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▶ 大学共同利用機関法人 高エネルギー加速器研究機構の特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024089664
(43)【公開日】2024-07-03
(54)【発明の名称】クライオ電子顕微鏡用試料の調製キット及びその使用
(51)【国際特許分類】
G01N 1/28 20060101AFI20240626BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20240626BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240626BHJP
C07K 14/00 20060101ALI20240626BHJP
H01J 37/20 20060101ALI20240626BHJP
G01N 33/483 20060101ALI20240626BHJP
【ＦＩ】
G01N1/28 J
C12N15/11 Z ZNA
C12N15/63 Z
C07K14/00
G01N1/28 F
H01J37/20 E
G01N33/483 E
【審査請求】未請求
【請求項の数】18
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023215238
(22)【出願日】2023-12-20
(31)【優先権主張番号】P 2022204279
(32)【優先日】2022-12-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）平成２９年度～令和３年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、「創薬等ライフサイエンス研究支援基盤事業」「創薬等ライフサイエンス研究のための相関構造解析プラットフォームによる支援と高度化」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】504151365
【氏名又は名称】大学共同利用機関法人 高エネルギー加速器研究機構
(74)【代理人】
【識別番号】100165179
【弁理士】
【氏名又は名称】田▲崎▼ 聡
(74)【代理人】
【識別番号】100188558
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100175824
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100152272
【弁理士】
【氏名又は名称】川越 雄一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100181722
【弁理士】
【氏名又は名称】春田 洋孝
(72)【発明者】
【氏名】川崎 政人
(72)【発明者】
【氏名】守屋 俊夫
【テーマコード（参考）】
2G045
2G052
4H045
5C101
【Ｆターム（参考）】
2G045AA40
2G045BA14
2G045DA36
2G045FA16
2G052AA28
2G052AB18
2G052AD32
2G052AD52
2G052EB08
2G052GA33
2G052JA11
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA09
4H045EA50
4H045EA60
4H045FA74
5C101FF16
(57)【要約】
【課題】試料中の目的タンパク質の電子線入射方向に対する望ましくない姿勢の偏り及び気液界面への衝突及び吸着が抑制されており、且つ、目的タンパク質が観察領域全体に分散したクライオ電子顕微鏡用試料が得られるクライオ電子顕微鏡用試料の調製キットを提供する。また、試料の氷の厚みが均一に制御されたクライオ電子顕微鏡用試料が得られるクライオ電子顕微鏡用試料の調製キットを提供する。
【解決手段】クライオ電子顕微鏡用試料の調製キットは、両親媒性タンパク質及びタンパク質架橋剤、又は、両親媒性をコードする核酸を含む発現ベクターを備える。クライオ電子顕微鏡用試料の調製キットは、両親媒性タンパク質が結合した氷厚制御分子を備える。
【選択図】なし
【解決手段】クライオ電子顕微鏡用試料の調製キットは、両親媒性タンパク質及びタンパク質架橋剤、又は、両親媒性をコードする核酸を含む発現ベクターを備える。クライオ電子顕微鏡用試料の調製キットは、両親媒性タンパク質が結合した氷厚制御分子を備える。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
両親媒性タンパク質、又は、前記両親媒性タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを備える、クライオ電子顕微鏡用試料の調製キット。
【請求項2】
両親媒性タンパク質が結合した氷厚制御分子を備える、クライオ電子顕微鏡用試料の調製キット。
【請求項3】
前記両親媒性タンパク質が、両親媒性のαヘリックス構造を有する、請求項１又は２に記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キット。
【請求項4】
前記両親媒性タンパク質が、不凍タンパク質である、請求項１又は２に記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キット。
【請求項5】
前記不凍タンパク質がＩ型不凍タンパク質である、請求項４に記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キット。
【請求項6】
前記Ｉ型不凍タンパク質がＨＰＬＣ６ペプチドである、請求項５に記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キット。
【請求項7】
前記両親媒性タンパク質が、ＫＡＬＡペプチドである、請求項１又は２に記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キット。
【請求項8】
タンパク質架橋剤を更に備える、請求項１に記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キット。
【請求項9】
前記タンパク質架橋剤がアミン反応性架橋剤である、請求項８に記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キット。
【請求項10】
前記アミン反応性架橋剤がグルタルアルデヒド、又はビス（３－スルホ－Ｎ－スクシンイミジル）スベラート若しくはその塩である、請求項９に記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キット。
【請求項11】
両親媒性タンパク質が結合した氷厚制御分子を更に備える、請求項１に記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キット。
【請求項12】
前記氷厚制御分子が不凍タンパク質であり、ホモ多量体タンパク質である、請求項２又は１１に記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キット。
【請求項13】
前記ホモ多量体タンパク質がグルタミン合成酵素又はフェリチンである、請求項１２に記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キット。
【請求項14】
請求項１又は２に記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キットを用いて、目的タンパク質を含むクライオ電子顕微鏡用試料を調製することを含む、クライオ電子顕微鏡用試料の調製方法。
【請求項15】
請求項１又は８又は１１に記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キットを用いて、目的タンパク質を含むクライオ電子顕微鏡用試料を調製することを含む、クライオ電子顕微鏡用試料中の目的タンパク質の姿勢の制御方法。
【請求項16】
請求項１又は８又は１１に記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キットを用いて、目的タンパク質を含むクライオ電子顕微鏡用試料を調製することを含む、クライオ電子顕微鏡用試料中の目的タンパク質の非晶質カーボン膜への吸着の抑制方法。
【請求項17】
請求項１又は８又は１１に記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キットを用いて、目的タンパク質を含むクライオ電子顕微鏡用試料を調製することを含む、クライオ電子顕微鏡用試料中の目的タンパク質の気液界面への衝突及び吸着の抑制方法。
【請求項18】
請求項２又は１１に記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キットを用いて、目的タンパク質を含むクライオ電子顕微鏡用試料を調製することを含む、クライオ電子顕微鏡用試料の氷の厚みの制御方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、クライオ電子顕微鏡用試料の調製キット及びその使用に関する。具体的には、本発明は、クライオ電子顕微鏡用試料の調製キット、クライオ電子顕微鏡用試料の調製方法、クライオ電子顕微鏡用試料中の目的タンパク質の姿勢の制御方法、クライオ電子顕微鏡用試料中の目的タンパク質の非晶質カーボン膜への衝突及び吸着の抑制方法、及びクライオ電子顕微鏡用試料の氷の厚みの制御方法に関する。
【背景技術】
【0002】
従来より、タンパク質等の生体分子の構造を解析する方法として、Ｘ線結晶回折法やＮＭＲ法等が用いられてきたが、近年、クライオ電子顕微鏡を用いた単粒子解析（以下、単に「クライオ電子顕微鏡法」と称する）が注目を浴びている。クライオ電子顕微鏡法では、Ｘ線結晶構造解析に必須な試料の結晶化が必要なく、ＮＭＲ法の応用を制限する試料の分子量上限がない。
【0003】
ただ、生体分子ではその立体構造を保持する原子間結合の大半が水素結合やイオン結合のような非共有結合であるため、金属や半導体等の試料に比べて電子線照射損傷を受け易い。そのため、クライオ電子顕微鏡法において、できる限り損傷を抑えて高分解能の生体分子粒子の投影像（以下、「粒子像」と称する）を高画質で記録するためには、生体分子の水溶液を薄膜として急速凍結することで生体分子を非晶質の氷薄膜に包埋し、液体ヘリウムや液体窒素で冷却した試料ステージ上で低温に保持したまま電子線を照射し、電子顕微鏡像を記録することが要求される。また、生体分子の種類によっては、試料グリッドの非晶質カーボン膜に該生体分子が吸着してしまい、観察領域である非晶質の氷薄膜が形成されているホール全体に生体分子を分散できない場合がある。
【0004】
さらに、個々の粒子像は様々な向きで氷薄膜に包埋された分子の投影像であるため、立体像を再構成するには様々な方向で投影された像をできるだけむら無く数多く集めることも必要となる。すなわち、できる限り多くの粒子像を効率よく収集し、粒子像の向きと位置を揃えた上、投影方向毎に分類して平均化することで、ノイズレベルを減少させ信号レベルを向上させることが必須となる。そして、各粒子像の投影方向の相対関係を決め逆投影することで、初めて高分解能の立体像を再構成することが可能となる。しかしながら、気液界面への衝突によりダメージを一部受けた粒子の投影像や気液界面への吸着によって特定の方向から粒子を撮影した投影像しか得られない場合がある。
【0005】
一方、両親媒性タンパク質である不凍タンパク質は３０アミノ酸残基以上１５０アミノ酸残基以下程度のポリペプチドからなる比較的小さなタンパク質であり、０℃以下の温度領域において、氷核の特定の結晶面に結合してその成長を抑えることによって、水又は含水物の凍結を阻害する能力を有することが知られている。近年、不凍タンパク質は気液界面に集合する性質を有することが明らかになっている（例えば、非特許文献１等参照）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Meister K et al., “Investigation of the Ice-Binding Site of an Insect Antifreeze Protein Using Sum-Frequency Generation Spectroscopy.”, J. Phys. Chem. Lett., Vol. 6, Issue 7, pp. 1162-1167, 2015.
