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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024095659
(43)【公開日】2024-07-10
(54)【発明の名称】核酸の標的組込み
(51)【国際特許分類】
C12N 15/11 20060101AFI20240703BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240703BHJP
C12N 15/52 20060101ALI20240703BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20240703BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20240703BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240703BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20240703BHJP
【ＦＩ】
C12N15/11 Z
C12N5/10 ZNA
C12N15/52 Z
C12P21/02 C
C12P21/08
C12N15/63 Z
C12N15/09 100
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024038487
(22)【出願日】2024-03-12
(62)【分割の表示】P 2022019272の分割
【原出願日】2018-12-21
(31)【優先権主張番号】62/609,806
(32)【優先日】2017-12-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/711,272
(32)【優先日】2018-07-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】509012625
【氏名又は名称】ジェネンテック， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110002077
【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人
(72)【発明者】
【氏名】ング， チー ギン ドミンゴス
(72)【発明者】
【氏名】クロフォード， ヨンピン クオ
(72)【発明者】
【氏名】シェン， エイミー
(72)【発明者】
【氏名】チョウ， メイシア
(72)【発明者】
【氏名】スネデカー， ブラッドリー アール．
(72)【発明者】
【氏名】ミサーギ， シャンハラム
(72)【発明者】
【氏名】カオ， アルバート エリック
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064AG27
4B064CA10
4B064CA19
4B064CA21
4B064CC06
4B064CC10
4B064CC12
4B064CC24
4B064DA01
4B064DA20
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AA91X
4B065AA93X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BA25
4B065BC03
4B065BC07
4B065BC11
4B065BC26
4B065BD16
4B065CA23
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
(57)【要約】 （修正有）
【課題】組換えタンパク質の発現に好適な標的組込み（ＴＩ）宿主細胞、ならびに該ＴＩ宿主細胞を作製かつ使用する方法を提供する。
【解決手段】宿主細胞ゲノムの特定の座位内における組込み部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含み、座位が、特定の核酸配列から選択される配列と少なくとも約９０％相同である、標的組込み（ＴＩ）宿主細胞を提供する。
【選択図】図１
【解決手段】宿主細胞ゲノムの特定の座位内における組込み部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含み、座位が、特定の核酸配列から選択される配列と少なくとも約９０％相同である、標的組込み（ＴＩ）宿主細胞を提供する。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
標的組込み（ＴＩ）宿主細胞であって、前記宿主細胞ゲノムの特定の座位内における組込み部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含み、前記座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同である、前記ＴＩ宿主細胞。
【請求項2】
前記組込み外因性ヌクレオチド配列のすぐ５’側の前記ヌクレオチド配列が、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４１１９０－４５２６９、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド６３５９０－２０７９１１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド２５３８３１－４９１９０９、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド６９３０３－７９７６８、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド２９３４８１－３１５２６５、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６５０４４３－２６６２０５４、またはＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド８２２１４－９７７０５と少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択される、請求項１に記載のＴＩ宿主細胞。
【請求項3】
前記組込み外因性ヌクレオチド配列のすぐ５’側の前記ヌクレオチド配列が、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２６９、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９０９、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６８、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６５、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５４、またはＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０５からの少なくとも１５塩基対、少なくとも２０塩基対、少なくとも３０塩基対、少なくとも４０塩基対、少なくとも５０塩基対、少なくとも７５塩基対、少なくとも１００塩基対、少なくとも１５０塩基対、少なくとも２００塩基対、少なくとも３００塩基対、少なくとも４００塩基対、少なくとも５００塩基対、少なくとも１，０００塩基対、少なくとも１，５００塩基対、少なくとも２，０００塩基対、少なくとも３，０００塩基対の配列からなる群から選択される、請求項１に記載のＴＩ宿主細胞。
【請求項4】
前記組込み外因性ヌクレオチド配列のすぐ３’側の前記ヌクレオチド配列が、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０－４５４９０、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２－７９２３７４、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０－６６７８１３、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９－１０００５９、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６－３６２４４２、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５－２７０１７６８、またはＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６－１０５１１７と少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択される、請求項１に記載のＴＩ宿主細胞。
【請求項5】
前記組込み外因性ヌクレオチド配列のすぐ３’側の前記ヌクレオチド配列が、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５、またはＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６からの少なくとも１５塩基対、少なくとも２０塩基対、少なくとも３０塩基対、少なくとも４０塩基対、少なくとも５０塩基対、少なくとも７５塩基対、少なくとも１００塩基対、少なくとも１５０塩基対、少なくとも２００塩基対、少なくとも３００塩基対、少なくとも４００塩基対、少なくとも５００塩基対、少なくとも１，０００塩基対、少なくとも１，５００塩基対、少なくとも２，０００塩基対、少なくとも３，０００塩基対の配列からなる群から選択される、請求項１に記載のＴＩ宿主細胞。
【請求項6】
前記組込み外因性ヌクレオチド配列が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列に機能的に連結される、請求項１～５のいずれか１項に記載のＴＩ宿主細胞。
【請求項7】
標的組込み（ＴＩ）宿主細胞であって、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれらと少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択される内因性遺伝子内における組込み部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む、前記ＴＩ宿主細胞。
【請求項8】
ＴＩ宿主細胞であって、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれらと少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択される内因性遺伝子に機能的に連結された組込み部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む、前記ＴＩ宿主細胞。
【請求項9】
ＴＩ宿主細胞であって、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択される配列の全てまたは一部にすぐ隣接する組込み部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む、前記ＴＩ宿主細胞。
【請求項10】
前記ＴＩ宿主細胞が、哺乳動物宿主細胞である、請求項１～９のいずれか１項に記載のＴＩ宿主細胞。
【請求項11】
前記ＴＩ宿主細胞が、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、またはマウス宿主細胞である、請求項１０に記載のＴＩ宿主細胞。
【請求項12】
前記ＴＩ宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１１宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、またはＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である、請求項１０または１１に記載のＴＩ宿主細胞。
【請求項13】
前記外因性ヌクレオチド配列が、１つ以上の組換え認識配列（ＲＲＳ）を含み、前記ＲＲＳがリコンビナーゼによって認識され得る、請求項１～１２のいずれか１項に記載のＴＩ宿主細胞。
【請求項14】
前記外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも２つのＲＲＳを含む、請求項１３に記載のＴＩ宿主細胞。
【請求項15】
前記リコンビナーゼが、ＣｒｅリコンビナーゼまたはＦＬＰリコンビナーゼである、請求項１３または１４に記載のＴＩ宿主細胞。
【請求項16】
前記リコンビナーゼが、Ｂｘｂ１インテグラーゼまたはφＣ３１インテグラーゼである、請求項１３または１４に記載のＴＩ宿主細胞。
【請求項17】
前記ＲＲＳが、ＬｏｘＰ配列、ＬｏｘＰ Ｌ３配列、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列、ＬｏｘＦａｓ配列、Ｌｏｘ５１１配列、Ｌｏｘ２２７２配列、Ｌｏｘ２３７２配列、Ｌｏｘ５１７１配列、Ｌｏｘｍ２配列、Ｌｏｘ７１配列、Ｌｏｘ６６配列、ＦＲＴ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列、φＣ３１ ａｔｔＰ配列、及びφＣ３１ ａｔｔＢ配列からなる群から選択される、請求項１３～１６のいずれか１項に記載のＴＩ宿主細胞。
【請求項18】
前記外因性ヌクレオチド配列が、第１及び第２ＲＲＳ、ならびに前記第１ＲＲＳと前記第２ＲＲＳとの間に位置する少なくとも１つの選択マーカーを含む、請求項１４～１７のいずれか１項に記載のＴＩ宿主細胞。
【請求項19】
第１選択マーカーを含み、前記第１選択マーカーが、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシン、Ｇ４１８ ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、アスパラギンシンテターゼ、トリプトファンシンテターゼ（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ）、ブラストサイジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、Ｚｅｏｃｉｎ、及びミコフェノール酸からなる群から選択される、請求項１８に記載のＴＩ宿主細胞。
【請求項20】
第２選択マーカーをさらに含み、前記第１及び前記第２選択マーカーが異なる、請求項１８または１９に記載のＴＩ宿主細胞。
【請求項21】
前記第２選択マーカーが、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシン、Ｇ４１８ ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、アスパラギンシンテターゼ、トリプトファンシンテターゼ（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ）、ブラストサイジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、Ｚｅｏｃｉｎ、及びミコフェノール酸からなる群から選択される、請求項２０に記載のＴＩ宿主細胞。
【請求項22】
第３選択マーカー及び内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含み、前記ＩＲＥＳが、前記第３選択マーカーに機能的に連結される、請求項２０または２１に記載のＴＩ宿主細胞。
【請求項23】
前記第３選択マーカーが、前記第１または前記第２選択マーカーとは異なる、請求項２２に記載のＴＩ宿主細胞。
【請求項24】
前記第３選択マーカーが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）マーカー、改良型ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）マーカー、合成ＧＦＰマーカー、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）マーカー、改良型ＹＦＰ（ｅＹＦＰ）マーカー、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）マーカー、ｍＰｌｕｍマーカー、ｍＣｈｅｒｒｙマーカー、ｔｄＴｏｍａｔｏマーカー、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙマーカー、Ｊ－ｒｅｄマーカー、ＤｓＲｅｄ－モノマーマーカー、ｍＯｒａｎｇｅマーカー、ｍＫＯマーカー、ｍＣｉｔｒｉｎｅマーカー、Ｖｅｎｕｓマーカー、ＹＰｅｔマーカー、Ｅｍｅｒａｌｄ６マーカー、ＣｙＰｅｔマーカー、ｍＣＦＰｍマーカー、Ｃｅｒｕｌｅａｎマーカー、及びＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅマーカーからなる群から選択される、請求項２２または２３に記載のＴＩ宿主細胞。
【請求項25】
第３ＲＲＳをさらに含み、前記第３ＲＲＳが前記第１ＲＲＳと前記第２ＲＲＳとの間に位置し、前記第３ＲＲＳが、前記第１または前記第２ＲＲＳと比較して異種特異的である、請求項１８～２４のいずれか１項に記載のＴＩ宿主細胞。
【請求項26】
前記外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの選択マーカー及び少なくとも１つの目的の外因性配列（ＳＯＩ）を含む、請求項１３～２５のいずれか１項に記載のＴＩ宿主細胞。
【請求項27】
前記外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの外因性ＳＯＩをさらに含む、請求項１３～２６のいずれか１項に記載のＴＩ宿主細胞。
【請求項28】
前記外因性ＳＯＩが、前記第１ＲＲＳと前記第２ＲＲＳとの間に位置する、請求項２７に記載のＴＩ宿主細胞。
【請求項29】
前記ＳＯＩが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、またはＦｃ融合タンパク質をコードする、請求項２７または２８に記載のＴＩ宿主細胞。
【請求項30】
前記外因性ヌクレオチド配列が、前記第１ＲＲＳと前記第３ＲＲＳとの間に位置する少なくとも１つの外因性ＳＯＩ、及び前記第３ＲＲＳと前記第２ＲＲＳとの間に位置する少なくとも１つの外因性ＳＯＩをさらに含む、請求項２５～２９のいずれか１項に記載のＴＩ宿主細胞。
【請求項31】
前記ＳＯＩが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、またはＦｃ融合タンパク質をコードする、請求項３０に記載のＴＩ宿主細胞。
【請求項32】
目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞の調製方法であって、
ａ）前記ＴＩ宿主細胞ゲノムの座位内における部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供し、前記座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、前記外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含むこと、
ｂ）ａ）で提供される前記細胞中に、前記組込み外因性ヌクレオチド配列上の２つのＲＲＳと一致し、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第２選択マーカーに隣接する前記２つのＲＲＳを含むベクターを導入すること、
ｃ）リコンビナーゼまたはリコンビナーゼをコードする核酸を導入し、前記リコンビナーゼが前記ＲＲＳを認識すること、ならびに
ｄ）前記第２選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、前記ポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む、前記方法。
ａ）前記ＴＩ宿主細胞ゲノムの座位内における部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供し、前記座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、前記外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含むこと、
ｂ）ａ）で提供される前記細胞中に、前記組込み外因性ヌクレオチド配列上の２つのＲＲＳと一致し、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第２選択マーカーに隣接する前記２つのＲＲＳを含むベクターを導入すること、
ｃ）リコンビナーゼまたはリコンビナーゼをコードする核酸を導入し、前記リコンビナーゼが前記ＲＲＳを認識すること、ならびに
ｄ）前記第２選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、前記ポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む、前記方法。
【請求項33】
前記リコンビナーゼが、ＣｒｅリコンビナーゼまたはＦＬＰリコンビナーゼである、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
前記リコンビナーゼが、Ｂｘｂ１インテグラーゼまたはφＣ３１インテグラーゼである、請求項３２に記載の方法。
【請求項35】
前記ＳＯＩが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、またはＦｃ融合タンパク質をコードする、請求項３２～３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項36】
前記ＴＩ宿主細胞が、哺乳動物宿主細胞である、請求３２～３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項37】
前記ＴＩ宿主細胞が、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、またはマウス宿主細胞である、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
前記ＴＩ宿主細胞が、ＣＨＯ宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１１宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、またはＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項39】
目的のポリペプチドの発現方法であって、
ａ）少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの選択マーカーを含むＴＩ宿主細胞を提供し、前記少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの選択マーカーが、前記ＴＩ宿主細胞ゲノムの座位内に組み込まれた２つのＲＲＳに隣接し、前記座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であること、ならびに
ｂ）前記目的のポリペプチドを発現し、そこから目的のポリペプチドを回収するのに好適な条件下でａ）の前記細胞を培養することを含む、前記方法。
ａ）少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの選択マーカーを含むＴＩ宿主細胞を提供し、前記少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの選択マーカーが、前記ＴＩ宿主細胞ゲノムの座位内に組み込まれた２つのＲＲＳに隣接し、前記座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であること、ならびに
ｂ）前記目的のポリペプチドを発現し、そこから目的のポリペプチドを回収するのに好適な条件下でａ）の前記細胞を培養することを含む、前記方法。
【請求項40】
少なくとも目的の第１及び第２ポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞の調製方法であって、
ａ）前記宿主細胞ゲノムの座位内における部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供し、前記座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、前記外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１選択マーカーに隣接する第１及び第２ＲＲＳ、ならびに前記第１ＲＲＳと前記第２ＲＲＳとの間に位置する第３ＲＲＳを含み、全ての前記ＲＲＳが異種特異的であること、
ｂ）ａ）で提供される前記細胞中に、前記組込み外因性ヌクレオチド配列上の前記第１及び前記第３ＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第１外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第２選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含む第１ベクターを導入すること、
ｃ）ａ）で提供される前記細胞中に、前記組込み外因性ヌクレオチド配列上の前記第２及び前記第３ＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第２外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳを含む第２ベクターを導入すること、
ｄ）１つ以上のリコンビナーゼ、または１つ以上のリコンビナーゼをコードする１つ以上の核酸を導入し、前記１つ以上のリコンビナーゼが前記ＲＲＳを認識すること、ならびに
ｅ）前記第２選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、前記目的の第１及び第２ポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む、前記方法。
ａ）前記宿主細胞ゲノムの座位内における部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供し、前記座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、前記外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１選択マーカーに隣接する第１及び第２ＲＲＳ、ならびに前記第１ＲＲＳと前記第２ＲＲＳとの間に位置する第３ＲＲＳを含み、全ての前記ＲＲＳが異種特異的であること、
ｂ）ａ）で提供される前記細胞中に、前記組込み外因性ヌクレオチド配列上の前記第１及び前記第３ＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第１外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第２選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含む第１ベクターを導入すること、
ｃ）ａ）で提供される前記細胞中に、前記組込み外因性ヌクレオチド配列上の前記第２及び前記第３ＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第２外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳを含む第２ベクターを導入すること、
ｄ）１つ以上のリコンビナーゼ、または１つ以上のリコンビナーゼをコードする１つ以上の核酸を導入し、前記１つ以上のリコンビナーゼが前記ＲＲＳを認識すること、ならびに
