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特開2024-90463３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸を生産するための遺伝子改変微生物および当該化学品の製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024090463
(43)【公開日】2024-07-04
(54)【発明の名称】３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸を生産するための遺伝子改変微生物および当該化学品の製造方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/21 20060101AFI20240627BHJP
C12P 7/44 20060101ALI20240627BHJP
C12P 7/42 20060101ALI20240627BHJP
C12N 15/53 20060101ALN20240627BHJP
【ＦＩ】
C12N1/21 ZNA
C12P7/44
C12P7/42
C12N15/53
【審査請求】未請求
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022206398
(22)【出願日】2022-12-23
(71)【出願人】
【識別番号】000003159
【氏名又は名称】東レ株式会社
(72)【発明者】
【氏名】森田 啓介
(72)【発明者】
【氏名】磯部 匡平
(72)【発明者】
【氏名】河村 健司
(72)【発明者】
【氏名】山田 勝成
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AD09
4B064AD15
4B064AD36
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA16
4B065AA26X
4B065AA44Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA03
4B065CA11
4B065CA60
(57)【要約】
【課題】
３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸の生産性を向上させることができる新規の遺伝子改変微生物を提供する。
【解決手段】
３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸を製造する能力を有する微生物において、オキサロ酢酸からリンゴ酸を生成する反応を強化し、かつ、ギ酸から二酸化炭素を生成する反応を強化した、遺伝子改変微生物。
【選択図】なし
３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸の生産性を向上させることができる新規の遺伝子改変微生物を提供する。
【解決手段】
３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸を製造する能力を有する微生物において、オキサロ酢酸からリンゴ酸を生成する反応を強化し、かつ、ギ酸から二酸化炭素を生成する反応を強化した、遺伝子改変微生物。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸を製造する能力を有する微生物において、オキサロ酢酸からリンゴ酸を生成する反応を強化し、かつ、ギ酸から二酸化炭素を生成する反応を強化した、遺伝子改変微生物。
【請求項2】
前記オキサロ酢酸からリンゴ酸を生成する反応の強化が、オキサロ酢酸からリンゴ酸を生成する触媒活性を有する酵素の発現量の増大である、請求項１に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項3】
前記オキサロ酢酸からリンゴ酸を生成する触媒活性を有する酵素が、リンゴ酸デヒドロゲナーゼである、請求項２に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項4】
前記ギ酸から二酸化炭素を生成する反応の強化が、ギ酸から二酸化炭素を生成する触媒活性を有する酵素の発現量の増大である、請求項１に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項5】
ギ酸から二酸化炭素を生成する触媒活性を有する酵素が、ＮＡＤＨ産生型ギ酸デヒドロゲナーゼである、請求項４に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項6】
３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を強化した、請求項１に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項7】
ホスホケトラーゼ経路による糖代謝をしない微生物である、請求項１に記載の遺伝子改変微生物。
【請求項8】
請求項１から７のいずれか１項に記載の遺伝子改変微生物を培養する工程を含む、３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸の製造方法。
【請求項9】
遺伝子改変により、３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸を製造する能力を有する微生物のオキサロ酢酸からリンゴ酸を生成する反応およびギ酸から二酸化炭素を生成する反応を強化する工程を含む、遺伝子改変微生物の製造方法。
【請求項10】
遺伝子改変により３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を強化する工程を含む、請求項９に記載の遺伝子改変微生物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸を高生産する遺伝子改変微生物および当該遺伝子改変微生物を用いた３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
３－ヒドロキシアジピン酸（ＩＵＰＡＣ名：３－ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｅｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）およびα－ヒドロムコン酸（ＩＵＰＡＣ名：（Ｅ）－ｈｅｘ－２－ｅｎｅｄｉｏｉｃ ａｃｉｄ）は炭素数６のジカルボン酸である。これらは多価アルコールと重合することでポリエステルとして、また多価アミンと重合することでポリアミドの原料として用いることができる。また、これらの末端にアンモニアを付加してラクタム化した化合物もポリアミドの原料として用いることができる。
【0003】
代謝経路を改変した遺伝子改変微生物を利用した３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸の製造に関連する文献として、特許文献１には、３－オキソアジピル－ＣｏＡから３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡへの還元反応を触媒する優れた活性を示すポリペプチドを用いた３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸の製造方法が記載されており、これら物質の生合成経路として、３－オキソアジピル－ＣｏＡを３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡへと還元する酵素反応を経由するとの記載がある。また、特許文献２には、３－オキソアジピル－ＣｏＡから３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡへの還元反応を触媒する優れた活性を示すポリペプチドを用いるとともに、ピルビン酸キナーゼの機能を欠損させた遺伝子改変微生物による３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸の製造方法が記載されている。
【0004】
特許文献３には、ピルビン酸キナーゼの機能が欠損し、さらに３－オキソアジピル－ＣｏＡから３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡへの反応およびホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼの活性を強化した遺伝子改変微生物による３－ヒドロキシアジピン酸、α－ヒドロムコン酸および／またはアジピン酸の製造方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】ＷＯ２０１９／１０７５１６号
【特許文献2】ＷＯ２０２０／２３０７１８号
【特許文献3】ＷＯ２０２０／２３０７１９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
前述の通り、３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸を製造する能力を有する微生物を利用した３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸を製造において、当該微生物の代謝経路を改変することによって３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸の生産性を高める技術が確立しているが、これまでに知られていない３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸の生産性向上に寄与する代謝関連遺伝子を改変することで、さらなる生産性向上が期待できる。
【0007】
そこで本発明では、これまでに知られていない３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸の生産性向上に寄与する代謝関連遺伝子を同定し、当該代謝関連遺伝子が関与する代謝経路を改変することで、３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸の生産性が向上した新規の遺伝子改変微生物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明者は上記目的を達成するため鋭意検討した結果、３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸を製造する能力を有する微生物において、遺伝子改変によって代謝経路中のオキサロ酢酸からリンゴ酸を生成する反応を強化し、さらに、ギ酸から二酸化炭素を生成する反応を強化することで、３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸の生産性が向上することを見出し、本発明を完成させるに至った。
【0009】
すなわち、本発明は以下の（１）から（１０）で構成される。
（１）３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸を製造する能力を有する微生物において、オキサロ酢酸からリンゴ酸を生成する反応を強化し、かつ、ギ酸から二酸化炭素を生成する反応を強化した、遺伝子改変微生物。
