(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024094545
(43)【公開日】2024-07-10
(54)【発明の名称】ＰＣＲ用溶液
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/686 20180101AFI20240703BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/686 Z ZNA
【審査請求】未請求
【請求項の数】6
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022211164
(22)【出願日】2022-12-28
(71)【出願人】
【識別番号】000001395
【氏名又は名称】杏林製薬株式会社
(72)【発明者】
【氏名】竹内 亮太
(72)【発明者】
【氏名】岡 正樹
(72)【発明者】
【氏名】遠藤 裕子
(72)【発明者】
【氏名】胡 博之
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA13
4B063QQ42
4B063QR08
4B063QR32
4B063QR41
4B063QR42
4B063QR56
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS34
4B063QX02
(57)【要約】
【課題】
レシプロカルフロー型の核酸増幅装置を用いたＰＣＲにおいて、核酸増幅効率、検出感度に優れた核酸増幅方法を提供することである。
【解決手段】
以下の成分（Ａ）～（Ｄ）を含有し、レシプロカルフロー型の核酸増幅装置を用いることを特徴とする核酸増幅用組成物。
（Ａ）ＤＮＡポリメラーゼ
（Ｂ）フォワードプライマー及びリバースプライマー
（Ｃ）炭素数２～６の直鎖、分岐鎖又は環状のジオール
（Ｄ）非イオン界面活性剤
【選択図】図６
レシプロカルフロー型の核酸増幅装置を用いたＰＣＲにおいて、核酸増幅効率、検出感度に優れた核酸増幅方法を提供することである。
【解決手段】
以下の成分（Ａ）～（Ｄ）を含有し、レシプロカルフロー型の核酸増幅装置を用いることを特徴とする核酸増幅用組成物。
（Ａ）ＤＮＡポリメラーゼ
（Ｂ）フォワードプライマー及びリバースプライマー
（Ｃ）炭素数２～６の直鎖、分岐鎖又は環状のジオール
（Ｄ）非イオン界面活性剤
【選択図】図６
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の成分（Ａ）～（Ｄ）を含有し、レシプロカルフロー型の核酸増幅装置を用いることを特徴とする核酸増幅用組成物。
（Ａ）ＤＮＡポリメラーゼ
（Ｂ）フォワードプライマー及びリバースプライマー
（Ｃ）炭素数２～６の直鎖、分岐鎖又は環状のジオール
（Ｄ）非イオン界面活性剤
（Ａ）ＤＮＡポリメラーゼ
（Ｂ）フォワードプライマー及びリバースプライマー
（Ｃ）炭素数２～６の直鎖、分岐鎖又は環状のジオール
（Ｄ）非イオン界面活性剤
【請求項2】
成分（Ａ）ＤＮＡポリメラーゼが、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体が結合したポリメラーゼである、請求項１記載の組成物。
【請求項3】
成分（Ｃ）が、炭素数２～６の直鎖のジオールである、請求項１又は２記載の組成物。
【請求項4】
さらに成分（Ｅ）蛍光色素で標識されたプローブを含有する、請求項１記載の組成物。
【請求項5】
成分（Ｅ）が、レポーター蛍光色素及びクエンチャー色素を有するプローブである、請求項４記載の組成物。
【請求項6】
さらに成分（Ｆ）ＤＭＳＯを含有する請求項３記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はＰＣＲ用溶液に関する。なお、本明細書に記載される文献は、下記先行技術文献（特許文献及び非特許文献）として挙げた文献を含め、全ての文献につき、記載される全ての内容が、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
核酸の検出は、医薬品の研究開発、法医学、臨床検査、農作物や病原性微生物の種類の同定など、様々な分野において中核をなしている。当該核酸の検出のために、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）が広く用いられている。ＰＣＲはＤＮＡのある特定領域を選択的に増幅する技術である。具体的には、サーマルサイクルと呼ばれる三相もしくは二相の温度条件を繰り返すことにより、単一鎖へのＤＮＡの変性、変性されたＤＮＡ一本鎖とプライマーのアニーリング、及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ酵素によるプライマーの伸長という個々の反応を順次繰り返すことによりＤＮＡを増幅する。
