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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024091656
(43)【公開日】2024-07-05
(54)【発明の名称】新規抗体およびヌクレオチド配列、ならびにそれらの使用
(51)【国際特許分類】
C07K 16/28 20060101AFI20240628BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240628BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240628BHJP
C12N 7/01 20060101ALI20240628BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240628BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240628BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240628BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240628BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20240628BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240628BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240628BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240628BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240628BHJP
A61K 35/12 20150101ALI20240628BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240628BHJP
【ＦＩ】
C07K16/28 ZNA
C12N15/13
C12N15/63 Z
C12N7/01
C12N5/10
C12N1/21
C12N1/19
C12N1/15
C12P21/08
A61P35/00
A61K39/395 D
A61K39/395 U
A61K31/7088
A61K48/00
A61K35/12
A61K35/76
【審査請求】有
【請求項の数】34
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024059450
(22)【出願日】2024-04-02
(62)【分割の表示】P 2021512914の分割
【原出願日】2019-09-03
(31)【優先権主張番号】18192311.1
(32)【優先日】2018-09-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(71)【出願人】
【識別番号】520031025
【氏名又は名称】バイオインベント インターナショナル アクティエボラーグ
(71)【出願人】
【識別番号】521091985
【氏名又は名称】トランジェヌ ソシエテ アノニム
(74)【代理人】
【識別番号】100099759
【弁理士】
【氏名又は名称】青木 篤
(74)【代理人】
【識別番号】100123582
【弁理士】
【氏名又は名称】三橋 真二
(74)【代理人】
【識別番号】100117019
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 陽一
(74)【代理人】
【識別番号】100141977
【弁理士】
【氏名又は名称】中島 勝
(74)【代理人】
【識別番号】100150810
【弁理士】
【氏名又は名称】武居 良太郎
(74)【代理人】
【識別番号】100197169
【弁理士】
【氏名又は名称】柴田 潤二
(72)【発明者】
【氏名】ビョルン フレンデウス
(72)【発明者】
【氏名】イングリッド テイゲ
(72)【発明者】
【氏名】モニカ センリヒ
(72)【発明者】
【氏名】リンダ モルテンソン
(72)【発明者】
【氏名】ペトラ ホルムコビスト
(72)【発明者】
【氏名】ジャン－バティスト マルシャン
(72)【発明者】
【氏名】ナタリ シルベストル
(57)【要約】
【課題】新規抗ＣＴＬＡ－４抗体分子、ならびにそのような抗体分子をコードするヌクレオチド配列およびウイルスなどの発現ベクターが記載される。
【解決手段】新規抗体分子はＴｒｅｇ枯渇抗体分子であり、これらはイピリムマブと比較して、ＴｒｅｇなどのＣＴＬＡ－４陽性細胞に対する改善された枯渇効果を有する。固形腫瘍などの癌の治療などの医薬におけるそのような抗体分子またはヌクレオチド配列またはウイルスの使用も記載される。
【選択図】図１－１
【解決手段】新規抗体分子はＴｒｅｇ枯渇抗体分子であり、これらはイピリムマブと比較して、ＴｒｅｇなどのＣＴＬＡ－４陽性細胞に対する改善された枯渇効果を有する。固形腫瘍などの癌の治療などの医薬におけるそのような抗体分子またはヌクレオチド配列またはウイルスの使用も記載される。
【選択図】図１－１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＣＴＬＡ－４に特異的に結合し、イピリムマブと比較してＣＴＬＡ－４陽性細胞に対する改善された枯渇効果を有する抗体分子。
【請求項2】
イピリムマブと比較して、ＣＤ４陽性細胞に対する改善された枯渇効果を有する、請求項１に記載の抗体分子。
【請求項3】
イピリムマブと比較して、Ｔｒｅｇに対する改善された枯渇効果を有する、請求項１または２に記載の抗体分子。
【請求項4】
前記抗体分子が、
（ｉ）ＣＤ１６－１５８Ｖ対立遺伝子をＧＦＰとともに発現するように安定的にトランスフェクトされたＮＫ－９２細胞株を使用して実行されるインビトロＡＤＣＣ試験であって、前記ＡＤＣＣ試験が、以下の連続したステップ：
１）標的細胞としての、ＣＴＬＡ－４陽性細胞、ＣＤ４陽性細胞、またはＴｒｅｇを、健康なドナーの末梢血から単離するステップ、
２）次に、前記標的細胞をＣＤ３／ＣＤ２８およびｒｈＩＬ－２で刺激するステップ、
３）次に、前記標的細胞を前記抗体分子とプレインキュベートし、次いでＮＫ細胞と混合するステップ、
４）次に、前記標的細胞を、１つのＨＥＰＥＳバッファー、ピルビン酸ナトリウム、およびＦＢＳ低ＩｇＧを含有するＲＰＭＩ １６４０＋ＧｌｕｔａＭＡＸ培地でインキュベートするステップ、
５）溶解をフローサイトメトリーによって決定するステップ、
６）ステップ３で前記抗体分子の代わりに使用されるイピリムマブを用いて、ステップ１～５を繰り返すか、または並行して実行するステップ、
７）前記抗体分子の前記溶解の結果をイピリムマブの溶解の結果と比較し、イピリムマブと比較して前記抗体分子の改善された溶解が、前記抗体分子が、ＣＴＬＡ－４陽性細胞、ＣＤ４陽性細胞および／またはＴｒｅｇに対する改善した枯渇効果を有することを示しているステップ、を含む、インビトロＡＤＣＣ試験、ならびに／あるいは
（ｉｉ）ＰＢＭＣ－ＮＯＧ／ＳＣＩＤモデルにおけるインビボ試験であって、前記インビボ試験は以下の連続したステップ：
１）ヒトＰＢＭＣを単離し、洗浄し、滅菌ＰＢＳに再懸濁するステップ、
２）ＮＯＧマウスにステップ１）からの細胞懸濁液を静脈内注射するステップ、
３）前記ＮＯＧマウスから脾臓を単離し、単一細胞懸濁液にするステップ、
４）ステップ３）からの前記細胞懸濁液を滅菌ＰＢＳに再懸濁するステップ、
５）ＳＣＩＤマウスにステップ４からの懸濁液を腹腔内注射するステップ、
６）次に、前記ＳＣＩＤマウスを前記抗体分子、イピリムマブ、またはアイソタイプ対照モノクローナル抗体のいずれかで処理するステップ、
７）処理された前記ＳＣＩＤマウスの腹腔内液を収集するステップ、
８）ヒトＴ細胞サブセットを、次のマーカー：ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ１２７を使用してＦＡＣＳによって同定および定量化するステップ、
９）前記抗体分子で処理された前記マウスからの前記Ｔ細胞サブセットの同定および定量化の結果を、イピリムマブで処理された前記マウスからの前記Ｔ細胞サブセットの同定および定量化の結果、ならびにアイソタイプ対照モノクローナル抗体で処理された前記マウスからの前記Ｔ細胞サブセットの同定および定量化の結果と比較し、イピリムマブで処理されたマウスの前記腹腔内液中のＣＴＬＡ－４陽性細胞、ＣＤ４陽性細胞および／またはＴｒｅｇの数と比較して試験対象の前記抗体分子で処理されたマウスの前記腹腔内液中のＣＴＬＡ－４陽性細胞、ＣＤ４陽性細胞、および／またはＴｒｅｇの数が少ないことが、前記抗体分子がイピリムマブと比較してＣＴＬＡ－４陽性細胞、ＣＤ４陽性細胞および／またはＴｒｅｇに対する改善した枯渇効果を有することを示しているステップ、を含む、ＰＢＭＣ－ＮＯＧ／ＳＣＩＤモデルでのインビボ試験、において改善された枯渇が示される場合に、イピリムマブと比較して、ＣＴＬＡ－４陽性細胞、ＣＤ４陽性細胞および／またはＴｒｅｇに対する改善された枯渇効果を有するとみなされる、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体分子。
（ｉ）ＣＤ１６－１５８Ｖ対立遺伝子をＧＦＰとともに発現するように安定的にトランスフェクトされたＮＫ－９２細胞株を使用して実行されるインビトロＡＤＣＣ試験であって、前記ＡＤＣＣ試験が、以下の連続したステップ：
１）標的細胞としての、ＣＴＬＡ－４陽性細胞、ＣＤ４陽性細胞、またはＴｒｅｇを、健康なドナーの末梢血から単離するステップ、
２）次に、前記標的細胞をＣＤ３／ＣＤ２８およびｒｈＩＬ－２で刺激するステップ、
３）次に、前記標的細胞を前記抗体分子とプレインキュベートし、次いでＮＫ細胞と混合するステップ、
４）次に、前記標的細胞を、１つのＨＥＰＥＳバッファー、ピルビン酸ナトリウム、およびＦＢＳ低ＩｇＧを含有するＲＰＭＩ １６４０＋ＧｌｕｔａＭＡＸ培地でインキュベートするステップ、
５）溶解をフローサイトメトリーによって決定するステップ、
６）ステップ３で前記抗体分子の代わりに使用されるイピリムマブを用いて、ステップ１～５を繰り返すか、または並行して実行するステップ、
７）前記抗体分子の前記溶解の結果をイピリムマブの溶解の結果と比較し、イピリムマブと比較して前記抗体分子の改善された溶解が、前記抗体分子が、ＣＴＬＡ－４陽性細胞、ＣＤ４陽性細胞および／またはＴｒｅｇに対する改善した枯渇効果を有することを示しているステップ、を含む、インビトロＡＤＣＣ試験、ならびに／あるいは
（ｉｉ）ＰＢＭＣ－ＮＯＧ／ＳＣＩＤモデルにおけるインビボ試験であって、前記インビボ試験は以下の連続したステップ：
１）ヒトＰＢＭＣを単離し、洗浄し、滅菌ＰＢＳに再懸濁するステップ、
２）ＮＯＧマウスにステップ１）からの細胞懸濁液を静脈内注射するステップ、
３）前記ＮＯＧマウスから脾臓を単離し、単一細胞懸濁液にするステップ、
４）ステップ３）からの前記細胞懸濁液を滅菌ＰＢＳに再懸濁するステップ、
５）ＳＣＩＤマウスにステップ４からの懸濁液を腹腔内注射するステップ、
６）次に、前記ＳＣＩＤマウスを前記抗体分子、イピリムマブ、またはアイソタイプ対照モノクローナル抗体のいずれかで処理するステップ、
７）処理された前記ＳＣＩＤマウスの腹腔内液を収集するステップ、
８）ヒトＴ細胞サブセットを、次のマーカー：ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ１２７を使用してＦＡＣＳによって同定および定量化するステップ、
９）前記抗体分子で処理された前記マウスからの前記Ｔ細胞サブセットの同定および定量化の結果を、イピリムマブで処理された前記マウスからの前記Ｔ細胞サブセットの同定および定量化の結果、ならびにアイソタイプ対照モノクローナル抗体で処理された前記マウスからの前記Ｔ細胞サブセットの同定および定量化の結果と比較し、イピリムマブで処理されたマウスの前記腹腔内液中のＣＴＬＡ－４陽性細胞、ＣＤ４陽性細胞および／またはＴｒｅｇの数と比較して試験対象の前記抗体分子で処理されたマウスの前記腹腔内液中のＣＴＬＡ－４陽性細胞、ＣＤ４陽性細胞、および／またはＴｒｅｇの数が少ないことが、前記抗体分子がイピリムマブと比較してＣＴＬＡ－４陽性細胞、ＣＤ４陽性細胞および／またはＴｒｅｇに対する改善した枯渇効果を有することを示しているステップ、を含む、ＰＢＭＣ－ＮＯＧ／ＳＣＩＤモデルでのインビボ試験、において改善された枯渇が示される場合に、イピリムマブと比較して、ＣＴＬＡ－４陽性細胞、ＣＤ４陽性細胞および／またはＴｒｅｇに対する改善された枯渇効果を有するとみなされる、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項5】
前記抗体分子が、配列番号３、６、８、１０、１２および１４からなる群から選択される１～６個のＣＤＲを含む抗体分子からなる群から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項6】
前記抗体分子が、ＣＤＲ、ＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、ＶＨ－ＣＤＲ３、ＶＬ－ＣＤＲ１およびＶＬ－ＣＤＲ３のうちの１～６個を含む抗体分子からなる群から選択され、
存在する場合、ＶＨ－ＣＤＲ１は、配列番号１５、２２、２９および３５からなる群から選択され、
存在する場合、ＶＨ－ＣＤＲ２は、配列番号１６、２３、３０、および３６からなる群から選択され、
存在する場合、ＶＨ－ＣＤＲ３は、配列番号１７、２４、３１および３７からなる群から選択され、
存在する場合、ＶＬ－ＣＤＲ１は、配列番号１０および３８からなる群から選択され、
存在する場合、ＶＬ－ＣＤＲ２は、配列番号１８、２５、３２および３９からなる群から選択され、
存在する場合、ＶＬ－ＣＤＲ３は、配列番号１９、２６および４０からなる群から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体分子。
存在する場合、ＶＨ－ＣＤＲ１は、配列番号１５、２２、２９および３５からなる群から選択され、
存在する場合、ＶＨ－ＣＤＲ２は、配列番号１６、２３、３０、および３６からなる群から選択され、
存在する場合、ＶＨ－ＣＤＲ３は、配列番号１７、２４、３１および３７からなる群から選択され、
存在する場合、ＶＬ－ＣＤＲ１は、配列番号１０および３８からなる群から選択され、
存在する場合、ＶＬ－ＣＤＲ２は、配列番号１８、２５、３２および３９からなる群から選択され、
存在する場合、ＶＬ－ＣＤＲ３は、配列番号１９、２６および４０からなる群から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項7】
前記抗体分子が、配列番号１５、１６、１７、１０、１８および１９を有する６個のＣＤＲまたは配列番号２２、２３、２４、１０、２５および２６を有する６個のＣＤＲを含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項8】
ＣＴＬＡ－４に特異的に結合する抗体分子であって、前記抗体分子は、配列番号１５、１６、１７、１０、１８および１９を有する６個のＣＤＲまたは配列番号２２、２３、２４、１０、２５および２６を有する６個のＣＤＲを含む、抗体分子。
【請求項9】
前記抗体分子が、配列番号２０および２７からなる群から選択される可変重鎖ならびに／または配列番号２１および２８からなる群から選択される可変軽鎖を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項10】
前記抗体分子が、配列番号４３の重鎖定常領域および／または配列番号４４の軽鎖定常領域を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項11】
前記抗体分子が、請求項７～１０のいずれか一項に記載の抗体分子と、ＣＴＬＡ－４への結合について競合することができる抗体分子である、請求項１～６のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項12】
前記抗体分子が、フルサイズ抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’、および（Ｆａｂ’）２からなる群から選択される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項13】
ヒトＣＴＬＡ－４（ｈＣＴＬＡ－４）に、および／またはカニクイザルＣＴＬＡ－４（ｃｍＣＴＬＡ－４）に、および／またはマウスＣＴＬＡ－４（ｍＣＴＬＡ－４）に、結合する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項14】
ヒトＣＤ２８に結合しない、請求項１～１３のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項15】
前記抗体分子が、ヒトＩｇＧ抗体、ヒト化ＩｇＧ抗体、およびヒト由来のＩｇＧ抗体からなる群から選択される、請求項１～１４のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項16】
前記抗体分子がヒトＩｇＧ１抗体である、請求項１５に記載の抗体分子。
【請求項17】
前記抗体分子がモノクローナル抗体である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の抗体分子。
【請求項18】
請求項１～１７のいずれか一項に記載の抗体分子をコードする、単離されたヌクレオチド配列。
【請求項19】
配列番号４５～５２からなる群から選択される配列を含む、またはそれからなる、請求項１８に記載の単離されたヌクレオチド配列。
【請求項20】
請求項１８または１９に記載のヌクレオチド配列を含む、プラスミド。
【請求項21】
請求項１８もしくは１９に記載のヌクレオチド配列、または請求項２０に記載のプラスミドを含む、ウイルス。
【請求項22】
腫瘍溶解性ウイルスであり、好ましくは腫瘍溶解性ポックスウイルスである、請求項２１に記載のウイルス。
【請求項23】
前記ポックスウイルスが、コードポックスウイルス（Ｃｈｏｒｄｏｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）亜科に属し、より好ましくは、ワクシニアウイルス、牛痘ウイルス、カナリア痘ウイルス、エクトロメリアウイルスおよび粘液腫ウイルスからなる群から好ましくは選択される、オルソポックスウイルス属に属する、請求項２２に記載のウイルス。
【請求項24】
前記腫瘍溶解性ウイルスが、チミジンキナーゼ（ＴＫ）および／またはリボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＲ）の両方の活性に欠陥があり、配列番号２０および配列番号２１、または配列番号５３および配列番号５４をコードするヌクレオチド配列を含む、ワクシニアウイルスである、請求項２３に記載のウイルス。
【請求項25】
前記腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、ＧＭ－ＣＳＦをコードするヌクレオチド配列、特に好ましくはヒトＧＭ－ＣＳＦ（例えば、配列番号５５もしくは配列番号５６を有する）またはマウスＧＭ－ＣＳＦ（例えば、配列番号５７もしくは配列番号５８を有する）をコードするヌクレオチド配列、をさらに含む、請求項２４に記載のウイルス。
【請求項26】
重鎖をコードするカセットが、Ｊ２Ｒ遺伝子座に挿入され、軽鎖をコードするカセットが、Ｉ４Ｌ遺伝子座に挿入される、請求項２１～２５のいずれか一項に記載のウイルス。
【請求項27】
請求項１８もしくは１９に記載のヌクレオチド配列、または請求項２０に記載のプラスミド、または請求項２１～２６のいずれか一項に記載のウイルスを含む、細胞。
【請求項28】
医薬において使用するための、請求項１～１７のいずれか一項に記載の抗体分子、請求項１８もしくは１９に記載のヌクレオチド配列、請求項２０に記載のプラスミド、請求項２１～２６のいずれか一項に記載のウイルス、または請求項２７に記載の細胞。
【請求項29】
癌の治療において使用するための、請求項１～１７のいずれか一項に記載の抗体分子、請求項１８もしくは１９に記載のヌクレオチド配列、請求項２０に記載のプラスミド、請求項２１～２６のいずれか一項に記載のウイルス、または請求項２７に記載の細胞。
【請求項30】
癌の治療において使用するための薬学的組成物の製造のための、請求項１～１７のいずれか一項に記載の抗体分子、請求項１８もしくは１９に記載のヌクレオチド配列、請求項２０に記載のプラスミド、請求項２１～２６のいずれか一項に記載のウイルス、または請求項２７に記載の細胞の使用。
【請求項31】
請求項１～１７のいずれか一項に記載の抗体分子、請求項１８もしくは１９に記載のヌクレオチド配列、請求項２０に記載のプラスミド、請求項２１～２６のいずれか一項に記載のウイルスまたは請求項２７に記載の細胞、ならびに任意選択で、薬学的に許容される希釈剤、担体、ビヒクルおよび／または賦形剤を含むかまたはそれらからなる薬学的組成物。
【請求項32】
癌の治療において使用するための請求項３１に記載の薬学的組成物。
【請求項33】
対象における癌の治療方法であって、請求項１～１７のいずれか一項に記載の抗体分子、請求項１８もしくは１９に記載のヌクレオチド配列、請求項２０に記載のプラスミド、請求項２１～２６のいずれか一項に記載のウイルス、請求項２７に記載の細胞、または請求項３１に記載の薬学的組成物の治療有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項34】
前記癌が固形癌である、請求項２４に記載の使用のための抗体分子、請求項２９に記載の使用のためのヌクレオチド配列、請求項２９に記載の使用のためのプラスミド、請求項２９に記載の使用のためのウイルス、請求項２９に記載の使用のための細胞、請求項３０に記載の使用、請求項３２に記載の薬学的組成物、または請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規抗ＣＴＬＡ－４抗体分子、癌療法においてそれを使用するためのそのような抗体分子をコードするヌクレオチド配列および発現ベクター（例えば腫瘍溶解性ウイルス）に関する。新規抗体は、イピリムマブと比較して改善したＴｒｅｇの枯渇を有する。
【背景技術】
【0002】
ＣＤ１５２としても知られる細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ－４またはＣＴＬＡ４）は、Ｔ細胞の活性化を遮断するＢ７／ＣＤ２８ファミリーのメンバーである。ＣＴＬＡ－４は活性化Ｔ細胞で発現し、抑制シグナルをＴ細胞に伝達する。これはＴ細胞共刺激タンパク質ＣＤ２８と相同であり、ＣＴＬＡ－４およびＣＤ２８の両方がＣＤ８０（Ｂ７－１とも表示）およびＣＤ８６（Ｂ７－２とも表示）に結合する。ＣＴＬＡ４は調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）にも見られ、その抑制機能に寄与している。ＣＴＬＡ－４タンパク質には、細胞外Ｖドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質尾部が含有されている。
【0003】
ＣＴＬＡ－４とそのリガンドＢ７．１およびＢ７．２との相互作用を遮断する抗体は、免疫応答を増強することができ、強力な抗腫瘍免疫を刺激できることが示されている（Ｋｏｒｍａｎ ｅｔ ａｌ ２００６，Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ａｄｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ．９０：２９７－３３９）。
【0004】
免疫調節性モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いた有望な臨床結果によって、免疫系が癌制御の鍵を握っているとの考えが復活している。これらのｍＡｂの、チェックポイントブロッカー（アンタゴニスト）または共刺激分子の活性化因子（アゴニスト）への分類は最近、両方のタイプの例が、抑制性調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の枯渇を通じて腫瘍と闘う可能性があるという発見により、疑問視されている。
【0005】
イピリムマブや他の抗ＣＴＬＡ４抗体などの免疫調節性ｍＡｂは、少数の患者ではあるが、治療が困難な悪性腫瘍で試験した場合に肯定的な結果を示した（Ｈｏｄｉ，Ｆ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．２０１０，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６３（８）：７１１－７２３、Ｂｅａｔｔｙ，Ｇ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．２０１１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３１（６０２４）：１６１２－１６１６、Ｂｒａｈｍｅｒ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．２０１２，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６６（２６）：２４５５－２４６５、Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｓ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．２０１２ Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６６（２６）：２４４３－２４５４）。これらの有望な結果は、免疫系が癌制御の鍵を握り得るという考えの再活性化を助長している。これらのｍＡｂは、Ｔ細胞または抗原提示細胞（ＡＰＣ）の重要な分子調節因子を標的とし、抑制シグナルの遮断（チェックポイントブロッカー）、または共刺激シグナルの送達（アゴニスト）を通じて、抗癌免疫を増強するために生成された。最近、この二項分類は、すべてＴ細胞を標的とする抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、および抗ＯＸ４０抗体の治療活性が、活性化ＦｃγＲの共関与に依存する抑制性ＣＤ４＋Ｔ調節性細胞の欠失を伴うことが明らかになった際に疑問視されている（Ｂｕｌｌｉａｒｄ，Ｊｏｌｉｃｏｅｕｒ ｅｔ ａｌ．２０１３、Ｍａｒａｂｅｌｌｅ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．２０１３，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２３（６）：２４４７－２４６３；、Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｔ．Ｒ．，ｅｔ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２１０（９）：１６９５－１７１０）。
【0006】
モノクローナルＣＴＬＡ－４抗体である、イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ（登録商標）、以前は１０Ｄ１、ＢＭＳ－７３４０１６、ＭＤＸ １０１、ＭＤＸ－０１０、ＭＤＸ－ＣＴＬＡ－４、ＭＤＸ－ＣＴＬＡ４と表記）は、黒色腫の治療のためにいくつかの国で承認されており、他の適応症について臨床試験が行われている（Ｗｅｂｅｒ ２００８，Ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ ｍｅｌａｎｏｍａ：ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＣＴＬＡ－４ ｗｉｔｈ ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ（ＭＤＸ－０１０）Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ，１３（Ｓｕｐｐｌ ４）：１６－２５）。イピリムマブは、組換えＤＮＡ技術によってチャイニーズハムスター卵巣細胞で産生される完全ヒト抗ＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体（ＩｇＧ１κ）である。それには４７７２０２－００－９および６Ｔ８Ｃ１５５６６６がある。イピリムマブは、ＵＳ９７８９１８２でさらに定義されており、イピリムマブの重鎖および軽鎖の配列（それぞれ配列番号１７および１８として）、ＶＨおよび／またはＶＬ領域の配列（それぞれ配列番号１９および配列番号２０として）ならびにＣＤＲ配列（配列番号２１、２２、および２３に記載の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに配列番号２４、２５、および２６に記載の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）も示している。
【0007】
いくつかの臨床試験で検査されている第２の完全ヒトモノクローナル抗ＣＴＬＡ－４抗体は、トレメリムマブ（以前のチシリムマブ、ＣＰ－６７５，２０６）である（Ｒｉｂａｓ ２００８，Ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ ｔｏ ｍｅｌａｎｏｍａ：ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＣＴＬＡ－４ ｗｉｔｈ ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ（ＣＰ－６７５，２０６）Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ，１３（Ｓｕｐｐｌ ４）：１０－５、Ｃａｌｌａｈａｎ ｅｔ ａｌ ２０１０，Ａｎｔｉ－ＣＴＬＡ－４ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｉｍｍｕｎｅ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ Ｄｕｒｉｎｇ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ Ｎｏｖｅｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃｏｌ．３７（５）：４７３－４８４．、Ｂｌａｎｋ ｅｔ ａｌ ２０１５，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｕｓｅ ｏｆ ａｎｔｉ－ＣＴＬＡ－４ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２７（１）：３－１０）。
【0008】
抗ＣＴＬＡ－４抗体は、以下を含むいくつかの特許出願および特許に記載されている。
【0009】
ＷＯ９３／００４３１は、ＣＴＬＡ４受容体タンパク質、ＣＴＬＡ４Ｉｇ融合タンパク質、およびそのような融合タンパク質またはモノクローナル抗体を使用して細胞相互作用を調節するための方法に言及している。
【0010】
ＷＯ９７／２０５７４は、ＣＴＬＡ－４シグナル伝達に関連するＴリンパ球の下方調節の遮断、および抗原性の刺激に対する哺乳類Ｔ細胞の応答を増加させるかまたは哺乳類の宿主における腫瘍細胞の増殖を減少させるＣＴＬＡ－４の細胞外ドメインに対する抗体以外のＣＴＬＡ－４遮断剤、に言及している。
【0011】
ＷＯ００／３７５０４は、ヒト抗ＣＴＬＡ－４抗体および癌の治療におけるそのような抗体の使用に言及している。ＷＯ００／３７５０４はさらに、上記のヒトモノクローナル抗体トレメリムマブに言及しており、これは、その特許出願では１１．２．１と示されている。ＷＯ０１／１４４２４はまた、ヒトＣＴＬＡ－４に特異的に結合するヒト抗体、および癌などのヒトの疾患および感染症の治療におけるその使用に言及している。ＷＯ０１／１４４２４はさらに、上記したかつさらに後述するヒトモノクローナル抗体イピリムマブに言及しており、これは、その特許出願では１０Ｄ１と示されている。
【発明の概要】
【0012】
本発明は、ＣＴＬＡ－４に特異的に結合し、イピリムマブと比較してＣＴＬＡ－４陽性細胞に対する改善された枯渇効果を有する抗体分子に関する。
【0013】
さらに、本発明は、ＣＴＬＡ－４に特異的に結合する抗体分子に関し、この抗体分子は、配列番号１５、１６、１７、１０、１８および１９を有する６個のＣＤＲまたは配列番号２２、２３、２４、１０、２５および２６を有する６個のＣＤＲを含む。
【0014】
さらに、本発明は、上記の抗体分子をコードする単離されたヌクレオチド配列に関する。
【0015】
さらに、本発明は、上記のヌクレオチド配列を含むプラスミドに関する。
【0016】
さらに、本発明は、上記のヌクレオチド配列または上記のプラスミドを含む腫瘍溶解性ウイルスなどのウイルスに関する。
【0017】
さらに、本発明は、上記のヌクレオチド配列または上記のプラスミドを含む、ＣＡＲ Ｔ細胞などの細胞に関する。
【0018】
さらに、本発明は、医薬において使用するための上記の抗体分子、ヌクレオチド配列、プラスミドおよび／または細胞に関する。
【0019】
さらに、本発明は、癌の治療において使用するための上記の抗体分子、ヌクレオチド配列、プラスミド、ウイルスおよび／または細胞に関する。
【0020】
さらに、本発明は、癌の治療において使用するための薬学的組成物の製造のための上記の抗体分子、ヌクレオチド配列、プラスミド、ウイルスおよび／または細胞の使用に関する。
【0021】
さらに、本発明は、上記の抗体分子、ヌクレオチド配列、プラスミド、ウイルスおよび／または細胞のうちの少なくとも１つ、および任意選択で薬学的に許容される希釈剤、担体または賦形剤を含む薬学的組成物に関する。
【0022】
さらに、本発明は、治療有効量の上記の抗体分子、ヌクレオチド配列、プラスミド、ウイルス、細胞および／または薬学的組成物のうちの少なくとも１つを対象に投与することを含む、対象における癌の治療のための方法に関する。
【0023】
さらに、本発明は、詳細な説明、実施例および／または図を参照して本明細書に記載される、抗体分子、使用するための抗体分子、単離されたヌクレオチド配列、使用するための単離されたヌクレオチド配列、プラスミド、使用するためのプラスミド、ウイルス、使用するためのウイルス、細胞、使用するための細胞、使用、薬学的組成物または治療方法に関する。
【発明を実施するための形態】
【0024】
ＣＴＬＡ－４陽性細胞は、調節性Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、ＴｒｅｇまたはＴｒｅｇ（以前は抑制性Ｔ細胞として既知であり、時には抑制性調節性Ｔ細胞とも称される）を含み、通常の免疫環境下および病理学的な免疫環境下で他の免疫細胞を抑制することが可能なＴ細胞の亜集団である。Ｔｒｅｇは、ＣＤ４陽性細胞（ＣＤ４＋細胞）である。Ｔｒｅｇではない他のＣＤ４＋Ｔ細胞があるが、ただし、非Ｔｒｅｇ ＣＤ４＋細胞は、ＦＯＸＰ３陰性（ＦＯＸＰ３－）であるのに対し、ＴｒｅｇはまたＦＯＸＰ３陽性（ＦＯＸＰ３＋）であるという点で、Ｔｒｅｇは非Ｔｒｅｇ ＣＤ４＋細胞から分離できる。
【0025】
イピリムマブと同様に、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ－４抗体分子は、少なくとも部分的に、ＴｒｅｇなどのＣＴＬＡ－４陽性細胞を枯渇させることによって作用する。さらに、イピリムマブと同様に、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ－４抗体分子は、ＣＴＬＡ－４とＢ７．１およびＢ７．２との相互作用を遮断する。したがって、これらの抗体は、結果として、エフェクターＴ細胞増殖に対するＣＴＬＡ－４誘導抑制効果を克服するのに役立つ。
【0026】
本明細書では、Ｔｒｅｇの枯渇、またはＴｒｅｇ枯渇とは、細胞の物理的クリアランスを通じたＴｒｅｇの枯渇、欠失、または排除を指す。具体的には、腫瘍内Ｔｒｅｇの枯渇を指す。Ｔｒｅｇの枯渇は、ＡＤＣＣ、すなわち抗体依存性細胞媒介性細胞傷害または抗体依存性細胞傷害、および／またはＡＤＣＰ、すなわち抗体依存性細胞食作用を介して達成され得る。これは、本明細書に記載の抗体分子がヒトなどの対象に投与されると、それがＴｒｅｇの表面に発現されるＣＴＬＡ－４に特異的に結合し、この結合がＴｒｅｇの枯渇をもたらすことを意味する。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４は、腫瘍微小環境における腫瘍浸潤リンパ球または腫瘍細胞に優先的に発現される。
【0027】
