特開 2024-89917 細胞培養デバイスおよび細胞培養方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024089917

(43)【公開日】2024-07-04

(54)【発明の名称】細胞培養デバイスおよび細胞培養方法

(51)【国際特許分類】

   C12M 3/00 20060101AFI20240627BHJP

   C12N 1/00 20060101ALI20240627BHJP

【ＦＩ】

C12M3/00 Z

C12N1/00 B

【審査請求】有

【請求項の数】7

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2022205460

(22)【出願日】2022-12-22

(11)【特許番号】

(45)【特許公報発行日】2024-02-29

(71)【出願人】

【識別番号】591163960

【氏名又は名称】大阪冶金興業株式会社

(71)【出願人】

【識別番号】522497870

【氏名又は名称】寺内 俊太郎

(71)【出願人】

【識別番号】501249076

【氏名又は名称】久保木 芳徳

(74)【代理人】

【識別番号】110002952

【氏名又は名称】弁理士法人鷲田国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】久保木 芳徳

【テーマコード（参考）】

4B029

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B029AA11

4B029BB11

4B029CC02

4B029DG10

4B065AA90X

4B065BC41

4B065BC50

4B065CA44

(57)【要約】

【課題】簡単な構成で力学的刺激を与えて細胞増殖を促進させうる細胞培養デバイスを提供すること。
【解決手段】細胞培養デバイスは、細胞を定着させた培養基材を収容するための箱体と、前記箱体内に前記箱体の深さ方向に移動可能に配置された可動蓋体と、を有する。前記培養基材は、前記箱体の底板と前記可動蓋体との間に配置される。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞を定着させた培養基材を収容するための箱体と、
前記箱体内に前記箱体の深さ方向に移動可能に配置された可動蓋体と、
を有し、
前記培養基材は、前記箱体の底板と前記可動蓋体との間に配置される、
細胞培養デバイス。

【請求項2】

前記箱体外への前記可動蓋体の脱落を防ぐための脱落防止部をさらに有する、請求項１に記載の細胞培養デバイス。

【請求項3】

前記箱体内に収容された前記培養基材に向けて前記可動蓋体を押圧するための弾性部材をさらに有する、請求項１に記載の細胞培養デバイス。

【請求項4】

前記底板と前記可動蓋体との間に配置されるスペーサーをさらに有する、請求項３に記載の細胞培養デバイス。

【請求項5】

前記底板および前記可動蓋体の少なくとも一方は、多孔質体である、請求項１に記載の細胞培養デバイス。

【請求項6】

前記箱体および前記可動蓋体は、チタン製である、請求項１に記載の細胞培養デバイス。

【請求項7】

前記底板および前記可動蓋体は、チタン不織布である、請求項１に記載の細胞培養デバイス。

【請求項8】

請求項１～７のいずれか一項に記載の細胞培養デバイスの前記箱体の前記底板と前記可動蓋体との間に、細胞を定着させた培養基材を収容する工程と、
前記培養基材を収容した前記細胞培養デバイスを回転させながら細胞を培養する工程と、
を有する、細胞培養方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、細胞培養デバイスおよび細胞培養方法に関する。

【背景技術】

【0002】

再生医療は、幹細胞などを用いて損傷した臓器や組織を再生し、失われた機能を回復させることを目指している。再生医療には様々なものがあるが、例えば、患者の体外において幹細胞などから人工的に構築した臓器や組織を患者の体内に移植する方法がある。

【0003】

本発明者らは、生体外において生体と同様に組織を形成するためには、（１）細胞、（２）三次元培養基材（細胞外マトリックスに対応）、（３）液性制御因子、（４）栄養供給系（血管系に対応）だけでなく、（５）力学的刺激も重要であると考えている。この考えに基づいて、本発明者らは、通常と異なる方向に重力を作用させながら細胞を培養する反重力培養方法およびこれに用いる装置を提案してきた（例えば、特許文献１および２参照）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】特開２０１２－９０５８４号公報

【特許文献2】特開２０１４－７６０２６号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

上記のように、本発明者らは、（５）力学的刺激として通常と異なる方向に重力を作用させることで細胞増殖を促進させうることを見出したが、（５）力学的刺激としてさらに異なる刺激を細胞に与えることでさらに細胞増殖や組織形成効率を向上させうるのではないかと考えた。

【0006】

本発明は、かかる点に鑑みてなされたものであり、簡単な構成で力学的刺激を与えて細胞増殖を促進させうる細胞培養デバイスおよびこれを用いた細胞培養方法を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本発明は、以下の細胞培養デバイスおよび細胞培養方法に関する。
［１］細胞を定着させた培養基材を収容するための箱体と、前記箱体内に前記箱体の深さ方向に移動可能に配置された可動蓋体と、を有し、前記培養基材は、前記箱体の底板と前記可動蓋体との間に配置される、細胞培養デバイス。
［２］前記箱体外への前記可動蓋体の脱落を防ぐための脱落防止部をさらに有する、［１］に記載の細胞培養デバイス。
［３］前記箱体内に収容された前記培養基材に向けて前記可動蓋体を押圧するための弾性部材をさらに有する、［１］または［２］に記載の細胞培養デバイス。
［４］前記底板と前記可動蓋体との間に配置されるスペーサーをさらに有する、［１］～［３］のいずれか一項に記載の細胞培養デバイス。
［５］前記箱体の底板および前記可動蓋体の少なくとも一方は、多孔質体である、［１］～［４］のいずれか一項に記載の細胞培養デバイス。
［６］前記箱体および前記可動蓋体は、チタン製である、［１］～［５］のいずれか一項に記載の細胞培養デバイス。
［７］前記箱体の底板および前記可動蓋体は、チタン不織布である、［１］～［６］のいずれか一項に記載の細胞培養デバイス。
［８］［１］～［７］のいずれか一項に記載の細胞培養デバイスの前記箱体の底板と前記可動蓋体との間に、細胞を定着させた培養基材を収容する工程と、前記培養基材を収容した前記細胞培養デバイスを回転させながら細胞を培養する工程と、を有する、細胞培養方法。