【0003】
また、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡの検出を容易とするリアルタイムＰＣＲが開発されている。
ＰＣＲは目的のＤＮＡを選択的に増幅できるが、増幅したＤＮＡを確認するためには、ＰＣＲの終了後に別途ゲル電気泳動などによる確認作業が必要であった。リアルタイムＰＣＲでは目的のＤＮＡの増幅量に合わせ蛍光を発生もしくは消光させることにより、試料中の目的のＤＮＡの有無を簡便に確認できるようになった。
また、従来のＰＣＲでは、ＰＣＲ前の試料中のテンプレートＤＮＡ量が一定量を超えると、ＰＣＲ後の増幅ＤＮＡ量はプラトーに達していることが多く、ＰＣＲ前のテンプレートＤＮＡ量を定量することはできない。しかし、リアルタイムＰＣＲにおいては、プラトーに達する前に、ＰＣＲ途中の増幅ＤＮＡ量をリアルタイムに検出できるため、ＤＮＡ増幅の様子からＰＣＲ前のテンプレートＤＮＡ量を定量することが可能である。そのためリアルタイムＰＣＲは、定量的ＰＣＲとも呼ばれる。
ＰＣＲは目的のＤＮＡを選択的に増幅できるが、増幅したＤＮＡを確認するためには、ＰＣＲの終了後に別途ゲル電気泳動などによる確認作業が必要であった。リアルタイムＰＣＲでは目的のＤＮＡの増幅量に合わせ蛍光を発生もしくは消光させることにより、試料中の目的のＤＮＡの有無を簡便に確認できるようになった。
また、従来のＰＣＲでは、ＰＣＲ前の試料中のテンプレートＤＮＡ量が一定量を超えると、ＰＣＲ後の増幅ＤＮＡ量はプラトーに達していることが多く、ＰＣＲ前のテンプレートＤＮＡ量を定量することはできない。しかし、リアルタイムＰＣＲにおいては、プラトーに達する前に、ＰＣＲ途中の増幅ＤＮＡ量をリアルタイムに検出できるため、ＤＮＡ増幅の様子からＰＣＲ前のテンプレートＤＮＡ量を定量することが可能である。そのためリアルタイムＰＣＲは、定量的ＰＣＲとも呼ばれる。
【0004】
また、１つのＰＣＲ反応系に複数のプライマー対を用いることで、複数の遺伝子領域を同時に増幅するマルチプレックスＰＣＲが注目されている。マルチプレックスＰＣＲを発展させたリアルタイムマルチプレックスＰＣＲは、それぞれのターゲットを、他のターゲットの影響（クロストーク）を受けにくく、感度を落とすことなく、複数の異なるターゲット遺伝子を区別して検出し、定量的な結果を得ることを目的としている。
【0005】
ＰＣＲに使用される汎用のサーマルサイクラー装置は、ヒーターであるアルミブロック部の巨大な熱容量のため温度制御が遅く、３０～４０サイクルのＰＣＲ操作に従来１～２時間、場合によってはそれ以上を要する。そのため、最新の遺伝子検査装置を用いても分析にはトータルで、通常１時間以上を要しており、ＰＣＲ操作の高速化は、技術登場以来の大きな課題であった。
【0006】
ＰＣＲの高速化のための手法として、レシプロカルフロー型の核酸増幅装置が提案されている（特許文献１）。
レシプロカルフロー型の核酸増幅装置を用いるＰＣＲにおいては、マイクロプロア等の送液機構を使用し、中間流路を介して連通している変性温度帯に維持されている流路と伸長およびアニーリング温度帯に維持されている流路との間で試料液を行き来させ、ＤＮＡを増幅する。
レシプロカルフロー型の核酸増幅装置を用いるＰＣＲにおいては、マイクロプロア等の送液機構を使用し、中間流路を介して連通している変性温度帯に維持されている流路と伸長およびアニーリング温度帯に維持されている流路との間で試料液を行き来させ、ＤＮＡを増幅する。
【0007】
また、さらに、レシプロカルフロー型の核酸増幅装置を使用してＰＣＲの高速化を実現するとともに、ノイズも低下させたリアルタイムマルチプレックスＰＣＲも提案されている（特許文献２）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】国際公開第２０１６／００６６１２号
【特許文献2】国際公開第２０２０／１８９５８１号
【特許文献3】国際公開第２０２２／１５３９９９号
【特許文献4】米国特許２００５／０４２６２７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