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、試料中の目的タンパク質の電子線入射方向に対する望ましくない姿勢の偏り及び気液界面への衝突及び吸着が抑制されており、且つ、目的タンパク質が観察領域全体に分散したクライオ電子顕微鏡用試料が得られるクライオ電子顕微鏡用試料の調製キットを提供する。また、試料の氷の厚みが均一に制御されたクライオ電子顕微鏡用試料が得られるクライオ電子顕微鏡用試料の調製キットを提供する。さらに、前記クライオ電子顕微鏡用試料の調製キットを用いた、クライオ電子顕微鏡用試料の調製方法、クライオ電子顕微鏡用試料中の目的タンパク質の姿勢の制御方法、クライオ電子顕微鏡用試料中の目的タンパク質の非晶質カーボン膜への吸着の抑制方法、クライオ電子顕微鏡用試料中の目的タンパク質の気液界面への衝突及び吸着の抑制方法、及びクライオ電子顕微鏡用試料の氷の厚みの制御方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【0008】
すなわち、本発明は、以下の態様を含む。
（１） 両親媒性タンパク質、又は、前記両親媒性タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを備える、クライオ電子顕微鏡用試料の調製キット。
（２） 両親媒性タンパク質が結合した氷厚制御分子を備える、クライオ電子顕微鏡用試料の調製キット。
（３） 前記両親媒性タンパク質が、両親媒性のαヘリックス構造を有する、（１）又は（２）に記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キット。
（４） 前記両親媒性タンパク質が、不凍タンパク質である、（１）～（３）のいずれか１つに記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キット。
（５） 前記不凍タンパク質がＩ型不凍タンパク質である、（４）に記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キット。
（６） 前記Ｉ型不凍タンパク質がＨＰＬＣ６ペプチドである、（５）に記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キット。
（７） 前記両親媒性タンパク質が、ＫＡＬＡペプチドである、（１）～（３）のいずれか１つに記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キット。
（８） タンパク質架橋剤を更に備える、（１）に記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キット。
（９） 前記タンパク質架橋剤がアミン反応性架橋剤である、（８）に記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キット。
（１０） 前記アミン反応性架橋剤がグルタルアルデヒド、又はビス（３－スルホ－Ｎ－スクシンイミジル）スベラート若しくはその塩である、（９）に記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キット。
（１１） 両親媒性タンパク質が結合した氷厚制御分子を更に備える、（１）に記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キット。
（１２） 前記氷厚制御分子が不凍タンパク質であり、ホモ多量体タンパク質である、（２）又は（１１）に記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キット。
（１３） 前記ホモ多量体タンパク質がグルタミン合成酵素又はフェリチンである、（１２）に記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キット。
（１４） （１）～（１３）のいずれか一つに記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キットを用いて、目的タンパク質を含むクライオ電子顕微鏡用試料を調製することを含む、クライオ電子顕微鏡用試料の調製方法。
（１５） （１）、（８）～（１１）のいずれか一つに記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キットを用いて、目的タンパク質を含むクライオ電子顕微鏡用試料を調製することを含む、クライオ電子顕微鏡用試料中の目的タンパク質の姿勢の制御方法。
（１６） （１）、（８）～（１１）のいずれか一つに記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キットを用いて、目的タンパク質を含むクライオ電子顕微鏡用試料を調製することを含む、クライオ電子顕微鏡用試料中の目的タンパク質の非晶質カーボン膜への吸着の抑制方法。
（１７） （１）、（８）～（１１）のいずれか一つに記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キットを用いて、目的タンパク質を含むクライオ電子顕微鏡用試料を調製することを含む、クライオ電子顕微鏡用試料中の目的タンパク質の気液界面への衝突及び吸着の抑制方法。
（１８） （２）、（１１）～（１３）のいずれか一つに記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キットを用いて、目的タンパク質を含むクライオ電子顕微鏡用試料を調製することを含む、クライオ電子顕微鏡用試料の氷の厚みの制御方法。
（１） 両親媒性タンパク質、又は、前記両親媒性タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを備える、クライオ電子顕微鏡用試料の調製キット。
（２） 両親媒性タンパク質が結合した氷厚制御分子を備える、クライオ電子顕微鏡用試料の調製キット。
（３） 前記両親媒性タンパク質が、両親媒性のαヘリックス構造を有する、（１）又は（２）に記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キット。
（４） 前記両親媒性タンパク質が、不凍タンパク質である、（１）～（３）のいずれか１つに記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キット。
（５） 前記不凍タンパク質がＩ型不凍タンパク質である、（４）に記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キット。
（６） 前記Ｉ型不凍タンパク質がＨＰＬＣ６ペプチドである、（５）に記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キット。
（７） 前記両親媒性タンパク質が、ＫＡＬＡペプチドである、（１）～（３）のいずれか１つに記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キット。
（８） タンパク質架橋剤を更に備える、（１）に記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キット。
（９） 前記タンパク質架橋剤がアミン反応性架橋剤である、（８）に記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キット。
（１０） 前記アミン反応性架橋剤がグルタルアルデヒド、又はビス（３－スルホ－Ｎ－スクシンイミジル）スベラート若しくはその塩である、（９）に記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キット。
（１１） 両親媒性タンパク質が結合した氷厚制御分子を更に備える、（１）に記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キット。
（１２） 前記氷厚制御分子が不凍タンパク質であり、ホモ多量体タンパク質である、（２）又は（１１）に記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キット。
（１３） 前記ホモ多量体タンパク質がグルタミン合成酵素又はフェリチンである、（１２）に記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キット。
（１４） （１）～（１３）のいずれか一つに記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キットを用いて、目的タンパク質を含むクライオ電子顕微鏡用試料を調製することを含む、クライオ電子顕微鏡用試料の調製方法。
（１５） （１）、（８）～（１１）のいずれか一つに記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キットを用いて、目的タンパク質を含むクライオ電子顕微鏡用試料を調製することを含む、クライオ電子顕微鏡用試料中の目的タンパク質の姿勢の制御方法。
（１６） （１）、（８）～（１１）のいずれか一つに記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キットを用いて、目的タンパク質を含むクライオ電子顕微鏡用試料を調製することを含む、クライオ電子顕微鏡用試料中の目的タンパク質の非晶質カーボン膜への吸着の抑制方法。
（１７） （１）、（８）～（１１）のいずれか一つに記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キットを用いて、目的タンパク質を含むクライオ電子顕微鏡用試料を調製することを含む、クライオ電子顕微鏡用試料中の目的タンパク質の気液界面への衝突及び吸着の抑制方法。
（１８） （２）、（１１）～（１３）のいずれか一つに記載のクライオ電子顕微鏡用試料の調製キットを用いて、目的タンパク質を含むクライオ電子顕微鏡用試料を調製することを含む、クライオ電子顕微鏡用試料の氷の厚みの制御方法。
【発明の効果】
【0009】
上記態様のクライオ電子顕微鏡用試料によれば、試料中の目的タンパク質の電子線入射方向に対する望ましくない姿勢の偏り及び気液界面への衝突及び吸着が抑制されており、且つ、目的タンパク質が観察領域全体に分散したクライオ電子顕微鏡用試料が得られる。また、上記態様のクライオ電子顕微鏡用試料によれば、試料の氷の厚みが均一に制御されたクライオ電子顕微鏡用試料が得られる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】実施例１におけるクライオ電子顕微鏡で撮影されたＨＰＬＣ６ペプチドが結合したヘマグルチニンタンパク質の粒子像の二次元クラス平均像である。
【図2A】実施例２におけるクライオ電子顕微鏡で撮影されたグルタミン合成酵素の画像である。
【図2B】実施例２におけるクライオ電子顕微鏡で撮影されたＨＰＬＣ６ペプチドが結合したグルタミン合成酵素の画像である。
【図3】実施例３におけるクライオ電子顕微鏡で撮影されたフェリチン及びＨＰＬＣ６ペプチドが結合したフェリチンの画像である。
【図4】実施例４におけるクライオ電子顕微鏡で撮影されたヘマグルチニンタンパク質及びＨＰＬＣ６ペプチドが結合したフェリチンの混合溶液の画像である。
【図5】実施例５におけるクライオ電子顕微鏡で撮影されたＩｎｏｓｉｎｅ－５’－ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２（ＩＭＰＤＨ２）の粒子像の二次元クラス平均像である。
【図6A】実施例６におけるクライオ電子顕微鏡で撮影されたフェリチンの画像である。
【図6B】実施例６におけるクライオ電子顕微鏡で撮影されたフェリチンとＫＡＬＡペプチドとの融合タンパク質の画像である。
