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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024093429
(43)【公開日】2024-07-09
(54)【発明の名称】核酸のライブラリー調製方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20240702BHJP
C12Q 1/6806 20180101ALI20240702BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20240702BHJP
C40B 40/06 20060101ALN20240702BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z
C12Q1/6806
C12Q1/686 Z
C40B40/06
【審査請求】未請求
【請求項の数】5
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022209803
(22)【出願日】2022-12-27
(71)【出願人】
【識別番号】000000918
【氏名又は名称】花王株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】上田 優衣
(72)【発明者】
【氏名】桑野 哲矢
(72)【発明者】
【氏名】上原 裕也
(72)【発明者】
【氏名】長森 夏海
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR62
4B063QS25
4B063QX02
(57)【要約】
【課題】核酸のライブラリーを調製する方法の提供。
【解決手段】ライブラリー調製方法であって、同一サンプルＲＮＡから逆転写及びＰＣＲにより得られるＰＣＲ産物を複数準備すること、及び該複数のＰＣＲ産物を混合してＰＣＲ産物のプールを調製すること、を含む、方法。
【選択図】なし
【解決手段】ライブラリー調製方法であって、同一サンプルＲＮＡから逆転写及びＰＣＲにより得られるＰＣＲ産物を複数準備すること、及び該複数のＰＣＲ産物を混合してＰＣＲ産物のプールを調製すること、を含む、方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ライブラリー調製方法であって、
同一サンプルＲＮＡから逆転写及びＰＣＲにより得られるＰＣＲ産物を複数準備すること、及び
該複数のＰＣＲ産物を混合してＰＣＲ産物のプールを調製すること、
を含む、方法。
同一サンプルＲＮＡから逆転写及びＰＣＲにより得られるＰＣＲ産物を複数準備すること、及び
該複数のＰＣＲ産物を混合してＰＣＲ産物のプールを調製すること、
を含む、方法。
【請求項2】
前記サンプルＲＮＡの濃度が、前記逆転写に供するＲＮＡ濃度として、１００ｐｇ／μＬ以下である、請求項１記載の方法。
【請求項3】
前記サンプルＲＮＡが、分解が進行したＲＮＡである、請求項１記載の方法。
【請求項4】
前記ＰＣＲがマルチプレックスＰＣＲである、請求項１記載の方法。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか１項記載の方法により調製されたライブラリーにおける遺伝子発現を検出することを含む、前記サンプルＲＮＡが由来する試料の遺伝子発現を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、核酸のライブラリー調製方法に関する。
【背景技術】
【0002】
マルチプレックスＰＣＲは、複数のプライマー対を同時に使用したＰＣＲ反応により、１つのＤＮＡサンプルから複数の領域を同時に増幅する方法である。ＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写（ＲＴ）反応をマルチプレックスＰＣＲと組み合わせたマルチプレックスＲＴ－ＰＣＲは、遺伝子発現解析やジェノタイピングなどのためのライブラリー調製に利用されている。遺伝子発現解析においては、試料中の特定のＲＮＡの濃度及び／又は相対的もしくは絶対的な量が決定され、特定のＲＮＡが定量化（定量）される。この場合には、精度が高く、再現性がある方法が望まれる。
【0003】
しかしながら、微量なＲＮＡを用いた核酸増幅反応では、プライマーダイマーの形成や非特異的な増幅が生じ、ＰＣＲ反応効率に偏りが生じやすい（ＰＣＲバイアス）。特に、複数の領域を同時に増幅するマルチプレックスＰＣＲにおいて、感度や特異度、増幅の優先性にも影響を及ぼす為、上述するＰＣＲバイアスが原因となり、シーケンス解析をはじめとする種々のダウンストリーム解析の精度、及び再現性が低減する場合がある（非特許文献１－３）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】BioMed Research International, Volume 2021, Article ID 6647597, 11 pages (2021)
【非特許文献2】Journal of Clinical Laboratory Analysis 16:47-51 (2002)
【非特許文献3】The Journal of Molecular Diagnostics, vol. 7, no. 1, pp. 36-39 (2005)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
本発明は、核酸のライブラリー調製方法を提供することに関する。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明者らは、ＰＣＲを利用する核酸のライブラリー調製において、同一ＲＮＡサンプルに対して、ＲＴ－ＰＣＲ反応を複数準備し、得られた複数のＰＣＲ産物をプールすることで、ＰＣＲバイアスを抑制できることを見出した。
【0007】
すなわち、本発明は、以下の１）及び２）に係るものである。
１）ライブラリー調製方法であって、
同一サンプルＲＮＡから逆転写及びＰＣＲにより得られるＰＣＲ産物を複数準備すること、及び
該複数のＰＣＲ産物を混合してＰＣＲ産物のプールを調製すること、
を含む、方法。
２）１）の方法により調製されたライブラリーにおける遺伝子発現を検出することを含む、前記サンプルＲＮＡが由来する試料の遺伝子発現を検出する方法。
１）ライブラリー調製方法であって、
同一サンプルＲＮＡから逆転写及びＰＣＲにより得られるＰＣＲ産物を複数準備すること、及び
該複数のＰＣＲ産物を混合してＰＣＲ産物のプールを調製すること、
を含む、方法。
２）１）の方法により調製されたライブラリーにおける遺伝子発現を検出することを含む、前記サンプルＲＮＡが由来する試料の遺伝子発現を検出する方法。
【発明の効果】
【0008】
本発明によれば、ＰＣＲを利用する核酸のライブラリー調製時のＰＣＲバイアスを抑制することができる。本発明は、微量及び／又は分解が進行したＲＮＡサンプルを用いた各種解析（例えば、遺伝子解析、診断など）の感度と精度の向上に貢献する。
【図面の簡単な説明】
【0009】
