science. 289, 947-950 (2000) DOI: 10.1126/science.289.5481.947
【非特許文献15】M. Beringer, S. Adio, W. Wintermeyer, & M. Rodnina: The G2447A Mutation Does Not Affect Ionization of a Ribosomal Group Taking Part in Peptide Bond Formation. RNA. 9, 919-922 (2003) DOI: 10.1261/rna.5600503.
【非特許文献16】N. Polacek, M. Gaynor, A. Yassin, & A. S. Mankin: Ribosomal Peptidyl Transferase Can Withstand Mutations at the Putative Catalytic Nucleotide. Nature. 411, 498-501 (2001) DOI: 10.1038/35078113
【非特許文献17】J. Thompson, et al.: Analysis of Mutations at Residues A2451 and G2447 of 23S rRNA in the Peptidyltransferase Active Site of the 50S Ribosomal Subunit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 9002-9007 (2001) DOI: 10.1073/pnas.151257098
【非特許文献18】V. I. Katunin, G. W. Muth, S. A. Strobel, W. Wintermeyer, & M. V. Rodnina.: Important Contribution to Catalysis of Peptide Bond Formation by a Single Ionizing Group within the Ribosome. Mol. Cell. 10, 339-346 (2002) DOI: 10.1016/S1097-2765(02)00566-X
【非特許文献19】E. M. Youngman, J. L. Brunelle, A. B. Kochaniak, & R. Green: The Active Site of the Ribosome is Composed of Two Layers of Conserved Nucleotides with Distinct Roles in Peptide Bond Formation and Peptide Release. Cell. 117, 589-599 (2004) DOI: 10.1016/S0092-8674(04)00411-8
【非特許文献20】J. L. Hansen, T. M. Schmeing, P. B. Moore, & T. A. Steitz: Structural Insights into Peptide Bond Formation. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 99, 11670-11675 (2002) DOI: 10.1073/pnas.172404099
【非特許文献21】T. M. Schmeing, K. S. Huang, D. E. Kitchen, S. A. Strobel, & T. A. Steitz: Structural Insights into the Roles of Water and the 2′ Hydroxyl of the P -site tRNA in the Peptidyl Transferase Reaction. Mol. Cell. 20, 437-448 (2005) DOI: 10.1016/j.molcel.2005.09.006
【非特許文献22】P. Bieling, M. Beringer, S. Adio, & M. V. Rodnina: Peptide Bond Formation Does Not Involve Acid-Base Catalysis by Ribosomal Residues. Nat. Struct. Mol. Biol. 13, 423-428 (2006) DOI: 10.1038/nsmb1091
【非特許文献23】T. M. Schmeing, K. S. Huang, S. A. Strobel, & T. A. Steitz: An Induced-fit Mechanism to Promote Peptide Bond Formation and Exclude Hydrolysis of Peptidyl-tRNA. Nature. 438, 520-524 (2005) DOI: 10.1038/nature04152
【非特許文献24】K. Lang, M. Erlacher, D. N. Wilson, R. Micura, & N. Polacek: The Role of 23S Ribosomal RNA Residue A2451 in Peptide Bond Synthesis Revealed by Atomic Mutagenesis. Chem. Biol. 15, 485-492 (2008) DOI: 10.1016/j.chembiol.2008.03.014
【非特許文献25】S. Trobro & J. Aqvist: Mechanism of Peptide Bond Synthesis on the Ribosome. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 102, 12395-12400 (2005) DOI: 10.1073/pnas.0504043102
【非特許文献26】P. K. Sharma, Y. Xiang, M. Kato, & A. Warshel: What Are the Roles of Substrate-assisted Catalysis and Proximity Effects in Peptide Bond Formation by the Ribosome? Biochemistry. 44, 11307-11314 (2005) DOI: 10.1021/bi0509806
【非特許文献27】S. M. Hecht, J. W. Kozarich, & F. J. Schmidt: Isomeric Phenylalanyl-tRNAs. Position of the Aminoacyl Moiety During Protein Biosynthesis. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 71, 4317-4321 (1974) DOI: 10.1073/pnas.71.11.4317
【非特許文献28】K. Quiggle, G. Kumar, T. W. Ott, E. K. Ryu, & S. Chladek: Donor Site of Ribosomal Peptidyltransferase: Investigation of Substrate Specificity Using 2′(3′)-O-(N-acylaminoacyl)dinucleoside Phosphates as Models of the 3′ Terminus of N-acylaminoacyl Transfer Ribonucleic Acid. Biochemistry. 20, 3480-3485 (1981) DOI: 10.1021/bi00515a027
【非特許文献29】S. Dorner, C. Panuschka, W. Schmid, & A. Barta: Mononucleotide Derivatives as Ribosomal P-site Substrates Reveal an Important Contribution of the 2′-OH to Activity. Nucleic. Acids. Res. 31, 6536-6542 (2003) DOI: 10.1093/nar/gkg842
【非特許文献30】J. S. Weinger, K. M. Parnell, S. Dorner, R. Green, & S. A. Strobel: Substrate-assisted Catalysis of Peptide Bond Formation by the Ribosome. Nat. Struct. Mol. Biol. 11, 1101-1106 (2004) DOI: 10.1038/nsmb841
【非特許文献31】M. Koch, Y. Huang, & M. Sprinzl: Peptide-bond Synthesis on the Ribosome: No Free Vicinal Hydroxy Group Required on the Terminal Ribose Residue of Peptidyl-tRNA. Angew. Chem. Int. Edn. Engl. 47, 7242-7245 (2008) DOI: 10.1002/anie.200801511
【非特許文献32】A. Bashan, et al: Structural Basis of the Ribosomal Machinery for Peptide Bond Formation, Translocation, and Nascent Chain Progression. Mol. Cell. 11, 91-102 (2003) DOI: 10.1016/S1097-2765(03)00009-1
【非特許文献33】J. L. Brunelle, E. M. Youngman, D. Sharma, & R. Green: The Interaction between c75 of trna and the a Loop of the Ribosome Stimulates Peptidyl Transferase Activity. RNA. 12, 33-39 (2006) DOI: 10.1261/rna.2256706.
【非特許文献34】K. Bokov & S. V. Steinberg: A Hierarchical Model for Evolution of 23S Ribosomal RNA. Nature. 457, 977-980 (2009) DOI: 10.1038/nature07749
【非特許文献35】M. Kazemie: Binding of Aminoacyl-tRNA to Reconstituted Subparticles of Escherichia coli Large Ribosomal Subunits. Eur. J. Biochem. 67, 373-378 (1976) DOI: 10.1111/j.1432-1033.1976.tb10701.x
【非特許文献36】D. Moazed & H. F. Noller: Intermediate States in the Movement of Transfer RNA in the Ribosome. Nature. 342, 142-148 (1989) DOI: 10.1038/342142a0
【非特許文献37】S. C.Blanchard, H. D. Kim, R. L. Gonzalez, J. D. Puglisi, & S. Chu: tRNA Dynamics on the Ribosome during Translation. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 101, 12893-12898 (2004) DOI: 10.1073/pnas.0403884101
【非特許文献38】D. N. Ermolenko, P. C. Spiegel, Z. K. Majumdar, R. P. Hickerson, R. M. Clegg, & H. F. Noller: The Antibiotic Viomycin Traps the Ribosome in an Intermediate State of Translocation. Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 493-497 (2007) DOI: 10.1038/nsmb1243
【非特許文献39】T. M. Schmeing, P. B. Moore, & T. A. Steitz: Structures of Deacylated tRNA Mimics Bound to the E Site of the Large Ribosomal Subunit. RNA. 9, 1345-1352 (2003) DOI: 10.1261/rna.5120503.
【非特許文献40】J. S. Feinberg & S. Joseph: Identification of Molecular Interactions between P-site tRNA and the Ribosome Essential for Translocation. Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 98, 11120-11125 (2001) DOI: 10.1073/pnas.211184098
【非特許文献41】M. A. Borovinskaya, et al: Structural Basis for Aminoglycoside Inhibition of Bacterial Ribosome Recycling. Nat. Struct. Mol. Biol. 14, 727-732 (2007) DOI: 10.1038/nsmb1271
【非特許文献42】A. Korostelev, S. Trakhanov, M. Laurberg, & H. F. Noller: Crystal Structure of a 70S Ribosome-tRNA Complex Reveals Functional Interactions and Rearrangements. Cell. 126, 1065-1077 (2006) DOI: 10.1016/j.cell.2006.08.032
【非特許文献43】I. Wohlgemuth, M. Beringer, & M. V. Rodnina: Rapid Peptide Bond Formation on Isolated 50S Ribosomal Subunits. EMBO Rep. 7, 699-703 (2006) DOI: 10.1038/sj.embor.7400732
【非特許文献44】J. L. Brunelle, E. M. Youngman, D. Sharma, & R. Green: The Interaction between C75 of tRNA and the A Loop of the Ribosome Stimulates Peptidyl Transferase Activity. RNA. 12, 33-39 (2006) DOI: 10.1261/rna.2256706.