【発明を実施するための形態】
【0011】
≪クライオ電子顕微鏡用試料の調製キット≫
＜第１実施形態＞
本発明の一実施形態に係るクライオ電子顕微鏡用試料の調製キット（以下、「本実施形態の調製キット」と称する場合がある）は、不凍タンパク質、又は、該不凍タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを備える。
＜第１実施形態＞
本発明の一実施形態に係るクライオ電子顕微鏡用試料の調製キット（以下、「本実施形態の調製キット」と称する場合がある）は、不凍タンパク質、又は、該不凍タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを備える。
【0012】
クライオ電子顕微鏡法において、目的タンパク質の立体像を再構成するためには、目的タンパク質について様々な方向で投影された像をできるだけむら無く数多く集めることが必要となる。しかしながら、クライオ電子顕微鏡用の試料グリッド中において、タンパク質の電子線入射方向に対する姿勢の偏りが生じて、同じ向きの粒子像が大半を占めることがある。また、タンパク質がグリッドの観察領域である孔（直径１μｍ程度）の空いた非晶質カーボン膜に吸着してしまい、観察領域内部に均一に分散せず、充分な数の粒子像が得られないことがある。さらに、気液界面への衝突によりダメージを一部受けた粒子の投影像や気液界面への吸着によって特定の方向から粒子を撮影した投影像しか得られない場合がある。
【0013】
これに対して、本実施形態の調製キットは、不凍タンパク質が気液界面に集合する性質から、特定の姿勢で気液界面に吸着しやすい性質の目的タンパク質について、不凍タンパク質と混合することで気液界面を保護し、目的タンパク質が気液界面に衝突する又は吸着してしまうことを抑制することができる。これにより、ダメージを一部受けた目的タンパク質の粒子像を減らすことができ、且つ、目的タンパク質粒子の選択配向（Ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ Ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）を軽減及び解消することができる。すなわち、タンパク質の電子線入射方向に対する姿勢の偏りを抑制し、様々な姿勢のタンパク質の投影像を取得することができる。
【0014】
また、本実施形態の調製キットは、上記不凍タンパク質が気液界面に集合する性質から、目的タンパク質の非晶質カーボン膜への吸着を抑制して、グリッドの観察領域（ホール）内部に目的タンパク質を均一に分散することができる。
【0015】
なお、本明細書において、クライオ電子顕微鏡法とは、単離精製されたタンパク質等の生体分子の試料溶液を急速凍結することで生体分子を薄い氷膜内に包埋し、試料を液体窒素（－１９６℃程度）冷却下で低温に保ったまま電子線を照射して観察を行える特殊な透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて数百から数千枚程度の画像を取得し、取得電顕画像からコンピューター画像処理によって目的生体分子の立体構造を再構成する手法を意味する。
【0016】
また、本明細書において、クライオ電子顕微鏡用試料とは、目的タンパク質を含む溶液を膜穴グリッド上で急速凍結させて作製されたものである。クライオ電子顕微鏡に用いられる膜穴グリッドは、銅、金、モリブデン等の導電性素材で構成された格子状に穴の空いた金属メッシュの上に、さらに規則的な穴の開いた支持膜が貼られた構造からなる。支持膜には、通常１０ｎｍ以上５０ｎｍ以下程度の薄いカーボン膜が用いられるが、電子線照射による膜の帯電を防止するため、これに５ｎｍ以上１０ｎｍ以下程度の金薄膜をコートしたものも用いられる。
【0017】
［不凍タンパク質］
不凍タンパク質は、低温環境下に生息する魚類等から見つかっているタンパク質であり、生体において、凝固点（凍る時の温度）を低下させ、凍結防止や氷結晶の再結晶化防止による生物の生命維持に寄与するタンパク質である。不凍タンパク質は、凍結の瞬間に水の内部に無数に生成する微小な氷結晶の表面に強く結合し、その成長を抑える。
不凍タンパク質は、低温環境下に生息する魚類等から見つかっているタンパク質であり、生体において、凝固点（凍る時の温度）を低下させ、凍結防止や氷結晶の再結晶化防止による生物の生命維持に寄与するタンパク質である。不凍タンパク質は、凍結の瞬間に水の内部に無数に生成する微小な氷結晶の表面に強く結合し、その成長を抑える。
【0018】
魚類由来の不凍タンパク質はその構造により４種類に分類されている。Ｉ型の不凍タンパク質はアラニン残基を多く含みスレオニン残基とアスパラギン酸残基が等間隔で配置されたαヘリックス型のタンパク質である。ＩＩ型の不凍タンパク質はジスルフィド結合を含みＣ型－レクチン様のタンパク質である。ＩＩＩ型の不凍タンパク質は特徴的な構造モチーフからなる球状タンパク質である。ＩＶ型の不凍タンパク質はグルタミン残基を多く含み立体構造未知のタンパク質である。中でも、結晶構造が既知であり、分子量が小さく、且つ、単純な構造からなり、目的タンパク質の粒子像の投影の邪魔にならないことから、Ｉ型不凍タンパク質が好ましい。好ましいＩ型不凍タンパク質としては、例えば、３７アミノ酸残基からなるＨＰＬＣ６ペプチド（アミノ酸配列：配列番号１）等が挙げられる。配列番号１で表されるＨＰＬＣ６ペプチドは、Ｐｓｅｕｄｏｐｌｅｕｒｏｎｅｃｔｅｓ ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ由来の不凍タンパク質の部分アミノ酸配列である。Ｐｓｅｕｄｏｐｌｅｕｒｏｎｅｃｔｅｓ ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ由来の不凍タンパク質の全長アミノ酸配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ５９９６４．１、ＣＡＡ３０３８９．１、ＡＡＡ４９４６９．１、ＡＡＡ４９４７１．１、ＡＡＡ４９４７２．１等に記載されている。
【0019】
また、本実施形態の調製キットにおいて、不凍タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを用いる場合に、該核酸の上流又は下流に目的タンパク質をコードする核酸を挿入することで、不凍タンパク質を目的タンパク質の任意の位置に結合させることができる。これにより、不凍タンパク質が気液界面に集合する性質から、目的タンパク質の該不凍タンパク質が結合している面が気液界面に向くことで、タンパク質の電子線入射方向に対する姿勢の偏りを抑制し、様々な姿勢のタンパク質の投影像を取得することができる。
【0020】
［タンパク質架橋剤］
或いは、本実施形態の調製キットは、不凍タンパク質とタンパク質架橋剤を組み合わせて用いることで、不凍タンパク質を目的タンパク質の任意の位置に結合させることができる。
或いは、本実施形態の調製キットは、不凍タンパク質とタンパク質架橋剤を組み合わせて用いることで、不凍タンパク質を目的タンパク質の任意の位置に結合させることができる。
【0021】
タンパク質架橋剤としては、一般にタンパク質同士の架橋剤として使用されているものを用いることができる。タンパク質架橋剤として具体的には、第一級アミノ基（－ＮＨ２）間を架橋するアミン反応性架橋剤、スルフヒドリル基間を架橋するスルフヒドリル反応性架橋剤、アミノ基とスルフヒドリル基間を架橋するアミノ基－スルフヒドリル基間架橋剤、カルボキシ基とアミノ基間を架橋するカルボキシ基－アミノ基間架橋剤、ヒドロキシ基とスルフヒドリル基間を架橋するヒドロキシ基－スルフヒドリル基間架橋剤等が挙げられる。
第一級アミノ基は、目的タンパク質や不凍タンパク質のＮ末端やリジンの側鎖に存在し、且つ、生理的ｐＨで正荷電されているため、主に目的タンパク質の立体構造の外表面に存在している。よって、外表面に存在する該第一級アミノ基同士の架橋に適していることから、タンパク質架橋剤としては、アミン反応性架橋剤が好ましい。
第一級アミノ基は、目的タンパク質や不凍タンパク質のＮ末端やリジンの側鎖に存在し、且つ、生理的ｐＨで正荷電されているため、主に目的タンパク質の立体構造の外表面に存在している。よって、外表面に存在する該第一級アミノ基同士の架橋に適していることから、タンパク質架橋剤としては、アミン反応性架橋剤が好ましい。
【0022】
アミン反応性架橋剤としては、例えば、グルタル酸Ｎ，Ｎ’－ジスクシンイミジル（ＤＳＧ）、ジスクシンイミジルスベラート;（ＤＳＳ）、ビス（３－スルホ－Ｎ－スクシンイミジル）スベラート（ＢＳ３）、及びそれらの塩等のＮ－ヒドロキシエステル（ＮＨＳエステル）基を反応基として有する架橋剤；ジメチルアジピミデート（ＤＭＡ）、ジメチルピメリミデート（ＤＭＰ）、ジメチルスベリミデート（ＤＭＳ）等のイミドエステル基を反応基として有する架橋剤；ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド等のアルデヒド基を反応基として有する架橋剤等が挙げられる。
中でも、アミン反応性架橋剤としては、グルタルアルデヒド、又はビス（３－スルホ－Ｎ－スクシンイミジル）スベラート若しくはその塩が好ましく、架橋剤同士の重合反応が起きないことから、ビス（３－スルホ－Ｎ－スクシンイミジル）スベラート又はその塩がより好ましい。
中でも、アミン反応性架橋剤としては、グルタルアルデヒド、又はビス（３－スルホ－Ｎ－スクシンイミジル）スベラート若しくはその塩が好ましく、架橋剤同士の重合反応が起きないことから、ビス（３－スルホ－Ｎ－スクシンイミジル）スベラート又はその塩がより好ましい。
【0023】
［発現ベクター］
本実施形態の調製キットは、上記不凍タンパク質及びタンパク質架橋剤の代わりに、或いは、上記不凍タンパク質及びタンパク質架橋剤に加えて、不凍タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを備えることができる。不凍タンパク質としては、上記「不凍タンパク質」において例示されたものと同様のものが挙げられる。不凍タンパク質をコードする核酸としては、例えば、ＨＰＬＣ６ペプチドをコードする核酸等が挙げられる。ＨＰＬＣ６ペプチドをコードする核酸（配列番号２）は、Ｐｓｅｕｄｏｐｌｅｕｒｏｎｅｃｔｅｓ ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ由来の不凍タンパク質をコードする核酸の部分塩基配列である。Ｐｓｅｕｄｏｐｌｅｕｒｏｎｅｃｔｅｓ ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ由来の不凍タンパク質の全長塩基配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＨ００５３２２、Ｘ０７５０６、Ｍ６２４１４、Ｍ６２４１６、Ｍ６２４１７等に記載されている。
本実施形態の調製キットは、上記不凍タンパク質及びタンパク質架橋剤の代わりに、或いは、上記不凍タンパク質及びタンパク質架橋剤に加えて、不凍タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを備えることができる。不凍タンパク質としては、上記「不凍タンパク質」において例示されたものと同様のものが挙げられる。不凍タンパク質をコードする核酸としては、例えば、ＨＰＬＣ６ペプチドをコードする核酸等が挙げられる。ＨＰＬＣ６ペプチドをコードする核酸（配列番号２）は、Ｐｓｅｕｄｏｐｌｅｕｒｏｎｅｃｔｅｓ ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ由来の不凍タンパク質をコードする核酸の部分塩基配列である。Ｐｓｅｕｄｏｐｌｅｕｒｏｎｅｃｔｅｓ ａｍｅｒｉｃａｎｕｓ由来の不凍タンパク質の全長塩基配列は、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＨ００５３２２、Ｘ０７５０６、Ｍ６２４１４、Ｍ６２４１６、Ｍ６２４１７等に記載されている。
