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特開2024-91499ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達抑制を介した色素沈着抑制方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024091499
(43)【公開日】2024-07-04
(54)【発明の名称】ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達抑制を介した色素沈着抑制方法
(51)【国際特許分類】
A61K 8/49 20060101AFI20240627BHJP
A61K 8/99 20170101ALI20240627BHJP
A61Q 19/02 20060101ALI20240627BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20240627BHJP
C12N 9/99 20060101ALN20240627BHJP
【ＦＩ】
A61K8/49
A61K8/99
A61Q19/02
C12Q1/02
C12N9/99
【審査請求】未請求
【請求項の数】13
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023207726
(22)【出願日】2023-12-08
(31)【優先権主張番号】P 2022205949
(32)【優先日】2022-12-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】000001959
【氏名又は名称】株式会社 資生堂
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100138210
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 達則
(74)【代理人】
【識別番号】100166165
【弁理士】
【氏名又は名称】津田 英直
(72)【発明者】
【氏名】小池 咲綾
【テーマコード（参考）】
4B063
4C083
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ08
4B063QQ27
4B063QQ79
4B063QR77
4B063QS24
4B063QS28
4B063QS33
4B063QX02
4C083AA111
4C083AA112
4C083AC851
4C083AC852
4C083AC861
4C083AC862
4C083CC02
4C083EE16
(57)【要約】
【課題】シミの根本原因にアプローチする新規の色素沈着抑制方法、美白剤、および美白剤のスクリーニング方法を提供する。
【解決手段】ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制することを含む、色素沈着抑制方法、ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制する効果を有する物質を含む、美白剤、およびｍＴＯＲシグナリング系に含まれる分子の阻害剤を選択する工程を含む、美白剤のスクリーニング方法が提供される。
【選択図】 図９
【解決手段】ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制することを含む、色素沈着抑制方法、ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制する効果を有する物質を含む、美白剤、およびｍＴＯＲシグナリング系に含まれる分子の阻害剤を選択する工程を含む、美白剤のスクリーニング方法が提供される。
【選択図】 図９
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制することを含む、色素沈着抑制方法。
【請求項2】
ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制することが、ｍＴＯＲシグナル伝達、Ｓ６キナーゼシグナル伝達、４Ｅ－ＢＰシグナル伝達、サイクリンＤ１シグナル伝達、およびｃ－Ｍｙｃシグナル伝達からなる群から選択される少なくとも１つのシグナル伝達を阻害することを含む、請求項１に記載の色素沈着抑制方法
【請求項3】
ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制することが、ｍＴＯＲ阻害剤、Ｓ６キナーゼ阻害剤、４Ｅ－ＢＰ阻害剤、サイクリンＤ１阻害剤、およびｃ－Ｍｙｃ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種を投与することを含む、請求項１に記載の色素沈着抑制方法。
【請求項4】
ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制することが、レインボーアルゲエキス、ラパマイシン、ＬＹ２５８４７０２トシレート、４ＥＧＩ－１、およびパルボシクリブからなる群から選択される少なくとも１種を投与することを含む、請求項１に記載の色素沈着抑制方法。
【請求項5】
ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制する効果を有する物質を含む、美白剤。
【請求項6】
ｍＴＯＲシグナル伝達、Ｓ６キナーゼシグナル伝達、４Ｅ－ＢＰシグナル伝達、サイクリンＤ１シグナル伝達、およびｃ－Ｍｙｃシグナル伝達からなる群から選択される少なくとも１つのシグナル伝達を阻害する物質を含む、請求項５に記載の美白剤。
【請求項7】
ｍＴＯＲ阻害剤、Ｓ６キナーゼ阻害剤、４Ｅ－ＢＰ阻害剤、サイクリンＤ１阻害剤、およびｃ－Ｍｙｃ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種を含む、請求項５に記載の美白剤。
【請求項8】
レインボーアルゲエキス、ラパマイシン、ＬＹ２５８４７０２トシレート、４ＥＧＩ－１、およびパルボシクリブからなる群から選択される少なくとも１種を含む、請求項５に記載の美白剤。
【請求項9】
美白剤のスクリーニング方法であって、
ｍＴＯＲシグナリング系に含まれる分子の阻害剤を選択する工程
を含む、スクリーニング方法。
ｍＴＯＲシグナリング系に含まれる分子の阻害剤を選択する工程
を含む、スクリーニング方法。
【請求項10】
ｍＴＯＲシグナリング系に含まれる分子が、ｍＴＯＲシグナル伝達、Ｓ６キナーゼシグナル伝達、４Ｅ－ＢＰシグナル伝達、サイクリンＤ１シグナル伝達、およびｃ－Ｍｙｃシグナル伝達からなる群から選択される少なくとも１つのシグナル伝達に含まれる分子である、請求項９に記載のスクリーニング方法。
【請求項11】
ｍＴＯＲシグナリング系に含まれる分子が、ｍＴＯＲ、ｍＴＯＲ複合体、Ｓ６キナーゼ、４Ｅ－ＢＰ、ｅＩＦ４Ｆ複合体、サイクリンＤ１、サイクリンＤ１・ＣＤＫ４／６複合体、ｃ－Ｍｙｃ、およびｃ－Ｍｙｃ／Ｍａｘ二量体からなる群から選択される少なくとも１種の分子である、請求項９に記載のスクリーニング方法。
【請求項12】
前記方法が以下の：
被験物質を含む培地で皮膚細胞を培養する工程、
培養後の皮膚細胞においてｍＴＯＲシグナリング系の活性を測定する工程、及び
測定されたｍＴＯＲシグナリング系の活性を、対照のｍＴＯＲシグナリング系の活性と比較する工程
を含み、ｍＴＯＲシグナリング系の活性が抑制された場合に、被験物質を色素沈着抑制剤、美白剤、又はシミ改善剤としてスクリーニングする、請求項９に記載のスクリーニング方法。
被験物質を含む培地で皮膚細胞を培養する工程、
培養後の皮膚細胞においてｍＴＯＲシグナリング系の活性を測定する工程、及び
測定されたｍＴＯＲシグナリング系の活性を、対照のｍＴＯＲシグナリング系の活性と比較する工程
を含み、ｍＴＯＲシグナリング系の活性が抑制された場合に、被験物質を色素沈着抑制剤、美白剤、又はシミ改善剤としてスクリーニングする、請求項９に記載のスクリーニング方法。
【請求項13】
レインボーアルゲエキスを含む、ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達抑制剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、色素沈着抑制方法に関し、より詳細には、ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達抑制を介した色素沈着抑制方法に関する。
【背景技術】
【0002】
シミ（色素斑）とは、肌に色素が沈着することにより生じ、肌の色素が沈着した部位と沈着していない部位との境界が明瞭である程度に色素が沈着した状態等を指す。シミにおける主要な色素成分としては、メラニン成分やヘモジデリン成分が挙げられる。
【0003】
メラニン成分などをターゲットとした化粧用組成物としては、例えば、特許文献１に、皮膚に局所的に適用された時に、表皮のメラニンを分解する子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ）由来酵素抽出物を含有する美白化組成物が開示されている。
【0004】
また、これまで、シミの原因遺伝子を明らかにするために、老人性色素斑（ｌｅｎｔｉｇｏ ｓｅｎｉｌｉｓ）における網羅的遺伝子発現解析（非特許文献１）や、ヒト皮膚組織を用いた関与因子の同定（特許文献２）が行われている。
【0005】
例えば、特許文献３には、皮膚のシミ状況分析方法として、被検対象より採取したヒト表皮組織におけるＣ１９ｏｒｆ２８、ＴＲＩＭ６３、ＰＩ１５、ＫＣＮＥ４、ＨＯＸＤ８、ＩＧＦＢＰ７、ＬＰＬ、ＬＯＣ３７５２９５、ＮＬＲＰ２、ＣＲＴＡＣ１、ＤＯＣＫ８、ＰＦＴＫ２、Ｃ２ｏｒｆ８８、ＴＲＩＭ９、ＨＭＣＮ１、ＡＥＢＰ１、ＦＬＴ１、ＭＡＰＫＢＰ１及びＭＫＬ２から選択される遺伝子の発現量、又は当該遺伝子の発現産物の量を指標とし、被検対象より採取した対照部位の同遺伝子の発現量、又は同遺伝子の発現産物の発現量と比較することにより、当該皮膚のシミ形成の進行度若しくは改善度を把握することを特徴とする方法が開示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特許第３９６７６８１号公報
【特許文献2】特許第３９４３４９０号公報
【特許文献3】特許第５８５８６０１号公報
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Aoki H et al. (2007) Br. J. Dermatol. 156: 1214-1223
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
しかしながら、従来の美白化粧品でターゲットとされているメラニン増加やターンオーバー停滞はシミの根本原因ではない。シミにおける生理機能は未だ未解明な点が多く、シミの根本原因を解明および制御することが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【0009】
本発明者らは、ｍＴＯＲシグナリング系が、シミの根本原因であるシミ化スイッチとしてシミの形成に寄与すること、具体的には、シミ部位ではｍＴＯＲシグナリング系が活性化されていること、ｍＴＯＲシグナリング系の活性化がその下流のシグナル伝達を介して、シミの形成に寄与することを見出した。そして、ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制することで、色素沈着抑制効果を得られることを発見した。本発明はこのような知見に基づくものであり、以下の態様を包含する。
【0010】
（態様１－１） ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制することを含む、色素沈着抑制方法。
（態様１－２） 色素沈着抑制において使用するためのｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達抑制剤。
（態様１－３） 色素沈着抑制剤の製造のための、ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達抑制剤の使用。
（態様１－４）ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達抑制剤を含む色素沈着抑制剤。
（態様２） ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制することが、ｍＴＯＲシグナル伝達、Ｓ６キナーゼシグナル伝達、４Ｅ－ＢＰシグナル伝達、サイクリンＤ１シグナル伝達、およびｃ－Ｍｙｃシグナル伝達からなる群から選択される少なくとも１つのシグナル伝達を阻害することを含む、態様１－１に記載の色素沈着抑制方法。
（態様３） ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制することが、ｍＴＯＲ阻害剤、Ｓ６キナーゼ阻害剤、４Ｅ－ＢＰ阻害剤、サイクリンＤ１阻害剤、およびｃ－Ｍｙｃ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種を投与することを含む、態様１－１又は２に記載の色素沈着抑制方法。
（態様３－２）ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達抑制剤が、ｍＴＯＲ阻害剤、Ｓ６キナーゼ阻害剤、４Ｅ－ＢＰ阻害剤、サイクリンＤ１阻害剤、およびｃ－Ｍｙｃ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１の阻害剤を含む、態様１－２～１－４に記載の発明。
（態様４） ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制することが、レインボーアルゲエキス、ラパマイシン、ＬＹ２５８４７０２トシレート、４ＥＧＩ－１、およびパルボシクリブからなる群から選択される少なくとも１種を投与することを含む、態様１～３のいずれか１つに記載の色素沈着抑制方法。
（態様４－２）ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達抑制剤が、レインボーアルゲエキス、ラパマイシン、ＬＹ２５８４７０２トシレート、４ＥＧＩ－１、およびパルボシクリブからなる群から選択される少なくとも１である、態様３－２に記載の発明。
（態様５－１） ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制する効果を有する物質を含む、美白剤。
（態様５－２）美白剤の製造のための、ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制する効果を有する
物質の使用。
（態様５－３）美白において使用するための、ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制する効果を有する物質。