【発明の効果】

【0008】

本発明によれば、簡単な構成で、細胞を培養する際に、力学的刺激として圧力またはせん断応力を細胞に加えて細胞増殖を促進させることができる。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】図１は、本発明の実施の形態１に係る細胞培養デバイスの斜視図である。

【図2】図２Ａは、実施の形態１に係る細胞培養デバイスの平面図であり、図２Ｂは、図２ＡのＡ－Ａ線の断面図である。

【図3】図３Ａ～Ｃは、実施の形態１に係る細胞培養デバイスを用いた細胞培養の一例を示す図である。

【図4】図４Ａは、箱体の開口部が上方にあるときの細胞培養デバイスの様子を示す断面図であり、図４Ｂは、箱体の開口部が下方にあるときの細胞培養デバイスの様子を示す断面図である。

【図5】図５Ａは、本発明の実施の形態２に係る細胞培養デバイスの平面図であり、図５Ｂは、図５ＡのＢ－Ｂ線の断面図である。

【図6】図６は、実施の形態２に係る細胞培養デバイスを用いた細胞培養の一例を示す図である。

【図7】図７Ａは、箱体の開口部が上方にあるときの細胞培養デバイスの様子を示す断面図であり、図７Ｂは、箱体の開口部が下方にあるときの細胞培養デバイスの様子を示す断面図である。

【図8】図８は、実施例１の実験結果を示すグラフである。

【図9】図９Ａ～Ｃは、実施例２の培養条件を説明するための断面図である。

【図10】図１０は、実施例２の実験結果を示すグラフである。

【発明を実施するための形態】

【0010】

以下、図面を参照しつつ、本発明の実施の形態について説明する。

【0011】

［実施の形態１］
（細胞培養デバイスの構成）
図１は、本発明の実施の形態１に係る細胞培養デバイス１００の斜視図である。図２Ａは、細胞培養デバイス１００の平面図であり、図２Ｂは、図２ＡのＡ－Ａ線の断面図である。

【0012】

図１～図２Ｂに示されるように、本実施の形態に係る細胞培養デバイス１００は、箱体１１０、可動蓋体１２０および脱落防止部１３０を有する。図２Ｂに示されるように、細胞培養デバイス１００は、箱体１１０の底板１１１と可動蓋体１２０との間に細胞を定着させた培養基材１４０を配置した状態で使用される。

【0013】

箱体１１０は、細胞を定着させた培養基材１４０を収容するための、開口部を有する容器である。本実施の形態では、箱体１１０は、底板１１１、側板１１２および開口部１１３を有する。箱体１１０の形状および大きさは、上記機能を発揮できれば特に限定されない。たとえば、箱体１１０の平面視形状は、縦８～１０ｃｍ程度、横３～５ｃｍ程度の略長方形である。箱体１１０内において可動蓋体１２０を箱体１１０の深さ方向に自由に移動できるようにする観点からは、箱体１１０の収容部（内部）の深さは、培養基材１４０および可動蓋体１２０の合計厚みよりもある程度大きいことが好ましい。

【0014】

箱体１１０を構成する材料は、細胞培養に悪影響を及ぼさず、かつ必要な強度を有するものであれば特に限定されないが、オートクレーブなどで滅菌できるものが好ましい。箱体１１０を構成する材料の例には、チタンや窒化チタン、チタン合金、ステンレス鋼などの金属、ポリプロピレンやポリスチレン、ポリエチレンなどの樹脂、セラミックスが含まれる。本実施の形態では、箱体１１０および可動蓋体１２０は、チタン製である。

【0015】

培養基材１４０内の細胞に酸素および栄養を到達させる観点、および液体培地中において可動蓋体１２０を移動させやすくする観点からは、箱体１１０および可動蓋体１２０の少なくとも一方は、貫通穴を有していることが好ましく、少なくともその一部が多孔質体であることがより好ましい。たとえば、箱体１１０の底板１１１および可動蓋体１２０の少なくとも一方が多孔質体であることが好ましく、箱体１１０の底板１１１および可動蓋体１２０の両方が多孔質体であることがより好ましい。本実施の形態では、箱体１１０の底板１１１は、多孔質体であるチタン不織布（例えば、株式会社ハイレックスコーポレーションのZellezや大阪冶金興業株式会社のチタン線維膜など）で構成されており、側板１１２は、チタンプレートで構成されている。箱体１１０の底板１１１の厚さは、特に限定されないが、例えば０．５～１ｍｍ程度である。

【0016】

また、細胞と接触する可能性がある箱体１１０の内面は、細胞増殖や細胞接着を促進させるためにコーティングされていてもよい。コーティングの材料は、特に限定されず、培養する細胞の種類などに応じて適宜選択されうる。コーティングの材料の例には、コラーゲンやエラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチンなどの細胞外基質を構成するタンパク質、ポリリジンやポリオルニチンなどのアミノ酸重合体などが含まれる。
本実施の形態では、箱体１１０の底板１１１は、コラーゲンでコーティングされている。

【0017】

可動蓋体１２０は、細胞を定着させた培養基材１４０を覆うように箱体１１０内に配置された蓋である。可動蓋体１２０は、重力などの力を受けることで、箱体１１０内において箱体１１０の深さ方向に自由に移動できるように配置される。この後説明するように、可動蓋体１２０が移動することで、培養基材１４０に定着した細胞に、圧力やせん断応力などの力学的刺激が加えられることとなる。

