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特開2024-94378ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインに特異的に結合する抗体
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024094378
(43)【公開日】2024-07-09
(54)【発明の名称】ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインに特異的に結合する抗体
(51)【国際特許分類】
C07K 16/40 20060101AFI20240702BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20240702BHJP
【ＦＩ】
C07K16/40 ZNA
C12N15/13
【審査請求】有
【請求項の数】4
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024067396
(22)【出願日】2024-04-18
(62)【分割の表示】P 2022568364の分割
【原出願日】2021-12-10
(31)【優先権主張番号】P 2020206269
(32)【優先日】2020-12-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(31)【優先権主張番号】P 2021098632
(32)【優先日】2021-06-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】000003160
【氏名又は名称】東洋紡株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】305060567
【氏名又は名称】国立大学法人富山大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】吉兼 峻史
(72)【発明者】
【氏名】黒澤 信幸
(72)【発明者】
【氏名】磯部 正治
(57)【要約】
【課題】ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を阻害する抗体又はその断片を提供する。
【解決手段】ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインに特異的に結合する抗体又はその断片が開示される。
【選択図】なし
【解決手段】ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインに特異的に結合する抗体又はその断片が開示される。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、及びＺ０５ポリメラーゼからなる群から選択される少なくとも一種のＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインに特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、配列番号１のＮ末端から５６～６６番目の領域又は配列番号２若しくは３のＮ末端から５６～６７番目の領域から選択されるアミノ酸領域Ａ；配列番号１のＮ末端から７５～８１番目の領域又は配列番号２若しくは３のＮ末端から７６～８２番目の領域から選択されるアミノ酸領域Ｂ；配列番号１のＮ末端から１６１～１８２番目の領域又は配列番号２若しくは３のＮ末端から１６２～１８３番目の領域から選択されるアミノ酸領域Ｃ；配列番号１のＮ末端から２６９～２８５番目の領域又は配列番号２若しくは３の２７１～２８７番目の領域から選択されるアミノ酸領域Ｄのいずれかの領域に存在する、抗体又はその抗原結合断片。
【請求項2】
前記少なくとも１つのエピトープが、前記アミノ酸領域Ａ又はＢのいずれかの領域に存在する、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項3】
前記アミノ酸領域Ａにおけるエピトープが配列番号６０～６３のいずれかであり、前記アミノ酸領域Ｂにおけるエピトープが配列番号６４又は６５であり、前記アミノ酸領域Ｃにおけるエピトープが配列番号６６～７４のいずれかであり、前記アミノ酸領域Ｄにおけるエピトープが配列番号７５～８３のいずれかである、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項4】
前記アミノ酸領域Ａにおけるエピトープが配列番号６１又は６２であり、前記アミノ酸領域Ｂにおけるエピトープが配列番号６４又は６５であり、前記アミノ酸領域Ｃにおけるエピトープが配列番号６６、６７、６８、７０、又は７１であり、前記アミノ酸領域Ｄにおけるエピトープが配列番号７７、７８、８０、又は８２である、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
核酸増幅法、特にポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ、以下「ＰＣＲ」と表記する）等に用いられるＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインに特異的に結合する抗体及びそれに関連する技術が提供される。
【背景技術】
【0002】
ＤＮＡポリメラーゼを用いた核酸テンプレートからのＤＮＡの合成は、分子生物学の分野において、シーケンシング法や核酸増幅法等、様々な方法に利用・応用されている。中でも、核酸増幅法は、研究分野のみならず、遺伝子診断、親子鑑定といった法医学分野、あるいは、食品や環境中の微生物検査等において、既に実用化されている。
【0003】
代表的な核酸増幅法は、ＰＣＲである。ＰＣＲは、（１）熱処理によるＤＮＡ変性（２本鎖ＤＮＡから１本鎖ＤＮＡへの解離）、（２）鋳型１本鎖ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、（３）ＤＮＡポリメラーゼを用いた前記プライマーの伸長、という３ステップを１サイクルとし、このサイクルを繰り返すことによって、試料中の標的核酸を増幅する方法である。（２）アニーリングと（３）伸長を同温度かつ１ステップで行い、２ステップを１サイクルとする場合もある。
【0004】
ＰＣＲは、原理的には１コピー、現実でも数コピー相当の核酸サンプルから増幅できる感度、特定部分のみを増幅する特異性などの特徴から、広く医学・生物学の研究や臨床診断等に利用されてきた。現在、ＰＣＲは更なる開発が行われており、複数のプライマーを同時に増幅するＭｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ法や、蛍光色素や蛍光標識プローブを用いて、増幅産物の生成過程を経時的にモニタリングするリアルタイムＰＣＲ法など、様々な技術が存在する。
【0005】
これらの核酸増幅法は、ＨＴＳ（Ｈｉｇｈ Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）などの大量サンプルの遺伝子解析や、多検体を処理する必要がある食品検査や環境検査等にも広く使用されている。大量サンプルを解析する場合、核酸増幅反応液を調製後に長時間（例えば、数時間から数日間）放置されることが想定される。しかしながら、前記反応液を常温で放置することで、前記反応液の安定性が低下することが懸念される。例えば、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ法（例えば非特許文献１を参照）では、調製後の反応液を常温で放置することで、Ｃｔ（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｃｙｃｌｅ）値が遅れる、あるいは、Ｃｔ値の検出そのものが不能になる現象が複数例確認されている（特許文献１及び２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】特開２０１７－１６３９０４号公報
【特許文献2】再表２０１６／１３６３２４号公報
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Ｈｏｌｌａｎｄら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第８８巻，１９９１年，第７２７６－７２８０頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明者らは、核酸増幅法等に用いられる核酸テンプレート、プライマー、プローブ等が５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインを有するＤＮＡポリメラーゼとの共存下で分解されるという問題をこれまでに見出している。
【0009】
本発明は、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインに対する(特異的に結合する)抗体又はその断片、及び当該抗体又はその断片の製造方法を提供することを主な課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインに対する(特異的に結合する)抗体又はその断片、及び当該抗体又はその断片の有用な製造方法を見出した。本発明はこれらの知見に基づいてさらに鋭意研究を重ねた結果完成したものである。
【0011】
代表的な本発明は、以下の通りである。
［項１］
ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインに特異的に結合する抗体又はその断片（抗原結合断片）。
［項２］
前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、及びＺ０５ポリメラーゼからなる群から選択される、項１に記載の抗体又はその断片。
［項３］
下記式（Ａ－１）：
ＧＦＸＡ３ＸＡ４ＸＡ５ＸＡ６ＸＡ７ＸＡ８ （Ａ－１）
［式中、
ＸＡ３はＴ又はＳであり、
ＸＡ４はＦ、Ｌ、又はＩであり、
ＸＡ５はＤ、Ｎ、Ｓ、又はＴであり、
ＸＡ６はＤ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｋ、Ｒ、又はＨであり、
ＸＡ７はＹ、Ｆ、又はＷであり、
ＸＡ８はＧ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ又はＦである］
で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１と、
下記式（Ｂ－１）：
ＩＸＢ２ＸＢ３ＸＢ４ＸＢ５ＸＢ６ＸＢ７ＸＢ８ （Ｂ－１）
［式中、
ＸＢ２はＧ、Ｓ、Ｔ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、又はＮであり、
ＸＢ３はＦ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、又はＮであり、
ＸＢ４はＧ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｒ、又はＨであり、
ＸＢ５はＧ、Ｓ、Ｔ、又はＡであり、
ＸＢ６はＧ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、又はＮであり、
ＸＢ７はＳ、Ｔ、Ｆ、Ｙ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｒ、又はＨであり、
ＸＢ８はＳ、Ｔ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、又はＭである］
で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２と、
下記式（Ｃ－１）～（Ｃ－６）：
ＶＲＸＣ１ＸＣ２ＸＣ３ＧＸＣ４ＸＣ５ＸＣ６ＴＧＦＤＸＣ７ （Ｃ－１）
ＶＲＸＣ１ＸＣ２ＸＣ３ＧＸＣ４ＸＣ５ＸＣ６ＦＤＸＣ７ （Ｃ－２）
ＸＣ８ＲＤＧＡＬＧＬＡＶＮＷＦＤＸＣ７ （Ｃ－３）
ＡＴＳＤＤＹＹＡＬＮＩ （Ｃ－４）
ＴＴＡＹＹＳＲＹＳＹＹＭＦＤＸＣ７ （Ｃ－５）
ＴＴＡＬＲＤＸＣ７ （Ｃ－６）
［式中、
ＸＣ１はＡ、Ｓ、Ｄ、Ｋ、Ｈ、又はＲであり、
ＸＣ２はＧ、Ａ、Ｄ、Ｐ、Ｋ、Ｈ、又はＲであり、
ＸＣ３はＳ、Ｔ、Ｌ、Ｙ、又はＩであり、
ＸＣ４はＡ、Ｖ、Ｉ、Ｒ、又はＬであり、
ＸＣ５はＡ、Ｖ、Ｙ、又はＰであり、
ＸＣ６はＡ、Ｖ、Ｓ、Ｔ、又はＹであり、
ＸＣ７はＶ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、又はＮであり、
ＸＣ８はＡ又はＶである］
のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３と、
下記式（Ｄ－１）：
ＸＤ１ＸＤ２ＸＤ３ＸＤ４ＸＤ５ＸＤ６ （Ｄ－１）
［式中、
ＸＤ１はＥ、Ｑ、Ｄ、又はＮであり、
ＸＤ２はＧ、Ａ、Ｓ、又はＴであり、
ＸＤ３はＡ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、又はＦであり、
ＸＤ４はＳ、Ｔ、Ｋ、Ｒ、又はＨであり、
ＸＤ５はＳ、Ｔ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｒ、又はＨであり、
ＸＤ６はＦ、Ｙ、又はＷである］
で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１と、
下記式（Ｅ－１）：
ＸＥ１ＸＥ２ＸＥ３ （Ｅ－１）
［式中、
ＸＥ１はＧ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｎ、Ｆ、Ｙ、Ｋ、Ｒ、又はＨであり、
ＸＥ２はＧ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｌ又はＩであり、
ＸＥ３はＫ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｎ、Ｓ、又はＴである］
で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２と、
下記式（Ｆ－１）又は（Ｆ－２）：
ＸＦ１ＸＦ２ＸＦ３ＸＦ４ＸＦ５ＸＦ６ＸＦ７ＸＦ８ （Ｆ－１）
ＸＦ１ＸＦ２ＸＦ３ＸＦ４ＸＦ５ＸＦ６ＸＦ７ＸＦ８ＸＦ９ （Ｆ－２）
［式中、
ＸＦ１はＬ、Ｉ、Ｅ、Ｑ、Ｆ、Ｙ又はＷであり、
ＸＦ２はＤ、Ｎ、Ｅ又はＱであり、
ＸＦ３はＳ、Ｔ、Ｆ、又はＹであり、
ＸＦ４はＧ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｙ、Ｎ又はＱであり、
ＸＦ５はＳ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｌ又はＩであり、
ＸＦ６はＧ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｙ、又はＷであり、
ＸＦ７はＳ、Ｔ、Ｐ、Ｙ又はＷであり、
ＸＦ８はＬ、Ｉ、Ｐ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｙ、Ｔ、又はＷであり、
ＸＦ９はＧ、Ｓ、Ｔ、Ｄ又はＥである］
で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３と
を含む、抗体又はその断片（抗原結合断片）。
［項４］
さらに、下記式（Ｅ－２）：
ＸＥ４ＸＥ５ＸＥ６ＸＥ７ （Ｅ－２）
［式中、
ＸＥ４はＧ、Ｓ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｎ、Ｆ、Ｙ、又はＴであり、
ＸＥ５はＬ、Ｉ、Ｋ、Ｈ、又はＲであり、
ＸＥ６はＧ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｆ、又はＹであり、
ＸＥ７はＧ、Ａ、Ｄ、Ｎ、Ｓ、又はＴである］
で表されるアミノ酸配列からなる、軽鎖ＣＤＲ２のＣ末端に隣接する配列領域を含む、項３に記載の抗体又はその断片。
［項５］
下記式（Ａ－１－１）：
ＧＦＴＦＸＡ５１ＸＡ６１ＸＡ７１ＸＡ８１ （Ａ－１－１）
ＸＡ５１はＤ、Ｎ、又はＳであり、
ＸＡ６１はＤ、Ｎ、Ｓ、Ｋ、又はＨであり、
ＸＡ７１はＹ又はＷであり、
ＸＡ８１はＧ、Ｗ、又はＹである］
で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１と、
下記式（Ｂ－１－１）：
ＩＸＢ２１ＸＢ３１ＸＢ４１ＸＢ５１ＸＢ６１ＸＢ７１ＸＢ８１ （Ｂ－１－１）
［式中、
ＸＢ２１はＧ、Ｓ、Ｔ、Ｋ、又はＮであり、
ＸＢ３１はＹ、Ｌ、Ｇ、Ｔ、又はＮであり、
ＸＢ４１はＧ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、又はＨであり、
ＸＢ５１はＧ又はＳであり、
ＸＢ６１はＧ、Ｓ、Ｔ、又はＤであり、
ＸＢ７１はＳ、Ｔ、Ｙ、Ｄ、又はＨであり、
ＸＢ８１はＳ、Ｔ、Ｖ、Ｉ、又はＭである］
で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２と、
下記式（Ｃ－１－１）～（Ｃ－６－１）：
ＶＲＸＣ１１ＸＣ２１ＸＣ３１ＧＸＣ４１ＸＣ５１ＸＣ６１ＴＧＦＤＸＣ７１ （Ｃ－１－１）
ＶＲＸＣ１１ＸＣ２１ＸＣ３１ＧＸＣ４１ＸＣ５１ＸＣ６１ＦＤＸＣ７１ （Ｃ－２－１）
ＸＣ８１ＲＤＧＡＬＧＬＡＶＮＷＦＤＸＣ７１ （Ｃ－３－１）
ＡＴＳＤＤＹＹＡＬＮＩ （Ｃ－４）
ＴＴＡＹＹＳＲＹＳＹＹＭＦＤＸＣ７１ （Ｃ－５－１）
ＴＴＡＬＲＤＸＣ７１ （Ｃ－６－１）
［式中、
ＸＣ１１はＡ又はＲであり、
ＸＣ２１はＰ又はＲであり、
ＸＣ３１はＴ又はＩであり、
ＸＣ４１はＶ又はＬであり、
ＸＣ５１はＰ又はＡであり、
ＸＣ６１はＴ又はＹであり、
ＸＣ７１はＶ、Ｔ、又はＮであり、
ＸＣ８１はＡ又はＶである］
のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３と、
下記式（Ｄ－１－１）：
ＱＸＤ２１ＸＤ３１ＸＤ４１ＸＤ５１ＸＤ６１ （Ｄ－１－１）
［式中、
ＸＤ２１はＧ又はＳであり、
ＸＤ３１はＶ又はＩであり、
ＸＤ４１はＳ又はＫであり、
ＸＤ５１はＳ、Ｎ、又はＫであり、
ＸＤ６１はＦ又はＹである］
で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１と、
下記式（Ｅ－１－１）：
ＸＥ１１ＸＥ２１ＸＥ３１ （Ｅ－１－１）
［式中、
ＸＥ１１はＧ、Ｔ、Ｄ、Ｙ、又はＲであり、
ＸＥ２１はＡ、Ｔ、又はＶであり、
ＸＥ３１はＫ、Ｄ、Ｎ、又はＳである］
で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２と、
下記式（Ｆ－１－１）又は（Ｆ－２－１）：
ＸＦ１１ＱＸＦ３１ＸＦ４１ＸＦ５１ＸＦ６１ＸＦ７１ＸＦ８１ （Ｆ－１－１）
ＸＦ１１ＱＸＦ３１ＸＦ４１ＸＦ５１ＸＦ６１ＸＦ７１ＸＦ８１Ｔ （Ｆ－２－１）
［式中、
ＸＦ１１はＬ、Ｑ、Ｆ、又はＹであり、
ＸＦ３１はＳ又はＹであり、
ＸＦ４１はＧ、Ｎ、Ｑ、又はＹであり、
ＸＦ５１はＳ、Ｎ、又はＩであり、
ＸＦ６１はＧ、Ｓ、Ｙ、又はＷであり、
ＸＦ７１はＳ、Ｐ、又はＷであり、
ＸＦ８１はＬ、Ｐ、Ｈ、Ｙ、又はＴである］
で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３と
を含む、抗体又はその断片（抗原結合断片）。
［項６］
さらに、下記式（Ｅ－２－１）又は（Ｅ－２－２）：
ＳＬＸＥ６１Ｓ （Ｅ－２－１）
ＸＥ４２ＸＥ５２ＸＥ６２ＸＥ７２ （Ｅ－２－２）
［式中、
ＸＥ６１はＡ又はＰであり、
ＸＥ４２はＲ、Ｎ、Ｙ、又はＴであり、
ＸＥ５２はＬ又はＲであり、
ＸＥ６２はＡ又はＹであり、
ＸＥ７２はＳ又はＴである］
で表されるアミノ酸配列からなる、軽鎖ＣＤＲ２のＣ末端に隣接する配列領域を含む、項５に記載の抗体又はその断片。
［項７］
Ｔａｑポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインに特異的に結合する、項３～６のいずれかに記載の抗体又はその断片。
［項８］
Ｔｔｈポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインに特異的に結合する、項３～６のいずれかに記載の抗体又はその断片。
［項９］
Ｚ０５ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインに特異的に結合する、項３～６のいずれかに記載の抗体又はその断片。
［項１０］
ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインに特異的に結合する抗体又はその断片であって、少なくとも１つのエピトープが、配列番号１のＮ末端から５６～６６番目の領域又は配列番号２若しくは３のＮ末端から５６～６７番目の領域から選択されるアミノ酸領域Ａ；配列番号１のＮ末端から７５～８１番目の領域又は配列番号２若しくは３のＮ末端から７６～８２番目の領域から選択されるアミノ酸領域Ｂ；配列番号１のＮ末端から１６１～１８２番目の領域又は配列番号２若しくは３のＮ末端から１６２～１８３番目の領域から選択されるアミノ酸領域Ｃ；配列番号１のＮ末端から２６９～２８５番目の領域又は配列番号２若しくは３の２７１～２８７番目の領域から選択されるアミノ酸領域Ｄのいずれかの領域に存在する、抗体又はその断片（抗原結合断片）。
［項１１］
前記少なくとも１つのエピトープが、前記アミノ酸領域Ａ又はＢのいずれかの領域に存在する、項１０に記載の抗体又はその断片。
［項１２］
前記アミノ酸領域Ａにおけるエピトープが配列番号６０～６３のいずれかであり、前記アミノ酸領域Ｂにおけるエピトープが配列番号６４又は６５であり、前記アミノ酸領域Ｃにおけるエピトープが配列番号６６～７４のいずれかであり、前記アミノ酸領域Ｄにおけるエピトープが配列番号７５～８３のいずれかである、項１０又は１１に記載の抗体又はその断片。
［項１３］
前記アミノ酸領域Ａにおけるエピトープが配列番号６１又は６２であり、前記アミノ酸領域Ｂにおけるエピトープが配列番号６４又は６５であり、前記アミノ酸領域Ｃにおけるエピトープが配列番号６６、６７、６８、７０、又は７１であり、前記アミノ酸領域Ｄにおけるエピトープが配列番号７７、７８、８０、又は８２である、項１０～１２のいずれかに記載の抗体又はその断片。
［項１４］
モノクローナル抗体又はその断片である、項１～１３のいずれかに記載の抗体又はその断片。
［項１５］
前記重鎖ＣＤＲ３が配列番号２１～２８のいずれかに示されるアミノ酸配列又はこれらのアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が変異しているアミノ酸配列からなり、
前記軽鎖ＣＤＲ３が配列番号４２～４８のいずれかに示されるアミノ酸配列又はこれらのアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が変異しているアミノ酸配列からなる、項１～１４のいずれかに記載の抗体又はその断片。
［項１６］
前記重鎖ＣＤＲ３が配列番号２１～２８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなり、
前記軽鎖ＣＤＲ３が配列番号４２～４８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなる、項１～１５のいずれかに記載の抗体又はその断片。
［項１７］
配列番号４～１１のいずれかに示されるアミノ酸配列又はこれらのアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が変異しているアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１と、
配列番号１２～２０のいずれかに示されるアミノ酸配列又はこれらのアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が変異しているアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２と、
配列番号２１～２８のいずれかに示されるアミノ酸配列又はこれらのアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が変異しているアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３と、
配列番号２９～３５のいずれかに示されるアミノ酸配列又はこれらのアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が変異しているアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１と、
YTN、YTD、YAD、YAN、DAS、GVK、RAK、GAK、又はTASのいずれかで示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２と、
配列番号４２～４８のいずれかに示されるアミノ酸配列又はこれらのアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が変異しているアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３と
を含む、項１～１６のいずれかに記載の抗体又はその断片。
［項１８］
配列番号４～１１のいずれかに示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１と、
配列番号１２～２０のいずれかに示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２と、
配列番号２１～２８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３と、
配列番号２９～３５のいずれかに示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１と、
YTN、YTD、YAD、YAN、DAS、GVK、RAK、GAK、又はTASのいずれかで示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２と、
配列番号４２～４８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３と
を含む、項１～１７のいずれかに記載の抗体又はその断片。
［項１９］
さらに、配列番号３６～４１のいずれかに示されるアミノ酸配列又はこれらのアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が変異しているアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２のＣ末端に隣接する配列領域を含む、項１７又は１８に記載の抗体又はその断片。
［項２０］
さらに、配列番号３６～４１のいずれかに示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２のＣ末端に隣接する配列領域を含む、項１７～１９のいずれかに記載の抗体又はその断片。
［項２１］
前記変異が保存的置換である、項１５、１７、及び１９のいずれかに記載の抗体又はその断片。
［項２２］
項１～２１のいずれかに記載の抗体の断片であって、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、又はｓｃＦｖである断片（抗原結合断片）。
［項２３］
項１～２１のいずれかに記載の抗体又はその断片、或いは、項２２に記載の断片を含む試薬。
［項２４］
５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインを有するＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、プローブ、及びデオキシリボヌクレオシド－５’－リン酸からなる群より選択される少なくとも一種を更に含む、項２３に記載の試薬。
［項２５］
前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、及びＺ０５ポリメラーゼからなる群から選択される、項２４に記載の試薬。
［項２６］
核酸増幅用試薬である、項２３～２５のいずれかに記載の試薬。
［項２７］
ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインに特異的に結合する抗体又はその断片（抗原結合断片）の製造方法であって、ＤＮＡポリメラーゼの一部（ここで、当該一部は５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインを含む）からなる免疫原で免疫した動物が産生する抗体から、ＤＮＡポリメラーゼの全体に対する結合能を有する抗体を選択する工程Ａを含む、製造方法。
［項２８］
前記免疫原が、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインからなる、項２７に記載の製造方法。
［項２９］
前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、及びＺ０５ポリメラーゼからなる群から選択される、項２７又は２８に記載の製造方法。
［項３０］
前記免疫原が、Ｔｔｈポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインからなる、項２７～２９のいずれかに記載の製造方法。
［項３１］
工程Ａが、Ｔｔｈポリメラーゼの一部（ここで、当該一部は５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインを含む）からなる免疫原で免疫した動物が産生する抗体から、Ｔａｑポリメラーゼの全体に対する結合能を有する抗体を選択する工程である、項２７に記載の製造方法。
［項３２］
工程Ａが、Ｔｔｈポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインからなる免疫原で免疫した動物が産生する抗体から、Ｔａｑポリメラーゼの全体に対する結合能を有する抗体を選択する工程である、項２７に記載の製造方法。
［項３３］
項２７～３２のいずれかに記載の製造方法によって得られた抗体のアミノ酸配列に基づき、その一部のアミノ酸配列を遺伝子工学的手法により発現させる工程を含む、抗体断片（抗原結合断片）の製造方法。
［項３４］
３７℃で２４時間にわたりＤＮＡポリメラーゼと共存させた場合、該ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼに対する阻害能が６０％以上である、項１～２１のいずれかに記載の抗体又はその断片、或いは、項２２に記載の断片。
［項３５］
２５℃で２４時間にわたり基質ＤＮＡ（ここで、基質ＤＮＡは一本鎖であっても二本鎖であってもよく、基質ＤＮＡはプローブとしての機能を有していてもよい）と５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインを有するＤＮＡポリメラーゼとを共存させた場合、該基質ＤＮＡ分解率が４０％以下である、項１～２１及び３４のいずれかに記載の抗体又はその断片、或いは、項２２に記載の断片。
［項３６］
５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインを有するＤＮＡポリメラーゼと、プライマー、プローブ、及び核酸テンプレートからなる群より選択される少なくとも一種の核酸とを含む組成物を安定化するための試薬であって、項１～２１、３４、及び３５のいずれかに記載の抗体又はその断片、或いは、項２２に記載の断片を含む試薬。
［項３７］
５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインを有するＤＮＡポリメラーゼと、プライマー、プローブ、及び核酸テンプレートからなる群より選択される少なくとも一種の核酸とを含む組成物を安定化する方法であって、項１～２１、３４、及び３５のいずれかに記載の抗体又はその断片、或いは、項２２に記載の断片を前記組成物に添加する工程を含む、方法。
［項１］
ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインに特異的に結合する抗体又はその断片（抗原結合断片）。
［項２］
前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、及びＺ０５ポリメラーゼからなる群から選択される、項１に記載の抗体又はその断片。
［項３］
下記式（Ａ－１）：
ＧＦＸＡ３ＸＡ４ＸＡ５ＸＡ６ＸＡ７ＸＡ８ （Ａ－１）
［式中、
ＸＡ３はＴ又はＳであり、
ＸＡ４はＦ、Ｌ、又はＩであり、
ＸＡ５はＤ、Ｎ、Ｓ、又はＴであり、
ＸＡ６はＤ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｋ、Ｒ、又はＨであり、
ＸＡ７はＹ、Ｆ、又はＷであり、
ＸＡ８はＧ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ又はＦである］
で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１と、
下記式（Ｂ－１）：
ＩＸＢ２ＸＢ３ＸＢ４ＸＢ５ＸＢ６ＸＢ７ＸＢ８ （Ｂ－１）
［式中、