レシプロカルフロー型の核酸増幅装置を用いたＰＣＲにおいては流路内を行き来させる試料液において複数の気泡が生じ、それらが結合してより大きな気泡が生じた結果、試料液が流路内で分断されることがあった（該状態を本明細書では液分かれという）。特に、単一鎖へのＤＮＡの変性においては、試料液の温度を沸点に近い温度まで上昇させるため気泡が生じやすくなる。
気泡発生を抑制するためにＰＣＲの変性温度を下げることもできるが、変性温度を下げると核酸の増幅効率が下がるという不都合を生じる。核酸の増幅効率を下げないために、変性時間を長くすることでカバーすることも可能ではあるが、ＰＣＲ時間が延びるため望ましいとはいえない。
そこで、本発明の目的は、レシプロカルフロー型の核酸増幅装置を用いたＰＣＲにおいて、核酸増幅効率、検出感度に優れた核酸増幅方法を提供することである。
気泡発生を抑制するためにＰＣＲの変性温度を下げることもできるが、変性温度を下げると核酸の増幅効率が下がるという不都合を生じる。核酸の増幅効率を下げないために、変性時間を長くすることでカバーすることも可能ではあるが、ＰＣＲ時間が延びるため望ましいとはいえない。
そこで、本発明の目的は、レシプロカルフロー型の核酸増幅装置を用いたＰＣＲにおいて、核酸増幅効率、検出感度に優れた核酸増幅方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0010】
本発明は、以下のとおりである。
以下の成分（Ａ）～（Ｄ）を含有し、レシプロカルフロー型の核酸増幅装置を用いることを特徴とする核酸増幅用組成物。
（Ａ）ＤＮＡポリメラーゼ
（Ｂ）フォワードプライマー及びリバースプライマー
（Ｃ）炭素数２～６の直鎖、分岐鎖又は環状のジオール
（Ｄ）非イオン界面活性剤
２）成分（Ａ）ＤＮＡポリメラーゼが、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体が結合したポリメラーゼである、１）記載の組成物。
３）成分（Ｃ）が、炭素数２～６の直鎖のジオールである、１）記載の組成物。
４）さらに成分（Ｅ）蛍光色素で標識されたプローブを含有する、１）記載の組成物。
５）成分（Ｅ）が、レポーター蛍光色素及びクエンチャー色素を有するプローブである、４）記載の組成物。
６）さらに成分（Ｆ）ＤＭＳＯを含有する３）記載の組成物。
以下の成分（Ａ）～（Ｄ）を含有し、レシプロカルフロー型の核酸増幅装置を用いることを特徴とする核酸増幅用組成物。
（Ａ）ＤＮＡポリメラーゼ
（Ｂ）フォワードプライマー及びリバースプライマー
（Ｃ）炭素数２～６の直鎖、分岐鎖又は環状のジオール
（Ｄ）非イオン界面活性剤
２）成分（Ａ）ＤＮＡポリメラーゼが、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体が結合したポリメラーゼである、１）記載の組成物。
３）成分（Ｃ）が、炭素数２～６の直鎖のジオールである、１）記載の組成物。
４）さらに成分（Ｅ）蛍光色素で標識されたプローブを含有する、１）記載の組成物。
５）成分（Ｅ）が、レポーター蛍光色素及びクエンチャー色素を有するプローブである、４）記載の組成物。
６）さらに成分（Ｆ）ＤＭＳＯを含有する３）記載の組成物。
【発明の効果】
【0011】
本発明によれば、レシプロカルフロー型の核酸増幅装置を用いたＰＣＲにおいて、核酸増幅効率、検出感度に優れた核酸増幅方法の提供を可能とした。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】レシプロカルフロー型の核酸増幅装置に係る流路であって、ＤＮＡ変性に適する温度に維持される流路(high)、および伸長およびアニーリングに適する温度に維持される流路(low)を有する流路の例を示す図である。
【図2】レシプロカルフロー型の核酸増幅装置に係る流路であって、逆転写反応に適する温度に維持される流路(Ｒ)、ＤＮＡ変性に適する温度に維持される流路(high)、および伸長およびアニーリングに適する温度に維持される流路(low)を有する流路の例を示す図である。
【図3】非イオン界面活性剤と1,5-ペンタンジオールのいずれも配合していないＰＣＲ反応液を用いたリアルタイムＰＣＲの結果を示す。
【図4】非イオン界面活性剤は配合したが、1,5-ペンタンジオールを配合していないＰＣＲ反応液を用いたリアルタイムＰＣＲの結果を示す。
【図5】1,5-ペンタンジオールは配合したが、非イオン界面活性剤を配合しいていないＰＣＲ反応液を用いたリアルタイムＰＣＲの結果を示す。
