(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024009208
(43)【公開日】2024-01-19
(54)【発明の名称】凝集物の除去
(51)【国際特許分類】
A61K 39/145 20060101AFI20240112BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240112BHJP
A61P 31/16 20060101ALI20240112BHJP
A61K 41/00 20200101ALI20240112BHJP
【ＦＩ】
A61K39/145
A61P37/04
A61P31/16
A61K41/00
【審査請求】有
【請求項の数】15
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023198238
(22)【出願日】2023-11-22
(62)【分割の表示】P 2021524077の分割
【原出願日】2019-07-10
(31)【優先権主張番号】2018902497
(32)【優先日】2018-07-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】AU
(71)【出願人】
【識別番号】521011352
【氏名又は名称】セキラス ピーティーワイ リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】スティーブン ロックマン
(72)【発明者】
【氏名】ジェシー ボードル
(72)【発明者】
【氏名】ナンシー グッゾ－パーネル
(57)【要約】
【課題】インフルエンザタンパク質を含む調製物中で凝集した材料を分散させる方法を提供すること。
【解決手段】上記方法は、上記調製物を超音波処理に供する工程を包含する。本開示は、インフルエンザタンパク質またはウイルスを含む調製物中で凝集した材料を分散させる方法であって、上記方法は、上記調製物を超音波処理に供する工程を包含する方法を提供する。本開示はまた、インフルエンザワクチンを生成する方法であって、上記方法は、不活性化またはスプリットインフルエンザビリオンを含む調製物を生成する工程および上記調製物を超音波処理する工程を包含する方法を提供する。
【選択図】なし
【解決手段】上記方法は、上記調製物を超音波処理に供する工程を包含する。本開示は、インフルエンザタンパク質またはウイルスを含む調製物中で凝集した材料を分散させる方法であって、上記方法は、上記調製物を超音波処理に供する工程を包含する方法を提供する。本開示はまた、インフルエンザワクチンを生成する方法であって、上記方法は、不活性化またはスプリットインフルエンザビリオンを含む調製物を生成する工程および上記調製物を超音波処理する工程を包含する方法を提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
本明細書に記載の発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年７月１０日出願の標題「Ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ａｇｇｌｏｍｅｒａｔｅｓ」のオーストラリア出願第２０１８９０２４９７号からの優先権を主張する。その出願の全内容は、本明細書に参考として援用される。
本出願は、２０１８年７月１０日出願の標題「Ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ ａｇｇｌｏｍｅｒａｔｅｓ」のオーストラリア出願第２０１８９０２４９７号からの優先権を主張する。その出願の全内容は、本明細書に参考として援用される。
【0002】
分野
本開示は、インフルエンザ抗原を含む調製物中で凝集物を分散させる方法、および特に、インフルエンザワクチンの生成におけるこの方法の使用に関する。
本開示は、インフルエンザ抗原を含む調製物中で凝集物を分散させる方法、および特に、インフルエンザワクチンの生成におけるこの方法の使用に関する。
【背景技術】
【0003】
背景
インフルエンザワクチンは、感染を防止する最も有効な方法と考えられる。最初のインフルエンザワクチンは、全ウイルス調製物であった［１］。不活性化三価および四価インフルエンザワクチン（それぞれ、ＴＩＶおよびＱＩＶ）の現在の製造プロセスは、インフルエンザウイルスの化学的破壊または１９６０年代に導入された「スプリット」に基づく［２］。化学的破壊（界面活性剤または溶媒による）は、多くの場合、免疫原性を損なうことなしに、ワクチンの反応原性を低減することが見出された。溶媒の高い揮発性に起因して、全ての市販のインフルエンザワクチンは、界面活性剤で破壊またはスプリットされる。しかし、全ビリオンを破壊するために利用される界面活性剤の濃度は、ワクチン内での受容可能な限界を超え、従って、許容可能なレベルへと除去されなければならない。
インフルエンザワクチンは、感染を防止する最も有効な方法と考えられる。最初のインフルエンザワクチンは、全ウイルス調製物であった［１］。不活性化三価および四価インフルエンザワクチン（それぞれ、ＴＩＶおよびＱＩＶ）の現在の製造プロセスは、インフルエンザウイルスの化学的破壊または１９６０年代に導入された「スプリット」に基づく［２］。化学的破壊（界面活性剤または溶媒による）は、多くの場合、免疫原性を損なうことなしに、ワクチンの反応原性を低減することが見出された。溶媒の高い揮発性に起因して、全ての市販のインフルエンザワクチンは、界面活性剤で破壊またはスプリットされる。しかし、全ビリオンを破壊するために利用される界面活性剤の濃度は、ワクチン内での受容可能な限界を超え、従って、許容可能なレベルへと除去されなければならない。
【0004】
界面活性剤の除去の帰結は、得られたスプリットビリオンが凝集物または凝集した材料を発生させるということである。凝集物の発生は、株およびスプリットプロセスにおいて利用される界面活性剤のレベル／タイプに関連する。多くの場合、ワクチンおよび他の薬学的製品は、ワクチンの適切な品質属性を維持するために、残留界面活性剤またはさらなる界面活性剤／化学材料のいずれかを含む。しかし、界面活性剤の存在は、特に、ワウチン接種の文脈において、抗原をより可溶性にし、免疫原性および従ってワクチンの有効性の減少を増強することが長年にわたって確立されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0005】
要旨
本開示は、インフルエンザタンパク質またはウイルスを含む調製物中で凝集した材料を分散させる方法であって、上記方法は、上記調製物を超音波処理に供する工程を包含する方法を提供する。
本開示は、インフルエンザタンパク質またはウイルスを含む調製物中で凝集した材料を分散させる方法であって、上記方法は、上記調製物を超音波処理に供する工程を包含する方法を提供する。
【0006】
本開示はまた、インフルエンザワクチンを生成する方法であって、上記方法は、不活性化またはスプリットインフルエンザビリオンを含む調製物を生成する工程および上記調製物を超音波処理する工程を包含する方法を提供する。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
インフルエンザタンパク質を含む調製物中の凝集した材料を分散させる方法であって、前記方法は、前記調製物を超音波処理に供する工程を包含する方法。
（項目２）
前記調製物は、インフルエンザヘマグルチニンを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記調製物は、スプリットインフルエンザビリオンを含む、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記調製物は、界面活性剤を実質的に含まない、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記超音波処理は、前記調製物に存在する凝集物のうちの少なくとも５０％が分散されるように、ある時間にわたっておよびある強度で行われる、項目１～４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６）
前記超音波処理は、８０％振幅の速度において行われる、項目１～５のいずれか１項に記載の方法。
（項目７）
前記超音波処理は、少なくとも９０ジュール／ｍＬのエネルギーを伝達させるように行わ
れる、項目１～６のいずれか１項に記載の方法。
（項目８）
推定ＨＡグリコシル化部位確率スコア（ｐＧｌｙスコア）≧１６を有するＨ３Ｎ２株は、≧９０ジュール／ｍＬの超音波処理を必要とし、ｐＧｌｙスコア≧１１を有するＨ１Ｎ１株は、≧９０ジュール／ｍＬの超音波処理を必要とする、項目１～７のいずれか１項に記載の方法。
（項目９）
インフルエンザワクチンを生成する方法であって、前記方法は、不活性化またはスプリットインフルエンザビリオンを含む調製物を生成する工程および前記調製物を超音波処理する工程を包含する方法。
（項目１０）
前記ワクチンは、少なくとも３つの異なるインフルエンザ株を含む、項目８に記載の方法。
（項目１１）
前記ワクチンは、一価ワクチンである、項目８に記載の方法。
（項目１２）
前記ワクチンは、四価ワクチンである、項目８に記載の方法。
（項目１３）
前記ワクチンは、インフルエンザＡおよびインフルエンザＢを含む、項目８、９および１１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４）
前記ワクチンは、凝集した材料を実質的に含まない、項目８～１２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５）