【図1】２０８０２遺伝子を対象としたＬｏｇ２（ＲＰＭ＋１）値の散布図。上段に実施例１の方法により取得した結果を、下段に実施例２の方法により取得した結果を示す。左：横軸にｑ＝２のライブラリーに基くＬｏｇ２（ＲＰＭ＋１）値、縦軸にプールした個々のテクニカルレプリケート由来のライブラリー（ｑ＝１）に基くＬｏｇ２（ＲＰＭ＋１）値の平均値をプロットした散布図。両データを比較し、２倍以上の発現差を認める遺伝子を黒色で表す（｜ＦＣ｜≧２）。中央：横軸にプールした一方のテクニカルレプリケート由来のライブラリー（ｑ＝１）に基くＬｏｇ２（ＲＰＭ＋１）値、縦軸にもう一方のテクニカルレプリケート由来のライブラリー（ｑ＝１）に基くデータをプロットした散布図。右：横軸にｑ＝２のライブラリーに基くＬｏｇ２（ＲＰＭ＋１）値、縦軸に初発ＲＮＡ量が１０倍高いライブラリーに基くＬｏｇ２（ＲＰＭ＋１）値をプロットした散布図
【図2】ＲＮＡのＲＮａｓｅ７処理濃度とＤＶ２００値の関係を示す図。
【発明を実施するための形態】
【0010】
本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
【0011】
本発明は、ＲＮＡからのライブラリー調製方法を提供する。本発明の方法は、同一サンプルＲＮＡから逆転写及びＰＣＲにより得られるＰＣＲ産物を複数準備すること、及び、該複数のＰＣＲ産物を混合してＰＣＲ産物のプールを調製すること、を含む。
【0012】
本発明の方法で用いられるサンプルＲＮＡは、いかなる種類のＲＮＡであってもよく、例えば、動物、植物、微生物、ウイルスなどに由来するＲＮＡが挙げられる。該サンプルＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｍａｌｌ ＲＮＡ（例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、Ｐｉｗｉ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）など）、ｌｏｎｇ ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ（ｌｉｎｃ）ＲＮＡ、などを含み得る。上記に挙げたＲＮＡの１種又は２種以上が該サンプルＲＮＡに含まれ得る。好ましくは、サンプルＲＮＡはｔｏｔａｌＲＮＡ又はｍＲＮＡである。
【0013】
該サンプルＲＮＡは、動物、植物、微生物、ウイルス、又はこれらを含む可能性のある食品、土壌、糞便などの試料から通常の手段で抽出することができる。例えば、該ＲＮＡの抽出には、フェノール／クロロホルム法、ＡＧＰＣ（ａｃｉｄ ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ－ｐｈｅｎｏｌ－ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ）法、又はそれらの変法、シリカをコーティングした特殊な磁性体粒子を用いる方法、Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ磁性体粒子を用いる方法、あるいは市販のＲＮＡ精製用試薬（例えばＴＲＩｚｏｌ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）、ＱＩＡｚｏｌ（登録商標）、ＩＳＯＧＥＮなど）、などを用いることができる。
【0014】
本発明の方法に用いられるサンプルＲＮＡは、体内で、又は細胞や組織サンプルの調製及び保存過程で、分解を受けていないＲＮＡであってもよく、ある程度分解が進行したＲＮＡであってもよく、これらの混合物であってもよい。本発明の方法に用いられる分解を受けていないＲＮＡと分解が進行したＲＮＡとは、Ａｇｉｌｅｎｔ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ システム（アジレント・テクノロジー株式会社）を用いて算出したＲＮＡ全体に対する２００ｎｔ以上のＲＮＡ断片の比率（ＤＶ２００）を用いて定義することができる。例えば、「分解を受けていないＲＮＡ」は、ＤＶ２００が３０％より大きい、５０％より大きい、８０％より大きい、９０％より大きい又は９５％より大きいなどと定義することができる。反対に「分解が進行したＲＮＡ」は、ＤＶ２００が９５％以下、９０％以下、８０％以下、５０％以下又は３０％以下などと定義することができる。本発明では、「分解を受けていないＲＮＡ」をＤＶ２００が９０％より大きい、「分解が進行したＲＮＡ」をＤＶ２００が９０％以下と定義するのが好ましい。
本発明の方法は、分解を受けていないＲＮＡに対してだけでなく、分解が進行したＲＮＡに対しても好適に適用することができる。より具体的にはＤＶ２００が９０％以下の分解が進行したＲＮＡに対して好適に適用することができ、好ましくはＤＶ２００が６０％以下のＲＮＡ、より好ましくはＤＶ２００が４０％以下のＲＮＡに好適に適用することができる。ＤＶ２００の下限は特に限定されないが、例えば、５％以上、１０％以上、２０％以上又は３０％以上が挙げられる。
本発明の方法は、分解を受けていないＲＮＡに対してだけでなく、分解が進行したＲＮＡに対しても好適に適用することができる。より具体的にはＤＶ２００が９０％以下の分解が進行したＲＮＡに対して好適に適用することができ、好ましくはＤＶ２００が６０％以下のＲＮＡ、より好ましくはＤＶ２００が４０％以下のＲＮＡに好適に適用することができる。ＤＶ２００の下限は特に限定されないが、例えば、５％以上、１０％以上、２０％以上又は３０％以上が挙げられる。
【0015】
サンプルＲＮＡの濃度は、逆転写やＰＣＲの条件に従って適宜決定することができる。例えば、サンプルＲＮＡの濃度は、逆転写に供するＲＮＡ濃度として、好ましくは０．１ｐｇ／μＬ以上、より好ましくは０．５ｐｇ／μＬ以上、さらに好ましくは１ｐｇ／μＬ以上である。逆転写に供する初発ＲＮＡ量としては、好ましくは１．５ｐｇ以上、さらに好ましくは１５ｐｇ以上である。ライブラリー調製に汎用されるＩｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）の標準プロトコルでは、サンプルの初発ＲＮＡ量の推奨下限値が１００ｐｇであるが、本発明の方法では、サンプルの初発ＲＮＡ量が１００ｐｇ以下あるいは１００ｐｇ未満であっても良好なライブラリー調製が可能である。よって、本発明の方法に用いられるサンプルＲＮＡの濃度の範囲としては、例えば、逆転写に供するＲＮＡ濃度として、０．１～１００ｐｇ／μＬ、０．５～１００ｐｇ／μＬ、１～１００ｐｇ／μＬ、１～７５ｐｇ／μＬ、１～６０ｐｇ／μＬ、０．１ｐｇ／μＬ以上１００ｐｇ／μＬ未満、０．５ｐｇ／μＬ以上１００ｐｇ／μＬ未満、１ｐｇ／μＬ以上１００ｐｇ／μＬ未満、１ｐｇ／μＬ以上７５ｐｇ／μＬ未満、１ｐｇ以上６０ｐｇ／μＬ未満が挙げられる。
【0016】
本発明の核酸のライブラリー調製方法は、微量及び／又は分解が進行したＲＮＡサンプルから核酸ライブラリーを調製し、遺伝子解析や診断などの各種解析を行う際に好適に用いることができる。微量なＲＮＡサンプルに該当する好適な例として、皮膚表上脂質由来ＲＮＡを挙げることができる。本明細書において、「皮膚表上脂質（ｓｋｉｎ ｓｕｒｆａｃｅ ｌｉｐｉｄｓ；ＳＳＬ）」とは、皮膚の表上に存在する脂溶性画分をいい、皮脂と呼ばれることもある。一般に、ＳＳＬは、皮膚にある皮脂腺などの外分泌腺から分泌された分泌物を主に含み、皮膚表面を覆う薄い層の形で皮膚表上に存在している。ＳＳＬには、被験体の皮膚細胞に由来するＲＮＡが含まれており、これを用いて生体の解析が可能である（国際公開公報第２０１８／００８３１９号）。
【0017】