（２）前記オキサロ酢酸からリンゴ酸を生成する反応の強化が、オキサロ酢酸からリンゴ酸を生成する触媒活性を有する酵素の発現量の増大である、（１）に記載の遺伝子改変微生物。
（３）前記オキサロ酢酸からリンゴ酸を生成する触媒活性を有する酵素が、リンゴ酸デヒドロゲナーゼである、（２）に記載の遺伝子改変微生物。
（４）前記ギ酸から二酸化炭素を生成する反応の強化が、ギ酸から二酸化炭素を生成する触媒活性を有する酵素の発現量の増大である、（１）に記載の遺伝子改変微生物。
（５）ギ酸から二酸化炭素を生成する触媒活性を有する酵素が、ＮＡＤＨ産生型ギ酸デヒドロゲナーゼである、（４）に記載の遺伝子改変微生物。
（６）３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を強化した、（１）に記載の遺伝子改変微生物。
（７）ホスホケトラーゼ経路による糖代謝をしない微生物である、（１）に記載の遺伝子改変微生物。
（８）（１）から（７）のいずれかに記載の遺伝子改変微生物を培養する工程を含む、３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸の製造方法。
（９）遺伝子改変により、３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸を製造する能力を有する微生物のオキサロ酢酸からリンゴ酸を生成する反応およびギ酸から二酸化炭素を生成する反応を強化する工程を含む、遺伝子改変微生物の製造方法。
（１０）遺伝子改変により３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を強化する工程を含む、（９）に記載の遺伝子改変微生物の製造方法。
（１）３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸を製造する能力を有する微生物において、オキサロ酢酸からリンゴ酸を生成する反応を強化し、かつ、ギ酸から二酸化炭素を生成する反応を強化した、遺伝子改変微生物。
（２）前記オキサロ酢酸からリンゴ酸を生成する反応の強化が、オキサロ酢酸からリンゴ酸を生成する触媒活性を有する酵素の発現量の増大である、（１）に記載の遺伝子改変微生物。
（３）前記オキサロ酢酸からリンゴ酸を生成する触媒活性を有する酵素が、リンゴ酸デヒドロゲナーゼである、（２）に記載の遺伝子改変微生物。
（４）前記ギ酸から二酸化炭素を生成する反応の強化が、ギ酸から二酸化炭素を生成する触媒活性を有する酵素の発現量の増大である、（１）に記載の遺伝子改変微生物。
（５）ギ酸から二酸化炭素を生成する触媒活性を有する酵素が、ＮＡＤＨ産生型ギ酸デヒドロゲナーゼである、（４）に記載の遺伝子改変微生物。
（６）３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を強化した、（１）に記載の遺伝子改変微生物。
（７）ホスホケトラーゼ経路による糖代謝をしない微生物である、（１）に記載の遺伝子改変微生物。
（８）（１）から（７）のいずれかに記載の遺伝子改変微生物を培養する工程を含む、３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸の製造方法。
（９）遺伝子改変により、３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸を製造する能力を有する微生物のオキサロ酢酸からリンゴ酸を生成する反応およびギ酸から二酸化炭素を生成する反応を強化する工程を含む、遺伝子改変微生物の製造方法。
（１０）遺伝子改変により３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を強化する工程を含む、（９）に記載の遺伝子改変微生物の製造方法。
【発明の効果】
【0010】
３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸を製造する能力を有する微生物において、オキサロ酢酸からリンゴ酸を生成する反応を強化し、かつ、ギ酸から二酸化炭素を生成する反応を強化する遺伝子改変により、当該遺伝子を改変していない親株の微生物と比較して、３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸の生産性を高めることができる。
【発明を実施するための形態】
【0011】
以下、本明細書では３－ヒドロキシアジピン酸を３ＨＡ、α－ヒドロムコン酸をＨＭＡと略すことがある。また、３－オキソアジピル－ＣｏＡを３ＯＡ－ＣｏＡ、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを３ＨＡ－ＣｏＡ、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡをＨＭＡ－ＣｏＡと略すことがある。また、ホスホエノールピルビン酸をＰＥＰと略すことがある。また、３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素を「３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼ」と記載する場合がある。また、リンゴ酸デヒドロゲナーゼをＭＤＨと略すことがある。また、ギ酸デヒドロゲナーゼをＦＤＨと略すことがある。
【0012】
本発明の遺伝子改変微生物は、以下の代謝経路に示されるとおりアセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡを中間体として、３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸を生合成することができる。グルコースからアセチル－ＣｏＡまでの代謝経路は解糖系、スクシニル－ＣｏＡまでの代謝経路はＴＣＡ回路、およびＰＥＰからオキサロ酢酸を生成する補充経路と還元的ＴＣＡ回路からなる代謝経路として周知である。
【0013】
【化1】
【0014】
アセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡから３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸を生産する代謝経路を、代謝産物を化学式で表示したものを以下に示す。ここで、反応Ａは、アセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡから３－オキソアジピル－ＣｏＡを生成する反応を示す。反応Ｂは、３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を示す。反応Ｃは、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡから２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡを生成する反応を示す。反応Ｄは、３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡから３－ヒドロキシアジピン酸を生成する反応を示す。反応Ｅは、２，３－デヒドロアジピル－ＣｏＡからα－ヒドロムコン酸を生成する反応を示す。以下の代謝経路での各反応を触媒する酵素、ならびに以下の代謝経路を利用した３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸を生産する能力を有する微生物を創出する方法は、ＷＯ２０１９／１０７５１６号に詳述されている。
【0015】
【化2】
【0016】
本発明は、オキサロ酢酸からリンゴ酸を生成する反応を強化し、かつ、ギ酸から二酸化炭素を生成する反応を強化することを特徴とする。
【0017】
本発明でオキサロ酢酸からリンゴ酸を生成する反応を強化する方法としては、オキサロ酢酸からリンゴ酸を生成する触媒活性を有する酵素反応を強化することが好ましく、その方法としては、例えば、当該酵素自体の触媒活性を増強することや、当該酵素の発現量を増加させることが挙げられるが、当該酵素の発現量を増大させることが好ましい。オキサロ酢酸からリンゴ酸を生成する触媒活性を有する酵素の発現量を増大させる方法としては、例えば、当該酵素をコードする遺伝子を宿主微生物の菌体外から菌体内へと導入したり、当該遺伝子のコピー数を増加させたり、当該遺伝子のコーディング領域上流のプロモーター領域やリボソーム結合配列を改変させたりする方法などが挙げられる。オキサロ酢酸からリンゴ酸を生成する触媒活性を有する酵素をコードする遺伝子を宿主微生物の菌体外から菌体内へと導入する、または、当該遺伝子のコピー数を増加させる方法としては、宿主遺伝子がもともと保有する当該遺伝子を人為的に導入する方法であっても、外来の当該遺伝子を導入する方法であっても良い。オキサロ酢酸からリンゴ酸を生成する触媒活性を有する酵素の発現量を増大させる方法としては、前述の方法を単独で行ってもよいし、組み合わせてもよい。
【0018】
オキサロ酢酸からリンゴ酸を生成する触媒活性を有する酵素の好ましい具体例としては、オキサロ酢酸およびＮＡＤＨからリンゴ酸およびＮＡＤ＋を生成する反応を触媒するリンゴ酸デヒドロゲナーゼが挙げられる。リンゴ酸デヒドロゲナーゼは、ＮＣＢＩやＫＥＧＧなどの公共データベースに登録されているものであればよく、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属やＳｅｒｒａｔｉａ属などのバクテリアでは、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｍａｌａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ、ＥＣ１．１．１．３７）はｍｄｈ遺伝子にコードされており、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒ．Ｋ－１２ ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５株由来のｍｄｈ（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿４１７７０３）や、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｇｒｉｍｅｓｉｉ ＮＢＲＣ１３５３７株由来のｍｄｈ（配列番号１）などが具体例として挙げられる。
【0019】
なお、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｌｅｔｔ． ２０１１ Ｄｅｃ；３３（１２）：２４３９－４４．には、３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸を製造する能力を有するＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物において、ピルビン酸からアセチルＣｏＡを生産する反応であるピルビン酸ギ酸リアーゼをコードするｐｆｌＢ遺伝子を欠失させ、かつ、オキサロ酢酸からリンゴ酸を生成する反応であるリンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードするｍｄｈ遺伝子発現を強化することによって、グルコースから３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸への代謝経路の上流にあるコハク酸の収率が増加したことが開示されていることから、３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸の生産性向上には、オキサロ酢酸からリンゴ酸を生成する反応の強化とピルビン酸からアセチルＣｏＡを生産する反応を低下させることが必須であると推定されたが、本明細書で示されるとおり、本発明においてはピルビン酸からアセチルＣｏＡを生産する反応の低下に依存せずに３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸の生産性が向上する。