【非特許文献45】N. Demeshkina, L. Jenner, G. Yusupova, & M. Yusupov: Interactions of the Ribosome with mRNA and tRNA. Curr. Opin. Struct. Biol. 20, 325-332 (2010) DOI: 10.1016/j.sbi.2010.03.002
【非特許文献46】A. Yonath & Z. Berkovitch-Yellin: Hollows, Voids, Gaps and Tunnels in the Ribosome. Curr. Opin. Struct. Biol. 3, 175-181 (1993) DOI: 10.1016/S0959-440X(05)80149-6
【非特許文献47】S. Fulle & H. Gohlke: Constraint Counting on RNA and Ribosomal Structures: Linking Flexibility and Function. J. Mol. Biol. 387, 502-517 (2009) DOI: 10.1186/1758-2946-3-S1-O11
【非特許文献48】H. Ishida & S. Hayward: Path of Nascent Polypeptide in Exit Tunnel Revealed by Molecular Dynamics Simulation of Ribosome. Biophys J. 95, 5962-5973 (2008) DOI: 10.1529/biophysj.108.134890
【非特許文献49】I. S. Gabashvili, S. T. Gregory, M. Valle, R. Grassucci, M. Worbs, & J. Frank: The Polypeptide Tunnel System in the Ribosome and Its Gating in Erythromycin Resistance Mutants of L4 and L22. Mol. Cell. 8, 181-188 (2001) DOI: 10.1016/S1097-2765(01)00293-3
【非特許文献50】K. Swiderek, S. Marti, I. Tunon, V. Moliner, & J. Bertran: Peptide Bond Formation Mechanism Catalyzed by Ribosome. J. Am. Chem. Soc. 137, 12024-12034 (2015) DOI: 10.1021/jacs.5b05916
【非特許文献51】K. Swiderek, I. Tunon, S. Marti, V. Moliner, & J. Bertran: Role of Solvent on Nonenzymatic Peptide Bond Formation Mechanisms and Kinetic Isotope Effects. J. Am. Chem. Soc. 135, 8708-8719 (2013) DOI: 10.1021/ja403038t
【非特許文献52】C. Acosta-Silva, J. Bertran, V. Branchadell, & A. Oliva: Quantum-Mechanical Study on the Mechanism of Peptide Bond Formation in the Ribosome. J. Am. Chem. Soc. 134, 5817-5831 (2012) DOI: 10.1021/ja209558d
【非特許文献53】K. Fukushima & H. Esaki: Theoretical Study of the Mechanism of Ribosomal Peptide Bond Formation Using the ONIOM Method. Chem. Pharm. Bull. 69, 734-740 (2021) DOI: 10.1248/cpb.c21-00148
【非特許文献54】C. Acosta-Silva, J. Bertran, V. Branchadell, & A. Oliva: Theoretical Study of a Proton Wire Mechanism for the Peptide Bond Formation in the Ribosome. Theor. Chem. Acc. 136, Article number: 49 (2017) DOI: 10.1007/s00214-017-2066-2
【非特許文献55】T. Oie, G. H. Loew, S. K. Burt, J. S. Binkley, R. D. MacElroy. J. Am. Chem. Soc, 104, 6169-6174 (1982)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
リボソームにおけるアミデーション反応をコンピュータ上でシミュレーションするためには、アミデーション反応の反応場の周囲に存在する空隙構造にフィットする分子を配置することが必要となる。
本発明は、アミデーション反応の反応場の周囲に存在する空隙構造に、理論的な整合性をもって当てはまる分子を配置したモデルを利用して、アミデーション反応をシミュレーション可能な技術を提供することを課題とする。
本発明は、アミデーション反応の反応場の周囲に存在する空隙構造に、理論的な整合性をもって当てはまる分子を配置したモデルを利用して、アミデーション反応をシミュレーション可能な技術を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
Ｘ線構造解析において、アミデーション反応の反応場の周囲に存在する空隙構造から散逸してしまった成分は、アミデーション反応部位の近くに存在する成分である可能性が高く、分子量や移動度がかなり大きいものと推察される。ｔＲＮＡがそのような条件を満たすと仮定し、その立体構造と空隙の構造とのおおよその相補性を調査した結果、ｔＲＮＡのアンチコドンループ領域に前記空隙との相補性が認められた。散逸成分はｔＲＮＡと推定されるため、このアンチコドンループ領域を空隙に適用し、これを初期構造として構造最適化の計算を行った。その結果、この空隙をうまく埋める構造を得ることができた。
【0007】
さらに、この構造によって、ペプチド反応で生成したペプチドの通り道である「出口トンネル」がより明確になった。さらに、アンチコドンの２番目の塩基がアミデーション反応部位の近くに配置されており、アミデーション反応に強く関与していることが示唆された。したがって、反応機構に関する詳細な情報を得ることができた。
【0008】
本発明は、本発明者による鋭意研究努力によって見出された上記知見に基づき完成された以下のとおりのものである。
【0009】
［１］ リボソームによるタンパク質合成系をモデル化したタンパク質合成系モデルを用いてアミデーション反応をコンピュータでシミュレーションする方法であって、
前記タンパク質合成系モデルは、
リボソームの全部又は一部をモデル化したリボソームモデルと、
少なくともアンチコドンループ部の全部又は一部を含む、ｔＲＮＡをモデル化したｔＲＮＡモデル、及び／又は、前記アンチコドンループ部を模倣したミミックをモデル化したミミックモデルと、
アミノアシルｔＲＮＡの全部又は一部をモデル化したアミノアシルｔＲＮＡモデル、及び／又は、ペプチジルｔＲＮＡの全部又は一部をモデル化したペプチジルｔＲＮＡモデルと、
を含み、
前記リボソームモデルにおけるアミデーション反応の反応場を取り囲んで存在する空隙に、前記アンチコドンループ部及び／又は前記ミミックモデルが配置され、
前記アミノアシルｔＲＮＡモデルを含む場合には、前記アミノアシルｔＲＮＡモデルは、前記リボソームモデルにおけるＡサイトに配置され、
前記ペプチジルｔＲＮＡモデルを含む場合には、前記ペプチジルｔＲＮＡモデルは、前記リボソームモデルにおけるＰサイトに配置されて、
構築されていることを特徴とする、アミデーション反応のシミュレーション方法。
前記タンパク質合成系モデルは、
リボソームの全部又は一部をモデル化したリボソームモデルと、
少なくともアンチコドンループ部の全部又は一部を含む、ｔＲＮＡをモデル化したｔＲＮＡモデル、及び／又は、前記アンチコドンループ部を模倣したミミックをモデル化したミミックモデルと、
アミノアシルｔＲＮＡの全部又は一部をモデル化したアミノアシルｔＲＮＡモデル、及び／又は、ペプチジルｔＲＮＡの全部又は一部をモデル化したペプチジルｔＲＮＡモデルと、
を含み、
前記リボソームモデルにおけるアミデーション反応の反応場を取り囲んで存在する空隙に、前記アンチコドンループ部及び／又は前記ミミックモデルが配置され、
前記アミノアシルｔＲＮＡモデルを含む場合には、前記アミノアシルｔＲＮＡモデルは、前記リボソームモデルにおけるＡサイトに配置され、
前記ペプチジルｔＲＮＡモデルを含む場合には、前記ペプチジルｔＲＮＡモデルは、前記リボソームモデルにおけるＰサイトに配置されて、
構築されていることを特徴とする、アミデーション反応のシミュレーション方法。
【0010】
［２］ 前記タンパク質合成系のモデルは、前記空隙に、タンパク質合成に影響を与えるか又はそれが予測される化合物をモデル化した助剤モデルをさらに配置して構築されている、［１］に記載のシミュレーション方法。
【0011】
［３］ 前記タンパク質合成系モデルは、前記ｔＲＮＡモデルを含み、
前記リボソームモデルにおける前記空隙を形成する構造と、前記ｔＲＮＡモデルのアンチコドンループ部の構造が相補的となるように、前記空隙に前記アンチコドンループ部が配置されて構成される、［１］又は［２］に記載のシミュレーション方法。
前記リボソームモデルにおける前記空隙を形成する構造と、前記ｔＲＮＡモデルのアンチコドンループ部の構造が相補的となるように、前記空隙に前記アンチコドンループ部が配置されて構成される、［１］又は［２］に記載のシミュレーション方法。
【0012】
［４］ 前記タンパク質合成系モデルは、これに含まれる各モデル要素を配置した構造を初期構造として、構造最適化計算によって最適化された構造を有する、［１］～［３］に記載のシミュレーション方法。
【0013】
［５］ 前記タンパク質合成系モデルに含まれるモデル要素の１つ又は２つ以上は、構造解析で得られた３次元構造情報に基づき作成されたものである、［１］～［４］の何れかに記載のシミュレーション方法。
【0014】
［６］ 前記アミノアシルｔＲＮＡモデルの３´末端に天然型アミノ酸ではないアミノ化合物が接続している、及び／又は、
前記ペプチジルｔＲＮＡモデルの３´末端に天然型アミノ酸ではない化合物がエステル結合により接続している、
［１］～［５］の何れかに記載のシミュレーション方法。
前記ペプチジルｔＲＮＡモデルの３´末端に天然型アミノ酸ではない化合物がエステル結合により接続している、
［１］～［５］の何れかに記載のシミュレーション方法。
【0015】
［７］ 半経験的分子軌道法又は非経験的分子軌道法によりアミデーション反応をシミュレーションする、［１］～［６］の何れかに記載の方法。
【発明の効果】
【0016】