ＸＢ２はＧ、Ｓ、Ｔ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、又はＮであり、
ＸＢ３はＦ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、Ｇ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、又はＮであり、
ＸＢ４はＧ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｒ、又はＨであり、
ＸＢ５はＧ、Ｓ、Ｔ、又はＡであり、
ＸＢ６はＧ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、又はＮであり、
ＸＢ７はＳ、Ｔ、Ｆ、Ｙ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｒ、又はＨであり、
ＸＢ８はＳ、Ｔ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、又はＭである］
で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２と、
下記式（Ｃ－１）～（Ｃ－６）：
ＶＲＸＣ１ＸＣ２ＸＣ３ＧＸＣ４ＸＣ５ＸＣ６ＴＧＦＤＸＣ７ （Ｃ－１）
ＶＲＸＣ１ＸＣ２ＸＣ３ＧＸＣ４ＸＣ５ＸＣ６ＦＤＸＣ７ （Ｃ－２）
ＸＣ８ＲＤＧＡＬＧＬＡＶＮＷＦＤＸＣ７ （Ｃ－３）
ＡＴＳＤＤＹＹＡＬＮＩ （Ｃ－４）
ＴＴＡＹＹＳＲＹＳＹＹＭＦＤＸＣ７ （Ｃ－５）
ＴＴＡＬＲＤＸＣ７ （Ｃ－６）
［式中、
ＸＣ１はＡ、Ｓ、Ｄ、Ｋ、Ｈ、又はＲであり、
ＸＣ２はＧ、Ａ、Ｄ、Ｐ、Ｋ、Ｈ、又はＲであり、
ＸＣ３はＳ、Ｔ、Ｌ、Ｙ、又はＩであり、
ＸＣ４はＡ、Ｖ、Ｉ、Ｒ、又はＬであり、
ＸＣ５はＡ、Ｖ、Ｙ、又はＰであり、
ＸＣ６はＡ、Ｖ、Ｓ、Ｔ、又はＹであり、
ＸＣ７はＶ、Ｉ、Ｌ、Ｓ、Ｔ、又はＮであり、
ＸＣ８はＡ又はＶである］
のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３と、
下記式（Ｄ－１）：
ＸＤ１ＸＤ２ＸＤ３ＸＤ４ＸＤ５ＸＤ６ （Ｄ－１）
［式中、
ＸＤ１はＥ、Ｑ、Ｄ、又はＮであり、
ＸＤ２はＧ、Ａ、Ｓ、又はＴであり、
ＸＤ３はＡ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、又はＦであり、
ＸＤ４はＳ、Ｔ、Ｋ、Ｒ、又はＨであり、
ＸＤ５はＳ、Ｔ、Ｄ、Ｎ、Ｋ、Ｒ、又はＨであり、
ＸＤ６はＦ、Ｙ、又はＷである］
で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１と、
下記式（Ｅ－１）：
ＸＥ１ＸＥ２ＸＥ３ （Ｅ－１）
［式中、
ＸＥ１はＧ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｎ、Ｆ、Ｙ、Ｋ、Ｒ、又はＨであり、
ＸＥ２はＧ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｌ又はＩであり、
ＸＥ３はＫ、Ｒ、Ｈ、Ｄ、Ｎ、Ｓ、又はＴである］
で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２と、
下記式（Ｆ－１）又は（Ｆ－２）：
ＸＦ１ＸＦ２ＸＦ３ＸＦ４ＸＦ５ＸＦ６ＸＦ７ＸＦ８ （Ｆ－１）
ＸＦ１ＸＦ２ＸＦ３ＸＦ４ＸＦ５ＸＦ６ＸＦ７ＸＦ８ＸＦ９ （Ｆ－２）
［式中、
ＸＦ１はＬ、Ｉ、Ｅ、Ｑ、Ｆ、Ｙ又はＷであり、
ＸＦ２はＤ、Ｎ、Ｅ又はＱであり、
ＸＦ３はＳ、Ｔ、Ｆ、又はＹであり、
ＸＦ４はＧ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｙ、Ｎ又はＱであり、
ＸＦ５はＳ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｌ又はＩであり、
ＸＦ６はＧ、Ｓ、Ｔ、Ｆ、Ｙ、又はＷであり、
ＸＦ７はＳ、Ｔ、Ｐ、Ｙ又はＷであり、
ＸＦ８はＬ、Ｉ、Ｐ、Ｋ、Ｒ、Ｈ、Ｙ、Ｔ、又はＷであり、
ＸＦ９はＧ、Ｓ、Ｔ、Ｄ又はＥである］
で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３と
を含む、抗体又はその断片（抗原結合断片）。
［項４］
さらに、下記式（Ｅ－２）：
ＸＥ４ＸＥ５ＸＥ６ＸＥ７ （Ｅ－２）
［式中、
ＸＥ４はＧ、Ｓ、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、Ｎ、Ｆ、Ｙ、又はＴであり、
ＸＥ５はＬ、Ｉ、Ｋ、Ｈ、又はＲであり、
ＸＥ６はＧ、Ａ、Ｓ、Ｔ、Ｐ、Ｆ、又はＹであり、
ＸＥ７はＧ、Ａ、Ｄ、Ｎ、Ｓ、又はＴである］
で表されるアミノ酸配列からなる、軽鎖ＣＤＲ２のＣ末端に隣接する配列領域を含む、項３に記載の抗体又はその断片。
［項５］
下記式（Ａ－１－１）：
ＧＦＴＦＸＡ５１ＸＡ６１ＸＡ７１ＸＡ８１ （Ａ－１－１）
ＸＡ５１はＤ、Ｎ、又はＳであり、
ＸＡ６１はＤ、Ｎ、Ｓ、Ｋ、又はＨであり、
ＸＡ７１はＹ又はＷであり、
ＸＡ８１はＧ、Ｗ、又はＹである］
で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１と、
下記式（Ｂ－１－１）：
ＩＸＢ２１ＸＢ３１ＸＢ４１ＸＢ５１ＸＢ６１ＸＢ７１ＸＢ８１ （Ｂ－１－１）
［式中、
ＸＢ２１はＧ、Ｓ、Ｔ、Ｋ、又はＮであり、
ＸＢ３１はＹ、Ｌ、Ｇ、Ｔ、又はＮであり、
ＸＢ４１はＧ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、又はＨであり、
ＸＢ５１はＧ又はＳであり、
ＸＢ６１はＧ、Ｓ、Ｔ、又はＤであり、
ＸＢ７１はＳ、Ｔ、Ｙ、Ｄ、又はＨであり、
ＸＢ８１はＳ、Ｔ、Ｖ、Ｉ、又はＭである］
で表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２と、
下記式（Ｃ－１－１）～（Ｃ－６－１）：
ＶＲＸＣ１１ＸＣ２１ＸＣ３１ＧＸＣ４１ＸＣ５１ＸＣ６１ＴＧＦＤＸＣ７１ （Ｃ－１－１）
ＶＲＸＣ１１ＸＣ２１ＸＣ３１ＧＸＣ４１ＸＣ５１ＸＣ６１ＦＤＸＣ７１ （Ｃ－２－１）
ＸＣ８１ＲＤＧＡＬＧＬＡＶＮＷＦＤＸＣ７１ （Ｃ－３－１）
ＡＴＳＤＤＹＹＡＬＮＩ （Ｃ－４）
ＴＴＡＹＹＳＲＹＳＹＹＭＦＤＸＣ７１ （Ｃ－５－１）
ＴＴＡＬＲＤＸＣ７１ （Ｃ－６－１）
［式中、
ＸＣ１１はＡ又はＲであり、
ＸＣ２１はＰ又はＲであり、
ＸＣ３１はＴ又はＩであり、
ＸＣ４１はＶ又はＬであり、
ＸＣ５１はＰ又はＡであり、
ＸＣ６１はＴ又はＹであり、
ＸＣ７１はＶ、Ｔ、又はＮであり、
ＸＣ８１はＡ又はＶである］
のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３と、
下記式（Ｄ－１－１）：
ＱＸＤ２１ＸＤ３１ＸＤ４１ＸＤ５１ＸＤ６１ （Ｄ－１－１）
［式中、
ＸＤ２１はＧ又はＳであり、
ＸＤ３１はＶ又はＩであり、
ＸＤ４１はＳ又はＫであり、
ＸＤ５１はＳ、Ｎ、又はＫであり、
ＸＤ６１はＦ又はＹである］
で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１と、
下記式（Ｅ－１－１）：
ＸＥ１１ＸＥ２１ＸＥ３１ （Ｅ－１－１）
［式中、
ＸＥ１１はＧ、Ｔ、Ｄ、Ｙ、又はＲであり、
ＸＥ２１はＡ、Ｔ、又はＶであり、
ＸＥ３１はＫ、Ｄ、Ｎ、又はＳである］
で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２と、
下記式（Ｆ－１－１）又は（Ｆ－２－１）：
ＸＦ１１ＱＸＦ３１ＸＦ４１ＸＦ５１ＸＦ６１ＸＦ７１ＸＦ８１ （Ｆ－１－１）
ＸＦ１１ＱＸＦ３１ＸＦ４１ＸＦ５１ＸＦ６１ＸＦ７１ＸＦ８１Ｔ （Ｆ－２－１）
［式中、
ＸＦ１１はＬ、Ｑ、Ｆ、又はＹであり、
ＸＦ３１はＳ又はＹであり、
ＸＦ４１はＧ、Ｎ、Ｑ、又はＹであり、
ＸＦ５１はＳ、Ｎ、又はＩであり、
ＸＦ６１はＧ、Ｓ、Ｙ、又はＷであり、
ＸＦ７１はＳ、Ｐ、又はＷであり、
ＸＦ８１はＬ、Ｐ、Ｈ、Ｙ、又はＴである］
で表されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３と
を含む、抗体又はその断片（抗原結合断片）。
［項６］
さらに、下記式（Ｅ－２－１）又は（Ｅ－２－２）：
ＳＬＸＥ６１Ｓ （Ｅ－２－１）
ＸＥ４２ＸＥ５２ＸＥ６２ＸＥ７２ （Ｅ－２－２）
［式中、
ＸＥ６１はＡ又はＰであり、
ＸＥ４２はＲ、Ｎ、Ｙ、又はＴであり、
ＸＥ５２はＬ又はＲであり、
ＸＥ６２はＡ又はＹであり、
ＸＥ７２はＳ又はＴである］
で表されるアミノ酸配列からなる、軽鎖ＣＤＲ２のＣ末端に隣接する配列領域を含む、項５に記載の抗体又はその断片。
［項７］
Ｔａｑポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインに特異的に結合する、項３～６のいずれかに記載の抗体又はその断片。
［項８］
Ｔｔｈポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインに特異的に結合する、項３～６のいずれかに記載の抗体又はその断片。
［項９］
Ｚ０５ポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインに特異的に結合する、項３～６のいずれかに記載の抗体又はその断片。
［項１０］
ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインに特異的に結合する抗体又はその断片であって、少なくとも１つのエピトープが、配列番号１のＮ末端から５６～６６番目の領域又は配列番号２若しくは３のＮ末端から５６～６７番目の領域から選択されるアミノ酸領域Ａ；配列番号１のＮ末端から７５～８１番目の領域又は配列番号２若しくは３のＮ末端から７６～８２番目の領域から選択されるアミノ酸領域Ｂ；配列番号１のＮ末端から１６１～１８２番目の領域又は配列番号２若しくは３のＮ末端から１６２～１８３番目の領域から選択されるアミノ酸領域Ｃ；配列番号１のＮ末端から２６９～２８５番目の領域又は配列番号２若しくは３の２７１～２８７番目の領域から選択されるアミノ酸領域Ｄのいずれかの領域に存在する、抗体又はその断片（抗原結合断片）。
［項１１］
前記少なくとも１つのエピトープが、前記アミノ酸領域Ａ又はＢのいずれかの領域に存在する、項１０に記載の抗体又はその断片。
［項１２］
前記アミノ酸領域Ａにおけるエピトープが配列番号６０～６３のいずれかであり、前記アミノ酸領域Ｂにおけるエピトープが配列番号６４又は６５であり、前記アミノ酸領域Ｃにおけるエピトープが配列番号６６～７４のいずれかであり、前記アミノ酸領域Ｄにおけるエピトープが配列番号７５～８３のいずれかである、項１０又は１１に記載の抗体又はその断片。
［項１３］
前記アミノ酸領域Ａにおけるエピトープが配列番号６１又は６２であり、前記アミノ酸領域Ｂにおけるエピトープが配列番号６４又は６５であり、前記アミノ酸領域Ｃにおけるエピトープが配列番号６６、６７、６８、７０、又は７１であり、前記アミノ酸領域Ｄにおけるエピトープが配列番号７７、７８、８０、又は８２である、項１０～１２のいずれかに記載の抗体又はその断片。
［項１４］
モノクローナル抗体又はその断片である、項１～１３のいずれかに記載の抗体又はその断片。
［項１５］
前記重鎖ＣＤＲ３が配列番号２１～２８のいずれかに示されるアミノ酸配列又はこれらのアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が変異しているアミノ酸配列からなり、
前記軽鎖ＣＤＲ３が配列番号４２～４８のいずれかに示されるアミノ酸配列又はこれらのアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が変異しているアミノ酸配列からなる、項１～１４のいずれかに記載の抗体又はその断片。
［項１６］
前記重鎖ＣＤＲ３が配列番号２１～２８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなり、
前記軽鎖ＣＤＲ３が配列番号４２～４８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなる、項１～１５のいずれかに記載の抗体又はその断片。
［項１７］
配列番号４～１１のいずれかに示されるアミノ酸配列又はこれらのアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が変異しているアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１と、
配列番号１２～２０のいずれかに示されるアミノ酸配列又はこれらのアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が変異しているアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２と、
配列番号２１～２８のいずれかに示されるアミノ酸配列又はこれらのアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が変異しているアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３と、
配列番号２９～３５のいずれかに示されるアミノ酸配列又はこれらのアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が変異しているアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１と、
YTN、YTD、YAD、YAN、DAS、GVK、RAK、GAK、又はTASのいずれかで示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２と、
配列番号４２～４８のいずれかに示されるアミノ酸配列又はこれらのアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が変異しているアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３と
を含む、項１～１６のいずれかに記載の抗体又はその断片。
［項１８］
配列番号４～１１のいずれかに示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ１と、
配列番号１２～２０のいずれかに示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ２と、
配列番号２１～２８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなる重鎖ＣＤＲ３と、
配列番号２９～３５のいずれかに示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ１と、
YTN、YTD、YAD、YAN、DAS、GVK、RAK、GAK、又はTASのいずれかで示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２と、
配列番号４２～４８のいずれかに示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ３と
を含む、項１～１７のいずれかに記載の抗体又はその断片。
［項１９］
さらに、配列番号３６～４１のいずれかに示されるアミノ酸配列又はこれらのアミノ酸配列において１～３個のアミノ酸が変異しているアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２のＣ末端に隣接する配列領域を含む、項１７又は１８に記載の抗体又はその断片。
［項２０］
さらに、配列番号３６～４１のいずれかに示されるアミノ酸配列からなる軽鎖ＣＤＲ２のＣ末端に隣接する配列領域を含む、項１７～１９のいずれかに記載の抗体又はその断片。
［項２１］
前記変異が保存的置換である、項１５、１７、及び１９のいずれかに記載の抗体又はその断片。
［項２２］
項１～２１のいずれかに記載の抗体の断片であって、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、又はｓｃＦｖである断片（抗原結合断片）。
［項２３］
項１～２１のいずれかに記載の抗体又はその断片、或いは、項２２に記載の断片を含む試薬。
［項２４］
５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインを有するＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、プローブ、及びデオキシリボヌクレオシド－５’－リン酸からなる群より選択される少なくとも一種を更に含む、項２３に記載の試薬。
［項２５］
前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、及びＺ０５ポリメラーゼからなる群から選択される、項２４に記載の試薬。
［項２６］
核酸増幅用試薬である、項２３～２５のいずれかに記載の試薬。
［項２７］
ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインに特異的に結合する抗体又はその断片（抗原結合断片）の製造方法であって、ＤＮＡポリメラーゼの一部（ここで、当該一部は５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインを含む）からなる免疫原で免疫した動物が産生する抗体から、ＤＮＡポリメラーゼの全体に対する結合能を有する抗体を選択する工程Ａを含む、製造方法。
［項２８］
前記免疫原が、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインからなる、項２７に記載の製造方法。
［項２９］
前記ＤＮＡポリメラーゼが、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、及びＺ０５ポリメラーゼからなる群から選択される、項２７又は２８に記載の製造方法。
［項３０］
前記免疫原が、Ｔｔｈポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインからなる、項２７～２９のいずれかに記載の製造方法。
［項３１］
工程Ａが、Ｔｔｈポリメラーゼの一部（ここで、当該一部は５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインを含む）からなる免疫原で免疫した動物が産生する抗体から、Ｔａｑポリメラーゼの全体に対する結合能を有する抗体を選択する工程である、項２７に記載の製造方法。
［項３２］
工程Ａが、Ｔｔｈポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインからなる免疫原で免疫した動物が産生する抗体から、Ｔａｑポリメラーゼの全体に対する結合能を有する抗体を選択する工程である、項２７に記載の製造方法。
［項３３］
項２７～３２のいずれかに記載の製造方法によって得られた抗体のアミノ酸配列に基づき、その一部のアミノ酸配列を遺伝子工学的手法により発現させる工程を含む、抗体断片（抗原結合断片）の製造方法。
［項３４］
３７℃で２４時間にわたりＤＮＡポリメラーゼと共存させた場合、該ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼに対する阻害能が６０％以上である、項１～２１のいずれかに記載の抗体又はその断片、或いは、項２２に記載の断片。
［項３５］
２５℃で２４時間にわたり基質ＤＮＡ（ここで、基質ＤＮＡは一本鎖であっても二本鎖であってもよく、基質ＤＮＡはプローブとしての機能を有していてもよい）と５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインを有するＤＮＡポリメラーゼとを共存させた場合、該基質ＤＮＡ分解率が４０％以下である、項１～２１及び３４のいずれかに記載の抗体又はその断片、或いは、項２２に記載の断片。
［項３６］
５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインを有するＤＮＡポリメラーゼと、プライマー、プローブ、及び核酸テンプレートからなる群より選択される少なくとも一種の核酸とを含む組成物を安定化するための試薬であって、項１～２１、３４、及び３５のいずれかに記載の抗体又はその断片、或いは、項２２に記載の断片を含む試薬。
［項３７］
５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインを有するＤＮＡポリメラーゼと、プライマー、プローブ、及び核酸テンプレートからなる群より選択される少なくとも一種の核酸とを含む組成物を安定化する方法であって、項１～２１、３４、及び３５のいずれかに記載の抗体又はその断片、或いは、項２２に記載の断片を前記組成物に添加する工程を含む、方法。
【発明の効果】
【0012】
本発明によって、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインに特異的に結合する抗体又はその断片、及び当該抗体又はその断片の有用な製造方法が提供される。例えば、当該抗体又はその断片を、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインを有するＤＮＡポリメラーゼとプライマー、プローブ等の核酸とを含む試薬に添加することにより、核酸の分解を抑制でき、試薬の安定性を向上させることが可能となる。また、前記試薬を用いて標的核酸を増幅する場合、核酸の分解による断片の発生を抑制することで、標的核酸の非特異増幅を抑制でき、標的核酸を高効率に増幅することができるので、非常に微量な標的核酸であっても高感度に検出することが可能となる。
【発明を実施するための形態】
【0013】
１．定義等
本明細書において、アミノ酸は、天然アミノ酸であっても非天然アミノ酸であってもよい。非天然アミノ酸としては、例えばシトルリン、オルニチン、ε－アセチル－リジン、β－アラニン、アミノ安息香酸、６－アミノカプロン酸、アミノ酪酸、ヒドロキシプロリン、メルカプトプロピオン酸、３－ニトロチロシン、ノルロイシン、ピログルタミン酸等が挙げられるが、これらに限定されない。また、アミノ酸は、例えばＬ－アミノ酸、Ｄ－アミノ酸、又はＤＬ－アミノ酸であってもよい。
本明細書において、アミノ酸は、天然アミノ酸であっても非天然アミノ酸であってもよい。非天然アミノ酸としては、例えばシトルリン、オルニチン、ε－アセチル－リジン、β－アラニン、アミノ安息香酸、６－アミノカプロン酸、アミノ酪酸、ヒドロキシプロリン、メルカプトプロピオン酸、３－ニトロチロシン、ノルロイシン、ピログルタミン酸等が挙げられるが、これらに限定されない。また、アミノ酸は、例えばＬ－アミノ酸、Ｄ－アミノ酸、又はＤＬ－アミノ酸であってもよい。
【0014】
本明細書において、アミノ酸配列の同一性とは、比較対象の２以上のアミノ酸配列を最適にアライメントさせたときのアミノ酸の一致の程度をいう。アミノ酸配列の同一性は、市販の又は電気通信回線（インターネット）を通じて利用可能な解析ツールを用いて算出することができ、例えば、市販のソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ（株式会社ゼネティックス社）を用いて、又は全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）の相同性アルゴリズムＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）においてデフォルト（初期設定）のパラメータを用いて算出することができる。
【0015】
本明細書に開示されるアミノ酸配列は、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼドメインに対する結合性を阻害しない限り、配列中の１個以上（例えば１、２、又は３個）のアミノ酸を欠失、置換、又は修飾してもよく、１個以上（例えば１、２、又は３個）のアミノ酸を配列に挿入又は付加してもよい。
【0016】
アミノ酸の置換は、構造及び／又は性質が類似する別のアミノ酸への置換（保存的置換）であることが好ましい。保存的置換は、例えば表１に示す群内での置換が挙げられる。
【0017】
【表1】
【0018】
アミノ酸の修飾としては、例えば、アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、スルフヒドリル（ＳＨ）基等の官能基の修飾が挙げられる。前記官能基の修飾は、例えばグリコシル化；メチル化；エステル化；アミド化；ＰＥＧ化；リン酸化；ヒドロキシル化；ｔ－ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）基、９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）基等の保護基との結合；ビオチニル化；フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等の蛍光色素との結合；ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）等の酵素との結合等であってもよい。
【0019】
本明細書において、抗体は、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。抗体は、任意のアイソタイプ、例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ等であることができる。抗体は、マウス抗体、ラット抗体、モルモット抗体、ヒト抗体等が挙げられるが、これらに限定されない。抗体は、モルモット－マウスキメラ抗体、マウス－ヒトキメラ抗体等のキメラ抗体であってもよい。
【0020】
本明細書において、抗体の断片としては、重鎖ＣＤＲ１～３及び軽鎖ＣＤＲ１～３を含む限り、特に制限されず、例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、ｄｉａｂｏｄｙ、ｔｒｉａｂｏｄｙ、ｔｅｔｒａｂｏｄｙ、ｍｉｎｉｂｏｄｙ等が挙げられる。好ましくは、抗体の断片は、抗原結合能を有する断片（抗原結合断片）である。
【0021】
本明細書において、重鎖ＣＤＲ１～３及び軽鎖ＣＤＲ１～３は、ＩＭＧＴ／ＢｌａｓｔＳｅａｒｃｈ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ｂｌａｓｔ／）による相同性検索によって特定される。
【0022】
ＤＮＡ、ＲＮＡ等のヌクレオチドには、次に例示するように公知の化学修飾が施されている類似体類であってもよい。例えば、ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えばホスホロチオエート（ＰＳ）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各リボヌクレオチドの糖（リボース）の２位の水酸基を、－ＯＲ（Ｒは、例えば－ＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（ＮＨ）ＮＨ２、－ＣＨ２ＣＯＮＨＣＨ３、－ＣＨ２ＣＨ２ＣＮ等を示す）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の５位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは２位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換等が挙げられる。さらには、リン酸部分やヒドロキシル部分が、例えばビオチン、アミノ基、低級アルキルアミン基、アセチル基等で修飾されたものなどを挙げることができるが、これらに限定されない。
【0023】
２．ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメイン（以下「ドメインＥ」と表記する）に特異的に結合する抗体
本発明の抗体又はその断片は、ＤＮＡポリメラーゼのドメインＥに特異的に結合することにより、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を阻害することができ、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性阻害剤として有用である。本発明の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性阻害剤は抗体であるので、特異性が高く、また加熱等で阻害活性を失活させることもできるのでホットスタート法にも適用させ易いという利点がある。ＤＮＡポリメラーゼは、ドメインＥを有する限り、特に限定されない。ＤＮＡポリメラーゼは、野生型のＤＮＡポリメラーゼであってもよく、該ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を任意の宿主細胞へ導入して得られた組換えＤＮＡポリメラーゼであってもよく、該遺伝子を改変したＤＮＡポリメラーゼであってもよい。例えば、ＤＮＡポリメラーゼは、野生型ではドメインＥを有さないＤＮＡポリメラーゼにドメインＥを融合したＤＮＡポリメラーゼであってもよい。
本発明の抗体又はその断片は、ＤＮＡポリメラーゼのドメインＥに特異的に結合することにより、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を阻害することができ、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性阻害剤として有用である。本発明の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性阻害剤は抗体であるので、特異性が高く、また加熱等で阻害活性を失活させることもできるのでホットスタート法にも適用させ易いという利点がある。ＤＮＡポリメラーゼは、ドメインＥを有する限り、特に限定されない。ＤＮＡポリメラーゼは、野生型のＤＮＡポリメラーゼであってもよく、該ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を任意の宿主細胞へ導入して得られた組換えＤＮＡポリメラーゼであってもよく、該遺伝子を改変したＤＮＡポリメラーゼであってもよい。例えば、ＤＮＡポリメラーゼは、野生型ではドメインＥを有さないＤＮＡポリメラーゼにドメインＥを融合したＤＮＡポリメラーゼであってもよい。
【0024】
一実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであることが好ましい。ここで、「耐熱性」とは、例えば６０℃で３０分間のように高温で熱処理しても、ＤＮＡポリメラーゼ活性を好ましくは５０％以上保持している性質をいう。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＨＢ８由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈポリメラーゼ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐ Ｚ０５由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｚ０５ポリメラーゼ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｃａポリメラーゼ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔポリメラーゼ）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｅｎｓｉｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（ＫＯＤポリメラーゼ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｆｕポリメラーゼ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｗｏｅｓｅｉ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｗｏポリメラーゼ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｂｒポリメラーゼ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｆｉポリメラーゼ）、Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｆｌポリメラーゼ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｍａポリメラーゼ）、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｎｅポリメラーゼ）、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ由来のＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔポリメラーゼ）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ＧＢ－Ｄ由来のＤＮＡポリメラーゼ（ＤＥＥＰＶＥＮＴポリメラーゼ）等が挙げられるが、これらに限定されない。なお、Ｔａｑポリメラーゼ等の用語には変異体も含まれる。ここで、変異体とは、元のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、ポリメラーゼ活性、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性、及び耐熱性等の酵素学的性質が維持されているものをいう。変異体のポリメラーゼ活性ドメインは、元のＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性ドメインのアミノ酸配列に対して８５％以上（好ましくは９０％以上又は９５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなることが好ましい。変異体のドメインＥは、元のＤＮＡポリメラーゼのドメインＥのアミノ酸配列に対して８５％以上（好ましくは９０％以上又は９５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなることが好ましい。変異体におけるアミノ酸の変異は保存的置換であることが好ましい。