【0020】
ギ酸から二酸化炭素を生成する反応を強化する方法としては、ギ酸から二酸化炭素を生成する触媒活性を有する酵素反応を強化することが好ましく、その方法としては、例えば、当該酵素自体の触媒活性を増強することや、当該酵素の発現量を増加させることが挙げられるが、当該酵素の発現量を増大させることが好ましい。ギ酸から二酸化炭素を生成する触媒活性を有する酵素の発現量を増大させる方法としては、例えば、当該酵素をコードする遺伝子を宿主微生物の菌体外から菌体内へと導入したり、当該遺伝子のコピー数を増加させたり、当該遺伝子のコーディング領域上流のプロモーター領域やリボソーム結合配列を改変させたりする方法などが挙げられる。ギ酸から二酸化炭素を生成する触媒活性を有する酵素をコードする遺伝子を宿主微生物の菌体外から菌体内へと導入する、または、当該遺伝子のコピー数を増加させる方法としては、宿主遺伝子がもともと保有する当該遺伝子を人為的に導入する方法であっても、外来の当該遺伝子を導入する方法であっても良い。ギ酸から二酸化炭素を生成する触媒活性を有する酵素の発現量を増大させる方法としては、前述の方法を単独で行ってもよいし、組み合わせてもよい。
【0021】
ギ酸から二酸化炭素を生成する触媒活性を有する酵素の具体例として、ＮＡＤＨ産生型ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ １．１７．１．９）が触媒する反応を強化することが挙げられる。ＮＡＤＨ産生型ギ酸デヒドロゲナーゼはギ酸から二酸化炭素を生成し、かつＮＡＤ＋をＮＡＤＨに還元する反応を触媒する。ＮＡＤＨ産生型ギ酸デヒドロゲナーゼの具体例としては、ＮＣＢＩやＫＥＧＧなどにおける公共データベース上でＢＬＡＳＴ検索してＮＡＤＨ産生型ギ酸デヒドロゲナーゼとしてヒットするポリペプチドが該当し、好ましい具体例として、Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ Ｓ２株由来のＦＤＨ１（配列番号２）、またはこれらのホモログなどが挙げられる。
【0022】
また、ギ酸から二酸化炭素を生成する触媒活性を有する酵素の別の具体例として、ギ酸水素リアーゼ複合体が挙げられる。ギ酸水素リアーゼ複合体はギ酸から二酸化炭素を生成する過程で水素を発生させる反応を触媒する。ギ酸水素リアーゼ複合体の好ましい具体例として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属などのバクテリアにおけるｆｄｈＦ遺伝子によってコードされるギ酸デヒドロゲナーゼＨ（ｆｏｒｍａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ－Ｈ、ＥＣ １．１７．９８．４）とｈｙｃＢ、ｈｙｃＣ、ｈｙｃＤ、ｈｙｃＥ、ｈｙｃＦおよびｈｙｃＧ遺伝子がコードする７つのポリペプチドのサブユニットで構成されるギ酸水素リアーゼ複合体（ｆｏｒｍａｔｅ ｈｙｄｒｏｇｅｎｌｙａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ、ＥＣ １．１７．９８．４）が挙げられる。
【0023】
また、ギ酸から二酸化炭素を生成する触媒活性を有する酵素の別の具体例として、ギ酸デヒドロゲナーゼＯおよび／またはギ酸デヒドロゲナーゼＮが挙げられる。ギ酸デヒドロゲナーゼＯおよび／またはギ酸デヒドロゲナーゼＮはギ酸から二酸化炭素を生成する過程でキノン類を還元させる反応を触媒する。ギ酸デヒドロゲナーゼＯおよび／またはギ酸デヒドロゲナーゼＮの好ましい具体例として、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属などのバクテリアにおけるｆｄｏＧ、ｆｄｏＨおよびｆｄｏＩ遺伝子がコードする３つのポリペプチドのサブユニットで構成されるギ酸デヒドロゲナーゼＯ（ｆｏｒｍａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ－Ｏ、ＥＣ １．１７．５．３）、ならびに、ｆｄｎＧ、ｆｄｎＨおよびｆｄｎＩ遺伝子がコードする３つのポリペプチドのサブユニットで構成されるギ酸デヒドロゲナーゼＮ（ｆｏｒｍａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ－Ｎ、ＥＣ １．１７．５．３）が挙げられる。
【0024】
本発明では、上記に挙げた酵素のうち、ＮＡＤＨ産生型ギ酸デヒドロゲナーゼが触媒する反応を強化することが好ましい。
【0025】
また、本発明では３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を強化することが好ましい。３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を強化するとは、例えば、本反応を触媒する酵素の発現量を増加することが挙げられる。発現量を増加する方法としては、例えば、本酵素遺伝子を宿主微生物の菌体外から菌体内へと導入したり、当該遺伝子のコピー数を増加させたり、当該遺伝子のコーディング領域上流のプロモーター領域やリボソーム結合配列を改変させたりする方法などが挙げられる。これらの方法は単独で行ってもよいし、組み合わせてもよいが、ＷＯ２０１９／１０７５１６号（米国特許出願公開第２０２０／２９１４３５Ａ１号明細書）に記載される方法により本酵素遺伝子を宿主微生物の菌体外から菌体内へ導入することが好ましい。
【0026】
３－オキソアジピル－ＣｏＡを還元して３－ヒドロキシアジピル－ＣｏＡを生成する反応を触媒する３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼの具体例としては、３－ヒドロキシアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼとしてＥＣ１．１．１．３５に分類される酵素、３－ヒドロキシブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼとしてＥＣ１．１．１．１５７に分類される酵素、ならびに、ＷＯ２０１９／１０７５１６号明細書に記載の配列番号１～６および２１３のいずれかのアミノ酸配列に対して７０％以上の配列同一性を有し、かつ、３－オキソアジピル－ＣｏＡレダクターゼ活性を有する酵素などが挙げられる。具体例として、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４０株由来のＰａａＨ（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿７４５４２５．１）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒ． Ｋ－１２ ｓｕｂｓｔｒ． ＭＧ１６５５株由来のＰａａＨ（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＮＰ＿４１５９１３．１）、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｙｌｙｉ ＡＤＰ１株由来のＤｃａＨ（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＣＡＧ６８５３３．１）、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ ＮＢＲＣ１０２５９９株由来のＰａａＨ（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＷＰ＿０６３１９７１２０）、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ ＡＴＣＣ１３８８０株由来のポリペプチド（ＮＣＢＩ－ＰｒｏｔｅｉｎＩＤ：ＫＦＤ１１７３２．１）が挙げられる。
【0027】
また、本発明の遺伝子改変微生物は、３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸の生産性の観点から、ホスホケトラーゼ経路による糖代謝をしない微生物であることが好ましい。このような微生物は自然界に存在しており、ホスホケトラーゼ経路によって糖代謝をしない本発明の遺伝子微生物を創出する際の宿主として好ましく利用できる。また、本発明の遺伝子改変微生物を創出後に、当業者に周知の手法により当該微生物のホスホケトラーゼ遺伝子をノックアウトする方法によってホスホケトラーゼ経路による糖代謝をしない微生物を創出してもよい。
【0028】
３－ヒドロキシアジピン酸を製造する能力を元来有する微生物としては、以下の微生物が挙げられる。
【0029】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉなどのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属。
【0030】
Ｓｅｒｒａｔｉａ ｇｒｉｍｅｓｉｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｏｄｏｒｉｆｅｒａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａまたはＳｅｒｒａｔｉａ ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａなどのＳｅｒｒａｔｉａ属。
【0031】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ ｓｕｂｓｐ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓなどのＰｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ属。
【0032】
Ｈａｆｎｉａ ａｌｖｅｉなどのＨａｆｎｉａ属。
【0033】
Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｅｔｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍなどのＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属。
【0034】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｄｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｏｓｅｕｓなどのＢａｃｉｌｌｕｓ属。
【0035】
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｎａｃｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｋａｒｎａｔａｋｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｌｉｖａｃｅｕｓなどのＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属。