該ＳＳＬ由来ＲＮＡが採取される被験体は、皮膚上にＳＳＬを有する生物であればよい。被験体の例としては、ヒト及び非ヒト哺乳動物を含む哺乳動物が挙げられ、好ましくはヒトである。例えば、該被験体は、自身の核酸の解析を必要とするか又は希望するヒト又は非ヒト哺乳動物であり得る。あるいは、該被験体は、皮膚における遺伝子発現解析、又は核酸を用いた皮膚もしくは皮膚以外の部位の状態の解析を必要とするか又は希望するヒト又は非ヒト哺乳動物であり得る。
【0018】
ＳＳＬからのＲＮＡの抽出には、上述した通常のＲＮＡ抽出手段、例えばフェノール／クロロホルム法、ＡＧＰＣ法、及び市販のＲＮＡ精製用の試薬、カラムもしくは磁性粒子を用いることができる。
【0019】
本発明において、サンプルＲＮＡの逆転写（ＲＴ）は、通常の手順で行うことができる。例えば、該サンプルＲＮＡ、プライマー、逆転写酵素、及び基質を含有する反応液をインキュベートして、該サンプルＲＮＡに逆転写酵素を作用させてｃＤＮＡを合成すればよい。該プライマーとしては、解析したい特定のＲＮＡを標的としたプライマーを用いてもよいが、より包括的な核酸の保存及び解析のためにはオリゴｄＴプライマー、ランダムプライマー、又はそれらの混合物を用いることが好ましい。該逆転写酵素としては、一般的な逆転写酵素を使用することができるが、逆転写の正確性及び効率性の高い逆転写酵素（例えばＭ－ＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ及びその改変体、あるいは後述する市販の逆転写反応用酵素）を使用することが好ましい。該基質は、該逆転写酵素の基質であり、好ましくはデオキシリボヌクレオチド、例えばｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、ならびにそれらの混合物を使用することができる。該デオキシリボヌクレオチドは修飾されていてもよい。本発明において、ＲＴのための酵素及びその他の試薬としては、市販の逆転写反応用酵素及び逆転写試薬キット、例えばＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅシリーズ（タカラバイオ社）、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅシリーズ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）などが挙げられ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）III Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（いずれもライフテクノロジーズジャパン株式会社）を好ましく用いることができる。ＲＴ反応の温度及び時間は、用いる酵素又は試薬の種類、サンプルＲＮＡ、合成すべきｃＤＮＡなどに応じて適宜設定することができる。例えば、市販の逆転写反応用試薬を用いて、そのマニュアルに従って、反応液を調製し、反応条件を設定すればよい。
【0020】
該ＲＴで合成されたｃＤＮＡのＰＣＲは、通常の手順で行うことができる。例えば、ｃＤＮＡ、プライマーペア、ＤＮＡ合成酵素、及び基質を含有する反応液をＰＣＲにかければよい。該プライマーペアは、標的ＤＮＡ配列に応じて適宜設計され得る。該ＤＮＡ合成酵素としては、一般的なＤＮＡ合成酵素を使用することができるが、増幅の正確性及び効率性の高いＤＮＡ合成酵素（例えば後述する市販のＰＣＲ用酵素）を使用することが好ましい。該基質は、該ＤＮＡ合成酵素の基質であり、好ましくはデオキシリボヌクレオチド、例えばｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、ならびにそれらの混合物を使用することができる。該デオキシリボヌクレオチドは修飾されていてもよい。本発明において、ＰＣＲのための酵素及びその他の試薬は、市販のＰＣＲ酵素及び試薬、例えば、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（ＴＯＹＯＢＯ）、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標） ＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社）、ＰｆｕＵｌｔｒａ（登録商標） ＤＮＡポリメラーゼ（アジレント・テクノロジー株式会社）、Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標） ＳｕｐｅｒＦｉ II ＤＮＡポリメラーゼ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）などを用いることができる。ＰＣＲ反応の温度及び時間は、用いる酵素又は試薬の種類、鋳型ｃＤＮＡなどに応じて適宜設定することができる。例えば、市販のＰＣＲ用試薬を用いて、そのマニュアルに従って、反応液を調製し、反応条件を設定すればよい。
【0021】
該ＰＣＲは、より包括的な核酸の解析のためには複数のプライマーペアを用いて１つのサンプルから複数の領域を同時に増幅するマルチプレックスＰＣＲ（ＭＰＣＲ）とすることが好ましい。ＭＰＣＲは、通常の手順で行うことができる。例えば、ｃＤＮＡ、複数のプライマーペア、ＤＮＡ合成酵素、及び基質を含有する反応液をＰＣＲにかければよい。該プライマーペアは、標的ＤＮＡ配列に応じて適宜設計され得る。該ＤＮＡ合成酵素としては、一般的なＤＮＡ合成酵素を使用することができるが、増幅の正確性及び効率性の高いＤＮＡ合成酵素（例えば後述する市販のマルチプレックスＰＣＲ用酵素）を使用することが好ましい。該基質は、該ＤＮＡ合成酵素の基質であり、好ましくはデオキシリボヌクレオチド、例えばｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰ、ならびにそれらの混合物を使用することができる。該デオキシリボヌクレオチドは修飾されていてもよい。本発明において、ＭＰＣＲのための酵素及びその他の試薬としては、市販のマルチプレックスＰＣＲ用酵素及び試薬、例えば、Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いることができる。ＭＰＣＲ反応の温度及び時間は、用いる酵素又は試薬の種類、鋳型ｃＤＮＡなどに応じて適宜設定することができる。例えば、市販のＭＰＣＲ用試薬を用いて、そのマニュアルに従って、反応液を調製し、反応条件を設定すればよい。
【0022】
本発明の方法において、該ＲＴとＰＣＲは、別々の反応系（２ステップ）で行われることが好ましいが、簡便さの点では１反応系（１ステップ）で行われてもよい。
【0023】
本発明の方法では、同一のサンプルＲＮＡから上記のＲＴとＰＣＲの手順により得られるＰＣＲ産物を複数準備する。この同一のサンプルＲＮＡに由来する複数のＰＣＲ産物はテクニカルレプリケートと称され、準備される複数のテクニカルレプリケートの個数をｑ値で示す。ここで、複数とは、サンプルＲＮＡ量に応じて適宜設定することができ、２個以上であればよく、調製されるライブラリーの感度と精度の点から４個以上が好ましく、他方、操作性とコストの点から１０個以下が好ましく、８個以下がより好ましい。また、複数の範囲としては、２～１０個、２～８個、４～１０個、４～８個が挙げられる。
【0024】