【0025】
一実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｆａｍｉｌｙ Ａに属するＤＮＡポリメラーゼであることが好ましい。Ｆａｍｉｌｙ Ａに属するＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、Ｚ０５ポリメラーゼ、Ｔｍａポリメラーゼ、Ｂｃａポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ等が挙げられるが、これらに限定されない。
【0026】
ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、及びＺ０５ポリメラーゼからなる群より選択される少なくとも１種であることが好ましい。特定の実施形態では、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、及びＺ０５ポリメラーゼからなる群より選択される２種以上のＤＮＡポリメラーゼであることが好ましく、Ｔａｑポリメラーゼと、Ｔｔｈポリメラーゼ及びＺ０５ポリメラーゼからなる群より選択される少なくとも１種との組合せであることがより好ましい。
【0027】
ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性は以下のようにして測定する。なお、ポリメラーゼ活性が強い場合には、保存緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０），５０ｍＭ ＫＣｌ，１ｍＭ ジチオスレイトール，０．１％（ｖ／ｖ） ポリエチレングリコールソルビタンモノラウラート（Ｔｗｅｅｎ(商標) ２０），０．１％（ｖ／ｖ） オクチルフェニル－ポリエチレングリコール（Ｎｏｎｉｄｅｔ(商標) Ｐ４０），５０％（ｖ／ｖ） グリセリン）でＤＮＡポリメラーゼ溶液を希釈してから以下のようにして測定を行う。
（１）下記のＡ液２５μｌ、Ｂ液５μｌ、Ｃ液５μｌ、滅菌水１０μｌ、及びＤＮＡポリメラーゼ溶液５μｌをマイクロチューブに加えて７５℃にて１０分間反応する。
（２）その後氷冷し、Ｅ液５０μｌ及びＤ液１００μｌを加えて、攪拌後更に１０分間氷冷する。
（３）この液をガラスフィルター（ワットマン製ＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、０．１Ｎ 塩酸及びエタノールで十分洗浄する。
（４）フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード製）で計測し、鋳型ＤＮＡのヌクレオチドの取り込みを測定する。ポリメラーゼ活性の１単位（ユニット）はこの条件で３０分当りの１０ｎｍｏｌのヌクレオチドを酸不溶性画分（即ち、Ｄ液を添加したときに不溶化する画分）に取り込むＤＮＡポリメラーゼ量とする。
Ａ液：４０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）１６ｍＭ 塩化マグネシウム１５ｍＭ ジチオスレイトール１００μｇ／ｍＬ ＢＳＡ（牛血清アルブミン）
Ｂ液：１．５μｇ／μｌ 活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ液：１．５ｍＭ ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ ［３Ｈ］ｄＴＴＰ）
Ｄ液：２０％(w/v) トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸ナトリウム）
Ｅ液：１ｍｇ／ｍＬ 仔牛胸腺ＤＮＡ
（１）下記のＡ液２５μｌ、Ｂ液５μｌ、Ｃ液５μｌ、滅菌水１０μｌ、及びＤＮＡポリメラーゼ溶液５μｌをマイクロチューブに加えて７５℃にて１０分間反応する。
（２）その後氷冷し、Ｅ液５０μｌ及びＤ液１００μｌを加えて、攪拌後更に１０分間氷冷する。
（３）この液をガラスフィルター（ワットマン製ＧＦ／Ｃフィルター）で濾過し、０．１Ｎ 塩酸及びエタノールで十分洗浄する。
（４）フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター（パッカード製）で計測し、鋳型ＤＮＡのヌクレオチドの取り込みを測定する。ポリメラーゼ活性の１単位（ユニット）はこの条件で３０分当りの１０ｎｍｏｌのヌクレオチドを酸不溶性画分（即ち、Ｄ液を添加したときに不溶化する画分）に取り込むＤＮＡポリメラーゼ量とする。
Ａ液：４０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）１６ｍＭ 塩化マグネシウム１５ｍＭ ジチオスレイトール１００μｇ／ｍＬ ＢＳＡ（牛血清アルブミン）
Ｂ液：１．５μｇ／μｌ 活性化仔牛胸腺ＤＮＡ
Ｃ液：１．５ｍＭ ｄＮＴＰ（２５０ｃｐｍ／ｐｍｏｌ ［３Ｈ］ｄＴＴＰ）
Ｄ液：２０％(w/v) トリクロロ酢酸（２ｍＭピロリン酸ナトリウム）
Ｅ液：１ｍｇ／ｍＬ 仔牛胸腺ＤＮＡ
【0028】
一実施形態において、本発明の抗体又はその断片は、
配列番号１：
に示されるアミノ酸配列（Ｔａｑポリメラーゼ（野生型）のＥドメインのアミノ酸配列）、
配列番号２：
に示されるアミノ酸配列（Ｔｔｈポリメラーゼ（野生型）のＥドメインのアミノ酸配列）、
配列番号３：
に示されるアミノ酸配列（Ｚ０５ポリメラーゼ（野生型）のＥドメインのアミノ酸配列）、及び
これらのアミノ酸配列に対して８０％以上（好ましくは８５％以上、９０％以上、又は９５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列
からなる群より選択される少なくとも一種のＥドメインに結合することが好ましい。
配列番号１：
配列番号２：
配列番号３：
これらのアミノ酸配列に対して８０％以上（好ましくは８５％以上、９０％以上、又は９５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列
からなる群より選択される少なくとも一種のＥドメインに結合することが好ましい。
【0029】
一実施形態において、本発明の抗体又はその断片は、上記の配列番号１～３のいずれかで示すアミノ酸配列において四角形で囲った４つのアミノ酸領域のいずれかのアミノ酸領域の一部又は全部を少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つ）のエピトープとして結合（又は認識）するものであることが好ましい。上記の四角形で囲った４つのアミノ酸領域のうち、配列番号１のＮ末端から５６～６６番目のアミノ酸領域又は配列番号２若しくは３のＮ末端から５６～６７番目のアミノ酸領域を「アミノ酸領域Ａ」といい；配列番号１のＮ末端から７５～８１番目のアミノ酸領域又は配列番号２若しくは３のＮ末端から７６～８２番目のアミノ酸領域を「アミノ酸領域Ｂ」といい；配列番号１のＮ末端から１６１～１８２番目のアミノ酸領域又は配列番号２若しくは３のＮ末端から１６２～１８３番目のアミノ酸領域を「アミノ酸領域Ｃ」といい；配列番号１のＮ末端から２６９～２８５番目のアミノ酸領域又は配列番号２若しくは３の２７１～２８７番目のアミノ酸領域を「アミノ酸領域Ｄ」という。Ｔａｑポリメラーゼを始めとするｐｏｌＩポリメラーゼファミリーは、Ｎ末端から２００番目付近までに保存性が特に高い領域が複数存在することが知られている（Ｋｉｍ Ｙら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ，Ｖｏｌ．７，Ｎｏ４，ｐｐ．４６８－４７２(参照することによりその全体が明細書に組み込まれる)）。本発明の抗体又はその断片は、ｐｏｌＩポリメラーゼのＮ末端から２００番目付近の領域（例えば、アミノ酸領域Ａ～Ｃ）内に存在する少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つ）のエピトープに結合する抗体又はその断片であることが特に好ましい。このような観点から、本発明の抗体又はその断片は、アミノ酸領域Ａ及び／又はアミノ酸領域Ｂの一部又は全部を少なくとも１つのエピトープとして結合するものであることが好ましい。特定の実施形態では、少なくともアミノ酸領域Ａの一部又は全部と、アミノ酸領域Ｃ又はＤのいずれかの一部又は全部（特に一部）とをエピトープとして結合する抗体又はその断片であることが好ましい。更に別の実施形態では、少なくともアミノ酸領域Ｂの一部又は全部（特に全部）と、アミノ酸領域Ｃ又はＤのいずれかの一部又は全部（特に一部）とをエピトープとして結合する抗体又はその断片であることが好ましい。
【0030】
アミノ酸領域Ａの一部又は全部のエピトープとしては、例えば、ＥＤＧＤＡＶＩＶＶＦ（配列番号６０）、ＫＥＤＧＤＡＶＩＶＶＦ（配列番号６１）、ＥＤＧＹＫＡＶＦＶＶＦ（配列番号６２）、ＫＥＤＧＹＫＡＶＦＶＶＦ（配列番号６３）が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、アミノ酸領域Ａの一部又は全部のエピトープは、配列番号６０又は６２を含むことが好ましい。好適な実施形態において、アミノ酸領域Ａの一部又は全部のエピトープは、配列番号６０、６１、又は６２であり、配列番号６１又は６２であることがより好ましい。
アミノ酸領域Ｂの一部又は全部のエピトープとしては、例えば、ＨＥＡＹＧＧＹ（配列番号６４）、ＨＥＡＹＥＡＹ（配列番号６５）が挙げられるが、これらに限定されない。
アミノ酸領域Ｃの一部又は全部のエピトープとしては、例えば、ＨＬＩＴＰＥＷＬＷ（配列番号６６）、ＫＹＧＬＲＰＥＱＷＶＤＦ（配列番号６７）、ＥＫＹＧＬＲＰＤＱＷＡＤＹ（配列番号６８）、ＫＹＧＬＲＰＤＱＷＡＤＹ（配列番号６９）、ＧＬＲＰＥＱＷＶＤＦ（配列番号７０）、ＩＴＰＥＷＬＷ（配列番号７１）、ＹＬＩＴＰＡＷＬＷＥＫＹＧＬＲＰＤＱＷＡＤＹ（配列番号７２）、ＨＬＩＴＰＥＷＬＷＥＫＹＧＬＲＰＥＱＷＶＤＦ（配列番号７３）、ＨＬＩＴＰＥＷＬＷＥＫＹＧＬＫＰＥＱＷＶＤＦ（配列番号７４）が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、アミノ酸領域Ｃの一部又は全部のエピトープは、配列番号６８、７０、又は７１を含むことが好ましい。好適な実施形態において、アミノ酸領域Ｃの一部又は全部のエピトープは、配列番号６６、６７、６８、７０、又は７１である。
アミノ酸領域Ｄの一部又は全部のエピトープとしては、例えば、ＬＥＲＬＥＦ（配列番号７５）、ＬＥＲＬＥＦＧＳＬＬＨ（配列番号７６）、ＬＥＲＬＥＦＧＳＬＬＨＥＦ（配列番号７７）、ＬＲＡＦＬＥＲＬＥＦ（配列番号７８）、ＲＡＦＬＥＲＬＥＦ（配列番号７９）、ＲＡＦＬＥＲＬＥＦＧＳＬＬＨ（配列番号８０）、ＬＥＦＧＳＬＬＨ（配列番号８１）、ＬＥＦＧＳＬＬＨＥＦ（配列番号８２）、ＬＲＡＦＬＥＲＬＥＦＧＳＬＬＨＥＦ（配列番号８３）が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、アミノ酸領域Ｄの一部又は全部のエピトープは、配列番号７５、７６、７８、７９、又は８１を含むことが好ましい。好適な実施形態において、アミノ酸領域Ｄの一部又は全部のエピトープは、配列番号７７、７８、８０、又は８２である。
アミノ酸領域Ｂの一部又は全部のエピトープとしては、例えば、ＨＥＡＹＧＧＹ（配列番号６４）、ＨＥＡＹＥＡＹ（配列番号６５）が挙げられるが、これらに限定されない。
アミノ酸領域Ｃの一部又は全部のエピトープとしては、例えば、ＨＬＩＴＰＥＷＬＷ（配列番号６６）、ＫＹＧＬＲＰＥＱＷＶＤＦ（配列番号６７）、ＥＫＹＧＬＲＰＤＱＷＡＤＹ（配列番号６８）、ＫＹＧＬＲＰＤＱＷＡＤＹ（配列番号６９）、ＧＬＲＰＥＱＷＶＤＦ（配列番号７０）、ＩＴＰＥＷＬＷ（配列番号７１）、ＹＬＩＴＰＡＷＬＷＥＫＹＧＬＲＰＤＱＷＡＤＹ（配列番号７２）、ＨＬＩＴＰＥＷＬＷＥＫＹＧＬＲＰＥＱＷＶＤＦ（配列番号７３）、ＨＬＩＴＰＥＷＬＷＥＫＹＧＬＫＰＥＱＷＶＤＦ（配列番号７４）が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、アミノ酸領域Ｃの一部又は全部のエピトープは、配列番号６８、７０、又は７１を含むことが好ましい。好適な実施形態において、アミノ酸領域Ｃの一部又は全部のエピトープは、配列番号６６、６７、６８、７０、又は７１である。
アミノ酸領域Ｄの一部又は全部のエピトープとしては、例えば、ＬＥＲＬＥＦ（配列番号７５）、ＬＥＲＬＥＦＧＳＬＬＨ（配列番号７６）、ＬＥＲＬＥＦＧＳＬＬＨＥＦ（配列番号７７）、ＬＲＡＦＬＥＲＬＥＦ（配列番号７８）、ＲＡＦＬＥＲＬＥＦ（配列番号７９）、ＲＡＦＬＥＲＬＥＦＧＳＬＬＨ（配列番号８０）、ＬＥＦＧＳＬＬＨ（配列番号８１）、ＬＥＦＧＳＬＬＨＥＦ（配列番号８２）、ＬＲＡＦＬＥＲＬＥＦＧＳＬＬＨＥＦ（配列番号８３）が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態において、アミノ酸領域Ｄの一部又は全部のエピトープは、配列番号７５、７６、７８、７９、又は８１を含むことが好ましい。好適な実施形態において、アミノ酸領域Ｄの一部又は全部のエピトープは、配列番号７７、７８、８０、又は８２である。
【0031】
前記エピトープの長さは特に限定されないが、例えば、５～２５残基で構成され、６～２０残基で構成されることが好ましく、６～１５残基で構成されることがより好ましく、７～１４残基で構成されることがさらに好ましい。
【0032】
一実施態様において、本発明の抗体又はその断片の重鎖ＣＤＲ１は、下記のアミノ酸配列からなることが好ましい：
・表２に示す式（Ａ－１）で表されるアミノ酸配列、
・当該アミノ酸配列に対して９０％以上（好ましくは９５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、又は
・当該アミノ酸配列の１～３個（好ましくは１又は２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が変異（好ましくは保存的置換）しているアミノ酸配列。
・表２に示す式（Ａ－１）で表されるアミノ酸配列、
・当該アミノ酸配列に対して９０％以上（好ましくは９５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、又は
・当該アミノ酸配列の１～３個（好ましくは１又は２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が変異（好ましくは保存的置換）しているアミノ酸配列。
【0033】
【表2】
【0034】
式（Ａ－１）において、ＸＡ３は好ましくはＴであり、ＸＡ４は好ましくはＦであり、ＸＡ５は好ましくはＤ、Ｎ、又はＳであり、ＸＡ６は好ましくはＤ、Ｎ、Ｓ、Ｋ、又はＨ、或いは、Ｄ、Ｎ、Ｓ、又はＨであり、ＸＡ７は好ましくはＹ又はＷ、或いは、Ｙであり、ＸＡ８は好ましくはＧ、Ｗ、又はＹである。
【0035】
本発明の抗体又はその断片の重鎖ＣＤＲ１は、好ましくは式（Ａ－１－１）で表されるアミノ酸配列、さらに好ましくは式（Ａ－１－２）～（Ａ－１－９）からなる群より選択されるアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる。前記同一性は、好ましくは９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、又は９５％以上である。
【0036】
一実施態様において、本発明の抗体又はその断片の重鎖ＣＤＲ２は、下記のアミノ酸配列からなることが好ましい：
・表３に示す式（Ｂ－１）で表されるアミノ酸配列、
・当該アミノ酸配列に対して９０％以上（好ましくは９５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、又は
・当該アミノ酸配列の１～３個（好ましくは１又は２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が変異（好ましくは保存的置換）しているアミノ酸配列。
・表３に示す式（Ｂ－１）で表されるアミノ酸配列、
・当該アミノ酸配列に対して９０％以上（好ましくは９５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、又は
・当該アミノ酸配列の１～３個（好ましくは１又は２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が変異（好ましくは保存的置換）しているアミノ酸配列。
【0037】
【表3】
【0038】
式（Ｂ－１）において、ＸＢ２は好ましくはＧ、Ｓ、Ｔ、Ｋ、又はＮ、Ｇ、Ｓ、又はＫ、或いは、Ｓであり、ＸＢ３は好ましくはＹ、Ｌ、Ｇ、Ｔ、又はＮ、さらに好ましくはＬ、Ｇ、又はＮ、Ｌ又はＮ、或いは、Ｙ、Ｇ、又はＴであり、ＸＢ４は好ましくはＧ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、又はＨ、さらに好ましくはＧ、Ｓ、Ｔ、又はＤ、Ｓ又はＴ、或いは、Ｇ、Ｄ、又はＨであり、ＸＢ５は好ましくはＧ又はＳ、或いは、Ｇであり、ＸＢ６は好ましくはＧ、Ｓ、Ｔ、又はＤ、Ｇ、Ｓ、又はＴ、或いは、Ｇ又はＳであり、ＸＢ７は好ましくはＳ、Ｔ、Ｙ、Ｄ、又はＨ、さらに好ましくはＳ、Ｔ、又はＹ、Ｓ又はＴ、或いは、Ｔ、Ｙ、Ｄ、又はＨであり、ＸＢ８は好ましくはＳ、Ｔ、Ｖ、Ｉ、又はＭ、さらに好ましくはＳ、Ｔ、又はＩ、Ｓ又はＴ、或いは、Ｔ、Ｖ、Ｉ、又はＭである。
【0039】
本発明の抗体又はその断片の重鎖ＣＤＲ２は、好ましくは式（Ｂ－１－１）で表されるアミノ酸配列、さらに好ましくは式（Ｂ－１－２）～（Ｂ－１－１０）からなる群より選択されるアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる。前記同一性は、好ましくは９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、又は９５％以上である。
【0040】
一実施態様において、本発明の抗体又はその断片の重鎖ＣＤＲ３は、下記のアミノ酸配列からなることが好ましい：
・表４に示す式（Ｃ－１）～（Ｃ－６）のいずれかで表されるアミノ酸配列、
・当該アミノ酸配列に対して９０％以上（好ましくは９５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、又は
・当該アミノ酸配列の１～３個（好ましくは１又は２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が変異（好ましくは保存的置換）しているアミノ酸配列。
・表４に示す式（Ｃ－１）～（Ｃ－６）のいずれかで表されるアミノ酸配列、
・当該アミノ酸配列に対して９０％以上（好ましくは９５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、又は
・当該アミノ酸配列の１～３個（好ましくは１又は２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が変異（好ましくは保存的置換）しているアミノ酸配列。
【0041】
【表4】
【0042】
式（Ｃ－１）において、ＸＣ１は好ましくはＡ又はＲ、さらに好ましくはＲであり、ＸＣ２は好ましくはＰ又はＲ、さらに好ましくはＲであり、ＸＣ３は好ましくはＴ又はＩ、さらに好ましくはＴであり、ＸＣ４は好ましくはＶ又はＬ、さらに好ましくはＶであり、ＸＣ５は好ましくはＰ又はＡ、さらに好ましくはＰであり、ＸＣ６は好ましくはＴ又はＹ、さらに好ましくはＴであり、ＸＣ７は好ましくはＶ、Ｔ、又はＮ、さらに好ましくはＶである。
【0043】
式（Ｃ－２）において、ＸＣ１は好ましくはＡ又はＲ、さらに好ましくはＡであり、ＸＣ２は好ましくはＰ又はＲ、さらに好ましくはＰであり、ＸＣ３は好ましくはＴ又はＩ、さらに好ましくはＩであり、ＸＣ４は好ましくはＶ又はＬであり、ＸＣ５は好ましくはＰ又はＡ、さらに好ましくはＡであり、ＸＣ６は好ましくはＴ又はＹ、さらに好ましくはＹであり、ＸＣ７は好ましくはＶ、Ｔ、又はＮ、さらに好ましくはＶ又はＴである。
【0044】
式（Ｃ－３）において、ＸＣ７は好ましくはＶ、Ｔ、又はＮ、さらに好ましくはＮである。
【0045】
式（Ｃ－５）において、ＸＣ７は好ましくはＶ、Ｔ、又はＮ、さらに好ましくはＶである。
【0046】
式（Ｃ－６）において、ＸＣ７は好ましくはＶ、Ｔ、又はＮ、さらに好ましくはＶである。
【0047】
本発明の抗体又はその断片の重鎖ＣＤＲ３は、好ましくは式（Ｃ－１－１）、（Ｃ－２－１）、（Ｃ－３－１）、（Ｃ－４）、（Ｃ－５－１）、及び（Ｃ－６－１）からなる群より選択されるアミノ酸配列、さらに好ましくは（Ｃ－１－２）、（Ｃ－２－２）、（Ｃ－２－３）、（Ｃ－３－２）、（Ｃ－３－３）、（Ｃ－４）、（Ｃ－５－２）、及び（Ｃ－６－２）からなる群より選択されるアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる。前記同一性は、好ましくは９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、又は９５％以上である。
【0048】
一実施態様において、本発明の抗体又はその断片の軽鎖ＣＤＲ１は、下記のアミノ酸配列からなることが好ましい：
・表５に示す式（Ｄ－１）で表されるアミノ酸配列、
・当該アミノ酸配列に対して９０％以上（好ましくは９５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、又は
・当該アミノ酸配列の１～３個（好ましくは１又は２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が変異（好ましくは保存的置換）しているアミノ酸配列。
・表５に示す式（Ｄ－１）で表されるアミノ酸配列、
・当該アミノ酸配列に対して９０％以上（好ましくは９５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、又は
・当該アミノ酸配列の１～３個（好ましくは１又は２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が変異（好ましくは保存的置換）しているアミノ酸配列。
【0049】
【表5】
【0050】
式（Ｄ－１）において、ＸＤ１は好ましくはＱであり、ＸＤ２は好ましくはＧ又はＳであり、ＸＤ３は好ましくはＶ又はＩであり、ＸＤ４は好ましくはＳ又はＫであり、ＸＤ５は好ましくはＳ、Ｎ、又はＫ、或いは、Ｓ又はＮであり、ＸＤ６は好ましくはＦ又はＹ、或いは、Ｙである。
【0051】
本発明の抗体又はその断片の軽鎖ＣＤＲ１は、好ましくは式（Ｄ－１－１）で表されるアミノ酸配列、さらに好ましくは（Ｄ－１－２）～（Ｄ－１－８）からなる群より選択されるアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる。前記同一性は、好ましくは９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、又は９５％以上である。
【0052】
一実施態様において、本発明の抗体又はその断片の軽鎖ＣＤＲ２は、下記のアミノ酸配列からなることが好ましい：
・表６Ａに示す式（Ｅ－１）で表されるアミノ酸配列、
・当該アミノ酸配列に対して９０％以上（好ましくは９５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、又は
・当該アミノ酸配列の１～３個（好ましくは１又は２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が変異（好ましくは保存的置換）しているアミノ酸配列。
・表６Ａに示す式（Ｅ－１）で表されるアミノ酸配列、
・当該アミノ酸配列に対して９０％以上（好ましくは９５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、又は
・当該アミノ酸配列の１～３個（好ましくは１又は２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が変異（好ましくは保存的置換）しているアミノ酸配列。
【0053】
【表6A】
【0054】
式（Ｅ－１）において、ＸＥ１は好ましくはＧ、Ｔ、Ｄ、Ｙ、又はＲ、より好ましくはＧ、Ｙ、又はＲ、或いは、Ｇ、Ｔ、Ｄ、又はＲ、さらに好ましくはＹ、或いは、Ｇ、Ｔ、Ｄ、又はＲであり、ＸＥ２は好ましくはＡ、Ｔ、又はＶ、さらに好ましくはＡ又はＴ、或いは、Ａ又はＶであり、ＸＥ３は好ましくはＫ、Ｄ、Ｎ、又はＳ、より好ましくはＫ、Ｄ、又はＮ、或いは、Ｋ又はＳ、さらに好ましくはＤ又はＮ、或いは、Ｋ又はＳである。
【0055】
本発明の抗体又はその断片の軽鎖ＣＤＲ２は、好ましくは式（Ｅ－１－１）で表されるアミノ酸配列、より好ましくは（Ｅ－１－２）又は（Ｅ－１－３）で表されるアミノ酸配列、さらに好ましくは（Ｅ－１－４）～（Ｅ－１－１２）からなる群より選択されるアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる。前記同一性は、好ましくは９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、又は９５％以上である。
【0056】
一実施態様において、本発明の抗体又はその断片の軽鎖ＣＤＲ２のＣ末端には、下記のアミノ酸配列が隣接していることが好ましい：
・表６Ｂに示す式（Ｅ－２）で表されるアミノ酸配列、
・当該アミノ酸配列に対して９０％以上（好ましくは９５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、又は
・当該アミノ酸配列の１～３個（好ましくは１又は２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が変異（好ましくは保存的置換）しているアミノ酸配列。
・表６Ｂに示す式（Ｅ－２）で表されるアミノ酸配列、
・当該アミノ酸配列に対して９０％以上（好ましくは９５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、又は
・当該アミノ酸配列の１～３個（好ましくは１又は２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が変異（好ましくは保存的置換）しているアミノ酸配列。
【0057】
【表6B】
【0058】
式（Ｅ－２）において、ＸＥ４は好ましくはＳ、Ｒ、Ｎ、Ｙ、又はＴ、さらに好ましくはＳ、或いは、Ｒ、Ｎ、Ｙ、又はＴであり、ＸＥ５は好ましくはＬ又はＲ、或いは、Ｌであり、ＸＥ６は好ましくはＡ、Ｐ、又はＹ、さらに好ましくはＡ又はＰ、或いは、Ａ又はＹであり、ＸＥ７は好ましくはＳ又はＴ、或いは、Ｓである。
【0059】
本発明の抗体又はその断片の軽鎖ＣＤＲ２のＣ末端には、好ましくは式（Ｅ－２－１）又は（Ｅ－２－２）で表されるアミノ酸配列、さらに好ましくは（Ｅ－２－３）～（Ｅ－２－８）からなる群より選択されるアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列が隣接している。前記同一性は、好ましくは９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、又は９５％以上である。
【0060】
本発明の抗体又はその断片の軽鎖ＣＤＲ２のＮ末端に隣接するアミノ酸は、特に限定されないが、Ｙ、Ｆ、又はＨであることが好ましく、これらのアミノ酸が保存的置換されていることも好ましい。
【0061】
一実施態様において、本発明の抗体又はその断片の軽鎖ＣＤＲ３は、下記のアミノ酸配列からなることが好ましい：
・表７に示す式（Ｆ－１）又は（Ｆ－２）で表されるアミノ酸配列、
・当該アミノ酸配列に対して９０％以上（好ましくは９５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、又は
・当該アミノ酸配列の１～３個（好ましくは１又は２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が変異（好ましくは保存的置換）しているアミノ酸配列。
・表７に示す式（Ｆ－１）又は（Ｆ－２）で表されるアミノ酸配列、
・当該アミノ酸配列に対して９０％以上（好ましくは９５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列、又は
・当該アミノ酸配列の１～３個（好ましくは１又は２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が変異（好ましくは保存的置換）しているアミノ酸配列。
【0062】
【表7】
【0063】
式（Ｆ－１）において、ＸＦ１は好ましくはＬ、Ｑ、Ｆ、又はＹ、より好ましくはＬ、Ｑ、又はＹ、或いは、Ｑ、Ｆ、又はＹ、さらに好ましくはＬ、Ｑ、又はＹ、或いは、Ｑ又はＦであり、ＸＦ２は好ましくはＱであり、ＸＦ３は好ましくはＳ又はＹ、或いは、Ｙであり、ＸＦ４は好ましくはＧ、Ｎ、Ｑ、又はＹ、さらに好ましくはＮ、Ｑ、又はＹ；Ｇ、Ｑ、又はＹ；Ｇ、Ｎ、又はＹ；或いはＧ又はＹであり、ＸＦ５は好ましくはＳ、Ｎ、又はＩ、さらに好ましくはＳ又はＩ、或いは、Ｓ又はＮであり、ＸＦ６は好ましくはＧ、Ｓ、Ｙ、又はＷ、さらに好ましくはＧ、Ｙ、又はＷ；Ｓ、Ｙ、又はＷ；或いは、Ｇ又はＳであり、ＸＦ７は好ましくはＳ、Ｐ、又はＷ、さらに好ましくはＰ又はＷ；Ｓ又はＰ；或いはＰであり、ＸＦ８は好ましくはＬ、Ｐ、Ｈ、又はＹ、さらに好ましくはＬ、Ｈ、Ｙ、又はＴ、或いは、Ｐである。
【0064】
本発明の抗体又はその断片の軽鎖ＣＤＲ３は、好ましくは式（Ｆ－１－１）又は（Ｆ－２－１）で表されるアミノ酸配列、さらに好ましくは（Ｆ－１－２）～（Ｆ－１－５）及び（Ｆ－２－２）～（Ｆ－２－４）で表されるアミノ酸配列、又は当該アミノ酸配列に対して９０％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなる。前記同一性は、好ましくは９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、又は９５％以上である。
【0065】
本発明の抗体又はその断片の重鎖ＣＤＲ１～３及び軽鎖ＣＤＲ１～３の組合せの好適な例を表８Ａに示す。
【0066】
【表8A】
【0067】
本発明の抗体又はその断片の重鎖ＣＤＲ１～３、軽鎖ＣＤＲ１～３、及び軽鎖ＣＤＲ２のＣ末端に隣接する配列の組合せの好適な例を表８Ｂに示す。
【0068】
【表8B】
【0069】
組合せＣ１４～Ｃ２６において、重鎖ＣＤＲ１～３、軽鎖ＣＤＲ１～３、及び軽鎖ＣＤＲ２のＣ末端に隣接する配列のうち少なくとも１個のアミノ酸配列において、１～３個（好ましくは１又は２個、さらに好ましくは１個）のアミノ酸が変異（好ましくは保存的置換）しているものも好ましい。
【0070】
重鎖ＣＤＲ１～３及び軽鎖ＣＤＲ１～３以外の領域は、抗体に使用し得るものであれば、特に制限されず、任意のアミノ酸配列とすることができる。定常領域としては、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＭの定常領域等を使用することができるが、これらに限定されない。また、定常領域は、任意の動物、例えば、マウス、ハムスター、ラット、モルモット、ウサギ、フェレット、ヤギ、サル、ヒト等の哺乳類に由来する定常領域であってもよく、例えば、配列番号５１及び５２に示されるアミノ酸配列（モルモット由来の重鎖及び軽鎖定常領域）、配列番号５３及び５４に示されるアミノ酸配列（マウス由来の重鎖及び軽鎖定常領域）、これらのアミノ酸配列に対して８０％以上（好ましくは８５％以上、９０％以上、又は９５％以上）の同一性を有するアミノ酸配列からなる配列領域が挙げられる。
【0071】
ＤＮＡポリメラーゼのドメインＥに対する、本発明の抗体又はその断片の平衡解離定数（ＫＤ）は、例えば５０ｎＭ以下、好ましくは１０ｎＭ以下であり、例えば１ｐＭ以上である。ＫＤは、例えば後述の実施例のように、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｘ１００（Ｃｙｔｉｖａ社）を用いて測定することができる。具体的には、ＮＨＳ（Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ）及びＥＤＣ（Ｎ－ｅｔｈｙｌ－Ｎ’－（３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）を利用したアミンカップリング反応によって、ＣＭ５センサーチップ（Ｃｙｔｉｖａ社）のカルボキシメチルデキストランにリガンド（５’→３’エキソヌクレアーゼ活性ドメインを有するＤＮＡポリメラーゼ）を固定化し、１Ｍ エタノールアミン塩酸塩溶液でブロッキングを行ってリガンドを固定化したフローセルを用意し、次いで、段階希釈した抗体を前記フローセル上に添加して反応シグナルを解析することによって、ＫＤを算出することができる。