【0036】
Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｅｃａｔｏｒ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｏｘａｌａｔｉｃｕｓなどのＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属。
【0037】
Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｙｌｙｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｒａｄｉｏｒｅｓＩｓｔｅｎｓなどのＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属。
【0038】
Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓなどのＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属。
【0039】
Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ ａｌｂｕｓなどのＮｏｃａｒｄｉｏｉｄｅｓ属。
【0040】
Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｏｄｉｎｕｍなどのＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属。
【0041】
Ｄｅｌｆｔｉａ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓなどのＤｅｌｆｔｉａ属。
【0042】
Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ ｂｌａｔｔａｅなどのＳｈｉｍｗｅｌｌｉａ属。
【0043】
Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅなどのＡｅｒｏｂａｃｔｅｒ属。
【0044】
Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒなどのＲｈｉｚｏｂｉｕｍ属。
【0045】
前記３－ヒドロキシアジピン酸を製造する能力を元来有する微生物の中でも、本発明では、ホスホケトラーゼ経路による糖代謝をしない微生物であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｈａｆｎｉａ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ属、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属が好ましく、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属またはＳｅｒｒａｔｉａ属に属する微生物がより好ましく利用される。
【0046】
α－ヒドロムコン酸を製造する能力を元来有すると推定される微生物としては、以下の微生物が挙げられる。
【0047】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉなどのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属。
【0048】
Ｓｅｒｒａｔｉａ ｇｒｉｍｅｓｉｉ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｉｃａｒｉａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｆｏｎｔｉｃｏｌａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｏｄｏｒｉｆｅｒａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ、Ｓｅｒｒａｔｉａ ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａまたはＳｅｒｒａｔｉａ ｎｅｍａｔｏｄｉｐｈｉｌａなどのＳｅｒｒａｔｉａ属。
【0049】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｚｏｔｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ ｓｕｂｓｐ． ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓなどのＰｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ属。
【0050】
Ｈａｆｎｉａ ａｌｖｅｉなどのＨａｆｎｉａ属。
【0051】
Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｂａｄｉｕｓなどのＢａｃｉｌｌｕｓ属。
【0052】
Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｄｕｒａｎｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｎｕｍａｚｕｅｎｓｉｓ、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ ｏｘａｌａｔｉｃｕｓなどのＣｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属。
【0053】
Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｙｌｙｉ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｒａｄｉｏｒｅｓｉｓｔｅｎｓなどのＡｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属。
【0054】
Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓなどのＡｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属。
【0055】
Ｄｅｌｆｔｉａ ａｃｉｄｏｖｏｒａｎｓなどのＤｅｌｆｔｉａ属。
【0056】
Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ ｂｌａｔｔａｅなどのＳｈｉｍｗｅｌｌｉａ属。
【0057】
前記α－ヒドロムコン酸を製造する能力を元来有する微生物の中でも、本発明では、ホスホケトラーゼ経路による糖代謝をしない微生物であるＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｈａｆｎｉａ属、Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ属が好ましく、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属またはＳｅｒｒａｔｉａ属に属する微生物がより好ましく利用される。
【0058】
本発明の遺伝子改変微生物が、３－ヒドロキシアジピン酸を製造する能力を元来有していない場合には、反応Ａ、Ｂ、Ｄを触媒する酵素をコードする核酸を適当に組み合わせて微生物に導入することで、これらの製造能を付与することができ、また、α－ヒドロムコン酸を製造する能力を元来有していない場合には、反応Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅを触媒する酵素をコードする核酸を適当に組み合わせて微生物に導入することで、これらの生成能を付与することができる。
【0059】
本発明で遺伝子改変微生物を得るための宿主として用いることができる微生物は、遺伝子改変が可能な微生物であれば特に制限はなく、３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸を製造する能力を有する微生物であってもそうでない微生物であってもよいが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｈａｆｎｉａ属、Ｐｓｕｅｄｏｍｏｎａｓ属、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属、Ｃｕｐｒｉａｖｉｄｕｓ属、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ属、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ属、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｄｅｌｆｔｉａ属、Ｓｈｉｍｗｅｌｌｉａ属、Ａｅｒｏｂａｃｔｅｒ属、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ属、Ｔｈｅｒｍｏｂｉｆｉｄａ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、Ｐｉｃｈｉａ属およびＣａｎｄｉｄａ属に属する微生物が好ましく、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、Ｈａｆｎｉａ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属に属する微生物がより好ましく、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属またはＳｅｒｒａｔｉａ属に属する微生物が特に好ましい。
【0060】
本発明の遺伝子改変微生物を創出するために遺伝子を導入する方法は特に限定されず、微生物内で自律複製可能な発現ベクターに当該遺伝子を組み込み、宿主微生物に導入する方法や、微生物のゲノムに当該遺伝子を組み込む方法などを用いることができる。
【0061】
導入する遺伝子は１種類でも複数種類でもよい。また遺伝子の導入と発現の増強を組み合わせてもよい。
【0062】
本発明で発現させる遺伝子を発現ベクターまたは宿主微生物ゲノムに組み込む場合、当該発現ベクターまたはゲノム組み込み用核酸はプロモーター、リボソーム結合配列、発現させる遺伝子、転写終結配列により構成されていることが好ましい。また、プロモーター活性を制御する遺伝子が含まれていてもよい。
【0063】
本発明で用いるプロモーターは、宿主微生物内で遺伝子を発現させられるものであれば特に限定されないが、例えばｇａｐプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが挙げられる。
【0064】
本発明で発現ベクターを用いて遺伝子の導入や、遺伝子の発現の増強を行う場合は、当該微生物中で自律複製可能であれば特に限定されないが、例えばｐＢＢＲ１ＭＣＳベクター、ｐＢＲ３２２ベクター、ｐＭＷベクター、ｐＥＴベクター、ｐＲＳＦベクター、ｐＣＤＦベクター、ｐＡＣＹＣベクター、および上述のベクターの派生型などが挙げられる。
【0065】