前記超音波処理は、８０％振幅の速度において行われる、項目８～１２のいずれか１項に記載の方法。
本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
インフルエンザタンパク質を含む調製物中の凝集した材料を分散させる方法であって、前記方法は、前記調製物を超音波処理に供する工程を包含する方法。
（項目２）
前記調製物は、インフルエンザヘマグルチニンを含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記調製物は、スプリットインフルエンザビリオンを含む、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
前記調製物は、界面活性剤を実質的に含まない、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記超音波処理は、前記調製物に存在する凝集物のうちの少なくとも５０％が分散されるように、ある時間にわたっておよびある強度で行われる、項目１～４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６）
前記超音波処理は、８０％振幅の速度において行われる、項目１～５のいずれか１項に記載の方法。
（項目７）
前記超音波処理は、少なくとも９０ジュール／ｍＬのエネルギーを伝達させるように行わ
れる、項目１～６のいずれか１項に記載の方法。
（項目８）
推定ＨＡグリコシル化部位確率スコア（ｐＧｌｙスコア）≧１６を有するＨ３Ｎ２株は、≧９０ジュール／ｍＬの超音波処理を必要とし、ｐＧｌｙスコア≧１１を有するＨ１Ｎ１株は、≧９０ジュール／ｍＬの超音波処理を必要とする、項目１～７のいずれか１項に記載の方法。
（項目９）
インフルエンザワクチンを生成する方法であって、前記方法は、不活性化またはスプリットインフルエンザビリオンを含む調製物を生成する工程および前記調製物を超音波処理する工程を包含する方法。
（項目１０）
前記ワクチンは、少なくとも３つの異なるインフルエンザ株を含む、項目８に記載の方法。
（項目１１）
前記ワクチンは、一価ワクチンである、項目８に記載の方法。
（項目１２）
前記ワクチンは、四価ワクチンである、項目８に記載の方法。
（項目１３）
前記ワクチンは、インフルエンザＡおよびインフルエンザＢを含む、項目８、９および１１のいずれか１項に記載の方法。
（項目１４）
前記ワクチンは、凝集した材料を実質的に含まない、項目８～１２のいずれか１項に記載の方法。
（項目１５）
前記超音波処理は、８０％振幅の速度において行われる、項目８～１２のいずれか１項に記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【図1】Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９（Ｈ１Ｎ１）およびＢ／Ｈｕｂｅｉ－Ｗｕｊｉａｇａｎｇ／１５８／１５８／２００９（Ｂ Ｙａｍａｇａｔａ）の株のインフルエンザウイルスワクチン（ＩＶＶ） ＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘに関する光学密度濁度（ＯＤＴ）アッセイの反復性。
【0008】
【図2】ＯＤＴ分析による、Ｈ３Ｎ２ Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１ ＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘの分散に対する送達エネルギーの量（ジュール／ｍＬ）および熱（３７℃、３０分間）に関する超音波処理の影響。
【0009】
【図3】ＯＤＴ分析による、Ｈ３Ｎ２ Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１ ＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘの分散に対する投入エネルギー（振幅）の強度に関する超音波処理の影響。
【0010】
【図4】超音波処理が、非処理サンプルおよびＰＳ８０処理サンプルと比較して、凝集物を効果的に分散させ、Ｈ３Ｎ２ Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２１０／２００９ ＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘの分散状態を時間を経て維持することを示すＯＤＴ結果。
【0011】
【図5】２４週間にわたってＤＬＳによって分析した、Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２１０／２００９の（Ａ）非処理、（Ｂ）ＰＳ８０処理および（Ｃ）超音波処理Ｈ３Ｎ２ ＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘの平均強度粒度分布（ＰＳＤ）（ｎ＝５）。
【0012】
【図6】２４週間にわたる、非処理、界面活性剤（ＰＳ８０）処理および超音波処理したＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘ（Ｈ３Ｎ２； Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２１０／２００９）の単一放射免疫拡散（ＳＲＩＤ）分析。
【0013】
【図7】ＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘ（ＭＰＨ）、超音波処理後ＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘ（超音波処理ＭＰＨ）およびポリソルベート８０の存在下のＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘ（ＭＰＨ＋ＰＳ８０）を表すＥＭ顕微鏡写真。全てのサンプルを、０ヶ月、１ヶ月、２ヶ月および６ヶ月の時点でＥＭによって分析した。
【0014】
【図8】０ヶ月、３ヶ月および６ヶ月の時点での超音波処理（Ｓｏｎ）前および超音波処理後のインフルエンザの４つの季節性株（Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｈ１Ｎ１）、Ｂ／Ｈｕｂｅｉ－Ｗｕｊｉａｇａｎｇ／１５８／２００９（Ｂ Ｙａｍａｇａｔａ）およびＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８（Ｂ Ｖｉｃｔｏｒｉａ））についてのＯＤＴ結果。
【0015】
【図9】６ヶ月間にわたってＤＬＳによって分析した、Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１（Ａ、Ｂ）、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９（Ｃ、Ｄ）、Ｂ／Ｈｕｂｅｉ－Ｗｕｊｉａｇａｎｇ／１５８／２００９（Ｅ、Ｆ）およびＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８（Ｇ、Ｈ）に関する非処理（左）および超音波処理（右）ＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘ材料の平均粒度分布（ＰＳＤ）（ｎ＝５）。
【0016】
【図10】６０ｍｌ、５００ｍｌおよび１０００ｍｌの種々のＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘバッチ体積に関する、ＯＤＴ≧８０％に相当するＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘバッチ体積（ＭＰＨ体積ｍＬ）にわたる超音波処理曝露時間（分）。
【0017】
【図11】６０ｍｌ、５００ｍｌおよび１０００ｍｌの種々のＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘバッチ体積に関する、ＯＤＴ≧８０％に相当する処理時間にわたる超音波処理投入エネルギー。
【0018】
【図12】ＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘのバッチ体積（６０ｍｌ、５００ｍｌおよび１０００ｍｌ）に対してフロースルーデバイスを使用する、ＯＤＴ≧８０％を達成するために必要とされる超音波処理投入エネルギー。
【0019】
【図13】ＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘにおける凝集の量（％ＯＤＴとして示される）と、ＨＡ分子上に存在するグリコシル化部位の推定数との間の線形的関係性。
【発明を実施するための形態】
【0020】
詳細な説明
本開示は、ＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘとして本明細書で以降言及されるインフルエンザウイルスワクチン（ＩＶＶ）薬物物質またはＩＶＶ薬物製品中で凝集した材料を効果的に分散させる超音波処理方法の使用を記載する。超音波処理の実行可能性を、インフルエンザウイルスのＨ３Ｎ２株に対して評価した。なぜならこのインフルエンザＡ亜株は、非Ｈ３Ｎ２株およびＢインフルエンザと比較して、最高の凝集レベルを示すからである。