【0072】
一つの実施形態では、本発明の抗体又はその断片について、３７℃で２４時間にわたりＤＮＡポリメラーゼと共存させた場合、該ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する阻害能は、例えば、５０％以上、好ましくは６０％以上、７０％以上、８０％以上、又は９０％以上である。当該阻害能は、後述の実施例のように、下記の成分：
放射性同位元素で標識した基質核酸λＤＮＡ；
ＤＮＡポリメラーゼ単独（１ユニット（Ｕ)）、又は、ＤＮＡポリメラーゼ（１Ｕ）及び本発明の抗体又はその断片（０．００５μｇ／μＬ）；
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．６）；
５０ｍＭ ＫＣｌ；及び
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２
を含む溶液を３７℃で２４時間インキュベートした際に遊離する標識塩基の放射能を測定し、下記式により算出することができる。
５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する阻害能（％）＝（Ｎ２－Ｎ３）÷（Ｎ２－Ｎ１）×１００
Ｎ１：本発明の抗体又はその断片を含まない溶液を３７℃で２４時間インキュベートする前（又は－２０℃で２４時間インキュベートした後）の遊離ヌクレオチドの量、或いは、本発明の抗体又はその断片もＤＮＡポリメラーゼも含まない溶液を３７℃で２４時間インキュベートした後の遊離ヌクレオチドの量
Ｎ２：本発明の抗体又はその断片を含まない溶液を３７℃で２４時間インキュベートした後の遊離ヌクレオチドの量
Ｎ３：本発明の抗体又はその断片を含む溶液を３７℃で２４時間インキュベートした後の遊離ヌクレオチドの量
放射性同位元素で標識した基質核酸λＤＮＡ；
ＤＮＡポリメラーゼ単独（１ユニット（Ｕ)）、又は、ＤＮＡポリメラーゼ（１Ｕ）及び本発明の抗体又はその断片（０．００５μｇ／μＬ）；
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．６）；
５０ｍＭ ＫＣｌ；及び
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２
を含む溶液を３７℃で２４時間インキュベートした際に遊離する標識塩基の放射能を測定し、下記式により算出することができる。
５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する阻害能（％）＝（Ｎ２－Ｎ３）÷（Ｎ２－Ｎ１）×１００
Ｎ１：本発明の抗体又はその断片を含まない溶液を３７℃で２４時間インキュベートする前（又は－２０℃で２４時間インキュベートした後）の遊離ヌクレオチドの量、或いは、本発明の抗体又はその断片もＤＮＡポリメラーゼも含まない溶液を３７℃で２４時間インキュベートした後の遊離ヌクレオチドの量
Ｎ２：本発明の抗体又はその断片を含まない溶液を３７℃で２４時間インキュベートした後の遊離ヌクレオチドの量
Ｎ３：本発明の抗体又はその断片を含む溶液を３７℃で２４時間インキュベートした後の遊離ヌクレオチドの量
【0073】
別の実施形態において、本発明の抗体又はその断片について、２５℃で２４時間にわたり基質ＤＮＡ（ここで、基質ＤＮＡは一本鎖であっても二本鎖であってもよく、基質ＤＮＡはプローブとしての機能を有していてもよい）とＤＮＡポリメラーゼとを共存させた場合、該ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する阻害能（基質ＤＮＡ分解阻害能）は、例えば、下記（１）又は（２）の方法で定量的に確認することもできる。
（１）本発明の抗体又はその断片を蛍光標識基質ＤＮＡ（例えば蛍光標識プローブ）と共存させて、２５℃で２４時間曝露した反応液と、コントロールの反応液（本発明の抗体又はその断片の非存在下、－２０℃で２４時間曝露後又は２５℃で２４時間曝露前の反応液）についてリアルタイムＰＣＲでのＣｔ値を比較する。Ｃｔ値の差が小さいほど、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する阻害能が高いことを意味する。
（２）本発明の抗体又はその断片を蛍光標識基質ＤＮＡ（例えば蛍光標識プローブ）と共存させて、２５℃で２４時間曝露した反応液と、コントロールの反応液（本発明の抗体又はその断片の非存在下、－２０℃で２４時間曝露後又は２５℃で２４時間曝露前の反応液）についてリアルタイムＰＣＲでのサイクル初期の蛍光強度を比較する。蛍光強度の差が小さいほど、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する阻害能が高いことを意味する。
（１）本発明の抗体又はその断片を蛍光標識基質ＤＮＡ（例えば蛍光標識プローブ）と共存させて、２５℃で２４時間曝露した反応液と、コントロールの反応液（本発明の抗体又はその断片の非存在下、－２０℃で２４時間曝露後又は２５℃で２４時間曝露前の反応液）についてリアルタイムＰＣＲでのＣｔ値を比較する。Ｃｔ値の差が小さいほど、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する阻害能が高いことを意味する。
（２）本発明の抗体又はその断片を蛍光標識基質ＤＮＡ（例えば蛍光標識プローブ）と共存させて、２５℃で２４時間曝露した反応液と、コントロールの反応液（本発明の抗体又はその断片の非存在下、－２０℃で２４時間曝露後又は２５℃で２４時間曝露前の反応液）についてリアルタイムＰＣＲでのサイクル初期の蛍光強度を比較する。蛍光強度の差が小さいほど、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する阻害能が高いことを意味する。
【0074】
（１）及び（２）における反応液としては、例えば、
下記の成分：
本発明の抗体又はその断片（０．０６μｇ／μＬ）；
配列番号４９に記載のＴａｑポリメラーゼ（０．０５Ｕ／μＬ）；
ホットスタートＰＣＲ用抗ポリメラーゼ抗体（０．０１μｇ／μＬ）；
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３）；
５０ｍＭ ＫＣｌ；
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；
０．３ｍＭ ｄＮＴＰｓ；
ＨｅＬａ細胞ＲＮＡ由来のｃＤＮＡ（５ｎｇ／μＬ）；及び
プライマー及びプローブ溶液（全体の液量の１／２０量）
を含む反応液、又は
下記の成分：
本発明の抗体又はその断片（０．０６μｇ／μＬ）；
配列番号５０に記載のＴｔｈポリメラーゼ又は配列番号５５に記載のＺ０５ポリメラーゼ（０．０５Ｕ／μＬ）；
ホットスタートＰＣＲ用抗ポリメラーゼ抗体（０．０１μｇ／μＬ）；
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３）；
８０ｍＭ ＫＣｌ；
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；
０．５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ；
０．１％（ｖ／ｖ） ＴｒｉｔｏｎＸ－１００；
０．１％（ｗ／ｖ） コール酸ナトリウム；
０．３ｍＭ ｄＮＴＰｓ；
ＨｅＬａ細胞ＲＮＡ由来のｃＤＮＡ（５ｎｇ／μＬ）；及び
プライマー及びプローブ溶液（全体の液量の１／２０量）
を含む反応液を使用することができる。
下記の成分：
本発明の抗体又はその断片（０．０６μｇ／μＬ）；
配列番号４９に記載のＴａｑポリメラーゼ（０．０５Ｕ／μＬ）；
ホットスタートＰＣＲ用抗ポリメラーゼ抗体（０．０１μｇ／μＬ）；
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３）；
５０ｍＭ ＫＣｌ；
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；
０．３ｍＭ ｄＮＴＰｓ；
ＨｅＬａ細胞ＲＮＡ由来のｃＤＮＡ（５ｎｇ／μＬ）；及び
プライマー及びプローブ溶液（全体の液量の１／２０量）
を含む反応液、又は
下記の成分：
本発明の抗体又はその断片（０．０６μｇ／μＬ）；
配列番号５０に記載のＴｔｈポリメラーゼ又は配列番号５５に記載のＺ０５ポリメラーゼ（０．０５Ｕ／μＬ）；
ホットスタートＰＣＲ用抗ポリメラーゼ抗体（０．０１μｇ／μＬ）；
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３）；
８０ｍＭ ＫＣｌ；
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；
０．５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ；
０．１％（ｖ／ｖ） ＴｒｉｔｏｎＸ－１００；
０．１％（ｗ／ｖ） コール酸ナトリウム；
０．３ｍＭ ｄＮＴＰｓ；
ＨｅＬａ細胞ＲＮＡ由来のｃＤＮＡ（５ｎｇ／μＬ）；及び
プライマー及びプローブ溶液（全体の液量の１／２０量）
を含む反応液を使用することができる。
【0075】
上記の反応液中のプライマー及びプローブ溶液としては、例えば、下記を用いる：Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ株式会社のＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ
［遺伝子：
Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ６、Ａｓｓａｙ ＩＤ： Ｈｓ００９８５６３９＿ｍ１（以下「ＩＬ６」と略す）、
ｃｙｃｌｉｎ―ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ １０、Ａｓｓａｙ ＩＤ： Ｈｓ００１７７５８６＿ｍ１（以下「ＣＤＫ１０」と略す）、
ＡＰＣ、ＷＮＴ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ、Ａｓｓａｙ ＩＤ： Ｈｓ０１５６８２６９＿ｍ１（以下「ＡＰＣ」と略す）、
ｍｉｔｏｇｅｎ―ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ８、Ａｓｓａｙ ＩＤ： Ｈｓ００１７７０８３＿ｍ１（以下「ＭＡＰＫ８」と略す）、
ＳＩＶＡ１ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ、Ａｓｓａｙ ＩＤ： Ｈｓ００２７６００２＿ｍ１（以下「ＳＩＶＡ１」と略す）、
ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ１９、Ａｓｓａｙ ＩＤ： Ｈｓ０３０４４１１５＿ｇ１（以下「ＲＰＳ１９」と略す）、又は
ｓｅｒｐｉｎ ｆａｍｉｌｙ Ｂ ｍｅｍｂｅｒ ５、Ａｓｓａｙ ＩＤ： Ｈｓ００９８５２８５＿ｍ１（以下「ＳＥＲＰＩＮＢ５」と略す）］
［遺伝子：
Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ６、Ａｓｓａｙ ＩＤ： Ｈｓ００９８５６３９＿ｍ１（以下「ＩＬ６」と略す）、
ｃｙｃｌｉｎ―ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ １０、Ａｓｓａｙ ＩＤ： Ｈｓ００１７７５８６＿ｍ１（以下「ＣＤＫ１０」と略す）、
ＡＰＣ、ＷＮＴ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｐａｔｈｗａｙ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ、Ａｓｓａｙ ＩＤ： Ｈｓ０１５６８２６９＿ｍ１（以下「ＡＰＣ」と略す）、
ｍｉｔｏｇｅｎ―ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ ８、Ａｓｓａｙ ＩＤ： Ｈｓ００１７７０８３＿ｍ１（以下「ＭＡＰＫ８」と略す）、
ＳＩＶＡ１ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ、Ａｓｓａｙ ＩＤ： Ｈｓ００２７６００２＿ｍ１（以下「ＳＩＶＡ１」と略す）、
ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓ１９、Ａｓｓａｙ ＩＤ： Ｈｓ０３０４４１１５＿ｇ１（以下「ＲＰＳ１９」と略す）、又は
ｓｅｒｐｉｎ ｆａｍｉｌｙ Ｂ ｍｅｍｂｅｒ ５、Ａｓｓａｙ ＩＤ： Ｈｓ００９８５２８５＿ｍ１（以下「ＳＥＲＰＩＮＢ５」と略す）］
【0076】
上記の反応液について、下記（ａ）～（ｃ）の１個、２個、又は３個を満たすことが好ましい。
（ａ）２５℃で２４時間曝露前（又は－２０℃で２４時間曝露後）のＣｔ値／２５℃で２４時間曝露後のＣｔ値≧０．８
（ｂ）２５℃で２４時間曝露前（又は－２０℃で２４時間曝露後）のサイクル初期の蛍光強度／２５℃で２４時間曝露後のサイクル初期の蛍光強度≧０．３
（式中、サイクル初期の蛍光強度とは、増幅曲線が立ち上がるまでのリアルタイムＰＣＲにおける蛍光強度を指し、サイクル初期とは、通常は１～３０サイクル目までをいう）
（ｃ）蛍光標識基質ＤＮＡ分解率≦４０％
（式中、蛍光標識基質ＤＮＡ分解率は、下記式で算出できる：
蛍光標識基質ＤＮＡ分解率（％）＝（Ｆ１３－Ｆ１１）÷（Ｆ１２－Ｆ１１）×１００
Ｆ１１：本発明の抗体又はその断片を含まない場合の２５℃で２４時間曝露前（又は－２０℃で２４時間曝露後）のサイクル初期の蛍光強度
Ｆ１２：本発明の抗体又はその断片を含まない場合の２５℃で２４時間曝露後のサイクル初期の蛍光強度
Ｆ１３：本発明の抗体又はその断片を含む場合の２５℃で２４時間曝露後のサイクル初期の蛍光強度）
（ａ）２５℃で２４時間曝露前（又は－２０℃で２４時間曝露後）のＣｔ値／２５℃で２４時間曝露後のＣｔ値≧０．８
（ｂ）２５℃で２４時間曝露前（又は－２０℃で２４時間曝露後）のサイクル初期の蛍光強度／２５℃で２４時間曝露後のサイクル初期の蛍光強度≧０．３
（式中、サイクル初期の蛍光強度とは、増幅曲線が立ち上がるまでのリアルタイムＰＣＲにおける蛍光強度を指し、サイクル初期とは、通常は１～３０サイクル目までをいう）
（ｃ）蛍光標識基質ＤＮＡ分解率≦４０％
（式中、蛍光標識基質ＤＮＡ分解率は、下記式で算出できる：
蛍光標識基質ＤＮＡ分解率（％）＝（Ｆ１３－Ｆ１１）÷（Ｆ１２－Ｆ１１）×１００
Ｆ１１：本発明の抗体又はその断片を含まない場合の２５℃で２４時間曝露前（又は－２０℃で２４時間曝露後）のサイクル初期の蛍光強度
Ｆ１２：本発明の抗体又はその断片を含まない場合の２５℃で２４時間曝露後のサイクル初期の蛍光強度
Ｆ１３：本発明の抗体又はその断片を含む場合の２５℃で２４時間曝露後のサイクル初期の蛍光強度）
【0077】
上記（ａ）における値（Ｃｔ値比）は、好ましくは０．９以上である。上記（ｂ）における値（蛍光強度比）は、好ましくは０．３５以上、より好ましくは０．５以上、さらに好ましくは０．７以上である。上記（ｃ）における値（蛍光標識基質ＤＮＡ分解率）は、好ましくは３０％以下、より好ましくは２０％以下である。
【0078】
更に他の実施形態において、本発明の抗体又はその断片について、２５℃又は３７℃で２４時間にわたり基質ＤＮＡ（ここで、基質ＤＮＡは一本鎖であっても二本鎖であってもよく、基質ＤＮＡはプローブとしての機能を有していてもよい）とＤＮＡポリメラーゼとを共存させた場合、該ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する阻害能（基質ＤＮＡ分解阻害能）は、例えば、下記（３）又は（４）の方法で定量的に確認することもできる。
（３）本発明の抗体又はその断片を基質ＤＮＡ（例えば二本鎖基質ＤＮＡ）と共存させて、２５℃で２４時間曝露した溶液と、コントロールの溶液（本発明の抗体又はその断片の非存在下で－２０℃で２４時間曝露後又は２５℃で２４時間曝露前の溶液）についてゲル電気泳動により基質ＤＮＡのバンド強度を比較する。バンド強度の差が小さいほど、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する阻害能が高いことを意味する。
（４）本発明の抗体又はその断片を蛍光標識基質ＤＮＡ（例えば、少なくとも一方の鎖が蛍光標識された二本鎖基質ＤＮＡ）と共存させて、３７℃で２４時間曝露した反応液と、コントロールの反応液（本発明の抗体又はその断片の非存在下で－２０℃で２４時間曝露後又は３７℃で２４時間曝露前の反応液）についてリアルタイムＰＣＲでのサイクル初期の蛍光強度又は分光光度計における蛍光強度を比較する。蛍光強度の差が小さいほど、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する阻害能が高いことを意味する。
（３）本発明の抗体又はその断片を基質ＤＮＡ（例えば二本鎖基質ＤＮＡ）と共存させて、２５℃で２４時間曝露した溶液と、コントロールの溶液（本発明の抗体又はその断片の非存在下で－２０℃で２４時間曝露後又は２５℃で２４時間曝露前の溶液）についてゲル電気泳動により基質ＤＮＡのバンド強度を比較する。バンド強度の差が小さいほど、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する阻害能が高いことを意味する。
（４）本発明の抗体又はその断片を蛍光標識基質ＤＮＡ（例えば、少なくとも一方の鎖が蛍光標識された二本鎖基質ＤＮＡ）と共存させて、３７℃で２４時間曝露した反応液と、コントロールの反応液（本発明の抗体又はその断片の非存在下で－２０℃で２４時間曝露後又は３７℃で２４時間曝露前の反応液）についてリアルタイムＰＣＲでのサイクル初期の蛍光強度又は分光光度計における蛍光強度を比較する。蛍光強度の差が小さいほど、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する阻害能が高いことを意味する。
【0079】
（３）及び（４）における溶液又は反応液としては、例えば、
下記の成分：
本発明の抗体又はその断片（０．０６μｇ／μＬ）；
配列番号４９に記載のＴａｑポリメラーゼ（０．０５Ｕ／μＬ）；
ホットスタートＰＣＲ用抗ポリメラーゼ抗体（０．０１μｇ／μＬ）；
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３）；
５０ｍＭ ＫＣｌ；
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；
０．３μＭ 基質ＤＮＡ；
を含むもの、又は
下記の成分：
本発明の抗体又はその断片（０．０６μｇ／μＬ）；
配列番号５０に記載のＴｔｈポリメラーゼ又は配列番号５５に記載のＺ０５ポリメラーゼ（０．０５Ｕ／μＬ）；
ホットスタートＰＣＲ用抗ポリメラーゼ抗体（０．０１μｇ／μＬ）；
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３）；
５０ｍＭ ＫＣｌ；
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；
０．３μＭ 基質ＤＮＡ；
を含むものを使用することができる。
下記の成分：
本発明の抗体又はその断片（０．０６μｇ／μＬ）；
配列番号４９に記載のＴａｑポリメラーゼ（０．０５Ｕ／μＬ）；
ホットスタートＰＣＲ用抗ポリメラーゼ抗体（０．０１μｇ／μＬ）；
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３）；
５０ｍＭ ＫＣｌ；
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；
０．３μＭ 基質ＤＮＡ；
を含むもの、又は
下記の成分：
本発明の抗体又はその断片（０．０６μｇ／μＬ）；
配列番号５０に記載のＴｔｈポリメラーゼ又は配列番号５５に記載のＺ０５ポリメラーゼ（０．０５Ｕ／μＬ）；
ホットスタートＰＣＲ用抗ポリメラーゼ抗体（０．０１μｇ／μＬ）；
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３）；
５０ｍＭ ＫＣｌ；
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；
０．３μＭ 基質ＤＮＡ；
を含むものを使用することができる。
【0080】
（３）の方法では、基質ＤＮＡは蛍光色素や放射性同位元素等で標識されていても、標識されていなくてもよい。基質ＤＮＡのうち、二本鎖基質ＤＮＡの例としては、配列番号５６及び配列番号５７の組合せに代表される、少なくとも一方の鎖の３’末端が他方の鎖の５’末端よりも突出した二本鎖基質ＤＮＡが挙げられるが、特に限定されない。突出部分の塩基長は、例えば、３～１０塩基長程度である。また、ゲル電気泳動の手法としては、例えば、アガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動などが挙げられるが、特に限定されない。核酸のバンド強度を定量できる装置を使用することが好ましく、当該装置の例としては、ＤＮＡ／ＲＮＡ分析用マイクロチップ電位泳動装置（ＭｕｌｔｉＮＡ、株式会社島津製作所）又は全自動ハイスループット電気泳動システム（ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎシリーズ、アジレント・テクノロジー株式会社）などが挙げられるが、特に限定されない。
【0081】
（４）の方法では、基質ＤＮＡは蛍光標識されていることが好ましい。基質ＤＮＡのうち、二本鎖基質ＤＮＡの例としては、配列番号５８及び配列番号５９の組合せに代表される、少なくとも一方の鎖の３’末端が他方の鎖の５’末端よりも突出し、且つ、他方の鎖の少なくとも片側の末端が蛍光標識された二本鎖基質ＤＮＡが挙げられるが、特に限定されない。突出部分の塩基長は、例えば、３～１０塩基長程度である。蛍光値の変化は、例えば、リアルタイムＰＣＲ装置や分光光度計による測定が挙げられるが、特に限定されない。
【0082】
上記の溶液又は反応液について、下記（ｄ）及び（ｅ）の１個又は２個を満たすことが好ましい。
（ｄ）基質ＤＮＡ分解率≦４０％
（式中、基質ＤＮＡ分解率は、下記式で算出できる：
基質ＤＮＡ分解率（％）＝（Ｓ１１－Ｓ１３）÷（Ｓ１１－Ｓ１２）×１００
Ｓ１１：本発明の抗体又はその断片を含まない場合の２５℃で２４時間曝露前（又は－２０℃で２４時間曝露後）のバンド強度
Ｓ１２：本発明の抗体又はその断片を含まない場合の２５℃で２４時間曝露後のバンド強度
Ｓ１３：本発明の抗体又はその断片を含む場合の２５℃で２４時間曝露後のバンド強度）
（ｅ）蛍光標識基質ＤＮＡ分解率≦４０％
（式中、蛍光標識基質ＤＮＡ分解率は、下記式で算出できる：
蛍光標識基質ＤＮＡ分解率（％）＝（Ｆ２３－Ｆ２１）÷（Ｆ２２－Ｆ２１）×１００）
Ｆ２１：本発明の抗体又はその断片を含まない場合の３７℃で２４時間曝露前（又は－２０℃で２４時間曝露後）のサイクル初期の蛍光強度
Ｆ２２：本発明の抗体又はその断片を含まない場合の３７℃で２４時間曝露後のサイクル初期の蛍光強度
Ｆ２３：本発明の抗体又はその断片を含む場合の３７℃で２４時間曝露後のサイクル初期の蛍光強度
サイクル初期：通常は１～３０サイクル目
蛍光強度：リアルタイムＰＣＲにおける蛍光強度）
（ｄ）基質ＤＮＡ分解率≦４０％
（式中、基質ＤＮＡ分解率は、下記式で算出できる：
基質ＤＮＡ分解率（％）＝（Ｓ１１－Ｓ１３）÷（Ｓ１１－Ｓ１２）×１００
Ｓ１１：本発明の抗体又はその断片を含まない場合の２５℃で２４時間曝露前（又は－２０℃で２４時間曝露後）のバンド強度
Ｓ１２：本発明の抗体又はその断片を含まない場合の２５℃で２４時間曝露後のバンド強度
Ｓ１３：本発明の抗体又はその断片を含む場合の２５℃で２４時間曝露後のバンド強度）
（ｅ）蛍光標識基質ＤＮＡ分解率≦４０％
（式中、蛍光標識基質ＤＮＡ分解率は、下記式で算出できる：
蛍光標識基質ＤＮＡ分解率（％）＝（Ｆ２３－Ｆ２１）÷（Ｆ２２－Ｆ２１）×１００）
Ｆ２１：本発明の抗体又はその断片を含まない場合の３７℃で２４時間曝露前（又は－２０℃で２４時間曝露後）のサイクル初期の蛍光強度
Ｆ２２：本発明の抗体又はその断片を含まない場合の３７℃で２４時間曝露後のサイクル初期の蛍光強度
Ｆ２３：本発明の抗体又はその断片を含む場合の３７℃で２４時間曝露後のサイクル初期の蛍光強度
サイクル初期：通常は１～３０サイクル目
蛍光強度：リアルタイムＰＣＲにおける蛍光強度）
【0083】
上記（ｄ）における基質ＤＮＡ分解率は、好ましくは３０％以下、より好ましくは２０％以下である。上記（ｅ）における蛍光標識基質ＤＮＡ分解率は、好ましくは３０％以下、より好ましくは２０％以下である。
【0084】
本発明の抗体又はその断片は、例えば、２５℃で２４時間、４８時間、又は７２時間、或いは、３７℃で２４時間にわたり、ＤＮＡポリメラーゼ及び核酸テンプレート、プライマー、プローブ等の核酸と共存させても、ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性による核酸の分解を抑制することができる。したがって、本発明の抗体又はその断片は、核酸増幅用試薬等の安定性を向上させるために好適に使用することができる。
【0085】
本発明の抗体又はその断片は、例えば、ＤＮＡポリメラーゼのドメインＥを含む一部又は全部を免疫原として動物に免疫することにより取得され得る。免疫原は、好ましくはＤＮＡポリメラーゼのドメインＥを含む一部であり、より好ましくはＴａｑポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、及びＺ０５ポリメラーゼからなる群より選択される少なくとも一種のＤＮＡポリメラーゼのドメインＥを含む一部であり、さらに好ましくはＴｔｈポリメラーゼのドメインＥを含む一部である。動物としては、例えば、マウス、ハムスター、ラット、モルモット、ウサギ、フェレット、ヤギ、サル、ヒト等の哺乳類が挙げられるが、これらに限定されない。
【0086】
本発明の抗体は、上記の免疫原で免疫した動物が産生する抗体をスクリーニングすることにより取得され得る。例えば、ＤＮＡポリメラーゼのドメインＥを含む一部を免疫原とする場合、ＤＮＡポリメラーゼの全部に対する結合能を指標としてスクリーニングしてもよいし、ＤＮＡポリメラーゼの全部を免疫原とする場合、ＤＮＡポリメラーゼのドメインＥを含む一部に対する結合能、又はＤＮＡポリメラーゼの全部に対する結合能とＤＮＡポリメラーゼのドメインＥを含む一部以外に対する結合能との差を指標としてスクリーニングしてもよい。一実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼのドメインＥを含む一部を免疫原、ＤＮＡポリメラーゼの全体に対する結合能を指標としてスクリーニングすることが好ましく、ＴｔｈポリメラーゼのドメインＥを含む一部を免疫原、ＤＮＡポリメラーゼの全体に対する結合能を指標としてスクリーニングすることがさらに好ましい。
【0087】
具体的なスクリーニング方法は、例えば、哺乳類の脾臓細胞とミエローマ細胞を細胞融合させるハイブリドーマ法、抗体ファージライブラリーから標的分子に対して親和性を有する抗体を選択するファージディスプレイ法等であってもよいが、免疫動物から抗原特異的形質細胞を選別し、抗体遺伝子（全長又は可変領域等の一部）を単離して、抗原に親和性の高い組換え抗体を取得する方法であってもよい。
【0088】
抗原特異的形質細胞を選別する方法としては、例えば、米国特許出願公開第２０１４／０３１５２８号（参照することによりその全体が明細書に組み込まれる）に記載の方法、及び米国特許出願公開第２０１８／２９２４０７号（参照することによりその全体が明細書に組み込まれる）に記載の方法が挙げられる。前者の方法では、免疫動物から調製した細胞懸濁溶液に、蛍光標識抗原と小胞体親和性蛍光色素を作用させ、細胞表面に発現した抗体を蛍光標識することによって、抗原特異的形質細胞を同定することができる。後者の方法では、抗体産生細胞を含む細胞群に対して、架橋剤を用いた固定化処理及び界面活性剤による細胞膜溶解処理を行い、細胞内部に発現した抗体を蛍光標識抗原と結合させることによって、抗原特異的形質細胞を同定することができる。当該方法において、セルソーターを利用したシングルセル解析を行うことにより、目的抗原と結合した少なくとも１個の形質細胞を分離することができる。また、当該方法において、細胞の小胞体に対する染色選択性が高く、形質細胞及び形質芽細胞を他の細胞と識別可能な蛍光プローブを用いることができる。当該蛍光プローブとしては、例えば、米国特許出願公開第２０１３／０２９３２５号（参照することによりその全体が明細書に組み込まれる）に記載されたものを使用することができる。
【0089】
抗原特異的形質細胞から抗体遺伝子を取得する方法としては、例えば、ハイブリドーマ法、抗体遺伝子のクローニング等が挙げられるが、これらに限定されない。後者の方法としては、例えば、抗原特異的形質細胞からｍＲＮＡを抽出して逆転写を行い、ｃＤＮＡを合成することで抗体遺伝子を取得する方法等が挙げられ、米国特許出願公開第２０１１／０２０８７９号（参照することによりその全体が明細書に組み込まれる）に記載の方法であってもよい。当該方法は、磁気ビーズを用いて抗原特異的形質細胞からｍＲＮＡを抽出し、ＲＴ－ＰＣＲにより抗体遺伝子を取得する方法であり、任意に洗浄工程を含む、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ合成、ＤＮＡの増幅等の複数の逐次反応を並列的に実施できる反応治具を利用する方法である。
【0090】
抗体遺伝子から組換え抗体を取得する方法は、例えば、抗体遺伝子を含む抗体発現ベクターを作製し、この抗体発現ベクターから抗体を発現させる方法であってもよい。当該方法としては、例えば、米国特許出願公開第２０１３／０２３００９号（参照することによりその全体が明細書に組み込まれる）に記載の方法、及び米国特許出願公開第２０１１／１１７６０９号（参照することによりその全体が明細書に組み込まれる）に記載の方法等が挙げられる。前者の方法では、標的遺伝子配列を含むＰＣＲ増幅産物に一つ以上の二本鎖ＤＮＡ断片を連結させることで、前記ＰＣＲ増幅産物を精製することなく、目的とする標的遺伝子に由来する配列を含む連結ＤＮＡ断片を特異的に作製できる。後者の方法では、線状化されたベクターの両端の相同組換え領域に、増幅用プライマーと標的遺伝子のみに存在する増幅用プライマー配列の内側の配列を保持させることで、標的ＤＮＡ断片を選択的に相同組換えしてベクターを構築できる。
【0091】
本発明の抗体又はその断片は、上記の方法によって取得した抗体又はその断片のアミノ酸配列情報に基づき、遺伝子工学的手法により得ることもできる。例えば、軽鎖ＣＤＲ１～３及び任意に軽鎖ＣＤＲ２のＣ末端隣接領域が上記の方法によって取得した抗体の軽鎖ＣＤＲ１～３及び任意に軽鎖ＣＤＲ２のＣ末端隣接領域のアミノ酸配列に対してそれぞれ８０％以上の同一性を有し、且つ、重鎖ＣＤＲ１～３が上記の方法によって取得した抗体の重鎖ＣＤＲ１～３のアミノ酸配列に対してそれぞれ８０％以上の同一性を有するように設計した抗体遺伝子を組み込んだ発現ベクターを、当該分野で公知の任意の宿主細胞で発現させること等によっても取得することができる。
【0092】
３．ポリヌクレオチド
本発明のポリヌクレオチドは、上記２に記載した抗体又はその断片のコード配列を含むことが好ましい。
本発明のポリヌクレオチドは、上記２に記載した抗体又はその断片のコード配列を含むことが好ましい。
【0093】
一実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、上記２に記載した抗体又はその断片の発現カセットを含むことが好ましい。当該発現カセットは、宿主細胞内での発現を可能とするものであれば特に制限されず、例えばプロモーター、及びそのプロモーターの制御下に配置されたコード配列を含む。
【0094】
プロモーターとしては、特に制限されず、宿主細胞の種類に応じて適宜選択することができる。プロモーターとしては、例えばｐｏｌ ＩＩ系プロモーターを各種使用することができる。ｐｏｌ ＩＩ系プロモーターとしては、特に制限されないが、例えばＣＭＶプロモーター、ＥＦ１プロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＳＣＶプロモーター等が挙げられる。その他にも、プロモーターとして、例えばｔｒｃ、ｔａｃ等のトリプトファンプロモーター；ｌａｃプロモーター；Ｔ７プロモーター；Ｔ５プロモーター；Ｔ３プロモーター；ＳＰ６プロモーター；アラビノース誘導プロモーター；コールドショックプロモーター；テトラサイクリン誘導性プロモーター等が挙げられる。
【0095】
発現カセットは、必要に応じて、他のエレメントを含んでいてもよい。他のエレメントとしては、例えばマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）、薬剤耐性遺伝子、複製起点、エンハンサー配列、リプレッサー配列、インスレーター配列、レポータータンパク質コード配列、薬剤耐性遺伝子コード配列等が挙げられる。これらは１種単独であっても２種以上の組合せであってもよい。
【0096】