（態様５－４）ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制する効果を有する物質を投与することを含む、美白方法。
（態様６） 前記ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制する効果を有する物質が、ｍＴＯＲシグナル伝達、Ｓ６キナーゼシグナル伝達、４Ｅ－ＢＰシグナル伝達、サイクリンＤ１シグナル伝達、およびｃ－Ｍｙｃシグナル伝達からなる群から選択される少なくとも１つのシグナル伝達を阻害する物質を含む、態様５－１～５－４に記載の発明。
（態様７） 前記ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制する効果を有する物質がｍＴＯＲ阻害剤、Ｓ６キナーゼ阻害剤、４Ｅ－ＢＰ阻害剤、サイクリンＤ１阻害剤、およびｃ－Ｍｙｃ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種を含む、態様５－１～６のいずれか一項に記載の発明。
（態様８） 前記ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制する効果を有する物質が、レインボーアルゲエキス、ラパマイシン、ＬＹ２５８４７０２トシレート、４ＥＧＩ－１、およびパルボシクリブからなる群から選択される少なくとも１種を含む、態様５－１～７のいずれか１つに記載の美白剤。
（態様９） 美白剤のスクリーニング方法であって、 ｍＴＯＲシグナリング系に含まれる分子の阻害剤を選択する工程を含む、スクリーニング方法。
（態様１０） ｍＴＯＲシグナリング系に含まれる分子が、ｍＴＯＲシグナル伝達、Ｓ６キナーゼシグナル伝達、４Ｅ－ＢＰシグナル伝達、サイクリンＤ１シグナル伝達、およびｃ－Ｍｙｃシグナル伝達からなる群から選択される少なくとも１つのシグナル伝達に含まれる分子である、態様９に記載のスクリーニング方法。
（態様１１） ｍＴＯＲシグナリング系に含まれる分子が、ｍＴＯＲ、ｍＴＯＲ複合体、Ｓ６キナーゼ、４Ｅ－ＢＰ、ｅＩＦ４Ｆ複合体、サイクリンＤ１、サイクリンＤ１・ＣＤＫ４／６複合体、ｃ－Ｍｙｃ、およびｃ－Ｍｙｃ／Ｍａｘ二量体からなる群から選択される少なくとも１種の分子である、態様９または１０に記載のスクリーニング方法。
（態様１２）
前記方法が以下の：
被験物質を含む培地で皮膚細胞を培養する工程、
培養後の皮膚細胞においてｍＴＯＲシグナリング系の活性を測定する工程、及び
測定されたｍＴＯＲシグナリング系の活性を、対照のｍＴＯＲシグナリング系の活性と比較する工程
を含み、ｍＴＯＲシグナリング系の活性が抑制された場合に、被験物質を色素沈着抑制剤、美白剤、又はシミ改善剤としてスクリーニングする、態様９に記載のスクリーニング方法。
（態様１３）レインボーアルゲエキスを含む、ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達抑制剤。
（態様１－２） 色素沈着抑制において使用するためのｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達抑制剤。
（態様１－３） 色素沈着抑制剤の製造のための、ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達抑制剤の使用。
（態様１－４）ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達抑制剤を含む色素沈着抑制剤。
（態様２） ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制することが、ｍＴＯＲシグナル伝達、Ｓ６キナーゼシグナル伝達、４Ｅ－ＢＰシグナル伝達、サイクリンＤ１シグナル伝達、およびｃ－Ｍｙｃシグナル伝達からなる群から選択される少なくとも１つのシグナル伝達を阻害することを含む、態様１－１に記載の色素沈着抑制方法。
（態様３） ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制することが、ｍＴＯＲ阻害剤、Ｓ６キナーゼ阻害剤、４Ｅ－ＢＰ阻害剤、サイクリンＤ１阻害剤、およびｃ－Ｍｙｃ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種を投与することを含む、態様１－１又は２に記載の色素沈着抑制方法。
（態様３－２）ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達抑制剤が、ｍＴＯＲ阻害剤、Ｓ６キナーゼ阻害剤、４Ｅ－ＢＰ阻害剤、サイクリンＤ１阻害剤、およびｃ－Ｍｙｃ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１の阻害剤を含む、態様１－２～１－４に記載の発明。
（態様４） ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制することが、レインボーアルゲエキス、ラパマイシン、ＬＹ２５８４７０２トシレート、４ＥＧＩ－１、およびパルボシクリブからなる群から選択される少なくとも１種を投与することを含む、態様１～３のいずれか１つに記載の色素沈着抑制方法。
（態様４－２）ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達抑制剤が、レインボーアルゲエキス、ラパマイシン、ＬＹ２５８４７０２トシレート、４ＥＧＩ－１、およびパルボシクリブからなる群から選択される少なくとも１である、態様３－２に記載の発明。
（態様５－１） ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制する効果を有する物質を含む、美白剤。
（態様５－２）美白剤の製造のための、ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制する効果を有する
物質の使用。
（態様５－３）美白において使用するための、ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制する効果を有する物質。
（態様５－４）ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制する効果を有する物質を投与することを含む、美白方法。
（態様６） 前記ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制する効果を有する物質が、ｍＴＯＲシグナル伝達、Ｓ６キナーゼシグナル伝達、４Ｅ－ＢＰシグナル伝達、サイクリンＤ１シグナル伝達、およびｃ－Ｍｙｃシグナル伝達からなる群から選択される少なくとも１つのシグナル伝達を阻害する物質を含む、態様５－１～５－４に記載の発明。
（態様７） 前記ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制する効果を有する物質がｍＴＯＲ阻害剤、Ｓ６キナーゼ阻害剤、４Ｅ－ＢＰ阻害剤、サイクリンＤ１阻害剤、およびｃ－Ｍｙｃ阻害剤からなる群から選択される少なくとも１種を含む、態様５－１～６のいずれか一項に記載の発明。
（態様８） 前記ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制する効果を有する物質が、レインボーアルゲエキス、ラパマイシン、ＬＹ２５８４７０２トシレート、４ＥＧＩ－１、およびパルボシクリブからなる群から選択される少なくとも１種を含む、態様５－１～７のいずれか１つに記載の美白剤。
（態様９） 美白剤のスクリーニング方法であって、 ｍＴＯＲシグナリング系に含まれる分子の阻害剤を選択する工程を含む、スクリーニング方法。
（態様１０） ｍＴＯＲシグナリング系に含まれる分子が、ｍＴＯＲシグナル伝達、Ｓ６キナーゼシグナル伝達、４Ｅ－ＢＰシグナル伝達、サイクリンＤ１シグナル伝達、およびｃ－Ｍｙｃシグナル伝達からなる群から選択される少なくとも１つのシグナル伝達に含まれる分子である、態様９に記載のスクリーニング方法。
（態様１１） ｍＴＯＲシグナリング系に含まれる分子が、ｍＴＯＲ、ｍＴＯＲ複合体、Ｓ６キナーゼ、４Ｅ－ＢＰ、ｅＩＦ４Ｆ複合体、サイクリンＤ１、サイクリンＤ１・ＣＤＫ４／６複合体、ｃ－Ｍｙｃ、およびｃ－Ｍｙｃ／Ｍａｘ二量体からなる群から選択される少なくとも１種の分子である、態様９または１０に記載のスクリーニング方法。
（態様１２）
前記方法が以下の：
被験物質を含む培地で皮膚細胞を培養する工程、
培養後の皮膚細胞においてｍＴＯＲシグナリング系の活性を測定する工程、及び
測定されたｍＴＯＲシグナリング系の活性を、対照のｍＴＯＲシグナリング系の活性と比較する工程
を含み、ｍＴＯＲシグナリング系の活性が抑制された場合に、被験物質を色素沈着抑制剤、美白剤、又はシミ改善剤としてスクリーニングする、態様９に記載のスクリーニング方法。
（態様１３）レインボーアルゲエキスを含む、ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達抑制剤。
【発明の効果】
【0011】
本発明によれば、シミの根本原因にアプローチする新規の色素沈着抑制方法、美白剤、および美白剤のスクリーニング方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図15】図１５Ａは、ラパマイシン又は被験物質としてレインボーアルゲエキスを添加した場合における、ｐS６Ｋについての免疫染色画像を表す。図１５Ｂは、免疫染色画像においてｐＳ６Ｋの蛍光強度を定量化した結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0013】
＜ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制することを含む、色素沈着抑制方法＞ 本発明の一態様は、ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制することを含む、色素沈着抑制方法に関する。
【0014】
ｍＴＯＲ（「ラパマイシンの機構的標的：ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｒａｐａｍｙｃｉｎ」または「ラパマイシンの哺乳類標的：ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔａｒｇｅｔ ｏｆ ｒａｐａｍｙｃｉｎ）」は、哺乳類などの動物における細胞内シグナル伝達に関与するタンパク質キナーゼ（セリン・スレオニンキナーゼ）の一種であり、転写、翻訳、タンパク質合成、解糖系、脂質生合成、血管新生、細胞周期、細胞増殖・分化、免疫などのさまざまな細胞機能の制御に働くＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナリング系の主要な構成分子である。 このｍＴＯＲについては、今日まで、ステントの再狭窄防止、抗癌剤、免疫抑制剤などとして阻害剤の開発がおこなわれてきたが、ｍＴＯＲがその下流のシグナル伝達を介して皮膚の黒化に関与すること、また、ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を制御することで色素沈着を抑制しうることはこれまで知られておらず、本発明者らが初めて見出した知見である。
【0015】
本発明において、ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制することにより、色素沈着を抑制する効果が得られる理由は明らかではないが、以下のように推測することができる。 何らかの要因によりｍＴＯＲが活性化されると、その下流のシグナル伝達（特には、転写、解糖系、それらの下流の翻訳の制御に関与するシグナル伝達）を介してタンパク質の生合成が活性化される。その結果、細胞の増殖・成長・分化のレベルが変化し、ケラチノサイトの過増殖やメラニン取り込みの増加が起こる。これにより、皮膚細胞のターンオーバーが停滞し、皮膚の黒化が引き起こされる。 したがって、ｍＴＯＲシグナリング系に含まれるいずれかのシグナル伝達を抑制することにより、メラニン排出停止を回復し、色素沈着を抑制しうるものと推測される。 ただし、このメカニズムは推論であり、本発明はいかなる理論に縛られるものではない。
【0016】
本明細書において、用語「ｍＴＯＲシグナリング系」は、ｍＴＯＲ自体のシグナル伝達（「ｍＴＯＲシグナル伝達」とも記載する）と、その下流の各種シグナル伝達を包含する。以下に、ｍＴＯＲシグナル伝達およびその下流のシグナル伝達、ならびにそれらの阻害剤を例示する。また、図１にｍＴＯＲシグナリング系におけるｍＴＯＲと細胞増殖・サイズ制御特異的反応のシグナル伝達経路を示す。
【0017】
（ｍＴＯＲシグナル伝達およびその阻害剤）
ｍＴＯＲは細胞において、ｍＴＯＲ複合体１（ｍＴＯＲＣ１）およびｍＴＯＲ複合体２（ｍＴＯＲＣ２）という２種類のタンパク質複合体として存在している。 ｍＴＯＲ複合体１は、ｍＴＯＲ、Ｒａｐｔｏｒ（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｍＴＯＲ）、およびｍＬＳＴ８（ｍａｍｍａｌｉａｎ ｌｅｔｈａｌ ｗｉｔｈ ＳＥＣ１３ ｐｒｏｔｅｉｎ ８）を含むタンパク質複合体である。ｍＴＯＲ複合体１は、その下流のシグナル伝達を介して、タンパク質合成および脂質合成などの同化代謝、細胞周期の進行、細胞の増殖・分化などを制御する。
ｍＴＯＲは細胞において、ｍＴＯＲ複合体１（ｍＴＯＲＣ１）およびｍＴＯＲ複合体２（ｍＴＯＲＣ２）という２種類のタンパク質複合体として存在している。 ｍＴＯＲ複合体１は、ｍＴＯＲ、Ｒａｐｔｏｒ（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｆ ｍＴＯＲ）、およびｍＬＳＴ８（ｍａｍｍａｌｉａｎ ｌｅｔｈａｌ ｗｉｔｈ ＳＥＣ１３ ｐｒｏｔｅｉｎ ８）を含むタンパク質複合体である。ｍＴＯＲ複合体１は、その下流のシグナル伝達を介して、タンパク質合成および脂質合成などの同化代謝、細胞周期の進行、細胞の増殖・分化などを制御する。
【0018】
ｍＴＯＲ複合体２は、ｍＴＯＲ、ＲＩＣＴＯＲ（ｒａｐａｍｙｃｉｎ－ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ｏｆ ｍＴＯＲ）、ｍＳＩＮ１（ｍａｍｍａｌｉａｎ ｓｔｒｅｓｓ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ １）を含むタンパク質複合体である。ｍＴＯＲ複合体２は、その下流のシグナル伝達を介して、細胞代謝や細胞骨格を調節する。
【0019】
本明細書において、「ｍＴＯＲシグナル伝達」は、上記ｍＴＯＲ複合体１またはｍＴＯＲ複合体２を介したシグナル伝達を指す。
【0020】
ｍＴＯＲシグナル伝達を抑制するｍＴＯＲ阻害剤としては、ｍＴＯＲを含めたｍＴＯＲ複合体１および２の各構成分子に対する阻害剤が挙げられる。そのような阻害剤としては、各構成分子の結合部位に結合して複合体形成を阻害する物質や、各構成分子の発現を阻害して複合体形成を阻害する物質などが挙げられる。ｍＴＯＲ阻害剤としては、例えばｍＴＯＲの細胞内受容体ＦＫＢＰ１２（ＦＫ５０６結合タンパク質１２）ドメインに結合して活性を阻害するラパマイシン（シロリムス）、およびその類似体が挙げられる。ラパマイシンは、ストレプトミセス属ヒグロスコピクスが生成するマクロライド系抗生物質である。ラパマイシン類似体（「ラパログ」とも総称される）の例としては、エベロリムス、リダフォロリムス、テムシロリムスなどが挙げられる。さらに別の例としては、ｍＴＯＲシグナル伝達阻害剤として、レインボーアルゲエキスが挙げられる。
