特開2024-94802ヒノキ花粉抗原Ｃｈａ ｏ ２に対するモノクローナル抗体及びその用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024094802
(43)【公開日】2024-07-10
(54)【発明の名称】ヒノキ花粉抗原Ｃｈａ ｏ ２に対するモノクローナル抗体及びその用途
(51)【国際特許分類】
C07K 16/16 20060101AFI20240703BHJP
C12N 5/20 20060101ALI20240703BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20240703BHJP
【ＦＩ】
C07K16/16 ZNA
C12N5/20
G01N33/53 Q
【審査請求】未請求
【請求項の数】12
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022211595
(22)【出願日】2022-12-28
(71)【出願人】
【識別番号】591039263
【氏名又は名称】鳥居薬品株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(72)【発明者】
【氏名】館野 実
(72)【発明者】
【氏名】菅原 健
【テーマコード（参考）】
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA92X
4B065AB05
4B065AC14
4B065CA25
4B065CA46
4H045AA11
4H045AA20
4H045DA76
4H045EA50
4H045FA72
(57)【要約】
【課題】ヒノキ花粉アレルゲンCha o 2に対するモノクローナル抗体の提供。
【解決手段】ヒノキ花粉アレルゲンCha o 2に対するモノクローナル抗体であって、Cha o 1及びスギ花粉アレルゲンCry j 2に反応する又は反応しない、前記モノクローナル抗体。
【選択図】なし
【解決手段】ヒノキ花粉アレルゲンCha o 2に対するモノクローナル抗体であって、Cha o 1及びスギ花粉アレルゲンCry j 2に反応する又は反応しない、前記モノクローナル抗体。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヒノキ花粉アレルゲンCha o 2に対するモノクローナル抗体であって、Cha o 1に反応しない、前記モノクローナル抗体。
【請求項2】
スギ花粉アレルゲンCry j 2に反応しない、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項3】
スギ花粉アレルゲンCry j 2に反応する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項4】
配列番号２～６に示されるいずれかのアミノ酸配列の全部又は一部をエピトープとして認識する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項5】
請求項２に記載のモノクローナル抗体と組み合わせたときのCha o 2の最低検出濃度が5ng/mL以下である請求項３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項6】
請求項３に記載のモノクローナル抗体と組み合わせたときのCha o 2の最低検出濃度が5ng/mL以下である請求項２に記載のモノクローナル抗体。
【請求項7】
変動係数が20%以下の再現性を有する、請求項１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項8】
請求項１に記載のモノクローナル抗体が結合するエピトープに結合する抗体。
【請求項9】
請求項１に記載のモノクローナル抗体、又は請求項８に記載の抗体の断片。
【請求項10】
請求項１に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項11】
請求項１若しくは８に記載の抗体又はこれらの断片と試料とを反応させて、Cha o 2を検出することを特徴とする、Cha o 2の検出方法。
【請求項12】
請求項１若しくは８に記載の抗体又はこれらの断片を含む、Cha o 2の検出用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ヒノキ花粉の主要アレルゲンであるCha o 2に対するモノクローナル抗体に関する。
【背景技術】
【0002】
ヒノキ花粉は花粉症症状を引き起こす原因物質の1つと考えられており、Cha o 2はヒノキ花粉の主要アレルゲンとして知られている（特許文献１、非特許文献２，３）。その他のヒノキ花粉アレルゲンとしてCha o 1（非特許文献１、特許文献１）、近年ではCha o 3（特許文献２、非特許文献４）が報告されている。
【0003】
日本の国民のおよそ3分の1はスギ花粉症であることが知られている。ヒノキ花粉はスギ花粉と共通の抗原性を持つことが報告されており（非特許文献５）、また春期花粉症患者の76.4％はスギ花粉とヒノキ花粉両方に陽性であるという報告から（非特許文献６）、ヒノキ花粉は春期にみられる花粉症を引き起こす原因アレルゲンのひとつとして考えられている。
【0004】
花粉症患者の花粉アレルゲンの解析やその研究には、抗原特異的なモノクローナル抗体は有用であり、高感度な抗原の検出や定量を可能にする。例えば、スギ花粉抗原Cry j 1又はCry j 2、ヒノキ花粉抗原Cha o 1に対するモノクローナル抗体（特許文献３、５）やダニ抗原Der f 1に対するモノクローナル抗体（特許文献４）については、既にその抗体、ハイブリドーマ及び用途などが知られている。しかしながら、ヒノキ花粉主要アレルゲンCha o 2に対する充分に検証された抗体やその用途についての報告はない。市販で使用可能な検出系としては、「Cha o 2 ポリクローナル抗体」（Agresera社）のみであるが、現状として抗体としての販売にとどまっており、性能の記述が無く、信頼性のある検出系とは言いがたい（非特許文献７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特開平8-176192号公報
【特許文献2】国際公開 WO2012/105541号
【特許文献3】特開2005-289929号公報
【特許文献4】特開平9-87298号公報
【特許文献5】特開2021-50146号公報
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Susuki M. et al., Mol Immunol, 33, 451-460 (1996): Purification, characterization and molecular cloning of Cha o 1, A major allergen of Chamaecyparis obtuse (Japanese cypress) pollen.
【非特許文献2】Mori T. et al., Biochem Biophys Res Commun，263，166-171 (1999): Purification, identification, and cDNA cloning of Cha o 2, the second major allergen of Japanese cypress pollen
【非特許文献3】Yasueda H. et al., Clin Exp Allergy，30，546-550 (2000): Identification and characterization of a group 2 conifer pollen allergen from Chamaecyparis obtusa, a homologue of Cry j 2 from Cryptomeria japonica
【非特許文献4】Osada T. et al., J Allergy Clin Immunol, 138, 911-913 (2016): Identification and gene cloning of a new major allergen Cha o 3 from Chamaecyparis obtusa (Japanese cypress) pollen
【非特許文献5】Sone T. et al., Clin Exp Allergy, 35, 664-671 (2005): Identification of human T cell epitopes in Japanese cypress pollen allergen, Cha o 1, elucidates the intrinsic mechanism of cross-allergenicity between Cha o 1 and Cry j 1, the major allergen of Japanese cedar pollen, at the T cell level.
【非特許文献6】岡野ら，アレルギー, 43, 1179-1184 (1994): ヒノキ特異的IgE抗体陽性患者の臨床的検討：ヒノキAlaSTAT検査を用いて
【非特許文献7】Anti-Cha o 2 | Major pollen allergen Cha o 2 antibodies (agrisera.com)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
ヒノキ花粉抗原Cha o 2に対するモノクローナル抗体を安定的に生産し、当該モノクローナル抗体を用いたヒノキ花粉抗原の解析及び定量系の開発が求められていた。Cha o 2にはアミノ酸の多型が報告されており（Tateno M. et al., PLoS ONE 16, e0261327 (2021)）、エピトープに多型が含まれる場合はモノクローナル抗体とCha o 2との親和性が変化する可能性がある。使用するモノクローナル抗体はアミノ酸多型の有無に関わらずCha o 2との結合が安定している必要がある。
【0008】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を行った結果、Cha o 2 特異的、アミノ酸多型をエピトープに含まない、かつ認識部位を特定したモノクローナル抗体を製造し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【0009】
すなわち、本発明は以下の通りである。
（１） ヒノキ花粉アレルゲンCha o 2に対するモノクローナル抗体であって、Cha o 1に反応しない、前記モノクローナル抗体。
（２）スギ花粉アレルゲンCry j 2に反応しない、（１）に記載のモノクローナル抗体。
（３）スギ花粉アレルゲンCry j 2に反応する、（１）に記載のモノクローナル抗体。
（４） 配列番号２～６に示されるいずれかのアミノ酸配列の全部又は一部をエピトープとして認識する、（１）～（３）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
（５）（２）に記載のモノクローナル抗体と組み合わせたときのCha o 2の最低検出濃度が5ng/mL以下である（３）に記載のモノクローナル抗体。
（６）（３）に記載のモノクローナル抗体と組み合わせたときのCha o 2の最低検出濃度が5ng/mL以下である（２）に記載のモノクローナル抗体。
（７） 変動係数が20%以下の再現性を有する、（１）～（６）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
（８）（１）～（７）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体が結合するエピトープに結合する抗体。
（９）（１）～（７）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体、又は（８）に記載の抗体の断片。
（１０）（１）～（７）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
