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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024009531
(43)【公開日】2024-01-23
(54)【発明の名称】新規ポリペプチド、新規ポリヌクレオチド及びそれらの用途
(51)【国際特許分類】
C12N 15/31 20060101AFI20240116BHJP
C07K 14/37 20060101ALI20240116BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240116BHJP
A01N 63/30 20200101ALI20240116BHJP
A01N 63/50 20200101ALI20240116BHJP
A01P 3/00 20060101ALI20240116BHJP
【ＦＩ】
C12N15/31
C07K14/37 ZNA
C12N15/63 Z
A01N63/30
A01N63/50
A01P3/00
【審査請求】未請求
【請求項の数】7
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2022111133
(22)【出願日】2022-07-11
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】516357373
【氏名又は名称】原 富次郎
(71)【出願人】
【識別番号】522278578
【氏名又は名称】株式会社ワンネス
(74)【代理人】
【識別番号】110002697
【氏名又は名称】めぶき弁理士法人
(74)【代理人】
【識別番号】100110973
【弁理士】
【氏名又は名称】長谷川 洋
(74)【代理人】
【識別番号】100116528
【弁理士】
【氏名又は名称】三宅 俊男
(72)【発明者】
【氏名】原 富次郎
(72)【発明者】
【氏名】▲高▼塚 由美子
(72)【発明者】
【氏名】山岸 純一
(72)【発明者】
【氏名】横田 健治
(72)【発明者】
【氏名】志波 優
【テーマコード（参考）】
4H011
4H045
【Ｆターム（参考）】
4H011AA01
4H011BB19
4H011BB21
4H011DH11
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA15
4H045DA83
4H045EA06
4H045FA20
4H045FA33
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
【課題】リゾクトニア・ソラニの分泌物質から、新規な抗糸状菌活性を有する物質を探索する。
【解決手段】配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド又は前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ抗糸状菌活性を有するポリペプチドを提供する。
【選択図】図１３
【解決手段】配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド又は前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ抗糸状菌活性を有するポリペプチドを提供する。
【選択図】図１３
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド又は前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ抗糸状菌活性を有するポリペプチド。
【請求項2】
配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド又は前記アミノ酸配列と配列同一性７０％以上のアミノ酸配列を有し、かつ抗糸状菌活性を有するポリペプチド。
【請求項3】
配列番号２で表される塩基配列の１５５～４１８番目の塩基配列を有するポリヌクレオチド又は前記ポリヌクレオチドと配列同一性７０％以上の塩基配列を有し、かつ抗糸状菌活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項4】
請求項３に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項5】
請求項１又は２に記載のポリペプチドの誘導体又は修飾体。
【請求項6】
請求項１又は２に記載のポリペプチド又はその誘導体若しくはその修飾体を含む植物伝染性糸状菌類防除用組成物。
【請求項7】
請求項１又は２に記載のポリペプチド又はその誘導体若しくはその修飾体を含む農薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規ポリペプチド、新規ポリヌクレオチド及びそれらの用途に関する。
【背景技術】
【0002】
リゾクトニア属菌は、その中にイネの紋枯病菌、ジャガイモの黒あざ病菌など多くの植物病原菌があることから、古くから注目をあび、これまでに百数十種類のリゾクトニアの種が報告されている。リゾクトニア・ソラニ（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）は、ふすま培地で増殖する際に、エンド型β－１，３－グルカナーゼやプロテアーゼなどの加水分解酵素群を分泌し、これらが酵母の細胞壁を溶解することが一般的に知られる（非特許文献１～３参照）。
【0003】
一方、このリゾクトニア・ソラニの分泌物質は、水稲伝染性糸状菌の菌糸生長阻害性や分生子形成阻害性も示すことが、報告されており（例えば、特許文献１参照）、詳細には、リゾクトニア・ソラニＤ１３８株から分泌されるβ－１，３－グルカナーゼはエキソ型も含み、あるいはエンド型、エキソ型も含む両特性が、水稲伝染性糸状菌の生育阻害性を示すことが強調して述べられている。従って、リゾクトニア・ソラニ又はその培養物は、微生物、特に糸状菌による植物伝染病害を防除しうることが示唆されている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Ｔｏｔａｎｉ Ｋ，Ｈａｒｕｍｉｙａ Ｓ，Ｎａｎｊｏ Ｆ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ β－１，３－ｇｌｕｃａｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ ｓｐｅｃｉｅｓ，Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，４７（５），１１５９－１１６２，１９８２
【非特許文献2】Ｕｓｕｉ Ｔ，Ｏｇｕｃｈｉ Ｍ，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｆｒｏｍ Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ ｌｙｓｉｎｇ ｙｅａｓｔ ｃｅｌｌ ｗａｌｌｓ，Ａｇｒｉｃ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．，５０（２），５３５－５３７，１９８６
【非特許文献3】Ｔｏｔｓｕｋａ Ａ，Ｕｓｕｉ Ｔ，Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｎｄｏ－β－（１－＞３）－Ｄ－ｇｌｕｃａｎａｓｅ ｆｒｏｍ Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５０（３），５４３－５５０，１９８６
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特開２０２１－２０８６４号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明は、リゾクトニア・ソラニの分泌物質から、新規な抗糸状菌活性を有する物質を探索することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
このような経緯を踏まえ、リゾクトニア・ソラニの分泌物質から、エキソ型やエンド型のβ－１，３－グルカナーゼ、あるいはグルカナーゼと同様な細胞膜溶解性を示すことが知られるプロテアーゼ、他の加水分解酵素類の調査・取得を目的に精製を行ったところ、以下に述べる糸状菌の菌糸生長阻害性を示す、分子量約１０ｋＤａの新規なポリペプチドを取得するに至った。すなわち、本発明は以下の実施形態を含む。
【0008】
（１）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド又は前記アミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を有し、かつ抗糸状菌活性を有するポリペプチド。
（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド又は前記アミノ酸配列と配列同一性７０％以上のアミノ酸配列を有し、かつ抗糸状菌活性を有するポリペプチド。
（３）配列番号２で表される塩基配列の１５５～４１８番目の塩基配列を有するポリヌクレオチド又は前記ポリヌクレオチドと配列同一性７０％以上の塩基配列を有し、かつ抗糸状菌活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（４）（３）に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（５）（１）又は（２）に記載のポリペプチドの誘導体又は修飾体。
（６）（１）又は（２）に記載のポリペプチド又はその誘導体若しくはその修飾体を含む植物伝染性糸状菌類防除用組成物。
（７）（１）又は（２）に記載のポリペプチド又はその誘導体若しくはその修飾体を含む農薬。
（２）配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するポリペプチド又は前記アミノ酸配列と配列同一性７０％以上のアミノ酸配列を有し、かつ抗糸状菌活性を有するポリペプチド。
（３）配列番号２で表される塩基配列の１５５～４１８番目の塩基配列を有するポリヌクレオチド又は前記ポリヌクレオチドと配列同一性７０％以上の塩基配列を有し、かつ抗糸状菌活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
（４）（３）に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
（５）（１）又は（２）に記載のポリペプチドの誘導体又は修飾体。
（６）（１）又は（２）に記載のポリペプチド又はその誘導体若しくはその修飾体を含む植物伝染性糸状菌類防除用組成物。
（７）（１）又は（２）に記載のポリペプチド又はその誘導体若しくはその修飾体を含む農薬。
【発明の効果】
【0009】
本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドは、新規な抗糸状菌活性を有する物質として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【発明を実施するための形態】
【0011】
次に、本発明の各実施形態について、図面を参照して説明する。なお、以下に説明する各実施形態は、特許請求の範囲に係る発明を限定するものではなく、また、各実施形態の中で説明されている諸要素及びその組み合わせの全てが本発明の解決手段に必須であるとは限らない。
【0012】
（新規ポリペプチド）
本発明の一実施形態に係るポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する。なお、特定のアミノ酸配列等を「有する(having)」ポリペプチドとは、当該アミノ酸配列等「からなる(consisting of)」ポリペプチド、及び当該アミノ酸配列等を「含む(comprising)」ポリペプチドを含む。また、本明細書において、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシ末端）である。
本発明の一実施形態に係るポリペプチドは、以下のアミノ酸配列を有する。なお、特定のアミノ酸配列等を「有する(having)」ポリペプチドとは、当該アミノ酸配列等「からなる(consisting of)」ポリペプチド、及び当該アミノ酸配列等を「含む(comprising)」ポリペプチドを含む。また、本明細書において、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシ末端）である。