本発明によれば、アミデーションの反応場の周囲に存在する空隙を、合理性をもって充填したタンパク質合成系モデルによって、アミデーション反応をシミュレーションすることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】リボソーム反応部位とＡＡ－ｔＲＮＡとＰ－ｔＲＮＡ。非特許文献１より抜粋（ＰＤＢ ４Ｖ５Ｃ）。Ａ：アミデーション反応部位。Ｂ：反応部位周辺の領域。緑色：リボソームのアミデーション反応部位の最近傍領域。赤色：Ａ－ｔＲＮＡ。黄色：Ｐ－ｔＲＮＡ。ＣＰＫカラー：リボソームのアミデーション反応部位周辺。なお、本図面以降、左上の「Ｓ」表記は立体図形であることを示す。
【図3】Ｐ－ｔＲＮＡのアンチコドンループ。非特許文献１から抜粋（ＰＤＢ ４Ｖ５Ｃ）。青色：アンチコドンループ。
【図5】ａ、ｂ：アミデーション反応部位へのアンチコドンループの詳細な手動フィッティングを示す。褐色：リボソームのアミデーション反応部位周辺。黄色：Ｐ－ｔＲＮＡのアンチコドンループ部分。
【図6】Ｄ；ＵＶ－３３の最適化計算結果。ＣＰＫカラー：最適化されたＤ。黄色：Ｄに対する立体的な拘束因子と考えられるリボソームの構造部分。
【図7】Ｅａ；ＣＶ－３２（部分）の最適化計算結果。ＣＰＫカラー：最適化されたＥａ。黄色：ＥａとＤの３′リン酸基に対する立体的な拘束因子と考えられるリボソームの構造部分。
【図8】Ｅｂ；ＣＶ－３２の最適化計算結果。ＣＰＫカラー：最適化されたＥ。黄色：Ｅに対する立体的制な拘束因子と考えられるリボソームの構造部分。
【図9】Ｆ；ＧＶ－３１の最適化計算結果。ＣＰＫカラー：最適化されたＦ。黄色：Ｆに対する立体的な拘束因子と考えられるリボソームの構造部分。
【図10】Ｆのベースペアリングパートナーとして固定されたＸ、ＣＶ－３９。ＣＰＫカラー：ＦとＦのベースペアリングパートナーとして固定されたＸ。黄色：Ｆに対する立体的な拘束因子と考えられるリボソームの構造部分。
【図11】Ｃ；ＣＶ－３４の最適化計算結果。ＣＰＫカラー；最適化されたＣ。黄色：リボソームの構造部分は、ＣとＡＹ７６の側鎖構造以外の部分が立体的な拘束となっていると考えられる。
【図12】Ｂ；ＡＶ－３５の最適化計算結果。ＣＰＫカラー：最適化されたＢ。黄色：Ｂへの立体的な拘束因子として考慮したリボソームの構造部分及びＣとＤ。
【図13】Ａ；ＵＶ－３６の最適化計算結果。ＣＰＫカラー：最適化されたＡ。黄色：ＢとＤ、およびＡに対する立体的な拘束因子と考えられるリボソームの構造部分。
【図14】Ｙ－Ｚ；ＡＶ－３８－ＡＶ－３７の最適化計算結果。ＣＰＫカラー：Ｙ－Ｚ。黄色：Ｙ－Ｚの立体的な拘束因子と見なしたＡ、Ｘとリボソームの構造部分。
【図15】ａ 反コドンループ全体に対する最適化計算結果。ＣＰＫカラー：最適化アンチコドンループ（ＸＹＺＡＢＣＤＥＦ）。黄色：アンチコドンループの立体的な拘束因子と考えられるリボソームの構造部分。ｂ アンチコドンループ最適化計算結果の部分展開。
【図16】ＰサイトＰｈｅ部分の最適化計算結果。ＣＰＫカラー：最適化ＰｈｅおよびＡｌａ－Ａｃｅ。黄色：Ｐｈｅ－Ａｌａ－ＡｃｅおよびＢとＤに対する立体的な拘束因子と考えられるリボソームの構造部分。
【図17】ＰサイトＡｌａ－Ａｃｅ部分の最適化計算結果。ＣＰＫカラー：Ａｌａ－Ａｃｅ部分 最適化計算結果。黄色：Ａｌａ－Ａｃｅ部分の立体的な拘束因子と考えられるリボソームの構造部分。
【図18】ＰサイトＰｈｅ－Ａｌａ－Ａｃｅの最適化構造結合結果。ＣＰＫカラー：Ｐｈｅ－Ａｌａ－Ａｃｅ。黄色：Ｐｈｅ－Ａｌａ－Ａｃｅに対する立体的な拘束因子と考えられるリボソームの構造部分。
【図19】ＰサイトＰｈｅ－Ａｌａ－Ａｃｅの最適化された構造と出口トンネル。ＣＰＫカラー：リボソーム。黄色：最適化されたＰｈｅ－Ａｌａ－Ａｃｅ。緑色：挿入され最適化されたアンチコドンループ。青色：出口トンネルの手前にあるリボソームの部分。ミスト構造：非特許文献４８の図３に記載されている出口トンネルのこと。
【図20】ＡサイトＰｈｅ部分の最適化計算結果。ＣＰＫカラー：Ａサイト Ｐｈｅ部分。黄色：Ｂ、Ｃ、およびＰｈｅに対する立体的な拘束因子として考慮されたリボソームの構造的部分。
【図21】アミデーション反応部位。ＡサイトｔＲＮＡの末端ＡＹ－７６とＰサイトｔＲＮＡの末端ＡＶ－７６に結合したフェニルアラニンとのアミデーション反応に直接関与する原子を強調した図である。
【図22】アミデーション反応部位の中心部における遷移状態構造を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【0018】
本発明は、リボソームによるタンパク質合成系をモデル化したタンパク質合成系モデルを用いてアミデーション反応をコンピュータでシミュレーションする方法である。
【0019】
本発明におけるタンパク質合成系モデルは、以下の（ａ）と、（ｂ－１）及び／又は（ｂ－２）と、（ｃ－１）及び／又は（ｃ－２）と、をモデル要素として含む。
（ａ）リボソームの全部又は一部をモデル化したリボソームモデル
（ｂ－１）少なくともアンチコドンループ部の全部又は一部を含む、ｔＲＮＡをモデル化したｔＲＮＡモデル
（ｂ－２）アンチコドンループ部を模倣したミミックをモデル化したミミックモデル
（ｃ－１）アミノアシルｔＲＮＡの全部又は一部をモデル化したアミノアシルｔＲＮＡモデル
（ｃ－２）ペプチジルｔＲＮＡの全部又は一部をモデル化したペプチジルｔＲＮＡモデル
（ａ）リボソームの全部又は一部をモデル化したリボソームモデル
（ｂ－１）少なくともアンチコドンループ部の全部又は一部を含む、ｔＲＮＡをモデル化したｔＲＮＡモデル
（ｂ－２）アンチコドンループ部を模倣したミミックをモデル化したミミックモデル
（ｃ－１）アミノアシルｔＲＮＡの全部又は一部をモデル化したアミノアシルｔＲＮＡモデル
（ｃ－２）ペプチジルｔＲＮＡの全部又は一部をモデル化したペプチジルｔＲＮＡモデル
【0020】
なお、タンパク質合成系モデルを構成する各要素モデルは、Ｘ線結晶解析、ｃｒｙｏ－ＥＭ解析、その他の解析方法で得られた３次元構造情報に基づき作成できる。タンパク質合成系を構成する要素、すなわち、リボソーム、アミノアシルｔＲＮＡ、ペプチジルｔＲＮＡ、ｔＲＮＡの３次元構造情報は、各種データベース（ＰＤＢなど）に一般公開されているものを利用することができる。
【0021】
データベースに登録されている３次元構造に対して、シミュレーションに必要な範囲において任意の立体構造的改変を加えて、各要素モデルを作成してもよい。
【0022】
コンピュータ上でシミュレーションするにあたって計算負荷を軽減するために、アミデーション反応のシミュレーションに必要な範囲以外を任意に省略して、各要素モデルを作成してもよい。
以下、各要素モデルについて詳述する。
以下、各要素モデルについて詳述する。
【0023】
（ａ）リボソームモデル
リボソームモデルは、少なくともアミデーション反応の反応場及びその周囲に存在する空隙を含むものであることが必要である。すなわち、リボソームモデルは、リボソームの全体構造をモデル化したものであってもよいし、アミデーション反応の反応場が存在する大サブユニットのみをモデル化したものであってもよい。また、アミデーション反応の反応場及びその周囲に存在する空隙のみをモデル化したものであってもよい。
リボソームモデルは、少なくともアミデーション反応の反応場及びその周囲に存在する空隙を含むものであることが必要である。すなわち、リボソームモデルは、リボソームの全体構造をモデル化したものであってもよいし、アミデーション反応の反応場が存在する大サブユニットのみをモデル化したものであってもよい。また、アミデーション反応の反応場及びその周囲に存在する空隙のみをモデル化したものであってもよい。
【0024】
リボソームモデルは以下の要素を含むことが好ましい。
・アミデーション反応部位の周辺に存在する、リボソームＧＡ－２０６１、ＡＡ－２０６２、ＣＡ－２０６３、ＣＡ－２０６４からなる中央部Ｃ１
・Ｃ１をリボソームＣＡ－２４４２、ＣＡ－２４４３、ＧＡ－２４４４、ＧＡ２４４５で囲むことで形成される溝Ｇ１
・Ｃ１をリボソームＣＡ－２４５２、ＵＡ－２５０６、ＵＡ－２５８５、ＣＡ－２５８６、ＡＡ－２５８７で囲むことによって形成される溝Ｇ２
・アミデーション反応部位の周辺に存在する、リボソームＧＡ－２０６１、ＡＡ－２０６２、ＣＡ－２０６３、ＣＡ－２０６４からなる中央部Ｃ１
・Ｃ１をリボソームＣＡ－２４４２、ＣＡ－２４４３、ＧＡ－２４４４、ＧＡ２４４５で囲むことで形成される溝Ｇ１
・Ｃ１をリボソームＣＡ－２４５２、ＵＡ－２５０６、ＵＡ－２５８５、ＣＡ－２５８６、ＡＡ－２５８７で囲むことによって形成される溝Ｇ２
【0025】
（ｂ－１）ｔＲＮＡモデル
ｔＲＮＡモデルは、少なくともアンチコドンループ部の全部又は一部を含む。アンチコドンループは９塩基で構成され、そのうちの３塩基はアンチコドンである。すなわち、ｔＲＮＡモデルは、アンチコドンループ部を構成する９塩基の全部又は一部を含んでいる。
ｔＲＮＡモデルは、少なくともアンチコドンループ部の全部又は一部を含む。アンチコドンループは９塩基で構成され、そのうちの３塩基はアンチコドンである。すなわち、ｔＲＮＡモデルは、アンチコドンループ部を構成する９塩基の全部又は一部を含んでいる。
【0026】
（ｂ－２）ミミックモデル
ミミックモデルは、アンチコドンループ部を模倣した化合物（ミミック）をモデル化したものである。後述するようにミミックは、リボソームモデルの空隙に配置するものであるため、当該空隙に適合する構造のものが好適に例示できる。ミミックとしては、核酸やペプチド核酸などが例示できる。
ミミックモデルは、アンチコドンループ部を模倣した化合物（ミミック）をモデル化したものである。後述するようにミミックは、リボソームモデルの空隙に配置するものであるため、当該空隙に適合する構造のものが好適に例示できる。ミミックとしては、核酸やペプチド核酸などが例示できる。
【0027】
タンパク質合成系モデルは、（ｂ－１）のｔＲＮＡモデルと（ｂ－２）のミミックモデルの何れか一方又は両方を含む。
ｔＲＮＡモデルとミミックモデルの両方を含む場合には、ｔＲＮＡモデルはアンチコドンループ部の一部を省略して作成し、その省略したアンチコドンループ部の一部を模倣した構造の化合物をモデル化したものをミミックモデルとすることができる。
ｔＲＮＡモデルとミミックモデルの両方を含む場合には、ｔＲＮＡモデルはアンチコドンループ部の一部を省略して作成し、その省略したアンチコドンループ部の一部を模倣した構造の化合物をモデル化したものをミミックモデルとすることができる。
【0028】
ミミックモデルを要素として含むタンパク質合成系モデルを用いてアミデーション反応をシミュレーションすることで、当該ミミックによるタンパク質合成系への影響を推測することができる。本実施形態は、例えばｔＲＮＡのアンチコドンループ部を模倣して設計したタンパク質合成阻害剤のタンパク質合成阻害能の評価に応用できる点で有利である。
【0029】
（ｃ－１）アミノアシルｔＲＮＡモデル
アミノアシルｔＲＮＡモデルは、アミノアシルｔＲＮＡの全部又は一部をモデル化して作成したものである。本発明はアミデーション反応をシミュレーションするものであるため、アミノアシルｔＲＮＡモデルは、少なくともｔＲＮＡの３´末端側の一部と当該末端に接続するアミノ酸から構成される部分をモデル化したものであることが好ましい。
