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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024089860
(43)【公開日】2024-07-04
(54)【発明の名称】ＺＩＣ５発現を調節するための核酸複合体
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20240627BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240627BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20240627BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240627BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 Z ZNA
A61P35/00
A61K31/713
A61K31/7088
【審査請求】未請求
【請求項の数】22
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022205354
(22)【出願日】2022-12-22
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和３年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、次世代がん医療創生研究事業「がん治療における薬剤耐性阻害を目指した転写因子ＺＩＣ５標的ヘテロ二本鎖核酸（ＨＤＯ）の開発」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】592068200
【氏名又は名称】学校法人東京薬科大学
(71)【出願人】
【識別番号】515295979
【氏名又は名称】レナセラピューティクス株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110002572
【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】佐藤 礼子
(72)【発明者】
【氏名】深見 希代子
(72)【発明者】
【氏名】高木 鋼
(72)【発明者】
【氏名】木澤 秀樹
(72)【発明者】
【氏名】兼子 佳子
(72)【発明者】
【氏名】岡本 大司
(72)【発明者】
【氏名】布施 伸之
(72)【発明者】
【氏名】植原 渉
【テーマコード（参考）】
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZB26
(57)【要約】
【課題】本発明は、ＺＩＣ５遺伝子の転写産物及びタンパク質の発現を調節するための核酸複合体を提供する。
【解決手段】ＺＩＣ５遺伝子の転写産物及びタンパク質の発現を調節するための核酸複合体は、ＺＩＣ５特異的な発現の抑制剤又は阻害剤として働くためＺＩＣ５の機能解明に有用である。また、発明者らの研究によりメラノーマにおいてＺＩＣ５の発現を抑制すると、がん細胞の特徴である生体内増殖能が著しく低下することが明らかとされたことから、メラノーマの治療、改善またはその進行の遅延に有用である。本発明の核酸複合体は、ＺＩＣ５の発現を特異的に阻害するため、メラノーマの治療、改善またはその進行の遅延を、必要とする患者において行うことに有用である。
【選択図】なし
【解決手段】ＺＩＣ５遺伝子の転写産物及びタンパク質の発現を調節するための核酸複合体は、ＺＩＣ５特異的な発現の抑制剤又は阻害剤として働くためＺＩＣ５の機能解明に有用である。また、発明者らの研究によりメラノーマにおいてＺＩＣ５の発現を抑制すると、がん細胞の特徴である生体内増殖能が著しく低下することが明らかとされたことから、メラノーマの治療、改善またはその進行の遅延に有用である。本発明の核酸複合体は、ＺＩＣ５の発現を特異的に阻害するため、メラノーマの治療、改善またはその進行の遅延を、必要とする患者において行うことに有用である。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
１２～３０個の連結したヌクレオチドからなるアンチセンス鎖を含む核酸複合体であって、当該アンチセンス鎖は、配列番号２で表される核酸塩基配列の
１５－２８、１０９－１２２、１８０－１９３、２４９－２６２、５１６－５２９、６１５－６２８、６５４－６６７、９２４－９３７、１０６３－１０７６、１２４１－１２５４、１４２５－１４３８、１４９９－１５１２、１５３５－１５４８、１６６４－１６７７、１７１４―１７３２、１７１５―１７３２、１７１６―１７３２、１７１６―１７３５、１７１７―１７３２、１７１７―１７３４、１７１８―１７３２、１７１８―１７３３、１７１９－１７３２、１７１９―１７３２、１７１９―１７３３、１７１９―１７３５、１７１９―１７３６、１７１９―１７３７、１８５９－１８７２、１９０６－１９１９、１９２０－１９３３、１９６７－１９８０、１９９０－２００３、２０１０－２０２３、２０１６－２０２９、２０２８－２０４１、２０４３－２０５６、２０６２－２０７５、２１４１－２１５４、２１８６－２２０４、２１８７―２２０４、２１８８―２２０７、２１８９－２２０４、２１８９―２２０６、２１９０―２２０５、２１９１―２２０４、２１９１―２２０６、２１９１―２２０７、２１９１―２２０８、２１９１―２２０９、２１９１－２２０４、２１９１－２２０５、２３２２－２３３５、２３５５－２３６８、２３９１－２４０４、２４０６－２４１９、２４９８－２５１１、２５５１－２５６４、２５６８－２５８１、２６０４－２６１７、２６１８－２６３１、２６４０－２６５３、３２１８－３２３１又は３９７５－３９８８番目のヌクレオチド
とハイブリダイズすることが可能であり、かつ、ＺＩＣ５転写産物に対しアンチセンス効果を有する、核酸複合体。
１５－２８、１０９－１２２、１８０－１９３、２４９－２６２、５１６－５２９、６１５－６２８、６５４－６６７、９２４－９３７、１０６３－１０７６、１２４１－１２５４、１４２５－１４３８、１４９９－１５１２、１５３５－１５４８、１６６４－１６７７、１７１４―１７３２、１７１５―１７３２、１７１６―１７３２、１７１６―１７３５、１７１７―１７３２、１７１７―１７３４、１７１８―１７３２、１７１８―１７３３、１７１９－１７３２、１７１９―１７３２、１７１９―１７３３、１７１９―１７３５、１７１９―１７３６、１７１９―１７３７、１８５９－１８７２、１９０６－１９１９、１９２０－１９３３、１９６７－１９８０、１９９０－２００３、２０１０－２０２３、２０１６－２０２９、２０２８－２０４１、２０４３－２０５６、２０６２－２０７５、２１４１－２１５４、２１８６－２２０４、２１８７―２２０４、２１８８―２２０７、２１８９－２２０４、２１８９―２２０６、２１９０―２２０５、２１９１―２２０４、２１９１―２２０６、２１９１―２２０７、２１９１―２２０８、２１９１―２２０９、２１９１－２２０４、２１９１－２２０５、２３２２－２３３５、２３５５－２３６８、２３９１－２４０４、２４０６－２４１９、２４９８－２５１１、２５５１－２５６４、２５６８－２５８１、２６０４－２６１７、２６１８－２６３１、２６４０－２６５３、３２１８－３２３１又は３９７５－３９８８番目のヌクレオチド
とハイブリダイズすることが可能であり、かつ、ＺＩＣ５転写産物に対しアンチセンス効果を有する、核酸複合体。
【請求項2】
前記アンチセンス鎖は一本鎖オリゴヌクレオチドである請求項１に記載の核酸複合体。
【請求項3】
前記アンチセンス鎖と、前記アンチセンス鎖に相補的である核酸鎖からなるヘテロ二本鎖核酸である請求項１に記載の核酸複合体。
【請求項4】
前記アンチセンス鎖が少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１に記載の核酸複合体。
【請求項5】
前記アンチセンス鎖が少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチドを含む、請求項１に記載の核酸複合体。
【請求項6】
前記アンチセンス鎖が少なくとも１つのホスホジエステルヌクレオレオチドを含む、請求項１に記載の核酸複合体。
【請求項7】
前記アンチセンス鎖がホスホロチオエートヌクレオチドである、請求項５に記載の核酸複合体。
【請求項8】
前記アンチセンス鎖が修飾核酸塩基を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の核酸複合体。
【請求項9】
前記修飾ヌクレオチドが５－メチルシトシン、２’－ＭＯＥ、２’－ＯＭｅ、２’－Ｆ、ＢＮＡ、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ｓｃｐＢＮＡ、ｃＥｔ又はＡｍＮＡである、請求項８に記載の核酸複合体。
【請求項10】
前記アンチセンス鎖に相補的である核酸鎖がＲＮＡであることを特徴とする請求項３に記載の核酸複合体。
【請求項11】
前記アンチセンス鎖が：
複数の核酸からなる５’ウイング領域；
複数の核酸からなるギャップ領域；
複数の核酸からなる３’ウイング領域；
を含むことを特徴とする請求項２に記載の核酸複合体。
複数の核酸からなる５’ウイング領域；
複数の核酸からなるギャップ領域；
複数の核酸からなる３’ウイング領域；
を含むことを特徴とする請求項２に記載の核酸複合体。
【請求項12】
前記アンチセンス鎖に相補的である核酸鎖が：
複数の核酸からなる５’ウイング領域；
複数の核酸からなるギャップ領域；
複数の核酸からなる３’ウイング領域；
を含むことを特徴とする請求項３に記載の核酸複合体。
複数の核酸からなる５’ウイング領域；
複数の核酸からなるギャップ領域；
複数の核酸からなる３’ウイング領域；
を含むことを特徴とする請求項３に記載の核酸複合体。
【請求項13】
前記核酸複合体が標識機能、精製機能及び／又は標的への送達機能を有する機能性部分
を含む、請求項１に記載の核酸複合体。
を含む、請求項１に記載の核酸複合体。
【請求項14】
前記機能性部分が蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ等の化合物、ビオチン、アビジン、
Ｈｉｓタグペプチド、ＧＳＴタグペプチド、ｃＲＤＧペプチド、ＦＬＡＧタグペプチド等の化合物、受容体に結合する化合物、Ｓ１Ｐ受容体に結合する化合物、コレステロール、脂肪酸等の脂質、ビタミンＥ、トコフェロール類、トコトリエノール類、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＫ等の脂溶性ビタミン、アシルカルニチン、アシルＣｏＡ等の中間代謝物、糖脂質及びグリセリドから選択される化合物又はそれらの誘導体であることを特徴とする請求項１３に記載の核酸複合体。
Ｈｉｓタグペプチド、ＧＳＴタグペプチド、ｃＲＤＧペプチド、ＦＬＡＧタグペプチド等の化合物、受容体に結合する化合物、Ｓ１Ｐ受容体に結合する化合物、コレステロール、脂肪酸等の脂質、ビタミンＥ、トコフェロール類、トコトリエノール類、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＫ等の脂溶性ビタミン、アシルカルニチン、アシルＣｏＡ等の中間代謝物、糖脂質及びグリセリドから選択される化合物又はそれらの誘導体であることを特徴とする請求項１３に記載の核酸複合体。
【請求項15】
核酸複合体を標的部位にデリバリーする機能を有するリガンドを、リンカーを介して、又は介さずアンチセンス鎖に結合する、請求項２に記載の核酸複合体。
【請求項16】
核酸複合体を標的部位にデリバリーする機能を有するリガンドを、リンカーを介して、又は介さず前記アンチセンス鎖に相補的である核酸鎖に結合する、請求項３に記載の核酸複合体。
【請求項17】
請求項１に記載の核酸複合体を含む、ＺＩＣ５特異的な阻害剤。
【請求項18】
請求項１に記載の核酸複合体を含む、腫瘍細胞の悪性化抑制剤。
【請求項19】
請求項１に記載の核酸複合体を含む、メラノーマの治療に用いられる抗腫瘍剤。
【請求項20】
被験体に投与することにより、メラノーマ組織においてＺＩＣ５の発現量を調節するための二本鎖核酸複合体であって、
二本鎖核酸複合体は第１の核酸鎖と、第２の核酸鎖とを含み、
第１の核酸鎖は、少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む１２～３０個の連結したヌクレオチドからなるアンチセンス鎖を含み、
第２の核酸鎖は、少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む１２～３０個の連結したヌクレオチドと、機能性部分を含み、
機能性部分は標識機能、精製機能及び／又は標的への送達機能を有する、
さらに、
第１の核酸鎖は、第２の核酸鎖とＺＩＣ５ｍＲＮＡの両方に相補的な塩基配列を有する、二本鎖核酸複合体。
二本鎖核酸複合体は第１の核酸鎖と、第２の核酸鎖とを含み、
第１の核酸鎖は、少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む１２～３０個の連結したヌクレオチドからなるアンチセンス鎖を含み、
第２の核酸鎖は、少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む１２～３０個の連結したヌクレオチドと、機能性部分を含み、
機能性部分は標識機能、精製機能及び／又は標的への送達機能を有する、
さらに、
第１の核酸鎖は、第２の核酸鎖とＺＩＣ５ｍＲＮＡの両方に相補的な塩基配列を有する、二本鎖核酸複合体。
【請求項21】
前記機能性部分が蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ等の化合物、ビオチン、アビジン、
Ｈｉｓタグペプチド、ＧＳＴタグペプチド、ｃＲＤＧペプチド、ＦＬＡＧタグペプチド等の化合物、受容体に結合する化合物、Ｓ１Ｐ受容体に結合する化合物、コレステロール、脂肪酸等の脂質、ビタミンＥ、トコフェロール類、トコトリエノール類、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＫ等の脂溶性ビタミン、アシルカルニチン、アシルＣｏＡ等の中間代謝物、糖脂質及びグリセリドから選択される化合物又はそれらの誘導体であることを特徴とする請求項２０に記載の二本鎖核酸複合体。
Ｈｉｓタグペプチド、ＧＳＴタグペプチド、ｃＲＤＧペプチド、ＦＬＡＧタグペプチド等の化合物、受容体に結合する化合物、Ｓ１Ｐ受容体に結合する化合物、コレステロール、脂肪酸等の脂質、ビタミンＥ、トコフェロール類、トコトリエノール類、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＫ等の脂溶性ビタミン、アシルカルニチン、アシルＣｏＡ等の中間代謝物、糖脂質及びグリセリドから選択される化合物又はそれらの誘導体であることを特徴とする請求項２０に記載の二本鎖核酸複合体。
【請求項22】
核酸複合体を標的部位にデリバリーする機能を有するリガンドを、リンカーを介して、又は介さずアンチセンス鎖に結合する、請求項２０に記載の二本鎖核酸複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ジンクフィンガープロテイン５遺伝子（Ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ５、以下、ＺＩＣ５）の発現を調節するための核酸複合体に関する。また、本発明は、ＺＩＣ５遺伝子若しくは転写産物の発現の調節に関する。また、本発明は、ＺＩＣ５遺伝子の転写産物の発現を調節する作用を有する悪性黒色腫（メラノーマ）の治療薬に関する。
【背景技術】
【0002】
悪性黒色腫（メラノーマ）は、メラニン産生細胞であるメラノサイトががん化した悪性腫瘍である。早期発見により治癒が可能であるが、遠隔性転移を起こした症例における５年生存率は約１０％と低く、有効な治療法が確立されていない（例えば、非特許文献１参照。）。また、症例の約６０～７０％以上でＢＲＡＦＶ６００Ｅ遺伝子変異が確認されている。ＢＲＡＦ（ＭＡＰＫ経路のＭＡＰＫＫＫ）が下流のＭＥＫ（ＭＡＰＫ経路のＭＡＰＫＫ）をリン酸化して活性化し、活性化されたＭＥＫによりさらに下流のＥＲＫ（ＭＡＰＫ経路のＭＡＰＫ）がリン酸化されて活性化することにより、増殖、生存、浸潤、転移に関わる多くのタンパク質が活性化される（例えば、非特許文献２参照。）。ＢＲＡＦＶ６００Ｅの変異によりＢＲＡＦが恒常的かつ強力に活性化していることが、メラノーマの原因の１つであり、現在では、変異型ＢＲＡＦに対する選択的な阻害剤（ＰＬＸ４０３２、ｖｅｍｕｒａｆｅｎｉｂ）を用いた臨床試験が行われ、高い奏効率が確認されている。しかし、ＢＲＡＦ遺伝子のスプライシングバリアントの発現や、間質細胞から分泌される肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）の発現など、様々な機構により、ＢＲＡＦ阻害剤に対する薬剤耐性が生じ、その効果は限定的であることが報告されている（例えば、非特許文献３～５参照。）。
【0003】
上皮性のがんが転移能を獲得する原因の１つとして、上皮間葉形質転換（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ Ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ；ＥＭＴ）が知られている。ＥＭＴは、上皮系の細胞が間葉系細胞の形質を獲得する現象であり、ＥＭＴを生じると、上皮細胞間接着分子であるＥ－カドヘリンの発現量が減少することが知られている。また、ＥＭＴは、Ｓｎａｉｌ、Ｓｌｕｇ、Ｔｗｉｓｔなどの転写因子によって制御されていることが明らかになっており、これらの因子がＥ－カドヘリンなどの発現を制御し、ＥＭＴを引き起こすことが知られている（例えば、非特許文献６参照。）。
【0004】
メラノーマにおいても、転移のある症例で多くのＥＭＴ関連遺伝子の発現が変化しており、ＥＭＴプログラムの亢進が転移の原因の一つであることが示唆されている（例えば、非特許文献７参照。）。また、ＢＲＡＦ変異をもつメラノーマにおいて、ＢＲＡＦの恒常的活性化によりＺｅｂ１、Ｔｗｉｓｔ１などの転写因子が発現誘導され、これらの因子によるＥ－カドヘリンの発現抑制が生じ、メラノーマの増悪が引き起こされるというＥＭＴ様の現象が確認されている（例えば、非特許文献８参照。）。Ｅ－カドヘリンの発現レベルは多くのメラノーマにおいて低下しており、Ｅ－カドヘリンの発現が低下している症例において再発率が有意に上昇することが報告されている（例えば、非特許文献９参照。）。これらの知見から、Ｅ－カドヘリンの発現低下とメラノーマの増悪との関連が示唆されている。