（１１）（１）～（７）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体若しくは（８）に記載の抗体、又はこれらの断片と試料とを反応させて、Cha o 2を検出することを特徴とする、Cha o 2の検出方法。
（１２）（１）～（７）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体若しくは（８）に記載の抗体、又はこれらの断片を含む、Cha o 2の検出用キット。
（１） ヒノキ花粉アレルゲンCha o 2に対するモノクローナル抗体であって、Cha o 1に反応しない、前記モノクローナル抗体。
（２）スギ花粉アレルゲンCry j 2に反応しない、（１）に記載のモノクローナル抗体。
（３）スギ花粉アレルゲンCry j 2に反応する、（１）に記載のモノクローナル抗体。
（４） 配列番号２～６に示されるいずれかのアミノ酸配列の全部又は一部をエピトープとして認識する、（１）～（３）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
（５）（２）に記載のモノクローナル抗体と組み合わせたときのCha o 2の最低検出濃度が5ng/mL以下である（３）に記載のモノクローナル抗体。
（６）（３）に記載のモノクローナル抗体と組み合わせたときのCha o 2の最低検出濃度が5ng/mL以下である（２）に記載のモノクローナル抗体。
（７） 変動係数が20%以下の再現性を有する、（１）～（６）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体。
（８）（１）～（７）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体が結合するエピトープに結合する抗体。
（９）（１）～（７）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体、又は（８）に記載の抗体の断片。
（１０）（１）～（７）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。
（１１）（１）～（７）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体若しくは（８）に記載の抗体、又はこれらの断片と試料とを反応させて、Cha o 2を検出することを特徴とする、Cha o 2の検出方法。
（１２）（１）～（７）のいずれか１項に記載のモノクローナル抗体若しくは（８）に記載の抗体、又はこれらの断片を含む、Cha o 2の検出用キット。
【発明の効果】
【0010】
本発明により、Cha o 2 特異的で，かつエピトープを特定したモノクローナル抗体を使用することによるアミノ酸多型の有無に関わらず抗原同定，定量系の問題点を解決し，免疫学的にヒノキ花粉エキス中のCha o 2を高感度かつ簡便に同定，定量できる試験系の開発が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】捕捉抗体及びビオチン化検出抗体の組み合わせによるCha o 2の検出性を示す図である。
【図2】エピトープマッピングを示す図である。
【図3】Cha o 2アミノ酸多型と抗Cha o 2抗体9A11-1F8と4H5-3C3のエピトープ配列を示す図である。
【図4】Indirect ELISAにおける抗Cha o 2抗体9A11-1F8と4H5-3C3のCha o 2とCry j 2への反応性を示す図である。
【図5-1】精製Cha o 2と精製Cry j 2を用いたウエスタンブロッティングにおける抗Cha o 2抗体9A11-1F8と4H5-3C3の特異性を示す図である。
【図5-2】ヒノキ花粉抽出物を用いたウエスタンブロッティングにおける抗Cha o 2抗体9A11-1F8と4H5-3C3の特異性を示す図である。
【図6】抗Cha o 2抗体9A11-1F8と4H5-3C3のエピトープ配列とCry j 2の相同配列を示す図である。
【図7】Sandwich ELISAの抗原の検出の特異性を示す図である。
【図8】Sandwich ELISAにおいてR2=1となる4パラロジスティック回帰曲線が作成された濃度範囲（0.313～50 ng/mL）を示す図である。
【図9】スギ花粉抽出物に対する交差性を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0012】
本発明は、ヒノキ花粉の主要アレルゲンCha o 2に対する複数のモノクローナル抗体に関する。本発明においては、ヒノキ抗原に対する複数のモノクローナル抗体を新規に作製し，そのエピトープの同定に成功した。また，それらモノクローナル抗体を用いることで，ヒノキ花粉エキス中のCha o 2に特異的で高感度かつ精度の高い検出法を開発した。
【0013】
ヒノキ花粉抗原の研究においては，検証された特異的な測定方法は一般的にはなく，ポリクローナル抗体を用いた試験系又は抗原の相同性を利用してスギ抗原に対するモノクローナル抗体を用いた試験系などが用いられている。ヒノキ抗原に対するポリクローナル抗体の場合，検出される抗原のエピトープは定めることはできず，また一般的に特異性の面ではモノクローナル抗体に劣る。ヒノキ抗原に相同性を有するスギ抗原に対するモノクローナル抗体を使用する場合には，スギ抗原も認識するため，測定できる検体範囲や結果の解釈に一定の制限が発生する。
本発明によって製造されるCha o 2特異的モノクローナル抗体は，検体中のヒノキ花粉抗原Cha o 2を高感度で認識する特徴を持ち， Western blotting法, ELISA法, Sandwich ELISA法などの免疫学的測定法に広く応用可能であることから，試薬やキットでの使用等，広い利点・有用性を有する。なお、本明細書においてCha o 2などの抗原を「認識する」とは、抗原と「反応する」、抗原と「結合する」と同義で用いることができる。
本発明によって製造されるCha o 2特異的モノクローナル抗体は，検体中のヒノキ花粉抗原Cha o 2を高感度で認識する特徴を持ち， Western blotting法, ELISA法, Sandwich ELISA法などの免疫学的測定法に広く応用可能であることから，試薬やキットでの使用等，広い利点・有用性を有する。なお、本明細書においてCha o 2などの抗原を「認識する」とは、抗原と「反応する」、抗原と「結合する」と同義で用いることができる。
【0014】
１．本発明のモノクローナル抗体
本発明のモノクローナル抗体（「抗Cha o 2抗体」ともいう）を得る方法としては、まず、Cha o 2抗原タンパク質又はCha o 2タンパク質の部分ペプチドを用いて非ヒト哺乳動物を免疫し、免疫動物から抗体産生細胞（例えばB細胞）を採取する。この抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させ、ハイブリドーマ（融合細胞株）を作製する。そして、このハイブリドーマから産生される抗体を採取することにより、目的のモノクローナル抗体を得る。
本発明のモノクローナル抗体（「抗Cha o 2抗体」ともいう）を得る方法としては、まず、Cha o 2抗原タンパク質又はCha o 2タンパク質の部分ペプチドを用いて非ヒト哺乳動物を免疫し、免疫動物から抗体産生細胞（例えばB細胞）を採取する。この抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させ、ハイブリドーマ（融合細胞株）を作製する。そして、このハイブリドーマから産生される抗体を採取することにより、目的のモノクローナル抗体を得る。
【0015】
（１）抗原の調製
本発明においては、Cha o 2の全長タンパク質を免疫抗原として用いる。Cha o 2の全長タンパク質は、ヒノキ花粉の抽出液から各種カラムクロマトグラフィーによる精製方法を組合わせることにより得ることができる。組み換えタンパク質として大腸菌又はその他の宿主細胞で発現させ、その抽出液から各種クロマトグラフィーによる精製方法を組み合わせることにより得ることもできる。また本発明においては、部分ペプチドを合成し免疫抗原として用いることもできる。
本発明においては、Cha o 2の全長タンパク質を免疫抗原として用いる。Cha o 2の全長タンパク質は、ヒノキ花粉の抽出液から各種カラムクロマトグラフィーによる精製方法を組合わせることにより得ることができる。組み換えタンパク質として大腸菌又はその他の宿主細胞で発現させ、その抽出液から各種クロマトグラフィーによる精製方法を組み合わせることにより得ることもできる。また本発明においては、部分ペプチドを合成し免疫抗原として用いることもできる。
【0016】
抗原ペプチドを合成する基本となるアミノ酸配列はCha o 2の全長アミノ酸配列の部分配列であり、そのアミノ酸配列の中から任意に連続する10～50個、好ましくは10～30個、さらに好ましくは15～20個の長さのアミノ酸配列を選択する。
抗原として使用できるペプチドは、Cha o 2の全長配列（配列番号１）又は一部の配列を有するペプチドである。一部の配列の場合は、Cha o 2の全長アミノ酸配列のうち、第113番目～第314番目の配列（配列番号２）から選択することができる。本発明の場合は、例えば113番目～132番目の領域のペプチド（配列番号３）、第288番目～307番目の領域のペプチド（配列番号４）、あるいは第295番目～314番目の領域のペプチド（配列番号５）も使用することができる。さらに、上記領域のペプチドのうち、アミノ酸配列が共通する第295番目～307番目のペプチド（配列番号６）を使用することもできる。
抗原として使用できるペプチドは、Cha o 2の全長配列（配列番号１）又は一部の配列を有するペプチドである。一部の配列の場合は、Cha o 2の全長アミノ酸配列のうち、第113番目～第314番目の配列（配列番号２）から選択することができる。本発明の場合は、例えば113番目～132番目の領域のペプチド（配列番号３）、第288番目～307番目の領域のペプチド（配列番号４）、あるいは第295番目～314番目の領域のペプチド（配列番号５）も使用することができる。さらに、上記領域のペプチドのうち、アミノ酸配列が共通する第295番目～307番目のペプチド（配列番号６）を使用することもできる。
【0017】
部分合成ペプチドは低分子であり、そのままの状態でマウスに免疫しても抗体を得ることは困難である。そこで、合成ペプチドとキャリアタンパク質とをジスルフィド結合させ、免疫抗原を作製する。
ペプチドの化学合成は、Fmoc法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、tBoc法(t-ブチルオキシカルボニル法)等の、当業者に公知の方法によって行うことができる。
キャリアタンパク質は、BSA（Bovin serum albumin）、KLH（Keyhole Limpet Hemocyanin）、OVA（Ovalbumin）等が挙げられる。
ペプチドの化学合成は、Fmoc法(フルオレニルメチルオキシカルボニル法)、tBoc法(t-ブチルオキシカルボニル法)等の、当業者に公知の方法によって行うことができる。
キャリアタンパク質は、BSA（Bovin serum albumin）、KLH（Keyhole Limpet Hemocyanin）、OVA（Ovalbumin）等が挙げられる。
【0018】
（２）動物の免疫
免疫する非ヒト哺乳動物の種類は特に限定されるものではなく、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ヤギ等などが挙げられ、マウスが好ましい。
抗原の動物1匹あたりの投与量は、全体で10～150μgである。抗原を免疫する際は、アジュバントと抗原溶液を混ぜることが一般的であり、アジュバントの種類としては、フロイント完全アジュバント（FCA）、フロイント不完全アジュバント（FIA）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内、筋中、足蹠皮下等に注入することにより行う。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは2～3週間間隔で、1～10回、好ましくは2～5回免疫を行う。