【0024】
上記核酸を挿入する発現ベクターとしては特に限定されず、例えば、大腸菌由来のプラスミド、枯草菌由来のプラスミド、酵母由来プラスミド、バクテリオファージ、ウイルスベクター及びこれらを改変したベクター等を用いることができる。大腸菌由来のプラスミドとしては、例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３等が挙げられる。枯草菌由来のプラスミドとしては、例えば、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４等が挙げられる。酵母由来プラスミドとしては、例えば、ｐＳＨ１９、ｐＳＨ１５等が挙げられる。バクテリオファージとしては、例えば、λファージ等が挙げられる。ウイルスベクターの由来となるウイルスとしては、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス、肝炎ウイルス等が挙げられる。
【0025】
上記発現ベクターにおいて、不凍タンパク質の発現用プロモーターとしては特に限定されず、動物細胞を宿主とした発現用のプロモーターであってもよく、植物細胞を宿主とした発現用のプロモーターであってもよく、昆虫細胞を宿主とした発現用のプロモーターであってもよい。動物細胞を宿主とした発現用のプロモーターとしては、例えば、ＥＦ１αプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＨＳＶ－ｔｋプロモーター、ＣＡＧプロモーター等が挙げられる。植物細胞を宿主とした発現用のプロモーターとしては、例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）の３５Ｓプロモーター、ＲＥＦ（ｒｕｂｂｅｒ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）プロモーター等が挙げられる。昆虫細胞を宿主とした発現用のプロモーターとしては、例えば、ポリヘドリンプロモーター、ｐ１０プロモーター等が挙げられる。これらプロモーターは、不凍タンパク質を発現する宿主の種類に応じて、適宜選択することができる。
【0026】
上記発現ベクターは、さらに、マルチクローニングサイト、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、複製起点等を有していてもよい。
【0027】
上記発現ベクターにおいて、不凍タンパク質をコードする核酸の上流又は下流に個別の目的遺伝子（本実施形態においては目的タンパク質をコードする遺伝子）を付加することが好ましい。或いは、上記発現ベクターにおいて、不凍タンパク質をコードする核酸は、目的タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列の途中に挿入されている形態とすることもできる。このとき、発現ベクターにおける不凍タンパク質をコードする核酸と、目的タンパク質をコードする遺伝子の位置関係を適宜調整することで、目的タンパク質の所望の位置に不凍タンパク質が結合した融合タンパク質を調製することができる。すなわち、不凍タンパク質をコードする核酸の挿入位置は、目的タンパク質の２次構造に応じて、適宜選択することができ、例えば、αヘリックス構造とβシートをつなぐループの部分に不凍タンパク質が挿入されるように、設定することができる。
【0028】
上述したように、上記発現ベクターは、不凍タンパク質をコードする核酸と、目的タンパク質をコードする遺伝子を備えることで、不凍タンパク質が目的タンパク質と融合した形の融合タンパク質を生成することができる。また、細胞外へのタンパク質分泌型シグナルを持つ発現ベクターに組み込んだ場合には、分泌型シグナルと不凍タンパク質のアミノ配列が付加された形の目的タンパク質との融合タンパクを培養液中で生成させて、回収することができる。また、細胞内発現型ベクターの場合であっても同様の不凍タンパク質付加融合タンパク質を生成することができる。
【0029】
上述のとおり、不凍タンパク質をコードする核酸及び目的タンパク質をコードする遺伝子が挿入された発現ベクターと、該発現ベクターの種類に応じた適当な宿主細胞を用いることにより、上記不凍タンパク質と目的タンパク質の融合タンパク質を発現させることができる。
【0030】
＜第２実施形態＞
本発明の一実施形態に係るクライオ電子顕微鏡用試料の調製キット（以下、「本実施形態の調製キット」と称する場合がある）は、不凍タンパク質が結合した氷厚制御分子を備える。
本発明の一実施形態に係るクライオ電子顕微鏡用試料の調製キット（以下、「本実施形態の調製キット」と称する場合がある）は、不凍タンパク質が結合した氷厚制御分子を備える。
【0031】
クライオ電子顕微鏡法において、できる限り損傷を抑えて高分解能の粒子像を高画質で記録するためには、目的タンパク質の水溶液を均一な薄膜として急速凍結することで非晶質の氷薄膜に目的タンパク質を包埋する必要がある。しかしながら、目的タンパク質の種類によっては、グリッドの観察領域の中央部に集中して凝集したり、或いは、観察領域の縁部に凝集することで、氷の厚みが均一にならず、また、氷が厚く形成される場合がある。
【0032】
これに対して、本実施形態の調製キットによれば、不凍タンパク質が結合しており、且つ、厚み又は粒径が一定の大きさである氷厚制御分子が、上記不凍タンパク質が気液界面に集合する性質から、グリッドの観察領域（ホール）内部に均一に分散することで、氷厚制御分子の厚み又は粒径に応じて、数十ｎｍ程度の厚みでも均一な氷を形成することができる。
【0033】
［氷厚制御分子］
氷厚制御分子としては、以下の要件を満たす高分子を用いることができる。
１）氷厚制御分子の粒子径が目的タンパク質の粒子径よりも少し大きい。
２）氷厚制御分子の形状が目的タンパク質の形状と異なり、区別しやすい。
３）不凍タンパク質を結合できる。
氷厚制御分子としては、以下の要件を満たす高分子を用いることができる。
１）氷厚制御分子の粒子径が目的タンパク質の粒子径よりも少し大きい。
２）氷厚制御分子の形状が目的タンパク質の形状と異なり、区別しやすい。
３）不凍タンパク質を結合できる。
【0034】
このような氷厚制御分子として具体的には、ホモ又はヘテロ多量タンパク質等が挙げられるが、これらに限定されない。
【0035】
中でも、氷厚制御分子としては、ホモ多量体タンパク質を好ましく用いることができる。
【0036】
ホモ多量体タンパク質としては、結晶構造が既知であり、溶液中で単量体が自己組織化して多量体を形成するタンパク質であれば特に限定されない。ホモ多量体タンパク質の厚み又は粒径は、所望の氷の厚みと同等の大きさであればよい。
【0037】
ホモ多量体タンパク質として具体的には、例えば、グルタミン合成酵素（２層のリング様構造、直径１６ｎｍ程度、厚み１１ｎｍ程度）、フェリチン（球状、粒径１４ｎｍ程度）等が挙げられる。
【0038】
これらホモ多量体タンパク質は、該ホモ多量体タンパク質を構成する単量体を発現させて、溶液中に自己組織化させることで得られる。不凍タンパク質は、ホモ多量体タンパク質に上述したタンパク質架橋剤を用いて結合させてもよく、或いは、単量体と不凍タンパク質との融合タンパク質を発現させることで結合させてもよい。中でも、不凍タンパク質の結合位置の調節が容易であることから、単量体と不凍タンパク質との融合タンパク質を発現させることで結合させることが好ましい。
【0039】
単量体と不凍タンパク質との融合タンパク質は、例えば、単量体をコードする核酸と、不凍タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを、該発現ベクターの種類に応じた適当な宿主細胞に形質転換することで、発現させることができる。発現ベクターの種類や、発現ベクターにおける単量体をコードする核酸と不凍タンパク質をコードする核酸の挿入位置については、上記第１実施形態の調製キットにおいて記載したとおりである。
【0040】
このとき、不凍タンパク質は、単量体全てに結合していてもよく、或いは、単量体の一部に結合していてもよい。すなわち、単量体と不凍タンパク質との融合タンパク質を溶液中で自己組織化させて、単量体全てに不凍タンパク質が結合したホモ多量体タンパク質を調製してもよく、単量体と不凍タンパク質との融合タンパク質と、単量体のみを溶液中で自己組織化させて、単量体の一部に不凍タンパク質が結合したホモ多量体タンパク質を調製してもよい。
【0041】
中でも、ホモ多量体タンパク質の所望の面をより効率的に気液界面に向けて、厚み又は粒径が揃った形でホモ多量体タンパク質を試料中に分散させることができることから、単量体全てに結合していることが好ましい。すなわち、本実施形態の調製キットは、不凍タンパク質が結合したホモ多量体タンパク質の代わりに、ホモ多量体タンパク質を構成する単量体をコードする核酸と、不凍タンパク質をコードする核酸と、（或いは、ホモ多量体タンパク質を構成する単量体と不凍タンパク質の融合タンパク質をコードする核酸）を含む発現ベクターを備えることもできる。
【0042】
ホモ多量体タンパク質を構成する単量体として具体的には、例えば、グルタミン合成酵素を構成する単量体（アミノ酸配列：例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ２８８０６．１、ＡＡＡ２３８７９．１、ＡＡＢ０３００４．１、ＡＡＣ７６８６７．１、ＢＡＥ７７４３９．１、ＡＡＡ９８０６６．１、ＡＡＡ２３８８２．１、ＡＡＡ２３８８０．１参照；塩基配列：例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ０５１７３、Ｍ１３７４６、Ｌ１９２０１、Ｕ０００９６、ＡＰ００９０４８、Ｊ０１６１８、Ｍ１０４２１、Ｋ０２１７６参照）、フェリチンを構成する単量体（アミノ酸配列：例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＡ３７５９３．１、ＡＡＣ７４９７５．１、ＢＡＡ１５７２８．１、ＡＡＡ７９０４９．１参照；塩基配列：例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ５３５１３、Ｕ０００９６、ＡＰ００９０４８、Ｕ３５０６６参照）等が挙げられる。
【0043】
また、ホモ多量体タンパク質を構成する単量体と不凍タンパク質の融合タンパク質をコードする核酸としては、例えば、グルタミン合成酵素の単量体のＮ末端に、不凍タンパク質として、Ｉ型不凍タンパク質であるＨＰＬＣ６ペプチドが結合した融合タンパク質をコードする核酸、フェリチンの単量体のＮ末端に、不凍タンパク質として、Ｉ型不凍タンパク質であるＨＰＬＣ６ペプチドが結合した融合タンパク質をコードする核酸等が挙げられる。
【0044】
＜その他構成＞
本実施形態の調製キットは、上述した構成に加えて、発現ベクターの種類に応じた宿主細胞や、目的タンパク質を溶解又は分散させる公知の緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等）、一般にクライオ電子顕微鏡用試料に用いられる膜穴グリッド等を更に含むことができる。
本実施形態の調製キットは、上述した構成に加えて、発現ベクターの種類に応じた宿主細胞や、目的タンパク質を溶解又は分散させる公知の緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等）、一般にクライオ電子顕微鏡用試料に用いられる膜穴グリッド等を更に含むことができる。
【0045】