アミノアシルｔＲＮＡモデルは、アミノアシルｔＲＮＡの全部又は一部をモデル化して作成したものである。本発明はアミデーション反応をシミュレーションするものであるため、アミノアシルｔＲＮＡモデルは、少なくともｔＲＮＡの３´末端側の一部と当該末端に接続するアミノ酸から構成される部分をモデル化したものであることが好ましい。
【0030】
アミノアシルｔＲＮＡモデルの３´末端には任意の天然型アミノ酸を接続することができる。
【0031】
また、アミノアシルｔＲＮＡモデルの３´末端に天然型アミノ酸ではないアミノ化合物を接続してもよい。
「天然型アミノ酸ではないアミノ化合物」としては、任意の非天然型アミノ酸や、アミノ酸ではない任意のアミノ化合物が挙げられる。
「天然型アミノ酸ではないアミノ化合物」としては、任意の非天然型アミノ酸や、アミノ酸ではない任意のアミノ化合物が挙げられる。
【0032】
アミノアシルｔＲＮＡモデルの３´末端にアミノ酸ではない任意のアミノ化合物を接続する場合、アミノアシルｔＲＮＡの３´Ｏと当該アミノ化合物が有する任意の酸基とがエステル結合により結合したものをモデル化し、アミノアシルｔＲＮＡモデルとしてもよい。
【0033】
天然アミノ酸ではない化合物が３´末端に接続したアミノアシルｔＲＮＡモデルを利用する場合、当該化合物を構成単位として含む人工タンパク質をリボソームによって合成可能か否かをシミュレーションすることができる。
【0034】
なお、本明細書においては、アミノ酸ではない化合物が３´末端に接続しているｔＲＮＡのモデルであっても、リボソームモデルのＡサイトに配置され、アミデーション反応のシミュレーションに供される場合には、これを「アミノアシルｔＲＮＡモデル」と呼ぶ。
【0035】
（ｃ－２）ペプチジルｔＲＮＡモデル
ペプチジルｔＲＮＡモデルは、ペプチジルｔＲＮＡの全部又は一部をモデル化して作成したものである。本発明はアミデーション反応をシミュレーションするものであるため、ペプチジルｔＲＮＡモデルは、少なくともｔＲＮＡの３´末端側の一部と当該末端に接続するペプチジル基から構成される部分をモデル化したものであることが好ましい。
ペプチジルｔＲＮＡモデルは、ペプチジルｔＲＮＡの全部又は一部をモデル化して作成したものである。本発明はアミデーション反応をシミュレーションするものであるため、ペプチジルｔＲＮＡモデルは、少なくともｔＲＮＡの３´末端側の一部と当該末端に接続するペプチジル基から構成される部分をモデル化したものであることが好ましい。
【0036】
ペプチジルｔＲＮＡモデルの３´末端には任意の天然型アミノ酸を接続することができる。
【0037】
また、ペプチジルｔＲＮＡモデルの３´末端に天然型アミノ酸ではない化合物をエステル結合により接続してもよい。
「天然型アミノ酸ではない化合物」としては、任意の非天然型アミノ酸や、アミノ酸ではない任意の化合物が挙げられる。
「天然型アミノ酸ではない化合物」としては、任意の非天然型アミノ酸や、アミノ酸ではない任意の化合物が挙げられる。
【0038】
ペプチジルｔＲＮＡモデルの３´末端にアミノ酸ではない任意の化合物を接続する場合、ペプチジルｔＲＮＡの３´Ｏと当該化合物が有する任意の酸基とがエステル結合により結合したものをモデル化し、ペプチジルｔＲＮＡモデルとしてもよい。
【0039】
天然アミノ酸ではない化合物が３´末端に接続したペプチジルｔＲＮＡモデルを利用する場合、当該化合物を構成単位として含む人工タンパク質をリボソームによって合成可能か否かをシミュレーションすることができる。
【0040】
なお、「ペプチジルｔＲＮＡモデルの３´末端に接続する」とは、ペプチジルｔＲＮＡモデルの３´末端に接続するペプチジル基を構成する構成単位のうち、ペプチジルｔＲＮＡモデルの３´Ｏに直接接続することをいう。
【0041】
また、本明細書においては、アミノ酸ではない化合物が３´末端に接続しているｔＲＮＡのモデルであっても、リボソームモデルのＰサイトに配置され、アミデーション反応のシミュレーションに供される場合には、これを「ペプチジルｔＲＮＡモデル」と呼ぶ。
【0042】
ペプチジルｔＲＮＡモデルの３´末端に接続するペプチジル基の残基数は特に限定されず、１又は２以上を任意に選択することができる。
【0043】
本発明におけるタンパク質合成系モデルは、上述したもの以外の任意の成分のモデルを含む形態としてもよい。タンパク質合成系モデルは、以下の（ｄ）を要素として含んでいてもよい。
（ｄ）タンパク質合成に影響を与えるか又はそれが予測される化合物をモデル化した助剤モデル
（ｄ）タンパク質合成に影響を与えるか又はそれが予測される化合物をモデル化した助剤モデル
【0044】
助剤モデルを要素として含むタンパク質合成系モデルを用いてアミデーション反応をシミュレーションすることで、助剤によるタンパク質合成系への影響を推測することができる。本実施形態は、例えば新規に設計したタンパク質合成阻害剤のタンパク質合成阻害能の評価に応用できる点で有利である。
【0045】
上で説明した各モデル要素は、コンピュータ上の仮想空間において以下の条件１－１及び／又は条件１－２並びに条件２－１及び／又は条件２－２で規定される配置関係で配置され、タンパク質合成系モデルが構築される。
【0046】
条件１－１：タンパク質合成系モデルがｔＲＮＡモデルを含む場合には、リボソームモデルにおけるアミデーション反応の反応場を取り囲んで存在する空隙に、アンチコドンループ部が配置される。
条件１－２：タンパク質合成系モデルがミミックモデルを含む場合には、リボソームモデルにおけるアミデーション反応の反応場を取り囲んで存在する空隙に、ミミックモデルが配置される。
条件２－１：アミノアシルｔＲＮＡモデルを含む場合には、アミノアシルｔＲＮＡモデルは、リボソームモデルにおけるＡサイトに配置される。
条件２－２：ペプチジルｔＲＮＡモデルを含む場合には、ペプチジルｔＲＮＡモデルは、リボソームモデルにおけるＰサイトに配置される。
条件１－２：タンパク質合成系モデルがミミックモデルを含む場合には、リボソームモデルにおけるアミデーション反応の反応場を取り囲んで存在する空隙に、ミミックモデルが配置される。
条件２－１：アミノアシルｔＲＮＡモデルを含む場合には、アミノアシルｔＲＮＡモデルは、リボソームモデルにおけるＡサイトに配置される。
条件２－２：ペプチジルｔＲＮＡモデルを含む場合には、ペプチジルｔＲＮＡモデルは、リボソームモデルにおけるＰサイトに配置される。
【0047】
以下、各配置条件について詳述する。
【0048】
（条件１－１）
条件１－１は、リボソームモデルにおけるアミデーション反応の反応場を取り囲んで存在する空隙に、アンチコドンループ部を配置することを規定する。
条件１－１は、リボソームモデルにおけるアミデーション反応の反応場を取り囲んで存在する空隙に、アンチコドンループ部を配置することを規定する。
【0049】
「空隙」としては、上述のＧ１及び／又はＧ２が例示できる。
リボソームモデルにおける前記空隙を形成する構造と、ｔＲＮＡモデルのアンチコドンループ部の構造が相補的となるように、前記空隙にアンチコドンループ部を配置することが好ましい。
アンチコドンループ部のＧＶ－３１、ＣＶ－３２をＧ１に相補的に配置することが好ましい。
また、アンチコドンループ部のＣＶ－３４、ＡＶ－３５、ＵＶ－３６、ＡＶ－３７、ＡＶ－３８、ＣＶ－３９をＧ２に相補的に配置することが好ましい。
リボソームモデルにおける前記空隙を形成する構造と、ｔＲＮＡモデルのアンチコドンループ部の構造が相補的となるように、前記空隙にアンチコドンループ部を配置することが好ましい。
アンチコドンループ部のＧＶ－３１、ＣＶ－３２をＧ１に相補的に配置することが好ましい。
また、アンチコドンループ部のＣＶ－３４、ＡＶ－３５、ＵＶ－３６、ＡＶ－３７、ＡＶ－３８、ＣＶ－３９をＧ２に相補的に配置することが好ましい。
【0050】
Ｃ１とリボソームのＣＡ－２５０１、ＧＡ－２４４６、ＧＡ－２４４７、ＡＡ－２４５０、ＡＡ－２４５１からなる構造部分Ｃ２には大きな溝構造はなく、多くの空隙が点在している。ｔＲＮＡモデルのアンチコドンループを上述のようにＧ１とＧ２にフィッティングさせると、ｔＲＮＡモデルの３２～３４番目の塩基は、このＣ２領域と相補的に配置することができる。
【0051】
（条件１－２）
条件１－２は、リボソームモデルにおけるアミデーション反応の反応場を取り囲んで存在する空隙に、ミミックモデルを配置することを規定する。
ミミックはｔＲＮＡのアンチコドンループ部を模倣したものであるため、条件１－１で説明したような配置関係にて、ミミックモデルを前記空隙に配置することができる。
ミミックがｔＲＮＡのアンチコドンループ部を模倣した核酸やペプチド核酸である場合、条件１－１で説明したように、ミミックモデルを前記空隙と相補的となるように配置することができる。
条件１－２は、リボソームモデルにおけるアミデーション反応の反応場を取り囲んで存在する空隙に、ミミックモデルを配置することを規定する。
ミミックはｔＲＮＡのアンチコドンループ部を模倣したものであるため、条件１－１で説明したような配置関係にて、ミミックモデルを前記空隙に配置することができる。
ミミックがｔＲＮＡのアンチコドンループ部を模倣した核酸やペプチド核酸である場合、条件１－１で説明したように、ミミックモデルを前記空隙と相補的となるように配置することができる。
【0052】
タンパク質合成系モデルは、条件１－１と条件１－２は何れか一方又は両方を満たすことができる。
上述したようにｔＲＮＡモデルはアンチコドンループ部の一部を省略して作成し、その省略したアンチコドンループ部の一部を模倣した構造の化合物をモデル化したものをミミックモデルとすることができる。この場合、条件１－１と条件１－２を両方満たすようにタンパク質合成系モデルを構築することができる。
上述したようにｔＲＮＡモデルはアンチコドンループ部の一部を省略して作成し、その省略したアンチコドンループ部の一部を模倣した構造の化合物をモデル化したものをミミックモデルとすることができる。この場合、条件１－１と条件１－２を両方満たすようにタンパク質合成系モデルを構築することができる。
【0053】
（条件２－１）
条件２－１は、タンパク質合成系モデルが、要素としてアミノアシルｔＲＮＡモデルを含む場合に適用される条件である。条件２－１は、アミノアシルｔＲＮＡモデルがリボソームモデルにおけるＡサイトに配置されることを規定する。
条件２－１は、タンパク質合成系モデルが、要素としてアミノアシルｔＲＮＡモデルを含む場合に適用される条件である。条件２－１は、アミノアシルｔＲＮＡモデルがリボソームモデルにおけるＡサイトに配置されることを規定する。
【0054】
アミノアシルｔＲＮＡがリボソームにおけるＡサイトに配置されている状態の３次元的配置関係は、Ｘ線構造解析等によって解析されている。その３次元構造情報は種々のデータベースから取得可能である。
【0055】
なお、アミノアシルｔＲＮＡモデルを含まないタンパク質合成系モデルを用いてアミデーション反応をシミュレーションする場合には、遊離したアミノ酸の一部又は全部をモデル化したアミノ酸モデルをアミデーション反応の反応場に配置することができる。この場合、アミノ酸モデルは、ｔＲＮＡの３´末端に接続されているときと同等の３次元座標に配置することができる。
【0056】
（条件２－２）
条件２－２は、タンパク質合成系モデルが、要素としてペプチジルｔＲＮＡモデルを含む場合に適用される条件である。条件２－２は、ペプチジルｔＲＮＡモデルがリボソームモデルにおけるＰサイトに配置されることを規定する。