【0021】
（Ｓ６キナーゼシグナル伝達およびその阻害剤）
上述のｍＴＯＲ複合体１は、ＰＤＫ１（３－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１：３－ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ－１）とともにＳ６キナーゼ（リボソームタンパク質Ｓ６キナーゼ：ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ６ ｋｉｎａｓｅ）をリン酸化する。リン酸化されたＳ６キナーゼは翻訳に関与する多数の基質タンパク質をリン酸化して、翻訳を制御する。「Ｓ６キナーゼシグナル伝達」は、このＳ６キナーゼによるリン酸化を介したシグナル伝達を指す。リン酸化される基質タンパク質としては、Ｓ６リボソームタンパク質の他、ｅＩＦ４Ａヘリカーゼの活性化因子であるｅＩＦ４Ｂ、リン酸化で阻害されるｅＩＦ４Ａ阻害因子であるＰＤＣＤ４、ｍＲＮＡのスプライシング因子であるＳＫＡＲなどが挙げられる。
上述のｍＴＯＲ複合体１は、ＰＤＫ１（３－ホスホイノシチド依存性プロテインキナーゼ－１：３－ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ－１）とともにＳ６キナーゼ（リボソームタンパク質Ｓ６キナーゼ：ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ６ ｋｉｎａｓｅ）をリン酸化する。リン酸化されたＳ６キナーゼは翻訳に関与する多数の基質タンパク質をリン酸化して、翻訳を制御する。「Ｓ６キナーゼシグナル伝達」は、このＳ６キナーゼによるリン酸化を介したシグナル伝達を指す。リン酸化される基質タンパク質としては、Ｓ６リボソームタンパク質の他、ｅＩＦ４Ａヘリカーゼの活性化因子であるｅＩＦ４Ｂ、リン酸化で阻害されるｅＩＦ４Ａ阻害因子であるＰＤＣＤ４、ｍＲＮＡのスプライシング因子であるＳＫＡＲなどが挙げられる。
【0022】
このＳ６Ｋシグナル伝達を阻害するＳ６キナーゼ阻害剤としては、ＬＹ２５８４７０２、ＬＹ２５８４７０２トシレート、ＰＦ－４７０８６７１、Ｓ６Ｋ－１８、ＡＤ８０、ＡＴ７８６７、ＡＴ１３１４８などが挙げられる。
【0023】
（４Ｅ－ＢＰシグナル伝達およびその阻害剤）
４Ｅ－ＢＰｓ（真核生物翻訳開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）結合タンパク質：ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ４Ｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）は翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅと結合することによりリボソームの導入を抑制し翻訳を阻害するポリペプチドである。上述のｍＴＯＲ複合体１は、４Ｅ－ＢＰｓをリン酸化することにより、ｅＩＦ４Ｅから４Ｅ－ＢＰｓを解離させる。解離したｅＩＦ４ＥはｅＩＦ４Ｇ、ｅＩＦ４Ａと結合してｅＩＦ４Ｆ複合体を形成する。ｅＩＦ４Ｆ複合体はｍＲＮＡの５’キャップ構造に結合し、リボソームをｍＲＮＡへと導入することにより翻訳の開始を制御する。「４Ｅ－ＢＰシグナル伝達」は、この４Ｅ－ＢＰｓの解離により生成するｅＩＦ４Ｆ複合体を介したシグナル伝達を指す。４Ｅ－ＢＰｓは、好ましくは４Ｅ－ＢＰ１である。
４Ｅ－ＢＰｓ（真核生物翻訳開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）結合タンパク質：ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ４Ｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）は翻訳開始因子ｅＩＦ４Ｅと結合することによりリボソームの導入を抑制し翻訳を阻害するポリペプチドである。上述のｍＴＯＲ複合体１は、４Ｅ－ＢＰｓをリン酸化することにより、ｅＩＦ４Ｅから４Ｅ－ＢＰｓを解離させる。解離したｅＩＦ４ＥはｅＩＦ４Ｇ、ｅＩＦ４Ａと結合してｅＩＦ４Ｆ複合体を形成する。ｅＩＦ４Ｆ複合体はｍＲＮＡの５’キャップ構造に結合し、リボソームをｍＲＮＡへと導入することにより翻訳の開始を制御する。「４Ｅ－ＢＰシグナル伝達」は、この４Ｅ－ＢＰｓの解離により生成するｅＩＦ４Ｆ複合体を介したシグナル伝達を指す。４Ｅ－ＢＰｓは、好ましくは４Ｅ－ＢＰ１である。
【0024】
この４Ｅ－ＢＰシグナル伝達を阻害する４Ｅ－ＢＰ阻害剤（４Ｅ－ＢＰ下流阻害剤）としては、４Ｅ－ＢＰｓおよびｅＩＦ４Ｆ複合体の各構成分子に対する阻害剤が挙げられる。そのような阻害剤としては、各構成分子の結合部位に結合して複合体形成を阻害する物質や、各構成分子の発現を阻害して複合体形成を阻害する物質などが挙げられる。４Ｅ－ＢＰ阻害剤の例としては、４Ｅ－ＢＰと同様にｅＩＦ４Ｅの結合部位に結合することでｅＩＦ４Ｇを置換する合成分子である４ＥＧＩ－１が挙げられる。４ＥＧＩ－１はまた、ｅＩＦ４ＥとｅＩＦ４Ｇの結合を阻害するだけでなく、同じモチーフを介してｅＩＦ４Ｅの異なる部位に結合し、内因性４Ｅ－ＢＰ１の結合性を増大させることも知られている。４ＥＧＩ－１は、ｅＩＦ４Ｅの影響を受けやすいｍＲＮＡ群（ｅＩＦ４Ｅ感受性ｍＲＮＡ）、例えばサイクリンＤ１、ｃ－Ｍｙｃなどのキャップ依存性翻訳を阻害する。
【0025】
（細胞の増殖・サイズ・分化の制御に関与するシグナル伝達）
上述のＳ６Ｋシグナル伝達および４Ｅ－ＢＰシグナル伝達の活性化を介して、細胞の増殖・サイズ・分化の制御に関与するタンパク質の合成が活性化される。そのようなタンパク質の例としては、サイクリンＤ１、ｃ－Ｍｙｃなどが挙げられる。これらのタンパク質を介したシグナル伝達を介して、細胞（ケラチノサイトなど）の増殖・サイズ・分化が制御された結果、皮膚細胞の黒化が引き起こされる。
上述のＳ６Ｋシグナル伝達および４Ｅ－ＢＰシグナル伝達の活性化を介して、細胞の増殖・サイズ・分化の制御に関与するタンパク質の合成が活性化される。そのようなタンパク質の例としては、サイクリンＤ１、ｃ－Ｍｙｃなどが挙げられる。これらのタンパク質を介したシグナル伝達を介して、細胞（ケラチノサイトなど）の増殖・サイズ・分化が制御された結果、皮膚細胞の黒化が引き起こされる。
【0026】
・サイクリンＤ１シグナル伝達およびその阻害剤
サイクリンＤ１は、ＣＤＫ（サイクリン依存性キナーゼ：ｃｙｃｌｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ）４／６とサイクリンＤ１・ＣＤＫ４／６複合体を形成する。サイクリンＤ１・ＣＤＫ４／６複合体は、Ｒｂ（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ）タンパク質をリン酸化し、細胞周期のＧ１期からＳ期への移行に必要な遺伝子の転写を促進する。「サイクリンＤ１シグナル伝達」は、このサイクリンＤ１・ＣＤＫ４／６複合体を介したシグナル伝達を指す。
サイクリンＤ１は、ＣＤＫ（サイクリン依存性キナーゼ：ｃｙｃｌｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ）４／６とサイクリンＤ１・ＣＤＫ４／６複合体を形成する。サイクリンＤ１・ＣＤＫ４／６複合体は、Ｒｂ（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ）タンパク質をリン酸化し、細胞周期のＧ１期からＳ期への移行に必要な遺伝子の転写を促進する。「サイクリンＤ１シグナル伝達」は、このサイクリンＤ１・ＣＤＫ４／６複合体を介したシグナル伝達を指す。
【0027】
このサイクリンＤ１シグナル伝達を阻害するサイクリンＤ１阻害剤は、サイクリンＤ１・ＣＤＫ４／６複合体の各構成分子に対する阻害剤でありうる。そのような阻害剤としては、各構成分子の結合部位に結合して複合体形成を阻害する物質や、各構成分子の発現を阻害して複合体形成を阻害する物質などが挙げられる。サイクリンＤ１阻害剤としては、ＣＤＫ４／６の活性を選択的に阻害するキナーゼ阻害薬であるパルボシクリブが挙げられる。
【0028】
・ｃ－Ｍｙｃシグナル伝達およびその阻害剤
ｃ－Ｍｙｃは、Ｅ－ｂｏｘ配列への結合とヒストンアセチル化酵素のリクルートによって多くの増殖促進遺伝子の発現を活性化する転写因子であり、ＭｙｃのＤＮＡへの結合を担うｂＨＬＨ（塩基性ヘリックスループヘリックス）モチーフと、他のｂＨＬＨ型転写因子であるＭａｘとの二量体化を担うＬＺ（ロイシンジッパー）モチーフを含む。ｃ－Ｍｙｃは、遺伝子の転写伸長反応をアップレギュレーションし、また細胞の増殖、成長、分化を調節する機能を有する。 このｃ－Ｍｙｃシグナル伝達を阻害するｃ－Ｍｙｃ阻害剤としては、ｃ－Ｍｙｃ／Ｍａｘ二量体の形成を阻害するＭＹＣｉ３６１、１００７４－Ｇ５など、およびｃ－Ｍｙｃの発現量を低下させるＪＱ１などが挙げられる。
ｃ－Ｍｙｃは、Ｅ－ｂｏｘ配列への結合とヒストンアセチル化酵素のリクルートによって多くの増殖促進遺伝子の発現を活性化する転写因子であり、ＭｙｃのＤＮＡへの結合を担うｂＨＬＨ（塩基性ヘリックスループヘリックス）モチーフと、他のｂＨＬＨ型転写因子であるＭａｘとの二量体化を担うＬＺ（ロイシンジッパー）モチーフを含む。ｃ－Ｍｙｃは、遺伝子の転写伸長反応をアップレギュレーションし、また細胞の増殖、成長、分化を調節する機能を有する。 このｃ－Ｍｙｃシグナル伝達を阻害するｃ－Ｍｙｃ阻害剤としては、ｃ－Ｍｙｃ／Ｍａｘ二量体の形成を阻害するＭＹＣｉ３６１、１００７４－Ｇ５など、およびｃ－Ｍｙｃの発現量を低下させるＪＱ１などが挙げられる。
【0029】
本明細書において、上に例示したｍＴＯＲシグナリング系におけるいずれかのシグナル伝達を阻害するシグナル伝達阻害剤は、それらの医薬的に許容可能な塩、溶媒和物、水和物、立体異性体、プロドラッグ、類似体、または誘導体であってもよい。
【0030】
一部の実施形態において、本発明の色素沈着抑制方法は、上記のシグナル伝達阻害剤を対象に投与することを含む。シグナル伝達阻害剤の投与方法および投与対象については、後述の＜ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制する効果を有する物質を含む、美白剤＞の項目で説明する。
【0031】
一部の実施形態において、本発明の色素沈着抑制方法は、美容または非治療的方法である。一部の実施態様において、本発明にかかる美容または非治療的方法は、いわゆる医療行為を含まない。
【0032】
＜ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制する効果を有する物質を含む、美白剤＞ 本発明の一態様は、ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制する効果を有する物質を含む、美白剤に関する。 ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制する効果を有する物質は、上記＜ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制することを含む、色素沈着抑制方法＞において説明したｍＴＯＲシグナリング系におけるいずれかのシグナル伝達を阻害するシグナル伝達阻害剤でありうる。
【0033】
本発明にかかる美白剤は、外用投与または経口投与することができる。 外用投与の形態としては、例えば、クリーム、乳液、液体、シート、スプレー、ゲルなど任意に選択することができる。したがって、本発明にかかる美白剤は、皮膚外用剤として調製することができる。本実施形態の皮膚外用剤は、例えば化粧品組成物である。 経口投与の形態としては、例えば、錠剤、サプリメント、飲料、粉末など任意に選択することができる。したがって、本発明にかかる美白剤は、経口投与用組成物として調製することができる。本実施形態の経口投与用組成物は、例えば食品でありうる。
【0034】
本発明に係る皮膚外用剤は、乳液、クリーム、美容液、ローション、パック、洗顔料、石鹸、ボディソープ、シャンプー等の各種化粧品であってもよく、液状、乳液状、クリーム状、固形状、シート状、スプレー状、ゲル状、泡状、パウダー状等の様々な形態であり得る。また、本開示に係る経口投与用組成物は、粉末、飲料、または錠剤であってもよく、粉末状、液状、固形状、顆粒状、粒状、ペースト状、ゲル状等の様々な形態であり得る。
【0035】
本発明にかかる美白剤には、ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制する効果を有する物質を、美白効果（色素沈着抑制効果）が十分発揮されるような量で含有させることが好ましい。その配合量は、それらの種類、目的、形態、利用方法などに応じて、適宜決めることができる。
【0036】
本発明にかかる美白剤が皮膚外用剤である場合、ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制する効果を有する物質の配合量は、例えば、本発明にかかる美白剤の組成物総重量当たり０．００１～５０重量％、０．０１～５重量％、０．０１～１重量％、０．０１～０．１重量％、０．０２～０．０５重量％等とすることができるがこれらに限定されない。
【0037】
本発明にかかる美白剤が経口投与用組成物である場合、ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制する効果を有する物質の配合量は、例えば、本発明にかかる美白剤の組成物の総重量当たり０．００１～５０重量％、０．０１～５重量％、０．０１～１重量％、０．０１～０．１重量％、０．０２～０．０５重量％等とすることができるがこれらに限定されない。
【0038】
本発明にかかる美白剤には、必要に応じて添加剤を任意に選択し併用することができる。添加剤としては賦形剤等を含ませることができる。
【0039】
賦形剤としては、所望の剤型としたときに通常用いられるものであれば何でも良く、例えば、コムギデンプン、コメデンプン、トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、デキストリン、シクロデキストリンなどのでんぷん類、結晶セルロース類、乳糖、ブドウ糖、砂糖、還元麦芽糖、水飴、フラクトオリゴ糖、乳化オリゴ糖などの糖類、ソルビトール、エリスリトール、キシリトール、ラクチトール、マンニトールなどの糖アルコール類が挙げられる。これら賦形剤は、単独でまたは二種以上組み合わせて使用できる。
【0040】
その他の添加剤として、着色剤、保存剤、増粘剤、結合剤、崩壊剤、分散剤、安定化剤、ゲル化剤、酸化防止剤、界面活性剤、保存剤、ｐＨ調整剤、油分、水、アルコール類、キレート剤、シリコーン類、紫外線吸収剤、保湿剤、香料、各種薬効成分、防腐剤、中和剤等の公知のものを適宜選択して使用できる。