各ＰＣＲ産物は、好ましくは精製される。該産物の精製は、反応産物のサイズ分離によって行われることが好ましい。サイズ分離により、目的のＰＣＲ産物を、ＰＣＲ反応液中に含まれるプライマーやその他の不純物から分離することができる。ＤＮＡのサイズ分離は、例えば、サイズ分離カラムや、サイズ分離チップ、サイズ分離に利用可能な磁気ビーズなどによって行うことができる。サイズ分離に利用可能な磁気ビーズの好ましい例としては、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰなどのＳｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ（ＳＰＲＩ）磁性ビーズが挙げられる。Ａｍｐｕｒｅ ＸＰとＤＮＡ溶液を混合すると、ＤＮＡは磁性ビーズの表面にコーティングされたカルボキシル基に吸着され、マグネットを用いて磁性ビーズのみを回収することでＤＮＡが精製される。またＡｍｐｕｒｅ ＸＰ溶液とＤＮＡ溶液の混合比を変化させると磁性ビーズに吸着するＤＮＡの分子サイズが変化する。この原理を利用することで、捕捉したい特定の分子サイズのＤＮＡを磁性ビーズ上に回収し、それ以外の分子サイズのＤＮＡや不純物を精製することが可能である。
【0025】
続いて、本発明の方法では、該複数のＰＣＲ産物（テクニカルレプリケート）を混合してＰＣＲ産物のプールを調製する。該複数のＰＣＲ産物としては、好ましくは精製後のＰＣＲ産物が用いられる。複数のテクニカルレプリケートを混合する際の混合比は特に限定されないが、好ましくは等量混合である。ここで、等量混合とは、各ＰＣＲ産物の溶液量が等量となるように混合することを指す。各ＰＣＲ産物は、同一のサンプルＲＮＡから同様に準備されるため、各ＰＣＲ産物の溶液量が等量とは、ＰＣＲ産物量が等量であることと同義である。混合量は、その後の解析に応じて適宜設定することができる。例えば、その後の解析に必要な溶液量をＰＣＲ産物の数で除し、算出された溶液量の各ＰＣＲ産物を混合してＰＣＲ産物のプールを調製し、プールの全量をその後の解析に供してもよいし、各ＰＣＲ産物を予め等量ずつ混合してＰＣＲ産物のプールを調製し、プールから必要量を分取してその後の解析に供してもよい。
【0026】
斯くして調製されたＰＣＲ産物のプールは、そのまま核酸のライブラリーとして用いることができる。あるいは、ＰＣＲ産物のプールに対して、その後の解析を行うために必要なさらなる処理を施してもよい。例えば、ＤＮＡのシーケンシングやフラグメント解析のために、ＰＣＲ産物のプールを、適切なバッファー溶液へと調製したり、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡに含まれるＰＣＲプライマー領域を切断したり、増幅されたＤＮＡにアダプター配列をさらに付加したりしてもよい。例えば、ＰＣＲ産物のプールをバッファー溶液へと調製し、増幅ＤＮＡに対してＰＣＲプライマー配列の除去及びアダプターライゲーションを行い、得られた反応産物を、必要に応じて増幅して、各種解析のためのライブラリーを調製することができる。これらの操作は、例えば、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）に付属している５×ＶＩＬＯ ＲＴ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ、及びＩｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）に付属している５×Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ ＨｉＦｉ Ｍｉｘ、及びＩｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｏｒｅ Ｐａｎｅｌを用いて、各キット付属のプロトコルに従って行うことができる。
【0027】
本発明の方法で調製されたライブラリーは、後記実施例に示すとおり、サンプルＲＮＡが微量及び／又は分解が進行したＲＮＡであっても、常法に従ってＰＣＲ産物をプールせずに調製したライブラリーと比較して、ＰＣＲバイアスが抑制されている。ここで、ＰＣＲバイアスとは、プライマーダイマーをはじめとする副産物やサンプル内の夾雑物等の影響により、ＰＣＲの反応効率に偏りが生じることを指す。よって、本発明の方法でライブラリーを調製すれば、サンプルＲＮＡが微量及び／又は分解が進行したＲＮＡであっても、遺伝子検出率の向上、群間差の明確化などのその後の解析における検定力の向上が可能となる。
【0028】
本発明の方法で調製されたライブラリーは、ＲＮＡを用いる各種の解析又は診断に応用することができる。好ましくは、本発明の方法で調製されたライブラリーは、ＰＣＲ、好ましくはマルチプレックスＰＣＲを応用することができるあらゆる解析、例えば、遺伝子発現解析、トランスクリプトーム解析、被験体の機能解析、疾患の診断、被験体に投与した薬物の効能評価などの、遺伝子の網羅的解析又は特定の遺伝子を標的とした発現解析に用いることができる。したがって、本発明はまた、上記の本発明によるライブラリーの調製方法により調製された核酸のライブラリーを、各種解析に用いることに関する。一実施形態において、本発明は、上記の本発明によるライブラリーの調製方法により調製された核酸のライブラリーにおける遺伝子発現を検出することを含む、サンプルＲＮＡが由来する試料の遺伝子発現を検出する方法を提供する。
【0029】
本発明による遺伝子発現を検出する方法は、本発明によるライブラリーの調製方法により調製された核酸のライブラリーを用いる限り、遺伝子発現検出の手順や手法は特に限定されない。斯かる手法としては、リアルタイムＰＣＲ、ＤＮＡチップ、ＤＮＡマイクロアレイ、ＲＮＡ－Ｓｅｑなどが挙げられ、好ましくはＲＮＡ－Ｓｅｑである。例えば、ＲＮＡ－Ｓｅｑによる遺伝子発現検出を行う場合、アダプターライゲーションしたライブラリーをシーケンシングにかけることができる。シーケンシングで得られた各遺伝子由来配列のリード数に基いて遺伝子発現を検出又は定量することができる。
【0030】
本発明の例示的実施形態として、以下の物質、製造方法、用途、方法などをさらに本明細書に開示する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
【0031】
〔１〕ライブラリー調製方法であって、
同一サンプルＲＮＡから逆転写及びＰＣＲにより得られるＰＣＲ産物を複数準備すること、及び
該複数のＰＣＲ産物を混合してＰＣＲ産物のプールを調製すること、
を含む、方法。
〔２〕前記サンプルＲＮＡの濃度が、前記逆転写に供するＲＮＡ濃度として、好ましくは０．１ｐｇ／μＬ以上、より好ましくは０．５ｐｇ／μＬ以上、さらに好ましくは１ｐｇ／μＬ以上であり、他方、好ましくは１００ｐｇ／μＬ以下、より好ましくは１００ｐｇ／μＬ未満であるか、あるいは、０．１～１００ｐｇ／μＬ、０．５～１００ｐｇ／μＬ、１～１００ｐｇ／μＬ、１～７５ｐｇ／μＬ、又は１～６０ｐｇ／μＬ、０．１ｐｇ／μＬ以上１００ｐｇ／μＬ未満、０．５ｐｇ／μＬ以上１００ｐｇ／μＬ未満、１ｐｇ／μＬ以上１００ｐｇ／μＬ未満、１ｐｇ／μＬ以上７５ｐｇ／μＬ未満、又は１ｐｇ以上６０ｐｇ／μＬ未満である、〔１〕記載の方法。
〔３〕好ましくは、前記サンプルＲＮＡが、分解を受けていないＲＮＡ、分解が進行したＲＮＡ、又はそれらの混合物である、〔１〕又は〔２〕記載の方法。
〔４〕前記分解を受けていないＲＮＡのＤＶ２００が９０％より大きく、前記分解が進行したＲＮＡのＤＶ２００が９０％以下である、〔３〕記載の方法。