【図6】非イオン界面活性剤及び1,5-ペンタンジオールを配合したＰＣＲ反応液を用いたリアルタイムＰＣＲの結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本実施形態の核酸増幅用組成物は、成分（Ａ）～（Ｄ）を配合する。
本実施形態の組成物に使用される成分（Ａ）の「ＤＮＡポリメラーゼ」は、４種のデオキシリボオヌクレオシド三リン酸を基質として鋳型ＤＮＡの塩基配列のＤＮＡ鎖の重合を触媒する酵素である。熱に対して抵抗性を示す耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが好ましく、公知のものを使用することができる。例えば、ファミリーＡ（ＰｏｌＩ型）に属するＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼやＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、ファミリーＢ（α型）に属するＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｕｌｔｉｍａ ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標） ＤＮＡポリメラーゼのシリーズ（ＨＳ、ＧＸＬ、Ｍａｘ）やこれらの変異体などが挙げられる。
成分（Ａ）の「ＤＮＡポリメラーゼ」は、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体が結合したポリメラーゼが好ましい。
「抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体が結合したポリメラーゼ」とは、特異的な抗体が結合することによりＤＮＡポリメラーゼ活性が阻害されており、最初の高温変性ステップ（例えば、９５℃）でこの結合した抗体が外れ、ＤＮＡポリメラーゼが活性化されるホットスタート特性を持つポリメラーゼを意味する。
本実施形態の組成物に使用される成分（Ａ）の「ＤＮＡポリメラーゼ」は、４種のデオキシリボオヌクレオシド三リン酸を基質として鋳型ＤＮＡの塩基配列のＤＮＡ鎖の重合を触媒する酵素である。熱に対して抵抗性を示す耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが好ましく、公知のものを使用することができる。例えば、ファミリーＡ（ＰｏｌＩ型）に属するＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼやＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、ファミリーＢ（α型）に属するＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｕｌｔｉｍａ ＤＮＡポリメラーゼ、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ（登録商標） ＤＮＡポリメラーゼのシリーズ（ＨＳ、ＧＸＬ、Ｍａｘ）やこれらの変異体などが挙げられる。
成分（Ａ）の「ＤＮＡポリメラーゼ」は、抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体が結合したポリメラーゼが好ましい。
「抗ＤＮＡポリメラーゼ抗体が結合したポリメラーゼ」とは、特異的な抗体が結合することによりＤＮＡポリメラーゼ活性が阻害されており、最初の高温変性ステップ（例えば、９５℃）でこの結合した抗体が外れ、ＤＮＡポリメラーゼが活性化されるホットスタート特性を持つポリメラーゼを意味する。
【0014】
本実施形態の組成物に使用される成分（Ｂ）の「フォワードプライマー及びリバースプライマー」は、一つの標的遺伝子領域に対応して１種のフォワードプライマー及び１種のリバースプライマーを用いる。但し、フォワードプライマーとリバースプライマーについて対が成立していればよく、溶液中、フォワードプライマーとリバースプライマーについて種類の数が同数である必要はない。例えば、本実施形態の溶液中、１種のフォワードプライマーと２種のリバースプライマーとが含有されるようにしてもよい。
成分（Ｂ）の含有量は、本実施形態の組成物に対してそれぞれ終濃度０．５～４μMであることが好ましい。
成分（Ｂ）の含有量は、本実施形態の組成物に対してそれぞれ終濃度０．５～４μMであることが好ましい。
【0015】
本実施形態の組成物に使用される成分（Ｃ）の「ジオール」は、炭素数２～６の直鎖、分岐鎖及び環状のジオールから選択される１種であっても２種以上であってもよい。