【0041】
本発明にかかる美白剤の投与の回数、頻度、量等は、所望の効果等に応じて適宜設定される。
【0042】
例えば、投与頻度は、４週間に１回、２週間に１回、１週間に１回、３日に１回、２日に１回、１日１回、１日２回、１日３回、１日４回、１日５回、都度投与等任意に選択できるがこれらに限定されない。
【0043】
（対象）
本発明にかかる色素沈着抑制方法および美白剤の適用対象は、限定されるものではないが、哺乳動物、特にヒト、ならびにイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタなどの非ヒト哺乳動物であり得る。対象は、好ましくはヒトである。
本発明にかかる色素沈着抑制方法および美白剤の適用対象は、限定されるものではないが、哺乳動物、特にヒト、ならびにイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタなどの非ヒト哺乳動物であり得る。対象は、好ましくはヒトである。
【0044】
一部の実施形態において、本発明にかかる色素沈着抑制方法および美白剤の適用対象となるシミは、加齢、紫外線、物理刺激、感染、生活習慣、疾患などに関連する任意の色素沈着である。一部の実施形態において、シミは、老人性色素斑、炎症後色素沈着などでありうる。本発明にかかる色素沈着抑制方法および美白剤は、シミの形成の予防および既に形成されたシミの改善のいずれにも用いられうる。既に形成されたシミは、一過性のシミ、初期のシミ、進行したシミのいずれでもありうる。本開示において、用語「美白」と「色素沈着の抑制」は同義でありうる。したがって、美白剤、色素沈着抑制剤、及びシミ改善剤はそれぞれ互換的に使用することができる。
【0045】
（ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制する効果を有する物質の使用）
本発明の一態様は、色素沈着の抑制のための、ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制する効果を有する物質およびそれを含む美白剤の使用に関する。さらに、本発明の一態様は、色素沈着の抑制に使用するためのｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制する効果を有する物質およびそれを含む美白剤に関する。ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制する効果を有する物質としては、レインボーアルゲエキスが挙げられる。
本発明の一態様は、色素沈着の抑制のための、ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制する効果を有する物質およびそれを含む美白剤の使用に関する。さらに、本発明の一態様は、色素沈着の抑制に使用するためのｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制する効果を有する物質およびそれを含む美白剤に関する。ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制する効果を有する物質としては、レインボーアルゲエキスが挙げられる。
【0046】
（色素沈着の抑制のための組成物の製造）
さらに、本発明の一態様は、色素沈着の抑制のための組成物（美白剤）の製造のためのｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制する効果を有する物質の使用に関する。
さらに、本発明の一態様は、色素沈着の抑制のための組成物（美白剤）の製造のためのｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制する効果を有する物質の使用に関する。
【0047】
＜スクリーニング方法＞
さらに、本発明の一態様は、ｍＴＯＲシグナリング系に含まれる分子の阻害剤を選択する工程を含む、美白剤のスクリーニング方法に関する。
さらに、本発明の一態様は、ｍＴＯＲシグナリング系に含まれる分子の阻害剤を選択する工程を含む、美白剤のスクリーニング方法に関する。
【0048】
一部の実施形態において、本発明のスクリーニング方法は、（１）ｍＴＯＲシグナリング系に含まれる分子を含む試料を用意する工程、（２）用意した試料に被験物質を接触させる工程、（３）被験物質を接触させた試料における目的のシグナル伝達の抑制効果を、被験物質を接触させていない試料におけるシグナル伝達の抑制効果と比較する工程を含む。 工程（３）において、被験物質を接触させていない試料と比較して、被験物質を接触させた試料のシグナル伝達の抑制効果が高い場合に、当該被験物質をｍＴＯＲシグナリング系に含まれる分子の阻害剤として選択する。
【0049】
（ｍＴＯＲシグナリング系に含まれる分子）
一部の実施形態において、本発明のスクリーニング方法におけるｍＴＯＲシグナリング系に含まれる分子（すなわち、阻害剤の標的となる分子）は、上記＜ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制することを含む、色素沈着抑制方法＞において説明したｍＴＯＲシグナリング系の各シグナル伝達に関与する分子でありうる。そのような分子の例としては、ｍＴＯＲ、ｍＴＯＲ複合体１および２（その構成成分である各分子を含む）、４Ｅ－ＢＰ（４Ｅ－ＢＰ１など）、ｅＩＦ４Ｆ複合体（その構成成分である各分子を含む）、Ｓ６キナーゼ、サイクリンＤ１、サイクリンＤ１・ＣＤＫ４／６複合体、ｃ－Ｍｙｃ、ｃ－Ｍｙｃ／Ｍａｘ二量体などが挙げられるがこれらに限定されない。
一部の実施形態において、本発明のスクリーニング方法におけるｍＴＯＲシグナリング系に含まれる分子（すなわち、阻害剤の標的となる分子）は、上記＜ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制することを含む、色素沈着抑制方法＞において説明したｍＴＯＲシグナリング系の各シグナル伝達に関与する分子でありうる。そのような分子の例としては、ｍＴＯＲ、ｍＴＯＲ複合体１および２（その構成成分である各分子を含む）、４Ｅ－ＢＰ（４Ｅ－ＢＰ１など）、ｅＩＦ４Ｆ複合体（その構成成分である各分子を含む）、Ｓ６キナーゼ、サイクリンＤ１、サイクリンＤ１・ＣＤＫ４／６複合体、ｃ－Ｍｙｃ、ｃ－Ｍｙｃ／Ｍａｘ二量体などが挙げられるがこれらに限定されない。
【0050】
（ｍＴＯＲシグナリング系に含まれる分子を含む試料）
一部の実施形態において、ｍＴＯＲシグナリング系に含まれる分子を含む試料は、細胞を用いないｉｎ ｖｉｔｒｏ試料である。本実施形態において、本発明のスクリーニング方法は、例えば組換えタンパク質を用いて実施することができる。
一部の実施形態において、ｍＴＯＲシグナリング系に含まれる分子を含む試料は、細胞を用いないｉｎ ｖｉｔｒｏ試料である。本実施形態において、本発明のスクリーニング方法は、例えば組換えタンパク質を用いて実施することができる。
【0051】
また、一部の実施形態において、ｍＴＯＲシグナリング系に含まれる分子を含む試料は皮膚細胞である。皮膚細胞は、好ましくは表皮細胞、より好ましくはケラチノサイトでありうる。
【0052】
（被験物質）
本発明のスクリーニング方法の被験物質（すなわち、ｍＴＯＲシグナリング系に含まれる分子の阻害剤）は、例えば、低分子化合物、高分子ポリマー、タンパク質、ペプチド、抗体、酵素、核酸、糖鎖、脂質などの任意の物質、およびそれらを含む組成物でありうる。
本発明のスクリーニング方法の被験物質（すなわち、ｍＴＯＲシグナリング系に含まれる分子の阻害剤）は、例えば、低分子化合物、高分子ポリマー、タンパク質、ペプチド、抗体、酵素、核酸、糖鎖、脂質などの任意の物質、およびそれらを含む組成物でありうる。
【0053】
さらに別の態様では、本発明のスクリーニング方法に用いる被験物質は、化粧品素材、食品素材、医薬品素材などの任意のライブラリーを使用することができる。かかるライブラリーとしては、化合物ライブラリー、エキスライブラリーなどを使用してもよい。各ライブラリーに含まれる化合物及びエキスは、市販の化合物及びエキスを使用してもよいし、合成された化合物及び調製されたエキスを使用してもよい。
【0054】
本明細書に記載される植物又は藻類のエキスは常法により得ることができ、例えばその起源となる植物又は藻類を抽出溶媒とともに常温又は加熱して浸漬または加熱還流した後、濾過し、濃縮して得ることができる。抽出溶媒としては、通常抽出に用いられる溶媒であれば任意に用いることができ、例えば、水性溶媒、例えば水、生理食塩水、リン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、あるいは有機溶媒、例えばエタノール、プロピレングリコール、１，３－ブチレングリコール、グリセリン等のアルコール類、含水アルコール類、クロロホルム、ジクロルエタン、四塩化炭素、アセトン、酢酸エチル、ヘキサン等を、それぞれ単独あるいは組み合わせて用いることができる。好ましくは、溶媒として水とアルコール、例えば１，３－ブチレングリコールの混合溶媒が使用される。上記溶媒で抽出して得られた抽出物をそのまま、あるいは例えば凍結乾燥などにより濃縮したエキスを使用でき、また必要であれば吸着法、例えばイオン交換樹脂を用いて不純物を除去したものや、ポーラスポリマー（例えばアンバーライトＸＡＤ－２）のカラムにて吸着させた後、所望の溶媒で溶出し、さらに濃縮したものも使用することができる。植物抽出物は、化粧品原料として市販されている抽出物を用いることもでき、市販の抽出物を所定の濃度にて配合することができる。
【0055】
レインボーアルゲエキスとは、褐藻の一種であるシフォリア（学名 Cystoseira tamariscifolia）から得られたエキスである。シフォリアは、ヨーロッパの海岸に分布する褐藻である。シフォリアの藻体に対し溶媒抽出を行うことで製造することもできる。溶媒としては、水、アルコール又はそれらの混合溶液を用いて抽出することで調製することができる。アルコールとしては、エタノール、プロピレングリコール、又はブチレングリコールが用いられる。より好ましくは、水と１，３－ブチレングリコールの任意の割合の混合液、例えば１０：９０～９０：１０の混合液、好ましく３０：７０～７０：３０、さらに好ましくは５０：５０の混合液により抽出されうる。レインボーアルゲエキスは、０．００１％～１％の濃度で配合され、０．１％～１％がより好ましい。
【0056】
一部の実施形態において、本発明のスクリーニング方法の被験物質は、ｍＴＯＲシグナリング系の各シグナル伝達に関与する分子に対して阻害効果を有することが既知の物質である。また一部の実施形態において、本発明のスクリーニング方法の被験物質は、メラニン蓄積量を低減する効果を有することが既知の物質である。すなわち、本発明のスクリーニング方法は、特定の被験物質の活性を評価するアッセイでありうる。
【0057】
また一部の実施形態において、本発明のスクリーニング方法の被験物質は、ｍＴＯＲシグナリング系の各シグナル伝達に関与する分子に対して阻害効果を有することが未知の物質である。また一部の実施形態において、本発明のスクリーニング方法の被験物質は、メラニン蓄積量を低減する効果を有することが未知の物質である。
【0058】
（シグナル伝達の抑制効果の評価）
シグナル伝達の抑制効果は、標的となるシグナル伝達に応じて任意の指標を用いて評価することができる。
シグナル伝達の抑制効果は、標的となるシグナル伝達に応じて任意の指標を用いて評価することができる。
【0059】
一部の実施形態において、本発明のスクリーニング方法におけるｍＴＯＲシグナリング系に含まれる分子は、転写の制御、解糖系の制御、翻訳の制御、およびそれらの下流の細胞の増殖・成長・分化の制御に関与する分子でありうる。すなわち、本発明のスクリーニング方法において、被験物質は、ｍＴＯＲシグナリング系に含まれる分子の転写制御能に対する阻害効果、解糖系の制御能に対する阻害効果、翻訳制御能に対する阻害効果、およびそれらの下流の細胞の増殖・成長・分化の制御能に対する阻害効果を指標として選択されうる。選択の基準は当業者であれば適宜決定することができる。さらに別の実施形態では、シグナル伝達の抑制効果は、ｍＴＯＲシグナリング系に含まれる分子の量に基づいて決定されてもよい。一例として、リン酸化Ｓ６キナーゼの量、リン酸化Ｓ６リボソームタンパク質の量、リン酸化４Ｅ－ＢＰの量、及び解離ｅＩＦ４Ｆの量を指標としてスクリーニングをすることができる。リン酸化Ｓ６キナーゼの量、リン酸化Ｓ６リボソームタンパク質の量、リン酸化４Ｅ－ＢＰの量、及び解離ｅＩＦ４Ｆの量は、それぞれ特異的な抗体を用いることで検出することができる。
【0060】
一の実施形態は、本発明は、培養皮膚細胞においてｍＴＯＲシグナリング系の活性を指標とした色素沈着抑制剤、美白剤、又はシミ改善剤のスクリーニング方法にも関する。本発明のスクリーニング方法は、より具体的に以下の：
被験物質を含む培地で皮膚細胞を培養する工程、
培養後の皮膚細胞においてｍＴＯＲシグナリング系の活性を測定する工程、及び
測定されたｍＴＯＲシグナリング系の活性を、対照のｍＴＯＲシグナリング系の活性と比較する工程
を含み、ｍＴＯＲシグナリング系の活性を抑制した場合に、被験物質を色素沈着抑制剤、美白剤、又はシミ改善剤としてスクリーニングすることができる。
対照のｍＴＯＲシグナリング系の活性は、被験物質を含まない点でのみ異なる皮膚細胞において測定されたｍＴＯＲシグナリング系の活性を使用することができる。また、別の態様では、被験物質とともに、ｍＴＯＲシグナリング活性の促進剤を添加してもよく、ｍＴＯＲシグナリング活性を予め亢進しておくことで、ｍＴＯＲシグナリング系の活性の抑制を決定してもよい。この場合、対照としては、被験物質を含まない点でのみ異なる対照と、ｍＴＯＲシグナリング活性の促進剤も含んでいない対照とを使用することができ、両方を使用してもよいし、一方のみを使用してもよい。対照群は、予め実験が行われて、対照群のｍＴＯＲシグナリング系の活性に基づいて閾値を設定してもよいし、並行して培養及び測定工程が行われてもよい。ｍＴＯＲシグナリング系の活性は、ｍＴＯＲシグナリング系に含まれる分子のうち活性化に関与する分子（すなわち、ｍＴＯＲシグナリング活性化マーカータンパク質）、皮膚細胞へのメラニンの蓄積量、又は皮膚細胞の過増殖抑制作用に基づいて決定することができる。
被験物質を含む培地で皮膚細胞を培養する工程、
培養後の皮膚細胞においてｍＴＯＲシグナリング系の活性を測定する工程、及び
測定されたｍＴＯＲシグナリング系の活性を、対照のｍＴＯＲシグナリング系の活性と比較する工程
を含み、ｍＴＯＲシグナリング系の活性を抑制した場合に、被験物質を色素沈着抑制剤、美白剤、又はシミ改善剤としてスクリーニングすることができる。