本発明のポリヌクレオチドは、例えばベクターの形態であることができる。使用目的、宿主細胞の種類等に応じて適当なベクターが選択される。例えば大腸菌を宿主とするベクターとしてはＭ１３ファージ又はその改変体、λファージ又はその改変体、ｐＢＲ３２２又はその改変体（例えばｐＢ３２５、ｐＡＴ１５３、ｐＵＣ８）等、酵母を宿主とするベクターとしてはｐＹｅｐＳｅｃ１、ｐＭＦａ、ｐＹＥＳ２、ｐＰＩＣ３．５Ｋ等、昆虫細胞を宿主とするベクターとしてはｐＡｃ、ｐＶＬ等、哺乳類細胞を宿主とするベクターとしてはｐｃＤＮＡ、ｐＣＤＭ８、ｐＭＴ２ＰＣ等を例示することができる。
【0097】
４．細胞
本発明の細胞は、上記３に記載したポリヌクレオチドを含むことが好ましい。細胞としては、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２等の大腸菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＭＩ１１４等のバチルス属細菌、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＨ２２等の酵母、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来のＳｆ細胞系もしくはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ由来のＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞系、嗅神経細胞等の昆虫細胞、動物細胞等を挙げることができる。動物細胞としては、好ましくは哺乳動物由来の培養細胞、具体的には、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｅｘｐｉ２９３細胞、２９３Ｆ細胞、２９３Ｔ細胞、２９３ＦＴ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＰＣ１２細胞、Ｎ１Ｅ－１１５細胞、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞等が挙げられる。
本発明の細胞は、上記３に記載したポリヌクレオチドを含むことが好ましい。細胞としては、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ１２等の大腸菌、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＭＩ１１４等のバチルス属細菌、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＡＨ２２等の酵母、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来のＳｆ細胞系もしくはＴｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ由来のＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞系、嗅神経細胞等の昆虫細胞、動物細胞等を挙げることができる。動物細胞としては、好ましくは哺乳動物由来の培養細胞、具体的には、ＣＯＳ７細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、Ｅｘｐｉ２９３細胞、２９３Ｆ細胞、２９３Ｔ細胞、２９３ＦＴ細胞、Ｈｅｌａ細胞、ＰＣ１２細胞、Ｎ１Ｅ－１１５細胞、ＳＨ－ＳＹ５Ｙ細胞等が挙げられる。
【0098】
一実施形態において、本発明の細胞は、ＤＮＡポリメラーゼのドメインＥに特異的に結合する抗体又はその断片を発現していることが好ましい。
【0099】
一実施形態において、本発明の細胞は、ＤＮＡポリメラーゼのドメインＥに特異的に結合する抗体又はその断片を分泌している又は細胞表面上に有することが好ましい。
【0100】
５．試薬
本発明の試薬は、上記２に記載した抗体又はその断片、上記３に記載したポリヌクレオチド、又は上記４に記載した細胞を含むことが好ましい。本発明の試薬は、さらに賦形剤もしくは担体及び／又は添加剤を含むことが好ましい。
本発明の試薬は、上記２に記載した抗体又はその断片、上記３に記載したポリヌクレオチド、又は上記４に記載した細胞を含むことが好ましい。本発明の試薬は、さらに賦形剤もしくは担体及び／又は添加剤を含むことが好ましい。
【0101】
前記賦形剤もしくは担体としては、例えばデンプン、乳糖、結晶セルロース、ソルビトール、リン酸水素カルシウム、水、エタノール、（ポリ）エチレングリコール、（ポリ）プロピレングリコール、グリセロール、植物油等が挙げられる。これらは１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。
【0102】
前記添加剤としては、例えば緩衝剤、等張化剤、増粘剤、キレート剤、乳化剤、着色剤、保存剤等が挙げられる。これらは１種を単独で又は２種以上組み合わせて使用することができる。
【0103】
本発明の試薬は、核酸増幅用試薬であることが好ましい。
【0104】
一実施形態において、本発明の試薬は、ドメインＥを有するＤＮＡポリメラーゼ、及び該ＤＮＡポリメラーゼのドメインＥに特異的に結合する抗体又はその断片を含むことが好ましい。前記抗体又はその断片とＤＮＡポリメラーゼとのモル比は、本発明の効果を奏する限り限定されないが、約１：１～約５００：１であることが望ましい。当該試薬は、さらに、ドメインＥを有さないＤＮＡポリメラーゼを含んでいてもよい。当該試薬は、核酸増幅用試薬であることが好ましい。
【0105】
一実施形態において、本発明の試薬は、ドメインＥを有するＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、プローブ、及びデオキシリボヌクレオシド－５’－リン酸からなる群より選択される少なくとも一種と、ＤＮＡポリメラーゼのドメインＥ（好ましくは、ドメインＥにおけるアミノ酸領域Ａ～Ｄのいずれかの領域に存在する少なくとも１つ(例えば、１つ又は２つ)のエピトープに結合する抗体）に特異的に結合する抗体又はその断片を含むことが好ましい。当該試薬は、さらに、ＤＮＡポリメラーゼ活性を向上させるために、例えばマンガン、マグネシウムなどの金属塩、緩衝剤などを含んでいてもよい。当該試薬は、核酸増幅用試薬であることが好ましい。
【0106】
本発明の試薬がドメインＥを有するＤＮＡポリメラーゼを含む場合、該ＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、上記２に記載したものが挙げられる。
【0107】
本発明の試薬がプライマーを含む場合、該プライマーは少なくとも２種のプライマーであってもよい。少なくとも２種のプライマーとは、増幅されるべき核酸配列に実質的に相補的なオリゴヌクレオチドであり、かつ、増幅されるべき核酸配列の両端を規定し、各プライマーから合成された伸長生成物がその相補体から分離された場合に、さらなる合成のための鋳型として機能するものであり得る。プライマーは、標的核酸に応じて適宜選択・設計して用いることができ、特に限定されない。さらに、ターゲットとする標的核酸が亜型であることが想定される場合、縮重プライマーであってもよい。一般的には、プライマーはヌクレオチド数が１２～６０であるオリゴヌクレオチドであり得る。プライマーはＤＮＡ合成装置により合成するか、又は生物学的供給源から単離することができる。
【0108】
本発明の試薬がプローブを含む場合、該プローブは、少なくとも１種類の標識物質で標識されたハイブリダイゼーションプローブであってもよい。このようなプローブを用いることによって、核酸増幅産物の分析を通常の電気泳動ではなく、蛍光シグナルのモニタリングで監視することができ、解析労力が低減される。さらには、反応容器を開放する必要がなく、より一層のコンタミネーションのリスク低減が可能である。例えば、検出対象とする核酸配列のサブタイプに対応する、それぞれのハイブリダイゼーションプローブを異なる蛍光色素で標識することによって、標的核酸のサブタイプを識別することも可能である。ハイブリダイゼーションプローブとしては、例えば、ＴａｑＭａｎ加水分解プローブ［米国特許第５，２１０，０１５号公報、米国特許第５，５３８，８４８号公報、米国特許第５，４８７，９７２号公報、米国特許第５，８０４，３７５号公報（参照することによりその全体が明細書に組み込まれる）］、モレキュラービーコン［米国特許第５，１１８，８０１号公報（参照することによりその全体が明細書に組み込まれる）］、ＦＲＥＴハイブリダイゼーションプローブ［国際公開第９７／４６７０７号、国際公開第９７／４６７１２号、国際公開第９７／４６７１４号（参照することによりその全体が明細書に組み込まれる）］等が挙げられる。
【0109】
本発明の試薬は、プローブに代えて、２本鎖ＤＮＡ結合蛍光化合物を含んでいてもよい。２本鎖ＤＮＡ結合蛍光化合物としては、例えば、ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｒｅｅｎ Ｉ，ＳＹＢＲ（登録商標） Ｇｏｌｄ、ＳＹＴＯ－９、ＳＹＴＰ－１３、ＳＹＴＯ－８２（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ），ＥｖａＧｒｅｅｎ（登録商標；Ｂｉｏｔｉｕｍ）、ＬＣＧｒｅｅｎ（Ｉｄａｈｏ），ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標） ４８０ ＲｅｓｏＬｉｇｈｔ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【0110】
本発明の試薬がデオキシリボヌクレオシド－５’－リン酸を含む場合、該デオキシリボヌクレオシド－５’－リン酸は、例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、又はこれらの混合物である。なお、ｄＡＴＰ等の用語には、化学修飾が施されたものも含まれる。
【0111】
本発明の試薬が核酸増幅用試薬である場合、核酸増幅法としては、例えば、ＰＣＲ法、Ｌｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＬＡＭＰ）法、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｒｔｉｏｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＴＲＣ）法、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＮＡＳＢＡ）法等が挙げられるが、これらに限定されない。核酸増幅方法は、好ましくはＰＣＲ法である。ＰＣＲ法の中でも、例えば、ＤＮＡポリメラーゼに特異的なモノクローナル抗体で所定の温度までプライマーアニーリングを阻害するＰＣＲ法、いわゆるホットスタートＰＣＲ法が好ましい。本発明のホットスタートＰＣＲ用試薬は、ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性ドメインに特異的に結合する抗体及びＤＮＡポリメラーゼのドメインＥに特異的に結合する抗体を組み合わせて含むことで一層効果的に非特異反応を抑制できる。本発明のホットスタートＰＣＲ用試薬は、プライマー、デオキシリボヌクレオシド－５’－リン酸、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性ドメインに特異的に結合する抗体、及びＤＮＡポリメラーゼのドメインＥに特異的に結合する抗体を含むことが好ましい。当該試薬を、標的核酸を含む試薬に混合し、得られた混合物を６０℃以上に加熱（例えば、９５℃で２０秒以上加熱）して、どちらの抗体も不活性化することでプライマー伸長生成物を形成させることができる。
【実施例0112】
以下、試験例をもって、本発明を具体的に説明する。もっとも、本発明は下記試験例に限定されるものではない。
【0113】
試験例１．抗原の作製
ＤＮＡポリメラーゼ全体を抗原とする場合には、配列番号４９のアミノ酸配列を有するＴａｑポリメラーゼ（ＴＡＰ－２０１、東洋紡株式会社、以下、「ｗｈｏｌｅ Ｔａｑ」と表記する）、及び、配列番号５０のアミノ酸配列を有するＴｔｈポリメラーゼ（ＴＴＨ－３０１、東洋紡株式会社、以下、「ｗｈｏｌｅ Ｔｔｈ」と表記する）を使用した。なお、ｗｈｏｌｅ Ｔａｑとｗｈｏｌｅ Ｔｔｈの配列同一性は８７％程度である。
ＤＮＡポリメラーゼ全体を抗原とする場合には、配列番号４９のアミノ酸配列を有するＴａｑポリメラーゼ（ＴＡＰ－２０１、東洋紡株式会社、以下、「ｗｈｏｌｅ Ｔａｑ」と表記する）、及び、配列番号５０のアミノ酸配列を有するＴｔｈポリメラーゼ（ＴＴＨ－３０１、東洋紡株式会社、以下、「ｗｈｏｌｅ Ｔｔｈ」と表記する）を使用した。なお、ｗｈｏｌｅ Ｔａｑとｗｈｏｌｅ Ｔｔｈの配列同一性は８７％程度である。
【0114】
ＤＮＡポリメラーゼのドメインＥを抗原とする場合には、配列番号１（ｗｈｏｌｅ ＴａｑのＮ末端から２９０番目のアミノ酸まで）のアミノ酸配列を有するポリペプチド（以下、「Ｔａｑ ｅｘｏ」と表記する）、及び、配列番号２（ｗｈｏｌｅ ＴｔｈのＮ末端から２９２番目のアミノ酸まで）のアミノ酸配列を有するポリペプチド（以下、「Ｔｔｈ ｅｘｏ」と表記する）を、それぞれ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株を用いて発現させ、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーを用いて精製して使用した。いずれの抗原もリン酸緩衝液に溶解した。
【0115】
試験例２．モルモットの免疫
Ｓｌｃ：Ｈａｒｔｌｅｙモルモット（７週齢のオス）の背部皮下（腰部）に抗原４００μｇの抗原調製物０．８ｍＬを注射した。抗原調製物は、試験例１で抗原をリン酸緩衝液に溶解させた抗原液とアジュバントＴｉｔｅｒＭＡＸＧｏｌｄ（ＴｉｔｅｒＭＡＸ社）を１：１（液量比）で混合して、エマルジョン化したものを用いた。３週間後に、さらに抗原４００μｇの抗原調製物０．８ｍＬを注射して、追加免疫を行った。さらに３週間後に、抗原４００μｇの抗原液０．４ｍＬを注射して追加免疫を実施した。免疫後のモルモットのリンパ節の腫れは、ｗｈｏｌｅ Ｔａｑ、Ｔａｑ ｅｘｏ、ｗｈｏｌｅ Ｔｔｈ、Ｔｔｈ ｅｘｏの順に大きくなった。
Ｓｌｃ：Ｈａｒｔｌｅｙモルモット（７週齢のオス）の背部皮下（腰部）に抗原４００μｇの抗原調製物０．８ｍＬを注射した。抗原調製物は、試験例１で抗原をリン酸緩衝液に溶解させた抗原液とアジュバントＴｉｔｅｒＭＡＸＧｏｌｄ（ＴｉｔｅｒＭＡＸ社）を１：１（液量比）で混合して、エマルジョン化したものを用いた。３週間後に、さらに抗原４００μｇの抗原調製物０．８ｍＬを注射して、追加免疫を行った。さらに３週間後に、抗原４００μｇの抗原液０．４ｍＬを注射して追加免疫を実施した。免疫後のモルモットのリンパ節の腫れは、ｗｈｏｌｅ Ｔａｑ、Ｔａｑ ｅｘｏ、ｗｈｏｌｅ Ｔｔｈ、Ｔｔｈ ｅｘｏの順に大きくなった。
【0116】
試験例３．蛍光標識タンパク質の作製
ＤＮＡポリメラーゼ全体、及び、ドメインＥを欠損したＤＮＡポリメラーゼをそれぞれ蛍光標識した。ドメインＥを欠損したＤＮＡポリメラーゼは、配列番号４９においてＮ末端から２８９番目までのアミノ酸を欠失させたＴａｑポリメラーゼ（以下、「ΔＴａｑ」と表記する）、及び、配列番号５０においてＮ末端から２９１番目までのアミノ酸を欠失させたＴｔｈポリメラーゼ（以下、「ΔＴｔｈ」と表記する）を、それぞれ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株を用いて発現させ、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーを用いて精製したものである。
ＤＮＡポリメラーゼ全体、及び、ドメインＥを欠損したＤＮＡポリメラーゼをそれぞれ蛍光標識した。ドメインＥを欠損したＤＮＡポリメラーゼは、配列番号４９においてＮ末端から２８９番目までのアミノ酸を欠失させたＴａｑポリメラーゼ（以下、「ΔＴａｑ」と表記する）、及び、配列番号５０においてＮ末端から２９１番目までのアミノ酸を欠失させたＴｔｈポリメラーゼ（以下、「ΔＴｔｈ」と表記する）を、それぞれ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９株を用いて発現させ、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーを用いて精製したものである。
【0117】
ｗｈｏｌｅ Ｔａｑ及びｗｈｏｌｅ ＴｔｈはＤｙＬｉｇｈｔ（商標）４８８ ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて蛍光標識を行った。ΔＴａｑ及びΔＴｔｈはＤｙＬｉｇｈｔ（商標）５５０ ＮＨＳ Ｅｓｔｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて蛍光標識を行った。
【0118】
試験例４．ドメインＥ特異的形質細胞の単離と抗体発現ベクターの構築
米国特許出願公開第２０１４／０３１５２８号、米国特許出願公開第２０１８／２９２４０７号、及び米国特許出願公開第２０１３／０２９３２５号に記載の方法により、試験例２で免疫したモルモットから腸骨リンパ節から細胞懸濁液を調製し、フローサイトメーターを用いてドメインＥ特異的形質細胞の選抜を行った。免疫に使用した抗原と試験例３で調製した蛍光標識タンパク質との組み合わせを変えて、以下の５種類の方法でドメインＥ特異的形質細胞の選抜を実施した。
米国特許出願公開第２０１４／０３１５２８号、米国特許出願公開第２０１８／２９２４０７号、及び米国特許出願公開第２０１３／０２９３２５号に記載の方法により、試験例２で免疫したモルモットから腸骨リンパ節から細胞懸濁液を調製し、フローサイトメーターを用いてドメインＥ特異的形質細胞の選抜を行った。免疫に使用した抗原と試験例３で調製した蛍光標識タンパク質との組み合わせを変えて、以下の５種類の方法でドメインＥ特異的形質細胞の選抜を実施した。
【0119】
［方法１］
ｗｈｏｌｅ Ｔａｑで免疫した細胞から、ＤｙＬｉｇｈｔ４８８標識ｗｈｏｌｅ ＴａｑとＤｙＬｉｇｈｔ５５０標識ΔＴａｑを用いて、サブトラクションによりドメインＥ特異的形質細胞を選抜した。すなわち、ＤｙＬｉｇｈｔ４８８に対応する蛍光が確認され、ＤｙＬｉｇｈｔ５５０に対応する蛍光が確認されない形質細胞を選抜した。
ｗｈｏｌｅ Ｔａｑで免疫した細胞から、ＤｙＬｉｇｈｔ４８８標識ｗｈｏｌｅ ＴａｑとＤｙＬｉｇｈｔ５５０標識ΔＴａｑを用いて、サブトラクションによりドメインＥ特異的形質細胞を選抜した。すなわち、ＤｙＬｉｇｈｔ４８８に対応する蛍光が確認され、ＤｙＬｉｇｈｔ５５０に対応する蛍光が確認されない形質細胞を選抜した。
【0120】
［方法２］
Ｔａｑ ｅｘｏで免疫した細胞から、ＤｙＬｉｇｈｔ４８８標識ｗｈｏｌｅ Ｔａｑを用いて、ドメインＥ特異的形質細胞を選抜した。
Ｔａｑ ｅｘｏで免疫した細胞から、ＤｙＬｉｇｈｔ４８８標識ｗｈｏｌｅ Ｔａｑを用いて、ドメインＥ特異的形質細胞を選抜した。
【0121】
［方法３］
Ｔｔｈ ｅｘｏで免疫した細胞から、ＤｙＬｉｇｈｔ４８８標識ｗｈｏｌｅ Ｔａｑを用いて、ドメインＥ特異的形質細胞を選抜した。
Ｔｔｈ ｅｘｏで免疫した細胞から、ＤｙＬｉｇｈｔ４８８標識ｗｈｏｌｅ Ｔａｑを用いて、ドメインＥ特異的形質細胞を選抜した。
【0122】
［方法４］
ｗｈｏｌｅ Ｔｔｈで免疫した細胞から、ＤｙＬｉｇｈｔ４８８標識ｗｈｏｌｅ ＴｔｈとＤｙＬｉｇｈｔ５５０標識ΔＴｔｈを用いて、サブトラクションによりドメインＥ特異的形質細胞を選抜した。すなわち、ＤｙＬｉｇｈｔ４８８に対応する蛍光が確認され、ＤｙＬｉｇｈｔ５５０に対応する蛍光が確認されない形質細胞を選抜した。
ｗｈｏｌｅ Ｔｔｈで免疫した細胞から、ＤｙＬｉｇｈｔ４８８標識ｗｈｏｌｅ ＴｔｈとＤｙＬｉｇｈｔ５５０標識ΔＴｔｈを用いて、サブトラクションによりドメインＥ特異的形質細胞を選抜した。すなわち、ＤｙＬｉｇｈｔ４８８に対応する蛍光が確認され、ＤｙＬｉｇｈｔ５５０に対応する蛍光が確認されない形質細胞を選抜した。
【0123】
［方法５］
Ｔｔｈ ｅｘｏで免疫した細胞について、ＤｙＬｉｇｈｔ４８８標識ｗｈｏｌｅ Ｔｔｈを用いて、ドメインＥ特異的形質細胞を選抜した。
Ｔｔｈ ｅｘｏで免疫した細胞について、ＤｙＬｉｇｈｔ４８８標識ｗｈｏｌｅ Ｔｔｈを用いて、ドメインＥ特異的形質細胞を選抜した。
【0124】
ＴａｑポリメラーゼのドメインＥを標的として選抜された形質細胞の個数は、方法１及び２よりも方法３で多くなり、方法３で２８８個であった。ＴｔｈポリメラーゼのドメインＥを標的として選抜された形質細胞の個数は、方法４で１９２個、方法５で２４０個であった。
【0125】
方法３～５で選抜された形質細胞を用いて、米国特許出願公開第２０１１／０２０８７９号、米国特許出願公開第２０１３／０２３００９号、及び米国特許出願公開第２０１１／１１７６０９号に記載の方法により、抗体発現ベクターの構築を行った。この際、モルモット重鎖及び軽鎖定常領域はそれぞれ配列番号５１及び５２に記載のアミノ酸配列を利用した。方法３から２２個、方法４から９個、方法５から６６個の抗体発現ベクターを取得することができた。
【0126】
方法３～５では、方法１及び２に比べて、モルモットのリンパ節の腫れが大きく、単離された形質細胞の個数が多かったことから、ＴｔｈポリメラーゼはＴａｑポリメラーゼに比べて抗原としての免疫反応が大きかったといえる。このため、Ｔｔｈポリメラーゼを抗原として用いることにより、Ｔａｑポリメラーゼ及びＴｔｈポリメラーゼのどちらに対しても、ドメインＥ特異的形質細胞を効率的に選抜できることが判明した。また、方法５では、方法４に比べて、単離された形質細胞の個数及び抗体発現ベクターが多く得られた。従って、ＤＮＡポリメラーゼ全体で免疫するよりも、ドメインＥのみで免疫した場合に、ドメインＥに特異的に結合する抗体（抗ドメインＥ抗体）を効率的に取得できることが判明した。
【0127】
以後の試験例では、方法３～５で得られた抗体発現ベクターを発現させることにより取得される抗体を使用した。
【0128】
試験例５．抗体のドメインＥに対する結合能評価
米国特許出願公開第２０１８／２９２４０７号に記載の方法により、２９３ＦＴ細胞に抗体発現ベクターを導入し、抗体が分泌された培養上清を回収した。炭酸緩衝液を用いて、市販のホットスタート抗体（ＴＣＰ－１０１、東洋紡株式会社製）をＥＬＩＳＡプレート（住友ベークライト社、ＭＳ－８８９６Ｆ）に固相化した。各ウェルを洗浄後に１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（グロブリンフリー、ナカライテスク社）を含む１×ＴＢＳ（ナカライテスク社）を用いてブロッキングを実施した。各ウェルを洗浄後に１×ＴＢＳ－Ｔ（ナカライテスク社）で希釈した抗原（ｗｈｏｌｅ Ｔａｑ、ｗｈｏｌｅ Ｔｔｈ）を各ウェルに添加した。各ウェルを洗浄後に培養上清を各ウェルに添加した。各ウェルを洗浄後に、Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ ＩｇＧ Ｈ＆Ｌ （ＨＲＰ）（Ａｂｃａｍ社）を５００００倍希釈して添加した。各ウェルを洗浄後に、ＴＭＢ溶液（ＴＭＢＷ－１０００－０１、ＳＵＲＭＯＤＩＣＳ社）を添加して発色させ、１Ｎ硫酸（ナカライテスク社）を添加して反応を停止させたのちに、プレートリーダで４５０～６２０ｎｍの波長を測定した。本結合能評価では、ＤＮＡポリメラーゼ活性ドメインは固相化抗体で占有されているため、ドメインＥに対する抗体の結合能が評価される。
米国特許出願公開第２０１８／２９２４０７号に記載の方法により、２９３ＦＴ細胞に抗体発現ベクターを導入し、抗体が分泌された培養上清を回収した。炭酸緩衝液を用いて、市販のホットスタート抗体（ＴＣＰ－１０１、東洋紡株式会社製）をＥＬＩＳＡプレート（住友ベークライト社、ＭＳ－８８９６Ｆ）に固相化した。各ウェルを洗浄後に１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン（グロブリンフリー、ナカライテスク社）を含む１×ＴＢＳ（ナカライテスク社）を用いてブロッキングを実施した。各ウェルを洗浄後に１×ＴＢＳ－Ｔ（ナカライテスク社）で希釈した抗原（ｗｈｏｌｅ Ｔａｑ、ｗｈｏｌｅ Ｔｔｈ）を各ウェルに添加した。各ウェルを洗浄後に培養上清を各ウェルに添加した。各ウェルを洗浄後に、Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｇｕｉｎｅａ ｐｉｇ ＩｇＧ Ｈ＆Ｌ （ＨＲＰ）（Ａｂｃａｍ社）を５００００倍希釈して添加した。各ウェルを洗浄後に、ＴＭＢ溶液（ＴＭＢＷ－１０００－０１、ＳＵＲＭＯＤＩＣＳ社）を添加して発色させ、１Ｎ硫酸（ナカライテスク社）を添加して反応を停止させたのちに、プレートリーダで４５０～６２０ｎｍの波長を測定した。本結合能評価では、ＤＮＡポリメラーゼ活性ドメインは固相化抗体で占有されているため、ドメインＥに対する抗体の結合能が評価される。
【0129】
方法３で取得した２２個の抗体のうち、ｗｈｏｌｅ Ｔａｑに結合する抗体は２０個（ヒット率９１％）であり、ｗｈｏｌｅ Ｔａｑ及びｗｈｏｌｅ Ｔｔｈのどちらにも結合する抗体は１９個（ヒット率８６％）であった。
【0130】
方法４で取得した９個の抗体のうち、ｗｈｏｌｅ Ｔｔｈに結合する抗体は１個（ヒット率１１％）であり、この抗体はｗｈｏｌｅ Ｔａｑへの結合は示さなかった。
【0131】
方法５で取得した６６個の抗体のうち、ｗｈｏｌｅ Ｔｔｈに結合する抗体は３２個（ヒット率４８％）であり、ｗｈｏｌｅ Ｔｔｈ及びｗｈｏｌｅ Ｔａｑのどちらにも結合する抗体は１２個（ヒット率１８％）であった。
【0132】
方法３では、方法４及び方法５に比べて、各ＤＮＡポリメラーゼに対するヒット率及び両方のＤＮＡポリメラーゼに対するヒット率が２～８倍程度高かった。この結果から、ＴａｑポリメラーゼのドメインＥに特異的に結合する抗体の取得において、免疫反応を強く誘起するＴｔｈ Ｅｘｏを抗原とし、蛍光標識したｗｈｏｌｅ Ｔａｑを用いてドメインＥ特異的形質細胞を選抜する手法が効率的であるといえる。また、ＴｔｈポリメラーゼのドメインＥに特異的に結合する抗体の取得においても、Ｔｔｈ Ｅｘｏを抗原とし、蛍光標識したｗｈｏｌｅ Ｔｔｈを用いてドメインＥ特異的形質細胞を選抜する手法が予想外の効果を生み、高い確率でドメインＥ特異的抗体を単離可能であることが判明した。
【0133】
試験例６．ドメインＥを有するＤＮＡポリメラーゼによるプローブの分解
ドメインＥを有するＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲ反応液を２５℃で２４時間曝露した場合、プローブが分解されることを確認した。
ドメインＥを有するＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲ反応液を２５℃で２４時間曝露した場合、プローブが分解されることを確認した。
【0134】
（１）ＰＣＲ反応液の構成成分
［ＰＣＲ用ミックス］
下記に示す組成のＰＣＲ用ミックス１を調製した。
ＰＣＲ用ミックス１：
Ｔａｑポリメラーゼ（０．０５Ｕ／μＬ、ＴＡＰ－２０１、東洋紡株式会社製）；
ホットスタートＰＣＲ用抗ポリメラーゼ抗体（０．０１μｇ／μＬ、ＴＣＰ－１０１、
東洋紡株式会社製）;
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３）；
５０ｍＭ ＫＣｌ；
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；及び
０．３ｍＭ ｄＮＴＰｓ。
［ＰＣＲ用ミックス］
下記に示す組成のＰＣＲ用ミックス１を調製した。
ＰＣＲ用ミックス１：
Ｔａｑポリメラーゼ（０．０５Ｕ／μＬ、ＴＡＰ－２０１、東洋紡株式会社製）；
ホットスタートＰＣＲ用抗ポリメラーゼ抗体（０．０１μｇ／μＬ、ＴＣＰ－１０１、
東洋紡株式会社製）;
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３）；
５０ｍＭ ＫＣｌ；
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；及び
０．３ｍＭ ｄＮＴＰｓ。
【0135】
［プライマー／プローブ］
２０倍濃度のプライマー／プローブ混合液として、ＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用した。当該混合液中のプライマー／プローブで増幅／検出される遺伝子は、ＩＬ６、ＣＤＫ１０、ＡＰＣ、ＭＡＰＫ８、ＳＩＶＡ１、ＲＰＳ１９、又はＳＥＲＰＩＮＢ５である。
２０倍濃度のプライマー／プローブ混合液として、ＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用した。当該混合液中のプライマー／プローブで増幅／検出される遺伝子は、ＩＬ６、ＣＤＫ１０、ＡＰＣ、ＭＡＰＫ８、ＳＩＶＡ１、ＲＰＳ１９、又はＳＥＲＰＩＮＢ５である。
【0136】
［核酸テンプレート］
ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌由来）ＲＮＡから作製したｃＤＮＡを用いた。ＲＮＡの抽出及びｃＤＮＡの合成には、Ｈｕｍａｎ ＨｅＬａ Ｃｅｌｌ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（６３６５４３、タカラバイオ株式会社）及びＳｕｐｅｒＰｒｅｐ（商標） ＩＩ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ＆ＲＴ Ｋｉｔ ｆｏｒ ｑＰＣＲ（ＳＣＱ－４０１、東洋紡株式会社）を用い、手順は取扱説明書に従った。
ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌由来）ＲＮＡから作製したｃＤＮＡを用いた。ＲＮＡの抽出及びｃＤＮＡの合成には、Ｈｕｍａｎ ＨｅＬａ Ｃｅｌｌ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（６３６５４３、タカラバイオ株式会社）及びＳｕｐｅｒＰｒｅｐ（商標） ＩＩ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ＆ＲＴ Ｋｉｔ ｆｏｒ ｑＰＣＲ（ＳＣＱ－４０１、東洋紡株式会社）を用い、手順は取扱説明書に従った。
【0137】
（２）反応
ＰＣＲ用ミックス１に、各プライマー／プローブを１／２０、核酸テンプレートを１／２０の割合で混合し、ＰＣＲ反応液２０μＬを調製した。ＰＣＲ反応液を、－２０℃又は２５℃で２４時間保管した。その後、リアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｆａｓｔ リアルタイムＰＣＲシステム）を使用して、以下の温度サイクルで反応を実施した。６０℃、６０秒の伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
（温度サイクル）
工程１：９５℃ １分
工程２：９５℃ １５秒－６０℃ ６０秒 ５０サイクル（ＰＣＲ）
ＰＣＲ用ミックス１に、各プライマー／プローブを１／２０、核酸テンプレートを１／２０の割合で混合し、ＰＣＲ反応液２０μＬを調製した。ＰＣＲ反応液を、－２０℃又は２５℃で２４時間保管した。その後、リアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｆａｓｔ リアルタイムＰＣＲシステム）を使用して、以下の温度サイクルで反応を実施した。６０℃、６０秒の伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
（温度サイクル）
工程１：９５℃ １分
工程２：９５℃ １５秒－６０℃ ６０秒 ５０サイクル（ＰＣＲ）
【0138】
（３）結果
本反応系では、ＦＡＭチャネルで各遺伝子を検出する。リアルタイムＰＣＲを用いて、ＨｅＬａ ｃＤＮＡ中の各遺伝子（ＩＬ６、ＣＤＫ１０、ＡＰＣ、ＭＡＰＫ８、ＳＩＶＡ１、ＲＰＳ１９、ＳＥＲＰＩＮＢ５）を検出した際のＣｔ値と、Ｍｕｌｔｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｄａｔａにおける１０サイクル目の蛍光値を表９に示す。
本反応系では、ＦＡＭチャネルで各遺伝子を検出する。リアルタイムＰＣＲを用いて、ＨｅＬａ ｃＤＮＡ中の各遺伝子（ＩＬ６、ＣＤＫ１０、ＡＰＣ、ＭＡＰＫ８、ＳＩＶＡ１、ＲＰＳ１９、ＳＥＲＰＩＮＢ５）を検出した際のＣｔ値と、Ｍｕｌｔｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｄａｔａにおける１０サイクル目の蛍光値を表９に示す。
【0139】
ＰＣＲ反応液を２５℃で２４時間曝露した場合、－２０℃で２４時間曝露した場合に比べて、ＩＬ６、ＣＤＫ１０、及びＳＩＶＡ１遺伝子でＣｔ値の２以上の遅れが見られ、ＲＰＳ１９遺伝子でＣｔ値が算出されなかった（結果の表において「－」で示す）。ＲＰＳ１９遺伝子でＣｔ値が算出されなかった理由は、プローブが全て分解され、増幅産物に対応する蛍光値の上昇が生じないためと推測される。
【0140】
また、ＰＣＲ反応液を２５℃で２４時間曝露した場合、－２０℃で２４時間曝露した場合に比べて、７種類全ての遺伝子で１０サイクル目の蛍光値が上昇した。蛍光値が上昇する理由は、２５℃で２４時間の曝露により、サイクル開始前に蛍光標識プローブが分解を受け、蛍光標識が遊離し、その結果、クエンチャーによる消光が解除されて蛍光が生じたためと推測される。従って、２５℃で２４時間曝露した場合、７種類の遺伝子を検出する蛍光標識プローブが全て分解することを見出した。
【0141】
【表9】
【0142】
試験例７．抗ドメインＥ抗体によるプローブの分解抑制