免疫する非ヒト哺乳動物の種類は特に限定されるものではなく、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、イヌ、ヤギ等などが挙げられ、マウスが好ましい。
抗原の動物1匹あたりの投与量は、全体で10～150μgである。抗原を免疫する際は、アジュバントと抗原溶液を混ぜることが一般的であり、アジュバントの種類としては、フロイント完全アジュバント（FCA）、フロイント不完全アジュバント（FIA）、水酸化アルミニウムアジュバント等が挙げられる。免疫は、主として静脈内、皮下、腹腔内、筋中、足蹠皮下等に注入することにより行う。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔、好ましくは2～3週間間隔で、1～10回、好ましくは2～5回免疫を行う。
【0019】
（３）抗体産生細胞の調製
抗体産生細胞は、免疫した非ヒト哺乳動物の脾臓細胞等又は所属リンパ節等から調製する。リンパ節は、例えば腸骨リンパ節、鼠径部リンパ節などが挙げられる。採取した細胞集団から特に抗体産生細胞の分離操作を行わなくてもよいが、細胞集団の中から抗体産生細胞のみを分離することが好ましい。但し、抗体産生細胞を調製する際には、組織の残骸や赤血球をできる限り除いておくことが好ましい。
抗体産生細胞は、免疫した非ヒト哺乳動物の脾臓細胞等又は所属リンパ節等から調製する。リンパ節は、例えば腸骨リンパ節、鼠径部リンパ節などが挙げられる。採取した細胞集団から特に抗体産生細胞の分離操作を行わなくてもよいが、細胞集団の中から抗体産生細胞のみを分離することが好ましい。但し、抗体産生細胞を調製する際には、組織の残骸や赤血球をできる限り除いておくことが好ましい。
【0020】
（４）細胞融合
細胞融合は、上記の抗体産生細胞と骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）とを融合させ、抗体を産生しながら半永久的に増え続ける細胞（ハイブリドーマ）を作製するために行う作業である。当業者であれば、公知の細胞融合方法を用いて、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることができる。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な細胞株を使用することができる。使用する細胞株としては、HAT選択培地（ヒポキサンチン、チミジン、アミノプテリンを含む培地）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞としては、例えばSP 2/0、P3U1、NS I、P3-X63-Ag8.653等が挙げられる。
細胞融合は、上記の抗体産生細胞と骨髄腫細胞（ミエローマ細胞）とを融合させ、抗体を産生しながら半永久的に増え続ける細胞（ハイブリドーマ）を作製するために行う作業である。当業者であれば、公知の細胞融合方法を用いて、抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることができる。抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞として、マウスなどの動物の一般に入手可能な細胞株を使用することができる。使用する細胞株としては、HAT選択培地（ヒポキサンチン、チミジン、アミノプテリンを含む培地）で生存できず、抗体産生細胞と融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが好ましい。ミエローマ細胞としては、例えばSP 2/0、P3U1、NS I、P3-X63-Ag8.653等が挙げられる。
【0021】
細胞融合は、ウシ胎児血清（FCS）等を含まないDMEMやRPMI1640培地などの一般に市販されている培地で、1×106～1×107個/mLの脾臓細胞又はリンパ節細胞と1×105～1×106個/mLのミエローマ細胞とを混合し、細胞融合促進剤存在下で融合を行う。脾臓細胞又はリンパ節細胞とミエローマ細胞との細胞比（脾臓細胞又はリンパ節細胞：ミエローマ細胞）は5：1が好ましい。細胞融合促進剤として、平均分子量200～20000ダルトンのポリエチレングリコールを使用することができる。
【0022】
また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて、あるいはセンダイウイルスを用いて、融合させることもできる。
融合後、例えば10～20% FCS含有RPMI1640培地などで作製したHAT培地で細胞を希釈後、96穴培養プレートの各ウェルに0.5～3×105個ずつ細胞を播き込み、CO2インキュベーターで培養する。
融合後、例えば10～20% FCS含有RPMI1640培地などで作製したHAT培地で細胞を希釈後、96穴培養プレートの各ウェルに0.5～3×105個ずつ細胞を播き込み、CO2インキュベーターで培養する。
【0023】
（５）ハイブリドーマの樹立
次に、細胞融合処理後の細胞から目的とする抗体を産生するハイブリドーマを選別する。細胞融合から10～14日後に、HAT培地で選択された細胞がコロニーを形成する。そのコロニー陽性96穴培養プレートの各ウェルの培養上清を採取して、Cha o 2に対する抗体価を確認する。確認方法としては、酵素免疫測定法（ELISA）や放射性免疫測定法（RIA）等で行う。部分ペプチドとキャリア蛋白質の結合体を免疫抗原とした場合、細胞から産生される抗体にはキャリアタンパク質であるKLHやBSAに対する抗体も含まれるので、KLH等に対する抗体価を測定することで、KLH等に対する抗体価の高いKLH抗体陽性ウェルを除くことができる。
次に、細胞融合処理後の細胞から目的とする抗体を産生するハイブリドーマを選別する。細胞融合から10～14日後に、HAT培地で選択された細胞がコロニーを形成する。そのコロニー陽性96穴培養プレートの各ウェルの培養上清を採取して、Cha o 2に対する抗体価を確認する。確認方法としては、酵素免疫測定法（ELISA）や放射性免疫測定法（RIA）等で行う。部分ペプチドとキャリア蛋白質の結合体を免疫抗原とした場合、細胞から産生される抗体にはキャリアタンパク質であるKLHやBSAに対する抗体も含まれるので、KLH等に対する抗体価を測定することで、KLH等に対する抗体価の高いKLH抗体陽性ウェルを除くことができる。
【0024】
Cha o 2に対する抗体産生陽性ウェルを確認できた後は、24穴や12穴培養プレートに細胞を移す。ここで、培地はアミノプテリンを除いたHT培地に置き換えることが好ましい。HT培地は、細胞内に残留したアミノプテリンの影響がある間、サルベージ経路にプリンおよびピリミジンの前駆体を供給し続けるハイブリドーマの回復用培地として用いる。HT培地中でしばらく培養した後、再度培養上清中の抗体価を確認する。
【0025】
前記したように、本発明においてはCry j 2との交差反応性を確認しつつ、Cha o 2に対して高い特異性を有するハイブリドーマを取得することが必要である。そこで、培養上清レベルでCry j 2との交差反応性をELISAやRIA等で確認する。
【0026】
最終的に選択されたウェルの細胞は、単一の細胞にするためにクローニングを行う。クローニングは、例えば細胞懸濁液を10～20%のFCS含有（好ましくは20%）RPMI1640培地などで適当に希釈後、96穴培養プレートの各ウェルに0.3～2個入るように細胞を播き込む。96穴培養プレートの各ウェルに入れる細胞の数は、1つのウェルに入る細胞が1個である確率が高くなるようにするため、好ましくは各ウェルに１個入るように細胞を播く。細胞播き込み後、7～10日後にコロニー陽性ウェルの培養上清を回収する。このとき、3～5日後にシングルコロニーであることを確認することが好ましい。回収した培養上清は、抗体価を確認する。ここでもCha o 2に対して高い特異性を有し、かつCry j 2との交差反応性が低いクローンと高いクローンそれぞれを選択する。さらに選択されたウェルの細胞をある程度増やしてハイブリドーマ株を樹立する。クローニングは必要に応じて数回行っても良い。
本発明においては、樹立されたハイブリドーマとして１１クローンが得られ、「2D6-2C3」「9A11-1F8」「3A8-2F2」「4H5-3C3」「8G10-1H7」「4G6-1D6」「9E12-2B7」「4F6-4B11」「5A8-4B2」「3E1-1C8」「6H5-2F2」と命名した。
本発明においては、樹立されたハイブリドーマとして１１クローンが得られ、「2D6-2C3」「9A11-1F8」「3A8-2F2」「4H5-3C3」「8G10-1H7」「4G6-1D6」「9E12-2B7」「4F6-4B11」「5A8-4B2」「3E1-1C8」「6H5-2F2」と命名した。
【0027】
（６）モノクローナル抗体の調製
樹立したハイブリドーマ株からは、以下の方法によりCha o 2特異的なモノクローナル抗体を精製及び採取する。すなわち、血清の濃度を抑えた培地で培養した培養上清から抗体を調製する方法、市販の無血清培地で培養した培養上清から抗体を調製する方法、動物の腹腔内にハイブリドーマを注入して、腹水を採取し、その腹水から抗体を調製する方法等がある。培養上清は、細胞を0.1～4×105個/mLで調製し、1～2週間培養したものから採取する。腹水の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを0.1～１×107個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、1～2週間後に腹水を採取する。
樹立したハイブリドーマ株からは、以下の方法によりCha o 2特異的なモノクローナル抗体を精製及び採取する。すなわち、血清の濃度を抑えた培地で培養した培養上清から抗体を調製する方法、市販の無血清培地で培養した培養上清から抗体を調製する方法、動物の腹腔内にハイブリドーマを注入して、腹水を採取し、その腹水から抗体を調製する方法等がある。培養上清は、細胞を0.1～4×105個/mLで調製し、1～2週間培養したものから採取する。腹水の場合は、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種系動物の腹腔内にハイブリドーマを0.1～１×107個投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、1～2週間後に腹水を採取する。
【0028】
培養方法としては、培養フラスコを用いる方法、スピナーフラスコを用いる方法、シェーカーフラスコを用いる方法、バイオリアクターを使用する方法等がある。抗体の精製方法は、プロテインGアフィニティカラム又はプロテインAアフィニティカラムで精製する方法、Cha o 2アフィニティカラムで精製する方法、硫安塩析分画からゲルろ過クロマトグラフィーで精製する方法、イオン交換クロマトグラフィーで精製する方法等があり、これら公知の方法を適宜選択し、又はこれらを組み合わせることにより精製することができる。
【0029】
２．抗Cha o 2抗体のエピトープ
本発明の抗Cha o 2抗体のエピトープ（抗原決定基）は、抗原であるCha o 2の少なくとも一部であればよく限定はされないが、例えば、第113番目～第314番目の領域のアミノ酸配列（配列番号２）が挙げられる。本発明においては、配列番号１に示されるCha o 2の全長アミノ酸配列のうち、第113番目～132番目のアミノ酸配列：WWAGQCKVVNGRTVCNDRNR（配列番号３）からなる領域又は当該領域の少なくとも一部、第288番目～307番目のアミノ酸配列（NPILINQFYCTSASACQNQR（配列番号４））からなる領域又は当該領域の少なくとも一部、第295番目～314番目のアミノ酸配列（FYCTSASACQNQRSAVQIQG（配列番号５））からなる領域又は当該領域の少なくとも一部、あるいは第295番目～307番目のアミノ酸配列（FYCTSASACQNQR（配列番号６））からなる領域又は当該領域の少なくとも一部であることが好ましい。なかでも、第295番目～第307番目のアミノ酸配列：FYCTSASACQNQR（配列番号６）からなる領域又は当該領域の少なくとも一部がより好ましい。