【0018】

可動蓋体１２０の形状および大きさは、上記機能を発揮できれば特に限定されない。本実施の形態では、可動蓋体１２０は、板状である。箱体１１０内において可動蓋体１２０を箱体１１０の深さ方向に自由に移動できるようにする観点からは、可動蓋体１２０の水平方向の大きさ（図２Ａにおける上下方向および左右方向の大きさ）は、箱体１１０の収容部の水平方向の大きさよりもある程度余裕をもって小さいことが好ましい。また、培養基材１４０に定着した細胞に力学的刺激を加える観点からは、可動蓋体１２０の水平方向の大きさは、培養基材１４０水平方向の大きさよりもある程度余裕をもって大きいことが好ましく、可動蓋体１２０は、ある程度の重量を有するように構成されていることが好ましい。可動蓋体１２０の厚さは、培養基材１４０に定着した細胞に加えようとする力学的刺激に応じて適宜調整され、箱体１１０の底板１１１よりも厚くてもよい。

【0019】

可動蓋体１２０を構成する材料は、細胞培養に悪影響を及ぼさず、かつ必要な強度を有するものであれば特に限定されないが、オートクレーブなどで滅菌できるものが好ましい。可動蓋体１２０を構成する材料の例には、チタンや窒化チタン、チタン合金、ステンレス鋼などの金属、ポリプロピレンやポリスチレン、ポリエチレンなどの樹脂、セラミックスが含まれる。前述のとおり、本実施の形態では、箱体１１０および可動蓋体１２０は、チタン製である。

【0020】

前述のとおり、培養基材１４０内の細胞に酸素および栄養を到達させる観点、および液体培地中において可動蓋体１２０を移動させやすくする観点からは、箱体１１０および可動蓋体１２０の少なくとも一方は、貫通穴を有していることが好ましく、少なくともその一部が多孔質体であることがより好ましい。たとえば、箱体１１０の底板１１１および可動蓋体１２０の少なくとも一方が多孔質体であることが好ましく、箱体１１０の底板１１１および可動蓋体１２０の両方が多孔質体であることがより好ましい。本実施の形態では、可動蓋体１２０は、多孔質体であるチタン不織布（例えば、株式会社ハイレックスコーポレーションのZellezや大阪冶金興業株式会社のチタン線維膜など）で構成されている。

【0021】

また、細胞と接触する可能性がある可動蓋体１２０は、細胞増殖や細胞接着を促進させるためにコーティングされていてもよい。コーティングの材料は、特に限定されず、培養する細胞の種類などに応じて適宜選択されうる。コーティングの材料の例には、コラーゲンやエラスチン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチンなどの細胞外基質を構成するタンパク質、ポリリジンやポリオルニチンなどのアミノ酸重合体などが含まれる。
本実施の形態では、可動蓋体１２０は、コラーゲンでコーティングされている。

【0022】

脱落防止部１３０は、箱体１１０外への可動蓋体１２０の脱落を防ぐための部材である。脱落防止部１３０の構成は、上記機能を発揮できれば特に限定されない。本実施の形態では、脱落防止部１３０は、箱体１１０の開口部１１３付近に着脱可能に取り付けられた２本の棒である。図１～図２Ｂでは、箱体１１０の側板１１２には４つの貫通孔が設けられているが、例えば異なる高さに４つずつ貫通孔が設けられていてもよい。このようにすることで、脱落防止部１３０として機能する２本の棒の高さを変更して、可動蓋体１２０の可動範囲を調整することができるようになる。

【0023】

培養基材１４０は、増殖させたり、組織または臓器を形成させたりするための細胞を培養するための足場である。前述のとおり、培養基材１４０は、箱体１１０の底板１１１と可動蓋体１２０との間に配置される。可動蓋体１２０と同様に、培養基材１４０も、重力などの力（例えば、後述する蓋付き試験管３００の回転に伴う重力の方向の変化）を受けることで、箱体１１０内において箱体１１０の深さ方向に自由に移動できるように配置される。

【0024】

培養基材１４０の種類、形状および大きさは、特に限定されず、公知の３次元培養基材から培養する細胞の種類などに応じて適宜選択されうる。培養基材１４０の例には、コラーゲン線維膜（コラーゲンゲル）、コラーゲンスポンジ（例えば、株式会社高研のコラーゲンスポンジ、コラーゲンスポンジ ハニカム、）、チタン不織布（例えば、株式会社ハイレックスコーポレーションのZellezや大阪冶金興業株式会社のチタン線維膜など）、樹脂製足場材（例えば、3D Biotek社の3D Insert-PSや3D Insert-PCL、Nanofiber solutions社のNanoECMやNanoHep）が含まれる。本実施の形態では、培養基材１４０は、細胞を含む板状のコラーゲン線維膜である。また、箱体１１０の底板１１１と可動蓋体１２０との間には、１つの培養基材１４０が配置されてもよいし、複数の培養基材１４０が配置されてもよい。

【0025】

本実施の形態に係る細胞培養デバイス１００を用いて細胞を培養する際には、細胞培養デバイス１００は、箱体１１０の底板１１１と可動蓋体１２０とで上下方向の位置が交互に変わるように回転させられる。細胞培養デバイス１００は、液体培地中に浸漬された状態で回転させられる。