条件２－２は、タンパク質合成系モデルが、要素としてペプチジルｔＲＮＡモデルを含む場合に適用される条件である。条件２－２は、ペプチジルｔＲＮＡモデルがリボソームモデルにおけるＰサイトに配置されることを規定する。
【0057】
ペプチジルｔＲＮＡがリボソームにおけるＰサイトに配置されている状態の３次元的配置関係は、Ｘ線構造解析等によって解析されている。その３次元構造情報は種々のデータベースから取得可能である。
【0058】
なお、ペプチジルｔＲＮＡモデルを含まないタンパク質合成系モデルを用いてアミデーション反応をシミュレーションする場合には、遊離したペプチジル基の一部又は全部をモデル化したペプチジル基モデルをアミデーション反応の反応場に配置することができる。この場合、ペプチジル基モデルは、ｔＲＮＡの３´末端に接続されているときと同等の３次元座標に配置することができる。
【0059】
タンパク質合成系モデルが助剤モデルを要素として含む場合には、助剤モデルを前記空隙に配置することが好ましい。
例えば、ｔＲＮＡモデルはアンチコドンループ部の一部を省略して作成し、その省略したアンチコドンループ部の一部が適合する前記空隙に助剤を配置することでタンパク質合成系モデルを構築してもよい。
例えば、ｔＲＮＡモデルはアンチコドンループ部の一部を省略して作成し、その省略したアンチコドンループ部の一部が適合する前記空隙に助剤を配置することでタンパク質合成系モデルを構築してもよい。
【0060】
タンパク質合成系モデルは、上述した各モデル要素を配置した構造を初期構造として、構造最適化計算によって最適化された構造としてもよい。
【0061】
初期構造は、各種データベースから取得できる３次元構造情報をそのまま流用してもよい。また、モデル要素を配置するにあたり、立体障害や許容できない歪みが生じる場合には、３次元構造情報を基礎としてマニュアル操作により立体構造や立体配座を改変した構造を初期構造としてもよい。
【0062】
構造最適化計算は、構造全体を対象に行ってもよい。また、構造を複数部分に分割し、各セクターについて構造最適化計算を行い、これらを統合してもよい。
【0063】
また、最適化計算を経たタンパク質合成系モデルの構造をさらにマニュアル操作によって改変を加えてもよい。
【0064】
このようにして構築したタンパク質合成系モデルを用いて、アミデーション反応のシミュレーションをコンピュータにより実施する。シミュレーションは、分子力学法、半経験的分子軌道法又は非経験的分子軌道法によって実行することができる。好ましくは半経験的分子軌道法又は非経験的分子軌道法によってシミュレーションを実行する。
【0065】
本発明においては、アミデーション反応のシミュレーションとして、遷移化状態最適化計算を行う実施形態とすることができる。かかる実施形態では、遷移状態の探索を行うための初期構造を求め、この初期構造から遷移状態の構造を探索する。ここで求めた遷移状態の構造の振動解析を行い、遷移状態であることを確認する。あるいは、固有反応座標計算を行い、遷移状態からそれぞれ生成物と反応物が生成することを確認する。
【0066】
タンパク質合成系モデルが上述の（ｂ－２）ミミックモデルや（ｄ）助剤モデルを要素として含む場合について説明する。かかるタンパク質合成系モデルに対して遷移状態構造最適化計算を実行し、アミデーション反応の遷移状態をとり、反応生成物としての伸長したペプチドが生成することが確認ないし推測できる場合には、ミミック及び当該助剤にはタンパク質合成阻害能が無いものと推測できる。一方で、遷移状態構造最適化計算を実行しても遷移状態を確認できない場合には、これらにタンパク質合成阻害能があるものと推測できる。
【0067】
また、上述の３´末端に天然アミノ酸以外の化合物が接続したアミノアシルｔＲＮＡモデルやペプチジルｔＲＮＡモデルを要素として含むタンパク質合成系モデルに対して遷移状態構造最適化計算を実行し、遷移状態をとることが確認できる場合には、当該化合物を含む人工タンパク質をリボソームによって合成可能であると推測することができる。
【0068】
シミュレーションを実行するための具体的方法は、使用するコンピュータの処理能力に応じて適宜選択することができる。
【実施例0069】
以下、本発明の合理性を実証するために行った研究について説明する。
【0070】
１．はじめに
１．１．リボソームのＸ線解析構造
リボソームは、２つの大きなサブユニットを備え、リボソームＲＮＡとリボソームタンパク質の大小の複合体から構成されている。リボソームの基本的な機能は概ね全生物共通であり、小サブユニットにはデコーディングセンターがあり、ｍＲＮＡの各コドンを解読してｔＲＮＡに結合させる役割を持つ。大サブユニットには、ペプチド結合の形成に作用するペプチジルトランスフェラーゼセンターが存在する。
１．１．リボソームのＸ線解析構造
リボソームは、２つの大きなサブユニットを備え、リボソームＲＮＡとリボソームタンパク質の大小の複合体から構成されている。リボソームの基本的な機能は概ね全生物共通であり、小サブユニットにはデコーディングセンターがあり、ｍＲＮＡの各コドンを解読してｔＲＮＡに結合させる役割を持つ。大サブユニットには、ペプチド結合の形成に作用するペプチジルトランスフェラーゼセンターが存在する。
【0071】
タンパク質合成は、コドンに対応するｔＲＮＡに結合したアミノ酸と、伸長過程で結合したペプチドとのアミデーション反応により、さらにペプチドが伸長することで進行する。
【0072】
Ｘ線解析により、リボソームの巨大な全体構造が解明されている（非特許文献１～８）。非特許文献１に示されている構造（ＰＤＢ ４Ｖ５Ｃ，４Ｖ５Ｄ）は、アミノアシルｔＲＮＡが配位するＡサイトと、ペプチジルｔＲＮＡが配位するＰサイトを表す。ｔＲＮＡは両方のサイトに結合し、ペプチド化反応が終了したｔＲＮＡはＥサイトに結合する。歴史的成果によってペプチド化反応部位は明確になっている。
【0073】
リボソームの構造の解明が進み（非特許文献１～８）、同時にその機能の解明も進んでいる（非特許文献９～４５）。
リボソームの最も重要な機能は、最大２０種類の多様なアミノ酸をアミデーション反応により結合させることである。現在解明されているアミデーション反応部位のＸ線解析構造は、空洞と空隙に囲まれた空の構造である（図１、図２）。このような空隙の多い反応部位の構造では、２０種類の多様な構造のアミノ酸それぞれに適応したアミデーション反応を説明することは、今のところできていない。
そもそも、空隙の多いこの構造でリボソームが複雑な機能を発揮しているとは考えにくい。
リボソームの最も重要な機能は、最大２０種類の多様なアミノ酸をアミデーション反応により結合させることである。現在解明されているアミデーション反応部位のＸ線解析構造は、空洞と空隙に囲まれた空の構造である（図１、図２）。このような空隙の多い反応部位の構造では、２０種類の多様な構造のアミノ酸それぞれに適応したアミデーション反応を説明することは、今のところできていない。
そもそも、空隙の多いこの構造でリボソームが複雑な機能を発揮しているとは考えにくい。
【0074】
リボソーム構造は巨大な大骨格構造であるが、くぼみ、空洞、トンネル、空隙の存在も確認されている（非特許文献４６～４９）。これらの機能との関係については、主に出口トンネルに関して議論されている（非特許文献４８～４９）。
【0075】
反応部位を取り囲む空隙は、部分的に出口トンネルとなりうる。しかし、出口トンネルに存在する新しいペプチドは多様でランダムであるため、周囲から見て繊細なアミノ化反応を直接サポートする構造であるとは考えにくい。
【0076】
本発明者は、この空隙は、Ｘ線解析に用いた結晶構造から、リボソームの機能に本来必要な構成要素が散逸したために生じたのではないかと考えた。そうであれば、散逸した構成要素がわかれば、リボソームの機能解明が進むことになる。
【0077】
１．２．Ｘ線解析構造から放散される成分
１．１で述べた理由により、形成直後のペプチド鎖が上記空隙の一部を占めるとしても、アミデーション反応部位周辺に存在する空隙の大部分を占めるとは考えにくい。従って、Ｘ線解析時にこれらの空隙から散逸する成分の候補からは除外される。
１．１で述べた理由により、形成直後のペプチド鎖が上記空隙の一部を占めるとしても、アミデーション反応部位周辺に存在する空隙の大部分を占めるとは考えにくい。従って、Ｘ線解析時にこれらの空隙から散逸する成分の候補からは除外される。
【0078】
ペプチド鎖以外の空隙の主要部分を埋めるアミデーション反応に不可欠な成分があるとする。その場合、その成分は反応部位付近に存在し、Ｘ線分析時に散逸するため、移動性があると考えられる。さらに、反応部位周辺の空隙の大きさ（図２）から、その物質は低分子量ではなく、かなり大きな分子量を持っていると考えられる。
【0079】
１．３．散逸成分としてのｔＲＮＡの可能性
ｔＲＮＡはペプチデーション反応工程で、リボソーム内のＡサイトに結合しその後Ｐサイト更にＥサイトへと移動した後にリボソームから分離する。
そのｔＲＮＡがＸ線解析により示された上記各サイトに結合した状態のｔＲＮＡの構造とは大きく異ならない構造で図２の空隙構造にリボソーム側の誘導適合を考慮しても排除できない立体障害が無く、相補的に適合する構造を取り得ることが構造最適化計算により示すことができれば、Ａ，Ｐ，Ｅサイトと移動する間に空隙構造を埋める過程が存在する可能性が示される。
ｔＲＮＡはペプチデーション反応工程で、リボソーム内のＡサイトに結合しその後Ｐサイト更にＥサイトへと移動した後にリボソームから分離する。
そのｔＲＮＡがＸ線解析により示された上記各サイトに結合した状態のｔＲＮＡの構造とは大きく異ならない構造で図２の空隙構造にリボソーム側の誘導適合を考慮しても排除できない立体障害が無く、相補的に適合する構造を取り得ることが構造最適化計算により示すことができれば、Ａ，Ｐ，Ｅサイトと移動する間に空隙構造を埋める過程が存在する可能性が示される。
【0080】
１．４．ｔＲＮＡアンチコドンのループとアミデーション反応部位周辺の空隙の視覚的フィッティング
散逸成分である可能性を探るため、ｔＲＮＡの各部の構造とリボソームのアミデーション反応部位を囲む溝構造の空隙の間に、相補的に配置できる部分があるかどうかを目視で確認した。
図２において、アミデーション反応部位の周囲の空隙は、白色で示した壁の内側の空間である。この部分がアミデーション反応部；Ａをループ状に取り囲んでいる。このループ構造に着目すると、図３では青色で示したｔＲＮＡのアンチコドンループ部分だけが可能性として残された（図４）。
散逸成分である可能性を探るため、ｔＲＮＡの各部の構造とリボソームのアミデーション反応部位を囲む溝構造の空隙の間に、相補的に配置できる部分があるかどうかを目視で確認した。
図２において、アミデーション反応部位の周囲の空隙は、白色で示した壁の内側の空間である。この部分がアミデーション反応部；Ａをループ状に取り囲んでいる。このループ構造に着目すると、図３では青色で示したｔＲＮＡのアンチコドンループ部分だけが可能性として残された（図４）。
【0081】
図４のフィッティングをより詳細に検討する。