本発明でゲノム組み込み用核酸を用いて遺伝子の導入や、遺伝子の発現の増強を行う場合は、部位特異的相同組換えを用いて導入する。部位相同組換えの方法は特に限定されないが、例えばλ Ｒｅｄ レコンビナーゼおよびＦＬＰレコンビナーゼを用いる方法（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０００ Ｊｕｎ ６；９７（１２）：６６４０－６６４５．）、λ ＲｅｄレコンビナーゼおよびｓａｃＢ遺伝子を用いる方法（Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００７ Ｄｅｃ；７１（１２）：２９０５－１１．）が挙げられる。
【0066】
発現ベクターまたはゲノム組み込み用核酸の導入方法は、微生物に核酸を導入する方法であれば特に限定されないが、例えばカルシウムイオン法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９ （１９７０））、エレクトロポレーション法（ＮＭ Ｃａｌｖｉｎ，ＰＣ Ｈａｎａｗａｌｔ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１７０ （１９８８），ｐｐ．２７９６－２８０１）などが挙げられる。
【0067】
本発明の遺伝子改変微生物は、通常の微生物が利用し得る炭素源を発酵原料として含有する培地、好ましくは液体培地中において培養する。当該遺伝子改変微生物が利用し得る炭素源の他には、窒素源、無機塩および必要に応じてアミノ酸やビタミンなどの有機微量栄養素を程よく含有した培地を用いる。上記栄養源を含有していれば天然培地、合成培地のいずれでも利用できる。
【0068】
発酵原料とは、当該遺伝子改変微生物が代謝し得る原料である。「代謝」とは、微生物が細胞外から取り入れた、あるいは細胞内で別の化学化合物より生じたある化学化合物が、酵素反応により別の化学化合物へと変換されることを指す。炭素源としては、糖類を好ましく用いることができる。糖類の具体例としては、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、キシロース、アラビノース等の単糖類、これら単糖類が結合したシュクロース等の二糖類、多糖類、およびこれらを含有する澱粉糖化液、糖蜜、セルロース含有バイオマス糖化液などが挙げられる。
【0069】
上記に挙げた炭素源は、一種類のみ用いてもよいし、組み合わせて用いてもよいが、特にグルコースを含む培地で培養することが好ましい。炭素源の添加において、培地中の炭素源の濃度は、特に限定されず、炭素源の種類などに応じて適宜設定することができる。グルコースの好ましい濃度は、５～３００ｇ／Ｌである。
【0070】
当該遺伝子改変微生物の培養に用いる窒素源としては、例えば、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩類、尿素、硝酸塩類、その他補助的に使用される有機窒素源、例えば、油粕類、大豆加水分解液、カゼイン分解物、その他のアミノ酸、ビタミン類、コーンスティープリカー、酵母または酵母エキス、肉エキス、ペプトン等のペプチド類、各種発酵菌体およびその加水分解物などが使用できる。培地中の窒素源の濃度は、特に限定されないが、好ましくは、０．１～５０ｇ／Ｌである。
【0071】
当該遺伝子改変微生物の培養に用いる無機塩類としては、例えば、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩およびマンガン塩等を適宜添加使用することができる。
【0072】
３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸を生産するための遺伝子改変微生物の培養条件は、前記成分組成の培地、培養温度、撹拌速度、ｐＨ、通気量、植菌量などを、当該遺伝子改変微生物の種類および外部条件などに応じて、適宜調節あるいは選択して設定する。
【0073】
培養におけるｐＨの範囲は当該遺伝子改変微生物が生育することができれば特に制限はないが、好ましくはｐＨ５～８、より好ましくはｐＨ５．５～６．８である。
【0074】
培養における通気条件の範囲は３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸を生産することができれば特に制限はないが、当該微生物変異体を良好に生育させるために、少なくとも培養開始時において培養容器内の気相および／または液相に酸素が残存していることが好ましい。
【0075】
液体培養において発泡がある場合には、鉱油、シリコーン油および界面活性剤などの消泡剤を適宜培地に配合することができる。
【0076】
前記微生物の培養物中に、３－ヒドロキシアジピン酸および／またはα－ヒドロムコン酸が回収可能な量まで生産された後、生産された当該生産物を回収することができる。生産された当該生産物の回収、例えば単離は、蓄積量が適度に高まった時点で培養を停止し、その培養物から、発酵生産物を採取する一般的な方法に準じて行うことができる。具体的には、遠心分離、ろ過などにより菌体を分離したのち、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、活性炭処理、結晶化、膜分離、蒸留などにより、当該生産物を培養物から単離することができる。より具体的には、当該生産物の塩に酸成分を添加して析出物を回収する方法、培養物を逆浸透膜やエバポレーターなどを用いた濃縮操作により水を除去して当該生産物の濃度を高めた後、冷却結晶化や断熱結晶化により当該生産物および／または当該生産物の塩の結晶を析出させ、遠心分離やろ過などにより当該生産物および／または当該生産物の塩の結晶を得る方法、培養物にアルコールを添加して当該生産物をエステルとした後、蒸留操作により当該生産物のエステルを回収後、加水分解により当該生産物を得る方法等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。また、これらの回収方法は生成物の物性などにより適当に選択して最適化することができる。
【実施例0077】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。なお、本実施例における各種分析は以下の方法に従った。
【0078】
［３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の定量分析］
当該培養液より菌体を遠心分離した上清をＭｉｌｌｅｘ－ＧＶ（０．２２μｍ、ＰＶＤＦ、Ｍｅｒｃｋ社製）を用いて膜処理し、透過液を以下の条件によるＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析することで培養上清中の３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の蓄積濃度を定量した。
・ＨＰＬＣ
装置：１２９０Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ ｈｙｄｒｏ－ＲＰ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）、長さ１００ｍｍ、内径３ｍｍ、粒径２．５μｍ
移動相：０．１％ギ酸水溶液／メタノール＝７０／３０
流速：０．３ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
ＬＣ検出器：１２６０ＤＡＤ ＶＬ＋（２１０ｎｍ）
・ＭＳ／ＭＳ
装置：Ｔｒｉｐｌｅ－Ｑｕａｄ ＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
イオン化法：ＥＳＩ ネガティブモード。
当該培養液より菌体を遠心分離した上清をＭｉｌｌｅｘ－ＧＶ（０．２２μｍ、ＰＶＤＦ、Ｍｅｒｃｋ社製）を用いて膜処理し、透過液を以下の条件によるＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析することで培養上清中の３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の蓄積濃度を定量した。
・ＨＰＬＣ
装置：１２９０Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
カラム：Ｓｙｎｅｒｇｉ ｈｙｄｒｏ－ＲＰ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）、長さ１００ｍｍ、内径３ｍｍ、粒径２．５μｍ
移動相：０．１％ギ酸水溶液／メタノール＝７０／３０
流速：０．３ｍＬ／分
カラム温度：４０℃
ＬＣ検出器：１２６０ＤＡＤ ＶＬ＋（２１０ｎｍ）
・ＭＳ／ＭＳ
装置：Ｔｒｉｐｌｅ－Ｑｕａｄ ＬＣ／ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）
イオン化法：ＥＳＩ ネガティブモード。
【0079】
（参考例１）アセチル－ＣｏＡおよびスクシニル－ＣｏＡから３ＯＡ－ＣｏＡおよび補酵素Ａを生成する反応（反応Ａ）、３ＯＡ－ＣｏＡから３ＨＡ－ＣｏＡを生成する反応（反応Ｂ）、３ＨＡ－ＣｏＡから３－ヒドロキシアジピン酸を生成する反応（反応Ｄ）およびＨＭＡ－ＣｏＡからα－ヒドロムコン酸を生成する反応（反応Ｅ）を触媒する酵素を発現するプラスミドの作製
大腸菌内で自律複製可能なベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２（ＭＥ Ｋｏｖａｃｈ，（１９９５），Ｇｅｎｅ １６６：１７５－１７６）をＸｈｏＩで切断し、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２／ＸｈｏＩを得た。当該ベクターに構成的な発現プロモーターを組み込むために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒ．Ｋ－１２ ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡを鋳型としてｇａｐＡ（ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ： ＮＣ＿０００９１３．３）の上流域２００ｂ（配列番号３）をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号４、５）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２／ＸｈｏＩを、“Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ”（タカラバイオ株式会社製）を用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え大腸菌株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：Ｐｇａｐとした。続いてｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＰｇａｐをＳｃａＩで切断し、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：Ｐｇａｐ／ＳｃａＩを得た。