また、本実施形態の調製キットは、第１実施形態に係るクライオ電子顕微鏡用試料の調製キットと、第２実施形態に係るクライオ電子顕微鏡用試料の調製キットを組み合わせて用いてもよい。
【0046】
すなわち、本発明の第１実施形態に係る調製キットは、不凍タンパク質が結合したホモ多量体タンパク質を更に備えてもよい。
【0047】
或いは、本発明の第２実施形態に係る調製キットは、不凍タンパク質及びタンパク質架橋剤、又は、不凍タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを更に備えてもよい。
【0048】
これにより、クライオ電子顕微鏡用試料における、目的タンパク質の電子線入射方向に対する姿勢の偏り、非晶質カーボン膜への吸着等の目的タンパク質の局在化、及び氷の厚みの制御という３つの課題を解決することができる。すなわち、第１実施形態に係るクライオ電子顕微鏡用試料の調製キットと、第２実施形態に係るクライオ電子顕微鏡用試料の調製キットを組み合わせて用いることで、試料中の目的タンパク質の電子線入射方向に対する姿勢の偏りが抑制されており、目的タンパク質が観察領域全体に分散しており、且つ、試料の氷の厚みが均一に制御されたクライオ電子顕微鏡用試料が得られる。
【0049】
≪クライオ電子顕微鏡用試料の調製方法≫
本発明の一実施形態に係るクライオ電子顕微鏡用試料の調製方法（以下、「本実施形態の調製方法」と称する場合がある）は、上記第１実施形態又は第２実施形態に係るクライオ電子顕微鏡用試料の調製キットを用いて、目的タンパク質を含むクライオ電子顕微鏡用試料を調製すること（以下、「調製工程」と称する場合がある）を含む。
本発明の一実施形態に係るクライオ電子顕微鏡用試料の調製方法（以下、「本実施形態の調製方法」と称する場合がある）は、上記第１実施形態又は第２実施形態に係るクライオ電子顕微鏡用試料の調製キットを用いて、目的タンパク質を含むクライオ電子顕微鏡用試料を調製すること（以下、「調製工程」と称する場合がある）を含む。
【0050】
本実施形態の調製方法によれば、主に、上記第１実施形態に係るクライオ電子顕微鏡用試料の調製キットを用いることで、試料中の目的タンパク質の電子線入射方向に対する姿勢の偏りを抑制することができる。すなわち、本実施形態の調製方法は、クライオ電子顕微鏡用試料中の目的タンパク質の姿勢の制御方法ということもできる。上記第１実施形態の調製キットが、両親媒性タンパク質が結合した氷厚制御分子をさらに備える場合も同様である。
【0051】
本実施形態の調製方法によれば、主に、上記第１実施形態に係るクライオ電子顕微鏡用試料の調製キットを用いることで、目的タンパク質が気液界面に衝突する又は吸着してしまうことを抑制することができる。すなわち、本実施形態の調製方法は、クライオ電子顕微鏡用試料中の目的タンパク質の気液界面への吸着の抑制方法、或いは、クライオ電子顕微鏡用試料中の目的タンパク質の気液界面への衝突の抑制方法ということもできる。上記第１実施形態の調製キットが、両親媒性タンパク質が結合した氷厚制御分子をさらに備える場合も同様である。
【0052】
本実施形態の調製方法によれば、主に、上記第１実施形態に係るクライオ電子顕微鏡用試料の調製キットを用いることで、試料中において目的タンパク質の非晶質カーボン膜への吸着を抑制し、目的タンパク質を観察領域全体に分散することができる。すなわち、本実施形態の調製方法は、クライオ電子顕微鏡用試料中の目的タンパク質の非晶質カーボン膜への吸着の抑制方法ということもできる。上記第１実施形態の調製キットが、両親媒性タンパク質が結合した氷厚制御分子をさらに備える場合も同様である。
【0053】
本実施形態の調製方法によれば、主に、上記第２実施形態に係るクライオ電子顕微鏡用試料の調製キットを用いることで、試料の氷の厚みを均一に制御することができる。すなわち、本実施形態の調製方法は、クライオ電子顕微鏡用試料の氷の厚みの制御方法ということもできる。
【0054】
次いで、本実施形態の調製方法を構成する工程について以下に詳細を説明する。
【0055】
＜調製工程＞
調製工程では、上記第１実施形態又は第２実施形態に係るクライオ電子顕微鏡用試料の調製キットを用いて、目的タンパク質を含むクライオ電子顕微鏡用試料を調製する。
調製工程では、上記第１実施形態又は第２実施形態に係るクライオ電子顕微鏡用試料の調製キットを用いて、目的タンパク質を含むクライオ電子顕微鏡用試料を調製する。
【0056】
具体的には、例えば、上記第１実施形態の調製キットとして、不凍タンパク質を用いる場合には、不凍タンパク質と、目的タンパク質とをｐＨ７以上９以下の緩衝液中で混合する。
【0057】
このとき、目的タンパク質と不凍タンパク質の混合比率はモル比で、１：１～１：５であってもよく、１：１～１：２であってもよい。モル比が上記範囲であることで、目的タンパク質が気液界面に衝突する又は吸着してしまうことを抑制することができ、その結果、目的タンパク質の電子線入射方向に対する姿勢の偏りをより抑制して、様々な姿勢の目的タンパク質を投影することができる。
【0058】
また、例えば、上記第１実施形態の調製キットとして、タンパク質架橋剤及び不凍タンパク質を組み合わせて用いる場合には、まず、目的タンパク質と不凍タンパク質を溶液中にてタンパク質架橋剤存在下で混合して、目的タンパク質に不凍タンパク質を結合させる。
【0059】
このとき、目的タンパク質と不凍タンパク質の混合比率はモル比で、１：１０～１：２００であってもよく、１：２０～１：１２０であってもよい。モル比が上記範囲であることで、不凍タンパク質を目的タンパク質により十分に結合させることができ、その結果、目的タンパク質の電子線入射方向に対する姿勢の偏りをより抑制して、様々な姿勢の目的タンパク質を投影することができる。
【0060】
また、タンパク質架橋剤はその種類に応じて公知のプロトコールに従い用いることができる。例えば、アミン反応性架橋剤では、ｐＨ７以上９以下のアミンを含まない緩衝液中で、タンパク質の総モル量に対して、１０倍モル以上５０倍モル以下程度の濃度で使用する。具体的なアミン反応性架橋剤の濃度としては、溶液中において０．２５ｍＭ以上１５．００ｍＭ以下程度で使用する。室温（２５℃程度）で例えば１分間以上６０分間以下、或いは、氷上で１時間以上５時間以下、架橋反応を行う。反応後、反応停止剤を含む溶液を添加する、或いは、透析又は脱塩により未反応のアミン反応性架橋剤を除去することで、架橋反応を停止する。
【0061】
また、例えば、上記第１実施形態の調製キットとして、不凍タンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを用いる場合には、該発現ベクターの所望の位置に、目的タンパク質をコードする遺伝子を挿入する。発現ベクターにおける不凍タンパク質をコードする核酸と目的タンパク質をコードする遺伝子との挿入位置については、上記第１実施形態の調製キットにおいて説明したとおりである。次いで、不凍タンパク質をコードする核酸と目的タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターを、該発現ベクターの種類に応じた適当な宿主細胞に形質転換することで、不凍タンパク質と目的タンパク質の融合タンパク質を発現させる。融合タンパク質は、宿主細胞の培養液から、或いは、宿主細胞を破砕することで宿主細胞内から得られる。必要に応じて、得られた融合タンパク質を公知の方法で精製してもよい。
【0062】
或いは、例えば、第２実施形態の調製キットを用いる場合には、不凍タンパク質が結合したホモ多量体タンパク質と、目的タンパク質とをｐＨ７以上９以下のアミンを含まない緩衝液中で混合する。目的タンパク質は、そのまま用いてもよく、或いは、上記第１実施形態の調製キットを用いて、不凍タンパク質が結合したものを用いてもよい。
【0063】
不凍タンパク質が結合したホモ多量体タンパク質及び目的タンパク質の混合溶液中に含まれる不凍タンパク質が結合したホモ多量体タンパク質及び目的タンパク質の各濃度は、使用するホモ多量体タンパク質の種類に応じて適宜調整することができる。例えばホモ多量体タンパク質がフェリチンである場合には、０．１μＭ以上３．０μＭ以下であってもよく、０．５μＭ以上１．５μＭ以下であってもよい。また、このとき、混合溶液中に含まれる目的タンパク質の濃度は、１．０μＭ以上５．０μＭ以下であってもよく、２．０μＭ以上４．０μＭ以下であってもよい。これらタンパク質の濃度が上記範囲であることで、ホモ多量体タンパク質の厚み又は粒径に応じた均一な氷を形成しながら、不凍タンパク質が結合したホモ多量体タンパク質の存在量が目的タンパク質の投影に邪魔にならない程度の量とすることができる。
【0064】
次いで、上記のとおり得られた、不凍タンパク質が結合した目的タンパク質を含む溶液、或いは、目的タンパク質と不凍タンパク質が結合したホモ多量体タンパク質を含む溶液を、グロー放電等により親水化処理を施した膜穴グリッドに載せる。次いで、余分な溶液をろ紙等を用いて除去した後、グリッドを液体エタン中に急速に落下して試料を凍結させる。これにより、目的タンパク質が非晶質の薄い氷の膜の中に閉じ込められた凍結グリッドを得る。得られた凍結グリッドはクライオ電子顕微鏡による観察まで、液体窒素中で保存する。
【0065】
本実施形態の調製方法で得られたクライオ電子顕微鏡用試料は、液体窒素で冷却されたクライオワークステーションの中でクライオトランスファーホルダー又は専用のカートリッジに取り付けられ、霜を付けないようにしてクライオ電子顕微鏡の中に挿入されて撮影される。撮影されたデータを基に単粒子解析による目的タンパク質の構造解析を行うことができる。また、電子線トモグラフィーを用いたサブトモグラム平均化を使った構造解析にも応用することができる。
【0066】
以上、不凍タンパク質（又は不凍タンパク質をコードする核酸を含むベクター）を用いた各実施形態について詳述したが、上記の各実施形態の調製キットは、不凍タンパク質（又は不凍タンパク質をコードする核酸を含むベクター）に代えて、又は不凍タンパク質とともに、不凍タンパク質以外の両親媒性タンパク質（又は両親媒性タンパク質をコードする核酸を含むベクター）を備えていてもよい。
また、上記の各実施形態の調製方法では、不凍タンパク質（又は不凍タンパク質をコードする核酸を含むベクター）に代えて、又は不凍タンパク質とともに、不凍タンパク質以外の両親媒性タンパク質（又は両親媒性タンパク質をコードする核酸を含むベクター）を用いてもよい。
また、上記の各実施形態の調製方法では、不凍タンパク質（又は不凍タンパク質をコードする核酸を含むベクター）に代えて、又は不凍タンパク質とともに、不凍タンパク質以外の両親媒性タンパク質（又は両親媒性タンパク質をコードする核酸を含むベクター）を用いてもよい。
【0067】
両親媒性タンパク質は、疎水性に富む部位と親水性に富む部位を備えている。これにより、両親媒性タンパク質の疎水性に富む部位が空気の方を向き、親水性に富む部位が水の方を向くため、両親媒性タンパク質は、不凍タンパク質に限らず、気液界面に集合する性質を有する。したがって、不凍タンパク質以外の両親媒性タンパク質を用いた場合であっても、同様の効果を得ることができる。
【0068】
両親媒性タンパク質としては、小さくて比較的単純な構造を有する両親媒性タンパク質が好ましいため、両親媒性のαヘリックス構造を有する両親媒性タンパク質がとくに好ましい。このようなタンパク質としては、例えば実施例に示すＨＰＬＣ６等のＩ型不凍タンパク質や、ＫＡＬＡペプチド等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【実施例0069】
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
【0070】
［実施例１］
（タンパク質架橋剤を用いた不凍タンパク質の目的タンパク質への結合）