ドメインＥを有するＤＮＡポリメラーゼ及び抗ドメインＥ抗体を含むＰＣＲ反応液を２５℃で２４時間曝露した場合、抗ドメインＥ抗体がプローブの分解を抑制するか否か確認した。
ドメインＥを有するＤＮＡポリメラーゼ及び抗ドメインＥ抗体を含むＰＣＲ反応液を２５℃で２４時間曝露した場合、抗ドメインＥ抗体がプローブの分解を抑制するか否か確認した。
【0143】
（１）抗ドメインＥ抗体の調製
米国特許出願公開第２０１８／２９２４０７号に記載の方法により、２９３ＦＴ細胞に、上記試験例１～４に記載の方法で得られた抗体発現ベクターを導入し、抗体が分泌された培養上清を回収した。ＡＫＴＡ ｐｕｒｅ ２５（Ｃｙｔｉｖａ社）を用いて、培養上清をＨｉＴｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＡ ＨＰカラム（Ｃｙｔｉｖａ社）に通して抗体を吸着させた。洗浄Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ ７．４）を用いて当該カラムを洗浄した後、溶出Ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍ クエン酸－ＮａＯＨ、ｐＨ３．５）で溶出させた。Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５（Ｍｅｒｃｋ社）を用いて抗体を濃縮し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ Ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で定量した。クローン番号Ａｎｔｉ－ＴＡＱ１～５は試験例４の方法３により取得した抗ドメインＥ抗体であり、クローン番号Ａｎｔｉ－ＴＴＨ１～５は試験例４の方法５により取得した抗ドメインＥ抗体である。
米国特許出願公開第２０１８／２９２４０７号に記載の方法により、２９３ＦＴ細胞に、上記試験例１～４に記載の方法で得られた抗体発現ベクターを導入し、抗体が分泌された培養上清を回収した。ＡＫＴＡ ｐｕｒｅ ２５（Ｃｙｔｉｖａ社）を用いて、培養上清をＨｉＴｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＡ ＨＰカラム（Ｃｙｔｉｖａ社）に通して抗体を吸着させた。洗浄Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ ７．４）を用いて当該カラムを洗浄した後、溶出Ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍ クエン酸－ＮａＯＨ、ｐＨ３．５）で溶出させた。Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５（Ｍｅｒｃｋ社）を用いて抗体を濃縮し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ Ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で定量した。クローン番号Ａｎｔｉ－ＴＡＱ１～５は試験例４の方法３により取得した抗ドメインＥ抗体であり、クローン番号Ａｎｔｉ－ＴＴＨ１～５は試験例４の方法５により取得した抗ドメインＥ抗体である。
【0144】
（２）ＰＣＲ反応液の構成成分
［ＰＣＲ用ミックス］
試験例６で使用したＰＣＲ用ミックス１と同じものを使用した。さらに、下記の２種類のＰＣＲ用ミックス２及び３を調製して使用した。
ＰＣＲ用ミックス２：
Ｔｔｈポリメラーゼ（０．０５Ｕ／μＬ、ＴＴＨ－３０１、東洋紡株式会社製）；
ホットスタートＰＣＲ用抗ポリメラーゼ抗体（０．０１μｇ／μＬ、ＴＣＰ－１０１、東洋紡株式会社製）;
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３）；
８０ｍＭ ＫＣｌ；
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；
０．５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ；
０．１％（ｖ／ｖ） ＴｒｉｔｏｎＸ－１００；
０．１％（ｗ／ｖ） コール酸ナトリウム；及び
０．３ｍＭ ｄＮＴＰｓ。
ＰＣＲ用ミックス３：
国際公開第２０１８／０９６９６１号に記載のＴｔｈポリメラーゼ（変異体）（０．０５Ｕ／μＬ）；
ホットスタートＰＣＲ用抗ポリメラーゼ抗体（０．０１μｇ／μＬ、ＴＣＰ－１０１、東洋紡株式会社製）;
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３）；
８０ｍＭ ＫＣｌ；
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；
０．５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ；
０．１％（ｖ／ｖ） ＴｒｉｔｏｎＸ－１００；
０．１％（ｗ／ｖ） コール酸ナトリウム；及び
０．３ｍＭ ｄＮＴＰｓ。
［ＰＣＲ用ミックス］
試験例６で使用したＰＣＲ用ミックス１と同じものを使用した。さらに、下記の２種類のＰＣＲ用ミックス２及び３を調製して使用した。
ＰＣＲ用ミックス２：
Ｔｔｈポリメラーゼ（０．０５Ｕ／μＬ、ＴＴＨ－３０１、東洋紡株式会社製）；
ホットスタートＰＣＲ用抗ポリメラーゼ抗体（０．０１μｇ／μＬ、ＴＣＰ－１０１、東洋紡株式会社製）;
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３）；
８０ｍＭ ＫＣｌ；
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；
０．５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ；
０．１％（ｖ／ｖ） ＴｒｉｔｏｎＸ－１００；
０．１％（ｗ／ｖ） コール酸ナトリウム；及び
０．３ｍＭ ｄＮＴＰｓ。
ＰＣＲ用ミックス３：
国際公開第２０１８／０９６９６１号に記載のＴｔｈポリメラーゼ（変異体）（０．０５Ｕ／μＬ）；
ホットスタートＰＣＲ用抗ポリメラーゼ抗体（０．０１μｇ／μＬ、ＴＣＰ－１０１、東洋紡株式会社製）;
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３）；
８０ｍＭ ＫＣｌ；
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；
０．５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ；
０．１％（ｖ／ｖ） ＴｒｉｔｏｎＸ－１００；
０．１％（ｗ／ｖ） コール酸ナトリウム；及び
０．３ｍＭ ｄＮＴＰｓ。
【0145】
［プライマー／プローブ］
２０倍濃度のプライマー／プローブの混合液として、ＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用した。当該混合液中のプライマー／プローブで増幅／検出される遺伝子はＲＰＳ１９である。
２０倍濃度のプライマー／プローブの混合液として、ＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用した。当該混合液中のプライマー／プローブで増幅／検出される遺伝子はＲＰＳ１９である。
【0146】
［核酸テンプレート］
ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌由来）ＲＮＡから作製したｃＤＮＡを用いた。ＲＮＡの抽出及びｃＤＮＡの合成には、Ｈｕｍａｎ ＨｅＬａ Ｃｅｌｌ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（６３６５４３、タカラバイオ株式会社）及びＳｕｐｅｒＰｒｅｐ（商標） ＩＩ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ＆ＲＴ Ｋｉｔ ｆｏｒ ｑＰＣＲ（ＳＣＱ－４０１、東洋紡株式会社）を用い、手順は取扱説明書に従った。
ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌由来）ＲＮＡから作製したｃＤＮＡを用いた。ＲＮＡの抽出及びｃＤＮＡの合成には、Ｈｕｍａｎ ＨｅＬａ Ｃｅｌｌ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（６３６５４３、タカラバイオ株式会社）及びＳｕｐｅｒＰｒｅｐ（商標） ＩＩ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ＆ＲＴ Ｋｉｔ ｆｏｒ ｑＰＣＲ（ＳＣＱ－４０１、東洋紡株式会社）を用い、手順は取扱説明書に従った。
【0147】
（３）反応
（反応液１）
ＰＣＲ用ミックス１に、プライマー／プローブを１／２０、核酸テンプレートを１／２０の割合で混合し、混合液１９μＬを調製した。コントロールとして、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１μＬを前記混合液に添加して、－２０℃又は２５℃で２４時間曝露した。また、同じくコントロールとして、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（１０９６５－０２８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）１μＬを前記混合液に添加し、２５℃で２４時間曝露した。抗ドメインＥ抗体については、各０．８ｍｇ／ｍＬ溶液１μＬを前記混合液に添加し（持ち込み量：０．８μｇ）、２５℃で２４時間曝露した。
（反応液２）
ＰＣＲ用ミックス２に、プライマー／プローブを１／２０、核酸テンプレートを１／２０の割合で混合し、混合液１９μＬを調製した。コントロールとして、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１μＬを前記混合液に添加して、－２０℃又は２５℃で２４時間曝露した。抗ドメインＥ抗体については、各１．２ｍｇ／ｍＬ溶液１μＬを前記混合液に添加し（持ち込み量：１．２μｇ）、２５℃で２４時間曝露した。
（反応液３）
ＰＣＲ用ミックス３に、プライマー／プローブを１／２０、核酸テンプレートを１／２０の割合で混合し、混合液１９μＬを調製した。コントロールとして、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１μＬを前記混合液に添加して、－２０℃又は２５℃で２４時間曝露した。抗ドメインＥ抗体については、各１．２ｍｇ／ｍＬ溶液１μＬを前記混合液に添加し（持ち込み量：１．２μｇ）、２５℃で２４時間曝露した。
（反応）
反応液１～３について、リアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｆａｓｔ リアルタイムＰＣＲシステム）を使用して、以下の温度サイクルで反応を実施した。６０℃、６０秒の伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。（温度サイクル）
工程１：９５℃ １分
工程２：９５℃ １５秒－６０℃ ６０秒 ５０サイクル（ＰＣＲ）
（反応液１）
ＰＣＲ用ミックス１に、プライマー／プローブを１／２０、核酸テンプレートを１／２０の割合で混合し、混合液１９μＬを調製した。コントロールとして、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１μＬを前記混合液に添加して、－２０℃又は２５℃で２４時間曝露した。また、同じくコントロールとして、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（１０９６５－０２８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）１μＬを前記混合液に添加し、２５℃で２４時間曝露した。抗ドメインＥ抗体については、各０．８ｍｇ／ｍＬ溶液１μＬを前記混合液に添加し（持ち込み量：０．８μｇ）、２５℃で２４時間曝露した。
（反応液２）
ＰＣＲ用ミックス２に、プライマー／プローブを１／２０、核酸テンプレートを１／２０の割合で混合し、混合液１９μＬを調製した。コントロールとして、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１μＬを前記混合液に添加して、－２０℃又は２５℃で２４時間曝露した。抗ドメインＥ抗体については、各１．２ｍｇ／ｍＬ溶液１μＬを前記混合液に添加し（持ち込み量：１．２μｇ）、２５℃で２４時間曝露した。
（反応液３）
ＰＣＲ用ミックス３に、プライマー／プローブを１／２０、核酸テンプレートを１／２０の割合で混合し、混合液１９μＬを調製した。コントロールとして、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１μＬを前記混合液に添加して、－２０℃又は２５℃で２４時間曝露した。抗ドメインＥ抗体については、各１．２ｍｇ／ｍＬ溶液１μＬを前記混合液に添加し（持ち込み量：１．２μｇ）、２５℃で２４時間曝露した。
（反応）
反応液１～３について、リアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｆａｓｔ リアルタイムＰＣＲシステム）を使用して、以下の温度サイクルで反応を実施した。６０℃、６０秒の伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。（温度サイクル）
工程１：９５℃ １分
工程２：９５℃ １５秒－６０℃ ６０秒 ５０サイクル（ＰＣＲ）
【0148】
（４）結果
反応液１、２、及び３について、ＲＰＳ１９遺伝子を検出した際のＣｔ値及びＭｕｌｔｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｄａｔａにおける１０サイクル目の蛍光値を、表１０、１１、及び１２にそれぞれ示す。また、Ａｎｔｉ－ＴＡＱ１～５及びＡｎｔｉ－ＴＴＨ１～５の重鎖（Ｈ鎖）相補性決定領域（ＣＤＲ）１～３、軽鎖（Ｌ鎖）相補性決定領域（ＣＤＲ）１～３の配列、及びＬ鎖ＣＤＲ２のＣ末端に隣接する配列を表１３に示す。
反応液１、２、及び３について、ＲＰＳ１９遺伝子を検出した際のＣｔ値及びＭｕｌｔｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｄａｔａにおける１０サイクル目の蛍光値を、表１０、１１、及び１２にそれぞれ示す。また、Ａｎｔｉ－ＴＡＱ１～５及びＡｎｔｉ－ＴＴＨ１～５の重鎖（Ｈ鎖）相補性決定領域（ＣＤＲ）１～３、軽鎖（Ｌ鎖）相補性決定領域（ＣＤＲ）１～３の配列、及びＬ鎖ＣＤＲ２のＣ末端に隣接する配列を表１３に示す。
【0149】
Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを添加した反応液１を２５℃で２４時間曝露した場合、－２０℃で２４時間曝露した場合に比べて、ＲＰＳ１９遺伝子のＣｔ値が５～６程度遅くなっていることから、検出感度が２５～２６倍程度低下しているといえる。これに対して、抗ドメインＥ抗体を添加した反応液１では、全てＣｔ値が３０を下回った。また、抗ドメインＥ抗体の全てのクローンでプローブ分解抑制指標（ａ）～（ｃ）を満たした：
（ａ）Ｃｔ値比［－２０℃２４時間の曝露後（２５℃２４時間の曝露前に相当）に測定したＣｔ値／２５℃２４時間の曝露後に測定したＣｔ値］≧０．８
（ｂ）蛍光強度比［－２０℃２４時間の曝露後（２５℃２４時間の曝露前に相当）に測定したサイクル初期の蛍光強度／２５℃２４時間の曝露後に測定したサイクル初期の蛍光強度］≧０．３
（ｃ）プローブ分解率［（Ｆ３３－Ｆ３１）÷（Ｆ３２－Ｆ３１）×１００］≦４０％
Ｆ３１：抗ドメインＥ抗体の非存在下で－２０℃２４時間の曝露後（２５℃２４時間の曝露前に相当）に測定したサイクル初期の蛍光強度
Ｆ３２：抗ドメインＥ抗体の非存在下で２５℃２４時間曝露した後に測定したサイクル初期の蛍光強度
Ｆ３３：抗ドメインＥ抗体の存在下で２５℃２４時間曝露した後に測定したサイクル初期の蛍光強度
このことから、抗ドメインＥ抗体の全てのクローンがプローブ分解抑制効果を有することを見出した。
（ａ）Ｃｔ値比［－２０℃２４時間の曝露後（２５℃２４時間の曝露前に相当）に測定したＣｔ値／２５℃２４時間の曝露後に測定したＣｔ値］≧０．８
（ｂ）蛍光強度比［－２０℃２４時間の曝露後（２５℃２４時間の曝露前に相当）に測定したサイクル初期の蛍光強度／２５℃２４時間の曝露後に測定したサイクル初期の蛍光強度］≧０．３
（ｃ）プローブ分解率［（Ｆ３３－Ｆ３１）÷（Ｆ３２－Ｆ３１）×１００］≦４０％
Ｆ３１：抗ドメインＥ抗体の非存在下で－２０℃２４時間の曝露後（２５℃２４時間の曝露前に相当）に測定したサイクル初期の蛍光強度
Ｆ３２：抗ドメインＥ抗体の非存在下で２５℃２４時間曝露した後に測定したサイクル初期の蛍光強度
Ｆ３３：抗ドメインＥ抗体の存在下で２５℃２４時間曝露した後に測定したサイクル初期の蛍光強度
このことから、抗ドメインＥ抗体の全てのクローンがプローブ分解抑制効果を有することを見出した。
【0150】
Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを添加した反応液２を２５℃で２４時間曝露した場合、ＲＰＳ１９遺伝子は検出できなかった。これに対して、抗ドメインＥ抗体を添加した反応液２では、全てＲＰＳ１９遺伝子を検出できた。また、抗ドメインＥ抗体の全てのクローンでプローブ分解抑制指標（ａ）～（ｃ）を満たし、プローブ分解抑制効果があることを見出した。Ａｎｔｉ－ＴＴＨ２及び３については、Ｔａｑを含む反応液１でも効果を示すことを見出した。
【0151】
Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを添加した反応液３を２５℃で２４時間曝露した場合、ＲＰＳ１９遺伝子は検出できなかった。これに対して、抗ドメインＥ抗体を添加した反応液３では、全てＲＰＳ１９遺伝子を検出できた。抗ドメインＥ抗体の全てのクローンでプローブ分解抑制指標（ａ）～（ｃ）を満たし、プローブ分解抑制効果があることを見出した。反応液３では、抗ドメインＥ抗体を添加した場合に、プローブ分解抑制指標（ｂ）が１を、プローブ分解抑制指標（ｃ）が１００％をそれぞれ大きく上回った。原因は、コントロールの試薬調製時やリアルタイムＰＣＲ装置へのセット時などに反応液が常温に達し、蛍光標識プローブが分解したためと考えられる。従って、本抗体は、長期間の反応液の保管だけではなく、通常の核酸増幅試薬の調製時などにも反応液中のプローブの分解を抑制できる。
【0152】
【表10】
【0153】
【表11】
【0154】
【表12】
【0155】
【表13】
【0156】
試験例８．ＰＣＲ反応液の２５℃での曝露時間の影響
ＰＣＲ反応液の２５℃での曝露時間を変化させて、抗ドメインＥ抗体のプローブ分解抑制効果について確認した。
（１）ＰＣＲ反応液の構成成分
［ＰＣＲ用ミックス］
試験例６で使用したＰＣＲ用ミックス１と同じものを使用した。
ＰＣＲ反応液の２５℃での曝露時間を変化させて、抗ドメインＥ抗体のプローブ分解抑制効果について確認した。
（１）ＰＣＲ反応液の構成成分
［ＰＣＲ用ミックス］
試験例６で使用したＰＣＲ用ミックス１と同じものを使用した。
【0157】
［プライマー／プローブ］
２０倍濃度のプライマー／プローブ混合液として、ＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用した。当該混合液中のプライマー／プローブで増幅／検出される遺伝子はＩＬ６、ＣＤＫ１０、及びＲＰＳ１９である。
２０倍濃度のプライマー／プローブ混合液として、ＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用した。当該混合液中のプライマー／プローブで増幅／検出される遺伝子はＩＬ６、ＣＤＫ１０、及びＲＰＳ１９である。
【0158】
［核酸テンプレート］
ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌由来）ＲＮＡから作製したｃＤＮＡを用いた。ＲＮＡの抽出及びｃＤＮＡの合成には、Ｈｕｍａｎ ＨｅＬａ Ｃｅｌｌ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（６３６５４３、タカラバイオ株式会社）及びＳｕｐｅｒＰｒｅｐ（商標） ＩＩ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ＆ＲＴ Ｋｉｔ ｆｏｒ ｑＰＣＲ（ＳＣＱ－４０１、東洋紡株式会社）を用い、手順は取扱説明書に従った。
ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌由来）ＲＮＡから作製したｃＤＮＡを用いた。ＲＮＡの抽出及びｃＤＮＡの合成には、Ｈｕｍａｎ ＨｅＬａ Ｃｅｌｌ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（６３６５４３、タカラバイオ株式会社）及びＳｕｐｅｒＰｒｅｐ（商標） ＩＩ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ＆ＲＴ Ｋｉｔ ｆｏｒ ｑＰＣＲ（ＳＣＱ－４０１、東洋紡株式会社）を用い、手順は取扱説明書に従った。
【0159】
（２）反応
（反応液）
ＰＣＲ用ミックス１に、各プライマー／プローブを１／２０、核酸テンプレートを１／２０の割合で混合し、混合液１９μＬを調製した。コントロールとして、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１μＬを前記混合液に添加して、－２０℃又は２５℃で２４時間曝露した。抗ドメインＥ抗体については、各０．１ｍｇ／ｍＬ溶液１μＬを前記混合液に添加し（持ち込み量：０．１μｇ）、２５℃で２４時間曝露した。その後、リアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｆａｓｔ リアルタイムＰＣＲシステム）を使用して、以下の温度サイクルで反応を実施した。６０℃、６０秒の伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
（温度サイクル）
工程１：９５℃ １分
工程２：９５℃ １５秒－６０℃ ６０秒 ５０サイクル（ＰＣＲ）
（反応液）
ＰＣＲ用ミックス１に、各プライマー／プローブを１／２０、核酸テンプレートを１／２０の割合で混合し、混合液１９μＬを調製した。コントロールとして、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１μＬを前記混合液に添加して、－２０℃又は２５℃で２４時間曝露した。抗ドメインＥ抗体については、各０．１ｍｇ／ｍＬ溶液１μＬを前記混合液に添加し（持ち込み量：０．１μｇ）、２５℃で２４時間曝露した。その後、リアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｆａｓｔ リアルタイムＰＣＲシステム）を使用して、以下の温度サイクルで反応を実施した。６０℃、６０秒の伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
（温度サイクル）
工程１：９５℃ １分
工程２：９５℃ １５秒－６０℃ ６０秒 ５０サイクル（ＰＣＲ）
【0160】
（３）結果
各遺伝子（ＩＬ６、ＣＤＫ１０、ＲＰＳ１９）を検出した際のＣｔ値を表１４に示す。Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを添加した反応液を２５℃で２４時間曝露した場合では、３つの遺伝子で検出不能となった。一方、各抗ドメインＥ抗体を０．１μｇ添加した反応液では、Ｃｔ値の遅れは確認されず、いずれの遺伝子も検出可能となった。また、当該反応液を２５℃で７２時間曝露してもＣｔ値の遅れは見られなかった。さらに、蛍光値の上昇も確認されないことから、抗ドメインＥ抗体の添加によってプローブの分解が抑制されていることが判明した。従って、当該抗体を用いることにより、２５℃で７２時間の条件下でもＰＣＲ反応液の保管が可能になることが確認された。
各遺伝子（ＩＬ６、ＣＤＫ１０、ＲＰＳ１９）を検出した際のＣｔ値を表１４に示す。Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを添加した反応液を２５℃で２４時間曝露した場合では、３つの遺伝子で検出不能となった。一方、各抗ドメインＥ抗体を０．１μｇ添加した反応液では、Ｃｔ値の遅れは確認されず、いずれの遺伝子も検出可能となった。また、当該反応液を２５℃で７２時間曝露してもＣｔ値の遅れは見られなかった。さらに、蛍光値の上昇も確認されないことから、抗ドメインＥ抗体の添加によってプローブの分解が抑制されていることが判明した。従って、当該抗体を用いることにより、２５℃で７２時間の条件下でもＰＣＲ反応液の保管が可能になることが確認された。
【0161】
【表14】
【0162】
試験例９．微量の抗ドメインＥ抗体によるプローブの分解抑制
０．１μｇの抗ドメインＥ抗体を含むＰＣＲ反応液を２５℃で２４時間曝露した場合、プローブの分解が抑制されるか否か確認した。
０．１μｇの抗ドメインＥ抗体を含むＰＣＲ反応液を２５℃で２４時間曝露した場合、プローブの分解が抑制されるか否か確認した。
【0163】
（１）反応液の構成成分
［ＰＣＲ用ミックス］
試験例７で使用したＰＣＲ用ミックス２と同じものを使用した。
［ＰＣＲ用ミックス］
試験例７で使用したＰＣＲ用ミックス２と同じものを使用した。
【0164】
［プライマー／プローブ］
２０倍濃度のプライマー／プローブ混合液として、ＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用した。当該混合液中のプライマー／プローブで増幅／検出される遺伝子はＩＬ６、ＣＤＫ１０、ＳＩＶＡ１、及びＲＰＳ１９である。
２０倍濃度のプライマー／プローブ混合液として、ＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用した。当該混合液中のプライマー／プローブで増幅／検出される遺伝子はＩＬ６、ＣＤＫ１０、ＳＩＶＡ１、及びＲＰＳ１９である。
【0165】
［核酸テンプレート］
ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌由来）ＲＮＡから作製したｃＤＮＡを用いた。ＲＮＡの抽出及びｃＤＮＡの合成には、Ｈｕｍａｎ ＨｅＬａ Ｃｅｌｌ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（６３６５４３、タカラバイオ株式会社）及びＳｕｐｅｒＰｒｅｐ（商標） ＩＩ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ＆ＲＴ Ｋｉｔ ｆｏｒ ｑＰＣＲ（ＳＣＱ－４０１、東洋紡株式会社）を用い、手順は取扱説明書に従った。
ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌由来）ＲＮＡから作製したｃＤＮＡを用いた。ＲＮＡの抽出及びｃＤＮＡの合成には、Ｈｕｍａｎ ＨｅＬａ Ｃｅｌｌ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（６３６５４３、タカラバイオ株式会社）及びＳｕｐｅｒＰｒｅｐ（商標） ＩＩ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ＆ＲＴ Ｋｉｔ ｆｏｒ ｑＰＣＲ（ＳＣＱ－４０１、東洋紡株式会社）を用い、手順は取扱説明書に従った。
【0166】
（２）反応
ＰＣＲ用ミックス２に、各プライマー／プローブを１／２０、核酸テンプレートを１／２０の割合で混合し、混合液１５μＬを調製した。コントロールとして、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）５μＬを前記混合液に添加して、－２０℃又は２５℃で２４時間曝露した。抗ドメインＥ抗体については、各０．１ｍｇ／ｍＬ溶液１μＬを前記混合液に添加し（持ち込み量：０．１μｇ）、２５℃で２４時間曝露した。
各反応液について、リアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
７５００ Ｆａｓｔ リアルタイムＰＣＲシステム）を使用して、以下の温度サイクルで反応を実施した。６０℃、６０秒の伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
（温度サイクル）
工程１：９５℃ １分
工程２：９５℃ １５秒－６０℃ ６０秒 ５０サイクル（ＰＣＲ）
ＰＣＲ用ミックス２に、各プライマー／プローブを１／２０、核酸テンプレートを１／２０の割合で混合し、混合液１５μＬを調製した。コントロールとして、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）５μＬを前記混合液に添加して、－２０℃又は２５℃で２４時間曝露した。抗ドメインＥ抗体については、各０．１ｍｇ／ｍＬ溶液１μＬを前記混合液に添加し（持ち込み量：０．１μｇ）、２５℃で２４時間曝露した。
各反応液について、リアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
７５００ Ｆａｓｔ リアルタイムＰＣＲシステム）を使用して、以下の温度サイクルで反応を実施した。６０℃、６０秒の伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
（温度サイクル）
工程１：９５℃ １分
工程２：９５℃ １５秒－６０℃ ６０秒 ５０サイクル（ＰＣＲ）
【0167】
（３）結果
表１５に、各遺伝子（ＩＬ６、ＣＤＫ１０、ＳＩＶＡ１、ＲＰＳ１９）を検出した際のＣｔ値を示す。
表１５に、各遺伝子（ＩＬ６、ＣＤＫ１０、ＳＩＶＡ１、ＲＰＳ１９）を検出した際のＣｔ値を示す。
【0168】
Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを添加した反応液４を２５℃で２４時間曝露した場合、各遺伝子でＣｔ値の遅れが確認された。一方、各抗ドメインＥ抗体を０．１μｇ添加した反応液４を２５℃で２４時間曝露した場合、Ｃｔ値の遅れは確認されなかった。
【0169】
Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを添加したコントロール反応液を２５℃で２４時間曝露した場合では、各遺伝子でＣｔ値の遅れが確認された。一方、抗ドメインＥ抗体を０．１μｇ添加した反応液５を２５℃で２４時間曝露した場合、Ｃｔ値の遅れは確認されなかった。
【0170】
【表15】
【0171】
試験例１０．キメラ抗ドメインＥ抗体の発現
（１）抗体発現プラスミドの作製
Ａｎｔｉ－ＴＴＨ４のＣＤＲを含む抗体配列を設計し、人工合成によりオリゴＤＮＡを取得した。Ｍａｍｍａｌｉａｎ ＰｏｗｅｒＥｘｐｒｅｓｓ Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（ＭＰＨ－１０２及びＭＰＬ－２０２、東洋紡株式会社）を用いて、付属の取扱説明書に従い、配列番号５３及び５４に記載のマウス由来重鎖及び軽鎖定常領域を有する抗体発現プラスミドを作製した。
（１）抗体発現プラスミドの作製
Ａｎｔｉ－ＴＴＨ４のＣＤＲを含む抗体配列を設計し、人工合成によりオリゴＤＮＡを取得した。Ｍａｍｍａｌｉａｎ ＰｏｗｅｒＥｘｐｒｅｓｓ Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（ＭＰＨ－１０２及びＭＰＬ－２０２、東洋紡株式会社）を用いて、付属の取扱説明書に従い、配列番号５３及び５４に記載のマウス由来重鎖及び軽鎖定常領域を有する抗体発現プラスミドを作製した。
【0172】
（２）ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞による抗体の発現
ＥｘｐｉＣＨＯ（商標） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、抗体の発現を行った。培養条件は、３７℃、５％（ｖ／ｖ） ＣＯ２、８０ｒｐｍの振盪培養で実施した。付属の取扱説明書に従い、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞を蘇生し、生存細胞数２．０×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬで振盪培養を行った。生存率が９５％に到達するまで継代を継続し、生存細胞数６．０×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬの培養液を調製した。培養液２５ｍＬに対し、抗体発現プラスミド１．０μｇ、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標） ＣＨＯ Ｒｅａｇｅｎｔ ８０μＬをＯｐｔｉＰｒｏ ＳＦＭ（商標） ２ｍＬで希釈して添加し、３７℃、５％（ｖ／ｖ） ＣＯ２、８０ｒｐｍで振盪培養を行った。２４時間後にＥｘｐｉＣＨＯ（商標） Ｅｎｈａｎｃｅｒ １５０μＬ及びＥｘｐｉＣＨＯ（商標） Ｆｅｅｄ ６ｍＬを添加して、生存率が５０％になるまで３７℃、５％（ｖ／ｖ） ＣＯ２、８０ｒｐｍで振盪培養を継続した。