ｅ）前記第２選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、前記目的の第１及び第２ポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む、前記方法。
【請求項41】
前記リコンビナーゼが、ＣｒｅリコンビナーゼまたはＦＬＰリコンビナーゼである、請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
前記リコンビナーゼが、Ｂｘｂ１インテグラーゼまたはφＣ３１インテグラーゼである、請求項４０に記載の方法。
【請求項43】
前記第１ベクターが、前記第１ＳＯＩの上流に、かつＲＲＳの下流に隣接して配置されるコドンＡＴＧに機能的に連結されるプロモーター配列をさらに含み、前記第２ベクターが、ＲＲＳの上流に、かつ前記第２ＳＯＩの下流に隣接するＡＴＧ転写開始コドンを欠く選択マーカーをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項44】
前記少なくとも１つのＳＯＩが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、またはＦｃ融合タンパク質をコードする、請求項３９に記載の方法。
【請求項45】
前記第１ＳＯＩが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、またはＦｃ融合タンパク質をコードする、請求項４０～４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項46】
前記第２ＳＯＩが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、またはＦｃ融合タンパク質をコードする、請求項４０～４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項47】
前記ＴＩ宿主細胞が、哺乳動物宿主細胞である、請求３９～４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項48】
前記ＴＩ宿主細胞が、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、またはマウス宿主細胞である、請求項４７に記載の方法。
【請求項49】
前記ＴＩ宿主細胞が、ＣＨＯ宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１１宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、またはＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である、請求項４８に記載の方法。
【請求項50】
目的のポリペプチドの発現方法であって、
ａ）前記宿主細胞ゲノムの座位内に組み込まれた少なくとも２つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの選択マーカーを含む宿主細胞を提供し、前記座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び１つの選択マーカーが、第１及び第３ＲＲＳに隣接し、少なくとも１つの外因性ＳＯＩが、第２及び前記第３ＲＲＳに隣接すること、ならびに
ｂ）前記目的のポリペプチドを発現し、そこから目的のポリペプチドを回収するのに好適な条件下でａ）の前記細胞を培養することを含む、前記方法。
ａ）前記宿主細胞ゲノムの座位内に組み込まれた少なくとも２つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの選択マーカーを含む宿主細胞を提供し、前記座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び１つの選択マーカーが、第１及び第３ＲＲＳに隣接し、少なくとも１つの外因性ＳＯＩが、第２及び前記第３ＲＲＳに隣接すること、ならびに
ｂ）前記目的のポリペプチドを発現し、そこから目的のポリペプチドを回収するのに好適な条件下でａ）の前記細胞を培養することを含む、前記方法。
【請求項51】
ベクターであって、
ａ．配列番号１の任意の部分から選択される２つの参照配列、
ｂ．配列番号２の任意の部分から選択される２つの参照配列、
ｃ．配列番号３の任意の部分から選択される２つの参照配列、
ｄ．配列番号４の任意の部分から選択される２つの参照配列、
ｅ．配列番号５の任意の部分から選択される２つの参照配列、
ｆ．配列番号６の任意の部分から選択される２つの参照配列、または
ｇ．配列番号７の任意の部分から選択される２つの参照配列
と少なくとも５０％相同の２つのヌクレオチド配列を含み、前記配列がＤＮＡカセットに隣接し、前記ＤＮＡカセットが、２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの選択マーカー及び少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む、前記ベクター。
ａ．配列番号１の任意の部分から選択される２つの参照配列、
ｂ．配列番号２の任意の部分から選択される２つの参照配列、
ｃ．配列番号３の任意の部分から選択される２つの参照配列、
ｄ．配列番号４の任意の部分から選択される２つの参照配列、
ｅ．配列番号５の任意の部分から選択される２つの参照配列、
ｆ．配列番号６の任意の部分から選択される２つの参照配列、または
ｇ．配列番号７の任意の部分から選択される２つの参照配列
と少なくとも５０％相同の２つのヌクレオチド配列を含み、前記配列がＤＮＡカセットに隣接し、前記ＤＮＡカセットが、２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの選択マーカー及び少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む、前記ベクター。
【請求項52】
前記ベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、組込みファージベクター、非ウイルスベクター、トランスポゾン及び／またはトランスポザーゼベクター、インテグラーゼ基質、ならびにプラスミドからなる群から選択される、請求項５１に記載のベクター。
【請求項53】
前記ＳＯＩが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、またはＦｃ融合タンパク質をコードする、請求項５１または５２に記載のベクター。
【請求項54】
目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞の調製方法であって、
ａ）前記宿主細胞ゲノムの座位を含む宿主細胞を提供し、前記座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であること、
ｂ）ベクターを前記宿主細胞中に導入し、前記ベクターが、ＤＮＡカセットに隣接する配列番号１～７から選択される配列と少なくとも５０％相同のヌクレオチド配列を含み、前記ＤＮＡカセットが、２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの選択マーカー及び少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含むこと、ならびに
ｃ）前記選択マーカーを選択し、前記ゲノムの前記座位中に組み込まれた前記ＳＯＩを有するＴＩ宿主細胞を単離して前記目的のポリペプチドを発現させることを含む、前記方法。
ａ）前記宿主細胞ゲノムの座位を含む宿主細胞を提供し、前記座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であること、
ｂ）ベクターを前記宿主細胞中に導入し、前記ベクターが、ＤＮＡカセットに隣接する配列番号１～７から選択される配列と少なくとも５０％相同のヌクレオチド配列を含み、前記ＤＮＡカセットが、２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの選択マーカー及び少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含むこと、ならびに
ｃ）前記選択マーカーを選択し、前記ゲノムの前記座位中に組み込まれた前記ＳＯＩを有するＴＩ宿主細胞を単離して前記目的のポリペプチドを発現させることを含む、前記方法。
【請求項55】
前記ベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、組込みファージベクター、非ウイルスベクター、トランスポゾン及び／またはトランスポザーゼベクター、インテグラーゼ基質、ならびにプラスミドからなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項56】
前記少なくとも１つのＳＯＩが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、またはＦｃ融合タンパク質をコードする、請求項５４または５５に記載の方法。
【請求項57】
前記ＴＩ宿主細胞が、哺乳動物宿主細胞である、請求項５３～５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項58】
前記ＴＩ宿主細胞が、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、またはマウス宿主細胞である、請求項５７に記載の方法。
【請求項59】
前記ＴＩ宿主細胞が、ＣＨＯ宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１１宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、またはＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である、請求項５７または５８に記載の方法。
【請求項60】
前記少なくとも１つのＳＯＩ及び選択マーカーを含む前記核酸の前記組込みが、外因性ヌクレアーゼによって促進される、請求項５４～５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項61】
前記外因性ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＺＦＮ二量体、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＴＡＬエフェクタードメイン融合タンパク質、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、操作されたメガヌクレアーゼ、及び規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項５７に記載の方法。
【請求項62】
ＴＩ宿主細胞であって、前記宿主細胞ゲノムの、１箇所以上の特定の座位内における組込み部位に組み込まれた少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列を含み、前記座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同である、前記ＴＩ宿主細胞。
【請求項63】
ＴＩ宿主細胞であって、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれらと少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択される内因性遺伝子内における１箇所以上の組込み部位に組み込まれた少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列を含む、前記ＴＩ宿主細胞。
【請求項64】
前記少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列が、１つ以上の組換え認識配列（ＲＲＳ）を含み、前記ＲＲＳがリコンビナーゼによって認識され得る、請求項６２～６３のいずれか１項に記載のＴＩ宿主細胞。
【請求項65】
前記少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの外因性ＳＯＩをさらに含む、請求項６４に記載のＴＩ宿主細胞。
【請求項66】
少なくとも１つの目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞の調製方法であって、
ｅ）前記ＴＩ宿主細胞ゲノムの１箇所以上の座位内における部位に組み込まれた少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供し、前記１箇所以上の座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、前記少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含むこと、
ｆ）ａ）で提供される前記細胞中に、前記組込み外因性ヌクレオチド配列上の２つのＲＲＳと一致し、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第２選択マーカーに隣接する前記２つのＲＲＳを含むベクターを導入すること、
ｇ）リコンビナーゼまたはリコンビナーゼをコードする核酸を導入し、前記リコンビナーゼが前記ＲＲＳを認識すること、ならびに
前記第２選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、前記少なくとも１つの目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む、前記方法。
ｅ）前記ＴＩ宿主細胞ゲノムの１箇所以上の座位内における部位に組み込まれた少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供し、前記１箇所以上の座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、前記少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含むこと、
ｆ）ａ）で提供される前記細胞中に、前記組込み外因性ヌクレオチド配列上の２つのＲＲＳと一致し、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第２選択マーカーに隣接する前記２つのＲＲＳを含むベクターを導入すること、
ｇ）リコンビナーゼまたはリコンビナーゼをコードする核酸を導入し、前記リコンビナーゼが前記ＲＲＳを認識すること、ならびに
前記第２選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、前記少なくとも１つの目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む、前記方法。
【請求項67】
少なくとも１つの目的の第１及び第２ポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞の調製方法であって、
ａ）前記宿主細胞ゲノムの１箇所以上の座位内における部位に組み込まれた少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供し、１箇所以上の座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、前記外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１選択マーカーに隣接する第１及び第２ＲＲＳ、ならびに前記第１ＲＲＳと前記第２ＲＲＳとの間に位置する第３ＲＲＳを含み、全ての前記ＲＲＳが異種特異的であること、
ｂ）ａ）で提供される前記細胞中に、前記少なくとも１つの組込み外因性ヌクレオチド配列上の前記第１及び前記第３ＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第１外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第２選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含む第１ベクターを導入すること、
ｃ）ａ）で提供される前記細胞中に、前記少なくとも１つの組込み外因性ヌクレオチド配列上の前記第２及び前記第３ＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第２外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳを含む第２ベクターを導入すること、
ｄ）１つ以上のリコンビナーゼ、または１つ以上のリコンビナーゼをコードする１つ以上の核酸を導入し、前記１つ以上のリコンビナーゼが前記ＲＲＳを認識すること、ならびに
ｅ）前記第２選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、前記少なくとも１つの目的の第１及び第２ポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む、前記方法。
ａ）前記宿主細胞ゲノムの１箇所以上の座位内における部位に組み込まれた少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供し、１箇所以上の座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、前記外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１選択マーカーに隣接する第１及び第２ＲＲＳ、ならびに前記第１ＲＲＳと前記第２ＲＲＳとの間に位置する第３ＲＲＳを含み、全ての前記ＲＲＳが異種特異的であること、
ｂ）ａ）で提供される前記細胞中に、前記少なくとも１つの組込み外因性ヌクレオチド配列上の前記第１及び前記第３ＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第１外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第２選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含む第１ベクターを導入すること、
ｃ）ａ）で提供される前記細胞中に、前記少なくとも１つの組込み外因性ヌクレオチド配列上の前記第２及び前記第３ＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第２外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳを含む第２ベクターを導入すること、
ｄ）１つ以上のリコンビナーゼ、または１つ以上のリコンビナーゼをコードする１つ以上の核酸を導入し、前記１つ以上のリコンビナーゼが前記ＲＲＳを認識すること、ならびに
ｅ）前記第２選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、前記少なくとも１つの目的の第１及び第２ポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む、前記方法。
【請求項68】
目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞の調製方法であって、
ａ）前記ＴＩ宿主細胞ゲノムの１箇所以上の座位内における部位に組み込まれた少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供し、前記１箇所以上の座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、前記外因性ヌクレオチド配列が１つ以上のＲＲＳを含むこと、
ｂ）ａ）で提供される前記細胞中に、前記組込み外因性ヌクレオチド配列上の１つ以上のＲＲＳと一致し、少なくとも１つの調節可能なプロモーターに機能的に連結される少なくとも１つの外因性ＳＯＩに隣接する前記１つ以上のＲＲＳを含むベクターを導入すること、
ｃ）リコンビナーゼまたはリコンビナーゼをコードする核酸を導入し、前記リコンビナーゼが前記ＲＲＳを認識すること、ならびに
ｄ）誘導物質の存在下で前記目的の外因性ポリペプチドを発現するＴＩ細胞を選択することによって、前記目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む、前記方法。
ａ）前記ＴＩ宿主細胞ゲノムの１箇所以上の座位内における部位に組み込まれた少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供し、前記１箇所以上の座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、前記外因性ヌクレオチド配列が１つ以上のＲＲＳを含むこと、
ｂ）ａ）で提供される前記細胞中に、前記組込み外因性ヌクレオチド配列上の１つ以上のＲＲＳと一致し、少なくとも１つの調節可能なプロモーターに機能的に連結される少なくとも１つの外因性ＳＯＩに隣接する前記１つ以上のＲＲＳを含むベクターを導入すること、
ｃ）リコンビナーゼまたはリコンビナーゼをコードする核酸を導入し、前記リコンビナーゼが前記ＲＲＳを認識すること、ならびに
ｄ）誘導物質の存在下で前記目的の外因性ポリペプチドを発現するＴＩ細胞を選択することによって、前記目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む、前記方法。
【請求項69】
目的のポリペプチドの発現方法であって、
ａ）前記宿主細胞ゲノムの座位内に組み込まれた２つのＲＲＳ及び調節可能なプロモーターに隣接する少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む宿主細胞を提供し、前記座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であること、ならびに
ｂ）前記ＳＯＩを発現し、そこから目的のポリペプチドを回収するのに好適な条件下で前記細胞を培養することを含む、前記方法。
ａ）前記宿主細胞ゲノムの座位内に組み込まれた２つのＲＲＳ及び調節可能なプロモーターに隣接する少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む宿主細胞を提供し、前記座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であること、ならびに
ｂ）前記ＳＯＩを発現し、そこから目的のポリペプチドを回収するのに好適な条件下で前記細胞を培養することを含む、前記方法。
【請求項70】
目的の第１及び第２ポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞の調製方法であって、
ａ）前記宿主細胞ゲノムの座位内における部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供し、前記座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、前記外因性ヌクレオチド配列が、第１、第２ＲＲＳ及び前記第１ＲＲＳと前記第２ＲＲＳとの間に位置する第３ＲＲＳを含み、全ての前記ＲＲＳが異種特異的であること、
ｂ）ａ）で提供される前記細胞中に、前記組込み外因性ヌクレオチド配列上の前記第１及び前記第３ＲＲＳと一致し、調節可能なプロモーターに機能的に連結される少なくとも１つの第１外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳを含む第１ベクターを導入すること、
ｃ）ａ）で提供される前記細胞中に、前記組込み外因性ヌクレオチド配列上の前記第２及び前記第３ＲＲＳと一致し、調節可能なプロモーターに機能的に連結される少なくとも１つの第２外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳを含む第２ベクターを導入すること、
ｄ）１つ以上のリコンビナーゼ、または１つ以上のリコンビナーゼをコードする１つ以上の核酸を導入し、前記１つ以上のリコンビナーゼが前記ＲＲＳを認識すること、ならびに
ｅ）誘導物質の存在下で前記目的の第１及び第２外因性ポリペプチドを発現するＴＩ細胞を選択することによって、前記目的の第１及び第２ポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む、前記方法。
ａ）前記宿主細胞ゲノムの座位内における部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供し、前記座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、前記外因性ヌクレオチド配列が、第１、第２ＲＲＳ及び前記第１ＲＲＳと前記第２ＲＲＳとの間に位置する第３ＲＲＳを含み、全ての前記ＲＲＳが異種特異的であること、
ｂ）ａ）で提供される前記細胞中に、前記組込み外因性ヌクレオチド配列上の前記第１及び前記第３ＲＲＳと一致し、調節可能なプロモーターに機能的に連結される少なくとも１つの第１外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳを含む第１ベクターを導入すること、
ｃ）ａ）で提供される前記細胞中に、前記組込み外因性ヌクレオチド配列上の前記第２及び前記第３ＲＲＳと一致し、調節可能なプロモーターに機能的に連結される少なくとも１つの第２外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳを含む第２ベクターを導入すること、
ｄ）１つ以上のリコンビナーゼ、または１つ以上のリコンビナーゼをコードする１つ以上の核酸を導入し、前記１つ以上のリコンビナーゼが前記ＲＲＳを認識すること、ならびに
ｅ）誘導物質の存在下で前記目的の第１及び第２外因性ポリペプチドを発現するＴＩ細胞を選択することによって、前記目的の第１及び第２ポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む、前記方法。
【請求項71】
少なくとも１つのＳＯＩを含む核酸の前記組込みが、外因性ヌクレアーゼによって促進される、請求項６６、６８、及び６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項72】
前記第１ＳＯＩが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、またはＦｃ融合タンパク質をコードし、前記第２ＳＯＩが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、またはＦｃ融合タンパク質をコードする、請求項６７または７０に記載の方法。
【請求項73】
前記外因性ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＺＦＮ二量体、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＴＡＬエフェクタードメイン融合タンパク質、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、操作されたメガヌクレアーゼ、及び規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項７１に記載の方法。
【請求項74】
前記調節可能なプロモーターが、ＳＶ４０及びＣＭＶプロモーターからなる群から選択される、請求項６６～７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項75】
ａ．前記第１ベクターが、前記第１ＳＯＩの上流に、かつＲＲＳの下流に隣接して配置されるコドンＡＴＧに機能的に連結されるプロモーター配列をさらに含み、
ｂ．前記第２ベクターが、ＲＲＳの上流に、かつ前記第２ＳＯＩの下流に隣接するＡＴＧ転写開始コドンを欠く選択マーカーをさらに含む、請求項６７及び７０のいずれか１項に記載の方法。
ｂ．前記第２ベクターが、ＲＲＳの上流に、かつ前記第２ＳＯＩの下流に隣接するＡＴＧ転写開始コドンを欠く選択マーカーをさらに含む、請求項６７及び７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項76】