本発明の抗Cha o 2抗体のエピトープ（抗原決定基）は、抗原であるCha o 2の少なくとも一部であればよく限定はされないが、例えば、第113番目～第314番目の領域のアミノ酸配列（配列番号２）が挙げられる。本発明においては、配列番号１に示されるCha o 2の全長アミノ酸配列のうち、第113番目～132番目のアミノ酸配列：WWAGQCKVVNGRTVCNDRNR（配列番号３）からなる領域又は当該領域の少なくとも一部、第288番目～307番目のアミノ酸配列（NPILINQFYCTSASACQNQR（配列番号４））からなる領域又は当該領域の少なくとも一部、第295番目～314番目のアミノ酸配列（FYCTSASACQNQRSAVQIQG（配列番号５））からなる領域又は当該領域の少なくとも一部、あるいは第295番目～307番目のアミノ酸配列（FYCTSASACQNQR（配列番号６））からなる領域又は当該領域の少なくとも一部であることが好ましい。なかでも、第295番目～第307番目のアミノ酸配列：FYCTSASACQNQR（配列番号６）からなる領域又は当該領域の少なくとも一部がより好ましい。
【0030】
これらの領域を認識する（これらの領域と結合又は反応する）抗Cha o 2抗体は、Cha o 2特異的であり検出感度も高く、Cha o 2の検出に極めて有用である。
本発明のモノクローナル抗体は、Cha o 2に特異的に結合する抗体であるが、クローンによっては、スギ花粉アレルゲンCry j 2と反応する抗体（Cry j 2との交差反応性を有する抗体）やCry j 2と反応しない抗体（Cry j 2との交差反応性を有さない抗体）が存在する。本発明においては、これらの態様の抗体のいずれも包含する。
本発明のモノクローナル抗体は、Cha o 2に特異的に結合する抗体であるが、クローンによっては、スギ花粉アレルゲンCry j 2と反応する抗体（Cry j 2との交差反応性を有する抗体）やCry j 2と反応しない抗体（Cry j 2との交差反応性を有さない抗体）が存在する。本発明においては、これらの態様の抗体のいずれも包含する。
【0031】
また、Cha o 2に対する抗体は、上記ハイブリドーマにより産生されるCha o 2に対するモノクローナル抗体そのものに限られず、これらのハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体が認識するエピトープに結合する限り、本発明の抗Cha o 2抗体に含まれる。ここでいう「エピトープ」とは、上記ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体が認識するエピトープを指す。このエピトープは、Cha o 2のアミノ酸配列のうち、第113番目～第314番目の領域のアミノ酸残基、例えば第113番目～132番目、第288番目～307番目、第295番目～314番目のアミノ酸残基、又は第295番目～307番目のアミノ酸残基のほか、さらに、これらの領域の一部であってもよい。
【0032】
３．組換え抗体
本発明のモノクローナル抗体は、組換え手段により調製され、発現される遺伝子組換え抗体又は抗原結合断片とすることもできる。例えば、本発明の抗Cha o 2抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒト抗体であってもよい。本発明の組換え抗体は、重鎖及び軽鎖の組換え発現によって製造することができる。
遺伝子組換え抗体を発現させるには、例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする核酸を有する組換え発現ベクターを、宿主細胞に導入し、当該ベクターが導入された宿主細胞を培養する。そして、当該宿主細胞の培養物から目的の抗体を回収する。抗体の重鎖及び軽鎖の遺伝子を入手し、これらの核酸を発現ベクターに組み込み、宿主細胞に導入するには、当分野で標準的な組換えDNA方法（Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012）を採用することができる。
本発明のモノクローナル抗体は、組換え手段により調製され、発現される遺伝子組換え抗体又は抗原結合断片とすることもできる。例えば、本発明の抗Cha o 2抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は完全ヒト抗体であってもよい。本発明の組換え抗体は、重鎖及び軽鎖の組換え発現によって製造することができる。
遺伝子組換え抗体を発現させるには、例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする核酸を有する組換え発現ベクターを、宿主細胞に導入し、当該ベクターが導入された宿主細胞を培養する。そして、当該宿主細胞の培養物から目的の抗体を回収する。抗体の重鎖及び軽鎖の遺伝子を入手し、これらの核酸を発現ベクターに組み込み、宿主細胞に導入するには、当分野で標準的な組換えDNA方法（Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012）を採用することができる。
【0033】
例えば、マウス－ヒトキメラ抗体であれば、Cha o 2タンパク質に対する抗体を産生するマウス細胞から抗体遺伝子を単離し、その重鎖（H鎖）定常領域及び軽鎖（L鎖）定常領域を、それぞれヒトIgGのH鎖定常領域遺伝子及びヒトIgGのL鎖定常領域遺伝子に組換え、マウス骨髄腫細胞に導入することにより調製できる。
重鎖可変領域（VH）をコードする核酸（例えばDNA）は、VHをコードするDNAと重鎖定常領域をコードするDNAと発現可能に結合することによって、完全長の重鎖遺伝子に構築させる。また、軽鎖可変領域（VL）をコードする核酸（例えばDNA）は、VLをコードするDNAと軽鎖定常領域をコードするDNAと発現可能に結合することによって、完全長の軽鎖遺伝子に構築させる。
完全長の軽鎖VH及びVLをコードする核酸が例えばマウスに由来する核酸であり、重鎖及び軽鎖定常領域をコードする核酸がヒトに由来する核酸であれば、マウス－ヒトキメラの抗体又は抗原結合断片となる。ヒト、マウス等由来の重鎖定常領域の核酸配列は、当分野で公知である。
重鎖可変領域（VH）をコードする核酸（例えばDNA）は、VHをコードするDNAと重鎖定常領域をコードするDNAと発現可能に結合することによって、完全長の重鎖遺伝子に構築させる。また、軽鎖可変領域（VL）をコードする核酸（例えばDNA）は、VLをコードするDNAと軽鎖定常領域をコードするDNAと発現可能に結合することによって、完全長の軽鎖遺伝子に構築させる。
完全長の軽鎖VH及びVLをコードする核酸が例えばマウスに由来する核酸であり、重鎖及び軽鎖定常領域をコードする核酸がヒトに由来する核酸であれば、マウス－ヒトキメラの抗体又は抗原結合断片となる。ヒト、マウス等由来の重鎖定常領域の核酸配列は、当分野で公知である。
【0034】
ヒト型化抗体を作製する場合は、いわゆるCDRグラフティング（CDR移植）と呼ばれる手法を採用することができる。CDRグラフティングとは、マウス抗体の可変領域から相補性決定領域（CDR）をヒト可変領域に移植して、フレームワーク領域（FR）はヒト由来であり、CDRはマウス由来のものからなる、再構成した可変領域を作製する方法である。CDRを含む抗体断片（ペプチド）は、VH又はVLのCDR（CDR1～3）の少なくとも１領域以上を含んで構成される。複数のCDRを含む抗体断片は、直接結合させるか、あるいは適当なペプチドリンカーを介して結合させることができる。
【0035】
次に、これらのヒト型化された再構成ヒト可変領域をヒト定常領域に連結する。このようなヒト型化抗体の作製法は、当分野において周知である（Nature, 321, 522-525 (1986)；J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)；Queen C et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10029-10033 (1989)）。
【0036】
ヒト抗体（完全ヒト抗体）は、一般に可変領域（V領域）の抗原結合部位である超可変領域（hyper variable region）、V領域のその他の部分及び定常領域の構造が、ヒトの抗体と同じ構造を有するものである。ヒト抗体を作製する技術も公知であり、ヒトに共通の遺伝子配列については遺伝子工学的手法によって作製する方法が確立されている。ヒト抗体は、例えば、ヒト抗体のH鎖及びL鎖の遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法（Tomizuka, K. et al., Nature Genetics, (1977)16, 133-143; Kuroiwa, Y.et.al., Nuc. Acids Res., (1998)26, 3447-3448等）や、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法（Wormstone, I. M.et.al, Investigative Ophthalmology & Visual Science., (2002)43 (7), 2301-8; Carmen, S. et.al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics,(2002)1 (2), 189-203等）により取得することができる。
【0037】
また、本発明においては、ハイブリドーマ又は当該ハイブリドーマから抽出したDNA若しくはRNAなどを原料として、上述した周知の方法に準じてキメラ抗体、ヒト型化抗体、ヒト化抗体を作製することができる。
【0038】
４．抗体断片の作製
本発明で使用されるCha o 2に対する抗体の断片は、本発明の抗体の一部分の領域を意味し、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、diabody（dibodies）、dsFv、scFv（single chain Fv）などが挙げられる。上記抗体断片は、本発明の抗体を目的に応じて各種タンパク質分解酵素で切断することにより得ることができる。
例えば、Fabは、抗体分子をパパインで処理することにより、F(ab')2は、抗体分子をペプシンで処理することによりそれぞれ得ることができる。また、Fab'は、上記F(ab')2のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することで得ることができる。
本発明で使用されるCha o 2に対する抗体の断片は、本発明の抗体の一部分の領域を意味し、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、diabody（dibodies）、dsFv、scFv（single chain Fv）などが挙げられる。上記抗体断片は、本発明の抗体を目的に応じて各種タンパク質分解酵素で切断することにより得ることができる。
例えば、Fabは、抗体分子をパパインで処理することにより、F(ab')2は、抗体分子をペプシンで処理することによりそれぞれ得ることができる。また、Fab'は、上記F(ab')2のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することで得ることができる。
【0039】
scFvの場合は、抗体のVH及びVLをコードするcDNAを取得し、scFvをコードするDNAを構築する。このDNAを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、scFvを製造することができる。
【0040】
diabodyの場合は、抗体のVH及びVLをコードするcDNAを取得し、ペプチドリンカーのアミノ酸配列の長さが８残基以下となるようにscFvをコードするDNAを構築する。このDNAを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、diabodyを製造することができる。
dsFvの場合は、抗体のVH及びVLをコードするcDNAを取得し、dsFvをコードするDNAを構築する。このDNAを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、dsFvを製造することができる。