ＥｘｐｉＣＨＯ（商標） Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いて、抗体の発現を行った。培養条件は、３７℃、５％（ｖ／ｖ） ＣＯ２、８０ｒｐｍの振盪培養で実施した。付属の取扱説明書に従い、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞を蘇生し、生存細胞数２．０×１０５ ｃｅｌｌｓ／ｍＬで振盪培養を行った。生存率が９５％に到達するまで継代を継続し、生存細胞数６．０×１０６ ｃｅｌｌｓ／ｍＬの培養液を調製した。培養液２５ｍＬに対し、抗体発現プラスミド１．０μｇ、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標） ＣＨＯ Ｒｅａｇｅｎｔ ８０μＬをＯｐｔｉＰｒｏ ＳＦＭ（商標） ２ｍＬで希釈して添加し、３７℃、５％（ｖ／ｖ） ＣＯ２、８０ｒｐｍで振盪培養を行った。２４時間後にＥｘｐｉＣＨＯ（商標） Ｅｎｈａｎｃｅｒ １５０μＬ及びＥｘｐｉＣＨＯ（商標） Ｆｅｅｄ ６ｍＬを添加して、生存率が５０％になるまで３７℃、５％（ｖ／ｖ） ＣＯ２、８０ｒｐｍで振盪培養を継続した。
【0173】
（３）ＰｒｏｔｅｉｎＡカラムによる抗体の精製
ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞の培養上清を遠心分離により回収した。ＡＫＴＡ ｐｕｒｅ ２５（Ｃｙｔｉｖａ社）を用いて、培養上清をＨｉＴｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＡ ＨＰカラム（Ｃｙｔｉｖａ社）に通して抗体を吸着させた。洗浄Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ ７．４）を用いて当該カラムを洗浄した後、溶出Ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍ クエン酸－ＮａＯＨ、ｐＨ３．５）で溶出させた。Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５（Ｍｅｒｃｋ社）を用いて抗体を濃縮し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ Ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で定量した。
ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞の培養上清を遠心分離により回収した。ＡＫＴＡ ｐｕｒｅ ２５（Ｃｙｔｉｖａ社）を用いて、培養上清をＨｉＴｒａｐ ＰｒｏｔｅｉｎＡ ＨＰカラム（Ｃｙｔｉｖａ社）に通して抗体を吸着させた。洗浄Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ リン酸緩衝液、ｐＨ ７．４）を用いて当該カラムを洗浄した後、溶出Ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍ クエン酸－ＮａＯＨ、ｐＨ３．５）で溶出させた。Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－１５（Ｍｅｒｃｋ社）を用いて抗体を濃縮し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ Ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で定量した。
【0174】
以後の試験例では、上記手法で得られたマウス由来定常領域を有するキメラ抗ドメインＥ抗体を使用した。
【0175】
試験例１１．キメラ抗ドメインＥ抗体によるプローブの分解抑制
キメラ抗ドメインＥ抗体を含むＰＣＲ反応液を２５℃で２４時間曝露した場合、キメラ抗ドメインＥ抗体がプローブの分解を抑制するか否か確認した。
キメラ抗ドメインＥ抗体を含むＰＣＲ反応液を２５℃で２４時間曝露した場合、キメラ抗ドメインＥ抗体がプローブの分解を抑制するか否か確認した。
【0176】
（１）反応液の構成成分
［ＰＣＲ用ミックス］
試験例６で使用したＰＣＲ用ミックス１及び試験例７で使用したＰＣＲ用ミックス２と同じものを使用した。
［ＰＣＲ用ミックス］
試験例６で使用したＰＣＲ用ミックス１及び試験例７で使用したＰＣＲ用ミックス２と同じものを使用した。
【0177】
［プライマー／プローブ］
２０倍濃度のプライマー／プローブ混合液として、ＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用した。当該混合液中のプライマー／プローブで増幅／検出される遺伝子はＲＰＳ１９である。
２０倍濃度のプライマー／プローブ混合液として、ＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用した。当該混合液中のプライマー／プローブで増幅／検出される遺伝子はＲＰＳ１９である。
【0178】
［核酸テンプレート］
ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌由来）ＲＮＡから作製したｃＤＮＡを用いた。ＲＮＡの抽出及びｃＤＮＡの合成には、Ｈｕｍａｎ ＨｅＬａ Ｃｅｌｌ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（６３６５４３、タカラバイオ株式会社）及びＳｕｐｅｒＰｒｅｐ（商標） ＩＩ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ＆ＲＴ Ｋｉｔ ｆｏｒ ｑＰＣＲ（ＳＣＱ－４０１、東洋紡株式会社）を用い、手順は取扱説明書に従った。
ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌由来）ＲＮＡから作製したｃＤＮＡを用いた。ＲＮＡの抽出及びｃＤＮＡの合成には、Ｈｕｍａｎ ＨｅＬａ Ｃｅｌｌ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（６３６５４３、タカラバイオ株式会社）及びＳｕｐｅｒＰｒｅｐ（商標） ＩＩ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ＆ＲＴ Ｋｉｔ ｆｏｒ ｑＰＣＲ（ＳＣＱ－４０１、東洋紡株式会社）を用い、手順は取扱説明書に従った。
【0179】
（２）反応
（反応液４及び５）
ＰＣＲ用ミックス１及び２のそれぞれに、プライマー／プローブを１／２０の割合で混合し、混合液１８μＬを調製した（それぞれ、反応液４及び５に対応）。ＮａｎｏｄｒｏｐＴＭ Ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で定量した核酸テンプレートを１００、１０、１、０．１ ｎｇ／μＬに希釈し、１μＬを前記混合液に添加した（持ち込み量：１００、１０、１、０．１ｎｇ）。コントロールとして、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１μＬを前記混合液に添加して、－２０℃又は２５℃で２４時間曝露した。キメラ抗ドメインＥ抗体については、０．１ｍｇ／ｍＬ溶液１μＬを前記混合液に添加し（持ち込み量：０．１μｇ）、２５℃で２４時間曝露した。その後、リアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｆａｓｔ リアルタイムＰＣＲシステム）を使用して、以下の温度サイクルで反応を実施した。６０℃、６０秒の伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
（温度サイクル）
工程１：９５℃ １分
工程２：９５℃ １５秒－６０℃ ６０秒 ５０サイクル（ＰＣＲ）
（反応液４及び５）
ＰＣＲ用ミックス１及び２のそれぞれに、プライマー／プローブを１／２０の割合で混合し、混合液１８μＬを調製した（それぞれ、反応液４及び５に対応）。ＮａｎｏｄｒｏｐＴＭ Ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で定量した核酸テンプレートを１００、１０、１、０．１ ｎｇ／μＬに希釈し、１μＬを前記混合液に添加した（持ち込み量：１００、１０、１、０．１ｎｇ）。コントロールとして、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１μＬを前記混合液に添加して、－２０℃又は２５℃で２４時間曝露した。キメラ抗ドメインＥ抗体については、０．１ｍｇ／ｍＬ溶液１μＬを前記混合液に添加し（持ち込み量：０．１μｇ）、２５℃で２４時間曝露した。その後、リアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｆａｓｔ リアルタイムＰＣＲシステム）を使用して、以下の温度サイクルで反応を実施した。６０℃、６０秒の伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
（温度サイクル）
工程１：９５℃ １分
工程２：９５℃ １５秒－６０℃ ６０秒 ５０サイクル（ＰＣＲ）
【0180】
（３）結果
反応液４については表１６、反応液５については表１７に、ＲＰＳ１９遺伝子を検出した際のＣｔ値とＭｕｌｔｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｄａｔａにおける１０サイクル目の蛍光値を示す。
反応液４については表１６、反応液５については表１７に、ＲＰＳ１９遺伝子を検出した際のＣｔ値とＭｕｌｔｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｄａｔａにおける１０サイクル目の蛍光値を示す。
【0181】
Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを添加した反応液４及び５については、２５℃で２４時間曝露した場合、ＲＰＳ１９遺伝子を検出できなかったが、キメラ抗ドメインＥ抗体を添加した反応液４及び５については、２５℃で２４時間曝露しても－２０℃で２４時間曝露した場合と同等のＣｔ値で、ＨｅＬａ ｃＤＮＡ １００、１０、１、０．１ｎｇ中のＲＰＳ１９遺伝子を検出可能であった。また、試験例７（ｃ）と同様の手法でプローブ分解率を見積もると、Ａｎｔｉ－ＴＡＱ２については４．４％、Ａｎｔｉ－ＴＴＨ４については３．３％と算出された。
【0182】
【表16】
【0183】
【表17】
【0184】
試験例１２．Ｔａｑポリメラーゼ（変異体）又はＺ０５ポリメラーゼを抗ドメインＥ抗体と共存させた場合のプローブの分解抑制
抗ドメインＥ抗体及びＴａｑポリメラーゼ（変異体）又はＺ０５ポリメラーゼを含むＰＣＲ反応液を２５℃で２４時間曝露した場合、抗ドメインＥ抗体がプローブの分解を抑制するか否か確認した。
抗ドメインＥ抗体及びＴａｑポリメラーゼ（変異体）又はＺ０５ポリメラーゼを含むＰＣＲ反応液を２５℃で２４時間曝露した場合、抗ドメインＥ抗体がプローブの分解を抑制するか否か確認した。
【0185】
（１）反応液の構成成分
［ＰＣＲ用ミックス］
下記の３種類のＰＣＲ用ミックス４～６を調製して使用した。
ＰＣＲ用ミックス４：
Ｔａｑポリメラーゼ（変異体）を含む、ＱｕａｎｔｉＮｏｖａ Ｐｒｏｂｅ ＲＴ－ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社、２０８３５２）
ＰＣＲ用ミックス５：
Ｔａｑポリメラーゼ（変異体）を含む、ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、４４４４５５６）
ＰＣＲ用ミックス６：
Ｚ０５ポリメラーゼ（０．０５Ｕ／μＬ、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、ＨａｗｋＺ０５、配列番号５５）；
ホットスタートＰＣＲ用抗ポリメラーゼ抗体（０．０１μｇ／μＬ、ＴＣＰ－１０１、東洋紡株式会社製）;
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３）；
８０ｍＭ ＫＣｌ；
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；
０．５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ；
０．１％（ｖ／ｖ） ＴｒｉｔｏｎＸ－１００；
０．１％（ｗ／ｖ） コール酸ナトリウム；及び
０．３ｍＭ ｄＮＴＰｓ。
［ＰＣＲ用ミックス］
下記の３種類のＰＣＲ用ミックス４～６を調製して使用した。
ＰＣＲ用ミックス４：
Ｔａｑポリメラーゼ（変異体）を含む、ＱｕａｎｔｉＮｏｖａ Ｐｒｏｂｅ ＲＴ－ＰＣＲ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社、２０８３５２）
ＰＣＲ用ミックス５：
Ｔａｑポリメラーゼ（変異体）を含む、ＴａｑＭａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、４４４４５５６）
ＰＣＲ用ミックス６：
Ｚ０５ポリメラーゼ（０．０５Ｕ／μＬ、Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社、ＨａｗｋＺ０５、配列番号５５）；
ホットスタートＰＣＲ用抗ポリメラーゼ抗体（０．０１μｇ／μＬ、ＴＣＰ－１０１、東洋紡株式会社製）;
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．３）；
８０ｍＭ ＫＣｌ；
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；
０．５ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ；
０．１％（ｖ／ｖ） ＴｒｉｔｏｎＸ－１００；
０．１％（ｗ／ｖ） コール酸ナトリウム；及び
０．３ｍＭ ｄＮＴＰｓ。
【0186】
［プライマー／プローブ］
２０倍濃度のプライマー／プローブ混合液として、ＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用した。当該混合液中のプライマー／プローブで増幅／検出される遺伝子はＲＰＳ１９である。
２０倍濃度のプライマー／プローブ混合液として、ＴａｑＭａｎ（登録商標） Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用した。当該混合液中のプライマー／プローブで増幅／検出される遺伝子はＲＰＳ１９である。
【0187】
［核酸テンプレート］
ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌由来）ＲＮＡから作製したｃＤＮＡを用いた。ＲＮＡの抽出及びｃＤＮＡの合成には、Ｈｕｍａｎ ＨｅＬａ Ｃｅｌｌ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（６３６５４３、タカラバイオ株式会社）及びＳｕｐｅｒＰｒｅｐ（商標） ＩＩ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ＆ＲＴ Ｋｉｔ ｆｏｒ ｑＰＣＲ（ＳＣＱ－４０１、東洋紡株式会社）を用い、手順は取扱説明書に従った。
ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌由来）ＲＮＡから作製したｃＤＮＡを用いた。ＲＮＡの抽出及びｃＤＮＡの合成には、Ｈｕｍａｎ ＨｅＬａ Ｃｅｌｌ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（６３６５４３、タカラバイオ株式会社）及びＳｕｐｅｒＰｒｅｐ（商標） ＩＩ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ＆ＲＴ Ｋｉｔ ｆｏｒ ｑＰＣＲ（ＳＣＱ－４０１、東洋紡株式会社）を用い、手順は取扱説明書に従った。
【0188】
（２）反応
（反応液６～８）
ＰＣＲ用ミックス４～６のそれぞれに、プライマー／プローブを１／２０、核酸テンプレートを１／２０の割合で混合し、混合液１９μＬを調製した（それぞれ、反応液６～８に対応）。コントロールとして、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）１μＬを前記混合液に添加して、－２０℃又は２５℃で２４時間曝露した。抗ドメインＥ抗体については、０．１ｍｇ／ｍＬ溶液１μＬを前記混合液に添加し（持ち込み量：０．１μｇ）、２５℃で２４時間曝露した。その後、リアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｆａｓｔ リアルタイムＰＣＲシステム）を使用して、以下の温度サイクルで反応を実施した。６０℃の伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
（ＰＣＲ用ミックス４を含む反応液６の温度サイクル）
工程１：９５℃ ２分
工程２：９５℃ ５秒－６０℃ ２４秒 ５０サイクル（ＰＣＲ）
（ＰＣＲ用ミックス５を含む反応液７の温度サイクル）
工程１：９５℃ ２０秒
工程２：９５℃ ３秒－６０℃ ３０秒 ５０サイクル（ＰＣＲ）
（ＰＣＲ用ミックス６を含む反応液８の温度サイクル）
工程１：９５℃ ６０秒
工程２：９５℃ １５秒－６０℃ ４５秒 ５０サイクル（ＰＣＲ）
（反応液６～８）
ＰＣＲ用ミックス４～６のそれぞれに、プライマー／プローブを１／２０、核酸テンプレートを１／２０の割合で混合し、混合液１９μＬを調製した（それぞれ、反応液６～８に対応）。コントロールとして、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）１μＬを前記混合液に添加して、－２０℃又は２５℃で２４時間曝露した。抗ドメインＥ抗体については、０．１ｍｇ／ｍＬ溶液１μＬを前記混合液に添加し（持ち込み量：０．１μｇ）、２５℃で２４時間曝露した。その後、リアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｆａｓｔ リアルタイムＰＣＲシステム）を使用して、以下の温度サイクルで反応を実施した。６０℃の伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
（ＰＣＲ用ミックス４を含む反応液６の温度サイクル）
工程１：９５℃ ２分
工程２：９５℃ ５秒－６０℃ ２４秒 ５０サイクル（ＰＣＲ）
（ＰＣＲ用ミックス５を含む反応液７の温度サイクル）
工程１：９５℃ ２０秒
工程２：９５℃ ３秒－６０℃ ３０秒 ５０サイクル（ＰＣＲ）
（ＰＣＲ用ミックス６を含む反応液８の温度サイクル）
工程１：９５℃ ６０秒
工程２：９５℃ １５秒－６０℃ ４５秒 ５０サイクル（ＰＣＲ）
【0189】
（３）結果
ＲＰＳ１９遺伝子を検出した際のＣｔ値、及び、Ｍｕｌｔｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｄａｔａにおける１０サイクル目の蛍光値を、それぞれ、表１８及び表１９に示す。
ＲＰＳ１９遺伝子を検出した際のＣｔ値、及び、Ｍｕｌｔｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｄａｔａにおける１０サイクル目の蛍光値を、それぞれ、表１８及び表１９に示す。
【0190】
Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを添加した反応液８～１０を２５℃で２４時間曝露すると、ＲＰＳ１９遺伝子を検出できるＣｔ値に遅れがみられ、検出不能となる遺伝子が生じた。一方、抗ドメインＥ抗体を添加した反応液８～１０の場合は２５℃で２４時間曝露しても－２０℃で２４時間曝露した場合と同等のＣｔ値で各遺伝子を検出可能であった。従って、抗ドメインＥ抗体は、Ｔａｑ変異体を含むＰＣＲ反応液の安定性を著しく向上させることが明らかになった。また、抗ドメインＥ抗体は、Ｚ０５ポリメラーゼを含むＰＣＲ反応液の安定性も著しく向上させることが判明した。
【0191】
【表18】
【0192】
【表19】
【0193】
試験例１３．抗ドメインＥ抗体の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する阻害能
取得した抗ドメインＥ抗体について、Ｔａｑポリメラーゼ又はＴｔｈポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する阻害能を確認した。
取得した抗ドメインＥ抗体について、Ｔａｑポリメラーゼ又はＴｔｈポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する阻害能を確認した。
【0194】
（１）反応
（反応液９）
Ｔａｑポリメラーゼ（ＴＡＰ－２０１、東洋紡株式会社）１ユニットと、市販のホットスタート抗体Ａｎｔｉ－Ｔａｑ ｈｉｇｈ（ＴＣＰ－１０１、東洋紡株式会社）０．２μｇとを含むＴａｑ酵素液を作製した。Ｔａｑポリメラーゼ酵素液及びＡｎｔｉ－ＴＡＱ２ ０．１μｇの混合液を、５’末端を３２Ｐで放射性標識した基質ＤＮＡ（９０００ｃｐｍ、計数率８０％）を含む反応液（終濃度：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）に加えて、液量２０μＬに調製した（サンプル３）。コントロールとして、Ｔａｑポリメラーゼ酵素液もＡｎｔｉ－ＴＡＱ２も含まないサンプル１、Ｔａｑポリメラーゼ酵素液のみを含むサンプル２を用意し、各サンプルを３７℃で２４時間インキュベートした。その後、各サンプルに１０％（ｗ／ｖ）ＴＣＡ １００μＬを添加して、基質ＤＮＡを沈殿させ、上清に残留した遊離の３２Ｐ標識塩基の放射能を測定した。
（反応液９）
Ｔａｑポリメラーゼ（ＴＡＰ－２０１、東洋紡株式会社）１ユニットと、市販のホットスタート抗体Ａｎｔｉ－Ｔａｑ ｈｉｇｈ（ＴＣＰ－１０１、東洋紡株式会社）０．２μｇとを含むＴａｑ酵素液を作製した。Ｔａｑポリメラーゼ酵素液及びＡｎｔｉ－ＴＡＱ２ ０．１μｇの混合液を、５’末端を３２Ｐで放射性標識した基質ＤＮＡ（９０００ｃｐｍ、計数率８０％）を含む反応液（終濃度：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）に加えて、液量２０μＬに調製した（サンプル３）。コントロールとして、Ｔａｑポリメラーゼ酵素液もＡｎｔｉ－ＴＡＱ２も含まないサンプル１、Ｔａｑポリメラーゼ酵素液のみを含むサンプル２を用意し、各サンプルを３７℃で２４時間インキュベートした。その後、各サンプルに１０％（ｗ／ｖ）ＴＣＡ １００μＬを添加して、基質ＤＮＡを沈殿させ、上清に残留した遊離の３２Ｐ標識塩基の放射能を測定した。
【0195】
（反応液１０）
Ｔｔｈポリメラーゼ（ＴＴＨ－３０１、東洋紡株式会社）１ユニットと、市販のホットスタート抗体Ａｎｔｉ－Ｔａｑ ｈｉｇｈ（ＴＣＰ－１０１、東洋紡株式会社）０．６μｇとを含むＴｔｈ酵素液を作製した。Ｔｔｈポリメラーゼ酵素液及びＡｎｔｉ－ＴＴＨ４ ０．１μｇの混合液を、５’末端を３２Ｐで放射性標識した基質ＤＮＡ（９０００ｃｐｍ、計数率８０％）を含む反応液（終濃度：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）に加えて、液量２０μＬに調製した（サンプル３）。コントロールとして、Ｔｔｈポリメラーゼ酵素液もＡｎｔｉ－ＴＴＨ４も含まないサンプル１、Ｔｔｈポリメラーゼ酵素液のみを含むサンプル２を用意し、各サンプルを３７℃で２４時間インキュベートした。その後、各サンプルに１０％（ｗ／ｖ）ＴＣＡ １００μＬを添加して、基質ＤＮＡを沈殿させ、上清に残留した遊離の３２Ｐ標識塩基の放射能を測定した。
Ｔｔｈポリメラーゼ（ＴＴＨ－３０１、東洋紡株式会社）１ユニットと、市販のホットスタート抗体Ａｎｔｉ－Ｔａｑ ｈｉｇｈ（ＴＣＰ－１０１、東洋紡株式会社）０．６μｇとを含むＴｔｈ酵素液を作製した。Ｔｔｈポリメラーゼ酵素液及びＡｎｔｉ－ＴＴＨ４ ０．１μｇの混合液を、５’末端を３２Ｐで放射性標識した基質ＤＮＡ（９０００ｃｐｍ、計数率８０％）を含む反応液（終濃度：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）に加えて、液量２０μＬに調製した（サンプル３）。コントロールとして、Ｔｔｈポリメラーゼ酵素液もＡｎｔｉ－ＴＴＨ４も含まないサンプル１、Ｔｔｈポリメラーゼ酵素液のみを含むサンプル２を用意し、各サンプルを３７℃で２４時間インキュベートした。その後、各サンプルに１０％（ｗ／ｖ）ＴＣＡ １００μＬを添加して、基質ＤＮＡを沈殿させ、上清に残留した遊離の３２Ｐ標識塩基の放射能を測定した。
【0196】
［基質ＤＮＡ］
λＤＮＡ １０μｇ及びＳｃａＩ（東洋紡株式会社製） ３０ユニットを取扱説明書に従って混合した反応液を調製し、３７℃で２４時間インキュベートした。フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（液量比２５：２４：１）処理及びエタノール沈殿によって生じたペレットをＴＥ緩衝液１００μＬに溶解した。この溶液８０μＬに、Ｐ－３２ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ５’－ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ，［γ－３２Ｐ］－（パーキンエルマー社製、ＮＥＧ００２）５μＬ、Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（東洋紡株式会社製、ＰＮＫ－１１１）５μＬ、１０×Ｂｌｕｎｔ Ｅｎｄ Ｋｉｎａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ １０μＬ（東洋紡株式会社製、ＰＮＫ－１１１添付品）を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（液量比２５：２４：１）処理及びエタノール沈殿によって生じたペレットをＴＥ緩衝液１００μＬに溶解した。
λＤＮＡ １０μｇ及びＳｃａＩ（東洋紡株式会社製） ３０ユニットを取扱説明書に従って混合した反応液を調製し、３７℃で２４時間インキュベートした。フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（液量比２５：２４：１）処理及びエタノール沈殿によって生じたペレットをＴＥ緩衝液１００μＬに溶解した。この溶液８０μＬに、Ｐ－３２ Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ５’－ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ，［γ－３２Ｐ］－（パーキンエルマー社製、ＮＥＧ００２）５μＬ、Ｔ４ Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ（東洋紡株式会社製、ＰＮＫ－１１１）５μＬ、１０×Ｂｌｕｎｔ Ｅｎｄ Ｋｉｎａｓｅ Ｂｕｆｆｅｒ １０μＬ（東洋紡株式会社製、ＰＮＫ－１１１添付品）を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール（液量比２５：２４：１）処理及びエタノール沈殿によって生じたペレットをＴＥ緩衝液１００μＬに溶解した。
【0197】
（２）結果
反応液９について、Ｔａｑポリメラーゼ酵素液もＡｎｔｉ－ＴＡＱ２も含まないサンプル１では基質ＤＮＡが分解されないので１００％とし、Ｔａｑポリメラーゼ酵素液のみを含むサンプル２では基質ＤＮＡが最も分解されるので０％として、サンプル３の基質ＤＮＡの残存率を、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性阻害能として算出した結果を表２０に示す。Ａｎｔｉ－ＴＡＱ２の活性阻害能は９１％と算出された。
反応液９について、Ｔａｑポリメラーゼ酵素液もＡｎｔｉ－ＴＡＱ２も含まないサンプル１では基質ＤＮＡが分解されないので１００％とし、Ｔａｑポリメラーゼ酵素液のみを含むサンプル２では基質ＤＮＡが最も分解されるので０％として、サンプル３の基質ＤＮＡの残存率を、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性阻害能として算出した結果を表２０に示す。Ａｎｔｉ－ＴＡＱ２の活性阻害能は９１％と算出された。
【0198】
反応液１０について、Ｔｔｈポリメラーゼ酵素液もＡｎｔｉ－ＴＴＨ４も含まないサンプル１では基質ＤＮＡが分解されないので１００％とし、Ｔｔｈポリメラーゼ酵素液のみを含むサンプル２では基質ＤＮＡが最も分解されるので０％として、サンプル３の基質ＤＮＡの残存率を、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性阻害能として算出した結果を表２１に示す。Ａｎｔｉ－ＴＴＨ４の活性阻害能は９８％と算出された。
【0199】
【表20】
【0200】
【表21】
【0201】
試験例１４．抗ドメインＥ抗体の添加量を変化させた場合の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する阻害能
取得した抗ドメインＥ抗体の添加量を変化させて、Ｔａｑポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する阻害能を確認した。
取得した抗ドメインＥ抗体の添加量を変化させて、Ｔａｑポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する阻害能を確認した。
【0202】
（１）反応
（反応液）
Ｔａｑポリメラーゼ（ＴＡＰ－２０１、東洋紡株式会社）１ユニットと、市販のホットスタート抗体Ａｎｔｉ－Ｔａｑ ｈｉｇｈ（ＴＣＰ－１０１、東洋紡株式会社）０．２μｇとを含むＴａｑポリメラーゼ酵素液を作製した。Ｔａｑポリメラーゼ酵素液及びＡｎｔｉ－ＴＡＱ２ ０．０５、０．１、０．２、又は０．４μｇの混合液を、５’末端を３２Ｐで放射性標識した基質ＤＮＡ（９０００ｃｐｍ、計数率８０％）を含む反応液（終濃度：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）に加えて、液量２０μＬに調製した（サンプル３～６）。コントロールとして、Ｔａｑポリメラーゼ酵素液もＡｎｔｉ－ＴＡＱ２も含まないサンプル１、Ｔａｑポリメラーゼ酵素液のみを含むサンプル２を用意し、各サンプルを３７℃で２４時間インキュベートした。その後、各サンプルに１０％（ｗ／ｖ）ＴＣＡ １００μＬを添加して、基質ＤＮＡを沈殿させ、上清に残留した遊離の３２Ｐ標識塩基の放射能を測定した。
（反応液）
Ｔａｑポリメラーゼ（ＴＡＰ－２０１、東洋紡株式会社）１ユニットと、市販のホットスタート抗体Ａｎｔｉ－Ｔａｑ ｈｉｇｈ（ＴＣＰ－１０１、東洋紡株式会社）０．２μｇとを含むＴａｑポリメラーゼ酵素液を作製した。Ｔａｑポリメラーゼ酵素液及びＡｎｔｉ－ＴＡＱ２ ０．０５、０．１、０．２、又は０．４μｇの混合液を、５’末端を３２Ｐで放射性標識した基質ＤＮＡ（９０００ｃｐｍ、計数率８０％）を含む反応液（終濃度：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２）に加えて、液量２０μＬに調製した（サンプル３～６）。コントロールとして、Ｔａｑポリメラーゼ酵素液もＡｎｔｉ－ＴＡＱ２も含まないサンプル１、Ｔａｑポリメラーゼ酵素液のみを含むサンプル２を用意し、各サンプルを３７℃で２４時間インキュベートした。その後、各サンプルに１０％（ｗ／ｖ）ＴＣＡ １００μＬを添加して、基質ＤＮＡを沈殿させ、上清に残留した遊離の３２Ｐ標識塩基の放射能を測定した。
【0203】
［基質ＤＮＡ］
試験例１３と同じ基質ＤＮＡを使用した。
試験例１３と同じ基質ＤＮＡを使用した。
【0204】
（２）結果
Ｔａｑポリメラーゼ酵素液もＡｎｔｉ－ＴＡＱ２も含まないサンプル１では基質ＤＮＡが分解されないので１００％とし、Ｔａｑポリメラーゼ酵素液のみを含むサンプル２では基質ＤＮＡが最も分解されるので０％として、サンプル３～６の基質ＤＮＡの残存率を、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性阻害能として算出した結果を表２２に示す。
Ｔａｑポリメラーゼ酵素液もＡｎｔｉ－ＴＡＱ２も含まないサンプル１では基質ＤＮＡが分解されないので１００％とし、Ｔａｑポリメラーゼ酵素液のみを含むサンプル２では基質ＤＮＡが最も分解されるので０％として、サンプル３～６の基質ＤＮＡの残存率を、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性阻害能として算出した結果を表２２に示す。
【0205】
【表22】
【0206】
試験例１５．ＴａｑポリメラーゼのドメインＥに特異的に結合する抗体による、Ｔｔｈポリメラーゼのプローブ分解の抑制
ＴａｑポリメラーゼのドメインＥに特異的に結合する抗体及びＴｔｈポリメラーゼを含むＰＣＲ反応液を２５℃で２４時間曝露した場合、前記抗体がＴｔｈポリメラーゼのプローブ分解を抑制するか否か確認した。
ＴａｑポリメラーゼのドメインＥに特異的に結合する抗体及びＴｔｈポリメラーゼを含むＰＣＲ反応液を２５℃で２４時間曝露した場合、前記抗体がＴｔｈポリメラーゼのプローブ分解を抑制するか否か確認した。
【0207】
（１）ＰＣＲ反応液の構成成分
［ＰＣＲ用ミックス］
試験例６で使用したＰＣＲ用ミックス１及び試験例７で使用したＰＣＲ用ミックス２と同じものを使用した。
［ＰＣＲ用ミックス］
試験例６で使用したＰＣＲ用ミックス１及び試験例７で使用したＰＣＲ用ミックス２と同じものを使用した。
【0208】