ベクターであって、配列番号１～７の任意の部分から選択される２つの配列、すなわち、
ａ．配列番号１の任意の部分から選択される２つの参照配列、
ｂ．配列番号２の任意の部分から選択される２つの参照配列、
ｃ．配列番号３の任意の部分から選択される２つの参照配列、
ｄ．配列番号４の任意の部分から選択される２つの参照配列、
ｅ．配列番号５の任意の部分から選択される２つの参照配列、
ｆ．配列番号６の任意の部分から選択される２つの参照配列、または
ｇ．配列番号７の任意の部分から選択される２つの参照配列
と少なくとも５０％相同の２つのヌクレオチド配列を含み、前記配列がＤＮＡカセットに隣接し、前記ＤＮＡカセットが、調節可能なプロモーターに機能的に連結され、２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む、前記ベクター。
ａ．配列番号１の任意の部分から選択される２つの参照配列、
ｂ．配列番号２の任意の部分から選択される２つの参照配列、
ｃ．配列番号３の任意の部分から選択される２つの参照配列、
ｄ．配列番号４の任意の部分から選択される２つの参照配列、
ｅ．配列番号５の任意の部分から選択される２つの参照配列、
ｆ．配列番号６の任意の部分から選択される２つの参照配列、または
ｇ．配列番号７の任意の部分から選択される２つの参照配列
と少なくとも５０％相同の２つのヌクレオチド配列を含み、前記配列がＤＮＡカセットに隣接し、前記ＤＮＡカセットが、調節可能なプロモーターに機能的に連結され、２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む、前記ベクター。
【請求項77】
前記ＳＯＩが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、またはＦｃ融合タンパク質をコードする、請求項７６に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１２月２２日出願の米国仮特許出願第６２／６０９，８０６号、及び２０１８年７月２７日出願の米国仮特許出願第６２／７１１，２７２号の利益を主張し、その各々の開示全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１７年１２月２２日出願の米国仮特許出願第６２／６０９，８０６号、及び２０１８年７月２７日出願の米国仮特許出願第６２／７１１，２７２号の利益を主張し、その各々の開示全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【0002】
本明細書で開示される主題は、組換えタンパク質の発現に好適な標的組込み（ＴＩ）宿主細胞に加えて、ＴＩ宿主細胞を作製かつ使用する方法に関する。
【0003】
配列表
本明細書は、配列表（２０１８年１２月２１日に「００Ｂ２０６０７７９ＳＥＱ．ｔｘｔ」と命名された．ｔｘｔファイルとして電子的に提出された）を参照する。００Ｂ２０６０７７９ＳＥＱ．ｔｘｔファイルは、２０１８年１２月２０日に生成され、サイズは１，２５１，２４０バイトである。配列表の内容全体が、参照によって本明細書に組み込まれる。
本明細書は、配列表（２０１８年１２月２１日に「００Ｂ２０６０７７９ＳＥＱ．ｔｘｔ」と命名された．ｔｘｔファイルとして電子的に提出された）を参照する。００Ｂ２０６０７７９ＳＥＱ．ｔｘｔファイルは、２０１８年１２月２０日に生成され、サイズは１，２５１，２４０バイトである。配列表の内容全体が、参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0004】
細胞生物学及び免疫学の急速な進歩によって、がん、心血管疾患及び代謝性疾患を含む様々な疾患のための新規治療用組換えタンパク質を開発する需要が高まっている。これらの生物製剤候補は、目的のタンパク質を発現できる市販の細胞株によって一般に製造される。例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、モノクローナル抗体を産生するように広く適合されている。
【0005】
市販の細胞株を開発するための従来の方針は、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のランダム組込み、続いて目的のポリペプチドを産生する細胞株の選択及び単離を含む。しかしながら、本アプローチはいくつかの欠点を有する。第１に、そのような組込みが珍しい事象であるだけでなく、ヌクレオチド配列が組み込まれる箇所に関してランダム性を考慮すると、これらの珍しい事象が、様々な遺伝子発現及び細胞増殖表現型も、もたらし得る。「位置効果の多様化」として知られるそのような多様化は、真核細胞ゲノム中に存在する複雑な遺伝子調節ネットワークならびに組込み及び遺伝子発現に関するある特定のゲノム座位の接近性に、少なくとも部分的には起因している。第２に、ランダム組込みの方針は一般に、宿主細胞ゲノム中に組み込まれる遺伝子コピーの数を制御しない。事実、遺伝子増幅方法が、高産生細胞を達成するために多くの場合に使用される。しかしながら、そのような遺伝子増幅は、望ましくない細胞表現型、例えば、不安定な細胞増殖及び／または産物発現などをもたらし得る。第３に、ランダム組込みプロセスに固有の組込み座位の不均一性ゆえに、トランスフェクション後に数千のクローンをスクリーニングし、目的のポリペプチドの望ましい発現レベルを示す細胞株を分離するには、多大な時間と労力を要する。そのような細胞株を単離した後であっても、目的のポリペプチドの安定発現は保証されず、安定した市販の細胞株を得るためにはさらにスクリーニングが必要となる場合がある。最後に、ランダムに組み込まれた細胞株から産生されるポリペプチドは高度な配列変動を示し、これは、目的のポリペプチドの高レベルな発現を選択するために使用される選択剤の変異原性に部分的に起因する可能性がある。
【発明の概要】
【0006】
本明細書で開示される主題は、組換えタンパク質の発現に好適な標的組込み（ＴＩ）宿主細胞に関する。本明細書で開示される主題は、高い生産性を有する宿主細胞のＴＩ部位を提供するだけでなく、リコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）によって宿主細胞の単一ＴＩ座位に複数の目的の配列を導入する新規方法も提供する。ＲＭＣＥ法の利点としては、生産性の向上及び同じＴＩ座位から複数のポリペプチドを異なる比率で共発現させる柔軟性が挙げられる。例えば、限定する意図はないが、本明細書で開示されるＲＭＣＥ方針は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つまたはそれを超える配列（例えば、抗体重鎖（ＨＣ）または軽鎖（ＬＣ）配列）のＴＩ座位への挿入を可能にする。８つ以上の配列を同時に標的とする能力と共に、２プラスミドＲＭＣＥは、ｍＡｂのＨＣ及びＬＣ鎖比の調節による生産性の改善、複数の鎖を有する複合分子の発現、ならびに抗体を用いた導入遺伝子、内因性遺伝子またはＲＮＡｉの標的化による細胞経路の変更を可能にする。
【0007】
ある特定の実施形態では、ＴＩ宿主細胞は、宿主細胞ゲノムの座位内における組込み部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含み、その座位は、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同である。ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列のすぐ５’側のヌクレオチド配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４１１９０－４５２６９、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド６３５９０－２０７９１１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド２５３８３１－４９１９０９、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド６９３０３－７９７６８、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド２９３４８１－３１５２６５、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６５０４４３－２６６２０５４、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド８２２１４－９７７０５と少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列のすぐ３’側のヌクレオチド配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０－４５４９０、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２－７９２３７４、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０－６６７８１３、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９－１０００５９、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６－３６２４４２、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５－２７０１７６８、またはＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６－１０５１１７と少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列に機能的に連結される。
【0008】
ある特定の実施形態では、ＴＩ宿主細胞は、ＬＯＣ１０７９７７０６２（配列番号１）、ＬＯＣ１００７６８８４５（配列番号２）、ＩＴＰＲ２（配列番号３）、ＥＲＥ６７０００．１（配列番号４）、ＵＢＡＰ２（配列番号５）、ＭＴＭＲ２（配列番号６）、ＸＰ＿００３５１２３３１．２（配列番号７）、及びそれらと少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択される内因性遺伝子内における組込み部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、ＬＯＣ１０７９７７０６２（配列番号１）、ＬＯＣ１００７６８８４５（配列番号２）、ＩＴＰＲ２（配列番号３）、ＥＲＥ６７０００．１（配列番号４）、ＵＢＡＰ２（配列番号５）、ＭＴＭＲ２（配列番号６）、ＸＰ＿００３５１２３３１．２（配列番号７）、及びそれらと少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択される内因性遺伝子に機能的に連結される組込み部位に組み込まれる。ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチドは、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列に隣接する。ある特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択される配列の全てまたは一部にすぐ隣接する組込み部位に組み込まれる。
【0009】
ある特定の実施形態では、ＴＩ宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞である。ある特定の実施形態では、ＴＩ宿主細胞は、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、またはマウス宿主細胞である。ある特定の実施形態では、ＴＩ宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１１宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、またはＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である。
【0010】
ある特定の実施形態では、ＴＩ宿主細胞は、組込み外因性ヌクレオチド配列を含み、その外因性ヌクレオチド配列は、１つ以上の組換え認識配列（ＲＲＳ）を含む。ある特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも２つのＲＲＳを含む。ＲＲＳは、リコンビナーゼ、例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ、ＦＬＰリコンビナーゼ、Ｂｘｂ１インテグラーゼ、またはφＣ３１インテグラーゼによって認識され得る。ＲＲＳは、ＬｏｘＰ配列、ＬｏｘＰ Ｌ３配列、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列、ＬｏｘＦａｓ配列、Ｌｏｘ５１１配列、Ｌｏｘ２２７２配列、Ｌｏｘ２３７２配列、Ｌｏｘ５１７１配列、Ｌｏｘｍ２配列、Ｌｏｘ７１配列、Ｌｏｘ６６配列、ＦＲＴ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列、φＣ３１ ａｔｔＰ配列、及びφＣ３１ ａｔｔＢ配列からなる群から選択され得る。
【0011】
ある特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、第１及び第２ＲＲＳ、ならびに第１ＲＲＳと第２ＲＲＳとの間に位置する少なくとも１つの選択マーカーを含む。ある特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は第３ＲＲＳをさらに含み、その第３ＲＲＳは第１ＲＲＳと第２ＲＲＳとの間に位置し、その第３ＲＲＳは第１ＲＲＳまたは第２ＲＲＳとは異なる。ある特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、第１及び第２ＲＲＳ、ならびに第１ＲＲＳと第２ＲＲＳとの間に位置する第１選択マーカーを含む。ある特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、第２選択マーカーをさらに含み、第１及び第２選択マーカーは異なっている。ある特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、第３選択マーカー及び内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含み得、そのＩＲＥＳは、第３選択マーカーに機能的に連結される。第３選択マーカーは、第１または第２選択マーカーとは異なり得る。選択マーカーは、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシン及びＧ４１８ ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、アスパラギンシンテターゼ、トリプトファンシンテターゼ（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ）、ならびにピューロマイシン、ブラストサイジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、Ｚｅｏｃｉｎ、及びミコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子からなる群から選択され得る。選択マーカーは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）マーカー、改良型ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）マーカー、合成ＧＦＰマーカー、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）マーカー、改良型ＹＦＰ（ｅＹＦＰ）マーカー、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）マーカー、ｍＰｌｕｍマーカー、ｍＣｈｅｒｒｙマーカー、ｔｄＴｏｍａｔｏマーカー、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙマーカー、Ｊ－ｒｅｄマーカー、ＤｓＲｅｄ－モノマーマーカー、ｍＯｒａｎｇｅマーカー、ｍＫＯマーカー、ｍＣｉｔｒｉｎｅマーカー、Ｖｅｎｕｓマーカー、ＹＰｅｔマーカー、Ｅｍｅｒａｌｄ６マーカー、ＣｙＰｅｔマーカー、ｍＣＦＰｍマーカー、Ｃｅｒｕｌｅａｎマーカー、及びＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅマーカーからなる群からも選択され得る。いくつかの実施形態では、選択マーカーは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）マーカー、改良型ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）マーカー、合成ＧＦＰマーカーからなる群から選択される。
【0012】
ある特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの選択マーカー及び少なくとも１つの目的の外因性配列（ＳＯＩ）を含む。ある特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、第１及び第２ＲＲＳ、ならびに第１ＲＲＳと第２ＲＲＳとの間に位置する少なくとも１つの選択マーカー及び少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む。ある特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、第１、第２、及び第３ＲＲＳ、第１ＲＲＳと第３ＲＲＳとの間に位置する少なくとも１つの選択マーカー及び少なくとも１つの外因性ＳＯＩ、ならびに第３ＲＲＳと第２ＲＲＳとの間に位置する少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む。目的の配列は、本明細書に列挙される例を含むがこれらに限定されない、いずれかの目的のポリペプチドをコードし得る。ＳＯＩは同じであり得るか、またはそれらは異なり得、例えば、ＳＯＩは、抗体の両鎖にコード配列を含み得る。２つ以上の異なるポリペプチドが発現される場合では、目的の配列は２つのポリペプチドを様々な比率で含み得、例えば、８つのコード配列が１：７、２：６などを含むが、これらに限定されない２つの異なるポリペプチドをコードする場合である。ＳＯＩは、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、またはＦｃ融合タンパク質をコードし得る。
【0013】
本明細書で開示される主題は、目的のポリペプチドの発現を促進するために、宿主細胞中への外因性核酸の標的組込み方法も提供する。ある特定の実施形態では、そのような方法は、リコンビナーゼ媒介組換えによる宿主細胞中への外因性核酸の標的組込みを含む。ある特定の実施形態では、そのような方法は、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれらと少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択される内因性遺伝子内における部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む細胞に関する。ある特定の実施形態では、そのような方法は、宿主細胞ゲノムの座位内に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む細胞に関し、その座位は、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であるヌクレオチド配列を含む。
【0014】
ある特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、本方法は、ａ）ＴＩ宿主細胞ゲノムの座位内における部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供し、その座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、その外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含むこと、ｂ）ａ）で提供される細胞中に、組込み外因性ヌクレオチド配列上の２つのＲＲＳと一致し、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第２選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含むベクターを導入すること、ｃ）リコンビナーゼを導入し、そのリコンビナーゼがＲＲＳを認識すること、ならびにｄ）第２選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む。
【0015】
ある特定の実施形態では、本開示は、目的の第１及び第２ポリペプチド（ここで第１及び第２ポリペプチドは、同じかまたは異なり得る）を発現するＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、本方法は、ａ）宿主細胞ゲノムの座位内における部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供し、その座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、その外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１選択マーカーに隣接する第１及び第２ＲＲＳ、ならびに第１ＲＲＳと第２ＲＲＳとの間に位置する第３ＲＲＳを含み、その第１、第２、及び第３ＲＲＳが異種特異的である、すなわち、第１、第２、及び第３ＲＲＳが一致しないＲＲＳであり、それゆえ、第１、第２、及び第３ＲＲＳのいずれか２つが、リコンビナーゼ媒介組換えの影響を受けないことになること、ｂ）ａ）で提供される細胞中に、組込み外因性ヌクレオチド配列上の第１及び第３ＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第１外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第２選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含む第１ベクターを導入すること、ｃ）ａ）で提供される細胞中に、組込み外因性ヌクレオチド配列上の第２及び第３ＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第２外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳを含む第２ベクターを導入すること、ｄ）１つ以上のリコンビナーゼを導入し、その１つ以上のリコンビナーゼがＲＲＳを認識すること、ならびにｅ）第２選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、目的の第１及び第２ポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む。
【0016】
ある特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現する方法を提供し、本方法は、ａ）宿主細胞ゲノムの座位内に組み込まれた２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの選択マーカーを含む宿主細胞を提供し、その座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であること、ならびにｂ）ＳＯＩを発現し、そこから目的のポリペプチドを回収するのに好適な条件下でａ）の細胞を培養することを含む。
【0017】
ある特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現する方法を提供し、本方法は、ａ）宿主細胞ゲノムの座位内に組み込まれた少なくとも２つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの選択マーカーを含む宿主細胞を提供し、その座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び１つの選択マーカーが、第１及び第３ＲＲＳに隣接し、少なくとも１つの外因性ＳＯＩが、第２及び第３ＲＲＳに隣接すること、ならびにｂ）ＳＯＩを発現し、そこから目的のポリペプチドを回収するのに好適な条件下でａ）の細胞を培養することを含む。
【0018】
本明細書で開示される主題はまた、ＴＩ宿主細胞の使用によって目的のポリペプチドを産生する組成物及び方法を提供する。そのような組成物及び方法は、ＴＩ宿主細胞中への外因性ヌクレオチド配列の組込みを促進するポリヌクレオチド及びベクターに加えて、外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞及び組成物ならびにその使用方法を含むが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、ベクターは、ＤＮＡカセットに隣接する配列番号１～７から選択される配列と少なくとも５０％相同のヌクレオチド配列を含み得、そのＤＮＡカセットは、２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの選択マーカー及び少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む。ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、組込みファージベクター、非ウイルスベクター、トランスポゾン及び／またはトランスポザーゼベクター、インテグラーゼ基質、ならびにプラスミドからなる群から選択され得る。
【0019】
ある特定の実施形態では、本開示の方法は、相同組換え、相同組換え修復（ＨＤＲ）、及び／または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による、宿主細胞中への目的のポリペプチドをコードする外因性核酸の標的組込みを含む。ある特定の実施形態では、そのような方法は、ＬＯＣ１０７９７７０６２（配列番号１）、ＬＯＣ１００７６８８４５（配列番号２）、ＩＴＰＲ２（配列番号３）、ＥＲＥ６７０００．１（配列番号４）、ＵＢＡＰ２（配列番号５）、ＭＴＭＲ２（配列番号６）、ＸＰ＿００３５１２３３１．２（配列番号７）、及びそれらと少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択される内因性遺伝子内の部位における、目的のポリペプチドをコードする外因性核酸の細胞中への組込みを含む。ある特定の実施形態では、そのような方法は、宿主細胞ゲノムの座位内の部位における、目的のポリペプチドをコードする外因性核酸の細胞中への組込みを含み、その座位は、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であるヌクレオチド配列を含む。
【0020】
ある特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、本方法は、ａ）宿主細胞ゲノムの座位を含む宿主細胞を提供し、その座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であること、ｂ）ベクターを宿主細胞中に導入し、そのベクターが、ＤＮＡカセットに隣接する配列番号１～７から選択される配列と少なくとも５０％相同のヌクレオチド配列を含み、そのＤＮＡカセットが、２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの選択マーカー及び少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含むこと、ならびにｃ）選択マーカーを選択し、ゲノム座位中に組み込まれたＳＯＩを有するＴＩ宿主細胞を単離して目的のポリペプチドを発現させることを含む。ある特定の実施形態では、そのような方法は、標的組込みを促進するための外因性ヌクレアーゼの使用を含む。外因性ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＺＦＮ二量体、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＴＡＬエフェクタードメイン融合タンパク質、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、操作されたメガヌクレアーゼ、及び規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼからなる群から選択され得る。