タンパク質架橋剤を用いて、不凍タンパク質を目的タンパク質の表面のアミノ基と結合させることで、目的タンパク質の電子線入射方向に対する姿勢を制御することを試みた。
（タンパク質架橋剤を用いた不凍タンパク質の目的タンパク質への結合）
タンパク質架橋剤を用いて、不凍タンパク質を目的タンパク質の表面のアミノ基と結合させることで、目的タンパク質の電子線入射方向に対する姿勢を制御することを試みた。
【0071】
１．ＨＰＬＣ６と目的タンパク質の架橋反応
目的タンパク質としては、ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ社製、ＭＢＳ４３４２０５）を使用した。不凍タンパク質としては、Ｉ型不凍タンパク質であるＨＰＬＣ６ペプチド（アミノ酸配列：配列番号１）を、ＧＳＴ融合タンパク質として大腸菌で発現した後、ＧＳＴを切断し精製して用いた。ＰＢＳに溶解したＨＡタンパク質（濃度：１ｍｇ／ｍＬ）とＨＰＬＣ６ペプチド（濃度：１．７ｍｇ／ｍＬ）とを、モル比で１：０、１：４、１：２２、又は１：１１０となるように混合し、タンパク質架橋剤として、０．１４質量％のグルタルアルデヒド存在下、室温（２５℃程度）で５分間、架橋反応させて、１Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を終濃度４４ｍＭとなるように加えて架橋反応を停止させた後、各試料溶液（ＨＡタンパク質の濃度：１．６μＭ（ＨＡタンパク質の濃度は各試料で同一、ＨＰＬＣ６ペプチドの濃度が異なる））を調製した。
目的タンパク質としては、ヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ社製、ＭＢＳ４３４２０５）を使用した。不凍タンパク質としては、Ｉ型不凍タンパク質であるＨＰＬＣ６ペプチド（アミノ酸配列：配列番号１）を、ＧＳＴ融合タンパク質として大腸菌で発現した後、ＧＳＴを切断し精製して用いた。ＰＢＳに溶解したＨＡタンパク質（濃度：１ｍｇ／ｍＬ）とＨＰＬＣ６ペプチド（濃度：１．７ｍｇ／ｍＬ）とを、モル比で１：０、１：４、１：２２、又は１：１１０となるように混合し、タンパク質架橋剤として、０．１４質量％のグルタルアルデヒド存在下、室温（２５℃程度）で５分間、架橋反応させて、１Ｍ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を終濃度４４ｍＭとなるように加えて架橋反応を停止させた後、各試料溶液（ＨＡタンパク質の濃度：１．６μＭ（ＨＡタンパク質の濃度は各試料で同一、ＨＰＬＣ６ペプチドの濃度が異なる））を調製した。
【0072】
２．試料グリッドの作製
グロー放電により膜穴グリッド（Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌ Ｒ１．２／１．３ Ｃｕ ３００）に親水化処理を施した後、３μＬの上記「１．」で調製した試料溶液をグリッドに載せた。次いで、余分な溶液をろ紙で除去した後、グリッドを液体エタン中に急速に落下して試料を凍結させた。これにより、タンパク質試料が非晶質の薄い氷の膜の中に閉じ込められた凍結グリッドを得た。得られた凍結グリッドはクライオ電子顕微鏡による観察まで、液体窒素中で保存した。
グロー放電により膜穴グリッド（Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌ Ｒ１．２／１．３ Ｃｕ ３００）に親水化処理を施した後、３μＬの上記「１．」で調製した試料溶液をグリッドに載せた。次いで、余分な溶液をろ紙で除去した後、グリッドを液体エタン中に急速に落下して試料を凍結させた。これにより、タンパク質試料が非晶質の薄い氷の膜の中に閉じ込められた凍結グリッドを得た。得られた凍結グリッドはクライオ電子顕微鏡による観察まで、液体窒素中で保存した。
【0073】
３．クライオ電子顕微鏡による観察
上記「２．」で作製した各凍結グリッドを、クライオ電子顕微鏡（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｔａｌｏｓ Ａｒｃｔｉｃａ）に挿入し、加速電圧２００ｋＶにて観察、撮影した。撮影された画像から、ＲＥＬＩＯＮを用いて、様々な向きで投影された粒子像を切り出し、同じ向きの粒子像に分類し、整列した後、投影方向毎に分類した粒子像の向きと位置を揃えて、平均像を得た。結果を図１に示す。図１において、ＨＡタンパク質とＨＰＬＣ６のモル比の横に記載した数は、投影された粒子像の合計数である。また、粒子像の上に記載した数は、同じ向きの粒子像の数を示し、粒子像の数の多いものから順に左から右に粒子像を整列させた。また、図１において、符号「Ｔ］は、ＨＡタンパク質を上から投影した粒子像であることを示し、符号「Ｓ」は、ＨＡタンパク質を横から投影した粒子像であることを示している。
上記「２．」で作製した各凍結グリッドを、クライオ電子顕微鏡（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｔａｌｏｓ Ａｒｃｔｉｃａ）に挿入し、加速電圧２００ｋＶにて観察、撮影した。撮影された画像から、ＲＥＬＩＯＮを用いて、様々な向きで投影された粒子像を切り出し、同じ向きの粒子像に分類し、整列した後、投影方向毎に分類した粒子像の向きと位置を揃えて、平均像を得た。結果を図１に示す。図１において、ＨＡタンパク質とＨＰＬＣ６のモル比の横に記載した数は、投影された粒子像の合計数である。また、粒子像の上に記載した数は、同じ向きの粒子像の数を示し、粒子像の数の多いものから順に左から右に粒子像を整列させた。また、図１において、符号「Ｔ］は、ＨＡタンパク質を上から投影した粒子像であることを示し、符号「Ｓ」は、ＨＡタンパク質を横から投影した粒子像であることを示している。
【0074】
図１に示すように、ＨＡタンパク質とＨＰＬＣ６ペプチドのモル比において、ＨＰＬＣ６ペプチドのモル比率が増加するのに伴って、ＨＡタンパク質を横から投影された粒子像の数が増加する傾向がみられ、ＨＡタンパク質とＨＰＬＣ６ペプチドのモル比が１：０～１：２２では、ＨＡタンパク質を上から投影した粒子像の数が最も多かったが、ＨＡタンパク質とＨＰＬＣ６ペプチドのモル比が１：１１０では、ＨＡタンパク質を横から投影した粒子像が最も多くなっていた。ＨＰＬＣ６ペプチドのモル比率が増加することで、ＨＡタンパク質の横（側面）に存在するリジン残基又はＮ末端のアミノ基に対して、結合するＨＰＬＣ６ペプチドの量が増えることで、該ＨＰＬＣ６ペプチドが結合した面（側面）が気液界面に向くことで、ＨＡタンパク質を横から投影した粒子像が増加したものと推察された。
【0075】
よって、目的タンパク質とＨＰＬＣ６ペプチドのモル比において、ＨＰＬＣ６ペプチドのモル比率を増加させることで、目的タンパク質の電子線入射方向に対する姿勢を制御して、様々な方向で投影された粒子像を数多く収集できることが確かめられた。
【0076】
［実施例２］
（不凍タンパク質による目的タンパク質の非晶質カーボン膜への吸着抑制効果）
グリッド中の非晶質カーボン膜に吸着しやすい性質の目的タンパク質について、遺伝子工学的に不凍タンパク質と目的タンパク質の融合タンパク質を調製することで、非晶質カーボン膜への吸着を抑制し、目的タンパク質を観察領域全体に分散することを検討した。
（不凍タンパク質による目的タンパク質の非晶質カーボン膜への吸着抑制効果）
グリッド中の非晶質カーボン膜に吸着しやすい性質の目的タンパク質について、遺伝子工学的に不凍タンパク質と目的タンパク質の融合タンパク質を調製することで、非晶質カーボン膜への吸着を抑制し、目的タンパク質を観察領域全体に分散することを検討した。
【0077】
１．融合タンパク質の発現及び精製
目的タンパク質としては、グルタミン合成酵素を使用した。グルタミン合成酵素は、ホモ１２量体で構成されており、直径１６ｎｍ程度、高さ（厚み）１１ｎｍ程度の六角柱様の形状である。グルタミン合成酵素の単量体は溶液中で自己組織化して１２量体を形成する。グルタミン合成酵素の単量体（アミノ酸配列：配列番号３）のＮ末端に、不凍タンパク質として、Ｉ型不凍タンパク質であるＨＰＬＣ６ペプチド（アミノ酸配列：配列番号１）がリンカー配列（アミノ酸配列：配列番号４、塩基配列：配列番号５）を介して結合した融合タンパク質をコードする核酸をプラスミドベクターｐＥＴ－２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に挿入した。該ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換した。発現誘導した大腸菌の可溶性画分から目的タンパク質をニッケルカラムにより精製、Ｈｉｓタグを切断後ゲルろ過カラムによりさらに精製した。
また、対照として、不凍タンパク質が結合していない、グルタミン合成酵素の単量体のみをコードする核酸（塩基配列：配列番号６）をプラスミドベクターに挿入し、大腸菌発現系を用いて、同様に発現及び精製した。
目的タンパク質としては、グルタミン合成酵素を使用した。グルタミン合成酵素は、ホモ１２量体で構成されており、直径１６ｎｍ程度、高さ（厚み）１１ｎｍ程度の六角柱様の形状である。グルタミン合成酵素の単量体は溶液中で自己組織化して１２量体を形成する。グルタミン合成酵素の単量体（アミノ酸配列：配列番号３）のＮ末端に、不凍タンパク質として、Ｉ型不凍タンパク質であるＨＰＬＣ６ペプチド（アミノ酸配列：配列番号１）がリンカー配列（アミノ酸配列：配列番号４、塩基配列：配列番号５）を介して結合した融合タンパク質をコードする核酸をプラスミドベクターｐＥＴ－２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に挿入した。該ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換した。発現誘導した大腸菌の可溶性画分から目的タンパク質をニッケルカラムにより精製、Ｈｉｓタグを切断後ゲルろ過カラムによりさらに精製した。
また、対照として、不凍タンパク質が結合していない、グルタミン合成酵素の単量体のみをコードする核酸（塩基配列：配列番号６）をプラスミドベクターに挿入し、大腸菌発現系を用いて、同様に発現及び精製した。
【0078】
２．試料グリッドの作製
ＨＰＬＣ６ペプチドが結合したグルタミン合成酵素を含む試料については、タンパク質濃度２．０μＭ、グルタミン合成酵素のみを含む試料については、タンパク質濃度２．０μＭとなるように、緩衝液（組成：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）で希釈して、実施例１の「２．」と同様の方法を用いて、試料グリッドを作製した。
ＨＰＬＣ６ペプチドが結合したグルタミン合成酵素を含む試料については、タンパク質濃度２．０μＭ、グルタミン合成酵素のみを含む試料については、タンパク質濃度２．０μＭとなるように、緩衝液（組成：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）で希釈して、実施例１の「２．」と同様の方法を用いて、試料グリッドを作製した。
【0079】
３．クライオ電子顕微鏡による観察
上記「２．」で作製した各凍結グリッドを、クライオ電子顕微鏡（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｔａｌｏｓ Ａｒｃｔｉｃａ）に挿入し、加速電圧２００ｋＶにて観察、撮影した。結果を図２Ａ（グルタミン合成酵素のみ）及び図２Ｂ（ＨＰＬＣ６ペプチドが結合したグルタミン合成酵素）に示す。
上記「２．」で作製した各凍結グリッドを、クライオ電子顕微鏡（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｔａｌｏｓ Ａｒｃｔｉｃａ）に挿入し、加速電圧２００ｋＶにて観察、撮影した。結果を図２Ａ（グルタミン合成酵素のみ）及び図２Ｂ（ＨＰＬＣ６ペプチドが結合したグルタミン合成酵素）に示す。