【0013】
Ｎ末端側 ＥＴＳＹＧＮＰＤＬＶＴＤＱＧＮＲＦＫＬＮＦＧＳＴＤＧＨＰＮＡＣＰＧＨＹＩＣＹＩＳＫＮＧＡＱＨＧＤＶＳＬＧＮＰＤＤＦＶＤＥＧＮＲＷＲＬＮＹＧＳＴＤＧＨＰＮＡＣＰＧＨＹＩＣＹＩＳＫ（配列番号１）
【0014】
本実施形態に係るポリペプチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が欠失、付加、及び／又は置換された相同性を有するポリペプチドであっても、抗糸状菌活性を有するものは包含する。本明細書において、「１～数個のアミノ酸が欠失、付加、及び／又は置換されているポリペプチド」という場合、それらのアミノ酸の個数は、そのポリペプチドが抗糸状菌活性を有する限りは特に限定されないが、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～５個、さらに好ましくは１個、２個若しくは３個である。欠失、付加、及び／又は置換されている場所は、ペプチドの末端であっても、中間であってもよく、１ヶ所であっても２ヶ所以上であってもよい。
【0015】
本明細書において、「抗糸状菌活性」とは糸状菌に対する静菌活性及び殺菌活性のいずれであってもよい。例えば、糸状菌の菌糸の伸長阻害又は抑制、糸状菌の分生子形成阻害又は抑制、及び糸状菌の菌糸体の形成阻害又は抑制等のいずれを意味してもよい。本明細書において、糸状菌とは、真菌門または変形菌門に属する真核生物で、真菌門には担子菌亜門、子嚢菌亜門、不完全菌亜門、接合菌亜門及び鞭毛菌亜門（卵菌類）が含まれ、細胞壁はキチン・グルカンまたはセルロース・グルカンからなり、糸状、分岐を持つ栄養体を形成し、胞子を形成する顕微鏡的大きさの微生物である。
【0016】
このような上記アミノ酸配列において１～数個のアミノ酸が欠失、付加、及び／又は置換されたアミノ酸配列として、上記アミノ酸配列と、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ ａｔ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等（例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて）を用いて計算したときに、少なくとも５０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、特に好ましくは９０％以上の同一性を有しているものが挙げられる。
【0017】
本実施形態に係るポリペプチドは、本発明の課題を解決するものである限り、その種々の誘導体、及び／又は修飾体も包含する。ポリペプチドの誘導体とは、アミノ酸置換、欠失、又は挿入により変化したアミノ酸配列を有するポリペプチド、糖鎖付加、糖鎖欠失、非天然アミノ酸挿入、リング挿入、メチル残基のような化学的修飾、タンパク質分解断片並びに欠失断片を含む。これらのポリペプチド誘導体は、天然に存在することができ、又は天然に存在しなくてもよい。天然に存在しない誘導体は、当技術分野で公知の突然変異誘発技術を使用して産生することができる。ポリペプチド誘導体は、官能側鎖基の反応により化学的に誘導体化された1つ以上の残基を有するポリペプチドを含む。同様に、２０個の標準アミノ酸の１つ以上の天然に存在するアミノ酸誘導体を含有するそれらのペプチドも、「誘導体」に含まれる。例えば、４－ヒドロキシプロリンをプロリンの代わりに使用することができ、５－ヒドロキシリジンをリジンの代わりに使用することができ、３－メチルヒスチジンをヒスチジンの代わりに使用することができ、ホモセリンをセリンの代わりに使用することができ、及びオルニチンをリジンの代わりに使用することができる。
【0018】
修飾体とは、本実施形態のポリペプチドに、化学的又は生物学的な修飾が施されてなるものを意味する。化学的な修飾体には、アミノ酸骨格への化学部分の結合、Ｎ－結合またはＯ－結合糖鎖の化学修飾体等が含まれる。化学的修飾体に含まれる化学部分としては、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコールコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール等の水溶性ポリマーを例示することができる。生物学的な修飾体には、翻訳後修飾（例えば、Ｎ－結合またはＯ－結合への糖鎖付加、Ｎ末またはＣ末のプロセッシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化）されたもの、原核生物宿主細胞を用いて発現させることによりＮ末にメチオニン残基が付加したもの、遺伝子組換えによりタグ等他のペプチドが付加された融合体等が含まれる。また、酵素標識体、蛍光標識体、アフィニティ標識体もかかる修飾物の意味に含まれる。
【0019】
本実施形態に係るポリペプチドの製造は、種々の宿主生物および宿主細胞中においての好適な核酸コンストラクトの異種発現によりなされてもよい。必要な遺伝子操作の方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌｌ ２００１ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＪに記載されている。原核生物のシステム（例えば、大腸菌）又は真核生物のシステム（例えば、昆虫細胞、植物細胞、または哺乳動物細胞）を用いることができる。
【0020】
あるいは本実施形態に係るポリペプチドは、化学的ペプチド合成法によって製造することができる。これは、例えばＢ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄに従う公知の固相法の使用を含み得る。合成は、ＦｍｏｃまたはＢｏｃ保護基戦略を用いて、自動ペプチド合成装置の助けを借りるかまたは手作業で行われ得る。より小さな断片を後から繋ぎ合わせることでポリペプチドを合成することができる。
【0021】
(新規ポリヌクレオチド)
本発明の別の実施形態に係るポリヌクレオチドは、以下の塩基配列において、１５５～４１８番目の塩基配列（下線を付した）を有する。
５’－ＡＴＣＣＡＡＣＡＧＡＴＣＴＣＧＴＣＴＣＡＡＧＣＴＣＡＣＴＴＴＣＣＡＡＧＣＡＣＡＣＡＣＣＡＡＣＴＣＡＧＣＣＡＴＧＴＴＴＴＣＣＴＣＴＧＣＴＣＡＴＣＴＣＧＣＴＴＴＣＴＴＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＧＣＴＣＴＴＧＴＴＧＣＴＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＣＡＣＴＧＡＧＣＴＣＧＡＡＧＧＡＣＡＧＡＣＴＣＴＴＧＣＣＡＡＧＣＧＣＧＡＧＡＣＧＴＣＡＴＡＣＧＧＣＡＡＴＣＣＣＧＡＣＴＴＧＧＴＡＡＣＴＧＡＣＣＡＧＧＧＣＡＡＴＣＧＣＴＴＣＡＡＧＣＴＣＡＡＣＴＴＴＧＧＣＡＧＣＡＣＣＧＡＣＧＧＣＣＡＣＣＣＧＡＡＣＧＣＧＴＧＴＣＣＣＧＧＡＣＡＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＴＡＣＡＴＣＴＣＡＡＡＧＡＡＣＧＧＡＧＣＣＣＡＡＣＡＴＧＧＣＧＡＣＧＴＣＴＣＴＣＴＣＧＧＣＡＡＴＣＣＣＧＡＣＧＡＣＴＴＴＧＴＡＧＡＴＧＡＧＧＧＣＡＡＣＣＧＴＴＧＧＣＧＣＣＴＧＡＡＣＴＡＴＧＧＴＡＧＣＡＣＣＧＡＴＧＧＡＣＡＣＣＣＧＡＡＣＧＣＣＴＧＣＣＣＴＧＧＡＣＡＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＴＡＴＡＴＣＡＧＣＡＡＧＴＧＡＡＣＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＡＡＣＴＣＧＴＣＡＴＴＴＣＣＣＧＣＡＧＴＴＴＣＣＴＴＴＡＴＧＴＴＴＧＴＡＴＴＡＣＴＴＣＴＣＡＧＴＴＡＡＡＴＣＡＡＣＣＡＴＡＧＧＡＡＡＴＡＴＡＧＣＴＡＴＣＴＴＴＡＡＣＡＣＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ－３’（配列番号２）
本発明の別の実施形態に係るポリヌクレオチドは、以下の塩基配列において、１５５～４１８番目の塩基配列（下線を付した）を有する。
５’－ＡＴＣＣＡＡＣＡＧＡＴＣＴＣＧＴＣＴＣＡＡＧＣＴＣＡＣＴＴＴＣＣＡＡＧＣＡＣＡＣＡＣＣＡＡＣＴＣＡＧＣＣＡＴＧＴＴＴＴＣＣＴＣＴＧＣＴＣＡＴＣＴＣＧＣＴＴＴＣＴＴＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＧＣＴＣＴＴＧＴＴＧＣＴＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＣＡＣＴＧＡＧＣＴＣＧＡＡＧＧＡＣＡＧＡＣＴＣＴＴＧＣＣＡＡＧＣＧＣＧＡＧＡＣＧＴＣＡＴＡＣＧＧＣＡＡＴＣＣＣＧＡＣＴＴＧＧＴＡＡＣＴＧＡＣＣＡＧＧＧＣＡＡＴＣＧＣＴＴＣＡＡＧＣＴＣＡＡＣＴＴＴＧＧＣＡＧＣＡＣＣＧＡＣＧＧＣＣＡＣＣＣＧＡＡＣＧＣＧＴＧＴＣＣＣＧＧＡＣＡＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＴＡＣＡＴＣＴＣＡＡＡＧＡＡＣＧＧＡＧＣＣＣＡＡＣＡＴＧＧＣＧＡＣＧＴＣＴＣＴＣＴＣＧＧＣＡＡＴＣＣＣＧＡＣＧＡＣＴＴＴＧＴＡＧＡＴＧＡＧＧＧＣＡＡＣＣＧＴＴＧＧＣＧＣＣＴＧＡＡＣＴＡＴＧＧＴＡＧＣＡＣＣＧＡＴＧＧＡＣＡＣＣＣＧＡＡＣＧＣＣＴＧＣＣＣＴＧＧＡＣＡＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＴＡＴＡＴＣＡＧＣＡＡＧＴＧＡＡＣＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＡＡＣＴＣＧＴＣＡＴＴＴＣＣＣＧＣＡＧＴＴＴＣＣＴＴＴＡＴＧＴＴＴＧＴＡＴＴＡＣＴＴＣＴＣＡＧＴＴＡＡＡＴＣＡＡＣＣＡＴＡＧＧＡＡＡＴＡＴＡＧＣＴＡＴＣＴＴＴＡＡＣＡＣＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ－３’（配列番号２）
【0022】
一実施形態では、配列番号２で表される塩基配列の１５５～４１８番目の塩基配列を有するポリヌクレオチドは、配列番号２で表される塩基配列の１５５～４１８番目の塩基配列と所定の配列同一性を有する塩基配列を有するポリヌクレオチドであり得る。塩基配列の同一性の程度は、約７０％以上、好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上、さらにより好ましくは約９６％以上、最も好ましくは約９７％以上、約９８％以上又は約９９％以上であり得る。塩基配列同一性は自体公知の方法により決定できる。例えば、塩基配列同一性（％）は、上述したアミノ酸配列同一性（％）と同様の方法により決定できる。
【0023】
別の実施形態では、上記ポリヌクレオチドは、配列番号２で表される塩基配列の１５５～４１８番目の塩基配列において１以上のヌクレオチドが置換、付加、欠失及び挿入から選ばれる１以上の修飾を施された塩基配列であり得る。修飾されるヌクレオチドの数は、１以上であれば特に限定されないが、例えば１～約１００個、好ましくは１～約７０個、より好ましくは１～約５０個、さらにより好ましくは１～約３０個、最も好ましくは１～約２０個、１～約１０個又は１～約５個（例、１個又は２個）であり得る。
【0024】
さらに別の実施形態では、上記ポリヌクレオチドは、配列番号２で表される塩基配列の１５５～４１８番目の塩基配列に対してハイストリンジェント条件下でハイブリダイズし得るポリヌクレオチドであり得る。ハイストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションの条件は、既報の条件を参考に設定することができる（例、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， ６．３．１－６．３．６ （１９９９）参照）。例えば、ハイストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションの条件としては、６×ＳＳＣ（ｓｏｄｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ／ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）／４５℃でのハイブリダイゼーション、次いで０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ／５０～６５℃での１回又は２回以上の洗浄が挙げられる。
【0025】