ここで、「炭素数２～６の直鎖又は分岐鎖のジオール」としては、エチレングリコール、1,2-プロパンジオール、1,3-プロパンジオール、1,2-ブタンジオール、1,3-ブタンジオール、1,4-ブタンジオール、1,2-ペンタンジオール、2,4-ペンタンジオール、1,5-ペンタンジオール、1,2-ヘキサンジオール、1,6-ヘキサンジオール、1,2-ペンタンジオール,2-メチル2,4-ペンタンジオールが挙げられる。
また、「炭素数２～６の環状のジオール」として、cis-1.2-シクロペンタンジオール, trans-1.2-シクロペンタンジオールが挙げられる。
成分（Ｃ）の含有量は、本実施形態の組成物に対して終濃度１～２０ vol％であることが好ましく、さらに好ましくは５～１５ vol％である。
ここで、「炭素数２～６の直鎖又は分岐鎖のジオール」としては、エチレングリコール、1,2-プロパンジオール、1,3-プロパンジオール、1,2-ブタンジオール、1,3-ブタンジオール、1,4-ブタンジオール、1,2-ペンタンジオール、2,4-ペンタンジオール、1,5-ペンタンジオール、1,2-ヘキサンジオール、1,6-ヘキサンジオール、1,2-ペンタンジオール,2-メチル2,4-ペンタンジオールが挙げられる。
また、「炭素数２～６の環状のジオール」として、cis-1.2-シクロペンタンジオール, trans-1.2-シクロペンタンジオールが挙げられる。
成分（Ｃ）の含有量は、本実施形態の組成物に対して終濃度１～２０ vol％であることが好ましく、さらに好ましくは５～１５ vol％である。
【0016】
本実施形態の組成物に使用される成分（Ｄ）の「非イオン界面活性剤」は、水溶液中でイオンに解離する基を持たない界面活性剤であり、例えば、プロピレンオキシドーエチレンオキシドブロック共重合体、アルキルグリコシド、ノニルフェニルエトキシレート、ポリエチレングリコールトリメチルノニルエーテル、ポリオキシエチレンp-t-オクチルフェニルエーテル（トリトンＸ１００、トリトンＸ４５、トリトンＸ１１４（ダウケミカル社製）など）、ポリエチレンアルキルエーテル（ブリッジ３０）、ソルビタン脂肪酸エステル（スパン系界面活性剤、アラセル系界面活性剤）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（トゥイーン系界面活性剤、例：トゥイーン２０）、ポリオキシエチレンアルキルルエーテル（ブリッジ系界面活性剤）、グリセリン脂肪酸エステルが挙げられる。
（Ｄ）非イオン界面活性剤の含有量は、本実施形態の組成物に対して０．００１～０．５ vol％であることが好ましく、さらに好ましくは０．０１～０．２ vol％である。
（Ｄ）非イオン界面活性剤の含有量は、本実施形態の組成物に対して０．００１～０．５ vol％であることが好ましく、さらに好ましくは０．０１～０．２ vol％である。
【0017】
本実施形態の組成物に使用される成分（Ｅ）の「蛍光色素で標識されたプローブ」は、蛍光色素と結合したオリゴヌクレオチドであり、相補的な配列とハイブリダイゼーションすることにより標的配列を検出することを目的とする。
本実施形態に係る「蛍光色素で標識されたプローブ」の蛍光色素の例としては、ＡＢＹ、アクリジン、アレクサフルーア４８８、アレクサフルーア５３２、アレクサフルーア５９４、アレクサフルーア６３３、アレクサフルーア６４７、ＡＴＴＯ（ＡＴＴＯ－ＴＥＣ蛍光色素）、バイオサーチブルー、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、クマリン、ＤＡＮＳＹＬ、ＦＡＭ（例えば、５－ＦＡＭ、６－ＦＡＭ）、ＦＩＴＣ、ＧＰＦ、５－ＨＥＸ、６－ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＪＵＮ、マリーナブルー、ＮＥＤ、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、パシフィックブルー、ＰＥＴ、パルサー、クエザー５７０、クエザー６７０、クエザー７０５、ローダミングリーン、ローダミンレッド、５－ＲＯＸ、６－ＲＯＸ、５－ＴＡＭＲＡ、６－ＴＡＭＲＡ、５－ＴＥＴ、６－ＴＥＴ、テキサスレッド、ＴＲＩＴＣ、ＶＩＣが挙げられる。
また、蛍光色素で標識したプローブは、さらにクエンチャー色素と結合したオリゴヌクレオチドであることが好ましい。クエンチャー色素とは、蛍光色素の発する蛍光を消失させることができる限り特に制限されず、例えば、ＴＡＭＲＡ、ＢＨＱ（ＢＨＱ－１～３）、ＮＦＱなどが挙げられる。
