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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024092455
(43)【公開日】2024-07-08
(54)【発明の名称】抗老化用又は細胞若返り用の剤
(51)【国際特許分類】
A61K 31/405 20060101AFI20240701BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240701BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20240701BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20240701BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20240701BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20240701BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240701BHJP
C07D 209/18 20060101ALN20240701BHJP
C07D 209/20 20060101ALN20240701BHJP
【ＦＩ】
A61K31/405
A61P43/00 107
A61P3/00
A61P3/04
A61P1/16
A61P13/12
A61P25/00
C07D209/18
C07D209/20
【審査請求】未請求
【請求項の数】5
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022208385
(22)【出願日】2022-12-26
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り 令和３年１２月２７日に大学共同利用機関法人情報・システム研究機構国立情報学研究所のウェブサイトにて公開
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和３年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、ムーンショット型研究開発事業、「ミトコンドリア先制医療」委託研究開発、産業技術力強化法１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】504157024
【氏名又は名称】国立大学法人東北大学
(74)【代理人】
【識別番号】100107984
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 雅紀
(74)【代理人】
【識別番号】100182305
【弁理士】
【氏名又は名称】廣田 鉄平
(74)【代理人】
【識別番号】100096482
【弁理士】
【氏名又は名称】東海 裕作
(74)【代理人】
【識別番号】100131093
【弁理士】
【氏名又は名称】堀内 真
(74)【代理人】
【識別番号】100150902
【弁理士】
【氏名又は名称】山内 正子
(74)【代理人】
【識別番号】100141391
【弁理士】
【氏名又は名称】園元 修一
(74)【代理人】
【識別番号】100221958
【弁理士】
【氏名又は名称】篠田 真希恵
(74)【代理人】
【識別番号】100192441
【弁理士】
【氏名又は名称】渡辺 仁
(72)【発明者】
【氏名】阿部 高明
(72)【発明者】
【氏名】菅野 新一郎
(72)【発明者】
【氏名】鈴木 健弘
(72)【発明者】
【氏名】橋本 功
(72)【発明者】
【氏名】笠原 朋子
(72)【発明者】
【氏名】原 文香
【テーマコード（参考）】
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086BC14
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA13
4C086MA17
4C086MA22
4C086MA23
4C086MA35
4C086MA37
4C086MA41
4C086MA43
4C086MA52
4C086MA55
4C086MA59
4C086MA66
4C086NA14
4C086ZA22
4C086ZA70
4C086ZA75
4C086ZA81
4C086ZB22
4C086ZC21
4C086ZC52
(57)【要約】 （修正有）
【課題】比較的簡便かつ安価に製造することができる低分子化合物を有効成分とする、抗老化用又は細胞若返り用の剤や老化に関連する症状若しくは疾患の予防又は改善剤。
【解決手段】式（Ｉ－１）で表される化合物に代表されるインドール化合物を含む、抗老化用又は細胞若返り用の剤である。
【選択図】なし
【解決手段】式（Ｉ－１）で表される化合物に代表されるインドール化合物を含む、抗老化用又は細胞若返り用の剤である。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の一般式（Ｉ０）；
［式中、Ｒ１は、水素原子；ベンゼン環が非置換若しくは炭素数１～７のアルキル基、炭素数１～７のアルコキシル基、フッ素及び／又は塩素で置換されたベンゾイルメチル基；非置換若しくはフッ素で置換された鎖状又は分枝状の炭素数４～６のアルキル基；又は、フェニル基、シクロペンチル基、若しくはピペリジニル基で置換されたメチレン又はエチレン；を表し、前記フェニル基はさらに１以上のフェニル基で置換されていてもよく、前記ピペリジニル基はさらにＮがアシル基で置換されていてもよく、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４は、同一でも異なっていてもよく、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１～Ｃ６のアルキル基、Ｃ２～Ｃ６のアルケニル基、Ｃ２～Ｃ６のアルキニル基、ＯＲ８で表される有機オキシ基を表し、Ｒ８は、Ｃ１～Ｃ７のアルキル基、Ｃ２～Ｃ６のアルケニル基、Ｃ２～Ｃ６のアルキニル基、又はベンジル基を表し、Ｚ５は、水素原子又はＣ１～Ｃ６のアルキル基を表し、Ｒ３はＯＨ、ＯＲ４、ＮＨＲ４及びＮＲ４Ｒ５のいずれか一つから選ばれる基であり、Ｒ４及びＲ５は同一又は異なって、置換若しくは非置換の炭素数１～４のアルキル基である。］
、一般式（II）；
［式中、Ｒ６は水素又はメチル基であり、Ｘは炭素数４～６のアルキレン基、若しくは炭素数４のエーテル基であり、Ｒ３はＯＨ、ＯＲ４、ＮＨＲ４及びＮＲ４Ｒ５のいずれか一つから選ばれる基であり、Ｒ４及びＲ５は同一又は異なって、置換若しくは非置換の炭素数１～４のアルキル基である。］
、及び、一般式（III）；
［式中、Ａはインドール若しくはナフタレンを表し、Ａがインドールのとき、インドールの３位及び５位に、それぞれ酢酸基及びＲ７Ｏが置換されており、Ａがナフタレンのとき、ナフタレンの１位及び７位に、それぞれ酢酸基及びＲ７Ｏが置換されており、Ｒ７は炭素数１～５のアルキル基又はベンジル基を表し、該ベンジル基のベンゼン環は１又は２以上の炭素数１～３のアルキル基又は炭素数１～３のアルコキシ基で置換されていてもよく、Ｒ３はＯＨ、ＯＲ４、ＮＨＲ４及びＮＲ４Ｒ５のいずれか一つから選ばれる基であり、Ｒ４及びＲ５は同一又は異なって、置換若しくは非置換の炭素数１～４のアルキル基である。］
で表される化合物、並びに、Ｒ３がＯＨのときそれらの医薬的に許容される塩からなる群から選択される１種又は２種以上の化合物を含む、抗老化用又は細胞若返り用の剤。
【化1】
、一般式（II）；
【化2】
、及び、一般式（III）；
【化3】
で表される化合物、並びに、Ｒ３がＯＨのときそれらの医薬的に許容される塩からなる群から選択される１種又は２種以上の化合物を含む、抗老化用又は細胞若返り用の剤。
【請求項2】
ＳＩＲＴタンパク質が、ＳＩＲＴ１タンパク質、ＳＩＲＴ２タンパク質、ＳＩＲＴ３タンパク質、ＳＩＲＴ４タンパク質、ＳＩＲＴ５タンパク質、ＳＩＲＴ６タンパク質、及び、ＳＩＲＴ７タンパク質から選択される１種又は２種以上のタンパク質である、請求項１に記載の抗老化用又は細胞若返り用の剤。
【請求項3】
化合物が、以下の式（Ｉ－１）、式（II－１）、式（Ｉ－２）、式（Ｉ－３）、式（Ｉ－４）、式（Ｉ－５）又は式（III－１）で表される化合物若しくはその医薬的に許容される塩である、請求項１に記載の抗老化用又は細胞若返り用の剤。
式（Ｉ－１）；
式（II－１）；
式（Ｉ－２）；
式（Ｉ－３）；
式（Ｉ－４）；
式（Ｉ－５）；
式（III－１）；
式（Ｉ－１）；
【化4】
【化5】
【化6】
【化7】
【化8】
【化9】
【化10】
【請求項4】
請求項１～３のいずれか１項に記載の抗老化用又は細胞若返り用の剤を含む、老化に関連する症状若しくは疾患の予防又は改善剤。
【請求項5】
老化に関連する症状若しくは疾患が、肥満症、肝疾患、肝機能の低下、腎線維化、腎機能障害、及び、運動機能の低下からなる群から選択される１種又は２種以上である、請求項４に記載の予防又は改善剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、後述する一般式（Ｉ０）、一般式（II）、及び一般式（III）で表される化合物、並びに、Ｒ３がＯＨのときそれらの医薬的に許容される塩からなる群（以下、これらを総称して「本件化合物群」ということがある）から選択される１種又は２種以上の化合物を含む、抗老化用又は細胞若返り用の剤や、かかる抗老化用又は細胞若返り用の剤を含む、老化に関連する症状若しくは疾患の予防又は改善剤に関する。
【背景技術】
【0002】
老化制御に関する研究において、古細菌、酵母、線虫、ヒトに至るまで、低栄養にならない程度のカロリー制限が抗老化、寿命延長効果を示すことがわかっている。これらの効果に関与する分子の一つとしてＳｉｒ２が同定されている。その哺乳類ホモログとして７種類のサーチュイン（Ｓｉｒｔｕｉｎ）ファミリーが存在している。中でも最もＳｉｒ２と構造や機能が類似しているサーチュイン１が注目されている。
【0003】
サーチュイン１は、ＮＡＤ依存性脱アセチル化酵素活性やＡＤＰリボシル転移酵素活性をもち、生体内で重要な役割を果たしている。例えばサーチュイン１高発現マウスにおいて身体能力の改善及び生殖期間の延長とともに、糖代謝、コレステロール代謝、脂肪代謝の改善が認められている。また、高脂肪食下での耐糖能改善、脂肪肝抑制も観察されている。つまりサーチュイン１の活性化が代謝系疾患の予防、治療又は改善に有用であると考えられている（非特許文献１）。
【0004】
またサーチュイン１の活性化により、転写因子ＮＦ－κＢ（nuclear factor-kappa B）のｐ６５サブユニットが脱アセチル化され、ＮＦ－κＢ活性が減弱する結果、炎症を抑制することが明らかとなっており、この炎症抑制作用が炎症性疾患の予防、治療又は改善すると考えられている（非特許文献１）。さらにマウスではＮＦ－κＢの遺伝子の遮断により、皮膚の増殖能が高まることが分かっており、サーチュイン１の活性化は皮膚の増殖能の亢進に有用であると考えられる（非特許文献２）。
【0005】
サーチュイン１はＦＯＸＯ、ｐ５３、ｐ７３、Ｋｕ７０、Ｓｍａｄ７等を脱アセチル化し、その結果として、酸化ストレス耐性の誘導、細胞死抑制を誘導する。これらの表現型の誘導が、抗老化、長寿命化の実現に寄与していると考えられている（非特許文献１）。
【0006】
細胞老化は紫外線等の外因的ストレスに曝されることにより引き起こされる。ここで細胞老化とは永久に細胞周期が停止する現象である。サーチュイン１はＴＥＲＴ（Telomere Reverse Transcriptase）の発現を調節し、ヒストンを脱アセチル化することによりテロメアの安定性を維持し、ＷＲＮタンパク質（Werner syndrome protein）等の修復タンパク質を脱アセチル化することでＤＮＡ修復を促進してゲノムの安定性を維持しており、これらの機能を通して細胞老化を抑制していることが明らかになっている（非特許文献３）。
【0007】
このように、サーチュイン１は代謝系疾患改善作用、炎症性疾患改善作用、細胞老化抑制作用に加え、糖尿病改善作用、心血管保護作用、腎疾患改善作用、神経保護作用等、様々な機能を有することが明らかになっている。そのため、サーチュイン１の活性化により、代謝系疾患、炎症性疾患、細胞老化、糖尿病、心血管疾患、腎疾患、神経疾患等の各種疾患の予防、治療、又は改善に有用であると考えられている。
【0008】
サーチュイン１を活性化させる物質として赤ブドウの皮に多く含まれているレスベラトロールが知られている。近年では、ボタンボウフウの植物体またはその溶媒抽出物からなることを特徴とするSirtuin-1活性化剤（特許文献１）や、黒ウコンの抽出物由来のサーチュイン活性化剤（特許文献２）や、トンカットアリの抽出物を含有するサーチュイン１の発現増強用組成物（特許文献３）も報告されている。また、特許文献４には、サーチュイン１に対する天然アンチセンス転写物に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、サーチュイン１を上方制御する方法が開示されている。
【0009】
一方、本発明者らは、４－（２，４－ジフルオロフェニル）－２－（１Ｈ－インドール－３－イル）－４－オキソ－ブタン酸（すなわち、ＭＡ５）が、エリスロポエチン発現増強効果及びミトコンドリア病の治療効果（特許文献５）、臓器線維化抑制効果（特許文献６）、難聴の予防又は改善効果（特許文献７）を有することを報告している。しかしながら、本件化合物群が、ＳＩＲＴタンパク質の産生促進効果、抗老化効果、細胞若返り効果などを有することについては、これまで知られていなかった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0010】
【特許文献1】特許第５６６６０５３号公報
【特許文献2】特開２０１８－１９９６８０号公報
【特許文献3】特開２０２１－０７５５０１号公報
【特許文献4】特開２０１７－２２１２２１号公報
【特許文献5】国際公開第２０１４／０８０６４０号パンフレット
【特許文献6】特開２０１５－１８９６７０号公報
【特許文献7】特開２０１９－１１６４５３号公報
【非特許文献】
【0011】
【非特許文献1】化学と生物, 2009年, Vol.47, No.8, p531-537
【非特許文献2】Aging cell, 2010年, 9, pp285-290
【非特許文献3】BMB Reports, 2019年, 52(1), p.24-34
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0012】
本発明の課題は、比較的簡便かつ安価に製造することができる低分子化合物を有効成分とする、抗老化用又は細胞若返り用の剤や、老化に関連する症状若しくは疾患の予防又は改善剤を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【0013】
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を続けている。その過程において、
（ａ）後述する本件化合物群が、ＳＩＲＴタンパク質の産生を、効果的に促進する作用（例えば、細胞内のＳＩＲＴタンパク質の量を効果的に増加する作用）を有すること、
（ｂ）後述する本件化合物群が、老化に関連する症状又は疾患である脂肪肝及び肥満症を改善する作用、及び、肝機能を改善する作用を有すること、
（ｃ）後述する本件化合物群が、老化に関連する運動機能の低下を改善する作用を有すること、
（ｄ）後述する本件化合物群が、ＦＯＸＯ１遺伝子の発現の上昇やＩＧＦ１シグナル経路の活性化、ＰＰＡＲ遺伝子によるＮＦ－ｋＢ経路の抑制、Longevity regulating経路の活性化、多能性に関する遺伝子群の発現の上昇などの作用を有すること、
（ｅ）後述する本件化合物群が、老化に関連するパスウェイのＤＮＡのメチル化を抑制する効果を有すること、