【0005】
一方で、ＥＭＴはがんだけでなく、初期胚発生時にも必須の現象であり、原腸陥入や神経冠細胞の分化に関与している。神経冠細胞は、背側神経管の一部でＥＭＴを起こし、上皮組織から乖離することで移動能を獲得し、末梢神経系、グリア細胞、衛星細胞、メラノサイト、象牙芽細胞、頭蓋顔面軟骨などに分化する。神経冠細胞のＥＭＴにおいても、Ｓｎａｉｌ、Ｓｌｕｇ、Ｔｗｉｓｔなどの転写因子によりＥ－カドヘリンの発現低下が引き起こされている（例えば、非特許文献６及び１０参照。）。
【0006】
がん治療において、薬剤耐性がんの出現は根治を妨げる問題となる。薬剤耐性獲得を防ぐには、最初の治療薬投与時に高率でがん細胞死を引き起こす必要がある。また、既に既存薬に対して耐性が生じてしまった症例に対して、新たな薬剤の開発が望まれる。
【0007】
発明者の深見、佐藤らは、独自のスクリーニングにより、メラノーマの薬剤耐性を促進する転写因子としてＺＩＣ５を同定した（非特許文献１１参照。）。ＺＩＣ５は、正常ヒト組織においてはほとんど発現していないのに対し、様々な種類のがん組織に高発現している。また、メラノーマにおいてＺＩＣ５を発現抑制すると、生体内増殖能が著しく低下する。さらに、分子標的薬や抗がん剤により誘導されるメラノーマ細胞死の割合が著しく増加し、ほとんどが死滅する。既に薬剤耐性を獲得しているメラノーマ細胞に対しても転写因子ＺＩＣ５の阻害は有効であり、細胞死を誘導した。また、他の癌種においてもＺＩＣ５が増悪を促進することが明らかになっている（非特許文献１２参照。）。従って、ＺＩＣ５は「がん特異的標的分子」であり、ＺＩＣ５に対する薬剤は、がん細胞の薬剤耐性を減弱させ、がん細胞死を高率に引き起こすと想定される。発明者の深見、佐藤らは、ＺＩＣ５については、国立研究開発法人科学技術振興機構（ＪＳＴ）から国際特許出願している（特許文献１参照。）。
【0008】
しかしながら、ＺＩＣ５遺伝子の転写産物の発現を調節するアンチセンス鎖を持つ核酸複合体であって、ＺＩＣ５の発現阻害活性の強いものは未だ十分に得られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0009】
【特許文献1】ＷＯ２０１６／１７８３７４
【非特許文献】
【0010】
【非特許文献1】Ａａｍｄａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，２０１１，ｖｏｌ．４７，Ｓｕｐｐｌ ３，ｐ．Ｓ３３６－Ｓ３３７．
【非特許文献2】Ｃａｎｇｏｌ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｊｏｕｒｎａｌ，２００９，ｖｏｌ．２７７（１），ｐ．２－２７．
【非特許文献3】Ｐｏｕｌｉｋａｋｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１１，ｖｏｌ．４８０，ｐ．３８７－３９０．
【非特許文献4】Ｐｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ２０１１，ｖｏｌ．２９（１９），ｐ．２６７５－２６８２．
【非特許文献5】Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１１，ｖｏｌ．７１，ｐ．７１３７．
【非特許文献6】Ｔｈｉｅｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２００９，ｖｏｌ．１３９，ｐ．８７１－８９０．
【非特許文献7】Ａｌｏｎｓｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２００７，ｖｏｌ．６７（７），ｐ．３４５０－３４６０．
【非特許文献8】Ｃａｒａｍｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，２０１３，ｖｏｌ．２４，ｐ．４６６－４８０．
【非特許文献9】Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｄｅｒｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２００４，ｖｏｌ．１７，ｐ．９９０－９９７．
【非特許文献10】Ａｃｌｏｑｕｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，２００９，ｖｏｌ．１１９，ｐ．１４３８－１４４９．
【非特許文献11】Ｓａｔｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｓｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２０１７，ｖｏｌ．７７（２），ｐ．３６６－３７７
【非特許文献12】Ｓａｔｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｓｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１７，ｖｏｌ．１０８，ｐ．２４０５－２４１２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
本発明は、ＺＩＣ５遺伝子若しくは転写産物の抑制剤又は阻害剤を提供することを解決すべき課題とする。本発明は、ＺＩＣ５遺伝子若しくは転写産物の発現を調節する新規な核酸複合体を提供することを解決すべき課題とする。本発明は、被験体のがんの患部若しくはがん組織にデリバリー可能なリガンドを結合した核酸複合体からなるメラノーマ治療薬を提供することを解決すべき課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0012】
発明者らは、がんの悪性化に関連する遺伝子について研究を進めた結果、ＺＩＣ５がメラノーマの薬剤耐性を促進する転写因子であることを見出した。本発明では、ＺＩＣ５遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡの発現を低減させるための核酸複合体及び方法が課題を解決する手段として開示される。
【0013】
そのようなＺＩＣ５の阻害剤は、メラノーマの治療、予防、改善またはその進行の遅延を、必要とする患者において行うことに有用である。
【0014】
特定の実施形態において、核酸複合体は、１２～３０のオリゴヌクレオチドを含み、当該オリゴヌクレオチドがＺＩＣ５転写産物に対して相補的である核酸塩基配列を有する。
特定の実施形態において、核酸複合体のオリゴヌクレオチドはＤＮＡ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）からなる一本鎖オリゴヌクレオチドである。つまり、ＤＮＡからなる一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ：ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）である。
特定の実施形態において、核酸複合体のオリゴヌクレオチドはＤＮＡ（ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）からなる一本鎖オリゴヌクレオチドである。つまり、ＤＮＡからなる一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ：ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）である。
【0015】
また、特定の実施形態において、核酸複合体は、オリゴヌクレオチドからなるアンチセンス鎖と、前記アンチセンス鎖に相補的である核酸鎖からなるヘテロ二本鎖核酸（ＨＤＯ：Ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）である。
【0016】
特定の実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは修飾オリゴヌクレオチドを含む。ある実施形態において、修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチドと任意に修飾ヌクレオチドとを含んだ構成でよいし、全て修飾ヌクレオチドであってもよい。生体内で酵素による消化作用により核酸鎖の切断を防止するため、核酸間の結合を天然型の核酸よりも強固にする目的で、アンチセンスオリゴヌクレオチドは修飾ヌクレオチドを任意の場所に任意の数だけ含んでよい。
【0017】
本発明のＺＩＣ５転写因子の発現を調節する核酸複合体を有効成分として含む医薬組成物が治療薬としての用途を有する疾患は、メラノーマなどの癌である。
【0018】
「阻害剤（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）」とは、酸化反応、重合反応、あるいは生体内反応の反応速度を低下させる物質の総称である。例えば、ＺＩＣ５の阻害剤とは、生体内、生体内の組織若しくは細胞内で転写因子ＺＩＣ５の発現を低下、阻害、若しくは抑制する剤のことである。
【0019】
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］ １２～３０個の連結した核酸からなるアンチセンス鎖を含む核酸複合体であって、当該アンチセンス鎖は、配列番号２で表される核酸塩基配列の
１５－２８、１８０－１９３、２４９－２６２、５１６－５２９、６１５－６２８、６５４－６６７、９２４－９３７、１０６３－１０７６、１２４１－１２５４、１４９９－１５１２、１５３５－１５４８、１７１９－１７３２、１９２０－１９３３、１９６７－１９８０、２０１６－２０２９、２１９１－２２０４、１０９－１２２、１４２５－１４３８、１６６４－１６７７、１８５９－１８７２、１９０６－１９１９、１９９０－２００３、２０１０－２０２３、２０２８－２０４１、２０４３－２０５６、２０６２－２０７５、２１４１－２１５４、２３２２－２３３５、２３５５－２３６８、２３９１－２４０４、２４０６－２４１９、２４９８－２５１１、２５５１－２５６４、２５６８－２５８１、２６０４－２６１７、２６１８－２６３１、２６４０－２６５３、３２１８－３２３１、３９７５－３９８８、１７１９―１７３７、１７１９―１７３６、１７１９―１７３５、１７１９―１７３３、１７１８―１７３２、１７１７―１７３２、１７１６―１７３２、１７１５―１７３２、１７１４―１７３２、１７１８―１７３３、１７１７―１７３４、１７１６―１７３５、１７１９―１７３２、２１９１―２２０９、２１９１―２２０８、２１９１―２２０７、２１９１―２２０６、２１８７―２２０４、２１９０―２２０５、２１８９―２２０６、２１８８―２２０７又は２１９１―２２０４番目のヌクレオチドとハイブリダイズすることが可能であり、かつ、ＺＩＣ５転写産物に対しアンチセンス効果を有する、核酸複合体。
［２］前記アンチセンス鎖は一本鎖オリゴヌクレオチドである［１］に記載の核酸複合体。
［３］前記アンチセンス鎖と、前記アンチセンス鎖に相補的である核酸鎖からなるヘテロ２重鎖核酸である［１］に記載の核酸複合体。
［４］前記アンチセンス鎖が少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、［１］～［３］のいずれか１項に記載の核酸複合体。
［５］ 前記アンチセンス鎖が少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチドを含む、［１］～［４］のいずれか１項に記載の核酸複合体。
［６］ 前記アンチセンス鎖が少なくとも１つのホスホジエステルヌクレオレオチドを含む、［１］～［５］のいずれか１項に記載の核酸複合体。
［７］ 前記アンチセンス鎖がホスホロチオエートヌクレオチドである、［５］に記載の核酸複合体。
［８］ 前記アンチセンス鎖が修飾核酸塩基を含む、［１］～［７］のいずれか１項に記載の核酸複合体。
［９］前記修飾ヌクレオチドが５－メチルシトシン、２’－ＭＯＥ、２’－ＯＭｅ、２’－Ｆ、ＢＮＡ、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ｓｃｐＢＮＡ、ｃＥｔ又はＡｍＮＡである、［８］に記載の核酸複合体。
［１０］前記アンチセンス鎖に相補的である核酸鎖がＲＮＡであることを特徴とする［３］に記載の核酸複合体。
［１１］前記アンチセンス鎖が：
複数の核酸からなる５‘ウイング領域；
複数の核酸からなるギャップ領域；
複数の核酸からなる３‘ウイング領域；
を含むことを特徴とする［１］に記載の核酸複合体。
［１２］前記アンチセンス鎖が：
複数の核酸からなる５‘ウイング領域；
複数の核酸からなるギャップ領域；
複数の核酸からなる３‘ウイング領域；
を含むことを特徴とする［３］に記載の核酸複合体。
［１３］前記核酸複合体が標識機能、精製機能及び／又は標的への送達機能を有する機能性部分を含む、［１］に記載の核酸複合体。
［１４］前記機能性部分が蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ等の化合物、ビオチン、アビジン、Ｈｉｓタグペプチド、ＧＳＴタグペプチド、ｃＲＤＧペプチド、ＦＬＡＧタグペプチド等の化合物、受容体に結合する化合物、Ｓ１Ｐ受容体に結合する化合物、コレステロール、脂肪酸等の脂質、ビタミンＥ、トコフェロール類、トコトリエノール類、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＫ等の脂溶性ビタミン、アシルカルニチン、アシルＣｏＡ等の中間代謝物、糖脂質及びグリセリドから選択される化合物又はそれらの誘導体であることを特徴とする［１３］に記載の核酸複合体。
［１５］核酸複合体を標的部位にデリバリーする機能を有するリガンドを、リンカーを介して、又は介さずアンチセンス鎖に結合する、［２］に記載の核酸複合体。
［１６］核酸複合体を標的部位にデリバリーする機能を有するリガンドを、リンカーを介して、又は介さず前記アンチセンス鎖に相補的である核酸鎖に結合する、［３］に記載の核酸複合体。
［１７］ ［１］に記載の核酸複合体を含む、ＺＩＣ５特異的な阻害剤。
［１８］ ［１］に記載の核酸複合体を含む、腫瘍細胞の悪性化抑制剤。
［１９］ ［１］に記載の核酸複合体を含む、メラノーマの治療に用いられる抗腫瘍剤。
［２０］被験体に投与することにより、メラノーマ組織においてＺＩＣ５の発現量を調節するための二本鎖核酸複合体であって、
二本鎖核酸複合体は第１の核酸鎖と、第２の核酸鎖とを含み、
第１の核酸鎖は、少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む１２～３０個の連結したヌクレオチドからなるアンチセンス鎖を含み、
第２の核酸鎖は、少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む１２～３０個の連結したヌクレオチドと、機能性部分を含み、
機能性部分は標識機能、精製機能及び／又は標的への送達機能を有する、
さらに、
第１の核酸鎖は、第２の核酸鎖とＺＩＣ５ｍＲＮＡの両方に相補的な塩基配列を有する、二本鎖核酸複合体。
［２１］前記機能性部分が蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ等の化合物、ビオチン、アビジン、Ｈｉｓタグペプチド、ＧＳＴタグペプチド、ｃＲＤＧペプチド、ＦＬＡＧタグペプチド等の化合物、受容体に結合する化合物、Ｓ１Ｐ受容体に結合する化合物、コレステロール、脂肪酸等の脂質、ビタミンＥ、トコフェロール類、トコトリエノール類、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＫ等の脂溶性ビタミン、アシルカルニチン、アシルＣｏＡ等の中間代謝物、糖脂質及びグリセリドから選択される化合物又はそれらの誘導体であることを特徴とする［２０］に記載の二本鎖核酸複合体。
［２２］核酸複合体を標的部位にデリバリーする機能を有するリガンドを、リンカーを介して、又は介さずアンチセンス鎖に結合する、［２０］に記載の二本鎖核酸複合体。
［１］ １２～３０個の連結した核酸からなるアンチセンス鎖を含む核酸複合体であって、当該アンチセンス鎖は、配列番号２で表される核酸塩基配列の
１５－２８、１８０－１９３、２４９－２６２、５１６－５２９、６１５－６２８、６５４－６６７、９２４－９３７、１０６３－１０７６、１２４１－１２５４、１４９９－１５１２、１５３５－１５４８、１７１９－１７３２、１９２０－１９３３、１９６７－１９８０、２０１６－２０２９、２１９１－２２０４、１０９－１２２、１４２５－１４３８、１６６４－１６７７、１８５９－１８７２、１９０６－１９１９、１９９０－２００３、２０１０－２０２３、２０２８－２０４１、２０４３－２０５６、２０６２－２０７５、２１４１－２１５４、２３２２－２３３５、２３５５－２３６８、２３９１－２４０４、２４０６－２４１９、２４９８－２５１１、２５５１－２５６４、２５６８－２５８１、２６０４－２６１７、２６１８－２６３１、２６４０－２６５３、３２１８－３２３１、３９７５－３９８８、１７１９―１７３７、１７１９―１７３６、１７１９―１７３５、１７１９―１７３３、１７１８―１７３２、１７１７―１７３２、１７１６―１７３２、１７１５―１７３２、１７１４―１７３２、１７１８―１７３３、１７１７―１７３４、１７１６―１７３５、１７１９―１７３２、２１９１―２２０９、２１９１―２２０８、２１９１―２２０７、２１９１―２２０６、２１８７―２２０４、２１９０―２２０５、２１８９―２２０６、２１８８―２２０７又は２１９１―２２０４番目のヌクレオチドとハイブリダイズすることが可能であり、かつ、ＺＩＣ５転写産物に対しアンチセンス効果を有する、核酸複合体。
［２］前記アンチセンス鎖は一本鎖オリゴヌクレオチドである［１］に記載の核酸複合体。
［３］前記アンチセンス鎖と、前記アンチセンス鎖に相補的である核酸鎖からなるヘテロ２重鎖核酸である［１］に記載の核酸複合体。
［４］前記アンチセンス鎖が少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、［１］～［３］のいずれか１項に記載の核酸複合体。
［５］ 前記アンチセンス鎖が少なくとも１つのホスホロチオエートヌクレオチドを含む、［１］～［４］のいずれか１項に記載の核酸複合体。