反応Ａを触媒する酵素をコードする遺伝子を増幅するために、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４０株のゲノムＤＮＡを鋳型としてアシルトランスフェラーゼ遺伝子ｐｃａＦ（ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：１０４１７５５）の全長をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号６、７）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：Ｐｇａｐ／ＳｃａＩを、“Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ”を用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴとした。続いてｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴをＨｐａＩで切断し、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴ／ＨｐａＩを得た。反応Ｄおよび反応Ｅを触媒する酵素をコードする遺伝子を増幅するために、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４０株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子ｐｃａＩおよびｐｃａＪ（ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：１０４６６１３、１０４６６１２）の全長を含む連続した配列をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号８、９）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴ／ＨｐａＩを、“Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ”を用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴとした。
大腸菌内で自律複製可能なベクターｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２（ＭＥ Ｋｏｖａｃｈ，（１９９５），Ｇｅｎｅ １６６：１７５－１７６）をＸｈｏＩで切断し、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２／ＸｈｏＩを得た。当該ベクターに構成的な発現プロモーターを組み込むために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒ．Ｋ－１２ ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡを鋳型としてｇａｐＡ（ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ： ＮＣ＿０００９１３．３）の上流域２００ｂ（配列番号３）をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号４、５）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２／ＸｈｏＩを、“Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ”（タカラバイオ株式会社製）を用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え大腸菌株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：Ｐｇａｐとした。続いてｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＰｇａｐをＳｃａＩで切断し、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：Ｐｇａｐ／ＳｃａＩを得た。反応Ａを触媒する酵素をコードする遺伝子を増幅するために、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４０株のゲノムＤＮＡを鋳型としてアシルトランスフェラーゼ遺伝子ｐｃａＦ（ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：１０４１７５５）の全長をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号６、７）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：Ｐｇａｐ／ＳｃａＩを、“Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ”を用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴとした。続いてｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴをＨｐａＩで切断し、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴ／ＨｐａＩを得た。反応Ｄおよび反応Ｅを触媒する酵素をコードする遺伝子を増幅するために、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ ＫＴ２４４０株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＣｏＡトランスフェラーゼ遺伝子ｐｃａＩおよびｐｃａＪ（ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：１０４６６１３、１０４６６１２）の全長を含む連続した配列をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号８、９）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴ／ＨｐａＩを、“Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ”を用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴとした。
【0080】
ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴをＳｃａＩで切断し、ｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ／ＳｃａＩを得た。Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ ＡＴＣＣ１３８８０株のゲノムＤＮＡを鋳型として、配列番号１０に記載の核酸を増幅するためのプライマーを設計し（配列番号１１、１２）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴ／ＳｃａＩを、“Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ”（タカラバイオ株式会社製）を用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られた組換え株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲとした。
【0081】
（参考例２）ｇａｐＡプロモーター導入プラスミドの作製
大腸菌内で自律複製可能な発現ベクターｐＣＤＦ－１ｂ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）をＢａｍＨＩで切断し、ｐＣＤＦ／ＢａｍＨＩを得た。当該ベクターに構成的な発現プロモーターを組み込むために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒ．Ｋ－１２ ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡを鋳型としてｇａｐＡ（ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ： ＮＣ＿０００９１３．３）の上流域２００ｂ（配列番号８）をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号１３、１４）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＣＤＦ／ＢａｍＨＩを、“Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ”（タカラバイオ株式会社製）を用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られたストレプトマイシン耐性株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＣＤＦ：：Ｐｇａｐとした。
大腸菌内で自律複製可能な発現ベクターｐＣＤＦ－１ｂ（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）をＢａｍＨＩで切断し、ｐＣＤＦ／ＢａｍＨＩを得た。当該ベクターに構成的な発現プロモーターを組み込むために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒ．Ｋ－１２ ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡを鋳型としてｇａｐＡ（ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ： ＮＣ＿０００９１３．３）の上流域２００ｂ（配列番号８）をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号１３、１４）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＣＤＦ／ＢａｍＨＩを、“Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ”（タカラバイオ株式会社製）を用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られたストレプトマイシン耐性株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＣＤＦ：：Ｐｇａｐとした。
【0082】
（参考例３）ＭＤＨを発現するプラスミドの作製
参考例２で作製したｇａｐＡプロモーター導入プラスミドｐＣＤＦ：：ＰｇａｐにＭＤＨをコードする塩基配列を導入し、ｇａｐＡプロモーターの制御下でＭＤＨが発現するようにデザインしたＭＤＨ発現プラスミドｐＣＤＦ：：ｍｄｈを作製した。
参考例２で作製したｇａｐＡプロモーター導入プラスミドｐＣＤＦ：：ＰｇａｐにＭＤＨをコードする塩基配列を導入し、ｇａｐＡプロモーターの制御下でＭＤＨが発現するようにデザインしたＭＤＨ発現プラスミドｐＣＤＦ：：ｍｄｈを作製した。
【0083】