などを見いだし、本発明を完成するに至った。
なお、ＦＯＸＯ１遺伝子の発現の上昇、ＩＧＦ１シグナル経路の活性化、ＮＦ－ｋＢ経路の抑制、Longevity regulating経路の活性化、多能性に関連する遺伝子群の発現の上昇は、長寿や抗老化などに関連することが知られている。
（ａ）後述する本件化合物群が、ＳＩＲＴタンパク質の産生を、効果的に促進する作用（例えば、細胞内のＳＩＲＴタンパク質の量を効果的に増加する作用）を有すること、
（ｂ）後述する本件化合物群が、老化に関連する症状又は疾患である脂肪肝及び肥満症を改善する作用、及び、肝機能を改善する作用を有すること、
（ｃ）後述する本件化合物群が、老化に関連する運動機能の低下を改善する作用を有すること、
（ｄ）後述する本件化合物群が、ＦＯＸＯ１遺伝子の発現の上昇やＩＧＦ１シグナル経路の活性化、ＰＰＡＲ遺伝子によるＮＦ－ｋＢ経路の抑制、Longevity regulating経路の活性化、多能性に関する遺伝子群の発現の上昇などの作用を有すること、
（ｅ）後述する本件化合物群が、老化に関連するパスウェイのＤＮＡのメチル化を抑制する効果を有すること、
などを見いだし、本発明を完成するに至った。
なお、ＦＯＸＯ１遺伝子の発現の上昇、ＩＧＦ１シグナル経路の活性化、ＮＦ－ｋＢ経路の抑制、Longevity regulating経路の活性化、多能性に関連する遺伝子群の発現の上昇は、長寿や抗老化などに関連することが知られている。
【0014】
すなわち、本発明は以下のとおりである。
〔１〕以下の一般式（Ｉ０）；
［式中、Ｒ１は、水素原子；ベンゼン環が非置換若しくは炭素数１～７のアルキル基、炭素数１～７のアルコキシル基、フッ素及び／又は塩素で置換されたベンゾイルメチル基；非置換若しくはフッ素で置換された鎖状又は分枝状の炭素数４～６のアルキル基；又は、フェニル基、シクロペンチル基、若しくはピペリジニル基で置換されたメチレン又はエチレン；を表し、前記フェニル基はさらに１以上のフェニル基で置換されていてもよく、前記ピペリジニル基はさらにＮがアシル基で置換されていてもよく、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４は、同一でも異なっていてもよく、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１～Ｃ６のアルキル基、Ｃ２～Ｃ６のアルケニル基、Ｃ２～Ｃ６のアルキニル基、ＯＲ８で表される有機オキシ基を表し、Ｒ８は、Ｃ１～Ｃ７のアルキル基、Ｃ２～Ｃ６のアルケニル基、Ｃ２～Ｃ６のアルキニル基、又はベンジル基を表し、Ｚ５は、水素原子又はＣ１～Ｃ６のアルキル基を表し、Ｒ３はＯＨ、ＯＲ４、ＮＨＲ４及びＮＲ４Ｒ５のいずれか一つから選ばれる基であり、Ｒ４及びＲ５は同一又は異なって、置換若しくは非置換の炭素数１～４のアルキル基である。］
、一般式（II）；
［式中、Ｒ６は水素原子又はメチル基であり、Ｘは炭素数４～６のアルキレン基、若しくは炭素数４のエーテル基であり、Ｒ３はＯＨ、ＯＲ４、ＮＨＲ４及びＮＲ４Ｒ５のいずれか一つから選ばれる基であり、Ｒ４及びＲ５は同一又は異なって、置換若しくは非置換の炭素数１～４のアルキル基である。］
、及び、一般式（III）；
［式中、Ａはインドール若しくはナフタレンを表し、Ａがインドールのとき、インドールの３位及び５位に、それぞれ酢酸基及びＲ７Ｏが置換されており、Ａがナフタレンのとき、ナフタレンの１位及び７位に、それぞれ酢酸基及びＲ７Ｏが置換されており、Ｒ７は炭素数１～５のアルキル基又はベンジル基を表し、該ベンジル基のベンゼン環は１又は２以上の炭素数１～３のアルキル基又は炭素数１～３のアルコキシ基で置換されていてもよく、Ｒ３はＯＨ、ＯＲ４、ＮＨＲ４及びＮＲ４Ｒ５のいずれか一つから選ばれる基であり、Ｒ４及びＲ５は同一又は異なって、置換若しくは非置換の炭素数１～４のアルキル基である。］
で表される化合物、並びに、Ｒ３がＯＨのときそれらの医薬的に許容される塩からなる群から選択される１種又は２種以上の化合物を含む、抗老化用又は細胞若返り用の剤。
〔２〕ＳＩＲＴタンパク質が、ＳＩＲＴ１タンパク質、ＳＩＲＴ２タンパク質、ＳＩＲＴ３タンパク質、ＳＩＲＴ４タンパク質、ＳＩＲＴ５タンパク質、ＳＩＲＴ６タンパク質、及び、ＳＩＲＴ７タンパク質から選択される１種又は２種以上のタンパク質である、上記〔１〕に記載の抗老化用又は細胞若返り用の剤。
〔３〕化合物が、以下の式（Ｉ－１）、式（II－１）、式（Ｉ－２）、式（Ｉ－３）、式（Ｉ－４）、式（Ｉ－５）又は式（III－１）で表される化合物若しくはその医薬的に許容される塩である、上記〔１〕又は〔２〕に記載の抗老化用又は細胞若返り用の剤。
式（Ｉ－１）（実施例で後述する化合物＃５）；
式（II－１）（実施例で後述する化合物＃１３）；
式（Ｉ－２）（実施例で後述する化合物＃９）；
式（Ｉ－３）（実施例で後述する化合物＃２１）；
式（Ｉ－４）（実施例で後述する化合物＃３０）；
式（Ｉ－５）（実施例で後述する化合物＃４）；
式（III－１）（実施例で後述する化合物＃３５）；
〔４〕上記〔１〕～〔３〕のいずれか１つに記載の抗老化用又は細胞若返り用の剤を含む、老化に関連する症状若しくは疾患の予防又は改善剤。
〔５〕老化に関連する症状若しくは疾患が、肥満症、肝疾患、肝機能の低下、腎線維化、腎機能障害、及び、運動機能の低下からなる群から選択される１種又は２種以上である、上記〔４〕に記載の予防又は改善剤。
〔１〕以下の一般式（Ｉ０）；
【化1】
、一般式（II）；
【化2】
、及び、一般式（III）；
【化3】
で表される化合物、並びに、Ｒ３がＯＨのときそれらの医薬的に許容される塩からなる群から選択される１種又は２種以上の化合物を含む、抗老化用又は細胞若返り用の剤。
〔２〕ＳＩＲＴタンパク質が、ＳＩＲＴ１タンパク質、ＳＩＲＴ２タンパク質、ＳＩＲＴ３タンパク質、ＳＩＲＴ４タンパク質、ＳＩＲＴ５タンパク質、ＳＩＲＴ６タンパク質、及び、ＳＩＲＴ７タンパク質から選択される１種又は２種以上のタンパク質である、上記〔１〕に記載の抗老化用又は細胞若返り用の剤。
〔３〕化合物が、以下の式（Ｉ－１）、式（II－１）、式（Ｉ－２）、式（Ｉ－３）、式（Ｉ－４）、式（Ｉ－５）又は式（III－１）で表される化合物若しくはその医薬的に許容される塩である、上記〔１〕又は〔２〕に記載の抗老化用又は細胞若返り用の剤。
式（Ｉ－１）（実施例で後述する化合物＃５）；
【化4】
【化5】
【化6】
【化7】
【化8】
【化9】
【化10】
〔５〕老化に関連する症状若しくは疾患が、肥満症、肝疾患、肝機能の低下、腎線維化、腎機能障害、及び、運動機能の低下からなる群から選択される１種又は２種以上である、上記〔４〕に記載の予防又は改善剤。
【0015】
また本発明の実施の他の形態として、本件化合物群から選択される１種又は２種以上の化合物を、抗老化又は細胞若返りを必要とする動物に投与する工程を備えた、前記動物における老化を抑制又は細胞を若返らせる方法や、抗老化用又は細胞若返り用の剤として使用するための、本件化合物群から選択される１種又は２種以上の化合物や、抗老化又は細胞若返りにおける使用のための、本件化合物群から選択される１種又は２種以上の化合物や、抗老化用又は細胞若返り用の剤を製造するための、本件化合物群から選択される１種又は２種以上の化合物の使用を挙げることができる。
【0016】
また本発明の実施の他の形態として、本件化合物群から選択される１種又は２種以上の化合物を、老化に関連する（好ましくは老化に起因する）症状若しくは疾患の予防又は改善（治療）を必要とする対象に投与する工程を含む、老化に関連する（好ましくは老化に起因する）症状若しくは疾患を予防又は改善（治療）する方法や、老化に関連する（好ましくは老化に起因する）症状若しくは疾患の予防又は改善（治療）剤として使用するための、本件化合物群から選択される１種又は２種以上の化合物や、老化に関連する（好ましくは老化に起因する）症状若しくは疾患の予防又は改善（治療）における使用のための、本件化合物群から選択される１種又は２種以上の化合物や、老化に関連する（好ましくは老化に起因する）症状若しくは疾患の予防又は改善（治療）剤を製造するための、本件化合物群から選択される１種又は２種以上の化合物の使用を挙げることができる。
【発明の効果】
【0017】
本発明によると、抗老化用又は細胞若返り用の剤や、老化に関連する症状若しくは疾患の予防又は改善剤を提供することができる。さらに、本発明は、比較的簡便かつ高収率で製造できる低分子化合物を、抗老化又は細胞若返りの有効成分とするため、比較的簡便かつ安価に製造することができる。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1-1】マウス内耳細胞株（ＨＥＩ－ＯＣ１細胞株）を、０．１％のＤＭＳＯ、又は各種濃度（１μＭ、３μＭ、１０μＭ、又は３０μＭ）のＭＡ５の存在下で培養し、細胞内の各種ＳＩＲＴ（ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２のアイソフォーム１、ＳＩＲＴ２のアイソフォーム２、及び、ＳＩＲＴ３）の発現レベルを、ウエスタンブロット法により解析した結果を示す図である。下のグラフは、上の結果における各バンド強度を、コントロールである０．１％のＤＭＳＯにおけるバンド強度を１としたときの相対値で表した結果である。
【図1-2】ＨＥＩ－ＯＣ１細胞株を、０．１％のＤＭＳＯ、又は各種濃度（１μＭ、３μＭ、１０μＭ、又は３０μＭ）のＭＡ５の存在下で培養し、細胞内の各種ＳＩＲＴ（ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、及びＳＩＲＴ７）の発現レベル及びβ－アクチンの発現レベルを、ウエスタンブロット法により解析した結果を示す図である。下のグラフは、上の結果における各バンド強度を、コントロールである０．１％のＤＭＳＯにおけるバンド強度を１としたときの相対値で表した結果である。
【図2】ＮＤＵＦＳ４（NADH:ubiquinone oxidoreductase subunit S4）ホモノックアウトマウス（Ｎｄｕｆｓ４－/－マウス）にＭＡ５（化合物＃５）を投与した場合の、褐色脂肪組織における褐色脂肪細胞への影響を示す図である。 上パネルは、ＮＤＵＦＳ４ホモノックアウトマウス（Ｎｄｕｆｓ４－/－マウス）に、マウスの体重１ｋｇあたり１０ｍｇ／日の化合物＃５を、５０日間投与した場合［化＃５投与群］の、マウスの褐色脂肪組織をＨＥ（ヘマトキシリン・エオジン）染色した結果を表す。 下パネルは、ＮＤＵＦＳ４ホモノックアウトマウス（Ｎｄｕｆｓ４－/－マウス）に、マウスの体重１ｋｇあたり１０ｍｇ／日のＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）を、５０日間投与した場合［ＣＭＣ投与群；コントロール群］の、マウスの褐色脂肪組織をＨＥ（ヘマトキシリン・エオジン）染色した結果を表す。
【図3】図２における［化＃５投与群］及び［コントロール群］の、Ｎｄｕｆｓ４－/－マウスの褐色脂肪細胞におけるＵＣＰ１（uncoupling protein 1）遺伝子、ＰＰＡＲγ（peroxisomeproliferator-activated receptor gamma）遺伝子、及び、ＦＡＢＰ４（fattyacid binding protein 4）遺伝子の発現を定量ＰＣＲにより解析した結果を示す図である。 グラフの縦軸のauは、コントロール群の発現量＝１とした発現量比を表す。
【図4】ＮＤＵＦＳ４（NADH:ubiquinone oxidoreductase subunit S4）ホモノックアウトマウス（Ｎｄｕｆｓ４－/－マウス）にＭＡ５（化合物＃５）を経口投与した場合の、脂肪肝への影響を示す図である。 図の左側のパネルは、野生型のマウスに水を与えた群における肝臓組織の電子顕微鏡画像であり、中央のパネルは、Ｎｄｕｆｓ４－/－マウスに水を与えた群における肝臓組織の電子顕微鏡画像であり、右側のパネルは、Ｎｄｕｆｓ４－/－マウスに、マウスの体重１ｋｇあたり０．１ｍｇ／日の化合物＃５を、２４日間投与した群（化＃５投与群）おける肝臓組織の電子顕微鏡画像である。 なお、図の左側の「X2000」や「X10000」は倍率を表す。
【図5】Ｃ５７ＢＬ６マウス（８週齢）に化合物＃４を経口投与した場合の、肝機能への影響を示す図である。 「Ｅｐｏ」はマウスの血液中のエリスロポエチン濃度（ＩＵ／Ｌ）を表し、「ＴＧ」はマウスの血液中の中性脂肪濃度（ｍｇ／ｄＬ）を表し、「ＧＯＴ」はマウスの血液中のグルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ濃度（ＩＵ／Ｌ）を表し、「ＧＰＴ」はマウスの血液中のグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ濃度（ＩＵ／Ｌ）を表し、「Ｔ－Ｃｈｏ」はマウスの血液中の総コレステロール濃度（ｍｇ／ｄＬ）を表し、「ＨＤＬ」はマウスの血液中のＨＤＬコレステロール濃度（ｍｇ／ｄＬ）を表す。 各パネルにおいて、「ＤＭＳＯ」は対照群（ｎ＝４）の結果であり、「Ｌ」は化合物＃４をマウスの体重１ｋｇあたり５０ｍｇ／日の化合物＃４を、７日間投与した群（ｎ＝４）の結果であり、「Ｈ」は化合物＃４をマウスの体重１ｋｇあたり１５０ｍｇ／日の化合物＃４を、７日間投与した群（ｎ＝４）の結果である。
【図6】ＲＨ３０細胞内の、ＳＩＲＴ１タンパク質量をウエスタンブロット法により検出した結果を示す図である。 図の左から、コントロールである［対照群］（ＤＭＳＯ）、ＭＡ５（化合物＃５）を添加した［化＃５添加群］、化合物＃９を添加した［化＃９添加群］、化合物＃１３を添加した［化＃１３添加群］、化合物＃２１を添加した［化＃２１添加群］、化合物＃３０を添加した［化＃３０添加群］、化合物＃３５を添加した［化＃１３添加群］の結果をそれぞれ表す。化合物＃５、＃９、＃１３、＃２１、＃３０、＃３５はいずれも本件化合物である。 なお、ローディングコントロールとして、β－Actin（β－アクチン）の結果を最下段に示す。
【図7】図６のウエスタンブロットの検出結果の各バンドを、ローディングコントロールであるβ－アクチンのバンドで標準化して定量化した結果を表す図である。 図の左から、コントロールである［対照群］（ＤＭＳＯ）、ＭＡ５（化合物＃５）を添加した［化＃５添加群］、化合物＃９を添加した［化＃９添加群］、化合物＃１３を添加した［化＃１３添加群］、化合物＃２１を添加した［化＃２１添加群］、化合物＃３０を添加した［化＃３０添加群］、化合物＃３５を添加した［化＃３５添加群］の結果をそれぞれ表す。
【図8】図８は、［ＭＡ５添加群］（右パネル）及び［Vehicle群］（左パネル）の老齢マウスのトレッドミルでの走行時間を測定した結果を表す図である。縦軸はトレッドミルでの走行時間（秒）を表し、横軸は測定開始からの経過週数を表す。＊＊はｐ＜０．０１を表す。
【図9】図９は、［ＭＡ５添加群］及び［Vehicle群］の老齢マウスのサバイバルの割合（その経過時間まで、疲労困憊せずに走り続けているマウスの割合）（％）を表す図である。サバイバルの割合が低い方の結果が［Vehicle群］の結果を表し、サバイバルの割合が高い方の結果が［ＭＡ５添加群］の結果を表す。横軸は試験開始からの経過時間（分）を表し、縦軸（Probability of Survival）は疲労困憊せずに走り続けているマウスの割合（％）を表す。
【図10】図１０は、［ＭＡ５添加群］及び［Vehicle群］の老齢マウスの筋肉の細胞について、ＲＮＡシーケンス（RNA-Seq）解析を行い、投与前の若齢マウスの筋肉の細胞と比較して［ＭＡ５添加群］及び［Vehicle群］において発現量が変化した（増加又は減少した）遺伝子を特定した結果を表す図である。図１０において、右側の５列の結果は［ＭＡ５添加群］の結果であり、左側の５列の結果は［Vehicle群］の結果である。
【図11】図１１は、［Vehicle群］の老齢マウスの筋肉細胞と［ＭＡ５添加群］の老齢マウスの筋肉細胞とで、多能性関連遺伝子であるＫｌｆ４遺伝子、Ｐｏｕ５ｆ１（Ｏｃｔ４）遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｍｙｃ遺伝子の発現量を比較した結果を表す図である。また、Ｎａｎｏｇ遺伝子の発現量を比較した結果も示す。＊はｐ＜０．０５を表し、＊＊はｐ＜０．０１を表す。