［６］ 前記アンチセンス鎖が少なくとも１つのホスホジエステルヌクレオレオチドを含む、［１］～［５］のいずれか１項に記載の核酸複合体。
［７］ 前記アンチセンス鎖がホスホロチオエートヌクレオチドである、［５］に記載の核酸複合体。
［８］ 前記アンチセンス鎖が修飾核酸塩基を含む、［１］～［７］のいずれか１項に記載の核酸複合体。
［９］前記修飾ヌクレオチドが５－メチルシトシン、２’－ＭＯＥ、２’－ＯＭｅ、２’－Ｆ、ＢＮＡ、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ｓｃｐＢＮＡ、ｃＥｔ又はＡｍＮＡである、［８］に記載の核酸複合体。
［１０］前記アンチセンス鎖に相補的である核酸鎖がＲＮＡであることを特徴とする［３］に記載の核酸複合体。
［１１］前記アンチセンス鎖が：
複数の核酸からなる５‘ウイング領域；
複数の核酸からなるギャップ領域；
複数の核酸からなる３‘ウイング領域；
を含むことを特徴とする［１］に記載の核酸複合体。
［１２］前記アンチセンス鎖が：
複数の核酸からなる５‘ウイング領域；
複数の核酸からなるギャップ領域；
複数の核酸からなる３‘ウイング領域；
を含むことを特徴とする［３］に記載の核酸複合体。
［１３］前記核酸複合体が標識機能、精製機能及び／又は標的への送達機能を有する機能性部分を含む、［１］に記載の核酸複合体。
［１４］前記機能性部分が蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ等の化合物、ビオチン、アビジン、Ｈｉｓタグペプチド、ＧＳＴタグペプチド、ｃＲＤＧペプチド、ＦＬＡＧタグペプチド等の化合物、受容体に結合する化合物、Ｓ１Ｐ受容体に結合する化合物、コレステロール、脂肪酸等の脂質、ビタミンＥ、トコフェロール類、トコトリエノール類、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＫ等の脂溶性ビタミン、アシルカルニチン、アシルＣｏＡ等の中間代謝物、糖脂質及びグリセリドから選択される化合物又はそれらの誘導体であることを特徴とする［１３］に記載の核酸複合体。
［１５］核酸複合体を標的部位にデリバリーする機能を有するリガンドを、リンカーを介して、又は介さずアンチセンス鎖に結合する、［２］に記載の核酸複合体。
［１６］核酸複合体を標的部位にデリバリーする機能を有するリガンドを、リンカーを介して、又は介さず前記アンチセンス鎖に相補的である核酸鎖に結合する、［３］に記載の核酸複合体。
［１７］ ［１］に記載の核酸複合体を含む、ＺＩＣ５特異的な阻害剤。
［１８］ ［１］に記載の核酸複合体を含む、腫瘍細胞の悪性化抑制剤。
［１９］ ［１］に記載の核酸複合体を含む、メラノーマの治療に用いられる抗腫瘍剤。
［２０］被験体に投与することにより、メラノーマ組織においてＺＩＣ５の発現量を調節するための二本鎖核酸複合体であって、
二本鎖核酸複合体は第１の核酸鎖と、第２の核酸鎖とを含み、
第１の核酸鎖は、少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む１２～３０個の連結したヌクレオチドからなるアンチセンス鎖を含み、
第２の核酸鎖は、少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含む１２～３０個の連結したヌクレオチドと、機能性部分を含み、
機能性部分は標識機能、精製機能及び／又は標的への送達機能を有する、
さらに、
第１の核酸鎖は、第２の核酸鎖とＺＩＣ５ｍＲＮＡの両方に相補的な塩基配列を有する、二本鎖核酸複合体。
［２１］前記機能性部分が蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ等の化合物、ビオチン、アビジン、Ｈｉｓタグペプチド、ＧＳＴタグペプチド、ｃＲＤＧペプチド、ＦＬＡＧタグペプチド等の化合物、受容体に結合する化合物、Ｓ１Ｐ受容体に結合する化合物、コレステロール、脂肪酸等の脂質、ビタミンＥ、トコフェロール類、トコトリエノール類、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＫ等の脂溶性ビタミン、アシルカルニチン、アシルＣｏＡ等の中間代謝物、糖脂質及びグリセリドから選択される化合物又はそれらの誘導体であることを特徴とする［２０］に記載の二本鎖核酸複合体。
［２２］核酸複合体を標的部位にデリバリーする機能を有するリガンドを、リンカーを介して、又は介さずアンチセンス鎖に結合する、［２０］に記載の二本鎖核酸複合体。
【発明の効果】
【0020】
本発明の１２～３０個の連結した核酸からなるＺＩＣ５転写産物の部分配列に対するアンチセンス鎖を含む核酸複合体は、相補的な塩基配列を含み、ＺＩＣ５転写産物の当該センス部分とハイブリダイズすることが可能であり、かつ、ＺＩＣ５転写産物に対しアンチセンス効果を有する。さらには、本発明の核酸複合体はメラノーマの治療に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【0021】
【発明を実施するための形態】
【0022】
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明は、１２～３０のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含み、当該オリゴヌクレオチドがＺＩＣ５遺伝子の転写産物の特定の核酸塩基サイトに対して相補的である核酸塩基配列を有する核酸複合体である。ＺＩＣ５遺伝子の転写産物に対して相補的である核酸塩基配列を有する核酸はＺＩＣ５遺伝子の転写産物に対してアンチセンス核酸として作用する。すなわち、ＺＩＣ５転写産物又は遺伝子の特異的な阻害剤として作用し、標的遺伝子であるＺＩＣ５遺伝子の発現、又は通常転写産物レベルをアンチセンス効果によって抑制する活性を有する。
本発明は、１２～３０のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含み、当該オリゴヌクレオチドがＺＩＣ５遺伝子の転写産物の特定の核酸塩基サイトに対して相補的である核酸塩基配列を有する核酸複合体である。ＺＩＣ５遺伝子の転写産物に対して相補的である核酸塩基配列を有する核酸はＺＩＣ５遺伝子の転写産物に対してアンチセンス核酸として作用する。すなわち、ＺＩＣ５転写産物又は遺伝子の特異的な阻害剤として作用し、標的遺伝子であるＺＩＣ５遺伝子の発現、又は通常転写産物レベルをアンチセンス効果によって抑制する活性を有する。
【0023】
ＺＩＣ５遺伝子の転写産物とは、ＺＩＣ５遺伝子をコードするゲノムＤＮＡから転写されたｍＲＮＡのことであり、塩基の修飾を受けていないｍＲＮＡや、スプライシングを受けていないｍＲＮＡ前駆体等も含まれる。通常、「転写産物」は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって合成される、いかなるＲＮＡであってもよい。
【0024】
本発明において「核酸複合体」とは、標的遺伝子、その転写産物又はその翻訳産物の発現又は編集を調節する核酸分子のことである。当該核酸分子の例としては、標的遺伝子又はその転写産物に相補的な核酸配列を有しアンチセンス活性を有する核酸分子が挙げられる。当該核酸分子は、より具体的には、一本鎖アンチセンス鎖（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＡＳＯ）、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、アンチセンス二本鎖核酸（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＡＤＯ）、ヘテロ二本鎖核酸（Ｈｅｔｅｒｏ－ｄｕｐｌｅｘ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＨＤＯ）が挙げられる。
【0025】
特定の実施形態において、核酸複合体のオリゴヌクレオチドは一本鎖オリゴヌクレオチドである。つまり、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ：ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）である。
【0026】
また、特定の実施形態において、核酸複合体は、オリゴヌクレオチドからなるアンチセンス鎖と、前記アンチセンス鎖に相補的である核酸鎖であるセンス鎖からなるヘテロ２重鎖核酸（ＨＤＯ：Ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）であり、アンチセンス鎖がセンス鎖核酸鎖にアニーリングしている。アンチセンス鎖を第１の核酸鎖と呼び、センス鎖を第２の核酸鎖と呼ぶことがある。このような核酸複合体を２重鎖核酸複合体という。
【0027】
また、特定の実施形態において、核酸複合体は、製造時は一本鎖のオリゴヌクレオチドであって、ＤＮＡヌクレオチド若しくはＤＮＡヌクレオチドアナログからなるアンチセンス鎖と、３～１０ヌクレオチドからなるリンカー部分と、前記アンチセンス鎖に相補的であるＲＮＡヌクレオチド若しくはＲＮＡヌクレオチドアナログからなるセンス鎖を含む構造であってもよい。この構造の核酸複合体は一本鎖ヘテロ二本鎖（ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ：ｓｓ－ＨＤＯ）と言われるものであり、例えば、ＷＯ２０１７／１３１１２４Ａ１に記載されているＸ－Ｌ－Ｙの構造からなるオリゴヌクレオチドである。Ｘはアンチセンス鎖で、Ｙはアンチセンス鎖に対する相補鎖で、Ｌがリンカーの役割をするヌクレオチドからなる。この一本鎖オリゴヌクレオチドを医薬組成物として用いる際は、生理食塩水や水性注射剤、非水性注射剤、懸濁性注射剤、固形注射剤等に用いられる溶媒若しくは血液または血漿中でアンチセンス鎖と、アンチセンス鎖に対する相補鎖がリンカーを支点として一分子アニーリングして２重鎖構造をとる。このような核酸複合体は、医薬組成物として作用するときは一分子アニーリングして２重鎖構造をとるため、２重鎖核酸複合体の一つである。
【0028】
本発明のＺＩＣ５転写産物又は遺伝子特異的な阻害剤を含む医薬組成物を実施するためのヘテロ２重鎖核酸（ＨＤＯ）の基本的な形態は以下に述べるものである。すなわち、ＨＤＯは活性本体であるＤＮＡで構成されるアンチセンス鎖（Ａｃｔｉｖｅ鎖）と、それと相補的な配列を有するＲＮＡで主に構成されるセンス鎖（Ｃａｒｒｉｅｒ鎖）との２本鎖で構成される。さらにＨＤＯはそのセンス鎖にリガンド構造を含むことを特徴とする。このような形態を持つことによりＺＩＣ５転写産物又は遺伝子特異的な阻害剤を含む医薬組成物はヒトにおける血中での安定性が高く、リガンドの性能に応じた標的組織に効率よくデリバリーされる。ＨＤＯが細胞内に送達された後にはＲＮａｓｅ Ｈにより速やかにＲＮＡ鎖が分解され除かれる。そこでフリーになったＤＮＡ鎖とｍＲＮＡとの間で新たに２本鎖構造を形成し、細胞内ＲＮａｓｅ Ｈの作用によりｍＲＮＡが分解されることでノックダウン作用が発揮される。
【0029】
特定の実施形態において、核酸複合体は、１２～３０のオリゴヌクレオチドを含み、当該オリゴヌクレオチドがＺＩＣ５遺伝子の転写産物に対して相補的である核酸塩基配列を有する。
【0030】
本発明の核酸複合体のアンチセンス鎖であるオリゴヌクレオチドは、ＺＩＣ５遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡを標的とする。該アンチセンス鎖の塩基配列は、ヒトＺＩＣ５遺伝子の塩基配列中の部分配列に相補的である。ヒトＺＩＣ５転写産物の塩基配列を配列番号１（ＮＭ＿０３３１３２．４）、配列番号２（ＮＭ＿０３３１３２．５）に表す。すなわち、本発明の１２～３０のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを含み、当該オリゴヌクレオチドがＺＩＣ５転写産物に対して相補的である核酸塩基配列は、ヒトＺＩＣ５遺伝子の塩基配列中の部分配列に相補的である配列である。
【0031】
「アンチセンス効果」とは、核酸分子のアンチセンス鎖が、標的遺伝子又はその転写産物（ＲＮＡセンス鎖）にハイブリダイズすることによって、標的遺伝子又はその転写産物にもたらされる発現又は編集を調節する効果をいう。
【0032】
「調節」とは、「標的遺伝子の発現を調節する」とか、「標的転写産物の発現を調節する」といった説明で使用され、標的遺伝子の発現又は標的転写産物の発現量（本明細書では、「標的転写産物の発現量」をしばしば「標的転写産物のレベル」と表記する）の抑制又は低下、亢進、翻訳の阻害、翻訳産物の機能阻害、ＲＮＡスプライシング制御（例えばスプライシングスイッチ、エクソンインクルージョン、エクソンスキッピング等）、転写産物の分解、又は標的遺伝子のタンパク質への結合の阻害を意味する。
【0033】
ある実施態様では、アンチセンス効果はハイブリダイゼーションにより前記転写産物を被覆することによって生じ得る翻訳の阻害又はエクソンスキッピング等のスプライシング機能変換効果、及び／又は、ハイブリダイズした部分が認識されることにより生じ得る前記転写産物の分解によって生じる、前記抑制を意味する。また別の実施態様では、アンチセンス効果は、標的遺伝子又は転写産物のエクソンインクルージョンにおいて、エクソンスキッピングとは逆に遺伝子の異常によりｍＲＮＡから排除されてしまうエクソンをアンチセンスの作用によりｍＲＮＡに組み込むことによって生じる、正常なｍＲＮＡの発現の亢進を意味する。
【0034】
例えば、標的遺伝子の転写後阻害では、ＡＳＯとしてＲＮＡオリゴヌクレオチドが細胞に導入されると、ＡＳＯは標的遺伝子の転写産物であるｍＲＮＡとアニーリングによって部分的二本鎖を形成する。この部分的二本鎖はリボソームによる翻訳を妨げるためのカバーとしての役割を果たし、それによって標的遺伝子にコードされた標的タンパク質の発現が翻訳レベルで阻害される（ステリックブロッキング）。一方、ＡＳＯとしてＤＮＡを含むオリゴヌクレオチドが細胞に導入されると、部分的ＤＮＡ－ＲＮＡヘテロ二本鎖が形成される。このヘテロ二本鎖構造がＲＮａｓｅによって認識される結果、標的遺伝子のｍＲＮＡが分解され、標的遺伝子にコードされたタンパク質の発現が発現レベルで阻害される。さらに、アンチセンス効果は、ｍＲＮＡ前駆体におけるイントロンを標的としてももたらされ得る。一実施形態で、標的転写産物の発現調節は、標的転写産物量の低下であってもよい。
【0035】
例えば、アンチセンス鎖を持つ核酸分子としてＡＤＯを使用する場合、細胞内でＤＮＡ二本鎖は、ＤＮＡヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）によって切断された後、ＤＮＡアンチセンス鎖は標的ＲＮＡにハイブリダイズし二本鎖を形成した後、標的ＲＮＡはＲＮａｓｅにより分解される、このサイクルを繰り返すことにより標的ＲＮＡの発現の阻害や標的ＲＮＡの作用抑制などを行う。また、別の実施態様では、ＡＤＯのＤＮＡ二本鎖がＤＮＡヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）によって切断された後、ＤＮＡアンチセンス鎖が標的ＲＮＡにハイブリダイズした後、標的ＲＮＡの転写または翻訳の阻害やエクソンスキッピング等のＲＮＡスプライシングの制御により標的遺伝子の発現抑制や発現亢進などを行う。
【0036】
例えば、アンチセンス鎖を持つ核酸分子としてＨＤＯを使用する場合、細胞内でＨＤＯのＲＮＡからなる相補鎖がＲＮａｓｅによって切断された後、ＤＮＡアンチセンス鎖は、標的ＲＮＡにハイブリダイズし二本鎖を形成した後、標的ＲＮＡがＲＮａｓｅにより分解される、このサイクルを繰り返すことにより標的ＲＮＡの発現の阻害や標的ＲＮＡの作用抑制などを行う。また、細胞内でＨＤＯのＲＮＡ相補鎖がＲＮａｓｅによって切断された後、ＤＮＡアンチセンス鎖が標的ＲＮＡにハイブリダイズし、標的ＲＮＡの転写または翻訳の阻害やエクソンスキッピング等のＲＮＡスプライシングの制御によって、標的遺伝子の発現抑制や発現亢進などを行う。
【0037】
例えば、アンチセンス鎖を持つ核酸分子としてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を使用する場合、ＲＮＡｉは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を利用する機序を介した、アンチセンス媒介性遺伝子サイレンシングを指す。ＲＮＡｉの例としては、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ等が挙げられる。
【0038】
特定のアンチセンス鎖を持つ核酸分子は、ｐｒｅ－ｍＲＮＡのスプライシングを変更する。特定の機序にかかわらず、配列特異性は、アンチセンス鎖を持つ核酸分子を、標的の検証及び遺伝子の機能化のためのツールとして、また、疾患の病因に関与する遺伝子の発現を選択的に調節する治療薬として使用される。
【0039】
アンチセンス鎖の鎖長としては特に制限はないが、少なくとも８塩基、例えば８～４０塩基であり、好ましくは１２～３０塩基であり、より好ましくは１２～２５塩基であり、又は１３～２０塩基である。ある場合においては、通常、前記標的に対する核酸鎖によるアンチセンス効果の強さや、費用、合成収率等の他の要素に応じて、鎖長は選択される。二本鎖核酸の場合においては、鎖長は、好ましくは二本鎖のＴｍ値が５０℃以上、さらに好ましくは６０℃以上となる鎖長から選択してもよい。
【0040】
二本鎖核酸の場合、相補鎖の鎖長は、アンチセンス鎖と同じであってもよい。その場合、少なくとも８塩基、例えば８～４０塩基であり、好ましくは１２～３０塩基であり、より好ましくは１２～２５塩基であり、又は１３～２０塩基である。また、アンチセンス核酸鎖の鎖長に対して数塩基、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８又は９塩基から十数塩基、例えば、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８又は１９塩基長くても短くてもよい。
【0041】
「ハイブリダイゼーション」とは、物の交雑あるいは雑種掲載のことであり、ＤＮＡまたはＲＮＡといった核酸の分子が相補的に複合体を形成することをハイブリダイゼーションという。
【0042】
「ハイブリダイズする」とは、ハイブリダイゼーションを形成するという意味である。例えば、ある核酸鎖と、相補的な配列を有する核酸鎖は、ハイブリダイズするといった表現で使用される。
【0043】