図５ａにおいて、アミデーション反応部位の周辺には、リボソームＧＡ－２０６１、ＡＡ－２０６２、ＣＡ－２０６３、ＣＡ－２０６４からなる中央部Ｃ１が配置されている。Ｃ１をリボソームＣＡ－２４４２、ＣＡ－２４４３、ＧＡ－２４４４、ＧＡ２４４５で囲むことで形成される溝Ｇ１がある。さらに、Ｃ１をリボソームＣＡ－２４５２、ＵＡ－２５０６、ＵＡ－２５８５、ＣＡ－２５８６、ＡＡ－２５８７で囲むことによって形成される溝Ｇ２が存在する。
図５ａにおいて、アミデーション反応部位の周辺には、リボソームＧＡ－２０６１、ＡＡ－２０６２、ＣＡ－２０６３、ＣＡ－２０６４からなる中央部Ｃ１が配置されている。Ｃ１をリボソームＣＡ－２４４２、ＣＡ－２４４３、ＧＡ－２４４４、ＧＡ２４４５で囲むことで形成される溝Ｇ１がある。さらに、Ｃ１をリボソームＣＡ－２４５２、ＵＡ－２５０６、ＵＡ－２５８５、ＣＡ－２５８６、ＡＡ－２５８７で囲むことによって形成される溝Ｇ２が存在する。
【0082】
これらの溝において、アンチコドンループＧＶ－３１、ＣＶ－３２はＧ１溝、アンチコドンループＣＶ－３４、ＡＶ－３５、ＵＶ－３６、ＡＶ－３７、ＡＶ－３８、ＣＶ－３９はＧ２溝にそれぞれ対応するように相補的に配置することができた（図５ａ）。
【0083】
また、Ｃ１とリボソームのＣＡ－２５０１、ＧＡ－２４４６、ＧＡ－２４４７、ＡＡ－２４５０、ＡＡ－２４５１からなる構造部分Ｃ２には大きな溝構造はなく、多くの空隙が点在している（注１）。上記のＧ１とＧ２へのフィッティングにより、アンチコドンループ３２－３４はこのＣ２領域と相補的であることがわかった（図５ｂ）。
注１：Ｘ線解析構造（４Ｖ５Ｃ）では、フェニルアラニンアナログのベンゼン環は、ＡＡ２４５１－ＣＡ２４５２で囲まれた領域のＡ－ｔＲＮＡの７６位末端に位置しているが、この領域は現段階では空隙として扱われている。
注１：Ｘ線解析構造（４Ｖ５Ｃ）では、フェニルアラニンアナログのベンゼン環は、ＡＡ２４５１－ＣＡ２４５２で囲まれた領域のＡ－ｔＲＮＡの７６位末端に位置しているが、この領域は現段階では空隙として扱われている。
【0084】
２．計算方法
２．１．基本計算条件（ハード・ソフト）
上記１．４において、アミデーション反応部位周辺の構造とｔＲＮＡアンチコドンループの構造が相補的であることが目視で確認されたため、構造最適化計算によりその可能性を確認した。構造最適化計算は、以下の計算機環境で行った。
２．１．基本計算条件（ハード・ソフト）
上記１．４において、アミデーション反応部位周辺の構造とｔＲＮＡアンチコドンループの構造が相補的であることが目視で確認されたため、構造最適化計算によりその可能性を確認した。構造最適化計算は、以下の計算機環境で行った。
【0085】
（ａ）計算に必要なＲｉｂｏｓｏｍｅとｔＲＮＡの座標データはすべてＲＣＳＢ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ （ＰＤＢ）から入手した。４Ｖ５Ｃ、４Ｖ５Ｄはhttps://www.rcsb.org/structure/からダウンロードした。計算結果を可視化するためのグラフィックインターフェースには、フリーウェアのＲＡＳＭＯＬを使用した（http://www.openrasmol.org.）。
【0086】
（ｂ）すべての計算は、ＴＯＳＨＩＢＡ ｄｙｎａｂｏｏｋ Ｒ７３１／３７ＣおよびＬＥＮＯＶＯ ８１Ｗ１００ＹＮＪＰのコンピュータで行った。
【0087】
（ｃ）構造最適化計算は，Ｗｉｎｍｏｓｔａｒ（ＧＥ）Ｖ４．０２４の計算パッケージでＭＯＡＰＣ－ＰＭ３ 半経験的ＭＯ法により行った（Ｘ－Ａｂｉｌｉｔｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（https://x-ability.co.jp/jp/））。計算に必要な初期構造は、ＰＤＢデータをもとにＷｉｎｍｏｓｔａｒを可視化し、必要に応じてマニュアル機能を用いて作成した。その際、構造に立体障害が生じた場合は、Ｗｉｎｍｏｓｔａｒのアプリケーションに含まれるＭＭ２法により最適化した。
【0088】
（ｄ）デフォルトの分子構造最適化計算には、Ｅｉｇｅｎｖｅｃｔｏｒ Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇルーチンを使用した。
ＭＯＰＡＣキーワード：ＰＭ３ ＥＦ ＰＲＥＣＩＳＥ ＶＥＣＴＯＲＳ ＭＭＯＫ
ＭＯＰＡＣキーワード：ＰＭ３ ＥＦ ＰＲＥＣＩＳＥ ＶＥＣＴＯＲＳ ＭＭＯＫ
【0089】
構造最適化計算を行うにあたり、計算能力の限界から、以下の原則を適用している。
（ａ）巨大なリボソーム側の誘導適合は原理的に無視される。
（ｂ）密接に配置されたアンチコドンループ近傍のリボソームヌクレオチドは、立体障害やアンチコドンループとの接触に直接関与する部分はできるだけ考慮し、直接関与しない構造部分はできるだけ省略し、立体障害に特化して負荷を軽減する構造最適化計算を行う。
（ｃ）Ｚ－ｍａｔｒｉｘに使用する原子間距離は、原則としてＸ線解析構造の値を採用する。
（ａ）巨大なリボソーム側の誘導適合は原理的に無視される。
（ｂ）密接に配置されたアンチコドンループ近傍のリボソームヌクレオチドは、立体障害やアンチコドンループとの接触に直接関与する部分はできるだけ考慮し、直接関与しない構造部分はできるだけ省略し、立体障害に特化して負荷を軽減する構造最適化計算を行う。
（ｃ）Ｚ－ｍａｔｒｉｘに使用する原子間距離は、原則としてＸ線解析構造の値を採用する。
【0090】
２．２．構造最適化計算手順
アンチコドンループの９塩基（ＧＶ－３１～ＣＶ－３９）のコドンに対応するＵＶ－３６、ＡＶ－３５、ＣＶ－３４をそれぞれＡ、Ｂ、Ｃと仮称し、ＵＶ－３３、ＣＶ－３２、ＧＶ－３１をそれぞれＤ、Ｅ、Ｆと仮称し、ＣＶ－３９、ＡＶ－３８、ＡＶ－３７はそれぞれＸ、Ｙ、Ｚと仮称する。
アンチコドンループの９塩基（ＧＶ－３１～ＣＶ－３９）のコドンに対応するＵＶ－３６、ＡＶ－３５、ＣＶ－３４をそれぞれＡ、Ｂ、Ｃと仮称し、ＵＶ－３３、ＣＶ－３２、ＧＶ－３１をそれぞれＤ、Ｅ、Ｆと仮称し、ＣＶ－３９、ＡＶ－３８、ＡＶ－３７はそれぞれＸ、Ｙ、Ｚと仮称する。
【0091】
９塩基からなるオリゴヌクレオチドは，構造最適化計算を一度に行うことが困難である。目視で得られた構造（図５ａ）をもとに，計算能力の範囲内で以下の手順で順次最適化計算を行った。
【0092】
１） まず、Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆのそれぞれについて、リボソーム部分による３次元拘束条件下で、初期構造の固定点を持たずに構造を最適化する。次に、最適化された構造がオープンスペースで発散しないヌクレオチドを選択し、これを参照ヌクレオチドとして使用する。
２） １）で最適化された構造の末端を固定端構造とし、それに続くループの１塩基をリボソーム部が３次元拘束条件下で最適化する。
３） ２）で得られた構造体の端部を固定端として、２）を繰り返す。
４） アンチコドンループ末端のＦとＸは塩基対Ｘ線解析構造の位置関係を維持し、ループ構造を維持する。
５） 最終ステップで逐次最適化計算のループを閉じ、連続する２塩基の両端を固定端とするリボソーム部分により、３次元構造拘束条件下で構造最適化を実施する。
２） １）で最適化された構造の末端を固定端構造とし、それに続くループの１塩基をリボソーム部が３次元拘束条件下で最適化する。
３） ２）で得られた構造体の端部を固定端として、２）を繰り返す。
４） アンチコドンループ末端のＦとＸは塩基対Ｘ線解析構造の位置関係を維持し、ループ構造を維持する。
５） 最終ステップで逐次最適化計算のループを閉じ、連続する２塩基の両端を固定端とするリボソーム部分により、３次元構造拘束条件下で構造最適化を実施する。
【0093】
３．結果および考察
３．１．アミデーション反応部位の近傍領域とｔＲＮＡアンチコドンループの構造最適化計算によるフィッティング
３．１．１．参照ヌクレオチドの検索と逐次計算順序の策定
図５ａ、ｂに示す初期フィッティングをもとに，固定点を持たないＸ、Ｙ、Ｚ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆの各核酸単位の初期構造を作成し，構造最適化の計算を行った。
その結果、溝構造に配置されたヌクレオチドがオープンスペースに発散することがわかった。しかし、空隙が散在するＣ２領域でＧＡ２０６１、ＡＡ２０６２、ＣＡ２０６３、ＡＡ２４５０、ＡＡ２４５１に囲まれて存在するＤだけはオープンスペースに乖離することがなかった。
最適化された構造を得ることができた（図６）。
３．１．アミデーション反応部位の近傍領域とｔＲＮＡアンチコドンループの構造最適化計算によるフィッティング
３．１．１．参照ヌクレオチドの検索と逐次計算順序の策定
図５ａ、ｂに示す初期フィッティングをもとに，固定点を持たないＸ、Ｙ、Ｚ、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆの各核酸単位の初期構造を作成し，構造最適化の計算を行った。
その結果、溝構造に配置されたヌクレオチドがオープンスペースに発散することがわかった。しかし、空隙が散在するＣ２領域でＧＡ２０６１、ＡＡ２０６２、ＣＡ２０６３、ＡＡ２４５０、ＡＡ２４５１に囲まれて存在するＤだけはオープンスペースに乖離することがなかった。
最適化された構造を得ることができた（図６）。
【0094】
この結果から、構造最適化計算の最初の参照ヌクレオチドはＤであることが判明した。
参照塩基がＤであるため、具体的には３．１．１から３．１．９に示した逐次計算処理を具体的には以下に示す順序で実行した。
参照塩基がＤであるため、具体的には３．１．１から３．１．９に示した逐次計算処理を具体的には以下に示す順序で実行した。
【0095】
【化1】
【0096】
３．１．２．Ｄ端を定点としたＥの最適化計算結果
Ｄの５′側末端のリン酸基は３．１．１で最適化されたが、その前方にＥを結合できる酸素原子が３個あり、Ｅの最適化に必要な３′側固定端は決定できなかった。
Ｄの５′側末端のリン酸基は３．１．１で最適化されたが、その前方にＥを結合できる酸素原子が３個あり、Ｅの最適化に必要な３′側固定端は決定できなかった。
【0097】
そこで、Ｄの４′Ｃと５′ＣはＥの３′側の固定端であり、リボソームＧＡ－２０６１、ＣＡ－２０６３、ＣＡ－２０６４、ＧＡ－２４４５、ＧＡ２４４６、ＡＡ－２４５０、ＣＡ－２５０１とＤの５′Ｃに繋がるリン酸基で囲まれた領域でＥの５′Ｏまでの構造最適化計算をすることにした。
【0098】
しかし，リボソーム側で拘束に用いるヌクレオチドの数が多く、計算能力の限界を超えたため、３．１．２－ａ．と３．１．２－ｂ．の２段階に分割して計算することにした。
【0099】
３．１．２．ａ．Ｄの４′Ｃと５′Ｃを固定点としたＥの最適化計算結果
３．１．１で最適化されたＤの４′Ｃと５′ＣをＥの３′側の固定端と定義する。
Ｄの３′リン酸基は予め最適化されていた。このリン酸基とリボソームのＧＡ２０６１、ＣＡ２０６３、ＣＡ２０６４、ＧＡ２４４６、ＡＡ２４５０、ＣＡ２５０１で囲まれた領域において、Ｅの３′にＤの５′リン酸基が結合した構造を手動で配置した。
３．１．１で最適化されたＤの４′Ｃと５′ＣをＥの３′側の固定端と定義する。
Ｄの３′リン酸基は予め最適化されていた。このリン酸基とリボソームのＧＡ２０６１、ＣＡ２０６３、ＣＡ２０６４、ＧＡ２４４６、ＡＡ２４５０、ＣＡ２５０１で囲まれた領域において、Ｅの３′にＤの５′リン酸基が結合した構造を手動で配置した。
【0100】