本実施形態のポリヌクレオチドは、本実施形態のポリペプチドをコードし得る。従って、本実施形態のポリヌクレオチドは、それによりコードされるポリペプチドが本実施形態のポリペプチドと同様の機能を示し得るようなポリヌクレオチドであり得る。
【0026】
（発現ベクター）
本発明の一実施形態に係る発現ベクターは、発現されるべき目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は発現されるべき目的ポリヌクレオチド、及び当該ポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターを含み得る。「プロモーターがポリヌクレオチドに機能的に連結されている」とは、プロモーターが、その制御下にあるポリヌクレオチド自体の発現又はポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現を可能とするように、該遺伝子をコードするポリヌクレオチドに結合していることを意味する。
本発明の一実施形態に係る発現ベクターは、発現されるべき目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド又は発現されるべき目的ポリヌクレオチド、及び当該ポリヌクレオチドに機能的に連結されたプロモーターを含み得る。「プロモーターがポリヌクレオチドに機能的に連結されている」とは、プロモーターが、その制御下にあるポリヌクレオチド自体の発現又はポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの発現を可能とするように、該遺伝子をコードするポリヌクレオチドに結合していることを意味する。
【0027】
本実施形態の発現ベクターのバックボーンとしては、所定の細胞で目的の物質を産生できるものであれば特に制限されないが、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクターが挙げられる。発現ベクターを医薬として用いる場合、哺乳動物への投与に好適なベクターとしては、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクターが挙げられる。
【0028】
宿主細胞として原核生物細胞を用いる場合、原核生物細胞を宿主細胞として利用可能な発現ベクターが用いられ得る。このような発現ベクターは、例えば、プロモーター－オペレーター領域、開始コドン、本実施形態のポリペプチド又はその部分ペプチドをコードするポリヌクレオチド、終止コドン、ターミネーター領域、複製起点等のエレメントを含み得る。細菌中で本発明のポリペプチドを発現させるためのプロモーター－オペレーター領域は、プロモーター、オペレーター及びＳｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列を含むものである。これらのエレメントについては、自体公知のものを用いることができる。
【0029】
また、宿主細胞として真核生物細胞を用いる場合、真核生物細胞を宿主細胞として利用可能な発現ベクターが用いられ得る。この場合、使用されるプロモーターは、哺乳動物等の真核生物で機能し得るものであれば特に制限されない。ポリペプチドの発現を目的とする場合、このようなプロモーターとしては、例えば、ＳＶ４０由来初期プロモーター、サイトメガロウイルスＬＴＲ、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＭｏＭｕＬＶ由来ＬＴＲ、アデノウイルス由来初期プロモーター等のウイルスプロモーター、並びにβ－アクチン遺伝子プロモーター、ＰＧＫ遺伝子プロモーター、トランスフェリン遺伝子プロモーター等の哺乳動物の構成タンパク質遺伝子プロモーターなどが挙げられる。ポリヌクレオチドの発現を目的とする場合、プロモーターは、ｐｏｌＩＩＩプロモーター（例、ｔＲＮＡプロモーター、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター）であり得る。
【0030】
本発明の発現ベクターはさらに、転写開始及び転写終結のための部位、及び転写領域において翻訳に必要とされ得るリボソーム結合部位、複製起点並びに選択マーカー遺伝子（例、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、スペクチノマイシン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール）などを含み得る。本発明の発現ベクターは、自体公知の方法により作製できる（例えば、上掲のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇなど参照）。
【0031】
（植物伝染性糸状菌類防除用組成物）
本実施形態の植物伝染性糸状菌類防除用組成物（以下、「本実施形態の組成物」という。）は、上記ポリペプチド又はその誘導体若しくはその修飾体を含むことを特徴とする。本実施形態の組成物は、常法に従って、製造することができる。すなわち、本実施形態の組成物は、有効成分として上記ポリペプチド又はその誘導体若しくはその修飾体の少なくとも１種を含む限り、他の有効成分を含むことができる。さらに、担体を混合して用いることができ、必要に応じて、例えば、界面活性剤、湿潤剤、固着剤、増粘剤、防菌防黴剤、着色剤、安定剤などの製剤用補助剤を添加して、常法に従って、適時、例えば、粒剤、水和剤、フロアブル剤、顆粒水和剤、粉剤、乳剤などに製剤化することができる。
本実施形態の植物伝染性糸状菌類防除用組成物（以下、「本実施形態の組成物」という。）は、上記ポリペプチド又はその誘導体若しくはその修飾体を含むことを特徴とする。本実施形態の組成物は、常法に従って、製造することができる。すなわち、本実施形態の組成物は、有効成分として上記ポリペプチド又はその誘導体若しくはその修飾体の少なくとも１種を含む限り、他の有効成分を含むことができる。さらに、担体を混合して用いることができ、必要に応じて、例えば、界面活性剤、湿潤剤、固着剤、増粘剤、防菌防黴剤、着色剤、安定剤などの製剤用補助剤を添加して、常法に従って、適時、例えば、粒剤、水和剤、フロアブル剤、顆粒水和剤、粉剤、乳剤などに製剤化することができる。
【0032】
本実施形態の組成物における有効成分の含有量は、通常、重量比で、０．００５～９９％の範囲であり、好ましくは、０．１～９０％の範囲であり、さらに好ましくは、０．３～８０％の範囲である。本実施形態の組成物における有効成分の含有量は、製剤形態によっても異なり、適宜選択されるが、通常、粉剤では、０．０１～３０重量％であり、水和剤では、０．１～８０重量％であり、粒剤では、０．５～２５重量％であり、乳剤では、２～５０重量％であり、フロアブル製剤では、１～５０重量％であり、ドライフロアブル製剤では、１～８０重量％である。
【0033】
本実施形態の組成物は、例えば、種々の糸状菌に由来する植物病害に対して有効であり、好ましくは、植物伝染性糸状菌類の防除に有効である。以下に、本実施形態の組成物が防除対象とする具体的病害を例示すると、例えば、イネいもち病（Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｏｒｙｚａｅ）、紋枯病（Ｔｈａｎａｔｅｐｈｏｒｕｓ ｃｕｃｕｍｅｒｉｓ）、ごま葉枯病（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ ｍｉｙａｂｅａｎｕｓ）、馬鹿苗病（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ）；ムギ類のうどんこ病（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｇｒａｍｉｎｉｓ）、さび病（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ）、斑葉病（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ ｇｒａｍｉｎｅａ）、網斑病（Ｐｙｒｅｎｏｐｈｏｒａ ｔｅｒｅｓ）；トウモロコシ赤かび病（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍなど）、苗立枯病（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ａｖｅｎａｃｅｕｍ）、ごま葉枯病（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ）、黒穂病（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ）；ナシの黒斑病（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ａｌｔｅｒｎａｔａ）、黒星病（Ｖｅｎｔｕｒｉａ ｎａｓｈｉｃｏｌａ）、赤星病（Ｇｙｍｎｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｈａｒａｅａｎｕｍ）；モモ黒星病（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｃａｒｐｏｐｈｉｌｕｍ）、フォモプシス腐敗病（Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ ｓｐ．）、疫病（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｓｐ．）；オウトウ炭疽病（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ ｃｉｎｇｕｌａｔａ）、幼果菌核病（Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ ｋｕｓａｎｏｉ）、灰星病（Ｍｏｎｉｌｉｎｉａ ｆｒｕｃｔｉｃｏｌａ）；カキ炭疽病（Ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｕｍ ｋａｋｉ）、落葉病（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｋａｋｉ）、うどんこ病（Ｐｈｙｌｌａｃｔｉｎｉａ ｋａｋｉｋｏｒａ）；カンキツ黒点病（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｃｉｔｒｉ）、緑かび病（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄｉｇｉｔａｔｕｍ）、青かび病（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｉｔａｌｉｃｕｍ）；トマト、キュウリ、豆類、イチゴ、ジャガイモ、キャベツ、ナス、レタスなどの灰色かび病（Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ）；トマト、キュウリ、豆類、イチゴ、ジャガイモ、ナタネ、キャベツ、ナス、レタスなどの菌核病（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）；トマト、キュウリ、豆類、ダイコン、スイカ、ナス、ナタネ、ピーマン、ホウレンソウ、テンサイなど各種野菜の苗立枯病（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｐｐ．）；ウリ類のべと病（Ｐｓｅｕｄｏｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ ｃｕｂｅｎｓｉｓ）、キュウリうどんこ病（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ ｃｕｃｕｒｂｉｔａｅ）；トマト輪紋病（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｓｏｌａｎｉ）、葉かび病（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ ｆｕｌｖａｍ）、トマトうどんこ病（Ｏｉｄｉｕｍ ｎｅｏｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｉ）；キャベツ株腐病（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）、萎黄病（Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）；ハクサイ尻腐病（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ）、黄化病（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ ｄａｈｌｉｅ）；ネギさび病（Ｐｕｃｃｉｎｉａ ａｌｌｉｉ）、黒斑病（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ ｐｏｒｒｉ）；ダイズ紫斑病（Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｋｉｋｕｃｈｉｉ）、黒とう病（Ｅｌｓｉｎｏｅ ｇｌｙｃｉｎｎｅｓ）、黒点病（Ｄｉａｐｏｒｔｈｅ ｐｈａｓｅｏｌｏｌｕｍ）などが挙げられるがこれらに限定されない。