本発明の核酸複合体のアンチセンス鎖は、標的転写産物の全部又は一部の塩基配列に相補的であることから標的転写産物にハイブリダイズ（又はアニール）することができる。塩基配列の相補性は、ＢＬＡＳＴプログラム等を使用することによって決定することができる。
【0044】
当業者であれば、鎖間の相補度を考慮して、２本の鎖がハイブリダイズし得る条件（温度、塩濃度等）を容易に決定することができる。さらに、当業者であれば、例えば標的遺伝子の塩基配列の情報に基づいて、標的転写産物に相補的なアンチセンス核酸を容易に設計することもできる。ハイブリダイゼーション条件は、例えば、低ストリンジェントな条件及び高ストリンジェントな条件等の様々なストリンジェントな条件であってもよい。低ストリンジェントな条件は、比較的低温で、かつ高塩濃度の条件、例えば、３０℃、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳであってよい。高ストリンジェントな条件は、比較的高温で、かつ低塩濃度の条件、例えば、６５℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳであってよい。温度及び塩濃度等の条件を変えることによって、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを調整できる。ここで、１×ＳＳＣは、１５０ｍＭ塩化ナトリウム及び１５ｍＭクエン酸ナトリウムを含む。
【0045】
「相補的」又は「相補性」とは、水素結合を介して、いわゆるワトソン－クリック型塩基対（天然型塩基対）や非ワトソン－クリック型塩基対（フーグスティーン型塩基対等）を形成できる関係のことを意味する。アンチセンス鎖の十分な数の核酸塩基が、標的遺伝子又は標的転写産物の対応する核酸塩基と水素結合し得る場合、アンチセンス鎖及び標的遺伝子又は標的転写産物は互いに相補的であるので、所望のアンチセンス効果が生じる。アンチセンス鎖と標的遺伝子又は標的転写産物との間の非相補的核酸塩基は、アンチセンス鎖が標的核酸に特異的にハイブリダイズできるという条件で許容され得る。さらに、アンチセンス鎖は標的遺伝子又は標的転写産物の１つ以上のセグメントに対してハイブリダイズでき、それにより介入する又は隣接するセグメントはハイブリダイゼーション事象（例えば、ループ構造、ミスマッチ又はヘアピン構造）に関与しない。当該アンチセンス鎖は、標的遺伝子又は標的転写産物の配列に対して相補的であると言える。相補的であるとは、アンチセンス鎖が標的遺伝子又は標的転写産物に結合できる程度に相補的であればよく、例えば、８０％以上、９０％以上、又は９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、若しくは９９％以上相補的であればよい。１００％相補的であってもよい。０～４個程度のミスマッチがあってもよい。
【0046】
特定の実施形態において、本明細書に提供されているアンチセンス鎖は標的核酸配列に対して８０～１００％、好ましくは９０～１００％、より好ましくは９５～１００％、若しくは１００％相補的である。標的核酸配列に対するアンチセンス鎖の相補性の割合は慣例の方法を使用して求められ得る。
【0047】
例えば、アンチセンス鎖の２０核酸塩基のうちの１６が標的領域に対して相補的であり、したがって特異的にハイブリダイズするアンチセンス鎖は８０％の相補性を表す。この例において、残りの非相補的核酸塩基には、相補的核酸塩基が集まり得る又は散在し得、これらの非相補的核酸塩基は互いに又は相補的核酸塩基に隣接している必要はない。例えば、標的核酸と完全な相補性の２つの領域の隣に４つの非相補的核酸塩基を有する１８核酸塩基長であるアンチセンス鎖は、標的核酸に対して１４が標的領域に対して相補的であるから７７．８％の全体の相補性を有するので、本発明の範囲内である。標的核酸の領域に対するアンチセンス鎖の相補性の割合は、当該技術分野において公知のＢＬＡＳＴプログラム等によって求めることができる。
【0048】
ある実施形態においては、第１の核酸鎖は、標的遺伝子の転写産物等の標的転写産物に相補的なアンチセンス核酸であって、第１の核酸鎖が前記転写産物にハイブリダイズした際に、少なくとも４つの連続したヌクレオチドを含む領域を有する核酸である。
【0049】
ここでは、「核酸」とはモノマーヌクレオチドを意味する場合もあり、複数のモノマーから構成されるオリゴヌクレオチドを意味する場合もある。「核酸鎖」という文言は、ここではオリゴヌクレオチドを称するためにも用いられる。核酸鎖は、その全部又は一部を、自動合成機の使用といった化学合成法によって調製してもよく、ポリメラーゼ、ライゲース又は制限酵素反応に限定されるわけではないが、酵素処理により調製してもよい。
【0050】
第１の核酸鎖の鎖長としては特に制限はないが、１２～３０塩基であり、１２～２５塩基であり、又は１３～２０塩基である。ある場合においては、通常、前記標的に対する核酸鎖によるアンチセンス効果の強さや、費用、合成収率等の他の要素に応じて、鎖長は選択される。
【0051】
第２の核酸鎖の鎖長は、第１の核酸鎖と同じであってもよい。その場合、１２～３０塩基であり、１２～２５塩基であり、又は１３～２０塩基である。また、第１の核酸鎖の鎖長に対して数塩基から十数塩基長くても短くてもよい。
【0052】
「ＲＮａｓｅＨによって認識される少なくとも４つの連続したヌクレオチド」は、通常、４～２０塩基の連続したヌクレオチドを含む領域であり、５～１６塩基の連続したヌクレオチドを含む領域であり、又は、６～１２塩基の連続しヌクレオチドを含む領域である。また、この領域には、天然型ＤＮＡのような、ＲＮＡヌクレオチドにハイブリダイズした際に、ＲＮＡ鎖を切断するＲＮａｓｅＨによって認識されるヌクレオチドを用いることができる。修飾されたＤＮＡヌクレオチド及び他の塩基といった、好適なヌクレオチドは、この分野において知られている。また、ＲＮＡヌクレオチドのような、２’位にヒドロキシ基を有するヌクレオチドは、不適当であることも知られている。「少なくとも４つの連続したヌクレオチド」を含むこの領域への利用に関し、当業者であればヌクレオチドの適合性を容易に決定することができる。
【0053】
ある実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはアンチセンス鎖は、修飾ヌクレオチドを含む。
【0054】
ある実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドと任意に修飾ヌクレオチドとを含んだ構成でよいし、全て修飾ヌクレオチドであってもよい。生体内で酵素による消化作用により核酸鎖の切断を防止するため、核酸間の結合を天然型の核酸よりも強固にする目的で、アンチセンスオリゴヌクレオチドは修飾ヌクレオチドを任意の場所に任意の数だけ含んでよい。
【0055】
ある実施形態において、第１の核酸鎖は「ヌクレオチド及び任意にヌクレオチドアナログ」を含む。この文言は、第１の核酸鎖は、ＤＮＡヌクレオチド、ＲＮＡヌクレオチドを有し、また当該核酸鎖において任意にヌクレオチドアナログを更に有していてもよいということを意味する。
【0056】
ここで「ＤＮＡヌクレオチド」は、天然に存在するＤＮＡヌクレオチド、又はその塩基、糖若しくはリン酸塩結合のサブユニットが修飾されているＤＮＡヌクレオチドを意味する。同様に、「ＲＮＡヌクレオチド」は、天然に存在するＲＮＡヌクレオチド、又はその塩基、糖若しくはリン酸塩結合のサブユニットが修飾されているＲＮＡヌクレオチドを意味する。塩基、糖又はリン酸塩結合のサブユニットの修飾とは、１の置換基の付加、又は、サブユニット内における１の置換のことであり、サブユニット全体を異なる化学基に置換することではない。ヌクレオチドを含む領域の一部又は全部は、ＤＮＡ分解酵素等に対する耐性が高いという観点から、ＤＮＡは修飾されたヌクレオチドであってもよい。
【0057】
また、「修飾ヌクレオチド」とは、修飾されたヌクレオチドを意味する。このような修飾ヌクレオチドとしては、例えば、シトシンの５－メチル化、５－フルオロ化、５－ブロモ化、５－ヨード化、Ｎ４－メチル化、チミジンの５－デメチル化、５－フルオロ化、５－ブロモ化、５－ヨード化、アデニンのＮ６－メチル化、８－ブロモ化、グアニンのＮ２－メチル化、８－ブロモ化、ホスホロチオエート化、メチルホスホネート化、メチルチオホスホネート化、キラル－メチルホスホネート化、ホスホロジチオエート化、ホスホロアミデート化、２’－Ｏ－メチル化、２’－メトキシエチル（ＭＯＥ）化、２’－アミノプロピル（ＡＰ）化、２’－フルオロ化が挙げられるが、体内動態に優れているという観点から、ホスホロチオエート化が好ましい。さらに、かかる修飾は同一のＤＮＡに対して、複数種組み合わせて施されていてもよい。また、後述の通り、同様の効果を奏するために、ＲＮＡヌクレオチドに修飾を施してもよい。ホスホロチオエート化されているヌクレオチドをホスホロチオエートヌクレオチドといい、ホスホロチオエート結合を形成する。また、ホスホジエステル結合を形成するヌクレオチドをホスホジエステルヌクレオチドという。
【0058】
ある場合において、修飾されたＤＮＡの数や位置によっては、ここで開示する二本鎖核酸が奏するアンチセンス効果等に影響を与えることになるかもしれない。これらの態様は、標的遺伝子の配列等によっても異なるため、一概には言えないが、当業者であれば、後記のアンチセンス法に関する文献の記載を参酌しながら、決定することができる。また、修飾後の二本鎖核酸複合体が有するアンチセンス効果を測定し、得られた測定値が、修飾前の二本鎖核酸複合体のそれよりも有意に低下していなければ（例えば、修飾後の二本鎖核酸複合体の測定値が修飾前の二本鎖核酸複合体の測定値の３０％以上であれば）、当該修飾は評価することができる。アンチセンス効果の測定は、例えば、後述の実施例において示されているような、細胞等に被検核酸化合物を導入し、該被検核酸化合物が奏するアンチセンス効果によって抑制された該細胞等における標的遺伝子の発現量（ｍＲＮＡ量、ｃＤＮＡ量、タンパク質量等）を、ノザンブロッティング、定量的ＰＣＲ、ウェスタンブロッティング等の公知の手法を適宜利用することによって行うことができる。修飾ヌクレオチドは次に説明するヌクレオチドアナログを含む。
【0059】
ここで「ヌクレオチドアナログ」は天然には存在しないヌクレオチドを意味し、ヌクレオチドの塩基、糖若しくはリン酸塩結合のサブユニットにおいて、２以上の置換基が付加されており、若しくは、サブユニット内が２以上置換されており、又はサブユニット全体を異なる化学基に置換されていることを意味する。２以上の置換を伴うアナログの例としては、架橋化核酸が挙げられる。架橋化核酸は、糖環における２箇所の置換に基づいて架橋ユニットが付加されるヌクレオチドアナログであり、典型的には、２’位の炭素と４’位の炭素とが結合しているヌクレオチドアナログが挙げられる。ある実施形態における第１の核酸鎖においては、標的遺伝子の転写産物の部分配列に対する親和性及び／又は核酸分解酵素に対する耐性が増大させるという観点から、第１の核酸鎖はヌクレオチドアナログをさらに含む。「ヌクレオチドアナログ」としては、修飾（架橋、置換等）により、標的遺伝子の転写産物の部分配列に対する親和性及び／又は核酸分解酵素に対する耐性が増大されているヌクレオチドであればよく、例えば、特開平１０－３０４８８９号公報、国際公開第２００５／０２１５７０号、特開平１０－１９５０９８号公報、特表２００２－５２１３１０号公報、国際公開第２００７／１４３３１５号、国際公開第２００８／０４３７５３号、国際公開第２００８／０２９６１９号、国際公開第２００８／０４９０８５号（以下、これら文献を「アンチセンス法に関する文献」とも称する）において、アンチセンス法に好適に用いられるとして開示されている核酸が挙げられる。すなわち、前記文献に開示されている核酸：ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、モルホリノ核酸、トリシクロ－ＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）、２’－Ｏ－メチル化核酸、２’－ＭＯＥ（２’－Ｏ－メトキシエチル）化核酸、２’－ＡＰ（２’－Ｏ－アミノプロピル）化核酸、２’－フルオロ化核酸、２’Ｆ‐アラビノ核酸（２’－Ｆ－ＡＮＡ）、ＢＮＡ（架橋化核酸（Ｂｒｉｄｇｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ）が挙げられる。
【0060】
ある実施態様におけるＢＮＡとしては、２’位の炭素と４’位の炭素とが、２以上の原子によって架橋されているリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドであればよい。架橋化核酸の例は当業者に知られている。このようなＢＮＡの一のサブグループとしては、２’位の炭素と４’位の炭素とが、４’－（ＣＨ２）ｐ－Ｏ－２’、４’－（ＣＨ２）ｐ－Ｓ－２’、４’－（ＣＨ２）ｐ－ＯＣＯ－２’、４’－（ＣＨ２）ｎ－Ｎ（Ｒ３）－Ｏ－（ＣＨ２）ｍ－２’によって架橋されているＢＮＡを挙げられる（ここで、ｐ、ｍ及びｎは、各々１～４、０～２及び１～３の整数である。Ｒ３は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、及びユニット置換基（蛍光あるいは化学発光標識分子、核酸切断活性官能基、又は細胞内若しくは核内移行シグナルペプチド等）を示す）。さらに、ある実施態様におけるＢＮＡにおいて、３’位の炭素における置換基：ＯＲ２及び５’位の炭素における置換基：ＯＲ１のＲ１及びＲ２は、典型的には水素原子であるが、同一又は異なっていてもよく、核酸合成の水酸基の保護基、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、シリル基、リン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、又は、－Ｐ（Ｒ４）Ｒ５（式中、Ｒ４及びＲ５は、同一又は異なっていてもよく、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１～５のアルコキシ基、炭素数１～５のアルキルチオ基、炭素数１～６のシアノアルコキシ基、又は、炭素数１～５のアルキル基で置換されたアミノ基を示す）であってもよい。このようなＢＮＡとしては、例えば、ＬＮＡ（ロックド核酸（Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（登録商標）、２’，４’－ＢＮＡ）とも称される、α－Ｌ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－２’）ＢＮＡ又はβ－Ｄ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－２’）ＢＮＡ、ＥＮＡとも称されるエチレンオキシ（４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’）ＢＮＡ、β－Ｄ－チオ（４’－ＣＨ２－Ｓ－２’）ＢＮＡ、アミノオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（Ｒ３）－２’）ＢＮＡ、２’，４’－ＢＮＡＮＣとも称されるオキシアミノ（４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ３）－Ｏ－２’）ＢＮＡ、２’，４’－ＢＮＡＣＯＣ、３’アミノ－２’，４’－ＢＮＡ、５’－メチルＢＮＡ，ｃＥｔ又はｃＥｔ－ＢＮＡとも称される（４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’）ＢＮＡ、ｃＭＯＥ－ＢＮＡとも称される（４’－ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）－Ｏ－２’）ＢＮＡ、ＡｍＮＡとも称されるアミドＢＮＡ（４’－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｒ）－２’）ＢＮＡ（Ｒ＝Ｈ，Ｍｅ）、ｓｃｐＢＮＡと称される２’，４’－ＢＮＡの架橋部にスピロシクロプロパン構造を導入した２’－Ｏ，４’－Ｃ－ｓｐｉｒｏｃｙｃｌｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｂｒｉｄｇｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ並びに当業者に知られた他のＢＮＡが挙げられる。
【0061】
さらに、ある実施態様における修飾核酸においては、塩基部位が修飾されていてもよい。塩基部位の修飾としては、例えば、シトシンの５－メチル化、５－フルオロ化、５－ブロモ化、５－ヨード化、Ｎ４－メチル化、チミジンの５－デメチル化、５－フルオロ化、５－ブロモ化、５－ヨード化、アデニンのＮ６－メチル化、８－ブロモ化、グアニンのＮ２－メチル化、８－ブロモ化が挙げられる。さらにまた、ある実施態様における修飾核酸においては、リン酸ジエステル結合部位が修飾されていてもよい。リン酸ジエステル結合部位の修飾としては、例えば、ホスホロチオエート化、メチルホスホネート化、メチルチオホスホネート化、キラル－メチルホスホネート化、ホスホロジチオエート化、ホスホロアミデート化が挙げられるが、体内動態に優れているという観点から、ホスホロチオエート化が用いられる。また、このような塩基部位の修飾やリン酸ジエステル結合部位の修飾は同一の核酸に対して、複数種組み合わせて施されていてもよい。
【0062】
全体として、修飾されたヌクレオチド及び修飾されたヌクレオチドアナログは、ここで例示したものに限定されるわけではない。多数の修飾されたヌクレオチド及び修飾されたヌクレオチドアナログが当該分野では知られており、例えば、Ｔａｃｈａｓらの米国特許第８２９９０３９号明細書の記載、特に１７～２２欄の記載を、本願の実施態様として利用することもできる。
【0063】
当業者であれば、このような修飾核酸の中から、アンチセンス効果、標的遺伝子の転写産物の部分配列に対する親和性、核酸分解酵素に対する耐性等の観点を考慮し、適宜ヌクレオチドアナログを選択して利用することができるが、ある実施形態において、ヌクレオチドアナログは下記式（１）で表わされるＬＮＡである。
【0064】
【化1】
【0065】
式（１）中、Ｂａｓｅは、置換基を有していてもよい芳香族複素環基若しくは芳香族炭化水素環基、例えば、天然型ヌクレオシドの塩基部位（プリン塩基、ピリミジン塩基）又は非天然型（修飾）ヌクレオシドの塩基部位を示す。なお、塩基部位の修飾の例は、前述の通りである。
【0066】