【図12】図１２は、［ＭＡ５添加群］の老齢マウスの筋肉細胞において発現が変動している遺伝子パスウェイ解析の結果を表す図である。上から１番目はmuscle structure development（筋肉構造の発達）、上から６番目はLongevity regulating pathway-multiple species（寿命制御経路－複数種）、上から１０番目はnegative regulation of MAPK cascade（ＭＡＰＫカスケードの負の制御）、下から２番目はinsulin signaling（インスリンシグナル）である。
【図13】図１３は、［ＭＡ５添加群］の老齢マウスの筋肉細胞において発現が変動した遺伝子と、その遺伝子又はその遺伝子の上流の遺伝子の発現を制御する転写因子との関連を示す図である。図の左に挙げられた遺伝子は、［Vehicle群］と比較して［ＭＡ５添加群］において発現量が増加又は減少した遺伝子を表す。図の上に挙げられた転写因子の下流で制御される遺伝子には、その転写因子の名称の真下の箇所に印が付けられている。例えば、ＦＯＸＯ１の下流で制御される遺伝子には、ＩＴＧＡ５、ＲＣＡＮ１などが含まれる。
【図14】図１４は、［Vehicle群］、［ＭＡ５低用量添加群］及び［ＭＡ５高用量添加群］の若齢マウスのトレッドミルでの走行時間を測定した結果を表す図である。横軸は、試験開始からの経過週数を表し、縦軸は、試験開始前（０ｗｅｅｋ）のトレッドミルでの走行時間を１とした場合の相対走行時間を表す。なお、□は［ＭＡ５高用量添加群］の結果を表し、△は［ＭＡ５低用量添加群］の結果を表し、○は［Vehicle群］の結果を表す。
【図15】図１５は、［Vehicle群］、［ＭＡ５低用量添加群］（Low dose）及び［ＭＡ５高用量添加群］（hign dose）の若齢マウスのサバイバルの割合（その経過時間まで、疲労困憊せずに走り続けているマウスの割合）（％）を表す図である。サバイバルの割合が最も高い結果が［ＭＡ５高用量添加群］の結果を表し、サバイバルの割合が次いで高い結果が［ＭＡ５低用量添加群］の結果を表し、サバイバルの割合が最も低い結果が［Vehicle群］の結果を表す。横軸は試験開始からの経過時間（分）を表し、縦軸（Probability of Survival）は疲労困憊せずに走り続けているマウスの割合（％）を表す。
【図16】図１６は、［ＭＡ５添加群］及び［Vehicle群］の若齢マウスの筋肉の細胞について、ＲＮＡシーケンス（RNA-Seq）解析を行い、投与前の若齢マウスの筋肉の細胞と比較して［ＭＡ５添加群］及び［Vehicle群］において発現量が変化した（増加又は減少した）遺伝子を特定した結果を表す図である。図１６において、右側の５列の結果は［ＭＡ５添加群］の結果であり、左側の５列の結果は［Vehicle群］の結果である。
【図18】図１８は、［ＭＡ５添加群］の若齢マウスの筋肉細胞において発現が変動した遺伝子と、その遺伝子又はその遺伝子の上流の遺伝子の発現を制御する転写因子との関連を示す図である。図の左に挙げられた遺伝子は、［Vehicle群］と比較して［ＭＡ５添加群］において発現量が増加又は減少した遺伝子を表す。図の上に挙げられた転写因子の下流で制御される遺伝子には、その転写因子の名称の真下の箇所に印が付けられている。例えば、ＳＵＺ１２の下流で制御される遺伝子には、ＳＭＹＤ２、ＭＰＺなどが含まれる。
【図19】図１９は、［ＭＡ５添加群］の若齢マウスの肝臓細胞において発現が変動した遺伝子と、その遺伝子又はその遺伝子の上流の遺伝子の発現を制御する転写因子との関連を示す図である。図の左に挙げられた遺伝子は、［Vehicle群］と比較して［ＭＡ５添加群］において発現量が増加又は減少した遺伝子を表す。図の上に挙げられた転写因子の下流で制御される遺伝子には、その転写因子の名称の真下の箇所に印が付けられている。例えば、ＭＹＣの下流で制御される遺伝子には、ＧＳＴＴ２、ＳＬＣ６Ａ６などが含まれる。
【図20】図２０は、［ＭＡ５添加群］の老齢マウスの肝臓細胞において発現が変動した遺伝子と、その遺伝子又はその遺伝子の上流の遺伝子の発現を制御する転写因子との関連を示す図である。図の左に挙げられた遺伝子は、投与前と比較して［ＭＡ５添加群］において発現量が増加又は減少した遺伝子を表す。図の上に挙げられた転写因子の下流で制御される遺伝子には、その転写因子の名称の真下の箇所に印が付けられている。例えば、ＦＯＸＯ１の下流で制御される遺伝子には、ＢＣＬ６、ＣＹＰ１７Ａ１などが含まれる。
【図21】図２１は、［ＭＡ５添加群］のＮｄｕｆｓ４ノックアウトマウスの内耳の蝸牛殻の細胞において発現が変動している遺伝子パスウェイ解析の結果を表す図である。上から５番目はインスリン様成長因子の輸送と取り込みの制御に関する経路である。
【図22】図２２は、２種類の群（KlothoホモKOマウス未投与群［図中の「Vehicle」］及びKlothoホモKOマウス投与群［［図中の「MA-5」］）の生存率を、カプラン・マイヤー法に基づく生存曲線より評価した結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0019】
本発明の抗老化用又は細胞若返り用の剤は、「抗老化のため」又は「細胞若返りのため」という用途が限定された、本件化合物群から選択される１種又は２種以上の化合物を有効成分として含有する剤（以下、「本件の剤」ということがある）であり、老化に関連する症状若しくは疾患の予防又は改善剤は、「老化に関連する症状若しくは疾患を予防又は改善するため」という用途が限定された、本件の剤を含有する剤（以下、「本件予防／改善剤」ということがある）であり、本件の剤や本件予防／改善剤は、それぞれの有効成分である本件化合物群を、単独で飲食品又は医薬品（製剤）として使用してもよいし、さらに添加剤を混合し、組成物の形態（飲食品組成物又は医薬組成物）として使用してもよい。かかる飲食品としては、例えば、健康食品（機能性食品、栄養補助食品、健康補助食品、栄養強化食品、栄養調整食品、サプリメント等）、保健機能食品（特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品等）を挙げることができる。
【0020】
本件化合物群は、ＳＩＲＴタンパク質の産生を、効果的に促進することができる。本明細書において、「ＳＩＲＴタンパク質」としては、動物（好ましくはヒト）におけるＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６及びＳＩＲＴ７からなる群から選択される１種又は２種以上が挙げられる。
【0021】
本明細書において、「ＳＩＲＴタンパク質」は、バリアントが存在する場合いずれであってもよい。ヒトの各ＳＩＲＴタンパク質のアミノ酸配列は、以下のアクセッション番号に開示されている。なお、ヒトや他の生物の各ＳＩＲＴタンパク質のアミノ酸配列は、GenBank（登録商標）などのウェブサイトにおいて把握することができる。
ヒトＳＩＲＴ１ isoforma；NP_036370.2
ヒトＳＩＲＴ１ isoformb；NP_001135970.1
ヒトＳＩＲＴ１ isoformc；NP_001300978.1
ヒトＳＩＲＴ２ isoform1；NP_036369.2
ヒトＳＩＲＴ２ isoform2；NP_085096.1
ヒトＳＩＲＴ２ isoform3；NP_001180215.1
ヒトＳＩＲＴ３ mitochondrialisoform a；NP_036371.1
ヒトＳＩＲＴ３ mitochondrialisoform b；NP_001017524.1
ヒトＳＩＲＴ３ mitochondrialisoform c；NP_001357239.1
ヒトＳＩＲＴ３ mitochondrialisoform d；NP_001357241.1
ヒトＳＩＲＴ３ mitochondrialisoform e；NP_001357243.1
ヒトＳＩＲＴ３ mitochondrial isoform f；NP_001357244.1
ヒトＳＩＲＴ３ mitochondrialisoform g；NP_001357245.1
ヒトＳＩＲＴ３ mitochondrialisoform h；NP_001357246.1
ヒトＳＩＲＴ３ mitochondrialisoform i；NP_001357250.1
ヒトＳＩＲＴ３ mitochondrialisoform j；NP_001357253.1
ヒトＳＩＲＴ４ mitochondrialisoform 1；NP_001372662.1
ヒトＳＩＲＴ４ mitochondrialisoform 2；NP_001372663.1
ヒトＳＩＲＴ５ mitochondrialisoform 1；NP_001363727.1
ヒトＳＩＲＴ５ mitochondrialisoform 2；NP_001363737.1
ヒトＳＩＲＴ５ mitochondrialisoform 3；NP_001180196.1
ヒトＳＩＲＴ５ mitochondrialisoform 4；NP_001229756.1
ヒトＳＩＲＴ５ mitochondrialisoform 5；NP_001363738.1
ヒトＳＩＲＴ５ mitochondrialisoform 6；NP_001363740.1
ヒトＳＩＲＴ５ mitochondrialisoform 7；NP_001363742.1
ヒトＳＩＲＴ５ mitochondrialisoform 8；NP_001363744.1
ヒトＳＩＲＴ６ isoform1；NP_057623.2
ヒトＳＩＲＴ６ isoform2；NP_001180214.1
ヒトＳＩＲＴ６ isoform3；NP_001307987.1
ヒトＳＩＲＴ６ isoform4；NP_001307988.1
ヒトＳＩＲＴ６ isoform5；NP_001307989.1
ヒトＳＩＲＴ６ isoform6；NP_001307990.1
ヒトＳＩＲＴ６ isoform7；NP_001307991.1
ヒトＳＩＲＴ６ isoform8；NP_001307992.1
ヒトＳＩＲＴ６ isoform9；NP_001307993.1
ヒトＳＩＲＴ７；NP_057622.1
ヒトＳＩＲＴ１ isoforma；NP_036370.2
ヒトＳＩＲＴ１ isoformb；NP_001135970.1
ヒトＳＩＲＴ１ isoformc；NP_001300978.1
ヒトＳＩＲＴ２ isoform1；NP_036369.2
ヒトＳＩＲＴ２ isoform2；NP_085096.1
ヒトＳＩＲＴ２ isoform3；NP_001180215.1
ヒトＳＩＲＴ３ mitochondrialisoform a；NP_036371.1
ヒトＳＩＲＴ３ mitochondrialisoform b；NP_001017524.1
ヒトＳＩＲＴ３ mitochondrialisoform c；NP_001357239.1
ヒトＳＩＲＴ３ mitochondrialisoform d；NP_001357241.1
ヒトＳＩＲＴ３ mitochondrialisoform e；NP_001357243.1
ヒトＳＩＲＴ３ mitochondrial isoform f；NP_001357244.1
ヒトＳＩＲＴ３ mitochondrialisoform g；NP_001357245.1
ヒトＳＩＲＴ３ mitochondrialisoform h；NP_001357246.1
ヒトＳＩＲＴ３ mitochondrialisoform i；NP_001357250.1
ヒトＳＩＲＴ３ mitochondrialisoform j；NP_001357253.1
ヒトＳＩＲＴ４ mitochondrialisoform 1；NP_001372662.1
ヒトＳＩＲＴ４ mitochondrialisoform 2；NP_001372663.1
ヒトＳＩＲＴ５ mitochondrialisoform 1；NP_001363727.1
ヒトＳＩＲＴ５ mitochondrialisoform 2；NP_001363737.1
ヒトＳＩＲＴ５ mitochondrialisoform 3；NP_001180196.1
ヒトＳＩＲＴ５ mitochondrialisoform 4；NP_001229756.1
ヒトＳＩＲＴ５ mitochondrialisoform 5；NP_001363738.1
ヒトＳＩＲＴ５ mitochondrialisoform 6；NP_001363740.1
ヒトＳＩＲＴ５ mitochondrialisoform 7；NP_001363742.1
ヒトＳＩＲＴ５ mitochondrialisoform 8；NP_001363744.1
ヒトＳＩＲＴ６ isoform1；NP_057623.2
ヒトＳＩＲＴ６ isoform2；NP_001180214.1
ヒトＳＩＲＴ６ isoform3；NP_001307987.1
ヒトＳＩＲＴ６ isoform4；NP_001307988.1
ヒトＳＩＲＴ６ isoform5；NP_001307989.1
ヒトＳＩＲＴ６ isoform6；NP_001307990.1
ヒトＳＩＲＴ６ isoform7；NP_001307991.1
ヒトＳＩＲＴ６ isoform8；NP_001307992.1
ヒトＳＩＲＴ６ isoform9；NP_001307993.1
ヒトＳＩＲＴ７；NP_057622.1
【0022】
本件化合物群に含まれる化合物の詳細な説明は以下に示す。
【0023】
本発明の一態様において、上記一般式（Ｉ０）におけるＲ１は、水素原子；ベンゼン環が非置換若しくは炭素数１～７のアルキル基、炭素数１～７のアルコキシル基、フッ素及び／又は塩素で置換されたベンゾイルメチル基である。かかるベンゾイルメチル基のベンゼン環は、置換されていてもよく、置換されたものとしては、ベンゼン環上に１～５の炭素数１～７のアルキル基、１～５の炭素数１～７のアルコキシル基、１～５のフッ素原子、又は１～５の塩素原子、若しくは炭素数１～４のアルキル基、炭素数１～４のアルコキシル基、フッ素原子及び塩素原子を合わせて１～５有するベンゾイルメチル基等を挙げることができる。ここで、炭素数１～７のアルキル基としては、直鎖状・分岐状のアルキル基であってもよく、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、２－エチルブチル基、２－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基等を挙げることができ、好ましくは、メチル基、２－エチルブチル基、２－メチルペンチル基、又は３－メチルペンチル基である。
【0024】
上記炭素数１～７のアルコキシル基としては、直鎖状・分岐状のアルコキシル基であってもよく、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基等を挙げることができる。
【0025】
本発明の他の態様において、上記一般式（Ｉ０）におけるＲ１は、非置換若しくはフッ素で置換された鎖状又は分枝状の炭素数４～６のアルキル基である。非置換若しくはフッ素で置換された鎖状又は分枝状の炭素数４～６のアルキル基としては、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、２－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、２－エチルブチル基、及びこれらのフッ素化体を挙げることができ、好ましくは、４，４，５，５，５－ペンタフルオロペンチル基、２－エチルブチル基、２－メチルペンチル基、３－メチルペンチル基、４，４，５，５，５－ペンタフルオロペンチル基、又は４，４，５，５，５－ペンタフルオロペンチル基である。
【0026】