【0034】
（農薬）
本実施形態の農薬は、前述のように、上記ポリペプチド又はその誘導体若しくはその修飾体を含むことを特徴とする。本実施形態の農薬によれば、例えば、微生物による植物伝染病害を防除できる。本発明の農薬は、上記植物伝染性糸状菌類防除用組成物の説明を援用できる。
本実施形態の農薬は、前述のように、上記ポリペプチド又はその誘導体若しくはその修飾体を含むことを特徴とする。本実施形態の農薬によれば、例えば、微生物による植物伝染病害を防除できる。本発明の農薬は、上記植物伝染性糸状菌類防除用組成物の説明を援用できる。
【0035】
本実施形態の農薬の剤形は、特に制限されず、例えば、散剤、細粒剤、顆粒剤、等の固形剤、液剤、乳剤等があげられる。本実施形態の農薬は、例えば、公知の農薬を含んでもよい。前記公知の農薬は、例えば、生物学的農薬、化学的農薬でもよい。前記生物学的農薬は、例えば、抗菌活性、殺虫活性、殺菌活性、除草活性、植物成長調節活性、昆虫忌避活性等の活性を有する微生物（例えば、細菌、真菌）を含む農薬である。また、前記化学的農薬は、例えば、抗菌物質、殺虫物質、殺菌物質、除草物質、植物成長調節物質、昆虫忌避物質等があげられる。
【0036】
前記農薬の使用対象は、特に制限されないが、例えば、植物、前記植物を栽培する土壌、水等の培地があげられる。前記植物は、例えば、イネ等のイネ科植物等があげられ、水稲が好ましい。前記農薬を前記植物に使用する場合、前記植物において前記農薬を接触させる位置は、特に制限されず、前記植物個体全体でもよいし、前記植物個体の部分でもよい。前記植物個体の部分は、例えば、器官、組織、細胞または栄養繁殖体等があげられ、いずれでもよい。前記器官は、例えば、花弁、花冠、花、葉、種子、果実、茎、根等があげられる。具体例として、前記使用対象は、例えば、イネの種子（種もみ）、苗等があげられる。前記農薬を使用する際の植物の成長状態は、特に制限されず、例えば、種子でもよいし、苗でもよいし、成長体でもよい。
【0037】
前記農薬の使用量および使用回数は、特に制限されず、例えば、前記使用対象に応じて適宜設定できる。本実施形態の農薬は、例えば、一般的な使用方法により、使用できる。前記使用方法は、例えば、前記農薬を手で直接散布する方法、背負い式散粒機、パイプ散粒機、空中散粒機、動力散粒機、育苗箱用散粒機、多口ホース散粒機、田植え機等に付設した散粒機等の散粒機を用いて散粒する方法等があげられる。また、本発明の農薬が液剤の場合、前記農薬は、例えば、背負い式散布機、動力散布機、スプリンクラー、トラクター等に搭載される型の散布機、多口ホース散布機等の散布機を用いて散布できる。
【0038】
本発明の農薬の使用場所は、特に制限されず、例えば、水田、乾田、育苗箱、畑地、果樹園、桑畑、温室、露地等の農耕地等に使用できる。
【0039】
本発明の農薬をイネに使用する場合について、例をあげて説明する。本発明の農薬をイネに使用する場合、本発明の農薬は、例えば、播種時、育苗期、田植時等に使用できる。本発明の農薬は、例えば、未希釈の状態で使用してもよいし、希釈した状態で使用してもよく、例えば、前記水田に使用する場合、例えば、前述の散粒機、散布機、スプリンクラー等を用いて散粒、散布等できる。また、本発明の農薬を前記イネの種もみの消毒に使用する場合、前記農薬は、例えば、前記イネの種もみのコート剤として使用できる。前記本発明の農薬は、例えば、さらに、前記イネの種もみの浸種の際、浸漬する水に溶解して使用してもよいし、前記イネの種もみを種子消毒する際、温湯に溶解して使用してもよいし、前記イネの種もみの催芽の際、水に噴霧してもよい。
【0040】
前記水田に使用する場合、本発明の農薬の使用量および使用回数は、特に制限されず、前記水田の大きさおよび前記使用方法に応じて適宜決定できる。
【0041】
次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。
【実施例0042】
[実施例１]新規な抗糸状菌ポリペプチドの精製
（分泌物質試料の調製、及び酸沈殿とＣＭカラムクロマトグラフィーによる分画）
本精製に使用した分泌物質試料は、特許文献１に記載された方法により作製したリゾクトニア・ソラニＤ１３８株の分泌酵素群乾燥粉末（富士フィルム和光純薬社ならびにケイ・アイ化成社）を用いた。
（分泌物質試料の調製、及び酸沈殿とＣＭカラムクロマトグラフィーによる分画）
本精製に使用した分泌物質試料は、特許文献１に記載された方法により作製したリゾクトニア・ソラニＤ１３８株の分泌酵素群乾燥粉末（富士フィルム和光純薬社ならびにケイ・アイ化成社）を用いた。
【0043】
上記乾燥粉末を２ｇ秤量し、２０ｍＬの５０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．８）（以下、「バッファーＡ」とする）に溶解して乾燥粉末溶解液とした。これを４℃で１８時間以上静置して生じた酸沈殿物を、８０００×ｇ、４℃、１５分間の遠心分離により除去し、回収した上清をセルロースチューブ２７／３２（エーディア社）を用いてバッファーＡに対して１８時間透析した。透析後の溶液を再び８０００×ｇで１５分間遠心し、得られた上清を０．２μｍのフィルター（ＤＩＳＭＩＣ－２５ＣＳ、アドバンテック社）でろ過したものを酸沈殿上清溶液とし、カラムクロマトグラフィーへ供した。
【0044】
タンパク質の定量は、Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔプロテインアッセイキット（バイオラッド・ラボラトリーズ社）を用い、ウシ血清アルブミンを標準品としたＢｒａｄｆｏｒｄ法によりおこなった。上記の乾燥粉末溶解液及び酸沈殿上清溶液の総タンパク質量は、それぞれ５５４ｍｇ及び３７５ｍｇであった。
【0045】
カラムクロマトグラフィーは、ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ１００クロマトグラフィーシステム（Ｃｙｔｉｖａ社）を用いて、４℃に設定したクロマトチャンバー内でおこなった。酸沈殿上清溶液を、弱陽イオン交換カラムであるＨｉＴｒａｐ ＣＭ ＦＦカラム（容量５ｍＬ、平均粒子径９０μｍ、Ｃｙｔｉｖａ社）に供した。バッファーＡを用いて流速２．５ｍＬ／分で２０分間平衡化したカラムを装置から一旦外し、３５ｍＬの酸沈殿上清溶液を３０ｍＬ容量のシリンジを使用して２．４分間かけて手動で導入した。カラムを再び装置に装着し、バッファーＡで流速２．５ｍＬ／分で５０分間洗浄し、続けて０～２５０ｍＭ塩化ナトリウムの直線濃度勾配で８０分間（２００ｍＬ）送液してタンパク質を分離・溶出させた。その後、速やかに塩化ナトリウム濃度を１Ｍまで上昇させ、流速２．５ｍＬ／分で２８分間カラムを洗浄した後、バッファーＡを流速２．５ｍＬ／分で２０分間送液した。検出器の波長は２８０ｎｍとし、溶出溶液は自動フラクションコレクターを用いて、５ｍＬずつ（２分間／本）回収した。その結果を図１に示す。
【0046】
図１のような溶出クロマトグラムが得られたため、カラム非吸着画分及び分画番号Ｆ３０からＦ４９についての抗真菌活性を、糸状菌の菌糸生長阻害性、及び酵母の増殖阻害性について調査した。
【0047】
（抗真菌活性の評価１：糸状菌の菌糸生長阻害性評価）
糸状菌の菌糸生長阻害性の評価は、アガー・ウェル法を用いておこなった。本法における指標菌には、独立行政法人農業生物資源研究所から分与を受けたフザリウム・フジクロイＭＡＦＦ２３５９４９株を使用し、培地はポテトデキストロース寒天培地（以下、「ＰＤＡ」とする）を用いた。
糸状菌の菌糸生長阻害性の評価は、アガー・ウェル法を用いておこなった。本法における指標菌には、独立行政法人農業生物資源研究所から分与を受けたフザリウム・フジクロイＭＡＦＦ２３５９４９株を使用し、培地はポテトデキストロース寒天培地（以下、「ＰＤＡ」とする）を用いた。
【0048】
ＭＡＦＦ２３５９４９株の胞子保存液を、あらかじめ以下の手順で調製した。ＰＤＡ斜面培地の種菌をＰＤＡ平面培地へ播種し、およそ２週間、２８℃で培養した。生育した菌糸体の一部をスライドグラスへ塗抹し、オリンパスＢＸ４３システム顕微鏡（エビデント社）による位相差観察により胞子の存在を確認した後、直径９ｃｍのシャーレ１枚あたり４ｍＬの０．２５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を加えてスプレッダーで懸濁し、次に局方滅菌ガーゼでろ過して菌糸体を取り除いた。回収したろ液に胞子が含まれていることを位相差観察により確認した後、ろ液を８０００×ｇ、４℃で１５分間遠心し、パスツールピペットで上清を除き、直ちに８ｍＬの滅菌純水を加えて沈殿した胞子を懸濁洗浄した。この洗浄操作を２回繰り返した後、再び８０００×ｇ、４℃で１５分間遠心した上清をパスツールピペットで除き、１．５ｍＬの滅菌純水を加えて胞子を懸濁した。さらに、滅菌した８０％グリセロール溶液を０．５ｍＬ加えて混合した後、分注して－８０℃で凍結保存した。
【0049】
作製した胞子懸濁液は、一部を使用して胞子濃度を以下のように求めた。滅菌水で１／１０～１／１００００倍まで段階希釈し、各希釈溶液の０．１ｍＬをＰＤＡへ塗布播種した。２８℃で４日間培養して生じたコロニー数から、発芽可能な胞子数を算出した結果、１ｍＬあたり約５×１０７個であった。凍結保存した胞子懸濁液のうち１本を解凍し、２０％グリセロール溶液を用いて約５×１０５個／ｍＬとなるように希釈溶液を調製した。これを分注して、再度－８０℃に凍結保存したものを、以下の抗糸状菌活性評価試験に用いた。
【0050】
アガー・ウェル法に使用する培地は、直径９ｃｍの滅菌シャーレに、滅菌したＰＤＡを２０ｍＬずつ分注して固化させた後、外径約７ｍｍの滅菌ガラス管を用いてシャーレ中心よりウェル端が２ｃｍの距離になるように４か所開穴し（以下、「ＰＤＡアッセイプレート」とする）、これを使用するまで４℃で保存した。乾燥粉末溶解液、酸沈殿上清溶液、及びＣＭカラムクロマトグラフィーで得られた溶出画分をバッファーＡで２～１６倍まで段階希釈し、ＰＤＡアッセイプレートのウェルへ８０μＬずつ添加した。抗糸状菌活性の無いコントロールとしては、バッファーＡのみをウェルへ８０μＬ添加した。各試料をウェルへ添加した後、ＰＤＡアッセイプレートの中心部に、約５×１０５個／ｍＬのＭＡＦＦ２３５９４９株の保存胞子懸濁液を１０μＬ滴下播種した。３０℃で４日間培養した後、培養温度を１５℃に変更し、菌糸がコントロールのウェル端に０．５ｃｍ以内に到達するまで、さらに５日間培養した。各試料の菌糸生長阻害作用の有無は、ウェル端と生育した菌糸との距離をコントロールと比較した目視で判別し、阻害性の強度は阻害作用を示した被験液の最大希釈倍率で評価した。
【0051】
その結果を表１及び図２に示す。表１において、乾燥粉末溶解液（Ｉ）及び酸沈殿上清（ＩＩ）については、調査した最大の希釈倍率１６倍（タンパク質量としてそれぞれ、１２６μｇ及び５４μｇ／ウェル）でも、強い抗糸状菌活性を確認した。ＣＭカラムクロマトグラフィー分画後については、カラム非吸着画分である分画番号Ｆ２、及び分画番号Ｆ３５～Ｆ３８（５０～６９ｍＭ塩化ナトリウム溶出画分）に強い菌糸生長阻害作用が認められ（図２）、調査した最大希釈倍率１６倍まで抗糸状菌活性を確認した（表１）。
【0052】
【表1】
【0053】
[凡例等]
１）＋：活性あり、±：弱い活性あり、－：活性なし
２）分画番号は、Ｉ及ＩＩはそれぞれ乾燥粉末溶解液及び酸沈殿上清溶液を示し、その他の数字はＣＭカラムクロマトグラフィーの分画番号（図１）を示した
３）ウェル位置：ＰＤＡアッセイプレート上のウェルの１つをＡとして固定し、右回りにＢ、Ｃ、Ｄとした。
１）＋：活性あり、±：弱い活性あり、－：活性なし
２）分画番号は、Ｉ及ＩＩはそれぞれ乾燥粉末溶解液及び酸沈殿上清溶液を示し、その他の数字はＣＭカラムクロマトグラフィーの分画番号（図１）を示した
３）ウェル位置：ＰＤＡアッセイプレート上のウェルの１つをＡとして固定し、右回りにＢ、Ｃ、Ｄとした。
【0054】
（抗真菌活性の評価２：酵母の増殖阻害性）