Ｒ１、Ｒ２は、同一又は異なっていてもよく、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、シリル基、リン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、又は、－Ｐ（Ｒ４）Ｒ５［ここで、Ｒ４及びＲ５は、同一又は異なっていてもよく、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１～５のアルコキシ基、炭素数１～５のアルキルチオ基、炭素数１～６のシアノアルコキシ基、又は、炭素数１～５のアルキル基で置換されたアミノ基を示す。］を示す。
【0067】
なお、前記化学式において示されている化合物はヌクレオシドであるが、ある実施形態における「ＬＮＡ」及び通常ＢＮＡには、当該ヌクレオシドにリン酸基が結合した形態（ヌクレオチド）も含まれる。すなわち、ＬＮＡといったＢＮＡは、二本鎖核酸複合体を含む核酸鎖に、ヌクレオチドとして組み込まれる。
【0068】
ある実施態様における「少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含むウイング領域」は、ＤＮＡヌクレオチドを含む複数の核酸からなる領域（以下「ＤＮＡギャップ領域」とも称する）の５’末側及び／又は３’末側に配置されるものである。ある実施態様では、ＤＮＡギャップ領域は、少なくとも４つ以上の連続したＤＮＡヌクレオチドを含む複数の核酸からなる。
【0069】
該ＤＮＡギャップ領域の５’末端に配置されたヌクレオチドアナログを含む領域（以下「５’ウイング領域」あるいは「５’ウイングセグメント」とも称する）、及び該ＤＮＡギャップ領域の３’末端に配置されたヌクレオチドアナログを含む領域（以下「３’ウイング領域」あるいは「３’ウイングセグメント」とも称する）は、それぞれ独立したものであり、前記アンチセンス法に関する文献に挙げられている修飾ヌクレオチドを少なくとも１種含んでいればよく、さらに、かかるヌクレオチドアナログ以外に天然型の核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）も含まれていてもよい。また、５’ウイング領域及び３’ウイング領域の鎖長は独立的に、通常１～１０塩基であり、１～７塩基、１～５塩基、又は２～５塩基である。
【0070】
さらに、５’ウイング領域及び３’ウイング領域において、修飾ヌクレオチドとしてのヌクレオチドアナログ及び天然型のヌクレオチドの種類や数や位置については、ある実施形態における二本鎖核酸複合体が奏するアンチセンス効果等に影響を与える場合もあるため、好ましい態様は、配列等によっても変わり得る。一概には言えないが、当業者であれば、前記アンチセンス法に関する文献の記載を参酌しながら、好ましい態様を決定することができる。また、前記「少なくとも４つ以上の連続したＤＮＡヌクレオチド」を含む領域同様に、修飾後の二本鎖核酸が有するアンチセンス効果を測定し、得られた測定値が、修飾前の二本鎖核酸のそれよりも有意に低下していなければ、当該修飾は好ましい態様であると評価することができる。
【0071】
修飾ヌクレオチドを含むＺＩＣ５転写産物のｍＲＮＡに対するアンチセンス鎖は、１～１０個の塩基からなる５’ウイング領域（５’ｗｉｎｇ ｓｉｔｅ）、８～２５個の塩基からなるギャップ領域、及び１～１０個の塩基からなる３’ウイング領域（３’ｗｉｎｇ ｓｉｔｅ）からなり得る。アンチセンス鎖は、例えば、５－８－５，５－１０－５，４－１０－４，３－１０－３，２－１０－２，１－１０－１，５－８－５，４－８－４又は３－８－３で表されるモチーフ等を有することができる。ここで、モチーフの１番目の数字は、５’ウイング領域内の塩基の数を表し、２番目の数字は、ギャップ領域内の塩基の数を表し、３番目の数字は、３’ウイング領域内の塩基の数を表す。
【0072】
なお、従前から試みられているＲＮＡやＬＮＡのみからなるアンチセンス法は、標的となるｍＲＮＡと結合することで翻訳を抑制したが、その効果は概して不十分であった。一方ＤＮＡのみからなるアンチセンス法では、標的遺伝子と結合するとＤＮＡとＲＮＡからなる二本鎖構造となるため、ＲＮａｓｅＨの標的となることでｍＲＮＡが切断されることにより強い標的遺伝子発現抑制効果が期待できたが、標的遺伝子との結合自体が弱いため実際の効果はやはり不十分だった。
【0073】
従って、第１の核酸鎖において、中央に少なくとも４塩基以上の鎖長のＤＮＡが配置され、さらにＲＮＡ（すなわち、標的転写産物）と強い結合能力を持つＬＮＡ（又は他のＢＮＡ）が両端に配置されることによって、このような複合鎖は、ＲＮａｓｅＨによる標的ＲＮＡの切断を促進することとなる。「鎖長が４塩基であるＤＮＡ」は、ＤＮＡヌクレオチドだけに制限されるわけではなく、第１の核酸鎖が転写産物にハイブリダイズした際に、ＲＮａｓｅＨによって認識される少なくとも４つの連続したヌクレオチドを、第１の核酸鎖が含むことも意図するものである。ある実施形態において、標的転写産物とのヘテロ二重鎖形成により生じるアンチセンス効果が極めて高いという観点から、第１の核酸鎖が転写産物にハイブリダイズした際に、ＲＮａｓｅＨによって認識される少なくとも４つの連続したヌクレオチドを含む領域の、５’末側及び３’末側に配置された修飾核酸を含むウイング領域は、任意にヌクレオチドアナログを含んでいることが望ましい。該ヌクレオチドアナログはＢＮＡであってもよく、例えばＬＮＡであってもよいし、ＥＮＡであってもよい。
【0074】
二本鎖核酸複合体の実施形態における第２の核酸鎖は、前述の第１の核酸鎖と相補的な核酸である。第２の核酸鎖の塩基配列と第１の核酸鎖の塩基配列とは、完全に相補的である必要はなく、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の相補性を有していればよい。
【0075】
第２の核酸鎖としては、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ＰＮＡ（ペプチド核酸）及びＢＮＡ（例えば、ＬＮＡ）からなる群から選択される少なくとも１種の核酸からなるオリゴヌクレオチドである。より具体的には、第２の核酸鎖は、（ｉ）ＲＮＡヌクレオチドと、任意にヌクレオチドアナログと、任意にＤＮＡヌクレオチドとを含み、（ｉｉ）ＤＮＡヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログを含み、又は、（ｉｉｉ）ＰＮＡヌクレオチドを含む。「ＲＮＡヌクレオチドと、任意にヌクレオチドアナログと、任意にＤＮＡヌクレオチドとを含む」という文言は、第２の核酸鎖はＲＮＡヌクレオチドを含み、さらに任意にヌクレオチドアナログを含んでもよく、さらにまた任意にＤＮＡヌクレオチドを含んでもよいということを意味する。「ＤＮＡヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログを含む」という文言は、第２の核酸鎖はＤＮＡヌクレオチド及びヌクレオチドアナログのいずれかを含んでいてもよく、またＤＮＡヌクレオチド及びヌクレオチドアナログを共に含んでいてもよいということを意味する。「ＰＮＡヌクレオチドを含む」とは第２の核酸鎖はＰＮＡヌクレオチドから構成されてもよいということを意味する。
【0076】
しかしながら、ある実施形態における二本鎖核酸複合体が細胞内のＲＮａｓｅＨに認識され、第２の核酸鎖が分解されることにより、第１の核酸鎖のアンチセンス効果が発揮し易くなるという観点から、第２の核酸鎖はＲＮＡを含む。また、ある実施形態における二本鎖核酸複合体にペプチド等の機能性分子を結合させ易いという観点からは、第２の核酸鎖はＰＮＡであってもよい。
【0077】
ここで、「ＲＮＡヌクレオチド」は、天然に存在するＲＮＡヌクレオチド、又はその塩基、糖若しくはリン酸塩結合のサブユニットが修飾されているＲＮＡヌクレオチドを意味する。塩基、糖又はリン酸塩結合のサブユニットの修飾とは、１の置換基の付加、又は、サブユニット内における１の置換のことであり、サブユニット全体を異なる化学基に置換することではない。
【0078】
第２の核酸鎖において、核酸の一部又は全部は、ＲＮＡ分解酵素等の核酸分解酵素に対する耐性が高いという観点から、修飾されたヌクレオチドであってもよい。このような修飾としては、例えば、シトシンの５－メチル化、５－フルオロ化、５－ブロモ化、５－ヨード化、Ｎ４－メチル化、チミジンの５－デメチル化、５－フルオロ化、５－ブロモ化、５－ヨード化、アデニンのＮ６－メチル化、８－ブロモ化、グアニンのＮ２－メチル化、８－ブロモ化、ホスホロチオエート化、メチルホスホネート化、メチルチオホスホネート化、キラル－メチルホスホネート化、ホスホロジチオエート化、ホスホロアミデート化、２’－Ｏ－メチル化、２’－メトキシエチル（ＭＯＥ）化、２’－アミノプロピル（ＡＰ）化、２’－フルオロ化が挙げられる。また、ウラシル塩基をチミジン塩基に置換したＲＮＡヌクレオチドの利用も考えられるが、薬物動態に優れているという観点から、ホスホロチオエート化が用いられる。また、かかる修飾は同一の核酸に対して、複数種組み合わせて施されていても良く、例えば、後述の実施例において用いられているように、酵素による切断に対する抵抗性を付与するため、同一のＲＮＡに対して、ホスホロチオエート化及び２’－Ｏ－メチル化を施してもよい。しかしながら、ＲＮａｓｅＨによってＲＮＡヌクレオチドが切断されることを期待し、又は望む場合には、ホスホロチオエート化及び２’－Ｏ－メチル化のいずれかのみを施すことができる。
【0079】
修飾の数や位置は、ある実施形態における二本鎖核酸複合体が奏するアンチセンス効果等に影響を与える場合もあるため、第２の核酸鎖におけるヌクレオチドアナログの数及び修飾の位置には好ましい態様が存在する。この好ましい態様は、修飾対象となる核酸の種類、配列等によっても異なるため、一概には言えないが、前述の第１の核酸鎖同様に、修飾後の二本鎖核酸が有するアンチセンス効果を測定することにより特定することができる。このような好ましい態様として、第２の核酸鎖が特定の細胞の核内に送達されるまで、ＲＮａｓｅＡ等のＲＮＡ分解酵素による分解を抑制しつつも、特定の細胞内においてはＲＮａｓｅＨにより該核酸鎖が分解されることにより、アンチセンス効果を発揮し易いという観点から、第２の核酸鎖はＲＮＡであって、第１の核酸鎖のヌクレオチドアナログを含む領域（すなわち、５’ウイング領域及び／又は３’ウイング領域）に対して相補的な領域は、修飾された核酸又はヌクレオチドアナログであり、前記修飾又はアナログがＲＮＡ分解酵素等の酵素による分解を抑制する効果を有するものである。ある実施態様においては、前記修飾はＲＮＡに対する２’－Ｏ－メチル化及び／又はホスホロチオエート化である。また、このような場合、第１の核酸鎖のヌクレオチドアナログを含む領域に相補的な領域の全てが修飾されていてもよく、第１の核酸鎖の修飾核酸を含む領域に相補的な領域の一部が修飾されていてもよい。さらに、修飾されている領域は、該一部を含む限り、第１の核酸鎖の修飾核酸を含む領域よりも長くなっていてもよく、短くなっていてもよい。
【0080】
ある実施形態における二本鎖核酸複合体において、第２の核酸鎖に機能性部分が結合していてもよい。第２の核酸鎖と機能性部分との結合は、直接的な結合であってもよく、他の物質を介した間接的な結合であってもよいが、ある実施形態において、共有結合、イオン結合、水素結合等で第２の核酸鎖と機能性部分とが直接的に結合していることが好ましく、より安定した結合が得られるという観点から、共有結合がより好ましい。
【0081】
ある実施形態において、「機能性部分」の構造上、特に制限はなく、それを結合する二本鎖核酸複合体及び／又は核酸鎖に所望の機能を付与する。所望の機能としては、標識機能、精製機能及び標的への送達機能が挙げられる。標識機能を付与する部分の例としては、蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ等の化合物が挙げられる。精製機能を付与する部分の例としては、ビオチン、アビジン、Ｈｉｓタグペプチド、ＧＳＴタグペプチド、ＦＬＡＧタグペプチド等の化合物が挙げられる。
【0082】
また、アンチセンス鎖を特異性高く効率的に標的部位に送達し、かつ当該核酸によって標的遺伝子の発現を非常に効果的に抑制するという観点から、核酸複合体に機能性部分として、ある実施形態における核酸複合体を標的部位に送達させる活性を有する分子が結合していることが好ましい。
【0083】
二本鎖核酸複合体におけるある実施形態では、第２の核酸鎖に機能性部分として、ある実施形態における二本鎖核酸複合体を標的部位に送達させる活性を有する分子が結合していることが好ましい。
【0084】
「標的への送達機能」を有する部分として、例えば、肝臓等に特異性高く効率的にある実施形態における二本鎖核酸複合体を送達できるという観点から、脂質が挙げられる。このような脂質としては、コレステロール、脂肪酸等の脂質（例えば、ビタミンＥ（トコフェロール類、トコトリエノール類）、ビタミンＡ、ビタミンＤ）、ビタミンＫ等の脂溶性ビタミン（例えば、アシルカルニチン）、アシルＣｏＡ等の中間代謝物、糖脂質、グリセリド、並びにそれらの誘導体等を例示することができるが、これらの中では、より安全性が高いという観点から、ある実施形態において、コレステロール、ビタミンＥ（トコフェロール類、トコトリエノール類）を利用することが好ましい。また、脳に特異性高く効率的に本発明の二本鎖核酸を送達できるという観点から、ある実施形態における「機能性部分」としては、糖（例えば、グルコース、スクロース）が挙げられる。また、各臓器の細胞表面にある各種タンパク質に結合することにより、当該臓器に特異性高く効率的にある実施形態における二本鎖核酸複合体を送達できるという観点から、受容体のリガンド、例えばＳ１Ｐ受容体のリガンドや、細胞接着分子に結合するペプチド、例えばインテグリンに結合するｃＲＧＤペプチドや、抗体、及び／又はそれらの断片等のペプチド又はタンパク質が、ある実施形態における「機能性部分」として挙げられる。
【0085】
以上、いくつかの実施態様において、二本鎖核酸複合体の好適な典型例について説明したが、いくつかの実施形態において、一本鎖アンチセンスからなるＡＳＯや、二本鎖核酸である、例えば、ＨＤＯ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡなどを使用することが可能である。
【0086】
それらの核酸複合体のアンチセンス鎖や相補鎖は、当業者であれば公知の方法を適宜選択することにより調製することができる。例えば、標的転写産物の塩基配列（又は、いくつかの場合においては標的遺伝子の塩基配列）の情報に基づいて、核酸の塩基配列を設計し、市販の核酸自動合成機（アプライドバイオシステムズ社製、べックマン社製等）を用いて合成し、次いで、得られるオリゴヌクレオチドを逆相カラム等を用いて精製することにより、核酸を調製することができる。そして、このようにして調製した核酸を適当な緩衝液中にて混合し、約９０～９８℃にて数分間（例えば、５分間）かけて変性させた後、約３０～７０℃にて約１～８時間かけてアニーリングさせることにより、いくつかの実施形態における二本鎖核酸複合体を調製することができる。また、機能性部分が結合している二本鎖核酸複合体は、予め機能性部分を結合させた核酸種を用いて、前記の通り、合成、精製及びアニーリングすることにより、調製することができる。機能性部分と核酸とを結合させるための多くの方法は、当該分野においてよく知られている。
【0087】
一般的には、ＲＮａｓｅＨ依存的アンチセンスオリゴヌクレオチドの活性部位は、ｓｉＲＮＡの活性部位であると予想される（Ｖｉｃｋｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２７８，７１０８－７１１８）。本発明の一態様において、二本鎖のアンチセンス鎖の核酸塩基配列は、少なくとも表１、表２、表６に示されるオリゴヌクレオチド配列の部分を含む。ｄｓＲＮＡ鎖の末端を、１またはそれ以上の天然の核酸塩基または修飾核酸塩基を付加することにより修飾して、オーバーハングを形成することができる。次いで、ｄｓＲＮＡのセンス鎖を、アンチセンス鎖の相補物として設計しそして合成し、そしていずれかの末端に修飾または付加を含有してもよい。例えば、一態様において、ｄｓＲＮＡ二本鎖の両方ともの鎖が、中央部核酸塩基にわたり相補的であり、それぞれが一方の末端または両方の末端にオーバーハングを有する。二本鎖は、単分子の二本鎖であってもまたは二分子の二本鎖であってもよい。すなわち、２本の鎖が、直接的またはリンカーにより連結されていてもよく、または別々の分子であってもよい。
【0088】
ある実施形態において、アンチセンス核酸はＲＮａｓｅＨ非依存的アンチセンス効果を有する。「ＲＮａｓｅＨ非依存的アンチセンス効果」とは、標的遺伝子の転写産物（ＲＮＡセンス鎖）と、その部分配列に相補的な核酸鎖とがハイブリダイズすることによる翻訳の阻害やエクソンスキッピング等のスプライシング機能変換効果によって生じる標的遺伝子の発現を抑制する活性のことを意味する。
【0089】
いくつかの実施形態における核酸複合体を含む組成物は、公知の製剤学的方法により製剤化することができる。例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、液剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、トローチ剤、舌下剤、咀嚼剤、バッカル剤、ペースト剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤、乳剤、塗布剤、軟膏剤、硬膏剤、パップ剤、経皮吸収型製剤、ローション剤、吸引剤、エアゾール剤、注射剤、坐剤等として、経腸管的（経口的等）又は非経腸管的に使用することができる。
【0090】
これら製剤化においては、薬理学上もしくは飲食品として許容される担体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、ｐＨ調節剤、安定剤、香味剤、芳香剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等と適宜組み合わせることができる。
【0091】
製剤化等に際し、機能性部分として脂質が結合している、いくつかの実施形態における核酸複合体においては、カイロミクロンやカイロミクロンレムナント等のリポタンパク質との複合体を形成させてもよい。さらに、経腸投与の効率を高めるという観点から、前記リポタンパク質に加え、大腸粘膜上皮透過性亢進作用を有する物質（例えば、中鎖脂肪酸、長鎖不飽和脂肪酸又はそれらの誘導体（塩、エステル体又はエーテル体））及び界面活性剤（非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤）との複合体（混合ミセル、エマルジョン）であってもよい。