【0021】
ある特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、本方法は、ａ）ＴＩ宿主細胞ゲノムの１箇所以上の座位内における部位に組み込まれた少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供し、その１箇所以上の座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、その外因性ヌクレオチド配列が１つ以上のＲＲＳを含むこと、ｂ）ａ）で提供される細胞中に、組込み外因性ヌクレオチド配列上の１つ以上のＲＲＳと一致し、調節可能なプロモーターに機能的に連結される少なくとも１つの外因性ＳＯＩに隣接する１つ以上のＲＲＳを含むベクターを導入すること、ｃ）リコンビナーゼまたはリコンビナーゼをコードする核酸を導入し、そのリコンビナーゼがＲＲＳを認識すること、ならびにｄ）誘導物質の存在下で外因性ＳＯＩを発現するＴＩ細胞を選択することによって、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む。
【0022】
ある特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現する方法を提供し、本方法は、ａ）宿主細胞ゲノムの座位内に組み込まれた２つのＲＲＳに隣接し、調節可能なプロモーターに機能的に連結される少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む宿主細胞を提供し、その座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であること、ならびにｂ）ＳＯＩを発現し、そこから目的のポリペプチドを回収するのに好適な条件下で細胞を培養することを含む。
【0023】
ある特定の実施形態では、本開示は、目的の第１及び第２ポリペプチド（ここで第１及び第２ポリペプチドは、同じかまたは異なり得る）を発現するＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、本方法は、ａ）宿主細胞ゲノムの座位内における部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供し、その座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、その外因性ヌクレオチド配列が、第１、第２ＲＲＳ及び第１ＲＲＳと第２ＲＲＳとの間に位置する第３ＲＲＳを含み、その第１、第２、及び第３ＲＲＳが異種特異的である、すなわち、第１、第２、及び第３ＲＲＳが一致しないＲＲＳであり、それゆえ、第１、第２、及び第３ＲＲＳのいずれか２つが、リコンビナーゼ媒介組換えの影響を受けないことになること、ｂ）ａ）で提供される細胞中に、組込み外因性ヌクレオチド配列上の第１及び第３ＲＲＳと一致し、調節可能なプロモーターに機能的に連結される少なくとも１つの第１外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳを含む第１ベクターを導入すること、ｃ）ａ）で提供される細胞中に、組込み外因性ヌクレオチド配列上の第２及び第３ＲＲＳと一致し、調節可能なプロモーターに機能的に連結される少なくとも１つの第２外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳを含む第２ベクターを導入すること、ｄ）１つ以上のリコンビナーゼ、または１つ以上のリコンビナーゼをコードする１つ以上の核酸を導入し、その１つ以上のリコンビナーゼがＲＲＳを認識すること、ならびにｅ）誘導物質の存在下で外因性ＳＯＩを発現するＴＩ細胞を選択することによって、目的の第１及び第２ポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む。
【図面の簡単な説明】
【0024】
【図1】抗体の安定した高発現を可能にする、ＣＨＯ ＴＩ座位を同定するためのゲノムワイドスクリーニングステップの概要を示す略図である。
【図2】標的抗体を発現する集団を生成するために利用された２つの二重選択スキームを示す。トランスポザーゼ生成ＴＩ宿主がＡに示され、ランダム組込み生成ＴＩ宿主がＢに示される。
【図3】２つの特定のＴＩ宿主によって生成された上位クローンの生産性を示す。
【図4】３つのＲＲＳ部位を使用し、２つの独立したＲＭＣＥを同時に実施することを含む２プラスミドＲＭＣＥ方針を示す。１つのベクター（前方）は、ＲＲＳ１、第１ＳＯＩ及びプロモーター（Ｐ）に続いて開始コドン（ＡＴＧ）及びＲＲＳ３を含む。他方のベクター（後方）は、開始コドン（ＡＴＧ）を持たないマーカーのコード配列に融合したＲＲＳ３、ＳＯＩ２及びＲＲＳ２を含む。２つのプラスミドが正確に標的する場合に限り、選択マーカーの完全な発現カセットが組み立てられ、それゆえ選択に対する耐性を細胞に付与することになる。
【図5】抗体Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、及びＪの発現に関連して単一ベクターまたは２ベクターＲＭＣＥのいずれかを使用した結果を示す。ＦＡＣＳ、ゲノムＰＣＲ、及び遺伝子コピー解析を評価し、両方のプラスミドカセットが正確にＴＩ部位を標的としたかを確認した。２プラスミドＲＭＣＥでは、単一プラスミドＲＭＣＥと比較した場合、より多くの総ＨＣ及びＬＣコピーがＴＩ部位を標的とした。
【図6】６つの分子の力価を示す。
【図7】複合ｍＡｂ形式を発現させるために２ベクターＲＭＣＥを使用した結果を示す。各々が４本の異なる鎖（２本のＨＣ及び２本のＬＣ）を要する２つの二重特異性分子を、産生及び％二重特異性形成についてアッセイした。どちらの場合も、８０％超の二重特異性含量で１．５ｇ／Ｌ超を示す細胞株を開発した。
【図8】４つの二重特異性分子に関する１４日目の力価を示す。
【図9A】ＲＴＩシステムでｍＡｂ－ＩまたはｍＡｂ－ＩＩを発現する細胞株の生成を示す。細胞株開発の組織学的結果がＡに示される。
【図9B】ＲＴＩシステムでｍＡｂ－ＩまたはｍＡｂ－ＩＩを発現する細胞株の生成を示す。ＲＴＩ細胞株開発（ＣＬＤ）プロセスの概略図がＢに示される。
【図10A】ｍＡｂ－ＩまたはｍＡｂ－ＩＩを発現する細胞株の力価及び比生産性の結果を示す。産生終了力価がＡに示される。
【図10B】ｍＡｂ－ＩまたはｍＡｂ－ＩＩを発現する細胞株の力価及び比生産性の結果を示す。産生終了ＩＶＣＣがＢに示される。
【図10C】ｍＡｂ－ＩまたはｍＡｂ－ＩＩを発現する細胞株の力価及び比生産性の結果を示す。産生終了比生産性がＣに示される。
【図11】ｍＡｂ－Ｉ及びｍＡｂ－ＩＩ発現細胞株のＨＣ及びＬＣ ｍＲＮＡの発現レベルを示す。ＨＣ ｍＲＮＡの発現レベルがＡに示され、ＨＬ ｍＲＮＡの発現レベルがＢに示される。
【図12A】ｍＡｂ－ＩまたはｍＡｂ－ＩＩを発現する細胞株中のＨＣ、ＨＬ及びＢｉＰ分子の細胞内レベルを示す。ＲＴＩシステムに対するシクロヘキシミド及びＤｏｘの効果に関する概略図がＡに示される。
【図12B】ｍＡｂ－ＩまたはｍＡｂ－ＩＩを発現する細胞株中のＨＣ、ＨＬ及びＢｉＰ分子の細胞内レベルを示す。ｍＡｂ－ＡまたはｍＡｂ－Ｂを発現する細胞株の上清中におけるＨＣ、ＬＣ及びＢｉＰの細胞内レベルに加えてＨＣ及びＬＣレベルが、Ｂに示される。
【図12C】ｍＡｂ－ＩまたはｍＡｂ－ＩＩを発現する細胞株中のＨＣ、ＨＬ及びＢｉＰ分子の細胞内レベルを示す。一晩ＣＨＸで処理した後のｍＡｂ－ＩまたはｍＡｂ－ＩＩを発現する細胞株のＨＣ、ＬＣ及びＢｉＰの細胞内レベルが、Ｃに示される。
【図12D】ｍＡｂ－ＩまたはｍＡｂ－ＩＩを発現する細胞株中のＨＣ、ＨＬ及びＢｉＰ分子の細胞内レベルを示す。培養培地からのドキシサイクリン除去後のｍＡｂ－ＩまたはｍＡｂ－ＩＩを発現する細胞株のＨＣ、ＬＣ及びＢｉＰの細胞内レベルが、Ｄに示される。
【図13A】ＢｉＰの細胞内蓄積とｍＡｂ－Ｉ ＬＣ発現との間の相関関係を示す。産生終了力価がＡに示される。
【図13B】ＢｉＰの細胞内蓄積とｍＡｂ－Ｉ ＬＣ発現との間の相関関係を示す。ＨＣ、ＬＣ及びＢｉＰの蓄積がＢに示される。
【図13C】ＢｉＰの細胞内蓄積とｍＡｂ－Ｉ ＬＣ発現との間の相関関係を示す。鎖交換実験の略図がＣに示される。
【図13D】ＢｉＰの細胞内蓄積とｍＡｂ－Ｉ ＬＣ発現との間の相関関係を示す。ｍＡｂ－Ｉ、ｍＡｂ－ＩＩ、またはこれらの分子の鎖交換型を発現するＲＴＩプールのＨＣ、ＬＣ及びＢｉＰの細胞内レベルが、Ｄに示される。
【図14A】この分子のプール発現に対するｍＡｂ－Ａ ＨＣ及びＨＬの寄与を示す。産生終了力価がＡに示される。
【図14B】この分子のプール発現に対するｍＡｂ－Ａ ＨＣ及びＨＬの寄与を示す。産生終了ＩＶＣＣがＢに示される。
【図14C】この分子のプール発現に対するｍＡｂ－Ａ ＨＣ及びＨＬの寄与を示す。産生終了比生産性がＣに示される。
【図15】発現低下の一因となる可能性のあるＬＣ及びＨＣのＣＤＲ領域を示す。ｍＡｂ－Ｉ及びｍＡｂ－ＩＩ ＬＣサブユニットの略図がＡに示される。ｍＡｂ－Ｉ及びｍＡｂ－ＩＩ ＨＣ領域の略図がＢに示される。
【図16A】ＨＣＡの発現に関連してＨＣ定常領域で２つの点変異を使用した結果を示す。ｍＡｂ－Ｉ及びｍＡｂ－ＩＩのＨＣ及びＬＣサブユニット間の様々な鎖交換の産生終了力価が、Ａに示される。
【図16B】ＨＣＡの発現に関連してＨＣ定常領域で２つの点変異を使用した結果を示す。様々なＲＴＩプールのＨＣ、ＬＣ及びＢｉＰの細胞内レベルがＢに示される。
【図16C】ＨＣＡの発現に関連してＨＣ定常領域で２つの点変異を使用した結果を示す。低タンパク質発現の診断ツールとしてのＲＴＩシステム利用に関する概略図が、Ｃに示される。
【図17-1】２つの異なる細胞培養プロセスを使用した産生を示す。
【図17-2】２つの異なる細胞培養プロセスを使用した産生を示す。
【図18】３つのｍＡｂのＲＭＣＥプールに関する力価及び比生産性の結果を示す。ＨＬ及びＨＬＬ構成を比較した３つのｍＡｂのＲＭＣＥプールに関する１４日目の力価が、Ａに示される。ＨＬ及びＨＬＬ構成を比較した３つのｍＡｂのＲＭＣＥプールに関する１４日目の比生産性（Ｑｐ）が、Ｂに示される。Ａのプールから生成されたクローンの１４日目の力価がＣに示される。Ａのプールから生成されたクローンの１４日目のＱｐがＤに示される。Ｃ及びＤでは、構成ごとに６つのクローンを試験した。
【図19A】３つの異なるプラスミド構成を比較したｍＡｂ ＹのＲＭＣＥプールに関する力価、Ｑｐ、及び増殖（生細胞濃度の積分、ＩＶＣＣで表される）、ｍＲＮＡ発現ならびにタンパク質発現を示す。１４日目の力価、Ｑｐ、及び増殖（生細胞濃度の積分、ＩＶＣＣで表される）が、それぞれＡ、Ｂ及びＣに示される。各バーは、単一プールからのデータを表す。Ａは、プールからのシードトレインｍＲＮＡ発現及び細胞内抗体タンパク質発現である。
【図19B】３つの異なるプラスミド構成を比較したｍＡｂ ＹのＲＭＣＥプールに関する力価、Ｑｐ、及び増殖（生細胞濃度の積分、ＩＶＣＣで表される）、ｍＲＮＡ発現ならびにタンパク質発現を示す。１４日目の力価、Ｑｐ、及び増殖（生細胞濃度の積分、ＩＶＣＣで表される）が、それぞれＡ、Ｂ及びＣに示される。各バーは、単一プールからのデータを表す。
【図19C】３つの異なるプラスミド構成を比較したｍＡｂ ＹのＲＭＣＥプールに関する力価、Ｑｐ、及び増殖（生細胞濃度の積分、ＩＶＣＣで表される）、ｍＲＮＡ発現ならびにタンパク質発現を示す。１４日目の力価、Ｑｐ、及び増殖（生細胞濃度の積分、ＩＶＣＣで表される）が、それぞれＡ、Ｂ及びＣに示される。各バーは、単一プールからのデータを表す。
【図19D】３つの異なるプラスミド構成を比較したｍＡｂ ＹのＲＭＣＥプールに関する力価、Ｑｐ、及び増殖（生細胞濃度の積分、ＩＶＣＣで表される）、ｍＲＮＡ発現ならびにタンパク質発現を示す。重鎖及び軽鎖のｍＲＮＡ発現を、ＨＬＬ－ＨＬ構成を基準として正規化し、各バーは４つの技術的複製物の平均である（エラーバーは標準偏差である）。重鎖及び軽鎖のｍＲＮＡ発現を、ＨＬＬ－ＨＬ構成を基準として正規化した。
【図19E】３つの異なるプラスミド構成を比較したｍＡｂ ＹのＲＭＣＥプールに関する力価、Ｑｐ、及び増殖（生細胞濃度の積分、ＩＶＣＣで表される）、ｍＲＮＡ発現ならびにタンパク質発現を示す。ウェスタンブロットから定量化し、ＨＬＬ－ＨＬ構成を基準として正規化した全てのプールからの細胞内重鎖及び軽鎖タンパク質発現がＥに示され、各バーは３つの技術的複製物の平均である（エラーバーは標準偏差である）。
【図19F】３つの異なるプラスミド構成を比較したｍＡｂ ＹのＲＭＣＥプールに関する力価、Ｑｐ、及び増殖（生細胞濃度の積分、ＩＶＣＣで表される）、ｍＲＮＡ発現ならびにタンパク質発現を示す。Ｅに示されるデータの代表的なウェスタンブロット画像がＦに示される。
【図20A】３つの異なる構成を有するＲＭＣＥプールから生成したｍＡｂ ＹまたはｍＡｂ ＩＩＩを発現する単クローンの力価、Ｑｐ、及び増殖（生細胞濃度の積分、ＩＶＣＣで表される）を示す。ｍＡｂ Ｙを発現する単クローンの１４日目の力価がＡに示される。
【図20B】３つの異なる構成を有するＲＭＣＥプールから生成したｍＡｂ ＹまたはｍＡｂ ＩＩＩを発現する単クローンの力価、Ｑｐ、及び増殖（生細胞濃度の積分、ＩＶＣＣで表される）を示す。ｍＡｂ Ｙを発現する単クローンの１４日目のＱｐがＢに示される。
【図20C】３つの異なる構成を有するＲＭＣＥプールから生成したｍＡｂ ＹまたはｍＡｂ ＩＩＩを発現する単クローンの力価、Ｑｐ、及び増殖（生細胞濃度の積分、ＩＶＣＣで表される）を示す。ｍＡｂ Ｙを発現するクローンの１４日目のＩＶＣＣがＣに示される。
【図20D】３つの異なる構成を有するＲＭＣＥプールから生成したｍＡｂ ＹまたはｍＡｂ ＩＩＩを発現する単クローンの力価、Ｑｐ、及び増殖（生細胞濃度の積分、ＩＶＣＣで表される）を示す。ｍＡｂ ＩＩＩを発現する単クローンの１４日目の力価がＤに示される。
【図20E】３つの異なる構成を有するＲＭＣＥプールから生成したｍＡｂ ＹまたはｍＡｂ ＩＩＩを発現する単クローンの力価、Ｑｐ、及び増殖（生細胞濃度の積分、ＩＶＣＣで表される）を示す。ｍＡｂ ＩＩＩを発現する単クローンの１４日目のＱｐがＥに示される。
【図20F】３つの異なる構成を有するＲＭＣＥプールから生成したｍＡｂ ＹまたはｍＡｂ ＩＩＩを発現する単クローンの力価、Ｑｐ、及び増殖（生細胞濃度の積分、ＩＶＣＣで表される）を示す。ｍＡｂ ＩＩＩを発現するクローンの１４日目のＩＶＣＣがＦに示される。
【図21A】様々な構成のＲＭＣＥプールの発現レベル、力価及びＱｐを示す。鎖発現に対するプラスミド位置の効果を評価するためにトランスフェクトした１本の重鎖、１本の軽鎖プラスミドの概略図がＡに示される。抗体重鎖（Ｈと略される）及び軽鎖（Ｌと略される）は、同じプラスミド上で発現されるか、または前方及び後方プラスミド間で分割されるかのいずれかであった。Ｌ３、Ｌｏｘｆａｓ、及び２Ｌ部位に注目し、後方プラスミド中のｐａｃピューロマイシン耐性遺伝子にも同様に注目する。
【図21B】様々な構成のＲＭＣＥプールの発現レベル、力価及びＱｐを示す。Ａで概要が述べられているＤＮＡ構成を有するプールからの重鎖及び軽鎖のシードトレインｍＲＮＡ発現がＢに示される。
【図21C】様々な構成のＲＭＣＥプールの発現レベル、力価及びＱｐを示す。様々な構成のＲＭＣＥプールに関する１４日目の力価がＣに示される。
【図21D】様々な構成のＲＭＣＥプールの発現レベル、力価及びＱｐを示す。様々な構成の１４日目のＱｐがＤに示される。
【図21E】様々な構成のＲＭＣＥプールの発現レベル、力価及びＱｐを示す。プールの重鎖及び軽鎖ＤＮＡコピー数がＥに示される。
【図22A】ｍＡｂの高分子量種（ＨＭＷＳ）パーセンテージに対するＨＣ：ＬＣ比の効果が、ＴＩ部位に依存しないことを示す。宿主７細胞上の抗体Ｓに関する１４日目の力価がＡに示される。
【図22B】ｍＡｂの高分子量種（ＨＭＷＳ）パーセンテージに対するＨＣ：ＬＣ比の効果が、ＴＩ部位に依存しないことを示す。宿主７細胞上の抗体Ｓの高分子量種（ＨＭＷＳ）パーセンテージがＢに示される。
【図22C】ｍＡｂの高分子量種（ＨＭＷＳ）パーセンテージに対するＨＣ：ＬＣ比の効果が、ＴＩ部位に依存しないことを示す。宿主４細胞上の抗体Ｓに関する１４日目の力価がＣに示される。
【図22D】ｍＡｂの高分子量種（ＨＭＷＳ）パーセンテージに対するＨＣ：ＬＣ比の効果が、ＴＩ部位に依存しないことを示す。宿主４細胞上の抗体Ｓの高分子量種（ＨＭＷＳ）パーセンテージがＤに示される。
【図23A】抗体ＩＶの生産性及び高分子量種（ＨＭＷＳ）に対するＨＣ：ＬＣ比の効果を示す。宿主４細胞上の抗体ＩＶに関する１４日目の力価がＡに示される。
【図23B】抗体ＩＶの生産性及び高分子量種（ＨＭＷＳ）に対するＨＣ：ＬＣ比の効果を示す。宿主４細胞上の抗体ＩＶの高分子量種（ＨＭＷＳ）パーセンテージがＢに示される。
【図24A】２部位ＴＩ宿主細胞中における抗体ＶＩの生産性及び高分子量種（ＨＭＷＳ）に対するＨＣ：ＬＣ比の効果を示す。２部位ＴＩ宿主細胞上の抗体ＶＩに関する１４日目の力価がＡに示される。
【図24B】２部位ＴＩ宿主細胞中における抗体ＶＩの生産性及び高分子量種（ＨＭＷＳ）に対するＨＣ：ＬＣ比の効果を示す。２部位ＴＩ宿主細胞上の抗体ＩＶの高分子量種（ＨＭＷＳ）パーセンテージがＢに示される。
【図25】２つのクローンが、それぞれ８．４及び８．７ｇ／Ｌの力価を有し、７．４％及び５．６％の凝集体を含むことを示す。
【図26】異なる調節された標的組込み細胞株における抗体Ｚの１４日目の力価を示す。
【図27】異なる調節された標的組込み細胞株における抗体Ｚの比生産性を示す。
【発明を実施するための形態】
【0025】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される宿主細胞、遺伝子構築物（例えば、ベクター）、組成物、及び方法は、標的組込み（ＴＩ）宿主細胞の開発及び／または使用に用いられ得る。ある特定の実施形態では、そのようなＴＩ宿主細胞は、宿主細胞ゲノムの特定の遺伝子または特定の座位内に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む。
【0026】
限定のためではなく開示を明確にするために、詳細な説明が以下のサブセクションに分割される：
１．定義
２．組込み部位
３．外因性ヌクレオチド配列
４．宿主細胞
５．標的組込み
６．ＴＩ宿主細胞の調製及び使用
７．産物
８．例示的な非限定的実施形態
１．定義
２．組込み部位
３．外因性ヌクレオチド配列
４．宿主細胞
５．標的組込み
６．ＴＩ宿主細胞の調製及び使用
７．産物
８．例示的な非限定的実施形態
【0027】
１．定義
別段の規定がない限り、本明細書で使用される全ての専門用語及び科学用語は、当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含む本文献によって規定されることになる。好ましい方法及び材料については以下で説明されるが、本明細書に記載されるものと類似するか、または同等の方法及び材料も、本明細書で開示される主題の実施または試験に使用され得る。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、それら全体が参照によって組み込まれる。本明細書に開示される材料、方法、及び例は、例示的にすぎず、限定することを意図するものではない。
別段の規定がない限り、本明細書で使用される全ての専門用語及び科学用語は、当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含む本文献によって規定されることになる。好ましい方法及び材料については以下で説明されるが、本明細書に記載されるものと類似するか、または同等の方法及び材料も、本明細書で開示される主題の実施または試験に使用され得る。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は、それら全体が参照によって組み込まれる。本明細書に開示される材料、方法、及び例は、例示的にすぎず、限定することを意図するものではない。
【0028】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「できる（ｃａｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」という用語、及びそれらの変化形は、本明細書で使用される場合、追加の行為または構造の可能性を排除することのないオープンエンドな移行句、用語、または単語であること意図する。単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、その文脈に別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。本開示はまた、明示的に記載されているか否かにかかわらず、本明細書に提示される実施形態または要素「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」、及び「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」他の実施形態も企図する。
【0029】
本明細書における数値範囲の列挙について、それらの間に介在する同程度の正確さを有する各数値が明示的に企図される。例えば、６～９の範囲では、６及び９に加えて、数値７及び８が企図され、範囲６．０～７．０では、数値６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び７．０が、明示的に企図される。
【0030】
本明細書で使用される場合、「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定されるような特定の値の許容誤差範囲内を意味し、値の測定方法または決定方法、すなわち、測定システムの限界に部分的に依存することになる。例えば、「約」は、当該技術分野における慣習に従って、３または３を超える標準偏差内を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％、好ましくは最大１０％、より好ましくは最大５％、さらにより好ましくは最大１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に生物系またはプロセスに関して、本用語は値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味し得る。
【0031】
本明細書で使用される場合、「選択マーカー」という用語は、対応する選択剤の存在下で、その遺伝子を保持する細胞が特異的に選択されるか、またはそれに対して選択されることを可能にする遺伝子であり得る。例えば、限定する意図はないが、選択マーカーは、選択マーカー遺伝子で形質転換された宿主細胞が、遺伝子の存在下でポジティブに選択されることを可能にし得、非形質転換宿主細胞は、選択的条件下では増殖または生存できないことになる。選択マーカーは、ポジティブ、ネガティブ、または二機能性であり得る。ポジティブ選択マーカーは、マーカーを保持する細胞の選択を可能にし得るのに対して、ネガティブ選択マーカーは、マーカーを保持する細胞が選択的に排除されることを可能にし得る。選択マーカーは、薬物に対する耐性を付与し得る、または宿主細胞の代謝もしくは異化障害を補い得る。とりわけ、原核細胞では、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシンまたはクロラムフェニコールに対する耐性を付与する遺伝子が使用され得る。真核細胞で選択マーカーとして有用な耐性遺伝子としては、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシン及びＧ４１８ ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、アスパラギンシンテターゼ、トリプトファンシンテターゼ（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ）の遺伝子、ならびにピューロマイシン、ブラストサイジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、Ｚｅｏｃｉｎ、及びミコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。追加のマーカー遺伝子は、ＷＯ９２／０８７９６及びＷＯ９４／２８１４３に記載されている。
【0032】
選択マーカーは、対応する選択剤の存在下における選択を容易にする以外に、通常は細胞中に存在することのない分子をコードする遺伝子、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、改良型ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）、合成ＧＦＰ、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、改良型ＹＦＰ（ｅＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ－モノマー、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、及びＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅを代わりに提供し得る。そのような遺伝子を持つ細胞は、例えば、コードされたポリペプチドによって放射される蛍光を検出することによって、この遺伝子を持たない細胞と区別され得る。
【0033】
本明細書で使用される場合、「機能的に連結される」という用語は、２つ以上の構成要素の並置を指し、その構成要素は、それらがその意図される手法で機能することを可能する関係にある。例えば、プロモーター及び／またはエンハンサーは、そのプロモーター及び／またはエンハンサーが、コード配列の転写を調節するように機能する場合、コード配列に機能的に連結されている。ある特定の実施形態では、「機能的に連結されている」ＤＮＡ配列は、単一染色体上で連続かつ隣接している。ある特定の実施形態では、例えば、分泌リーダー及びポリペプチドなどの２つのタンパク質をコードする領域を結合させる必要がある場合、配列は連続して隣接し、同じリーディングフレーム内に存在する。ある特定の実施形態では、機能的に連結されているプロモーターは、コード配列の上流に位置し、それに隣接し得る。ある特定の実施形態では、例えば、コード配列の発現を調節するエンハンサー配列に関して、２つの構成要素は隣接していないが、機能的に連結され得る。エンハンサーは、そのエンハンサーがコード配列の転写を増加させる場合、コード配列に機能的に連結されている。機能的に連結されているエンハンサーは、コード配列の上流、配列内、または配列の下流に位置し得、コード配列のプロモーターとは相当な距離を置いて位置し得る。機能的連結は、当該技術分野において既知の組換え方法によって、例えば、ＰＣＲ手法を使用して、及び／または都合の良い制限部位でのライゲーションによって達成され得る。都合の良い制限部位が存在しない場合には、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来方法に従って使用され得る。内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）は、それが５’末端に依存しない手法で内部位置においてオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳を開始できる場合、ＯＲＦに機能的に連結されている。
【0034】