本実施形態に係る「蛍光色素で標識されたプローブ」の蛍光色素の例としては、ＡＢＹ、アクリジン、アレクサフルーア４８８、アレクサフルーア５３２、アレクサフルーア５９４、アレクサフルーア６３３、アレクサフルーア６４７、ＡＴＴＯ（ＡＴＴＯ－ＴＥＣ蛍光色素）、バイオサーチブルー、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、クマリン、ＤＡＮＳＹＬ、ＦＡＭ（例えば、５－ＦＡＭ、６－ＦＡＭ）、ＦＩＴＣ、ＧＰＦ、５－ＨＥＸ、６－ＨＥＸ、ＪＯＥ、ＪＵＮ、マリーナブルー、ＮＥＤ、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、パシフィックブルー、ＰＥＴ、パルサー、クエザー５７０、クエザー６７０、クエザー７０５、ローダミングリーン、ローダミンレッド、５－ＲＯＸ、６－ＲＯＸ、５－ＴＡＭＲＡ、６－ＴＡＭＲＡ、５－ＴＥＴ、６－ＴＥＴ、テキサスレッド、ＴＲＩＴＣ、ＶＩＣが挙げられる。
また、蛍光色素で標識したプローブは、さらにクエンチャー色素と結合したオリゴヌクレオチドであることが好ましい。クエンチャー色素とは、蛍光色素の発する蛍光を消失させることができる限り特に制限されず、例えば、ＴＡＭＲＡ、ＢＨＱ（ＢＨＱ－１～３）、ＮＦＱなどが挙げられる。
【0018】
本発明の組成物に使用される成分（Ｆ）の「ＤＭＳＯ」（ジメチルスルホキシド）は、富士フィルム和光純薬等の試薬メーカーより入手可能である。
【0019】
図１はレシプロカルフロー型の核酸増幅装置において鋳型をＤＮＡとする場合の流路の概要を示す図である。また、図２はレシプロカルフロー型の核酸増幅装置において鋳型をＲＮＡとする場合の流路の概要を示す図である。
レシプロカルフロー型の核酸増幅装置は、特許文献１、２、３に記載の装置を使用することができる。流路が形成された核酸増幅用チップに試料液を投入し、前述の流路の両端に送液用機構を接続する。送液用機構として、マイクロブロアまたは送風機を用いることで、サーマルサイクラーのＤＮＡ変性に必要な温度帯とＤＮＡの伸長およびアニーリング反応に必要な温度帯の間の往復運動（送液、停止）が可能となる。
レシプロカルフロー型の核酸増幅装置は、特許文献１、２、３に記載の装置を使用することができる。流路が形成された核酸増幅用チップに試料液を投入し、前述の流路の両端に送液用機構を接続する。送液用機構として、マイクロブロアまたは送風機を用いることで、サーマルサイクラーのＤＮＡ変性に必要な温度帯とＤＮＡの伸長およびアニーリング反応に必要な温度帯の間の往復運動（送液、停止）が可能となる。
【0020】
図１中、ｈｉｇｈとして示した流路はＰＣＲにおけるＤＮＡ変性反応に必要な温度帯（例えば９０～１００℃）に維持されている流路である。また、ｌｏｗとして示した流路はＰＣＲにおけるＤＮＡの伸長およびアニーリング反応に必要な温度帯（例えば４０～７５℃）に維持されている流路である。ｈｉｇｈとして示した流路とｌｏｗとして示した流路とは中間流路aを介して連通している。レシプロカルフロー型の核酸増幅装置においては、流路内に投入された試料液をｈｉｇｈとして示した流路とｌｏｗとして示した流路とを行き来させることにより、ＰＣＲに係るサーマルサイクリングを行い、ＤＮＡを増幅する。なお、ＰＣＲに係るプロトコールについても特に限定されず、例えば公知のものを用いることができる。
【0021】
また、図１と同様に、図２中、ｈｉｇｈとして示した流路はＰＣＲにおけるＤＮＡ変性反応に必要な温度帯に維持されている流路であり、ｌｏｗとして示した流路はＰＣＲにおけるＤＮＡの伸長およびアニーリング反応に必要な温度帯に維持されている流路である。また、Ｒとして示した流路は逆転写酵素による逆転写反応が行われる流路であって、逆転写反応に必要な温度帯（例えば３７～４５℃）に維持されている流路である。ｈｉｇｈとして示した流路とｌｏｗとして示した流路とは中間流路aを介して連通しており、ｌｏｗとして示した流路とＲとして示した流路とは流路bを介して連通している。
鋳型をＲＮＡとする場合は、試料液はまずＲとして示した流路に投入され、逆転写酵素による逆転写反応が行われ、ＲＮＡに相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が生成される。その後、試料液はｈｉｇｈとして示した流路およびｌｏｗとして示した流路に送られ、ｈｉｇｈとして示した流路およびｌｏｗとして示した流路の間で試料液を行き来させることによりＰＣＲに係るサーマルサイクリングを行い、ＤＮＡを増幅する。