酵母の増殖阻害作用は、９６穴マイクロタイタープレートを用いた微量液体希釈法で評価した。指標菌には独立行政法人製品評価技術基盤機構から分与を受けたサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１００７４株を使用し、培地はポテトデキストロース液体培地（以下、「ＰＤＢ」とする）を用いた。
酵母の増殖阻害作用は、９６穴マイクロタイタープレートを用いた微量液体希釈法で評価した。指標菌には独立行政法人製品評価技術基盤機構から分与を受けたサッカロマイセス・セレビシエＮＢＲＣ１００７４株を使用し、培地はポテトデキストロース液体培地（以下、「ＰＤＢ」とする）を用いた。
【0055】
あらかじめ２．４×１０７ｃｆｕ／ｍＬの濃度に調製し、－８０℃で凍結保存しておいたＮＢＲＣ１００７４株を、１０ｍＬのＰＤＢへ２０μＬ接種し、３０℃、１２０ｒｐｍで１８時間振とう培養することで、２．４×１０７ｃｆｕ／ｍＬの新鮮な酵母培養液を得た。これをさらに、２×ＰＤＢで１００倍希釈し、２．４×１０５ｃｆｕ／ｍＬの酵母懸濁液とした。９６穴マイクロタイタープレート（８行１２列）のすべてのウェルに１００μＬのバッファーＡを分注した後、１列目の各ウェルへ乾燥粉末溶解液、酸沈殿上清溶液、またはＣＭカラムクロマトグラフィー溶出画分液（原液）を１００μＬずつ分注した（希釈倍率は２倍となる）。次に８連マルチピペットを用いて、１列目のウェルより１００μＬずつ取り２列目へ混和した（希釈倍率４倍）。さらに２列目のウェルより１００μＬずつ取り３列目へ混和した（希釈倍率８倍）。同様の分取及び混和操作を１１列目まで繰り返すことで、希釈倍率２～２０４８倍の試料希釈溶液を調製した（１２列目はバッファーＡのみの陰性コントロールとした）。さらに、全てのウェル へ上記の酵母懸濁液を１００μＬ（２．４×１０４ｃｆｕ）ずつ添加した。この操作により、活性評価に使用した試料溶液の希釈倍率は４～４０９６倍となった。マイクロタイタープレートは水分蒸発を防ぐためにプラスチックバックへ収納し、２８℃で１８時間静置培養した。酵母増殖阻害性の強度は、各ウェルの濁度をコントロールと比較し、目視で増殖阻害を確認できる被験液の最大希釈倍率で示した。その結果を以下の表２に示す。
【0056】
表２に示したように、乾燥粉末溶解液、及び酸沈殿上清溶液においては、希釈倍率２５６倍までの強い酵母増殖阻害活性を確認した。ＣＭカラムクロマトグラフィー分画溶液については、カラム非吸着画分である分画番号Ｆ２及びＦ３でそれぞれ、１２８倍及び６４倍希釈までの強い増殖阻害性が認められた（表２）。一方で、分画番号Ｆ３０～Ｆ４１の溶出画分においては、希釈倍率４倍でもはっきりとした酵母増殖阻害活性が認められず(表２)、上記（抗真菌活性の評価１：糸状菌の菌糸生長阻害性評価）で、分画番号Ｆ２及びＦ３とＦ３５～Ｆ３８の両方に抗糸状菌活性が検出された結果とは、異なる傾向が認められた。
【0057】
【表2】
【0058】
[凡例]
判定結果 ＋：増殖あり、±：弱い増殖あり、－：増殖なし
判定結果 ＋：増殖あり、±：弱い増殖あり、－：増殖なし
【0059】
以上の２種類の抗真菌活性評価における結果から、リゾクトニア・ソラニＤ１３８株の分泌物質試料中には抗真菌タンパク質が少なくとも２種類以上存在し、一方は糸状菌及び酵母の両方を阻害するＣＭカラムに非吸着な性質（上記の実験条件において）を有し、もう一方はＣＭカラムに吸着・分離され、糸状菌のみに対して強い阻害活性を示すことが明らかとなった。以降では、糸状菌のみに作用する特徴的な性質を有する後者の活性画分（分画番号Ｆ３５～Ｆ３８）をターゲットにさらに精製を進めた。分画番号Ｆ３５～Ｆ３８の総タンパク質量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法による定量で、６５．３ｍｇであった。
【0060】
（ＣＭカラムクロマトグラフィー溶出画分のタンパク質分子組成の確認）
糸状菌のみに阻害活性を有するＣＭカラムクロマトグラフィー分画番号Ｆ３５～Ｆ３８とその周辺画分について、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によりタンパク質の組成と分子量を確認した。
糸状菌のみに阻害活性を有するＣＭカラムクロマトグラフィー分画番号Ｆ３５～Ｆ３８とその周辺画分について、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によりタンパク質の組成と分子量を確認した。
【0061】
ＳＤＳ－ＰＡＧＥは一般的によく用いられるＬａｅｍｍｌｉの方法に従っておこない、タンパク質の染色にはクイック－ＣＢＢキット（富士フィルム和光純薬社）を用いた。また、分子量マーカーには色素結合したタンパク質マーカーであるＢｌｕｅＳｔａｒ Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌａｄｄｅｒ（日本ジェネティクス社）を使用した。その結果を図３に示す。分画番号Ｆ３５～Ｆ３８には幅広い分子量の多くのタンパク質が混在しており、また各画分間において泳動パターンに著しい相違は認められなかった。
【0062】
（ＳＰカラムクロマトグラフィーによる分画）
ＣＭカラムクロマトグラフィーで回収した分画番号Ｆ３７とＦ３８ の溶液について、アミコンウルトラ遠心式限外ろ過フィルター（メルクミリポア社）を用いて脱塩・濃縮した後、強陽イオン交換カラムであるＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰカラム（容量１ｍＬ、平均粒子径３４μｍ、Ｃｙｔｉｖａ社）に供した。バッファーＡを流速１ｍＬ／分で１０分間送液して平衡化したカラムに、試料全量（２ｍＬ）をサンプルループを使用して注入し、さらにバッファーＡをサンプルループを流路として６分間送液 した。バッファーＡでカラムを１８分間洗浄した後、０～２５０ｍＭ塩化ナトリウムの直線濃度勾配で４０分間（４０ｍＬ）送液し、タンパク質を分離・溶出させた。その後、速やかに塩化ナトリウム濃度を１Ｍまで上昇させて流速１ｍＬ／分で１８分間カラムを洗浄した後、バッファーＡを流速１ｍＬ／分で１０分間送液した。検出器の波長は２８０ｎｍとし、溶出溶液は自動フラクションコレクターを用いて、試料導入後の洗浄液（カラム非吸着画分）は２ｍＬずつ（２分間／本）、直線塩濃度勾配開始後は１ｍＬずつ（１分間／本）回収した。
ＣＭカラムクロマトグラフィーで回収した分画番号Ｆ３７とＦ３８ の溶液について、アミコンウルトラ遠心式限外ろ過フィルター（メルクミリポア社）を用いて脱塩・濃縮した後、強陽イオン交換カラムであるＨｉＴｒａｐ ＳＰ ＨＰカラム（容量１ｍＬ、平均粒子径３４μｍ、Ｃｙｔｉｖａ社）に供した。バッファーＡを流速１ｍＬ／分で１０分間送液して平衡化したカラムに、試料全量（２ｍＬ）をサンプルループを使用して注入し、さらにバッファーＡをサンプルループを流路として６分間送液 した。バッファーＡでカラムを１８分間洗浄した後、０～２５０ｍＭ塩化ナトリウムの直線濃度勾配で４０分間（４０ｍＬ）送液し、タンパク質を分離・溶出させた。その後、速やかに塩化ナトリウム濃度を１Ｍまで上昇させて流速１ｍＬ／分で１８分間カラムを洗浄した後、バッファーＡを流速１ｍＬ／分で１０分間送液した。検出器の波長は２８０ｎｍとし、溶出溶液は自動フラクションコレクターを用いて、試料導入後の洗浄液（カラム非吸着画分）は２ｍＬずつ（２分間／本）、直線塩濃度勾配開始後は１ｍＬずつ（１分間／本）回収した。
【0063】
その結果を図４に示す。図４に示したような溶出クロマトグラムが得られたため、カラム非吸着画分である分画番号Ｆ１～Ｆ３、及び分画番号Ｆ１８～Ｆ２９（３８～１０６ｍＭ塩化ナトリウム溶出画分）について、次のＳＰカラムクロマトグラフィー溶出画分の抗糸状菌活性評価へ供した。
【0064】
（ＳＰカラムクロマトグラフィー溶出画分の抗糸状菌活性評価）
抗糸状菌活性評価は、上記の「抗真菌活性の評価１：糸状菌の菌糸生長阻害性評価」へ記載の方法に準じておこなった。
抗糸状菌活性評価は、上記の「抗真菌活性の評価１：糸状菌の菌糸生長阻害性評価」へ記載の方法に準じておこなった。
【0065】
その結果を図５に示す。図５に示したように、分画番号Ｆ２０～Ｆ２３（５０～６９ｍＭ塩化ナトリウム溶出画分）において、フザリウム・フジクロイＭＡＦＦ２３５９４９株に対する菌糸生長阻害作用が認められ、分画番号Ｆ２０～Ｆ２２では調査した最大の希釈倍率８倍まで、分画番号Ｆ２３では希釈倍率４倍まで、抗糸状菌活性を確認した（表３）。活性画分として回収した分画番号Ｆ２０～Ｆ２３の総タンパク質量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法による定量で、２．８６ｍｇであった。
【0066】
【表3】
【0067】
[凡例]
１）＋：活性あり、±：弱い活性あり、－：活性なし
２）ウェル位置：ＰＤＡアッセイプレート上のウェルの１つをＡとして固定し、右回りにＢ、Ｃ、Ｄとした。
１）＋：活性あり、±：弱い活性あり、－：活性なし
２）ウェル位置：ＰＤＡアッセイプレート上のウェルの１つをＡとして固定し、右回りにＢ、Ｃ、Ｄとした。
【0068】
（ＳＰカラムクロマトグラフィー溶出画分のタンパク質分子組成の確認）
タンパク質分子組成の確認は、上記「ＣＭカラムクロマトグラフィー溶出画分のタンパク質分子組成の確認」へ記載の方法に準じておこなった。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析の結果（図６）、分画番号Ｆ２０～Ｆ２３の活性画分のうち、分画番号Ｆ２０～Ｆ２２の電気泳動パターンは類似しており、また、分子量マーカー（図６、レーン「Ｍ」と表記）を参考にすると、約３５ｋＤａより低分子のタンパク質が抗糸状菌活性を示していることが示唆された。
タンパク質分子組成の確認は、上記「ＣＭカラムクロマトグラフィー溶出画分のタンパク質分子組成の確認」へ記載の方法に準じておこなった。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析の結果（図６）、分画番号Ｆ２０～Ｆ２３の活性画分のうち、分画番号Ｆ２０～Ｆ２２の電気泳動パターンは類似しており、また、分子量マーカー（図６、レーン「Ｍ」と表記）を参考にすると、約３５ｋＤａより低分子のタンパク質が抗糸状菌活性を示していることが示唆された。
【0069】
（Ｃａｐｔｏ ＨｉＲｅｓ Ｓカラムクロマトグラフィーによる分画）
ＳＰカラムクロマトグラフィーで回収した分画番号Ｆ２０～Ｆ２３の溶液を、アミコンウルトラ遠心式限外ろ過フィルター（メルクミリポア社）を用いて脱塩・濃縮した後、高分離能の強陽イオン交換カラムであるＣａｐｔｏ ＨｉＲｅｓ Ｓ ５／５０カラム（容量１ｍＬ、平均粒子径９μｍ、Ｃｙｔｉｖａ社）に供した。
ＳＰカラムクロマトグラフィーで回収した分画番号Ｆ２０～Ｆ２３の溶液を、アミコンウルトラ遠心式限外ろ過フィルター（メルクミリポア社）を用いて脱塩・濃縮した後、高分離能の強陽イオン交換カラムであるＣａｐｔｏ ＨｉＲｅｓ Ｓ ５／５０カラム（容量１ｍＬ、平均粒子径９μｍ、Ｃｙｔｉｖａ社）に供した。
【0070】
バッファーＡを流速０．５ｍＬ／分で２０分間送液して平衡化したカラムに、試料全量（２ｍＬ）をサンプルループを使用して注入し、さらにバッファーＡをサンプルループを流路として１２分間送液した。バッファーＡでカラムを４０分間洗浄した後、０～１５０ｍＭ塩化ナトリウムの直線濃度勾配で８０分間（４０ｍＬ）送液し、タンパク質を分離・溶出させた。その後、速やかに塩化ナトリウム濃度を１Ｍまで上昇させて流速０．５ｍＬ／分で２０分間カラムを洗浄した後、バッファーＡを流速０．５ｍＬ／分で１０分間送液した。検出器の波長は２８０ｎｍとし、溶出溶液は自動フラクションコレクターを用いて、試料導入後の洗浄液（カラム非吸着画分）は２ｍＬずつ（４分間／本）、直線塩濃度勾配開始後は１ｍＬずつ（２分間／本）回収した。
【0071】
その結果、図７に示したような溶出クロマトグラムが得られたため、分画番号Ｆ１７～Ｆ３１（１５～６８ｍＭ塩化ナトリウム溶出画分）について、次の「Ｃａｐｔｏ ＨｉＲｅｓ Ｓカラムクロマトグラフィー溶出画分の抗糸状菌活性評価」へ供した。
【0072】
（Ｃａｐｔｏ ＨｉＲｅｓ Ｓカラムクロマトグラフィー溶出画分の抗糸状菌活性評価）
抗糸状菌活性評価は、上記の「抗真菌活性の評価１：糸状菌の菌糸生長阻害性評価」へ記載の方法に準じておこなった。
抗糸状菌活性評価は、上記の「抗真菌活性の評価１：糸状菌の菌糸生長阻害性評価」へ記載の方法に準じておこなった。
【0073】