本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、転写及び／または翻訳を指す。ある特定の実施形態では、所望の産物の転写レベルは、存在している対応するｍＲＮＡの量に基づいて決定され得る。例えば、目的の配列から転写されたｍＲＮＡは、ＰＣＲによって、またはノーザンハイブリダイゼーションによって定量され得る。ある特定の実施形態では、目的の配列によってコードされるタンパク質は、様々な方法によって、例えば、ＥＬＩＳＡによって、タンパク質の生物活性についてアッセイすることによって、またはそのような活性に依存しないアッセイ、例えば、タンパク質を認識してそれに結合する抗体を使用するウェスタンブロッティングもしくはラジオイムノアッセイなどを用いることによって定量され得る。
【0035】
本明細書における「抗体」という用語は、最も広義に使用され、抗体が所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、半抗体、及び抗体断片を含むが、これらに限定されない様々な抗体構造を包含する。
【0036】
本明細書で使用される場合、「抗体断片」という用語は、インタクトな抗体が結合する抗原と結合する、インタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の抗体断片の概説については、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１１２６－１１３６（２００５）を参照のこと。
【0037】
本明細書で使用される場合、「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体と抗原との結合に関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖（それぞれ、ＶＨ及びＶＬ）の可変ドメインは、一般に類似した構造を有し、各ドメインが４つの保存フレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。（例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ ｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，ｐａｇｅ ９１（２００７）を参照のこと。）単一ＶＨまたはＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分な場合がある。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、その抗原と結合する抗体からのＶＨまたはＶＬドメインを使用して単離され、それぞれ相補的なＶＬまたはＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングしてよい。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０－８８７（１９９３）、Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）を参照のこと。
【0038】
本明細書で使用される場合、「重鎖」という用語は、免疫グロブリン重鎖を指す。
【0039】
本明細書で使用される場合、「軽鎖」という用語は、免疫グロブリン軽鎖を指す。
【0040】
抗体の「クラス」は、その重鎖が有する定常ドメインまたは定常領域の種類を指す。抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在し、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２にさらに分類される場合がある。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【0041】
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が同一であり、及び／または同じエピトープと結合するが、例えば、天然に存在する変異を含有する、またはモノクローナル抗体調製物の産生中に発生する可能性のあるバリアント抗体を除き、そのようなバリアントは一般に少量で存在する。異なる決定基（エピトープ）を対象とする異なる抗体を典型的に含む、ポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対象とする。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体の集団から得られるような抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本発明に従うモノクローナル抗体は、様々な技術、例えば、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン座位の全てまたは一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含むが、これらに限定されない技術によって作製されてよく、モノクローナル抗体を作製するそのような方法及び他の例示的な方法は、本明細書に記載されている。
【0042】
「多重特異性抗体」は、少なくとも２つの異なる部位、すなわち、異なる抗原上の異なるエピトープまたは同じ抗原上の異なるエピトープに対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。ある特定の態様では、多重特異性抗体は３つ以上の結合特異性を有する。多重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片として調製されてよい。
【0043】
「全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」という用語は、本明細書では天然抗体構造と実質的に類似した構造を有する、または本明細書で定義されるようなＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指すように同じ意味で使用される。
【0044】
「抗体断片」は、インタクトな抗体が結合する抗原と結合する、インタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、直鎖状抗体、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ、及びｓｃＦａｂ）、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）、ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の抗体断片の概説については、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１１２６－１１３６（２００５）を参照のこと。
【0045】
「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／または軽鎖の一部が特定の供給源または種に由来する一方で、重鎖及び／または軽鎖の残部が、異なる供給源または種に由来する抗体を指す。
【0046】
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生される抗体またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体をコードする配列を利用する非ヒト供給源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。
【0047】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＣＤＲのアミノ酸残基及びヒトＦＲのアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。ある特定の態様では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの全てを実質的に含み、そのドメイン中ではＣＤＲの全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のＣＤＲに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト抗体のＦＲに対応することになる。ヒト化抗体は場合により、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を経た抗体を指す。「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が同一であり、及び／または同じエピトープと結合するが、例えば、天然に存在する変異を含有する、またはモノクローナル抗体調製物の産生中に発生する可能性のあるバリアント抗体を除き、そのようなバリアントは一般に少量で存在する。異なる決定基（エピトープ）を対象とする異なる抗体を典型的に含む、ポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対象とする。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体の集団から得られるような抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。
【0048】
「治療用抗体」という用語は、疾患の処置に使用される抗体を指す。治療用抗体は、様々な作用機序を有する場合がある。治療用抗体は、抗原と関連する標的と結合し、その正常な機能を中和する場合がある。例えば、がん細胞の生存に必要なタンパク質の活性をブロックするモノクローナル抗体は、細胞死を引き起こす。別の治療用モノクローナル抗体は、抗原と関連する標的と結合し、その正常な機能を活性化する場合がある。例えば、モノクローナル抗体は、細胞上のタンパク質に結合し、アポトーシスシグナルを誘導し得る。さらに別のモノクローナル抗体は、患部組織上でのみ発現される標的抗原に結合する可能性があり、毒性ペイロード（効果的な薬剤）、例えば、化学療法剤または放射性薬剤などとモノクローナル抗体との複合化によって、毒性ペイロードを患部組織に特異的に送達するための薬剤が作製され、健康な組織への害が減少し得る。治療用抗体の「生物学的に機能的断片」は、インタクトな抗体に起因する生物学的機能の一部または全てではないとしても、少なくとも１つを示し、その機能は少なくとも標的抗原への特異的結合を含むことになる。
【0049】
「診断用抗体」という用語は、疾患の診断試薬として使用される抗体を指す。診断用抗体は、特定の疾患と特異的に関連するか、または特定の疾患において発現の増加を示す標的抗原に結合する場合がある。診断用抗体は、例えば、患者からの生体試料中において、または患者の腫瘍などの疾患部位に関する画像診断において標的を検出するために使用されてよい。診断用抗体の「生物学的に機能的断片」は、インタクトな抗体に起因する生物学的機能の一部または全てではないとしても、少なくとも１つを示し、その機能は少なくとも標的抗原への特異的結合を含むことになる。
【0050】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」という用語は同じ意味で使用され、外因性核酸が導入されている細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換細胞」を含み、それらは初代形質転換細胞及び継代の数に関係なくそれらに由来する子孫を含む。子孫は、親細胞と核酸含有量の点で完全に同一ではない場合があるが、変異を含有する場合もある。元々の形質転換細胞中でスクリーニングされた、または選択されたものと同じ機能または生物活性を有する変異体子孫が、本明細書に含まれる。
【0051】
「核酸分子」または「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び／または物質を含む。各ヌクレオチドは、塩基、特にプリン塩基またはピリミジン塩基（すなわち、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ））、糖（すなわち、デオキシリボースまたはリボース）、及びリン酸基で構成される。多くの場合、核酸分子は塩基の配列によって記載され、それにより塩基は核酸分子の一次構造（線状構造）を表す。塩基の配列は通常、５’～３’で表される。本明細書において、核酸分子という用語は、例えば、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）及びゲノムＤＮＡを含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、特にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡまたはＲＮＡの合成形態、ならびにこれらの分子のうち２つ以上を含む混合ポリマーを包含する。核酸分子は、線状または環状であってよい。加えて、核酸分子という用語は、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方に加えて、一本鎖及び二本鎖形態を含む。さらに、本明細書に記載される核酸分子は、天然に存在するか、または天然に存在しないヌクレオチドを含有し得る。天然に存在しないヌクレオチドの例としては、誘導体化された糖もしくはリン酸骨格結合を有する修飾ヌクレオチド塩基または化学的に修飾された残基が挙げられる。核酸分子はまた、インビトロ及び／またはインビボで、例えば、宿主または患者中における本発明の抗体の直接発現を目的としたベクターとして好適なＤＮＡ及びＲＮＡ分子を包含する。そのようなＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ベクターは、修飾され得ないか、または修飾され得る。例えば、ｍＲＮＡは、ｍＲＮＡを対象に注入するとインビボで抗体を生成することができるように、ＲＮＡベクターの安定性及び／またはコードされた分子の発現を増強するために化学的に修飾され得る（例えば、Ｓｔａｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１７、２０１７年６月１２日にオンライン出版、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．４３５６またはＥＰ ２ １０１ ８２３ Ｂ１を参照のこと）。
【0052】
「単離」核酸は、その自然環境の構成成分から分離されている核酸分子を指す。単離核酸は、核酸分子を通常含有する細胞中に含有される核酸分子を含むが、その核酸分子は、染色体外に、またはその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
【0053】
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、核酸分子に連結される別の核酸を増殖できる核酸分子を指す。本用語は、自己複製核酸構造としてのベクターに加えて、ベクターが導入されている宿主細胞のゲノム中に組み込まれるベクターを含む。ある特定の実施形態では、ベクターは、それらが機能的に連結されている核酸の発現を誘導する。そのようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と称される。
【0054】
本明細書で使用される場合、「相同配列」という用語は、配列のアラインメントによって決定されるような、有意な配列類似性を共有する配列を指す。例えば、２つの配列は、約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または９９．９％相同であり得る。アラインメントは、アルゴリズム及びコンピュータプログラム、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＨＭＭＥを含むが、これらに限定されないものによって実施され、これは配列を比較し、要素、例えば、配列長、配列の識別情報及び類似性、ならびに配列のミスマッチ及びギャップの存在及び長さなどに基づいて一致の統計的有意性を算出する。相同配列は、ＤＮＡ配列及びタンパク質配列の両方を指し得る。
【0055】
本明細書で使用される場合、「隣接」という用語は、第１ヌクレオチド配列が、第２ヌクレオチド配列の５’末端もしくは３’末端、または両端のいずれかに位置することを指す。隣接ヌクレオチド配列は、第２ヌクレオチド配列に隣接し得るか、または第２ヌクレオチド配列から規定の距離にあり得る。隣接ヌクレオチド配列の長さに特定の制限はない。例えば、隣接配列は、若干の塩基対または数千の塩基対であり得る。ある特定の実施形態では、隣接ヌクレオチド配列の長さは、約少なくとも１５塩基対、少なくとも２０塩基対、少なくとも３０塩基対、少なくとも４０塩基対、少なくとも５０塩基対、少なくとも７５塩基対、少なくとも１００塩基対、少なくとも１５０塩基対、少なくとも２００塩基対、少なくとも３００塩基対、少なくとも４００塩基対、少なくとも５００塩基対、少なくとも１，０００塩基対、少なくとも１，５００塩基対、少なくとも２，０００塩基対、少なくとも３，０００塩基対、少なくとも４，０００塩基対、少なくとも５，０００塩基対、少なくとも６，０００塩基対、少なくとも７，０００塩基対、少なくとも８，０００塩基対、少なくとも９，０００塩基対、少なくとも１０，０００塩基対であり得る。
【0056】
本明細書で使用される場合、「外因性」という用語は、ヌクレオチド配列が宿主細胞に由来せず、従来のＤＮＡ送達方法によって、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、または形質転換方法によって宿主細胞中に導入されることを示す。「内因性」という用語は、ヌクレオチド配列が宿主細胞に由来することを指す。「外因性」ヌクレオチド配列は、塩基組成の点で同一である「内因性」対応物を有し得るが、「外因性」配列は、例えば、組換えＤＮＡ技術によって宿主細胞中に導入される。
【0057】
２．組込み部位
本明細書で開示される主題は、外因性ヌクレオチド配列の標的組込みに好適な宿主細胞を提供する。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、宿主細胞、すなわち、ＴＩ宿主細胞のゲノム上の組込み部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む。
本明細書で開示される主題は、外因性ヌクレオチド配列の標的組込みに好適な宿主細胞を提供する。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、宿主細胞、すなわち、ＴＩ宿主細胞のゲノム上の組込み部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む。
【0058】
「組込み部位」は、外因性ヌクレオチド配列が挿入されている宿主細胞ゲノム内の核酸配列を含む。ある特定の実施形態では、組込み部位は、宿主細胞ゲノム上の２つの隣接するヌクレオチド間に存在する。ある特定の実施形態では、組込み部位は、外因性ヌクレオチド配列が挿入され得るヌクレオチドのいずれかの間にヌクレオチドのストレッチを含む。ある特定の実施形態では、組込み部位は、ＴＩ宿主細胞ゲノムの特定の座位内に位置する。ある特定の実施形態では、組込み部位は、ＴＩ宿主細胞の内因性遺伝子内に存在する。
【0059】
ある特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、ＴＩ宿主細胞ゲノムの特定の座位内における部位に組み込まれる。ある特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列が組み込まれる座位は、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％相同である。
【0060】
ある特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、ＴＩ宿主細胞ゲノムの特定の座位内における部位に組み込まれる。ある特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列が組み込まれる座位は、コンティグＮＷ＿００６８７４０４７．１、ＮＷ＿００６８８４５９２．１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１、ＮＷ＿００３６１６４１２．１、ＮＷ＿００３６１５０６３．１、ＮＷ＿００６８８２９３６．１、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１から選択される配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％相同である。
【0061】
ある特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号１の合計で１～１，０００ｂｐ、１，０００～２，０００ｂｐ、２，０００～３，０００ｂｐ、３，０００～４，０００ｂｐ、及び４，０００～４，３０１ｂｐとなるヌクレオチドから選択される位置内に位置する組込み部位に組み込まれる。ある特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号２の合計で１～１００，０００ｂｐ、１００，０００～２００，０００ｂｐ、２００，０００～３００，０００ｂｐ、３００，０００～４００，０００ｂｐ、４００，０００～５００，０００ｂｐ、５００，０００～６００，０００ｂｐ、６００，０００～７００，０００ｂｐ、及び７００，０００～７２８７８５ｂｐとなるヌクレオチドから選択される位置内に位置する組込み部位に組み込まれる。ある特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号３の合計で１～１００，０００ｂｐ、１００，０００～２００，０００ｂｐ、２００，０００～３００，０００ｂｐ、３００，０００～４００，０００ｂｐ、及び４００，０００～４１３，９８３となるヌクレオチドから選択される位置内に位置する組込み部位に組み込まれる。ある特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号４の合計で１～１０，０００ｂｐ、１０，０００～２０，０００ｂｐ、２０，０００～３０，０００ｂｐ、及び３０，０００～３０，７５７ｂｐとなるヌクレオチドから選択される位置内に位置する組込み部位に組み込まれる。ある特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号５の合計で１～１０，０００ｂｐ、１０，０００～２０，０００ｂｐ、２０，０００～３０，０００ｂｐ、３０，０００～４０，０００ｂｐ、４０，０００～５０，０００ｂｐ、５０，０００～６０，０００ｂｐ、及び６０，０００～６８，９６２ｂｐとなるヌクレオチドから選択される位置内に位置する組込み部位に組み込まれる。ある特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号６の合計で１～１０，０００ｂｐ、１０，０００～２０，０００ｂｐ、２０，０００～３０，０００ｂｐ、３０，０００～４０，０００ｂｐ、４０，０００～５０，０００ｂｐ、及び５０，０００～５１，３２６ｂｐとなるヌクレオチドから選択される位置内に位置する組込み部位に組み込まれる。ある特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号７の合計で１～１０，０００ｂｐ、１０，０００～２０，０００ｂｐ、及び２０，０００～２２，９０４ｂｐとなるヌクレオチドから選択される位置内に位置する組込み部位に組み込まれる。
【0062】
ある特定の実施形態では、組込み外因性配列のすぐ５’側のヌクレオチド配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４１１９０－４５２６９、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド６３５９０－２０７９１１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド２５３８３１－４９１９０９、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド６９３０３－７９７６８、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド２９３４８１－３１５２６５、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６５０４４３－２６６２０５４、またはＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド８２２１４－９７７０５及びそれらと少なくとも５０％相同の配列からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、組込み外因性配列のすぐ５’側のヌクレオチド配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４１１９０－４５２６９、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド６３５９０－２０７９１１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド２５３８３１－４９１９０９、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド６９３０３－７９７６８、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド２９３４８１－３１５２６５、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６５０４４３－２６６２０５４、またはＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド８２２１４－９７７０５と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％相同である。
【0063】
ある特定の実施形態では、組込み外因性配列のすぐ３’側のヌクレオチド配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０－４５４９０、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２－７９２３７４、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０－６６７８１３、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９－１０００５９、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６－３６２４４２、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５－２７０１７６８、またはＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６－１０５１１７及びそれらと少なくとも５０％相同の配列からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、組込み外因性配列のすぐ３’側のヌクレオチド配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０－４５４９０、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２－７９２３７４、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０－６６７８１３、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９－１０００５９、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６－３６２４４２、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５－２７０１７６８、またはＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６－１０５１１７と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％相同である。