対照のｍＴＯＲシグナリング系の活性は、被験物質を含まない点でのみ異なる皮膚細胞において測定されたｍＴＯＲシグナリング系の活性を使用することができる。また、別の態様では、被験物質とともに、ｍＴＯＲシグナリング活性の促進剤を添加してもよく、ｍＴＯＲシグナリング活性を予め亢進しておくことで、ｍＴＯＲシグナリング系の活性の抑制を決定してもよい。この場合、対照としては、被験物質を含まない点でのみ異なる対照と、ｍＴＯＲシグナリング活性の促進剤も含んでいない対照とを使用することができ、両方を使用してもよいし、一方のみを使用してもよい。対照群は、予め実験が行われて、対照群のｍＴＯＲシグナリング系の活性に基づいて閾値を設定してもよいし、並行して培養及び測定工程が行われてもよい。ｍＴＯＲシグナリング系の活性は、ｍＴＯＲシグナリング系に含まれる分子のうち活性化に関与する分子（すなわち、ｍＴＯＲシグナリング活性化マーカータンパク質）、皮膚細胞へのメラニンの蓄積量、又は皮膚細胞の過増殖抑制作用に基づいて決定することができる。
【0061】
一部の実施形態では、ｍＴＯＲシグナリング系の活性は、ｍＴＯＲシグナリング系に含まれる分子のうち、活性化に関与する分子、すなわちｍＴＯＲシグナリング活性化マーカータンパク質の量に基づき決定することができる。より具体的に、皮膚細胞中のリン酸化Ｓ６キナーゼの量、リン酸化Ｓ６リボソームタンパク質の量、リン酸化４Ｅ－ＢＰの量、及び解離ｅＩＦ４Ｆの量を指標としてスクリーニングをすることができ、これらのｍＴＯＲシグナリング活性化マーカータンパク質の量は、免疫学的手法、例えばＥＬＩＳＡや蛍光免疫染色等の本技術分野に周知の手法を用いて測定することができる。
【0062】
また、一部の実施形態において、本発明のスクリーニング方法の被験物質は、メラニン蓄積量を指標として選択されうる。すなわち、本実施形態のスクリーニング方法は、ｍＴＯＲシグナリング系に含まれる分子を含む試料におけるメラニン蓄積量を測定する工程を含む。例えば、本発明のスクリーニング方法は、（１）ｍＴＯＲシグナリング系に含まれる分子を含む試料として皮膚細胞を用意する工程、（２）皮膚細胞に被験物質を接触させる工程、（３）被験物質を接触させた皮膚細胞におけるメラニン蓄積量を、被験物質を接触させていない皮膚細胞におけるメラニン蓄積量と比較する工程を含む。本実施形態において、被験物質は、ｍＴＯＲシグナリング系の各シグナル伝達に関与する分子に対する阻害効果、および／またはメラニン蓄積量を低減する効果を有することが既知の物質でありうる。
【0063】
一部の実施形態では、ｍＴＯＲシグナリング系の活性は、皮膚細胞の増殖抑制効果に基づいて決定することができる。ｍＴＯＲシグナリング系は活性化されると、サイクリンＤ１・ＣＤＫ４／６複合体、ｃ－Ｍｙｃ、ｃ－Ｍｙｃ／Ｍａｘ二量体などの細胞増殖因子の発現が促進されて細胞増殖する。したがって、ｍＴＯＲシグナリング系の活性の指標として、皮膚細胞、特にケラチノサイトの細胞数を指標とすることができ、増殖が抑制された場合に、ｍＴＯＲシグナリング系の活性が抑制されたと決定することができ、それにより
被験物質を、色素沈着抑制剤、美白剤、又はシミ改善剤と決定することができる。
被験物質を、色素沈着抑制剤、美白剤、又はシミ改善剤と決定することができる。
【0064】
スクリーニングを方法において用いる皮膚細胞としては、ケラチノサイト、メラノサイトを含む培養物を用いることが好ましく、３次元皮膚モデルも使用することができる。
【0065】
本発明にかかるスクリーニング方法により選択された被験物質（すなわち、ｍＴＯＲシグナリング系に含まれる分子の阻害剤）は、美白剤の成分として使用されうる。
【0066】
本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は、特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば本発明の構成要件の追加、削除および置換を行うことができる。
【実施例0067】
次に実施例によって本発明をさらに詳細に説明する。なお、本発明はこれにより限定されるものではない。
【0068】
（実施例１）
ＣＴＩ－Ｂｉｏｔｅｃｈ社より老人性色素斑の特徴を有する色素沈着部位（Ｈｙｐｅｒｐｉｇｍｅｎｔｅｄ／全て顔面）の皮膚を包埋したパラフィンブロックを５検体分入手した。
ＣＴＩ－Ｂｉｏｔｅｃｈ社より老人性色素斑の特徴を有する色素沈着部位（Ｈｙｐｅｒｐｉｇｍｅｎｔｅｄ／全て顔面）の皮膚を包埋したパラフィンブロックを５検体分入手した。
【0069】
入手したパラフィンブロックからパラフィン切片（５μｍ）を作製し、ＦＭ染色により組織およびメラニンの状態を評価した。具体的には、パラフィン切片（５μｍ）を作製し、脱パラフィンを行った後にフォンタナマッソン染色を実施した。フォンタナアンモニア銀溶液（ムトウ化学）に１時間浸漬した後、０．２％塩化金（ムトウ化学）に５秒間浸漬し、メラニンを染色した。封入後、撮影およびバーチャル化をし、刺激の有無によるメラニンの局在と量の変化や乳頭層構造の変化を確認した（図２）。 図２に、代表的な健常部位とシミ部位（厚みがあって色調の濃い老人性色素斑）の結果を示す。シミ部位では、ケラチノサイトの過増殖とメラニン滞留が同時に起きていることが分かる。
【0070】
（実施例２）
入手した５検体について、分化状態を免疫蛍光染色により評価した。具体的には、脱パラフィンしたスライドに抗原賦活化ならびに透過処理を施した。ＴＢＳで３回洗浄後、１０％ヤギ血清（ニチレイバイオサイエンス）を添加し、室温で１時間ブロッキングを行った。更にＴＢＳで３回洗浄した後、１次抗体ａｎｔｉ－Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、ａｎｔｉ－ｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎ（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、ａｎｔｉ－Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ ５（ＬｉｆｅＳｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を希釈液（１％ＢＳＡ－ＴＢＳ）で１：１００に希釈し、スライド上に添加して室温で１時間静置した。ＴＢＳ洗浄を３回行った後、２次抗体ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８，５９４，６４７（Ａｂｃａｍ）を１：１０００の比率で希釈したものをスライド上に添加し、室温で１時間静置した。再度ＴＢＳで３回洗浄した後、ＤＡＰＩ含有封入剤Ｆｌｕｏｒｏ－ＫＥＥＰＥＲ Ａｎｔｉ ｆａｄｅＲｅａｇｅｎｔ（ナカライテスク株式会社）で封入し、顕微鏡による蛍光観察および画像撮影を行った。免疫蛍光染色の結果はＬＳＭ７００レーザースキャン共焦点顕微鏡で観察し、Ｚｅｎ２０１１ソフトウェア（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ）で画像を得た。４回の独立した実験を行った後、代表的な写真を結果として示した（図３）。 図３より、シミ部位には分化の乱れが起き、分化初期段階の細胞が多く滞留していることが分かる。この結果から、シミが排出されることなく、長期的に肌に残るのは、メラニン排出システムの停止が肌に記憶されるためと予想される。
入手した５検体について、分化状態を免疫蛍光染色により評価した。具体的には、脱パラフィンしたスライドに抗原賦活化ならびに透過処理を施した。ＴＢＳで３回洗浄後、１０％ヤギ血清（ニチレイバイオサイエンス）を添加し、室温で１時間ブロッキングを行った。更にＴＢＳで３回洗浄した後、１次抗体ａｎｔｉ－Ｆｉｌａｇｇｒｉｎ（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、ａｎｔｉ－ｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎ（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、ａｎｔｉ－Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ ５（ＬｉｆｅＳｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を希釈液（１％ＢＳＡ－ＴＢＳ）で１：１００に希釈し、スライド上に添加して室温で１時間静置した。ＴＢＳ洗浄を３回行った後、２次抗体ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８，５９４，６４７（Ａｂｃａｍ）を１：１０００の比率で希釈したものをスライド上に添加し、室温で１時間静置した。再度ＴＢＳで３回洗浄した後、ＤＡＰＩ含有封入剤Ｆｌｕｏｒｏ－ＫＥＥＰＥＲ Ａｎｔｉ ｆａｄｅＲｅａｇｅｎｔ（ナカライテスク株式会社）で封入し、顕微鏡による蛍光観察および画像撮影を行った。免疫蛍光染色の結果はＬＳＭ７００レーザースキャン共焦点顕微鏡で観察し、Ｚｅｎ２０１１ソフトウェア（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ）で画像を得た。４回の独立した実験を行った後、代表的な写真を結果として示した（図３）。 図３より、シミ部位には分化の乱れが起き、分化初期段階の細胞が多く滞留していることが分かる。この結果から、シミが排出されることなく、長期的に肌に残るのは、メラニン排出システムの停止が肌に記憶されるためと予想される。
【0071】
（実施例３）
入手した５検体について、タンパク質の発現を免疫蛍光染色により評価した。脱パラフィンしたスライドに抗原賦活化ならびに透過処理を施した。ＴＢＳで３回洗浄後、１０％ヤギ血清（ニチレイバイオサイエンス）を添加し、室温で１時間ブロッキングを行った。更にＴＢＳで３回洗浄した後、１次抗体ａｎｔｉ－ｐＳ６Ｋ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とａｎｔｉ－ｐ４ＥＢＰ１（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を希釈液（１％ＢＳＡ－ＴＢＳ）で１：１００に希釈し、スライド上に添加して室温で１時間静置した。ＴＢＳ洗浄を３回行った後、２次抗体ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８（Ａｂｃａｍ）を１：１０００の比率で希釈したものをスライド上に添加し、室温で１時間静置した。再度ＴＢＳで３回洗浄した後、ＤＡＰＩ含有封入剤Ｆｌｕｏｒｏ－ＫＥＥＰＥＲ Ａｎｔｉ ｆａｄｅＲｅａｇｅｎｔ（ナカライテスク株式会社）で封入し、顕微鏡による蛍光観察および画像撮影を行った。免疫蛍光染色の結果はＬＳＭ７００レーザースキャン共焦点顕微鏡で観察し、Ｚｅｎ２０１１ソフトウェア（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ）で画像を得た。４回の独立した実験を行った後、代表的な写真を結果として示した（図４）。 この結果から、シミ部位ではｍＴＯＲシグナリング系の恒常的活性化が起きていることが分かる。
入手した５検体について、タンパク質の発現を免疫蛍光染色により評価した。脱パラフィンしたスライドに抗原賦活化ならびに透過処理を施した。ＴＢＳで３回洗浄後、１０％ヤギ血清（ニチレイバイオサイエンス）を添加し、室温で１時間ブロッキングを行った。更にＴＢＳで３回洗浄した後、１次抗体ａｎｔｉ－ｐＳ６Ｋ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）とａｎｔｉ－ｐ４ＥＢＰ１（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を希釈液（１％ＢＳＡ－ＴＢＳ）で１：１００に希釈し、スライド上に添加して室温で１時間静置した。ＴＢＳ洗浄を３回行った後、２次抗体ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８（Ａｂｃａｍ）を１：１０００の比率で希釈したものをスライド上に添加し、室温で１時間静置した。再度ＴＢＳで３回洗浄した後、ＤＡＰＩ含有封入剤Ｆｌｕｏｒｏ－ＫＥＥＰＥＲ Ａｎｔｉ ｆａｄｅＲｅａｇｅｎｔ（ナカライテスク株式会社）で封入し、顕微鏡による蛍光観察および画像撮影を行った。免疫蛍光染色の結果はＬＳＭ７００レーザースキャン共焦点顕微鏡で観察し、Ｚｅｎ２０１１ソフトウェア（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ）で画像を得た。４回の独立した実験を行った後、代表的な写真を結果として示した（図４）。 この結果から、シミ部位ではｍＴＯＲシグナリング系の恒常的活性化が起きていることが分かる。
【0072】
以上の結果より、シミ部位では、ｍＴＯＲシグナリングがタンパクレベルで過剰発現していることが示された。 これらの結果を踏まえ、次に、ｍＴＯＲシグナリングがどのようなメカニズムでシミ形成に寄与するのかを検証した。
【0073】
（実施例４）
＜細胞培養および細胞生存率測定＞
正常ヒト表皮ケラチノサイト（倉敷紡績株式会社）は、ケラチノサイト成長サプリメント（ＥＤＧＳ）を添加した６０μＭカルシウムを含むＥｐｉｌｉｆｅ（登録商標）培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で培養した。８割コンフルエント時に、１μＭ ｒａｐａｍｙｃｉｎ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）（ｍＴＯＲ阻害剤）または１０μＭ ＭＨＹ１４８５（東京化成）（ｍＴＯＲ活性化剤）を含有した培地に交換し、更に２４時間培養後、アラマーブルーアッセイにより細胞増殖率を評価した。培養終了後、終濃度が１０％になるようにアラマーブルー試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加した培地をｗｅｌｌ内にそれぞれ２ｍｌずつ加え、細胞を３７℃、４時間、暗所にて更に培養した。培養後、培地を回収してＯＤ５７０ｎｍ及びＯＤ６００ｎｍで測定し、細胞が発する蛍光の強度を測定した。 図５に代表的な培養細胞の写真、および相対蛍光強度のグラフを示す。 これらの結果より、ｍＴＯＲ活性化はケラチノサイトの過増殖を引き起こすことが分かる。
＜細胞培養および細胞生存率測定＞
正常ヒト表皮ケラチノサイト（倉敷紡績株式会社）は、ケラチノサイト成長サプリメント（ＥＤＧＳ）を添加した６０μＭカルシウムを含むＥｐｉｌｉｆｅ（登録商標）培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で培養した。８割コンフルエント時に、１μＭ ｒａｐａｍｙｃｉｎ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）（ｍＴＯＲ阻害剤）または１０μＭ ＭＨＹ１４８５（東京化成）（ｍＴＯＲ活性化剤）を含有した培地に交換し、更に２４時間培養後、アラマーブルーアッセイにより細胞増殖率を評価した。培養終了後、終濃度が１０％になるようにアラマーブルー試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加した培地をｗｅｌｌ内にそれぞれ２ｍｌずつ加え、細胞を３７℃、４時間、暗所にて更に培養した。培養後、培地を回収してＯＤ５７０ｎｍ及びＯＤ６００ｎｍで測定し、細胞が発する蛍光の強度を測定した。 図５に代表的な培養細胞の写真、および相対蛍光強度のグラフを示す。 これらの結果より、ｍＴＯＲ活性化はケラチノサイトの過増殖を引き起こすことが分かる。