【0092】
いくつかの実施形態における組成物の好ましい投与形態としては特に制限はなく、経腸管的（経口的等）又は非経腸管的、より具体的には、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、気道内投与、直腸投与及び筋肉内投与、輸液による投与が挙げられる。
【0093】
いくつかの実施形態における組成物は、ヒトを含む動物を被験体として、被験体に用いることができる。
【0094】
いくつかの実施形態における組成物を投与又は摂取する場合、その投与量又は摂取量は、対象の年齢、体重、症状、健康状態、組成物の種類（医薬品、飲食品など）等に応じて、適宜選択されるが、ある実施形態にかかる組成物の有効摂取量は、ヌクレオチド換算で０．００１ｍｇ／ｋｇ／日～５０ｍｇ／ｋｇ／日であることが好ましい。
【0095】
本発明は、ＺＩＣ５遺伝子特異的な阻害剤、又はＺＩＣ５転写産物の阻害剤を含むメラノーマの治療薬を包含する。
【実施例0096】
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
【0097】
実施例１
ＺＩＣ５を阻害するＨＤＯの設計
ＮＣＢＩのウェブサイト（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)よりヒトおよびマウスＺＩＣ５の配列情報を入手し、ヒトＺＩＣ５転写産物配列：ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＭ＿０３３１３２．４（配列番号１）、ヒトＺＩＣ５転写産物配列：ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＭ＿０３３１３２．５（配列番号２）およびマウスＺＩＣ５転写産物配列：ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＭ＿０２２９８７．３（配列番号３）配列に基づいて、計１１０本のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）をデザインした。これら１１０本のＡＳＯ配列のうち６８本がヒト選択的配列で、４２本がヒトマウス共通配列である。
ＺＩＣ５を阻害するＨＤＯの設計
ＮＣＢＩのウェブサイト（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)よりヒトおよびマウスＺＩＣ５の配列情報を入手し、ヒトＺＩＣ５転写産物配列：ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＭ＿０３３１３２．４（配列番号１）、ヒトＺＩＣ５転写産物配列：ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＭ＿０３３１３２．５（配列番号２）およびマウスＺＩＣ５転写産物配列：ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＭ＿０２２９８７．３（配列番号３）配列に基づいて、計１１０本のアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）をデザインした。これら１１０本のＡＳＯ配列のうち６８本がヒト選択的配列で、４２本がヒトマウス共通配列である。
【0098】
表１には、アンチセンス鎖名称、アンチセンス鎖の塩基配列、相補鎖名称、相補鎖の塩基配列、鎖長、モチーフ、種別、ＧＣ含有量、Ｔｍ値（℃）、ＺＩＣ５ｍＲＮＡのサイト位置（開始サイト、停止サイト）を示す。
【0099】
表１は、ヒト選択的ＺＩＣ５配列（６８本）にハイブリダイズ可能な核酸塩基配列を有するアンチセンス鎖を示す。
【0100】
【表1】
【0101】
【0102】
【0103】
【0104】
【0105】
表１のアンチセンス鎖、センス鎖の配列式中、小文字はＤＮＡ、大文字はＲＮＡ、（Ｌ）はＬＮＡ、Ｃ（Ｌ）は５－メチルシトシンＬＮＡ、（Ｍ）は２’―Ｏ―メチル糖修飾、＾はホスホロチオエート結合をそれぞれ表す。
【0106】
表２は、ヒト・マウスＺＩＣ５共通配列（４２本）にハイブリダイズ可能な核酸塩基配列を有するアンチセンス鎖を示す。
【0107】
【表2】
【0108】
【0109】
【0110】
【0111】
【0112】
表２のアンチセンス鎖、センス鎖の配列式中の表記方法は、表１と同様である。
表１、２中のＡｎｔｉｓｅｎｓｅの欄に記載されている配列はすべてヌクレオチド間にホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む。それらのうち太字部分の塩基にはＬＮＡ修飾を含む。Ｍｏｔｉｆの欄の例えば３－８－３は３個のＬＮＡ修飾核酸－８個の非修飾核酸－３個のＬＮＡ修飾核酸（すべてのヌクレオチド間にＰＳ修飾含む）の計１４ｍｅｒ核酸塩基で構成されるアンチセンス核酸を示す。Ｓｐｅｃｉｅｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙの欄のｈｕｍａｎ／ｍｏｕｓｅとはヒトとマウスとで完全マッチするアンチセンス核酸であることを示す。また、ｍｏｕｓｅとはマウス配列とは完全マッチするが、ヒト配列とは完全マッチしないアンチセンス核酸であることを示す。ＧＣ ｃｏｎｔｅｎｔはウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｇｒｌ．ｃｏ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ／０２１７ｏｌｉｇｏｃａｌｃ．ｈｔｍ）に基づいて算出した。ＬＮＡ修飾アンチセンス核酸のＴｍ値はウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｘｉｑｏｎ．ｃｏｍ／ｌｓ／ｐａｇｅｓ／ｅｘｉｑｏｎｔｍｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｔｏｏｌ．ａｓｐｘ）に基づいて算出した。ヒト及びマウスのｃｏｄｉｎｇ領域内の配列情報はＮＣＢＩのウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）より入手した。
表１、２中のＡｎｔｉｓｅｎｓｅの欄に記載されている配列はすべてヌクレオチド間にホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む。それらのうち太字部分の塩基にはＬＮＡ修飾を含む。Ｍｏｔｉｆの欄の例えば３－８－３は３個のＬＮＡ修飾核酸－８個の非修飾核酸－３個のＬＮＡ修飾核酸（すべてのヌクレオチド間にＰＳ修飾含む）の計１４ｍｅｒ核酸塩基で構成されるアンチセンス核酸を示す。Ｓｐｅｃｉｅｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙの欄のｈｕｍａｎ／ｍｏｕｓｅとはヒトとマウスとで完全マッチするアンチセンス核酸であることを示す。また、ｍｏｕｓｅとはマウス配列とは完全マッチするが、ヒト配列とは完全マッチしないアンチセンス核酸であることを示す。ＧＣ ｃｏｎｔｅｎｔはウェブサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｇｒｌ．ｃｏ．ｊｐ／ｔｏｏｌｓ／０２１７ｏｌｉｇｏｃａｌｃ．ｈｔｍ）に基づいて算出した。ＬＮＡ修飾アンチセンス核酸のＴｍ値はウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｘｉｑｏｎ．ｃｏｍ／ｌｓ／ｐａｇｅｓ／ｅｘｉｑｏｎｔｍｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｔｏｏｌ．ａｓｐｘ）に基づいて算出した。ヒト及びマウスのｃｏｄｉｎｇ領域内の配列情報はＮＣＢＩのウェブサイト（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）より入手した。
【0113】
実施例２
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ 試験（スクリーニング）
ＺＩＣ５の発現を阻害するＨＤＯ配列を同定するため、また、ＺＩＣ５抑制率の高いアンチセンス鎖配列を同定する為、ＺＩＣ５に対応する１１０か所の配列を使用し、次の方法でスクリーニングを行った。表１、２に記載した配列の核酸鎖は、株式会社ジーンデザイン社から入手した。
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ 試験（スクリーニング）
ＺＩＣ５の発現を阻害するＨＤＯ配列を同定するため、また、ＺＩＣ５抑制率の高いアンチセンス鎖配列を同定する為、ＺＩＣ５に対応する１１０か所の配列を使用し、次の方法でスクリーニングを行った。表１、２に記載した配列の核酸鎖は、株式会社ジーンデザイン社から入手した。
【0114】
ＺＩＣ５を高発現するメラノーマ細胞株であるＡ３７５細胞を市販の９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに３×１０３ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌずつ播種し、２４時間ＣＯ２インキュベータ中で培養した。その翌日にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＬＴＸ ｗｉｔｈ Ｐｌｕｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ製）を用いてＡＳＯのトランスフェクションを行い、ＣＯ２インキュベータ中にて４８時間培養した。培養後の９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅの各ウェルよりＳｕｐｅｒＰｒｅｐ（登録商標）Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ＆ＲＴ Ｋｉｔ ｆｏｒ ｑＰＣＲ（Ｔｏｙｏｂｏ製）を用いてＴｏｔａｌ ＲＮＡの抽出と逆転写反応を行った。１２－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅを使用したアッセイにおいては、ＲｅｌｉａＰｒｅｐ（商標）ＲＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、Ｈｉｇｈ－Ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いてｃＤＮＡを合成した。定量ＰＣＲはＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（登録商標）ＳＹＢＲ（登録商標） ｑＰＣＲ Ｍｉｘ（Ｔｏｙｏｂｏ製）を用い、定量ＰＣＲ装置はＣＦＸ９６ リアルタイム ＰＣＲ 解析システム（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用した。その際、プライマーとしてＺＩＣ５－Ｆ：ＡＡＣＣＴＣＡＡＧＡＴＣＣＡＣＡＡＧＣＧＴ（配列番号２８２）ａｎｄ Ｒ：ＣＡＣＴＧＧＴＧＴＧＧＡＣＡＴＧＧＧＡＡ（配列番号２８３）；ＡＣＴＢ－Ｆ：ＧＣＣＣＴＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＡＣＡＡＴ（配列番号２８４）ａｎｄ Ｒ：ＧＧＡＧＧＧＧＣＣＧＧＡＣＴＣＧＴＣＡＴ（配列番号２８５）；ＧＡＰＤＨ－Ｆ：ＡＧＣＣＴＣＣＣＧＣＴＴＣＧＣＴＣＴＣＴ（配列番号２８６）ａｎｄ Ｒ：ＣＣＡＧＧＣＧＣＣＣＡＡＴＡＣＧＡＣＣＡ（配列番号２８７）を使用し、ｍＲＮＡ発現量はＺＩＣ５とＡＣＴＢ又はＧＡＰＤＨの各Ｃｔ値を測定した後、検量線に基づく相対定量法により算出した。この方法で算出した値をＺＩＣ５ｍＲＮＡの相対発現率（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｒａｔｅ）という。
【0115】
１）スクリーニング（９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ ａｓｓａｙ：１００ｎＭ）(i)
ヒトメラノーマＡ３７５細胞を用いたスクリーニング(i)を実施した。試験は再現性確認を兼ねて３回に分けて実施した。ＺＩＣ５発現量の補正はＡＣＴＢで行った。はじめに、９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅを用いてＡＳＯ濃度は１００ｎＭで１１０本のすべてにつきノックダウン活性を調べた。
ノックダウン活性の測定は、上述したＺＩＣ５ｍＲＮＡの相対発現率の算出方法に従った。
結果を表３に示す。
ヒトメラノーマＡ３７５細胞を用いたスクリーニング(i)を実施した。試験は再現性確認を兼ねて３回に分けて実施した。ＺＩＣ５発現量の補正はＡＣＴＢで行った。はじめに、９６－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅを用いてＡＳＯ濃度は１００ｎＭで１１０本のすべてにつきノックダウン活性を調べた。
ノックダウン活性の測定は、上述したＺＩＣ５ｍＲＮＡの相対発現率の算出方法に従った。
結果を表３に示す。
【0116】
【表3】
【0117】
【0118】
【0119】
その結果、Ｒｅｎ－４－５ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－７ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－１０ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－１３ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－１４ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－１６ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－２２ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－２３ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－２４ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－３２ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－３３ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－３６ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－３９ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－４０ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－４１ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－４２ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－４８ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－５３ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－５４ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－５６ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－５７ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－５８ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－５９ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－６０ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－６１ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－６２ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－６３ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－６４ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－６６ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－６７ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－６８ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－６９ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－７２ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－７３ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－７５ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－７６ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－７７ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－８９ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－１０５ＡＳＯの３９本は、５０％以上のノックダウン活性を示した。
【0120】