本発明の他の態様において、上記一般式（Ｉ０）におけるＲ１は、フェニル基、シクロペンチル基、若しくはピペリジニル基が置換したメチレン又はエチレンであり、前記フェニル基はさらに１又は２以上のフェニル基で置換されていてもよく、前記ピペリジニル基はさらにＮがアシル基で置換されていてもよい。そのアシル基としては、アセチル基、ベンゾイル基などが挙げられる。フェニル基、シクロペンチル基、若しくはピペリジニル基が置換したメチレン又はエチレンとは、ベンジル基、２－フェネチル基、シクロペンチルメチル基又は２－シクロペンチルエチル基である。１又は２以上のフェニル基が置換したベンジル基又は２－フェネチル基としては、３－フェニルベンジル基、２－（１，１’－ビフェニル－３－イル）－エチル基、２－（１，１’－ビフェニル－４－イル）－エチル基、２－（３，５－ジフェニルフェニル）－エチル基等を挙げることができる。上記一般式（Ｉ）におけるＲ１としては、２－フェネエチル基、２－シクロペンチルエチル基、２－（１，１’－ビフェニル－３－イル）－エチル基、１－アセチル－４－ピペリジニルメチル基を好適に例示することができる。
【0027】
上記一般式（Ｉ０）におけるＺ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４としては、同一でも異なっていてもよく、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１～Ｃ６のアルキル基、Ｃ２～Ｃ６のアルケニル基、Ｃ２～Ｃ６のアルキニル基、ＯＲ８で表される有機オキシ基を表し、Ｒ８は、Ｃ１～Ｃ７のアルキル基、Ｃ２～Ｃ６のアルケニル基、Ｃ２～Ｃ６のアルキニル基、ベンジル基を表し、Ｚ５は、水素原子又はＣ１～Ｃ７のアルキル基を挙げることができる。ハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子、ヨウ素原子を挙げることができる。Ｃ１～Ｃ７のアルキル基としては、直鎖状・分岐状のアルキル基であってもよく、例えば、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｎ－ヘキシル基、ｎ－ヘプチル基等を挙げることができ、好ましくは、メチル基、エチル基、プロピル基、ｎ－ブチル基、ｎ－ヘキシル基、又はｎ－ヘプチル基である。Ｃ２～Ｃ６のアルケニル基としては、直鎖状・分岐状のアルケニル基であってもよく、例えば、エテニル基（ビニル基）、１－プロペニル基、２－プロペニル基（アリル基）等を挙げることができる。Ｃ１～Ｃ７のアルコキシル基（ＯＲ８で表される有機オキシ基において、Ｒ８がＣ１～Ｃ７のアルキル基である場合）としては、直鎖状・分岐状のアルコキシル基であってもよく、例えば、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ｎ－ブトキシ基、イソブトキシ基、ｓｅｃ－ブトキシ基、ｎ－ペントキシ基、ｎ－ヘプチルオキシ基等を挙げることができ、好ましくは、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ｎ－ブトキシ基、ｎ－ペントキシ基、又はｎ－ヘプチルオキシ基である。好ましくは、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４は、同一でも異なっていてもよく、水素、メトキシ基、フッ素、塩素である。
【0028】
上記一般式（Ｉ０）におけるＲ３はＯＨ、ＯＲ４、ＮＨＲ４及びＮＲ４Ｒ５のいずれか一つから選ばれる基であり、Ｒ４及びＲ５は、同一又は異なって置換若しくは非置換の炭素数１～４のアルキル基である。置換若しくは非置換の炭素数１～４のアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、Ｒ４とＲ５が窒素と一緒になったピロリジンや、これらのメトキシ基、フェニル基、フッ素及び塩素により置換されたものを挙げることができ、好ましくは、メチル基、モノクロロメチル基、エチル基、２－メトキシエチル基、２，２，２－トリクロロエチル基、１－フェニルエチル基、２－フェニルエチル基、メトキシエチル基、イソプロピル基、ヘキサフルオロイソプロピル基、及びピロリジンであり、より好ましくは、メチル基及びエチル基である。
【0029】
上記一般式（Ｉ０）の実施態様として下記の一般式（Ｉ）で表される化合物、及び、好ましくは、一般式（１）で表される化合物が例示される。
【0030】
【化11】
【0031】
【化12】
【0032】
式（１）におけるＺ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４は、水素原子、ハロゲン原子、Ｃ１～Ｃ６のアルキル基、ＯＲ８で表される有機オキシ基が好ましく、特に水素原子、フッ素原子、塩素原子、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基等のＣ１～Ｃ３のアルキル基、ＯＲ８で表される有機オキシ基がより好ましい。
【0033】
上記Ｚ５は、水素原子又はＣ１～Ｃ３のアルキル基が好ましく、水素原子又はメチル基がより好ましい。
【0034】
上記Ｒ８は、Ｃ１～Ｃ６のアルキル基が好ましく、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基等のＣ１～Ｃ３のアルキル基、ベンジル基がより好ましい。
【0035】
前記式（１）で表される化合物の中でも、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５のいずれか１置換基が置換した化合物が好ましい。
【0036】
上記式（２）、式（３）、式（４）、式（５）、式（６）中、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５は、式（１）におけるＺ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５と同じ定義である。
【0037】
式（１）で表される化合物は、具体的には、以下に示す化合物を例示することができる。
【0038】
【化13】
【0039】
【化14】
【0040】
【化15】
【0041】
【化16】
【0042】
【化17】
【0043】
上記化合物の中でも、（Ｉ－１）、（２－１）、（３－１）、（３－２）、（３－３）、（３－４）、（４－１）、（４－２）、（５－１）、（５－２）、又は（６－１）の化合物が好ましい。
【0044】
上記一般式（Ｉ０）におけるＲ１が２，４－ジフルオロベンゾイルメチル基であり、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５が水素であり、かつＲ３がＯＨのとき、一般式（Ｉ０）で表される化合物は、実施例で後述する化合物＃５（「ＭＡ５」ともいう）を表し、上記一般式（Ｉ０）におけるＲ１が４－フルオロベンゾイルメチル基であり、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５が水素であり、かつＲ３がＯＨのとき、一般式（Ｉ０）で表される化合物は、実施例で後述する化合物＃４を表し、上記一般式（Ｉ０）におけるＲ１が１－アセチル－４－ピペリジニルメチル基であり、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５が水素であり、かつＲ３がＯＨのとき、一般式（Ｉ０）で表させる化合物は、実施例で後述する化合物＃９を表し、上記一般式（Ｉ０）におけるＲ１が４，４，５，５，５－ペンタフルオロペンチル基であり、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５が水素であり、かつＲ３がＯＨのとき、一般式（Ｉ０）で表させる化合物は、実施例で後述する化合物＃２１を表し、上記一般式（Ｉ０）におけるＲ１が水素であり、Ｚ１、Ｚ２、Ｚ３、Ｚ４が水素であり、Ｚ５がヘキシル基であり、Ｒ３がＯＨのとき、一般式（Ｉ０）で表させる化合物は、実施例で後述する化合物＃３０を表す。
【0045】
上記一般式（II）におけるＸは、炭素数４～６の直鎖のアルキレン基、即ちブチレン－（ＣＨ２）４－、ペンチレン－（ＣＨ２）５－、ヘキシレン－（ＣＨ２）６－、又は炭素数４のエーテル基であり、炭素数４のエーテル基としては、メチレン－Ｏ－プロピレン基、エチレン－Ｏ－エチレン基、プロピレン－Ｏ－メチレン基を挙げることができ、ブチレン、ヘキシレン及びエチレン－Ｏ－エチレン基が好ましい。
【0046】
上記一般式（II）におけるＲ４及びＲ５は、同一又は異なって置換若しくは非置換の炭素数１～４のアルキル基である。置換若しくは非置換の炭素数１～４のアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、Ｒ４とＲ５が窒素と一緒になったピロリジンや、これらのメトキシ基、フェニル基、フッ素及び塩素により置換されたものを挙げることができ、好ましくは、メチル基、モノクロロメチル基、エチル基、２，２，２－トリクロロメチル基、１－フェニルエチル基、２－フェニルエチル基、メトキシエチル基、イソプロピル基、ヘキサフルオロイソプロピル基、及びピロリジンであり、より好ましくはメチル基及びエチル基である。
【0047】
一般式（II）で表される化合物の中で具体的なものとして、実施例で後述する化合物＃１３は、上記一般式（II）におけるＸがヘキシレン基であり、Ｒ６がメチル基であり、かつＲ３がＯＨである化合物である。
【0048】
上記一般式（III）におけるＲ７は、炭素数１～５のアルキル基又はベンジル基である
。鎖状又は分枝状の炭素数１～５のアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、１－メチルブチル基、２－メチルブチル基、３－メチルブチル基、１－エチルプロピル基、１，１－ジメチルプロピル基、１，２－ジメチルプロピル基、及び２，２－ジメチルプロピル基を挙げることができる。また、前記ベンジル基のベンゼン間は１又は２以上の炭素数１～３のアルキル基又は炭素数１～３のアルコキシ基で置換されていてもよい。炭素数１～３のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、及びイソプロピル基を挙げることができ、炭素数１～３のアルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロポキシ基、及びイソプロポキシ基を挙げることができる。上記一般式（III）におけるＲ７は、好ましくはメチル基、エチル基、プロピル基、ｎ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、及び３，５－ジメトキシベンジル基であり、より好ましくは３，５－ジメトキシベンジル基である。
。鎖状又は分枝状の炭素数１～５のアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、１－メチルブチル基、２－メチルブチル基、３－メチルブチル基、１－エチルプロピル基、１，１－ジメチルプロピル基、１，２－ジメチルプロピル基、及び２，２－ジメチルプロピル基を挙げることができる。また、前記ベンジル基のベンゼン間は１又は２以上の炭素数１～３のアルキル基又は炭素数１～３のアルコキシ基で置換されていてもよい。炭素数１～３のアルキル基としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、及びイソプロピル基を挙げることができ、炭素数１～３のアルコキシ基としては、メトキシ基、エトキシ基、ｎ－プロポキシ基、及びイソプロポキシ基を挙げることができる。上記一般式（III）におけるＲ７は、好ましくはメチル基、エチル基、プロピル基、ｎ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、及び３，５－ジメトキシベンジル基であり、より好ましくは３，５－ジメトキシベンジル基である。
【0049】
上記一般式（III）においてＲ４及びＲ５は、同一又は異なって置換若しくは非置換の炭素数１～４のアルキル基である。置換若しくは非置換の炭素数１～４のアルキル基としては、メチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、Ｒ４とＲ５が窒素と一緒になったピロリジンや、これらのメトキシ基、フェニル基、フッ素及び塩素により置換されたものを挙げることができ、好ましくは、メチル基、モノクロロメチル基、エチル基、２，２，２－トリクロロメチル基、１－フェニルエチル基、２－フェニルエチル基、メトキシエチル基、イソプロピル基、ヘキサフルオロイソプロピル基、及びピロリジンであり、より好ましくはメチル基及びエチル基である。
【0050】
上記一般式（III）におけるＡがインドールであり、Ｒ７が３，５－ジメトキシベンジル基であり、かつＲ３がＯＨのとき、一般式（III）で表させる化合物は、実施例で後述する化合物＃３５を表す。
【0051】
本件化合物群から選択される化合物が不斉炭素原子及び軸不斉に係わる不斉点をもつとき、かかる化合物は、考えられ得るすべての光学異性体を含み、それら光学異性体は任意の比で使用することができる。例えば、ある光学活性化合物は、エナンチオマーでもラセミでも任意の割合のエナンチオマー混合物でも使用することができ、不斉点が複数存在するときは、任意の割合のジアステレオマー混合物で使用してもよい。
【0052】
本件化合物群における医薬的に許容される塩には、アルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム及び亜鉛から生成された金属塩や、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ－メチルグルカミン、リジン、プロカイン等から生成された有機塩などが含まれる。
【0053】
本件化合物群から選択される化合物の合成方法は、特許文献５、国際公開第２０１９／２３５４５５号パンフレット等に開示された方法を用いることができるが、これらの方法に限られず、一般的に知られている合成法を用いることができる。また、以下に示す化合物は、シグマ－アルドリッチ社、東京化成工業、和光純薬、関東化学等から入手することができる。また、反応溶媒、反応温度に関して、特に記載のない場合は、通常その反応に利用される溶媒、温度で反応が行われる。反応は、通常、アルゴン又は窒素雰囲気下で行われる。保護基は、Green&Wuts, “PROTECTIVE GROUPS inORGANIC SYNTHESIS” 3rded.JohnWiley&Sons, Inc.を参照し、用いることできる。
【0054】
本件化合物群としては、本願明細書の実施例において、その効果が具体的に示されている化合物＃５、＃４、＃９、＃１３、＃２１、＃３０、＃３５が好ましい。
【0055】
本件の剤及び本件予防／改善剤の添加剤としては、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、等張剤、添加剤、被覆剤、可溶化剤、潤滑剤、滑走剤、溶解補助剤、滑沢剤、風味剤、甘味剤、溶剤、ゲル化剤、栄養剤等の配合成分を例示することができる。かかる配合成分としては、具体的に、水、生理食塩水、動物性脂肪及び油、植物油、乳糖、デンプン、ゼラチン、結晶性セルロース、ガム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリアルキレングリコール、ポリビニルアルコール、グリセリンを例示することができる。
【0056】
本件の剤及び本件予防／改善剤の投与形態としては、粉末、顆粒、錠剤、カプセル剤、シロップ剤、懸濁液などの剤型で投与する経口投与や、溶液、乳剤、懸濁液などの剤型を注射、又はスプレー剤の型で鼻孔内投与する非経口投与を挙げることができる。
【0057】
本件の剤及び本件予防／改善剤の投与量は、年齢、体重、性別、症状、薬剤への感受性等に応じて適宜決定される。通常、１μｇ～２００ｍｇ／ｄａｙの投与量の範囲で、好ましくは２μｇ～２０００μｇ／ｄａｙの投与量の範囲で、より好ましくは３～２００μｇ／ｄａｙの投与量の範囲で、さらに好ましくは４～２０μｇ／ｄａｙの投与量の範囲で、一日あたり単回又は複数回（例えば、２～４回）に分けて投与されるが、症状の改善の状況に応じて投与量を調節してよい。
【0058】