〔５〕好ましくは、前記サンプルＲＮＡが、分解が進行したＲＮＡである、〔３〕記載の方法。
〔６〕前記サンプルＲＮＡのＤＶ２００が、９０％以下、好ましくは６０％以下、より好ましくは４０％以下である、〔５〕記載の方法。
〔７〕前記サンプルＲＮＡのＤＶ２００が、５％以上、１０％以上、２０％以上又は３０％以上である、〔５〕記載の方法。
〔８〕好ましくは、前記ＰＣＲがマルチプレックスＰＣＲである、〔１〕～〔７〕のいずれか１項記載の方法。
〔９〕前記逆転写が、好ましくは、オリゴｄＴプライマー、ランダムプライマー、又はそれらの混合物を含む反応液中で行われ、より好ましくは、ランダムプライマーを含む反応液中で行われる、〔１〕～〔８〕のいずれか１項記載の方法。
〔１０〕好ましくは、前記複数のＰＣＲ産物を混合前にそれぞれ精製することをさらに含む、〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載の方法。
〔１１〕前記複数のＰＣＲ産物の混合が等量混合である、〔１〕～〔１０〕のいずれか１項記載の方法。
〔１２〕〔１〕～〔１１〕のいずれか１項記載の方法により調製されたライブラリーにおける遺伝子発現を検出することを含む、前記サンプルＲＮＡが由来する試料の遺伝子発現を検出する方法。
〔１３〕〔１〕～〔１１〕のいずれか１項記載の方法によりライブラリーを調製すること、及び該調製されたライブラリーにおける遺伝子発現を検出することを含む、前記サンプルＲＮＡが由来する試料の遺伝子発現を検出する方法。
〔１４〕好ましくは、前記遺伝子発現の検出がシーケンシングにより行われる、〔１２〕又は〔１３〕記載の方法。
同一サンプルＲＮＡから逆転写及びＰＣＲにより得られるＰＣＲ産物を複数準備すること、及び
該複数のＰＣＲ産物を混合してＰＣＲ産物のプールを調製すること、
を含む、方法。
〔２〕前記サンプルＲＮＡの濃度が、前記逆転写に供するＲＮＡ濃度として、好ましくは０．１ｐｇ／μＬ以上、より好ましくは０．５ｐｇ／μＬ以上、さらに好ましくは１ｐｇ／μＬ以上であり、他方、好ましくは１００ｐｇ／μＬ以下、より好ましくは１００ｐｇ／μＬ未満であるか、あるいは、０．１～１００ｐｇ／μＬ、０．５～１００ｐｇ／μＬ、１～１００ｐｇ／μＬ、１～７５ｐｇ／μＬ、又は１～６０ｐｇ／μＬ、０．１ｐｇ／μＬ以上１００ｐｇ／μＬ未満、０．５ｐｇ／μＬ以上１００ｐｇ／μＬ未満、１ｐｇ／μＬ以上１００ｐｇ／μＬ未満、１ｐｇ／μＬ以上７５ｐｇ／μＬ未満、又は１ｐｇ以上６０ｐｇ／μＬ未満である、〔１〕記載の方法。
〔３〕好ましくは、前記サンプルＲＮＡが、分解を受けていないＲＮＡ、分解が進行したＲＮＡ、又はそれらの混合物である、〔１〕又は〔２〕記載の方法。
〔４〕前記分解を受けていないＲＮＡのＤＶ２００が９０％より大きく、前記分解が進行したＲＮＡのＤＶ２００が９０％以下である、〔３〕記載の方法。
〔５〕好ましくは、前記サンプルＲＮＡが、分解が進行したＲＮＡである、〔３〕記載の方法。
〔６〕前記サンプルＲＮＡのＤＶ２００が、９０％以下、好ましくは６０％以下、より好ましくは４０％以下である、〔５〕記載の方法。
〔７〕前記サンプルＲＮＡのＤＶ２００が、５％以上、１０％以上、２０％以上又は３０％以上である、〔５〕記載の方法。
〔８〕好ましくは、前記ＰＣＲがマルチプレックスＰＣＲである、〔１〕～〔７〕のいずれか１項記載の方法。
〔９〕前記逆転写が、好ましくは、オリゴｄＴプライマー、ランダムプライマー、又はそれらの混合物を含む反応液中で行われ、より好ましくは、ランダムプライマーを含む反応液中で行われる、〔１〕～〔８〕のいずれか１項記載の方法。
〔１０〕好ましくは、前記複数のＰＣＲ産物を混合前にそれぞれ精製することをさらに含む、〔１〕～〔９〕のいずれか１項記載の方法。
〔１１〕前記複数のＰＣＲ産物の混合が等量混合である、〔１〕～〔１０〕のいずれか１項記載の方法。
〔１２〕〔１〕～〔１１〕のいずれか１項記載の方法により調製されたライブラリーにおける遺伝子発現を検出することを含む、前記サンプルＲＮＡが由来する試料の遺伝子発現を検出する方法。
〔１３〕〔１〕～〔１１〕のいずれか１項記載の方法によりライブラリーを調製すること、及び該調製されたライブラリーにおける遺伝子発現を検出することを含む、前記サンプルＲＮＡが由来する試料の遺伝子発現を検出する方法。
〔１４〕好ましくは、前記遺伝子発現の検出がシーケンシングにより行われる、〔１２〕又は〔１３〕記載の方法。
【実施例0032】
以下、実施例に基き本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【0033】
実施例１ ライブラリー調製及びシーケンシング（１）
１．ライブラリー調製
Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）の方法に準じてライブラリー調製を行った。具体的には、表皮角化細胞由来のＲＮＡ（Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ， Ｐｏｒｔｌａｎｄ， ＯＲ， ＵＳＡ）に対し、ＤＮａｓｅ/Ｒｎａｓｅ－Ｆｒｅｅ水を用いて１０ｐｇ／μＬの濃度に調整し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて４２℃、９０分間逆転写を行いｃＤＮＡの合成を行った。逆転写反応のプライマーには、キットに付属しているランダムプライマーを使用した。得られたｃＤＮＡから、マルチプレックスＰＣＲにより２０８０２遺伝子に由来するＤＮＡを含むライブラリーを調製した。マルチプレックスＰＣＲは、Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて、［９９℃、２分→（９９℃、１５秒→６０℃、１６分）×１６サイクル→４℃、Ｈｏｌｄ］の条件で行った。得られたＰＣＲ産物は、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ（ベックマン・コールター株式会社）で精製した。逆転写から精製までに至る上述の工程を２回行い、同一ＲＮＡに由来するテクニカルレプリケートとした。精製後の各テクニカルレプリケートを最終量３．５μＬとなるよう等量混合し、テクニカルレプリケートのプールを作成した後、バッファーの再構成、プライマー配列の消化、アダプターライゲーションと精製を行い、ライブラリーを調製した（テクニカルレプリケートの個数ｑ＝２のライブラリー）。これとは別に、混合前のそれぞれのテクニカルレプリケート３．５μＬに対して同様にバッファーの再構成、プライマー配列の消化、アダプターライゲーションと精製を行い、ライブラリーを調製した（ｑ＝１のライブラリー）。
上記と並行して、初発濃度が１０倍の１００ｐｇ／μＬの細胞ＲＮＡに対し、上記と同様の工程にて逆転写から精製とバッファーの再構成、プライマー配列の消化、アダプターライゲーションと精製を行い、ライブラリーを調製した（初発１０倍量のライブラリー）。
１．ライブラリー調製
Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）の方法に準じてライブラリー調製を行った。具体的には、表皮角化細胞由来のＲＮＡ（Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ， Ｐｏｒｔｌａｎｄ， ＯＲ， ＵＳＡ）に対し、ＤＮａｓｅ/Ｒｎａｓｅ－Ｆｒｅｅ水を用いて１０ｐｇ／μＬの濃度に調整し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて４２℃、９０分間逆転写を行いｃＤＮＡの合成を行った。逆転写反応のプライマーには、キットに付属しているランダムプライマーを使用した。得られたｃＤＮＡから、マルチプレックスＰＣＲにより２０８０２遺伝子に由来するＤＮＡを含むライブラリーを調製した。マルチプレックスＰＣＲは、Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔ（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いて、［９９℃、２分→（９９℃、１５秒→６０℃、１６分）×１６サイクル→４℃、Ｈｏｌｄ］の条件で行った。得られたＰＣＲ産物は、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰ（ベックマン・コールター株式会社）で精製した。逆転写から精製までに至る上述の工程を２回行い、同一ＲＮＡに由来するテクニカルレプリケートとした。精製後の各テクニカルレプリケートを最終量３．５μＬとなるよう等量混合し、テクニカルレプリケートのプールを作成した後、バッファーの再構成、プライマー配列の消化、アダプターライゲーションと精製を行い、ライブラリーを調製した（テクニカルレプリケートの個数ｑ＝２のライブラリー）。これとは別に、混合前のそれぞれのテクニカルレプリケート３．５μＬに対して同様にバッファーの再構成、プライマー配列の消化、アダプターライゲーションと精製を行い、ライブラリーを調製した（ｑ＝１のライブラリー）。
上記と並行して、初発濃度が１０倍の１００ｐｇ／μＬの細胞ＲＮＡに対し、上記と同様の工程にて逆転写から精製とバッファーの再構成、プライマー配列の消化、アダプターライゲーションと精製を行い、ライブラリーを調製した（初発１０倍量のライブラリー）。
【0034】
２．シーケンシング
１で調製した各種のライブラリーをＩｏｎ ５４０ Ｃｈｉｐにローディングし、Ｉｏｎ Ｓ５／ＸＬシステム（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いてシーケンシングした。
シーケンス解析では、遺伝子の発現量の定量にゲノムにマッピングされたシーケンスリードの数が使用される。各サンプルのリードカウントデータは、ＲＰＭ（Ｒｅａｄｓ Ｐｅｒ Ｍｉｌｌｉｏｎ ｒｅａｄｓ ｍａｐｐｅｄ）値に整数１を加算した底２の対数値（Ｌｏｇ２（ＲＰＭ＋１）値）に変換した補正値を用いてデータ解析を行った。
１で調製した各種のライブラリーをＩｏｎ ５４０ Ｃｈｉｐにローディングし、Ｉｏｎ Ｓ５／ＸＬシステム（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いてシーケンシングした。
シーケンス解析では、遺伝子の発現量の定量にゲノムにマッピングされたシーケンスリードの数が使用される。各サンプルのリードカウントデータは、ＲＰＭ（Ｒｅａｄｓ Ｐｅｒ Ｍｉｌｌｉｏｎ ｒｅａｄｓ ｍａｐｐｅｄ）値に整数１を加算した底２の対数値（Ｌｏｇ２（ＲＰＭ＋１）値）に変換した補正値を用いてデータ解析を行った。
【0035】
図１上段に２０８０２遺伝子を対象としたＬｏｇ２（ＲＰＭ＋１）値の散布図を示す。図１上段の左の図は、横軸にｑ＝２のライブラリーに基くＬｏｇ２（ＲＰＭ＋１）値、縦軸にプールした個々のテクニカルレプリケート由来のライブラリー（ｑ＝１）に基くＬｏｇ２（ＲＰＭ＋１）値の平均値をプロットした散布図であり、両データを比較し、２倍以上の発現差を認める遺伝子を黒色で表す（｜ＦＣ｜≧２）。上段中央の図は、横軸にプールした一方のテクニカルレプリケート由来のライブラリー（ｑ＝１）に基くＬｏｇ２（ＲＰＭ＋１）値、縦軸にもう一方のテクニカルレプリケート由来のライブラリー（ｑ＝１）に基くデータをプロットした散布図である。上段右の図は、横軸にｑ＝２のライブラリーに基くＬｏｇ２（ＲＰＭ＋１）値、縦軸に初発ＲＮＡ量が１０倍高いライブラリーに基くＬｏｇ２（ＲＰＭ＋１）値をプロットした散布図である。すなわち、上段右図は、横軸に初発ＲＮＡ量が１０ｐｇ／μＬの場合のｑ＝２のライブラリーに基くＬｏｇ２（ＲＰＭ＋１）値、縦軸に初発ＲＮＡ量が１００ｐｇ／μＬの場合のｑ＝１のライブラリーに基くＬｏｇ２（ＲＰＭ＋１）値をプロットした散布図である。
図１上段左図に示す通り、ＲＴ－ＰＣＲ産物のテクニカルレプリケートをプールするライブラリー調製方法により調製されたライブラリーに基いて取得されたシーケンスデータは、個々のテクニカルレプリケートに由来するライブラリーに基いて取得されるシーケンスデータの平均値とのデータ相関性が、Ｒｈｏ≒０．９８と高いことが確認され、テクニカルレプリケート間のＲＴ－ＰＣＲ反応のバラつきが平均化されることが示された。さらに、図１上段右図に示す通り、１０倍の初発ＲＮＡ量でライブラリー調製した場合のシーケンスデータと比較した結果、図１上段中央図に示すテクニカルレプリケート間のＲｈｏ値よりも高いことが明らかとなり、テクニカルレプリケートをプールすることでより高濃度サンプルの発現プロファイルに近似されることが示された。
図１上段左図に示す通り、ＲＴ－ＰＣＲ産物のテクニカルレプリケートをプールするライブラリー調製方法により調製されたライブラリーに基いて取得されたシーケンスデータは、個々のテクニカルレプリケートに由来するライブラリーに基いて取得されるシーケンスデータの平均値とのデータ相関性が、Ｒｈｏ≒０．９８と高いことが確認され、テクニカルレプリケート間のＲＴ－ＰＣＲ反応のバラつきが平均化されることが示された。さらに、図１上段右図に示す通り、１０倍の初発ＲＮＡ量でライブラリー調製した場合のシーケンスデータと比較した結果、図１上段中央図に示すテクニカルレプリケート間のＲｈｏ値よりも高いことが明らかとなり、テクニカルレプリケートをプールすることでより高濃度サンプルの発現プロファイルに近似されることが示された。
【0036】
実施例２ ライブラリー調製及びシーケンシング（２）
１．ライブラリー調製
特開２０２０－７４７６９号公報の試験例２に記載の方法に準じてライブラリー調製を行った。具体的には、表記角化細胞由来ＲＮＡ（Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ， Ｐｏｒｔｌａｎｄ， ＯＲ， ＵＳＡ）に対し、ＤＮａｓｅ/Ｒｎａｓｅ－Ｆｒｅｅ水を用いて１ｐｇ／μＬの濃度に調整し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔを用いて４２℃、９０分間逆転写を行いｃＤＮＡの合成を行った。逆転写反応のプライマーには、キットに付属しているランダムプライマーを使用した。得られたｃＤＮＡから、マルチプレックスＰＣＲにより２０８０２遺伝子に由来するＤＮＡを含むライブラリーを調製した。マルチプレックスＰＣＲは、Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔを用いて、［９９℃、２分→（９９℃、１５秒→６２℃、１６分）×２０サイクル→４℃、Ｈｏｌｄ］の条件で行った。得られたＰＣＲ産物は、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰで精製した。逆転写から精製までに至る上述の工程を２回行い、同一ＲＮＡに由来するＰＣＲ産物のテクニカルレプリケートとした。精製後の各テクニカルレプリケートを最終量３．５μＬとなるよう等量混合し、テクニカルレプリケートのプールを作成した後、バッファーの再構成、プライマー配列の消化、アダプターライゲーションと精製、増幅を行い、ライブラリーを調製した（テクニカルレプリケートの個数ｑ＝２のライブラリー）。これとは別に、混合前のそれぞれのテクニカルレプリケート３．５μＬに対して同様にバッファーの再構成、プライマー配列の消化、アダプターライゲーションと精製を行い、ライブラリーを調製した（ｑ＝１のライブラリー）。