これら３９本のアンチセンス鎖は、配列番号２の核酸塩基１５－２８、１８０－１９３、２４９－２６２、５１６－５２９、６１５－６２８、６５４－６６７、９２４－９３７、１０６３－１０７６、１２４１－１２５４、１４９９－１５１２、１５３５－１５４８、１７１９－１７３２、１９２０－１９３３、１９６７－１９８０、２０１６－２０２９、２１９１－２２０４、１０９－１２２、１４２５－１４３８、１６６４－１６７７、１８５９－１８７２、１９０６－１９１９、１９９０－２００３、２０１０－２０２３、２０２８－２０４１、２０４３－２０５６、２０６２－２０７５、２１４１－２１５４、２３２２－２３３５、２３５５－２３６８、２３９１－２４０４、２４０６－２４１９、２４９８－２５１１、２５５１－２５６４、２５６８－２５８１、２６０４－２６１７、２６１８－２６３１、２６４０－２６５３、３２１８－３２３１又は３９７５－３９８８のセンス部分とハイブリダイズする。
【0121】
これら３９本のアンチセンス鎖の配列番号は、配列番号８、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号５１、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号９２、配列番号１０８である。
【0122】
その中でＲｅｎ－４－５ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－７ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－２２ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－２３ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－２４ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－３２ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－３３ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－３６ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－４０ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－４２ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－５３ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－６３ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－６４ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－７２ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－７３ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－７６ＡＳＯの１６本は、６０％以上のノックダウン活性を示した。
【0123】
これら１６本のアンチセンス鎖は、配列番号２の核酸塩基１５－２８、１８０－１９３、９２４－９３７、１０６３－１０７６、１２４１－１２５４、１４９９－１５１２、１５３２０６２－２０７５５－１５４８、１７１９－１７３２、１９６７－１９８０、２１９１－２２０４、１４２５－１４３８、２１４１－２１５４、２３２２－２３３５、２５５１－２５６４、２５６８－２５８１、２６１８－２６３１のセンス部分とハイブリダイズする。
【0124】
これら１６本のアンチセンス鎖の配列番号は、配列番号８、配列番号１０、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３９、配列番号４３、配列番号４５、配列番号５６、配列番号６６、配列番号６７、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７９である。
【0125】
２）スクリーニング（１２－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ ａｓｓａｙ：３０，５０，１００ｎＭ）(ii)
次に、ヒトメラノーマＡ３７５細胞を用いたスクリーニング(ii)を実施した。ノックダウン活性の測定は、上述したＺＩＣ５ｍＲＮＡの相対発現率の算出方法に従った。ＺＩＣ５発現量の補正はＡＣＴＢとＧＡＰＤＨの両方で行った。試験は１２－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅを用いてＡＳＯ濃度は３０，５０，１００ｎＭで、スクリーニング(i)で５０％以上のノックダウン活性を示したＡＳＯ１６本について上述した方法によりＺＩＣ５ｍＲＮＡの相対発現率を調べた。
その結果を表４に示す。
次に、ヒトメラノーマＡ３７５細胞を用いたスクリーニング(ii)を実施した。ノックダウン活性の測定は、上述したＺＩＣ５ｍＲＮＡの相対発現率の算出方法に従った。ＺＩＣ５発現量の補正はＡＣＴＢとＧＡＰＤＨの両方で行った。試験は１２－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅを用いてＡＳＯ濃度は３０，５０，１００ｎＭで、スクリーニング(i)で５０％以上のノックダウン活性を示したＡＳＯ１６本について上述した方法によりＺＩＣ５ｍＲＮＡの相対発現率を調べた。
その結果を表４に示す。
【0126】
【表4】
【0127】
その結果、オリゴはＲｅｎ－４－３２ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－３６ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－４２ＡＳＯの３本は、ＺＩＣ５ｍＲＮＡの相対発現率で６０％以上のノックダウン活性を示した。
【0128】
３）スクリーニング（１２－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ ａｓｓａｙ：３０，５０ｎＭ）(iii)
次に、ヒトメラノーマＡ３７５細胞を用いたスクリーニング(iii)を実施した。ノックダウン活性の測定は、上述したＺＩＣ５ｍＲＮＡの相対発現率の算出方法に従った。ＺＩＣ５発現量の補正はＡＣＴＢとＧＡＰＤＨの両方で行った。試験は１２－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅを用いてＡＳＯ濃度は３０，５０ｎＭで、スクリーニング(ii)でヒットした配列を含む計１２本についてノックダウン活性を調べた。その結果を表５に示す。
次に、ヒトメラノーマＡ３７５細胞を用いたスクリーニング(iii)を実施した。ノックダウン活性の測定は、上述したＺＩＣ５ｍＲＮＡの相対発現率の算出方法に従った。ＺＩＣ５発現量の補正はＡＣＴＢとＧＡＰＤＨの両方で行った。試験は１２－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅを用いてＡＳＯ濃度は３０，５０ｎＭで、スクリーニング(ii)でヒットした配列を含む計１２本についてノックダウン活性を調べた。その結果を表５に示す。
【0129】
Ｒｅｎ－４－３６ＡＳＯとＲｅｎ－４－４２ＡＳＯの２本は５９％以上のノックダウン活性を示した。
【0130】
以上の結果より、Ｒｅｎ－４－３６ＡＳＯとＲｅｎ－４－４２ＡＳＯが再現性よく強いノックダウン作用を示すことが明らかとなった。よって、これらの２配列を２次スクリーニングに進めることにした。
【0131】
【表5】
【0132】
実施例３
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験（スクリーニング）
発明者らは、実施例２のスクリーニングの抑制効率が高かった１４量体（１４ｍｅｒ）のＲｅｎ－４－３６ＡＳＯとＲｅｎ－４－４２ＡＳＯの配列付近で、各配列をさらに改変したアンチセンス鎖を１４本ずつ、塩基長は１４～２０ｍｅｒ、合計２８本をデザインした。
Ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験（スクリーニング）
発明者らは、実施例２のスクリーニングの抑制効率が高かった１４量体（１４ｍｅｒ）のＲｅｎ－４－３６ＡＳＯとＲｅｎ－４－４２ＡＳＯの配列付近で、各配列をさらに改変したアンチセンス鎖を１４本ずつ、塩基長は１４～２０ｍｅｒ、合計２８本をデザインした。
【0133】
発明者らが対象とする疾患領域はヒトの癌であることから、ｉｎ ｖｉｖｏ評価をヒト癌モデルで実施することを考慮してアンチセンス鎖の塩基長を１４～２０ｍｅｒで設計する際に、マウスのｍＲＮＡの塩基配列とヒトのｍＲＮＡの配列のミスマッチが生じた場合は全てヒト配列を選択した。１４ｍｅｒのＲｅｎ－４－３６ＡＳＯは、ヒト／マウス共通であったが、Ｒｅｎ－４－３６ＡＳＯに由来する１４配列のうち１０配列（Ｒｅｎ－４－３６－１，２，３，４，５，９，１０，１１，１２，１３）はマウスのｍＲＮＡの塩基配列とヒトのｍＲＮＡの配列のミスマッチが生じたため、ヒトのｍＲＮＡの塩基配列のセンス部位に相補的な配列とした。一方、Ｒｅｎ－４－４２ＡＳＯに由来する１４配列には、ミスマッチ部分がなかったため、全ての配列をヒト／マウス共通配列としてデザインした。これらの２８本のオリゴはジーンデザインから入手した。
【0134】
これら２８本のアンチセンス鎖、相補鎖、モチーフ、ＧＣ含有量（ＧＣ ｃｏｎｔｅｎｔｓ）、Ｔｍ値（Ｔｍ ｖａｌｕｅ）、ＺＩＣ５ｍＲＮＡ上のスタート位置、ストップ位置を表６に示す。
【0135】
表６は、Ｒｅｎ－４－３６ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－４２ＡＳＯの配列付近で、配列設計した２８本のアンチセンス鎖を示す表である。
【0136】
【表6】
【0137】
【0138】
【0139】
これらの２８本のアンチセンス鎖を使用し、発明者らは、Ａ３７５細胞における各アンチセンス鎖のＺＩＣ５ ｍＲＮＡのノックダウン活性を測定した。ノックダウン活性の測定は、上述したＺＩＣ５ｍＲＮＡの相対発現率の算出方法に従った。ＺＩＣ５発現量の補正はＡＣＴＢとＧＡＰＤＨの両方で行った。試験は１２－ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅを用いてＡＳＯ濃度は３０，５０ｎＭでＺＩＣ５ｍＲＮＡのノックダウン活性を調べた。その結果を表７、表８に示す。
【0140】
表７は、ＡＳＯ濃度３０ｎＭ，５０ｎＭにおけるＺＩＣ５ｍＲＮＡの相対発現率（ＺＩＣ５／ＧＡＰＤＨ）を示す表である。
【0141】
【表7】
【0142】
表７に示す通り、Ｒｅｎ－４－３６－１ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－３６－２ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－３６－３ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－３６－５ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－３６－６ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－３６－７ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－３６－８ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－３６－９ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－３６－１０ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－３６－１１ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－３６－１２ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－３６－１３ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－３６－１４ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－４２－１ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－４２－２ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－４２－３ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－４２－４ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－４２－９ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－４２－１１ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－４２－１２ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－４２－１３ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－４２－１４ＡＳＯは、ＺＩＣ５ｍＲＮＡの発現を５０％以上阻害した。
【0143】
これら２２本のアンチセンス鎖は、配列番号２の核酸塩基１７１９―１７３７、１７１９―１７３６、１７１９―１７３５、１７１９―１７３３、１７１８―１７３２、１７１７―１７３２、１７１６―１７３２、１７１５―１７３２、１７１４―１７３２、１７１８―１７３３、１７１７―１７３４、１７１６―１７３５、１７１９―１７３２、２１９１―２２０９、２１９１―２２０８、２１９１―２２０７、２１９１―２２０６、２１８７―２２０４、２１９０―２２０５、２１８９―２２０６、２１８８―２２０７、２１９１―２２０４のセンス部分とハイブリダイズする。
【0144】
これら２２本のアンチセンス鎖の配列番号は、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３６、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１である。
【0145】
Ｒｅｎ－４－３６－１ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－３６－６ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－３６－１１ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－４２－３ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－４２－４ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－４２－１１ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－４２－１２ＡＳＯは、３０ｎＭでＺＩＣ５ｍＲＮＡの発現を８０％以上阻害した。
【0146】
Ｒｅｎ－４－３６－１ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－３６－６ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－４２－１２ＡＳＯは３０ｎＭ、５０ｎＭの両方でＺＩＣ５ｍＲＮＡの発現を８０％以上阻害した。Ｒｅｎ－４－３６－１ＡＳＯは、３０ｎＭ、５０ｎＭの両方でＺＩＣ５ｍＲＮＡの発現を８７％以上阻害した。
【0147】
表８は、ＡＳＯ濃度３０ｎＭ，５０ｎＭにおけるＺＩＣ５ｍＲＮＡの相対発現率（ＺＩＣ５／ＡＣＴＢ）を示す表である。
【0148】
【表8】
【0149】
表８に示す通り、Ｒｅｎ－４－３６－１ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－３６－２ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－３６－３ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－３６－５ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－３６－６ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－３６－７ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－３６－８ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－３６－９ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－３６－１０ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－３６－１１ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－３６－１２ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－３６－１３ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－３６－１４ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－４２－１ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－４２－２ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－４２－３ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－４２－４ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－４２－５ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－４２－７ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－４２－１０ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－４２－１１ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－４２－１２ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－４２－１３ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－４２－１４ＡＳＯの２４本は、ＺＩＣ５ｍＲＮＡの発現を５０％以上阻害した。