その結果、分画番号Ｆ１９～Ｆ２１（２３～３０ｍＭ塩化ナトリウム溶出画分）において、フザリウム・フジクロイＭＡＦＦ２３５９４９株に対する菌糸生長阻害作用が認められ（図８）、調査した最大の希釈倍率４倍、タンパク質量１．１μｇ／ウェルでもはっきりとした抗糸状菌活性を確認した（表４）。活性画分として回収した分画番号Ｆ１９～Ｆ２１の総タンパク質量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法による定量で０．１８７ｍｇであった。本タンパク質量は、ここまでの一連の精製による抗糸状菌活性ポリペプチドの最終収量であり、タンパク質量としての回収率は０．０３４％ であった。
【0074】
【表4】
【0075】
[凡例]
１）＋：活性あり、－：活性なし
２）ウェル位置：ＰＤＡアッセイプレート上のウェルの１つをＡとして固定し、右回りにＢ、Ｃ、Ｄとした。
１）＋：活性あり、－：活性なし
２）ウェル位置：ＰＤＡアッセイプレート上のウェルの１つをＡとして固定し、右回りにＢ、Ｃ、Ｄとした。
【0076】
（Ｃａｐｔｏ ＨｉＲｅｓ Ｓカラムクロマトグラフィー溶出画分のタンパク質分子組成の確認）
タンパク質分子組成の確認は、上記「ＣＭカラムクロマトグラフィー溶出画分のタンパク質分子組成の確認」へ記載の方法に準じておこなった。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析の結果、分画番号Ｆ１９～Ｆ２１では単一のタンパク質バンドが検出されており、分子量マーカー（図９、レーン「Ｍ」と表記）を参考にすると、およそ１０ｋＤａ近傍のポリペプチドが、抗糸状菌活性物質として精製されたことが示された（図９）。
タンパク質分子組成の確認は、上記「ＣＭカラムクロマトグラフィー溶出画分のタンパク質分子組成の確認」へ記載の方法に準じておこなった。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析の結果、分画番号Ｆ１９～Ｆ２１では単一のタンパク質バンドが検出されており、分子量マーカー（図９、レーン「Ｍ」と表記）を参考にすると、およそ１０ｋＤａ近傍のポリペプチドが、抗糸状菌活性物質として精製されたことが示された（図９）。
【0077】
[実施例２]１０ｋＤａ抗糸状菌ポリペプチドのアミノ酸配列情報の分析
（精製タンパク質のＮ末端アミノ酸配列の分析と相同性検索）
実施例１で得られた分子量約１０ｋＤａの抗糸状菌タンパク質について、精製標品（Ｃａｐｔｏ ＨｉＲｅｓ Ｓカラムクロマトグラフィー分画番号Ｆ２０を使用した）を用いて、Ｎ末端アミノ酸配列を分析した。
（精製タンパク質のＮ末端アミノ酸配列の分析と相同性検索）
実施例１で得られた分子量約１０ｋＤａの抗糸状菌タンパク質について、精製標品（Ｃａｐｔｏ ＨｉＲｅｓ Ｓカラムクロマトグラフィー分画番号Ｆ２０を使用した）を用いて、Ｎ末端アミノ酸配列を分析した。
【0078】
タンパク質量として８．１μｇの分画番号Ｆ２０の溶液をＳＤＳ－ＰＡＧＥに供し、電気泳動後のポリアクリルアミドゲルから、タンク式ブロッティング装置（ミニトランスブロットセル、バイオラッド・ラボラトリーズ社）を用いて、タンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－ＰＳＱメンブレン、０．２μｍ、メルク社）に転写した。転写後のＰＶＤＦ膜は、５０％メタノールに溶解した０．１％クマシーブリリアントブルーＲ２５０溶液中でゆるやかに振盪しながら２分間染色した後、５０％メタノールで脱色し、さらに超純水で洗浄して膜上の余分な色素を除いた。その後、１８時間乾燥させたＰＶＤＦ膜から分子量約１０ｋＤａのタンパク質バンドを切り出し、Ｎ末端アミノ酸配列分析へ供した。
【0079】
Ｎ末端アミノ酸配列分析は、気相シークエンサー（４９１ｃＬｃ、アプライドバイオシステム社）を使用して、自動エドマン分解によりおこなった。機器の取り扱いと諸設定は、製造販売元の指定する手順書にしたがっておこなった。その結果、以下に示す１３残基のＮ末端アミノ酸配列が得られた。
Ｎ末端側 ＥＴＳＹＧＮＰＤＬＶＴＤＱ（配列番号３）
Ｎ末端側 ＥＴＳＹＧＮＰＤＬＶＴＤＱ（配列番号３）
【0080】
この１３残基の部分アミノ酸配列について、米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）が提供するＢＬＡＳＴ検索システムによるアミノ酸配列相同性検索をおこなった結果、相同性１００％として、以下に示すＨｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ＲＨＳ０４＿００５２５［Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ］、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＫＡＦ８６８５６４６．１が提示された。
【0081】
Ｎ末端側 ＭＫＲＨＰＫＫＹＱＴＥＴＴＤＡＶＡＡＳＲＬＫＬＴＦＱＡＨＴＮＳＡＭＦＳＳＡＨＬＡＦＦＡＡＡＡＡＡＬＶＡＡＳＰＶＴＥＬＥＧＱＴＬＡＫＲＥＴＳＹＧＮＰＤＬＶＴＤＱＧＮＲＦＫＬＮＦＧＳＴＤＧＨＰＮＡＣＰＧＨＹＩＣＹＩＳＫＮＧＡＱＨＧＤＶＳＬＧＮＰＤＤＦＶＤＥＧＮＲＷＡＴＰＥＬＷ（配列番号４）
【0082】
上記アミノ酸配列内の下線は、配列番号３と相同性１００％の配列を示した。この相同性検索の結果から、本ポリペプチドは生体機能が未知のタンパク質と高い相同性を示すことが明らかとなり、抗糸状菌ポリペプチドとして新規であることが強く示唆された。
【0083】
（リゾクトニア・ソラニＤ１３８株の全ゲノム情報に基づく１０ｋＤａ抗糸状菌ポリペプチド配列の推定）
上記の精製タンパク質のアミノ酸配列分析から得られた情報に基づく解析に加えて、本ポリペプチド生産株であるリゾクトニア・ソラニＤ１３８株の全ゲノム配列を決定し、その情報を基にした解析も試みた。
上記の精製タンパク質のアミノ酸配列分析から得られた情報に基づく解析に加えて、本ポリペプチド生産株であるリゾクトニア・ソラニＤ１３８株の全ゲノム配列を決定し、その情報を基にした解析も試みた。
【0084】
全ゲノム配列解析に使用したゲノムＤＮＡは、以下のように調製した。リゾクトニア・ソラニＤ１３８株は、ＰＤＡ斜面培地で継代されてきた種株から菌糸体の一部を掻き取り、これをＰＤＡ平面培地へ播種して３０℃で約８日間培養した。次に、このＰＤＡ平面培地へ４ｍＬの滅菌純水を加えてスプレッダーで懸濁し、一部を１．５ｍＬのマイクロチューブへ回収した。続いて、このマイクロチューブを６０００×ｇ、４℃、５分間遠心して上清を除いた。残った菌糸体の沈殿物へ５μＬの滅菌純水を再び加えた全量を、破砕用のステンレスビーズが入ったチューブへ再回収した。これにＬｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｆ（ニッポンジーン社）を加え、Ｓｈａｋｅ Ｍａｓｔｅｒ Ｎｅｏ（ｂｍｓ社）を用い、１５００ｒｐｍで２分間粉砕した。破砕した試料は、６５℃で１０分間インキュベートし、その後、１２０００×ｇで２分間遠心分離をおこなって上清を回収した。ＭＰｕｒｅ－１２システムとＭＰｕｒｅ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（共にＭＰ Ｂｉｏ社）を用いて回収した上清からＤＮＡを精製した。
【0085】
ライブラリー作製のために、まずＳｙｎｅｒｇｙ ＬＸ（Ｂｉｏ Ｔｅｋ社）とＱｕａｎｔｉＦｌｕｏｒ ｄｓＤＮＡ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いて、上記で調製したゲノムＤＮＡ溶液の濃度を測定した。次に、ＭＧＩＥａｓｙ ＦＳ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｓｅｔ（ＭＧＩ社）を用いて、製造販売元の手順書にしたがってライブラリーを作製した。酵素切断の反応時間は４分間とした。また、その際にＭＧＩＥａｓｙ ＤＮＡ Ａｄａｐｔｅｒｓ－９６（Ｐｌａｔｅ）Ｋｉｔ（ＭＧＩ社）のアダプターを使用した。ライブラリーの定量は、Ｑｕｂｉｔ ３．０ ＦｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒとｄｓＤＮＡ ＨＳ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（共にＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）を用いておこなった。ライブラリーの品質確認は、Ｆｒａｇｍｅｎｔ ＡｎａｌｙｚｅｒとｄｓＤＮＡ ９１５ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ（共にＡｄｖａｎｃｅｄ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いておこなった。環状化ＤＮＡは、作製したライブラリとＭＧＩＥａｓｙ Ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＭＧＩ社）を用いて製造販売元の指示書にしたがって作製した。ＤＮＡ Ｎａｎｏｂａｌｌ（以下、「ＤＮＢ」）は、ＤＮＢＳＥＱ－Ｇ４００ＲＳ Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｅｔ（ＭＧＩ社）を用いて、製造販売元の指示書にしたがって作製した。ＤＮＡシークエンスは、ＤＮＢＳＥＱ－Ｇ４００（ＭＧＩ社）を用いて、２×２００ｂｐの条件の下、上記で作製したＤＮＢを基に解析した。結果は、表５－１および表５－２へ示した。
【0086】
【表5-1】
【0087】
【表5-2】
【0088】
ＤＮＢシークエンス情報を用いて次のような手順で解析をおこなった。まずＦａｓｔＱＣ１ ｖ０．１１．８を用いて、ペアエンド・リード配列の生データの品質を確認し、次にＣｕｔａｄａｐｔ２ ｖ３．４を用いて、ＤＮＢＳＥＱアダプター配列のトリミングをおこなった。さらにトリミングされたリード配列を、ＳＰＡｄｅｓ３ ｖ３．１２．０を用いてアセンブルした。以上の品質確認やトリミング、およびアッセンブルの作業は、Ｇａｌａｘｙ４（サムソン社）のローカルサーバー上で実行した。遺伝子予測と機能アノテーションの作業は、Ｆｕｎａｎｎｏｔａｔｅ５ ｐｉｐｅｌｉｎｅ ｖ１．８．１０を用いて実行した。
【0089】
以上の方法から導き出されたＤ１３８株の全ゲノム配列の情報を基に予測された遺伝子のアミノ酸配列に対し、上記配列番号３を用いて、ＢＬＡＳＴ検索システムによるアミノ酸相同性検索をおこなったところ、相同性１００％として「ＦＵＮ＿００９１５８－Ｔ１ ＦＵＮ＿００９１５８」が提示された。提示されたアミノ酸配列及びＤＮＡ配列をそれぞれ以下に示す。アミノ酸配列内の下線は配列番号３と相同性１００％の配列を示す。
【0090】
Ｎ末端側 ＭＦＳＳＡＨＬＡＦＦＡＡＡＡＡＡＬＶＡＡＳＰＶＴＥＬＥＧＱＴＬＡＫＲＥＴＳＹＧＮＰＤＬＶＴＤＱＧＮＲＦＫＬＮＦＧＳＴＤＧＨＰＮＡＣＰＧＨＹＩＣＹＩＳＫＮＧＡＱＨＧＤＶＳＬＧＮＰＤＤＦＶＤＥＧＮＲＷＡ（配列番号５）
【0091】
５’－ＡＴＧＴＴＴＴＣＣＴＣＴＧＣＴＣＡＴＣＴＣＧＣＴＴＴＣＴＴＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＧＣＴＣＴＴＧＴＴＧＣＴＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＣＡＣＴＧＡＧＣＴＣＧＡＡＧＧＡＣＡＧＡＣＴＣＴＴＧＣＣＡＡＧＣＧＣＧＡＧＡＣＧＴＣＡＴＡＣＧＧＣＡＡＴＣＣＣＧＡＣＴＴＧＧＴＡＡＣＴＧＡＣＣＡＧＧＧＣＡＡＴＣＧＣＴＴＣＡＡＧＣＴＣＡＡＣＴＴＴＧＧＣＡＧＣＡＣＣＧＡＣＧＧＣＣＡＣＣＣＧＡＡＣＧＣＧＴＧＴＣＣＣＧＧＡＣＡＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＴＡＣＡＴＣＴＣＡＡＡＧＡＡＣＧＧＡＧＣＣＣＡＡＣＡＴＧＧＣＧＡＣＧＴＣＴＣＴＣＴＣＧＧＣＡＡＴＣＣＣＧＡＣＧＡＣＴＴＴＧＴＡＧＡＴＧＡＧＧＧＣＡＡＣＣＧＴＴＧＧＧＣＡＡ－３’（配列番号６）
【0092】
本結果は、新規な抗糸状菌ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が、Ｄ１３８株の全ゲノム情報内のコンティグ配列の中に予測されており、Ｄ１３８株が本抗糸状菌ポリペプチドを産生する遺伝子を確実に有していることを示した。なお、本抗糸状菌ポリペプチドは、リゾクトニア・ソラニから分泌されるが、リゾクトニア・ソラニＤ１３８株からの分泌に限定されない。
【0093】
[実施例３]１０ｋＤａ抗糸状菌ポリペプチドのｃＤＮＡ配列の解析