参考例２で作成したｐＣＤＦ：：ＰｇａｐをＢａｍＨＩで切断し、ｐＣＤＦ：：Ｐｇａｐ／ＢａｍＨＩを得た。リンゴ酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子を増幅するために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒ．Ｋ－１２ ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡを鋳型としてｍｄｈ（ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：９４７８５４）全長を含む領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号１５、１６）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＣＤＦ：：Ｐｇａｐ／ＢａｍＨＩを、“Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ”（タカラバイオ株式会社製）を用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られたストレプトマイシン耐性株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＣＤＦ：：ｍｄｈとした。
【0084】
（参考例４）ＦＤＨを発現するプラスミドの作製
参考例２で作製したｇａｐＡプロモーター導入プラスミドｐＣＤＦ：：ＰｇａｐにＦＤＨをコードする塩基配列を導入し、ｇａｐＡプロモーターの制御下でＦＤＨが発現するようにデザインしたＦＤＨ発現プラスミドｐＣＤＦ：：ｆｄｈを作製した。
参考例２で作製したｇａｐＡプロモーター導入プラスミドｐＣＤＦ：：ＰｇａｐにＦＤＨをコードする塩基配列を導入し、ｇａｐＡプロモーターの制御下でＦＤＨが発現するようにデザインしたＦＤＨ発現プラスミドｐＣＤＦ：：ｆｄｈを作製した。
【0085】
参考例２で作成したｐＣＤＦ：：ＰｇａｐをＢａｍＨＩで切断し、ｐＣＤＦ：：Ｐｇａｐ／ＢａｍＨＩを得た。Ｃａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ Ｓ２株由来のＮＡＤＨ産生型ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ１）をコードする塩基配列（配列番号１７）を遺伝子合成し、当該領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号１８、１９）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＣＤＦ：：Ｐｇａｐ／ＢａｍＨＩを、“Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ”（タカラバイオ株式会社製）を用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られたストレプトマイシン耐性株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＣＤＦ：：ｆｄｈとした。
【0086】
（参考例５）ＭＤＨおよびＦＤＨを同時発現するプラスミドの作製
参考例３で作製したＭＤＨ発現プラスミドｐＣＤＦ：：ｍｄｈにＦＤＨをコードする塩基配列を導入し、ｇａｐＡプロモーターの制御下でＭＤＨおよびＦＤＨが同時発現するようにデザインした発現プラスミドｐＣＤＦ：：ｆｄｈ－ｍｄｈを作製した。
参考例３で作製したＭＤＨ発現プラスミドｐＣＤＦ：：ｍｄｈにＦＤＨをコードする塩基配列を導入し、ｇａｐＡプロモーターの制御下でＭＤＨおよびＦＤＨが同時発現するようにデザインした発現プラスミドｐＣＤＦ：：ｆｄｈ－ｍｄｈを作製した。
【0087】
参考例５で作成したｐＣＤＦ：：ｍｄｈをＢｓａＩとＫｐｎＩで切断し、ｐＣＤＦ：：ｍｄｈ／ＢｓａＩ＿ＫｐｎＩを得た。ｇａｐＡプロモーターの一部とＣａｎｄｉｄａ ｂｏｉｄｉｎｉｉ Ｓ２株由来のＮＡＤＨ産生型ギ酸デヒドロゲナーゼ（ＦＤＨ１）をコードする塩基配列（配列番号１７）、およびｇａｐＡプロモーターの３’末端側の一部とＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒ．Ｋ－１２ ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５のｍｄｈ（ＮＣＢＩ－ＧｅｎｅＩＤ：９４７８５４）の５’末端側の一部を含む配列（配列番号２０）を遺伝子合成し、当該領域をＰＣＲ増幅するためのプライマーを設計し（配列番号２１、２２）、常法に従ってＰＣＲ反応を行った。得られた断片およびｐＣＤＦ：：ｍｄｈ／ＢｓａＩ＿ＫｐｎＩを、“Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ”（タカラバイオ株式会社製）を用いて連結し、大腸菌株ＤＨ５αに導入した。得られたストレプトマイシン耐性株から当該プラスミドを抽出し、常法により塩基配列を確認したプラスミドをｐＣＤＦ：：ｆｄｈ－ｍｄｈとした。
【0088】
（参考例６）反応Ａ、Ｂ、ＤおよびＥを触媒する酵素を発現するプラスミドを有する大腸菌の作製
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒ．Ｋ－１２ ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５に対して、参考例１で作製したプラスミドを導入し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体を作製した。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒ．Ｋ－１２ ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５に対して、参考例１で作製したプラスミドを導入し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体を作製した。
【0089】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｔｒ．Ｋ－１２ ｓｕｂｓｔｒ．ＭＧ１６５５を５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３０℃で１日振とう培養した。培養液０．５ｍＬを５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３０℃で２時間、振とう培養した。培養液を２０分間氷冷したのち、菌体を１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで３回洗浄した。洗浄後のペレットを１００μＬの１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで懸濁し、１５０ｎｇのｐＢＢＲ１ＭＣＳ－２：：ＡＴＣＴＯＲと混合したのちエレクトロポレーションキュベット内で１０分間氷冷した。Ｇｅｎｅ ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ－ｒａｄ社製）を用いてエレクトロポレーションを実施した（３ｋＶ、２００Ω、２５μＦ）後、即座に１ｍＬのＳＯＣ培地を添加し、３０℃で１時間振とう培養した。カナマイシン２５μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３０℃で１日インキュベートした。得られた株をＥｃ／３ＨＡとした。
【0090】
（参考例７）反応Ａ、Ｂ、ＤおよびＥを触媒する酵素を発現するプラスミドを有し、かつｐＣＤＦ：：Ｐｇａｐを有する大腸菌の作製
Ｅｃ／３ＨＡをカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含む５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３０℃で１日振とう培養した。培養液０．５ｍＬをカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含む５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３０℃で２時間、振とう培養した。培養液を２０分間氷冷したのち、菌体を１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで３回洗浄した。洗浄後のペレットを１００μＬの１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで懸濁し、１５０ｎｇのｐＣＤＦ：：Ｐｇａｐと混合したのちエレクトロポレーションキュベット内で１０分間氷冷した。Ｇｅｎｅ ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ－ｒａｄ社製）を用いてエレクトロポレーションを実施した（３ｋＶ、２００Ω、２５μＦ）後、即座に１ｍＬのＳＯＣ培地を添加し、３０℃で１時間振とう培養した。５０μＬをカナマイシン２５μｇ／ｍＬ、およびストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３０℃で１日インキュベートした。得られた株をＥｃ／３ＨＡｐＣＤＦとした。
Ｅｃ／３ＨＡをカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含む５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３０℃で１日振とう培養した。培養液０．５ｍＬをカナマイシン２５μｇ／ｍＬを含む５ｍＬのＬＢ培地に植菌し、３０℃で２時間、振とう培養した。培養液を２０分間氷冷したのち、菌体を１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで３回洗浄した。洗浄後のペレットを１００μＬの１０％（ｗ／ｗ）グリセロールで懸濁し、１５０ｎｇのｐＣＤＦ：：Ｐｇａｐと混合したのちエレクトロポレーションキュベット内で１０分間氷冷した。Ｇｅｎｅ ｐｕｌｓｅｒ（Ｂｉｏ－ｒａｄ社製）を用いてエレクトロポレーションを実施した（３ｋＶ、２００Ω、２５μＦ）後、即座に１ｍＬのＳＯＣ培地を添加し、３０℃で１時間振とう培養した。５０μＬをカナマイシン２５μｇ／ｍＬ、およびストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬを含むＬＢ寒天培地に塗布し、３０℃で１日インキュベートした。得られた株をＥｃ／３ＨＡｐＣＤＦとした。
【0091】
（参考例８）反応Ａ、Ｂ、ＤおよびＥを触媒する酵素を発現するプラスミドを有し、かつｐＣＤＦ：：Ｐｇａｐを有する大腸菌の３－ヒドロキシアジピン酸の生産試験
ｐＨ７に調整した培地Ｉ（Ｂａｃｔｏトリプトン（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）１０ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、カナマイシン２５μｇ／ｍＬ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬ）５ｍＬ（φ１８ｍｍガラス試験管、アルミ栓）に、参考例７で作製したＥｃ／３ＨＡｐＣＤＦを一白金耳植菌し、３０℃、１２０ｍｉｎ－１で２４時間振とう培養した。当該培養液０．２５ｍＬをｐＨ６．５に調整した培地ＩＩ（グルコース５０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸カリウム５０ｍＭ、硫酸マグネシウム０．０２５ｇ／Ｌ、硫酸鉄０．０６２５ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン２．７ｍｇ／Ｌ、塩化カルシウム０．３３ｍｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１．２５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏトリプトン２．５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス１．２５ｇ／Ｌ、カナマイシン２５μｇ／ｍＬ）５ｍＬ（φ１８ｍｍガラス試験管、アルミ栓）に添加し、３０℃で振とう培養した。培養上清中に蓄積した３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の収率は表１に示すとおりである。