本開示は、ＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘとして本明細書で以降言及されるインフルエンザウイルスワクチン（ＩＶＶ）薬物物質またはＩＶＶ薬物製品中で凝集した材料を効果的に分散させる超音波処理方法の使用を記載する。超音波処理の実行可能性を、インフルエンザウイルスのＨ３Ｎ２株に対して評価した。なぜならこのインフルエンザＡ亜株は、非Ｈ３Ｎ２株およびＢインフルエンザと比較して、最高の凝集レベルを示すからである。
【0021】
本開示の一例は、タンパク質凝集の阻害は一般に、製剤への適合性の賦形剤の添加によって達成されるため以前に認められていなかったアプローチを提供する。例えば、賦形剤（例えば、糖、ポリオール、アミノ酸、塩、ポリマーおよび界面活性剤）は、優先的な相互作用［（Ａｒａｋａｗａら（１９９１）； Ｔｉｍａｓｈｅｆｆ （１９９８）］、タンパク質折りたたみの速度の増大［Ｗａｎｇら（１９９５）； Ｆｒｙｅ ａｎｄ Ｒｏｙｅｒ （１９９７）］、溶媒接近性およびコンホメーション可動性の低減［Ｋｅｎｄｒｉｃｋら（１９９７）］、ならびに溶媒粘性の増大［Ｊａｃｏｂ ａｎｄ Ｓｃｈｍｉｄ
（１９９９）］により凝集物を安定化させることが見出されている。
（１９９９）］により凝集物を安定化させることが見出されている。
【0022】
本開示は、ワクチンの免疫原性に有害に影響を及ぼし得、ワクチンを受容する個体において望ましくない副作用を引き起こし得る、これらの添加剤の必要性を回避する。
【0023】
１つの例において、本開示は、インフルエンザタンパク質を含む調製物中で凝集した材料を分散させる方法であって、上記方法は、上記調製物を超音波処理に供する工程を包含する方法を提供する。
【0024】
別の例において、本開示は、インフルエンザワクチンを生成する方法であって、上記方法は、不活性化またはスプリットインフルエンザビリオンを含む調製物を生成する工程および上記調製物を超音波処理する工程を包含する方法を提供する。
【0025】
超音波処理のための調製物は、全ビリオン、スプリットビリオン、サブユニットワクチンまたは組換えワクチンであり得る。上記調製物の無菌性のための濾過を容易にするために、凝集物のパーセンテージが最終調製物中で１０％未満であることが好ましい。
【0026】
一例において、上記調製物は、インフルエンザヘマグルチニンを含み、例えば、上記調製物は、スプリットインフルエンザビリオンを含む。１つの例において、上記調製物は、界面活性剤を実質的に含まない。本明細書で使用される場合、語句「界面活性剤を実質的に含まない」とは、０．０２％未満のレベルを有することを意味する。例えば、界面活性剤のレベルは、２００ｐｐｍ未満である。さらなる例において、界面活性剤のレベルは、５０ｐｐｍ未満である。
【0027】
代表的には、上記超音波処理は、上記調製物に存在する凝集物のうちの少なくとも５０％が分散されるように、ある時間にわたってある強度で行われる。凝集物の分散のために生成される超音波処理エネルギーは、３つの方法のうちの１つによって標的ＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘへと送達されうる：（１）エネルギーがＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘ中に懸濁されたソニケータープローブを介して直接伝達される、（２）ＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘがフロースルーデバイスの中に取り囲まれたソニケーターのプローブ先端の振動先端を通過する、または（３）金属またはガラス管を経た、ＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘが通過する場所への間接的エネルギー伝達。全ての超音波処理方法は、少なくとも８９ジュール／ｍＬのエネルギーの伝達を、ＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘ内の凝集物のうちの少なくとも５０％を分散させるために必要とする。
【0028】
本開示の方法によって生成されるワクチンは、一価季節性ワクチンまたは一価パンデミックワクチンであり得る。別の例において、本開示のワクチンは、三価および四価ワクチンのような多価ワクチンである。
【0029】
本開示の方法によって生成されるワクチンは、代表的には、インフルエンザＡおよびインフルエンザＢ抗原を含み、例えば、凝集した材料を実質的に含まない。１つの例において、語句「凝集した材料を実質的に含まない」とは、材料のうちの５０％超（約９０ジュール／ｍＬ超音波処理）が集塊化されていないことを意味する。さらなる例において、材料のうちの少なくとも６０％（約１３４ジュール／ｍＬ超音波処理）、７０％（約１７８ジュール／ｍＬ超音波処理）または８０％（約２２３ジュール／ｍＬ超音波処理）が、集塊化されていない。別の例において、材料のうちの少なくとも９０％（約２６７ジュール／ｍＬ超音波処理）が、集塊化されていない。
【0030】
以下で記載されるように、本開示の方法は、多くの予測外の利益を提供する。第１に、上記方法は、インフルエンザ抗原調製物に存在する凝集物を分散させるにあたって高度に効率的である。驚くべきことに、これらの分散した凝集物は、長期間の貯蔵（４℃）にもかかわらず、再集塊化しない。さらに、本開示の方法を使用して生成したワクチンは、同じ抗原を含むが、処理しなかったかまたは凝集物を分散させるために添加剤で処理したワクチンより、フェレットモデルにおいてより強い免疫応答を誘発し得ることが示された。
【0031】
本明細書全体を通じて、別段文脈が要求しなければ、文言「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」またはバリエーション（例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、述べられた要素もしくは整数、または要素もしくは整数の群の包含を意味し、いかなる他の要素もしくは整数、または要素もしくは整数の群の排除も意味しないことが理解される。
【0032】
任意の先行する刊行物（またはそこから得られる情報）への、または公知の任意の事項への本明細書中での言及は、先行する刊行物（またはそこから得られる情報）または公知の事項が、本明細書が関連する注力分野における技術常識の一部を形成するという承認もしくは自認または何らかの形態の示唆として解釈されず、解釈されるべきではない。
【0033】
本明細書中で言及される全ての刊行物は、それらの全体において本明細書に参考として援用される。
【0034】
本明細書で使用される場合、単数形「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、および「上記（ｔｈｅ）」は、文脈が別段明示的に規定しなければ、複数形をも含むことが注記されなければならない。従って、例えば、「ある薬剤（ａｎ ａｇｅｎｔ）への言及は、単一の薬剤、および２つまたはこれより多くの薬剤も含む；「ある分子（ａ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」への言及は、単一の分子、および２つまたはこれより多くの分子も含む；など。
【実施例0035】
方法
ＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘの超音波処理
直接プローブ超音波処理方法
ＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘを、ソニケーターホーン／プローブをビーカー内に含まれるサンプルへと直接浸けることによって、「直接」超音波処理方法を使用して処理した。
ＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘの超音波処理
直接プローブ超音波処理方法
ＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘを、ソニケーターホーン／プローブをビーカー内に含まれるサンプルへと直接浸けることによって、「直接」超音波処理方法を使用して処理した。
【0036】
Ｂｒａｎｓｏｎ Ｍｏｄｅｌ ４５０ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ（登録商標）（Ｂｒａｎｓｏｎ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ）を使用して、超音波処理を行い、これは４つの構成要素（電源装置、モデル１０２Ｃコンバーターおよび０．５インチタップ付きホーンを含む）から構成された。
【0037】
超音波処理プロセスの効率を評価するために、Ｂａｎｄｅｌｉｎ ＳＯＮＯＰＵＬＳ Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ（Ｂａｎｄｅｌｉｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ．
ＫＧ）を使用した。その構成は、ＧＭ３２００ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ電源装置、ＵＷ３２００コンバーター、ＳＨ２１３ＧブースターおよびＴＴ１３ １３ｍｍ チタン先端からなった。ＩＶＶ薬物物質材料の超音波処理を、Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｃａｔｏｒに関して記載される方法に従って、ビーカーの中で行った。
ＫＧ）を使用した。その構成は、ＧＭ３２００ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ電源装置、ＵＷ３２００コンバーター、ＳＨ２１３ＧブースターおよびＴＴ１３ １３ｍｍ チタン先端からなった。ＩＶＶ薬物物質材料の超音波処理を、Ｂｒａｎｓｏｎ Ｓｏｎｉｃａｔｏｒに関して記載される方法に従って、ビーカーの中で行った。