【0080】
図２Ａに示すように、グルタミン合成酵素のみを含む試料グリッドでは、ホール中央にはグルタミン合成酵素が観察されず、ホール周辺の非晶質カーボン膜にグルタミン合成酵素が吸着しており、観察領域全体に分散していなかった。
【0081】
一方、図２Ｂに示すように、ＨＰＬＣ６ペプチドが結合したグルタミン合成酵素を含む試料グリッドでは、ホール中央及びホール周辺のいずれにも万遍なく粒子が分散していた。
また、図２Ｂでは、グルタミン合成酵素の１２量体を上から投影した粒子像が主に観察された。これは、試料中において、Ｎ末端にＨＰＬＣ６ペプチドが結合したグルタミン合成酵素の単量体が１２量体を形成し、ＨＰＬＣ６ペプチドが結合している面（上面）が気液界面に向くことで、グルタミン合成酵素の１２量体の電子線入射方向に対する姿勢が揃って、上から投影した粒子像が主に観察されたものと推察された。
さらに、ホール全体像において、ホール内部が全体的に白っぽくなっており、均一で薄い氷が形成されていることが確認された。
また、図２Ｂでは、グルタミン合成酵素の１２量体を上から投影した粒子像が主に観察された。これは、試料中において、Ｎ末端にＨＰＬＣ６ペプチドが結合したグルタミン合成酵素の単量体が１２量体を形成し、ＨＰＬＣ６ペプチドが結合している面（上面）が気液界面に向くことで、グルタミン合成酵素の１２量体の電子線入射方向に対する姿勢が揃って、上から投影した粒子像が主に観察されたものと推察された。
さらに、ホール全体像において、ホール内部が全体的に白っぽくなっており、均一で薄い氷が形成されていることが確認された。
【0082】
よって、グリッド中の非晶質カーボン膜に吸着しやすい性質の目的タンパク質について、不凍タンパク質との融合タンパク質とすることで、非晶質カーボン膜への吸着が抑制されて、目的タンパク質の粒子を観察領域全体に分散できることが確かめられた。
【0083】
また、厚みや粒子径が揃っているホモ多量体タンパク質を用いることで、グリッドの氷の厚みを薄く均一に制御できることが明らかとなった。
【0084】
［実施例３］
（不凍タンパク質が結合したホモ多量体タンパク質による氷の厚みの制御）
グルタミン合成酵素以外の、厚みや粒子径が揃っているホモ多量体タンパク質においても、不凍タンパク質と結合した融合タンパク質とすることで、グリッドの氷の厚みを薄く均一に制御できるかを検討した。
（不凍タンパク質が結合したホモ多量体タンパク質による氷の厚みの制御）
グルタミン合成酵素以外の、厚みや粒子径が揃っているホモ多量体タンパク質においても、不凍タンパク質と結合した融合タンパク質とすることで、グリッドの氷の厚みを薄く均一に制御できるかを検討した。
【0085】
１．融合タンパク質の発現及び精製
目的タンパク質としては、フェリチンを使用した。なお、実施例３において、フェリチンは、目的タンパク質としての役割と、氷厚制御分子としての役割を兼ねている。フェリチンは、ホモ２４量体で構成されており、直径１４ｎｍ程度の球状である。フェリチンの単量体は溶液中で自己組織化して２４量体を形成する。フェリチンの単量体（アミノ酸配列：配列番号７）のＮ末端に、不凍タンパク質として、Ｉ型不凍タンパク質であるＨＰＬＣ６ペプチド（アミノ酸配列：配列番号１）がリンカー配列（アミノ酸配列：配列番号８、塩基配列：配列番号９）を介して結合した融合タンパク質をコードする核酸をプラスミドベクターｐＥＴ－２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に挿入した。該ベクターを大腸菌に形質転換した。発現誘導した大腸菌の可溶性画分から目的タンパク質をニッケルカラムにより精製、Ｈｉｓタグを切断後ゲルろ過カラムによりさらに精製した。
また、対照として、不凍タンパク質が結合していない、フェリチンの単量体のみをコードする核酸（塩基配列：配列番号１０）をプラスミドベクターに挿入し、大腸菌発現系を用いて、同様に発現及び精製した。
目的タンパク質としては、フェリチンを使用した。なお、実施例３において、フェリチンは、目的タンパク質としての役割と、氷厚制御分子としての役割を兼ねている。フェリチンは、ホモ２４量体で構成されており、直径１４ｎｍ程度の球状である。フェリチンの単量体は溶液中で自己組織化して２４量体を形成する。フェリチンの単量体（アミノ酸配列：配列番号７）のＮ末端に、不凍タンパク質として、Ｉ型不凍タンパク質であるＨＰＬＣ６ペプチド（アミノ酸配列：配列番号１）がリンカー配列（アミノ酸配列：配列番号８、塩基配列：配列番号９）を介して結合した融合タンパク質をコードする核酸をプラスミドベクターｐＥＴ－２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に挿入した。該ベクターを大腸菌に形質転換した。発現誘導した大腸菌の可溶性画分から目的タンパク質をニッケルカラムにより精製、Ｈｉｓタグを切断後ゲルろ過カラムによりさらに精製した。
また、対照として、不凍タンパク質が結合していない、フェリチンの単量体のみをコードする核酸（塩基配列：配列番号１０）をプラスミドベクターに挿入し、大腸菌発現系を用いて、同様に発現及び精製した。
【0086】
２．試料グリッドの作製
ＨＰＬＣ６ペプチドが結合したフェリチンを含む試料については、タンパク質濃度２μＭ、フェリチンのみを含む試料については、タンパク質濃度７μＭとなるように緩衝液（組成：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）で希釈して、実施例１の「２．」と同様の方法を用いて、試料グリッドを作製した。
ＨＰＬＣ６ペプチドが結合したフェリチンを含む試料については、タンパク質濃度２μＭ、フェリチンのみを含む試料については、タンパク質濃度７μＭとなるように緩衝液（組成：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）で希釈して、実施例１の「２．」と同様の方法を用いて、試料グリッドを作製した。
【0087】
３．クライオ電子顕微鏡による観察
上記「２．」で作製した各凍結グリッドを、クライオ電子顕微鏡（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｔａｌｏｓ Ａｒｃｔｉｃａ）に挿入し、加速電圧２００ｋＶにて観察、撮影した。結果を図３（左：フェリチンのみ。右：ＨＰＬＣ６ペプチドが結合したフェリチン）に示す。
上記「２．」で作製した各凍結グリッドを、クライオ電子顕微鏡（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｔａｌｏｓ Ａｒｃｔｉｃａ）に挿入し、加速電圧２００ｋＶにて観察、撮影した。結果を図３（左：フェリチンのみ。右：ＨＰＬＣ６ペプチドが結合したフェリチン）に示す。
【0088】
図３に示すように、フェリチンのみを含む試料グリッドでは、ホール内部の中央部のみが白っぽくなっており、中央部のみに氷が薄い状態となっていた。
一方、ＨＰＬＣ６ペプチドが結合したフェリチンを含む試料グリッドでは、ホール内部が全体的に白っぽくなっており、均一で薄い氷が形成されていることが確認された。これは、試料中において、Ｎ末端にＨＰＬＣ６ペプチドが結合したフェリチンの単量体が２４量体を形成し、ＨＰＬＣ６ペプチドが結合している面（上面）が気液界面に向いてホール全体に亘って分散することで、その結果、氷の厚みがフェリチンの直径に従って均一に薄く形成されたものと推察された。
一方、ＨＰＬＣ６ペプチドが結合したフェリチンを含む試料グリッドでは、ホール内部が全体的に白っぽくなっており、均一で薄い氷が形成されていることが確認された。これは、試料中において、Ｎ末端にＨＰＬＣ６ペプチドが結合したフェリチンの単量体が２４量体を形成し、ＨＰＬＣ６ペプチドが結合している面（上面）が気液界面に向いてホール全体に亘って分散することで、その結果、氷の厚みがフェリチンの直径に従って均一に薄く形成されたものと推察された。
【0089】
よって、ホモ多量体タンパク質の種類に関わらず、厚みや粒子径が揃っているホモ多量体タンパク質を用いることで、グリッドの氷の厚みを薄く均一に制御できることが確かめられた。
【0090】
［実施例４］
（不凍タンパク質が結合したホモ多量体タンパク質による氷の厚みの制御及び目的タンパク質の分散効果）
グリッドの観察領域の中央部に凝集しやすい性質の目的タンパク質について、不凍タンパク質が結合したホモ多量体タンパク質と混合することで、グリッドの氷の厚みを薄く均一に制御しながら、グリッドの観察領域の中央部への目的タンパク質の凝集を抑制し、目的タンパク質を観察領域全体に分散することを検討した。
（不凍タンパク質が結合したホモ多量体タンパク質による氷の厚みの制御及び目的タンパク質の分散効果）
グリッドの観察領域の中央部に凝集しやすい性質の目的タンパク質について、不凍タンパク質が結合したホモ多量体タンパク質と混合することで、グリッドの氷の厚みを薄く均一に制御しながら、グリッドの観察領域の中央部への目的タンパク質の凝集を抑制し、目的タンパク質を観察領域全体に分散することを検討した。
【0091】
１．融合タンパク質の発現及び精製
目的タンパク質としては、ＨＡタンパク質（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ社製、ＭＢＳ４３４２０５）を使用した。融合タンパク質としては、フェリチンの単量体のＮ末端に、不凍タンパク質として、Ｉ型不凍タンパク質であるＨＰＬＣ６ペプチドが結合した融合タンパク質を上記実施例３の「１．」と同様の方法で発現及び精製した。
目的タンパク質としては、ＨＡタンパク質（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ社製、ＭＢＳ４３４２０５）を使用した。融合タンパク質としては、フェリチンの単量体のＮ末端に、不凍タンパク質として、Ｉ型不凍タンパク質であるＨＰＬＣ６ペプチドが結合した融合タンパク質を上記実施例３の「１．」と同様の方法で発現及び精製した。
【0092】
２．試料グリッドの作製
ＨＡタンパク質及びＨＰＬＣ６ペプチドを融合したフェリチンを含む試料については、ＨＡタンパク質の濃度が３．０μＭ、ＨＰＬＣ６ペプチドを融合したフェリチンの濃度が１．０μＭとなるように緩衝液（組成：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）で希釈して、実施例１の「２．」と同様の方法を用いて、試料グリッドを作製した。
ＨＡタンパク質及びＨＰＬＣ６ペプチドを融合したフェリチンを含む試料については、ＨＡタンパク質の濃度が３．０μＭ、ＨＰＬＣ６ペプチドを融合したフェリチンの濃度が１．０μＭとなるように緩衝液（組成：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）で希釈して、実施例１の「２．」と同様の方法を用いて、試料グリッドを作製した。
【0093】
３．クライオ電子顕微鏡による観察
上記「２．」で作製した各凍結グリッドを、クライオ電子顕微鏡（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｔａｌｏｓ Ａｒｃｔｉｃａ）に挿入し、加速電圧２００ｋＶにて観察、撮影した。結果を図４に示す。
上記「２．」で作製した各凍結グリッドを、クライオ電子顕微鏡（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｔａｌｏｓ Ａｒｃｔｉｃａ）に挿入し、加速電圧２００ｋＶにて観察、撮影した。結果を図４に示す。
【0094】
【0095】
よって、目的タンパク質と不凍タンパク質が結合したホモ多量体タンパク質とを組み合わせて用いることで、グリッドの氷の厚みを薄く均一に制御しながら、目的タンパク質を観察領域全体に分散できることが確かめられた。