ＡＤＣＣは、Ｆｃ受容体を有するエフェクター細胞が、腫瘍由来の抗原、すなわちこの場合はＣＴＬＡ－４、を表面に発現している抗体でコーティングされた標的細胞を認識して死滅させることができる免疫機構である。ＡＤＣＰも同様の機構であるが、細胞傷害性ではなく食作用によって標的細胞を死滅させる。
【0028】
抗体は、免疫学および分子生物学分野の当業者には公知である。通常は、抗体は、２つの重鎖（Ｈ）と、２つの軽鎖（Ｌ）と、を含む。本明細書では、時には、この完全な抗体分子をフルサイズ抗体または完全長抗体と称する。抗体の重鎖は、１つの可変領域（ＶＨ）および３つの定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）を含み、抗体分子の軽鎖は、１つの可変領域（ＶＬ）および１つの定常領域（ＣＬ）を含む。可変領域（時にＦＶ領域と総称される）は、抗体の標的、または抗原に結合する。各可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される３つのループを含み、これらのループが標的の結合に関与する。定常領域は、抗体の抗原への結合には直接関与しないが、種々のエフェクター機能を呈する。それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、抗体または免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの５つの主要なクラスがあり、ヒトでは、これらのうちのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４；ＩｇＡ１およびＩｇＡ２に分割される。抗体の別の部分は、Ｆｃドメイン（あるいは断片結晶性ドメインとしても知られている）であり、抗体の重鎖の各々の２つの定常ドメインを含む。Ｆｃドメインは、抗体とＦｃ受容体との間の相互作用に関与する。
【0029】
Ｆｃ受容体は、多くの場合、免疫系の細胞の細胞表面上に見られる膜タンパク質である（すなわち、Ｆｃ受容体は、標的細胞膜上に見られる－あるいは形質膜または細胞質膜としても知られている）。Ｆｃ受容体の役割は、Ｆｃドメインを介して抗体に結合し、抗体を細胞内に取り込むことである。免疫系では、これによって、抗体媒介性食作用、および抗体依存性細胞媒介性細胞傷害をもたらし得る。
【0030】
本明細書で用いる場合、抗体分子という用語は、完全長抗体またはフルサイズ抗体、ならびに完全長抗体の機能的フラグメントおよびこのような抗体分子の誘導体を包含する。
【0031】
フルサイズ抗体の機能的フラグメントは、対応するフルサイズ抗体と同じ抗原結合特徴を有し、対応するフルサイズ抗体と同じ可変領域（すなわち、ＶＨ配列およびＶＬ配列）および／または同じＣＤＲ配列のいずれかを含む。機能的フラグメントが、対応するフルサイズ抗体と同じ抗原結合特徴を有するということは、標的上のフルサイズ抗体と同じエピトープに結合することを意味する。このような機能的フラグメントは、完全サイズ抗体のＦｖ部分に対応し得る。あるいは、このようなフラグメントは、Ｆｃ部分を含有しない、一価の抗原結合フラグメントであるＦ（ａｂ）とも表されるＦａｂ、またはジスルフィド結合によって一緒に連結された２つの抗原結合Ｆａｂ部分を含有する二価の抗原結合フラグメントであるＦ（ａｂ’）２、またはＦ（ａｂ’）、すなわちＦ（ａｂ’）２の一価の変異体であり得る。このようなフラグメントは、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）でもあり得る。
【0032】
機能的フラグメントは、対応するフルサイズ抗体の６個のＣＤＲのすべてを常に含有するわけではない。３つ以下のＣＤＲ領域（場合によっては、単一のＣＤＲだけまたはその一部）を含有する分子は、そのＣＤＲ（複数可）に由来する抗体の抗原結合活性を保持することが可能であることが理解される。例えば、全ＶＬ鎖（３個のＣＤＲをすべて含む）がその基質に対して高い親和性を有することが、Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：３２３８９～９３に記載されている。
【0033】
２個のＣＤＲ領域を含有する分子については、例えば、Ｖａｕｇｈａｎ＆Ｓｏｌｌａｚｚｏ ２００１，Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，４：４１７～４３０に記載されている。４１８頁（右欄－３（Ｏｕｒ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ Ｄｅｓｉｇｎ））に、フレームワーク領域内に散在するＨ１およびＨ２ ＣＤＲ超可変領域のみを含むミニボディについて記載されている。ミニボディは、標的に結合することが可能であると記載されている。Ｐｅｓｓｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：３６７～９、およびＢｉａｎｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３６：６４９～５９は、Ｖａｕｇｈａｎ＆Ｓｏｌｌａｚｚｏによって参照され、Ｈ１およびＨ２ミニボディ、ならびにその特性についてより詳細に記載している。Ｑｉｕ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２５：９２１～９では、２つの結合されたＣＤＲからなる分子が抗原に結合することが可能であることが示されている。Ｑｕｉｏｃｈｏ １９９３，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２９３～４は、「ミニボディ」技術の概要を提供している。Ｌａｄｎｅｒ ２００７，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２５：８７５～７は、２個のＣＤＲを含有する分子が抗原結合活性を保持することが可能であると見解を述べている。
【0034】
単一のＣＤＲ領域を含有する抗体分子については、例えば、Ｌａｕｎｅ ｅｔ ａｌ．，１９９７，ＪＢＣ，２７２：３０９３７～４４に記載されており、ここでは、ＣＤＲに由来するさまざまなヘキサペプチドが抗原結合活性を表すことが示され、完全な単一のＣＤＲの合成ペプチドが強力な結合活性を示すことに言及している。Ｍｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９９，ＪＢＣ，２７４：３７８９～９６では、さまざまな１２量体ペプチドおよび関連するフレームワーク領域が、抗原結合活性を有することが示されており、ＣＤＲ３様ペプチド単独で抗原に結合することが可能であると見解を述べている。Ｈｅａｐ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，８６：１７９１～１８００では、「マイクロ抗体」（単一のＣＤＲを含有する分子）は抗原に結合することが可能であることが報告されており、抗ＨＩＶ抗体からの環状ペプチドが、抗原結合活性および機能を有することが示されている。Ｎｉｃａｉｓｅ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３：１８８２～９１では、単一のＣＤＲが、そのリゾチーム抗原に対する抗原結合活性および親和性を付与し得ることが示されている。
【0035】
したがって、５個、４個、３個またはそれ以下のＣＤＲを有する抗体分子は、それらが由来する完全長抗体の抗原結合特性を保持することが可能である。
【0036】
抗体分子は、完全長抗体の誘導体またはそのような抗体のフラグメントであってもよい。誘導体が、対応する完全サイズ抗体と同じ抗原結合特徴を有するということは、完全サイズ抗体と同じ標的上のエピトープに結合することを意味する。
【0037】
したがって、本明細書で使用する場合、「抗体分子」という用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体、組換えて生成された抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、可変フラグメント（Ｆｖ）、二価一本鎖可変フラグメント（ｄｉ－ｓｃＦｖ）およびジスルフィド連結可変フラグメントを含む一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖフラグメント）、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖のホモ二量体、抗体軽鎖のホモ二量体、抗体重鎖のヘテロ二量体、抗体軽鎖のヘテロ二量体、そのようなホモおよびヘテロ二量体の抗原結合機能的フラグメントを含む、すべてのタイプの抗体分子、ならびにそれらの機能的フラグメントおよびそれらの誘導体を含む。
【0038】
さらに、本明細書で使用される場合、「抗体分子」という用語は、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを含む、すべてのクラスの抗体分子および機能的フラグメントを含む。
【0039】
いくつかの実施形態では、抗体は、ヒトＩｇＧ１である。当業者は、マウスＩｇＧ２ａおよびヒトＩｇＧ１が、活性化Ｆｃガンマ受容体と生産的に結合し、例えばＡＤＣＰおよびＡＤＣＣによる、活性化Ｆｃガンマ受容体を担持する免疫細胞（例えばマクロファージおよびＮＫ細胞）の活性化を通じて、標的細胞の欠失を活性化する能力を共有していることを認識している。このように、マウスＩｇＧ２ａは、マウスでの欠失に好ましいアイソタイプである一方で、ヒトＩｇＧ１は、ヒトにおける欠失に好ましいアイソタイプである。逆に、ＴＮＦＲスーパーファミリーのアゴニスト受容体、例えば４－１ＢＢ、ＯＸ４０、ＴＮＦＲＩＩ、ＣＤ４０の最適な共刺激は、抑制性ＦｃγＲＩＩの抗体結合に依存することが知られている。マウスでは、抑制性Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲＩＩＢ）に優先的に結合し、活性化Ｆｃガンマ受容体に弱くのみ結合するＩｇＧ１アイソタイプは、ｍＡｂを標的とするＴＮＦＲスーパーファミリーの共刺激活性に最適であることが知られている。ヒトでのマウスＩｇＧ１アイソタイプの直接的な同等物については記載されていないが、活性化ヒトＦｃガンマ受容体を上回る抑制性ヒトＦｃガンマ受容体への同様に向上した結合を示すように抗体を操作することができる。そのような操作されたＴＮＦＲスーパーファミリー標的化抗体はまた、ヒト活性化および抑制性Ｆｃガンマ受容体を発現するように操作されたトランスジェニックマウスにおいて、インビボでの共刺激活性を改善している（Ｄａｈａｎ ｅｔ ａｌ，２０１６，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ａｇｏｎｉｓｔｉｃ，Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉ－ＣＤ４０ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｒｅｑｕｉｒｅｓ Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ＦｃγＲ Ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ．２９（６）：８２０－３１）。
【0040】
上記で概説したように、抗体分子の異なるタイプおよび形態が本発明に含まれ、免疫学当業者には既知であろう。治療目的に使用される抗体は、多くの場合、抗体分子の特性を修正する追加の構成成分を用いて改変されることが公知である。
【0041】
したがって、本発明の抗体分子または本発明に従って使用される抗体分子（例えば、モノクローナル抗体分子、および／またはポリクローナル抗体分子、および／または二重特異性抗体分子）は、検出可能な部分および／または細胞傷害性部分を備える場合を含む。
【0042】
「検出可能な部分」とは、酵素、放射性原子、蛍光部分、化学発光部分、生物発光部分で構成される群からの１つ以上を含む。検出可能な部分により、抗体分子をインビトロ、および／またはインビボ、および／またはエクスビボで視覚化することが可能になる。
【0043】
「細胞傷害性部分」とは、放射性部分および／または酵素が挙げられ、例えば、酵素はカスパーゼおよび／または毒素であり、例えば毒素は細菌毒素または毒液であり、細胞傷害性部分は細胞溶解を誘導することが可能である。
【0044】
さらに、抗体分子は、単離された形態および／または精製された形態であってよく、ならびに／またはＰＥＧ化されてもよいことを含む。
【0045】
上述のように、抗体のＣＤＲは、抗体標的に結合する。本明細書に記載の各ＣＤＲへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ ＥＡら、１９９１、“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２，ｐｐ ｘｖ－ｘｖｉｉによる定義に従う。
【0046】
当業者が認識するように、アミノ酸を各ＣＤＲに割り当てるための他の方法も存在する。例えば、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（ＩＭＧＴ（商標））（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／およびＡｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２００１により出版のＬｅｆｒａｎｃ ａｎｄ Ｌｅｆｒａｎｃ“Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ＦａｃｔｓＢｏｏｋ”ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ）。
【0047】
さらなる実施形態では、本発明のまたは本発明に従って使用される抗体分子は、配列番号１５、１６、１７、１０、１８および１９または配列番号２２、２３、２４、１０、２５および２６を含む抗体分子などの、本明細書に記載の特定の抗体と競合することができる抗体分子である。
【0048】
「競合することが可能である」とは、競合抗体が、本明細書で定義される抗体分子の特定の標的への結合を少なくとも部分的に抑制またはその他の方法で干渉する能力があることを意味する。
【0049】
例えば、そのような競合抗体分子は、本明細書に記載の抗体分子の結合を、少なくとも約１０％、例えば少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約１００％抑制可能であり得るか、かつ／あるいは本明細書に記載の抗体の特定の標的への結合能力を抑制可能であり得、少なくとも約１０％、例えば少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％防止または低減し得る。
【0050】
競合結合は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）などの当業者に公知の方法によって決定することができる。
【0051】
ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、エピトープ修飾抗体または遮断抗体を評価することができる。競合抗体を同定するために好適な追加の方法は、参照により本明細書に組み込まれるＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅに開示されている（例えば、５６７～５６９頁、５７４～５７６頁、５８３頁、および５９０～６１２頁、１９８８，ＣＳＨＬ，ＮＹ，ＩＳＢＮ０－８７９６９－３１４－２を参照されたい）。
【0052】
抗体が定義された標的分子または抗原に特異的に結合すること、かつ、これは、抗体が、標的ではない分子ではなく、その標的に優先的かつ選択的に結合することを意味することはよく知られている。
【0053】
本発明による抗体の、または本発明に従って使用される抗体の、標的ＣＴＬＡ－４は、細胞の表面で発現し、すなわち、それらは抗体にとっての、エピトープ（あるいは、これに関連して細胞表面エピトープとして既知である）を含む、細胞表面抗原である。細胞表面抗原およびエピトープは、免疫学または細胞生物学の当業者によって容易に理解される用語である。
【0054】
「細胞表面抗原」とは、本明細書に記載の抗体分子が細胞膜の細胞外側に露出している細胞表面抗原または少なくともそのエピトープを含む。
【0055】
タンパク質の結合を評価する方法は、生化学および免疫学の当業者には既知である。当業者であれば、それらの方法を使用して、抗体の標的への結合および／または抗体のＦｃドメインのＦｃ受容体への結合、ならびにそれらの相互作用の相対的な強度、または特異性、抑制、または防止、または低減を評価することができることを理解するであろう。タンパク質の結合を評価するために使用され得る方法の例は、例えば、イムノアッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅ、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）がある（抗体特異性に関する考察については、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ 第２版，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、３３２～３３６頁（１９８９）を参照されたい）。
【0056】
したがって、本明細書において、「ＣＴＬＡ－４に特異的に結合する抗体分子」および「抗ＣＴＬＡ－４抗体分子」の両方は、標的ＣＴＬＡ－４に特異的に結合するが非標的に結合しない、または標的よりも弱く（親和性が低いなど）非標的に結合する抗体分子を指す。
【0057】
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４に特異的に結合する抗体分子（または抗ＣＴＬＡ－４抗体分子）は、ＣＴＬＡ－４の細胞外ドメインに特異的に結合する抗体分子を指す。
【0058】
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４に特異的に結合する抗体分子（または抗ＣＴＬＡ－４抗体分子）は、ＣＤ２８と交差反応しない。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４に特異的に結合する抗体分子（または抗ＣＴＬＡ－４抗体分子）は、ＣＴＬＡ－４のＣＤ８０および／またはＣＤ８６への結合を遮断し、それにより、ＣＬＴＡ－４シグナル伝達を阻害する。
【0059】
また、抗体が標的ＣＴＬＡ－４に、非標的よりも、少なくとも２倍強く、または少なくとも５倍強く、または少なくとも１０倍強く、または少なくとも２０倍強く、または少なくとも５０倍強く、または少なくとも１００倍強く、または少なくとも２００倍強く、または少なくとも５００倍強く、または少なくとも約１０００倍強く、特異的に結合するという意味を含む。
【0060】
加えて、抗体が標的ＣＴＬＡ－４に、少なくとも約１０－１Ｋｄ、または少なくとも約１０－２Ｋｄ、または少なくとも約１０－３Ｋｄ、または少なくとも約１０－４Ｋｄ、または少なくとも約１０－５Ｋｄ、または少なくとも約１０－６Ｋｄ、または少なくとも約１０－７Ｋｄ、または少なくとも約１０－８Ｋｄ、または少なくとも約１０－９Ｋｄ、または少なくとも約１０－１０Ｋｄ、または少なくとも約１０－１１Ｋｄ、または少なくとも約１０－１２Ｋｄ、または少なくとも約１０－１３Ｋｄ、または少なくとも約１０－１４Ｋｄ、または少なくとも約１０－１５ＫｄのＫｄで結合する場合、抗体が標的ＣＴＬＡ－４に特異的に結合するという意味を含む。
【0061】
上記のように、本明細書に記載のＣＴＬＡ－４に特異的に結合する抗体分子（または抗ＣＴＬＡ－４抗体分子）は、イピリムマブと比較して、ＣＴＬＡ－４陽性細胞に対する改善された枯渇効果を有する。
【0062】
抗体分子がＣＴＬＡ－４陽性細胞に枯渇効果を有するということは、ヒトなどの対象に投与すると、そのような抗体がＣＴＬＡ－４陽性細胞の表面に発現するＣＴＬＡ－４に特異的に結合し、この結合がそのような細胞の枯渇をもたらすことを意味する。
【0063】
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４陽性細胞は、ＣＤ４陽性（ＣＤ４＋）細胞、すなわち、ＣＤ４を発現する細胞である。
【0064】
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４陽性細胞は、ＣＤ４陽性およびＦＯＸＰ３陽性の両方であり、すなわち、ＣＤ４およびＦＯＸＰ３の両方を発現する。これらの細胞はＴｒｅｇである。ＣＤ８陽性Ｔ細胞もＣＴＬＡ－４を発現するが、ＴｒｅｇはＣＤ８陽性Ｔ細胞よりも有意に高いレベルのＣＴＬＡ－４を発現する。これにより、Ｔｒｅｇは、発現の少ないＣＤ８＋細胞と比較して枯渇しやすくなる。
【0065】
状況によっては、ＣＴＬＡ－４は腫瘍微小環境の免疫細胞（腫瘍浸潤細胞、ＴＩＬＳ）に優先的に発現する。
【0066】
したがって、腫瘍微小環境では、ＴｒｅｇはＣＴＬＡ－４の発現が最も高い細胞となり、ＣＴＬＡ－４に特異的に結合する抗体分子（または抗ＣＴＬＡ－４抗体分子）がＴｒｅｇ枯渇効果を有することとなる。これについては、以下、例えば実施例４で、図１３に関連して詳しく説明する。
【0067】
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４陽性細胞は、固形腫瘍におけるＴｒｅｇである。そのようなＴｒｅｇは、ＣＴＬＡ－４の非常に高い発現を有するため、ＣＴＬＡ－４に特異的に結合する抗体分子を投与すると、そのようなＴｒｅｇの枯渇を優先的にもたらす。
【0068】
上記のように、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ－４抗体分子は、Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子であり、これは、ヒトなどの対象に投与すると、そのような抗体分子が、Ｔｒｅｇの表面に発現するＣＴＬＡ－４に特異的に結合し、この結合がＴｒｅｇの枯渇をもたらすことを意味する。
【0069】
抗体分子が、本明細書で言及されるイピリムマブと比較してＣＴＬＡ－４陽性細胞に対する改善した枯渇効果を有する抗体分子であるかどうかを決定するために、インビトロ抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）アッセイまたはＰＢＭＣ－ＮＯＧ／ＳＣＩＤモデルでのインビボ試験を使用することが可能である。
【0070】
ＣＤ１６－１５８Ｖ対立遺伝子をＧＦＰとともに発現するように安定的にトランスフェクトされたＮＫ－９２細胞株を使用して実行されるインビトロＡＤＣＣ試験であって、ＡＤＣＣ試験は以下の連続した７つのステップを含む：
１）標的細胞としての、ＣＴＬＡ－４陽性細胞、ＣＤ４陽性細胞、またはＴｒｅｇを、健康なドナーの末梢血から単離するステップ。この単離は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃの市販キットなどのＣＤ４＋Ｔ細胞単離キットを使用して行うことができる。
２）次に、標的細胞をＣＤ３／ＣＤ２８で、例えば、ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）およびｒｈＩＬ－２、例えば、５０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ－２を使用して、例えば４８時間刺激するステップ。刺激は３７℃で行うことができる。
３）次に、標的細胞を、試験される抗体分子と、例えば、１０μｇ／ｍｌで、４℃で３０分間プレインキュベートし、次にＮＫ細胞と混合するステップ。
４）次に、標的細胞を、ＨＥＰＥＳバッファー、ピルビン酸ナトリウム、およびＦＢＳ低ＩｇＧを含有するＲＰＭＩ １６４０＋ＧｌｕｔａＭＡＸ培地で、適切な時間、例えば４時間インキュベートするステップ。ＲＰＭＩ １６４０＋ＧｌｕｔａＭＡＸ培地には、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび１０％ＦＢＳ低ＩｇＧを含有してよく、エフェクター：標的細胞の比率は２：１であってよい。
５）溶解をフローサイトメトリーによって決定するステップ。
６）ステップ３で試験された抗体分子の代わりに使用されるイピリムマブを用いて、ステップ１～５を繰り返すか、または並行して実行するステップ。
７）試験した抗体分子の溶解結果を、イピリムマブの溶解結果と比較するステップ。イピリムマブと比較して試験された抗体分子の改善された溶解は、この試験された抗体分子が、使用された標的細胞に応じて、ＣＴＬＡ－４陽性細胞、ＣＤ４陽性細胞またはＴｒｅｇに対してそれぞれ改善された枯渇効果を有することを示している。
１）標的細胞としての、ＣＴＬＡ－４陽性細胞、ＣＤ４陽性細胞、またはＴｒｅｇを、健康なドナーの末梢血から単離するステップ。この単離は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃの市販キットなどのＣＤ４＋Ｔ細胞単離キットを使用して行うことができる。
２）次に、標的細胞をＣＤ３／ＣＤ２８で、例えば、ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）およびｒｈＩＬ－２、例えば、５０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ－２を使用して、例えば４８時間刺激するステップ。刺激は３７℃で行うことができる。
３）次に、標的細胞を、試験される抗体分子と、例えば、１０μｇ／ｍｌで、４℃で３０分間プレインキュベートし、次にＮＫ細胞と混合するステップ。
４）次に、標的細胞を、ＨＥＰＥＳバッファー、ピルビン酸ナトリウム、およびＦＢＳ低ＩｇＧを含有するＲＰＭＩ １６４０＋ＧｌｕｔａＭＡＸ培地で、適切な時間、例えば４時間インキュベートするステップ。ＲＰＭＩ １６４０＋ＧｌｕｔａＭＡＸ培地には、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび１０％ＦＢＳ低ＩｇＧを含有してよく、エフェクター：標的細胞の比率は２：１であってよい。
５）溶解をフローサイトメトリーによって決定するステップ。
６）ステップ３で試験された抗体分子の代わりに使用されるイピリムマブを用いて、ステップ１～５を繰り返すか、または並行して実行するステップ。
７）試験した抗体分子の溶解結果を、イピリムマブの溶解結果と比較するステップ。イピリムマブと比較して試験された抗体分子の改善された溶解は、この試験された抗体分子が、使用された標的細胞に応じて、ＣＴＬＡ－４陽性細胞、ＣＤ４陽性細胞またはＴｒｅｇに対してそれぞれ改善された枯渇効果を有することを示している。
【0071】
いくつかの実施形態では、上記のステップ７）における改善された枯渇効果は、有意に改善された枯渇効果である。
【0072】
このアッセイは、図１２と組み合わせて、以下の実施例４でより詳細に示されている。
【0073】
インビボ試験は、本明細書ではＰＢＭＣ－ＮＯＧ／ＳＣＩＤモデルと呼ばれる、ＰＢＭＣマウスおよびＮＯＧ／ＳＣＩＤマウスの併用に基づいている。ＰＢＭＣマウスおよびＮＯＧ／ＳＣＩＤマウス両方とも公知のモデルである。ＰＢＭＣ－ＮＯＧ／ＳＣＩＤモデルにおけるインビボ試験は、次の９つの連続したステップで構成される。
１）ヒトＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）を単離し、洗浄し、滅菌ＰＢＳに再懸濁するステップ。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、７５×１０６細胞／ｍｌでＰＢＳに再懸濁される。
２）ＮＯＧマウスに、ステップ１）からの細胞懸濁液の適切な量、例えば２００μｌを、ｉ．ｖ．（静脈内）注射するステップ。２００μＬを注射している場合は、これは１５×１０６細胞／マウスに相当する。
３）注射後、適切な時期に例えば２週間、ＮＯＧマウスから脾臓を単離し、単一細胞懸濁液にするステップ。任意選択で、単一細胞懸濁液から少量の試料を採取して、ＣＴＬＡ－４の発現を確認するために、ＦＡＣＳによってヒトＴ細胞上のＣＴＬＡ－４の発現を決定する。
４）ステップ３）の細胞懸濁液を滅菌ＰＢＳに再懸濁するステップ。いくつかの実施形態では、懸濁液は、５０×１０６細胞／ｍｌで滅菌ＰＢＳに再懸濁される。任意選択のＣＴＬＡ－４発現決定がステップ３に含まれている場合、残りの細胞懸濁液はステップ４で再懸濁される。
５）ＳＣＩＤマウスに、ステップ４からの懸濁液の適切な量、例えば２００μｌを、ｉ．ｐ．（腹腔内）注射するステップ。２００μＬを注射している場合は、これは１０×１０６細胞／マウスに相当する。
６）ステップ５）の注射後、適切な時間に例えば１時間、ＳＣＩＤマウスを、試験される抗体分子、イピリムマブまたはアイソタイプ対照モノクローナル抗体のいずれかの適切な量、例えば１０ｍｇ／ｋｇで処理するステップ。
７）処理されたＳＣＩＤマウスの腹腔内液を、ステップ６）の処理後、適切な時間例えば２４時間で収集するステップ。
８）ヒトＴ細胞サブセットを、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５および／またはＣＤ１２７のマーカーを使用してＦＡＣＳによって同定および定量化するステップ。
９）試験された抗体分子で処理したマウスからのＴ細胞サブセットの同定および定量化の結果を、イピリムマブで処理したマウスからのＴ細胞サブセットの同定および定量化の結果、ならびにアイソタイプ対照モノクローナル抗体で処理したマウスからのＴ細胞サブセットの同定および定量化の結果と比較するステップ。イピリムマブで処理されたマウスの腹腔内液中のＣＴＬＡ－４陽性細胞の数と比較して、試験された抗体分子で処理されたマウスの腹腔内液中のＣＴＬＡ－４陽性細胞の数が少ないことは、この抗体分子がイピリムマブと比較してＣＴＬＡ－４陽性細胞に対する改善した枯渇効果を有することを示している。イピリムマブで処理されたマウスの腹腔内液中のＣＤ４陽性細胞の数と比較して、試験された抗体分子で処理されたマウスの腹腔内液中のＣＤ４陽性細胞の数が少ないことは、この抗体分子がイピリムマブと比較してＣＤ４陽性細胞に対する改善した枯渇効果を有することを示している。イピリムマブで処理されたマウスの腹腔内液中のＴｒｅｇの数と比較して、試験された抗体分子で処理されたマウスの腹腔内液中のＴｒｅｇの数が少ないことは、この抗体分子がイピリムマブと比較してＴｒｅｇに対する改善した枯渇効果を有すること示している。
１）ヒトＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）を単離し、洗浄し、滅菌ＰＢＳに再懸濁するステップ。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、７５×１０６細胞／ｍｌでＰＢＳに再懸濁される。
２）ＮＯＧマウスに、ステップ１）からの細胞懸濁液の適切な量、例えば２００μｌを、ｉ．ｖ．（静脈内）注射するステップ。２００μＬを注射している場合は、これは１５×１０６細胞／マウスに相当する。
３）注射後、適切な時期に例えば２週間、ＮＯＧマウスから脾臓を単離し、単一細胞懸濁液にするステップ。任意選択で、単一細胞懸濁液から少量の試料を採取して、ＣＴＬＡ－４の発現を確認するために、ＦＡＣＳによってヒトＴ細胞上のＣＴＬＡ－４の発現を決定する。
４）ステップ３）の細胞懸濁液を滅菌ＰＢＳに再懸濁するステップ。いくつかの実施形態では、懸濁液は、５０×１０６細胞／ｍｌで滅菌ＰＢＳに再懸濁される。任意選択のＣＴＬＡ－４発現決定がステップ３に含まれている場合、残りの細胞懸濁液はステップ４で再懸濁される。
５）ＳＣＩＤマウスに、ステップ４からの懸濁液の適切な量、例えば２００μｌを、ｉ．ｐ．（腹腔内）注射するステップ。２００μＬを注射している場合は、これは１０×１０６細胞／マウスに相当する。
６）ステップ５）の注射後、適切な時間に例えば１時間、ＳＣＩＤマウスを、試験される抗体分子、イピリムマブまたはアイソタイプ対照モノクローナル抗体のいずれかの適切な量、例えば１０ｍｇ／ｋｇで処理するステップ。
７）処理されたＳＣＩＤマウスの腹腔内液を、ステップ６）の処理後、適切な時間例えば２４時間で収集するステップ。
８）ヒトＴ細胞サブセットを、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５および／またはＣＤ１２７のマーカーを使用してＦＡＣＳによって同定および定量化するステップ。
９）試験された抗体分子で処理したマウスからのＴ細胞サブセットの同定および定量化の結果を、イピリムマブで処理したマウスからのＴ細胞サブセットの同定および定量化の結果、ならびにアイソタイプ対照モノクローナル抗体で処理したマウスからのＴ細胞サブセットの同定および定量化の結果と比較するステップ。イピリムマブで処理されたマウスの腹腔内液中のＣＴＬＡ－４陽性細胞の数と比較して、試験された抗体分子で処理されたマウスの腹腔内液中のＣＴＬＡ－４陽性細胞の数が少ないことは、この抗体分子がイピリムマブと比較してＣＴＬＡ－４陽性細胞に対する改善した枯渇効果を有することを示している。イピリムマブで処理されたマウスの腹腔内液中のＣＤ４陽性細胞の数と比較して、試験された抗体分子で処理されたマウスの腹腔内液中のＣＤ４陽性細胞の数が少ないことは、この抗体分子がイピリムマブと比較してＣＤ４陽性細胞に対する改善した枯渇効果を有することを示している。イピリムマブで処理されたマウスの腹腔内液中のＴｒｅｇの数と比較して、試験された抗体分子で処理されたマウスの腹腔内液中のＴｒｅｇの数が少ないことは、この抗体分子がイピリムマブと比較してＴｒｅｇに対する改善した枯渇効果を有すること示している。
【0074】
このインビボ試験では、いくつかの実施形態では、ステップ７でのＴｒｅｇ枯渇を調べることが最も興味深い。
【0075】
このアッセイは、図１４と組み合わせて、以下の実施例４でより詳細に示されている。
【0076】
Ｔｒｅｇ枯渇はまた、当業者に知られているように、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）アッセイにおいて評価され得る。
【0077】
いくつかの実施形態では、抗体分子は、Ｙｅｒｖｏｙと比較して、Ｂ７．１およびＢ７．２リガンドとのＣＴＬＡ－４相互作用に対して同様の遮断効果を有する。これは、ＥＬＩＳＡ（図１０に示す）によって、または抗ＣＴＬＡ－４抗体がＳＥＢによるＰＢＭＣの刺激に応答してＴ細胞によるＩＬ－２産生を増強するより機能的なアッセイによって評価することができる。
【0078】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体分子は、ヒト抗体分子である。
【0079】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体分子は、ヒト化抗体分子である。
【0080】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体分子は、ヒト由来の抗体分子であり、これは、それが、その後修飾されたヒト抗体分子に由来することを意味する。
【0081】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体分子は、ヒトＩｇＧ１抗体である。
【0082】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体はまた、１つまたはいくつかの活性化Ｆｃ受容体への結合の改善を示す、かつ／あるいは１つまたはいくつかの活性化Ｆｃ受容体への結合の改善のために操作されたヒトＩｇＧ１抗体の形態の抗体であり、したがって、いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、Ｆｃ操作されたヒトＩｇＧ１抗体である。
【0083】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、マウスまたはヒト化マウスＩｇＧ２ａ抗体である。
【0084】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、ヒトＣＴＬＡ－４と交差反応性であるマウス抗体である。
【0085】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、モノクローナル抗体である。
【0086】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、ポリクローナル抗体である。
【0087】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体分子は、以下の表１に示される、３つの選択的ＶＨ－ＣＤＲ１配列のうちの１つ、３つの選択的ＶＨ－ＣＤＲ２配列のうちの１つ、２つの選択的ＶＨ－ＣＤＲ３配列のうちの１つ、２つのＶＬ－ＣＤＲ１配列のうちの１つ、２つのＶＬ－ＣＤＲ２配列のうちの１つ、および／または２つの選択的ＶＬ－ＣＤＲ３配列のうちの１つを含む抗体分子である。