【0026】

図３Ａ～Ｃは、細胞培養デバイス１００を用いた細胞培養の一例を示す図である。この例では、細胞培養デバイス１００は、蓋付き試験管３００内に収容されている。図３Ａおよび図３Ｂは、蓋付き試験管３００の側方から、回転する蓋付き試験管３００および細胞培養デバイス１００を見た図であり、図３Ｃは、図３ＢのＣ－Ｃ線の断面を示す図である。細胞培養デバイス１００は蓋付き試験管３００内に固定されており、蓋付き試験管３００を回転させることで細胞培養デバイス１００も回転する。蓋付き試験管３００の設置方法は、特に限定されない。たとえば、１～２週間程度の短期間の培養では、試験管（ＢＴ－３０、日電理化硝子株式会社）の開口部にアルミニウム製の開放型キャップ（ＮＥ－３０、日電理化硝子株式会社）を被せた状態で、試験管を約２０～３０°傾斜した状態で設置して回転させればよい。これによって、培地に必要な気相（５％ＣＯ_２）を安定確保できる。一方、長期間の培養では、蓋付き試験管３００には、予め５％ＣＯ_２の気相と平衡した培地を供給するためのチューブ３１０と、蓋付き試験管３００内の液体培地を排出するためのチューブ３１０とが接続されていてもよい。これによって、蓋付き試験管３００内には常に新鮮な液体培地が供給され、数日から数カ月といった長期間に亘り連続かつ自動で細胞を培養することが可能となる。蓋付き試験管３００内の液体培地を効率よく新しいものに置換する観点からは、２本のチューブ３１０のうちの一方のチューブ３１０の先端を蓋付き試験管３００の試験管本体の底部付近に配置し、他方のチューブ３１０の先端を試験管本体の開口部付近に配置することが好ましい。

【0027】

蓋付き試験管３００の種類は、特に限定されず、細胞培養デバイス１００の構成や培養する細胞の種類などに応じて適宜選択される。蓋付き試験管３００は、ガラス製であってもよいし、樹脂製であってもよいし、金属製であってもよい。また、細胞培養デバイス１００の固定方法も特に限定されない。たとえば、図３Ｃに示されるように、蓋付き試験管３００内にぎりぎりで収容できるように（断面視したときに複数箇所で内接するように）細胞培養デバイス１００の大きさを調整することで、別途固定器具を用いることなく細胞培養デバイス１００を蓋付き試験管３００に固定することができる。チューブ３１０の種類も、特に限定されず、液体培地の種類などに応じて適宜選択される。たとえば、チューブ３１０は、内径が０．３～０．７ｍｍ程度のシリコーン製のチューブである。液体培地の種類も、特に限定されず、培養する細胞の種類などに応じて適宜選択される。液体培地は、適切な温度、気相と平衡にされた状態（例えば、３７℃、５％二酸化炭素、９５％空気）で供給される。液体培地の供給は、手動で行うこともできるが、長時間に亘り大量の培地を供給する場合などはポンプなどにより行うことが好ましく、その場合には後述する交互回転法で蓋付き試験管３００を回転させることが特に好ましい。

【0028】

細胞培養デバイス１００を収容した蓋付き試験管３００を回転させる方法は、特に限定されない。また、蓋付き試験管３００を回転させる際の蓋付き試験管３００の角度も、特に限定されず、例えば水平面に対して０～４５°の範囲内で適宜調整されうる。また、回転方向および回転速度も、特に限定されず、適宜調整されうる。たとえば、細胞培養デバイス１００を収容した蓋付き試験管３００を、時計回りまたは反時計回りに連続または断続的に回転させてもよいし、時計回りと反時計回りとを交互に繰り返して回転させてもよい（交互回転法）。また、箱体１１０の底板１１１と可動蓋体１２０とで上下方向の位置が交互に変わるのであれば、細胞培養デバイス１００を収容した蓋付き試験管３００は、３６０°回転させられる必要はなく、例えば１８０°回転させられてもよい。また、細胞培養デバイス１００を収容した蓋付き試験管３００は、特許文献１に記載の反重力培養装置を用いて連続的に回転させられてもよい。

【0029】

（細胞培養方法）
本実施の形態に係る細胞培養方法は、（１）細胞培養デバイス１００に細胞を定着させた培養基材１４０を収容する工程と、（２）細胞培養デバイス１００を回転させながら細胞を培養する工程と、を有する。以下、各工程について説明する。

【0030】

まず、細胞培養デバイス１００に細胞を定着させた培養基材１４０を収容する。より具体的には、細胞培養デバイス１００の箱体１１０の底板１１１と可動蓋体１２０との間に、細胞を定着させた培養基材１４０を収容する。

【0031】

培養する細胞の種類は、特に制限されず、目的に応じて適宜選択されうる。培養する細胞の例には、ｉＰＳ細胞や、ＥＳ細胞、Ｍｕｓｅ細胞、ＤＦＡＴ細胞などの多能性幹細胞、各種分化細胞が含まれる。培養基材１４０の種類は、細胞の種類などに応じて適宜選択される。

【0032】

たとえば、１×１０^６個／ｍＬの濃度の多能性幹細胞（例えばＤＦＡＴ細胞）懸濁液とコラーゲン溶液との混合液を線維化させ、１日静置して安定化させる。これにより、多能性幹細胞が包埋されたコラーゲン線維膜（培養基材１４０）を得られる。また、箱体１１０の底板１１１としてのチタン不織布および可動蓋体１２０としてのチタン不織布には、細胞を含まないコラーゲン溶液を含侵させ、被覆させる。これにより、底板１１１および可動蓋体１２０として、コラーゲンでコーティングされたチタン不織布を得られる。そして、底板１１１の上に多能性幹細胞が包埋されたコラーゲン線維膜（培養基材１４０）を配置し、さらにその上に可動蓋体１２０を配置し、脱落防止部１３０で可動蓋体１２０が脱落しないようにする（図２Ａおよび図２Ｂ参照）。組み立てられた細胞培養デバイス１００を、液体培地で満たされた蓋付き試験管３００内に設置する（図３Ａ～Ｃ参照）。