Ｅの基部（４，５，６位）の一部を削減し、隣接するＧＡ２４４５を拘束から除外して計算容量の上限を超えないようにした。
また、ＧＡ２０６１の糖部分やＣＡ２５０１の糖部分と塩基部分のねじれ角など、Ｅ付近で立体障害が頻発し、特にリボソーム側の影響が大きく広がらない範囲で誘導適合を考慮した。
上記の修正を加えた初期構造に対して構造最適化計算を行い、最適化された構造を得た（図７）。
また、ＧＡ２０６１の糖部分やＣＡ２５０１の糖部分と塩基部分のねじれ角など、Ｅ付近で立体障害が頻発し、特にリボソーム側の影響が大きく広がらない範囲で誘導適合を考慮した。
上記の修正を加えた初期構造に対して構造最適化計算を行い、最適化された構造を得た（図７）。
【0101】
３．１．２．ｂ． Ｄの５′リン酸基を固定点としたＥの再最適化計算結果
３．１．２．ａで最適化したＤの５′リン酸基をＥの３′側の固定端とし、３．１．２ａで得られたＥの５′ＯまでをリボソームＧＡ－２０６１、ＣＡ－２０６３、ＣＡ－２０６４、ＧＡ－２４４５、ＧＡ２４４６、ＣＡ－２５０１に囲まれた領域に拘束して配置し初期構造とした。Ｅの省略した塩基部分を復元し、これに近いＧＡ－２４４５も拘束因子として初期構造に追加した。この構造に対して最適化計算を行い、最適化構造を得た（図８）。
３．１．２．ａで最適化したＤの５′リン酸基をＥの３′側の固定端とし、３．１．２ａで得られたＥの５′ＯまでをリボソームＧＡ－２０６１、ＣＡ－２０６３、ＣＡ－２０６４、ＧＡ－２４４５、ＧＡ２４４６、ＣＡ－２５０１に囲まれた領域に拘束して配置し初期構造とした。Ｅの省略した塩基部分を復元し、これに近いＧＡ－２４４５も拘束因子として初期構造に追加した。この構造に対して最適化計算を行い、最適化構造を得た（図８）。
【0102】
３．１．３．Ｅ端を定点としたＦの最適化計算結果
３．１．２．ｂで最適化したＥの５′Ｃと５′ＯをＦの３′側の固定端とし、リボソームのＧＡ２０６１、ＡＡ２０６２、ＡＡ２５０３で囲まれた領域にＦを手動で配置した。構造最適化計算を行い、最適化された構造を得た（図９）。
３．１．２．ｂで最適化したＥの５′Ｃと５′ＯをＦの３′側の固定端とし、リボソームのＧＡ２０６１、ＡＡ２０６２、ＡＡ２５０３で囲まれた領域にＦを手動で配置した。構造最適化計算を行い、最適化された構造を得た（図９）。
【0103】
３．１．４．Ｆの塩基対パートナーとしてのＸの配置
３．１．３で最適化したＦを固定構造とし、Ｘ線解析構造でＦと塩基対をなすＸをＸ線解析構造の位置関係を維持したまま配置・固定した（図１０）。
３．１．３で最適化したＦを固定構造とし、Ｘ線解析構造でＦと塩基対をなすＸをＸ線解析構造の位置関係を維持したまま配置・固定した（図１０）。
【0104】
３．１．５．Ｄ端を定点としたＣの最適化
３．１．１．で最適化したＤの３′側末端の３′Ｃと３′Ｏを固定末端とした。そして、これにリン酸エステルを接続し、その後のＣの３′Ｏまでの構造最適化計算を行い、図１１に示すような収束した構造を得た。
３．１．１．で最適化したＤの３′側末端の３′Ｃと３′Ｏを固定末端とした。そして、これにリン酸エステルを接続し、その後のＣの３′Ｏまでの構造最適化計算を行い、図１１に示すような収束した構造を得た。
【0105】
構造最適化計算の初期構造は、リボソームＧＡ－２０６１、ＡＡ－２４５１、ＣＡ－２４５２、ＧＡ－２４４７、ＣＡ－２５０１、ＡＡ－２５０３、ＡＹ－７６（注２）に囲まれた領域内で極端な立体障害を起こさないように調整した。
（注２；１．４．ではこの位置は空隙として扱われていた（注１）。）
（注２；１．４．ではこの位置は空隙として扱われていた（注１）。）
【0106】
この段階で、ＡＹ－７６に結合しているフェニルアラニンアミノアシルアナログをグリシンアミノアシルアナログに置き換え、さらにＣの３次元構造拘束を適用した。初期構造を設定する際には、以下の仮定を置いた。まず、Ｃは実際の反応時に最適化された位置付近に配置し、その後にＡＹ－７６を配置してアミデーション反応を行う。次に、アミノアシル基の側鎖部分を別の空隙に配置する（３．３．で示す）。
【0107】
３．１．６．Ｃ末端を定点としたＢの最適化計算結果
３．１．５で最適化されたＣの３′側末端の３′Ｃと３′Ｏは固定末端とした。これに接続されたリン酸エステルおよびこれに続くＢの３′Ｏは遊離させた。これを初期構造としてＢの構造最適化計算を行ったところ、図１２に示すような収束した構造が得られた。
３．１．５で最適化されたＣの３′側末端の３′Ｃと３′Ｏは固定末端とした。これに接続されたリン酸エステルおよびこれに続くＢの３′Ｏは遊離させた。これを初期構造としてＢの構造最適化計算を行ったところ、図１２に示すような収束した構造が得られた。
【0108】
構造最適化計算の初期構造はリボソームのＡＡ－２０６２、ＡＡ－２５０３、ＵＡ－２５０６、ＵＡ２５８５、及び３．１．１．と３．１．５．で構造最適化されたＤとＣとに囲まれた領域内で、極端な立体障害を生じないようにマニュアルで調整した。
【0109】
３．１．７．Ｂ端を定点としたＡの最適化計算結果
３．１．６．で最適化したＢの３′側端の３′Ｃと３′Ｏを固定端とした。これに接続するリン酸エステルとそれに続くＡの３′Ｏを遊離させた。最後に、Ａの構造最適化計算を行い、図１３に示す収束構造を得た。
３．１．６．で最適化したＢの３′側端の３′Ｃと３′Ｏを固定端とした。これに接続するリン酸エステルとそれに続くＡの３′Ｏを遊離させた。最後に、Ａの構造最適化計算を行い、図１３に示す収束構造を得た。
【0110】
構造最適化計算の初期構造は、３．１．１で構造最適化したリボソームＵＡ－２５０６、ＵＡ－２５８５、ＣＡ－２５８６、Ｄと３．１．６で構造最適化したＢの糖部分とで囲まれ、極端に立体障害を起こさないようにマニュアルで調整した。
【0111】
３．１．８．ＡとＸを両端固定点とした場合のＹ－Ｚ最適化計算結果
３．１．４．でＦの塩基対として固定したＸの４′Ｃと５′ＣをＹの３′側の固定端とし、３．１．７．で最適化したＡの３′Ｃと３′ＯをＺの５′側の固定端として設定した。リボソームＡＡ７４６、ＧＡ７４８、ＵＡ２６１１、Ｘ、Ａで囲まれた領域にジヌクレオチドＹ－Ｚをマニュアルで配置し、構造最適化計算を行い、最適化した構造（図１４）を得ることができた。
３．１．４．でＦの塩基対として固定したＸの４′Ｃと５′ＣをＹの３′側の固定端とし、３．１．７．で最適化したＡの３′Ｃと３′ＯをＺの５′側の固定端として設定した。リボソームＡＡ７４６、ＧＡ７４８、ＵＡ２６１１、Ｘ、Ａで囲まれた領域にジヌクレオチドＹ－Ｚをマニュアルで配置し、構造最適化計算を行い、最適化した構造（図１４）を得ることができた。
【0112】
【0113】
３．２．ｔＲＮＡアンチコドンループとアミデーション反応部位の近傍領域との適合に関する考察
３．１．２から３．１．９で得られた構造最適化計算の結果、Ｇ１、Ｇ２およびＣ１、Ｃ２に存在する空隙（上記１．４で述べたアミデーション反応部位周辺の溝）をほぼ全て埋める構造が存在することがわかった。
これは、ｔＲＮＡのアンチコドンループが、リボソームのアミデーション反応部位周辺に多く存在する空隙にフィットする構造である可能性を示している。
３．１．２から３．１．９で得られた構造最適化計算の結果、Ｇ１、Ｇ２およびＣ１、Ｃ２に存在する空隙（上記１．４で述べたアミデーション反応部位周辺の溝）をほぼ全て埋める構造が存在することがわかった。
これは、ｔＲＮＡのアンチコドンループが、リボソームのアミデーション反応部位周辺に多く存在する空隙にフィットする構造である可能性を示している。
【0114】
上記の可能性は立体構造でも示されているが、アミデーション反応部位の周辺に多くの空隙を埋めてしまう。それはリボソームの機能に大きな影響を与えるはずであり、その影響はもちろんリボソーム本来の機能と密接に関係しているはずである。これを検証するために、次の二つの文献例を３．１の研究結果と比較する。
（３．２．１）生成されたペプチドの出口トンネル（非特許文献４８～４９）
（３．２．２）アミデーション反応部位（非特許文献５０～５４）
（３．２．１）生成されたペプチドの出口トンネル（非特許文献４８～４９）
（３．２．２）アミデーション反応部位（非特許文献５０～５４）
【0115】
３．２．１．出口トンネルとｔＲＮＡアンチコドンループの位置関係の検証
アミデーション反応によって生成されたペプチドは、出口トンネルを経由してリボソームから出る（非特許文献４８～４９）。
最適化されたアンチコドンループ（ＸＹＺＡＢＣＤＥＦ）は、出口トンネルを塞ぐことなくアミデーション反応部位周辺の空隙構造を埋めるはずである。このことを確認するために、以下の研究を行った。
アミデーション反応によって生成されたペプチドは、出口トンネルを経由してリボソームから出る（非特許文献４８～４９）。
最適化されたアンチコドンループ（ＸＹＺＡＢＣＤＥＦ）は、出口トンネルを塞ぐことなくアミデーション反応部位周辺の空隙構造を埋めるはずである。このことを確認するために、以下の研究を行った。
【0116】
アミデーション反応で生成されたペプチドは、リボソームのＰサイトに存在するｔＲＮＡの末端であるＡＶ－７６の３′Ｏに結合し、出口トンネルの入り口に接続される。この出口トンネルまでの鎖の構造を探るため、アミデーション反応によって生成されたペプチドをＡＶ－７６に結合させたモデルに対して構造最適化計算を行うこととした。
【0117】
Ｘ線解析構造４Ｖ５Ｄ（非特許文献１）のＡＶ－７６に結合したフェニルアラニンアナログの構造を４Ｖ５Ｃ（非特許文献１）のＡＶ－７６に移すと、リボソームＣＡ－２０６３と一部重なる。
上記の３．１の研究は４Ｖ５Ｃの構造に基づいていたため、構造最適化計算は４Ｖ５Ｄのフェニルアラニンアナログの構造を想定せず、４Ｖ５ＣのＡＶ－７６の３´Ｏを固定端として使用する。これを初期構造として使用することに決定した。
上記の３．１の研究は４Ｖ５Ｃの構造に基づいていたため、構造最適化計算は４Ｖ５Ｄのフェニルアラニンアナログの構造を想定せず、４Ｖ５ＣのＡＶ－７６の３´Ｏを固定端として使用する。これを初期構造として使用することに決定した。
【0118】
初期構造のペプチドのモデルとして、反応部位近傍の立体配置の制限を理解しやすくするために、かさ高いベンゼン環を持つフェニルアラニン誘導体（アセチルアラニルフェニルアラニン（Ｐｈｅ－Ａｌａ－Ａｃｅ））を採用した。
【0119】
３．２．１．ａ． ＡＶ－７６の３′Ｏ端に結合したＰｈｅ－Ａｌａ－Ａｃｅの構造最適化計算結果
初期構造は、３．１．６で構造最適化したＢ、リボソームのＡＶ－７６の糖部分と５′ＰＯ３部分、ＡＹ－７６の基部、ＵＡ－２５８５の基部とその５′ＰＯ３部分、および３．１．１で構造最適化したＤの基部で囲まれた領域を設定し、極端な立体障害を起こさないようにマニュアルで調整した。
構造最適化計算の結果、図１６に示すような収束した構造が得られた。
初期構造は、３．１．６で構造最適化したＢ、リボソームのＡＶ－７６の糖部分と５′ＰＯ３部分、ＡＹ－７６の基部、ＵＡ－２５８５の基部とその５′ＰＯ３部分、および３．１．１で構造最適化したＤの基部で囲まれた領域を設定し、極端な立体障害を起こさないようにマニュアルで調整した。
構造最適化計算の結果、図１６に示すような収束した構造が得られた。
【0120】