【0088】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体分子は、配列番号３、６、８、１０、１２および１４からなる群から選択される１～６個のＣＤＲを含む抗体分子からなる群から選択される。
【0089】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体分子は、配列番号３、６、８、１０、１２および１４を有するＣＤＲを含む抗体分子からなる群から選択される。
【0090】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体分子は、ＣＤＲ、ＶＨ－ＣＤＲ１、ＶＨ－ＣＤＲ２、ＶＨ－ＣＤＲ３、ＶＬ－ＣＤＲ１、およびＶＬ－ＣＤＲ３のうちの１～６個を含む抗体分子からなる群から選択され、
存在する場合、ＶＨ－ＣＤＲ１は、配列番号１５、２２、２９および３５からなる群から選択され、
存在する場合、ＶＨ－ＣＤＲ２は、配列番号１６、２３、３０、および３６からなる群から選択され、
存在する場合、ＶＨ－ＣＤＲ３は、配列番号１７、２４、３１および３７からなる群から選択され、
存在する場合、ＶＬ－ＣＤＲ１は、配列番号１０および３８からなる群から選択され、
存在する場合、ＶＬ－ＣＤＲ２は、配列番号１８、２５、３２および３９からなる群から選択され、
存在する場合、ＶＬ－ＣＤＲ３は、配列番号１９、２６および４０からなる群から選択される。
存在する場合、ＶＨ－ＣＤＲ１は、配列番号１５、２２、２９および３５からなる群から選択され、
存在する場合、ＶＨ－ＣＤＲ２は、配列番号１６、２３、３０、および３６からなる群から選択され、
存在する場合、ＶＨ－ＣＤＲ３は、配列番号１７、２４、３１および３７からなる群から選択され、
存在する場合、ＶＬ－ＣＤＲ１は、配列番号１０および３８からなる群から選択され、
存在する場合、ＶＬ－ＣＤＲ２は、配列番号１８、２５、３２および３９からなる群から選択され、
存在する場合、ＶＬ－ＣＤＲ３は、配列番号１９、２６および４０からなる群から選択される。
【0091】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体分子は、以下からなる群から選択される６個のＣＤＲを含む抗体分子からなる群から選択される：
配列番号１５、１６、１７、１０、１８および１９；
配列番号２２、２３、２４、１０、２５および２６；
配列番号２９、３０、３１、１０、３２および２６；および
配列番号３５、３６、３７、３８、３９および４０。
配列番号１５、１６、１７、１０、１８および１９；
配列番号２２、２３、２４、１０、２５および２６；
配列番号２９、３０、３１、１０、３２および２６；および
配列番号３５、３６、３７、３８、３９および４０。
【0092】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体分子は、配列番号１５、１６、１７、１０、１８および１９を有する６個のＣＤＲを含む抗体分子である。
【0093】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体分子は、配列番号２２、２３、２４、１０、２５および２６を有する６個のＣＤＲを含む抗体分子である。
【0094】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体分子は、配列番号２０、２７、３３および４１からなる群から選択されるＶＨを有する抗体分子からなる群から選択される抗体分子である。
【0095】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体分子は、配列番号２１、２８、３４および４２からなる群から選択されるＶＬを有する抗体分子からなる群から選択される抗体分子である。
【0096】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体分子は、配列番号２０～２１、２７～２８、３３～３４および４１～４２、からなる群から選択されるＶＨおよびＶＬを有する抗体分子からなる群から選択される抗体分子である。
【0097】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体分子は、配列番号２０を有するＶＨおよび配列番号２１を有するＶＬを含む。
【0098】
いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体分子は、配列番号２７を有するＶＨおよび配列番号２８を有するＶＬを含む。
【表1-1】
【表1-2】
【表2-1】
【表2-2】
【表2-3】
【0099】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ－４抗体分子はまた、以下の表３に示される定常領域の一方または両方を含み得る。
【表3】
【0100】
イクツカノ実施形態デハ、抗ＣＴＬＡ－４抗体分子ハ、以下ノ表４ニ示サレルヌクレオチド配列ノウチノ１ツニヨッテコードサレル分子デアル。
【表4-1】
【表4-2】
【表4-3】
【表4-4】
【0101】
いくつかの実施形態では、抗体分子が、ヒトＣＴＬＡ－４（ｈＣＴＬＡ－４）およびカニクイザルＣＴＬＡ－４（ｃｍＣＴＬＡ－４またはｃｙｎｏＣＴＬＡ－４）の両方に結合することが有利である。カニクイザル（ｃｒａｂ－ｅａｔｉｎｇ ｍａｃａｑｕｅまたはＭａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）とも呼ばれるカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）の細胞に発現するＣＴＬＡ－４との交差反応性は、特に忍容性に焦点を当てた代理抗体を使用せずにサルにおける抗体分子の試験を可能にするため、有利である可能性がある。
【0102】
いくつかの実施形態では、抗体分子がヒトＣＴＬＡ－４（ｈＣＴＬＡ－４）およびマウスＣＴＬＡ－４（ｍＣＴＬＡ－４）の両方に結合することが有利である。これは、代理抗体を使用する必要なしに、効果および薬力学に特に焦点を合わせて、マウスにおける抗体分子の試験を可能にするため、これは有利である可能性がある。
【0103】
いくつかの実施形態では、抗体分子は、３つすべてのｈＣＴＬＡ－４、ｃｍＣＴＬＡ－４およびｍＣＴＬＡ－４に結合する。
【0104】
いくつかの実施形態では、マウスの関連するインビボモデルにおいて抗体分子の機能的活性を試験するには、代理抗体を使用する必要がある。ヒトにおける抗体分子の効果とマウスにおける代理抗体のインビボ結果との間の比較可能性を確実にするために、ヒト抗体分子と同じインビトロ特性を有する機能的に同等の代理抗体を選択することが不可欠である。
【0105】
いくつかの実施形態では、抗体分子は、ヒトＣＤ２８に結合しない。
【0106】
例えば、薬剤が体に吸収される速度を変更するように、薬剤は、異なる添加物で改変することができ、例えば身体への特定の投与経路を可能にするように異なる形態で改変することができることは、医薬当業者には既知であろう。
【0107】
したがって、本明細書に記載の抗体分子、ヌクレオチド配列、プラスミド、ウイルスおよび／または細胞を、薬学的に許容される賦形剤、担体、希釈剤、ビヒクルおよび／またはアジュバントと組み合わせて薬学的組成物にすることができることを含む。この文脈において、薬学的組成物という用語は、薬学的調製物、薬学的製剤、治療組成物、治療調製物、治療製剤、および治療実体（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｎｔｉｔｙ）という用語と交換可能に使用することができる。
【0108】
本明細書に記載の薬学的組成物は、抗体分子、ヌクレオチド配列、プラスミド、ウイルスまたは細胞を含み得るか、またはいくつかの実施形態ではそれらからなる。
【0109】
本明細書に記載の薬学的組成物は、いくつかの実施形態では、上記の抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含むかまたは上記のヌクレオチド配列を含む、プラスミドからなるか、またはそれを含み得る。
【0110】
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、細胞またはウイルスゲノムまたはビリオーム（ｖｉｒｉｏｍｅ）に組み込まれた、本明細書に記載の抗体分子の一部または完全な抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含み得る。そして、薬学的組成物は、本発明の抗体の送達ビヒクル（または本発明の抗体をコードするヌクレオチド配列の送達ビヒクル）としての細胞またはウイルスを含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、ウイルスは、本明細書に記載される抗体分子の少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列を含む治療的腫瘍溶解性ウイルスの形態であってよい。いくつかの実施形態では、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、完全長ヒトＩｇＧ抗体をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、ｓｃＦｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含む。
【0111】
添付の特許請求の範囲に記載されているように、本発明は、一実施形態では、本発明のヌクレオチド配列または本発明のプラスミドを含むウイルスに関する。好ましくは、ウイルスは、治療的腫瘍溶解性ウイルスなどの腫瘍溶解性ウイルスである。本明細書で使用される場合、「腫瘍溶解性」という用語は、非分裂中の（例えば正常または健康）細胞内での複製を全くなくまたは最小限にしながら、インビトロまたはインビボでのいずれかで、分裂中の細胞（例えば癌細胞などの増殖細胞）において、増殖を遅らせ、および／または当該分裂中の細胞を溶解する目的で、選択的に複製するウイルスの能力を指す。「複製（Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）」（または「複製する（ｒｅｐｌｉｃａｔｅ）」および「複製すること（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ）」などの任意の形態の複製）は、核酸のレベルで、または好ましくは感染性ウイルス粒子のレベルで起こり得るウイルスの重複（ｄｕｐｌｉｃａｔｉｏｎ）を意味する。このような腫瘍溶解性ウイルスは、現時点で同定されているウイルスの任意のメンバーから入手することができる。それは、自然に腫瘍溶解性であるか、またはＤＮＡ複製、核酸代謝、宿主向性、表面付着、病原性、溶解および拡散に関与するものなどの分裂細胞における腫瘍選択性および／または優先的複製を増加させるように１つ以上のウイルス遺伝子を改変することによって操作され得る天然ウイルスであり得る（例えば、Ｗｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｖｉｒｕｓｅｓ ２：７８－１０６を参照されたい）。また、１つ以上のウイルス遺伝子（複数可）をイベントまたは組織特異的調節エレメント（例えばプロモータ）の制御下に置くことを想定することもできる。例示的な腫瘍溶解性ウイルスには、レオウイルス、セネカバレーウイルス（ＳＶＶ）、水胞性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、モルビリウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルス、麻疹ウイルス、泡沫状ウイルス、アルファウイルス、レンチウイルス、インフルエンザウイルス、シンビス（Ｓｉｎｂｉｓ ｖｉｒｕｓ）ウイルス、粘液腫ウイルス、ラブドウイルス、ピコルナウイルス、コクサッキーウイルス、パルボウイルスなどが含まれるが、これらに限定されない。腫瘍溶解性ウイルスは、医薬およびウイルス学の当業者に既知である。
【0112】
いくつかの実施形態では、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、ヘルペスウイルスから得られる。ヘルペスウイルス科は、すべて共通の構造を共有するＤＮＡウイルスの大きなファミリーであり、脂質二重層膜に包まれた正二十面体キャプシド内にキャプシド形成されている、１００～２００個の遺伝子をコードする比較的大きな二本鎖の線形ＤＮＡゲノムで構成されている。腫瘍溶解性ヘルペスウイルスはさまざまな種類のＨＳＶに由来する可能性があるが、ＨＳＶ１とＨＳＶ２が特に好ましい。ヘルペスウイルスは、腫瘍内でウイルス複製を制限したり、非分裂細胞内での細胞傷害性を低下させたりするように遺伝子改変することができる。例えば、チミジンキナーゼ（Ｍａｒｔｕｚａ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：８５４－６）、リボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＲ）（Ｍｉｎｅｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５４：３３６３－６６）、またはウラシル－Ｎ－グリコシラーゼ（Ｐｙｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：４９６３－７２）など、核酸代謝に関与する任意のウイルス遺伝子を不活性にすることができる。別の態様は、ＩＣＰ３４．５遺伝子などの病原性因子をコードする遺伝子の機能に欠損があるウイルス変異体を含む（Ｃｈａｍｂｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１４１１－５）。腫瘍溶解性ヘルペスウイルスの代表的な例には、ＮＶ１０２０（例えば、Ｇｅｅｖａｒｇｈｅｓｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２１（９）：１１１９－２８）およびＴ－ＶＥＣ（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．１５（１２）：１３８９－１４０３）が含まれる。
【0113】
いくつかの実施形態では、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、アデノウイルスから得られる。腫瘍溶解性アデノウイルスを操作するための方法が当技術分野で利用可能である。有利な戦略には、ウイルスプロモーターを腫瘍選択的プロモーターに置き換えるか、またはＥ１アデノウイルス遺伝子産物（複数可）を改変して、腫瘍細胞で変更されるｐ５３または網膜芽細胞腫（Ｒｂ）タンパク質とのそれらの結合機能を不活性化することが含まれる。自然な状況では、アデノウイルスＥ１Ｂ５５ｋＤａ遺伝子は、別のアデノウイルス産物と協力してｐ５３を不活性化し（ｐ５３は癌細胞で頻繁に調節不全になる）、アポトーシスを防止する。腫瘍溶解性アデノウイルスの代表的な例には、ＯＮＹＸ－０１５（例えば、Ｋｈｕｒｉ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｎａｔ．Ｍｅｄ ６（８）：８７９－８５）およびＯｎｃｏｒｉｎｅとも呼ばれるＨ１０１（Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ａｉ Ｚｈｅｎｇ ２３（１２）：１６６６－７０）が含まれる。
【0114】
いくつかの実施形態では、そのような腫瘍溶解性ウイルスはポックスウイルスである。本明細書で使用される場合、「ポックスウイルス」という用語は、ポックスウイルス科に属するウイルスを指し、コードポックスウイルス（Ｃｈｏｒｄｏｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）亜科、より好ましくはオルソポックスウイルス属に属するポックスウイルスが特に好ましい。ワクシニアウイルス、牛痘ウイルス、カナリア痘ウイルス、エクトロメリアウイルス、粘液腫ウイルスは、本発明に関連して特に適切である。そのようなポックスウイルスのゲノム配列は、当技術分野および専門のデータベースで入手可能である（例えば、それぞれ受入番号ＮＣ＿００６９９８、ＮＣ＿００３６６３またはＡＦ４８２７５８．２、ＮＣ＿００５３０９、ＮＣ＿００４１０５、ＮＣ＿００１１３２でのＧｅｎｂａｎｋ）。
【0115】
特定の好ましい実施形態では、そのような腫瘍溶解性ポックスウイルスは、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスである。ワクシニアウイルスは、ウイルスが宿主細胞機構から独立して複製することを可能にする多数のウイルス酵素および因子をコードする２００ｋｂの二本鎖ＤＮＡゲノムを特徴とするポックスウイルスファミリーのメンバーである。ワクシニアウイルス粒子の大部分は、細胞内にあり（細胞内成熟ビリオンの場合はＩＭＶ）、単一の脂質エンベロープを有し、溶解するまで感染細胞のサイトゾルに留まる。他の感染形態は、感染した細胞を溶解せずに発芽する二重エンベロープ粒子（細胞外エンベロープビリオンのＥＥＶ）である。ワクシニアウイルス株に由来する可能性があるが、エルストリー（Ｅｌｓｔｒｅｅ）、ワイス（Ｗｙｅｔｈ）、コペンハーゲン（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ）、リスター（Ｌｉｓｔｅｒ）、ウエスタンリザーブ（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｒｅｓｅｒｖｅ）株が特に好ましい。本明細書で使用される遺伝子命名法は、特に明記しない限り、コペンハーゲンワクシニア株の命名法である。ただし、コペンハーゲンと他のワクシニア株との対応は、一般的に文献で入手できる。
【0116】
好ましくは、そのような腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、１つ以上のウイルス遺伝子（複数可）を変更することによって改変される。当該改変（複数可）は、好ましくは、合成の欠如、または未改変遺伝子によって通常の条件下で産生されるタンパク質の活性を保証することができない欠陥ウイルスタンパク質の合成をもたらす。例示的な改変は、ＤＮＡ代謝、宿主毒性、ＩＦＮ経路（例えばＧｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１（５）：５９５－６０８）などに関与するウイルス遺伝子を改変することを目的とする文献に開示されている。ウイルス遺伝子座を変更するための改変は、ウイルス遺伝子またはその調節エレメント内の１つ以上のヌクレオチド（複数可）（隣接しているかどうかにかかわらず）の欠失、変異および／または置換を包含する。改変（複数可）は、従来の組換え技術を使用して当業者に知られているいくつかの方法によって行うことができる。
【0117】
より好ましくは、そのような腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、チミジンキナーゼをコードする遺伝子（遺伝子座Ｊ２Ｒ）を変更することによって改変される。チミジンキナーゼ（ＴＫ）酵素は、デオキシリボヌクレオチドの合成に関与している。ＴＫは、正常細胞でのウイルス複製に必要であり、それはこれらの細胞が一般にヌクレオチド濃度が低いためであり、一方、高いヌクレオチド濃度を含有する分裂細胞では不要である。
【0118】
その代わりに、または組み合わせて、そのような腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、リボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＲ）をコードする少なくとも１つの遺伝子または両方の遺伝子を変更することによって改変される。自然な状況では、この酵素はリボヌクレオチドのデオキシリボヌクレオチドへの還元を触媒し、これは、ＤＮＡ生合成の重要なステップを表している。ウイルス酵素は、サブユニット構造が哺乳類の酵素と類似しており、Ｉ４ＬおよびＦ４Ｌ遺伝子座によってそれぞれコードされるＲ１およびＲ２として設計された２つの異種サブユニットで構成されている。本発明の関連では、Ｉ４Ｌ遺伝子（Ｒ１大サブユニットをコードする）またはＦ４Ｌ遺伝子（Ｒ２小サブユニットをコードする）のいずれかまたは両方が不活化され得る（例えば、ＷＯ２００９／０６５５４６およびＦｏｌｏｐｐｅ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１５：１３６１－７１に記載されるもの）。Ｊ２Ｒ、Ｉ４ＬおよびＦ４Ｌ遺伝子の配列と、さまざまなポックスウイルスのゲノムにおけるそれらの位置は、公開データベースで入手できる。
【0119】
いくつかの実施形態では、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、上記の表２に示される配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、上記の表２に示される配列と少なくとも８５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、上記の表２に示される配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、上記の表２に示される配列と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0120】
いくつかの実施形態では、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、配列番号２０および配列番号２１をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、配列番号２７および配列番号２８をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、配列番号３３および配列番号３４をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、配列番号４１および配列番号４２をコードするヌクレオチド配列を含む。
【0121】
いくつかの実施形態では、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、上記の表４に示される配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、上記の表４に示される配列と少なくとも８５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、上記の表４に示される配列と少なくとも９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、上記の表４に示される配列と少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【0122】
いくつかの実施形態では、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、配列番号４５および４６を含む。いくつかの実施形態では、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、配列番号４７および４８を含む。いくつかの実施形態では、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、配列番号４９および５０を含む。いくつかの実施形態では、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、配列番号５１および５２を含む。
【0123】
一部の腫瘍溶解性ウイルスは、完全長のヒト抗体配列の統合に対応するのに十分な大きさのＤＮＡ挿入を受け入れるする能力を持っている。弱毒化ワクシニアウイルスおよび単純ヘルペスウイルスは、そのゲノムが完全長ＩｇＧ抗体配列の組み込みを可能にするのに十分に大きい、治療用腫瘍溶解性ウイルスの例である（Ｃｈａｎ，Ｗ．Ｍ．ｅｔ ａｌ ２０１４ Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｖｉｒｏｌ １（１）：１１９－１４１、Ｂｏｍｍａｒｅｄｄｙ，Ｐ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．２０１８ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８（８）：４９８－５１３）。完全長ＩｇＧ抗体は腫瘍溶解性ワクシニアウイルスにうまく組み込まれ、ウイルス感受性宿主細胞、例えば癌細胞の感染時に完全長ＩｇＧ抗体の発現と細胞外放出（産生）をもたらす（Ｋｌｅｉｎｐｅｔｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．２０１６，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５（１０）：ｅ１２２０４６７）。アデノウイルスはまた、細胞感染時に機能的に産生および分泌される完全長ＩｇＧ抗体をコードするように操作することもできる（Ｍａｒｉｎｏ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．２０１７ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２３（６）：２４４７－２４６３）。
【0124】
好ましい実施形態では、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、ＴＫ活性に欠陥がある（Ｊ２Ｒ遺伝子座の変化に起因する）またはＴＫおよびＲＲの両方の活性に欠陥がある（Ｊ２Ｒ遺伝子座と、ＲＲをコードするＩ４Ｌおよび／またはＦ４Ｌ遺伝子座の少なくとも１つの、両方の変化に起因する）、ならびに（ａ）配列番号２０および配列番号２１をコードするヌクレオチド配列、または（ｂ）配列番号２７および配列番号２８をコードするヌクレオチド配列、または（ｃ）配列番号３３および配列番号３４をコードするヌクレオチド配列、または（ｄ）配列番号４１および配列番号４２をコードするヌクレオチド配列を含む、ポックスウイルス（例えば、ワクシニアウイルス）である。
【0125】
適切な場合、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスに挿入されたヌクレオチド配列（複数可）が、発現、輸送および生物学的活性を促進するための追加の調節エレメントを含むことが有利であり得る。例えば、シグナルペプチドは、プロデューサー細胞（例えば、感染細胞）の外側への分泌を促進するために含まれ得る。シグナルペプチドは通常、Ｍｅｔイニシエーターの直後にコードされたポリペプチドのＮ末端に挿入される。シグナルペプチドの選択は広く、当業者が利用できる。例えば、別の免疫グロブリン（例えば、重鎖ＩｇＧ）に由来するシグナルペプチドを本発明の状況下で使用して、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体をプロデューサー細胞の外に分泌させることができる。説明のために、ＩｇＧ由来ペプチドシグナルを備えた本明細書に記載の４－Ｅ０３抗体の軽鎖および重鎖を含む配列番号５３および配列番号５４を参照することができる。
【0126】
特に好ましい腫瘍溶解性ウイルスは、ＴＫおよびＲＲ活性（Ｊ２Ｒ遺伝子座とＩ４Ｌ遺伝子座の両方の変化に起因する）の両方に欠陥があり、配列番号２０および配列番号２１または配列番号５３および配列番号５４をコードするヌクレオチド配列を含む、ワクシニアウイルス（例えば、コペンハーゲン株）である。
【0127】
いくつかの実施形態では、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、免疫調節性ポリペプチド（複数可）（すなわち、直接的または間接的に免疫応答を刺激することに関与するポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列（複数可）などの治療上の関心の追加のヌクレオチド配列（複数可）をさらに含むことができる。適切な免疫調節性ポリペプチドの代表的な例には、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、特にヒト、非ヒト霊長類またはマウスＧＭ－ＣＳＦが特異的に好ましいサイトカインおよびケモカインが含まれるが、これらに限定されない。追加のヌクレオチド配列は、当技術分野でアクセス可能な配列データおよび本明細書で提供される情報を使用して、標準的な分子生物学技術（例えば、ＰＣＲ増幅、ｃＤＮＡクローニング、化学合成）によって容易に得ることができる。特に好ましい腫瘍溶解性ウイルスは、ＴＫおよびＲＲの両方の活性に欠陥があり（Ｊ２Ｒ遺伝子座およびＩ４Ｌ遺伝子座の両方の変化に起因する）、配列番号２０および配列番号２１または配列番号５３および配列番号５４をコードするヌクレオチド配列ならびにヒトＧＭ－ＣＳＦ（例えば、配列番号５５または配列番号５６を有する）またはマウスＧＭ－ＣＳＦ（例えば、配列番号５７または配列番号５８を有する）が特に好ましい、ＧＭ－ＣＳＦをコードするヌクレオチド配列を含む、ワクシニアウイルス（例えば、コペンハーゲン株）である。
【0128】
さらに、そのような腫瘍溶解性ウイルスに挿入されるヌクレオチド配列は、１つ以上のコドン（複数可）を改変することによって、特定の宿主細胞または対象において高レベルの発現を提供するために最適化することができる。コドン使用頻度の最適化に加えて、集中領域に存在するまれな非最適コドンのクラスター化を防止するため、および／または発現レベルに悪影響を与えると予想される「負の」配列要素を抑制または改変するために、さまざまな改変も想定され得る。このような負の配列要素には、非常に高い（＞８０％）または非常に低い（＜３０％）ＧＣ含量を有する領域；ＡＴリッチまたはＧＣリッチの配列ストレッチ；不安定な直接または逆方向反復配列；ＲＡ二次構造；および／または内部ＴＡＴＡボックス、カイ（ｃｈｉ）部位、リボソーム進入部位、および／またはスプライシング供与／受容部位などの内部潜在的調節エレメント、が含まれるが、これらに限定されない。
【0129】
いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列（複数可）は、宿主細胞または対象におけるそれらの適切な発現のための適切な調節エレメントの制御下に置かれる。本明細書で使用される場合、「調節エレメント」という用語は、その複製、重複、転写、スプライシング、翻訳、安定性、および／または発現細胞内外の輸送を含む、所与の宿主細胞または対象におけるコード化ヌクレオチド配列（複数可）の発現を可能にし、寄与し、または調節する任意のエレメントを指す。調節エレメントの選択は、ヌクレオチド配列自体、それが挿入されるウイルス、宿主細胞または対象、所望の発現レベルなどのような因子に依存し得ることが当業者によって理解されるであろう。プロモーターは特に重要である。本発明の状況において、それは、多くの種類の宿主細胞で制御するか、または特定の宿主細胞に特異的であるか、または特定の事象または外因性因子（例えば、温度、栄養添加物、ホルモンなどによる）に応答して、またはウイルスサイクルの段階（例えば後期または初期）に従って調節されるヌクレオチド配列の構成的指示発現であり得る。ウイルス媒介性発現に適応したプロモーターは当技術分野で知られている。腫瘍溶解性ポックスウイルスによる発現の代表的な例には、ワクシニアｐ７．５Ｋ、ｐＨ５．Ｒ、ｐ１１Ｋ７．５、ＴＫ、ｐ２８、ｐ１１、ｐＢ２Ｒ、ｐＡ３５Ｒ、Ｋ１ＬおよびｐＳＥ／Ｌプロモーター（Ｅｒｂｓ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１５（１）：１８－２８、Ｏｒｕｂｕ ｅｔ ａｌ．２０１２，ＰｌｏＳ Ｏｎｅ ７：ｅ４０１６７）、初期／後期キメラプロモーターおよび合成プロモーター（Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３：１０９４－７、Ｈａｍｍｏｎｄ ｅｔ ａｌ，１９９７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６６：１３５－８、およびＫｕｍａｒ ａｎｄ Ｂｏｙｌｅ，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７９：１５１－８）が含まれるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、本明細書に記載の抗体の軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列は、それぞれ、同じ転写強度を有するプロモーターの制御下に置かれ、好ましくは、同じプロモーター（例えば、配列番号５９に記載されているようなｐ７．５Ｋまたは配列番号６０に記載されているようなｐＨ５．Ｒ）の制御下に置かれて、両方の鎖で同様のレベルの発現を取得し、したがって、ヘテロ四量体タンパク質としての抗体の最適な組み立てを取得する（つまり、会合していない鎖の過剰を回避する）。追加のヌクレオチド配列（例えば、ＧＭ－ＣＳＦをコードする）は、異なるプロモーター（例えば、配列番号６１に記載されているようなｐＳＥ／Ｌ）の下に置くことができる。
【0130】
そのような腫瘍溶解性ウイルスのゲノムへのヌクレオチド配列（複数可）（おそらく適切な調節エレメントを備えている）の挿入は、適切な制限酵素を使用するか、または好ましくは相同組換えによる、従来の手段によって行われる。ヌクレオチド配列（複数可）は、ウイルスゲノムの任意の場所に独立して挿入することができる。さまざまな挿入部位は、例えば、そのような腫瘍溶解性ウイルスのゲノムの、非必須ウイルス遺伝子、遺伝子間領域、または非コード部分を考慮することができる。Ｊ２Ｒ遺伝子座および／またはＩ４Ｌ遺伝子座は、ポックスウイルスである腫瘍溶解性ウイルス（例えば腫瘍溶解性ワクシニアウイルス）に特に適している。ヌクレオチド配列（複数可）のウイルスゲノムへの挿入する、挿入部位のウイルス遺伝子座が少なくとも部分的に欠失させられ得る。一実施形態では、この欠失または部分的欠失は、完全にまたは部分的に欠失した遺伝子座によってコードされるウイルス遺伝子産物の抑制された発現をもたらし、当該ウイルス機能の欠損ウイルスをもたらし得る。特に好ましい腫瘍溶解性ウイルスは、Ｊ２Ｒ遺伝子座に挿入された重鎖をコードするカセットおよびＩ４Ｌ遺伝子座に挿入された軽鎖をコードするカセットを含む、ＴＫおよび／またはＲＲ欠損ワクシニアウイルスである。追加のＧＭ－ＣＳＦをコードするヌクレオチド配列をコードするカセットは、ウイルスゲノムの別の場所、またはＪ２ＲまたはＩ４Ｌ遺伝子座に挿入でき、Ｉ４Ｌ遺伝子座への挿入が好ましい。
【0131】
本発明はまた、本明細書に記載のそのような腫瘍溶解性ウイルス、特に腫瘍溶解性ポックスウイルスを適切な宿主細胞（プロデューサー細胞）に生成するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、そのような方法は、ウイルスゲノムと、挿入部位の上流および下流にそれぞれ存在するウイルス配列の５’および３’に隣接して挿入されるヌクレオチド配列（おそらく調節エレメントを有する）を含むトランスファープラスミドとの間の相同組換えの１つ以上のステップを含む。当該トランスファープラスミドは、日常的な技術によって（例えばトランスフェクションによって）宿主細胞に生成し、導入することができる。ウイルスゲノムは、感染によって宿主細胞に導入され得る。各隣接ウイルス配列のサイズは、ヌクレオチド配列の各側で少なくとも１００ｂｐから最大で１５００ｂｐまで変化し得る（好ましくは２００～５５０ｂｐ、より好ましくは２５０～５００ｂｐ）。そのような腫瘍溶解性ウイルスの生成を可能にする相同組換えは、好ましくは、培養細胞株（例えば、ＨｅＬａ、Ｖｅｒｏ）または発育卵から得られたニワトリ胚性線維芽細胞（ＣＥＦ）細胞において行われる。
【0132】
いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列およびおそらく追加のヌクレオチド配列（例えば、ＧＭ－ＣＳＦ）をコードする抗ＣＴＬＡ４を組み込んだ腫瘍溶解性ウイルスの同定は、選択および／または検出可能な遺伝子の使用によって容易にできる。好ましい実施形態では、トランスファープラスミドは、選択培地（例えば、ミコフェノール酸、キサンチンおよびヒポキサンチンの存在下）での増殖を可能にするＧＰＴ遺伝子（グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼをコードする）またはＧＦＰ、ｅ－ＧＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙなどの検出可能な遺伝子産物コードする検出可能な遺伝子が特に好ましい、選択マーカーをさらに含む。さらに、当該選択または検出可能な遺伝子において二本鎖切断を提供することができるエンドヌクレアーゼの使用も考慮され得る。当該エンドヌクレアーゼは、タンパク質の形態であり得るか、または発現ベクターによって発現され得る。