上記と並行して、初発濃度が１０倍の１０ｐｇ／μＬの細胞ＲＮＡに対し、上記と同様の工程にて逆転写から精製とバッファーの再構成、プライマー配列の消化、アダプターライゲーションと精製を行い、ライブラリーを調製した（初発１０倍量のライブラリー）。
１．ライブラリー調製
特開２０２０－７４７６９号公報の試験例２に記載の方法に準じてライブラリー調製を行った。具体的には、表記角化細胞由来ＲＮＡ（Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ， Ｐｏｒｔｌａｎｄ， ＯＲ， ＵＳＡ）に対し、ＤＮａｓｅ/Ｒｎａｓｅ－Ｆｒｅｅ水を用いて１ｐｇ／μＬの濃度に調整し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＶＩＬＯ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｋｉｔを用いて４２℃、９０分間逆転写を行いｃＤＮＡの合成を行った。逆転写反応のプライマーには、キットに付属しているランダムプライマーを使用した。得られたｃＤＮＡから、マルチプレックスＰＣＲにより２０８０２遺伝子に由来するＤＮＡを含むライブラリーを調製した。マルチプレックスＰＣＲは、Ｉｏｎ ＡｍｐｌｉＳｅｑＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｋｉｔを用いて、［９９℃、２分→（９９℃、１５秒→６２℃、１６分）×２０サイクル→４℃、Ｈｏｌｄ］の条件で行った。得られたＰＣＲ産物は、Ａｍｐｕｒｅ ＸＰで精製した。逆転写から精製までに至る上述の工程を２回行い、同一ＲＮＡに由来するＰＣＲ産物のテクニカルレプリケートとした。精製後の各テクニカルレプリケートを最終量３．５μＬとなるよう等量混合し、テクニカルレプリケートのプールを作成した後、バッファーの再構成、プライマー配列の消化、アダプターライゲーションと精製、増幅を行い、ライブラリーを調製した（テクニカルレプリケートの個数ｑ＝２のライブラリー）。これとは別に、混合前のそれぞれのテクニカルレプリケート３．５μＬに対して同様にバッファーの再構成、プライマー配列の消化、アダプターライゲーションと精製を行い、ライブラリーを調製した（ｑ＝１のライブラリー）。
上記と並行して、初発濃度が１０倍の１０ｐｇ／μＬの細胞ＲＮＡに対し、上記と同様の工程にて逆転写から精製とバッファーの再構成、プライマー配列の消化、アダプターライゲーションと精製を行い、ライブラリーを調製した（初発１０倍量のライブラリー）。
【0037】
２．シーケンシング
１で調製した各種ライブラリーをＩｏｎ ５４０ Ｃｈｉｐにローディングし、Ｉｏｎ Ｓ５／ＸＬシステム（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いてシーケンシングした。
シーケンス解析では、遺伝子の発現量の定量にゲノムにマッピングされたシーケンスリードの数が使用される。各サンプルのリードカウントデータは、ＲＰＭ（Ｒｅａｄｓ Ｐｅｒ Ｍｉｌｌｉｏｎ ｒｅａｄｓ ｍａｐｐｅｄ）値に整数１を加算した底２の対数値（Ｌｏｇ２（ＲＰＭ＋１）値）に変換した補正値を用いてデータ解析を行った。
１で調製した各種ライブラリーをＩｏｎ ５４０ Ｃｈｉｐにローディングし、Ｉｏｎ Ｓ５／ＸＬシステム（ライフテクノロジーズジャパン株式会社）を用いてシーケンシングした。
シーケンス解析では、遺伝子の発現量の定量にゲノムにマッピングされたシーケンスリードの数が使用される。各サンプルのリードカウントデータは、ＲＰＭ（Ｒｅａｄｓ Ｐｅｒ Ｍｉｌｌｉｏｎ ｒｅａｄｓ ｍａｐｐｅｄ）値に整数１を加算した底２の対数値（Ｌｏｇ２（ＲＰＭ＋１）値）に変換した補正値を用いてデータ解析を行った。
【0038】
図１下段に２０８０２遺伝子を対象としたＬｏｇ２（ＲＰＭ＋１）値の散布図を示す。図１下段左の図は、横軸にｑ＝２のライブラリーに基くＬｏｇ２（ＲＰＭ＋１）値、縦軸にプールした個々のテクニカルレプリケート由来のライブラリー（ｑ＝１）に基くＬｏｇ２（ＲＰＭ＋１）値の平均値をプロットした散布図であり、両データを比較し、２倍以上の発現差を認める遺伝子を黒色で表す（｜ＦＣ｜≧２）。下段中央の図は、横軸にプールした一方のテクニカルレプリケート由来のライブラリー（ｑ＝１）に基くＬｏｇ２（ＲＰＭ＋１）値、縦軸にもう一方のテクニカルレプリケート由来のライブラリー（ｑ＝１）に基くデータをプロットした散布図である。下段右の図は、横軸にｑ＝２のライブラリーに基くＬｏｇ２（ＲＰＭ＋１）値、縦軸に初発ＲＮＡ量が１０倍高いライブラリーに基くＬｏｇ２（ＲＰＭ＋１）値をプロットした散布図である。すなわち、下段右図は、横軸に初発ＲＮＡ量が１ｐｇ／μＬの場合のｑ＝２のライブラリーに基くＬｏｇ２（ＲＰＭ＋１）値、縦軸に初発ＲＮＡ量が１０ｐｇ／μＬの場合のｑ＝１のライブラリーに基くＬｏｇ２（ＲＰＭ＋１）値をプロットした散布図である。
図１下段左図に示す通り、ＲＴ－ＰＣＲ産物のテクニカルレプリケートをプールするライブラリー調製方法により調製されたライブラリーに基いて取得されたシーケンスデータは、個々のテクニカルレプリケートに由来するライブラリーに基いて取得されるシーケンスデータの平均値とのデータ相関性がＲｈｏ≒０．９８と高いことが確認され、テクニカルレプリケート間のＲＴ－ＰＣＲ反応のバラつきが平均化されることが示された。さらに、図１下段右図に示す通り、１０倍の初発ＲＮＡ量でライブラリー調製した場合のシーケンスデータと比較した結果、図１下段中央図に示すテクニカルレプリケート間のＲｈｏ値よりも高いことが明らかとなり、テクニカルレプリケートをプールすることでより高濃度サンプルの発現プロファイルに近似されることが示された。
図１下段左図に示す通り、ＲＴ－ＰＣＲ産物のテクニカルレプリケートをプールするライブラリー調製方法により調製されたライブラリーに基いて取得されたシーケンスデータは、個々のテクニカルレプリケートに由来するライブラリーに基いて取得されるシーケンスデータの平均値とのデータ相関性がＲｈｏ≒０．９８と高いことが確認され、テクニカルレプリケート間のＲＴ－ＰＣＲ反応のバラつきが平均化されることが示された。さらに、図１下段右図に示す通り、１０倍の初発ＲＮＡ量でライブラリー調製した場合のシーケンスデータと比較した結果、図１下段中央図に示すテクニカルレプリケート間のＲｈｏ値よりも高いことが明らかとなり、テクニカルレプリケートをプールすることでより高濃度サンプルの発現プロファイルに近似されることが示された。
【0039】
実施例３ 微量又は分解亢進ＲＮＡを用いたライブラリー調製と検証