試料液を変性温度帯内に保持させる時間及び試料液を伸長・アニーリング温度帯内に保持させる時間のそれぞれは、標的遺伝子領域（遺伝子の種類、領域の長さ等）に応じて適宜設定することができる。例えば、試料液を変性温度帯内に保持させる時間としては、２～１０秒程度、試料液を伸長・アニーリング温度帯内に保持させる時間としては、２～６０秒程度とすることができる。
鋳型をＲＮＡとする場合は、試料液はまずＲとして示した流路に投入され、逆転写酵素による逆転写反応が行われ、ＲＮＡに相補的なＤＮＡ（ｃＤＮＡ）が生成される。その後、試料液はｈｉｇｈとして示した流路およびｌｏｗとして示した流路に送られ、ｈｉｇｈとして示した流路およびｌｏｗとして示した流路の間で試料液を行き来させることによりＰＣＲに係るサーマルサイクリングを行い、ＤＮＡを増幅する。
試料液を変性温度帯内に保持させる時間及び試料液を伸長・アニーリング温度帯内に保持させる時間のそれぞれは、標的遺伝子領域（遺伝子の種類、領域の長さ等）に応じて適宜設定することができる。例えば、試料液を変性温度帯内に保持させる時間としては、２～１０秒程度、試料液を伸長・アニーリング温度帯内に保持させる時間としては、２～６０秒程度とすることができる。
【0022】
実験例１
(試験方法)
RNase Free dH2O、10xFAST Buffer I、dNTP Mixture、100 μMフォワードプライマー（配列番号１）、100 μMリバースプライマー（配列番号２）、100 μMプローブ (配列番号３) 、Hot Start TTx DNA polymerase (東洋紡社製)、ROX Reference Dye (タカラバイオ社製)および1x104 copies/μLポジティブコントロールDNAを1反応当たり10.87μL : 2.0 μL : 1.6 μL : 0.48 μL : 0.64 μL : 0.08 μL : 0.25 μL :0.08 μL： 1.0 μLで混合した。
ポジティブコントロールDNAは、pUC57ベクターのEcoRVサイトにN2の配列を含むDNA配列（配列番号４）を挿入し、直鎖状にしたものである。
非イオン界面活性剤の効果を検討する際には、2.4 μMのCy5-Azide (sigma社製)、0.24 μMのDMSO (富士フィルム和光純薬社製)、4 x ROX Reference Dye (東洋紡社製、50xを希釈して調製)、2 vol%のTween 20 (富士フィルム和光純薬社製) を混合した溶液を1 μL加えた。ジオールの効果を検討する際には、96 vol%の1,5-ペンタンジオールを2 μL加えた。それぞれの試薬の効果を検討する際の対照はRNase Free dH2O (タカラバイオ社製)とした。さらにPCR反応液の容量が20 μLになるよう上記の混合液にRNase Free dH2O (タカラバイオ社製)を加え、PCR反応液とした。GeneSoC MINI (杏林製薬社製)及びその専用チップ（図２参照）を用いて、リアルタイムPCRを実施した。
PCR条件は活性化反応: 94 又は 95℃, 10秒、
熱変性反応 (DN): 94 又は 95℃, 4秒、
アニーリングおよび伸長反応 (AE): 58℃, 8秒
とし、DNとAEを50サイクル行い、非イオン界面活性剤および1,5-ペンタジオールが活性化反応および熱変性反応に与える影響をCt値および最終蛍光強度で判断した。
フォワードプライマー: AAATTTTGGGGACCAGGAAC
リバースプライマー: TGGCAGCTGTGTAGGTCAAC
プローブ: FAM-ATGTCGCGCATTGGCATGGA-TAMRA
(試験方法)
RNase Free dH2O、10xFAST Buffer I、dNTP Mixture、100 μMフォワードプライマー（配列番号１）、100 μMリバースプライマー（配列番号２）、100 μMプローブ (配列番号３) 、Hot Start TTx DNA polymerase (東洋紡社製)、ROX Reference Dye (タカラバイオ社製)および1x104 copies/μLポジティブコントロールDNAを1反応当たり10.87μL : 2.0 μL : 1.6 μL : 0.48 μL : 0.64 μL : 0.08 μL : 0.25 μL :0.08 μL： 1.0 μLで混合した。
ポジティブコントロールDNAは、pUC57ベクターのEcoRVサイトにN2の配列を含むDNA配列（配列番号４）を挿入し、直鎖状にしたものである。