【0133】
一旦生成されると、そのような腫瘍溶解性ウイルスは、感染性粒子の産生および回収を可能にするために、適切な条件下でトランスフェクトまたは感染した宿主細胞を培養することを含む従来の技術を使用して、適切な宿主細胞内で増幅することができる。
【0134】
本発明はまた、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスを産生するための方法に関する。好ましくはこの方法は、ａ）プロデューサー細胞株を調製するステップと、ｂ）調製したプロデューサー細胞株に腫瘍溶解性ウイルスをトランスフェクトまたは感染させるステップと、ｃ）トランスフェクトまたは感染したプロデューサー細胞株を適切な条件下で培養してウイルスの産生を可能にするステップと、ｄ）当該プロデューサー細胞株の培養物から産生されたウイルスを回収するステップと、任意選択でｅ）当該回収されたウイルスを精製するステップと、を含む。
【0135】
いくつかの実施形態では、プロデューサー細胞は、ＨｅＬａ細胞（例えば、ＡＴＣＣ－ＣＲＭ－ＣＣＬ－２（商標）またはＡＴＣＣ－ＣＣＬ－２．２（商標））、ＨＥＲ９６、ＰＥＲ－Ｃ６（Ｆａｌｌａｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．９：１９０９－１７）などの哺乳類（例えば、ヒトまたは非ヒト）細胞、ＢＨＫ－２１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ－１０）などのハムスター細胞株およびＷＯ２００５／０４２７２８、ＷＯ２００６／１０８８４６、ＷＯ２００８／１２９０５８、ＷＯ２０１０／１３０７５６、ＷＯ２０１２／００１０７５に記載されているような鳥類細胞、ならびに受精卵から得られたニワトリ胚から調製された初代ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）からなる群から選択される。プロデューサー細胞は、必要に応じて、血清および／または適切な増殖因子（複数可）を補充してもよいしまたはしなくてもよい（例えば、動物またはヒト由来の産物を含まないことが好ましい既知組成培地）適切な培地で培養することが好ましい。適切な培地は、プロデューサー細胞に応じて当業者によって容易に選択され得る。そのような培地は市販されている。プロデューサー細胞は、感染前に、＋３０～＋３８℃（より好ましくは約＋℃３７℃）の温度で１～８日間培養することが好ましい。必要に応じて、細胞の総数を増やすために、１～８日の継代を数回行うことができる。
【0136】
ステップｂ）では、プロデューサー細胞の生産的な感染を可能にするために、適切な感染多重度（ＭＯＩ）を使用して、プロデューサー細胞を適切な条件下で腫瘍溶解性ウイルスに感染させる。説明のために、適切なＭＯＩは１０－３～２０の範囲であり、特に好ましいＭＯＩは、０．０１～５、より好ましくは０．０３～１を含む。感染ステップは、プロデューサー細胞の培養に使用される培地と同じであっても異なっていてもよい培地で実施される。
【0137】
次に、ステップｃ）では、感染したプロデューサー細胞を、子孫ウイルス粒子が産生されるまで、当業者に周知の適切な条件下で培養する。感染したプロデューサー細胞の培養はまた、好ましくは、プロデューサー細胞の培養および／または感染ステップに使用される培地／培地（複数）と同じまたは異なっていてもよい培地で、＋３２℃～＋３７℃の温度で１～５日間行われる。
【0138】
ステップｄ）では、ステップｃ）で生成されたウイルス粒子を、培養上清および／またはプロデューサー細胞から収集する。プロデューサー細胞からの回収には、プロデューサー細胞膜の破壊を可能にしてウイルスの遊離を可能にするステップが必要な場合がある。プロデューサー細胞膜の破壊は、凍結／解凍、低張溶解、超音波処理、マイクロフルイダイゼーション、高剪断（高速とも呼ばれる）均質化または高圧均質化を含むがこれらに限定されない、当業者に周知のさまざまな技術によって誘発することができる。
【0139】
回収された腫瘍溶解性ウイルスは、用量で分配され、本明細書に記載されるように使用される前に、少なくとも部分的に精製され得る。清澄化、酵素処理（例えば、エンドヌクレアーゼ、プロテアーゼなど）、クロマトグラフィーおよびろ過ステップを含む、膨大な数の精製ステップおよび方法が当技術分野で利用可能である。適切な方法が当技術分野で説明されている（例えば、ＷＯ２００７／１４７５２８、ＷＯ２００８／１３８５３３、ＷＯ２００９／１００５２１、ＷＯ２０１０／１３０７５３、ＷＯ２０１３／０２２７６４を参照されたい）。
【0140】
一実施形態では、本発明はまた、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスに感染した細胞を提供する。
【0141】
本発明はまた、上記の腫瘍溶解性ウイルスなどのウイルス、ならびに薬学的に許容される希釈剤、ビヒクルおよび／またはアジュバントを含む薬学的組成物を包含する。
【0142】
薬学的組成物は、いくつかの実施形態では、そのキメラ抗原Ｔ細胞受容体をコードする配列の一部として本明細書に記載の部分または完全な抗体配列を有するＣＡＲ－Ｔ細胞の形態であり得る。
【0143】
本発明はまた、上記のＣＡＲ－Ｔ細胞ならびに薬学的に許容される希釈剤、ビヒクルおよび／またはアジュバントを含む薬学的組成物を包含する。
【0144】
本発明はまた、抗体薬物コンジュゲート、融合タンパク質などの他の治療法、または薬物の「形状」、およびそのような治療法を含む薬学的組成物を含む。
【0145】
本明細書に記載の抗体分子、ヌクレオチド配列、プラスミド、ウイルス、細胞および／または薬学的組成物は、抗酸化剤、および／もしくはバッファー、および／もしくは静菌剤、および／もしくは、意図するレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質を含有し得る水性および／もしくは非水性滅菌注射溶液；ならびに／または懸濁剤および／もしくは増粘剤を含み得る水性および／もしくは非水性滅菌懸濁液を含み、非経口投与に好適であり得る。本明細書に記載の抗体分子、ヌクレオチド配列、プラスミド、細胞および／または薬学的組成物は、単位用量または複数用量容器、例えば、密封されたアンプルおよびバイアル内に存在させてもよく、使用直前に滅菌液体担体、例えば注射用水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存されてもよい。
【0146】
即時注射液および懸濁液剤は、前述の種類の滅菌散剤、および／または顆粒剤、および／または錠剤から調製され得る。
【0147】
ヒト患者への非経口投与では、抗ＣＴＬＡ－４抗体分子の１日投与量レベルは通常、患者の体重で１ｍｇ／ｋｇ～２０ｍｇ／ｋｇであり、あるいは場合によっては、最大１００ｍｇ／ｋｇを単回または分割用量で投与するであろう。特別な状況下、例えば長期投与と組み合わせて、より低い用量を使用してもよい。いずれにしても、医師は個々の患者に最も好適であろう実際の投与量を決定し、それは特定の患者の年齢、体重、および反応によって変動するであろう。上述の投与量は平均的な場合の例示である。当然ながら、より高いかまたはより低い投与量範囲が妥当である個々の症例があり得、それらも本発明の範囲内に含まれる。
【0148】
典型的には、抗体分子を含む本明細書に記載の薬学的組成物（または医薬）は、約２ｍｇ／ｍｌ～１５０ｍｇ／ｍｌまたは約２ｍｇ／ｍｌ～２００ｍｇ／ｍｌの濃度で抗ＣＴＬＡ－４抗体分子を含有するであろう。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、１０ｍｇ／ｍｌの濃度で抗ＣＴＬＡ－４抗体分子を含有するであろう。
【0149】
典型的には、薬学的組成物（または医薬）は、ウイルスおよび定量的技術に依存して約１０３～１０１２ｖｐ（ウイルス粒子）、ｉｕ（感染単位）またはＰＦＵ（プラーク形成単位）の濃度で、本明細書に記載の腫瘍溶解性ウイルスを含有する。試料中に存在するｐｆｕの量は、許容細胞（例えばＣＥＦまたはＶｅｒｏ細胞）の感染後のプラーク数を数えてプラーク形成単位（ｐｆｕ）の力価を取得することによって決定でき、ｖｐの量はＡ２６０吸光度を測定することによって決定でき、ｉｕの量は、例えば抗ウイルス抗体を使用する、定量的免疫蛍光法によって、決定できる。一般的なガイダンスとして、腫瘍溶解性ポックスウイルスを含む薬学的組成物に好適な個々の用量は、約１０３～約１０１０ｐｆｕ、有利には約１０３ｐｆｕ～約１０９ｐｆｕ、好ましくは約１０４ｐｆｕ～約１０８ｐｆｕ、より好ましくは約１０４ｐｆｕ～約１０７ｐｆｕの範囲である。
【0150】
一般に、ヒトでは、本明細書に記載の抗体分子、ヌクレオチド配列、プラスミド、ウイルス、細胞、および／または薬学的組成物の経口または非経口投与が好ましい経路であり、最も便利である。獣医学的使用のために、本明細書に記載の抗体分子、ヌクレオチド配列、プラスミド、ウイルス、細胞、および／または薬学的組成物は、通常の獣医学的診療に従って適宜許容される薬剤処方として投与され、獣医師は、ある特定の動物にとって最も適切であろう投与計画および投与経路を決定するであろう。したがって、本発明は、（上述および以下でさらに説明する）さまざまな状態を治療するのに有効な、本発明の抗体分子、ヌクレオチド配列、プラスミド、ウイルスおよび／または細胞の量を含む薬学的製剤を提供する。好ましくは、本明細書に記載の抗体分子、ヌクレオチド配列、プラスミド、ウイルス、細胞、および／または薬学的組成物は、静脈内、腫瘍内、筋肉内、皮下を含む群から選択される経路による送達に適合される。投与は、単回注射または複数回の反復注射の形態で行うことができる（例えば、同じまたは異なる用量で、同じまたは異なる経路で、同じまたは異なる投与部位で）。例示の目的のために、腫瘍溶解性ポックスウイルス（例えば、本明細書に記載のＴＫおよびＲＲ欠損ワクシニアウイルス）の約１０４、５×１０４、１０５、５×１０５、１０６、５×１０６、１０７、５×１０７、１０８、５×１０８、１０９、５×１０９または１０１０ｐｆｕを含む個々の用量が、腫瘍内投与に特に適している。
【0151】
本発明はまた、本発明のポリペプチド結合部分の薬学的に許容される酸または塩基付加塩を含む、本明細書に記載の抗体分子、ヌクレオチド配列、プラスミド、ウイルス、細胞および／または薬学的組成物を含む。本発明で有用な前述の塩基化合物の薬学的に許容可能な酸付加塩を調製するために使用される酸は、とりわけ、非毒性の酸付加塩、すなわち塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、重酒石酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、糖酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、およびパモエート［すなわち、１，１’－メチレン－ビス－（２－ヒドロキシ－３ナフトエート）］塩などの薬理学的に許容可能なアニオンを含有する塩を形成するものである。また、薬学的に許容される塩基付加塩を使用して、本発明による薬剤の薬学的に許容される塩の形態を生成してもよい。本質的に酸性である本薬剤の薬学的に許容される塩基塩を調製するための試薬として使用され得る化学塩基は、そのような化合物と非毒性塩基塩を形成するものである。そのような非毒性塩基塩には、これらに限定されないが、とりわけ、アルカリ金属カチオン（例えばカリウムおよびナトリウム）およびアルカリ土類金属カチオン（例えばカルシウムおよびマグネシウム）、アンモニウムまたは水溶性アミン付加塩、例えばＮ－メチルグルカミン－（メグルミン）、および低級アルカノールアンモニウム、ならびに他の薬学的に許容される有機アミンの塩基塩などのそのような薬理学的に許容されるカチオンに由来するものが挙げられる。本明細書に記載の抗体分子、ヌクレオチド配列、プラスミド、ウイルスおよび／または細胞は、保存のために凍結乾燥され、使用前に適切な担体中で元にもどすことができる。任意の好適な凍結乾燥法（例えば、噴霧乾燥、ケーキ乾燥）、および／または再構成技法を用いてもよい。凍結乾燥および再構成によって、抗体活性低下の程度の変動に至る場合があり（例えば、従来の免疫グロブリンでは、ＩｇＭ抗体はＩｇＧ抗体よりも活性が大きく低下する傾向を有する）、使用レベルを上方調節して補う必要があり得ることを当業者は理解するであろう。一実施形態では、凍結乾燥（フリーズドライ）ポリペプチド結合部分は、再水和されるとき、（凍結乾燥前の）その活性のうちの約２０％未満、または約２５％未満、または約３０％未満、または約３５％未満、または約４０％未満、または約４５％未満、または約５０％未満を損失する。
【0152】
いくつかの実施形態では、ウイルス組成物は、生理学的またはわずかに塩基性のｐＨ（例えば、約ｐＨ７～約ｐＨ９であり、７～８．５の間、より具体的には８に近いｐＨが特に好ましい）で適切に緩衝される。適切な浸透圧を確保するために、ウイルス組成物に一価の塩を含めることも有益である可能性がある。当該一価塩は、特に、ＮａＣｌおよびＫＣｌから選択することができ、好ましくは、当該一価塩は、好ましくは１０～５００ｍＭ（例えば、５０ｍＭ）の濃度のＮａＣｌである。適切なウイルス組成物は、サッカロース５０ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ ５０ｍＭ、トリス－ＨＣｌ １０ｍＭおよびグルタミン酸ナトリウム１０ｍＭ、ｐＨ８を含む。組成物はまた、低い保存温度で腫瘍溶解性ウイルスを保護するための凍結防止剤を含むように製剤化され得る。適切な凍結防止剤には、好ましくは０．５～２０％（ｗ／ｖとも称される、ｇによる重量／Ｌによる体積）の濃度でのスクロース（またはサッカロース）、トレハロース、マルトース、ラクトース、マンニトール、ソルビトール、およびグリセロールならびにデキストランもしくはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの高分子量ポリマーが含まれるが、これらに限定されない。
【0153】
本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ－４抗体分子、ヌクレオチド配列および薬学的組成物は、対象における癌の治療での使用に、使用することができる。
【0154】
対象は、哺乳類または非哺乳類である場合を含む。好ましくは、馬、または牛、または羊、または豚、またはラクダ、または犬、または猫などの哺乳類対象はヒトであるか、あるいは非哺乳類である。最も好ましくは、哺乳類対象はヒトである。
【0155】
「呈する」とは、対象が、癌症状および／もしくは癌診断マーカーを表すこと、ならびに／または癌症状および／もしくは癌診断マーカーを測定、および／または評価、および／または定量化できる場合を含む。
【0156】
医薬当業者であれば、癌症状および癌診断マーカーがどのようなものであるか、ならびに癌症状の重症度に低減または増加があるかどうか、または癌診断マーカーに低減もしくは増加があるかどうかを測定および／もしくは評価および／もしくは定量化する方法、ならびに癌症状および／もしくは癌診断マーカーを使用して、癌に関する予後診断を形成することができる方法は、容易に明らかであろう。
【0157】
癌治療は、多くの場合、一連の治療として投与される、すなわち治療剤は、ある期間にわたって投与される。一連の治療の時間的な長さは、他の理由のなかでもとりわけ、投与される治療剤のタイプ、治療される癌のタイプ、治療される癌の重篤度、ならびに対照の年齢および健康状態を含む多数の要因に依存する。
【0158】
「治療中」とは、対象が現在一連の治療を受けていること、および／または治療剤を受けていること、および／または一連の治療剤を受けていることを含む。
【0159】
いくつかの実施形態では、本発明に従って治療される癌は、固形腫瘍である。
【0160】
いくつかの実施形態では、癌は、進行性固形腫瘍、黒色腫および他の皮膚の悪性新生物、滑膜肉腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、膀胱癌、前立腺癌、中皮腫、卵巣癌、乳癌、腎細胞癌、肝細胞癌、頭頸部癌、結腸直腸癌からなる群から選択される。
【0161】
上述の癌のいずれもが公知であり、症状および癌診断マーカーは、それらの癌を治療するのに使用される治療剤であるため、十分に説明されている。したがって、上記の種類の癌を治療するために用いられる症状、癌診断マーカーおよび治療剤は、医薬当業者には既知であろう。
【0162】
大多数の癌の診断、予後診断、進行の臨床的定義は、ステージ分類として既知である、ある特定の分類による。それらのステージ分類システムは、多くの異なる癌診断マーカーおよび癌症状を照合して、癌の診断、および／または予後診断、および／または進行の概要を提供するように機能する。ステージ分類システムを使用して、癌の診断、および／または予後診断、および／または進行を評価する方法、ならびにそのためにどの癌診断マーカーおよび癌症状を使用すべきかということは、腫瘍学当業者には既知であろう。
【0163】
「癌のステージ分類」とは、ステージ０、ステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ、およびステージＩＶを含む、Ｒａｉステージ分類、ならびに／またはステージＡ、ステージＢ、およびステージＣを含むＢｉｎｅｔステージ分類、ならびに／またはステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ、およびステージＩＶを含む、Ａｎｎ Ａｒｂｏｕｒステージ分類が挙げられる。
【0164】
癌は、細胞の形態に異常を引き起こし得ることが既知である。これらの異常は、多くの場合、ある特定の癌で再現性よく生じ、これは形態におけるこれらの変化の検査（あるいは組織学的検査としても既知である）が、癌の診断または予後診断に使用することができることを意味する。細胞の形態を検査するために試料を視覚化し、視覚化用に試料を準備するための技法は、例えば、光学顕微鏡法または共焦点顕微鏡法など、当技術分野で公知である。
【0165】
「組織学的検査」とは、小さな成熟リンパ球の存在、および／または細胞質の境界が狭い小さな成熟リンパ球の存在、識別可能な核小体が欠如する密な核を有する小さな成熟リンパ球の存在、および／または細胞質の境界が狭く、識別可能な核小体が欠如する密な核を有する小さな成熟リンパ球の存在、および／または異型細胞、および／もしくは切断細胞、および／もしくは前リンパ球の存在が挙げられる。
【0166】
癌は、細胞のＤＮＡの変異の結果であり、これによって細胞の細胞死回避、または制御不能な増殖に至り得ることは公知である。したがって、これらの変異の検査（細胞遺伝学的検査としても既知である）は、癌の診断および／または予後診断を評価するための有用なツールであり得る。この例は、慢性リンパ球性白血病の特徴である染色体上の位置１３ｑ１４．１の欠失である。細胞内の変異を検査するための技法は、例えば、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）など、当技術分野で公知である。
【0167】
「細胞遺伝学的検査」とは、細胞内のＤＮＡ、具体的には染色体の検査を含む。細胞遺伝学的検査を使用して、難治性癌および／または再発した癌の存在に関連し得る、ＤＮＡの変化を同定することができる。そのようなものとしては、１３番染色体の長腕の欠失、および／または染色体位置１３ｑ１４．１の欠失、ならびに／または１２番染色体のトリソミー、および／または１２番染色体の長腕の欠失、ならびに／または１１番染色体の長腕の欠失、および／または１１ｑの欠失、ならびに／または６番染色体の長腕の欠失、および／または６ｑの欠失、ならびに／または１７番染色体の短腕の欠失、および／または１７ｐの欠失、ならびに／またはｔ（１１：１４）転座、ならびに／または（ｑ１３：ｑ３２）転座、ならびに／または抗原遺伝子受容体再配列、ならびに／またはＢＣＬ２再配列、ならびに／またはＢＣＬ６再配列、ならびに／またはｔ（１４：１８）転座、ならびに／またはｔ（１１：１４）転座、ならびに／または（ｑ１３：ｑ３２）転座、ならびに／または（３：ｖ）転座、ならびに／または（８：１４）転座、ならびに／または（８：ｖ）転座、ならびに／またはｔ（１１：１４）および（ｑ１３：ｑ３２）転座を挙げることができる。
【0168】
癌を有する対象は、ある特定の身体的症状を呈することが知られており、これは多くの場合、癌が身体に負担をかけている結果である。これらの症状は、多くの場合、同じ癌で再発するため、疾患の診断、および／または予後、および／または進行の特徴であり得る。医薬当業者であれば、どの身体症状がどの癌に関連しているか、ならびにそれらの身体系の評価が疾患の診断、および／または予後診断、および／または進行とどのように相関し得るかを理解するであろう。「身体的症状」としては、肝腫大および／または脾腫が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【0169】
以下の実施例では、次の図を参照している。
【0170】
【図1-1】本発明の抗体はＣＴＬＡ－４に特異的に結合する 抗体はＥＬＩＳＡにより、ヒトおよびカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｏｕｓ）のＣＴＬＡ－４に結合するが、ヒトＣＤ２８タンパク質には結合しないことが示された。２－Ｃ０６（図１Ａ）、４－Ｅ－０３（図１Ｂ）、５－Ｂ０７（図１Ｃ）の結合をＹｅｒｖｏｙ（図１Ｄ）と比較した。
【図1-2】同上。
【図2-1】抗ＣＴＬＡ－４ｍＡｂのｈＣＴＬＡ－４トランスフェクト細胞への用量依存的結合 抗ＣＴＬＡ－４ｍＡｂ（図２Ａ～２Ｄ）は、Ｙｅｒｖｏｙ（図２Ｅ）と同様にＣＴＬＡ－４を発現する２９３Ｔ細胞に強い結合を示す。
【図2-2】同上。
【図3】抗ＣＴＬＡ－４ｍＡｂはインビトロで活性化されたヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に結合する 末梢ヒト血液から得られたＣＤ４＋Ｔ細胞はインビトロで刺激された。抗ＣＴＬＡ－４ｍＡｂ（実線、上段）の結合をＦＡＣＳで分析し、Ｙｅｒｖｏｙ（点線、上段）および市販のＦＡＣＳ抗体（下段）と比較した。
【図4】インビトロで活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞の結合遮断 インビトロで活性化されたヒトＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ａｌｅｘａ６４７標識抗ＣＴＬＡ－４ｍＡｂで染色された（黒線）。抗体の結合はｒｈＣＴＬＡ－４－Ｆｃタンパク質によって遮断された（灰色線）。
【図5】インビトロで活性化されたカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）ＣＤ４＋Ｔ細胞への結合 末梢カニクイザル血から得られたＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズ（ｄｙｎａｂｅａｄｓ）によりインビトロで刺激された。抗ＣＴＬＡ－４ｍＡｂ（実線、上段）の結合をＦＡＣＳで分析し、Ｙｅｒｖｏｙ（点線、上段）および市販のＦＡＣＳ抗体（下段）と比較した。
【図6】ヒトおよびカニクイザルＣＴＬＡ－４タンパク質による細胞結合の遮断 ２９３Ｔ－ＣＴＬＡ－４細胞をＡｌｅｘａ６４７標識抗ＣＴＬＡ－４ｍＡｂで染色した（黒線）。抗体の結合はｒｈＣＴＬＡ－４－Ｆｃタンパク質（薄灰色線）およびｒｃｍＣＴＬＡ－４－Ｆｃタンパク質（濃灰色線）によって遮断された。
【図7】カニクイザルＣＴＬＡ－４を発現する２９３Ｔ細胞への結合 ２９３Ｔ細胞にカニクイザルＣＴＬＡ－４を一過性にトランスフェクトし、さまざまな濃度の抗ＣＴＬＡ－４ｍＡｂの結合をＦＡＣＳで分析した。
【図8】休止ヒト／カニクイザルＰＢＭＣへの結合の予想される欠如 ４－Ｅ０３ならびに２－Ｃ０６、５－Ｂ０７および２－Ｆ０９（データは表示しない）は、ＦＡＣＳで分析した場合、ヒト（上段）およびカニクイザル（下段）ＰＢＭＣの異なる細胞サブセットへの非特異的結合を示さない。
【図9-1】直接的なアゴニスト活性の予想される欠如 健康なドナーからのＣＦＳＥ標識ＣＤ４＋Ｔ細胞は、コーティングされた抗ＣＤ３と可溶性抗ＣＴＬＡ－４ｍＡｂまたは抗ＣＤ２８で刺激された。％分裂細胞（ＣＦＳＥｌｏｗ ＣＤ２５＋細胞）は、ＦＡＣＳによって３日後に決定された。（Ａ）１つの代表的な実験のＦＡＣＳプロット（Ｂ）６人のドナーのグラフを要約したもの。
【図9-2】同上。
【図11】インビトロでの機能的リガンド遮断 ＰＢＭＣを、ＳＥＢと増減調整用量（ｔｉｔｒａｔｉｎｇ ｄｏｓｅ）の抗ＣＴＬＡ－４抗体で刺激した。上清中分泌されたＩＬ－２の量はＭＳＤによって決定された。この図には、６人中１人の代表的なドナーが示されている。
【図12】インビトロ活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞のＡＤＣＣアッセイ １０μｇ／ｍｌの抗ＣＴＬＡ－４ｍＡｂで事前にオプソニン化された健康ドナーからのインビトロ活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞を、２：１の比でＮＫ細胞（ＮＫ－９２細胞株）と共培養した。ＡＤＣＣ活性を、以下に記載するようにＦＡＣＳによって評価した。この図は、４～８人のドナーの平均＋ＳＤを示している。
【図13】ＣＴＬＡ－４は腫瘍に存在するＴｒｅｇ細胞で最も多く発現している。 手術で切除したばかりの卵巣腫瘍、血液の試料を患者から入手した。腹水は、さまざまな癌の兆候を有する患者から収集された。この患者材料でのＣＴＬＡ発現を健康なＰＢＭＣと比較した。腫瘍試料を細かく刻み、消化した。遠心分離によって末梢血単核細胞を分離した。フローサイトメトリーによって、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７－Ｔｒｅｇ細胞、ＣＤ４＋非Ｔｒｅｇ細胞、およびＣＤ８＋エフェクターＴ細胞上でのＣＴＬＡ－４発現を評価した。データは、個々の患者／ドナーを表し、健康なＰＢＭＣではｎ＝１２、腹水ではｎ＝２０、腫瘍ではｎ＝９、および患者の血液ではｎ＝５である。 ＣＴＬＡ－４の発現は、インビボでＮＯＧマウスにおいて活性化され、これらのマウスの脾臓から単離されたヒトＴ細胞でも分析された（図１４を参照）。
【図14】抗ＣＴＬＡ－４ｍＡｂはインビボでＴｒｅｇの枯渇を媒介する。 ヒトＰＢＭＣをＮＯＧマウスに静脈内注射した。約２週間後、脾臓を採取し、ヒトＴｒｅｇ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞でのＣＴＬＡ－４の発現をＦＡＣＳで分析した。ＮＯＧマウスから単離された脾臓細胞を腹腔内でＳＣＩＤマウスに移植した。１時間後、マウスをＣＴＬＡ－４ｈＩｇＧ１または対照ｍＡｂで腹腔内処理した。腹腔内液を２４時間後に収集し、ヒトＴ細胞サブセット（１４Ａ：Ｔｒｅｇおよび１４Ｂ：ＣＤ８＋Ｔ細胞）の頻度をフローサイトメトリーで測定した。
【図15】抗ＣＴＬＡ－４抗体の特徴をまとめた表
【図16-1】図１６：マウス代理抗ＣＴＬＡ－４ｍＡｂの特性評価 図１６Ａ～Ｂ：リガンド遮断特性を評価するために、ｍ５－Ｂ０７を使用して遮断ＥＬＩＳＡを実行した。抗体は、図１６Ａ）ＣＤ８０および図１６Ｂ）ＣＤ８６のそのリガンドＣＴＬＡ－４への結合を用量依存的に遮断する。 図１６Ｃ～Ｄ：マウスＩｇＧ２ａフォーマット５－Ｂ０７はＣＴ２６腫瘍モデルにおけるＴｒｅｇ欠失を媒介した。Ｂａｌｂ／ｃマウスは、１×１０６ＣＴ２６細胞を皮下注射し、約７×７ｍｍの腫瘍サイズで処理を開始した。１０ｍｇ／ｋｇ抗体を３回注射した後、腫瘍単一細胞懸濁液をＦＡＣＳによって免疫細胞含有量について分析した。図１６Ｃ：リガンド遮断代理抗体５－Ｂ０７はＴｒｅｇの枯渇を引き起こす。これにより、図１６Ｄに示すように、ＣＤ８＋／ＴｒｅｇＴ細胞比がシフトする。
【図16-2】同上。
【図17】ＣＯＰＴＧ１９３８４とＣＯＰＴＧ１９３８５の生成 この研究で使用したＣＯＰＴＧ１９３８４およびＣＯＰＴＧ１９３８５の概略図。ＣＯＰＴＧ１９３８５は、ｐ７．５Ｋによって駆動される抗ＣＴＬＡ－４の重鎖に置き換えられたＴＫ遺伝子座のＪ２Ｒ遺伝子の欠失およびｐ７．５Ｋによって駆動される抗ＣＴＬＡ－４の軽鎖に置き換えられたＲＲ遺伝子座のＩ４Ｌ遺伝子の欠失を、含有する。ＣＯＰＴＧ１９３８４は、ｐ７．５Ｋによって駆動される抗ＣＴＬＡ－４の重鎖に置き換えられたＴＫ遺伝子座のＪ２Ｒ遺伝子の欠失ならびにｐ７．５Ｋによって駆動されおよびｐＳＥ／Ｌによって駆動されるＧＭ－ＣＳＦによって、抗ＣＴＬＡ－４の軽鎖に置き換えられたＲＲ遺伝子座のＩ４Ｌ遺伝子の欠失を、含有する。
【図18】ＣＯＰＴＧ１９３８４に感染したＣＥＦ細胞の上清中の４－Ｅ０３モノクローナル抗体の発現解析 Ａ）ウエスタンブロットによる：ＣＥＦ細胞をＭＯＩ０．０５でＣＯＰＴＧ１９３８４に三連で感染させた。４８時間後に細胞上清を回収し、非還元条件での電気泳動後、抗Ｉｇ（左ブロット）または抗軽鎖（右ブロット）ＨＲＰコンジュゲート抗体を使用してＷＢで分析した。 Ｂ）ＥＬＩＳＡによる：ＣＥＦ細胞をＭＯＩ０．０５でＣＯＰＴＧ１９３８４に三連で、またはＶＶＴＧ１７１３７に感染させた。４８時間後に細胞上清を回収し、４－Ｅ０３モノクローナル抗体のいずれかの検出のためＥＬＩＳＡによって分析した。
【図19】ＣＯＰＴＧ１９３８４に感染したＣＥＦ細胞の上清中のＧＭ－ＣＳＦのＥＬＩＳＡによる発現解析 ＣＥＦ細胞をＭＯＩ０．０５で、ＣＯＰＴＧ１９３８４一次研究ストックを三連で（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）またはＶＶＴＧ１７１３７で感染させた。細胞上清を４８時間後に回収し、ＧＭ－ＣＳＦの検出のためにＥＬＩＳＡによって分析した。
【図20-1】正常肝細胞と腫瘍肝細胞におけるＣＯＰ ＷＴ、ＣＯＰＴＧ１９３８４（２バッチ）、ＶＶＴＧ１７１３７（２バッチ）の複製研究 Ａ）正常なヒト肝細胞での複製率。 Ｂ）悪性ＨｅｐＧ２の複製率。 Ｃ）ＨｅｐＧ２および肝細胞で測定された複製率から計算された治療指数。
【図20-2】同上。
【図21】再構成ヒト皮膚におけるＣＯＰＴＧ１９３８４とＶＶＴＧ１７１３７の複製 ＣＯＰＴＧ１９３８４とＶＶＴＧ１７１３７の複製は、７日後に、１０～１０５ｐｆｕで変化させる接種量で評価した。結果は、３回の測定の平均とＳＥＭである。
【図22-1】ＭＩＡ ＰａＣａ－２（Ａ）、ＬｏＶｏ（Ｂ）、ＨｅｐＧ２（Ｃ）の３つのヒト腫瘍細胞株におけるＣＯＰＴＧ１９３８４およびＶＶＴＧ１７１３７の腫瘍溶解活性
【図22-2】同上。
【図23-1】（Ａ）感染ＨｅｐＧ２およびＬｏＶｏの上清ならびに（Ｂ）５つの異なる感染ヒト腫瘍細胞株の上清における、４－Ｅ０３モノクローナル抗体とＧＭ－ＣＳＦの両方の発現レベル Ａ）４－Ｅ０３およびＧＭ－ＣＳＦの発現レベルは、５日間のインキュベーション後、ＣＯＰＴＧ１９３８４では１０－５から１０－２のＭＯＩで、陰性対照として使用したＶＶＴＧ１７１３７では１０－２のＭＯＩで評価した。 Ｂ）４－Ｅ０３およびＧＭ－ＣＳＦの発現レベルは、感染の４８時間後にＭＯＩ０．０５でＣＯＰＴＧ１９３８４により評価した。
【図23-2】同上。
【図24】４－Ｅ０３の異なるバッチのＣＴＬＡ－４タンパク質への結合 ＣＨＯ（４－Ｅ０３研究バッチ）またはＨＥＫ（４－Ｅ０３ ｔｏｘバッチ）細胞によって組換え生産された４－Ｅ０３の（Ａ）ヒトおよび（Ｂ）カニクイザル組換えタンパク質への結合を、ＥＬＩＳＡにより、感染したＭＩＡ ＰａＣａ－２腫瘍細胞（４－Ｅ０３ＴＧ）の上清から精製された４－Ｅ０３の結合と比較した。
【図25】４－Ｅ０３の異なるバッチのＣＴＬＡ－４発現細胞への結合 ＣＨＯ（４－Ｅ０３研究バッチ）またはＨＥＫ（４－Ｅ０３ ｔｏｘバッチ）細胞によって組換え産生された４－Ｅ０３の（Ａ）ヒトおよび（Ｂ）カニクイザルＣＴＬＡ－４発現細胞への結合を、フローサイトメトリーにより、感染したＭＩＡ ＰａＣａ－２腫瘍細胞（４－Ｅ０３ＴＧ）の上清から精製された４－Ｅ０３の結合と比較した。
【図26】ＬｏＶｏ異種移植された腫瘍におけるウイルス蓄積の動態 ２つの異なる用量（１０４または１０５ｐｆｕ）でＣＯＰＴＧ１９３８４またはＶＶＴＧ１７１３７のいずれかの単回の腫瘍内注射後のＬｏＶｏの異種移植された腫瘍におけるウイルスの蓄積の動態を評価した。実線または破線は、各時点で決定された３つの値の中央値を表す。
【図27】ＬｏＶｏ異種移植された腫瘍における４－Ｅ０３ｍＡｂとＧＭ－ＣＳＦの蓄積の動態 Ａ）ＬｏＶｏ異種移植された腫瘍における４－Ｅ０３ｍＡｂ蓄積の動態を、２つの異なる用量（１０４または１０５ｐｆｕ）でのＣＯＰＴＧ１９３８４またはＶＶＴＧ１７１３７のいずれかの単回の腫瘍内注射後に、または３ｍｇ／ｋｇの４－Ｅ０３モノクローナル抗体の単回腹腔内注射後に評価した。実線または破線は、３つの値の中央値を表す。 Ｂ）ＬｏＶｏ異種移植された腫瘍におけるＧＭ－ＣＳＦの蓄積の動態を、２つの異なる用量（１０４または１０５ｐｆｕ）でのＣＯＰＴＧ１９３８４またはＶＶＴＧ１７１３７（１０５ｐｆｕ）のいずれかの単回の腫瘍内注射後に、評価した。実線は、各時点で決定された３つの値の中央値を表す。
【図28】ＬｏＶｏ異種移植されたマウスの血清中の４－Ｅ０３ｍＡｂおよびＧＭ－ＣＳＦ濃度の動態 Ａ）血清中の４－Ｅ０３ｍＡｂ濃度の動態は、２つの異なる用量（１０４または１０５ｐｆｕ）でのＣＯＰＴＧ１９３８４またはＶＶＴＧ１７１３７のいずれかのＬｏＶｏ異種移植された腫瘍への単回腫瘍内注射後に、または３ｍｇ／ｋｇの４－Ｅ０３モノクローナル抗体の単回腹腔内注射後に評価した。実線は、３つの値の中央値を表す。 Ｂ）２つの異なる用量（１０４または１０５ｐｆｕ）でのＣＯＰＴＧ１９３８４またはＶＶＴＧ１７１３７（１０５ＰＦＵ）のいずれかでのＬｏＶｏ異種移植された腫瘍への単回腫瘍内注射後の血清中のＧＭ－ＣＳＦ濃度の動態。破線は、各時点で決定された３つの値の中央値を表す。
【図29】ＣＴ２６腫瘍におけるウイルス蓄積の動態 ＶＶＴＧ１８０５８、ＣＯＰＴＧ１９４２１、またはＣＯＰＴＧ１９４０７のいずれかの、１０７ｐｆｕ／注射での３回の腫瘍内注射（Ｄ０、Ｄ２、およびＤ４）後のＣＴ２６腫瘍におけるウイルス蓄積の動態。
【図30A】ＣＴ２６腫瘍におけるｍ５－Ｂ０７ｍＡｂおよびｍＧＭ－ＣＳＦ蓄積の動態 Ａ）ＶＶＴＧ１８０５８、ＣＯＰＴＧ１９４２１、またはＣＯＰＴＧ１９４０７（１０７ｐｆｕ／注射）の３回の腫瘍内注射中および注射後、または３ｍｇ／ｋｇのｍ５－Ｂ０７モノクローナル抗体の１回の腹腔内注射後の、ＣＴ２６腫瘍におけるｍ５－Ｂ０７ｍＡｂ濃度の動態。実線は、３つの値の中央値を表す。
【図30B】Ｂ）ＶＶＴＧ１８０５８、ＣＯＰＴＧ１９４２１、またはＣＯＰＴＧ１９４０７（１０７ｐｆｕ／注射）の３回の腫瘍内注射中および注射後、または３ｍｇ／ｋｇのｍ５－Ｂ０７モノクローナル抗体の１回の腹腔内注射後の、ＣＴ２６腫瘍におけるｍＧＭ－ＣＳＦ濃度の動態。実線は、各時点で決定された３つの値の中央値を表す。
【図31】ＣＴ２６モデルの血清中のｍ５－Ｂ０７ｍＡｂ濃度の動態 ＶＶＴＧ１８０５８、ＣＯＰＴＧ１９４２１、またはＣＯＰＴＧ１９４０７のいずれかのＣＴ２６腫瘍への３回の腫瘍内注射後（１０７ｐｆｕ／注射）、または３ｍｇ／ｋｇのｍ５－Ｂ０７モノクローナル抗体の単回腹腔内注射後の、血清中のｍ５－Ｂ０７ｍＡｂ濃度の動態。実線は、各時点で決定された３つの値の中央値を表す。
【図32】ＣＴ２６モデルにおける抗腫瘍活性：ＣＴ２６腫瘍増殖（Ａ）およびマウス生存（Ｂ）に対するＣＯＰＴＧ１９３４７＋／－抗ＰＤ１の効果 ＣＴ２６細胞をＤ－７でＢａｌＢ／ｃマウスに皮下注射した。ＣＯＰＴＧ１９３４７（１０７ｐｆｕ）、ＶＶＴＧ１８０５８（１０７ｐｆｕ）、ＶＶＴＧ１８０５８またはバッファーをＤ０、Ｄ２、およびＤ４に腫瘍内注射し、続いて２５０μｇ／マウスの抗ＰＤ１ ＲＭＰＩ－１４をＤ７、Ｄ１０、Ｄ１４、Ｄ１７およびＤ２１に腹腔内注射した。
【図33】ＣＴ２６モデルにおける用量効果評価（ＣＯＰＴＧ１９４０７、ＣＯＰＴＧ１９４２１およびＶＶＴＧ１８０５８の処理後に観察された生存データの編集）
【図34-1】ＣＴ２６腫瘍モデルにおけるＶＶＴＧ１８０５８プラスｍ５－Ｂ０７と比較したＣＯＰＴＧ１９４０７の抗腫瘍活性 ＣＴ２６細胞をＢａｌＢ／ｃマウスに皮下注射した。腫瘍が約１００ｍｍ３に達したときにマウスの処理を開始した。マウスに、ＣＯＰＴＧ１９４０７（８．５×１０６ｐｆｕ腫瘍内）、ＶＶＴＧ１８０５８（８．５×１０６ｐｆｕ腫瘍内）、ｍ５－Ｂ０７（１０ｍｇ／ｋｇ腹腔内）、またはＶＶＴＧ１８０５８（８．５×１０６ｐｆｕ腫瘍内）とｍ５－Ｂ０７（１０ｍｇ／ｋｇ腹腔内）の組み合わせをＤ０、Ｄ２、およびＤ５に注射した。図３０Ａ～Ｄ：腫瘍増殖および図１６Ｅ：生存を経時的に追跡した。
【図34-2】同上。
【図34-3】同上。