【0038】
ＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘサンプルを、１０ｍｌバッチにおいて調製し、清浄な３０ｍｌビーカーの中に入れ、これを、ソニケータープローブがサンプル溶液の中に十分に浸かる状態にして（すなわち、ソニケーター先端とビーカーの基部との間の距離は、およそ１ｍｍであった）、クランプスタンド上に固定した。次いで、超音波処理を、エネルギー伝達の速度（振幅）を変動させながら、ある範囲の投入エネルギーを送達して行った：
【0039】
送達した超音波処理エネルギーの範囲を、ＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘの１ミリリットルあたりのジュール（エネルギー）として測定したところ、０ジュール／ｍＬ、８３ジュール／ｍＬ、１６５ジュール／ｍＬ、２５９ジュール／ｍＬ、３４５ジュール／ｍＬを含んだ。
【0040】
上記サンプルの過熱を回避するために、超音波処理を少なくとも２回に分けて行い、処理間では上記ビーカーを、氷上で短時間静置して冷却した。最後の超音波処理したＩＶＶ薬物物質サンプルを、プラスチックチューブへと移し、さらなる分析の前に２～８℃において貯蔵した。
【0041】
フロースルー超音波処理方法
超音波処理プロセスの拡張性を評価するために、フロースルーデバイスを取り付けたＢａｎｄｅｌｉｎ ＳＯＮＯＰＵＬＳ Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ（Ｂａｎｄｅｌｉｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ． ＫＧ）を、使用した。その構成は、ＧＭ３２００
Ｓｏｎｉｆｉｅｒ電源装置、ＵＷ３２００コンバーター、ＳＨ２１３Ｇブースター、ＴＴ１３ １３ｍｍチタン先端およびＤＧ ４ Ｇ フロースルー処理容器からなった。ＩＶＶ薬物物質材料の超音波処理を、ソニケーターのフロースルーデバイスを通して、５２０Ｕ蠕動ポンプ（Ｗａｔｓｏｎ ＆ Ｍａｒｌｏｗ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ）によって循環させた。
超音波処理プロセスの拡張性を評価するために、フロースルーデバイスを取り付けたＢａｎｄｅｌｉｎ ＳＯＮＯＰＵＬＳ Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ（Ｂａｎｄｅｌｉｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ＧｍｂＨ ＆ Ｃｏ． ＫＧ）を、使用した。その構成は、ＧＭ３２００
Ｓｏｎｉｆｉｅｒ電源装置、ＵＷ３２００コンバーター、ＳＨ２１３Ｇブースター、ＴＴ１３ １３ｍｍチタン先端およびＤＧ ４ Ｇ フロースルー処理容器からなった。ＩＶＶ薬物物質材料の超音波処理を、ソニケーターのフロースルーデバイスを通して、５２０Ｕ蠕動ポンプ（Ｗａｔｓｏｎ ＆ Ｍａｒｌｏｗ， Ａｕｓｔｒａｌｉａ）によって循環させた。
【0042】
凝集した材料の測定
光学密度濁度（ＯＤＴ）アッセイ
ワクチン中間生成物ＩＶＶ薬物物質中の凝集していない材料の程度を評価するために、回収したタンパク質のレベルを、軽度の遠心力の適用後に上清のＡ２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を利用して、決定した（Ｔａｙら： Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ
ａｌｔｅｒｎａｔｅ ｔｅｓｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖａｃｃｉｎｅ． Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ２０１５ １１ （７） １６７３－８４）。遠心分離後のペレット中のタンパク質の割合は、サンプル内の凝集した材料の程度に直接相関するので、上清中のより高い回収率は、分散したタンパク質のより大きな割合に相当する。このアッセイを、光学密度濁度（ＯＤＴ）法と称した；タンパク質回収値は、０～１００％の範囲であり（ここでは％ ＯＤＴとして示した）、サンプル中の分散タンパク質の量に伴って増大する。
光学密度濁度（ＯＤＴ）アッセイ
ワクチン中間生成物ＩＶＶ薬物物質中の凝集していない材料の程度を評価するために、回収したタンパク質のレベルを、軽度の遠心力の適用後に上清のＡ２８０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）を利用して、決定した（Ｔａｙら： Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ ｉｎｔｏ
ａｌｔｅｒｎａｔｅ ｔｅｓｔｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖａｃｃｉｎｅ． Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ２０１５ １１ （７） １６７３－８４）。遠心分離後のペレット中のタンパク質の割合は、サンプル内の凝集した材料の程度に直接相関するので、上清中のより高い回収率は、分散したタンパク質のより大きな割合に相当する。このアッセイを、光学密度濁度（ＯＤＴ）法と称した；タンパク質回収値は、０～１００％の範囲であり（ここでは％ ＯＤＴとして示した）、サンプル中の分散タンパク質の量に伴って増大する。
【0043】
上記アッセイのいくつかの属性を、３つのインフルエンザ株（Ｈ１Ｎ１；Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９、Ｈ３Ｎ２；Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１およびＢ；Ｂ／Ｈｕｂｅｉ Ｗｕｊｉａｇａｎｇ／１５８／１５８／２００９を含む）に関して評価した。検証結果は、反復性（％ＣＶ）が２．９％、３．１％および３．１％（それぞれ）、精度のロット間変動性（％ＣＶ）が８．８％、６．５％および３．４％（それぞれ）、室内再現精度が０．４％、６．３％および０．２％（それぞれ）、実施者間の統計的に有意でない差がｐ＝０．８１、０．１３および０．７８（それぞれ）であり、期待される結果と観察された結果との間の予測可能な線形性は（Ｒ＝０．９６８５）を示した。季節性ワクチンサブタイプ：Ｈ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２およびインフルエンザＢを表すＩＶＶ薬物物質のレプリケートロットに関する代表的％ＯＤＴプロフィールを、図１に詳述する。
【0044】
さらにこのアッセイは、動的光散乱（ＤＬＳ）および非対称フィールドフロー分画（Ａ４Ｆ）を含む、凝集特徴付けの代替法と相関した。ＯＤＴ分析からの低レベルの変動は、このアッセイが、中間ワクチン材料における凝集の評価に非常に適していることを示した。
【0045】
動的光散乱（ＤＬＳ）
ＤＬＳによる粒度分析を、サンプル内の凝集特徴をさらに理解するためのＯＤＴアッセイの補完的方法として使用した。ＤＬＳ技術は、粒子のその周りの溶媒分子との衝突に起因するランダムな運動である、溶液中のタンパク質のブラウン運動の測定に基づく。ブラウン運動は、ＤＬＳによって測定される散乱光の強度において時間依存性の揺動を誘導し、サンプルの粒度分布（ＰＳＤ）を生じる。
ＤＬＳによる粒度分析を、サンプル内の凝集特徴をさらに理解するためのＯＤＴアッセイの補完的方法として使用した。ＤＬＳ技術は、粒子のその周りの溶媒分子との衝突に起因するランダムな運動である、溶液中のタンパク質のブラウン運動の測定に基づく。ブラウン運動は、ＤＬＳによって測定される散乱光の強度において時間依存性の揺動を誘導し、サンプルの粒度分布（ＰＳＤ）を生じる。
【0046】
ＤＬＳ測定を、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ Ｓｅｒｉｅｓ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｌｔｄ）を使用して行った。分析した各サンプルの密度（ＤＡ－１００Ｍ Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｍｅｔｅｒ， Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ）、粘性（Ｌｏｖｉｓ ２０００Ｍ Ｍｉｃｒｏｖｉｓｃｏｍｅｔｅｒ， Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ）および屈折率（３０ＧＳ Ｒｅｆｒａｃｔｏｍｅｔｅｒ， Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ）を含む、溶液中の粒子のブラウン運動に影響を及ぼすいくつかの特性を予め決定した。サンプルの事前処理は、不安定でありかつ後で分析に干渉する大きな粒子を含む任意の外来の材料または沈殿を除去するために、１分間、８０００ｒｐｍでの遠心分離を含んだ。次いで、各サンプルの得られた上清成分を引抜き、ＤＬＳによって評価した；各サンプル測定は、後方散乱角度１７３°で行い、温度２５℃で３分間平衡化した５個のレプリケート（ｎ＝５）に基づいた。
【0047】
インフルエンザ抗原性評価
単一放射免疫拡散（ＳＲＩＤ）