ｐＨ７に調整した培地Ｉ（Ｂａｃｔｏトリプトン（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）１０ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、カナマイシン２５μｇ／ｍＬ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍＬ）５ｍＬ（φ１８ｍｍガラス試験管、アルミ栓）に、参考例７で作製したＥｃ／３ＨＡｐＣＤＦを一白金耳植菌し、３０℃、１２０ｍｉｎ－１で２４時間振とう培養した。当該培養液０．２５ｍＬをｐＨ６．５に調整した培地ＩＩ（グルコース５０ｇ／Ｌ、硫酸アンモニウム１ｇ／Ｌ、リン酸カリウム５０ｍＭ、硫酸マグネシウム０．０２５ｇ／Ｌ、硫酸鉄０．０６２５ｍｇ／Ｌ、硫酸マンガン２．７ｍｇ／Ｌ、塩化カルシウム０．３３ｍｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１．２５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏトリプトン２．５ｇ／Ｌ、Ｂａｃｔｏ酵母エキス１．２５ｇ／Ｌ、カナマイシン２５μｇ／ｍＬ）５ｍＬ（φ１８ｍｍガラス試験管、アルミ栓）に添加し、３０℃で振とう培養した。培養上清中に蓄積した３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の収率は表１に示すとおりである。
【0092】
（比較例１）反応Ａ、Ｂ、ＤおよびＥを触媒する酵素を発現するプラスミドをならびにＭＤＨ発現プラスミドを導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体の作製
Ｅｃ／３ＨＡに対して、参考例７と同様の方法にて、参考例３で作製したプラスミドｐＣＤＦ：：ｍｄｈを導入し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体を作製した。得られた株をＥｃ／３ＨＡｍｄｈとした。
Ｅｃ／３ＨＡに対して、参考例７と同様の方法にて、参考例３で作製したプラスミドｐＣＤＦ：：ｍｄｈを導入し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体を作製した。得られた株をＥｃ／３ＨＡｍｄｈとした。
【0093】
（比較例２）反応Ａ、Ｂ、ＤおよびＥを触媒する酵素を発現するプラスミドならびにＭＤＨ発現プラスミドを導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体を用いた３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験
比較例１で作製したＥｃ／３ＨＡｍｄｈを、参考例８と同様の方法にて培養した。培養上清中に蓄積した３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸および培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量して算出した３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の収率は表１に示すとおりであり、ｍｄｈの発現量が増大し、かつ反応Ａ、Ｂ、ＤおよびＥを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体では、３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の収率が低下することがわかった。
比較例１で作製したＥｃ／３ＨＡｍｄｈを、参考例８と同様の方法にて培養した。培養上清中に蓄積した３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸および培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量して算出した３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の収率は表１に示すとおりであり、ｍｄｈの発現量が増大し、かつ反応Ａ、Ｂ、ＤおよびＥを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体では、３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の収率が低下することがわかった。
【0094】
（比較例３）反応Ａ、Ｂ、ＤおよびＥを触媒する酵素を発現するプラスミドをならびにＦＤＨ発現プラスミドを導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体の作製
Ｅｃ／３ＨＡに対して、参考例８と同様の方法にて、参考例４で作製したプラスミドｐＣＤＦ：：ｆｄｈを導入し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体を作製した。得られた株をＥｃ／３ＨＡｆｄｈとした。
Ｅｃ／３ＨＡに対して、参考例８と同様の方法にて、参考例４で作製したプラスミドｐＣＤＦ：：ｆｄｈを導入し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体を作製した。得られた株をＥｃ／３ＨＡｆｄｈとした。
【0095】
（比較例４）反応Ａ、Ｂ、ＤおよびＥを触媒する酵素を発現するプラスミドならびにＦＤＨ発現プラスミドを導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体を用いた３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験
比較例２で作製したＥｃ／３ＨＡｆｄｈを、参考例８と同様の方法にて培養した。培養上清中に蓄積した３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸および培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量して算出した３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の収率は表１に示すとおりであり、ＦＤＨの発現量が増大し、かつ反応Ａ、Ｂ、ＤおよびＥを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体では、３－ヒドロキシアジピン酸の収率が低下することがわかった。
比較例２で作製したＥｃ／３ＨＡｆｄｈを、参考例８と同様の方法にて培養した。培養上清中に蓄積した３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸および培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量して算出した３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の収率は表１に示すとおりであり、ＦＤＨの発現量が増大し、かつ反応Ａ、Ｂ、ＤおよびＥを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体では、３－ヒドロキシアジピン酸の収率が低下することがわかった。
【0096】
（実施例１）反応Ａ、Ｂ、ＤおよびＥを触媒する酵素を発現するプラスミドをならびにＦＤＨとＭＤＨを同時発現するプラスミドを導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体の作製
Ｅｃ／３ＨＡに対して、参考例７と同様の方法にて、参考例５で作製したプラスミドｐＣＤＦ：：ｆｄｈ－ｍｄｈを導入し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体を作製した。得られた株をＥｃ／３ＨＡｆｄｈ－ｍｄｈとした。
Ｅｃ／３ＨＡに対して、参考例７と同様の方法にて、参考例５で作製したプラスミドｐＣＤＦ：：ｆｄｈ－ｍｄｈを導入し、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体を作製した。得られた株をＥｃ／３ＨＡｆｄｈ－ｍｄｈとした。
【0097】
（実施例２）反応Ａ、Ｂ、ＤおよびＥを触媒する酵素を発現するプラスミドならびにＦＤＨ１とＭＤＨを同時発現するプラスミドを導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体を用いた３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の生産試験
実施例１で作製したＥｃ／３ＨＡｆｄｈ－ｍｄｈを、参考例８と同様の方法にて培養した。培養上清中に蓄積した３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸および培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量して算出した３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の収率は表１に示すとおりであり、ＦＤＨとＭＤＨの発現量が同時に増大し、かつ反応Ａ、Ｂ、ＤおよびＥを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体では、３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の収率が向上し、ＦＤＨ１の発現量を単独で増大させた時よりもα－ヒドロムコン酸の収率がさらに向上することがわかった。
実施例１で作製したＥｃ／３ＨＡｆｄｈ－ｍｄｈを、参考例８と同様の方法にて培養した。培養上清中に蓄積した３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸および培地中に利用されずに残存している糖の濃度を定量して算出した３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の収率は表１に示すとおりであり、ＦＤＨとＭＤＨの発現量が同時に増大し、かつ反応Ａ、Ｂ、ＤおよびＥを触媒する酵素を発現するプラスミドを導入したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属微生物変異体では、３－ヒドロキシアジピン酸およびα－ヒドロムコン酸の収率が向上し、ＦＤＨ１の発現量を単独で増大させた時よりもα－ヒドロムコン酸の収率がさらに向上することがわかった。
【0098】
【表1】
【配列表】