【図35-1】皮下Ａ２０腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスの個々の腫瘍体積曲線。Ａ２０細胞をＢａｌＢ／ｃマウスに皮下注射した。腫瘍が８０～１００ｍｍ３に達したときにマウスの処理を開始した。マウスに、ビヒクル（腫瘍内）、ＣＯＰＴＧ１９４０７（４．７５×１０６ｐｆｕ腫瘍内）、ＶＶＴＧ１８０５８（４．７５×１０６ｐｆｕ腫瘍内）、ＲＭＰ１－１４（抗ｍＰＤ－１）（２５０μｇ／マウス腹腔内）またはＣＯＰＴＧ１９４０７（４．７５×１０６ｐｆｕ腫瘍内）とＲＭＰ１－１４（２５０μｇ／マウス腹腔内）の組み合わせをＤ０、Ｄ２、およびＤ４に注射した。 Ａ）ビヒクルで処理されたグループ１の動物 Ｂ）ＶＶＴＧ１８０５８で処理されたグループ２の動物 Ｃ）ＣＯＰＴＧ１９４０７で処理されたグループ３の動物 Ｄ）マウス抗ＰＤ１で処理されたグループ４の動物 Ｅ）ＣＯＰＴＧ１９４０７とマウス抗ＰＤ１で処理されたグループ５の動物
【図35-2】同上。
【図36】皮下Ａ２０腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃＮマウスの平均腫瘍体積曲線。 各点は、グループごとに記録された腫瘍体積の平均を表す。すべての動物の腫瘍体積を６４日間にわたって監視した。マウスを、ビヒクル（グループ１）、ＶＶＴＧ１８０５８（グループ２）、ＣＯＰＴＧ１９４０７（グループ３）、マウス抗ＰＤ１抗体ＲＭＰ１－１４（ＢｉｏＸＣｅｌｌ）（グループ４）およびＣＯＰＴＧ１９４０７とＲＭＰ１－１４（グループ５）で処理した。動物はＤ７で無作為化され、Ｄ７～Ｄ３１の期間中に処理された。最後マウスをＤ６１でと殺した。
【図37】Ａ２０モデルにおける抗腫瘍活性：Ａ２０腫瘍増殖（Ａ）およびマウス生存（Ｂ）に対するＣＯＰＴＧ１９４０７＋／－抗ＰＤ１の効果 Ａ２０細胞をＢａｌＢ／ｃマウスに皮下注射した。腫瘍が８０～１００ｍｍ３に達したときにマウスの処理を開始した。マウスを、ビヒクル（腫瘍内）（グループ１）、抗ＰＤ－１（グループ２）、アイソタイプ（グループ３）、ＶＶＴＧ１８０５８（１０５ｐｆｕ腫瘍内）（グループ４）、ＶＶＴＧ１８０５８（１０５ｐｆｕ腫瘍内）＋アイソタイプ（グループ５）、ＶＶＴＧ１８０５８（１０５ｐｆｕ腫瘍内）＋抗ＰＤ－１（グループ６）、ＶＶＴＧ１９４０７（１０５ｐｆｕ腫瘍内）（グループ７）、ＶＶＴＧ１９４０７（１０５ｐｆｕ腫瘍内）＋アイソタイプ（グループ８）およびＶＶＴＧ１９４０７（１０５ｐｆｕ腫瘍内）＋抗ＰＤ－１（グループ９）で処理した。
【図38-1】皮下Ｃ３８腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスの個々の腫瘍体積曲線。 Ｃ３８細胞をＣ５７ｂｌ／６マウスに皮下注射した。腫瘍が８０～１００ｍｍ３に達したときにマウスの処理を開始した。マウスに、ビヒクル（腫瘍内）、ＣＯＰＴＧ１９４０７（４．７５×１０６ｐｆｕ腫瘍内）、ＶＶＴＧ１８０５８（４．７５×１０６ｐｆｕ腫瘍内）、ＲＭＰ１－１４（抗ｍＰＤ－１）（２５０μｇ／マウス腹腔内）またはＣＯＰＴＧ１９４０７（４．７５×１０６ｐｆｕ腫瘍内）とＲＭＰ１－１４（２５０μｇ／マウス腹腔内）の組み合わせをＤ０、Ｄ２、およびＤ４に注射した。 Ａ）ビヒクルで処理されたグループ１の動物 Ｂ）ＶＶＴＧ１８０５８で処理されたグループ２の動物 Ｃ）ＣＯＰＴＧ１９４０７で処理されたグループ３の動物 Ｄ）マウス抗ＰＤ１で処理されたグループ４の動物 Ｅ）ＣＯＰＴＧ１９４０７とマウス抗ＰＤ１で処理されたグループ５の動物
【図38-2】同上。
【図39】皮下Ｃ３８腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスの平均腫瘍体積曲線。 各点は、グループごとに記録された腫瘍体積の平均を表す。すべての動物の腫瘍体積を６１日間にわたって監視した。マウスをビヒクル（グループ１）、ＶＶＴＧ１８０５８（グループ２）、ＣＯＰＴＧ１９４０７（グループ３）、マウス抗ＰＤ１抗体ＲＭＰ１－１４（ＢｉｏＸＣｅｌｌ）（グループ４）、およびＣＯＰＴＧ１９４０７とＲＭＰ１－１４（グループ５）で処理した。動物はＤ７で無作為化され、Ｄ７～Ｄ３１の期間中に処理された。最後マウスをＤ６１でと殺した。
【図40-1】皮下ＥＭＴ６腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスの個々の腫瘍体積曲線。 ＥＭＴ６細胞をＢａｌＢ／ｃマウスに皮下注射した。腫瘍が８０～１００ｍｍ３に達したときにマウスの処理を開始した。マウスに、ビヒクル（腫瘍内）、ＣＯＰＴＧ１９４０７（４．７５×１０６ｐｆｕ腫瘍内）、ＶＶＴＧ１８０５８（４．７５×１０６ｐｆｕ腫瘍内）、ＲＭＰ１－１４（抗ｍＰＤ－１）（２５０μｇ／マウス腹腔内）またはＣＯＰＴＧ１９４０７（４．７５×１０６ｐｆｕ腫瘍内）とＲＭＰ１－１４（２５０μｇ／マウス腹腔内）の組み合わせをＤ０、Ｄ２、およびＤ４に注射した。 Ａ）ビヒクルで処理されたグループ１の動物 Ｂ）ＶＶＴＧ１８０５８で処理されたグループ２の動物 Ｃ）ＣＯＰＴＧ１９４０７で処理されたグループ３の動物 Ｄ）マウス抗ＰＤ１で処理されたグループ４の動物 Ｅ）ＣＯＰＴＧ１９４０７とマウス抗ＰＤ１で処理されたグループ５の動物
【図40-2】同上。
【図40-3】同上。
【図41】皮下ＥＭＴ６腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスの平均腫瘍体積曲線。 各点は、グループごとに記録された腫瘍体積の平均を表す。すべての動物の腫瘍体積を６１日間にわたって監視した。マウスをビヒクル（グループ１）、ＶＶＴＧ１８０５８（グループ２）、ＣＯＰＴＧ１９４０７（グループ３）、マウス抗ＰＤ１抗体ＲＭＰ１－１４（ＢｉｏＸＣｅｌｌ）（グループ４）、およびＣＯＰＴＧ１９４０７とＲＭＰ１－１４（グループ５）で処理した。動物はＤ７で無作為化され、Ｄ７～Ｄ３１の期間中に処理された。最後マウスをＤ５６でと殺した。２０％以上のマウスが死亡した後、曲線を停止した。
【実施例0171】
ここで、本発明のいくつかの態様を具体的に示す、特定の非限定的な実施例を説明する。実施例では、ｒｈタンパク質は、ヒト組換えタンパク質を示し（例えばｒｈＩＬ－２は、ヒト組換えＩＬ－２タンパク質を示す）、ｒｃｍタンパク質は、カニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）組換えタンパク質を示す（例えばｒｃｍＣＴＬＡ４は、カニクイザル組換えＣＴＬＡ－４タンパク質を示す）。
【0172】
上記の配列に加えて、いくつかの追加の配列が実施例で使用されており、これらは以下の表５に設定される。
【表5】
【0173】
実施例１－ＣＴＬＡ－４特異的抗体の生成
ｓｃＦｖ抗体フラグメントの単離
ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）ｓｃＦｖライブラリ（ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ；Ｓｏｄｅｒｌｉｎｄ Ｅ，ｅｔ ａｌ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０００；１８（８）：８５２－６）を使用して、ヒトＣＴＬＡ－４を認識するｓｃＦｖ抗体フラグメントを単離した。
ｓｃＦｖ抗体フラグメントの単離
ｎ－ＣｏＤｅＲ（登録商標）ｓｃＦｖライブラリ（ＢｉｏＩｎｖｅｎｔ；Ｓｏｄｅｒｌｉｎｄ Ｅ，ｅｔ ａｌ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０００；１８（８）：８５２－６）を使用して、ヒトＣＴＬＡ－４を認識するｓｃＦｖ抗体フラグメントを単離した。
【0174】
ファージライブラリは、組換えヒトタンパク質に対する３回の連続パニングで使用された。ファージのインキュベーション後、細胞を洗浄して未結合のファージを除去した。結合ファージをトリプシンで溶出し、Ｅ．ｃｏｌｉで増幅した。得られたファージストックをｓｃＦｖフォーマットに変換した。Ｅ．ｃｏｌｉをｓｃＦｖ保有プラスミドで形質転換し、個々のｓｃＦｖクローンを発現させた。
【0175】
固有なＣＴＬＡ－４結合ｓｃＦｖの同定
３回目のパニングからの変換されたｓｃＦｖを、ホモジニアスＦＭＡＴ分析（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、ヒトＣＴＬＡ－４または非標的タンパク質を発現するトランスフェクトされた２９３ＦＴ細胞への結合についてアッセイした。
３回目のパニングからの変換されたｓｃＦｖを、ホモジニアスＦＭＡＴ分析（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、ヒトＣＴＬＡ－４または非標的タンパク質を発現するトランスフェクトされた２９３ＦＴ細胞への結合についてアッセイした。
【0176】
簡単に説明すると、トランスフェクトされた細胞を、発現プレートからのｓｃＦｖ含有上清（１：７に希釈）、マウス抗Ｈｉｓ Ｔａｇ抗体（０．４μｇ／ｍｌ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、およびＡＰＣコンジュゲートヤギ抗マウス抗体（０．２μｇ／ｍｌ、カタログ番号１１５－１３６－１４６、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）とともに透明底プレートに添加した。ＦＭＡＴプレートを室温（約２０～２５℃）で９時間インキュベートした後、読み取った。標的特異的細菌クローンを活性物質として分類し、ｃｈｅｒｒｙを９６ウェルプレートに採取した。
【0177】
ＥＬＩＳＡにおけるＣＴＬＡ－４へのＩｇＧの結合
９６ウェルプレート（Ｌｕｍｉｔｒａｃ ６００ ＬＩＡプレート、Ｇｒｅｉｎｅｒ）を、１ｐｍｏｌ／ウェルの組換えヒトＣＴＬＡ－４－Ｆｃタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１ｐｍｏｌ／ウェルのカニクイザル（ｃｍ）ＣＴＬＡ－４－Ｆｃタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、０．３ｐｍｏｌ／ウェルの組換えマウスＣＴＬＡ－４－Ｆｃタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１℃ｐｍｏｌ／ウェルの組換えヒトＣＤ２８－Ｆｃタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）または０．３ｐｍｏｌ／ウェルの組換えマウスＣＤ２８－Ｆｃタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で４で一晩コーティングした。洗浄後、０μｇ／ｍｌ～０．０６ｎｇ／ｍｌ（６６ｎＭ～０．３ｐＭ）の増減調整した用量（ｔｉｔｒａｔｅｄ ｄｏｓｅ）の抗ＣＴＬＡ－４ｍＡｂを１時間結合させた。次にプレートを再度洗浄し、結合した抗体を５０ｎｇ／ｍｌに希釈した抗ヒトＦ（ａｂ）－ＨＲＰ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で検出した。Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を基質として使用し、Ｔｅｃａｎ Ｕｌｔｒａ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒを使用してプレートを分析した。
９６ウェルプレート（Ｌｕｍｉｔｒａｃ ６００ ＬＩＡプレート、Ｇｒｅｉｎｅｒ）を、１ｐｍｏｌ／ウェルの組換えヒトＣＴＬＡ－４－Ｆｃタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１ｐｍｏｌ／ウェルのカニクイザル（ｃｍ）ＣＴＬＡ－４－Ｆｃタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、０．３ｐｍｏｌ／ウェルの組換えマウスＣＴＬＡ－４－Ｆｃタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、１℃ｐｍｏｌ／ウェルの組換えヒトＣＤ２８－Ｆｃタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）または０．３ｐｍｏｌ／ウェルの組換えマウスＣＤ２８－Ｆｃタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で４で一晩コーティングした。洗浄後、０μｇ／ｍｌ～０．０６ｎｇ／ｍｌ（６６ｎＭ～０．３ｐＭ）の増減調整した用量（ｔｉｔｒａｔｅｄ ｄｏｓｅ）の抗ＣＴＬＡ－４ｍＡｂを１時間結合させた。次にプレートを再度洗浄し、結合した抗体を５０ｎｇ／ｍｌに希釈した抗ヒトＦ（ａｂ）－ＨＲＰ二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で検出した。Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を基質として使用し、Ｔｅｃａｎ Ｕｌｔｒａ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒを使用してプレートを分析した。
【0178】
ＥＬＩＳＡでアッセイしたところ、すべての抗体はヒトおよびカニクイザルＣＴＬＡ－４タンパク質に結合するが、ヒトＣＤ２８タンパク質には結合しないことが示された。さらに、５－Ｂ０７はマウスＣＴＬＡ－４に結合するが、マウスＣＤ２８には結合しないことが示された（図１を参照）。
【0179】
フローサイトメトリーにおけるＣＴＬＡ－４発現２９３Ｔ細胞へのＩｇＧの結合
変換されたＩｇＧクローンを、ＣＴＬＡ－４発現２９３Ｔ細胞（Ｃｒｏｗｎｂｉｏから購入）への結合について分析した。細胞を異なる濃度（図２に示す）の抗ＣＴＬＡ－４ｍＡｂとともに４で２０分間インキュベートした後、洗浄し、ＡＰＣ標識ヤギ抗ヒト二次抗体（カタログ番号１０９－℃１３６－０８８、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で染色した。死細胞は、Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用する分析から除外された。ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）でデータ収集を実行し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）で分析した。
変換されたＩｇＧクローンを、ＣＴＬＡ－４発現２９３Ｔ細胞（Ｃｒｏｗｎｂｉｏから購入）への結合について分析した。細胞を異なる濃度（図２に示す）の抗ＣＴＬＡ－４ｍＡｂとともに４で２０分間インキュベートした後、洗浄し、ＡＰＣ標識ヤギ抗ヒト二次抗体（カタログ番号１０９－℃１３６－０８８、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で染色した。死細胞は、Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用する分析から除外された。ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）でデータ収集を実行し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）で分析した。
【0180】
抗ＣＴＬＡ－４ｍＡｂは、Ｙｅｒｖｏｙと同様のＥＣ５０値で、用量依存的にヒトＣＴＬＡ－４発現２９３Ｔ細胞に結合することが示された（図２）。
【0181】
ヒトＣＴＬＡ－４で安定的にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞、カニクイザルＣＴＬＡ－４で一過性にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞、ナイーブなヒトまたはカニクイザルＰＢＭＣ、インビトロで活性化されたヒトまたはｃｙｎｏ℃ＣＤ４＋Ｔ細胞を、示された濃度の抗ＣＴＬＡ－４ｍＡｂとともに４で２０分間インキュベートした後、洗浄し、ＡＰＣ標識抗ヒト二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で染色した。
【0182】
実施例２－抗ＣＴＬＡ－４ｍＡｂは、ヒトおよびカニクイザルのＣＴＬＡ－４発現（初代）細胞に特異的に結合する
ＣＴＬＡ－４特異的ｍＡｂは、初代ヒトおよびカニクイザルのインビトロ活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞に結合するが、健康なドナーから単離されたナイーブなＰＢＭＣには結合しない。
ＰＢＭＣをバフィーコートから単離した。簡単に説明すると、バフィーをＰＢＳで１：３に希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）クッションにロードした。試料を８００ｘｇで２０分間２０℃にて遠心分離した。上部の血漿含有相を除去し、血漿／フィコール相間の明確な白いバンドから単核細胞を単離した。
ＣＴＬＡ－４特異的ｍＡｂは、初代ヒトおよびカニクイザルのインビトロ活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞に結合するが、健康なドナーから単離されたナイーブなＰＢＭＣには結合しない。
ＰＢＭＣをバフィーコートから単離した。簡単に説明すると、バフィーをＰＢＳで１：３に希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）クッションにロードした。試料を８００ｘｇで２０分間２０℃にて遠心分離した。上部の血漿含有相を除去し、血漿／フィコール相間の明確な白いバンドから単核細胞を単離した。
【0183】
ヒト末梢ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＭＡＣＳ ＣＤ４Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用する陰性選択によって精製した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、Ｒ１０培地（２ｍＭグルタミン、１ｍＭピルビン酸塩、１００ＩＵ／ｍｌペニシリンおよびストレプトマイシンならびに１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ（Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＧＩＢＣＯ）中、ＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と５０ｎｇ／ｍｌ ｒｈＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で３日間インビトロで活性化させ、ＣＴＬＡ－４の発現を上方調節した。カニクイザルＣＤ４＋Ｔ細胞は、非ヒトＣＤ４マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して単離し、５０ｎｇ／ｍｌ ＰＭＡ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および１００ｎｇ／ｍｌイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と３日間インキュベートした。
【0184】
ナイーブなヒトまたはカニクイザルＰＢＭＣ、インビトロで活性化されたヒトまたはｃｙｎｏＣＤ４＋Ｔ細胞を、示された濃度の抗ＣＴＬＡ－４ｍＡｂとともに４℃で２０分間インキュベートした後、洗浄し、ＡＰＣ標識抗ヒト二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で染色した。抗ＣＴＬＡ－４ｍＡｂの結合を、ＢＤ ＦＡＣＳ Ｖｅｒｓｅを使用するＦＡＣＳによって分析した。
【0185】
抗体は、インビトロで活性化されたヒト（図３）およびカニクイザル（図５）のＣＤ４＋Ｔ細胞に結合するが、休止ＰＢＭＣには結合しないことが示された（図８）。内因的にＣＴＬＡ－４を発現するＴ細胞への結合は、Ｙｅｒｖｏｙによる染色（図３、上段、点線）、および陽性対照としての、市販のＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの抗ＣＴＬＡ－４ＦＡＣＳ抗体（クローンＢＮＩ３、図３、下段）よる染色と同様である。
【0186】
図４に示すように、ヒトインビトロで活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞（黒線）の染色は、ｒｈＣＴＬＡ－４－Ｆｃ（灰色線）によって完全に遮断され、抗体の特異性を示している。この競合結合アッセイでは、２μｇ／ｍｌのＡｌｅｘａ６４７標識抗ＣＴＬＡ－４ｍＡｂを組換えヒトＣＴＬＡ－４－Ｆｃタンパク質（５０μｇ／ｍｌ）と混合してから、ＣＴＬＡ－４発現細胞とインキュベーションした。ＩｇＧ結合はＦＡＣＳによって検出された。
【0187】
ヒトおよびカニクイザルＣＴＬＡ－４を発現するトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞は、試験された抗体のｃｙｎｏ交差反応性を確認する
抗体のｃｙｎｏ交差反応性は、トランスフェクトされたＣＴＬＡ－４発現２９３Ｔ細胞でさらに確認された。
抗体のｃｙｎｏ交差反応性は、トランスフェクトされたＣＴＬＡ－４発現２９３Ｔ細胞でさらに確認された。
【0188】
図６に示すように、ＣＴＬＡ－４特異的抗体のヒトＣＴＬＡ－４発現トランスフェクト細胞への結合は、ヒトおよびカニクイザル組換えタンパク質（どちらもＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）によって阻害される。抗体は、カニクイザルＣＴＬＡ－４を発現するトランスフェクト細胞に結合することも示された（図７、上段）。この結合は、カニクイザル組換えタンパク質によって再び遮断される（下段、灰色線）。
【0189】
実験は、図４に関連する実施例２で上述した競合アッセイと同様に実行された。
【0190】
予想される直接的なアゴニスト活性の欠如
予期しない直接的なアゴニスト活性（例えば、非特異的結合による）を除外するために、インビトロ増殖アッセイを実行した。
予期しない直接的なアゴニスト活性（例えば、非特異的結合による）を除外するために、インビトロ増殖アッセイを実行した。
【0191】
ヒト末梢血ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＭＡＣＳ ＣＤ４Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用する陰性選択により、健康なＰＢＭＣから精製され、その後ＣＦＳＥ（２μＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で標識された。抗体を、室温で１時間、ＩｇＧ：Ｆ（ａｂ’）２のモル比＝１．５：１で、Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγフラグメント特異性またはＦ（ａｂ’）２ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃγフラグメント特異性と架橋させた。１×１０５個の精製ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を、プレート結合した抗ＣＤ３（０．５μｇ／ｍｌ、クローンＵＣＨＴ１、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）および４μｇ／ｍｌの可溶性、架橋抗ＣＴＬＡ－４または架橋抗ＣＤ２８（クローンＣＤ２８．２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用いて３７℃で７２時間刺激した。細胞を洗浄し、ＢＶ４２１コンジュゲート抗ＣＤ２５抗体（クローンＭ－Ａ２５１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色した。ＣＤ２５＋／ＣＦＳＥｌｏｗ分裂細胞のパーセンテージをＦＡＣＳによって分析した。
【0192】
図９は、試験した抗ＣＴＬＡ－４ｍＡｂのいずれも、抗ＣＤ２８刺激とは対照的にＴ細胞増殖を誘導しないことを示している。
【0193】
実施例３－抗ＣＴＬＡ－４ｍＡｂはＣＤ８０／ＣＤ８６のリガンド結合を遮断する
リガンド遮断ＥＬＩＳＡ
抗ＣＴＬＡ－４ ＩｇＧのリガンド遮断活性を、ＥＬＩＳＡによって評価した。この目的のために、組換えヒトＣＴＬＡ－４－Ｆｃタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を１ｐｍｏｌ／ウェルで９６ウェルプレート（Ｌｕｍｉｔｒａｃ ６００ ＬＩＡプレート、Ｇｒｅｉｎｅｒ）にコーティングした。洗浄後、増減調整した用量の抗ＣＴＬＡ－４ｍＡｂを１時間結合させた。Ｈｉｓタグ付きリガンドをそれぞれ２００ｎＭおよび１００ｎＭで添加し（ｒｈＣＤ８０およびｒｈＣＤ８６、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、プレートをさらに１５分間インキュベートした。洗浄後、結合したリガンドをＨＲＰ標識抗Ｈｉｓ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で検出した。Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を基質として使用し、Ｔｅｃａｎ Ｕｌｔｒａ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒを使用してプレートを分析した。
リガンド遮断ＥＬＩＳＡ
抗ＣＴＬＡ－４ ＩｇＧのリガンド遮断活性を、ＥＬＩＳＡによって評価した。この目的のために、組換えヒトＣＴＬＡ－４－Ｆｃタンパク質（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を１ｐｍｏｌ／ウェルで９６ウェルプレート（Ｌｕｍｉｔｒａｃ ６００ ＬＩＡプレート、Ｇｒｅｉｎｅｒ）にコーティングした。洗浄後、増減調整した用量の抗ＣＴＬＡ－４ｍＡｂを１時間結合させた。Ｈｉｓタグ付きリガンドをそれぞれ２００ｎＭおよび１００ｎＭで添加し（ｒｈＣＤ８０およびｒｈＣＤ８６、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、プレートをさらに１５分間インキュベートした。洗浄後、結合したリガンドをＨＲＰ標識抗Ｈｉｓ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で検出した。Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を基質として使用し、Ｔｅｃａｎ Ｕｌｔｒａ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒを使用してプレートを分析した。
【0194】
図１０に示すように、試験した抗ＣＴＬＡ－４抗体は、Ｙｅｒｖｏｙと同様のリガンド遮断活性を示す。
【0195】
インビトロでの機能的リガンド遮断
ＳＥＢ ＰＢＭＣアッセイでは、健康なドナーからの全ＰＢＭＣを９６ウェルプレート（１×１０５細胞／ウェル）に播種し、増減調整した用量の抗－ＣＴＬＡ－４ ＩｇＧの存在下で、１μｇ／ｍｌのスタフィロコッカスエンテロトキシンＢ（ＳＥＢ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で刺激した。ＩＬ－２分泌を、３日目に製造業者の指示に従ってＭＳＤ（メソスケール）によって測定した。
ＳＥＢ ＰＢＭＣアッセイでは、健康なドナーからの全ＰＢＭＣを９６ウェルプレート（１×１０５細胞／ウェル）に播種し、増減調整した用量の抗－ＣＴＬＡ－４ ＩｇＧの存在下で、１μｇ／ｍｌのスタフィロコッカスエンテロトキシンＢ（ＳＥＢ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で刺激した。ＩＬ－２分泌を、３日目に製造業者の指示に従ってＭＳＤ（メソスケール）によって測定した。
【0196】
抗体４－Ｅ０３および２－Ｃ０６はＩＬ－２産生を増強することが示され、それらの効力はＹｅｒｖｏｙと同様であることが示された。図１１には、６人のうち１人の代表的なドナーが示されている。
【0197】
実施例４－抗ＣＴＬＡ－４ｍＡｂはインビトロおよびインビボでＣＴＬＡ－４発現細胞を枯渇させる
抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）
ＡＤＣＣアッセイは、ＣＤ１６－１５８Ｖ対立遺伝子をＧＦＰと一緒に発現するように安定的にトランスフェクトされたＮＫ－９２細胞株を使用して実行した（Ｃｏｎｋｗｅｓｔ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから購入；Ｂｉｎｙａｍｉｎ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ＮＫ ｃｅｌｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｓｅｌｆ－ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ａｎｔｉ－ｌｙｍｐｈｏｍａ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １８０，６３９２－６４０１）。ＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、健康なドナーの末梢血からＣＤ４＋標的Ｔ細胞を単離した。細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）および５０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で、３７℃で４８時間刺激した。標的細胞を０．１～１０μｇ／ｍｌのｍＡＢと、４℃で３０分間プレインキュベートし、その後ＮＫ細胞と混合した。細胞を、２：１のエフェクター：標的細胞比で、１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、および１０％のＦＢＳ低ＩｇＧを含有するＲＰＭＩ１６４０＋ＧｌｕｔａＭＡＸ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で４時間培養した。溶解は、フローサイトメトリーによって決定した。簡単に説明すると、インキュベーションの最後に、細胞懸濁液を、１０ｎＭのＳＹＴＯＸ Ｒｅｄ死細胞染色剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）とともに、ＢＶ５１０コンジュゲート抗ＣＤ４（クローンＲＰＡ－Ｔ４，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、４℃の暗所で２０分間染色し、次いで細胞をＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。
抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）
ＡＤＣＣアッセイは、ＣＤ１６－１５８Ｖ対立遺伝子をＧＦＰと一緒に発現するように安定的にトランスフェクトされたＮＫ－９２細胞株を使用して実行した（Ｃｏｎｋｗｅｓｔ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡから購入；Ｂｉｎｙａｍｉｎ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｂｌｏｃｋｉｎｇ ＮＫ ｃｅｌｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｓｅｌｆ－ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｉｎ ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ａｎｔｉ－ｌｙｍｐｈｏｍａ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １８０，６３９２－６４０１）。ＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、健康なドナーの末梢血からＣＤ４＋標的Ｔ細胞を単離した。細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）および５０ｎｇ／ｍｌのｒｈＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で、３７℃で４８時間刺激した。標的細胞を０．１～１０μｇ／ｍｌのｍＡＢと、４℃で３０分間プレインキュベートし、その後ＮＫ細胞と混合した。細胞を、２：１のエフェクター：標的細胞比で、１０ｍＭのＨＥＰＥＳバッファー、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、および１０％のＦＢＳ低ＩｇＧを含有するＲＰＭＩ１６４０＋ＧｌｕｔａＭＡＸ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で４時間培養した。溶解は、フローサイトメトリーによって決定した。簡単に説明すると、インキュベーションの最後に、細胞懸濁液を、１０ｎＭのＳＹＴＯＸ Ｒｅｄ死細胞染色剤（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＦｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）とともに、ＢＶ５１０コンジュゲート抗ＣＤ４（クローンＲＰＡ－Ｔ４，ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、４℃の暗所で２０分間染色し、次いで細胞をＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。
【0198】
４－Ｅ０３は、Ｙｅｒｖｏｙと比較して、インビトロでＣＴＬＡ－４＋Ｔ細胞の除去が有意に改善されたことを示した（図１２）。
【0199】
一次患者材料でのＣＴＬＡ－４発現
抗ＣＴＬＡ－４ｍＡｂの枯渇活性に関する上記の発見の翻訳可能性を検証するために、ＣＴＬＡ－４発現を一次患者材料で調べた。
抗ＣＴＬＡ－４ｍＡｂの枯渇活性に関する上記の発見の翻訳可能性を検証するために、ＣＴＬＡ－４発現を一次患者材料で調べた。
【0200】
臨床試料の使用に関する倫理的承認は、Ｓｋａｎｅ大学病院の倫理委員会から取得した。インフォームドコンセントは、ヘルシンキ宣言に従って提供した。試料は、ＬｕｎｄのＳｋａｎｅ大学病院の婦人科および腫瘍科を通じて入手した。単離した単一細胞懸濁液として腹水を評価した。腫瘍材料を小片に切断し、ＤＮａｓｅ Ｉ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）およびリベラーゼ（商標）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）とともにＲ１０で、３７℃で２０分間インキュベートした。残りの組織は、機械的に破壊し、細胞懸濁液と一緒に７０μｍのセルストレーナーを通過させた。腹水および腫瘍から単離した細胞を染色した。異なるＴ細胞サブセットを同定するために、以下の抗体を使用した：ＣＤ４－ＢＶ５１０（ＲＰＡ－Ｔ４）、ＣＤ２５－ＢＶ４２１（Ｍ－Ａ２５１）、抗ＣＤ１２７－ＦＩＴＣ（ＨＩＬ－７Ｒ－Ｍ２１）、ＣＴＬＡ－４－ＰＥ（ＢＮＩ３）、ＣＤ８－ＰｅＣｙ７（ＲＰＡ－Ｔ８）、ＣＤ３－ＡＰＣ（ＵＣＨＴ１）、ＣＤ４５－ＰｅｒｃＰ－Ｃｙ５．５（ＨＩ３０）、マウスＩｇＧ２ａアイソタイプ、κコントロール－ＰＥ（Ｇ１５５－１７８、すべてＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）。ＦＡＣＳＶｅｒｓｅを使用してデータ収集を実行し、ＦｌｏｗＪｏを使用してデータを分析した。
【0201】
図１３に示すように、ＣＴＬＡ－４は腫瘍内Ｔｒｅｇ細胞で最も発現が高く、ＣＴＬＡ－４特異的抗体を枯渇させるための優れた標的となる。
【0202】
ＰＢＭＣ－ＮＯＧ／ＳＣＩＤモデル
ＣＴＬＡ－４特異的抗体の枯渇活性に関するインビトロの所見を確認するために、インビボでのＰＢＭＣ－ＮＯＧ／ＳＣＩＤモデルにおける抗ＣＴＬＡ－４ｍＡｂの枯渇能力を分析した。このモデルは、確立したｈｕ－ＰＢＭＣ－ＮＯＧモデルに基づいており（Ｓｏｎｄｅｒｇａａｒｄ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３ Ｍａｙ；１７２（２）：３００－１０．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｃｅｉ．１２０５１、Ｃｏｘ Ｊ Ｈ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３ Ｄｅｃ ２３；８（１２）：ｅ８２９４４．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００８２９４４．ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ２０１３）、以下に説明するように社内で変更された。