ＳＲＩＤアッセイを、以前に記載されるように行った［Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ， １９８０］。簡潔には、参照および試験抗原材料を、１％ Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ溶液（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ， Ｄａｒｍｓｔａｄｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を含むＰＢＳ－中で１：１、２：３および１：３希釈し、ポリクローナル抗血清を含むアガロースゲルの２反復のウェルに添加した。ゲルを、加湿チャンバの中で７２時間インキュベートし、ガラスプレート上で乾燥させ、クーマシーブリリアントブルーＲ－２５０（Ｓｉｇｍａ，
Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， ＵＳＡ）で染色した。抗原－抗体沈殿物の円形のゾーンを測定し、ＨＡ濃度を、ＩＺＰ標準と比較して、平行線バイオアッセイ法によって計算し（１５）、試験の有効性を、「ｇ」検定を使用して確認した（ｇ≦０．０６１）（１６）。
電子顕微鏡法（ＥＭ）による画像化
単一放射免疫拡散（ＳＲＩＤ）
ＳＲＩＤアッセイを、以前に記載されるように行った［Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ， １９８０］。簡潔には、参照および試験抗原材料を、１％ Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ溶液（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ， Ｄａｒｍｓｔａｄｔ， Ｇｅｒｍａｎｙ）を含むＰＢＳ－中で１：１、２：３および１：３希釈し、ポリクローナル抗血清を含むアガロースゲルの２反復のウェルに添加した。ゲルを、加湿チャンバの中で７２時間インキュベートし、ガラスプレート上で乾燥させ、クーマシーブリリアントブルーＲ－２５０（Ｓｉｇｍａ，
Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ， ＵＳＡ）で染色した。抗原－抗体沈殿物の円形のゾーンを測定し、ＨＡ濃度を、ＩＺＰ標準と比較して、平行線バイオアッセイ法によって計算し（１５）、試験の有効性を、「ｇ」検定を使用して確認した（ｇ≦０．０６１）（１６）。
電子顕微鏡法（ＥＭ）による画像化
【0048】
陰性染色ＥＭを、Ｈａｙａｔ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ（１９９０）が採用したアガー重層濾過法（ａｇａｒ ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）によって行った。各サンプルの３個のグリッドを準備した；ＩＶＶ薬物物質を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．２）で１／５０に希釈して、不連続単層を提供した。サンプル（１μＬ）を、ｆｏｒｍｖａｒコーティングした銅電子顕微鏡グリッドに塗布し、次いで、これを２％ｗ／ｖ アガープレート上に裏返しにして載せた。上記アガープレートにグリッドを据えると（すなわち、液体がアガーによって吸収される）、上記グリッドは、陰性染色液の液滴（ｐＨ７．０の２％ｗ／ｖ リンタングステン酸ナトリウム）上に浮いた。次いで、２０秒後に、上記グリッドを持ち上げ、過剰な染色液を、グリッドの縁に破ったＷｈａｔｍａｎ Ｎｏ． １濾紙の小片を接触させることによって除去した。染色液の残った薄い膜を、電子顕微鏡による検鏡前に風乾するまで放置した。
【0049】
結果
超音波処理による凝集したＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘの破壊
凝集した材料を分散させるために最も有効な方法を、界面活性剤による破壊後に最高のレベルの凝集した材料を形成する傾向があることから、インフルエンザのＨ３Ｎ２亜株を使用して決定した。いくつかの方法を評価して、界面活性剤による破壊後の凝集した材料が分散し得るか否かを立証した。
超音波処理による凝集したＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘの破壊
凝集した材料を分散させるために最も有効な方法を、界面活性剤による破壊後に最高のレベルの凝集した材料を形成する傾向があることから、インフルエンザのＨ３Ｎ２亜株を使用して決定した。いくつかの方法を評価して、界面活性剤による破壊後の凝集した材料が分散し得るか否かを立証した。
【0050】
第１のアプローチは、超音波処理による高周波数音波を使用して、Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１、亜株Ｈ３Ｎ２のＩＶＶ薬物物質材料内で凝集物を分散させることを含んだ（図２）。直接超音波処理方法を使用し、この方法において、限局的かつ高強度の超音波エネルギーを、プローブからサンプルを含むビーカーへと直接伝えることができた。サンプル（１０ｍｌバッチにおいて調製）を、８３ジュール／ｍＬ～３４５ジュール／ｍＬの範囲に及ぶ超音波処理投入エネルギー範囲に供し、分散の程度を、ＯＤＴアッセイによって評価した。その結果は、投入エネルギーの量と脱会合した凝集物のレベルとの間で線形的関係性を示す。すなわち、％ＯＤＴ値は、非処理の場合の４０％と比較して、超音波処理後に５０％～８０％の範囲に及んだ（図２）。興味深いのは、分散のレベルが２５９ジュール／ｍＬで最大に達し、そこから分散のさらなる増大は観察されなかったことであった。対照的に、ＩＶＶ薬物物質の軽度の加熱および撹拌（６００ｒｐｍで撹拌しながら３７℃で３０分）は、分散した材料のレベルを変化させなかった。
【0051】
エネルギーがＩＶＶ薬物物質に伝えられる強度を、曝露時間を全てのサンプルに関して０．７０ｓ／ｍｌで一定にしたまま、超音波処理振幅（０～１００％）を調節することによって探った。ＯＤＴ結果は、伝達されるエネルギー量に関して以前に認められたとおりの予測可能な傾向を示し、ＩＶＶ薬物物質における分散の程度は、曝露時間を一定に維持した場合、超音波処理振幅とともに増大した（図３）。超音波処理エネルギー伝達の最適速度は、８０％振幅で達成された。それを超えても、凝集物の脱会合のレベルにさらなる上昇は認められない。これらの結果は、８０％が凝集物を脱会合するための最適振幅（すなわち、エネルギー伝達速度）であることを示唆する。
【0052】
ＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘ材料を分散させるための超音波処理の実行可能性
受容可能となるために、不活性化ワクチンは、一定の品質属性を必要とする。すなわち、ある方法が、凝集した材料を分散させることが示されている場合、その材料がこの特徴を維持することが重要である。
受容可能となるために、不活性化ワクチンは、一定の品質属性を必要とする。すなわち、ある方法が、凝集した材料を分散させることが示されている場合、その材料がこの特徴を維持することが重要である。
【0053】
界面活性剤であるポリソルベート８０（ＰＳ８０）の存在下および非存在下の両方で、Ｈ３Ｎ２ Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２１０／２００９のＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘ中で凝集した材料を分散させる方法として、超音波処理の実行可能性を評価するために、２４週間にわたる試験を行った。サンプルの種々の特徴をモニターするために、多数の試験を使用した（凝集評価に関してのＯＤＴおよびＤＬＳ、抗原性に関しての単一放射免疫拡散（ＳＲＩＤ）、および形態的画像化に関しての電子顕微鏡法（ＥＭ）を含む）。
【0054】
ＯＤＴおよびＤＬＳによる凝集挙動
非処理、超音波処理およびＰＳ８０処理したＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘの凝集特徴を、ＯＤＴアッセイおよびＤＬＳによって評価した。ＯＤＴ分析は、超音波処理（少なくとも２００ジュール／ｍＬ）後に、ＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘ中の分散した材料のレベルが、非超音波処理材料に関する４０％（時間０で）と比較して、８０％に達することを示した（図４）。この分散レベルは、４℃で２４週間経過しても一定のままであった。これは、不可逆的な分散状態を示す（図４）。さらに、コントロール（非処理）材料の分散またはさらなる凝集は、この時間を経ても増大しなかった。界面活性剤（０．１％
ＰＳ８０）を添加しても、最初のレベルと比較して、この材料における凝集物のレベルに対して特筆すべき影響はなかった。よって、このことは、ＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘ材料の凝集のレベルは、界面活性剤での破壊後に設定されることを示した。
非処理、超音波処理およびＰＳ８０処理したＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘの凝集特徴を、ＯＤＴアッセイおよびＤＬＳによって評価した。ＯＤＴ分析は、超音波処理（少なくとも２００ジュール／ｍＬ）後に、ＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘ中の分散した材料のレベルが、非超音波処理材料に関する４０％（時間０で）と比較して、８０％に達することを示した（図４）。この分散レベルは、４℃で２４週間経過しても一定のままであった。これは、不可逆的な分散状態を示す（図４）。さらに、コントロール（非処理）材料の分散またはさらなる凝集は、この時間を経ても増大しなかった。界面活性剤（０．１％