dsFvの場合は、抗体のVH及びVLをコードするcDNAを取得し、dsFvをコードするDNAを構築する。このDNAを発現ベクターに挿入し、当該発現ベクターを宿主生物に導入して発現させることにより、dsFvを製造することができる。
【0041】
５．検出方法及び検出用キット
Cha o 2は、ヒノキ花粉症のアレルゲンとなるため、本発明の抗Cha o 2抗体を試料と反応させ、試料中のCha o 2を測定することにより、Cha o 2を検出することができる。
従って、本発明は、本発明の抗体又はその断片とCha o 2とを反応させて、Cha o 2を検出することを特徴とする、Cha o 2の検出方法を提供する。
また本発明においては、抗Cha o 2抗体をCha o 2の検出用試薬又はキットとして使用することができる。
Cha o 2は、ヒノキ花粉症のアレルゲンとなるため、本発明の抗Cha o 2抗体を試料と反応させ、試料中のCha o 2を測定することにより、Cha o 2を検出することができる。
従って、本発明は、本発明の抗体又はその断片とCha o 2とを反応させて、Cha o 2を検出することを特徴とする、Cha o 2の検出方法を提供する。
また本発明においては、抗Cha o 2抗体をCha o 2の検出用試薬又はキットとして使用することができる。
【0042】
本発明の抗Cha o 2抗体をキットとして用いる場合には、抗Cha o 2抗体を他の溶媒や溶質と組み合わせて組成物とすることができる。例えば、蒸留水、pH緩衝試薬、塩、タンパク質、界面活性剤などを組み合わせることができる。また、抗Cha o 2抗体を酵素標識やビオチン標識し、使用することができる。標識酵素として、HRP（セイヨウワサビペルオキシダーゼ）の他に、アルカリホスファターゼ、リンゴ酸脱水酵素、α-グルコシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、金コロイドなどを用いることができる。
【0043】
本発明をキットに用いる場合には、本発明の抗体の他に、上記の溶媒、溶質、酵素標識試薬、抗原固相化マイクロプレート、抗体希釈溶液、OPD（オルトフェニレンジアミン）錠、基質液、反応停止液、濃縮洗浄液、使用説明書などを含めることができる。また、反応の至適条件を与える緩衝液、反応生成物質の安定化に有用な緩衝液、反応物質の安定化剤などの反応媒体も本発明のキットに含まれ得る。
【0044】
本発明の抗Cha o 2抗体及びキットは、Cha o 2を特異的かつ高感度に測定できるが、十分な測定精度を達成することもできる。従って、本発明の抗Cha o 2抗体及びキットは、アレルゲン免疫療法やヒト血清中のヒノキ花粉アレルゲンに対する抗体価測定等の臨床において用いるヒノキ花粉抽出物などの品質評価に用いることができる。測定精度とは、同一の試料を複数の試験管又はウェルに分けて1回のアッセイを行ったときに、それぞれの測定値がどの程度ばらつくかを示す指標となるものであり、統計学的には、変動係数（CV：Coefficient of variation）、すなわち平均値に対する標準偏差の割合（%）として表現される。本発明においては、この変動係数（CV）を再現性という。再現性は20％以下であるが、15%以下、又は10%以下であることが好ましく、5%以下であることがさらに好ましい。
【0045】
本発明のキットの最低検出濃度は5 ng/mL以下、例えば1～3 ng/mLである。また、同時再現性は10%以下、好ましくは5%前後であり、日間再現性は20％以下、又は15%以下、好ましくは約8～10%である。いずれの再現性もCV=20%以下である。
本発明の抗体は、前記の通りCha o 2と特異的に結合する（Cha o 2と特異的に反応する）抗体であるが、スギ花粉アレルゲンCry j 2と反応する抗体やCry j 2と反応しない抗体を包含する。
この場合、Cry j 2と反応する抗体とCry j 2と反応しない抗体とを組み合わせたときのCha o 2の最低検出濃度は、例えば5ng/mL以下である。
本発明の抗体は、前記の通りCha o 2と特異的に結合する（Cha o 2と特異的に反応する）抗体であるが、スギ花粉アレルゲンCry j 2と反応する抗体やCry j 2と反応しない抗体を包含する。
この場合、Cry j 2と反応する抗体とCry j 2と反応しない抗体とを組み合わせたときのCha o 2の最低検出濃度は、例えば5ng/mL以下である。
【0046】
実施例
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されるものではない。
【実施例0047】
1 材料及び方法
1.1 材料
1.2 試薬
ヒノキ花粉：ヤミゾ花粉研究会又は鳥居薬品
スギ花粉：鳥居薬品
HiTrap Octyl FF：Cytiva
HiTrap SP HP：Cytiva
HiTrap IMAC HP ：Cytiva ADJUVANT COMPLETE FREUND：DIFCO
Hybridoma-SFM：GIBCO
NaHCO3：富士フイルム和光純薬
HCl：富士フイルム和光純薬
NaOH：富士フイルム和光純薬
FBS：Biological Industry
Recombinant human IL-6：R&D Systems
D-MEM：富士フイルム和光純薬
Hypoxanthine：SIGMA-ALDRICH
Aminopterin：SIGMA-ALDRICH
Thymidine：富士フイルム和光純薬
PEG 1500：Roche
ペニシリン-ストレプトマイシン-アムホテリシンB懸濁液：富士フイルム和光純薬
Buffer Kit：プロテノバ
硫酸アンモニウム：富士フイルム和光純薬
Oriole Fluorescent Gel Stain：BIO-RAD
TMB ONE：Kem-en-tec
Goat, anti mouse-HRP：R&D systems
Avidin, Horseradish Peroxidase Conjugated（アビジン-HRP）：Pierce
PBS：富士フイルム和光純薬
Tween20：純正化学
BSA：Sigma-Aldrich
Tris-Glycine サンプルバッファー(2X)：TEFCO
DTT (1,4-Dithiothreitol) ：純正化学
Bullet PAGE One Precast Gel, 5-15% (17 well)：ナカライテスク
泳動バッファー：富士フイルム和光純薬
Precision plus Protein Dual color Standard：Bio-RAD
10x トリス/グリシン（転写buffer）：Bio-RAD
ブロックエース：KAC
ECL Prime RPN2232 ：GEヘルスケア
NH4HCO3：富士フイルム和光純薬
NaCl：純正化学
抗Cry j 2抗体（8D6）：鳥居薬品
1.1 材料
1.2 試薬
ヒノキ花粉：ヤミゾ花粉研究会又は鳥居薬品
スギ花粉：鳥居薬品
HiTrap Octyl FF：Cytiva
HiTrap SP HP：Cytiva
HiTrap IMAC HP ：Cytiva ADJUVANT COMPLETE FREUND：DIFCO
Hybridoma-SFM：GIBCO
NaHCO3：富士フイルム和光純薬
HCl：富士フイルム和光純薬
NaOH：富士フイルム和光純薬
FBS：Biological Industry
Recombinant human IL-6：R&D Systems
D-MEM：富士フイルム和光純薬
Hypoxanthine：SIGMA-ALDRICH
Aminopterin：SIGMA-ALDRICH
Thymidine：富士フイルム和光純薬
PEG 1500：Roche
ペニシリン-ストレプトマイシン-アムホテリシンB懸濁液：富士フイルム和光純薬
Buffer Kit：プロテノバ
硫酸アンモニウム：富士フイルム和光純薬
Oriole Fluorescent Gel Stain：BIO-RAD
TMB ONE：Kem-en-tec
Goat, anti mouse-HRP：R&D systems
Avidin, Horseradish Peroxidase Conjugated（アビジン-HRP）：Pierce
PBS：富士フイルム和光純薬
Tween20：純正化学
BSA：Sigma-Aldrich
Tris-Glycine サンプルバッファー(2X)：TEFCO
DTT (1,4-Dithiothreitol) ：純正化学
Bullet PAGE One Precast Gel, 5-15% (17 well)：ナカライテスク
泳動バッファー：富士フイルム和光純薬
Precision plus Protein Dual color Standard：Bio-RAD
10x トリス/グリシン（転写buffer）：Bio-RAD
ブロックエース：KAC
ECL Prime RPN2232 ：GEヘルスケア
NH4HCO3：富士フイルム和光純薬
NaCl：純正化学
抗Cry j 2抗体（8D6）：鳥居薬品
【0048】
1.3 器材
Zeba Spin Desalting Columns (7K MWCO) ：Thermo Scientific
96穴マイクロプレート Maxisorp：NUNC
96穴マイクロプレートIMMULON 2HB：Thermo Scientific
Immoblon-PSQ membrane 7x8.4：Millipore
Zeba Spin Desalting Columns (7K MWCO) ：Thermo Scientific
96穴マイクロプレート Maxisorp：NUNC
96穴マイクロプレートIMMULON 2HB：Thermo Scientific
Immoblon-PSQ membrane 7x8.4：Millipore
【0049】
1.4 試液
10% FBS, Hybridoma-SFM培地
Hybridoma-SFMに，非働化したFBS 50 mL，ペニシリン-ストレプトマイシン-アムホテリシンB懸濁液を5 mL, 10 μg/mL IL-6を50 μL添加し，全量を500 mLとした。
10% FBS, Hybridoma-SFM培地
Hybridoma-SFMに，非働化したFBS 50 mL，ペニシリン-ストレプトマイシン-アムホテリシンB懸濁液を5 mL, 10 μg/mL IL-6を50 μL添加し，全量を500 mLとした。
【0050】
無血清培地
Hybridoma-SFMに，ペニシリン-ストレプトマイシン-アムホテリシンB懸濁液を5 mL, 10 μg/mL IL-6を50 μL添加し，全量を500 mLとした。
Hybridoma-SFMに，ペニシリン-ストレプトマイシン-アムホテリシンB懸濁液を5 mL, 10 μg/mL IL-6を50 μL添加し，全量を500 mLとした。
【0051】
HAT培地
HypoxanthineとThymidineを水で溶かしたものと，Aminopterinを水と1M NaOHで溶解したものをHybridoma-SFM培地に加えた。その際，10%FBSとIL-6(1 ng/mL)を添加した。
HypoxanthineとThymidineを水で溶かしたものと，Aminopterinを水と1M NaOHで溶解したものをHybridoma-SFM培地に加えた。その際，10%FBSとIL-6(1 ng/mL)を添加した。
【0052】
PBS-T
10×PBSを10倍希釈し，Tween 20を最終濃度0.05%になるように調製した。
10×PBSを10倍希釈し，Tween 20を最終濃度0.05%になるように調製した。
【0053】
1% BSA/PBS-T
BSAを最終濃度10%になるようにPBS-Tで調製し，-20℃で保存した。使用前に溶解し，PBS-Tで10倍希釈した。
抽出液水にNH4HCO3及びNaClを加え，それぞれの最終濃度が40 mM及び0.5 Mになるように調製した。
BSAを最終濃度10%になるようにPBS-Tで調製し，-20℃で保存した。使用前に溶解し，PBS-Tで10倍希釈した。
抽出液水にNH4HCO3及びNaClを加え，それぞれの最終濃度が40 mM及び0.5 Mになるように調製した。
【0054】
1.5 機器
クールインキュベータ：三菱電機エンジニアリング株式会社，CN-40A