【0096】
［実施例５］
（不凍タンパク質の気液界面保護による目的タンパク質の気液界面への吸着抑制効果による姿勢の偏りの抑制）
特定の姿勢で気液界面に吸着しやすい性質の目的タンパク質について、不凍タンパク質と混合することで気液界面保護し、目的タンパク質が気液界面に衝突して吸着することを抑制することで、目的タンパク質の姿勢の偏りを抑制することを検討した。
（不凍タンパク質の気液界面保護による目的タンパク質の気液界面への吸着抑制効果による姿勢の偏りの抑制）
特定の姿勢で気液界面に吸着しやすい性質の目的タンパク質について、不凍タンパク質と混合することで気液界面保護し、目的タンパク質が気液界面に衝突して吸着することを抑制することで、目的タンパク質の姿勢の偏りを抑制することを検討した。
【0097】
１．目的タンパク質及び不凍タンパク質の準備
目的タンパク質としては、Ｉｎｏｓｉｎｅ－５’－ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２（ＩＭＰＤＨ２）の変異体Ｙ１２Ａ（以下、「ＩＭＰＤＨ２（Ｙ１２Ａ）」と称する場合がある）を使用した。ＩＭＰＤＨ２（Ｙ１２Ａ）は、野生型のＩＭＰＤＨ２をコードする遺伝子を含むプラスミドに、Ｙ１２Ａ変異を導入した後、大腸菌で発現して調製した。不凍タンパク質としては、Ｉ型不凍タンパク質であるＨＰＬＣ６ペプチド（アミノ酸配列：配列番号１）を、ＧＳＴ融合タンパク質として大腸菌で発現した後、ＧＳＴを切断し精製して用いた。
目的タンパク質としては、Ｉｎｏｓｉｎｅ－５’－ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ２（ＩＭＰＤＨ２）の変異体Ｙ１２Ａ（以下、「ＩＭＰＤＨ２（Ｙ１２Ａ）」と称する場合がある）を使用した。ＩＭＰＤＨ２（Ｙ１２Ａ）は、野生型のＩＭＰＤＨ２をコードする遺伝子を含むプラスミドに、Ｙ１２Ａ変異を導入した後、大腸菌で発現して調製した。不凍タンパク質としては、Ｉ型不凍タンパク質であるＨＰＬＣ６ペプチド（アミノ酸配列：配列番号１）を、ＧＳＴ融合タンパク質として大腸菌で発現した後、ＧＳＴを切断し精製して用いた。
【0098】
２．試料グリッドの作製
ＩＭＰＤＨ２（Ｙ１２Ａ）及びＨＰＬＣ６ペプチドを含む試料については、ＩＭＰＤＨ２（Ｙ１２Ａ）とＨＰＬＣ６ペプチドのモル比が１：１．２５となるように緩衝液（組成：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）で希釈して、実施例１の「２．」と同様の方法を用いて、試料グリッドを作製した。グリッドとして、膜穴グリッド（Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌ Ｒ１．２／１．３ Ｃｕ ３００）及びグラフェングリッド（株式会社エアメンブレン社製、２層グラフェンＴＥＭグリッド Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌ Ｒ１．２／１．３ ３００ｍｅｓｈ Ａｕ 親水化処理済）を用いた。対照として、目的タンパク質のみを含む試料も準備した。
ＩＭＰＤＨ２（Ｙ１２Ａ）及びＨＰＬＣ６ペプチドを含む試料については、ＩＭＰＤＨ２（Ｙ１２Ａ）とＨＰＬＣ６ペプチドのモル比が１：１．２５となるように緩衝液（組成：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）で希釈して、実施例１の「２．」と同様の方法を用いて、試料グリッドを作製した。グリッドとして、膜穴グリッド（Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌ Ｒ１．２／１．３ Ｃｕ ３００）及びグラフェングリッド（株式会社エアメンブレン社製、２層グラフェンＴＥＭグリッド Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌ Ｒ１．２／１．３ ３００ｍｅｓｈ Ａｕ 親水化処理済）を用いた。対照として、目的タンパク質のみを含む試料も準備した。
【0099】
３．クライオ電子顕微鏡による観察
上記「２．」で作製した各凍結グリッドを、クライオ電子顕微鏡（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｔａｌｏｓ Ａｒｃｔｉｃａ）に挿入し、加速電圧２００ｋＶにて観察、撮影した。結果を図５に示す。図５において、符号「Ｔ］は、ＩＭＰＤＨ２（Ｙ１２Ａ）を上から投影した粒子像であることを示し、符号「Ｓ」は、ＩＭＰＤＨ２（Ｙ１２Ａ）を横から投影した粒子像であることを示している。
上記「２．」で作製した各凍結グリッドを、クライオ電子顕微鏡（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｔａｌｏｓ Ａｒｃｔｉｃａ）に挿入し、加速電圧２００ｋＶにて観察、撮影した。結果を図５に示す。図５において、符号「Ｔ］は、ＩＭＰＤＨ２（Ｙ１２Ａ）を上から投影した粒子像であることを示し、符号「Ｓ」は、ＩＭＰＤＨ２（Ｙ１２Ａ）を横から投影した粒子像であることを示している。
【0100】
図５の（Ａ）及び（Ｃ）に示すように、目的タンパク質であるＩＭＰＤＨ２（Ｙ１２Ａ）のみを含む試料では、特定の姿勢で気液界面に吸着しており、ＩＭＰＤＨ２（Ｙ１２Ａ）を上から投影された粒子像の数が多数を占めていた。一方、図５の（Ｂ）及び（Ｄ）に示すように、ＩＭＰＤＨ２（Ｙ１２Ａ）とＨＰＬＣ６ペプチドを含む試料では、ＩＭＰＤＨ２（Ｙ１２Ａ）を横や斜め上から投影した粒子像も観察された。
【0101】
よって、目的タンパク質とＨＰＬＣ６ペプチドを混合して用いることで、目的タンパク質が気液界面に衝突して吸着することを抑制して、様々な方向で投影された粒子像を数多く収集できることが確かめられた。
【0102】
［実施例６］
（不凍タンパク質以外の両親媒性タンパク質による目的タンパク質の非晶質カーボン膜への吸着抑制効果）
グリッド中の非晶質カーボン膜に吸着しやすい性質の目的タンパク質について、不凍タンパク質以外の両親媒性タンパク質と目的タンパク質の融合タンパク質を調製することで、非晶質カーボン膜への吸着を抑制し、目的タンパク質を観察領域全体に分散することを検討した。
（不凍タンパク質以外の両親媒性タンパク質による目的タンパク質の非晶質カーボン膜への吸着抑制効果）
グリッド中の非晶質カーボン膜に吸着しやすい性質の目的タンパク質について、不凍タンパク質以外の両親媒性タンパク質と目的タンパク質の融合タンパク質を調製することで、非晶質カーボン膜への吸着を抑制し、目的タンパク質を観察領域全体に分散することを検討した。
【0103】
１．融合タンパク質の発現及び精製
目的タンパク質としては、フェリチンを使用した。フェリチンの単量体のＮ末端に、不凍タンパク質以外の両親媒性タンパク質の一例としてのＫＡＬＡペプチドを含むアミノ酸配列（配列番号１１）からなるタンパク質を結合した融合タンパク質をコードする核酸を、プラスミドベクターｐＥＴ－２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に挿入した。この融合タンパク質では、リンカー配列（アミノ酸配列：配列番号８）を介して、フェリチンの単量体と、ＫＡＬＡペプチドを含むタンパク質とが連結されている。当該ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換した。発現誘導した大腸菌の可溶性画分から目的タンパク質をニッケルカラムにより精製、Ｈｉｓタグを切断後ゲルろ過カラムによりさらに精製した。
また、対照として、実施例３の「１．」で詳述した、両親媒性タンパク質の配列を含まない大腸菌発現系を用いて得られたフェリチンのみの試料も用意した。
目的タンパク質としては、フェリチンを使用した。フェリチンの単量体のＮ末端に、不凍タンパク質以外の両親媒性タンパク質の一例としてのＫＡＬＡペプチドを含むアミノ酸配列（配列番号１１）からなるタンパク質を結合した融合タンパク質をコードする核酸を、プラスミドベクターｐＥＴ－２８ａ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）に挿入した。この融合タンパク質では、リンカー配列（アミノ酸配列：配列番号８）を介して、フェリチンの単量体と、ＫＡＬＡペプチドを含むタンパク質とが連結されている。当該ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換した。発現誘導した大腸菌の可溶性画分から目的タンパク質をニッケルカラムにより精製、Ｈｉｓタグを切断後ゲルろ過カラムによりさらに精製した。
また、対照として、実施例３の「１．」で詳述した、両親媒性タンパク質の配列を含まない大腸菌発現系を用いて得られたフェリチンのみの試料も用意した。
【0104】
２．試料グリッドの作製
ＫＡＬＡペプチドが結合したフェリチンを含む試料、及びフェリチンのみを含む試料について、タンパク質濃度が２．０μＭとなるように、緩衝液（組成：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）で希釈して、実施例１の「２．」と同様の方法を用いて、試料の凍結グリッドを作製した。
ＫＡＬＡペプチドが結合したフェリチンを含む試料、及びフェリチンのみを含む試料について、タンパク質濃度が２．０μＭとなるように、緩衝液（組成：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）で希釈して、実施例１の「２．」と同様の方法を用いて、試料の凍結グリッドを作製した。
【0105】
３．クライオ電子顕微鏡による観察
上記「２．」で作製した各凍結グリッドを、クライオ電子顕微鏡（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｔａｌｏｓ Ａｒｃｔｉｃａ）に挿入し、加速電圧２００ｋＶにて観察、撮影した。
上記「２．」で作製した各凍結グリッドを、クライオ電子顕微鏡（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、Ｔａｌｏｓ Ａｒｃｔｉｃａ）に挿入し、加速電圧２００ｋＶにて観察、撮影した。
【0106】
【0107】
図６Ａに示すように、フェリチンのみを含む凍結グリッドでは、ホール中央にフェリチンが観察されず、ホール周辺の非晶質カーボン膜にフェリチンが吸着しており、フェリチンが観察領域全体に分散していなかった。
【0108】
これに対して、図６Ｂに示すように、ＫＡＬＡペプチドが結合したフェリチンを含む凍結グリッドでは、矢印で示したホール中央、及びホール周辺のいずれにも万遍なく融合タンパク質の粒子が分散していた。
【0109】
以上の結果から、不凍タンパク質以外の両親媒性タンパク質であっても、目的タンパク質がホール周辺の非晶質カーボン膜に吸着してしまうことを効果的に抑制できることが確認できた。本実施形態はＨＰＬＣ６以外のタンパク質、例えば他の両親媒性αヘリックス構造を有するタンパク質、その他の不凍タンパク質、およびその他の両親媒性タンパク質に応用可能であると考えられる。
【産業上の利用可能性】
【0110】
本実施形態のクライオ電子顕微鏡用試料によれば、試料中の目的タンパク質の電子線入射方向に対する望ましくない姿勢の偏り及び気液界面への衝突及び吸着が抑制されており、且つ、目的タンパク質が観察領域全体に分散したクライオ電子顕微鏡用試料が得られる。また、本実施形態のクライオ電子顕微鏡用試料によれば、試料の氷の厚みが均一に制御されたクライオ電子顕微鏡用試料が得られる。
【符号の説明】
【0111】
Ｓ…タンパク質を横から投影した粒子像、Ｔ…タンパク質を上から投影した粒子像
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【配列表】