【0074】
（実施例５）
＜メラニン取り込み検討およびフォンタナマッソン染色＞
ケラチノサイトを５ｘ１０４ｃｅｌｌｓずつ６ｗｅｌｌカルチャープレートに播種し、２４時間後に１μＭ ｒａｐａｍｙｃｉｎ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）または１０μＭ ＭＨＹ１４８５（東京化成）を含有したＥｐｉｌｉｆｅ（登録商標）培地に交換した上で、終濃度が０．００４％（ｗ／ｗ）になるように合成メラニン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。４８時間後に培地を除去した後、ＰＢＳ洗浄を３回繰り返し、４％パラホルムアルデヒド（Ｗａｋｏ）を添加して、室温で２０分間細胞を固定した。メラニン取り込みの可視化にはフォンタナマッソン染色を用いた。フォンタナアンモニア銀溶液（ムトウ化学）に１時間浸漬した後、０．２％塩化金（ムトウ化学）に５秒間浸漬し、メラニンを染色した。核染色にはＮｕｃｌｅａｒＦａｓｔＲｅｄ（ａｂｃａｍ）を使用した。３回の独立した実験を行った後、代表的な写真を結果として示した（図６）。 この結果より、ｍＴＯＲ活性化ケラチノサイトではメラニン取り込みが増加することが分かる。
＜メラニン取り込み検討およびフォンタナマッソン染色＞
ケラチノサイトを５ｘ１０４ｃｅｌｌｓずつ６ｗｅｌｌカルチャープレートに播種し、２４時間後に１μＭ ｒａｐａｍｙｃｉｎ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）または１０μＭ ＭＨＹ１４８５（東京化成）を含有したＥｐｉｌｉｆｅ（登録商標）培地に交換した上で、終濃度が０．００４％（ｗ／ｗ）になるように合成メラニン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。４８時間後に培地を除去した後、ＰＢＳ洗浄を３回繰り返し、４％パラホルムアルデヒド（Ｗａｋｏ）を添加して、室温で２０分間細胞を固定した。メラニン取り込みの可視化にはフォンタナマッソン染色を用いた。フォンタナアンモニア銀溶液（ムトウ化学）に１時間浸漬した後、０．２％塩化金（ムトウ化学）に５秒間浸漬し、メラニンを染色した。核染色にはＮｕｃｌｅａｒＦａｓｔＲｅｄ（ａｂｃａｍ）を使用した。３回の独立した実験を行った後、代表的な写真を結果として示した（図６）。 この結果より、ｍＴＯＲ活性化ケラチノサイトではメラニン取り込みが増加することが分かる。
【0075】
（実施例６）
＜メラニンを取り込んだケラチノサイトの増殖率測定＞
正常ヒト表皮ケラチノサイト（倉敷紡績株式会社）は、ケラチノサイト成長サプリメント（ＥＤＧＳ）を添加した６０μＭカルシウムを含むＥｐｉｌｉｆｅ（登録商標）培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で培養した。８割コンフルエント時に、１μＭ ｒａｐａｍｙｃｉｎ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）（ｍＴＯＲ阻害剤）または１０μＭ ＭＨＹ１４８５（東京化成）（ｍＴＯＲ活性化剤）を含有した培地に交換した上で、終濃度が０．００４％（ｗ／ｗ）になるように合成メラニン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。更に２４時間培養後、アラマーブルーアッセイにより細胞増殖率を評価した。培養終了後、終濃度が１０％になるようにアラマーブルー試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加した培地をｗｅｌｌ内にそれぞれ２ｍｌずつ加え、細胞を３７℃、４時間、暗所にて更に培養した。培養後、培地を回収してＯＤ５７０ｎｍ及びＯＤ６００ｎｍで測定し、細胞が発する蛍光の強度を測定した。 図７に、代表的な培養細胞の写真、および相対蛍光強度（増殖率）のグラフを示す。 この結果より、メラニンを取り込んだケラチノサイトはｍＴＯＲを活性化してもそれ以上増殖しないことが分かる。
＜メラニンを取り込んだケラチノサイトの増殖率測定＞
正常ヒト表皮ケラチノサイト（倉敷紡績株式会社）は、ケラチノサイト成長サプリメント（ＥＤＧＳ）を添加した６０μＭカルシウムを含むＥｐｉｌｉｆｅ（登録商標）培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で培養した。８割コンフルエント時に、１μＭ ｒａｐａｍｙｃｉｎ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）（ｍＴＯＲ阻害剤）または１０μＭ ＭＨＹ１４８５（東京化成）（ｍＴＯＲ活性化剤）を含有した培地に交換した上で、終濃度が０．００４％（ｗ／ｗ）になるように合成メラニン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。更に２４時間培養後、アラマーブルーアッセイにより細胞増殖率を評価した。培養終了後、終濃度が１０％になるようにアラマーブルー試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加した培地をｗｅｌｌ内にそれぞれ２ｍｌずつ加え、細胞を３７℃、４時間、暗所にて更に培養した。培養後、培地を回収してＯＤ５７０ｎｍ及びＯＤ６００ｎｍで測定し、細胞が発する蛍光の強度を測定した。 図７に、代表的な培養細胞の写真、および相対蛍光強度（増殖率）のグラフを示す。 この結果より、メラニンを取り込んだケラチノサイトはｍＴＯＲを活性化してもそれ以上増殖しないことが分かる。
【0076】
（実施例７）
＜分化誘導および細胞免疫蛍光染色＞
ケラチノサイトを５ｘ１０３ｃｅｌｌｓずつチャンバースライド上に播種し、２４時間後に１．８ｍＭのカルシウムを含有したＥｐｉｌｉｆｅ（登録商標）培地に交換した上で、ｒａｐａｍｙｃｉｎまたはＭＨＹ１４８５を添加した。十分に分化が誘導されるよう、更に４８時間培養した後に細胞を固定し、免疫蛍光染色により分化の進行を確認した。チャンバースライドから培地を除去し、ＰＢＳで洗浄後、４％パラホルムアルデヒド（Ｗａｋｏ）を添加し、室温で２０分間細胞を固定した。ＰＢＳで３回洗浄し、１０％ヤギ血清（ニチレイバイオサイエンス）を各ウェルに添加して室温で１時間ブロッキングを行った。更にＰＢＳで３回洗浄後、１次抗体ａｎｔｉ－Ｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎ（Ａｂｃａｍ）を希釈液（１％ＢＳＡ－ＰＢＳ）で１：１００に希釈し、固定細胞に添加して室温で１時間静置した。ＰＢＳ洗浄を３回行った後、２次抗体ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８（Ａｂｃａｍ）を１：１０００の比率で希釈したものを固定細胞に添加し、室温にて１時間静置した。再度ＰＢＳで３回洗浄した後、ＤＡＰＩ含有封入剤Ｆｌｕｏｒｏ－ＫＥＥＰＥＲ Ａｎｔｉ ｆａｄｅＲｅａｇｅｎｔ（ナカライテスク株式会社）で封入し、顕微鏡による蛍光観察および画像撮影を行った。免疫蛍光染色の結果はＬＳＭ７００レーザースキャン共焦点顕微鏡で観察し、Ｚｅｎ２０１１ソフトウェア（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ）で画像を得た。４回の独立した実験を行った後、代表的な写真を結果として示した（図８）。 この結果より、分化の進行にはｍＴＯＲの不活化が起こることが報告されているが、ｍＴＯＲが活性化された状態では、誘導条件下でも分化が進みにくいことが分かる。
＜分化誘導および細胞免疫蛍光染色＞
ケラチノサイトを５ｘ１０３ｃｅｌｌｓずつチャンバースライド上に播種し、２４時間後に１．８ｍＭのカルシウムを含有したＥｐｉｌｉｆｅ（登録商標）培地に交換した上で、ｒａｐａｍｙｃｉｎまたはＭＨＹ１４８５を添加した。十分に分化が誘導されるよう、更に４８時間培養した後に細胞を固定し、免疫蛍光染色により分化の進行を確認した。チャンバースライドから培地を除去し、ＰＢＳで洗浄後、４％パラホルムアルデヒド（Ｗａｋｏ）を添加し、室温で２０分間細胞を固定した。ＰＢＳで３回洗浄し、１０％ヤギ血清（ニチレイバイオサイエンス）を各ウェルに添加して室温で１時間ブロッキングを行った。更にＰＢＳで３回洗浄後、１次抗体ａｎｔｉ－Ｉｎｖｏｌｕｃｒｉｎ（Ａｂｃａｍ）を希釈液（１％ＢＳＡ－ＰＢＳ）で１：１００に希釈し、固定細胞に添加して室温で１時間静置した。ＰＢＳ洗浄を３回行った後、２次抗体ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８（Ａｂｃａｍ）を１：１０００の比率で希釈したものを固定細胞に添加し、室温にて１時間静置した。再度ＰＢＳで３回洗浄した後、ＤＡＰＩ含有封入剤Ｆｌｕｏｒｏ－ＫＥＥＰＥＲ Ａｎｔｉ ｆａｄｅＲｅａｇｅｎｔ（ナカライテスク株式会社）で封入し、顕微鏡による蛍光観察および画像撮影を行った。免疫蛍光染色の結果はＬＳＭ７００レーザースキャン共焦点顕微鏡で観察し、Ｚｅｎ２０１１ソフトウェア（ＣａｒｌＺｅｉｓｓ）で画像を得た。４回の独立した実験を行った後、代表的な写真を結果として示した（図８）。 この結果より、分化の進行にはｍＴＯＲの不活化が起こることが報告されているが、ｍＴＯＲが活性化された状態では、誘導条件下でも分化が進みにくいことが分かる。
【0077】
以上の結果より、シミ部位ではｍＴＯＲが活性化されること、その結果、ケラチノサイトの過増殖に伴いメラニンの取り込みが増えること、メラニンをため込んだケラチノサイト（黒色ケラチノサイト）が増殖を停止することが示された。すなわち、ｍＴＯＲの活性化によりターンオーバーが滞り、大量の黒色ケラチノサイトが動けなくなった結果、消えないシミが形成されるという、シミの実態が解明された。 これらの結果は、ｍＴＯＲシグナリングが、ケラチノサイトの増殖／分化挙動を制御することでシミの形成に寄与していることを示す結果である。
【0078】
（実施例８）
＜３Ｄ皮膚モデルを用いた検討＞
メラノサイト含有表皮モデルＭＥＬ－３００（倉敷紡績株式会社）を６ｗｅｌｌプレート内に設置し、９００μｌ／ｗｅｌｌの表皮モデル培養用維持培地ＥＰＩ－ＬＬＭＭ（倉敷紡績株式会社）を加え、１時間馴化させた。培地を除いた後、新たな培地を５ｍｌずつ添加し、更に１４日間気相培養を行った。ｍＴＯＲシグナリング阻害評価のため、１０μＭ ＭＨＹ１４８５（東京化成）前処理によってｍＴＯＲ活性を誘導したモデルの上部に、ｍＴＯＲもしくはその下流因子の阻害剤を加えた。ｍＴＯＲ阻害剤ｒａｐａｍｙｃｉｎ（１００ｎＭ，１μＭ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ｐ７０Ｓ６Ｋ阻害剤ＬＹ２５８４７０２ Ｔｏｓｙｌａｔｅ（１μＭ，１０μＭ，ＳｅｌｌｅｃｋＣｈｅｍｉｃａｌｓ）、ＥＩＦ４Ｅ／ＥＩＦ４Ｇ ＩＮＴＥＲＡＣＴＩＯＮ阻害剤４ＥＧＩ－１（２５μＭ，５０μＭ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ＣＤＫ４／６阻害剤Ｐａｌｂｏｃｉｃｒｉｂ－ＨＣｌ（１μＭ，５μＭ，Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）は、それぞれ対応するモデルの上部に２５μｌずつ添加した。４ＥＧＩ－１は４ＥＢＰ－１の活性、Ｐａｌｂｏｃｉｃｒｉｂ－ＨＣｌはＣＤＫ４またはＣＤＫ６と複合体を形成するサイクリンＤ１の機能を阻害する。培地交換は二日に一度の頻度で行い、その際にモデル上部の残存溶液をピペットマンで除去し、ＰＢＳで３回洗浄を加えた後に新たな刺激を加えた。培養終了後、モデルの色調を目視及びメラニン定量で評価した。三次元皮膚モデルから表皮シートを回収し、超音波で破砕した後、遠心分離（４℃、２，３００ｇ、５ｍｉｎ）をかけた。得られた細胞塊に１２０μｌの０．２Ｎ ＮａＯＨを加え、８０℃で３０分間湯煎して細胞内メラニンを抽出した。得られた上清はＯＤ４０５ｎｍで測定し、これを細胞内含有メラニン量とした。メラニン量は合成メラニン（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）によって得た検量線で定量化した後に、タンパク量によって標準化した。結果は３回の独立した実験により得た。フォンタナマッソン染色によるメラニン局在評価には、３Ｄ皮膚モデルを４％ＰＦＡ内にて４℃で一晩固定し、パラフィン包埋を行った。パラフィン切片（５μｍ）を作製し、脱パラフィンを行った後にフォンタナマッソン染色を実施した。フォンタナアンモニア銀溶液（ムトウ化学）に１時間浸漬した後、０．２％塩化金（ムトウ化学）に５秒間浸漬し、メラニンを染色した。封入後、撮影およびバーチャル化をし、刺激の有無によるメラニンの局在と量の変化を確認した。 図９に、３Ｄ皮膚モデルの外観写真、およびメラニン定量のグラフを示す。 この結果より、ｍＴＯＲが活性化されると下流の増殖経路を介して皮膚の黒化が起きることが分かる。
＜３Ｄ皮膚モデルを用いた検討＞
メラノサイト含有表皮モデルＭＥＬ－３００（倉敷紡績株式会社）を６ｗｅｌｌプレート内に設置し、９００μｌ／ｗｅｌｌの表皮モデル培養用維持培地ＥＰＩ－ＬＬＭＭ（倉敷紡績株式会社）を加え、１時間馴化させた。培地を除いた後、新たな培地を５ｍｌずつ添加し、更に１４日間気相培養を行った。ｍＴＯＲシグナリング阻害評価のため、１０μＭ ＭＨＹ１４８５（東京化成）前処理によってｍＴＯＲ活性を誘導したモデルの上部に、ｍＴＯＲもしくはその下流因子の阻害剤を加えた。ｍＴＯＲ阻害剤ｒａｐａｍｙｃｉｎ（１００ｎＭ，１μＭ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ｐ７０Ｓ６Ｋ阻害剤ＬＹ２５８４７０２ Ｔｏｓｙｌａｔｅ（１μＭ，１０μＭ，ＳｅｌｌｅｃｋＣｈｅｍｉｃａｌｓ）、ＥＩＦ４Ｅ／ＥＩＦ４Ｇ ＩＮＴＥＲＡＣＴＩＯＮ阻害剤４ＥＧＩ－１（２５μＭ，５０μＭ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ＣＤＫ４／６阻害剤Ｐａｌｂｏｃｉｃｒｉｂ－ＨＣｌ（１μＭ，５μＭ，Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）は、それぞれ対応するモデルの上部に２５μｌずつ添加した。４ＥＧＩ－１は４ＥＢＰ－１の活性、Ｐａｌｂｏｃｉｃｒｉｂ－ＨＣｌはＣＤＫ４またはＣＤＫ６と複合体を形成するサイクリンＤ１の機能を阻害する。培地交換は二日に一度の頻度で行い、その際にモデル上部の残存溶液をピペットマンで除去し、ＰＢＳで３回洗浄を加えた後に新たな刺激を加えた。培養終了後、モデルの色調を目視及びメラニン定量で評価した。三次元皮膚モデルから表皮シートを回収し、超音波で破砕した後、遠心分離（４℃、２，３００ｇ、５ｍｉｎ）をかけた。得られた細胞塊に１２０μｌの０．２Ｎ ＮａＯＨを加え、８０℃で３０分間湯煎して細胞内メラニンを抽出した。得られた上清はＯＤ４０５ｎｍで測定し、これを細胞内含有メラニン量とした。メラニン量は合成メラニン（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）によって得た検量線で定量化した後に、タンパク量によって標準化した。結果は３回の独立した実験により得た。フォンタナマッソン染色によるメラニン局在評価には、３Ｄ皮膚モデルを４％ＰＦＡ内にて４℃で一晩固定し、パラフィン包埋を行った。パラフィン切片（５μｍ）を作製し、脱パラフィンを行った後にフォンタナマッソン染色を実施した。フォンタナアンモニア銀溶液（ムトウ化学）に１時間浸漬した後、０．２％塩化金（ムトウ化学）に５秒間浸漬し、メラニンを染色した。封入後、撮影およびバーチャル化をし、刺激の有無によるメラニンの局在と量の変化を確認した。 図９に、３Ｄ皮膚モデルの外観写真、およびメラニン定量のグラフを示す。 この結果より、ｍＴＯＲが活性化されると下流の増殖経路を介して皮膚の黒化が起きることが分かる。