【0064】
ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は、配列番号１～７及びそれらと少なくとも５０％相同の配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列に機能的に連結される。ある特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列に機能的に連結されるヌクレオチド配列は、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％相同である。ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つのＳＯＩを含む。ある特定の実施形態では、機能的に連結されたヌクレオチド配列は、ランダムに組み込まれたＳＯＩと比較してＳＯＩの発現レベルを増加させる。ある特定の実施形態では、組込み外因性ＳＯＩは、ランダムに組み込まれたＳＯＩよりも約２０％、３０％、４０％、５０％、１００％、２倍、３倍、５倍、または１０倍高く発現される。
【0065】
ある特定の実施形態では、組込み外因性配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４１１９０－４５２６９、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド６３５９０－２０７９１１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド２５３８３１－４９１９０９、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド６９３０３－７９７６８、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド２９３４８１－３１５２６５、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６５０４４３－２６６２０５４、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド８２２１４－９７７０５ならびにそれらと少なくとも５０％相同の配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の５’側に隣接し、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０－４５４９０、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２－７９２３７４、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０－６６７８１３、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９－１０００５９、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６－３６２４４２、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５－２７０１７６８、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６－１０５１１７ならびにそれらと少なくとも５０％相同の配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列の３’側に隣接する。ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列の５’側に隣接するヌクレオチド配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４１１９０－４５２６９、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド６３５９０－２０７９１１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド２５３８３１－４９１９０９、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド６９３０３－７９７６８、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド２９３４８１－３１５２６５、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６５０４４３－２６６２０５４、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド８２２１４－９７７０５と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％相同であり、組込み外因性ヌクレオチド配列の３’側に隣接するヌクレオチド配列は、配列番号ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０－４５４９０、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２－７９２３７４、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０－６６７８１３、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９－１０００５９、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６－３６２４４２、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５－２７０１７６８、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６－１０５１１７と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％相同である。
【0066】
ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチドは、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択される配列の全てまたは一部にすぐ隣接する座位中に組み込まれる。
【0067】
ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は、配列番号１～７及びそれらと少なくとも５０％相同の配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列に隣接する。ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は、配列番号１～７及びそれらと少なくとも５０％相同の配列からなる群から選択される配列から約１００ｂｐ、約２００ｂｐ、約５００ｂｐ、約１ｋｂ以内の距離にある。ある特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列に隣接するヌクレオチド配列は、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％相同である。
【0068】
ある特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号１の合計で１～１，０００ｂｐ、１，０００～２，０００ｂｐ、２，０００～３，０００ｂｐ、３，０００～４，０００ｂｐ、及び４，０００～４，３０１ｂｐとなるヌクレオチドから選択される位置に隣接する組込み部位に組み込まれる。ある特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号２の合計で１～１００，０００ｂｐ、１００，０００～２００，０００ｂｐ、２００，０００～３００，０００ｂｐ、３００，０００～４００，０００ｂｐ、４００，０００～５００，０００ｂｐ、５００，０００～６００，０００ｂｐ、６００，０００～７００，０００ｂｐ、及び７００，０００～７２８７８５ｂｐとなるヌクレオチドから選択される位置に隣接する組込み部位に組み込まれる。ある特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号３の合計で１～１００，０００ｂｐ、１００，０００～２００，０００ｂｐ、２００，０００～３００，０００ｂｐ、３００，０００～４００，０００ｂｐ、及び４００，０００～４１３，９８３となるヌクレオチドから選択される位置に隣接する組込み部位に組み込まれる。ある特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号４の合計で１～１０，０００ｂｐ、１０，０００～２０，０００ｂｐ、２０，０００～３０，０００ｂｐ、及び３０，０００～３０，７５７ｂｐとなるヌクレオチドから選択される位置に隣接する組込み部位に組み込まれる。ある特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号５の合計で１～１０，０００ｂｐ、１０，０００～２０，０００ｂｐ、２０，０００～３０，０００ｂｐ、３０，０００～４０，０００ｂｐ、４０，０００～５０，０００ｂｐ、５０，０００～６０，０００ｂｐ、及び６０，０００～６８，９６２ｂｐとなるヌクレオチドから選択される位置に隣接する組込み部位に組み込まれる。ある特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号６の合計で１～１０，０００ｂｐ、１０，０００～２０，０００ｂｐ、２０，０００～３０，０００ｂｐ、３０，０００～４０，０００ｂｐ、４０，０００～５０，０００ｂｐ、及び５０，０００～５１，３２６ｂｐとなるヌクレオチドから選択される位置に隣接する組込み部位に組み込まれる。ある特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、配列番号７の合計で１～１０，０００ｂｐ、１０，０００～２０，０００ｂｐ、及び２０，０００～２２，９０４ｂｐとなるヌクレオチドから選択される位置に隣接する組込み部位に組み込まれる。
【0069】
ある特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列の組込み部位を含む座位は、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をコードしない。ある特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列の組込み部位を含む座位は、シス作用性エレメント、例えば、プロモーター及びエンハンサーを含む。ある特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列の組込み部位を含む座位は、遺伝子発現を増強する任意のシス作用性エレメント、例えば、プロモーター及びエンハンサーを含まない。
【0070】
ある特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びＸＰ＿００３５１２３３１．２からなる群から選択される内因性遺伝子内における組込み部位に組み込まれる。内因性ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びＸＰ＿００３５１２３３１．２遺伝子は、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びＸＰ＿００３５１２３３１．２遺伝子の野生型及び全ての相同配列を含む。ある特定の実施形態では、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びＸＰ＿００３５１２３３１．２遺伝子の相同配列は、野生型ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びＸＰ＿００３５１２３３１．２遺伝子と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％相同であり得る。ある特定の実施形態では、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びＸＰ＿００３５１２３３１．２遺伝子は、野生型哺乳動物ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びＸＰ＿００３５１２３３１．２遺伝子である。ある特定の実施形態では、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びＸＰ＿００３５１２３３１．２遺伝子は、野生型ヒトＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びＸＰ＿００３５１２３３１．２遺伝子である。ある特定の実施形態では、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びＸＰ＿００３５１２３３１．２遺伝子は、野生型ハムスターＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びＸＰ＿００３５１２３３１．２遺伝子である。
【0071】
ある特定の実施形態では、組込み部位は、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれらの少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択される内因性遺伝子に機能的に連結される。ある特定の実施形態では、組込み部位は、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれらの少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択される内因性遺伝子に隣接する。
【0072】
表１は、例示的なＴＩ宿主細胞の組込み部位を提供する：
表１－ＴＩ宿主細胞の組込み部位
表１－ＴＩ宿主細胞の組込み部位
【0073】
ある特定の実施形態では、組込み部位及び／または組込み部位に隣接するヌクレオチド配列は、実験的に同定され得る。ある特定の実施形態では、組込み部位及び／または組込み部位に隣接するヌクレオチド配列は、ゲノムワイドスクリーニングアプローチによって同定され、１つ以上の外因性ヌクレオチド配列中に組み込まれた１つ以上のＳＯＩによってコードされる目的のポリペプチドを望ましいレベルで発現する宿主細胞を単離し得、その外因性配列は、宿主細胞ゲノム中の１箇所以上の座位に組み込まれた配列である。ある特定の実施形態では、組込み部位及び／または組込み部位に隣接するヌクレオチド配列は、トランスポザーゼに基づくカセット組込み事象後のゲノムワイドスクリーニングアプローチによって同定され得る。ある特定の実施形態では、組込み部位及び／または組込み部位に隣接するヌクレオチド配列は、ブルートフォースランダム組込みスクリーニングによって同定され得る。ある特定の実施形態では、組込み部位及び／または組込み部位に隣接するヌクレオチド配列は、従来のシーケンシングアプローチ、例えば、標的座位増幅（ＴＬＡ）、それに続く次世代シーケンシング（ＮＧＳ）及び全ゲノムＮＧＳなどによって決定され得る。ある特定の実施形態では、染色体上の組込み部位の位置は、従来の細胞生物学アプローチ、例えば、蛍光ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析などによって決定され得る。
【0074】
ある特定の実施形態では、ＴＩ宿主細胞は、ＴＩ宿主細胞ゲノム中の特定の第１座位内における第１組込み部位に組み込まれた第１外因性ヌクレオチド配列及びゲノム中の特定の第２座位内における第２組込み部位に組み込まれた第２外因性ヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、ＴＩ宿主細胞は、ＴＩ宿主細胞ゲノム中の複数の組込み部位に組み込まれた複数の外因性ヌクレオチド配列を含む。
【0075】
ある特定の実施形態では、本開示のＴＩ宿主細胞は、少なくとも２つの異なる外因性ヌクレオチド配列、例えば、少なくとも１つのＲＲＳを含む外因性ヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、２つ以上の外因性ヌクレオチド配列が、１つ以上のＳＯＩの導入のために標的とされ得る。ある特定の実施形態では、ＳＯＩは同じである。ある特定の実施形態では、ＳＯＩは異なる。ある特定の実施形態では、第１外因性ヌクレオチド配列を含む親ＴＩ宿主細胞は、第１外因性ヌクレオチド配列の組込み部位とは異なる組込み部位に第２外因性ヌクレオチド配列を含み得る。
【0076】
ある特定の実施形態では、組込み部位は、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％相同である。ある特定の実施形態では、組込み部位は、同じ染色体上に存在し得る。ある特定の実施形態では、組込み部位は、同じ染色体中で互いに１～１，０００ヌクレオチド、１，０００～１００，０００ヌクレオチド、１００，０００～１，０００，０００ヌクレオチドまたはそれを超える範囲内に位置する。ある特定の実施形態では、組込み部位は、異なる染色体上に存在する。ある特定の実施形態では、１つの組込み部位に外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞は、同じまたは異なる組込み部位における少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、またはそれを超える外因性ヌクレオチド配列の挿入に使用され得る。
【0077】
ある特定の実施形態では、少なくとも２箇所の組込み部位のリコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）に関する実現可能性は、各部位について個別に評価され得る。ある特定の実施形態では、少なくとも２箇所の組込み部位のＲＭＣＥに関する実現可能性は、同時に評価され得る。複数の部位のＲＭＣＥに関する実現可能性は、当該技術分野において既知の方法、例えば、ポリペプチド力価、またはポリペプチド比生産を測定することによって評価され得る。ある特定の実施形態では、評価は、当該技術分野において既知の方法によって、例えば、ＳＯＩ（複数可）を発現するＴＩ宿主細胞の培養物の力価及び／または比生産性を評価することによって実施され得る。例示的な培養方針としては、流加振盪フラスコ培養及びバイオリアクター流加培養が挙げられるが、これらに限定されない。目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞の力価及び比生産性は、当該技術分野において既知の方法、例えば、これらに限定されないが、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、蛍光微量アッセイ技術（Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ Ｍｉｃｒｏｖｏｌｕｍｅ Ａｓｓａｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（ＦＭＡＴ）、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、ウェスタンブロット分析によって評価され得る。
【0078】
３．外因性ヌクレオチド配列
外因性ヌクレオチド配列は、宿主細胞に由来しないが、従来のＤＮＡ送達方法によって、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、または形質転換方法によって宿主細胞中に導入され得るヌクレオチド配列である。ある特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、目的の配列（ＳＯＩ）、例えば、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。しかしながら、ある特定の実施形態では、本開示との関連において用いられる外因性ヌクレオチド配列は、要素、例えば、１つ以上の組換え認識配列（ＲＲＳ）及び１つ以上の選択マーカーを含み、これらは追加の核酸配列、例えば、ＳＯＩの導入を促進する。ある特定の実施形態では、追加の核酸配列の導入を促進する外因性ヌクレオチド配列は、本明細書においては「ランディングパッド」と称される。したがって、ある特定の実施形態では、ＴＩ宿主細胞は、（１）１つ以上のＳＯＩ、例えば、外因性部位特異的ヌクレアーゼ媒介（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介）標的組込みによって宿主細胞ゲノム中の特定の座位に組み込まれたＳＯＩを含む外因性ヌクレオチド配列、（２）１つ以上のランディングパッドを含む外因性ヌクレオチド配列、または（３）１つ以上のＳＯＩが組み込まれている１つ以上のランディングパッドを含む外因性ヌクレオチド配列を含み得る。
外因性ヌクレオチド配列は、宿主細胞に由来しないが、従来のＤＮＡ送達方法によって、例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション、または形質転換方法によって宿主細胞中に導入され得るヌクレオチド配列である。ある特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、目的の配列（ＳＯＩ）、例えば、目的のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列である。しかしながら、ある特定の実施形態では、本開示との関連において用いられる外因性ヌクレオチド配列は、要素、例えば、１つ以上の組換え認識配列（ＲＲＳ）及び１つ以上の選択マーカーを含み、これらは追加の核酸配列、例えば、ＳＯＩの導入を促進する。ある特定の実施形態では、追加の核酸配列の導入を促進する外因性ヌクレオチド配列は、本明細書においては「ランディングパッド」と称される。したがって、ある特定の実施形態では、ＴＩ宿主細胞は、（１）１つ以上のＳＯＩ、例えば、外因性部位特異的ヌクレアーゼ媒介（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介）標的組込みによって宿主細胞ゲノム中の特定の座位に組み込まれたＳＯＩを含む外因性ヌクレオチド配列、（２）１つ以上のランディングパッドを含む外因性ヌクレオチド配列、または（３）１つ以上のＳＯＩが組み込まれている１つ以上のランディングパッドを含む外因性ヌクレオチド配列を含み得る。
【0079】
ある特定の実施形態では、ＴＩ宿主細胞は、ＴＩ宿主細胞ゲノム中の１箇所以上の組込み部位に組み込まれた少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、外因性ヌクレオチド配列は、ＴＩ宿主細胞ゲノムの特定の座位内における１箇所以上の組込み部位に組み込まれる。例えば、限定する意図はないが、少なくとも１つの外因性核酸配列は、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％の相同を有する１箇所以上の座位に組み込まれ得る。
【0080】
３．１ ランディングパッド
ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は、１つ以上の組換え認識配列（ＲＲＳ）を含み、そのＲＲＳはリコンビナーゼによって認識され得る。ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも２つのＲＲＳを含む。ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は２つのＲＲＳを含み、２つのＲＲＳが同じである。ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は２つのＲＲＳを含み、２つのＲＲＳが異種特異的である、すなわち、同じリコンビナーゼによって認識されない。ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は３つのＲＲＳを含み、その第３ＲＲＳは第１ＲＲＳと第２ＲＲＳとの間に位置する。ある特定の実施形態では、第１及び第２ＲＲＳは同じであり、第３ＲＲＳは第１または第２ＲＲＳとは異なる。ある特定の実施形態では、３つ全てのＲＲＳが異種特異的である。ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つのＲＲＳを含む。ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は、複数のＲＲＳを含む。ある特定の実施形態では、複数の２つ以上のＲＲＳが同じである。ある特定の実施形態では、２つ以上のＲＲＳが異種特異的である。ある特定の実施形態では、各ＲＲＳは、異なるリコンビナーゼによって認識され得る。ある特定の実施形態では、ＲＲＳの総数のサブセットは同種特異的である、すなわち、同じリコンビナーゼによって認識され、ＲＲＳの総数のサブセットは異種特異的である、すなわち、同じリコンビナーゼによって認識されない。ある特定の実施形態では、ＲＲＳまたは複数のＲＲＳは、ＬｏｘＰ配列、ＬｏｘＰ Ｌ３配列、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列、ＬｏｘＦａｓ配列、Ｌｏｘ５１１配列、Ｌｏｘ２２７２配列、Ｌｏｘ２３７２配列、Ｌｏｘ５１７１配列、Ｌｏｘｍ２配列、Ｌｏｘ７１配列、Ｌｏｘ６６配列、ＦＲＴ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列、φＣ３１ ａｔｔＰ配列、及びφＣ３１ ａｔｔＢ配列からなる群から選択され得る。
ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は、１つ以上の組換え認識配列（ＲＲＳ）を含み、そのＲＲＳはリコンビナーゼによって認識され得る。ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも２つのＲＲＳを含む。ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は２つのＲＲＳを含み、２つのＲＲＳが同じである。ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は２つのＲＲＳを含み、２つのＲＲＳが異種特異的である、すなわち、同じリコンビナーゼによって認識されない。ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は３つのＲＲＳを含み、その第３ＲＲＳは第１ＲＲＳと第２ＲＲＳとの間に位置する。ある特定の実施形態では、第１及び第２ＲＲＳは同じであり、第３ＲＲＳは第１または第２ＲＲＳとは異なる。ある特定の実施形態では、３つ全てのＲＲＳが異種特異的である。ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は、４つ、５つ、６つ、７つ、または８つのＲＲＳを含む。ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は、複数のＲＲＳを含む。ある特定の実施形態では、複数の２つ以上のＲＲＳが同じである。ある特定の実施形態では、２つ以上のＲＲＳが異種特異的である。ある特定の実施形態では、各ＲＲＳは、異なるリコンビナーゼによって認識され得る。ある特定の実施形態では、ＲＲＳの総数のサブセットは同種特異的である、すなわち、同じリコンビナーゼによって認識され、ＲＲＳの総数のサブセットは異種特異的である、すなわち、同じリコンビナーゼによって認識されない。ある特定の実施形態では、ＲＲＳまたは複数のＲＲＳは、ＬｏｘＰ配列、ＬｏｘＰ Ｌ３配列、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列、ＬｏｘＦａｓ配列、Ｌｏｘ５１１配列、Ｌｏｘ２２７２配列、Ｌｏｘ２３７２配列、Ｌｏｘ５１７１配列、Ｌｏｘｍ２配列、Ｌｏｘ７１配列、Ｌｏｘ６６配列、ＦＲＴ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列、φＣ３１ ａｔｔＰ配列、及びφＣ３１ ａｔｔＢ配列からなる群から選択され得る。