ＣＴＬＡ－４特異的抗体の枯渇活性に関するインビトロの所見を確認するために、インビボでのＰＢＭＣ－ＮＯＧ／ＳＣＩＤモデルにおける抗ＣＴＬＡ－４ｍＡｂの枯渇能力を分析した。このモデルは、確立したｈｕ－ＰＢＭＣ－ＮＯＧモデルに基づいており（Ｓｏｎｄｅｒｇａａｒｄ Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３ Ｍａｙ；１７２（２）：３００－１０．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｃｅｉ．１２０５１、Ｃｏｘ Ｊ Ｈ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１３ Ｄｅｃ ２３；８（１２）：ｅ８２９４４．ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００８２９４４．ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ２０１３）、以下に説明するように社内で変更された。
【0203】
マウスは、ホームオフィスのガイドラインに従って、地元の施設で飼育および維持した。８週令の雌Ｃ．Ｂ．１７ｓｃｉｄ（Ｂｏｓｍａ ＧＣ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．１９８３ Ｆｅｂ １０；３０１（５９００）：５２７－３０）およびＮＯＧ（ＮＯＤ／Ｓｈｉ－ｓｃｉｄ／ＩＬ－２Ｒγｎｕｌｌ；Ｉｔｏ Ｍ ｅｔ ａｌ，２００２，ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γ
ｍｏｕｓｅ：ａｎ ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ １００（９）：３１７５－３１８２）マウスは、Ｔａｃｏｎｉｃ（Ｂｏｍｈｏｌｔ、Ｄｅｎｍａｒｋ）から供給され、地元の動物施設で飼育された。ＰＢＭＣ－ＮＯＧ／ＳＣＩＤ（初代ヒト異種移植）モデルの場合、ヒトＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ ＰＬＵＳを用いて単離し、洗浄した後、細胞を７５×１０６細胞／ｍｌで滅菌ＰＢＳに再懸濁した。ＮＯＧマウスに、１５×１０６細胞／マウスに相当する２００μｌの細胞懸濁液を静脈内注射した。注射の２週間後、脾臓を単離し、単一細胞懸濁液にした。その後、少量の試料を採取して、ＦＡＣＳによってヒトＴ細胞におけるＣＴＬＡ－４の発現を測定した。図１３に示すように、ＣＴＬＡ－４は、ヒト患者の状況を反映して、他のＴ細胞と比較してＴｒｅｇ細胞でより高く発現している。細胞の大部分は、５０×１０６細胞／ｍｌで滅菌ＰＢＳに再懸濁した。ＳＣＩＤマウスに、１０×１０６細胞／マウスに相当する２００μｌの懸濁液を腹腔内注射した。１時間後、マウスを１０ｍｇ／ｋｇの抗ＣＴＬＡ－４ｈＩｇＧ１、Ｙｅｒｖｏｙ、またはアイソタイプ対照ｍＡｂのいずれかで処理した。マウスの腹腔内液を２４時間後に収集した。ヒトＴ細胞サブセットは、以下のマーカー：ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、ＣＤ１２７（すべてＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を使用するＦＡＣＳによって同定および定量化された。
【化1】
【0204】
試験したすべての抗体は、Ｙｅｒｖｏｙと同等またはそれ以上のＴｒｅｇ枯渇活性を示した。ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞などの他のＴ細胞集団は影響を受けなかった（図１４）。
【0205】
実施例５－選択された代理抗体ｍ５－Ｂ０７は、４－Ｅ０３と同じ機能的特徴を示す
いくつかの例、特にインビボの例では、ｍＩｇＧ２ａフォーマットの抗体クローン５－Ｂ０７が使用されている（ｍ５－Ｂ０７としても示されている）。これは、本明細書に開示されるヒト抗体の代理抗体であるマウス抗体である。マウスＣＴＬＡ－４に結合し、それによってリガンド結合を遮断するため、代理抗体として選択されている（図１６Ａ～Ｂ）。さらに、Ｔｒｅｇ枯渇活性も示している（図１６Ｃ～Ｄ）。
いくつかの例、特にインビボの例では、ｍＩｇＧ２ａフォーマットの抗体クローン５－Ｂ０７が使用されている（ｍ５－Ｂ０７としても示されている）。これは、本明細書に開示されるヒト抗体の代理抗体であるマウス抗体である。マウスＣＴＬＡ－４に結合し、それによってリガンド結合を遮断するため、代理抗体として選択されている（図１６Ａ～Ｂ）。さらに、Ｔｒｅｇ枯渇活性も示している（図１６Ｃ～Ｄ）。
【0206】
リガンド遮断ＥＬＩＳＡ
５－Ｂ０７のリガンド遮断活性をＥＬＩＳＡで評価した。この目的のために、組換えマウスＣＴＬＡ－４－Ｆｃタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｏｃａｌ Ｉｎｃ．）を１ｐｍｏｌ／ウェルで９６ウェルプレート（Ｌｕｍｉｔｒａｃ ６００ ＬＩＡプレート、Ｇｒｅｉｎｅｒ）にコーティングした。洗浄後、増減調整した用量の抗ＣＴＬＡ－４ｍＡｂを１時間結合させた。Ｈｉｓタグ付きリガンドをそれぞれ２００ｎＭおよび１００ｎＭで添加し（ｒｍＣＤ８０およびｒｍＣＤ８６；Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．）、プレートをさらに１５分間インキュベートした。洗浄後、結合したリガンドをＨＲＰ標識抗Ｈｉｓ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で検出した。Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を基質として使用し、Ｔｅｃａｎ Ｕｌｔｒａ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒを使用してプレートを分析した。
５－Ｂ０７のリガンド遮断活性をＥＬＩＳＡで評価した。この目的のために、組換えマウスＣＴＬＡ－４－Ｆｃタンパク質（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｏｃａｌ Ｉｎｃ．）を１ｐｍｏｌ／ウェルで９６ウェルプレート（Ｌｕｍｉｔｒａｃ ６００ ＬＩＡプレート、Ｇｒｅｉｎｅｒ）にコーティングした。洗浄後、増減調整した用量の抗ＣＴＬＡ－４ｍＡｂを１時間結合させた。Ｈｉｓタグ付きリガンドをそれぞれ２００ｎＭおよび１００ｎＭで添加し（ｒｍＣＤ８０およびｒｍＣＤ８６；Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．）、プレートをさらに１５分間インキュベートした。洗浄後、結合したリガンドをＨＲＰ標識抗Ｈｉｓ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で検出した。Ｓｕｐｅｒ Ｓｉｇｎａｌ ＥＬＩＳＡ Ｐｉｃｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を基質として使用し、Ｔｅｃａｎ Ｕｌｔｒａ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒを使用してプレートを分析した。
【0207】
図１６に示すように、抗体は（Ａ）ＣＤ８０および（Ｂ）ＣＤ８６のリガンドＣＴＬＡ－４への結合を遮断する。
【0208】
インビボでのＴｒｅｇ枯渇活性
インビボでの腫瘍のＴ細胞サブセットに対するＣＴＬＡ－４特異的抗体の効果を、以下に記載するようにＣＴ２６腫瘍モデルで調査した。
インビボでの腫瘍のＴ細胞サブセットに対するＣＴＬＡ－４特異的抗体の効果を、以下に記載するようにＣＴ２６腫瘍モデルで調査した。
【0209】
マウスは、ホームオフィスのガイドラインに従って、地元の施設で飼育および維持した。６～８週齢のメスのＢａｌｂ／Ｃは、Ｔａｃｏｎｉｃ（Ｂｏｍｈｏｌｔ、Ｄｅｎｍａｒｋ）から供給され、地元の動物施設で飼育された。ＣＴ２６細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％ＦＣＳを添加したグルタマックス緩衝ＲＰＭＩで増殖させた。細胞が半コンフルエントになったとき、それらをトリプシンで剥離させ、１０×１０６細胞／ｍｌで滅菌ＰＢＳに再懸濁した。マウスに１×１０６細胞／マウスに相当する１００μｌの細胞懸濁液を皮下注射した。腫瘍が約７×７ｍｍに達したとき、図に示されるように、マウスを週２回腹腔内に１０ｍｇ／ｋｇの示された抗体で処理した。３回目の投与後、腫瘍を解剖し、機械的に小片に分割し、１００μｇ／ｍｌのリベラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）および１００μｇ／ｍｌのＤｎａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）の混合物を使用して、３７℃で２×５分間、ボルテックスを間にいれて消化した。次に、細胞懸濁液を、１０％ＦＢＳを含むＰＢＳで洗浄した（４００ｇで１０分間）。その後、細胞をＭＡＣＳバッファーに再懸濁し、ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ４、およびＣＤ２５（すべてＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を染色する抗体パネルで染色した。染色する前に、１００μｇ／ｍｌのＩＶＩＧを使用して非特異的結合について細胞を遮断した。ＦＡＣＳ Ｖｅｒｓｅ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して細胞を分析した。マウスＴｒｅｇ細胞は、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞として同定された。
【0210】
図１６Ｃに示すように、マウスＩｇＧ２ａフォーマットの５－Ｂ０７は、他のＣＴＬＡ－４特異的ｎ－ＣｏＤｅＲ抗体および十分に説明されている市販のクローン９Ｈ１０と比較して、Ｄ）増加したＣＤ８／Ｔｒｅｇ比に関連する腫瘍のＴｒｅｇ除去を媒介する。
【0211】
実施例６－抗ＣＴＬＡ４ｍＡｂ（ＣＯＰＴＧ１９３８５）または抗ＣＴＬＡ４ｍＡｂおよびＧＭ－ＣＳＦ（ＣＯＰＴＧ１９３８４）を発現するウイルスの生成、導入遺伝子の発現および遺伝的安定性の特性評価
ＣＯＰＴＧ１９３８４およびＣＯＰＴＧ１９３８５は、モノクローナル抗体抗ＣＴＬＡ４（４－Ｅ０３）をコードするワクシニアウイルス（コペンハーゲン株）である。ＣＯＰＴＧ１９３８４はさらにヒトＧＭ－ＣＳＦをコードする。より具体的には、ＣＯＰＴＧ１９３８４およびＣＯＰＴＧ１９３８５は、どちらもチミジンキナーゼ（ＴＫ、Ｊ２Ｒ遺伝子座）およびリボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＲ、Ｉ４Ｌ遺伝子座）の活性に欠陥がある。図１７に示すように、ｐ７．５Ｋプロモーター（配列番号５９）の制御下にある４－Ｅ０３重鎖（ＨＣ、配列番号５４）をコードする発現カセットはＪ２Ｒ遺伝子座に挿入され、ｐ７．５Ｋプロモーター配列番号５９）の制御下にある４－Ｅ０３ ＩｇＧの軽鎖（ＬＣ、配列番号５３）をコードする発現カセットはＩ４Ｌ遺伝子座に配置された。ＣＯＰＴＧ１９３８４の場合、ｐＳＥ／Ｌプロモーター（配列番号６１）の制御下にあるヒトＧＭ－ＣＳＦ（配列番号５６）をコードする発現カセットもＩ４Ｌ遺伝子座に配置された。
ＣＯＰＴＧ１９３８４およびＣＯＰＴＧ１９３８５は、モノクローナル抗体抗ＣＴＬＡ４（４－Ｅ０３）をコードするワクシニアウイルス（コペンハーゲン株）である。ＣＯＰＴＧ１９３８４はさらにヒトＧＭ－ＣＳＦをコードする。より具体的には、ＣＯＰＴＧ１９３８４およびＣＯＰＴＧ１９３８５は、どちらもチミジンキナーゼ（ＴＫ、Ｊ２Ｒ遺伝子座）およびリボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＲ、Ｉ４Ｌ遺伝子座）の活性に欠陥がある。図１７に示すように、ｐ７．５Ｋプロモーター（配列番号５９）の制御下にある４－Ｅ０３重鎖（ＨＣ、配列番号５４）をコードする発現カセットはＪ２Ｒ遺伝子座に挿入され、ｐ７．５Ｋプロモーター配列番号５９）の制御下にある４－Ｅ０３ ＩｇＧの軽鎖（ＬＣ、配列番号５３）をコードする発現カセットはＩ４Ｌ遺伝子座に配置された。ＣＯＰＴＧ１９３８４の場合、ｐＳＥ／Ｌプロモーター（配列番号６１）の制御下にあるヒトＧＭ－ＣＳＦ（配列番号５６）をコードする発現カセットもＩ４Ｌ遺伝子座に配置された。
【0212】
同じプロモーター（ｐ７．５Ｋ）を使用して、ＨＣおよびＬＣの発現を制御し、両方の鎖で同じレベルの発現を得て、したがって、ヘテロ四量体タンパク質としての抗体の最適な組み立てを取得した（すなわち、関連付けられていない鎖の過剰を回避するため）。ただし、抗体の両方の鎖に同じプロモーターがあると、それらを同じ遺伝子座に挿入することを妨げる（ＤＮＡ配列が同一であると、組換えのリスクが高まり、導入遺伝子が排除される）。したがって、４－Ｅ０３ＨＣをコードするカセットがＪ２Ｒ遺伝子座に挿入され、４－Ｅ０３ＬＣをコードするカセットがＩ４Ｌ遺伝子座に挿入された。ＧＭ－ＣＳＦ導入遺伝子をコードしているが、異なるプロモーター（ｐＳＥ／Ｌ）の下にあるカセットも、抗体軽鎖のようにＩ４Ｌ遺伝子座に挿入された。
【0213】
ＣＯＰＴＧ１９３８４の生成
ワクシニアウイルス転移プラスミドｐＴＧ１９３３９およびｐＴＧ１９３４１は、それぞれワクシニアウイルスゲノムのＪ２ＲおよびＩ４Ｌ遺伝子座での相同組換えによるヌクレオチド配列の挿入を可能にするように設計された。それらは、Ｊ２Ｒ（ｐＴＧ１９３３９）またはＩ４Ｌ（ｐＴＧ１９３４１）遺伝子座を取り巻く隣接配列（ＢＲＧおよびＢＲＤ）がクローン化されたプラスミドｐＵＣ１８に由来する。各プラスミドは、ｐ７．５Ｋプロモーターも含有している。
ワクシニアウイルス転移プラスミドｐＴＧ１９３３９およびｐＴＧ１９３４１は、それぞれワクシニアウイルスゲノムのＪ２ＲおよびＩ４Ｌ遺伝子座での相同組換えによるヌクレオチド配列の挿入を可能にするように設計された。それらは、Ｊ２Ｒ（ｐＴＧ１９３３９）またはＩ４Ｌ（ｐＴＧ１９３４１）遺伝子座を取り巻く隣接配列（ＢＲＧおよびＢＲＤ）がクローン化されたプラスミドｐＵＣ１８に由来する。各プラスミドは、ｐ７．５Ｋプロモーターも含有している。
【0214】
４－Ｅ０３抗体のＨＣ遺伝子を含有する１４３６ｂｐの「フラグメントＨＣ」という名前の合成フラグメントを作製した。４－Ｅ０３抗体のＬＣ遺伝子およびｐＳＥ／Ｌの制御下にあるｈＧＭ－ＣＳＦ遺伝子を含有するフラグメント「ＬＣフラグメント」を合成法により生成し、プラスミドベクターに挿入した。コード配列はヒトのコドン使用頻度に合わせて最適化され、ＡＴＧ開始コドンの前にコザック（Ｋｏｚａｋ）配列（ＡＣＣ）が追加され、終止コドンの後に転写ターミネーター（ＴＴＴＴＴＮＴ）が追加された。さらに、いくつかのパターンは除外された：ＴＴＴＴＴＮＴ、ＧＧＧＧＧ、ＣＣＣＣＣ、これらはポックスウイルスでの発現に有害である。
【0215】
ＨＣフラグメントは、相同組換えによってＰｖｕＩＩで制限されたｐＴＧ１９３３９に挿入され、ｐＴＧ１９３６７を生じさせた。ＬＣを運ぶプラスミドはＳｎａＢ１によって制限され、得られたフラグメント「ＬＣ－ＧＭＣＳＦ」は、ＰｖｕＩＩで制限されたｐＴＧ１９３４１に相同組換えによって挿入され、ｐＴＧ１９３８４を生じさせた。このプラスミドでは、発現カセットが組換えアームの間に頭から尾まで挿入され、ワクシニアウイルスゲノムのＩ４Ｌ遺伝子座での相同組換えを可能にした。
【0216】
ＣＯＰＴＧ１９３８４は、Ｉ４ＬおよびＪ２Ｒ遺伝子座への連続挿入のための２つの連続相同組換えによって、および親ウイルスとしてのＣＯＰＴＧ１９１５６と２つのトランスファープラスミドｐＴＧ１９３６７およびｐＴＧ１９３８４を使用することによって、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）で、生成された。ＣＥＦは、１２日齢の発育ＳＰＦ卵（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）から単離された。胚を機械的に引き裂き、Ｔｒｙｐｌｅ Ｓｅｌｅｃｔ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に可溶化し、５％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）および２ｍＭ Ｌ－グルタミンを添加したＭＢＥ（Ｅａｇｌｅ Ｂａｓｅｄ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｇｉｂｃｏ）で培養した。
【0217】
トランスファープラスミドと親ワクシニアウイルスとの間の相同組換えにより、ＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ発現カセットを失い、抗体およびＧＭ－ＣＳＦ発現カセットを獲得した組換えワクシニアウイルスの生成が可能になる。ＣＯＰＴＧ１９１５６には、Ｉ４Ｌ遺伝子座にｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子の発現カセットが含有され、Ｊ２Ｒ遺伝子座にＧＦＰ遺伝子の発現カセットが含有されている。トランスファープラスミドｐＴＧ１９３６７と親ＣＯＰＴＧ１９１５６の間の相同組換えにより、ＧＦＰ発現カセットを失い、４－Ｅ０３重鎖発現カセットを獲得した組換えワクシニアウイルスの生成が可能になり、赤色蛍光プラークの単離によって選択が行われた。この中間組換えウイルス（ＣＯＰＴＧ１９３６７）は、ｍＣｈｅｒｒｙ発現カセットを失い、４－Ｅ０３軽鎖とＧＭ－ＣＳＦ発現カセットを獲得した組換えワクシニアウイルスを生成するためのトランスファープラスミドとしてのｐＴＧ１９３８４との２回目の相同組換えの親ウイルスとして使用された。ＣＯＰＴＧ１９３８４（図１７）の選択を、白い非蛍光プラークを単離することによって実行した。
【0218】
ＣＯＰＴＧ１９３８４のウイルスストックを２つのＦ１７５フラスコ内のＣＥＦで増幅し、適切なウイルスストックを生成したが、これらのウイルスは分注して、使用するまで－８０℃で保存できる。ウイルスストックをＣＥＦ細胞で増減調整し、感染力価をｐｆｕ／ｍＬで表して、以下の式で計算した：溶解領域の数ｘ希釈係数ｘ４。説明のために、生成されたウイルスストックは６．８ｘ１０６ｐｆｕ／ｍＬで増減調整された。このストックをＰＣＲで分析し、適切なプライマーペアを使用して発現カセットと組換えアームの完全性を検証した。両方の発現カセットの配列決定により、ストックも分析した。配列決定結果のアラインメントは、理論的に予想される配列と１００％の相同性を示した。必要に応じて、ウイルス調製物を従来の技術を使用して精製した（例えばＷＯ２００７／１４７５２８に記載されているように）。
【0219】
ＣＯＰＴＧ１９３８５の生成
ワクシニアウイルス転移プラスミドｐＴＧ１９３３９およびｐＴＧ１９３４１は、それぞれワクシニアウイルスゲノムのＪ２ＲおよびＩ４Ｌ遺伝子座での相同組換えによるヌクレオチド配列の挿入を可能にするように設計された。それらは、Ｊ２Ｒ（ｐＴＧ１９３３９）またはＩ４Ｌ（ｐＴＧ１９３４１）遺伝子座を取り巻く隣接配列（ＢＲＧおよびＢＲＤ）がクローン化されたプラスミドｐＵＣ１８に由来する。各プラスミドは、ｐ７．５Ｋプロモーターも含有している。
ワクシニアウイルス転移プラスミドｐＴＧ１９３３９およびｐＴＧ１９３４１は、それぞれワクシニアウイルスゲノムのＪ２ＲおよびＩ４Ｌ遺伝子座での相同組換えによるヌクレオチド配列の挿入を可能にするように設計された。それらは、Ｊ２Ｒ（ｐＴＧ１９３３９）またはＩ４Ｌ（ｐＴＧ１９３４１）遺伝子座を取り巻く隣接配列（ＢＲＧおよびＢＲＤ）がクローン化されたプラスミドｐＵＣ１８に由来する。各プラスミドは、ｐ７．５Ｋプロモーターも含有している。
【0220】
４－Ｅ０３抗体のＨＣ遺伝子を含有する１４３６ｂｐの「フラグメントＨＣ」という名前の合成フラグメントを作製した。コード配列はヒトのコドン使用頻度に合わせて最適化され、ＡＴＧ開始コドンの前にコザック配列（ＡＣＣ）が追加され、停止コドンの後に転写ターミネーター（ＴＴＴＴＴＮＴ）が追加された。さらに、いくつかのパターンは除外された：ＴＴＴＴＴＮＴ、ＧＧＧＧＧ、ＣＣＣＣＣ、これらはポックスウイルスでの発現に有害である。
【0221】
ＨＣフラグメントは、相同組換えによってＰｖｕＩＩで制限されたｐＴＧ１９３３９に挿入され、ｐＴＧ１９３６７を生じさせた。
【0222】
４－Ｅ０３軽鎖のみをコードする発現カセットを含有するプラスミドは、プラスミドｐＴＧ１９３８４（上記）中のｐＳＥ／Ｌの制御下でｈＧＭ－ＣＳＦ遺伝子をコードするカセットを除去することにより得られた。ｐＴＧ１９３８４はＮｈｅＩおよびＸｂａＩ（互換性ある付着末端）で制限され、再結合されて（ｒｅｌｉｇａｔｅｄ）ｐＴＧ１９３８５が生成された。
【0223】
ＣＯＰＴＧ１９３８５は、Ｊ２ＲおよびＩ４Ｌ遺伝子座への連続挿入のための２つの連続相同組換えによって、および親ウイルスとしてのＣＯＰＴＧ１９１５６と２つのトランスファープラスミドｐＴＧ１９３６７およびｐＴＧ１９３８５を使用することによって、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）で、生成された。ＣＥＦは、１２日齢の発育ＳＰＦ卵（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）から単離された。胚を機械的に引き裂き、Ｔｒｙｐｌｅ Ｓｅｌｅｃｔ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に可溶化し、５％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）および２ｍＭ Ｌ－グルタミンを添加したＭＢＥ（Ｅａｇｌｅ Ｂａｓｅｄ Ｍｅｄｉｕｍ、Ｇｉｂｃｏ）で培養した。
【0224】
トランスファープラスミドと親ワクシニアウイルスとの間の相同組換えにより、ＧＦＰおよびｍＣｈｅｒｒｙ発現カセットを失い、抗体発現カセットを獲得した組換えワクシニアウイルスの生成が可能になる。ＣＯＰＴＧ１９１５６には、Ｉ４Ｌ遺伝子座にｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子の発現カセットが含有され、Ｊ２Ｒ遺伝子座にＧＦＰ遺伝子の発現カセットが含有されている。トランスファープラスミドｐＴＧ１９３６７と親ＣＯＰＴＧ１９１５６の間の相同組換えにより、ＧＦＰ発現カセットを失い、４－Ｅ０３重鎖発現カセットを獲得した組換えワクシニアウイルスの生成が可能になり、赤色蛍光プラークの単離によって選択が行われた。この中間組換えウイルス（ＣＯＰＴＧ１９３６７）は、ｍＣｈｅｒｒｙ発現カセットを失い、４－Ｅ０３軽鎖発現カセットを獲得した組換えワクシニアウイルスを生成するためのトランスファープラスミドとしてのｐＴＧ１９３８５との２回目の相同組換えの親ウイルスとして使用された。ＣＯＰＴＧ１９３８５の選択を、白い非蛍光プラークを単離することによって実行した。
【0225】
ＣＯＰＴＧ１９３８５のウイルスストックを２つのＦ１７５フラスコのＣＥＦで増幅して、適切なウイルスストックを生成したが、これらのウイルスストックは、分注して使用するまで－８０℃で保存できる。ウイルスストックをＣＥＦ細胞で増減調整し、感染力価をｐｆｕ／ｍＬで表して、以下の式で計算した：溶解領域の数ｘ希釈係数ｘ４。説明のために、生成されたウイルスストックは１．０４×１０７ｐｆｕ／ｍＬで増減調整された。このストックをＰＣＲで分析し、適切なプライマーペアを使用して発現カセットと組換えアームの完全性を検証した。両方の発現カセットの配列決定により、ストックも分析した。配列決定結果のアラインメントは、理論的に予想される配列と１００％の相同性を示した。必要に応じて、ウイルス調製物を従来の技術を使用して精製した（例えばＷＯ２００７／１４７５２８に記載されているように）。
【0226】
導入遺伝子の発現
４－Ｅ０３モノクローナル抗体のウイルス媒介発現はウエスタンブロット（ＷＢ）によってＣＯＰＴＧ１９３８４に感染したＣＥＦ細胞の上清で評価され、組換え産生抗体（４０ｎｇの４－Ｅ０３）と比較された。ＷＢを使用すると、ＣＴＬＡ４に結合しない非機能性分子（例えば、鎖の組み立てが不完全な分子、凝集体）の存在を視覚化できる。ＣＥＦ細胞は、ＭＯＩ０．０５でＣＯＰＴＧ１９３８４ウイルスストックに三連で感染させた。４８時間後に細胞上清を回収し、非還元条件での電気泳動後、抗Ｉｇ（左ブロット）または抗軽鎖（右ブロット）ＨＲＰコンジュゲート抗体を使用してＷＢで分析した。図１８Ａに示す結果は、感染したＣＥＦによって生成されたｍＡｂの非還元状態でのＷＢプロファイルが精製された４－Ｅ０３のプロファイルに近く、１００～１５０ｋＤａの同様の見かけのサイズであり、正しい鎖の折り畳みと組み立てを示している。
４－Ｅ０３モノクローナル抗体のウイルス媒介発現はウエスタンブロット（ＷＢ）によってＣＯＰＴＧ１９３８４に感染したＣＥＦ細胞の上清で評価され、組換え産生抗体（４０ｎｇの４－Ｅ０３）と比較された。ＷＢを使用すると、ＣＴＬＡ４に結合しない非機能性分子（例えば、鎖の組み立てが不完全な分子、凝集体）の存在を視覚化できる。ＣＥＦ細胞は、ＭＯＩ０．０５でＣＯＰＴＧ１９３８４ウイルスストックに三連で感染させた。４８時間後に細胞上清を回収し、非還元条件での電気泳動後、抗Ｉｇ（左ブロット）または抗軽鎖（右ブロット）ＨＲＰコンジュゲート抗体を使用してＷＢで分析した。図１８Ａに示す結果は、感染したＣＥＦによって生成されたｍＡｂの非還元状態でのＷＢプロファイルが精製された４－Ｅ０３のプロファイルに近く、１００～１５０ｋＤａの同様の見かけのサイズであり、正しい鎖の折り畳みと組み立てを示している。
【0227】
機能的に分泌された４－Ｅ０３抗体およびＧＭ－ＣＳＦの上清中の定量化をＥＬＩＳＡで行った。ＥＬＩＳＡは、細胞上清で産生された機能的ポリペプチドの量を定量的に測定することを可能にした。ＶＶＴＧ１７１３７を陰性対照として使用した。これは、自殺遺伝子ＦＣＵ１をコードするＪ２ＲおよびＩ４Ｌ遺伝子座で欠失させられたワクシニアウイルス（コペンハーゲン株）である（ＷＯ２００９／０６５５４６に記載）。
【0228】
４－Ｅ０３抗体を推定するために、マイクロプレートをウェルあたり１００μＬの、０．２５μｇ／ｍＬのＣＴＬＡ４－Ｆｃと４℃で一晩インキュベートすることにより、コーティングした。インキュベーション後、コーティング溶液を廃棄し、遮断溶液を加え、プレートを室温で１～２時間インキュベートした後、洗浄した。４－Ｅ０３キャリブレーション標準（０．０９７～１００ｎｇ／ｍＬ）、または遮断溶液で希釈した試料（３連で）をウェルに添加し、プレートを３７℃で２時間インキュベートした後、洗浄した。遮断溶液で希釈したＨＲＰコンジュゲート抗体を各ウェルに加え、プレートを３７℃で１時間インキュベートしてから洗浄した。暗所で室温で３０分間ＴＭＢ溶液とインキュベートした後、Ｈ２ＳＯ４ ２Ｍ（停止溶液）を添加して酵素反応を停止した。マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍの吸光度を読み取った。吸光度をキャリブレーション標準の抗体濃度に対してプロットした。図１８Ｂに示すように、機能的な４－Ｅ０３ｍＡｂは、ＣＯＰＴＧ１９３８４に感染した細胞で産生され、１μｇ／ｍＬに近い濃度に達した。
【0229】
Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ（登録商標）ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｒｅｆ ＳＧＭ００）を使用して、同じ上清でＧＭ－ＣＳＦのウイルス媒介発現も評価した。簡単に説明すると、このアッセイは２つの抗ｈＧＭ－ＣＳＦ抗体を使用している。試料中のｈＧＭ－ＣＳＦを捕捉するために使用された最初の抗体を、９６ウェルプレートのウェル表面にコーティングした。第２の抗体はコンジュゲートされ、溶液中のプレートに加えられて、捕捉されたｈＧＭ－ＣＳＦを検出する。次に、試料中のｈＧＭ－ＣＳＦの濃度は、キットによって提供されるいくつかの精製されたｈＧＭ－ＣＳＦで確立された検量線からの内挿によって計算される。図１９に示すように、ＧＭ－ＣＳＦの発現レベルは約６μｇ／ｍＬであった。
【0230】
結論として、１μｇ／ｍＬ以上の濃度が両方の導入遺伝子で検出され、満足のいくレベルの発現を示している。
【0231】
遺伝的安定性：
遺伝的安定性試験は、感染多重度（ＭＯＩ）が１０－４の無血清培地でＣＥＦ上でウイルスを５回継代した後に実行された。継代Ｐ５を希釈し、６０ｍｍ培養皿のＣＥＦ細胞に接種して、皿あたり２０～４０個のウイルスプラークを得た。１００個のウイルスプラークが単離され、継代培養された。１回の増幅サイクルの後、単離されたウイルスプラークをＣＥＦ細胞に接種し、ＰＣＲおよびＥＬＩＳＡによって試験した。ＰＣＲ分析と導入遺伝子の発現は、９０％以上のクローンが正しいプロファイルを持っていることを示した。製品の臨床開発の受け入れ基準は９０％以上の遺伝的安定性であるため、ＣＯＰＴＧ１９３８４は遺伝的に安定しているとみなされた。
遺伝的安定性試験は、感染多重度（ＭＯＩ）が１０－４の無血清培地でＣＥＦ上でウイルスを５回継代した後に実行された。継代Ｐ５を希釈し、６０ｍｍ培養皿のＣＥＦ細胞に接種して、皿あたり２０～４０個のウイルスプラークを得た。１００個のウイルスプラークが単離され、継代培養された。１回の増幅サイクルの後、単離されたウイルスプラークをＣＥＦ細胞に接種し、ＰＣＲおよびＥＬＩＳＡによって試験した。ＰＣＲ分析と導入遺伝子の発現は、９０％以上のクローンが正しいプロファイルを持っていることを示した。製品の臨床開発の受け入れ基準は９０％以上の遺伝的安定性であるため、ＣＯＰＴＧ１９３８４は遺伝的に安定しているとみなされた。
【0232】
実施例７－ＣＯＰＴＧ１９３８４のインビトロ特性評価
肝細胞における複製研究：抗ＣＴＬＡ４ｍＡｂおよびＧＭ－ＣＳＦを発現するウイルスの腫瘍選択性
ＣＯＰＴＧ１９３８４は、ヌクレオチド代謝に関与するウイルス酵素（ＴＫおよびＲＲ）をコードする２つの遺伝子欠失を持っている。機能している場合、これらの酵素は、ウイルスが休止状態の細胞を含むほとんどの細胞の細胞質で複製することを可能にする（すなわち、利用可能なヌクレオチドプールが少ない）。Ｊ２ＲおよびＩ４Ｌ遺伝子座への異なる導入遺伝子の挿入が宿主範囲の選択性を変更しないことを確認するために、宿主範囲の研究が初代および悪性細胞で実行された。ＣＯＰＴＧ１９３８４の複製は、正常な初代ヒト細胞（肝細胞、Ｂｉｏｐｒｅｄｉｃによって調製）および同じ臓器の腫瘍細胞（肝細胞癌由来のＨｅｐＧ２、ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＢ－８０６５（商標））で評価された。複製率と治療指数を計算し、非選択的ワクシニアウイルスの参照として野生型コペンハーゲンワクシニア（ＣＯＰ ＷＴ、欠失のないウイルス）と組換え二重欠失ＶＶＴＧ１７１３７ウイルス（Ｊ２Ｒの代わりに自殺ＦＣＵ１遺伝子が挿入されたＪ２ＲおよびＩ４Ｌ遺伝子が欠失させられた）の両方のそれらとそれぞれ比較した。研究バッチ（バッチ１）とＧＭＰ生成バッチ（バッチ２）の２つのバッチを分析した。複製率は、インキュベーション終了時の総感染粒子／最初の感染粒子（接種量）の比率として決定された。各ウイルスの治療指数は、ＨｅｐＧ２細胞での複製率／肝細胞での複製率の比率として決定された。比率が高いほど、腫瘍細胞に対するウイルスの選択性が高くなる。
肝細胞における複製研究：抗ＣＴＬＡ４ｍＡｂおよびＧＭ－ＣＳＦを発現するウイルスの腫瘍選択性
ＣＯＰＴＧ１９３８４は、ヌクレオチド代謝に関与するウイルス酵素（ＴＫおよびＲＲ）をコードする２つの遺伝子欠失を持っている。機能している場合、これらの酵素は、ウイルスが休止状態の細胞を含むほとんどの細胞の細胞質で複製することを可能にする（すなわち、利用可能なヌクレオチドプールが少ない）。Ｊ２ＲおよびＩ４Ｌ遺伝子座への異なる導入遺伝子の挿入が宿主範囲の選択性を変更しないことを確認するために、宿主範囲の研究が初代および悪性細胞で実行された。ＣＯＰＴＧ１９３８４の複製は、正常な初代ヒト細胞（肝細胞、Ｂｉｏｐｒｅｄｉｃによって調製）および同じ臓器の腫瘍細胞（肝細胞癌由来のＨｅｐＧ２、ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＢ－８０６５（商標））で評価された。複製率と治療指数を計算し、非選択的ワクシニアウイルスの参照として野生型コペンハーゲンワクシニア（ＣＯＰ ＷＴ、欠失のないウイルス）と組換え二重欠失ＶＶＴＧ１７１３７ウイルス（Ｊ２Ｒの代わりに自殺ＦＣＵ１遺伝子が挿入されたＪ２ＲおよびＩ４Ｌ遺伝子が欠失させられた）の両方のそれらとそれぞれ比較した。研究バッチ（バッチ１）とＧＭＰ生成バッチ（バッチ２）の２つのバッチを分析した。複製率は、インキュベーション終了時の総感染粒子／最初の感染粒子（接種量）の比率として決定された。各ウイルスの治療指数は、ＨｅｐＧ２細胞での複製率／肝細胞での複製率の比率として決定された。比率が高いほど、腫瘍細胞に対するウイルスの選択性が高くなる。
【0233】
初代肝細胞は、肝細胞培地用の１．６％添加剤を添加した肝細胞用基本培地（Ｂａｓａｌ Ｈｅｐａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｍｅｄｉｕｍ）で増殖させた。ＨｅｐＧ２細胞は、４Ｅ＋０５細胞／ウェルで１２ウェルプレートに播種し、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。感染前に培地を除去し、肝細胞用のＰＢＳまたはＨｅｐＧ２用のＦＣＳ補充ＰＢＳのいずれか中の７０ｐｆｕ／ウェルのウイルスを各ウェルに加えた。感染した細胞を３７℃、５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした後、１．５ｍＬ／ウェルの培地を添加した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で３日間インキュベートした後、－８０℃で保存した。次に、プレートを解凍し、ウェルを３０秒間４０％の振幅で超音波処理後、Ｖｅｒｏ細胞で力価測定した。
【0234】
正常なヒト肝細胞における複製率：
これらの初代細胞は、ドナーから直接定期的に入手できるため、正常なヒト細胞でのＣＯＰＴＧ１９３８４の能力を監視するために正常な肝細胞を選択した。これらの細胞では、ＣＯＰ ＷＴは５０，０００を超える複製率で良好に拡散した（図２０Ａ）。言い換えれば、最初の感染ウイルス粒子ごとに、約５０，０００個の新しいウイルスが生成された。２つの組換え二重欠失ウイルス（すなわち、ＶＶＴＧ１７１３７およびＣＯＰＴＧ１９３８４）の場合、この複製率は、ウイルスまたはウイルスのバッチに応じて５～１５に劇的に減少した（図２０Ａ）。この最後の結果は、２つの欠失によってもたらされる正常細胞への弱毒化された複製がＶＶＴＧ１７１３７とＣＯＰＴＧ１９３８４の間で保存されたことを示している。
これらの初代細胞は、ドナーから直接定期的に入手できるため、正常なヒト細胞でのＣＯＰＴＧ１９３８４の能力を監視するために正常な肝細胞を選択した。これらの細胞では、ＣＯＰ ＷＴは５０，０００を超える複製率で良好に拡散した（図２０Ａ）。言い換えれば、最初の感染ウイルス粒子ごとに、約５０，０００個の新しいウイルスが生成された。２つの組換え二重欠失ウイルス（すなわち、ＶＶＴＧ１７１３７およびＣＯＰＴＧ１９３８４）の場合、この複製率は、ウイルスまたはウイルスのバッチに応じて５～１５に劇的に減少した（図２０Ａ）。この最後の結果は、２つの欠失によってもたらされる正常細胞への弱毒化された複製がＶＶＴＧ１７１３７とＣＯＰＴＧ１９３８４の間で保存されたことを示している。
【0235】
腫瘍細胞ＨｅｐＧ２の複製率：
ＨｅｐＧ２細胞は、正常な肝細胞の悪性対応物であるため、腫瘍性ヒト細胞で複製するＣＯＰＴＧ１９３８４の能力を監視するために選択された。これらの細胞では、試験された５つのウイルスの複製率は非常に似ており、最初に試験されたウイルスが何であれ、約１００，０００の新しいウイルスに達した（図２０Ｂ）。したがって、ＶＶＴＧ１７１３７とＣＯＰＴＧ１９３８４の両方での二重欠失と導入遺伝子のベクター化は、悪性細胞で複製する能力を損なうことはなかった。
ＨｅｐＧ２細胞は、正常な肝細胞の悪性対応物であるため、腫瘍性ヒト細胞で複製するＣＯＰＴＧ１９３８４の能力を監視するために選択された。これらの細胞では、試験された５つのウイルスの複製率は非常に似ており、最初に試験されたウイルスが何であれ、約１００，０００の新しいウイルスに達した（図２０Ｂ）。したがって、ＶＶＴＧ１７１３７とＣＯＰＴＧ１９３８４の両方での二重欠失と導入遺伝子のベクター化は、悪性細胞で複製する能力を損なうことはなかった。
【0236】
治療指数：
図２０Ｃに示すように、計算された指数はＣＯＰ ＷＴに対して２つだけであり、腫瘍細胞と正常細胞に対するＣＯＰ ＷＴの選択性が低いことを示している。逆に、ＶＶＴＧ１７１３７とＣＯＰＴＧ１９３８４の両方（および試験されたウイルスの両方のロット）の場合、この指数は８．２Ｅ＋０３～１．８Ｅ＋０４で変化する。このことは、２つの組換えウイルスが腫瘍細胞と正常細胞に対して同じ良好な選択性を持っていることを確認する。