パーソナルインキュベーター：EYELA（型式：LTI2000）
マイクロプレートリーダー：Molecular Devices，SPECTRAmaxPLUS 384
パワーサプライ：BIO-RAD，POWER PAC 300
バイオイメージアナライザー：GEヘルスケア，Image Quant LAS 4010
転写装置（セミドライ式）：BIO-RAD
サンプルボイル：ヒートブロックDry Thermo Unit（DTU-2B）
クールインキュベータ：三菱電機エンジニアリング株式会社，CN-40A
パーソナルインキュベーター：EYELA（型式：LTI2000）
マイクロプレートリーダー：Molecular Devices，SPECTRAmaxPLUS 384
パワーサプライ：BIO-RAD，POWER PAC 300
バイオイメージアナライザー：GEヘルスケア，Image Quant LAS 4010
転写装置（セミドライ式）：BIO-RAD
サンプルボイル：ヒートブロックDry Thermo Unit（DTU-2B）
【0055】
1.6 方法
1.6.1 ヒノキ花粉からのCha o 2の精製
ヒノキ花粉に20倍量の40 mM NH4HCO3を加え，3時間4℃で撹拌し抽出した。撹拌後，20,000 ×gで30分遠心分離した沈殿に20倍量の40 mM NH4HCO3, 0.5 M NaClを加え，3時間4℃で撹拌しCha o 2を抽出した。20%飽和硫安となるように硫酸アンモニウムを添加，一晩4℃で撹拌した。20,000 ×gで30分遠心分離した上清に80%飽和硫安となるように硫酸アンモニウムを添加，4時間4℃で撹拌した。20,000 ×gで30分遠心分離して得た沈殿を2 M硫酸アンモニウム，50 mM Tris-Cl (pH7.8)に透析でバッファー交換を行った。透析後Octyl FFカラムにアプライした。2 M 硫酸アンモニウム，50 mM トリス塩酸緩衝液（pH7.8）から50 mM トリス塩酸緩衝液（pH7.8）となるようにグラジエントで溶出し，Cha o 2画分を回収した。回収した画分を0.5 M NaCl, 30 mM リン酸緩衝液（pH 7.8）に透析しHiTrap IMAC HPにアプライした。0.5 M NaCl, 30 mM リン酸緩衝液（pH 7.8）から0.5 M NaCl，30 mM 酢酸緩衝液 (pH 4.0)となるようグラジエントで溶出し、Cha o 2画分を回収した。回収した画分を0.2 M NaCl, 30 mM 酢酸緩衝液 (ph 4.0)に透析し、HiTrap SP HPにアプライした。0.2 M NaCl, 30 mM 酢酸緩衝液 (ph 4.0)から1 M NaCl，30 mM 酢酸緩衝液（pH 4.0）となるようにグラジエントで溶出し、Cha o 2画分を回収した。回収した画分を精製Cha o 2とし，使用前まで-20℃で保存した。
1.6.1 ヒノキ花粉からのCha o 2の精製
ヒノキ花粉に20倍量の40 mM NH4HCO3を加え，3時間4℃で撹拌し抽出した。撹拌後，20,000 ×gで30分遠心分離した沈殿に20倍量の40 mM NH4HCO3, 0.5 M NaClを加え，3時間4℃で撹拌しCha o 2を抽出した。20%飽和硫安となるように硫酸アンモニウムを添加，一晩4℃で撹拌した。20,000 ×gで30分遠心分離した上清に80%飽和硫安となるように硫酸アンモニウムを添加，4時間4℃で撹拌した。20,000 ×gで30分遠心分離して得た沈殿を2 M硫酸アンモニウム，50 mM Tris-Cl (pH7.8)に透析でバッファー交換を行った。透析後Octyl FFカラムにアプライした。2 M 硫酸アンモニウム，50 mM トリス塩酸緩衝液（pH7.8）から50 mM トリス塩酸緩衝液（pH7.8）となるようにグラジエントで溶出し，Cha o 2画分を回収した。回収した画分を0.5 M NaCl, 30 mM リン酸緩衝液（pH 7.8）に透析しHiTrap IMAC HPにアプライした。0.5 M NaCl, 30 mM リン酸緩衝液（pH 7.8）から0.5 M NaCl，30 mM 酢酸緩衝液 (pH 4.0)となるようグラジエントで溶出し、Cha o 2画分を回収した。回収した画分を0.2 M NaCl, 30 mM 酢酸緩衝液 (ph 4.0)に透析し、HiTrap SP HPにアプライした。0.2 M NaCl, 30 mM 酢酸緩衝液 (ph 4.0)から1 M NaCl，30 mM 酢酸緩衝液（pH 4.0）となるようにグラジエントで溶出し、Cha o 2画分を回収した。回収した画分を精製Cha o 2とし，使用前まで-20℃で保存した。
【0056】
1.6.2 抗Cha o 2モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製
1.6.2.1 免疫及びハイブリドーマの作製
抗Cha o 2モノクローナル抗体の作製は，マウス腸骨リンパ節法（特開2007-020547号公報）にて作製した。
ヒノキ花粉から精製したCha o 2とFreund’s Complete Adjuvant（FCA）を体積比1：2で混合し，B6D2F1/Slcマウス（日本エスエルシー株式会社，入荷時8週齢，メス5匹）の尾根部筋肉にCha o 2量を1匹あたり27 μg投与した。初回投与から17日後に，追加免疫として，Cha o 2を1匹あたり16 μg投与した。初回投与から21日後に，腸骨リンパ節を摘出し，マウス骨髄腫由来細胞（ミエローマ細胞）との細胞融合に用いた。
1.6.2.1 免疫及びハイブリドーマの作製
抗Cha o 2モノクローナル抗体の作製は，マウス腸骨リンパ節法（特開2007-020547号公報）にて作製した。
ヒノキ花粉から精製したCha o 2とFreund’s Complete Adjuvant（FCA）を体積比1：2で混合し，B6D2F1/Slcマウス（日本エスエルシー株式会社，入荷時8週齢，メス5匹）の尾根部筋肉にCha o 2量を1匹あたり27 μg投与した。初回投与から17日後に，追加免疫として，Cha o 2を1匹あたり16 μg投与した。初回投与から21日後に，腸骨リンパ節を摘出し，マウス骨髄腫由来細胞（ミエローマ細胞）との細胞融合に用いた。
【0057】
1.6.2.2 細胞融合及び抗体産生ハイブリドーマスクリーニング
細無菌的に摘出したマウスの腸骨リンパ節をDMEM培地中で懸濁し，ミエローマ細胞（SP2/W）と細胞数が5：1（リンパ球：ミエローマ）となるように混合し，PEGを用いた定法により細胞融合を実施した。HAT培地にリンパ球数として0.9975×106 cells/mLになるよう再懸濁し，96穴プレート8枚に100 μL/wellずつ播種した。5% CO2，37℃にて6日間培養した後，培養上清の一部を回収し，ELISA及びウエスタンブロッティングによるスクリーニングを行なった。Cha o 2に反応性を有したウェルを選択し，限界希釈法にてモノクローナル抗体産生ハイブリドーマをクローニングした。
細無菌的に摘出したマウスの腸骨リンパ節をDMEM培地中で懸濁し，ミエローマ細胞（SP2/W）と細胞数が5：1（リンパ球：ミエローマ）となるように混合し，PEGを用いた定法により細胞融合を実施した。HAT培地にリンパ球数として0.9975×106 cells/mLになるよう再懸濁し，96穴プレート8枚に100 μL/wellずつ播種した。5% CO2，37℃にて6日間培養した後，培養上清の一部を回収し，ELISA及びウエスタンブロッティングによるスクリーニングを行なった。Cha o 2に反応性を有したウェルを選択し，限界希釈法にてモノクローナル抗体産生ハイブリドーマをクローニングした。
【0058】
1.6.2.3 モノクローナル抗体の調製
クローニングしたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを10% FBS, Hybridoma-SFM培地中で一晩培養後，無血清培地に交換し，5～7日培養後，培養上清を回収した。回収した培養上清に50%飽和となるよう硫酸アンモニウムを加え，遠心分離の沈殿をPBSに溶解した。この溶液からアフィニティー精製カラム（Ab-Rapid PuRe EX：プロテノバ）にてモノクローナル抗体を精製した。
ビオチン化モノクローナル抗体は，市販のビオチン標識キット（同仁化学，biotin labeling Kit-NH2）を用いて，ビオチン標識した。
クローニングしたモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを10% FBS, Hybridoma-SFM培地中で一晩培養後，無血清培地に交換し，5～7日培養後，培養上清を回収した。回収した培養上清に50%飽和となるよう硫酸アンモニウムを加え，遠心分離の沈殿をPBSに溶解した。この溶液からアフィニティー精製カラム（Ab-Rapid PuRe EX：プロテノバ）にてモノクローナル抗体を精製した。
ビオチン化モノクローナル抗体は，市販のビオチン標識キット（同仁化学，biotin labeling Kit-NH2）を用いて，ビオチン標識した。
【0059】
1.6.3 Sandwich ELISAによる抗体の組み合わせの選出
20 μg/mLに調製した精製モノクローナル抗体溶液を96穴マイクロプレートの各ウェルに50 μLずつ加えて25℃で一晩放置した。洗浄後1％BSA/PBS-T溶液にてブロッキングした後，50 ng/mLの精製Cha o 2溶液を50 μLずつ加えて，25℃で1時間放置した。PBS-Tにて洗浄した後，ビオチン化した精製モノクローナル抗体溶液（1 μg/ml）を50 μL加え，25℃にて1時間反応させた。反応後，PBS-Tにて洗浄した後，アビジン-HRPを反応させた。PBS-Tにて洗浄した後，基質であるTMBを加え25℃で5分間反応させた。その後，2 Ｎ硫酸で反応を停止し，マイクロプレートリーダーを用いて450 nmの吸光度を測定した。
20 μg/mLに調製した精製モノクローナル抗体溶液を96穴マイクロプレートの各ウェルに50 μLずつ加えて25℃で一晩放置した。洗浄後1％BSA/PBS-T溶液にてブロッキングした後，50 ng/mLの精製Cha o 2溶液を50 μLずつ加えて，25℃で1時間放置した。PBS-Tにて洗浄した後，ビオチン化した精製モノクローナル抗体溶液（1 μg/ml）を50 μL加え，25℃にて1時間反応させた。反応後，PBS-Tにて洗浄した後，アビジン-HRPを反応させた。PBS-Tにて洗浄した後，基質であるTMBを加え25℃で5分間反応させた。その後，2 Ｎ硫酸で反応を停止し，マイクロプレートリーダーを用いて450 nmの吸光度を測定した。
【0060】
1.6.4 エピトープの同定
Cha o 2の全長アミノ酸配列（UniProt No.Q7M1E7：配列番号１）からシグナル配列（-50M～-1H）を除くアミノ酸配列（1S～464P）（上付きの数字はアミノ酸残基の位置、アルファベットは1文字表記のアミノ酸残基を表す。以下同様。）について，7残基が重複する20残基のオーバーラップペプチドライブラリーを作製した（SIGMA-ALDRICH，PEPscreen）。各Cha o 2部分配列ペプチドを20μMに調製し，その溶液を96穴マイクロプレートに100 μLずつ加えて，25℃で一晩放置した。洗浄した後，1％BSA/PBS-T溶液にてブロッキングした。ブロッキングしたプレートの各ウェルに0.5 μg/mLに調製した精製モノクローナル抗体溶液を100 μL加え，25℃で1時間反応させた。PBS-Tにて洗浄後，ヤギ由来ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗体を反応させた。PBS-Tにて洗浄後，基質であるTMBを加え室温で5分間反応させた後，2 Ｎ硫酸で反応を停止し，マイクロプレートリーダーを用いて450 nmの吸光度を測定した。