非イオン界面活性剤の効果を検討する際には、2.4 μMのCy5-Azide (sigma社製)、0.24 μMのDMSO (富士フィルム和光純薬社製)、4 x ROX Reference Dye (東洋紡社製、50xを希釈して調製)、2 vol%のTween 20 (富士フィルム和光純薬社製) を混合した溶液を1 μL加えた。ジオールの効果を検討する際には、96 vol%の1,5-ペンタンジオールを2 μL加えた。それぞれの試薬の効果を検討する際の対照はRNase Free dH2O (タカラバイオ社製)とした。さらにPCR反応液の容量が20 μLになるよう上記の混合液にRNase Free dH2O (タカラバイオ社製)を加え、PCR反応液とした。GeneSoC MINI (杏林製薬社製)及びその専用チップ（図２参照）を用いて、リアルタイムPCRを実施した。
PCR条件は活性化反応: 94 又は 95℃, 10秒、
熱変性反応 (DN): 94 又は 95℃, 4秒、
アニーリングおよび伸長反応 (AE): 58℃, 8秒
とし、DNとAEを50サイクル行い、非イオン界面活性剤および1,5-ペンタジオールが活性化反応および熱変性反応に与える影響をCt値および最終蛍光強度で判断した。
フォワードプライマー: AAATTTTGGGGACCAGGAAC
リバースプライマー: TGGCAGCTGTGTAGGTCAAC
プローブ: FAM-ATGTCGCGCATTGGCATGGA-TAMRA
【0023】
(試験結果)
非イオン界面活性剤と1,5-ペンタンジオールのいずれも配合していないPCR反応液を使用した場合、95℃におけるCt値は44.6±2.1であり、94℃におけるCt値は算出できなかった。
非イオン界面活性剤は配合したものの、1,5-ペンタンジオールを配合していないPCR反応液を使用した場合も、95℃におけるCt値は41.4±0.9であったが、94℃でのCt値は算出できなかった。
非イオン界面活性剤は配合せず、1,5-ペンタンジオールを配合したPCR反応液を使用した場合、95℃におけるCt値は37.8±0.6であり、94℃におけるCt値は44.4±1.4であった。
非イオン界面活性剤、1,5-ペンタンジオールのいずれも配合したPCR反応液を使用した場合、95℃におけるCt値は35.1±0.3であったが、94℃でのCt値は40.0±0.2であった。
また、非イオン界面活性剤は配合せず、1,5-ペンタンジオールを配合したPCR反応液を使用した場合、95℃における最終蛍光強度が77±5であり、94℃における最終蛍光強度が46±5であった。
非イオン界面活性剤と1,5-ペンタンジオールのいずれも配合したPCR反応液を使用した場合、95℃における最終蛍光強度が296±6であり、94℃における最終蛍光強度が200±7であった。
以上のことから、非イオン界面活性剤及び1,5-ペンタンジオールを添加することで、変性温度を下げても効率がよく核酸増幅を行うことが可能となった。
非イオン界面活性剤と1,5-ペンタンジオールのいずれも配合していないPCR反応液を使用した場合、95℃におけるCt値は44.6±2.1であり、94℃におけるCt値は算出できなかった。
非イオン界面活性剤は配合したものの、1,5-ペンタンジオールを配合していないPCR反応液を使用した場合も、95℃におけるCt値は41.4±0.9であったが、94℃でのCt値は算出できなかった。
非イオン界面活性剤は配合せず、1,5-ペンタンジオールを配合したPCR反応液を使用した場合、95℃におけるCt値は37.8±0.6であり、94℃におけるCt値は44.4±1.4であった。
非イオン界面活性剤、1,5-ペンタンジオールのいずれも配合したPCR反応液を使用した場合、95℃におけるCt値は35.1±0.3であったが、94℃でのCt値は40.0±0.2であった。
また、非イオン界面活性剤は配合せず、1,5-ペンタンジオールを配合したPCR反応液を使用した場合、95℃における最終蛍光強度が77±5であり、94℃における最終蛍光強度が46±5であった。
非イオン界面活性剤と1,5-ペンタンジオールのいずれも配合したPCR反応液を使用した場合、95℃における最終蛍光強度が296±6であり、94℃における最終蛍光強度が200±7であった。
以上のことから、非イオン界面活性剤及び1,5-ペンタンジオールを添加することで、変性温度を下げても効率がよく核酸増幅を行うことが可能となった。
【0024】
【表1】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】