（Ｄ１３８株培養菌体からのＲＮＡ調製）
１０ｋＤａ抗糸状菌ポリペプチドのｃＤＮＡ解析のため、リゾクトニア・ソラニＤ１３８株からＲＮＡを以下のように調製した。１０ｋＤａ抗糸状菌ポリペプチドが得られた分泌物質試料調製の培養条件である、特許文献１に記載されたふすまを固体培地とした培養方法に従ってリゾクトニア・ソラニＤ１３８株を培養した。本培養２日目、６日目、および９日目の菌糸が生育したふすま培養物から、ＭＮ Ｂｅａｄ Ｔｕｂｅｓ Ｔｙｐｅ Ｃ及びＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＲＮＡ Ｐｌａｎｔ ａｎｄ Ｆｕｎｇｉ キット（いずれもＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬ社製）を用い、製造販売元の指示書に従ってＲＮＡ溶液を調製した（表６）。
（Ｄ１３８株培養菌体からのＲＮＡ調製）
１０ｋＤａ抗糸状菌ポリペプチドのｃＤＮＡ解析のため、リゾクトニア・ソラニＤ１３８株からＲＮＡを以下のように調製した。１０ｋＤａ抗糸状菌ポリペプチドが得られた分泌物質試料調製の培養条件である、特許文献１に記載されたふすまを固体培地とした培養方法に従ってリゾクトニア・ソラニＤ１３８株を培養した。本培養２日目、６日目、および９日目の菌糸が生育したふすま培養物から、ＭＮ Ｂｅａｄ Ｔｕｂｅｓ Ｔｙｐｅ Ｃ及びＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＲＮＡ Ｐｌａｎｔ ａｎｄ Ｆｕｎｇｉ キット（いずれもＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬ社製）を用い、製造販売元の指示書に従ってＲＮＡ溶液を調製した（表６）。
【0094】
【表6】
【0095】
（３’－ＲＡＣＥ法による１０ｋＤａ抗糸状菌ポリペプチドｃＤＮＡの３’－側配列の解析）
ｃＤＮＡ配列の解析にはＲａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ（ＲＡＣＥ）法を用い、３’－ＲＡＣＥ法による３’－側配列の解析、および５’－ＲＡＣＥ法による５’－側配列の解析の２段階によりｃＤＮＡ全長配列を解析した。
ｃＤＮＡ配列の解析にはＲａｐｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃＤＮＡ Ｅｎｄｓ（ＲＡＣＥ）法を用い、３’－ＲＡＣＥ法による３’－側配列の解析、および５’－ＲＡＣＥ法による５’－側配列の解析の２段階によりｃＤＮＡ全長配列を解析した。
【0096】
まず、３’－側配列の解析を、ＳＭＡＲＴｅｒ（登録商標）ＲＡＣＥ５’／３’Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ社製）を用いて、製造販売元の指示書に従って実施した。上記「Ｄ１３８株培養菌体からのＲＮＡ調製」で得た、培養２日目、６日目、および９日目のｔｏｔａｌ ＲＮＡ、０．７μｇ、０．９μｇ、および１μｇのそれぞれを使用して、３’－ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙ １ｓｔ－ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを指示書に従い合成した。
【0097】
次に、合成した各３’－ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡを鋳型として３’－ＲＡＣＥ ＰＣＲを指示書に従い行った。プライマーセットは、キット付属のＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ｍｉｘと、上記実施例２で得られた１０ｋＤａ抗糸状菌ポリペプチドのＮ末端アミノ酸配列情報を基に合成したプライマーＰ１０－Ｎ１－Ｆ（配列番号７）を使用し、反応条件は［９４℃、１分間→（９４℃、３０秒→７２℃、２分間）を５サイクル→（９４℃、３０秒→７０℃、３０秒→７２℃、２分間）を５サイクル→（９４℃、３０秒→６８℃、３０秒→７２℃、２分間）を２５サイクル］で実施した。
【0098】
プライマーＰ１０－Ｎ１－Ｆ：５’－ＧＡＴＴＡＣＧＣＣＡＡＧＣＴＴＧＡＧＡＣＧＴＣＡＴＡＣＧＧＣＡＡＴＣＣＣＧＡ－３’（配列番号７）
【0099】
その結果、Ｄ１３８株のふすま培養物、２日目、６日目、または９日目から調製したＲＮＡ由来のいずれの１ｓｔ－ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを鋳型とした３’－ＲＡＣＥ ＰＣＲ反応においても、約４５０ｂｐの増幅産物が認められ、塩基配列の解析により１０ｋＤａ抗糸状菌ポリペプチドのＣ末端側をコードする領域とポリＡテイルまでの配列が明らかとなった（図１０参照）。
【0100】
（５’－ＲＡＣＥ法による１０ｋＤａ抗糸状菌ポリペプチドｃＤＮＡの５’－側未知領域配列の解析）
上記「３’－ＲＡＣＥ法による１０ｋＤａ抗糸状菌ポリペプチドｃＤＮＡの３’－側配列の解析」により得られた３’－側の約４５０ｂｐの配列を利用して、５’－側の未知領域配列の解析を５’－Ｆｕｌｌ ＲＡＣＥ Ｃｏｒｅ Ｓｅｔ（タカラバイオ社製）を用いて製造販売元の指示書に従って行った。
上記「３’－ＲＡＣＥ法による１０ｋＤａ抗糸状菌ポリペプチドｃＤＮＡの３’－側配列の解析」により得られた３’－側の約４５０ｂｐの配列を利用して、５’－側の未知領域配列の解析を５’－Ｆｕｌｌ ＲＡＣＥ Ｃｏｒｅ Ｓｅｔ（タカラバイオ社製）を用いて製造販売元の指示書に従って行った。
【0101】
上記「Ｄ１３８株培養菌体からのＲＮＡ調製」で得た、培養２日目、６日目、および９日目のｔｏｔａｌ ＲＮＡ、０．９μｇ、１．１μｇ、および１．２μｇのそれぞれを使用し、３’－ＲＡＣＥ法で得た１０ｋＤａ抗糸状菌ポリペプチドｃＤＮＡの既知配列を基に作製した５’末端リン酸化ＲＴ－プライマー（Ｐ１０－３ｅｎｄ＿３－ＲＰ：配列番号８）を用いて１ｓｔ－ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡを合成した。
【0102】
５’末端リン酸化プライマーＰ１０－３ｅｎｄ＿３－ＲＰ：５’－（Ｐ）ＧＧＧＡＡＡＴＧＡＣＧＡＧＴＴ－３’（配列番号８）
【0103】
次に、ＲＮａｓｅＨ処理によりｈｙｂｒｉｄ ＲＮＡを分解した後、Ｔ４ ＲＮＡ ｌｉｇａｓｅにより一本鎖ｃＤＮＡを環状化（またはコンカテマー化）させた。これを鋳型として、既知領域に作製したプライマーを用い、５’側の未知領域の増幅をインバースＰＣＲにより行った。ＰＣＲ酵素にはＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑを使用し、１ｓｔ ＰＣＲをプライマーセットＰ１０－Ｄ５９－Ｆ（配列番号９）とＰ１０－Ｇ４７－Ｒ（配列番号１０）を用いて、反応条件［９４℃、３分間→（９４℃、３０秒→６８℃、３０秒→７２℃、１分間）を２５サイクル→７２℃、３分間］で実施した。
【0104】
プライマー Ｐ１０－Ｄ５９－Ｆ
５’－ＡＴＧＡＧＧＧＣＡＡＣＣＧＴＴＧＧＣＧＣＣＴＧ－３’（配列番号９）
５’－ＡＴＧＡＧＧＧＣＡＡＣＣＧＴＴＧＧＣＧＣＣＴＧ－３’（配列番号９）
【0105】
プライマー Ｐ１０－Ｇ４７－Ｒ
５’－ＣＣＡＴＧＴＴＧＧＧＣＴＣＣＧＴＴＣＴＴＴＧＡ－３’（配列番号１０）
５’－ＣＣＡＴＧＴＴＧＧＧＣＴＣＣＧＴＴＣＴＴＴＧＡ－３’（配列番号１０）
【0106】
さらに、１ｓｔ ＰＣＲ反応溶液の原液または１０倍希釈液の１μＬを２５μＬの反応系に鋳型として添加し、２ｎｄ ＰＣＲを下記のＡ～Ｅの５種類のプライマーセットを用いて、反応条件［９４℃、３分間→（９４℃、３０秒→６８℃、３０秒→７２℃、１分間）を３０サイクル→７２℃、３分間］で実施した。
【0107】
５種類のプライマーセット
Ａ：Ｐ１０－Ｄ５９－Ｆ／Ｐ１０－Ｓ２３－Ｒ（配列番号１１）
Ｂ：Ｐ１０－Ｄ５９－Ｆ／Ｐ１０－Ｆ１７－Ｒ（配列番号１２）
Ｃ：Ｐ１０－Ｙ８２－Ｆ（配列番号１３）／Ｐ１０－Ｇ４７－Ｒ
Ｄ：Ｐ１０－Ｙ８２－Ｆ／Ｐ１０－Ｓ２３－Ｒ
Ｅ：Ｐ１０－Ｙ８２－Ｆ／Ｐ１０－Ｆ１７－Ｒ
Ａ：Ｐ１０－Ｄ５９－Ｆ／Ｐ１０－Ｓ２３－Ｒ（配列番号１１）
Ｂ：Ｐ１０－Ｄ５９－Ｆ／Ｐ１０－Ｆ１７－Ｒ（配列番号１２）
Ｃ：Ｐ１０－Ｙ８２－Ｆ（配列番号１３）／Ｐ１０－Ｇ４７－Ｒ
Ｄ：Ｐ１０－Ｙ８２－Ｆ／Ｐ１０－Ｓ２３－Ｒ
Ｅ：Ｐ１０－Ｙ８２－Ｆ／Ｐ１０－Ｆ１７－Ｒ
【0108】
Ｐ１０－Ｓ２３－Ｒ
５’－ＧＣＴＧＣＣＡＡＡＧＴＴＧＡＧＣＴＴＧＡＡＧＣ－３’（配列番号１１）
Ｐ１０－Ｆ１７－Ｒ
５’－ＡＡＧＣＧＡＴＴＧＣＣＣＴＧＧＴＣＡＧＴＴＡＣ－３’（配列番号１２）
Ｐ１０－Ｙ８２－Ｆ
５’－ＣＡＴＣＴＧＣＴＡＴＡＴＣＡＧＣＡＡＧＴＧＡＡＣ－３’（配列番号１３）
５’－ＧＣＴＧＣＣＡＡＡＧＴＴＧＡＧＣＴＴＧＡＡＧＣ－３’（配列番号１１）
Ｐ１０－Ｆ１７－Ｒ
５’－ＡＡＧＣＧＡＴＴＧＣＣＣＴＧＧＴＣＡＧＴＴＡＣ－３’（配列番号１２）
Ｐ１０－Ｙ８２－Ｆ
５’－ＣＡＴＣＴＧＣＴＡＴＡＴＣＡＧＣＡＡＧＴＧＡＡＣ－３’（配列番号１３）
【0109】
その結果、ふすま培養９日目のｔｏｔａｌ ＲＮＡを使用して一連の反応を行った試料において、上記Ａ～Ｅの各プライマーセットを用いた２ｎｄ ＰＣＲ反応で、Ａ：約３４０ｂｐ、Ｂ：約３２０ｂｐ、Ｃ：約３４０ｂｐ、Ｄ：約２７０ｂｐ、Ｅ：約２５０ｂｐの増幅産物が得られた。塩基配列解析の結果、各ＰＣＲ増幅産物は１０ｋＤａ抗糸状菌ポリペプチドｃＤＮＡの５’側未知領域をコードしており、上記の３’－ＲＡＣＥ解析結果と合わせて、１０ｋＤａ抗糸状菌ポリペプチドｃＤＮＡの全長が明らかとなった（図１０参照）。この配列内の下線部は５’－ＲＡＣＥ法で、それ以外は３’－ＲＡＣＥ法でそれぞれ明らかとなった配列を示す。
【0110】
１０ｋＤａ抗糸状菌ポリペプチドｃＤＮＡの全長配列（配列番号２）
５’－ＡＴＣＣＡＡＣＡＧＡＴＣＴＣＧＴＣＴＣＡＡＧＣＴＣＡＣＴＴＴＣＣＡＡＧＣＡＣＡＣＡＣＣＡＡＣＴＣＡＧＣＣＡＴＧＴＴＴＴＣＣＴＣＴＧＣＴＣＡＴＣＴＣＧＣＴＴＴＣＴＴＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＧＣＴＣＴＴＧＴＴＧＣＴＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＣＡＣＴＧＡＧＣＴＣＧＡＡＧＧＡＣＡＧＡＣＴＣＴＴＧＣＣＡＡＧＣＧＣＧＡＧＡＣＧＴＣＡＴＡＣＧＧＣＡＡＴＣＣＣＧＡＣＴＴＧＧＴＡＡＣＴＧＡＣＣＡＧＧＧＣＡＡＴＣＧＣＴＴＣＡＡＧＣＴＣＡＡＣＴＴＴＧＧＣＡＧＣＡＣＣＧＡＣＧＧＣＣＡＣＣＣＧＡＡＣＧＣＧＴＧＴＣＣＣＧＧＡＣＡＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＴＡＣＡＴＣＴＣＡＡＡＧＡＡＣＧＧＡＧＣＣＣＡＡＣＡＴＧＧＣＧＡＣＧＴＣＴＣＴＣＴＣＧＧＣＡＡＴＣＣＣＧＡＣＧＡＣＴＴＴＧＴＡＧＡＴＧＡＧＧＧＣＡＡＣＣＧＴＴＧＧＣＧＣＣＴＧＡＡＣＴＡＴＧＧＴＡＧＣＡＣＣＧＡＴＧＧＡＣＡＣＣＣＧＡＡＣＧＣＣＴＧＣＣＣＴＧＧＡＣＡＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＴＡＴＡＴＣＡＧＣＡＡＧＴＧＡＡＣＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＡＡＣＴＣＧＴＣＡＴＴＴＣＣＣＧＣＡＧＴＴＴＣＣＴＴＴＡＴＧＴＴＴＧＴＡＴＴＡＣＴＴＣＴＣＡＧＴＴＡＡＡＴＣＡＡＣＣＡＴＡＧＧＡＡＡＴＡＴＡＧＣＴＡＴＣＴＴＴＡＡＣＡＣＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ－３’
５’－ＡＴＣＣＡＡＣＡＧＡＴＣＴＣＧＴＣＴＣＡＡＧＣＴＣＡＣＴＴＴＣＣＡＡＧＣＡＣＡＣＡＣＣＡＡＣＴＣＡＧＣＣＡＴＧＴＴＴＴＣＣＴＣＴＧＣＴＣＡＴＣＴＣＧＣＴＴＴＣＴＴＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＣＧＣＴＣＴＴＧＴＴＧＣＴＧＣＡＡＧＣＣＣＴＧＴＣＡＣＴＧＡＧＣＴＣＧＡＡＧＧＡＣＡＧＡＣＴＣＴＴＧＣＣＡＡＧＣＧＣＧＡＧＡＣＧＴＣＡＴＡＣＧＧＣＡＡＴＣＣＣＧＡＣＴＴＧＧＴＡＡＣＴＧＡＣＣＡＧＧＧＣＡＡＴＣＧＣＴＴＣＡＡＧＣＴＣＡＡＣＴＴＴＧＧＣＡＧＣＡＣＣＧＡＣＧＧＣＣＡＣＣＣＧＡＡＣＧＣＧＴＧＴＣＣＣＧＧＡＣＡＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＴＡＣＡＴＣＴＣＡＡＡＧＡＡＣＧＧＡＧＣＣＣＡＡＣＡＴＧＧＣＧＡＣＧＴＣＴＣＴＣＴＣＧＧＣＡＡＴＣＣＣＧＡＣＧＡＣＴＴＴＧＴＡＧＡＴＧＡＧＧＧＣＡＡＣＣＧＴＴＧＧＣＧＣＣＴＧＡＡＣＴＡＴＧＧＴＡＧＣＡＣＣＧＡＴＧＧＡＣＡＣＣＣＧＡＡＣＧＣＣＴＧＣＣＣＴＧＧＡＣＡＣＴＡＣＡＴＣＴＧＣＴＡＴＡＴＣＡＧＣＡＡＧＴＧＡＡＣＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＡＡＣＴＣＧＴＣＡＴＴＴＣＣＣＧＣＡＧＴＴＴＣＣＴＴＴＡＴＧＴＴＴＧＴＡＴＴＡＣＴＴＣＴＣＡＧＴＴＡＡＡＴＣＡＡＣＣＡＴＡＧＧＡＡＡＴＡＴＡＧＣＴＡＴＣＴＴＴＡＡＣＡＣＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ－３’