Cha o 2の全長アミノ酸配列（UniProt No.Q7M1E7：配列番号１）からシグナル配列（-50M～-1H）を除くアミノ酸配列（1S～464P）（上付きの数字はアミノ酸残基の位置、アルファベットは1文字表記のアミノ酸残基を表す。以下同様。）について，7残基が重複する20残基のオーバーラップペプチドライブラリーを作製した（SIGMA-ALDRICH，PEPscreen）。各Cha o 2部分配列ペプチドを20μMに調製し，その溶液を96穴マイクロプレートに100 μLずつ加えて，25℃で一晩放置した。洗浄した後，1％BSA/PBS-T溶液にてブロッキングした。ブロッキングしたプレートの各ウェルに0.5 μg/mLに調製した精製モノクローナル抗体溶液を100 μL加え，25℃で1時間反応させた。PBS-Tにて洗浄後，ヤギ由来ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG抗体を反応させた。PBS-Tにて洗浄後，基質であるTMBを加え室温で5分間反応させた後，2 Ｎ硫酸で反応を停止し，マイクロプレートリーダーを用いて450 nmの吸光度を測定した。
【0061】
1.6.5 Indirect ELISAによる反応性の検討
Cha o 2及びCry j 2をそれぞれ1μg/mLに調製し，その溶液を96穴マイクロプレートに50 μLずつ加えて，37℃で1時間放置した。洗浄した後，1％BSA/PBS-T溶液にてブロッキングした。ブロッキングしたプレートの各ウェルに抗Cha o 2モノクローナル抗体4H5-3C3、9A11-1F8又は抗Cry j 2モノクローナル抗体8D6（1又は10 μg/ml）を50 μL加え，25℃にて1時間反応させた。PBS-Tにて洗浄後，ヤギ由来ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG 抗体を反応させた。PBS-Tにて洗浄後，基質であるTMBをウェルに加え室温で5分間反応させた後，2 Ｎ硫酸で反応を停止し，マイクロプレートリーダーを用いて450 nmの吸光度を測定した。
Cha o 2及びCry j 2をそれぞれ1μg/mLに調製し，その溶液を96穴マイクロプレートに50 μLずつ加えて，37℃で1時間放置した。洗浄した後，1％BSA/PBS-T溶液にてブロッキングした。ブロッキングしたプレートの各ウェルに抗Cha o 2モノクローナル抗体4H5-3C3、9A11-1F8又は抗Cry j 2モノクローナル抗体8D6（1又は10 μg/ml）を50 μL加え，25℃にて1時間反応させた。PBS-Tにて洗浄後，ヤギ由来ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG 抗体を反応させた。PBS-Tにて洗浄後，基質であるTMBをウェルに加え室温で5分間反応させた後，2 Ｎ硫酸で反応を停止し，マイクロプレートリーダーを用いて450 nmの吸光度を測定した。
【0062】
1.6.6 花粉抽出液の作製
ヒノキ花粉もしくはスギ花粉0.5 gに10 mL（20倍量）の抽出液を加え，一晩4℃で撹拌した。撹拌後，20,000 ×gで30分遠心分離した上清を花粉抽出液とした。
ヒノキ花粉もしくはスギ花粉0.5 gに10 mL（20倍量）の抽出液を加え，一晩4℃で撹拌した。撹拌後，20,000 ×gで30分遠心分離した上清を花粉抽出液とした。
【0063】
1.6.7 ウエスタンブロッティングによる反応性の検討
Cha o 2，Cry j 2又はヒノキ花粉抽出液に等量の50 mM DTT / 2×SDSサンプルバッファーを加え95℃で5分間加熱した。冷却後，5-15 ％濃度のSDS-ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動し，タンパク質染色及びウエスタンブロッティングを行った。タンパク質染色はOrioleTM Fluorescent Gel Stainにて染色した。ウエスタンブロッティングはゲル上の分離したタンパク質をPVDF膜に電気的に転写後に，1％スキムミルクでブロッキングし，抗Cha o 2モノクローナル抗体4H5-3C3又は抗Cha o 2抗体9A11-1F8を加え室温で1時間反応させた。反応後，PBS-Tにて洗浄し，ヤギ由来ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG 抗体を反応させた。PBS-Tにて洗浄後， ECLprime検出試薬を加え化学発光をバイオイメージアナライザーにて検出した。
Cha o 2，Cry j 2又はヒノキ花粉抽出液に等量の50 mM DTT / 2×SDSサンプルバッファーを加え95℃で5分間加熱した。冷却後，5-15 ％濃度のSDS-ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動し，タンパク質染色及びウエスタンブロッティングを行った。タンパク質染色はOrioleTM Fluorescent Gel Stainにて染色した。ウエスタンブロッティングはゲル上の分離したタンパク質をPVDF膜に電気的に転写後に，1％スキムミルクでブロッキングし，抗Cha o 2モノクローナル抗体4H5-3C3又は抗Cha o 2抗体9A11-1F8を加え室温で1時間反応させた。反応後，PBS-Tにて洗浄し，ヤギ由来ペルオキシダーゼ標識抗マウスIgG 抗体を反応させた。PBS-Tにて洗浄後， ECLprime検出試薬を加え化学発光をバイオイメージアナライザーにて検出した。
【0064】
1.6.8 Sandwich ELISAによる反応性の検討
1.6.3項にてSandwich ELISAの捕捉抗体として抗Cha o 2モノクローナル抗体4H5-3C3と検出抗体として抗Cha o 2抗体9A11-1F8の組み合わせを選定した。抗Cha o 2モノクローナル抗体4H5-3C3溶液（10 μg/mL）を96穴マイクロプレートに100 μLずつ加えて25℃で一晩放置した。洗浄後，1％ BSA/PBS-T溶液にてブロッキングした。ブロッキングしたプレートのウェルに0.625～1000 ng/mLの範囲で調製したCha o 2又は50～3000 ng/mLの範囲で調製した Cha o 1及びCry j 2溶液を100 μLずつ加えて，25℃で2時間放置した。洗浄した後，ビオチン化した抗Cha o 2抗体9A11-1F8溶液（1 μg/ml）を100 μl加え, 25℃にて1時間反応させた。PBS-Tにて洗浄後，アビジン-HRPを反応させた。PBS-Tにて洗浄後，基質であるTMBを加え25℃で5分間反応させた後，2 Ｎ硫酸で反応を停止し，マイクロプレートリーダーを用いて450 nmの吸光度を測定した。なお測定は全て2重測定で行った。
1.6.3項にてSandwich ELISAの捕捉抗体として抗Cha o 2モノクローナル抗体4H5-3C3と検出抗体として抗Cha o 2抗体9A11-1F8の組み合わせを選定した。抗Cha o 2モノクローナル抗体4H5-3C3溶液（10 μg/mL）を96穴マイクロプレートに100 μLずつ加えて25℃で一晩放置した。洗浄後，1％ BSA/PBS-T溶液にてブロッキングした。ブロッキングしたプレートのウェルに0.625～1000 ng/mLの範囲で調製したCha o 2又は50～3000 ng/mLの範囲で調製した Cha o 1及びCry j 2溶液を100 μLずつ加えて，25℃で2時間放置した。洗浄した後，ビオチン化した抗Cha o 2抗体9A11-1F8溶液（1 μg/ml）を100 μl加え, 25℃にて1時間反応させた。PBS-Tにて洗浄後，アビジン-HRPを反応させた。PBS-Tにて洗浄後，基質であるTMBを加え25℃で5分間反応させた後，2 Ｎ硫酸で反応を停止し，マイクロプレートリーダーを用いて450 nmの吸光度を測定した。なお測定は全て2重測定で行った。
【0065】
1.6.9 Sandwich ELISAの再現性の検討
0.625，1.25，2.5，5，10，20及び50 ng/mLに調製した精製Cha o 2を検量線とし， 2，4，10，20及び50 ng/mLに調製した精製Cha o 2を検体として，Sandwich ELISAの同時再現性と日差再現性を検討した。検量線の調製は実験毎に行ない，検体は-20℃で保管した同一検体を使用した。検量線及び検体の希釈は1% BSA/PBS-Tで行い，Sandwich ELISA を1.6.8項と同様の方法で行なった。同時再現性は9重測定を行ったときの同一測定時内における変動係数，日差再現性は同一検体を3重測定で日を変えて3回測定したときの測定間における変動係数とした。
0.625，1.25，2.5，5，10，20及び50 ng/mLに調製した精製Cha o 2を検量線とし， 2，4，10，20及び50 ng/mLに調製した精製Cha o 2を検体として，Sandwich ELISAの同時再現性と日差再現性を検討した。検量線の調製は実験毎に行ない，検体は-20℃で保管した同一検体を使用した。検量線及び検体の希釈は1% BSA/PBS-Tで行い，Sandwich ELISA を1.6.8項と同様の方法で行なった。同時再現性は9重測定を行ったときの同一測定時内における変動係数，日差再現性は同一検体を3重測定で日を変えて3回測定したときの測定間における変動係数とした。
【0066】
1.6.10 花粉抽出液中のCha o 2の定量
ヒノキ花粉抽出物を27倍希釈から，3倍公比で希釈し，Sandwich ELISAによる測定を行った。Sandwich ELISAは1.6.8項と同様の方法で実施した。
ヒノキ花粉抽出物を27倍希釈から，3倍公比で希釈し，Sandwich ELISAによる測定を行った。Sandwich ELISAは1.6.8項と同様の方法で実施した。
【0067】
1.6.11 スギ花粉抽出液に対する交差性
ヒノキ花粉抽出液を27～59049倍希釈，スギ花粉抽出液を7.49～1820倍希釈し，Sandwich ELISAによる測定を行った。Sandwich ELISAは1.6.8項と同様の方法で実施した。
ヒノキ花粉抽出液を27～59049倍希釈，スギ花粉抽出液を7.49～1820倍希釈し，Sandwich ELISAによる測定を行った。Sandwich ELISAは1.6.8項と同様の方法で実施した。
【0068】
2 [結果]
2.1 抗Cha o 2モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製
抗Cha o 2モノクローナル抗体産生ハイブリドーマとして，「2D6-2C3」「9A11-1F8」「3A8-2F2」「4H5-3C3」「8G10-1H7」「4G6-1D6」「9E12-2B7」「4F6-4B11」「5A8-4B2」「3E1-1C8」「6H5-2F2」の11クローンのハイブリドーマを得た。
2.1 抗Cha o 2モノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製
抗Cha o 2モノクローナル抗体産生ハイブリドーマとして，「2D6-2C3」「9A11-1F8」「3A8-2F2」「4H5-3C3」「8G10-1H7」「4G6-1D6」「9E12-2B7」「4F6-4B11」「5A8-4B2」「3E1-1C8」「6H5-2F2」の11クローンのハイブリドーマを得た。
【0069】
2.2 Sandwich ELISAによる抗体組み合わせの検討
作製した11種類の抗Cha o 2モノクローナル抗体においてSandwich ELISAでCha o 2を検出できる抗体の組み合わせを検討した（図１）。110通りのモノクローナル抗体の組み合わせを検討した結果，作製した7種類の抗Cha o 2抗体3A8-2F2，3E1-1C8，4G6-1D6，4H5-3C3，5A8-4B2 ，6H5-2F2及び9A11-1F8を用いた12通りの組み合わせでCha o 2をS/N比10以上の高感度に検出できることが明らかになった。
作製した11種類の抗Cha o 2モノクローナル抗体においてSandwich ELISAでCha o 2を検出できる抗体の組み合わせを検討した（図１）。110通りのモノクローナル抗体の組み合わせを検討した結果，作製した7種類の抗Cha o 2抗体3A8-2F2，3E1-1C8，4G6-1D6，4H5-3C3，5A8-4B2 ，6H5-2F2及び9A11-1F8を用いた12通りの組み合わせでCha o 2をS/N比10以上の高感度に検出できることが明らかになった。
【0070】
2.3 エピトープの同定