本件化合物群は、後述する実施例において具体的に示すとおり、ＳＩＲＴタンパク質の産生を、効果的に促進する作用のほか、老化に関連する症状又は疾患である脂肪肝及び肥満症を改善する作用、及び、肝機能を改善する作用、並びに、老化に関連する運動機能の低下を改善する作用などを有する。また、本件化合物群は、後述する実施例において具体的に示すとおり、ＦＯＸＯ１遺伝子の発現の上昇やＩＧＦ１シグナル経路の活性化、ＰＰＡＲ遺伝子によるＮＦ－ｋＢ経路の抑制やＤＮＡ修復、Longevity regulating経路の活性化、多能性に関する遺伝子群の発現の上昇などの作用も有している。また、本件化合物群は、後述する実施例において具体的に示すとおり、老化に関連するパスウェイであるＤＮＡのメチル化を抑制する作用も有している。これらのことから、本件化合物群を摂取することにより、それを摂取した対象において、老化に関連する（好ましくは、老化に起因する）症状又は疾患の進行を抑制若しくは遅延させることや、細胞若返りを生じさせることが十分期待される。
【0059】
本明細書において「抗老化」とは、老化に関連する（好ましくは、老化に起因する）症状又は疾患のうち、いずれか１つの症状又はいずれか１つの疾患の進行を抑制若しくは遅延させることを意味する。本明細書において、「老化に関連する（好ましくは、老化に起因する）症状又は疾患」としては、例えば、癌(例えば、乳癌、結腸直腸癌、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、前立腺癌)；肉腫（骨肉腫、脊索腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫などの骨肉腫；悪性抹消神経鞘腫瘍、横紋筋肉腫、滑膜肉腫、血管肉腫、骨外性ユーイング肉腫、消化管間質腫瘍、脂肪肉腫、繊維肉腫、粘液線維肉腫、平滑筋肉腫、胞巣状軟部肉腫、未分化多形肉腫、明細胞肉腫、隆起性皮膚線維肉腫、類上皮肉腫などの軟部肉腫）；嚢胞性線維症；神経変性疾患または神経変性障害(例えば、アルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症およびポリグルタミンの凝集によって引き起こされる障害);骨格筋疾患(例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、骨格筋萎縮、ベッカー型筋ジストロフィーまたは筋緊張性ジストロフィー)；運動機能の低下（例えば骨格筋の筋力低下,サルコペニア、骨粗鬆症、変形性関節症）;代謝疾患(例えば、インスリン抵抗性、糖尿病、肥満症、耐糖能障害、高血中コレステロール、高血糖症、脂質異常症および高脂血症、視床下部、下垂体、副腎ホルモン低下・亢進、例えば、原発性アルドステロン症);成人発症型糖尿病、糖尿病性腎症、ニューロパチー(例えば、感覚性ニューロパチー、自律神経ニューロパチー、運動神経障害、網膜症);骨疾患(例えば、骨粗鬆症)、血液疾患(例えば、白血病);肝疾患(例えば、脂肪肝、Ｂ型慢性肝炎、Ｃ型慢性肝炎、肝硬変、肝がん、アルコール性肝障害、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）などの慢性肝疾患；急性ウイルス性肝炎、薬剤性肝障害などの急性肝疾患);肥満症;骨吸収、老化黄斑変性症、エイズ関連認知症、感染症、肺繊維症、ＡＬＳ（筋萎縮性側索硬化症)、Fagile X症候群、多発性硬化症、ベル麻痺、アテローム性動脈硬化症、心疾患(例えば、不整脈、慢性うっ血性心不全、虚血性脳卒中、冠動脈疾患および心筋症、不整脈)、慢性変性疾患(例えば、心筋疾患)、腎線維化、腎機能障害（例えば、急性腎不全、慢性腎不全、急性糸球体腎炎、慢性糸球体腎炎、微小変化型腎炎、腎硬化症、膜性増殖性腎炎、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、膜性増殖性糸球体腎炎、半月体形成性腎炎、急速進行性糸球体腎炎、膜性糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎、急性腎盂腎炎、慢性腎盂腎炎、管内増殖性腎炎、ループス腎炎等の腎炎や、アミロイド腎、膜性腎症、巣状糸球体硬化症、ＩｇＡ腎症、急性尿細管壊死、ネフローゼ症候群、糖尿病性腎症、痛風腎、腎性浮腫、腎腫瘍、腎臓虚血障害、腎臓虚血再灌流障害）、２型糖尿病、潰瘍、白内障、老視、ギラン－バレー症候群、出血性卒中、関節リウマチ、炎症性腸疾患、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、乾癬、アトピー性皮膚炎、、変形性関節症、骨粗鬆症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺炎、皮膚老化、アンドロゲン性脱毛症、尿失禁、難聴、視力傷害、認知障害、ならびに神経細胞の死、老化または望まれない細胞損失を特徴とする他の状態に関連する疾患または症状を挙げることができる。本件の剤をこれら対象に投与すると、長寿や抗老化などに関連する遺伝子の発現を亢進すること等によって、寿命を延長したり、上記疾患や症状を予防又は治療することができると考えられる。本件の剤及び本件予防又は改善剤は、上記疾患や症状の中でも、肥満症、肝疾患、肝機能の低下、腎線維化、腎機能障害、及び、運動機能（例えば、筋力）の低下からなる群から選択される１種又は２種以上の予防又は治療に好適に用いることができる。かかる肝疾患として、脂肪肝、Ｂ型慢性肝炎、Ｃ型慢性肝炎、肝硬変、肝がん、アルコール性肝障害、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）などの慢性肝疾患；急性ウイルス性肝炎、薬剤性肝障害などの急性肝疾患；が好ましく挙げられ、中でも、脂肪肝がより好ましく挙げられる。
【0060】
本件の剤は、細胞若返り用の剤でもある。本明細書において「細胞若返り」には、細胞において、ＦＯＸＯ１遺伝子の発現の上昇、ＩＧＦ１シグナル経路の活性化、ＮＦ－ｋＢ経路の抑制、Longevity regulating経路の活性化、メチル化抑制、多能性に関する遺伝子群の発現の上昇、及び、ポリコーム抑制複合体２（ＰＲＣ２）経路の活性化、並びに、血液中のスペルミジン濃度の上昇からなる群から選択される１種又は２種以上が生じることが好適に含まれる。
【0061】
上記の「多能性に関する遺伝子群」としては、例えば、Ｍｙｃ遺伝子、Ｏｃｔ４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子、及び、Ｏｃｔ１遺伝子からなる群から選択される１種又は２種以上が挙げられる。上記の「ＩＧＦ１シグナル経路の活性化」としては、例えば、ＩＧＦ－１、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、及び、ｍＴＯＲからなる群から選択される１種又は２種以上から構成されるシグナル経路の活性化を意味する。上記の「ＮＦ－ｋＢ経路の抑制」としては、例えば、ＮＦ－ｋＢ、ＴＮＦ－α、ＬＰＳ（リポ多糖）、ＣＤ４０Ｌ、ＢＡＦＦ（B cell activating factor）、ＲＡＮＫＬ（receptoractivator of NF-ｋB ligand）、ＬＴβ（lymphotoxin β）、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１２、ＣＯＸ２、ＶＣＡＭ（vascularcell adhesion molecule）、及び、ＩＣＡＭ（intercellular adhesionmolecule）からなる群から選択される１種又は２種以上から構成されるシグナル経路の活性化を意味する。上記の「Longevity regulating経路の活性化」としては、例えば、ＩＧＦ－１、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ｍＴＯＲ、ＦＯＸＯ、ＳＯＤ２、ＣＡＴ（catalase）、ＡＴＧ５、及び、ＳＩＲＴ１からなる群から選択される１種又は２種以上から構成されるシグナル経路の活性化を意味する。上記のＰＲＣ２経路の活性化としては、例えば、Ｓｕｚ１２、Ｅｅｄ、Ｅｚｈ１、Ｅｚｈ２、及び、Ｒｂｂｐ４からなる群から選択される１種又は２種以上から構成されるシグナル経路の活性化を意味する。
【0062】
本件の剤及び本件予防又は改善剤の投与対象の生物種としては、動物が挙げられ、かかる動物としては、哺乳類（ヒト又は非ヒト哺乳動物）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、無脊椎動物等を挙げることができ、中でも、ヒトを好ましく挙げることができる。また、動物の他の態様として、ヒト、家畜を挙げることができる。ここで「家畜」とは、ヒトが飼育し、繁殖させた動物を意味する。かかる家畜としては、非ヒト哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット等のげっ歯類；ウサギ等のウサギ目；ブタ、ウシ、ヤギ、ウマ、ヒツジ等の有蹄目；イヌ、ネコ等のネコ目など）、鳥類（例えば、ニワトリ、ウズラ、シチメンチョウ、ハト、アヒル、ガチョウ等）、魚類（例えば、コイ、キンギョ等）、無脊椎動物（例えば、カイコ、ミツバチ等）などを例示することができる。
【0063】
本件の剤及び本件予防又は改善剤としては、本件化合物群以外の、ＳＩＲＴタンパク質の産生促進成分、抗老化成分、及び、細胞若返り成分からなる群から選択される１種又は２種以上を含むものであってもよいが、本件化合物群単独でも優れたＳＩＲＴタンパク質の産生促進効果、抗老化効果、及び、細胞若返り効果からなる群から選択される１種又は２種以上を発揮するため、本件化合物群以外の、ＳＩＲＴタンパク質の産生促進成分（例えば、特許文献１に記載のボタンボウフウの植物体またはその溶媒抽出物；特許文献２に記載の黒ウコンの抽出物；特許文献３に記載のトンカットアリの抽出物；など）、抗老化成分、及び、細胞若返り成分からなる群から選択される１種又は２種以上を含まないものが好ましい。
【0064】
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。なお、以下の実施例において、軟骨細胞の培養は、２５ｃｍ２フラスコを使用し、５％ＣＯ２／２０％Ｏ２、３７℃条件下で行った。また、軟骨細胞の培養液として、α―ＭＥＮ（α-Modified Eagle Medium）（１×）（lifetechnologies社製、REF:12571-063）５ｍＬに、１０％ウシ胎仔血清（foetal calf serum；ＦＣＳ）（life technologies社製、REF:26140-079）、１％ Insulin Transfellin Seline（life technologies社製、REF:41400-045）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン－１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン合剤（LONZA社製、REF:17-602E）を添加したものを用いた。
【実施例0065】
１．本件化合物である化合物＃５がＳＩＲＴタンパク質の産生促進効果を有することの確認
［方法］
１０ｍＬの培養液（１０重量％のＦＢＳを添加した、グルコース低含有ＤＭＥＭ培地（グルコース濃度１．０ｇ／ｄＬ）を含むディッシュに、１×１０６ｃｅｌｌ／ｄｉｓｈのＨＥＩ－ＯＣ１細胞（マウス内耳細胞株）を播種して培養した。１日後に化合物の溶媒である０．１％のＤＭＳＯ、又は各種濃度（１μＭ、３μＭ、１０μＭ、又は３０μＭ）の化合物＃５を添加し、２４時間培養した（［化＃５添加群］）。培養終了後、細胞を回収し、常法によって細胞を破壊して細胞内の各種ＳＩＲＴ（ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、及びＳＩＲＴ７）の発現レベルをウエスタンブロット法により解析した（図１－１、図１－２参照）。
［方法］
１０ｍＬの培養液（１０重量％のＦＢＳを添加した、グルコース低含有ＤＭＥＭ培地（グルコース濃度１．０ｇ／ｄＬ）を含むディッシュに、１×１０６ｃｅｌｌ／ｄｉｓｈのＨＥＩ－ＯＣ１細胞（マウス内耳細胞株）を播種して培養した。１日後に化合物の溶媒である０．１％のＤＭＳＯ、又は各種濃度（１μＭ、３μＭ、１０μＭ、又は３０μＭ）の化合物＃５を添加し、２４時間培養した（［化＃５添加群］）。培養終了後、細胞を回収し、常法によって細胞を破壊して細胞内の各種ＳＩＲＴ（ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＳＩＲＴ３、ＳＩＲＴ５、ＳＩＲＴ６、及びＳＩＲＴ７）の発現レベルをウエスタンブロット法により解析した（図１－１、図１－２参照）。
【0066】
［結果］
図１－１及び図１－２から分かるように、ＨＥＩ－ＯＣ１細胞株を、ＭＡ５の存在下で培養すると、ＭＡ５の非存在下で培養した場合と比べ、細胞内の各種ＳＩＲＴの発現量が増加することが示された。
この結果は、本件化合物群（化合物＃５）が細胞中のＳＩＲＴタンパク質の産生を促進する効果を有することを示している。
図１－１及び図１－２から分かるように、ＨＥＩ－ＯＣ１細胞株を、ＭＡ５の存在下で培養すると、ＭＡ５の非存在下で培養した場合と比べ、細胞内の各種ＳＩＲＴの発現量が増加することが示された。
この結果は、本件化合物群（化合物＃５）が細胞中のＳＩＲＴタンパク質の産生を促進する効果を有することを示している。
【0067】
２．本件化合物である化合物＃５が肥満症の改善効果を有することの確認
［方法］
ＮＤＵＦＳ４ホモノックアウトマウス（Ｎｄｕｆｓ４－/－マウス）（２８日齢）に、マウスの体重１ｋｇあたり１０ｍｇ／日の化合物＃５を、５０日間投与した（［化＃５投与群］）。
また、ＮＤＵＦＳ４ホモノックアウトマウス（Ｎｄｕｆｓ４－/－マウス）に、マウスの体重１ｋｇあたり１０ｍｇ／日のＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）を、５０日間投与した（［ＣＭＣ投与群；コントロール群］）。
なお、ＮＤＵＦＳ４ホモノックアウトマウスは、ミトコンドリア機能異常マウスであり、ミトコンドリア機能異常は加齢現象の1つであるため、ＮＤＵＦＳ４ホモノックアウトマウスは老化モデルマウスの１種として用いることができると考えられる。
［方法］
ＮＤＵＦＳ４ホモノックアウトマウス（Ｎｄｕｆｓ４－/－マウス）（２８日齢）に、マウスの体重１ｋｇあたり１０ｍｇ／日の化合物＃５を、５０日間投与した（［化＃５投与群］）。
また、ＮＤＵＦＳ４ホモノックアウトマウス（Ｎｄｕｆｓ４－/－マウス）に、マウスの体重１ｋｇあたり１０ｍｇ／日のＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）を、５０日間投与した（［ＣＭＣ投与群；コントロール群］）。
なお、ＮＤＵＦＳ４ホモノックアウトマウスは、ミトコンドリア機能異常マウスであり、ミトコンドリア機能異常は加齢現象の1つであるため、ＮＤＵＦＳ４ホモノックアウトマウスは老化モデルマウスの１種として用いることができると考えられる。
【0068】
上記の［化＃５投与群］及び［ＣＭＣ投与群］のマウスの褐色脂肪組織をＨＥ（ヘマトキシリン・エオジン）染色した結果を図２に示す。
【0069】
［結果］
［化＃５投与群］では、［ＣＭＣ投与群］と比較して、脂肪滴のサイズの減少が認められた（図２）。この結果は、本件化合物群（化合物＃５）が肥満症の改善効果を有することを示している。本件化合物群（化合物＃５）は、老化に起因する肥満症に対する改善効果を有すると考えられる。
［化＃５投与群］では、［ＣＭＣ投与群］と比較して、脂肪滴のサイズの減少が認められた（図２）。この結果は、本件化合物群（化合物＃５）が肥満症の改善効果を有することを示している。本件化合物群（化合物＃５）は、老化に起因する肥満症に対する改善効果を有すると考えられる。
【0070】
３．本件化合物である化合物＃５の、ＵＣＰ１遺伝子、ＰＰＡＲγ遺伝子、及び、ＦＡＢＰ４遺伝子の発現への影響の確認
［方法］