ＰＳ８０）を添加しても、最初のレベルと比較して、この材料における凝集物のレベルに対して特筆すべき影響はなかった。よって、このことは、ＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘ材料の凝集のレベルは、界面活性剤での破壊後に設定されることを示した。
【0055】
ＯＤＴアッセイとともに、サンプルをＤＬＳによって分析して、凝集をさらに特徴づけた。各サンプルに関して、ＤＬＳ測定（ｎ＝５）により、粒度分布（ＰＳＤ）の強度を生成したが、これは、種々のサイズ集団の粒子によって分散した光の相対的強度を示す。ＤＬＳの結果は、全３つのサンプルに関してＯＤＴの結果との密接な相関を明らかにした（図５）。例えば、非処理およびＰＳ８０処理ＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘサンプルは、ピークが６０ｎｍ、４００ｎｍおよび７０００ｎｍに存在する多峰性のＰＳＤを示し、従って、内部の凝集物を示した（図５ＡおよびＢ）。しかし、超音波処理は、単一の明瞭なピークが３００ｎｍに存在する単峰性の分布を生じた。これは、凝集物を欠く、均一かつ十分に分散したサンプルを示唆する（図５Ｃ）。各分析時点で、全てのサンプルは、再現性のあるＰＳＤを生じ、さらに２４週間の期間を経ても変化しないままであった。
【0056】
ＳＲＩＤおよびＥＩＡによる抗原性
抗原性材料のレベルをＳＲＩＤによって評価して、超音波処理または界面活性剤の添加が、インフルエンザ抗原に影響するか否かを決定した。ＳＲＩＤ分析は、上記材料が超音波処理されているか、界面活性剤の存在下で処理されているかにかかわらず、抗原性材料のレベルが、非処理サンプルと同じ効力で残っており、時間を経ても一定であることを示した（表１、図６）。
抗原性材料のレベルをＳＲＩＤによって評価して、超音波処理または界面活性剤の添加が、インフルエンザ抗原に影響するか否かを決定した。ＳＲＩＤ分析は、上記材料が超音波処理されているか、界面活性剤の存在下で処理されているかにかかわらず、抗原性材料のレベルが、非処理サンプルと同じ効力で残っており、時間を経ても一定であることを示した（表１、図６）。
【表1】
【0057】
ＥＭによる形態的画像化
ＥＭによる画像化を使用して、０ヶ月、１ヶ月、２ヶ月および６ヶ月の時点でのサンプルの形態的外観を調べた（図７）。顕著な差異が、超音波処理およびコントロールのＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘサンプル間で観察された。コントロール／非処理のＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘ（ＰＳ８０ありおよびなし）は、顕微鏡写真においてより暗い領域によって表されるように、全６ヶ月の時間経過の間中、顕著な量の凝集物を含んだ。対照的に、超音波処理したＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘは、サイズが低減したより少ない凝集物を含み、上記材料の外観は、試験した期間にわたって一定のままであった。これらの観察は、ＯＤＴ分析およびＤＬＳ分析の両方から得られた結果を反映したが、その両方の分析において、超音波処理した材料は、非処理または界面活性剤（ＰＳ８０）を組み込んだＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘより明らかに分散していた。
ＥＭによる画像化を使用して、０ヶ月、１ヶ月、２ヶ月および６ヶ月の時点でのサンプルの形態的外観を調べた（図７）。顕著な差異が、超音波処理およびコントロールのＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘサンプル間で観察された。コントロール／非処理のＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘ（ＰＳ８０ありおよびなし）は、顕微鏡写真においてより暗い領域によって表されるように、全６ヶ月の時間経過の間中、顕著な量の凝集物を含んだ。対照的に、超音波処理したＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘは、サイズが低減したより少ない凝集物を含み、上記材料の外観は、試験した期間にわたって一定のままであった。これらの観察は、ＯＤＴ分析およびＤＬＳ分析の両方から得られた結果を反映したが、その両方の分析において、超音波処理した材料は、非処理または界面活性剤（ＰＳ８０）を組み込んだＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘより明らかに分散していた。
【0058】
インフルエンザの全ての季節性株への超音波処理の適用可能性
Ｈ３Ｎ２は、他の季節性株と比較して、最高の凝集レベルを示す（図１）が、この方法が全ての株の凝集物を破壊できることを示すことは、必須である。４つの季節性株を、超音波処理（少なくとも２００ジュール／ｍＬ）前および処理後、６ヶ月間の期間にわたって分散した凝集物レベルに関して試験した（図８）。試験した全てのウイルス調製物において、超音波処理の適用は分散した材料のレベルを増大させ、この材料は、６ヶ月間の期間にわたって分散したままであった。超音波処理した際の凝集物分散の上昇は、Ｙａｍａｇａｔａ系統およびＶｉｃｔｏｒｉａ系統から派生した２つのインフルエンザＢウイルスとの比較において、インフルエンザＡ、Ｈ３Ｎ２およびＨ１Ｎ１の２つの亜株に対してより顕著であると思われた。例えば、分散した材料のレベルは、Ｂ株に関しての３～１０％増大と比較して、２つのＡ株に関してはおよそ６０～１００％増大した。
Ｈ３Ｎ２は、他の季節性株と比較して、最高の凝集レベルを示す（図１）が、この方法が全ての株の凝集物を破壊できることを示すことは、必須である。４つの季節性株を、超音波処理（少なくとも２００ジュール／ｍＬ）前および処理後、６ヶ月間の期間にわたって分散した凝集物レベルに関して試験した（図８）。試験した全てのウイルス調製物において、超音波処理の適用は分散した材料のレベルを増大させ、この材料は、６ヶ月間の期間にわたって分散したままであった。超音波処理した際の凝集物分散の上昇は、Ｙａｍａｇａｔａ系統およびＶｉｃｔｏｒｉａ系統から派生した２つのインフルエンザＢウイルスとの比較において、インフルエンザＡ、Ｈ３Ｎ２およびＨ１Ｎ１の２つの亜株に対してより顕著であると思われた。例えば、分散した材料のレベルは、Ｂ株に関しての３～１０％増大と比較して、２つのＡ株に関してはおよそ６０～１００％増大した。
【0059】
ＯＤＴ結果を、全４つのインフルエンザ株のＤＬＳ分析から得たデータによってさらに確証した。０ヶ月、３ヶ月および６ヶ月において各サンプルについて５つのレプリケート測定から得られた強度ＰＳＤを、図８に示す。Ａ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１の非処理サンプルは、その多峰性のプロフィールから種々のサイズの集団の凝集物の存在を示した（図９Ａ）。それに対して、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／７／２００９、Ｂ／Ｈｕｂｅｉ－Ｗｕｊｉａｇａｎｇ／１５８／２００９およびＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８のＰＳＤは、より単峰性の構造を有し、従って、より均一な粒子集団を示唆した（それぞれ、図９Ｃ、Ｅ、Ｇ）。超音波処理後に、全４株は、いかなる凝集物をも含まない充分に分散したＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘに特徴的である分布を示した（図９Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ）。
【0060】
超音波処理したＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘの安定性およびバッチの一貫性