１．０μｇの表皮角化細胞由来ＲＮＡ（Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ， Ｐｏｒｔｌａｎｄ， ＯＲ， ＵＳＡ）に対し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ＝８．０）を用いて０、３００、１００又は３３．３ｎｇ／μＬに濃度調整したリコンビナントＲＮａｓｅ７（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を添加し、室温で３０分間反応させた後、ＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、付属のプロトコルに準じてＲＮＡを精製した。精製したＲＮＡは、それぞれ、Ｃｔｒｌ（コントロール）、Ａ、Ｂ、Ｃと称する。精製したＲＮＡの濃度を１００ｐｇ／μＬ、あるいは１０ｐｇ／μＬに調整し、上述した実施例２の方法に準じて、ｑ＝１、２又は４でライブラリーを調製し、シーケンスを実施した。
出力されたＲＮＡ発現量データは、ＤＥＳｅｑ２（Love MI et al. Genome Biol. 2014）により正規化されたリードカウント値（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｃｏｕｎｔ値）に整数１を加算した底２の対数値（Ｌｏｇ２（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｃｏｕｎｔ＋１）値）を用いてデータ解析を行った。
１．０μｇの表皮角化細胞由来ＲＮＡ（Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ， Ｐｏｒｔｌａｎｄ， ＯＲ， ＵＳＡ）に対し、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ＝８．０）を用いて０、３００、１００又は３３．３ｎｇ／μＬに濃度調整したリコンビナントＲＮａｓｅ７（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）を添加し、室温で３０分間反応させた後、ＱＩＡｚｏｌ Ｌｙｓｉｓ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、付属のプロトコルに準じてＲＮＡを精製した。精製したＲＮＡは、それぞれ、Ｃｔｒｌ（コントロール）、Ａ、Ｂ、Ｃと称する。精製したＲＮＡの濃度を１００ｐｇ／μＬ、あるいは１０ｐｇ／μＬに調整し、上述した実施例２の方法に準じて、ｑ＝１、２又は４でライブラリーを調製し、シーケンスを実施した。
出力されたＲＮＡ発現量データは、ＤＥＳｅｑ２（Love MI et al. Genome Biol. 2014）により正規化されたリードカウント値（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｃｏｕｎｔ値）に整数１を加算した底２の対数値（Ｌｏｇ２（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｃｏｕｎｔ＋１）値）を用いてデータ解析を行った。
【0040】
ＲＮＡの分解進行度を評価する為、Ａｇｉｌｅｎｔ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎ システム（アジレント・テクノロジー株式会社）を用いて、２００ｎｔ以上のＲＮＡ断片の比率（ＤＶ２００）を算出した。ＲＮａｓｅ７の添加濃度とＤＶ２００値を図２に示す。ＲＮａｓｅ７の添加濃度依存的にＤＶ２００値は低下し、ＲＮＡ分解によりＲＮＡの品質が低下することが示された。
【0041】
シーケンスの結果に基き、検出可能な遺伝子総数に対する検出できた遺伝子数の割合；遺伝子検出率（Ｔａｒｇｅｔｓ Ｄｅｔｅｃｔｅｄ、以下ＴＤと記す。）を表１に示す。微量、あるいは分解が進んだ低品質ＲＮＡを用いた検証の結果、ｑ値が高くなるごとに、即ち、プールするテクニカルレプリケートの個数が増えるごとに、ＴＤ値が上昇することが明らかとなった。微量又は分解度が進んだサンプル程、ＴＤ値の上昇幅が大きいことが示された（表１）。さらに、分解されていないＲＮＡ（Ｃｔｒｌ）のＲＮＡ発現量データと分解が進んだサンプル（Ａ）のＲＮＡ発現量データとの間のスピアマン順位相関係数を表２に示す。表２に示す通り、分解が進んだ低品質ＲＮＡのＲＴ－ＰＣＲ産物のテクニカルレプリケートをプールすることで、分解されていない同一ＲＮＡとのデータ相関性が向上した。
以上より、微量及び／又は分解が進行した低品質ＲＮＡを用いるライブラリー調製における本技術の有用性が示された。
以上より、微量及び／又は分解が進行した低品質ＲＮＡを用いるライブラリー調製における本技術の有用性が示された。
【0042】
【表1】
【0043】
【表2】
【0044】
実施例４ カルシウム刺激有／無しの微量ＲＮＡを用いたライブラリー調製と検証
１．ヒト表皮角化細胞ＲＮＡの調製
Nature. 2010 January 28; 463(7280): 563-567に準じ、１．２ｍＭのｃａｌｃｉｕｍで４８時間処理した後、細胞を回収し、ＲＮＡを抽出した（カルシウム刺激有／無しの各群ｎ＝３）。
１．ヒト表皮角化細胞ＲＮＡの調製
Nature. 2010 January 28; 463(7280): 563-567に準じ、１．２ｍＭのｃａｌｃｉｕｍで４８時間処理した後、細胞を回収し、ＲＮＡを抽出した（カルシウム刺激有／無しの各群ｎ＝３）。
【0045】
２．ライブラリー調製とシーケンシング
１でカルシウム刺激有／無しの各群から調製されたヒト表皮角化細胞ＲＮＡ １．０ｐｇ／μＬに対し、上述した実施例２の方法に従い、ライブラリーを調製し、シーケンスを実施した。
１でカルシウム刺激有／無しの各群から調製されたヒト表皮角化細胞ＲＮＡ １．０ｐｇ／μＬに対し、上述した実施例２の方法に従い、ライブラリーを調製し、シーケンスを実施した。
【0046】
出力されたＲＮＡ発現量データは、ＤＥＳｅｑ２により正規化されたリードカウント値（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｃｏｕｎｔ値）に整数１を加算した底２の対数値（Ｌｏｇ２（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ ｃｏｕｎｔ＋１）値）を算出した。Ｗａｌｄ検定を用いて、カルシウム刺激群と対照群の二群間比較解析を行った。検定の多重性と発現変動量を考慮し、ＦＤＲ（ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ）＝０．０５、及び｜ｌｏｇＦＣ（ｆｏｌｄ－ｃｈａｎｇｅ）｜＝１を閾値に設定し、ＦＤＲ＜０．０５かつ｜ｌｏｇＦＣ（ｆｏｌｄ－ｃｈａｎｇｅ）｜＜１を満たす発現差遺伝子（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ Ｇｅｎｅｓ：ＤＥＧｓ）をｑ値ごとに抽出した（表４）。
【0047】
微量な細胞ＲＮＡを用いた検証の結果、実施例３の検討結果同様、ｑ値が高くなるごとにＴＤ値が上昇することが明らかとなった（表３）。さらに、カルシウム刺激＋／－の群間比較解析を実施したところ、ｑ値が高くなるごとにＤＥＧｓが増加することが示された（表４）。抽出されたＤＥＧｓには、既報（Nature. 2010 January 28; 463(7280): 563-567）と重複する分子が多数含まれていることが確認された。
以上より、本技術を利用することで群間差が明確化され、検定力が向上することが示された。
以上より、本技術を利用することで群間差が明確化され、検定力が向上することが示された。
【0048】
【表3】
【0049】
【表4】
【図1】
【図2】