ＮＤＵＦＳ４ホモノックアウトマウス（Ｎｄｕｆｓ４－/－マウス）（４週齢）に、マウスの体重１ｋｇあたり１０ｍｇ／日の化合物＃５を、５０日間投与した（［化＃５投与群］）。
また、ＮＤＵＦＳ４ホモノックアウトマウス（Ｎｄｕｆｓ４－/－マウス）に、マウスの体重１ｋｇあたり１０ｍｇ／日のＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）を、５０日間投与した（［ＣＭＣ投与群；コントロール群］）。
［方法］
ＮＤＵＦＳ４ホモノックアウトマウス（Ｎｄｕｆｓ４－/－マウス）（４週齢）に、マウスの体重１ｋｇあたり１０ｍｇ／日の化合物＃５を、５０日間投与した（［化＃５投与群］）。
また、ＮＤＵＦＳ４ホモノックアウトマウス（Ｎｄｕｆｓ４－/－マウス）に、マウスの体重１ｋｇあたり１０ｍｇ／日のＣＭＣ（カルボキシメチルセルロース）を、５０日間投与した（［ＣＭＣ投与群；コントロール群］）。
【0071】
上記の［化＃５投与群］及び［ＣＭＣ投与群］のマウスの褐色脂肪細胞を採取した。かかる褐色脂肪細胞から総ＲＮＡを抽出し、それからｃＤＮＡを調製してｍＲＮＡ発現量の測定に用いた。測定は、定量ＰＣＲ法により行った。ｍＲＮＡの発現量は、内部標準として用いたβアクチンとの相対比により求めた。その結果を図３に示す。なお、プライマー及びプローブとしては、以下の市販品（Thermo Fisher Scientific社製など）を使用した。
マウス Acts(actinbeta, β-actin) Mm02619580_g1, Cat # 4331182
マウス Ucp1(uncouplingprotein 1), Mm00494069_m1, Cat# 4331182
マウス Pparg(PPARγ,peroxisome proliferator activated receptor gamma), Mm00440945_m1, Cat# 4331182p
マウス Fabp4(fatty acidbinding protein 4), Mm00445880_m1, Cat# 4331182
マウス Acts(actinbeta, β-actin) Mm02619580_g1, Cat # 4331182
マウス Ucp1(uncouplingprotein 1), Mm00494069_m1, Cat# 4331182
マウス Pparg(PPARγ,peroxisome proliferator activated receptor gamma), Mm00440945_m1, Cat# 4331182p
マウス Fabp4(fatty acidbinding protein 4), Mm00445880_m1, Cat# 4331182
【0072】
［結果］
［化＃５投与群］では、［ＣＭＣ投与群］と比較して、ＰＰＡＲγ遺伝子の発現が有意に高いことが示された（図３）。また、［化＃５投与群］では、［ＣＭＣ投与群］と比較して、ＦＡＢＰ４遺伝子の発現が高いことも示された（図３）。［化＃５投与群］が肥満症や脂肪肝（後述の試験４．参照）を改善するメカニズムの詳細は明らかではないが、ＰＰＡＲγ遺伝子やＦＡＢＰ４遺伝子の発現の増加が何らかの関与をしている可能性が考えられた。また、化＃５が肥満症や脂肪肝を改善することには、後述の試験結果（後述の試験９．及び１２．～１４．など）に示されるように、化＃５が抗老化関連遺伝子、長寿関連遺伝子、リプログラミング関連遺伝子などが関与をしている可能性も考えられた。
［化＃５投与群］では、［ＣＭＣ投与群］と比較して、ＰＰＡＲγ遺伝子の発現が有意に高いことが示された（図３）。また、［化＃５投与群］では、［ＣＭＣ投与群］と比較して、ＦＡＢＰ４遺伝子の発現が高いことも示された（図３）。［化＃５投与群］が肥満症や脂肪肝（後述の試験４．参照）を改善するメカニズムの詳細は明らかではないが、ＰＰＡＲγ遺伝子やＦＡＢＰ４遺伝子の発現の増加が何らかの関与をしている可能性が考えられた。また、化＃５が肥満症や脂肪肝を改善することには、後述の試験結果（後述の試験９．及び１２．～１４．など）に示されるように、化＃５が抗老化関連遺伝子、長寿関連遺伝子、リプログラミング関連遺伝子などが関与をしている可能性も考えられた。
【0073】
４．本件化合物である化合物＃５が、脂肪肝の改善効果を有することの確認
［方法］
ＮＤＵＦＳ４ホモノックアウトマウス（Ｎｄｕｆｓ４－/－マウス）（４週齢）に、マウスの体重１ｋｇあたり０．１ｍｇ／日の化合物＃５を、２４日間経口投与した（［化＃５投与群］）。
また、ＮＤＵＦＳ４ホモノックアウトマウス（Ｎｄｕｆｓ４－/－マウス）に水を２４日間経口投与した（［ＤＭＳＯ群；コントロール群］）。
さらに、野生型のマウスに水を２４日間経口投与した（［コントロール２群］）。
［方法］
ＮＤＵＦＳ４ホモノックアウトマウス（Ｎｄｕｆｓ４－/－マウス）（４週齢）に、マウスの体重１ｋｇあたり０．１ｍｇ／日の化合物＃５を、２４日間経口投与した（［化＃５投与群］）。
また、ＮＤＵＦＳ４ホモノックアウトマウス（Ｎｄｕｆｓ４－/－マウス）に水を２４日間経口投与した（［ＤＭＳＯ群；コントロール群］）。
さらに、野生型のマウスに水を２４日間経口投与した（［コントロール２群］）。
【0074】
上記の［化＃５投与群］、［コントロール１群］及び［コントロール２群］のマウスの肝臓組織を採取して、その切片を電子顕微鏡で観察した結果を図４に示す。
【0075】
［結果］
図４から分かるように、［コントロール１群］では、肝細胞内に著明な脂肪沈着が認められる脂肪肝の所見が認められる肝細胞内に著明な脂肪沈着が認められる脂肪肝の所見が認められるのに対し、［化＃５投与群］では、肝細胞内の脂肪沈着が明らかに軽減して脂肪肝の改善が認められる所見であった。今回の図４の結果から、本件化合物群（化合物＃５）は、老化に起因する脂肪肝に対する改善効果を有すると考えられる。
図４から分かるように、［コントロール１群］では、肝細胞内に著明な脂肪沈着が認められる脂肪肝の所見が認められる肝細胞内に著明な脂肪沈着が認められる脂肪肝の所見が認められるのに対し、［化＃５投与群］では、肝細胞内の脂肪沈着が明らかに軽減して脂肪肝の改善が認められる所見であった。今回の図４の結果から、本件化合物群（化合物＃５）は、老化に起因する脂肪肝に対する改善効果を有すると考えられる。
【0076】
５．本件化合物である化合物＃４が、肝機能の改善効果を有することの確認
［方法］
Ｃ５７ＢＬ６マウス（８週齢）に、マウスの体重１ｋｇあたり５０ｍｇ／ｋｇ／日/ＤＭＳＯコーン油の化合物＃４を、７日間経口投与した（［Ｌ群］）。
また、Ｃ５７ＢＬ６マウス（８週齢）に、マウスの体重１ｋｇあたり１５０ｍｇ／ｋｇ／日/ＤＭＳＯコーン油の化合物＃４を、７日間経口投与した（［Ｈ群］）。
さらに、Ｃ５７ＢＬ６マウス（８週齢））にＤＭＳＯコーン油を７日間経口投与した（［対照群］）。
［方法］
Ｃ５７ＢＬ６マウス（８週齢）に、マウスの体重１ｋｇあたり５０ｍｇ／ｋｇ／日/ＤＭＳＯコーン油の化合物＃４を、７日間経口投与した（［Ｌ群］）。
また、Ｃ５７ＢＬ６マウス（８週齢）に、マウスの体重１ｋｇあたり１５０ｍｇ／ｋｇ／日/ＤＭＳＯコーン油の化合物＃４を、７日間経口投与した（［Ｈ群］）。
さらに、Ｃ５７ＢＬ６マウス（８週齢））にＤＭＳＯコーン油を７日間経口投与した（［対照群］）。
【0077】
上記の［Ｌ群］、［Ｈ群］及び［対照群］のマウスの血液を採取して、血液中のエリスロポエチン濃度、中性脂肪濃度、ＧＯＴ濃度、ＧＴＰ濃度、総コレステロール（Ｔ－Ｃｈｏ）濃度、ＨＤＬ濃度を測定した結果を図５に示す。
【0078】
［結果］
図５から分かるように、本件化合物群（化合物＃４）を投与すると、ＧＯＴ、ＧＰＴが減少したことから、本件化合物群（化合物＃４）は肝臓保護機能を有し、肝機能の改善効果を有していることが示された。
図５から分かるように、本件化合物群（化合物＃４）を投与すると、ＧＯＴ、ＧＰＴが減少したことから、本件化合物群（化合物＃４）は肝臓保護機能を有し、肝機能の改善効果を有していることが示された。
【0079】
６．化合物＃５以外の本件化合物もＳＩＲＴタンパク質の産生促進効果を有することの確認
［方法］
１０ｍＬの培養液（１０重量％のＦＢＳを添加した、グルコース低含有ＤＭＥＭ培地（グルコース濃度１．０ｇ／ｄＬ）を含むディッシュに、１×１０６ｃｅｌｌ／ｄｉｓｈのＲＨ３０細胞（ヒト横紋筋肉腫細胞株；ｇｌｉ遺伝子発現＋、Ｎ－ｍｙｃ遺伝子発現＋）を播種して培養した。１日後に化合物＃５を３０μＭになるように添加し、２４時間培養した（［化＃５添加群］）。なお、化合物＃５に代えて、本件化合物である化合物＃９、化合物＃１３、化合物＃２１、化合物＃３０又は化合物＃３５を添加して同様に培養したものを、それぞれ［化＃９添加群］、［化＃１３添加群］、［化＃２１添加群］、［化＃３０添加群］、及び、［化＃１３添加群］とした。
一方、コントロールとして、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を０．２重量％となるように添加し、２４時間培養した（［対照群］）。
培養終了後、細胞を回収し、常法によって細胞を破壊して細胞内の各タンパク質（ＳＩＲＴ１タンパク質など）量をウエスタンブロット法により検出した。その結果を図６に示す。さらに、図６のウエスタンブロットの検出結果の各バンドを、ローディングコントロールであるβ－アクチンのバンドで標準化して定量化した結果を図７に示す。
［方法］
１０ｍＬの培養液（１０重量％のＦＢＳを添加した、グルコース低含有ＤＭＥＭ培地（グルコース濃度１．０ｇ／ｄＬ）を含むディッシュに、１×１０６ｃｅｌｌ／ｄｉｓｈのＲＨ３０細胞（ヒト横紋筋肉腫細胞株；ｇｌｉ遺伝子発現＋、Ｎ－ｍｙｃ遺伝子発現＋）を播種して培養した。１日後に化合物＃５を３０μＭになるように添加し、２４時間培養した（［化＃５添加群］）。なお、化合物＃５に代えて、本件化合物である化合物＃９、化合物＃１３、化合物＃２１、化合物＃３０又は化合物＃３５を添加して同様に培養したものを、それぞれ［化＃９添加群］、［化＃１３添加群］、［化＃２１添加群］、［化＃３０添加群］、及び、［化＃１３添加群］とした。
一方、コントロールとして、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を０．２重量％となるように添加し、２４時間培養した（［対照群］）。
培養終了後、細胞を回収し、常法によって細胞を破壊して細胞内の各タンパク質（ＳＩＲＴ１タンパク質など）量をウエスタンブロット法により検出した。その結果を図６に示す。さらに、図６のウエスタンブロットの検出結果の各バンドを、ローディングコントロールであるβ－アクチンのバンドで標準化して定量化した結果を図７に示す。
【0080】
［結果］
［化＃５添加群］だけでなく、［化＃９添加群］、［化＃１３添加群］、［化＃２１添加群］、［化＃３０添加群］、及び、［化＃１３添加群］のいずれにおいても、細胞中のＳＩＲＴ１タンパク質の量は、「対照群」と比べて増加していた（図６～図７）。
これらの結果は、化合物＃５だけでなく、多くの本件化合物群が、細胞中のＳＩＲＴ１タンパク質の産生を促進する効果を有することを示している。
［化＃５添加群］だけでなく、［化＃９添加群］、［化＃１３添加群］、［化＃２１添加群］、［化＃３０添加群］、及び、［化＃１３添加群］のいずれにおいても、細胞中のＳＩＲＴ１タンパク質の量は、「対照群」と比べて増加していた（図６～図７）。
これらの結果は、化合物＃５だけでなく、多くの本件化合物群が、細胞中のＳＩＲＴ１タンパク質の産生を促進する効果を有することを示している。
【0081】
７．化合物＃５が、老齢マウスの運動機能の低下に対する抑制効果を有することの確認
［方法］
Ｃ５７ＢＬ６マウス（９２週齢）に、水に懸濁した化合物＃５を与えて、マウスの体重１ｋｇあたり５０ｍｇ／ｋｇ／日の化合物＃５を、２か月間経口投与した（［ＭＡ５添加群］、ｎ＝５）。２か月間の経口投与後には、かかるマウスは１０１週齢となった。
また、Ｃ５７ＢＬ６マウス（９２週齢）に、水を２か月間経口投与した（［Vehicle群］、ｎ＝５）。２か月間の経口投与後には、かかるマウスは１０１週齢となった。
［方法］
Ｃ５７ＢＬ６マウス（９２週齢）に、水に懸濁した化合物＃５を与えて、マウスの体重１ｋｇあたり５０ｍｇ／ｋｇ／日の化合物＃５を、２か月間経口投与した（［ＭＡ５添加群］、ｎ＝５）。２か月間の経口投与後には、かかるマウスは１０１週齢となった。
また、Ｃ５７ＢＬ６マウス（９２週齢）に、水を２か月間経口投与した（［Vehicle群］、ｎ＝５）。２か月間の経口投与後には、かかるマウスは１０１週齢となった。
【0082】
上記の［ＭＡ５添加群］及び［Vehicle群］の各老齢マウスのトレッドミルでの走行時間を測定した結果を、図８に示す。また、それらの［ＭＡ５添加群］及び［Vehicle群］の各老齢マウスのサバイバルの割合（その経過時間まで、疲労困憊せずに走り続けているマウスの割合）（％）を算出した結果を、図９に示す。
【0083】
［結果］
図８から分かるように、［Vehicle群］の老齢マウスでは、トレッドミルでの走行時間が有意に減少し、運動機能が低下したのに対し、［ＭＡ５添加群］の老齢マウスでは、トレッドミルでの走行時間は減少せず、運動機能の低下が抑制された。また、図９から分かるように、［Vehicle群］の老齢マウスと比較して、［ＭＡ５添加群］の老齢マウスでは、疲労困憊までの時間が有意に向上した（ｐ＝０．００３４）。
これらの結果から、化合物＃５は、老齢マウスにおける老化による運動機能の低下に対する抑制効果を有することが示された。
図８から分かるように、［Vehicle群］の老齢マウスでは、トレッドミルでの走行時間が有意に減少し、運動機能が低下したのに対し、［ＭＡ５添加群］の老齢マウスでは、トレッドミルでの走行時間は減少せず、運動機能の低下が抑制された。また、図９から分かるように、［Vehicle群］の老齢マウスと比較して、［ＭＡ５添加群］の老齢マウスでは、疲労困憊までの時間が有意に向上した（ｐ＝０．００３４）。
これらの結果から、化合物＃５は、老齢マウスにおける老化による運動機能の低下に対する抑制効果を有することが示された。
【0084】
８．化合物＃５で処理した老齢マウスの筋肉細胞において上昇制御された遺伝子経路などの確認
［方法］
Ｃ５７ＢＬ６マウス（９２週齢）に、水に懸濁した化合物＃５を与えて、マウスの体重１ｋｇあたり５０ｍｇ／ｋｇ／日の化合物＃５を２か月間経口投与した（［ＭＡ５添加群］、ｎ＝５）。２か月間の経口投与後には、かかるマウスは１０１週齢となった。
また、Ｃ５７ＢＬ６マウス（９２週齢）に、水を２か月間経口投与した（［Vehicle群］、ｎ＝５）。２か月間の経口投与後には、かかるマウスは１０１週齢となった。
［方法］
Ｃ５７ＢＬ６マウス（９２週齢）に、水に懸濁した化合物＃５を与えて、マウスの体重１ｋｇあたり５０ｍｇ／ｋｇ／日の化合物＃５を２か月間経口投与した（［ＭＡ５添加群］、ｎ＝５）。２か月間の経口投与後には、かかるマウスは１０１週齢となった。
また、Ｃ５７ＢＬ６マウス（９２週齢）に、水を２か月間経口投与した（［Vehicle群］、ｎ＝５）。２か月間の経口投与後には、かかるマウスは１０１週齢となった。
【0085】
上記の［ＭＡ５添加群］及び［Vehicle群］の老齢マウスの筋肉の細胞について、ＲＮＡシーケンス（RNA-Seq）解析を行い、投与前の若齢マウスの筋肉の細胞と比較して［ＭＡ５添加群］及び［Vehicle群］において発現量が変化した（増加又は減少した）遺伝子を特定した。その結果を図１０に示す。また、老齢マウスの［Vehicle群］と［ＭＡ５添加群］とで、多能性関連遺伝子であるＫｌｆ４遺伝子、Ｎａｎｏｇ遺伝子、Ｐｏｕ５ｆ１（Ｏｃｔ４）遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｍｙｃ遺伝子の発現量を比較した結果を図１１に示す。
【0086】
［結果］