【0033】

次に、培養基材１４０を収容した細胞培養デバイス１００を回転させながら細胞を培養する（図３Ａ～Ｃ参照）。

【0034】

図４Ａは、箱体１１０の開口部１１３が上方（鉛直上向き）にあるときの細胞培養デバイス１００の様子を示す断面図であり、図４Ｂは、箱体１１０の開口部１１３が下方（鉛直下向き）にあるときの細胞培養デバイス１００の様子を示す断面図である。開口部１１３が上方にあるときは、図４Ａに示されるように、培養基材１４０は、底板１１１の上に配置された状態で可動蓋体１２０により押圧される。一方、開口部１１３が下方にあるときは、図４Ｂに示されるように、培養基材１４０は、可動蓋体１２０の上に配置されるが、底板１１１により押圧されることはない。細胞培養デバイス１００を回転させると、図４Ａの状態と図４Ｂの状態とを交互に繰り返すことになるので、可動蓋体１２０は、重力の方向の変化に伴って移動し、培養基材１４０は、可動蓋体１２０により断続的に押圧されることとなる。したがって、培養基材１４０中の細胞にも、断続的に圧力またはせん断応力が加えられることとなる。また、細胞に対する重力の向きも周期的に変化する。その結果、細胞の増殖、細胞の成長、組織の形成、臓器の形成を促進することができる。

【0035】

（効果）
以上のように、本実施の形態に係る細胞培養デバイス１００を用いることで、力学的刺激として圧力またはせん断応力を細胞に断続的に加えながら細胞を培養することができる。その結果、細胞の増殖、細胞の成長、組織の形成、臓器の形成を促進することができる。

【0036】

［実施の形態２］
（細胞培養デバイスの構成）
図５Ａは、本発明の実施の形態２に係る細胞培養デバイス２００の平面図であり、図５Ｂは、図５ＡのＢ－Ｂ線の断面図である。

【0037】

図５Ａおよび図５Ｂに示されるように、本実施の形態に係る細胞培養デバイス２００は、箱体１１０、可動蓋体１２０、弾性部材２１０およびスペーサー２２０を有する。図５Ｂに示されるように、細胞培養デバイス２００は、箱体１１０の底板１１１と可動蓋体１２０との間に細胞を定着させた培養基材１４０を配置した状態で使用される。

【0038】

実施の形態２に係る細胞培養デバイス２００は、脱落防止部１３０の代わりに弾性部材２１０およびスペーサー２２０を有する点において実施の形態１に係る細胞培養デバイス１００と異なる。実施の形態１に係る細胞培養デバイス１００と同一の構成要素については、同一の符号を付してその説明を省略する。

【0039】

弾性部材２１０は、箱体１１０内に収容された培養基材１４０に向けて可動蓋体１２０を押圧する。弾性部材２１０は、箱体１１０の開口部１１３が上方（鉛直上向き）にあるときに、可動蓋体１２０が培養基材１４０を押圧するのを促進するとともに、箱体１１０の開口部１１３が下方（鉛直下向き）にあるときに、箱体１１０から可動蓋体１２０が外れないように脱落防止部として機能するとともに、可動蓋体１２０の自由落下を制御する。この後説明するように、本実施の形態では、弾性部材２１０は、可動蓋体１２０と蓋付き試験管３００の試験管本体の側壁との間に配置された状態で、可動蓋体１２０を押圧する（図６参照）。弾性部材２１０の弾性は、上記の機能を発揮できれば特に限定されないが、箱体１１０の開口部１１３が下方（鉛直下向き）にあるときに、可動蓋体１２０が培養基材１４０を押圧しないように調整されていることが好ましい（図７Ｂ参照）。

【0040】

弾性部材２１０の構成は、上記の機能を発揮できれば特に限定されない。弾性部材２１０の例には、コイルばねや板ばね、線細工ばねなどのばね（スプリング）が含まれる。弾性部材２１０の材料も特に限定されず、例えば金属、ゴム、樹脂、セラミックスなどである。本実施の形態では、弾性部材２１０は、金属製のコイルばねである。弾性部材２１０の数も、上記の機能を発揮できれば特に限定されない。本実施の形態では、細胞培養デバイス２００は、２つの弾性部材２１０を有している。

【0041】

スペーサー２２０は、箱体１１０の底板１１１と可動蓋体１２０との間に配置され、弾性部材２１０が可動蓋体１２０を押圧しているときに、底板１１１と可動蓋体１２０との間に培養基材１４０が配置されていない空間が存在することに起因して可動蓋体１２０が過度に傾くことを防止する。スペーサー２２０の厚みは、箱体１１０の開口部１１３が上方（鉛直上向き）にあるときに、可動蓋体１２０が培養基材１４０を押圧するのを妨げず、かつ上記機能を発揮できれば特に限定されない。スペーサー２２０の厚みは、培養基材１４０の厚みより少し薄い厚みであることが好ましく、例えば培養基材１４０の厚みの５０～９５％程度の厚みであることが好ましい。

【0042】

スペーサー２２０の構成は、上記の機能を発揮できれば特に限定されない。スペーサー２２０の材料も特に限定されず、例えば金属、ゴム、樹脂、セラミックスなどである。本実施の形態では、スペーサー２２０は、矩形の金属板をコの字状に折り曲げたものである。スペーサー２２０の数も、上記の機能を発揮できれば特に限定されない。本実施の形態では、細胞培養デバイス２００は、４つのスペーサー２２０を有している。

【0043】

培養基材１４０については、実施の形態１で説明したので説明を省略する。前述のとおり、箱体１１０の底板１１１と可動蓋体１２０との間には、１つの培養基材１４０が配置されてもよいし、複数の培養基材１４０が配置されてもよい。本実施の形態では、底板１１１と可動蓋体１２０との間には、複数の培養基材１４０が配置されている。

【0044】

本実施の形態に係る細胞培養デバイス２００を用いて細胞を培養する際には、細胞培養デバイス２００は、箱体１１０の底板１１１と可動蓋体１２０とで上下方向の位置が交互に変わるように回転させられる。細胞培養デバイス２００は、液体培地中に浸漬された状態で回転させられる。