【0081】
ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの選択マーカーを含む。ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は、１つのＲＲＳ及び少なくとも１つの選択マーカーを含む。ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は、第１及び第２ＲＲＳ、ならびに少なくとも１つの選択マーカーを含む。ある特定の実施形態では、選択マーカーは、第１ＲＲＳと第２ＲＲＳとの間に位置する。ある特定の実施形態では、２つのＲＲＳが少なくとも１つの選択マーカーに隣接する、すなわち、第１ＲＲＳは選択マーカーの５’側上流に位置し、第２ＲＲＳは選択マーカーの３’側下流に位置する。ある特定の実施形態では、第１ＲＲＳは選択マーカーの５’末端に隣接し、第２ＲＲＳは選択マーカーの３’末端に隣接する。
【0082】
ある特定の実施形態では、選択マーカーは、第１ＲＲＳと第２ＲＲＳとの間に位置し、２つの隣接ＲＲＳは同じである。ある特定の実施形態では、選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳは、両方ともＬｏｘＰ配列である。ある特定の実施形態では、選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳは、両方ともＦＲＴ配列である。ある特定の実施形態では、選択マーカーは、第１ＲＲＳと第２ＲＲＳとの間に位置し、２つの隣接ＲＲＳは異種特異的である。ある特定の実施形態では、第１隣接ＲＲＳはＬｏｘＰ Ｌ３配列であり、第２隣接ＲＲＳはＬｏｘＰ ２Ｌ配列である。ある特定の実施形態では、ＬｏｘＰ Ｌ３配列は選択マーカーの５’側に位置し、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列は選択マーカーの３’側に位置する。ある特定の実施形態では、第１隣接ＲＲＳは野生型ＦＲＴ配列であり、第２隣接ＲＲＳは変異体ＦＲＴ配列である。ある特定の実施形態では、第１隣接ＲＲＳはＢｘｂ１ ａｔｔＰ配列であり、第２隣接ＲＲＳはＢｘｂ１ ａｔｔＢ配列である。ある特定の実施形態では、第１隣接ＲＲＳはφＣ３１ ａｔｔＰ配列であり、第２隣接ＲＲＳはφＣ３１ ａｔｔＢ配列である。ある特定の実施形態では、２つのＲＲＳは同じ方向に配置される。ある特定の実施形態では、２つのＲＲＳは、両方ともフォワードまたはリバース方向に存在する。ある特定の実施形態では、２つのＲＲＳは逆方向に配置される。
【0083】
ある特定の実施形態では、選択マーカーは、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシン及びＧ４１８ ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、アスパラギンシンテターゼ、トリプトファンシンテターゼ（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ）、ならびにピューロマイシン、ブラストサイジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、Ｚｅｏｃｉｎ、またはミコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子であり得る。ある特定の実施形態では、選択マーカーは、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、合成ＧＦＰ、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、ＣＦＰ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ－モノマー、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、またはＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅマーカーであり得る。ある特定の実施形態では、選択マーカーは、少なくとも２つの選択マーカーを含む融合構築物であり得る。ある特定の実施形態では、選択マーカーまたは選択マーカーの断片をコードする遺伝子は、異なる選択マーカーまたはその断片をコードする遺伝子に融合され得る。
【0084】
ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は、２つのＲＲＳに隣接する２つの選択マーカーを含み、第１選択マーカーは第２選択マーカーとは異なる。ある特定の実施形態では、２つの選択マーカーは両方とも、グルタミンシンテターゼ選択マーカー、チミジンキナーゼ選択マーカー、ＨＹＧ選択マーカー、及びピューロマイシン耐性選択マーカーからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は、チミジンキナーゼ選択マーカー及びＨＹＧ選択マーカーを含む。ある特定の実施形態では、第１選択マーカーは、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）（例えば、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシン及びＧ４１８ ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、アスパラギンシンテターゼ、トリプトファンシンテターゼ（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ）、ならびにピューロマイシン、ブラストサイジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、Ｚｅｏｃｉｎ、及びミコフェノール酸に対する耐性をコードする遺伝子からなる群から選択され、第２選択マーカーは、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、合成ＧＦＰ、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、ＣＦＰ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ－モノマー、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、及びＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅマーカーからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、第１選択マーカーはグルタミンシンテターゼ選択マーカーであり、第２選択マーカーはＧＦＰマーカーである。ある特定の実施形態では、両方の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳは同じである。ある特定の実施形態では、両方の選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳは異なっている。
【0085】
ある特定の実施形態では、選択マーカーは、プロモーター配列に機能的に連結される。ある特定の実施形態では、選択マーカーは、ＳＶ４０プロモーターに機能的に連結される。ある特定の実施形態では、選択マーカーは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターに機能的に連結される。
【0086】
ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの選択マーカー及びＩＲＥＳを含み、そのＩＲＥＳは選択マーカーに機能的に連結される。ある特定の実施形態では、ＩＲＥＳに機能的に連結される選択マーカーは、ＧＦＰ、ｅＧＦＰ、合成ＧＦＰ、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、ＣＦＰ、ｍＰｌｕｍ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊ－ｒｅｄ、ＤｓＲｅｄ－モノマー、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、ＣｙＰｅｔ、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、及びＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅマーカーからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ＩＲＥＳに機能的に連結される選択マーカーは、ＧＦＰマーカーである。ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は、２つのＲＲＳに隣接するＩＲＥＳ及び２つの選択マーカーを含み、そのＩＲＥＳは第２選択マーカーに機能的に連結される。ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は、２つのＲＲＳに隣接するＩＲＥＳ及び３つの選択マーカーを含み、そのＩＲＥＳは第３選択マーカーに機能的に連結される。ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は、２つのＲＲＳに隣接するＩＲＥＳ及び３つの選択マーカーを含み、そのＩＲＥＳは第３選択マーカーに機能的に連結される。ある特定の実施形態では、第３選択マーカーは、第１または第２選択マーカーとは異なる。ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は、プロモーターに機能的に連結される第１選択マーカー及びＩＲＥＳに機能的に連結される第２選択マーカーを含む。ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は、ＳＶ４０プロモーターに機能的に連結されるグルタミンシンテターゼ選択マーカー及びＩＲＥＳに機能的に連結されるＧＦＰ選択マーカーを含む。ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は、ＣＭＶプロモーターに機能的に連結されるチミジンキナーゼ選択マーカー及びＨＹＧ選択マーカーならびにＩＲＥＳに機能的に連結されるＧＦＰ選択マーカーを含む。
【0087】
ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は、３つのＲＲＳを含む。ある特定の実施形態では、第３ＲＲＳは、第１ＲＲＳと第２ＲＲＳとの間に位置する。ある特定の実施形態では、３つ全てのＲＲＳが同じである。ある特定の実施形態では、第１及び第２ＲＲＳは同じであり、第３ＲＲＳは第１または第２ＲＲＳとは異なる。ある特定の実施形態では、３つ全てのＲＲＳが異種特異的である。
【0088】
３．２ 目的の配列（ＳＯＩ）
ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む。ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの選択マーカー及び少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む。ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの選択マーカー、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ、及び少なくとも１つのＲＲＳを含む。ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つまたはそれを超えるＳＯＩを含む。ある特定の実施形態では、ＳＯＩは同じである。ある特定の実施形態では、ＳＯＩは異なる。
ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む。ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの選択マーカー及び少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む。ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの選択マーカー、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ、及び少なくとも１つのＲＲＳを含む。ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つまたはそれを超えるＳＯＩを含む。ある特定の実施形態では、ＳＯＩは同じである。ある特定の実施形態では、ＳＯＩは異なる。
【0089】
ある特定の実施形態では、ＳＯＩは、一本鎖抗体またはその断片をコードする。ある特定の実施形態では、ＳＯＩは、抗体重鎖配列またはその断片をコードする。ある特定の実施形態では、ＳＯＩは、抗体軽鎖配列またはその断片をコードする。ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は、抗体重鎖配列またはその断片をコードするＳＯＩ及び抗体軽鎖配列またはその断片をコードするＳＯＩを含む。ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は、第１抗体重鎖配列またはその断片をコードするＳＯＩ、第２抗体重鎖配列またはその断片をコードするＳＯＩ、及び抗体軽鎖配列またはその断片をコードするＳＯＩを含む。ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は、第１抗体重鎖配列またはその断片をコードするＳＯＩ、第２抗体重鎖配列またはその断片をコードするＳＯＩ、第１抗体軽鎖配列またはその断片をコードするＳＯＩ及び抗体軽鎖配列またはその断片をコードする第２ＳＯＩを含む。ある特定の実施形態では、重鎖及び軽鎖配列をコードするＳＯＩの数は、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの所望の発現レベルを達成するために、例えば、二重特異性抗体産生の所望の量を達成するために選択され得る。ある特定の実施形態では、重鎖及び軽鎖配列をコードする個々のＳＯＩは、例えば、単一の組込み部位に存在する単一の外因性核酸配列に、単一の組込み部位に存在する複数の外因性核酸配列に、またはＴＩ宿主細胞内の異なる組込み部位に組み込まれた複数の外因性核酸配列に組み込まれ得る。
【0090】
ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの選択マーカー、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ、及び１つのＲＲＳを含む。ある特定の実施形態では、ＲＲＳは、少なくとも１つの選択マーカーまたは少なくとも１つの外因性ＳＯＩに隣接して位置する。ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は、少なくとも１つの選択マーカー、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ、及び２つのＲＲＳを含む。ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は、第１ＲＲＳと第２ＲＲＳとの間に位置する少なくとも１つの選択マーカー及び少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む。ある特定の実施形態では、選択マーカー及び外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳは同じである。ある特定の実施形態では、選択マーカー及び外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳは異なる。ある特定の実施形態では、第１隣接ＲＲＳはＬｏｘＰ Ｌ３配列であり、第２の隣接ＲＲＳはＬｏｘＰ ２Ｌ配列である。ある特定の実施形態では、Ｌ３ ＬｏｘＰ配列は、選択マーカー及び外因性ＳＯＩの５’側に位置し、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列は、選択マーカー及び外因性ＳＯＩの３’側に位置する。
【0091】
ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は、３つのＲＲＳ及び２つの外因性ＳＯＩを含み、第３ＲＲＳは第１ＲＲＳと第２ＲＲＳとの間に位置する。ある特定の実施形態では、第１ＳＯＩは、第１ＲＲＳと第３ＲＲＳとの間に位置し、第２ＳＯＩは、第３ＲＲＳと第２ＲＲＳとの間に位置する。ある特定の実施形態では、第１及び第２ＳＯＩは異なる。ある特定の実施形態では、第１及び第２ＲＲＳは同じであり、第３ＲＲＳは第１または第２ＲＲＳとは異なる。ある特定の実施形態では、３つ全てのＲＲＳが異種特異的である。ある特定の実施形態では、第１ＲＲＳはＬｏｘＰ Ｌ３部位であり、第２ＲＲＳはＬｏｘＰ ２Ｌ部位であり、第３ＲＲＳはＬｏｘＦａｓ部位である。ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は、３つのＲＲＳ、１つの外因性ＳＯＩ、及び１つの選択マーカーを含む。ある特定の実施形態では、ＳＯＩは、第１ＲＲＳと第３ＲＲＳとの間に位置し、選択マーカーは、第３ＲＲＳと第２ＲＲＳとの間に位置する。ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は、３つのＲＲＳ、２つの外因性ＳＯＩ、及び１つの選択マーカーを含む。ある特定の実施形態では、第１ＳＯＩ及び選択マーカーは、第１ＲＲＳと第３ＲＲＳとの間に位置し、第２ＳＯＩは、第３ＲＲＳと第２ＲＲＳとの間に位置する。
【0092】
ある特定の実施形態では、外因性ＳＯＩは、目的のポリペプチドをコードする。そのような目的のポリペプチドは、これらに限定されないが、抗体、酵素、サイトカイン、成長因子、ホルモン、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、ワクチンタンパク質、または治療機能を有するタンパク質を含む群から選択され得る。ある特定の実施形態では、外因性ＳＯＩは、抗体またはその抗原結合断片をコードする。ある特定の実施形態では、外因性ＳＯＩは、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、またはＦｃ融合タンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、外因性ＳＯＩ（または複数のＳＯＩ）は、標準抗体をコードする。ある特定の実施形態では、外因性ＳＯＩ（または複数のＳＯＩ）は、半抗体、例えば、これらに限定されないが、本開示の抗体Ｂ、Ｑ、Ｔ及びｍＡｂＩをコードする。ある特定の実施形態では、外因性ＳＯＩ（または複数のＳＯＩ）は、複合抗体をコードする。ある特定の実施形態では、複合抗体は、二重特異性抗体、例えば、これらに限定されないが、本開示の二重特異性分子Ａ、二重特異性分子Ｂ、二重特異性分子Ｃ、または二重特異性分子Ｄであり得る。ある特定の実施形態では、外因性ＳＯＩは、少なくとも１つのシス作用性エレメント、例えば、プロモーターまたはエンハンサーに機能的に連結される。ある特定の実施形態では、外因性ＳＯＩは、ＣＭＶプロモーターに機能的に連結される。
【0093】
ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は、２つのＲＲＳ及び２つのＲＲＳ間に位置する少なくとも２つの外因性ＳＯＩを含む。ある特定の実施形態では、抗体の１本の重鎖及び１本の軽鎖をコードするＳＯＩは、２つのＲＲＳ間に位置する。ある特定の実施形態では、抗体の１本の重鎖及び２本の軽鎖をコードするＳＯＩは、２つのＲＲＳ間に位置する。ある特定の実施形態では、抗体の重鎖及び軽鎖コピーの異なる組合せをコードするＳＯＩは、２つのＲＲＳ間に位置する。
【0094】
ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は、３つのＲＲＳ及び少なくとも２つの外因性ＳＯＩを含み、第３ＲＲＳは第１ＲＲＳと第２ＲＲＳとの間に位置する。ある特定の実施形態では、少なくとも１つのＳＯＩは、第１ＲＲＳと第３ＲＲＳとの間に位置し、少なくとも１つのＳＯＩは、第３ＲＲＳと第２ＲＲＳとの間に位置する。ある特定の実施形態では、第１及び第２ＲＲＳは同じであり、第３ＲＲＳは第１または第２ＲＲＳとは異なる。ある特定の実施形態では、３つ全てのＲＲＳが異種特異的である。ある特定の実施形態では、第１抗体の１本の重鎖及び１本の軽鎖をコードするＳＯＩは、第１ＲＲＳと第３ＲＲＳとの間に位置し、第２抗体の１本の重鎖及び１本の軽鎖をコードするＳＯＩは、第３ＲＲＳと第２ＲＲＳとの間に位置する。ある特定の実施形態では、第１抗体の１本の重鎖及び２本の軽鎖をコードするＳＯＩは、第１ＲＲＳと第３ＲＲＳとの間に位置し、第２抗体の１本の重鎖及び１本の軽鎖をコードするＳＯＩは、第３ＲＲＳと第２ＲＲＳとの間に位置する。ある特定の実施形態では、第１抗体の１本の重鎖及び３本の軽鎖をコードするＳＯＩは、第１ＲＲＳと第３ＲＲＳとの間に位置し、第１抗体の１本の軽鎖ならびに第２抗体の１本の重鎖及び１本の軽鎖をコードするＳＯＩは、第３ＲＲＳと第２ＲＲＳとの間に位置する。ある特定の実施形態では、第１抗体の１本の重鎖及び３本の軽鎖をコードするＳＯＩは、第１ＲＲＳと第３ＲＲＳとの間に位置し、第１抗体の２本の軽鎖ならびに第２抗体の１本の重鎖及び１本の軽鎖をコードするＳＯＩは、第３ＲＲＳと第２ＲＲＳとの間に位置する。ある特定の実施形態では、複数の抗体の重鎖及び軽鎖コピーの異なる組合せをコードするＳＯＩは、第１ＲＲＳと第３ＲＲＳとの間に、かつ第３ＲＲＳと第２ＲＲＳとの間に位置する。
【0095】
ある特定の実施形態では、ＳＯＩの数は、ＳＯＩを発現する宿主細胞の力価及び／または比生産性を増加させるように選択される。例えば、限定する意図はないが、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、またはそれを超えるＳＯＩの組込みは、力価及び／または比生産性の増加をもたらし得る。
【0096】
抗体発現との関連において、ＳＯＩをコードする追加の重鎖または軽鎖の包含は、力価及び／または比生産性の増加をもたらし得る。例えば、限定する意図はないが、１本の重鎖及び１本の軽鎖をコードする配列（ＨＬ）から１本の重鎖及び２本の軽鎖をコードする配列（ＨＬＬ）にコピー数を増加させる場合、力価及び／または比生産性の増加が達成され得る。同様に、以下の実施例で概要が述べられるように、ＨＬＬ（３つのＳＯＩ）からＨＬＬ－ＨＬ（５つのＳＯＩ）またはＨＬＬ－ＨＬＬ（６つのＳＯＩ）に増加させると、力価及び／または比生産性の増加が可能になり得る。さらに、コピー数をＨＬＬ－ＨＬ（５つのＳＯＩ）またはＨＬＬ－ＨＬＨＬ（７つのＳＯＩ）に増加させると、力価及び／または比生産性の増加が可能になり得る。重鎖及び軽鎖ＳＯＩコピー数の追加の選択肢としては、ＨＨＬ、ＨＨＬ－Ｈ、ＨＬＬ－Ｈ、ＨＨＬ－ＨＨ、ＨＨＬ－ＨＬ、ＨＨＬ－ＬＬ、ＨＬＬ－ＨＨ、ＨＬＬ－ＨＬ、ＨＬＬ－ＬＬ、ＨＨＬ－ＨＨＬ、ＨＨＬ－ＨＨＨ、ＨＨＬ－ＨＬＬ、ＨＨＫ－ＬＬＬ、ＨＬＬ－ＨＨＬ、ＨＬＬ－ＨＨＨ、ＨＬＬ－ＬＬＬ、ＨＨＬ－ＨＨＨＬ、ＨＨＬ－ＨＨＨＨ、ＨＨＬ－ＨＨＬＬ、ＨＨＬ－ＨＬＬＬ、ＨＨＬ－ＬＬＬＬ、ＨＬＬ－ＨＨＨＬ、ＨＬＬ－ＨＨＨＨ、ＨＬＬ－ＨＬＬＬ、及びＨＬＬ－ＬＬＬＬが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、追加コピーの包含は単一ゲノム座位で生じるが、ある特定の実施形態では、ＳＯＩコピーが２箇所以上の座位に組み込まれ得、例えば、複数のコピーが、単一座位に組み込まれ得、１つ以上のコピーが１つ以上の追加の座位に組み込まれ得る。
【0097】
ある特定の実施形態では、ＳＯＩの位置、例えば、１つのＳＯＩが、別のＳＯＩと比較して３’側または５’側に位置するかどうかは、ＳＯＩを発現する宿主細胞の力価及び／または比生産性を増加させるように選択される。例えば、限定する意図はないが、抗体産生との関連において、重鎖及び軽鎖ＳＯＩの組込み位置は、力価及び／または比生産性の増加をもたらし得る。図２３Ａ～Ｄ及び以下に提示される実施例で概要が述べられるように、重鎖及び軽鎖ＳＯＩの相対位置は、ＳＯＩコピー数に変化がないにもかかわらず、力価及び比生産性に影響を与え得る。
【0098】
４．宿主細胞
本明細書で開示される主題は、ヌクレオチド配列の標的組込み及び目的のポリペプチドの発現に好適な宿主細胞を提供する。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２及びそれらと少なくとも５０％相同の配列からなる群から選択される内因性遺伝子、または宿主細胞ゲノムの座位を含み、その座位は、配列番号１～７及びそれらと少なくとも５０％相同の配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
本明細書で開示される主題は、ヌクレオチド配列の標的組込み及び目的のポリペプチドの発現に好適な宿主細胞を提供する。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２及びそれらと少なくとも５０％相同の配列からなる群から選択される内因性遺伝子、または宿主細胞ゲノムの座位を含み、その座位は、配列番号１～７及びそれらと少なくとも５０％相同の配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【0099】
ある特定の実施形態では、宿主細胞は、真核生物宿主細胞である。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物宿主細胞である。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、またはマウス宿主細胞である。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１１宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、またはＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である。
【0100】
ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７）、ヒト胎児腎臓株（例えば、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）に記載されるような２９３または２９３細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３－２５１（１９８０）に記載されるようなＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２）、例えば、Ｍａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４－６８（１９８２）に記載されるような、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、Ｙ０細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、及びＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞からなる群から選択される。
【0101】
ある特定の実施形態では、宿主細胞は細胞株である。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ある特定の世代数で培養されている細胞株である。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、初代細胞である。
【0102】