図１０において、右側の５列の結果は［ＭＡ５添加群］の結果であり、左側の５列の結果は［Vehicle群］の結果である。図１０のうち、上から１０種類の遺伝子名は、投与前と比較して［ＭＡ５添加群］及び［Vehicle群］においてそれぞれ発現量の増加傾向及び減少傾向が認められた遺伝子群であり、下から１０種類の遺伝子名は、投与前と比較して［ＭＡ５添加群］及び［Vehicle群］においてそれぞれ発現量の減少傾向及び増加傾向が認められた遺伝子群である。図１１から分かるように、［ＭＡ５添加群］の老齢マウスの筋肉細胞では、多能性関連遺伝子であるＫｌｆ４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｍｙｃ遺伝子の発現量が有意に増加しており、また、Ｎａｎｏｇ遺伝子、Ｐｏｕ５ｆ１（Ｏｃｔ４）遺伝子の発現量について増加傾向が認められた。
図１０において、右側の５列の結果は［ＭＡ５添加群］の結果であり、左側の５列の結果は［Vehicle群］の結果である。図１０のうち、上から１０種類の遺伝子名は、投与前と比較して［ＭＡ５添加群］及び［Vehicle群］においてそれぞれ発現量の増加傾向及び減少傾向が認められた遺伝子群であり、下から１０種類の遺伝子名は、投与前と比較して［ＭＡ５添加群］及び［Vehicle群］においてそれぞれ発現量の減少傾向及び増加傾向が認められた遺伝子群である。図１１から分かるように、［ＭＡ５添加群］の老齢マウスの筋肉細胞では、多能性関連遺伝子であるＫｌｆ４遺伝子、Ｓｏｘ２遺伝子、Ｍｙｃ遺伝子の発現量が有意に増加しており、また、Ｎａｎｏｇ遺伝子、Ｐｏｕ５ｆ１（Ｏｃｔ４）遺伝子の発現量について増加傾向が認められた。
【0087】
［方法］
ＲＮＡシーケンス（RNA-Seq）解析において、［Vehicle群］の老齢マウスと比較して、［ＭＡ５添加群］の老齢マウスにおいて発現量が増加又は減少した遺伝子名に基づいて、［ＭＡ５添加群］の老齢マウスの筋肉細胞において発現が変動している遺伝子パスウェイ解析を行った。その結果を図１２に示す。
ＲＮＡシーケンス（RNA-Seq）解析において、［Vehicle群］の老齢マウスと比較して、［ＭＡ５添加群］の老齢マウスにおいて発現量が増加又は減少した遺伝子名に基づいて、［ＭＡ５添加群］の老齢マウスの筋肉細胞において発現が変動している遺伝子パスウェイ解析を行った。その結果を図１２に示す。
【0088】
［結果］
図１２から分かるように、［ＭＡ５添加群］の老齢マウスでは、寿命制御経路（Longevityregulating pathway）の亢進、ＭＡＰＫカスケードの抑制、インスリンシグナル経路の亢進などが生じていることが示された。
図１２から分かるように、［ＭＡ５添加群］の老齢マウスでは、寿命制御経路（Longevityregulating pathway）の亢進、ＭＡＰＫカスケードの抑制、インスリンシグナル経路の亢進などが生じていることが示された。
【0089】
［方法］
ＲＮＡシーケンス（RNA-Seq）解析において、［Vehicle群］の老齢マウスと比較して、［ＭＡ５添加群］の老齢マウスにおいて発現量が増加又は減少した遺伝子名の結果を利用して、ChIP-Atlasとの統合解析を行い、それらの遺伝子が関連すると考えられる転写因子を調べた。その結果を表１及び図１３に示す。
ＲＮＡシーケンス（RNA-Seq）解析において、［Vehicle群］の老齢マウスと比較して、［ＭＡ５添加群］の老齢マウスにおいて発現量が増加又は減少した遺伝子名の結果を利用して、ChIP-Atlasとの統合解析を行い、それらの遺伝子が関連すると考えられる転写因子を調べた。その結果を表１及び図１３に示す。
【0090】
［結果］
【0091】
【表1】
【0092】
表１及び図１３から分かるように、［ＭＡ５添加群］の老齢マウスにおいて発現が増加している遺伝子が関連する転写因子には、長寿遺伝子として知られるＦＯＸＯ１や、ｉＰＳ細胞作製の際に必要なリプログラミング因子の一つであるＫＬＦ４、多能性関連遺伝子であるＫＬＦ２、ＫＬＦ５などが含まれていることが示された。
【0093】
９．化合物＃５が、若齢マウスの運動機能の低下に対する抑制効果を有することの確認
［方法］
Ｃ５７ＢＬ６マウス（１２週齢）に、水に懸濁した化合物＃５を与えて、マウスの体重１ｋｇあたり５０ｍｇ／ｋｇ／日の化合物＃５を、２か月間経口投与した（［ＭＡ５高用量添加群］、ｎ＝５）。
また、Ｃ５７ＢＬ６マウス（１２週齢）に、水に懸濁した化合物＃５を与えて、マウスの体重１ｋｇあたり１０ｍｇ／ｋｇ／日の化合物＃５を、２か月間経口投与した（［ＭＡ５低用量添加群］、ｎ＝５）。
また、Ｃ５７ＢＬ６マウス（１２週齢）に、水を２か月間経口投与した（［Vehicle群］、ｎ＝５）。
［方法］
Ｃ５７ＢＬ６マウス（１２週齢）に、水に懸濁した化合物＃５を与えて、マウスの体重１ｋｇあたり５０ｍｇ／ｋｇ／日の化合物＃５を、２か月間経口投与した（［ＭＡ５高用量添加群］、ｎ＝５）。
また、Ｃ５７ＢＬ６マウス（１２週齢）に、水に懸濁した化合物＃５を与えて、マウスの体重１ｋｇあたり１０ｍｇ／ｋｇ／日の化合物＃５を、２か月間経口投与した（［ＭＡ５低用量添加群］、ｎ＝５）。
また、Ｃ５７ＢＬ６マウス（１２週齢）に、水を２か月間経口投与した（［Vehicle群］、ｎ＝５）。
【0094】
上記の［ＭＡ５高用量添加群］、［ＭＡ５低用量添加群］及び［Vehicle群］の各若齢マウスのトレッドミルでの走行時間を測定した結果を、図１４に示す。また、それらの［ＭＡ５高用量添加群］、［ＭＡ５低用量添加群］及び［Vehicle群］の各若齢マウスのサバイバルの割合（その経過時間まで、疲労困憊せずに走り続けているマウスの割合）（％）を算出した結果を、図１５に示す。
【0095】
［結果］
図１４から分かるように、［Vehicle群］の若齢マウスでは、トレッドミルでの走行時間が減少し、運動機能が低下したのに対し、［ＭＡ５低用量添加群］や［ＭＡ５高用量添加群］の若齢マウスでは、トレッドミルでの走行時間の減少が、ＭＡ５の用量依存的に抑制され、運動機能の低下が抑制された。また、図１５から分かるように、［Vehicle群］の若齢マウスと比較して、［ＭＡ５低用量添加群］や［ＭＡ５高用量添加群］の若齢マウスでは、疲労困憊までの時間が有意に向上した（ｐ＜０．０１）。
これらの結果から、化合物＃５は、若齢マウスにおいても、老化による運動機能の低下に対する抑制効果を有することが示された。
図１４から分かるように、［Vehicle群］の若齢マウスでは、トレッドミルでの走行時間が減少し、運動機能が低下したのに対し、［ＭＡ５低用量添加群］や［ＭＡ５高用量添加群］の若齢マウスでは、トレッドミルでの走行時間の減少が、ＭＡ５の用量依存的に抑制され、運動機能の低下が抑制された。また、図１５から分かるように、［Vehicle群］の若齢マウスと比較して、［ＭＡ５低用量添加群］や［ＭＡ５高用量添加群］の若齢マウスでは、疲労困憊までの時間が有意に向上した（ｐ＜０．０１）。
これらの結果から、化合物＃５は、若齢マウスにおいても、老化による運動機能の低下に対する抑制効果を有することが示された。
【0096】
１０．化合物＃５で処理した若齢マウスの筋肉細胞において上昇制御された遺伝子経路などの確認
［方法］
Ｃ５７ＢＬ６マウス（１２週齢）に、水に懸濁した化合物＃５を与えて、マウスの体重１ｋｇあたり５０ｍｇ／ｋｇ／日の化合物＃５を２か月間経口投与した（［ＭＡ５添加群］、ｎ＝５）。２か月間の経口投与後には、かかるマウスは２０週齢となった。
また、Ｃ５７ＢＬ６マウス（１２週齢）に、水を２か月間経口投与した（［Vehicle群］、ｎ＝５）。２か月間の経口投与後には、かかるマウスは２０週齢となった。
［方法］
Ｃ５７ＢＬ６マウス（１２週齢）に、水に懸濁した化合物＃５を与えて、マウスの体重１ｋｇあたり５０ｍｇ／ｋｇ／日の化合物＃５を２か月間経口投与した（［ＭＡ５添加群］、ｎ＝５）。２か月間の経口投与後には、かかるマウスは２０週齢となった。
また、Ｃ５７ＢＬ６マウス（１２週齢）に、水を２か月間経口投与した（［Vehicle群］、ｎ＝５）。２か月間の経口投与後には、かかるマウスは２０週齢となった。
【0097】
上記の［ＭＡ５添加群］及び［Vehicle群］の若齢マウスの筋肉の細胞について、ＲＮＡシーケンス（RNA-Seq）解析を行い、投与前の若齢マウスの筋肉の細胞と比較して［ＭＡ５添加群］及び［Vehicle群］において発現量が変化した（増加又は減少した）遺伝子を特定した。その結果を図１６に示す。
【0098】
［結果］
図１６において、右側の５列の結果は［ＭＡ５添加群］の結果であり、左側の５列の結果は［Vehicle群］の結果である。図１６のうち、上から５種類の遺伝子名は、投与前と比較して［ＭＡ５添加群］及び［Vehicle群］においてそれぞれ発現量の増加傾向及び減少傾向が認められた遺伝子群であり、下から５種類の遺伝子名は、投与前と比較して［ＭＡ５添加群］及び［Vehicle群］においてそれぞれ発現量の減少傾向及び増加傾向が認められた遺伝子群である。図１６から分かるように、［ＭＡ５添加群］の若齢マウスでは、Ｔｂｘ１遺伝子など、筋肉の分化、発達などに関連する遺伝子の発現量が増加していることが示された。
図１６において、右側の５列の結果は［ＭＡ５添加群］の結果であり、左側の５列の結果は［Vehicle群］の結果である。図１６のうち、上から５種類の遺伝子名は、投与前と比較して［ＭＡ５添加群］及び［Vehicle群］においてそれぞれ発現量の増加傾向及び減少傾向が認められた遺伝子群であり、下から５種類の遺伝子名は、投与前と比較して［ＭＡ５添加群］及び［Vehicle群］においてそれぞれ発現量の減少傾向及び増加傾向が認められた遺伝子群である。図１６から分かるように、［ＭＡ５添加群］の若齢マウスでは、Ｔｂｘ１遺伝子など、筋肉の分化、発達などに関連する遺伝子の発現量が増加していることが示された。
【0099】
［方法］
ＲＮＡシーケンス（RNA-Seq）解析において、［Vehicle群］の若齢マウスと比較して、［ＭＡ５添加群］の若齢マウスにおいて発現量が増加又は減少した遺伝子名に基づいて、［ＭＡ５添加群］において発現が変動している遺伝子パスウェイ解析を行った。その結果を図１７に示す。
ＲＮＡシーケンス（RNA-Seq）解析において、［Vehicle群］の若齢マウスと比較して、［ＭＡ５添加群］の若齢マウスにおいて発現量が増加又は減少した遺伝子名に基づいて、［ＭＡ５添加群］において発現が変動している遺伝子パスウェイ解析を行った。その結果を図１７に示す。
【0100】
【0101】
［方法］
ＲＮＡシーケンス（RNA-Seq）解析において、［Vehicle群］の若齢マウスと比較して、［ＭＡ５添加群］の若齢マウスにおいて発現量が増加又は減少した遺伝子名の結果を利用して、ChIP-Atlasとの統合解析を行い、それらの遺伝子が関連すると考えられる転写因子を調べた。その結果を表２及び図１８に示す。
ＲＮＡシーケンス（RNA-Seq）解析において、［Vehicle群］の若齢マウスと比較して、［ＭＡ５添加群］の若齢マウスにおいて発現量が増加又は減少した遺伝子名の結果を利用して、ChIP-Atlasとの統合解析を行い、それらの遺伝子が関連すると考えられる転写因子を調べた。その結果を表２及び図１８に示す。
【0102】
［結果］
【0103】
【表2】
【0104】
表２及び図１８から分かるように、［ＭＡ５添加群］の若齢マウスの筋肉細胞において発現が増加している遺伝子が関連する転写因子には、ヒストンメチル化を抑制するポリコーム抑制複合体２（ＰＲＣ２）を構成する因子であるＳＵＺ１２、ＥＺＨ２などが含まれていることが示された。
【0105】
１１．化合物＃５で処理した若齢マウスの肝臓細胞において上昇制御された遺伝子経路などの確認
［方法］
Ｃ５７ＢＬ６マウス（１２週齢）に、水に懸濁した化合物＃５を与えて、マウスの体重１ｋｇあたり５０ｍｇ／ｋｇ／日の化合物＃５を２か月間経口投与した（［ＭＡ５添加群］、ｎ＝５）。２か月間の経口投与後には、かかるマウスは２０週齢となった。
また、Ｃ５７ＢＬ６マウス（１２週齢）に、水を２か月間経口投与した（［Vehicle群］、ｎ＝５）。２か月間の経口投与後には、かかるマウスは２０週齢となった。
［方法］
Ｃ５７ＢＬ６マウス（１２週齢）に、水に懸濁した化合物＃５を与えて、マウスの体重１ｋｇあたり５０ｍｇ／ｋｇ／日の化合物＃５を２か月間経口投与した（［ＭＡ５添加群］、ｎ＝５）。２か月間の経口投与後には、かかるマウスは２０週齢となった。
また、Ｃ５７ＢＬ６マウス（１２週齢）に、水を２か月間経口投与した（［Vehicle群］、ｎ＝５）。２か月間の経口投与後には、かかるマウスは２０週齢となった。
【0106】
上記の［ＭＡ５添加群］及び［Vehicle群］の若齢マウスの肝臓細胞について、ＲＮＡシーケンス（RNA-Seq）解析を行い、［Vehicle群］と比較して［ＭＡ５添加群］において発現量が変化した（増加又は減少した）遺伝子を特定した。それらの遺伝子名の結果を利用して、ChIP-Atlasとの統合解析を行い、それらの遺伝子が関連すると考えられる転写因子を調べた。その結果を表３及び図１９に示す。
【0107】
［結果］
【0108】
【表3】
【0109】
表３及び図１９から分かるように、［ＭＡ５添加群］の若齢マウスの肝臓細胞において発現が増加している遺伝子が関連する転写因子には、ｉＰＳ細胞作製の際のリプログラミング因子に関連するＭＹＣ、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧや、ＳＩＲＴに関連するＲＸＲ（レチノイドＸ受容体）、ＰＰＡＲＡ（ペルオキシソーム増殖剤活性化レセプターα）、ヒストンメチル化に関連するＴＲＩＭ２８（トリパータイトモチーフ含有タンパク質２８）などが含まれていることが示された。
【0110】
１２．化合物＃５で処理した老齢マウスの肝臓細胞において上昇制御された遺伝子経路などの確認
［方法］
Ｃ５７ＢＬ６マウス（９２週齢）に、水に懸濁した化合物＃５を与えて、マウスの体重１ｋｇあたり５０ｍｇ／ｋｇ／日の化合物＃５を２か月間経口投与した（［ＭＡ５添加群］、ｎ＝５）。２か月間の経口投与後には、かかるマウスは１０１週齢となった。
また、Ｃ５７ＢＬ６マウス（９２週齢）に、水を２か月間経口投与した（［Vehicle群］、ｎ＝５）。２か月間の経口投与後には、かかるマウスは１０１週齢となった。
［方法］
Ｃ５７ＢＬ６マウス（９２週齢）に、水に懸濁した化合物＃５を与えて、マウスの体重１ｋｇあたり５０ｍｇ／ｋｇ／日の化合物＃５を２か月間経口投与した（［ＭＡ５添加群］、ｎ＝５）。２か月間の経口投与後には、かかるマウスは１０１週齢となった。
また、Ｃ５７ＢＬ６マウス（９２週齢）に、水を２か月間経口投与した（［Vehicle群］、ｎ＝５）。２か月間の経口投与後には、かかるマウスは１０１週齢となった。
【0111】
上記の［ＭＡ５添加群］及び［Vehicle群］の老齢マウスの肝臓細胞について、ＲＮＡシーケンス（RNA-Seq）解析を行い、投与前の若齢マウスの肝臓細胞と比較して［ＭＡ５添加群］において発現量が変化した（増加又は減少した）遺伝子を特定した。それらの遺伝子名の結果を利用して、ChIP-Atlasとの統合解析を行い、それらの遺伝子が関連すると考えられる転写因子を調べた。その結果を表４及び図２０に示す。
【0112】
［結果］
【0113】
【表4】
【0114】
表４及び図２０から分かるように、［ＭＡ５添加群］の老齢マウスの肝臓細胞において発現が増加している遺伝子が関連する転写因子には、長寿遺伝子として知られるＦＯＸＯ１、ＳＩＲＴに関連するＰＰＡＲＡ（ペルオキシソーム増殖剤活性化レセプターα）などが含まれていることが示された。
【0115】
１３．化合物＃５で処理したＮｄｕｆｓ４ノックアウトマウスの内耳の蝸牛殻（cochlea）の細胞において上昇制御された遺伝子経路などの確認
［方法］
Ｎｄｕｆｓ４（ＮＡＤＨ－ユビキノン酸化還元酵素サブユニット４）ノックアウトマウス（６週齢）に、水に懸濁した化合物＃５を与えて、マウスの体重１ｋｇあたり５０ｍｇ／ｋｇ／日の化合物＃５を２週間経口投与した（［ＭＡ５添加群］、ｎ＝５）。
また、Ｎｄｕｆｓ４ノックアウトマウス（６週齢）に、水を２週間経口投与した（［Vehicle群］、ｎ＝５）。
［方法］
Ｎｄｕｆｓ４（ＮＡＤＨ－ユビキノン酸化還元酵素サブユニット４）ノックアウトマウス（６週齢）に、水に懸濁した化合物＃５を与えて、マウスの体重１ｋｇあたり５０ｍｇ／ｋｇ／日の化合物＃５を２週間経口投与した（［ＭＡ５添加群］、ｎ＝５）。