Sandwich ELISAにてCha o 2を高感度に検出可能であった抗Cha o 2抗体3A8-2F2，3E1-1C8，4G6-1D6，4H5-3C3，5A8-4B2 ，6H5-2F2及び9A11-1F8についてエピトープを同定し報告されている13種類の多型（Tateno M. et al., PLoS ONE 16, e0261327 (2021)）をエピトープに含まない2クローン（4H5-3C3及び9A11-1F8）を選んだ（図２）。抗Cha o 2抗体4H5-3C3はペプチドNo. 17（113WWAGQCKVVNGRTVCNDRNR132（配列番号３））を認識した。抗Cha o 2抗体9A11-1F8はペプチドNo. 42（288NPILINQFYCTSASACQNQR307（配列番号４））及びNo. 43（295FYCTSASACQNQRSAVQIQG314（配列番号５））を認識し，他のペプチドには反応しなかった（図２）。抗Cha o 2抗体4H5-3C3及び9A11-1F8はエピトープにアミノ酸多型を含まないため、アミノ酸置換によらずCha o 2を認識できると考えられた。
Sandwich ELISAにてCha o 2を高感度に検出可能であった抗Cha o 2抗体3A8-2F2，3E1-1C8，4G6-1D6，4H5-3C3，5A8-4B2 ，6H5-2F2及び9A11-1F8についてエピトープを同定し報告されている13種類の多型（Tateno M. et al., PLoS ONE 16, e0261327 (2021)）をエピトープに含まない2クローン（4H5-3C3及び9A11-1F8）を選んだ（図２）。抗Cha o 2抗体4H5-3C3はペプチドNo. 17（113WWAGQCKVVNGRTVCNDRNR132（配列番号３））を認識した。抗Cha o 2抗体9A11-1F8はペプチドNo. 42（288NPILINQFYCTSASACQNQR307（配列番号４））及びNo. 43（295FYCTSASACQNQRSAVQIQG314（配列番号５））を認識し，他のペプチドには反応しなかった（図２）。抗Cha o 2抗体4H5-3C3及び9A11-1F8はエピトープにアミノ酸多型を含まないため、アミノ酸置換によらずCha o 2を認識できると考えられた。
【0071】
2.4 Indirect ELISA
選出した抗Cha o 2抗体4H5-3C3並びに9A11-1F8の利用方法としてIndirect ELISAによるCha o 2の検出を検討した。抗Cha o 2 抗体4H5-3C3は，ヒノキ花粉の主要アレルゲンであるCha o 2 には反応性を示し，スギ花粉の主要アレルゲンのCry j 2 に対しては反応性を示さなかった。抗Cha o 2 抗体9A11-1F8は，ヒノキ花粉の主要アレルゲンであるCha o 2 とスギ花粉の主要アレルゲンのCry j 2 の両方に同等の反応性を示した。抗Cha o 2抗体9A11-1F8並びに4H5-3C3はIndirect ELISAでCha o 2の検出に利用できることがわかった（図４）。抗Cha o 2抗体4H5-3C3はIndirect ELISAでCha o 2を特異的な検出に利用できることがわかった（図４）。
選出した抗Cha o 2抗体4H5-3C3並びに9A11-1F8の利用方法としてIndirect ELISAによるCha o 2の検出を検討した。抗Cha o 2 抗体4H5-3C3は，ヒノキ花粉の主要アレルゲンであるCha o 2 には反応性を示し，スギ花粉の主要アレルゲンのCry j 2 に対しては反応性を示さなかった。抗Cha o 2 抗体9A11-1F8は，ヒノキ花粉の主要アレルゲンであるCha o 2 とスギ花粉の主要アレルゲンのCry j 2 の両方に同等の反応性を示した。抗Cha o 2抗体9A11-1F8並びに4H5-3C3はIndirect ELISAでCha o 2の検出に利用できることがわかった（図４）。抗Cha o 2抗体4H5-3C3はIndirect ELISAでCha o 2を特異的な検出に利用できることがわかった（図４）。
【0072】
2.5 ウエスタンブロッティング
抗Cha o 2抗体4H5-3C3並びに9A11-1F8の利用方法として，ウエスタンブロッティングによるCha o 2検出を検討した。抗Cha o 2 抗体4H5-3C3は，ウエスタンブロッティングにて精製Cha o 2にのみ反応が認められた（図５－１）。また，高い相同性を有するCry j 2に対する反応性も認められず，高い特異性を有することが明らかとなった。抗Cha o 2 抗体9A11-1F8は，ウエスタンブロッティングにて精製Cha o 2とスギ花粉主要アレルゲンのCry j 2の両方に同等の反応性が認められた（図５－１）。
ヒノキ花粉抽出液のタンパク質染色では，Cha o 2以外に多数のタンパク質が存在するが，抗Cha o 2抗体9A11-1F8並びに4H5-3C3はCha o 2以外のタンパク質への反応性を有さないことから，ウエスタンブロッティングによるヒノキ花粉抽出液中のCha o 2の特異的な検出に利用できることが明らかになった（図５－２）。
抗Cha o 2抗体4H5-3C3並びに9A11-1F8の利用方法として，ウエスタンブロッティングによるCha o 2検出を検討した。抗Cha o 2 抗体4H5-3C3は，ウエスタンブロッティングにて精製Cha o 2にのみ反応が認められた（図５－１）。また，高い相同性を有するCry j 2に対する反応性も認められず，高い特異性を有することが明らかとなった。抗Cha o 2 抗体9A11-1F8は，ウエスタンブロッティングにて精製Cha o 2とスギ花粉主要アレルゲンのCry j 2の両方に同等の反応性が認められた（図５－１）。
ヒノキ花粉抽出液のタンパク質染色では，Cha o 2以外に多数のタンパク質が存在するが，抗Cha o 2抗体9A11-1F8並びに4H5-3C3はCha o 2以外のタンパク質への反応性を有さないことから，ウエスタンブロッティングによるヒノキ花粉抽出液中のCha o 2の特異的な検出に利用できることが明らかになった（図５－２）。
【0073】
抗Cha o 2抗体4H5-3C3並びに9A11-1F8のエピトープ配列をCry j 2の相同アミノ酸配列上で比較すると、4H5-3C3のepitope配列はCha o 2とCry j 2間で保存性が低いことがわかる（図６）。一方、9A11-1F8のepitope配列はCha o 2とCry j 2間でほぼ一致していた。このことは抗Cha o 2モノクローナル抗体9A11-1F8がindirect ELISAとウエスタンブロッティングでCha o 2とCry j 2を同等の強度で認識できたこと、そして抗Cha o 2モノクローナル抗体4H5-3C3がindirect ELISAとウエスタンブロッティングでCry j 2を認識できなかったことと一致した。
【0074】
2.6 Sandwich ELISA
抗Cha o 2抗体4H5-3C3並びに9A11-1F8の利用方法としてSandwich ELISAによる反応性を検討した。設定したSandwich ELISAでは，Cha o 2濃度依存的なシグナルの増大が認められ（図7），0.313～50 ng/mLの範囲でR2=1となる4パラメータロジスティック回帰が作成された（図8）。一方，Cha o 1及びCry j 2 には反応性を示さなかった。(図7)。
抗Cha o 2抗体4H5-3C3並びに9A11-1F8の利用方法としてSandwich ELISAによる反応性を検討した。設定したSandwich ELISAでは，Cha o 2濃度依存的なシグナルの増大が認められ（図7），0.313～50 ng/mLの範囲でR2=1となる4パラメータロジスティック回帰が作成された（図8）。一方，Cha o 1及びCry j 2 には反応性を示さなかった。(図7)。
【0075】
2.7 Sandwich ELISAの再現性の検討
定量範囲内であった0.625～50 ng/mLの濃度を検量線とし，2～50 ng/mLの精製Cha o 2の含量測定の再現性の検討を行った。その結果，同時再現性の変動係数は3.0%～7.3%，日差再現性の変動係数は7.1%～14.8%と良好な値を示し，抗Cha o 2抗体4H5-3C3並びに9A11-1F8を利用したSandwich ELISAは高い再現性を有するCha o 2定量系であることが明らかとなった（表１）。
定量範囲内であった0.625～50 ng/mLの濃度を検量線とし，2～50 ng/mLの精製Cha o 2の含量測定の再現性の検討を行った。その結果，同時再現性の変動係数は3.0%～7.3%，日差再現性の変動係数は7.1%～14.8%と良好な値を示し，抗Cha o 2抗体4H5-3C3並びに9A11-1F8を利用したSandwich ELISAは高い再現性を有するCha o 2定量系であることが明らかとなった（表１）。
【表1】
【0076】
2.8 花粉抽出物中のCha o 2の定量
抗Cha o 2抗体4H5-3C3並びに9A11-1F8を利用したSandwich ELISAが共雑物質を多く含む花粉抽出液中でのCha o 2の定量にも使用可能か検討した。ヒノキ花粉抽出物を729，2187，6561倍希釈したとき得られた吸光度は検量線範囲内（0.625-50 ng/mL）となった。このときの吸光度よりヒノキ花粉抽出物中のCha o 2濃度を推定するとそれぞれ，6.44, 6.55及び6.40 μg/mLとなり，ほぼ同じ濃度が得られた（CV 1.2 %）。このことより，抗Cha o 2抗体4H5-3C3並びに9A11-1F8を利用したSandwich ELISAは，希釈倍率によらず，共雑物質の影響を受けない定量系であり，花粉抽出液中のCha o 2も測定可能であることがわかった。
抗Cha o 2抗体4H5-3C3並びに9A11-1F8を利用したSandwich ELISAが共雑物質を多く含む花粉抽出液中でのCha o 2の定量にも使用可能か検討した。ヒノキ花粉抽出物を729，2187，6561倍希釈したとき得られた吸光度は検量線範囲内（0.625-50 ng/mL）となった。このときの吸光度よりヒノキ花粉抽出物中のCha o 2濃度を推定するとそれぞれ，6.44, 6.55及び6.40 μg/mLとなり，ほぼ同じ濃度が得られた（CV 1.2 %）。このことより，抗Cha o 2抗体4H5-3C3並びに9A11-1F8を利用したSandwich ELISAは，希釈倍率によらず，共雑物質の影響を受けない定量系であり，花粉抽出液中のCha o 2も測定可能であることがわかった。
【0077】
2.9 スギ花粉抽出物に対する交差性
構築したELISAがスギ花粉抽出物と交差するのか検討した。ヒノキ花粉抽出物と86倍以上の感度の差があった（図9）。このことより，抗Cha o 2抗体9A11-1F8並びに4H5-3C3を利用したSandwich ELISAは，高い特異性を有し，ヒノキ花粉中にスギ花粉が混入した場合でも，Cha o 2含量のみを測定可能な測定系であることが明らかとなった。
構築したELISAがスギ花粉抽出物と交差するのか検討した。ヒノキ花粉抽出物と86倍以上の感度の差があった（図9）。このことより，抗Cha o 2抗体9A11-1F8並びに4H5-3C3を利用したSandwich ELISAは，高い特異性を有し，ヒノキ花粉中にスギ花粉が混入した場合でも，Cha o 2含量のみを測定可能な測定系であることが明らかとなった。
【0078】
2.10 既存技術との比較
なお、Agresera社から販売されている「Cha o 2 ポリクローナル抗体」はポリクローナルであるため、エピトープに多型が含まれる場合、親和性が変わる可能性が考えられる。さらにポリクローナル抗体は生産量が有限な点で制約がある。これに対し、本願発明のモノクローナル抗体は特異性が高く、Cha o 2多型によらず検出が可能であり、無限に生産できる。
なお、Agresera社から販売されている「Cha o 2 ポリクローナル抗体」はポリクローナルであるため、エピトープに多型が含まれる場合、親和性が変わる可能性が考えられる。さらにポリクローナル抗体は生産量が有限な点で制約がある。これに対し、本願発明のモノクローナル抗体は特異性が高く、Cha o 2多型によらず検出が可能であり、無限に生産できる。
【配列表フリーテキスト】
【0079】
配列番号２～６：合成ペプチド
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【配列表】