【0111】
１０ｋＤａ抗糸状菌ポリペプチドｃＤＮＡの全長配列について、３’側のポリＡ部分を除く配列についてＢＬＡＳＴ検索を行った結果、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ ｕｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＲｈｉＸＮ＿０９３２７），ｐａｒｔｉａｌ ｍＲＮＡ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ番号：ＸＭ＿０４３３２９１４３．１）と９３．９５％、Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ ｕｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＲｈｉＸＮ＿０９３２８），ｐａｒｔｉａｌ ｍＲＮＡ（同：ＸＭ＿０４３３２９１４４．１）と９９．１２％、それぞれ一致していた。
【0112】
また、上記のｃＤＮＡ配列より明らかとなった１０ｋＤａ抗糸状菌ポリペプチドのアミノ酸配列全長、１２２アミノ酸残基を、配列番号１４に示した。シグナルペプチドと推測される配列（配列番号１４中の下線部）を除いた、精製タンパク質のＮ末端アミノ酸配列（上掲の配列番号３）以降の成熟タンパク質は８８アミノ酸残基から成り、推定分子量は９６４８．２４であった。
【0113】
１０ｋＤａ抗糸状菌ポリペプチドのアミノ酸配列全長
Ｎ末端側 ＭＦＳＳＡＨＬＡＦＦＡＡＡＡＡＡＬＶＡＡＳＰＶＴＥＬＥＧＱＴＬＡＫＲＥＴＳＹＧＮＰＤＬＶＴＤＱＧＮＲＦＫＬＮＦＧＳＴＤＧＨＰＮＡＣＰＧＨＹＩＣＹＩＳＫＮＧＡＱＨＧＤＶＳＬＧＮＰＤＤＦＶＤＥＧＮＲＷＲＬＮＹＧＳＴＤＧＨＰＮＡＣＰＧＨＹＩＣＹＩＳＫ（配列番号１４）
Ｎ末端側 ＭＦＳＳＡＨＬＡＦＦＡＡＡＡＡＡＬＶＡＡＳＰＶＴＥＬＥＧＱＴＬＡＫＲＥＴＳＹＧＮＰＤＬＶＴＤＱＧＮＲＦＫＬＮＦＧＳＴＤＧＨＰＮＡＣＰＧＨＹＩＣＹＩＳＫＮＧＡＱＨＧＤＶＳＬＧＮＰＤＤＦＶＤＥＧＮＲＷＲＬＮＹＧＳＴＤＧＨＰＮＡＣＰＧＨＹＩＣＹＩＳＫ（配列番号１４）
【0114】
[実施例４]遺伝子組換え型１０ｋＤａ抗糸状菌ポリペプチドの発現系構築と組換えタンパク質による糸状菌生育阻害活性
（１０ｋＤａ抗糸状菌ポリペプチド発現用プラスミドの構築）
１０ｋＤａ抗糸状菌ポリペプチド発現用のプラスミドは、市販のタンパク質発現用ベクターであるｐＥＴ－１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社；Ｔ７プロモーター制御、アンピシリン耐性）を基に構築した。
（１０ｋＤａ抗糸状菌ポリペプチド発現用プラスミドの構築）
１０ｋＤａ抗糸状菌ポリペプチド発現用のプラスミドは、市販のタンパク質発現用ベクターであるｐＥＴ－１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社；Ｔ７プロモーター制御、アンピシリン耐性）を基に構築した。
【0115】
まず、８８アミノ酸残基の成熟タンパク質のＮ末端に開始メチオニンを付加した１０ｋＤａ抗糸状菌ポリペプチド遺伝子とその下流域を含むＤＮＡ断片を、以下の条件のＰＣＲで増幅した。上記[実施例３]の「３’－ＲＡＣＥ法による１０ｋＤａ抗糸状菌ポリペプチドｃＤＮＡの３’－側配列の解析」で合成した３’－ＲＡＣＥ－Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡを鋳型とし、プライマーｉＦｐＥＴ＿ｐ１０（Ｍｅｔ）－Ｆｗ（配列番号１５）とｉＦｐ１０（ｅｎｄ－２）＿ｐＥＴ－Ｒｖ（配列番号１６）を使用して、反応条件［９４℃、１分間→（９４℃、３０秒→７２℃、２分間）を５サイクル→（９４℃、３０秒→７０℃、３０秒→７２℃、２分間）を５サイクル→（９４℃、３０秒→６８℃、３０秒→７２℃、２分間）を２５サイクル］でＰＣＲを実施した。得られた約３００ｂｐのＤＮＡ断片をＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ＆ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐ Ｋｉｔ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ－ＮＡＧＥＬ社製）を使用して精製した後、制限酵素ＮｃｏＩ及びＮｄｅＩで切断したｐＥＴ－１５ｂベクターに、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｈｅｃｈ社製）を用いてクローニングした。これにより、成熟タンパク質８８残基に開始メチオニン残基が付加された１０ｋＤａ抗糸状菌ポリペプチド発現用プラスミドｐＥｐ１０を得た。図１１及び配列番号１７に１０ｋＤａ抗糸状菌ポリペプチド発現ベクターのインサート及びその周辺配列を示す。
【0116】
プライマーｉＦｐＥＴ＿ｐ１０（Ｍｅｔ）－Ｆｗ：
５’－（ＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧ）ＧＡＧＡＣＧＴＣＡＴＡＣＧＧＣＡＡＴＣＣＣＧＡ－３’（配列番号１５）（下線：制限酵素ＮｃｏＩ認識配列、この配列内のＡＴＧは開始メチオニンコドン）
５’－（ＡＧＧＡＧＡＴＡＴＡＣＣＡＴＧ）ＧＡＧＡＣＧＴＣＡＴＡＣＧＧＣＡＡＴＣＣＣＧＡ－３’（配列番号１５）（下線：制限酵素ＮｃｏＩ認識配列、この配列内のＡＴＧは開始メチオニンコドン）
【0117】
プライマーｉＦｐ１０（ｅｎｄ－２）＿ｐＥＴ－Ｒｖ：
５’－（ＧＧＡＴＣＣＴＣＧＡＧＣＡＴＡ）ＴＧＧＡＡＡＣＴＧＣＧＧＧＡＡＡＴＧＡＣＧＡＧＴＴ－３’（配列番号１６）（下線：制限酵素ＮｄｅＩ認識配列）
５’－（ＧＧＡＴＣＣＴＣＧＡＧＣＡＴＡ）ＴＧＧＡＡＡＣＴＧＣＧＧＧＡＡＡＴＧＡＣＧＡＧＴＴ－３’（配列番号１６）（下線：制限酵素ＮｄｅＩ認識配列）
【0118】
配列番号１５および配列番号１６において、括弧で括った配列はＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎクローニングに必要な１５塩基の配列を示した。
【0119】
（大腸菌での組換えタンパク質の発現）
上記で作製したプラスミドｐＥｐ１０又はｐＥＴ－１５ｂで形質転換した大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）株を、アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）を添加した２０ｍＬの２×ＹＴ培地（１．６％トリプトン、１．０％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）で、温度３０℃、１２０ｒｐｍで培養した。波長６６０ｎｍにおける濁度Ｏ．Ｄ．６６０が１～１．１となったところで培養液の一部（２００μＬ）を採取し、菌体を回収した（発現誘導時間０分）。残りの培養液に最終濃度０．２ｍＭとなるようにイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、９０分間培養を継続して組換えタンパク質を発現誘導させた後、培養液２００μＬ分の菌体を採取回収するとともに、残りの培養液の菌体全ても３０００×ｇ、６℃、１５分間の遠心分離により回収し、－８０℃に保存した。
上記で作製したプラスミドｐＥｐ１０又はｐＥＴ－１５ｂで形質転換した大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）株を、アンピシリン（最終濃度１００μｇ／ｍＬ）を添加した２０ｍＬの２×ＹＴ培地（１．６％トリプトン、１．０％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ）で、温度３０℃、１２０ｒｐｍで培養した。波長６６０ｎｍにおける濁度Ｏ．Ｄ．６６０が１～１．１となったところで培養液の一部（２００μＬ）を採取し、菌体を回収した（発現誘導時間０分）。残りの培養液に最終濃度０．２ｍＭとなるようにイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、９０分間培養を継続して組換えタンパク質を発現誘導させた後、培養液２００μＬ分の菌体を採取回収するとともに、残りの培養液の菌体全ても３０００×ｇ、６℃、１５分間の遠心分離により回収し、－８０℃に保存した。
【0120】
発現誘導時間０分および９０分において採取した各培養液の菌体について、２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）に再懸濁後、ＳＤＳおよびメルカプトエタノール存在下で１００℃、５分間処理し、得られた溶液中の菌体総タンパク質をゲル濃度１２．５％のＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）により解析した結果を図１２に示した。
【0121】
ｐＥｐ１０形質転換株では、発現誘導時間９０分において、誘導前（０分）あるいはｐＥＴ－１５ｂ形質転換株には見られない、約１０ｋＤａの位置に顕著なタンパク質のバンドが検出されており、１０ｋＤａ抗糸状菌ポリペプチド組換えタンパク質が発現していることが確認できた（図１２）。
【0122】
（遺伝子組換え型１０ｋＤａ抗糸状菌ポリペプチドによる糸状菌生育阻害活性）
上記「大腸菌での組換えタンパク質の発現」で、ＩＰＴＧによる発現誘導９０分後に回収して－８０℃に保存した菌体を、Ｏ．Ｄ．６６０＝２０となるように２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）に再懸濁し、超音波発生機ＵＤ－２１１（トミー工業社製）を使用して超音波破砕した。菌体破砕液を３０００×ｇ、６℃、１０分間遠心分離し、得られた上清を０．２μｍのフィルターで濾過滅菌した溶液を用いて、糸状菌生育阻害活性を測定した。
上記「大腸菌での組換えタンパク質の発現」で、ＩＰＴＧによる発現誘導９０分後に回収して－８０℃に保存した菌体を、Ｏ．Ｄ．６６０＝２０となるように２０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．２）に再懸濁し、超音波発生機ＵＤ－２１１（トミー工業社製）を使用して超音波破砕した。菌体破砕液を３０００×ｇ、６℃、１０分間遠心分離し、得られた上清を０．２μｍのフィルターで濾過滅菌した溶液を用いて、糸状菌生育阻害活性を測定した。
【0123】
糸状菌生育阻害活性の測定方法は、上記［実施例１］に記載した、ＰＤＡアッセイプレートを使用したアガー・ウェル法により行った。被検糸状菌としてＦｕｓａｒｉｕｍ ｆｕｊｉｋｕｒｏｉ ＭＡＦＦ２３５９４９株を使用した結果を、図１３（Ａ）に示した。
【0124】
図１３（Ａ）のＰＤＡアッセイプレートにおいて、ｐＥｐ１０形質転換株の超音波破砕液上清に、強い菌糸生長阻害活性を確認できた（図１３（Ａ）、ｐＥｐ１０）。また、それぞれのウェルに最も近い部分の生育菌糸先端の様子を位相差顕微鏡で観察したところ（図１３（Ｂ））、緩衝液又はｐＥＴ－１５ｂ形質転換株の超音波破砕液上清を添加したウェル近くでは、菌糸が良く伸長していたのに対し（図１３（Ｂ）、Ｂｕｆｆｅｒ及びｐＥＴ－１５ｂ）、ｐＥｐ１０形質転換株破砕液上清を添加したウェル近くにおいては、菌糸の伸長が著しく阻害されている様子が観察された（図１３（Ｂ）、ｐＥｐ１０）。
【0125】
これらの結果から、大腸菌で発現させた遺伝子組換え型１０ｋＤａ抗糸状菌ポリペプチドが、糸状菌の菌糸生長阻害活性を有することが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【0126】
本発明のポリペプチド及びポリヌクレオチドは、新規な抗糸状菌活性を有する物質として使用することができ、農薬などの植物伝染性糸状菌類防除用組成物として、さらにヒト及び動物における感染症の治療薬として利用できる可能性がある。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】