図２０Ｃに示すように、計算された指数はＣＯＰ ＷＴに対して２つだけであり、腫瘍細胞と正常細胞に対するＣＯＰ ＷＴの選択性が低いことを示している。逆に、ＶＶＴＧ１７１３７とＣＯＰＴＧ１９３８４の両方（および試験されたウイルスの両方のロット）の場合、この指数は８．２Ｅ＋０３～１．８Ｅ＋０４で変化する。このことは、２つの組換えウイルスが腫瘍細胞と正常細胞に対して同じ良好な選択性を持っていることを確認する。
【0237】
これらの結果は、ＣＯＰＴＧ１９３８４とＶＶＴＧ１７１３７が腫瘍細胞と健康な細胞の両方で非常に類似した複製特性を有することを示した。ＣＯＰ ＷＴと比較すると、腫瘍性Ｈｅｐ Ｇ２での複製は類似しているが、健康な肝細胞では非常に損なわれている。したがって、２つの遺伝子（Ｊ２ＲおよびＩ４Ｌ）の欠失は、欠失させられたウイルスの複製を、腫瘍細胞を含む増殖細胞（つまり、ヌクレオチドプールが高い）に制限する。導入遺伝子の発現と複製は密接に関連しているため、ＣＯＰＴＧ１９３８４は治療用タンパク質を腫瘍に選択的に送達するための効率的なベクターである。
【0238】
ＣＥＦおよびＬｏＶｏでの複製アッセイ：
ＣＯＰＴＧ１９３８４の複製は、１１日または１２日齢の特定病原体フリー卵（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒｓ）から単離されたＣＥＦ（プロデューサー細胞）および腫瘍性ヒト細胞株（ＬｏＶｏ、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２２９（商標））で評価された。ＣＥＦおよびＬｏＶｏ細胞は懸濁液で調製され、ＭＯＩがＣＥＦの場合は１０－３、およびＬｏＶｏの場合は１０－２で感染させた（細胞ごとおよび時点ごとに３つのウェル）。異なる時間のインキュベーションの後、Ｖｅｒｏ細胞（ＣＣＬ－８１（商標））でウイルス力価測定を行った。ＣＯＰＴＧ１９３８４複製は、ベンチマークとしてＶＶＴＧ１７１３７複製と比較された。結果は、ＣＯＰＴＧ１９３８４およびＶＶＴＧ１７１３７の複製がＣＥＦおよびＬｏＶｏの両方で類似していたことを示している（データは示さず）。
ＣＯＰＴＧ１９３８４の複製は、１１日または１２日齢の特定病原体フリー卵（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒｓ）から単離されたＣＥＦ（プロデューサー細胞）および腫瘍性ヒト細胞株（ＬｏＶｏ、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２２９（商標））で評価された。ＣＥＦおよびＬｏＶｏ細胞は懸濁液で調製され、ＭＯＩがＣＥＦの場合は１０－３、およびＬｏＶｏの場合は１０－２で感染させた（細胞ごとおよび時点ごとに３つのウェル）。異なる時間のインキュベーションの後、Ｖｅｒｏ細胞（ＣＣＬ－８１（商標））でウイルス力価測定を行った。ＣＯＰＴＧ１９３８４複製は、ベンチマークとしてＶＶＴＧ１７１３７複製と比較された。結果は、ＣＯＰＴＧ１９３８４およびＶＶＴＧ１７１３７の複製がＣＥＦおよびＬｏＶｏの両方で類似していたことを示している（データは示さず）。
【0239】
再構成ヒト皮膚での複製アッセイ：
ＣＯＰＴＧ１９３８４の複製は、再構成ヒト皮膚（Ｔ－Ｓｋｉｎ（商標）／ヒト全層皮膚モデル）でも評価された。（ＥＰＩＳＫＩＮ ＳＡ）から入手した３６個のＴ－Ｓｋｉｎ（商標）試料を６ウェルプレートで培養し、新鮮な培地で維持した。処理する最終濃度（すなわち、１０１～１０５ｐｆｕ／ウェル）を得るためにＶＶＴＧ１７１３７とＣＯＰＴＧ１９３８４を各ウェルに（三連で）分配した。ウイルスを含まない培地に対応する陰性対照も試験した（モック（Ｍｏｃｋ））。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で７日間インキュベートし、Ｔ－Ｓｋｉｎ（商標）試料を収集して２つに切断した。感染力価を、ウイルス力価測定にＶｅｒｏ細胞を使用して、２つのピースのうちの１つで決定した。図２１は、ＣＯＰＴＧ１９３８４がベンチマークＶＶＴＧ１７１３７と同程度に再構成皮膚で複製することを示し、ＧＭ－ＣＳＦと４－Ｅ０３ｍＡｂの両方のベクター化がヒトの再構成皮膚でのワクシニアウイルスの複製挙動を変更しなかったという事実を裏付けている。
ＣＯＰＴＧ１９３８４の複製は、再構成ヒト皮膚（Ｔ－Ｓｋｉｎ（商標）／ヒト全層皮膚モデル）でも評価された。（ＥＰＩＳＫＩＮ ＳＡ）から入手した３６個のＴ－Ｓｋｉｎ（商標）試料を６ウェルプレートで培養し、新鮮な培地で維持した。処理する最終濃度（すなわち、１０１～１０５ｐｆｕ／ウェル）を得るためにＶＶＴＧ１７１３７とＣＯＰＴＧ１９３８４を各ウェルに（三連で）分配した。ウイルスを含まない培地に対応する陰性対照も試験した（モック（Ｍｏｃｋ））。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で７日間インキュベートし、Ｔ－Ｓｋｉｎ（商標）試料を収集して２つに切断した。感染力価を、ウイルス力価測定にＶｅｒｏ細胞を使用して、２つのピースのうちの１つで決定した。図２１は、ＣＯＰＴＧ１９３８４がベンチマークＶＶＴＧ１７１３７と同程度に再構成皮膚で複製することを示し、ＧＭ－ＣＳＦと４－Ｅ０３ｍＡｂの両方のベクター化がヒトの再構成皮膚でのワクシニアウイルスの複製挙動を変更しなかったという事実を裏付けている。
【0240】
腫瘍溶解アッセイ
腫瘍溶解活性は、腫瘍細胞に対する試験されたウイルス試料の溶解活性の代表的なものである。それは異なる腫瘍細胞株：ヒト結腸直腸腺癌細胞株ＬｏＶｏ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２２９（商標））、ヒト膵臓腫瘍細胞株ＭＩＡ ＰａＣａ－２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－１４２０）およびヒト肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＢ－８０６５（商標））での５日間のインキュベーション後の細胞生存率の定量化によって評価された。ＣＯＰＴＧ１９３８４の腫瘍溶解活性を、ベンチマークとしてＶＶＴＧ１７１３７の腫瘍溶解活性と比較した。非感染細胞に対応する陰性対照もプレーティングした（モック感染細胞）。
腫瘍溶解活性は、腫瘍細胞に対する試験されたウイルス試料の溶解活性の代表的なものである。それは異なる腫瘍細胞株：ヒト結腸直腸腺癌細胞株ＬｏＶｏ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２２９（商標））、ヒト膵臓腫瘍細胞株ＭＩＡ ＰａＣａ－２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－１４２０）およびヒト肝細胞癌細胞株ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＢ－８０６５（商標））での５日間のインキュベーション後の細胞生存率の定量化によって評価された。ＣＯＰＴＧ１９３８４の腫瘍溶解活性を、ベンチマークとしてＶＶＴＧ１７１３７の腫瘍溶解活性と比較した。非感染細胞に対応する陰性対照もプレーティングした（モック感染細胞）。
【0241】
細胞を調製し、エッペンドルフチューブ（１．２×１０６細胞／チューブ）に分配してから、１０－５～１０－２のＭＯＩでウイルスに感染させ、３７℃で３０分間インキュベートした。適切な完全培地をエッペンドルフチューブに加え、この懸濁液のアリコートを、２ｍＬの適切な完全培地を含有する６ウェルプレートの各ウェルに（３連ずつ）加えた。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で５日間インキュベートし、細胞生存率をＶｉ－Ｃｅｌｌカウンターで測定した。結果を、モック感染細胞の細胞生存率のパーセンテージとして表した。４－Ｅ０３ｍＡｂおよびＧＭ－ＣＳＦの濃度を測定するために、細胞上清も回収した。図２２は、ＣＯＰＴＧ１９３８４およびＶＶＴＧ１７１３７の腫瘍溶解活性が、評価した３つの腫瘍細胞株で類似していることを示している。
【0242】
導入遺伝子の発現レベル
腫瘍崩壊活性測定（可変ＭＯＩでの感染の５日）後に回収されたＨｅｐＧ２およびＬｏＶｏ細胞の培養上清において、４－Ｅ０３モノクローナル抗体およびＧＭ－ＣＳＦの両方の発現レベルをＥＬＩＳＡ（実施例６に記載）によって測定した。
腫瘍崩壊活性測定（可変ＭＯＩでの感染の５日）後に回収されたＨｅｐＧ２およびＬｏＶｏ細胞の培養上清において、４－Ｅ０３モノクローナル抗体およびＧＭ－ＣＳＦの両方の発現レベルをＥＬＩＳＡ（実施例６に記載）によって測定した。
【0243】
４－Ｅ０３およびＧＭ－ＣＳＦの発現レベルを、それぞれ以下の条件で培養された５つの細胞株、ヒト胃癌細胞株Ｈｓ－７４６ Ｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－１３５（商標））、ヒト卵巣腫瘍細胞株ＳＫ－ＯＶ－３（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ－７７（商標））、ヒト膵臓腫瘍細胞株ＭＩＡ ＰａＣａ－２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－１４２０）、ヒト結腸直腸腺癌細胞株ＬｏＶｏ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２２９（商標））およびヒト結腸直腸癌細胞株ＨＣＴ１１６（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２４７（商標））の上清においてＥＬＩＳＡ（実施例６を参照）によって測定した。各細胞株を６ウェルプレート（１０６細胞／ウェル）で（３連ずつ）培養し、３７℃、５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした後、ＭＯＩ ０．０５で感染させた。次に、４－Ｅ０３ｍＡｂおよびＧＭ－ＣＳＦの濃度を決定するために、感染の４８時間後に細胞上清を回収した。予想通り、ＭＯＩ、感染後の時間、細胞株は、感染細胞の上清における導入遺伝子の発現レベルに影響を与える重要なパラメーターである。図２３Ａは、ＣＯＰＴＧ１９３８４に感染した場合、複製を許容する（ＨｅｐＧ２）および耐性を示す（ＬｏＶｏ）腫瘍細胞株が、培養上清中にほぼ同量の４－Ｅ０３ｍＡｂおよびＧＭ－ＣＳＦを産生できることを示している。ただし、ＨｅｐＧ２の最大発現は、ＬｏＶｏの１０分の１のＭＯＩで到達する。さらに、試験した５つの腫瘍細胞株では、導入遺伝子の発現は、４－Ｅ０３ｍＡｂおよびＧＭ－ＣＳＦでそれぞれ０．１および１μｇ／ｍＬを超えていた（図２３Ｂ）。４－Ｅ０３ｍＡｂの濃度を測定するために使用されるＥＬＩＳＡアッセイは、抗原ＣＴＬＡ４を使用して抗体を捕捉することに注意するべきである。言い換えれば、このアッセイによって測定された抗体は、少なくとも部分的に機能的である（すなわち、それらの抗原を認識し、抗体の他の機能は、Ｆｃ部分によって運ばれる）、
【0244】
４－Ｅ０３ｍＡｂの精製とグリコシル化プロファイル分析
感染細胞から４－Ｅ０３ｍＡｂのかなり大量に製造するために、約４．７ １０７Ｍｉａ－ＰＡＣＡ細胞／フラスコを含有する１５個のＦ１７５フラスコをＭＯＩ ０．０１でＣＯＰＴＧ１９３８４に感染させ、７２時間インキュベートした。ＭＩＡ Ｐａｃａ－２細胞培養上清（ＥＬＩＳＡで測定した場合、６７０μｇのｍＡｂ ４－Ｅ０３を含有する約４５０ｍＬ）を回収し、プールし、遠心分離によって清澄化して、ほとんどの細胞破片を除去した。清澄化した上清を０．２μｍフィルターでろ過し、２ｍＭ ＥＤＴＡ（推定金属プロテアーゼを阻害するため）および２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５（ｐＨを上げるため）を添加した。次に、ろ過した上清をｐｒｏｔＡ Ｈｉｔｒａｐカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、参照１７－５０７９－０１）に通した。カラムを移してＰｕｒｉｆｉｅｒＦＰＬＣ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に接続し、精製プログラム（ＴＨＭ／ＰｒｏｔＡ １ｍＬ注射ｌｏｏｐ ｆｒａｃ ｂｌｅｕ）を適用した。ｍＡｂを含む溶出画分を、ｍＡｂのジスルフィド結合を還元するかしないためにベータメルカプトエタノールを含有するか含有しないＬａｅｍｌｌｉバッファー（Ｂｉｏｒａｄ）を添加した後、４～１２％（Ｔｈｅｒｍｏ ＮＰ０３２３）のＮｕＰａｇｅＢｉｓ－Ｔｒｉｓゲルにロードした。ゲルはＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ、ＩＳＢ１Ｌ）で染色した。溶出のメインピークに対応する３つの画分をプールし、配合バッファーに対して透析した後、抗体濃度を２８０ｎｍでの吸光度によって決定した。精製ｍＡｂの最終濃度は０．２９ｍｇ／ｍＬであった。
感染細胞から４－Ｅ０３ｍＡｂのかなり大量に製造するために、約４．７ １０７Ｍｉａ－ＰＡＣＡ細胞／フラスコを含有する１５個のＦ１７５フラスコをＭＯＩ ０．０１でＣＯＰＴＧ１９３８４に感染させ、７２時間インキュベートした。ＭＩＡ Ｐａｃａ－２細胞培養上清（ＥＬＩＳＡで測定した場合、６７０μｇのｍＡｂ ４－Ｅ０３を含有する約４５０ｍＬ）を回収し、プールし、遠心分離によって清澄化して、ほとんどの細胞破片を除去した。清澄化した上清を０．２μｍフィルターでろ過し、２ｍＭ ＥＤＴＡ（推定金属プロテアーゼを阻害するため）および２０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ７．５（ｐＨを上げるため）を添加した。次に、ろ過した上清をｐｒｏｔＡ Ｈｉｔｒａｐカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、参照１７－５０７９－０１）に通した。カラムを移してＰｕｒｉｆｉｅｒＦＰＬＣ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に接続し、精製プログラム（ＴＨＭ／ＰｒｏｔＡ １ｍＬ注射ｌｏｏｐ ｆｒａｃ ｂｌｅｕ）を適用した。ｍＡｂを含む溶出画分を、ｍＡｂのジスルフィド結合を還元するかしないためにベータメルカプトエタノールを含有するか含有しないＬａｅｍｌｌｉバッファー（Ｂｉｏｒａｄ）を添加した後、４～１２％（Ｔｈｅｒｍｏ ＮＰ０３２３）のＮｕＰａｇｅＢｉｓ－Ｔｒｉｓゲルにロードした。ゲルはＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ、ＩＳＢ１Ｌ）で染色した。溶出のメインピークに対応する３つの画分をプールし、配合バッファーに対して透析した後、抗体濃度を２８０ｎｍでの吸光度によって決定した。精製ｍＡｂの最終濃度は０．２９ｍｇ／ｍＬであった。
【0245】
最初の特性評価は、還元および非還元条件での電気泳動による鎖組み立ての評価であった。非還元条件では、２つの軽鎖と２つの重鎖を組み立てて、天然の機能的な抗体を形成する。感染したＭＩＡ ＰａＣａ－２から精製された４－Ｅ０３と組換えによって生成された４－Ｅ０３は、還元条件と非還元条件の両方で区別できない電気泳動プロファイルを持っているように見えた。言い換えれば、感染したＭＩＡ ＰａＣａ－２から精製された４－Ｅ０３は、軽鎖と重鎖の予想される比率を持ち、２つの軽鎖と２つの重鎖のヘテロ四量体に正しく組み立てられる。このヘテロ四量体の存在は、質量分析によっても確認された。精製されたｍＡｂは、グリコシル化分析のために質量分析にかけられた。簡単に説明すると、ｍＡｂは、ヒンジでＩｇＧを特異的に切断する（Ｆ（ａｂ’）２およびＦｃ部分が生じる）ＩｄｅＳプロテアーゼで消化されたか、または消化されなかった。Ｎ－グリコシル化を有する抗体全体またはＦｃ部分の質量を決定し、各質量にＦｃの一次配列から計算された理論質量とグリコシル化パターンを適合させた。感染ＭＩＡ ＰａＣａ－２から精製した４－Ｅ０３ｍＡｂのグリコシル化プロファイルを、クリニックで使用されるヒトＩｇＧ１のベンチマークとして組換えにより生成および精製された４－Ｅ０３およびＭａｂＴｈｅｒａのプロファイルと比較した。結果は、感染したＭＩＡ ＰａＣａ２から生成された４－Ｅ０３のグリコシル化プロファイルが、Ｇ０Ｆの大部分（８８％）を持つ２つの抗体参照とは異なるグリコシル化プロファイルを有していたのに対し、組換え４－Ｅ０３とＭａｂＴｈｅｒａはどちらも典型的なＧ０Ｆ、Ｇ１ＦおよびＧ２Ｆ分布と同様のグリコシル化プロファイルを有していることを示している。ただし、ＭＩＡ ＰａＣａ－２は、ベータ－１，４－ガラクトシルトランスフェラーゼ１転写産物のレベルが低いため、精製された４－Ｅ０３ｍＡｂのＧ１ＦおよびＧ２Ｆ種が低い原因であると疑われ、これは、ＭＩＡ ＰａＣａ－２で発現した４－Ｅ０３のガラクトシル部分（したがってＧ１ｆおよびＧ２Ｆの欠失）の原因である可能性がある。
【0246】
ＣＥＦで生成されたＣＯＰＴＧ１９３８４の精製中に回収されたパーミエートからも、同じタイプの精製とそれに続く質量分析が実行された。結果は、感染したＣＥＦからの４－Ｅ０３のグリコシル化プロファイルが、ＭａｂＴｈｅｒａまたは組換え４－Ｅ０３のものと非常に類似していたことを示している。この最新の結果は、抗体のグリコシル化プロファイルが、感染自体よりも使用される細胞株によってより影響を受けることを示唆している。
【0247】
感染したＭＩＡ ＰａＣａ－２細胞（４－Ｅ０３ＴＧ）の上清から精製された４－Ｅ０３も、ＣＨＯ（研究バッチ）またはＨＥＫ（ｔｏｘバッチ）細胞によって組換え生産された４－Ｅ０３と同じ結合特性を呈する（図２４および２５）。これは、組換え（図２４Ａ）ヒトおよび（図２４Ｂ）カニクイザルＣＴＬＡ－４タンパク質への結合を試験するためのＥＬＩＳＡ（実施例１に記載）によって示された。（図２５Ａ）ヒトおよび（図２５Ｂ）カニクイザルＣＴＬＡ－４発現細胞への結合を試験したＦＡＣＳ分析（実施例１および２を参照）により、異なる４－Ｅ０３バッチに対して同様の交差反応性および結合親和性が確認された。
【0248】
ＧＭ－ＣＳＦのグリコシル化とジスルフィド結合のパターン
グリコシル化パターンといくつかのジスルフィド結合の存在を調査するために、異なるヒト腫瘍細胞株をＣＯＰＴＧ１９３８４に感染させ、それらの上清を同じＷＢ法で分析した。ＭＩＡ－Ｐａｃａ－２、ＬｏＶｏ、ＨｅｐＧ２およびＨＣＴ１１６細胞をＭＯＩ ０．０１で感染させ、血清を含まない培地で７２時間インキュベートした。培養上清を回収し、遠心分離により清澄化し、０．２μｍフィルターでろ過した。上清は分析まで－２０℃で保存した。それらは、８μｌのＲａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆ Ｂｕｆｆｅｒ ５Ｘを添加し、続いて７５℃で５分間インキュベートすることにより処理された。次に、１μＬのＰＮＧａｓｅ Ｆを添加し（糖タンパク質からＮ－グリカンを除去するため）、混合物を５０℃で３０分間インキュベートした。ウエスタンブロッティングに供する前に、ベータメルカプトエタノール（還元および非還元条件）を含むまたは含まない５μＬのＬａｅｍｍｌｉ ｂｕｆｆｅｒｘ４を添加することにより、２５μＬの試料を調製した。Ａｍｅｒｓｈａｍ ＥＣＬ Ｐｒｉｍｅウエスタンブロッティングを使用して免疫複合体を検出し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｅｒ ＣｈｅｍｉＤＯＣ ＸＲＳ（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して化学発光を記録した。
グリコシル化パターンといくつかのジスルフィド結合の存在を調査するために、異なるヒト腫瘍細胞株をＣＯＰＴＧ１９３８４に感染させ、それらの上清を同じＷＢ法で分析した。ＭＩＡ－Ｐａｃａ－２、ＬｏＶｏ、ＨｅｐＧ２およびＨＣＴ１１６細胞をＭＯＩ ０．０１で感染させ、血清を含まない培地で７２時間インキュベートした。培養上清を回収し、遠心分離により清澄化し、０．２μｍフィルターでろ過した。上清は分析まで－２０℃で保存した。それらは、８μｌのＲａｐｉｄ ＰＮＧａｓｅ Ｆ Ｂｕｆｆｅｒ ５Ｘを添加し、続いて７５℃で５分間インキュベートすることにより処理された。次に、１μＬのＰＮＧａｓｅ Ｆを添加し（糖タンパク質からＮ－グリカンを除去するため）、混合物を５０℃で３０分間インキュベートした。ウエスタンブロッティングに供する前に、ベータメルカプトエタノール（還元および非還元条件）を含むまたは含まない５μＬのＬａｅｍｍｌｉ ｂｕｆｆｅｒｘ４を添加することにより、２５μＬの試料を調製した。Ａｍｅｒｓｈａｍ ＥＣＬ Ｐｒｉｍｅウエスタンブロッティングを使用して免疫複合体を検出し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍａｇｅｒ ＣｈｅｍｉＤＯＣ ＸＲＳ（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して化学発光を記録した。
【0249】
感染したＨＣＴ１１６、ＬｏＶｏ、およびＭＩＡ ＰａＣａ－２からのＧＭ－ＣＳＦは同じパターンのグリコシル化を表したが、感染したＨｅｐＧ２によって生成されたＧＭ－ＣＳＦは非Ｎ－グリコシル化分子として移動した。これらの結果は、ＣＯＰＴＧ１９３８４に感染したヒト腫瘍細胞によって産生されたＧＭ－ＣＳＦが、予想される翻訳後修飾（すなわち、ジスルフィド結合およびＮ－グリコシル化）を有することを示している。ただし、これらの修飾は、感染に使用される腫瘍細胞株とそれらの特定の代謝状態によっておそらく異なる。
【0250】
実施例８：ＣＯＰＴＧ１９３８４の腫瘍内注射後の薬物動態
ＬｏＶｏ異種移植モデルにおけるワクシニアウイルスの腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射後の抗ＣＴＬＡ４抗体、ＧＭ－ＣＳＦおよびウイルスの腫瘍および血流における発現の動態。
プロトコル
５×１０６細胞のＬｏＶｏ細胞をスイスヌードマウス（Ｓｗｉｓｓ ｎｕｄｅ ｍｉｃｅ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ））の右側腹部に移植した。腫瘍体積が約１２０ｍｍ３に達した約２週間後、マウスを無作為化し、１５匹の動物からなる６グループに分けた。
●グループ１のマウスは、Ｄ０（処理初日）に１ｘ１０４ｐｆｕ／マウスの用量でＣＯＰＴＧ１９３８４の腫瘍内投与を受けた。
●グループ２のマウスは、Ｄ０に１ｘ１０５ｐｆｕ／マウスの用量でＣＯＰＴＧ１９３８４の腫瘍内投与を受けた。
●グループ３のマウスは、Ｄ０に１ｘ１０４ｐｆｕ／マウスの用量でＶＶＴＧ１７１３７の腫瘍内投与を受けた。
●グループ４のマウスは、Ｄ０に１ｘ１０５ｐｆｕ／マウスの用量でＶＶＴＧ１７１３７の腫瘍内投与を受けた。
●グループ５のマウスは、Ｄ０に３ｍｇ／ｋｇの用量で４－Ｅ０３の腹腔内（ｉ．ｐ．）投与を受けた。
●グループ６のマウスは、Ｄ０で３ｍｇ／ｋｇの用量でイピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ）の腹腔内投与を受けた。
ＬｏＶｏ異種移植モデルにおけるワクシニアウイルスの腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射後の抗ＣＴＬＡ４抗体、ＧＭ－ＣＳＦおよびウイルスの腫瘍および血流における発現の動態。
プロトコル
５×１０６細胞のＬｏＶｏ細胞をスイスヌードマウス（Ｓｗｉｓｓ ｎｕｄｅ ｍｉｃｅ（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ））の右側腹部に移植した。腫瘍体積が約１２０ｍｍ３に達した約２週間後、マウスを無作為化し、１５匹の動物からなる６グループに分けた。
●グループ１のマウスは、Ｄ０（処理初日）に１ｘ１０４ｐｆｕ／マウスの用量でＣＯＰＴＧ１９３８４の腫瘍内投与を受けた。
●グループ２のマウスは、Ｄ０に１ｘ１０５ｐｆｕ／マウスの用量でＣＯＰＴＧ１９３８４の腫瘍内投与を受けた。
●グループ３のマウスは、Ｄ０に１ｘ１０４ｐｆｕ／マウスの用量でＶＶＴＧ１７１３７の腫瘍内投与を受けた。
●グループ４のマウスは、Ｄ０に１ｘ１０５ｐｆｕ／マウスの用量でＶＶＴＧ１７１３７の腫瘍内投与を受けた。
●グループ５のマウスは、Ｄ０に３ｍｇ／ｋｇの用量で４－Ｅ０３の腹腔内（ｉ．ｐ．）投与を受けた。
●グループ６のマウスは、Ｄ０で３ｍｇ／ｋｇの用量でイピリムマブ（Ｙｅｒｖｏｙ）の腹腔内投与を受けた。
【0251】
３匹の動物からの腫瘍および血液を１、３、６、１０および２０日目に収集した。腫瘍は、即時処理のために加重および均質化された。ホモジナイズした腫瘍の４分の１をウイルス力価測定のために収集し、残りの懸濁液を遠心分離し、使用するまで上清を－２０℃で保存した。血液を２つの部分に分けた：１つは力価測定アッセイのためにヘパリンチューブ（２５ＩＵ／１００μＬの血液）に加え、分析まで－８０℃で凍結した。清澄化した血清を他の部分から生成し、使用するまで－２０℃で保存した。ウイルス力価は、Ｖｅｒｏ細胞での力価測定によって腫瘍および血液試料で決定された。
【0252】
ＬｏＶｏモデルにおけるウイルス複製の速度論：
ＣＯＰＴＧ１９３８４は、２つの用量（１×１０４または１×１０５ｐｆｕ）で１回注射されたＬｏＶｏモデルでは、ウイルス複製が監視され、同じ条件で注射したＶＶＴＧ１７１３７のものと比較された。図２６に表示された結果は、各時点で測定されたウイルス力価の３つの値の重要な分散を示している。とにかく、結果はまた、両方のウイルスおよび両方の用量で腫瘍内で複製し、注射後３日目から最大２０日まで腫瘍のかなり高い力価／ｇを維持することを示している。所与の時点で、２回のウイルス投与間または使用した２つのウイルス間でウイルス力価に明らかな違いはない。興味深いことに、１３ｐｆｕ／ｍＬしか検出されなかった１つの試料（ＶＶＴＧ１７１３７、１０日目で用量：１×１０７ｐｆｕ）を除いて、すべての血液試料がウイルス検出に対して陰性であった（データは示さず）。
ＣＯＰＴＧ１９３８４は、２つの用量（１×１０４または１×１０５ｐｆｕ）で１回注射されたＬｏＶｏモデルでは、ウイルス複製が監視され、同じ条件で注射したＶＶＴＧ１７１３７のものと比較された。図２６に表示された結果は、各時点で測定されたウイルス力価の３つの値の重要な分散を示している。とにかく、結果はまた、両方のウイルスおよび両方の用量で腫瘍内で複製し、注射後３日目から最大２０日まで腫瘍のかなり高い力価／ｇを維持することを示している。所与の時点で、２回のウイルス投与間または使用した２つのウイルス間でウイルス力価に明らかな違いはない。興味深いことに、１３ｐｆｕ／ｍＬしか検出されなかった１つの試料（ＶＶＴＧ１７１３７、１０日目で用量：１×１０７ｐｆｕ）を除いて、すべての血液試料がウイルス検出に対して陰性であった（データは示さず）。
【0253】
一緒にこれらの結果は、１×１０４または１×１０５ＰＦＵのいずれかの１回の腫瘍内注射後、ウイルスの複製は、ＬｏＶｏ腫瘍において少なくとも２０日間維持され、血流中にはほとんど検出されない存在であることを示している。ＬｏＶｏ異種移植モデルは、寛容なヒト腫瘍細胞と、免疫系が著しく損なわれ、したがって抗ウイルス活性が制限されているスイスヌードマウスを使用するため、ウイルス複製に非常に有利であることに注意する必要がある。
【0254】
ＬｏＶｏモデルにおける導入遺伝子発現の動態：
予想通り、腫瘍における導入遺伝子発現の動態は、４－Ｅ０３ｍＡｂに（図２７Ａ）およびＧＭ－ＣＳＦ（図２７Ｂ）の両方で６日目または１０日目に最大濃度（Ｃｍａｘ）でウイルス複製の動態に従った。４－Ｅ０３ｍＡｂ（またはイピリムマブ）の単回注射の場合、腫瘍および血液中のＣｍａｘが最初の時点（１日目）で観察され、その後測定されたｍＡｂの濃度は、マウスにおけるヒトＩｇＧ１の薬物動態と一致していた（図２８）。
予想通り、腫瘍における導入遺伝子発現の動態は、４－Ｅ０３ｍＡｂに（図２７Ａ）およびＧＭ－ＣＳＦ（図２７Ｂ）の両方で６日目または１０日目に最大濃度（Ｃｍａｘ）でウイルス複製の動態に従った。４－Ｅ０３ｍＡｂ（またはイピリムマブ）の単回注射の場合、腫瘍および血液中のＣｍａｘが最初の時点（１日目）で観察され、その後測定されたｍＡｂの濃度は、マウスにおけるヒトＩｇＧ１の薬物動態と一致していた（図２８）。
【0255】
さらに、Ｃｍａｘ以降（すなわち注射後６～１０から２０日）の腫瘍への４－Ｅ０３の濃度は、ＣＯＰＴＧ１９３８４処理後（両方の用量）、３ｍｇ／ｋｇの処理用量での４－Ｅ０３ｍＡｂの単回注射後よりも約１０倍高かった（図２７Ａ）。対照的に、ＣＯＰＴＧ１９３８４処理後のｍＡｂの血中濃度は、３ｍｇ／ｋｇの４－Ｅ０３の腹腔内注射後に測定された濃度よりも常に劣っていた（図２８Ａ）。この結果は、ｍＡｂのベクター化が、ｍＡｂの処理的投与で得られる血中濃度を超えたり、到達したりすることなく、腫瘍内に高濃度に到達できることを示している。
【0256】
ＣＯＰＴＧ１９３８４処理後のＧＭ－ＣＳＦの発現動態は、４－Ｅ０３で観察されたものに従う（図２７Ｂ）。興味深いことに、腫瘍で測定されたＧＭ－ＣＳＦのレベルは、同じ試料の４－Ｅ０３のレベルを下回っているが、ＣＯＰＴＧ１９３８４に感染したインビトロＬｏＶｏは、４－Ｅ０３の約２倍のＧＭ－ＣＳＦを発現する。ＧＭ－ＣＳＦの血中濃度も４－Ｅ０３のものと比較して非常に低かった（図２８Ｂ）。この結果は、ヒトＩｇＧ１の半減期と比較して非常に短いＧＭ－ＣＳＦのインビボ半減期と一致している。
【0257】
これらの結果は、ベクター化された抗体およびＧＭ－ＣＳＦが、最小限の全身曝露でＣＯＰＴＧ１９３８４を腫瘍内注射した後、主に腫瘍で発現されることを示している。これらの結果は、ベクター化が毒物学的（例えば抗ＣＴＬＡ４）または薬物動態（例えばＧＭ－ＣＳＦ）の問題を伴う導入遺伝子に特に適していることを確認する。
【0258】
ＣＴ２６同系モデルにおけるワクシニアウイルスの腫瘍内注射後の抗ＣＴＬＡ４抗体、ＧＭ－ＣＳＦおよびウイルスの腫瘍および血流における発現の動態
ＣＴ２６免疫適格性マウスモデルにおけるウイルス活性の評価には、マウスＧＭ－ＣＳＦの有無にかかわらず、マウス抗ｍＣＴＬＡ４をコードするいくつかの代理ウイルスの生成が必要である。
●ＣＯＰＴＧ１９４０７は、Ｊ２Ｒ遺伝子座のｐ７．５プロモーター下にマウスｍ５－Ｂ０７ ＩｇＧ２（配列番号６３）の重鎖をコードする発現カセットとＩ４Ｌ遺伝子座のｐ７．５プロモーター下にｍ５－Ｂ０７（配列番号６２）およびｐＳＥ／Ｌプロモーター下にマウスＧＭ－ＣＳＦ（配列番号５８）の軽鎖をコードする発現カセットを含有するワクシニアウイルス（コペンハーゲン株）である。
●ＣＯＰＴＧ１９４２１は、Ｊ２Ｒ遺伝子座のｐ７．５プロモーター下にｍ５－Ｂ０７重鎖をコードする発現カセットと、Ｉ４Ｌ遺伝子座のｐ７．５プロモーター下にｍ５－Ｂ０７の軽鎖をコードする発現カセットを含有するワクシニアウイルス（コペンハーゲン株）である。
●ベンチマークとして使用されているＶＶＴＧ１８０５８は、Ｊ２ＲおよびＩ４Ｌ遺伝子が欠失させられたワクシニアウイルス（コペンハーゲン株）であり、導入遺伝子（「空の」ウイルス）は含まれていない。
ＣＴ２６免疫適格性マウスモデルにおけるウイルス活性の評価には、マウスＧＭ－ＣＳＦの有無にかかわらず、マウス抗ｍＣＴＬＡ４をコードするいくつかの代理ウイルスの生成が必要である。
●ＣＯＰＴＧ１９４０７は、Ｊ２Ｒ遺伝子座のｐ７．５プロモーター下にマウスｍ５－Ｂ０７ ＩｇＧ２（配列番号６３）の重鎖をコードする発現カセットとＩ４Ｌ遺伝子座のｐ７．５プロモーター下にｍ５－Ｂ０７（配列番号６２）およびｐＳＥ／Ｌプロモーター下にマウスＧＭ－ＣＳＦ（配列番号５８）の軽鎖をコードする発現カセットを含有するワクシニアウイルス（コペンハーゲン株）である。
●ＣＯＰＴＧ１９４２１は、Ｊ２Ｒ遺伝子座のｐ７．５プロモーター下にｍ５－Ｂ０７重鎖をコードする発現カセットと、Ｉ４Ｌ遺伝子座のｐ７．５プロモーター下にｍ５－Ｂ０７の軽鎖をコードする発現カセットを含有するワクシニアウイルス（コペンハーゲン株）である。
●ベンチマークとして使用されているＶＶＴＧ１８０５８は、Ｊ２ＲおよびＩ４Ｌ遺伝子が欠失させられたワクシニアウイルス（コペンハーゲン株）であり、導入遺伝子（「空の」ウイルス）は含まれていない。
【0259】
これらのワクシニアウイルスは、実施例６に記載のプロセスに従って、Ｊ２Ｒ（ＴＫ）および次にＩ４Ｌ（ＲＲ）遺伝子座での２つの連続した相同組換えによって、ヒト対応物に関して生成された。ｍ５－Ｂ０７抗体およびｍＧＭ－ＣＳＦを定量化するためのＥＬＩＳＡ法は、マウスＣＴＬＡ４－Ｆｃ抗原を使用してマウス抗体を捕捉し、ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＥＬＩＳＡキットマウスＧＭ－ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してｍＧＭ－ＣＳＦを定量したことを除いて、上述したものと同様であった（実施例６、４－Ｅ０３およびＧＭ－ＣＳＦの「導入遺伝子の発現」）。これらのウイルスの腫瘍溶解活性は、さまざまな細胞株（１つの肉腫：ＭＣＡ２０５および２つの結腸癌ＣＴ２６およびＭＣ３８）でも評価され、ＶＶＴＧ１８０５８の腫瘍溶解活性と同様であり、ｍＧＭ－ＣＳＦの有無にかかわらずマウス抗体のベクター化がワクシニアウイルスの腫瘍溶解能力に影響を与えなかったことを示している（データは示していない）。
【0260】
プロトコル：ＣＴ２６細胞（２×１０５細胞）をＢａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）の右側腹部に移植した。腫瘍体積が２５～５０ｍｍ３に達した約１週間後、マウスを無作為化し、２０匹の動物からなる３つのグループ（グループ１～３）と１０匹からなる１つのグループ４に分けた。腫瘍と血液は、最初の３つのグループでは１、４、８、１０日目に、グループ４では１日目に収集されたことを除いて、ＬｏＶｏモデルで説明されているように収集および処理された。
●グループ１のマウスは、Ｄ０、Ｄ２、およびＤ４に１×１０７ｐｆｕ／マウスの用量でＶＶＴＧ１８０５８の腫瘍内投与を受けた。
●グループ２のマウスは、Ｄ０、Ｄ２、およびＤ４に１×１０７ｐｆｕ／マウスの用量でＣＯＰＴＧ１９４０７の腫瘍内投与を受けた。
●グループ３のマウスは、Ｄ０、Ｄ２、およびＤ４に１×１０７ｐｆｕ／マウスの用量でＣＯＰＴＧ１９４２１の腫瘍内投与を受けた。
●グループ４のマウスは、Ｄ０に３ｍｇ／ｋｇの用量でｍ５－Ｂ０７の腹腔内投与を受けた。
●グループ１のマウスは、Ｄ０、Ｄ２、およびＤ４に１×１０７ｐｆｕ／マウスの用量でＶＶＴＧ１８０５８の腫瘍内投与を受けた。
●グループ２のマウスは、Ｄ０、Ｄ２、およびＤ４に１×１０７ｐｆｕ／マウスの用量でＣＯＰＴＧ１９４０７の腫瘍内投与を受けた。
●グループ３のマウスは、Ｄ０、Ｄ２、およびＤ４に１×１０７ｐｆｕ／マウスの用量でＣＯＰＴＧ１９４２１の腫瘍内投与を受けた。
●グループ４のマウスは、Ｄ０に３ｍｇ／ｋｇの用量でｍ５－Ｂ０７の腹腔内投与を受けた。
【0261】
ＣＴ２６モデルにおけるウイルス複製の速度論：
２つの代理ウイルスが３回注射されたＣＴ２６モデル（１×１０７ｐｆｕ／注入）では、ウイルス複製が監視され、同じ条件で注射されたＶＶＴＧ１８０５８のものと比較された。図２９に表示された結果は、ＬｏＶｏモデルに関して、各時点で測定されたウイルス力価の３つの値の重要な分散を示している。ただし、３つのウイルスの力価は、時間にわたって最大１０日間まで維持され、少なくともこの時間枠では、２つの導入遺伝子がウイルスのクリアランスまたは複製に影響を与えなかったことを示している。いずれの血液試料でもウイルス感染性粒子は検出されなかった（データは示さず）。
２つの代理ウイルスが３回注射されたＣＴ２６モデル（１×１０７ｐｆｕ／注入）では、ウイルス複製が監視され、同じ条件で注射されたＶＶＴＧ１８０５８のものと比較された。図２９に表示された結果は、ＬｏＶｏモデルに関して、各時点で測定されたウイルス力価の３つの値の重要な分散を示している。ただし、３つのウイルスの力価は、時間にわたって最大１０日間まで維持され、少なくともこの時間枠では、２つの導入遺伝子がウイルスのクリアランスまたは複製に影響を与えなかったことを示している。いずれの血液試料でもウイルス感染性粒子は検出されなかった（データは示さず）。
【0262】
ＣＴ２６モデルにおける導入遺伝子発現の動態
ＬｏＶｏモデルと同様に、腫瘍への導入遺伝子の発現はウイルス複製を反映している。言い換えれば、ｍ５－Ｂ０７抗体（図３０Ａ）とｍＧＭ－ＣＳＦ（図３０Ｂ）は、監視の１０日間にわたってかなり一定のレベルで腫瘍で検出された。
ＬｏＶｏモデルと同様に、腫瘍への導入遺伝子の発現はウイルス複製を反映している。言い換えれば、ｍ５－Ｂ０７抗体（図３０Ａ）とｍＧＭ－ＣＳＦ（図３０Ｂ）は、監視の１０日間にわたってかなり一定のレベルで腫瘍で検出された。
【0263】