【0045】

図６は、細胞培養デバイス２００を用いた細胞培養の一例を示す図である。この例では、細胞培養デバイス２００は、蓋付き試験管３００（例えばアルミニウム製の開放型キャップ（ＮＥ－３０、日電理化硝子株式会社）を被せた試験管（ＢＴ－３０、日電理化硝子株式会社））内に収容されており、蓋付き試験管３００は、約２０～３０°傾斜した状態で回転培養台に設置されている。細胞培養デバイス２００は蓋付き試験管３００内に固定されており、蓋付き試験管３００を回転させることで細胞培養デバイス２００も回転する。

【0046】

実施の形態１と同様に、細胞培養デバイス２００の固定方法は、特に限定されない。たとえば、蓋付き試験管３００内にぎりぎりで収容できるように（断面視したときに複数箇所で内接するように）細胞培養デバイス２００の大きさを調整することで、別途固定器具を用いることなく細胞培養デバイス２００を蓋付き試験管３００に固定することができる。また、実施の形態１と同様に、細胞培養デバイス２００を収容した蓋付き試験管３００を回転させる方法も、特に限定されない。

【0047】

（細胞培養方法）
実施の形態１と同様に、本実施の形態に係る細胞培養方法は、（１）細胞培養デバイス２００に細胞を定着させた培養基材１４０を収容する工程と、（２）細胞培養デバイス２００を回転させながら細胞を培養する工程と、を有する。以下、各工程について説明する。

【0048】

まず、細胞培養デバイス２００に細胞を定着させた培養基材１４０を収容する。より具体的には、細胞培養デバイス２００の箱体１１０の底板１１１と可動蓋体１２０との間に、細胞を定着させた培養基材１４０を収容する。

【0049】

たとえば、コラーゲン溶液を線維化させ、１日静置して安定化させる。得られたコラーゲンゲルに３×１０^５個／ｍＬの濃度の多能性幹細胞（例えばＤＦＡＴ細胞）懸濁液を含侵させ、１日静置して細胞を定着させる。これにより、多能性幹細胞が定着したコラーゲン線維膜（培養基材１４０）を得られる。また、箱体１１０の底板１１１としてのチタン不織布および可動蓋体１２０としてのチタン不織布にも、コラーゲン溶液を含侵させ、被覆させる。これにより、底板１１１および可動蓋体１２０として、コラーゲンでコーティングされたチタン不織布を得られる。そして、底板１１１の上に多能性幹細胞が定着したコラーゲン線維膜（培養基材１４０）を配置し、さらにその上に可動蓋体１２０を配置し、弾性部材２１０で可動蓋体１２０が脱落しないようにする（図５Ａおよび図５Ｂ参照）。組み立てられた細胞培養デバイス２００を、液体培地で満たされた蓋付き試験管３００内に設置する（図６参照）。

【0050】

次に、培養基材１４０を収容した細胞培養デバイス２００を回転させながら細胞を培養する（図６参照）。

【0051】

図７Ａは、箱体１１０の開口部１１３が上方（鉛直上向き）にあるときの細胞培養デバイス２００の様子を示す断面図であり、図７Ｂは、箱体１１０の開口部１１３が下方（鉛直下向き）にあるときの細胞培養デバイス２００の様子を示す断面図である。開口部１１３が上方にあるときは、図７Ａに示されるように、培養基材１４０は、底板１１１の上に配置された状態で可動蓋体１２０により押圧される。このとき、培養基材１４０は、可動蓋体１２０の重さの分だけでなく、弾性部材２１０による押圧力の分も押圧される。一方、開口部１１３が下方にあるときは、図７Ｂに示されるように、培養基材１４０は、可動蓋体１２０の上に配置されるが、底板１１１により押圧されることはない。このとき、可動蓋体１２０は、箱体１１０に固定された脱落防止部１３０（実施の形態１参照）ではなく弾性部材２１０に支持されているので、可動蓋体１２０の可動範囲は、絶対的な範囲に制限されない。たとえば、細胞が増殖して培養基材１４０と細胞の複合体の厚みが増大しても、可動蓋体１２０は、図７Ｂの状態のときに複合体の厚みに応じた位置に移動して、複合体にほとんど圧力を加えないようにすることができる。細胞培養デバイス２００を回転させると、図７Ａの状態と図７Ｂの状態とを交互に繰り返すことになるので、可動蓋体１２０は、重力の方向の変化に伴って移動し、培養基材１４０は、可動蓋体１２０により断続的に押圧されることとなる。したがって、培養基材１４０中の細胞にも、断続的に圧力またはせん断応力が加えられることとなる。また、細胞に対する重力の向きも周期的に変化する。その結果、細胞の増殖、細胞の成長、組織の形成、臓器の形成を促進することができる。

【0052】

（効果）
以上のように、本実施の形態に係る細胞培養デバイス２００を用いることで、実施の形態１に係る細胞培養デバイス１００と同様に、力学的刺激として圧力またはせん断応力を細胞に断続的に加えながら細胞を培養することができる。その結果、細胞の増殖、細胞の成長、組織の形成、臓器の形成を促進することができる。また、本実施の形態に係る細胞培養デバイス２００では、可動蓋体１２０が弾性部材２１０に支持されているので、細胞が増殖して培養基材１４０と細胞の複合体の厚みが増大しても、細胞に加える圧力またはせん断応力を連続的ではなく断続的に加えることができる。

【0053】

以下の実施例によって、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されない。

【実施例0054】

［実施例１］
（１）培養基材の準備
非特許文献１に記載されている方法で、子牛の皮膚から抽出したコラーゲンを用いて複数のコラーゲン線維膜（fibrous collagen membrane；ＦＣＭ）を調製した。各コラーゲン線維膜の大きさは、縦５ｍｍ×横５ｍｍ×厚み２ｍｍとした。本実施例では、これらのコラーゲン線維膜を培養基材として使用した。
［非特許文献１］Yoshinori Kuboki, et al., "Regeneration of periodontal ligament and cementum by BMP-applied tissue engineering", European Journal of Oral Sciences, Vol. 106, pp. 197-203.