４つのワクチン候補タイプ／サブタイプを代表するＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘを超音波処理して、目標の凝集物分散レベルを達成するために制御されたエネルギーレベル（ジュール／ｍｌ）を適用することの一貫性および安定性の両方を決定した（表２、図８）。各代表株に関するＩＶＶ薬物材料を、６つの部分アリコートに分けた。その６つのアリコートのうちの３つを、独立して、少なくとも２００ジュール／ｍＬの超音波処理に曝露し、それらの非超音波処理コントロール群とともに、２～８℃において６ヶ月まで貯蔵した。０ヶ月、１ヶ月、３ヶ月および６ヶ月において全ての群からサンプルを採取し、存在する凝集物のレベルに関してＯＤＴによって分析した。インフルエンザＡ株サブタイプ：Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９およびＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１内の全ての下位ロットに関して、非超音波処理コントロールと比較した場合に、超音波処理サンプルにおいて分散した凝集物のレベルの有意な変化を観察した。両方の代表的インフルエンザＡ株に関して独立して超音波処理した下位ロットの間で優れた一貫性が存在した。時間０では、上記Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２株の全３つの下位ロットが、超音波処理後に目標％ＯＤＴ（＞８０％）を満たした（それぞれ、％ＣＶは２．１％および１．１％であり、十分に１０％限界の範囲内）。凝集物分散のレベルにおけるより少ない変化が、コントロール群に存在する凝集物の低含有量に起因して、Ｂ株を代表するロットにおいて観察された。超音波処理後に、上記Ｂ株下位ロットは、Ａ株を代表するロットと同じレベルのバッチ間一貫性を示した（時間０でのＢ／Ｈｕｂｅｉ Ｗｕｊｉａｇａｎｇ／１５８／２００９およびＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８に関する％ＣＶは、それぞれ、１．２％および０．７％）。重要なことには、全４つの季節性インフルエンザ株を代表する下位ロットは、全６ヶ月間の時間経過にわたってそれらの上昇した％ＯＤＴレベルおよびバッチ間一貫性を維持した。これは、超音波処理による凝集物破壊が恒久的であることを示唆する。
４つのワクチン候補タイプ／サブタイプを代表するＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘを超音波処理して、目標の凝集物分散レベルを達成するために制御されたエネルギーレベル（ジュール／ｍｌ）を適用することの一貫性および安定性の両方を決定した（表２、図８）。各代表株に関するＩＶＶ薬物材料を、６つの部分アリコートに分けた。その６つのアリコートのうちの３つを、独立して、少なくとも２００ジュール／ｍＬの超音波処理に曝露し、それらの非超音波処理コントロール群とともに、２～８℃において６ヶ月まで貯蔵した。０ヶ月、１ヶ月、３ヶ月および６ヶ月において全ての群からサンプルを採取し、存在する凝集物のレベルに関してＯＤＴによって分析した。インフルエンザＡ株サブタイプ：Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９およびＡ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／３６１／２０１１内の全ての下位ロットに関して、非超音波処理コントロールと比較した場合に、超音波処理サンプルにおいて分散した凝集物のレベルの有意な変化を観察した。両方の代表的インフルエンザＡ株に関して独立して超音波処理した下位ロットの間で優れた一貫性が存在した。時間０では、上記Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２株の全３つの下位ロットが、超音波処理後に目標％ＯＤＴ（＞８０％）を満たした（それぞれ、％ＣＶは２．１％および１．１％であり、十分に１０％限界の範囲内）。凝集物分散のレベルにおけるより少ない変化が、コントロール群に存在する凝集物の低含有量に起因して、Ｂ株を代表するロットにおいて観察された。超音波処理後に、上記Ｂ株下位ロットは、Ａ株を代表するロットと同じレベルのバッチ間一貫性を示した（時間０でのＢ／Ｈｕｂｅｉ Ｗｕｊｉａｇａｎｇ／１５８／２００９およびＢ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／６０／２００８に関する％ＣＶは、それぞれ、１．２％および０．７％）。重要なことには、全４つの季節性インフルエンザ株を代表する下位ロットは、全６ヶ月間の時間経過にわたってそれらの上昇した％ＯＤＴレベルおよびバッチ間一貫性を維持した。これは、超音波処理による凝集物破壊が恒久的であることを示唆する。
【表2】
【0061】
ＨＡ上の推定グリコシル化部位の数と必要とされる超音波処理の量に関する線形的関係性
エンベロープの糖タンパク質；ヘマグルチニン（ＨＡ）は、インフルエンザウイルスが宿主細胞と結合し、一旦エンドソームに飲み込まれても消化から逃れることを可能にする、インフルエンザウイルスのシアル酸レセプター結合タンパク質である。ＨＡ分子の球状の頭部領域は、抗原性部位と重なり合い、これらの抗原性部位が抗体および主要組織適合遺伝子複合体により結合されるのを覆い隠すのに関与すると考えられるＮ結合型グリコシル化部位を含む（Ｓｋｅｈｅｌら， １９８４； Ｊａｃｋｓｏｎら， １９９４）。さらに、Ｎ－グリカンの構造上の複雑さは、ＨＡ－レセプター結合特異性と正に相関する（Ｔｓｕｃｈｉａら， ２００２）。ＨＡの球状頭部領域におけるＮ結合型グリコシル化部位の数は、Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２ヒトインフルエンザＡウイルスが進化する間に増大してきた（Ｓｕｚｕｋｉ． ２０１１）。本発明者らは、インフルエンザＡのＨＡ分子上の推定グリコシル化部位の数と存在する凝集のレベルとの間の関係性を決定した。グリコシル化部位の数を、ＮｅｔＮＧｌｙｃ １．０ Ｓｅｒｖｅｒ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＮＧｌｙｃ／）上で入手可能なアルゴリズムを使用して、確率スコアを計算することによって推定した。確率スコアを生成するために、問題の株のＨＡタンパク質配列をアルゴリズム提出パネルへと入力し、分析用に提出した。上記ソフトウェアは、確率の強度に応じて、１～３のプラス（＋）記号でスコア付けされる、入力配列内の推定グリコシル化部位の表を生成する。推定ＨＡグリコシル化部位確率スコア（ｐＧｌｙスコア）は、所与の出力配列に関するプラス記号の合計として定義される。本発明者らは、≧１６のｐＧｌｙスコアを有するＨ３Ｎ２株が≧９０ジュール／ｍＬの超音波処理を必要とし、≧１１のｐＧｌｙスコアを有するＨ１Ｎ１が、≧９０ジュール／ｍＬの超音波処理を必要とすることを提唱する（ここで材料のうちの５０％超は、集塊化されない）。
ＩＶＶ薬物物質を分散させるための代替の物理的破壊方法
ＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘを分散させる超音波処理の特有の能力を評価するために、他の物理的破壊法を試験した。これは、局所加熱（１秒および１０秒間のマイクロ波）および剪断力（２５往復および１００往復を使用するダウンス型ホモジナイゼーション）を含んだ。いずれの例でも、非処理材料と比較して、分散に顕著な差異はなかった（表４）。
エンベロープの糖タンパク質；ヘマグルチニン（ＨＡ）は、インフルエンザウイルスが宿主細胞と結合し、一旦エンドソームに飲み込まれても消化から逃れることを可能にする、インフルエンザウイルスのシアル酸レセプター結合タンパク質である。ＨＡ分子の球状の頭部領域は、抗原性部位と重なり合い、これらの抗原性部位が抗体および主要組織適合遺伝子複合体により結合されるのを覆い隠すのに関与すると考えられるＮ結合型グリコシル化部位を含む（Ｓｋｅｈｅｌら， １９８４； Ｊａｃｋｓｏｎら， １９９４）。さらに、Ｎ－グリカンの構造上の複雑さは、ＨＡ－レセプター結合特異性と正に相関する（Ｔｓｕｃｈｉａら， ２００２）。ＨＡの球状頭部領域におけるＮ結合型グリコシル化部位の数は、Ｈ１Ｎ１およびＨ３Ｎ２ヒトインフルエンザＡウイルスが進化する間に増大してきた（Ｓｕｚｕｋｉ． ２０１１）。本発明者らは、インフルエンザＡのＨＡ分子上の推定グリコシル化部位の数と存在する凝集のレベルとの間の関係性を決定した。グリコシル化部位の数を、ＮｅｔＮＧｌｙｃ １．０ Ｓｅｒｖｅｒ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＮｅｔＮＧｌｙｃ／）上で入手可能なアルゴリズムを使用して、確率スコアを計算することによって推定した。確率スコアを生成するために、問題の株のＨＡタンパク質配列をアルゴリズム提出パネルへと入力し、分析用に提出した。上記ソフトウェアは、確率の強度に応じて、１～３のプラス（＋）記号でスコア付けされる、入力配列内の推定グリコシル化部位の表を生成する。推定ＨＡグリコシル化部位確率スコア（ｐＧｌｙスコア）は、所与の出力配列に関するプラス記号の合計として定義される。本発明者らは、≧１６のｐＧｌｙスコアを有するＨ３Ｎ２株が≧９０ジュール／ｍＬの超音波処理を必要とし、≧１１のｐＧｌｙスコアを有するＨ１Ｎ１が、≧９０ジュール／ｍＬの超音波処理を必要とすることを提唱する（ここで材料のうちの５０％超は、集塊化されない）。
【表3】
ＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘを分散させる超音波処理の特有の能力を評価するために、他の物理的破壊法を試験した。これは、局所加熱（１秒および１０秒間のマイクロ波）および剪断力（２５往復および１００往復を使用するダウンス型ホモジナイゼーション）を含んだ。いずれの例でも、非処理材料と比較して、分散に顕著な差異はなかった（表４）。
【表4】
【0062】
結論