【0079】
（実施例９）
＜Ｅｘ ｖｉｖｏ新鮮皮膚を用いた検討＞
Ｇｅｎｏｓｋｉｎ社より新鮮皮膚（ＮＳＡ１１）を購入した。ｍＴＯＲシグナリング阻害評価のため、１０μＭ ＭＨＹ１４８５（東京化成）によってｍＴＯＲ活性を誘導した皮膚サンプルの上部に、ｍＴＯＲもしくは下流因子の阻害剤を加えた。ｍＴＯＲ阻害剤ｒａｐａｍｙｃｉｎ（１００ｎＭ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ｐ７０Ｓ６Ｋ阻害剤ＬＹ２５８４７０２Ｔｏｓｙｌａｔｅ（１μＭ，Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、ＥＩＦ４Ｅ／ＥＩＦ４Ｇ ＩＮＴＥＲＡＣＴＩＯＮ阻害剤４ＥＧＩ－１（２５μＭ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ＣＤＫ４／６阻害剤Ｐａｌｂｏｃｉｃｒｉｂ－ＨＣｌ（１μＭ，Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）は、それぞれ対応する皮膚サンプルの上部に５０μｌずつ添加した。 培地交換は毎日行い、その際にサンプル上部の残存溶液を綿棒で除去し、ＰＢＳで３回洗浄を加えた後に新たな刺激を加えた。６日間の培養終了後に、皮膚サンプルを回収した。 皮膚サンプルは４％ＰＦＡ内にて４℃で一晩固定し、パラフィン包埋を行った。パラフィン切片（５μｍ）を作製し、脱パラフィンを行った後にフォンタナマッソン染色を実施した。フォンタナアンモニア銀溶液（ムトウ化学）に１時間浸漬した後、０．２％塩化金（ムトウ化学）に５秒間浸漬し、メラニンを染色した。封入後、撮影およびバーチャル化をし、刺激の有無によるメラニンの局在と量の変化や乳頭層構造の変化を確認した（図１１～１３）。
＜Ｅｘ ｖｉｖｏ新鮮皮膚を用いた検討＞
Ｇｅｎｏｓｋｉｎ社より新鮮皮膚（ＮＳＡ１１）を購入した。ｍＴＯＲシグナリング阻害評価のため、１０μＭ ＭＨＹ１４８５（東京化成）によってｍＴＯＲ活性を誘導した皮膚サンプルの上部に、ｍＴＯＲもしくは下流因子の阻害剤を加えた。ｍＴＯＲ阻害剤ｒａｐａｍｙｃｉｎ（１００ｎＭ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ｐ７０Ｓ６Ｋ阻害剤ＬＹ２５８４７０２Ｔｏｓｙｌａｔｅ（１μＭ，Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、ＥＩＦ４Ｅ／ＥＩＦ４Ｇ ＩＮＴＥＲＡＣＴＩＯＮ阻害剤４ＥＧＩ－１（２５μＭ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ＣＤＫ４／６阻害剤Ｐａｌｂｏｃｉｃｒｉｂ－ＨＣｌ（１μＭ，Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）は、それぞれ対応する皮膚サンプルの上部に５０μｌずつ添加した。 培地交換は毎日行い、その際にサンプル上部の残存溶液を綿棒で除去し、ＰＢＳで３回洗浄を加えた後に新たな刺激を加えた。６日間の培養終了後に、皮膚サンプルを回収した。 皮膚サンプルは４％ＰＦＡ内にて４℃で一晩固定し、パラフィン包埋を行った。パラフィン切片（５μｍ）を作製し、脱パラフィンを行った後にフォンタナマッソン染色を実施した。フォンタナアンモニア銀溶液（ムトウ化学）に１時間浸漬した後、０．２％塩化金（ムトウ化学）に５秒間浸漬し、メラニンを染色した。封入後、撮影およびバーチャル化をし、刺激の有無によるメラニンの局在と量の変化や乳頭層構造の変化を確認した（図１１～１３）。
【0080】
図１０に皮膚外観写真を、図１１～１３にメラニン染色像を示す。 これらの結果より、ｍＴＯＲ下流の増殖経路の抑制は、皮膚の明色化を示すことが分かる（図１０）。 また、ＭＨＹ１４８５処理皮膚では表皮肥厚・真皮への落ち込み・表皮層におけるメラニン滞留が出現し（図１１）、また、ＭＨＹ１４８５処理皮膚は、老人性色素斑の組織の特徴を有する（図１２、老人性色素斑の写真は参考写真）のに対し、ｍＴＯＲ下流阻害剤はＭＨＹ１４８５に誘導されたシミ様特徴を改善することが分かる（図１３）。
【0081】
これらの結果より、ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達を抑制することで、色素沈着抑制効果が得られることが実証された。
【0082】
＜統計処理＞
本実施例における統計処理はＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）を用い、一次元配置分散分析によって行った。ｐ＜０．０５の時に統計学的有意差があると判断し、その程度はそれぞれ以下のアスタリスク表記により示した。（＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１）すべての実験は３回以上繰り返し、再現性の確認を行った。
本実施例における統計処理はＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ５（ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）を用い、一次元配置分散分析によって行った。ｐ＜０．０５の時に統計学的有意差があると判断し、その程度はそれぞれ以下のアスタリスク表記により示した。（＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．００１）すべての実験は３回以上繰り返し、再現性の確認を行った。
【0083】
（実施例１０）
＜ｍＴＯＲ活性阻害のスクリーニング＞
＜ＥＬＩＳＡ法＞
ＥＬＩＳＡはＨｕｍａｎ Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｐ７０Ｓ６Ｋ（Ｔｈｒ４２１／Ｓｅｒ４２４） Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ）を用い、製造者の指示に従って行った。正常ヒト表皮ケラチノサイト（倉敷紡績株式会社）は、ケラチノサイト成長サプリメント（ＥＤＧＳ）を添加した６０μＭカルシウムを含むＥｐｉｌｉｆｅ（登録商標）培地 （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で培養した。８割コンフルエント時に、１μＭ ラパマイシン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）または被験物質として、終濃度が０．１％、０．５％、１％になるようにレインボーアルゲエキス（ＣＯＤＩＦ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を添加し、更に３０分間培養をした。培養細胞をＰＢＳですすぎ、Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒにて可溶化、セルスクレイパーで回収した後、氷上でピペッティングを行い３０分間静置した。その後１３，０００ｒｐｍで１０分間、４℃で遠心分離を行い、不要物を除去した上清を細胞抽出液とした。希釈した細胞抽出液を、ａｎｔｉ－ｐａｎ－Ｐ７０Ｓ６Ｋ でコーティングされた９６ウェルプレートに１００μｌずつ加え、２．５時間室温でインキュベートした。ウェルを洗浄し、検出抗体ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ－ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｐ７０Ｓ６Ｋ （Ｔｈｒ４２１／Ｓｅｒ４２４）を１００μｌずつ加え、更に１時間インキュベートした。更にウェルを洗浄した後、ＨＲＰ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ １００μｌを加え、穏やかに振とうしながら室温で１時間インキュベートした。再度ウェルの洗浄後、１００μｌのＴＭＢ（３，３，５，５’－ｔｅｔｒａ ｍｅｔｈｙｌ ｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｒｅａｇｅｎｔを各ウェルに加えた。室温で３０分間インキュベートし、５０μｌずつＳｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（０．２Ｍ ｓｕｌｆｕｒｉｃ ａｃｉｄ）を加えた後、すみやかにＯＤ４５０ｎｍで測定し、細胞が発する蛍光の強度を測定した。対照としては、被験物質を含まないことを除き同じ条件で実験を行い、蛍光の強度を測定した（Ｃｏｎｔｒｏｌ）。対照と比較して、被験物質のレインボーアルゲエキスを用いた場合に、ｐＳ６Ｋのタンパク質量が有意に減少した（図１４）。またレインボーアルゲエキスを１％の濃度で用いた場合に、ｐＳ６Ｋのタンパク質量は、ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達抑制剤である１μＭのラパマイシンを用いた場合と同程度であった。これにより、被験物質のレインボーアルゲエキスは、ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達抑制剤としてスクリーニングされ、色素沈着抑制剤、美白剤、又はシミ改善剤として使用できることが示された。
＜ｍＴＯＲ活性阻害のスクリーニング＞
＜ＥＬＩＳＡ法＞
ＥＬＩＳＡはＨｕｍａｎ Ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｐ７０Ｓ６Ｋ（Ｔｈｒ４２１／Ｓｅｒ４２４） Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ Ｋｉｔ（ＲａｙＢｉｏｔｅｃｈ）を用い、製造者の指示に従って行った。正常ヒト表皮ケラチノサイト（倉敷紡績株式会社）は、ケラチノサイト成長サプリメント（ＥＤＧＳ）を添加した６０μＭカルシウムを含むＥｐｉｌｉｆｅ（登録商標）培地 （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で培養した。８割コンフルエント時に、１μＭ ラパマイシン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）または被験物質として、終濃度が０．１％、０．５％、１％になるようにレインボーアルゲエキス（ＣＯＤＩＦ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を添加し、更に３０分間培養をした。培養細胞をＰＢＳですすぎ、Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒにて可溶化、セルスクレイパーで回収した後、氷上でピペッティングを行い３０分間静置した。その後１３，０００ｒｐｍで１０分間、４℃で遠心分離を行い、不要物を除去した上清を細胞抽出液とした。希釈した細胞抽出液を、ａｎｔｉ－ｐａｎ－Ｐ７０Ｓ６Ｋ でコーティングされた９６ウェルプレートに１００μｌずつ加え、２．５時間室温でインキュベートした。ウェルを洗浄し、検出抗体ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ－ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｐ７０Ｓ６Ｋ （Ｔｈｒ４２１／Ｓｅｒ４２４）を１００μｌずつ加え、更に１時間インキュベートした。更にウェルを洗浄した後、ＨＲＰ－ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ １００μｌを加え、穏やかに振とうしながら室温で１時間インキュベートした。再度ウェルの洗浄後、１００μｌのＴＭＢ（３，３，５，５’－ｔｅｔｒａ ｍｅｔｈｙｌ ｂｅｎｚｉｄｉｎｅ）Ｏｎｅ－Ｓｔｅｐ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ Ｒｅａｇｅｎｔを各ウェルに加えた。室温で３０分間インキュベートし、５０μｌずつＳｔｏｐ ｓｏｌｕｔｉｏｎ（０．２Ｍ ｓｕｌｆｕｒｉｃ ａｃｉｄ）を加えた後、すみやかにＯＤ４５０ｎｍで測定し、細胞が発する蛍光の強度を測定した。対照としては、被験物質を含まないことを除き同じ条件で実験を行い、蛍光の強度を測定した（Ｃｏｎｔｒｏｌ）。対照と比較して、被験物質のレインボーアルゲエキスを用いた場合に、ｐＳ６Ｋのタンパク質量が有意に減少した（図１４）。またレインボーアルゲエキスを１％の濃度で用いた場合に、ｐＳ６Ｋのタンパク質量は、ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達抑制剤である１μＭのラパマイシンを用いた場合と同程度であった。これにより、被験物質のレインボーアルゲエキスは、ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達抑制剤としてスクリーニングされ、色素沈着抑制剤、美白剤、又はシミ改善剤として使用できることが示された。
【0084】
（実施例１１）
＜ｍＴＯＲ活性阻害のスクリーニング＞
＜免疫蛍光染色＞