［プライマー／プローブ］
２０倍濃度のプライマー／プローブ混合液として、ＴａｑＭａｎ(登録商標) Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用した。当該混合液中のプライマー／プローブで増幅／検出される遺伝子はＩＬ６、ＣＤＫ１０、ＳＩＶＡ１、ＲＰＳ１９、及びＳＥＲＰＩＮＢ５である。
２０倍濃度のプライマー／プローブ混合液として、ＴａｑＭａｎ(登録商標) Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を使用した。当該混合液中のプライマー／プローブで増幅／検出される遺伝子はＩＬ６、ＣＤＫ１０、ＳＩＶＡ１、ＲＰＳ１９、及びＳＥＲＰＩＮＢ５である。
【0209】
［核酸テンプレート］
ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌由来）ＲＮＡから作製したｃＤＮＡを用いた。ＲＮＡの抽出及びｃＤＮＡの合成には、Ｈｕｍａｎ ＨｅＬａ Ｃｅｌｌ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（製品コード：６３６５４３、タカラバイオ株式会社）及びＳｕｐｅｒＰｒｅｐ（商標） ＩＩ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ＆ＲＴ Ｋｉｔ ｆｏｒ ｑＰＣＲ（ＳＣＱ－４０１、東洋紡株式会社）を用い、手順は取扱説明書に従った。
ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌由来）ＲＮＡから作製したｃＤＮＡを用いた。ＲＮＡの抽出及びｃＤＮＡの合成には、Ｈｕｍａｎ ＨｅＬａ Ｃｅｌｌ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（製品コード：６３６５４３、タカラバイオ株式会社）及びＳｕｐｅｒＰｒｅｐ（商標） ＩＩ Ｃｅｌｌ Ｌｙｓｉｓ＆ＲＴ Ｋｉｔ ｆｏｒ ｑＰＣＲ（ＳＣＱ－４０１、東洋紡株式会社）を用い、手順は取扱説明書に従った。
【0210】
（２）反応
ＰＣＲ用ミックス１又は２に、各プライマー／プローブを１／２０の割合で混合し、混合液１８μＬを調製した。ＮａｎｏｄｒｏｐＴＭ Ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で定量した核酸テンプレートを１００ｎｇ／μＬに希釈し、１μＬを添加した（持ち込み量：１００ｎｇ）。コントロールとして、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１μＬ添加して、－２０℃又は２５℃に２４時間曝露した。Ａｎｔｉ－ＴＡＱ２については、０．１ｍｇ／ｍＬ溶液を４μＬ添加し（持ち込み量：０．４μｇ）、２５℃に２４時間曝露した。その後、リアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｆａｓｔ リアルタイムＰＣＲシステム）を使用して、以下の温度サイクルで反応を実施した。６０℃、４５秒の伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
（温度サイクル）
工程１：９５℃ １分
工程２：９５℃ １５秒－６０℃ ４５秒 ５０サイクル（ＰＣＲ）
ＰＣＲ用ミックス１又は２に、各プライマー／プローブを１／２０の割合で混合し、混合液１８μＬを調製した。ＮａｎｏｄｒｏｐＴＭ Ｏｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で定量した核酸テンプレートを１００ｎｇ／μＬに希釈し、１μＬを添加した（持ち込み量：１００ｎｇ）。コントロールとして、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）１μＬ添加して、－２０℃又は２５℃に２４時間曝露した。Ａｎｔｉ－ＴＡＱ２については、０．１ｍｇ／ｍＬ溶液を４μＬ添加し（持ち込み量：０．４μｇ）、２５℃に２４時間曝露した。その後、リアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｆａｓｔ リアルタイムＰＣＲシステム）を使用して、以下の温度サイクルで反応を実施した。６０℃、４５秒の伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
（温度サイクル）
工程１：９５℃ １分
工程２：９５℃ １５秒－６０℃ ４５秒 ５０サイクル（ＰＣＲ）
【0211】
（３）結果
各遺伝子を検出した際のＣｔ値とＭｕｌｔｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｄａｔａにおける１０サイクル目の蛍光値を表２３に示す。Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを添加した反応液を２５℃で２４時間曝露した場合では、各遺伝子を検出できない、もしくはＣｔ値の大幅な遅れ、すなわち検出感度の低下が確認された。一方、Ａｎｔｉ－ＴＡＱ２を添加した反応液を２５℃で２４時間曝露した場合、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを添加した反応液を－２０℃で２４時間曝露した場合と同等のＣｔ値で、ＨｅＬａ ｃＤＮＡの各遺伝子を検出可能であった。さらに、ＴａｑポリメラーゼとＴｔｈポリメラーゼの両方に対して、Ａｎｔｉ－ＴＡＱ２はプローブ分解の抑制能を示すことが確認された。従って、Ｔｔｈ ｅｘｏを免疫原とし、ｗｈｏｌｅ Ｔａｑに対する抗体をスクリーニングする方法３により、ＴａｑとＴｔｈの両方に中和活性を有する抗体を取得できることが確認された。
各遺伝子を検出した際のＣｔ値とＭｕｌｔｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｄａｔａにおける１０サイクル目の蛍光値を表２３に示す。Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを添加した反応液を２５℃で２４時間曝露した場合では、各遺伝子を検出できない、もしくはＣｔ値の大幅な遅れ、すなわち検出感度の低下が確認された。一方、Ａｎｔｉ－ＴＡＱ２を添加した反応液を２５℃で２４時間曝露した場合、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを添加した反応液を－２０℃で２４時間曝露した場合と同等のＣｔ値で、ＨｅＬａ ｃＤＮＡの各遺伝子を検出可能であった。さらに、ＴａｑポリメラーゼとＴｔｈポリメラーゼの両方に対して、Ａｎｔｉ－ＴＡＱ２はプローブ分解の抑制能を示すことが確認された。従って、Ｔｔｈ ｅｘｏを免疫原とし、ｗｈｏｌｅ Ｔａｑに対する抗体をスクリーニングする方法３により、ＴａｑとＴｔｈの両方に中和活性を有する抗体を取得できることが確認された。
【0212】
【表23】
【0213】
試験例１６．基質ＤＮＡを変更した場合における、抗ドメインＥ抗体の５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する阻害能
配列番号５６及び５７に記載のλＤＮＡ由来二本鎖基質ＤＮＡを設計し、Ｔａｑポリメラーゼ又はＴｔｈポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する抗ドメインＥ抗体の阻害能を確認した。
配列番号５６及び５７に記載のλＤＮＡ由来二本鎖基質ＤＮＡを設計し、Ｔａｑポリメラーゼ又はＴｔｈポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性に対する抗ドメインＥ抗体の阻害能を確認した。
【0214】
（１）サンプル調製
下記の２種類の活性測定用ミックス１及び２を調製して使用した。
活性測定用ミックス１：
Ｔａｑポリメラーゼ（０．０５Ｕ／μＬ、ＴＡＰ－２０１、東洋紡株式会社製）；
ホットスタートＰＣＲ用抗ポリメラーゼ抗体（０．０１μｇ／μＬ、ＴＣＰ－１０１、東洋紡株式会社製）;
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．６）；
５０ｍＭ ＫＣｌ；
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；
０．３μＭ 二本鎖基質ＤＮＡ；
活性測定用ミックス２：
Ｔｔｈポリメラーゼ（０．０５Ｕ／μＬ、ＴＴＨ－３０１、東洋紡株式会社製）；
ホットスタートＰＣＲ用抗ポリメラーゼ抗体（０．０１μｇ／μＬ、ＴＣＰ－１０１、東洋紡株式会社製）;
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．６）；
５０ｍＭ ＫＣｌ；
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；
０．３μＭ 二本鎖基質ＤＮＡ；
下記の２種類の活性測定用ミックス１及び２を調製して使用した。
活性測定用ミックス１：
Ｔａｑポリメラーゼ（０．０５Ｕ／μＬ、ＴＡＰ－２０１、東洋紡株式会社製）；
ホットスタートＰＣＲ用抗ポリメラーゼ抗体（０．０１μｇ／μＬ、ＴＣＰ－１０１、東洋紡株式会社製）;
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．６）；
５０ｍＭ ＫＣｌ；
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；
０．３μＭ 二本鎖基質ＤＮＡ；
活性測定用ミックス２：
Ｔｔｈポリメラーゼ（０．０５Ｕ／μＬ、ＴＴＨ－３０１、東洋紡株式会社製）；
ホットスタートＰＣＲ用抗ポリメラーゼ抗体（０．０１μｇ／μＬ、ＴＣＰ－１０１、東洋紡株式会社製）;
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．６）；
５０ｍＭ ＫＣｌ；
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；
０．３μＭ 二本鎖基質ＤＮＡ；
【0215】
［二本鎖基質ＤＮＡ］
配列番号５６及び５７に記載のオリゴヌクレオチドを有するλＤＮＡ由来二本鎖基質ＤＮＡを設計した。配列番号５６及び５７に記載のオリゴヌクレオチドはそれぞれ別個に合成し、等量に混合して使用した。
配列番号５６及び５７に記載のオリゴヌクレオチドを有するλＤＮＡ由来二本鎖基質ＤＮＡを設計した。配列番号５６及び５７に記載のオリゴヌクレオチドはそれぞれ別個に合成し、等量に混合して使用した。
【0216】
コントロールとして、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）１μＬを、各活性測定用ミックス１９μＬに添加して、－２０℃又は２５℃で２４時間曝露した。抗ドメインＥ抗体は、１９μＬの活性測定用ミックス１に対して０．１ｍｇ／ｍＬ溶液１μＬ（持ち込み量：０．１μｇ）、１９μＬの活性測定用ミックス２に対して０．４ｍｇ／ｍＬ溶液１μＬ（持ち込み量：０．４μｇ）を添加し、２５℃で２４時間曝露した。その後、ＤＮＡ／ＲＮＡ分析用マイクロチップ電気泳動装置（ＭｕｌｔｉＮＡ、株式会社島津製作所）及びＤＮＡ－５００キット（Ｓ２９２－２７９１０－９１、株式会社島津製作所）を使用して、各サンプルを分析した。
【0217】
（２）結果
各サンプルを分析した際のバンドの定量値を表２４に示す。活性測定ミックス１及び２のいずれにおいても、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを添加して２５℃で２４時間曝露した場合では、－２０℃で２４時間曝露した場合に比べて、バンドの定量値が著しく低下し、二本鎖基質ＤＮＡの分解が確認された。一方で、Ａｎｔｉ－ＴＡＱ２を添加して２５℃で２４時間曝露した場合は、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを添加して－２０℃で２４時間曝露した場合と同等のバンドの定量値で、二本鎖基質ＤＮＡの分解は確認されなかった。
また、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性阻害能を、下記の（ｄ）二本鎖基質ＤＮＡ分解率を算出することで判断した。
（ｄ）二本鎖基質ＤＮＡ分解率（％）［（Ｓ２１－Ｓ２３）÷（Ｓ２１－Ｓ２２）×１００］
Ｓ２１：抗ドメインＥ抗体を含まない場合の－２０℃で２４時間曝露後（２５℃で２４時間曝露前に相当）のバンド強度
Ｓ２２：抗ドメインＥ抗体を含まない場合の２５℃で２４時間曝露後のバンド強度
Ｓ２３：抗ドメインＥ抗体を含む場合の２５℃で２４時間曝露後のバンド強度
Ａｎｔｉ－ＴＡＱ２を添加して２５℃で２４時間曝露したサンプルでは、Ｔａｑポリメラーゼ及びＴｔｈポリメラーゼによる（ｄ）二本鎖基質ＤＮＡ分解率（％）≦１０％と算出された。従って、ＴａｑポリメラーゼとＴｔｈポリメラーゼの両方に対して、Ａｎｔｉ－ＴＡＱ２は二本鎖基質ＤＮＡ分解の十分な抑制能を示すことが確認された。
各サンプルを分析した際のバンドの定量値を表２４に示す。活性測定ミックス１及び２のいずれにおいても、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを添加して２５℃で２４時間曝露した場合では、－２０℃で２４時間曝露した場合に比べて、バンドの定量値が著しく低下し、二本鎖基質ＤＮＡの分解が確認された。一方で、Ａｎｔｉ－ＴＡＱ２を添加して２５℃で２４時間曝露した場合は、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを添加して－２０℃で２４時間曝露した場合と同等のバンドの定量値で、二本鎖基質ＤＮＡの分解は確認されなかった。
また、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性阻害能を、下記の（ｄ）二本鎖基質ＤＮＡ分解率を算出することで判断した。
（ｄ）二本鎖基質ＤＮＡ分解率（％）［（Ｓ２１－Ｓ２３）÷（Ｓ２１－Ｓ２２）×１００］
Ｓ２１：抗ドメインＥ抗体を含まない場合の－２０℃で２４時間曝露後（２５℃で２４時間曝露前に相当）のバンド強度
Ｓ２２：抗ドメインＥ抗体を含まない場合の２５℃で２４時間曝露後のバンド強度
Ｓ２３：抗ドメインＥ抗体を含む場合の２５℃で２４時間曝露後のバンド強度
Ａｎｔｉ－ＴＡＱ２を添加して２５℃で２４時間曝露したサンプルでは、Ｔａｑポリメラーゼ及びＴｔｈポリメラーゼによる（ｄ）二本鎖基質ＤＮＡ分解率（％）≦１０％と算出された。従って、ＴａｑポリメラーゼとＴｔｈポリメラーゼの両方に対して、Ａｎｔｉ－ＴＡＱ２は二本鎖基質ＤＮＡ分解の十分な抑制能を示すことが確認された。
【0218】
【表24】
【0219】
試験例１７．ＴａｑポリメラーゼのドメインＥに特異的に結合する抗体による、ＤＮＡポリメラーゼの蛍光標識二本鎖基質ＤＮＡ（プローブ）分解の抑制
ＴａｑポリメラーゼのドメインＥに特異的に結合する抗体とＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼ又はＴｔｈポリメラーゼ）とを含むＰＣＲ反応液を３７℃で２４時間曝露した場合、前記抗体がポリメラーゼの蛍光標識二本鎖基質ＤＮＡ分解を抑制するか否か確認した。
ＴａｑポリメラーゼのドメインＥに特異的に結合する抗体とＤＮＡポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラーゼ又はＴｔｈポリメラーゼ）とを含むＰＣＲ反応液を３７℃で２４時間曝露した場合、前記抗体がポリメラーゼの蛍光標識二本鎖基質ＤＮＡ分解を抑制するか否か確認した。
【0220】
（１）反応液の構成成分
［ＰＣＲ用ミックス］
下記の２種類のＰＣＲ用ミックス７及び８を調製して使用した。
ＰＣＲ用ミックス７：
Ｔａｑポリメラーゼ（０．０５Ｕ／μＬ、ＴＡＰ－２０１、東洋紡株式会社製）；
ホットスタートＰＣＲ用抗ポリメラーゼ抗体（０．０１μｇ／μＬ、ＴＣＰ－１０１、東洋紡株式会社製）;
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．６）；
５０ｍＭ ＫＣｌ；
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；及び
０．３μＭ 蛍光標識二本鎖基質ＤＮＡ。
ＰＣＲ用ミックス８：
Ｔｔｈポリメラーゼ（０．０５Ｕ／μＬ、ＴＴＨ－３０１、東洋紡株式会社製）；
ホットスタートＰＣＲ用抗ポリメラーゼ抗体（０．０１μｇ／μＬ、ＴＣＰ－１０１、東洋紡株式会社製）;
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．６）；
５０ｍＭ ＫＣｌ；
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；及び
０．３μＭ 蛍光標識二本鎖基質ＤＮＡ。
［ＰＣＲ用ミックス］
下記の２種類のＰＣＲ用ミックス７及び８を調製して使用した。
ＰＣＲ用ミックス７：
Ｔａｑポリメラーゼ（０．０５Ｕ／μＬ、ＴＡＰ－２０１、東洋紡株式会社製）；
ホットスタートＰＣＲ用抗ポリメラーゼ抗体（０．０１μｇ／μＬ、ＴＣＰ－１０１、東洋紡株式会社製）;
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．６）；
５０ｍＭ ＫＣｌ；
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；及び
０．３μＭ 蛍光標識二本鎖基質ＤＮＡ。
ＰＣＲ用ミックス８：
Ｔｔｈポリメラーゼ（０．０５Ｕ／μＬ、ＴＴＨ－３０１、東洋紡株式会社製）；
ホットスタートＰＣＲ用抗ポリメラーゼ抗体（０．０１μｇ／μＬ、ＴＣＰ－１０１、東洋紡株式会社製）;
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．６）；
５０ｍＭ ＫＣｌ；
１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２；及び
０．３μＭ 蛍光標識二本鎖基質ＤＮＡ。
【0221】
［蛍光標識二本鎖基質ＤＮＡ］
配列番号５８及び５９に記載のオリゴヌクレオチドを有するλＤＮＡ由来蛍光標識二本鎖基質ＤＮＡを設計した（ここで、配列番号５８の５’末端をＦＡＭで標識し、５’末端をＢＨＱ１で標識した）。配列番号５８及び５９に記載のオリゴヌクレオチドはそれぞれ別個に合成し、等量に混合して使用した。
配列番号５８及び５９に記載のオリゴヌクレオチドを有するλＤＮＡ由来蛍光標識二本鎖基質ＤＮＡを設計した（ここで、配列番号５８の５’末端をＦＡＭで標識し、５’末端をＢＨＱ１で標識した）。配列番号５８及び５９に記載のオリゴヌクレオチドはそれぞれ別個に合成し、等量に混合して使用した。
【0222】
（２）反応
コントロールとして、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）１μＬを、ＰＣＲ用ミックス１９μＬに添加した反応液を－２０℃又は３７℃で２４時間曝露した。ＰＣＲ用ミックス１９μＬに対して０．４ｍｇ／ｍＬの抗ドメインＥ抗体溶液１μＬ（持ち込み量：０．４μｇ）を添加した反応液を３７℃で２４時間曝露した。その後、リアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｆａｓｔ リアルタイムＰＣＲシステム）を使用して、以下の温度サイクルで反応を実施した。６０℃、４５秒の伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
（温度サイクル）
工程１：９５℃ １分
工程２：９５℃ １５秒－６０℃ ４５秒 ５０サイクル（ＰＣＲ）
コントロールとして、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）１μＬを、ＰＣＲ用ミックス１９μＬに添加した反応液を－２０℃又は３７℃で２４時間曝露した。ＰＣＲ用ミックス１９μＬに対して０．４ｍｇ／ｍＬの抗ドメインＥ抗体溶液１μＬ（持ち込み量：０．４μｇ）を添加した反応液を３７℃で２４時間曝露した。その後、リアルタイムＰＣＲ装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ Ｆａｓｔ リアルタイムＰＣＲシステム）を使用して、以下の温度サイクルで反応を実施した。６０℃、４５秒の伸長ステップで蛍光値の読み取りを行った。
（温度サイクル）
工程１：９５℃ １分
工程２：９５℃ １５秒－６０℃ ４５秒 ５０サイクル（ＰＣＲ）
【0223】
（３）結果
Ｍｕｌｔｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｄａｔａにおける１０サイクル目の蛍光値を表２５に示す。Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを添加した反応液を３７℃で２４時間曝露した場合では、－２０℃で２４時間曝露した場合に比べて、蛍光値の上昇が確認された。一方、Ａｎｔｉ－ＴＡＱ２を添加した反応液を３７℃で２４時間曝露した場合、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを添加した反応液を－２０℃で２４時間曝露した場合と同等で、Ｔａｑポリメラーゼ及びＴｔｈポリメラーゼ共に蛍光値の上昇は確認されなかった。
具体的には、（ｅ）蛍光標識二本鎖基質ＤＮＡ分解率は、下記の式で算出できる。
（ｅ）蛍光標識二本鎖基質ＤＮＡ分解率［（Ｆ４３－Ｆ４１）÷（Ｆ４２－Ｆ４１）×１００）］
Ｆ４１：抗ドメインＥ抗体を含まない場合の－２０℃で２４時間曝露後（３７℃２４時間の曝露前に相当）の１０サイクル目の蛍光強度
Ｆ４２：抗ドメインＥ抗体を含まない場合の３７℃で２４時間曝露後の１０サイクル目の蛍光強度
Ｆ４３：抗ドメインＥ抗体を含む場合の３７℃で２４時間曝露後の１０サイクル目の蛍光強度
Ａｎｔｉ－ＴＡＱ２を添加して３７℃で２４時間曝露したサンプルでは、Ｔａｑポリメラーゼ及びＴｔｈポリメラーゼ共に（ｅ）蛍光標識二本鎖基質ＤＮＡ分解率（％）≦１０％と算出された。従って、ＴａｑポリメラーゼとＴｔｈポリメラーゼの両方に対して、Ａｎｔｉ－ＴＡＱ２は蛍光標識二本鎖基質ＤＮＡ分解の十分な抑制能を示すことが確認された。
Ｍｕｌｔｉｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｄａｔａにおける１０サイクル目の蛍光値を表２５に示す。Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを添加した反応液を３７℃で２４時間曝露した場合では、－２０℃で２４時間曝露した場合に比べて、蛍光値の上昇が確認された。一方、Ａｎｔｉ－ＴＡＱ２を添加した反応液を３７℃で２４時間曝露した場合、Ｔｒｉｓ－ＨＣｌを添加した反応液を－２０℃で２４時間曝露した場合と同等で、Ｔａｑポリメラーゼ及びＴｔｈポリメラーゼ共に蛍光値の上昇は確認されなかった。
具体的には、（ｅ）蛍光標識二本鎖基質ＤＮＡ分解率は、下記の式で算出できる。
（ｅ）蛍光標識二本鎖基質ＤＮＡ分解率［（Ｆ４３－Ｆ４１）÷（Ｆ４２－Ｆ４１）×１００）］
Ｆ４１：抗ドメインＥ抗体を含まない場合の－２０℃で２４時間曝露後（３７℃２４時間の曝露前に相当）の１０サイクル目の蛍光強度
Ｆ４２：抗ドメインＥ抗体を含まない場合の３７℃で２４時間曝露後の１０サイクル目の蛍光強度
Ｆ４３：抗ドメインＥ抗体を含む場合の３７℃で２４時間曝露後の１０サイクル目の蛍光強度
Ａｎｔｉ－ＴＡＱ２を添加して３７℃で２４時間曝露したサンプルでは、Ｔａｑポリメラーゼ及びＴｔｈポリメラーゼ共に（ｅ）蛍光標識二本鎖基質ＤＮＡ分解率（％）≦１０％と算出された。従って、ＴａｑポリメラーゼとＴｔｈポリメラーゼの両方に対して、Ａｎｔｉ－ＴＡＱ２は蛍光標識二本鎖基質ＤＮＡ分解の十分な抑制能を示すことが確認された。
【0224】
【表25】
【0225】
試験例１８．抗体の結合速度定数ｋａ値、解離速度定数ｋｄ値、及び平衡解離定数Ｋ
Ｄ
値の測定
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて、Ｔｔｈポリメラーゼに対する抗体の親和性を決定した。測定装置は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ１００装置（Ｃｙｔｉｖａ社）を使用した。ランニング緩衝液は、０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％（ｖ／ｖ） Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ ２０（Ｃｙｔｉｖａ社）を使用した。
（１）アミンカップリングによる固定化
ＥＤＣ及びＮＨＳを用いて、リガンド（Ｔｔｈポリメラーゼ）をＣＭ５センサーチップ（Ｃｙｔｉｖａ社）に固定化し、１Ｍ ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ溶液でブロッキングを行った。その結果、フローセル１－４上で２００－５００ＲＵの密度でＴｔｈポリメラーゼが固定化された。
（２）相互作用測定
抗体を０．２２２～８１ｎＭの範囲で段階希釈して、フローセル上に添加した。得られたセンサグラムをＢｉａｃｏｒｅ Ｘ１００評価ソフトウェアのＢｉｖａｌｅｎｔ ａｎａｌｙｔｅモデルにフィッティングさせて、結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）、および平衡解離定数（ＫＤ）を決定した。
（３）結果
抗ドメインＥ抗体としてＡｎｔｉ－ＴＴＨ２、Ａｎｔｉ－ＴＴＨ４、Ａｎｔｉ－ＴＴＨ５の相互作用を解析した結果を表２４に示す。抗ドメインＥ抗体は、いずれも１０ｎＭ以下のＫＤを示した。
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて、Ｔｔｈポリメラーゼに対する抗体の親和性を決定した。測定装置は、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ１００装置（Ｃｙｔｉｖａ社）を使用した。ランニング緩衝液は、０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％（ｖ／ｖ） Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ ２０（Ｃｙｔｉｖａ社）を使用した。
（１）アミンカップリングによる固定化
ＥＤＣ及びＮＨＳを用いて、リガンド（Ｔｔｈポリメラーゼ）をＣＭ５センサーチップ（Ｃｙｔｉｖａ社）に固定化し、１Ｍ ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ溶液でブロッキングを行った。その結果、フローセル１－４上で２００－５００ＲＵの密度でＴｔｈポリメラーゼが固定化された。
（２）相互作用測定
抗体を０．２２２～８１ｎＭの範囲で段階希釈して、フローセル上に添加した。得られたセンサグラムをＢｉａｃｏｒｅ Ｘ１００評価ソフトウェアのＢｉｖａｌｅｎｔ ａｎａｌｙｔｅモデルにフィッティングさせて、結合速度定数（ｋａ）、解離速度定数（ｋｄ）、および平衡解離定数（ＫＤ）を決定した。
（３）結果
抗ドメインＥ抗体としてＡｎｔｉ－ＴＴＨ２、Ａｎｔｉ－ＴＴＨ４、Ａｎｔｉ－ＴＴＨ５の相互作用を解析した結果を表２４に示す。抗ドメインＥ抗体は、いずれも１０ｎＭ以下のＫＤを示した。
【表26】
【0226】
試験例１９．抗体のエピトープマッピング
エピトープマッピングは、ＰＥＰｐｅｒＰＲＩＮＴ社のＰＥＰｐｅｒＭＡＰ（商標）Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ受託解析サービスの立体配座エピトープマッピングを利用して実施した。配列番号１に示したＴａｑ ｅｘｏのアミノ酸配列（ｗｈｏｌｅ ＴａｑのＮ末端から２９０番目のアミノ酸まで）、及び配列番号２に示したＴｔｈ ｅｘｏのアミノ酸配列（ｗｈｏｌｅ ＴｔｈのＮ末端から２９２番目のアミノ酸まで）のうち、７、１０、１３アミノ酸からなるペプチドを６、９、１２アミノ酸ずつ重複するように１アミノ酸ずつずらしてペプチドアレイ上に合成した。その後、各ペプチドアレイに対して、Ａｎｔｉ－ＴＡＱ２及びＡｎｔｉ－ＴＴＨ４の結合性を示す検出シグナルを測定し、抗体と相互作用するエピトープを特定した。
エピトープマッピングは、ＰＥＰｐｅｒＰＲＩＮＴ社のＰＥＰｐｅｒＭＡＰ（商標）Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ受託解析サービスの立体配座エピトープマッピングを利用して実施した。配列番号１に示したＴａｑ ｅｘｏのアミノ酸配列（ｗｈｏｌｅ ＴａｑのＮ末端から２９０番目のアミノ酸まで）、及び配列番号２に示したＴｔｈ ｅｘｏのアミノ酸配列（ｗｈｏｌｅ ＴｔｈのＮ末端から２９２番目のアミノ酸まで）のうち、７、１０、１３アミノ酸からなるペプチドを６、９、１２アミノ酸ずつ重複するように１アミノ酸ずつずらしてペプチドアレイ上に合成した。その後、各ペプチドアレイに対して、Ａｎｔｉ－ＴＡＱ２及びＡｎｔｉ－ＴＴＨ４の結合性を示す検出シグナルを測定し、抗体と相互作用するエピトープを特定した。
【0227】
（結果）
Ａｎｔｉ－ＴＡＱ２は、Ｔａｑ ｅｘｏ（配列番号１）におけるアミノ酸配列ＫＥＤＧＤＡＶＩＶＶＦ（配列番号６１）及びＬＥＲＬＥＦＧＳＬＬＨＥＦ（配列番号７７）の少なくとも２つの領域に結合し、また、Ｔｔｈ ｅｘｏ（配列番号２）におけるアミノ酸配列ＥＤＧＹＫＡＶＦＶＶＦ（配列番号６２）、ＨＬＩＴＰＥＷＬＷ（配列番号６６）、ＫＹＧＬＲＰＥＱＷＶＤＦ（配列番号６７）及びＬＲＡＦＬＥＲＬＥＦ（配列番号７８）の少なくとも４つの領域に結合することが確認された。
Ａｎｔｉ－ＴＴＨ４は、Ｔａｑ ｅｘｏ（配列番号１）におけるアミノ酸配列ＨＥＡＹＧＧＹ（配列番号６４）、ＥＫＹＧＬＲＰＤＱＷＡＤＹ（配列番号６８）及びＲＡＦＬＥＲＬＥＦＧＳＬＬＨ（配列番号８０）の少なくとも３つの領域に結合し、また、Ｔｔｈ ｅｘｏ（配列番号２）におけるアミノ酸配列ＨＥＡＹＥＡＹ（配列番号６５）、ＧＬＲＰＥＱＷＶＤＦ（配列番号７０）、ＩＴＰＥＷＬＷ（配列番号７１）、ＬＲＡＦＬＥＲＬＥＦ（配列番号７８）及びＬＥＦＧＳＬＬＨＥＦ（配列番号８２）の少なくとも５つの領域に結合することが確認された。
Ａｎｔｉ－ＴＡＱ２は、Ｔａｑ ｅｘｏ（配列番号１）におけるアミノ酸配列ＫＥＤＧＤＡＶＩＶＶＦ（配列番号６１）及びＬＥＲＬＥＦＧＳＬＬＨＥＦ（配列番号７７）の少なくとも２つの領域に結合し、また、Ｔｔｈ ｅｘｏ（配列番号２）におけるアミノ酸配列ＥＤＧＹＫＡＶＦＶＶＦ（配列番号６２）、ＨＬＩＴＰＥＷＬＷ（配列番号６６）、ＫＹＧＬＲＰＥＱＷＶＤＦ（配列番号６７）及びＬＲＡＦＬＥＲＬＥＦ（配列番号７８）の少なくとも４つの領域に結合することが確認された。
Ａｎｔｉ－ＴＴＨ４は、Ｔａｑ ｅｘｏ（配列番号１）におけるアミノ酸配列ＨＥＡＹＧＧＹ（配列番号６４）、ＥＫＹＧＬＲＰＤＱＷＡＤＹ（配列番号６８）及びＲＡＦＬＥＲＬＥＦＧＳＬＬＨ（配列番号８０）の少なくとも３つの領域に結合し、また、Ｔｔｈ ｅｘｏ（配列番号２）におけるアミノ酸配列ＨＥＡＹＥＡＹ（配列番号６５）、ＧＬＲＰＥＱＷＶＤＦ（配列番号７０）、ＩＴＰＥＷＬＷ（配列番号７１）、ＬＲＡＦＬＥＲＬＥＦ（配列番号７８）及びＬＥＦＧＳＬＬＨＥＦ（配列番号８２）の少なくとも５つの領域に結合することが確認された。
【0228】
Ａｎｔｉ－ＴＡＱ２は、Ｔａｑ ｅｘｏとＴｔｈ ｅｘｏで共通もしくは類似するアミノ酸領域Ａにおける配列（ＥＤＧＤＡＶＩＶＶＦ(配列番号６０)又はＥＤＧＹＫＡＶＦＶＶＦ(配列番号６２)）を含むエピトープと、アミノ酸領域Ｄにおける共通配列（ＬＥＲＬＥＦ(配列番号７５)）を含むエピトープとを認識して結合する抗体であった。
Ａｎｔｉ－ＴＴＨ４は、Ｔａｑ ｅｘｏとＴｔｈ ｅｘｏで共通もしくは類似するアミノ酸領域Ｂにおける配列（ＨＥＡＹＧＧＹ(配列番号６４)又はＨＥＡＹＥＡＹ(配列番号６５)）を含むエピトープと、アミノ酸領域Ｃにおける共通配列（ＥＫＹＧＬＲＰＤＱＷＡＤＹ(配列番号６８)、ＧＬＲＰＥＱＷＶＤＦ(配列番号７０)、又はＩＴＰＥＷＬＷ(配列番号７１)）を含むエピトープと、アミノ酸領域Ｄにおける共通配列（ＲＡＦＬＥＲＬＥＦ(配列番号７９)又はＬＥＦＧＳＬＬＨ(配列番号８１)）を含むエピトープとを認識して結合する抗体であった。
Ａｎｔｉ－ＴＴＨ４は、Ｔａｑ ｅｘｏとＴｔｈ ｅｘｏで共通もしくは類似するアミノ酸領域Ｂにおける配列（ＨＥＡＹＧＧＹ(配列番号６４)又はＨＥＡＹＥＡＹ(配列番号６５)）を含むエピトープと、アミノ酸領域Ｃにおける共通配列（ＥＫＹＧＬＲＰＤＱＷＡＤＹ(配列番号６８)、ＧＬＲＰＥＱＷＶＤＦ(配列番号７０)、又はＩＴＰＥＷＬＷ(配列番号７１)）を含むエピトープと、アミノ酸領域Ｄにおける共通配列（ＲＡＦＬＥＲＬＥＦ(配列番号７９)又はＬＥＦＧＳＬＬＨ(配列番号８１)）を含むエピトープとを認識して結合する抗体であった。
【0229】
また、Ａｎｔｉ－ＴＡＱ２及びＡｎｔｉ－ＴＴＨ４の両方に共通して、Ｔａｑ ｅｘｏのアミノ酸配列では、アミノ酸領域Ｄにおける共通配列（ＬＥＲＬＥＦＧＳＬＬＨ(配列番号７６)）を含むエピトープに結合し、Ｔｔｈ ｅｘｏのアミノ酸配列では、アミノ酸領域Ｃにおける共通配列（ＧＬＲＰＥＱＷＶＤＦ(配列番号７０)又はＩＴＰＥＷＬＷ(配列番号７１)）を含むエピトープと、結合領域Ｄにおける共通配列（ＬＲＡＦＬＥＲＬＥＦ(配列番号７８)）を含むエピトープとを認識して結合することが示された。そして、Ａｎｔｉ－ＴＡＱ２及びＡｎｔｉ－ＴＴＨ４は、Ｔａｑ ｅｘｏ及びＴｔｈ ｅｘｏにおいてアミノ酸領域Ｄにおける共通配列（ＬＥＲＬＥＦ(配列番号７５)）を含むエピトープに結合することも確認された。
【配列表】