また、Ｎｄｕｆｓ４ノックアウトマウス（６週齢）に、水を２週間経口投与した（［Vehicle群］、ｎ＝５）。
【0116】
上記の［ＭＡ５添加群］及び［Vehicle群］のＮｄｕｆｓ４ノックアウトマウスの内耳の蝸牛殻の細胞について、ＲＮＡシーケンス（RNA-Seq）解析を行い、［Vehicle群］と比較して［ＭＡ５添加群］において発現量が変化した（増加又は減少した）遺伝子を特定した。その遺伝子名に基づいて、［ＭＡ５添加群］のＮｄｕｆｓ４ノックアウトマウスの内耳細胞において発現が変動している遺伝子パスウェイ解析を行った。その結果を図２１に示す。
【0117】
［結果］
図２１から分かるように、［ＭＡ５添加群］のＮｄｕｆｓ４ノックアウトマウスの内耳の蝸牛殻の細胞では、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）遺伝子のパスウェイが亢進しており、ＭＡ５処理によって、ＩＧＦ１シグナル経路が亢進することが示された。
図２１から分かるように、［ＭＡ５添加群］のＮｄｕｆｓ４ノックアウトマウスの内耳の蝸牛殻の細胞では、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）遺伝子のパスウェイが亢進しており、ＭＡ５処理によって、ＩＧＦ１シグナル経路が亢進することが示された。
【0118】
［方法］
ＲＮＡシーケンス（RNA-Seq）解析において、［Vehicle群］のＮｄｕｆｓ４ノックアウトマウスと比較して、［ＭＡ５添加群］のＮｄｕｆｓ４ノックアウトマウスにおいて発現量が増加又は減少した遺伝子名の結果を利用して、ChIP-Atlasとの統合解析を行い、それらの遺伝子が関連すると考えられる転写因子を調べた。その結果を表５に示す。
ＲＮＡシーケンス（RNA-Seq）解析において、［Vehicle群］のＮｄｕｆｓ４ノックアウトマウスと比較して、［ＭＡ５添加群］のＮｄｕｆｓ４ノックアウトマウスにおいて発現量が増加又は減少した遺伝子名の結果を利用して、ChIP-Atlasとの統合解析を行い、それらの遺伝子が関連すると考えられる転写因子を調べた。その結果を表５に示す。
【0119】
［結果］
【0120】
【表5】
【0121】
表５から分かるように、［ＭＡ５添加群］のＮｄｕｆｓ４ノックアウトマウスの内耳の蝸牛殻（cochlea）の細胞において発現が増加している遺伝子が関連する転写因子には、ｉＰＳ細胞作製の際に必要なリプログラミング因子の一つであるＳＯＸ２、ＭＹＣ、多能性関連遺伝子であるＰＯＵ２Ｆ１（ＯＣＴ１）などが含まれていることが示された。
【0122】
１４．化合物＃５で処理した野生型マウスの内耳の蝸牛殻（cochlea）の細胞において上昇制御された遺伝子経路などの確認
［方法］
Ｃ５７ＢＬ６マウス（６週齢）に、水に懸濁した化合物＃５を与えて、マウスの体重１ｋｇあたり５０ｍｇ／ｋｇ／日の化合物＃５を２週間経口投与した（［ＭＡ５添加群］、ｎ＝５）。
また、Ｃ５７ＢＬ６マウス（６週齢）に、水を２か月間経口投与した（［Vehicle群］、ｎ＝５）。
［方法］
Ｃ５７ＢＬ６マウス（６週齢）に、水に懸濁した化合物＃５を与えて、マウスの体重１ｋｇあたり５０ｍｇ／ｋｇ／日の化合物＃５を２週間経口投与した（［ＭＡ５添加群］、ｎ＝５）。
また、Ｃ５７ＢＬ６マウス（６週齢）に、水を２か月間経口投与した（［Vehicle群］、ｎ＝５）。
【0123】
上記の［ＭＡ５添加群］及び［Vehicle群］の野生型マウスの内耳の蝸牛殻の細胞について、ＲＮＡシーケンス（RNA-Seq）解析を行い、［Vehicle群］と比較して［ＭＡ５添加群］において発現量が変化した（増加又は減少した）遺伝子を特定した。その遺伝子名の結果を利用して、ChIP-Atlasとの統合解析を行い、それらの遺伝子が関連すると考えられる転写因子を調べた。その結果を表６に示す。
【0124】
［結果］
【0125】
【表6】
【0126】
表６から分かるように、［ＭＡ５添加群］の野生型マウスの内耳の蝸牛殻（cochlea）の細胞において発現が増加している遺伝子が関連する転写因子には、ヒストンをメチル化するポリコーム抑制複合体２（ＰＲＣ２）を構成する因子であるＳＵＺ１２、ＥＺＨ２などが含まれていることが示された。
【0127】
１７．化合物＃５で処理したマウス内耳細胞ＨＥＩ－ＯＣ１において上昇制御された遺伝子経路などの確認
［方法］
マウス内耳細胞ＨＥＩ－ＯＣ１を、化合物＃５を１０μＭ（０．１％ＤＭＳＯにて溶解）含む１０％ＦＢＳ入のＤＭＥＭ培地中で培養した（［ＭＡ５添加群］、ｎ＝５）。
また、マウス内耳細胞ＨＥＩ－ＯＣ１を、化合物＃５を０．１％ ＤＭＳＯ含む１０％ＦＢＳ入のＤＭＥＭ培地中で培養した（［Vehicle群］、ｎ＝５）。
［方法］
マウス内耳細胞ＨＥＩ－ＯＣ１を、化合物＃５を１０μＭ（０．１％ＤＭＳＯにて溶解）含む１０％ＦＢＳ入のＤＭＥＭ培地中で培養した（［ＭＡ５添加群］、ｎ＝５）。
また、マウス内耳細胞ＨＥＩ－ＯＣ１を、化合物＃５を０．１％ ＤＭＳＯ含む１０％ＦＢＳ入のＤＭＥＭ培地中で培養した（［Vehicle群］、ｎ＝５）。
【0128】
上記の［ＭＡ５添加群］及び［Vehicle群］のＨＥＩ－ＯＣ１細胞について、ＲＮＡシーケンス（RNA-Seq）解析を行い、［Vehicle群］と比較して［ＭＡ５添加群］において発現量が変化した（増加又は減少した）遺伝子を特定した。その遺伝子名の結果を利用して、ChIP-Atlasとの統合解析を行い、それらの遺伝子が関連すると考えられる転写因子を調べた。ChIP enrichment analysis（ＣｈＥＡ）による解析結果を表７に示し、ENCODEand ChEA consensus TFs from ChIP-Xによる解析結果を表８に示す。
【0129】
［結果］
【0130】
【表7】
【0131】
【表8】
【0132】
表７から分かるように、［ＭＡ５添加群］のＨＥＩ－ＯＣ１細胞において発現が増加している遺伝子が関連する転写因子には、ヒストンをメチル化するポリコーム抑制複合体２（ＰＲＣ２）を構成する因子であるＳＵＺ１２、ＥＺＨ２、ｉＰＳ細胞作製の際に必要なリプログラミング因子の一つであるＳＯＸ２などが含まれていることが示された。また、表８から分かるように、長寿関連遺伝子であるＰＰＡＲＧ（ペルオキシソーム増殖剤活性化レセプターγ）、ｉＰＳ細胞作製の際に必要なリプログラミング因子の一つであるＭＹＣ、ヒストンメチル化に関連するＴＲＩＭ２８（トリパータイトモチーフ含有タンパク質２８）などが含まれていることが示された。
【0133】
１８．化合物＃５が、若齢マウス及び老齢マウスの肝臓細胞においてＤＮＡメチル化抑制効果を有することの確認
［方法］
Ｃ５７ＢＬ６マウス（１２週齢）に、水に懸濁した化合物＃５を与えて、マウスの体重１ｋｇあたり５０ｍｇ／ｋｇ／日の化合物＃５を、２か月間経口投与した（［ＭＡ５高用量添加群］、ｎ＝５）。かかる若齢マウスの肝臓細胞のゲノムＤＮＡのメチル化の程度を、バイサルファイト法により測定した。その結果を表９に示す。
［方法］
Ｃ５７ＢＬ６マウス（１２週齢）に、水に懸濁した化合物＃５を与えて、マウスの体重１ｋｇあたり５０ｍｇ／ｋｇ／日の化合物＃５を、２か月間経口投与した（［ＭＡ５高用量添加群］、ｎ＝５）。かかる若齢マウスの肝臓細胞のゲノムＤＮＡのメチル化の程度を、バイサルファイト法により測定した。その結果を表９に示す。
【0134】
また、Ｃ５７ＢＬ６マウス（９２週齢）に、水に懸濁した化合物＃５を与えて、マウスの体重１ｋｇあたり５０ｍｇ／ｋｇ／日の化合物＃５を、２か月間経口投与した（［ＭＡ５添加群］、ｎ＝５）。かかる老齢マウスの肝臓細胞のゲノムＤＮＡのメチル化の程度を、バイサルファイト法により測定した。その結果を表１０に示す。なお、表９及び表１０において、「Count」は、pathwayに関連する遺伝子中、どれだけの遺伝子が関連していたかを表す。例えば、２０個の遺伝子が関わるpathwayの中で、化合物＃５の投与により発現量が変動していた遺伝子が３個あった場合は、Countは３となり、その「％」は(3/20)×100で算出される数値となる。「p-value」は、pathwayの群間比較のｐ値を表し、「Benjamini」は、Benjamini and Hochberg (1995)の線形ステップアップ法を用いて算出したp値を表す（算出法は例えばhttps://david.ncifcrf.gov/helps/functional_annotation.htmlを参照）。
【0135】
【表9】
【0136】
【表10】
【0137】
表９から、［ＭＡ５添加群］の若齢マウスでは、老化に関連するパスウェイであるWnt signaling pathway、Signaling pathwaysregulating pluripotency of stem cells、Insulin secretionのメチル化が抑制されていることが示された。また、表１０から、［ＭＡ５添加群］の老齢マウスでは、老化に関連するパスウェイであるInsulin resistance、Insulin signaling pathwayのメチル化が抑制されていることが示された。これらの結果から、化合物＃５は、老化に関連するパスウェイのＤＮＡのメチル化を抑制する効果を有することが示された。
【0138】
１９．α-Klothoノックアウトマウスへの化合物＃５投与による生存率改善効果の確認
［方法］
早期老化動物モデルであるα-Klotho遺伝子欠損マウス（２８日齢）に、水に懸濁した化合物＃５を１０ｍｇ／体重ｋｇ／日で経口投与し、死亡するまで経過を観察し、カプラン・マイヤー法に基づく生存曲線より生存率を評価した（KlothoホモKOマウス投与群、ｎ＝９）。
また、α-Klotho遺伝子欠損マウス（２８日齢）に、水を死亡するまでの間経口投与した（KlothoホモKOマウス未投与群、ｎ＝９）。
［方法］
早期老化動物モデルであるα-Klotho遺伝子欠損マウス（２８日齢）に、水に懸濁した化合物＃５を１０ｍｇ／体重ｋｇ／日で経口投与し、死亡するまで経過を観察し、カプラン・マイヤー法に基づく生存曲線より生存率を評価した（KlothoホモKOマウス投与群、ｎ＝９）。
また、α-Klotho遺伝子欠損マウス（２８日齢）に、水を死亡するまでの間経口投与した（KlothoホモKOマウス未投与群、ｎ＝９）。
【0139】
［結果］
図２２から分かるように、早期老化動物モデルであるα-Klotho遺伝子欠損マウスに若齢期（２８日齢）から化合物＃５を投与すると、生存率が有意に上昇すること（ｐ＝０．００５６）が示された。
図２２から分かるように、早期老化動物モデルであるα-Klotho遺伝子欠損マウスに若齢期（２８日齢）から化合物＃５を投与すると、生存率が有意に上昇すること（ｐ＝０．００５６）が示された。
【0140】
２０．α-Klothoノックアウトマウスにおける腎線維化に対する化合物＃５投与の影響
［方法］
α-Klotho遺伝子欠損マウス（２８日齢）に、水に懸濁した化合物＃５を１０ｍｇ／体重ｋｇ／日で６０日齢まで経口投与した（KlothoホモKOマウス投与群、ｎ＝３）。
また、野生型マウス（２８日齢）及びα-Klotho遺伝子欠損マウス（２８日齢）に、それぞれ水を６０日齢まで経口投与した（それぞれ、野生型未投与群及びKlothoホモKOマウス未投与群、共にｎ＝３）。
６０日齢のそれぞれのマウスから定法に従って腎臓組織を採取し、市販のカラム抽出キット（RNeasy Micro Kit、キアゲン社製）を用いて総ＲＮＡを抽出し、１μｇの総ＲＮＡから、ReverTraAce（TOYOBO社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。その後、２種類の線維化関連遺伝子（αＳＭＡ及びＣｏｌ１ａ１）由来のｍＲＮＡと、内部標準であるＧＡＰＤＨ遺伝子由来のｍＲＮＡを定量するために、測定機器としてQuantStudio 5 Real-time PCR system（AppliedBiosystems社製）を用い、反応液として、THUNDERBIRD SYBR qPCR MasterMix（TOYOBO社製）を用いたリアルタイムＰＣＲを、定法に従って行った。
［方法］
α-Klotho遺伝子欠損マウス（２８日齢）に、水に懸濁した化合物＃５を１０ｍｇ／体重ｋｇ／日で６０日齢まで経口投与した（KlothoホモKOマウス投与群、ｎ＝３）。
また、野生型マウス（２８日齢）及びα-Klotho遺伝子欠損マウス（２８日齢）に、それぞれ水を６０日齢まで経口投与した（それぞれ、野生型未投与群及びKlothoホモKOマウス未投与群、共にｎ＝３）。
６０日齢のそれぞれのマウスから定法に従って腎臓組織を採取し、市販のカラム抽出キット（RNeasy Micro Kit、キアゲン社製）を用いて総ＲＮＡを抽出し、１μｇの総ＲＮＡから、ReverTraAce（TOYOBO社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。その後、２種類の線維化関連遺伝子（αＳＭＡ及びＣｏｌ１ａ１）由来のｍＲＮＡと、内部標準であるＧＡＰＤＨ遺伝子由来のｍＲＮＡを定量するために、測定機器としてQuantStudio 5 Real-time PCR system（AppliedBiosystems社製）を用い、反応液として、THUNDERBIRD SYBR qPCR MasterMix（TOYOBO社製）を用いたリアルタイムＰＣＲを、定法に従って行った。
【0141】
［結果］
図２３から分かるように、早期老化動物モデルであるα-Klotho遺伝子欠損マウスに化合物＃５を投与すると、加齢に伴い進行する腎線維化が抑制されることが示された。
図２３から分かるように、早期老化動物モデルであるα-Klotho遺伝子欠損マウスに化合物＃５を投与すると、加齢に伴い進行する腎線維化が抑制されることが示された。
【0142】
２１．α-Klothoノックアウトマウスへの化合物＃５投与による血液中代謝物に及ぼす影響
［方法］
α-Klotho遺伝子欠損マウス（２８日齢）に、水に懸濁した化合物＃５を１０ｍｇ／体重ｋｇ／日で６０日齢まで経口投与した（KlothoホモKOマウス投与群、ｎ＝２）。
また、野生型マウス（２８日齢）及びα-Klotho遺伝子欠損マウス（２８日齢）に、それぞれ水を６０日齢まで経口投与した（それぞれ、野生型未投与群及びKlothoホモKOマウス未投与群、ともにｎ＝２）。
６０日齢のそれぞれのマウスから血漿を調製し、化合物＃５投与が血漿中代謝物に及ぼす影響を、ＣＥ－ＴＯＦＭＳによるターゲット解析（網羅的解析）を行った（ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ社製）。
［方法］
α-Klotho遺伝子欠損マウス（２８日齢）に、水に懸濁した化合物＃５を１０ｍｇ／体重ｋｇ／日で６０日齢まで経口投与した（KlothoホモKOマウス投与群、ｎ＝２）。
また、野生型マウス（２８日齢）及びα-Klotho遺伝子欠損マウス（２８日齢）に、それぞれ水を６０日齢まで経口投与した（それぞれ、野生型未投与群及びKlothoホモKOマウス未投与群、ともにｎ＝２）。
６０日齢のそれぞれのマウスから血漿を調製し、化合物＃５投与が血漿中代謝物に及ぼす影響を、ＣＥ－ＴＯＦＭＳによるターゲット解析（網羅的解析）を行った（ヒューマン・メタボローム・テクノロジーズ社製）。
【0143】
［結果］
図２４から分かるように、化合物＃５をα-Klotho遺伝子欠損マウスに投与することにより増加する血漿中代謝物として、長寿分子として知られるスペルミジンが同定された。
図２４から分かるように、化合物＃５をα-Klotho遺伝子欠損マウスに投与することにより増加する血漿中代謝物として、長寿分子として知られるスペルミジンが同定された。
【産業上の利用可能性】
【0144】
本発明によると、抗老化用又は細胞若返り用の剤や、老化に関連する症状若しくは疾患の予防又は改善剤を提供することができる。さらに、本発明は、比較的簡便かつ高収率で製造できる低分子化合物を、抗老化又は細胞若返りの有効成分とするため、比較的簡便かつ安価に製造することができる。
【図1-1】
【図1-2】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