【0055】

コラーゲン線維膜の調製方法について簡単に説明しておく。子牛の皮膚から抽出したコラーゲンをペプシン処理して酸性コラーゲン溶液を得た。この酸性コラーゲン溶液を弱アルカリ性溶液を用いて透析することによりコラーゲン線維を得た。このコラーゲン線維を含む懸濁液を縦１０ｃｍ×横１０ｃｍ×深さ３ｃｍのステンレス鋼製の鋳型に入れて凍結乾燥し、ヘキサメチレンジイソシアネートで架橋させた後、洗浄、凍結乾燥して、コラーゲン線維膜を得た。最後に、コラーゲン線維膜をプレスして厚みを２ｍｍに調整し、縦５ｍｍ×横５ｍｍの大きさで切断した。

【0056】

最小量の液体培地を含ませた各コラーゲン線維膜に、３×１０^５個のＤＦＡＴ細胞を含む液体培地を含侵させ、２４時間静置して細胞を定着させた。コラーゲン線維膜は、厚さが２倍以上に膨潤した。

【0057】

（２）細胞培養デバイスの準備
実施の形態２に係る細胞培養デバイスおよび蓋付き試験管を２セット準備した（図５Ａ～図６参照）。厚み０．１ｍｍのチタン板を縦５５ｍｍ、横２６ｍｍ、高さ１０ｍｍの略角筒形状に加工して、箱体の側板とした。また、縦５５ｍｍ、横２６ｍｍ、厚み１ｍｍのチタン不織布を箱体の底板とし、縦５０ｍｍ、横２３ｍｍ、厚み１．５ｍｍのチタン不織布を可動蓋体とした。これら２枚のチタン不織布は、上記酸性コラーゲン溶液を含侵させることで、コラーゲンでコーティングした。弾性部材としては、コイルばねを使用した。これら２つのコイルばねは、可動蓋体のみであれば略変形せずに可動蓋体を支持でき、可動蓋体に１０枚のコラーゲン線維膜が加わると変形しつつ可動蓋体を支持できる程度の弾性を有している。スペーサーとしては、矩形の金属板をコの字状に折り曲げたものを使用した。スペーサーの厚みは、３ｍｍとした。蓋付き試験管の試験管本体としては、深さ１２０ｍｍ、外径３０ｍｍ、厚み０．６ｍｍのガラス培養管を使用した。

【0058】

（３）細胞培養
上記（２）で準備した２つの細胞培養デバイスのそれぞれにおいて、箱体の底板と可動蓋体との間に上記（１）で準備したＤＦＡＴ細胞を定着させた１０枚のコラーゲン線維膜を互いに重ならないように配置した。コラーゲン線維膜を収容した細胞培養デバイスを４０ｍＬの液体培地を収容した蓋付き試験管内に設置し、さらに可動蓋体と蓋付き試験管の間に２つのコイルばねを設置した。

【0059】

２つの細胞培養デバイスのうち、一方の細胞培養デバイス（実施例）については、細胞培養デバイスを設置した蓋付き試験管を約２０～３０°傾斜した状態で、１時間当たり２４０回交互に回転する（１分間に４往復する）ように回転させながら、３７℃で二酸化炭素５％、空気９５％の気相で７日間培養した（図６参照）。培地の交換は行わなかった。他方の細胞培養デバイス（比較例）については、細胞培養デバイスを設置した蓋付き試験管を約２０～３０°傾斜し、かつ箱体の開口部が上方に位置する状態で静置して、３７℃で二酸化炭素５％、空気９５％の気相で７日間培養した。この対照実験によって、細胞培養デバイスの核心である動的要素のすべてを欠いた比較例とした。この比較例によって、本発明に係る細胞培養デバイスの動的要素の効果、すなわち圧力変動効果と、培地の流動によるせん断応力効果が如実に示されるはずである。

【0060】

（４）結果
７日間培養した後、それぞれの細胞培養デバイスから１０枚のコラーゲン線維膜を取り出し、２４ウェルプレートの各ウェルに１枚ずつ収容した。各ウェルに０．４ｍＬの液体培地と０．０４ｍＬのCell Counting Kit-8（ＣＣＫ－８）の試薬溶液を加え、９０分間培養をした後、各ウェルについて４５０ｎｍの吸光度を測定した。測定された吸光度は、生細胞数と比例関係にある。

【0061】

図８は、蓋付き試験管を回転させながら培養した場合（実施例）における細胞の数（吸光度）と、蓋付き試験管を回転させずに培養した場合（比較例）における細胞の数（吸光度）を示すグラフである。このグラフに示されるように、実施例に係る細胞培養方法では、比較例に係る細胞培養方法よりも細胞が６倍増殖した。

【0062】

［実施例２］
（１）培養基材の準備
培養基材として、直径６ｍｍ、厚さ２ｍｍのコラーゲンスポンジ（ハニカムディスク９６、株式会社高研）を３０枚準備した。

【0063】

最小量の液体培地を含ませた各コラーゲンスポンジに、３×１０^５個のＤＦＡＴ細胞を含む液体培地を含侵させ、２４時間静置して細胞を定着させた。コラーゲンスポンジは、厚さが２倍以上に膨潤した。

【0064】

（２）細胞培養デバイスの準備
実施の形態１に係る細胞培養デバイスおよび蓋付き試験管を３セット準備した（図１～図４Ｂ参照）。実施例１と同様に、箱板および可動蓋体を作製した。箱体の側板には４つの貫通孔を形成し、２本のチタン棒を脱落防止部として挿入した。３セットのうち１セットでは、細胞培養デバイスを回転させることで可動蓋体および培養基材が移動できるように（底板と可動蓋体との間隔が変化するように）、箱板の底板から離れた位置に４つの貫通孔を形成した（実施例：図９Ａ参照）。残りの２セットでは、細胞培養デバイスを回転させても可動蓋体および培養基材が移動できないように（底板と可動蓋体との間隔が変化しないように）、箱板の底板に近い位置に４つの貫通孔を形成した（比較例：図９Ｂおよび図９Ｃ参照）。また、実施の形態２に係る細胞培養デバイスのように、箱体の底板と可動蓋体との間に複数のスペーサーを配置した。スペーサーとしては、矩形の金属板をコの字状に折り曲げたものを使用した。スペーサーの厚みは、３ｍｍとした。蓋付き試験管の試験管本体としては、深さ１２０ｍｍ、外径３０ｍｍ、厚み０．６ｍｍのガラス培養管を使用した。