ケラチノサイトを５ｘ１０３細胞ずつチャンバースライド上に播種し、２４時間後にラパマイシンまたは被験物質として、終濃度が０．１％、０．５％、１％になるようレインボーアルゲエキス（ＣＯＤＩＦ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を添加した。更に３０分間培養した後、速やかにチャンバースライドから培地を除去し、ＰＢＳで 洗浄、４％パラホルムアルデヒド（Ｗａｋｏ） を添加し、室温で２０分間細胞を固定した。ＰＢＳ で３回洗浄し、１０％ヤギ血清（ニチレイバイオサイエンス）を各ウェルに添加して室温で１時間ブロッキングを行った。更にＰＢＳ で３回洗浄後、１次抗体ａｎｔｉ－ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｐ７０Ｓ６Ｋ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を希釈液（１％ ＢＳＡ－ＰＢＳ）で１：１００に希釈し、固定細胞に添加して室温で１時間静置した。ＰＢＳ 洗浄を３ 回行った後、２次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（Ａｂｃａｍ）を１ ： １０００ の比率で希釈したものを固定細胞に添加し、室温にて１時間静置した。再度ＰＢＳで３ 回洗浄した後、ＤＡＰＩ含有封入剤Ｆｌｕｏｒｏ－ＫＥＥＰＥＲ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（ナカライテスク株式会社）で封入し、顕微鏡による蛍光観察および画像撮影を行った。免疫蛍光染色の結果はＬＳＭ７００レーザースキャン共焦点顕微鏡で観察し、Ｚｅｎ２０１１ソフトウェア（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）で画像を得た。４回の独立した実験を行った後、代表的な写真を結果として示した（図１５Ａ）。また、蛍光強度を、Image Jを用いて解析して示した（図１５Ｂ）。対照としては、被験物質を含まないことを除き同じ条件で実験を行った（Ｃｏｎｔｒｏｌ）。対照と比較して、被験物質のレインボーアルゲエキスを用いた場合に、ｐＳ６Ｋのタンパク質量が有意に減少した（図１５Ｂ）。またレインボーアルゲエキスを１％の濃度で用いた場合に、ｐＳ６Ｋのタンパク質量は、ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達抑制剤である１μＭのラパマイシンを用いた場合と同程度であった。これにより、被験物質のレインボーアルゲエキスは、ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達抑制剤としてスクリーニングされ、色素沈着抑制剤、美白剤、又はシミ改善剤として使用できることが示された。
＜ｍＴＯＲ活性阻害のスクリーニング＞
＜免疫蛍光染色＞
ケラチノサイトを５ｘ１０３細胞ずつチャンバースライド上に播種し、２４時間後にラパマイシンまたは被験物質として、終濃度が０．１％、０．５％、１％になるようレインボーアルゲエキス（ＣＯＤＩＦ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を添加した。更に３０分間培養した後、速やかにチャンバースライドから培地を除去し、ＰＢＳで 洗浄、４％パラホルムアルデヒド（Ｗａｋｏ） を添加し、室温で２０分間細胞を固定した。ＰＢＳ で３回洗浄し、１０％ヤギ血清（ニチレイバイオサイエンス）を各ウェルに添加して室温で１時間ブロッキングを行った。更にＰＢＳ で３回洗浄後、１次抗体ａｎｔｉ－ｐｈｏｓｐｈｏ－Ｐ７０Ｓ６Ｋ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を希釈液（１％ ＢＳＡ－ＰＢＳ）で１：１００に希釈し、固定細胞に添加して室温で１時間静置した。ＰＢＳ 洗浄を３ 回行った後、２次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（Ａｂｃａｍ）を１ ： １０００ の比率で希釈したものを固定細胞に添加し、室温にて１時間静置した。再度ＰＢＳで３ 回洗浄した後、ＤＡＰＩ含有封入剤Ｆｌｕｏｒｏ－ＫＥＥＰＥＲ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｒｅａｇｅｎｔ（ナカライテスク株式会社）で封入し、顕微鏡による蛍光観察および画像撮影を行った。免疫蛍光染色の結果はＬＳＭ７００レーザースキャン共焦点顕微鏡で観察し、Ｚｅｎ２０１１ソフトウェア（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）で画像を得た。４回の独立した実験を行った後、代表的な写真を結果として示した（図１５Ａ）。また、蛍光強度を、Image Jを用いて解析して示した（図１５Ｂ）。対照としては、被験物質を含まないことを除き同じ条件で実験を行った（Ｃｏｎｔｒｏｌ）。対照と比較して、被験物質のレインボーアルゲエキスを用いた場合に、ｐＳ６Ｋのタンパク質量が有意に減少した（図１５Ｂ）。またレインボーアルゲエキスを１％の濃度で用いた場合に、ｐＳ６Ｋのタンパク質量は、ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達抑制剤である１μＭのラパマイシンを用いた場合と同程度であった。これにより、被験物質のレインボーアルゲエキスは、ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達抑制剤としてスクリーニングされ、色素沈着抑制剤、美白剤、又はシミ改善剤として使用できることが示された。
【0085】
（実施例１２）
＜ｍＴＯＲ活性阻害のスクリーニング＞
＜細胞培養および細胞生存率測定＞
正常ヒト表皮ケラチノサイト（倉敷紡績株式会社）は、ケラチノサイト成長サプリメント（ＥＤＧＳ）を添加した６０μＭカルシウムを含むＥｐｉｌｉｆｅ（登録商標）培地 （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で培養した。８割コンフルエント時に、１μＭラパマイシン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）または１０μＭ ＭＨＹ１４８５（東京化成）を含有した培地に交換し、更に、被験物質として終濃度が０．１％、０．５％、１％になるようレインボーアルゲエキス（ＣＯＤＩＦ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を添加した。２４時間培養後、アラマーブルーアッセイにより細胞増殖率を評価した。培養終了後、終濃度が１０％になるようにアラマーブルー試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加した培地をｗｅｌｌ内にそれぞれ２ｍｌずつ加え、細胞を３７℃、４時間、暗所にて更に培養した（図１６Ａ）。培養後、培地を回収してＯＤ５７０ｎｍ及びＯＤ６００ｎｍで測定し、細胞が発する蛍光の強度を測定した。対照としては、被験物質を含まないことを除き同じ条件で実験を行った（Ｃｏｎｔｒｏｌ）。対照と比較して、被験物質のレインボーアルゲエキスを用いた場合に、細胞数が有意に減少した（図１６Ｂ）。ｍＴＯＲ活性化剤であるＭＨＹ１４８５を用いた場合に、細胞数は対照に比較して増大し、過増殖状態となった。一方で、ＭＨＹ１４８５とレインボーアルゲエキスを０．１％、０．５％、１％の濃度で用いた場合に細胞数を対照以下に減少させた。細胞数の減少は、ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達抑制剤である１μＭのラパマイシンを用いた場合よりも少なかった。これにより、被験物質のレインボーアルゲエキスは、ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達抑制剤としてスクリーニングされ、色素沈着抑制剤、美白剤、又はシミ改善剤として使用できることが示された。
＜ｍＴＯＲ活性阻害のスクリーニング＞
＜細胞培養および細胞生存率測定＞
正常ヒト表皮ケラチノサイト（倉敷紡績株式会社）は、ケラチノサイト成長サプリメント（ＥＤＧＳ）を添加した６０μＭカルシウムを含むＥｐｉｌｉｆｅ（登録商標）培地 （Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で培養した。８割コンフルエント時に、１μＭラパマイシン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）または１０μＭ ＭＨＹ１４８５（東京化成）を含有した培地に交換し、更に、被験物質として終濃度が０．１％、０．５％、１％になるようレインボーアルゲエキス（ＣＯＤＩＦ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を添加した。２４時間培養後、アラマーブルーアッセイにより細胞増殖率を評価した。培養終了後、終濃度が１０％になるようにアラマーブルー試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加した培地をｗｅｌｌ内にそれぞれ２ｍｌずつ加え、細胞を３７℃、４時間、暗所にて更に培養した（図１６Ａ）。培養後、培地を回収してＯＤ５７０ｎｍ及びＯＤ６００ｎｍで測定し、細胞が発する蛍光の強度を測定した。対照としては、被験物質を含まないことを除き同じ条件で実験を行った（Ｃｏｎｔｒｏｌ）。対照と比較して、被験物質のレインボーアルゲエキスを用いた場合に、細胞数が有意に減少した（図１６Ｂ）。ｍＴＯＲ活性化剤であるＭＨＹ１４８５を用いた場合に、細胞数は対照に比較して増大し、過増殖状態となった。一方で、ＭＨＹ１４８５とレインボーアルゲエキスを０．１％、０．５％、１％の濃度で用いた場合に細胞数を対照以下に減少させた。細胞数の減少は、ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達抑制剤である１μＭのラパマイシンを用いた場合よりも少なかった。これにより、被験物質のレインボーアルゲエキスは、ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達抑制剤としてスクリーニングされ、色素沈着抑制剤、美白剤、又はシミ改善剤として使用できることが示された。
【0086】
（実施例１３）
＜ｍＴＯＲ活性阻害のスクリーニング＞
＜メラニン取り込み検討およびフォンタナマッソン染色＞
ケラチノサイトを５ｘ１０４細胞ずつ６ｗｅｌｌカルチャープレートに播種し、２４時間後に１μＭラパマイシン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）または１０μＭ ＭＨＹ１４８５（東京化成）を含有したＥｐｉｌｉｆｅ（登録商標）培地に交換した上で、終濃度が０．１％、０．５％、１％になるようレインボーアルゲエキス（ＣＯＤＩＦ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を添加した。更に、終濃度が０．００４％（ｗ／ｗ）になるように合成メラニン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。４８時間後に培地を除去した後、ＰＢＳ洗浄を３回繰り返し、４％パラホルムアルデヒド（Ｗａｋｏ） を添加して、室温で２０分間細胞を固定した。メラニン取り込みの可視化にはフォンタナマッソン染色を用いた。フォンタナアンモニア銀溶液（ムトウ化学）に１時間浸漬した後、０．２％塩化金（ムトウ化学）に５秒間浸漬し、メラニンを染色した。核染色にはＮｕｃｌｅａｒ Ｆａｓｔ Ｒｅｄ（ａｂｃａｍ）を使用した。撮影した写真からメラニンを含む領域を定量する際には画像解析ソフトＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を用いた。４回の独立した実験を行った後、代表的な写真を結果として示した（図１７Ａ）。対照としては、被験物質を含まないことを除き同じ条件で実験を行った（Ｃｏｎｔｒｏｌ）。ｍＴＯＲ活性化剤であるＭＨＹ１４８５を用いた場合に、メラニン取り込み量は対照に比較して増大した（図１７Ｂ）。一方で、ＭＨＹ１４８５とレインボーアルゲエキスを０．１％、０．５％、１％の濃度で用いた場合にメラニン取り込み量は、対照と比較して増大したものの、ＭＨＹ１４８５添加群と比較して低下した。これにより、被験物質のレインボーアルゲエキスは、ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達抑制剤としてスクリーニングされ、色素沈着抑制剤、美白剤、又はシミ改善剤として使用できることが示された。
＜ｍＴＯＲ活性阻害のスクリーニング＞
＜メラニン取り込み検討およびフォンタナマッソン染色＞
ケラチノサイトを５ｘ１０４細胞ずつ６ｗｅｌｌカルチャープレートに播種し、２４時間後に１μＭラパマイシン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）または１０μＭ ＭＨＹ１４８５（東京化成）を含有したＥｐｉｌｉｆｅ（登録商標）培地に交換した上で、終濃度が０．１％、０．５％、１％になるようレインボーアルゲエキス（ＣＯＤＩＦ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を添加した。更に、終濃度が０．００４％（ｗ／ｗ）になるように合成メラニン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。４８時間後に培地を除去した後、ＰＢＳ洗浄を３回繰り返し、４％パラホルムアルデヒド（Ｗａｋｏ） を添加して、室温で２０分間細胞を固定した。メラニン取り込みの可視化にはフォンタナマッソン染色を用いた。フォンタナアンモニア銀溶液（ムトウ化学）に１時間浸漬した後、０．２％塩化金（ムトウ化学）に５秒間浸漬し、メラニンを染色した。核染色にはＮｕｃｌｅａｒ Ｆａｓｔ Ｒｅｄ（ａｂｃａｍ）を使用した。撮影した写真からメラニンを含む領域を定量する際には画像解析ソフトＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を用いた。４回の独立した実験を行った後、代表的な写真を結果として示した（図１７Ａ）。対照としては、被験物質を含まないことを除き同じ条件で実験を行った（Ｃｏｎｔｒｏｌ）。ｍＴＯＲ活性化剤であるＭＨＹ１４８５を用いた場合に、メラニン取り込み量は対照に比較して増大した（図１７Ｂ）。一方で、ＭＨＹ１４８５とレインボーアルゲエキスを０．１％、０．５％、１％の濃度で用いた場合にメラニン取り込み量は、対照と比較して増大したものの、ＭＨＹ１４８５添加群と比較して低下した。これにより、被験物質のレインボーアルゲエキスは、ｍＴＯＲシグナリング系のシグナル伝達抑制剤としてスクリーニングされ、色素沈着抑制剤、美白剤、又はシミ改善剤として使用できることが示された。
【0087】
＜統計処理＞
統計処理はＧｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ５（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）を用い、一次元配置分散分析によって行った。ｐ ＜ ０．０５の時に統計学的優位差があると判断し、その程度はそれぞれ以下のアスタリスク表記により示した。（＊ｐ ＜ ０．０５， ＊＊ｐ ＜ ０．０１， ＊＊＊ｐ ＜ ０．００１）すべての実験は３回以上繰り返し、再現性の確認を行った。
統計処理はＧｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ５（Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ， Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）を用い、一次元配置分散分析によって行った。ｐ ＜ ０．０５の時に統計学的優位差があると判断し、その程度はそれぞれ以下のアスタリスク表記により示した。（＊ｐ ＜ ０．０５， ＊＊ｐ ＜ ０．０１， ＊＊＊ｐ ＜ ０．００１）すべての実験は３回以上繰り返し、再現性の確認を行った。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