直接超音波処理方法の使用は、ＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘ内の凝集物を効果的に分散させることが見出された。サブタイプ：Ｈ３Ｎ２内のインフルエンザ株は、最高の凝集レベルを示す。プロセスの最適化は、ＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘに伝達されたエネルギー量および伝達が起こった速度が、凝集物分散のレベルの制御において必須であることを示した。超音波処理の速度（振幅）および／または曝露時間（秒）の増大は、線形的傾向で相関する凝集物脱会合のレベルの増大を生じた。分散レベルのプラトーが、ＯＤＴが９７％に達した後に観察され、その後、凝集物はほとんどまたはそれ以上分散しなかった（ＯＤＴによって測定した場合）。ＩＶＶ薬物物質において凝集物を分散させるための方法としての超音波処理の使用を、界面活性剤（ＰＳ８０）の存在下および非存在下の両方で、２４週間（６ヶ月間）という時間経過にわたって評価した。ＯＤＴ、ＤＬＳおよびＥＭを含むいくつかの特徴付け分析は、超音波処理したＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘが、非処理および界面活性剤処理サンプルと比較して、顕著に増大した量の分散した材料を含むことを明らかにした。凝集物分散の目標レベルに達するために必要とされる超音波処理の量は、推定可能であり、バッチ間で一致した。さらに、分散のレベルは、実行可能性試験の継続時間全体にわたって一貫したままであったので、安定なかつ恒久的に凝集物が分散した状態を示す。ＳＲＩＤによる免疫学的評価によって、超音波処理も界面活性剤処理も、ＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘの抗原性を損なわないことが確認された。
直接超音波処理方法の使用は、ＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘ内の凝集物を効果的に分散させることが見出された。サブタイプ：Ｈ３Ｎ２内のインフルエンザ株は、最高の凝集レベルを示す。プロセスの最適化は、ＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘに伝達されたエネルギー量および伝達が起こった速度が、凝集物分散のレベルの制御において必須であることを示した。超音波処理の速度（振幅）および／または曝露時間（秒）の増大は、線形的傾向で相関する凝集物脱会合のレベルの増大を生じた。分散レベルのプラトーが、ＯＤＴが９７％に達した後に観察され、その後、凝集物はほとんどまたはそれ以上分散しなかった（ＯＤＴによって測定した場合）。ＩＶＶ薬物物質において凝集物を分散させるための方法としての超音波処理の使用を、界面活性剤（ＰＳ８０）の存在下および非存在下の両方で、２４週間（６ヶ月間）という時間経過にわたって評価した。ＯＤＴ、ＤＬＳおよびＥＭを含むいくつかの特徴付け分析は、超音波処理したＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘが、非処理および界面活性剤処理サンプルと比較して、顕著に増大した量の分散した材料を含むことを明らかにした。凝集物分散の目標レベルに達するために必要とされる超音波処理の量は、推定可能であり、バッチ間で一致した。さらに、分散のレベルは、実行可能性試験の継続時間全体にわたって一貫したままであったので、安定なかつ恒久的に凝集物が分散した状態を示す。ＳＲＩＤによる免疫学的評価によって、超音波処理も界面活性剤処理も、ＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘの抗原性を損なわないことが確認された。
【0063】
この研究は、高度に凝集したＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘを含むインフルエンザワクチンの品質属性を改善するために、単純で、実務的かつ有効なアプローチとして超音波処理の価値を強く例証した。さらに、この方法は、インフルエンザの全季節性株に適用可能であることも示された。超音波処理の後に、増大したレベルの分散した材料が、Ｈ３Ｎ２、Ｈ１Ｎ１、ならびにＹａｍａｇａｔａ系統およびＶｉｃｔｏｒｉａ系統の２つのインフルエンザＢ株のＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘにおいて観察された。これは、６ヶ月間にわたって十分に維持された。
【0064】
研究室スケールの調査のために設計した直接超音波処理方法に対する代替として、連続流超音波処理構成を、ＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘの商業的体積を処理するために調査した。簡潔には、ソニケーターユニットを、２０ｋＨｚのコンバーターと組み合わせた高周波数発電機によって電力供給する；接続ブースターホーンを、指定した流速において定常的に再循環されるサンプルを含むフロースルー処理容器に入れる。
【0065】
システムの拡張性を評価するために、超音波処理強度（振幅）および生成物再循環流速を含む種々の処理パラメーターの影響を調査して、ＩＶＶ薬物物質内の凝集物分散の効率に対する影響を決定した。１２０ｍｌ／分というソニケーターを通る一定の再循環流速および８０％という固定振幅を使用すると、バッチ体積（６０ｍｌ、５００ｍｌおよび１０００ｍｌ）と８０％というＯＤＴ閾値に達するために必要とされる超音波処理時間（６０分超）との間で強い線形的な相関関係が示された（Ｒ２＝０．９８９）。この傾向は、超音波処理エネルギー（ジュール）と時間との間でも（Ｒ２≧０．９９８）、よって、超音波処理エネルギーとＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘのバッチ体積との間でも（Ｒ２＝０．９８１、表５および図１０～１２）観察された。このデータは、概説した超音波処理プロセスが、ＩＶＶ薬物物質バッチサイズに関して拡張可能であることを示唆する。さらに、上記データは、少なくとも３００ジュール／ｍＬという固定投入エネルギーが、このシステムにおける体積にかかわらず、凝集物を≧８０％のＯＤＴレベルに脱会合させるのに十分であることを示唆する。
【0066】
【表5】
【0067】
本発明者らは、インフルエンザＡ ＨＡ分子上の推定グリコシル化部位の数とその株のＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘ中で見出される凝集の程度との間に線形的関係性があることを決定した（図１３）。相関係数の値（ｒ値）を、２００５～２０１７年の間に製造された１２のＨ３Ｎ２株の推定グリコシル化部位とＩＶＶ Ｄｒｕｇ Ｍａｔｒｉｘに関する凝集の程度との間の関係について計算した。そのｒ値は０．７４であった。これは、これら２つの属性に関する中程度の強さの相関関係を示唆する。本発明者らは、≧１６のｐＧｌｙスコアを有するＨ３Ｎ２株が、≧９０ジュール／ｍＬの超音波処理を必要とし、≧１１のｐＧｌｙスコアを有するＨ１Ｎ１株が、≧９０ジュール／ｍＬの超音波処理を必要とすることを提唱する。
参考文献
参考文献
【表6-1】
【表6-2】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【手続補正書】
【提出日】2023-12-21
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
インフルエンザウイルスタンパク質を含む調製物であって、前記調製物は、凝集した材料を分散させるための超音波処理に供されており、前記超音波処理は、少なくとも９０ジュール／ｍＬのエネルギーを伝達させるように行われ、前記エネルギーは０．７ｓ／ｍｌの速度で伝えられ、前記超音波処理は少なくとも４０％の振幅の速度で行われる、調製物。
【請求項2】
前記調製物は、前記インフルエンザウイルスタンパク質であるヘマグルチニンを含む、請求項１に記載の調製物。
【請求項3】
前記調製物は、スプリットインフルエンザビリオンを含む、請求項１または２に記載の調製物。
【請求項4】
前記調製物は、０．０２％未満のレベルの界面活性剤を含む、請求項３に記載の調製物。
【請求項5】
前記超音波処理は、前記調製物に存在する凝集物のうちの少なくとも５０％が分散されるように、ある時間にわたっておよびある強度で行われる、請求項１～４のいずれか１項に記載の調製物。
【請求項6】
前記超音波処理は、８０％振幅の速度において行われる、請求項１～５のいずれか１項に記載の調製物。
【請求項7】
前記調製物は、推定ＨＡグリコシル化部位確率スコア（ｐＧｌｙスコア）≧１６を有するＨ３Ｎ２株のインフルエンザタンパク質を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の調製物。
【請求項8】
前記調製物は、ｐＧｌｙ≧１１を有するＨ１Ｎ１株のインフルエンザタンパク質を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の調製物。
【請求項9】
インフルエンザワクチンであって、前記ワクチンは、不活性化またはスプリットインフルエンザビリオンを含む調製物を含み、前記超音波処理は、少なくとも９０ジュール／ｍＬのエネルギーを伝達させるように行われ、前記エネルギーは０．７ｓ／ｍｌの速度で伝えられ、前記調製物は超音波処理に供されており、前記超音波処理は少なくとも４０％の振幅の速度で行われる、インフルエンザワクチン。
【請求項10】
前記ワクチンは、少なくとも３つの異なるインフルエンザ株を含む、請求項９に記載のインフルエンザワクチン。
【請求項11】
前記ワクチンは、一価ワクチンである、請求項９に記載のインフルエンザワクチン。
【請求項12】
前記ワクチンは、四価ワクチンである、請求項９に記載のインフルエンザワクチン。
【請求項13】
前記ワクチンは、インフルエンザＡおよびインフルエンザＢを含む、請求項９、１１または１２に記載のインフルエンザワクチン。
【請求項14】
前記調製物における凝集物のうちの少なくとも５０％が分散される、請求項９～１３のいずれか１項に記載のインフルエンザワクチン。
【請求項15】
前記超音波処理は、８０％振幅の速度において行われる、請求項９～１４のいずれか１項に記載のインフルエンザワクチン。