【0150】
これら２４本のアンチセンス鎖は、配列番号２の核酸塩基１７１９―１７３７、１７１９―１７３６、１７１９―１７３５、１７１９―１７３３、１７１８―１７３２、１７１７―１７３２、１７１６―１７３２、１７１５―１７３２、１７１４―１７３２、１７１８―１７３３、１７１７―１７３４、１７１６―１７３５、１７１９―１７３２、２１９１―２２０９、２１９１―２２０８、２１９１―２２０７、２１９１―２２０６、２１９１－２２０５、２１８９－２２０４、２１８６－２２０４、２１９０―２２０５、２１８９―２２０６、２１８８―２２０７、２１９１―２２０４のセンス部分とハイブリダイズする。
【0151】
これら２４本のアンチセンス鎖の配列番号は、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３４、配列番号１３７、配列番号１３８、配列番号１３９、配列番号１４０、配列番号１４１である。
【0152】
Ｒｅｎ－４－３６－１ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－４２－３ＡＳＯ、Ｒｅｎ－４－４２－４ＡＳＯは、３０ｎＭでＺＩＣ５ｍＲＮＡの発現を８０％以上阻害した。
【0153】
Ｒｅｎ－４－３６－１ＡＳＯは、３０ｎＭ、５０ｎＭの両方でＺＩＣ５ｍＲＮＡの発現を８４％以上阻害した。
【0154】
実施例４
ヒトメラノーマ細胞Ａ３７５を５×１０５ｃｅｌｌｓをマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ製）５０μＬと混合し、皮下移植した免疫不全マウスを被験体とし、被験体におけるＲｅｎ－４－３６－１ＡＳＯ投与による抗腫瘍作用を検証した。
ヒトメラノーマ細胞Ａ３７５を５×１０５ｃｅｌｌｓをマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ製）５０μＬと混合し、皮下移植した免疫不全マウスを被験体とし、被験体におけるＲｅｎ－４－３６－１ＡＳＯ投与による抗腫瘍作用を検証した。
【0155】
発明者らは、免疫不全マウスにヒトメラノーマ細胞Ａ３７５を皮下移植した担癌マウスを作製し、腫瘍抑制試験を行った。各群９匹ずつに対して、ＰＢＳまたはＲｅｎ－４－３６－１ＡＳＯを１．５μｍｏｌ／ｋｇの量で週一回、３週に亘り、繰り返し尾静脈から投与を行った。１回目の投与（８日目）、２回目の投与（１５日目）、３回目の投与（２２日目）、３回目の投与から１週間後（２９日目）にそれぞれ被験体の腫瘍体積（ｍｍ３）を測定した。また、３回目の投与から１週間後（２９日目）に被験体の腫瘍組織を摘出しＺＩＣ５ｍＲＮＡのノックダウン活性を測定した。ノックダウン活性の算出方法は、実施例２に記載したＺＩＣ５ｍＲＮＡの相対発現率の算出方法に従って行った。
【0156】
【0157】
図１は ｉｎ ｖｉｖｏ試験におけるＲｅｎ－４－３６－１ＡＳＯによる腫瘍サイズの推移を示す。Ｒｅｎ－４－３６－１ＡＳＯの投与により腫瘍体積は減少した。２２日以降の腫瘍体積の減少幅は拡大傾向を示した。
【0158】
図２Ａ、２Ｂは ｉｎ ｖｉｖｏ試験におけるＲｅｎ－４－３６－１ＡＳＯによるＺＩＣ５ ｍＲＮＡの相対発現率を示す。ｎ＝１－９の平均値Ａｖは、ＰＢＳ投与群３．３７に比べＲｅｎ－４－３６－１ＡＳＯ投与群の平均値Ａｖ１．９９と、Ｒｅｎ－４－３６－１ＡＳＯはＺＩＣ５ ｍＲＮＡの発現を抑制した（図２Ａ）。ｎ＝９のデータを統計処理し、Ｒｅｎ－４－３６－１ＡＳＯの投与により腫瘍体積は減少し、腫瘍におけるＺＩＣ５ ｍＲＮＡ量の有意な減少がみられた（図２Ｂ Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ ＰＢＳ投与群 ＊＊：ｐ＜０．０１）。
【0159】
実施例５
リガンドの選択試験を実施した。
ＨＤＯのＲＮＡ鎖にリガンド分子を付加することで、ＨＤＯをがん細胞選択的にデリバリーすることが可能である。メラノーマ特異的にＨＤＯをデリバリーするために適切なリガンドを確認した。
リガンドの選択試験を実施した。
ＨＤＯのＲＮＡ鎖にリガンド分子を付加することで、ＨＤＯをがん細胞選択的にデリバリーすることが可能である。メラノーマ特異的にＨＤＯをデリバリーするために適切なリガンドを確認した。
【0160】
本実施例では下記に示す配列番号１４２のアンチセンス鎖と、配列番号１４３の相補鎖（配列番号１４２のアンチセンス鎖に相補的でありハイブリダイズ可能に構成されている）とからなり、ヒトＭａｌａｔ１ ｎｃＲＮＡを標的とするＨＤＯを用いて、メラノーマ特異的にＨＤＯをデリバリーするために適切なリガンドを評価した。ＨＤＯはヒトＭａｌａｔ１ ｎｃＲＮＡを標的とする連続する１６個の核酸（１６ｍｅｒ）からなるアンチセンス鎖であり、ヒトＭａｌａｔ１ ｎｃＲＮＡの標的部位にハイブリダイズ可能な次の配列で構成されている。アンチセンス鎖と相補鎖の配列は次の通りである。
【0161】
アンチセンス鎖：５’-Ｇ（Ｌ）＾Ｃ（Ｌ）＾Ａ（Ｌ）＾ｔ＾ｔ＾ｃ＾ｔ＾ａ＾ａ＾ｔ＾ａ＾ｇ＾ｃ＾Ａ（Ｌ）＾Ｇ（Ｌ）＾Ｃ（Ｌ）―３’（Ｍａｌａｔ１ＡＳＯ、配列番号１４２）
センス鎖：５’-Ｇ（Ｍ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｕ（Ｍ）ＧＣＵＡＵＵＡＧＡＡＵ（Ｍ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｃ（Ｍ）―３’（Ｍａｌａｔ１ＳＯ、配列番号１４３）
センス鎖：５’-Ｇ（Ｍ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｕ（Ｍ）ＧＣＵＡＵＵＡＧＡＡＵ（Ｍ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｃ（Ｍ）―３’（Ｍａｌａｔ１ＳＯ、配列番号１４３）
【0162】
上記アンチセンス鎖、センス鎖の配列式中、小文字はＤＮＡを表し、大文字はＲＮＡを表し、（Ｌ）はＬＮＡを表し、Ｃ（Ｌ）は５－メチルシトシンＬＮＡを表し、（Ｍ）は２’―Ｏ―メチル糖修飾を表し、＾はホスホロチオエート結合を表す。
【0163】
Ｍａｌａｔ１ＡＳＯと、Ｍａｌａｔ１ＳＯがアニーリングしているＨＤＯを、Ｍａｌａｔ１ＨＤＯという。
【0164】
オリゴ核酸とｃＲＧＤ基はトリアゾール環、ＳＳ結合、Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ－Ｔｈｉｏｌ結合など介した共有結合させることが可能である。
【0165】
【化2】
【0166】
例えば相補鎖Ｍａｌａｔ１ＳＯにｃＲＧＤを結合させる方法としては、配列番号１４３のＭａｌａｔ１ＳＯの５’端にＸ（ビシクロオクチン－カルボニル－ヘキシルアミノ基）を結合した５′ジベンゾシクロオクチン－スクシニル－ヘキシルアミノオリゴ核酸（５’-ＸＧ（Ｍ）＾Ｃ（Ｍ）＾Ｕ（Ｍ）ＧＣＵＡＵＵＡＧＡＡＵ（Ｍ）＾Ｇ（Ｍ）＾Ｃ（Ｍ）―３’
【0167】
配列中、Ｘはビシクロオクチン－カルボニル－ヘキシルアミノ基、小文字はＤＮＡを表し、大文字はＲＮＡを表し、（Ｌ）はＬＮＡを表し、Ｃ（Ｌ）は５－メチルシトシンＬＮＡを表し、（Ｍ）は２’―Ｏ―メチル糖修飾を表し、＾はホスホロチオエート結合を表す。）に対し、ｃＲＧＤｆＫとＡｚｉｄｏ－ＰＥＧ４－ＮＨＳｅｓｔｅｒをＤＭＳＯ溶媒化縮合させることで合成することができるｃＲＧＤ－Ａｍｉｄｅ－Ｐｅｇ４－Ａｚｉｄｅを加え、攪拌後５分から～３６時間静置する事で合成ができる。この際Ａｚｉｄｏ－ＰＥＧ４－ＮＨＳに変えて任意の長さのＰＥＧ基をもつＡｚｉｄｏ－ＰＥＧｎ－ＮＨＳ（ｎ＝１～３２）や任意の長さのアルキル基を持つＡｚｉｄｏ－（ＣＨ２）ｎ－ＮＨＳ（ｎ＝１～３２）用いる事で任意を用いても同様に対応するアジドを合成しオリゴ核酸に結合させることができる。
【0168】
反応後の溶液を８ｍＭトリエチルアミン１００ｍＭヘキサフルオロイソプロパノール５％(v/v)メタノール水溶液で希釈し、ＨＰＬＣにて精製（カラム：ＹＭＣ－ＴｒｉａｒｔＣ１８、１５０Ｘ１０．０ｍｍＩＤ Ｓ－５μｍ；溶離液：Ａ ８ｍＭ トリエチルアミン１００ｍＭヘキサフルオロイソプロパノール５％(w/v)メタノール水溶液、Ｂ ８０％(w/v)メタノール水溶液；溶出条件：４．７ｍＬ／分、０－６０％Ｂ）を行った。溶媒を減圧下除去した後に、水（１ｍＬ）に再度溶解し、塩化ナトリウム水溶液を（５．０Ｍ、３０μＬ）添加・攪拌した後、ＥｔＯＨ（４ｍＬ）を加え遠心した。得られた沈殿は８０％(w/v)ＥｔＯＨで洗浄したのち減圧下乾燥させ、ｃＲＧＤ－Ｍａｌａｔ１ＳＯを得た。
【0169】
上記プロセスにおいて、Ｍａｌａｔ１ＳＯを任意のオリゴ核酸配列に変更することで、任意のオリゴ核酸を得ることが可能である。例えばＭａｌａｔ１ＡＳＯとすることでｃＲＧＤ―Ｍａｌａｔ１ＡＳＯが合成可能である。
【0170】
Ｍａｌａｔ１ＡＳＯ（１０ｎｍｏｌ）と、ｃＲＧＤ－Ｍａｌａｔ１ＳＯ（１０．５ｎｍｏｌ）を混合させ溶媒を除去することでリガンドを結合させたＨＤＯであるｃＲＧＤ－Ｍａｌａｔ１ＨＤＯを得た。ｃＲＧＤ－Ｍａｌａｔ１ＨＤＯに生理食塩液（大塚生食注（大塚製薬））を添加し、この溶液を９５℃で５分加熱し、溶液をゆっくりと室温に冷却してアニールを実施した。
【0171】
上記の合成プロセスで、オリゴ核酸の配列をＭａｌａｔ１を任意の配列に変更することができる。例えば、Ｒｅｎ－４－３６とすることでｃＲＧＤ―Ｒｅｎ－４－３６―ＨＤＯを合成可能である。また、５′ジベンゾシクロオクチン－スクシニル－ヘキシルアミノ基に代えて、５′ビシクロオクチン－カルボニル－ヘキシルアミノ基にかえてもｃＲＧＤ基を導入することが可能である。
【0172】
配列番号１４３：Ｍａｌａｔ１ＳＯの５’端に３―（２―ピリジルジチオプロピオニル－ヘキシルアミノ基を修飾した５′３―（２―ピリジルジチオプロピオニル－ヘキシルアミノオリゴ核酸（１．０ｍＭ１．０ｍＬ、：５’－ＸＧ＊Ｃ＊Ａ＊ＵＵＣＡＧＵＧＡＡＣ＊Ｕ＊Ａ＊Ｇ－３’、Ｘは３―（２―ピリジルジチオプロピオニル－ヘキシルアミノ基、＊はホスホロチオエート結合、大文字斜体は２’－Ｏ－メチル糖修飾を表し、大文字はＲＮＡを表す）に対し、ｃＲＧＤｆＣを加え攪拌後５分から３６時間静置した。８ｍＭトリエチルアミン１００ｍＭヘキサフルオロイソプロパノール５％(w/v)メタノール水溶液で希釈し、ＨＰＬＣにて精製（カラム：ＹＭＣ－ＴｒｉａｒｔＣ１８、１５０Ｘ１０．０ｍｍＩＤ Ｓ－５μｍ；溶離液：Ａ ８ｍＭ トリエチルアミン１００ｍＭヘキサフルオロイソプロパノール５％(w/v)メタノール水溶液、Ｂ ８０％(w/v)メタノール水溶液；溶出条件：４．７ｍＬ／分、０－６０％Ｂ）を行った。溶媒を留去後、水（１ｍＬ）に再度溶解し、塩化ナトリウム水溶液を（５．０Ｍ、３０μＬ）添加・攪拌した後、エタノール（４ｍＬ）を加え遠心した。得られた沈殿は８０％(w/v)ＥｔＯＨで洗浄したのち減圧下乾燥させ、ｃＲＧＤｆＣ－Ｍａｌａｔ１ＳＯを得た。
【0173】
Ｍａｌａｔ１ＡＳＯ（１０ｎｍｏｌ）と、ｃＲＧＤｆＣ－Ｍａｌａｔ１ＳＯ（１０．５ｎｍｏｌ）を混合させ溶媒を除去することでリガンドを結合させたＨＤＯであるｃＲＧＤ－Ｍａｌａｔ１ＨＤＯを得た。ｃＲＧＤ－Ｍａｌａｔ１ＨＤＯに生理食塩液（大塚生食注（大塚製薬））を添加し、この溶液を９５℃で５分加熱し、溶液をゆっくりと室温に冷却してアニールを実施した。
【0174】
ｃＲＧＤ以外のリガンド：コレステロール（Ｃｈｏｌ）、トコフェノール（Ｔｏｃ）、ＶＰＣ－Ｐも同様の方法によりＭａｌａｔ１ＨＤＯに付加した。
【0175】
【表9】
【0176】
実施例２で作成したＭａｌａｔ１ＨＤＯと、リガンド結合したＭａｌａｔ１ＨＤＯの培養細胞における標的遺伝子ノックダウン効果を試験した。この実験では、ヒトメラノーマ細胞株Ａ３７５（ＡＴＣＣより入手）を使用した。３７℃にて５％ＣＯ２中、Ａ３７５細胞を、１０％(w/v)ウシ胎仔血清（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、および１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補充したダルベッコ改変イーグル培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で維持した。１０ｃｍ ｄｉｓｈ１枚に８０％コンフルエントな状態の細胞を、０．２５％（ｗ／ｖ）トリプシンー０．５３ｍＭ ＥＤＴＡを用いて回収した後、４８ｗｅｌｌ―ｐｌａｔｅに細胞を２×１０４／ｗｅｌｌで播種し、３７℃で培養した。翌日、終濃度が１０、１００、１０００μＭのＨＤＯを培養液中に添加し、４８ｗｅｌｌ―ｐｌａｔのｗｅｌｌに全量加えた。陰性対照として、ＰＢＳ添加群を実施した。各ＨＤＯ添加７日後、上清を捨てて細胞からＬｙｓｉｓ ｂｕｆｆｅｒを用いてＲＮＡを抽出し、ＳＶ９６ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてＴｏｔａｌ ＲＮＡを精製し、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡからＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＲＴ ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ、ＲＲ０３６Ａ）を用いてｃＤＮＡを合成した。さらにこれを２分の１に希釈した後、Ｌｕｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ、Ｍ３００３）とヒトＭａｌａｔ１とヒトＧａｐｄｈのプライマーおよびプローブ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｈｓ００２７３９０７＿ｓ１、Ｈｓ０２７８６６２４＿ｇ１）を用いてｑＰＣＲを行いｈＭａｌａｔ１とｈＧａｐｄｈ ｍＲＮＡ発現量はヒトＭａｌａｔ１とヒトＧａｐｄｈ ｍＲＮＡの各Ｃｔ値を測定した後、ΔΔＣｔ法に基づく相対定量法により算出した。
【0177】
上記の方法で、各ＨＤＯについて内在遺伝子Ｍａｌａｔ１のノックダウン効果試験を実施した。結果を図３に示す。図３の縦軸は、相対的なｈＭａｌａｔ１ ｎｃＲＮＡ発現量を示す。０ｎMのＨＤＯを投与した時のｈＭａｌａｔ１ ｎｃＲＮＡ発現量を１とした。図３に於いて横軸は、ＰＢＳ群又は１０ｎｍｏｌ／Ｌ、１００ｎｍｏｌ／Ｌ、１０００ｎｍｏｌ／ＬのＭａｌａｔ１ＨＤＯ、Ｃｈｏｌ―Ｍａｌａｔ１ＨＤＯ、Ｔｏｃ－Ｍａｌａｔ１ＨＤＯ、ｃＲＧＤ－Ｍａｌａｔ１ＨＤＯ又はＶＰＣ－Ｐ―Ｍａｌａｔ１ＨＤＯを表す。縦軸は、相対発現レベル（ｈＭａｌａｔ１ ｎｃＲＮＡ発現量／ｈＧａｐｄｈ ｍＲＮＡ発現量）を表す。図３に示すように、１０ｎｍｏｌ／Ｌまたは１００ｎｍｏｌ／Ｌまたは１０００ｎｍｏｌ／ＬのＭａｌａｔ１ＨＤＯ添加で３１、３０、７０％のｈＭａｌａｔ１ ｎｃＲＮＡ発現量のノックダウン効果が確認された。１０ｎｍｏｌ／Ｌまたは１００ｎｍｏｌ／Ｌまたは１０００ｎｍｏｌ／ＬのＣｈｏｌ―Ｍａｌａｔ１ＨＤＯ添加で２５、７２、６５％のｈＭａｌａｔ１ ｎｃＲＮＡ発現量のノックダウン効果が確認された。１０ｎｍｏｌ／Ｌまたは１００ｎｍｏｌ／Ｌまたは１０００ｎｍｏｌ／ＬのＴｏｃ―Ｍａｌａｔ１ＨＤＯ添加で２６、２０、６８％のｈＭａｌａｔ１ ｎｃＲＮＡ発現量のノックダウン効果が確認された。１０ｎｍｏｌ／Ｌまたは１００ｎｍｏｌ／Ｌまたは１０００ｎｍｏｌ／ＬのｃＲＧＤ―Ｍａｌａｔ１ＨＤＯ添加で４、１８、５２％のｈＭａｌａｔ１ ｎｃＲＮＡ発現量のノックダウン効果が確認された。１００ｎｍｏｌ／Ｌまたは１０００ｎｍｏｌ／ＬのＶＰＣ－Ｐ―Ｍａｌａｔ１ＨＤＯ添加で８、６８％のｈＭａｌａｔ１ ｎｃＲＮＡ発現量のノックダウン効果が確認された。図３に示すとおりに、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、トコフェノール（Ｔｏｃ）、ｃＲＧＤ、ＶＰＣ－ＰはＭａｌａｔ１ＨＤＯをヒトメラノーマ細胞Ａ３７５にＨＤＯをデリバリーする効果があることが明らかとなった。
【0178】
Ｍａｌａｔ１ＨＤＯと、各リガンド結合したＭａｌａｔ１ＨＤＯのＩＣ５０値を調べた。結果を表１０に示す。
【0179】
【表10】
【0180】
実施例６
ヒトメラノーマ細胞Ａ３７５を５×１０５ｃｅｌｌｓをマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ製）５０μＬと混合し、皮下移植した免疫不全マウスを被験体とし、被験体におけるＣｈｏｌ－Ｒｅｎ－４－３６－１ＨＤＯ投与による抗腫瘍作用を検証した。
ヒトメラノーマ細胞Ａ３７５を５×１０５ｃｅｌｌｓをマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ製）５０μＬと混合し、皮下移植した免疫不全マウスを被験体とし、被験体におけるＣｈｏｌ－Ｒｅｎ－４－３６－１ＨＤＯ投与による抗腫瘍作用を検証した。
【0181】
実施例５で複数のリガンドを付加したＨＤＯを用いて検討を行ったところ、コレステロール（ｃｈｏｌ）を付加したものでより低濃度でメラノーマ細胞内に取り込まれることを見出した。そこで、発明者らはＺＩＣ５標的ＨＤＯを用いたリガンドの効果を調べるため、担癌マウスにＣｈｏｌ－Ｒｅｎ－４－３６－１ＨＤＯを静脈内投与したときのｉｎ ｖｉｖｏ での腫瘍抑制効果を検証した。Ｃｈｏｌ－Ｒｅｎ－４－３６－１ＨＤＯを１．５μｍｏｌ／ｋｇの量で週一回、２週間、尾静脈投与を行った。その結果、肝毒性がみられたがＣｈｏｌ－Ｒｅｎ－４－３６－１ＨＤＯの投与により、腫瘍が有意に退縮した（図４ Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｔｏ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐ ｏｎ Ｄａｙ１９＊＊：ｐ＜０．０１）。
【0182】
図４は、Ｃｈｏｌ－Ｒｅｎ－４－３６－１ＨＤＯを担癌マウスに静脈投与したときの腫瘍の大きさの推移を示す。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【配列表】