しかし、この構造のＡｌａの側鎖のメチル基はＡＡ－２６０２のＣ１と非常に近いことがわかり、最適化計算では周辺構造として考慮されなかった（図１６）。そこで、ＡＡ－２６０２を周辺構造として追加した。Ｄは計算負荷の増大を抑えるために周辺構造から除外し、ＰｈｅのＣαとＮは固定端とした。Ａｌａ－Ａｃｅの部分について再度最適化計算を行った。計算の結果、図１７に示すような収束した構造が得られた。
【0121】
【0122】
３．２．１．ｂ． 出口トンネルとｔＲＮＡアンチコドンループの位置関係についての考察
図１９は、非特許文献４８の図３で述べた出口トンネルの入口部分の構造と、最適化されたジペプチド（Ｐｈｅ－Ａｌａ－Ａｃｅ）の複合構造である。非特許文献４８で述べられている出口トンネルの入り口部分と、最適化されたジペプチドであるＰｈｅ－Ａｌａ－Ａｃｅを組み合わせた構造である。図１９を見ると、ジペプチド（Ｐｈｅ－Ａｌａ－Ａｃｅの末端のＡｌａ－Ａｃｅ）が出口トンネルの入口に位置していることが確認できる。
図１９は、非特許文献４８の図３で述べた出口トンネルの入口部分の構造と、最適化されたジペプチド（Ｐｈｅ－Ａｌａ－Ａｃｅ）の複合構造である。非特許文献４８で述べられている出口トンネルの入り口部分と、最適化されたジペプチドであるＰｈｅ－Ａｌａ－Ａｃｅを組み合わせた構造である。図１９を見ると、ジペプチド（Ｐｈｅ－Ａｌａ－Ａｃｅの末端のＡｌａ－Ａｃｅ）が出口トンネルの入口に位置していることが確認できる。
【0123】
また、図１９では、リボソームのＡＡ－２０５９（赤色、非特許文献４８では出口トンネルを向いている）、ＡＡ－２０５７、ＵＡ－２６１１、ＧＡ２５０５（青色、出口トンネルを向いている）、最適化アンチコドンループ（緑色）に囲まれた空隙に「ミスト構造」があることがわかる。
以上のことから、アミデーション反応部位周辺の空隙構造をアンチコドンループ（ＸＹＺＡＢＣＤＥＦ）で埋めても、アミデーション反応で生成したペプチドは出口トンネルに向かう構造を取りうることが確認された。
以上のことから、アミデーション反応部位周辺の空隙構造をアンチコドンループ（ＸＹＺＡＢＣＤＥＦ）で埋めても、アミデーション反応で生成したペプチドは出口トンネルに向かう構造を取りうることが確認された。
【0124】
３．２．２．アミデーション反応部位の検証
アミデーション反応機構の詳細を解明するためには、反応に関与するアミノ基を持つＡサイトｔＲＮＡのＡＹ－７６の３′Ｏに結合したアミノ酸の立体構造を知る必要がある。
アミデーション反応の進行を考えると、アンチコドンループの次のアミノアシルｔＲＮＡが接近し、アミデーション反応を誘導する反応部位が形成されると考えるのが妥当である。
この前提のもと、Ｃは３．１．５で最適化された。その結果、４Ｖ５ＣのＸ線解析構造（非特許文献１）でＡＹ－７６に結合したフェニルアラニンアナログのベンゼン環が配置されている空隙に、Ｃのシトシン環が配置されることになった。
この空隙は、芳香環などが配置されやすい空間と考えられている。４Ｖ５ＣのＸ線結晶構造解析に用いた結晶を作製した際、フェニルアラニンアナログのベンゼン環が、たまたまアンチコドンループが配置されていない空隙だらけの反応部位付近に収まって結晶化したと考えられる。
アミデーション反応機構の詳細を解明するためには、反応に関与するアミノ基を持つＡサイトｔＲＮＡのＡＹ－７６の３′Ｏに結合したアミノ酸の立体構造を知る必要がある。
アミデーション反応の進行を考えると、アンチコドンループの次のアミノアシルｔＲＮＡが接近し、アミデーション反応を誘導する反応部位が形成されると考えるのが妥当である。
この前提のもと、Ｃは３．１．５で最適化された。その結果、４Ｖ５ＣのＸ線解析構造（非特許文献１）でＡＹ－７６に結合したフェニルアラニンアナログのベンゼン環が配置されている空隙に、Ｃのシトシン環が配置されることになった。
この空隙は、芳香環などが配置されやすい空間と考えられている。４Ｖ５ＣのＸ線結晶構造解析に用いた結晶を作製した際、フェニルアラニンアナログのベンゼン環が、たまたまアンチコドンループが配置されていない空隙だらけの反応部位付近に収まって結晶化したと考えられる。
【0125】
以上より、３．２．と同様に、上記の前提に従った４Ｖ５Ｃのフェニルアラニンアナログの代わりに、フェニルアラニンと結合したＡＹ－７６とアンチコドンループを挿入した構造（アンチコドンループを配置したアミド反応時の反応部位の構造）を検証した。以上より、３．２．と同様に、上記の前提に従い、４Ｖ５ＣのＡＹ－７６にフェニルアラニンアナログが結合した構造を、アンチコドンループを配置したＡＹ－７６にフェニルアラニンが結合した構造に置き換えた。この構造に対して最適化計算を行った。
【0126】
３．２．２．ａ． ＡＹ－７６の３′Ｏに結合したフェニルアラニンの構造最適化計算結果
ＡＹ－７６の３′Ｃと３′Ｏは固定末端である。３．１．６で最適化したＢと３．１．５で最適化したＣ、リボソームＡＡ－２４５１、ＣＡ－２４５２、ＵＡ－２５０６、ＡＡ－２６０２、ＡＹ－７６（フェニルアラニンアナログを除く）ＡＶ－７６は周辺構造として使用した。これらとの極端な立体障害を避けるために、初期構造を作成した。構造最適化計算の結果、フェニルアラニンのベンゼン環が別の空隙に含まれる最適化構造を得た（図２０）。
ＡＹ－７６の３′Ｃと３′Ｏは固定末端である。３．１．６で最適化したＢと３．１．５で最適化したＣ、リボソームＡＡ－２４５１、ＣＡ－２４５２、ＵＡ－２５０６、ＡＡ－２６０２、ＡＹ－７６（フェニルアラニンアナログを除く）ＡＶ－７６は周辺構造として使用した。これらとの極端な立体障害を避けるために、初期構造を作成した。構造最適化計算の結果、フェニルアラニンのベンゼン環が別の空隙に含まれる最適化構造を得た（図２０）。
【0127】
３．２．２．ｂ． アミデーション反応部位とアミデーション反応機構の考察
３．２．１でＡＶ－７６の３´Ｏの先端に結合したフェニルアラニンの構造最適化の結果（図１８）と、上記のＡＹ－７６の３´Ｏの先端に結合したフェニルアラニンの構造最適化の結果（図２０）を組み合わせて、アミド化反応部位の最近傍部位のみの構造図を作成した（図２１）。
３．２．１でＡＶ－７６の３´Ｏの先端に結合したフェニルアラニンの構造最適化の結果（図１８）と、上記のＡＹ－７６の３´Ｏの先端に結合したフェニルアラニンの構造最適化の結果（図２０）を組み合わせて、アミド化反応部位の最近傍部位のみの構造図を作成した（図２１）。
【0128】
図２１を見ると，３．１．６で構造最適化したＢが反応部位のすぐ近くに存在していることがわかる。このことは、Ｂ（ＡＶ－３６）がアミデーション反応に直接関与していることを示している。特にＢのアデニン環の６位のアミノ基はＡＶ－７６の２′Ｏと３′Ｏに近い位置に存在する。この位置は、非特許文献５０で提案されているアミデーションで遷移状態構造に付加される溶媒の水分子に近い位置である。図２１において、アミデーション反応でアミド結合を形成するアミノ基とカルボニル基の距離は結合距離よりかなり大きい（図中破線矢印）。反応の進行に伴い、互いに接近していくと考えられる。
【0129】
本明細書では、巨大リボソームの誘導適合を考慮せずにアンチコドンループの挿入構造の最適化計算を行っているため、今後、より高度な計算機環境でのアミデーション反応過程の詳細な検証が待たれるところである。
【0130】
４．アミデーション反応のシミュレーション
３．２．２．ｂに記載したアミデーション反応部位の最適化計算結果の構造を基に、Ｙ－７６の３´Ｏに結合したアミノ酸のアミノ基を非特許文献５５で報告されたアミデーション反応遷移状態構造を形成する位置に移動させて、Ｖ－７６の３´Ｏとそれに結合した最適化したＰｈｅ－Ａｌａ－ＡｃｅのＣα炭素を上記遷移状態構造の対応する原子に最近傍に配置し、更に３．１．６．で最適化されＢのＶ－７６の２´Ｏの至近に存在することが判明したアデニン部の６位アミノ基を２´Ｏとの水素結合距離に調整して配置し、遷移状態構造計算の初期構造とした。尚反応中心部以外の構造について、計算能力に応じて適宜省略を行った。
３．２．２．ｂに記載したアミデーション反応部位の最適化計算結果の構造を基に、Ｙ－７６の３´Ｏに結合したアミノ酸のアミノ基を非特許文献５５で報告されたアミデーション反応遷移状態構造を形成する位置に移動させて、Ｖ－７６の３´Ｏとそれに結合した最適化したＰｈｅ－Ａｌａ－ＡｃｅのＣα炭素を上記遷移状態構造の対応する原子に最近傍に配置し、更に３．１．６．で最適化されＢのＶ－７６の２´Ｏの至近に存在することが判明したアデニン部の６位アミノ基を２´Ｏとの水素結合距離に調整して配置し、遷移状態構造計算の初期構造とした。尚反応中心部以外の構造について、計算能力に応じて適宜省略を行った。
【0131】
この初期構造について半経験分子軌道法（ＰＭ３ ＴＳ ＰＲＥＣＩＳＥ ＭＭＯＫ）による遷移状態最適化計算を行い、反応中心部の遷移状態構造（図２２）を得た。
この遷移状態構造はアミデーション反応にＢのＶ－７６のアデニン部の６位アミノ基が直接関わっていることを示している。
この遷移状態構造はアミデーション反応にＢのＶ－７６のアデニン部の６位アミノ基が直接関わっていることを示している。
【0132】
５．結論
ｔＲＮＡのアンチコドンループが、Ｘ線解析で得られたリボソーム構造中のアミデーション反応部位周辺に豊富に存在する空隙に挿入されると仮定して、構造最適化計算を行った。この計算の結果、アンチコドンループがアミデーション反応部位の近くに存在し、アミデーション反応に直接関与している可能性が明らかになった。
ｔＲＮＡのアンチコドンループが、Ｘ線解析で得られたリボソーム構造中のアミデーション反応部位周辺に豊富に存在する空隙に挿入されると仮定して、構造最適化計算を行った。この計算の結果、アンチコドンループがアミデーション反応部位の近くに存在し、アミデーション反応に直接関与している可能性が明らかになった。
【0133】
この構造は、生成したペプチドの通り道である出口トンネルに関する非特許文献４８～４９や、アミデーション反応における遷移状態構造に関する非特許文献５０～５４と一致することがわかった。
【0134】
本明細書のシミュレーションは、使用したハードウェア、ソフトウェアともに容量的な拘束のもとで行われた。計算結果をすべて公開することで、今後、この仮想構造のシミュレーションをより精密に行い、直接的に証明することで、ペプチド化に関する以下の点が進展することが期待される。
【0135】
（１） ＰサイトｔＲＮＡの変形・移動によるアンチコドンループの再配列過程の解析によるペプチド化の動的過程の解明。
（２） ペプチド化に関与する２０種のアミノ酸それぞれのアミデーション反応機構の詳細な解明と、タンパク質を構成するアミノ酸の構造の起源の理解。
（３） 全２０種類のアミノ酸とＤＮＡコドンの対応関係の起源を解明する。
以上の事項は「セントラルドグマ」の最終工程を理解することに他ならない。
（２） ペプチド化に関与する２０種のアミノ酸それぞれのアミデーション反応機構の詳細な解明と、タンパク質を構成するアミノ酸の構造の起源の理解。
（３） 全２０種類のアミノ酸とＤＮＡコドンの対応関係の起源を解明する。
以上の事項は「セントラルドグマ」の最終工程を理解することに他ならない。
【産業上の利用可能性】
【0136】
本発明は、リボソームによるタンパク質合成反応のシミュレーションに応用することができる。また、本発明は、タンパク質合成阻害剤の合成阻害能の評価に応用できる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