モノクローナル抗体の場合、ＣＯＰＴＧ１９４２１またはＣＯＰＴＧ１９４０７のいずれかの注射後に到達したＣｍａｘは、３ｍｇ／ｍＬのｍ５－Ｂ０７抗体の単回腹腔内注射で観察されたＣｍａｘよりも約１０倍低かった（図３０Ａ）。血清では、３ｍｇ／ｋｇのｍ５－Ｂ０７注射と比較して、ウイルス処理後のｍ５－Ｂ０７の循環濃度が約１００分の１になると、その差はさらに顕著になった（図３１）。
【0264】
ＧＭ－ＣＳＦの場合、ＣＯＰＴＧ１９４０７による治療のみが、ＣＴ２６腫瘍で測定可能な濃度のｍＧＭ－ＣＳＦをもたらし、測定されたサイトカインが内因性ではなく組換え由来であることを示している。ＬｏＶｏモデルと同様に、腫瘍で測定されたｍＧＭ－ＣＳＦ濃度は、ｍ５－Ｂ０７の濃度よりも低かった（図３０Ｂ）。さらに、腫瘍によって産生されたｍＧＭ－ＣＳＦは、おそらく全身蓄積を妨げる分子の短い半減期のために、どの血清試料でも検出できなかった。
【0265】
実施例９：抗腫瘍活性研究
ＣＯＰＴＧ１９３４７は、Ｊ２ＲおよびＩ４Ｌ遺伝子が欠失させられ、マウスＣＴＬＡ４抗原を認識するマウス抗体全体（すなわち、ｍ５－Ｂ０７、重鎖および軽鎖）をコードするワクシニアウイルス（コペンハーゲン株）である。ＣＯＰＴＧ１９４２１対ＣＯＰＴＧ１９３４７では、ｍ５－Ｂ０７の両方を発現したが、異なるプロモーター、すなわちそれぞれｐ７．５ＫとｐＨ５．Ｒ下で発現した。ｍ５－Ｂ０７の定量化は、ＭＯＩ １０－１の感染ＣＴ２６では約１μｇ／ｍＬ、ＭＯＩ １０－２の感染ＭＣＡ２０５細胞では約４μｇ／ｍＬに達する感染細胞の上清で評価された。ＣＴ２６と比較したＭＣＡ２０５でのより高い発現は、ＣＯＰＴＧ１９４０７に感染した細胞の培養上清中のｍＧＭ－ＣＳＦでも観察された（データは示さず）。
ＣＯＰＴＧ１９３４７は、Ｊ２ＲおよびＩ４Ｌ遺伝子が欠失させられ、マウスＣＴＬＡ４抗原を認識するマウス抗体全体（すなわち、ｍ５－Ｂ０７、重鎖および軽鎖）をコードするワクシニアウイルス（コペンハーゲン株）である。ＣＯＰＴＧ１９４２１対ＣＯＰＴＧ１９３４７では、ｍ５－Ｂ０７の両方を発現したが、異なるプロモーター、すなわちそれぞれｐ７．５ＫとｐＨ５．Ｒ下で発現した。ｍ５－Ｂ０７の定量化は、ＭＯＩ １０－１の感染ＣＴ２６では約１μｇ／ｍＬ、ＭＯＩ １０－２の感染ＭＣＡ２０５細胞では約４μｇ／ｍＬに達する感染細胞の上清で評価された。ＣＴ２６と比較したＭＣＡ２０５でのより高い発現は、ＣＯＰＴＧ１９４０７に感染した細胞の培養上清中のｍＧＭ－ＣＳＦでも観察された（データは示さず）。
【0266】
抗ＰＤ１と組み合わせたＣＴ２６モデルを有するマウスにおける抗腫瘍活性
プロトコル：
ＣＴ２６細胞（２×１０５細胞）をＢａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）の右側腹部に移植した。腫瘍の体積が２５～５０ｍｍ３に達したとき、マウスを１０匹の動物からなる５つのグループに無作為に分けた。簡単に説明すると、マウスを２日間隔で３回腫瘍内投与し、続いてマウス抗ＰＤ１（ＲＭＰ１－１４ ＢｉｏＸｃｅｌｌ）を週２回、３週間腹腔内処理した。すなわち、
●グループ１のマウスはビヒクルを受けた。
●グループ２のマウスはＤ０、Ｄ２およびＤ４に１×１０７ｐｆｕのＣＯＰＴＧ１９３４７の腫瘍内投与を受けた。
●グループ３のマウスはＤ０、Ｄ２、およびＤ４に１×１０７ｐｆｕのＣＯＰＴＧ１９３４７の腫瘍内投与を受け、およびＤ７、Ｄ１１、Ｄ１４、Ｄ１８およびＤ２２に２５０μｇ／マウスのＲＭＰ１－１４のｉ．ｐ．腹腔内投与を受けた。
●グループ４のマウスはＤ７、Ｄ１１、Ｄ１４、Ｄ１８およびＤ２２に２５０μｇ／マウスのＲＭＰ１－１４の腹腔内投与を受けた。
●グループ５のマウスはＤ０、Ｄ２およびＤ４に１×１０７ｐｆｕのＶＶＴＧ１８０５８の腫瘍内投与を受けた。
プロトコル：
ＣＴ２６細胞（２×１０５細胞）をＢａｌｂ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）の右側腹部に移植した。腫瘍の体積が２５～５０ｍｍ３に達したとき、マウスを１０匹の動物からなる５つのグループに無作為に分けた。簡単に説明すると、マウスを２日間隔で３回腫瘍内投与し、続いてマウス抗ＰＤ１（ＲＭＰ１－１４ ＢｉｏＸｃｅｌｌ）を週２回、３週間腹腔内処理した。すなわち、
●グループ１のマウスはビヒクルを受けた。
●グループ２のマウスはＤ０、Ｄ２およびＤ４に１×１０７ｐｆｕのＣＯＰＴＧ１９３４７の腫瘍内投与を受けた。
●グループ３のマウスはＤ０、Ｄ２、およびＤ４に１×１０７ｐｆｕのＣＯＰＴＧ１９３４７の腫瘍内投与を受け、およびＤ７、Ｄ１１、Ｄ１４、Ｄ１８およびＤ２２に２５０μｇ／マウスのＲＭＰ１－１４のｉ．ｐ．腹腔内投与を受けた。
●グループ４のマウスはＤ７、Ｄ１１、Ｄ１４、Ｄ１８およびＤ２２に２５０μｇ／マウスのＲＭＰ１－１４の腹腔内投与を受けた。
●グループ５のマウスはＤ０、Ｄ２およびＤ４に１×１０７ｐｆｕのＶＶＴＧ１８０５８の腫瘍内投与を受けた。
【0267】
腫瘍の寸法をキャリパーで週に２回測定し、その体積を式（п／６）（長さｘ幅２）を使用して計算した。動物は、それらの腫瘍体積が２０００ｍｍ３に達したとき、安楽死させた。
【0268】
ＣＴ２６モデルにおけるＣＯＰＴＧ１９３４７の抗腫瘍活性：
図３２に示すように、ＣＯＰＴＧ１９３４７処理は、腫瘍増殖阻害（図３２Ａ）だけでなく、腫瘍の退縮ももたらし、最終的には１００日まで生存する腫瘍のないマウスになる（図３２Ｂ）。ＣＯＰＴＧ１９３４７による処理は１００日目に６０％腫瘍のないマウスをもたらした。抗ＰＤ－１抗体との併用処理は、腫瘍増殖阻害または長期生存マウスのパーセンテージを有意に改善しなかった（１００日目で約７０％の腫瘍のないマウス）。比較すると、ＲＰＭＩ－１４処理は抗腫瘍効果を提供しなかった（未治療マウスと同じ挙動（最初の４０日以内にすべて死亡）が、ＶＶＴＧ１８０５８は低い活性を有した（１００日目で約１０％の腫瘍のないマウス）。
図３２に示すように、ＣＯＰＴＧ１９３４７処理は、腫瘍増殖阻害（図３２Ａ）だけでなく、腫瘍の退縮ももたらし、最終的には１００日まで生存する腫瘍のないマウスになる（図３２Ｂ）。ＣＯＰＴＧ１９３４７による処理は１００日目に６０％腫瘍のないマウスをもたらした。抗ＰＤ－１抗体との併用処理は、腫瘍増殖阻害または長期生存マウスのパーセンテージを有意に改善しなかった（１００日目で約７０％の腫瘍のないマウス）。比較すると、ＲＰＭＩ－１４処理は抗腫瘍効果を提供しなかった（未治療マウスと同じ挙動（最初の４０日以内にすべて死亡）が、ＶＶＴＧ１８０５８は低い活性を有した（１００日目で約１０％の腫瘍のないマウス）。
【0269】
ＣＴ２６モデルにおける用量効果評価：
３つの代理ウイルスを比較し（ｍ５－Ｂ０７を駆動するための異なるプロモーターおよびｍ－ＧＭ－ＣＳＦの有無にかかわらず）、ＣＯＰＴＧ１９４０７とＶＶＴＧ１８０５８の用量漸増を実行した（７．５×１０４、７．５×１０５、または７．５×１０６ｐｆｕ）。実験条件は、抗ＰＤ１との同時処理を省略したことを除いて、上記の条件とまったく同じであった。
３つの代理ウイルスを比較し（ｍ５－Ｂ０７を駆動するための異なるプロモーターおよびｍ－ＧＭ－ＣＳＦの有無にかかわらず）、ＣＯＰＴＧ１９４０７とＶＶＴＧ１８０５８の用量漸増を実行した（７．５×１０４、７．５×１０５、または７．５×１０６ｐｆｕ）。実験条件は、抗ＰＤ１との同時処理を省略したことを除いて、上記の条件とまったく同じであった。
【0270】
２つの独立した実験の結果は、３種のウイルスの試験したＣＯＰＴＧ１９４０７、ＣＯＰＴＧ１９４２１とＣＯＰＴＧ１９３４７が、７．５×１０６ｐｆｕの用量で強力な抗腫瘍活性を有することを明確に示した。これは、ＣＯＰＴＧ１９４０７でコード化されたｍＧＭ－ＣＳＦも、ＣＯＰＴＧ１９４２１およびＣＯＰＴＧ１９４０７で最も弱いプロモーターの使用も、武装化ウイルス（ａｒｍｅｄ ｖｉｒｕｓ）の抗腫瘍活性を損なうことはなかったことを確認する。次の表に要約するように、試験した最高用量（すなわち７．５×１０６ｐｆｕ）では、８０日での腫瘍のないマウスの数はウイルスと実験に応じて５／１０から７／１０の間であったが、空のウイルスで処理したマウスでは０／１０であった。
【表6】
【0271】
さらに、「空の」ウイルス（ＶＶＴＧ１８０５８）とＣＯＰＴＧ１９３８４代理体（ＣＯＰＴＧ１９４０７）の両方で実行された用量漸増は、次の表に示すように、同じ低用量でのＶＶＴＧ１８０５８による治療の０／１０に対して、比較的低用量（７．５×１０４ｐｆｕ）でも、８０～９８日で４／１０および２／１０の腫瘍のないマウスで抗体発現ウイルスが明確な抗腫瘍活性を有することを示した。
【表7】
【0272】
生存データの編集（２つの独立した研究から編集された全生存プロット）を図３３に示す。ログランク検定を使用した統計分析を実行して、各グループの生存に有意差があったかどうかを調べた。
【0273】
ＶＶＴＧ１８０５８とｍ５－Ｂ０７の組み合わせと比較したＣＯＰＴＧ１９４０７の抗腫瘍活性
ＣＴ２６担癌マウスを以前に記載されたように設定した（実施例５）。簡単に説明すると、ＣＴ２６細胞をＢａｌＢ／ｃマウスに皮下注射した。腫瘍が約１００ｍｍ３に達したときにマウスの処理を開始した。次に、マウスに、ＣＯＰＴＧ１９４０７（８．５×１０６ｐｆｕ腫瘍内）、ＶＶＴＧ１８０５８（８．５×１０６ｐｆｕ腫瘍内）、ｍ５－Ｂ０７（１０ｍｇ／ｋｇ腹腔内）、またはＶＶＴＧ１８０５８（８．５×１０６ｐｆｕ腫瘍内）とｍ５－Ｂ０７（１０ｍｇ／ｋｇ腹腔内）の組み合わせをＤ０、Ｄ２およびＤ５に注射した。腫瘍の寸法をその後週に２回測定し、腫瘍が２０００ｍｍ３に達した時点でマウスを安楽死させた。図３４Ａから３４Ｄに示すように、マウスを抗ＣＴＬＡ－４およびＧＭ－ＣＳＦを発現するウイルスＣＯＰＴＧ１９４０７で処理した場合、腫瘍増殖は有意に阻害されたが、非武装ウイルス（ｕｎａｒｍｅｄ ｖｉｒｕｓ）と抗ＣＴＬＡ４ｍ５－Ｂ０７の組み合わせでは単剤使用と比較しで改善した療法をもたらさなかった。ｍ５－Ｂ０７のみ、ウイルスＶＶＴＧ１８０５８のみ、またはｍ５－Ｂ０７とＶＶＴＧ１８０５８の両方の組み合わせで治療したグループでは、７０日後に生存したマウスはわずか２０％であった（図３４Ｅ）。対照的に、マウスの９０％は、ＣＯＰＴＧ１９４０７の投与後１００日以上生存し、ベクター化戦略の効力を示している。
ＣＴ２６担癌マウスを以前に記載されたように設定した（実施例５）。簡単に説明すると、ＣＴ２６細胞をＢａｌＢ／ｃマウスに皮下注射した。腫瘍が約１００ｍｍ３に達したときにマウスの処理を開始した。次に、マウスに、ＣＯＰＴＧ１９４０７（８．５×１０６ｐｆｕ腫瘍内）、ＶＶＴＧ１８０５８（８．５×１０６ｐｆｕ腫瘍内）、ｍ５－Ｂ０７（１０ｍｇ／ｋｇ腹腔内）、またはＶＶＴＧ１８０５８（８．５×１０６ｐｆｕ腫瘍内）とｍ５－Ｂ０７（１０ｍｇ／ｋｇ腹腔内）の組み合わせをＤ０、Ｄ２およびＤ５に注射した。腫瘍の寸法をその後週に２回測定し、腫瘍が２０００ｍｍ３に達した時点でマウスを安楽死させた。図３４Ａから３４Ｄに示すように、マウスを抗ＣＴＬＡ－４およびＧＭ－ＣＳＦを発現するウイルスＣＯＰＴＧ１９４０７で処理した場合、腫瘍増殖は有意に阻害されたが、非武装ウイルス（ｕｎａｒｍｅｄ ｖｉｒｕｓ）と抗ＣＴＬＡ４ｍ５－Ｂ０７の組み合わせでは単剤使用と比較しで改善した療法をもたらさなかった。ｍ５－Ｂ０７のみ、ウイルスＶＶＴＧ１８０５８のみ、またはｍ５－Ｂ０７とＶＶＴＧ１８０５８の両方の組み合わせで治療したグループでは、７０日後に生存したマウスはわずか２０％であった（図３４Ｅ）。対照的に、マウスの９０％は、ＣＯＰＴＧ１９４０７の投与後１００日以上生存し、ベクター化戦略の効力を示している。
【0274】
Ａ２０皮下マウスＢ細胞リンパ腫を有するマウスにおける抗ＣＴＬＡ－４およびＧＭ－ＣＳＦをコードするＶＶＴＫ－ＲＲの抗腫瘍活性
Ａ２０細胞株は、老ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮマウス（ＡＴＣＣ ＴＩＢ－２０８（商標））に見られる自発的な細網細胞新生物に由来するＢＡＬＢ／ｃＢ細胞リンパ腫株である。
Ａ２０細胞株は、老ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮマウス（ＡＴＣＣ ＴＩＢ－２０８（商標））に見られる自発的な細網細胞新生物に由来するＢＡＬＢ／ｃＢ細胞リンパ腫株である。
【0275】
プロトコル（１）：
腫瘍は、雌のＢａｌｂ／ｃＮマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）の右側腹部に５×１０６個のＡ２０細胞を皮下注射することによって誘発された。腫瘍が平均体積９５ｍｍ３に達したとき、５０匹のマウスを１０匹の動物からなる５つのグループに無作為に分けた。
●グループ１のマウスは、Ｄ０、Ｄ２およびＤ４にビヒクルの腫瘍内投与を受け、
●グループ２のマウスは、Ｄ０、Ｄ２およびＤ４に４．７５×１０６ｐｆｕの用量のＶＶＴＧ１８０５８の腫瘍内投与を受け、
●グループ３のマウスは、Ｄ０、Ｄ２およびＤ４に４．７５×１０６ｐｆｕの用量のＣＯＰＴＧ１９４０７の腫瘍内投与を受け、
●グループ４のマウスは、Ｄ７、Ｄ１０、Ｄ１４、Ｄ１７、Ｄ２１、Ｄ２４に２５０μｇの用量の抗ＰＤ－１抗体の腹腔内投与を受け、
●グループ５のマウスは、Ｄ０、Ｄ２およびＤ４に４．７５×１０６ｐｆｕの用量のＣＯＰＴＧ１９４０７を腫瘍内投与と、Ｄ７、Ｄ１０、Ｄ１４、Ｄ１７、Ｄ２１およびＤ２４に２５０μｇの用量の抗ＰＤ－１抗体を腹腔内投与を受けた。
腫瘍は、雌のＢａｌｂ／ｃＮマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）の右側腹部に５×１０６個のＡ２０細胞を皮下注射することによって誘発された。腫瘍が平均体積９５ｍｍ３に達したとき、５０匹のマウスを１０匹の動物からなる５つのグループに無作為に分けた。
●グループ１のマウスは、Ｄ０、Ｄ２およびＤ４にビヒクルの腫瘍内投与を受け、
●グループ２のマウスは、Ｄ０、Ｄ２およびＤ４に４．７５×１０６ｐｆｕの用量のＶＶＴＧ１８０５８の腫瘍内投与を受け、
●グループ３のマウスは、Ｄ０、Ｄ２およびＤ４に４．７５×１０６ｐｆｕの用量のＣＯＰＴＧ１９４０７の腫瘍内投与を受け、
●グループ４のマウスは、Ｄ７、Ｄ１０、Ｄ１４、Ｄ１７、Ｄ２１、Ｄ２４に２５０μｇの用量の抗ＰＤ－１抗体の腹腔内投与を受け、
●グループ５のマウスは、Ｄ０、Ｄ２およびＤ４に４．７５×１０６ｐｆｕの用量のＣＯＰＴＧ１９４０７を腫瘍内投与と、Ｄ７、Ｄ１０、Ｄ１４、Ｄ１７、Ｄ２１およびＤ２４に２５０μｇの用量の抗ＰＤ－１抗体を腹腔内投与を受けた。
【0276】
抗腫瘍活性：
すべての動物の腫瘍体積は、研究を通して監視された。処理の抗腫瘍活性は、腫瘍倍加時間、腫瘍増殖遅延、および腫瘍増殖阻害（Ｔ／Ｃ％）の基準の評価に基づいている。
すべての動物の腫瘍体積は、研究を通して監視された。処理の抗腫瘍活性は、腫瘍倍加時間、腫瘍増殖遅延、および腫瘍増殖阻害（Ｔ／Ｃ％）の基準の評価に基づいている。
【0277】
腫瘍倍加時間は、５．１４日（グループ１）から６．３７日（グループ２）の範囲のグループ１、２、および４で同様であった。グループ３の場合、腫瘍が指数関数的に増殖しなかったため、腫瘍倍加時間を正確に計算できず、これは、グループ１、２、および４と比較して処理の有効性が高いことを示している。同様に、腫瘍倍加時間は、グループ５の１匹の動物のみを使用して計算された。グループ３の１０匹のマウスのうち９匹は、Ｄ１５で退縮し、Ｄ２５からＤ６４での研究が終了するまで実質的に体積が増加しなかった腫瘍を有していた。Ｄ６４では、これらの９匹のマウスの腫瘍体積を４ｍｍ３（腫瘍検出の技術的限界）～５９．７７ｍｍ３の範囲であった。同様に、グループ５では、処理開始後９匹のマウスにおいて腫瘍が退縮し、Ｄ６４の研究の終了時に７．２４～６３．２１ｍｍ３の範囲の値に到達した。処理の各グループ（図３５Ａ～Ｅに対応するグループ１～５）の個々の腫瘍体積曲線を示す図３５に見られるように、ＣＯＰＴＧ１９４０７を投与されたグループ３および５の動物では腫瘍は増殖せず、抗ＰＤ１の有無にかかわらず、抗体発現ウイルスの強力な抗腫瘍活性を確認する。
【0278】
腫瘍増殖遅延は、腫瘍が３００ｍｍ３の平均目標体積に達するまでにかかる時間を推定することによって計算した。このパラメーターは、目標体積３００ｍｍ３に達した腫瘍に対してのみ計算できたため、グループ３および５の大多数の動物には当てはまらず、結果は腫瘍倍加時間で得られた結果と同様であった。グループ１、２、および４の平均腫瘍増殖遅延は、それぞれ１６、２１、および１７日であり、互いに有意差はなかった。さらに、グループ３（ｎ＝２）の平均腫瘍遅延は１４日であり、このグループで増殖した腫瘍はグループ１、２、４と同じ速度で増殖したが、これらの腫瘍は実際には両方の動物で退縮したことを示している。比較すると、増殖したグループ５（ｎ＝１）の単一の腫瘍は、他のすべてのグループよりも有意に（ｐ≦０．００２６）長い４３日間の腫瘍増殖遅延を示した。
【0279】
腫瘍増殖阻害（Ｔ／Ｃ％）は、ビヒクルで処理したグループ１の腫瘍体積の中央値を他の処理グループと比較することによって計算した。グループ２の最適Ｔ／Ｃ％はＤ２２で３４％であり、一過性の限界抗腫瘍活性を示しているが、この値はＤ３１までに７１％まで増加した。中程度の抗腫瘍活性（１０～３０％Ｔ／Ｃ％）がグループ４で観察された。比較すると、グループ３と５は両方とも、Ｄ２７～Ｄ３１（Ｔ／Ｃ％の最後の計算可能な値）で顕著な抗腫瘍活性（Ｔ／Ｃ％が１０％未満）を示した。
【0280】
図３６は、皮下Ａ２０腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃＮマウスの平均腫瘍体積曲線を示しており、腫瘍増殖に対し抗ＰＤ１の有無にかかわらず抗ＣＴＬＡ４およびＧｍ－ＣＳＦ発現ウイルスＣＯＰＴＧ１９４０７の劇的な効果を示している。
【0281】
プロトコル（２）：
腫瘍は、雌のＢＡＬＢ／ｃＮマウスの右側腹部に５×１０６個のＡ２０細胞を皮下注射することによって誘発された。腫瘍の平均体積が８０～１００ｍｍ３に達したとき、９０匹の動物を１０匹の動物からなる９つのグループに無作為に分けた。
●グループ１のマウスは、Ｄ０、Ｄ２およびＤ４にビヒクルの腫瘍内投与を受けた
●グループ２のマウスは、Ｄ０、Ｄ４、Ｄ７、Ｄ１０、Ｄ１４およびＤ１７に２５０μｇ／マウス／注射の用量の抗ＰＤ－１抗体の腹腔内投与を受けた
●グループ３のマウスは、Ｄ０、Ｄ４、Ｄ７、Ｄ１０、Ｄ１４およびＤ１７に２５０μｇ／マウス／注射の用量のアイソタイプの腹腔内投与を受けた
●グループ４のマウスは、Ｄ０、Ｄ２およびＤ４に１×１０５ｐｆｕの用量のＶＶＴＧ１８０５８の腫瘍内投与を受けた
●グループ５のマウスは、Ｄ０、Ｄ２およびＤ４に１×１０５ｐｆｕの用量のＶＶＴＧ１８０５８の腫瘍内投与と、Ｄ０、Ｄ４、Ｄ７、Ｄ１０、Ｄ１４およびＤ１７に２５０μｇ／マウス／注射の用量のアイソタイプの腹腔内投与を受けた
●グループ６のマウスは、Ｄ０、Ｄ２およびＤ４に１×１０５ｐｆｕの用量のＶＶＴＧ１８０５８の腫瘍内投与とＤ０、Ｄ４、Ｄ７、Ｄ１０、Ｄ１４およびＤ１７に２５０μｇ／／マウス／注射の用量の抗ＰＤ－１抗体の腹腔内投与を受けた
●グループ７のマウスは、Ｄ０、Ｄ２およびＤ４に１×１０５ｐｆｕの用量のＣＯＰＴＧ１９４０７の腫瘍内投与を受けた
●グループ８のマウスは、Ｄ０、Ｄ２およびＤ４に１×１０５ｐｆｕの用量のＣＯＰＴＧ１９４０７の腫瘍内投与を、Ｄ０、Ｄ４、Ｄ７、Ｄ１０、Ｄ１４、Ｄ１７およびＤ２４に２５０μｇ／マウス／注射の用量のアイソタイプの腹腔内投与と組み合わせて受けた。
●グループ９のマウスは、Ｄ０、Ｄ２およびＤ４に１×１０５ｐｆｕの用量のＣＯＰＴＧ１９４０７の腫瘍内投与を、Ｄ０、Ｄ４、Ｄ７、Ｄ１０、Ｄ１４およびＤ１７に２５０μｇ／マウス／注射の用量の抗ＰＤ－１抗体の腹腔内腫瘍投与と組み合わせて受けた。
腫瘍は、雌のＢＡＬＢ／ｃＮマウスの右側腹部に５×１０６個のＡ２０細胞を皮下注射することによって誘発された。腫瘍の平均体積が８０～１００ｍｍ３に達したとき、９０匹の動物を１０匹の動物からなる９つのグループに無作為に分けた。
●グループ１のマウスは、Ｄ０、Ｄ２およびＤ４にビヒクルの腫瘍内投与を受けた
●グループ２のマウスは、Ｄ０、Ｄ４、Ｄ７、Ｄ１０、Ｄ１４およびＤ１７に２５０μｇ／マウス／注射の用量の抗ＰＤ－１抗体の腹腔内投与を受けた
●グループ３のマウスは、Ｄ０、Ｄ４、Ｄ７、Ｄ１０、Ｄ１４およびＤ１７に２５０μｇ／マウス／注射の用量のアイソタイプの腹腔内投与を受けた
●グループ４のマウスは、Ｄ０、Ｄ２およびＤ４に１×１０５ｐｆｕの用量のＶＶＴＧ１８０５８の腫瘍内投与を受けた
●グループ５のマウスは、Ｄ０、Ｄ２およびＤ４に１×１０５ｐｆｕの用量のＶＶＴＧ１８０５８の腫瘍内投与と、Ｄ０、Ｄ４、Ｄ７、Ｄ１０、Ｄ１４およびＤ１７に２５０μｇ／マウス／注射の用量のアイソタイプの腹腔内投与を受けた
●グループ６のマウスは、Ｄ０、Ｄ２およびＤ４に１×１０５ｐｆｕの用量のＶＶＴＧ１８０５８の腫瘍内投与とＤ０、Ｄ４、Ｄ７、Ｄ１０、Ｄ１４およびＤ１７に２５０μｇ／／マウス／注射の用量の抗ＰＤ－１抗体の腹腔内投与を受けた
●グループ７のマウスは、Ｄ０、Ｄ２およびＤ４に１×１０５ｐｆｕの用量のＣＯＰＴＧ１９４０７の腫瘍内投与を受けた
●グループ８のマウスは、Ｄ０、Ｄ２およびＤ４に１×１０５ｐｆｕの用量のＣＯＰＴＧ１９４０７の腫瘍内投与を、Ｄ０、Ｄ４、Ｄ７、Ｄ１０、Ｄ１４、Ｄ１７およびＤ２４に２５０μｇ／マウス／注射の用量のアイソタイプの腹腔内投与と組み合わせて受けた。
●グループ９のマウスは、Ｄ０、Ｄ２およびＤ４に１×１０５ｐｆｕの用量のＣＯＰＴＧ１９４０７の腫瘍内投与を、Ｄ０、Ｄ４、Ｄ７、Ｄ１０、Ｄ１４およびＤ１７に２５０μｇ／マウス／注射の用量の抗ＰＤ－１抗体の腹腔内腫瘍投与と組み合わせて受けた。
【0282】
抗腫瘍活性：
ＣＯＰＴＧ１９４０７の投与量は最適ではなく、腫瘍の体積とマウスの生存の点で、抗ＰＤ－１処理と同様の軽度の抗腫瘍活性を示した。
ＣＯＰＴＧ１９４０７の投与量は最適ではなく、腫瘍の体積とマウスの生存の点で、抗ＰＤ－１処理と同様の軽度の抗腫瘍活性を示した。
【0283】
対照的に、ＣＯＰＴＧ１９４０７と抗ＰＤ－１の組み合わせは、強力な抗腫瘍活性を示し、図３７Ａに示すように他のグループと比較して腫瘍体積が小さくなり（抗ＰＤ－１単独またはＣＯＰＴＧ１９４０７単独を投与されたマウスの２４日目でそれぞれ約６３０ｍｍ３および７５０ｍｍ３であるのに対し、３６日目で約２９０ｍｍ３）、図３７Ｂに示すように動物の生存がはるかに良好である（グループ９の５７日目に７匹の動物がまだ生存しているのに対し、グループ２または７ではそれぞれ２匹または１匹のみ）。
【0284】
Ｃ３８皮下結腸腫瘍細胞を有するマウスにおける抗ＣＴＬＡ－４およびＧＭ－ＣＳＦをコードするＶＶＴＫ－ＲＲの抗腫瘍活性研究
Ｃ３８は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２７７９（商標））に由来するマウス結腸腺癌である。
Ｃ３８は、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２７７９（商標））に由来するマウス結腸腺癌である。
【0285】
プロトコル：
腫瘍断片（３０～５０ｍｇ）を、雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｎｖｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）の右側腹部に皮下移植した。腫瘍が約６０ｍｍ３の平均体積に達したとき、５０匹の動物を１０匹の動物からなる５つのグループに無作為に分けた。
●グループ１のマウスは、Ｄ０、Ｄ２およびＤ４にビヒクルの腫瘍内投与を受けた。
●グループ２のマウスは、Ｄ０、Ｄ２およびＤ４に４．７５×１０６ｐｆｕの用量のＶＶＴＧ１８０５８の腫瘍内投与を受け、
●グループ３のマウスは、Ｄ０、Ｄ２およびＤ４に４．７５×１０６ｐｆｕの用量のＣＯＰＴＧ１９４０７の腫瘍内投与を受け、
●グループ４のマウスは、Ｄ７、Ｄ１０、Ｄ１４、Ｄ１７、Ｄ２１、Ｄ２４に２５０μｇの用量のマウス抗ＰＤ－１抗体の腹腔内投与を受け、
●グループ５のマウスは、Ｄ０、Ｄ２およびＤ４に４．７５×１０６ｐｆｕの用量のＣＯＰＴＧ１９４０７の腫瘍内投与と、Ｄ７、Ｄ１０、Ｄ１４、Ｄ１７、Ｄ２１およびＤ２４に２５０μｇの用量で抗ＰＤ－１抗体の腹腔内投与を受けた。
腫瘍断片（３０～５０ｍｇ）を、雌のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（Ｊａｎｖｉｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）の右側腹部に皮下移植した。腫瘍が約６０ｍｍ３の平均体積に達したとき、５０匹の動物を１０匹の動物からなる５つのグループに無作為に分けた。
●グループ１のマウスは、Ｄ０、Ｄ２およびＤ４にビヒクルの腫瘍内投与を受けた。
●グループ２のマウスは、Ｄ０、Ｄ２およびＤ４に４．７５×１０６ｐｆｕの用量のＶＶＴＧ１８０５８の腫瘍内投与を受け、
●グループ３のマウスは、Ｄ０、Ｄ２およびＤ４に４．７５×１０６ｐｆｕの用量のＣＯＰＴＧ１９４０７の腫瘍内投与を受け、
●グループ４のマウスは、Ｄ７、Ｄ１０、Ｄ１４、Ｄ１７、Ｄ２１、Ｄ２４に２５０μｇの用量のマウス抗ＰＤ－１抗体の腹腔内投与を受け、
●グループ５のマウスは、Ｄ０、Ｄ２およびＤ４に４．７５×１０６ｐｆｕの用量のＣＯＰＴＧ１９４０７の腫瘍内投与と、Ｄ７、Ｄ１０、Ｄ１４、Ｄ１７、Ｄ２１およびＤ２４に２５０μｇの用量で抗ＰＤ－１抗体の腹腔内投与を受けた。
【0286】
抗腫瘍活性：
以前のように、すべての動物の腫瘍体積は、研究を通して監視された。腫瘍倍加時間は、グループ１と２で約６．７日で同様であった。グループ４（ｎ＝５）は、腫瘍倍加時間（１０．４日）が長かったが、グループ間に有意差はなかった。グループ３および５の場合、腫瘍倍加時間は計算可能であったが、これらのグループのマウスの腫瘍の大部分が指数関数的に増殖しなかったため、動物の数は少なくなっており（ｎ＝２）、グループ１、２、および４と比較して処理の有効性が高いことを示している。図３８からわかるように、グループ３の１０匹のマウスのうち８匹は、Ｄ１５から退縮し、実質的に体積が増加しなかった腫瘍を有しており、５匹のマウスはＤ６１の研究終了時に検出可能な腫瘍を有していなかった。同様に、グループ５では、治療の開始後８匹のマウスで腫瘍が退縮し、Ｄ６１の研究終了時に０（ｎ＝２）～４７．８２ｍｍ３の範囲の値に達した。
以前のように、すべての動物の腫瘍体積は、研究を通して監視された。腫瘍倍加時間は、グループ１と２で約６．７日で同様であった。グループ４（ｎ＝５）は、腫瘍倍加時間（１０．４日）が長かったが、グループ間に有意差はなかった。グループ３および５の場合、腫瘍倍加時間は計算可能であったが、これらのグループのマウスの腫瘍の大部分が指数関数的に増殖しなかったため、動物の数は少なくなっており（ｎ＝２）、グループ１、２、および４と比較して処理の有効性が高いことを示している。図３８からわかるように、グループ３の１０匹のマウスのうち８匹は、Ｄ１５から退縮し、実質的に体積が増加しなかった腫瘍を有しており、５匹のマウスはＤ６１の研究終了時に検出可能な腫瘍を有していなかった。同様に、グループ５では、治療の開始後８匹のマウスで腫瘍が退縮し、Ｄ６１の研究終了時に０（ｎ＝２）～４７．８２ｍｍ３の範囲の値に達した。
【0287】
腫瘍増殖遅延は、腫瘍が３００ｍｍ３の平均目標体積に達するまでにかかる時間を推定することによって計算した。このパラメーターは、目標体積３００ｍｍ３に達した腫瘍に対してのみ計算できたため、グループ３および５の大多数の動物には当てはまらず、結果は腫瘍倍加時間で得られた結果と同様であった。グループ間に有意差はなかった。グループ１、２、および４（ｎ＝５）の平均腫瘍増殖遅延は、それぞれ２３～２７日であった。さらに、グループ３（ｎ＝２）と５（ｎ＝３）の平均増殖遅延は、それぞれ１８日と２４日であった。これは、これら２つのグループで増殖した腫瘍が、グループ１、２、および４と同様の速度で増殖したことを示している。
【0288】
腫瘍増殖阻害（Ｔ／Ｃ％）は、ビヒクルで処理したグループ１の腫瘍体積の中央値を他の処理グループと比較することによって計算した。研究期間中、Ｔ／Ｃ％が１００％を超えたままであったため、グループ２は腫瘍増殖阻害を示さなかった。比較すると、グループ３、４、および５はすべて、Ｄ３１（グループ３のみ）～Ｄ４２（Ｔ／Ｃ％の最後の計算可能な値）で顕著な抗腫瘍活性（Ｔ／Ｃ％が１０％未満）を示した。
【0289】
図３９は、皮下Ｃ３８腫瘍を有するＣ５７ＢＬ／６マウスの平均腫瘍体積曲線を示しており、腫瘍増殖に対し抗ＰＤ１の有無にかかわらず抗ＣＴＬＡ４／ＧＭ－ＣＳＦ発現ウイルスＣＯＰＴＧ１９４０７の劇的な効果を示している。
【0290】
ＥＭＴ６皮下乳腺腫瘍細胞を有するマウスにおける抗ＣＴＬＡ－４およびＧＭ－ＣＳＦをコードするＶＶＴＫ－ＲＲの抗腫瘍活性研究
ＥＭＴ６は、ＡＴＴＣ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２７５５（商標））に由来するマウス乳癌である。
ＥＭＴ６は、ＡＴＴＣ（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－２７５５（商標））に由来するマウス乳癌である。
【0291】
プロトコル：
腫瘍は、雌のＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウスに１×１０６個のＥＭＴ６細胞（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）を皮下注射することによって誘発された。腫瘍が約５１ｍｍ３の平均体積に達したとき、個々の腫瘍体積によって５０匹のマウスを１０匹の動物からなる５つのグループに無作為に分けた。
●グループ１のマウスは、Ｄ０、Ｄ２およびＤ４にビヒクルの腫瘍内投与を受け、
●グループ２のマウスは、Ｄ０、Ｄ２およびＤ４に４．７５×１０６ｐｆｕの用量のＶＶＴＧ１８０５８の腫瘍内投与を受け、
●グループ３のマウスは、Ｄ０、Ｄ２およびＤ４に４．７５×１０６ｐｆｕの用量のＣＯＰＴＧ１９４０７の腫瘍内投与を受け、
●グループ４のマウスは、Ｄ７、Ｄ１０、Ｄ１４、Ｄ１７、Ｄ２１およびＤ２４に２５０μｇの用量の抗ＰＤ－１抗体の腹腔内投与を受け、
●グループ５のマウスは、Ｄ０、Ｄ２およびＤ４に４．７５×１０６ｐｆｕの用量のＣＯＰＴＧ１９４０７を腫瘍内投与と、Ｄ７、Ｄ１０、Ｄ１４、Ｄ１７、Ｄ２１およびＤ２４に２５０μｇの用量の抗ＰＤ－１抗体を腹腔内投与を受けた。
腫瘍は、雌のＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウスに１×１０６個のＥＭＴ６細胞（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）を皮下注射することによって誘発された。腫瘍が約５１ｍｍ３の平均体積に達したとき、個々の腫瘍体積によって５０匹のマウスを１０匹の動物からなる５つのグループに無作為に分けた。
●グループ１のマウスは、Ｄ０、Ｄ２およびＤ４にビヒクルの腫瘍内投与を受け、
●グループ２のマウスは、Ｄ０、Ｄ２およびＤ４に４．７５×１０６ｐｆｕの用量のＶＶＴＧ１８０５８の腫瘍内投与を受け、
●グループ３のマウスは、Ｄ０、Ｄ２およびＤ４に４．７５×１０６ｐｆｕの用量のＣＯＰＴＧ１９４０７の腫瘍内投与を受け、
●グループ４のマウスは、Ｄ７、Ｄ１０、Ｄ１４、Ｄ１７、Ｄ２１およびＤ２４に２５０μｇの用量の抗ＰＤ－１抗体の腹腔内投与を受け、
●グループ５のマウスは、Ｄ０、Ｄ２およびＤ４に４．７５×１０６ｐｆｕの用量のＣＯＰＴＧ１９４０７を腫瘍内投与と、Ｄ７、Ｄ１０、Ｄ１４、Ｄ１７、Ｄ２１およびＤ２４に２５０μｇの用量の抗ＰＤ－１抗体を腹腔内投与を受けた。
【0292】
すべての動物の腫瘍体積は、腫瘍倍加時間、腫瘍増殖遅延、および腫瘍増殖阻害（Ｔ／Ｃ％）の基準を評価することにより、研究全体を通して監視された。
【0293】
抗腫瘍活性：
腫瘍倍加時間は、グループ１、２、および４で約５．４日で同様であった。グループ３の場合、腫瘍の大部分が指数関数的に増殖しなかったため、腫瘍倍加時間を計算できず、これはグループ１、２、および４と比較して治療の有効性が高いことを示している。同様の効果がグループ５で観察され、腫瘍倍加時間の計算に１匹の動物のみが使用された。個々の腫瘍体積のグラフ（図４０）に見られるように、グループ３の１０匹のマウスのうち８匹は、Ｄ１５から退縮し、体積が実質的に増加しなかった腫瘍を有し、７匹のマウスはＤ６１の研究終了時に検出可能な腫瘍を有していなかった。同様に、グループ５では、処理開始後９匹のマウスで腫瘍が退縮し、Ｄ５６の研究終了時に０（ｎ＝８）～１３．２４ｍｍ３の範囲の値に達した。
腫瘍倍加時間は、グループ１、２、および４で約５．４日で同様であった。グループ３の場合、腫瘍の大部分が指数関数的に増殖しなかったため、腫瘍倍加時間を計算できず、これはグループ１、２、および４と比較して治療の有効性が高いことを示している。同様の効果がグループ５で観察され、腫瘍倍加時間の計算に１匹の動物のみが使用された。個々の腫瘍体積のグラフ（図４０）に見られるように、グループ３の１０匹のマウスのうち８匹は、Ｄ１５から退縮し、体積が実質的に増加しなかった腫瘍を有し、７匹のマウスはＤ６１の研究終了時に検出可能な腫瘍を有していなかった。同様に、グループ５では、処理開始後９匹のマウスで腫瘍が退縮し、Ｄ５６の研究終了時に０（ｎ＝８）～１３．２４ｍｍ３の範囲の値に達した。
【0294】
腫瘍増殖遅延は、腫瘍が２００ｍｍ３の平均目標体積に達するまでにかかる時間を推定することによって計算した。このパラメーターは、目標体積２００ｍｍ３に達した腫瘍に対してのみ計算できたため、グループ３および５の大多数の動物には当てはまらず、結果は腫瘍倍加時間で得られた結果と同様であった。グループ１、２、および４の平均腫瘍増殖遅延は約１９日であった。さらに、グループ３と５（両方のグループでｎ＝２）の平均増殖遅延は、それぞれ２４日と１２日であった。これは、これら２つのグループで増殖した腫瘍が、グループ１、２、および４と同様の速度で増殖したことを示している。グループ間に有意差はなかった。
【0295】
腫瘍増殖阻害（Ｔ／Ｃ％）は、ビヒクルで処理したグループ１の腫瘍体積の中央値を他の処理グループと比較することによって計算した。グループ２は、Ｄ２８で一過性の辺縁性腫瘍増殖阻害を示したが、Ｄ３１で７９％に増加した。グループ４は抗腫瘍活性を示さず、研究期間中のＴ／Ｃ％＞６０％であった。比較すると、グループ３と５は両方とも、Ｄ２４～Ｄ３１（Ｔ／Ｃ％の最後の計算可能な値）で顕著な抗腫瘍活性（Ｔ／Ｃ％が１０％未満）を示した。
【0296】
図４１は、皮下ＥＭＴ６腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウスの平均腫瘍体積曲線を示しており、腫瘍増殖に対し抗ＰＤ１の有無にかかわらず抗ＣＴＬＡ４／ＧＭ－ＣＳＦ発現ウイルスＣＯＰＴＧ１９４０７の劇的な効果を示している。
【0297】
ＣＴ２６の再チャレンジ
特定の抗腫瘍免疫反応が発生したかどうかを研究するため、１０４、１０５または１０６ｐｆｕのＣＯＰＴＧ１９４２または１０６ｐｆｕのＣＯＰＴＧ１９４０７処理後に生存したＣＴ２６腫瘍細胞でチャレンジされたＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＣＴ２６腫瘍細胞で再チャレンジするかまたはＲｅｎｃａ細胞（腎臓腺癌細胞：対照）でチャレンジした。
特定の抗腫瘍免疫反応が発生したかどうかを研究するため、１０４、１０５または１０６ｐｆｕのＣＯＰＴＧ１９４２または１０６ｐｆｕのＣＯＰＴＧ１９４０７処理後に生存したＣＴ２６腫瘍細胞でチャレンジされたＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＣＴ２６腫瘍細胞で再チャレンジするかまたはＲｅｎｃａ細胞（腎臓腺癌細胞：対照）でチャレンジした。
【表8】
【0298】
表８に示される結果は、ＣＯＰＴＧ１９４２１またはＣＯＰＴＧ１９４０７を投与された０／８マウスは、ＲｅｎＣａチャレンジ後に腫瘍がなかったのに対し、ＣＯＰＴＧ１９４２１またはＣＯＰＴＧ１９４０７を投与された７／１０マウスは、ＣＴ２６再チャレンジ後に腫瘍がなかったことを示している。これは、ＣＯＰＴＧ１９４２１とＣＯＰＴＧ１９４０７がＣＴ２６細胞に対して特定の免疫記憶を高めたことを示している。
【図1-1】
【図1-2】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9-1】
【図9-2】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16-1】
【図16-2】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20-1】
【図20-2】
【図21】
【図22-1】
【図22-2】
【図23-1】
【図23-2】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30A】
【図30B】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34-1】
【図34-2】
【図34-3】
【図35-1】
【図35-2】
【図36】
【図37】
【図38-1】
【図38-2】
【図39】
【図40-1】
【図40-2】
【図40-3】
【図41】
【配列表】
【外国語明細書】