【0065】

（３）細胞培養
上記（２）で準備した３つの細胞培養デバイスのそれぞれにおいて、箱体の底板と可動蓋体との間に上記（１）で準備したＤＦＡＴ細胞を定着させた１０枚のコラーゲンスポンジを互いに重ならないように配置し、可動蓋体が脱落しないように２本のチタン棒を挿入した。コラーゲンスポンジを収容した細胞培養デバイスを４０ｍＬの液体培地を収容した蓋付き試験管内に設置した。

【0066】

３つの細胞培養デバイスのうち、可動蓋体および培養基材が移動できる１つの細胞培養デバイス（実施例）については、細胞培養デバイスを設置した蓋付き試験管を約２０～３０°傾斜した状態で、１時間当たり２４０回交互に回転する（１分間に４往復する）ように回転させながら、３７℃で二酸化炭素５％、空気９５％の気相で７日間培養した（図９Ａ参照）。培地の交換は行わなかった。

【0067】

可動蓋体および培養基材が移動できない他の１つの細胞培養デバイス（比較例１）についても、細胞培養デバイスを設置した蓋付き試験管を約２０～３０°傾斜した状態で、１時間当たり２４０回交互に回転する（１分間に４往復する）ように回転させながら、３７℃で二酸化炭素５％、空気９５％の気相で７日間培養した（図９Ｂ参照）。培地の交換は行わなかった。

【0068】

可動蓋体および培養基材が移動できない最後の１つの細胞培養デバイス（比較例２）については、細胞培養デバイスを設置した蓋付き試験管を約２０～３０°傾斜し、かつ箱体の開口部が上方に位置する状態で静置して、３７℃で二酸化炭素５％、空気９５％の気相で７日間培養した。培地の交換は行わなかった。

【0069】

（４）結果
７日間培養した後、それぞれの細胞培養デバイスから１０枚のコラーゲンスポンジを取り出し、実施例１と同様の手順で吸光度を測定した。測定された吸光度は、生細胞数と比例関係にある。

【0070】

図１０は、可動蓋体および培養基材が移動できる細胞培養デバイスを回転させながら培養した場合（実施例）における細胞の数（吸光度）と、可動蓋体および培養基材が移動できない細胞培養デバイスを回転させながら培養した場合（比較例１）と、可動蓋体および培養基材が移動できない細胞培養デバイスを回転させずに培養した場合（比較例２）における細胞の数（吸光度）を示すグラフである。このグラフに示されるように、実施例に係る細胞培養方法では、比較例１に係る細胞培養方法よりも細胞が３倍、比較例２に係る細胞培養方法よりも細胞が１３倍増殖した。このことから、細胞培養デバイスを回転させるだけでなく、可動蓋体および／または培養基材の移動による力学的刺激をさらに加えることで、細胞の増殖をより促進させうることがわかる。

【産業上の利用可能性】

【0071】

本発明に係る細胞培養デバイスおよび細胞培養方法は、例えば再生医療における臓器または組織の形成などに有用である。また、本発明に係る細胞培養デバイスおよび細胞培養方法は、間もなく訪れるであろう世界的な食料危機、特に食用肉の供給困難に対する、人工の培養肉の製造などにも有用である。

【符号の説明】

【0072】

１００、２００ 細胞培養デバイス
１１０ 箱体
１１１ 底板
１１２ 側板
１１３ 開口部
１２０ 可動蓋体
１３０ 脱落防止部
１４０ 培養基材
２１０ 弾性部材
２２０ スペーサー
３００ 蓋付き試験管
３１０ チューブ

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【手続補正書】

【提出日】2023-12-13

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項1】

細胞を定着させた培養基材を収容するための箱体と、
前記箱体内に前記箱体の深さ方向に移動可能に配置された可動蓋体と、
前記箱体外への前記可動蓋体の脱落を防ぐための脱落防止部と、
を有し、
前記培養基材は、前記箱体の底板と前記可動蓋体との間に配置される、
細胞培養デバイス。

【請求項2】

細胞を定着させた培養基材を収容するための箱体と、
前記箱体内に前記箱体の深さ方向に移動可能に配置された可動蓋体と、
前記箱体内に収容された前記培養基材に向けて前記可動蓋体を押圧するための弾性部材と、
を有し、
前記培養基材は、前記箱体の底板と前記可動蓋体との間に配置される、
細胞培養デバイス。

【請求項3】

前記底板と前記可動蓋体との間に配置されるスペーサーをさらに有する、請求項２に記載の細胞培養デバイス。

【請求項4】

前記底板および前記可動蓋体の少なくとも一方は、多孔質体である、請求項１または請求項２に記載の細胞培養デバイス。

【請求項5】

前記箱体および前記可動蓋体は、チタン製である、請求項１または請求項２に記載の細胞培養デバイス。

【請求項6】

前記底板および前記可動蓋体は、チタン不織布である、請求項１または請求項２に記載の細胞培養デバイス。

【請求項7】

請求項１または請求項２に記載の細胞培養デバイスの前記箱体の前記底板と前記可動蓋体との間に、細胞を定着させた培養基材を収容する工程と、
前記培養基材を収容した前記細胞培養デバイスを回転させながら細胞を培養する工程と、
を有する、細胞培養方法。