ある特定の実施形態では、目的のポリペプチドの発現は、発現レベルがある特定のレベルに維持され、１０、２０、３０、５０、１００、２００、または３００世代にわたって２０％未満で増加する、または減少する場合に安定している。ある特定の実施形態では、目的のポリペプチドの発現は、培養物がいずれの選択も行うことなく維持され得る場合に安定している。ある特定の実施形態では、目的のポリペプチドの発現は、目的の遺伝子のポリペプチド産物が、約１ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約５ｇ／Ｌ、約１０ｇ／Ｌ、約１２ｇ／Ｌ、約１４ｇ／Ｌ、または約１６ｇ／Ｌに到達する場合に高い。
【0103】
本明細書で開示される主題は、目的のポリペプチドを産生する方法にも関する。ある特定の実施形態では、そのような方法は、ａ）宿主細胞ゲノムの座位内に組み込まれた２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの選択マーカーを含む宿主細胞を提供し、その座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であること、ならびにｂ）ＳＯＩを発現し、そこから目的のポリペプチドを回収するのに好適な条件下でａ）の細胞を培養することを含む。ある特定の実施形態では、そのような方法は、ａ）宿主細胞ゲノムの座位内に組み込まれた少なくとも２つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの選択マーカーを含む宿主細胞を提供し、その座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び１つの選択マーカーが、第１及び第３ＲＲＳに隣接し、少なくとも１つの外因性ＳＯＩが、第２及び第３ＲＲＳに隣接すること、ならびにｂ）ＳＯＩを発現し、そこから目的のポリペプチドを回収するのに好適な条件下でａ）の細胞を培養することを含む。ある特定の実施形態では、そのような方法は、ａ）ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれらの少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択される内因性遺伝子内に組み込まれた２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの選択マーカーを含む宿主細胞を提供すること、ならびにｂ）ＳＯＩを発現し、そこから目的のポリペプチドを回収するのに好適な条件下でａ）の細胞を培養することを含む。ある特定の実施形態では、そのような方法は、ａ）ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれらと少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択される内因性遺伝子内に組み込まれた少なくとも２つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの選択マーカーを含む宿主細胞を提供し、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び１つの選択マーカーが、第１及び第３ＲＲＳに隣接し、少なくとも１つの外因性ＳＯＩが、第２及び第３ＲＲＳに隣接すること、ならびにｂ）ＳＯＩを発現し、そこから目的のポリペプチドを回収するのに好適な条件下でａ）の細胞を培養することを含む。
【0104】
ある特定の実施形態では、目的のポリペプチドが産生され、細胞培養培地中に分泌される。ある特定の実施形態では、目的のポリペプチドは、宿主細胞内で発現かつ保持される。ある特定の実施形態では、目的のポリペプチドは、宿主細胞膜で発現される、宿主細胞膜中に挿入される、かつ宿主細胞膜中で保持される。
【0105】
目的の外因性ヌクレオチドまたはベクターは、従来の細胞生物学の方法、例えば、トランスフェクション、形質導入、エレクトロポレーション、または注入を含むが、これらに限定されない方法によって宿主細胞中に導入され得る。ある特定の実施形態では、目的の外因性ヌクレオチドまたはベクターは、脂質ベースのトランスフェクション法、リン酸カルシウムベースのトランスフェクション法、カチオン性ポリマーベースのトランスフェクション法、またはナノ粒子ベースのトランスフェクションを含む化学物質ベースのトランスフェクション法によって宿主細胞中に導入される。ある特定の実施形態では、目的の外因性ヌクレオチドは、ウイルス媒介形質導入、例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルス媒介形質導入を含むが、これらに限定されない形質導入によって宿主細胞中に導入される。ある特定の実施形態では、目的の外因性ヌクレオチドまたはベクターは、遺伝子銃媒介注入によって宿主細胞中に導入される。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ及びＲＮＡ分子の両方が、本明細書に記載される方法を使用して宿主細胞中に導入される。
【0106】
５．標的組込み
標的組込みは、外因性ヌクレオチド配列が、宿主細胞ゲノムの１箇所以上の所定部位に組み込まれることを可能にする。ある特定の実施形態では、標的組込みは、１つ以上のＲＲＳを認識するリコンビナーゼによって媒介される。ある特定の実施形態では、標的組込みは、相同組換えによって媒介される。ある特定の実施形態では、標的組込みは、外因性部位特異的ヌクレアーゼ、続いてＨＤＲ及び／またはＮＨＥＪによって媒介される。
標的組込みは、外因性ヌクレオチド配列が、宿主細胞ゲノムの１箇所以上の所定部位に組み込まれることを可能にする。ある特定の実施形態では、標的組込みは、１つ以上のＲＲＳを認識するリコンビナーゼによって媒介される。ある特定の実施形態では、標的組込みは、相同組換えによって媒介される。ある特定の実施形態では、標的組込みは、外因性部位特異的ヌクレアーゼ、続いてＨＤＲ及び／またはＮＨＥＪによって媒介される。
【0107】
５．１．リコンビナーゼ媒介組換えによる標的組込み
「組換え認識配列」（ＲＲＳ）は、リコンビナーゼによって認識されるヌクレオチド配列であり、リコンビナーゼ媒介組換え事象に必要かつ十分である。ＲＲＳは、組換え事象がヌクレオチド配列中で発生することになる位置を定義するために使用され得る。
「組換え認識配列」（ＲＲＳ）は、リコンビナーゼによって認識されるヌクレオチド配列であり、リコンビナーゼ媒介組換え事象に必要かつ十分である。ＲＲＳは、組換え事象がヌクレオチド配列中で発生することになる位置を定義するために使用され得る。
【0108】
ある特定の実施形態では、ＲＲＳは、ＬｏｘＰ配列、ＬｏｘＰ Ｌ３配列、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列、ＬｏｘＦａｓ配列、Ｌｏｘ５１１配列、Ｌｏｘ２２７２配列、Ｌｏｘ２３７２配列、Ｌｏｘ５１７１配列、Ｌｏｘｍ２配列、Ｌｏｘ７１配列、Ｌｏｘ６６配列、ＦＲＴ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列、φＣ３１ ａｔｔＰ配列、及びφＣ３１ ａｔｔＢ配列からなる群から選択される。
【0109】
ある特定の実施形態では、ＲＲＳは、Ｃｒｅリコンビナーゼによって認識され得る。ある特定の実施形態では、ＲＲＳは、ＦＬＰリコンビナーゼによって認識され得る。ある特定の実施形態では、ＲＲＳは、Ｂｘｂ１インテグラーゼによって認識され得る。ある特定の実施形態では、ＲＲＳは、φＣ３１インテグラーゼによって認識され得る。
【0110】
ＲＲＳがＬｏｘＰ部位である場合のある特定の実施形態では、宿主細胞は、組換えを実施するためにＣｒｅリコンビナーゼを必要とする。ＲＲＳがＦＲＴ部位である場合のある特定の実施形態では、宿主細胞は、組換えを実施するためにＦＬＰリコンビナーゼを必要とする。ＲＲＳがＢｘｂ１ ａｔｔＰまたはＢｘｂ１ ａｔｔＢ部位である場合のある特定の実施形態では、宿主細胞は、組換えを実施するためにＢｘｂ１インテグラーゼを必要とする。ＲＲＳがφＣ３１ ａｔｔＰまたはφＣ３１ａｔｔＢ部位である場合のある特定の実施形態では、宿主細胞は、組換えを実施するためにφＣ３１インテグラーゼを必要とする。リコンビナーゼは、酵素のコード配列を含む発現ベクターを使用して宿主細胞中に導入され得る。
【0111】
Ｃｒｅ－ＬｏｘＰ部位特異的組換えシステムは、多くの生物学的実験システムで広く使用されている。Ｃｒｅは、３４ｂｐのＬｏｘＰ配列を認識する３８ｋＤａの部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼである。Ｃｒｅは、バクテリオファージＰ１に由来し、チロシンファミリーの部位特異的リコンビナーゼに属する。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ＬｏｘＰ配列間の分子内及び分子間組換えの両方を媒介し得る。ＬｏｘＰ配列は、２つの１３ｂｐ逆方向反復配列に隣接する８ｂｐの非回文コア領域で構成される。Ｃｒｅリコンビナーゼは、１３ｂｐの反復配列に結合することによって、８ｂｐのコア領域内の組換えを媒介する。Ｃｒｅ－ＬｏｘＰ媒介組換えは、高効率で行われ、他の宿主因子を一切必要としない。２つのＬｏｘＰ配列が、同じヌクレオチド配列上で同じ方向に配置されている場合、Ｃｒｅ媒介組換えによって、２つのＬｏｘＰ配列間に位置するＤＮＡ配列が共有結合閉環として切り取られることになる。２つのＬｏｘＰ配列が、同じヌクレオチド配列上で逆位置に配置されている場合、Ｃｒｅ媒介組換えによって、２つの配列間に位置するＤＮＡ配列の方向性が反転されることになる。ＬｏｘＰ配列はまた、異なる染色体間の組換えを促進するために、異なる染色体上にも配置され得る。２つのＬｏｘＰ配列が２つの異なるＤＮＡ分子上に存在する場合、かつ１つのＤＮＡ分子が環状である場合、Ｃｒｅ媒介組換えによって、環状ＤＮＡ配列の組込みがもたらされることになる。
【0112】
ある特定の実施形態では、ＬｏｘＰ配列は、野生型ＬｏｘＰ配列である。ある特定の実施形態では、ＬｏｘＰ配列は、変異体ＬｏｘＰ配列である。変異体ＬｏｘＰ配列は、Ｃｒｅ媒介組込みまたは置換の効率を高めるために開発されてきた。ある特定の実施形態では、変異体ＬｏｘＰ配列は、ＬｏｘＰ Ｌ３配列、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列、ＬｏｘＦａｓ配列、Ｌｏｘ５１１配列、Ｌｏｘ２２７２配列、Ｌｏｘ２３７２配列、Ｌｏｘ５１７１配列、Ｌｏｘｍ２配列、Ｌｏｘ７１配列、及びＬｏｘ６６配列からなる群から選択される。例えば、Ｌｏｘ７１配列は、左側の１３ｂｐ反復配列中に変異した５ｂｐを有する。Ｌｏｘ６６配列は、右側の１３ｂｐ反復配列中に変異した５ｂｐを有する。野生型及び変異体ＬｏｘＰ配列の両方とも、Ｃｒｅ依存的組換えを媒介し得る。
【0113】
ＦＬＰ－ＦＲＴ部位特異的組換えシステムは、Ｃｒｅ－Ｌｏｘシステムに類似している。そのシステムはフリッパーゼ（ＦＬＰ）リコンビナーゼを含み、これは酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの２μｍプラスミドに由来する。ＦＬＰは、チロシンファミリーの部位特異的リコンビナーゼにも属する。ＦＲＴ配列は、各々が８ｂｐのスペーサーに隣接する１３ｂｐの２つの回文配列からなる３４ｂｐの配列である。ＦＬＰは、１３ｂｐの回文配列に結合し、８ｂｐスペーサー内でＤＮＡ切断、交換及びライゲーションを媒介する。Ｃｒｅリコンビナーゼと同様に、２つのＦＲＴ配列の位置及び方向性によって、ＦＬＰ媒介組換えの結果が決定される。ある特定の実施形態では、ＦＲＴ配列は、野生型ＦＲＴ配列である。ある特定の実施形態では、ＦＲＴ配列は、変異体ＦＲＴ配列である。野生型及び変異体ＦＲＴ配列の両方とも、ＦＬＰ依存的組換えを媒介し得る。ある特定の実施形態では、ＦＲＴ配列は、応答性受容体ドメイン配列、例えば、これに限定されないが、タモキシフェン応答性受容体ドメイン配列などに融合される。
【0114】
Ｂｘｂ１及びφＣ３１は、セリンリコンビナーゼファミリーに属する。それらは両方ともバクテリオファージに由来し、溶原性を確立して細菌ゲノム中へのファージゲノムの部位特異的組込みを促進するためにこれらのバクテリオファージによって使用される。これらのインテグラーゼは、ａｔｔＰ及びａｔｔＢ配列と称される短い（４０～６０ｂｐ）ＤＮＡ基質間の部位特異的組換え事象を触媒し、その配列は、それぞれファージＤＮＡ及び細菌ＤＮＡ上に位置する元々の付着部位である。組換え後、２つの新しい配列が形成され、これらはａｔｔＬ及びａｔｔＲ配列と称され、各々がａｔｔＰ及びａｔｔＢに由来する半分の配列を含有する。組換えはまた、ａｔｔＬ配列とａｔｔＲ配列との間で行われ、組み込まれたファージを細菌ＤＮＡから切り出すこともできる。両方のインテグラーゼは、追加の宿主因子による支援を一切受けることなく、組換えを触媒し得る。補助因子が一切存在しない場合、これらのインテグラーゼは、ａｔｔＰとａｔｔＢとの間における一方向性の組換えを８０％超の効率で媒介する。これらのインテグラーゼによって認識され得る短いＤＮＡ配列及び一方向性の組換えのため、これらの組換えシステムは、遺伝子工学の目的で広く使用されているＣｒｅ－ＬｏｘＰ及びＦＲＴ－ＦＬＰシステムを補完するものとして開発されてきた。
【0115】
「一致ＲＲＳ」及び「同種特異的ＲＲＳ」という用語は、２つのＲＲＳ間で組換えが行われることを示す。ある特定の実施形態では、２つの一致ＲＲＳは同じである。ある特定の実施形態では、両方のＲＲＳが野生型ＬｏｘＰ配列である。ある特定の実施形態では、両方のＲＲＳが変異体ＬｏｘＰ配列である。ある特定の実施形態では、両方のＲＲＳが野生型ＦＲＴ配列である。ある特定の実施形態では、両方のＲＲＳが変異体ＦＲＴ配列である。ある特定の実施形態では、２つの一致ＲＲＳは異なる配列であるが、同じリコンビナーゼによって認識され得る。ある特定の実施形態では、第１一致ＲＲＳはＢｘｂ１ ａｔｔＰ配列であり、第２一致ＲＲＳはＢｘｂ１ ａｔｔＢ配列である。ある特定の実施形態では、第１一致ＲＲＳはφＣ３１ ａｔｔＢ配列であり、第２一致ＲＲＳはφＣ３１ ａｔｔＢ配列である。
【0116】
ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列は２つのＲＲＳを含み、ベクターは、組込み外因性ヌクレオチド配列上の２つのＲＲＳと一致する２つのＲＲＳを含む、すなわち、組込み外因性ヌクレオチド配列上の第１ＲＲＳが、ベクター上の第１ＲＲＳと一致し、組込み外因性ヌクレオチド配列上の第２ＲＲＳが、ベクター上の第２ＲＲＳと一致する。ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列上の第１ＲＲＳ及びベクター上の第１ＲＲＳは、組込み外因性ヌクレオチド配列上の第２ＲＲＳ及びベクター上の第２ＲＲＳと同じである。そのような「単一ベクターＲＭＣＥ」方針の非限定的な例は、図２Ａに提示される。ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列上の第１ＲＲＳ及びベクター上の第１ＲＲＳは、組込み外因性ヌクレオチド配列上の第２ＲＲＳ及びベクター上の第２ＲＲＳとは異なる。ある特定の実施形態では、組込み外因性ヌクレオチド配列上の第１ＲＲＳ及びベクター上の第１ＲＲＳは、両方ともＬｏｘＰ Ｌ３配列であり、組込み外因性ヌクレオチド配列上の第２ＲＲＳ及びベクター上の第２ＲＲＳは、両方ともＬｏｘＰ ２Ｌ配列である。
【0117】
ある特定の実施形態では、「２ベクターＲＭＣＥ」方針が用いられる。例えば、限定する意図はないが、組込み外因性ヌクレオチド配列は３つのＲＲＳを含み、例えば、第３ＲＲＳ（「ＲＲＳ３」）が第１ＲＲＳ（「ＲＲＳ１」）と第２ＲＲＳ（「ＲＲＳ２」）との間に存在する一方で、第１ベクターが、組込み外因性ヌクレオチド配列上の第１及び第３ＲＲＳと一致する２つのＲＲＳを含み、第２ベクターが、組込み外因性ヌクレオチド配列上の第３及び第２ＲＲＳと一致する２つのＲＲＳを含む場合の配置であり得る。２ベクターＲＭＣＥ方針の例が図４に示される。そのような例では、ＲＲＳ１、ＲＲＳ２、及びＲＲＳ３は異種特異的であり、例えば、それらは互いに交差反応しない。いくつかの実施形態では、１つのベクター（前方）は、ＲＲＳ１、第１ＳＯＩ及びプロモーターに続いて、開始コドン及びＲＲＳ３を（この順序で）含む。他方のベクター（後方）は、開始コドン（ＡＴＧ）を持たないマーカーのコード配列に融合したＲＲＳ３、ＳＯＩ２及びＲＲＳ２を（この順序で）含む。追加のヌクレオチドが、確実に融合タンパク質のインフレーム翻訳を行うために、ＲＲＳ３部位と選択マーカー配列との間に挿入される場合がある。いくつかの実施形態では、第１ＳＯＩは抗体をコードする。いくつかの実施形態では、抗体は、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、またはＦｃ融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、第２ＳＯＩは抗体をコードする。いくつかの実施形態では、抗体は、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、またはＦｃ融合タンパク質である。ある特定の実施形態では、第１及び第２ＳＯＩによってコードされる抗体は、多重特異性、例えば、二重特異性抗体を形成するために対になる。
【0118】
そのような２ベクターＲＭＣＥ方針は、ＲＲＳの各対間に適切な数のＳＯＩを組み込むことによって、８つ以上のＳＯＩの導入を可能にする。
【0119】
単一ベクター及び２ベクターＲＭＣＥの両方とも、宿主細胞ゲノムの所定の部位に対する１つ以上のドナーＤＮＡ分子（複数可）の一方向性組込み、及びドナーＤＮＡ上に存在するＤＮＡカセットと、組込み部位が存在する宿主ゲノム上のＤＮＡカセットとの正確な交換を可能にする。ＤＮＡカセットは、少なくとも１つの選択マーカー（しかしながら、ある特定の２ベクターＲＭＣＥの例では、「分割選択マーカー」が本明細書で概要が述べられているように使用され得る）及び／または少なくとも１つの外因性ＳＯＩに隣接する２つの異種特異的ＲＲＳを特徴とする。ＲＭＣＥは、標的ゲノム座位及びドナーＤＮＡ分子内の２つの異種特異的ＲＲＳ間における、リコンビナーゼによって触媒される二重組換え交差事象を含む。ＲＭＣＥは、ＳＯＩまたは選択マーカーのコピーを、宿主細胞ゲノムの所定の座位に導入するように設計される。１回だけの交差事象を含む組換えとは異なり、ＲＭＣＥは、原核生物ベクター配列が宿主細胞ゲノム中に導入されないように実施されることにより、宿主免疫または防御機構の不必要な誘導を減少させ得る、及び／または防止し得る。ＲＭＣＥ手順は、複数のＤＮＡカセットで反復され得る。
【0120】
ある特定の実施形態では、標的組込みは、１回の交差組換え事象によって達成され、少なくとも１つの外因性ＳＯＩまたは少なくとも１つの選択マーカーに隣接する１つのＲＲＳを含む１つの外因性ヌクレオチド配列が、宿主細胞ゲノムの所定の部位に組み込まれる。ある特定の実施形態では、標的組込みは、１回のＲＭＣＥによって達成され、２つの異種特異的ＲＲＳに隣接する少なくとも１つの外因性ＳＯＩまたは少なくとも１つの選択マーカーを含むＤＮＡカセットが、宿主細胞ゲノムの所定の部位に組み込まれる。ある特定の実施形態では、標的組込みは、２回のＲＭＣＥによって達成され、２つの異種特異的ＲＲＳに隣接する少なくとも１つの外因性ＳＯＩまたは少なくとも１つの選択マーカーを各々が含む２つの異なるＤＮＡカセットが、宿主細胞ゲノムの所定の部位に両方とも組み込まれる。ある特定の実施形態では、標的組込みは、複数回のＲＭＣＥによって達成され、２つの異種特異的ＲＲＳに隣接する少なくとも１つの外因性ＳＯＩまたは少なくとも１つの選択マーカーを各々が含む、複数のベクターに由来するＤＮＡカセットが、宿主細胞ゲノムの所定の部位に全て組み込まれる。ある特定の実施形態では、選択マーカーは、両方のＲＭＣＥの組込みが選択マーカーの発現を可能にするように、第１ベクター上で部分的にコードされ、第２ベクター上で部分的にコードされ得る。そのようなシステムの例は、図４に提示される。
【0121】
ある特定の実施形態では、リコンビナーゼ媒介組換えによる標的組込みは、原核生物ベクターに由来する配列と共に、宿主細胞ゲノムの、１箇所以上の所定の組込み部位に組み込まれた選択マーカーまたは１つ以上の外因性ＳＯＩをもたらす。ある特定の実施形態では、リコンビナーゼ媒介組換えによる標的組込みは、原核生物ベクターに由来する配列を含まない宿主細胞ゲノムの、１箇所以上の所定の組込み部位に組み込まれた選択マーカーまたは１つ以上の外因性ＳＯＩをもたらす。
【0122】
５．２ 相同組換え、ＨＤＲ、またはＮＨＥＪによる標的組込み
本明細書で開示される主題は、相同組換えによって、または外因性部位特異的ヌクレアーゼに続いてＨＤＲもしくはＮＨＥＪによって媒介される標的組込みにも関する。
本明細書で開示される主題は、相同組換えによって、または外因性部位特異的ヌクレアーゼに続いてＨＤＲもしくはＮＨＥＪによって媒介される標的組込みにも関する。
【0123】
相同組換えは、広範囲の配列相同性を共有するＤＮＡ分子間の組換えである。それは、二本鎖ＤＮＡ切断の誤りのない修復を誘導するために使用され得、減数分裂中に配偶子の配列多様性を生成する。相同組換えは、２つの相同ＤＮＡ分子間の遺伝情報交換を含むため、それは染色体上の遺伝子の全体的な配置を変更するわけではない。相同組換え中、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）中にニックまたは切断が形成され、続いて一本鎖ＤＮＡ末端による相同ｄｓＤＮＡ分子の侵入、相同配列の対合、ホリデイジャンクションを形成する分岐点移動、及びホリデイジャンクションの最終的な解離が行われる。
【0124】
二本鎖切断（ＤＳＢ）は、ＤＮＡ損傷の最も深刻な形態であり、そのようなＤＮＡ損傷の修復は、全ての生物でゲノム完全性を維持するために不可欠である。ＤＳＢを修復するには、２つの主な修復経路が存在する。第１修復経路は、相同組換え修復（ＨＤＲ）経路であり、相同組換えはＨＤＲの最も一般的な形態である。ＨＤＲは細胞中に存在する相同ＤＮＡの存在を必要とするため、この修復経路は通常、細胞周期のＳ期及びＧ２期で活性となり、新たに複製された姉妹染色分体が相同鋳型として利用可能である。ＨＤＲはまた、ＤＮＡ複製中に崩壊した複製フォークを修復するための主な修復経路でもある。ＨＤＲは、比較的誤りのない修復経路と考えられる。ＤＳＢの第２修復経路は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）である。ＮＨＥＪは、切断されたＤＮＡの末端が相同ＤＮＡ鋳型を必要とすることなく、一緒にライゲートされる修復経路である。
【0125】
標的組込みは、外因性部位特異的ヌクレアーゼに続いてＨＤＲによって促進され得る。これは、相同組換えの頻度が、特定の標的ゲノム部位にＤＳＢを導入することによって増加され得ることに起因する。ある特定の実施形態では、外因性ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＺＦＮ二量体、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＴＡＬエフェクタードメイン融合タンパク質、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、操作されたメガヌクレアーゼ、及び規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼからなる群から選択され得る。
【0126】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ及びＴＡＬＥＮシステムは、最も容易な構築及び高効率を提供する２つのゲノム編集ツールである。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓは、バクテリオファージの侵入に対する細菌の免疫防御機構として同定された。Ｃａｓは、合成ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）によって誘導される場合、細胞中の特定のヌクレオチド配列と関連して、そのヌクレオチド配列中またはその周囲のＤＮＡを、例えば、一本鎖切断、ＤＳＢ、及び／または点変異のうち１つ以上を行うことによって編集できるヌクレアーゼである。ＴＡＬＥＮは、操作された部位特異的ヌクレアーゼであり、これはＴＡＬＥ（転写活性化因子様エフェクター）のＤＮＡ結合ドメイン及び制限エンドヌクレアーゼＦｏｋＩの触媒ドメインで構成される。ＤＮＡ結合ドメインモノマーの超可変残基領域中に存在するアミノ酸を変更することによって、様々な人工ＴＡＬＥＮが、様々なヌクレオチド配列を標的とするために作製され得る。その後、ＤＮＡ結合ドメインはヌクレアーゼを標的配列に誘導し、ＤＳＢを作製する。
【0127】
相同組換えまたはＨＤＲによる標的組込みは、組込み部位への相同配列の存在を含む。ある特定の実施形態では、相同配列はベクター上に存在する。ある特定の実施形態では、相同配列は、ポリヌクレオチド上に存在する。
【0128】
ある特定の実施形態では、宿主細胞中への外因性ヌクレオチド配列の標的組込みを目的としたベクターは、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びＸＰ＿００３５１２３３１．２からなる群から選択される内因性遺伝子と、または少なくとも１つの選択マーカーに隣接する配列番号１～７から選択される配列と相同なヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、宿主細胞中への外因性ヌクレオチド配列の標的組込みを目的としたベクターは、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びＸＰ＿００３５１２３３１．２からなる群から選択される内因性遺伝子と、または少なくとも１つの選択マーカー及び少なくとも１つの外因性ＳＯＩに隣接する配列番号１～７から選択される配列と相同なヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、宿主細胞中への外因性ヌクレオチド配列の標的組込みを目的としたベクターは、ＤＮＡカセットに隣接する配列番号１～７から選択される配列と少なくとも５０％相同のヌクレオチド配列を含み、そのＤＮＡカセットは、２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの選択マーカー及び少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む。ある特定の実施形態では、宿主細胞中への外因性ヌクレオチド配列の標的組込みを目的としたベクターは、ＤＮＡカセットに隣接するＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びＸＰ＿００３５１２３３１．２からなる群から選択される内因性遺伝子と少なくとも５０％相同のヌクレオチド配列を含み、そのＤＮＡカセットは、２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの選択マーカー及び少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む。ある特定の実施形態では、ベクターヌクレオチド配列は、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びＸＰ＿００３５１２３３１．２からなる群から選択される内因性遺伝子と、または配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％相同である。ある特定の実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、組込みファージベクター、非ウイルスベクター、トランスポゾン及び／またはトランスポザーゼベクター、インテグラーゼ基質、ならびにプラスミドからなる群から選択される。
【0129】
ある特定の実施形態では、宿主細胞中への外因性ヌクレオチド配列の標的組込みを目的としたポリヌクレオチドは、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びＸＰ＿００３５１２３３１．２からなる群から選択される内因性遺伝子と、または少なくとも１つの選択マーカーに隣接する配列番号１～７から選択される配列と相同なヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、宿主細胞中への外因性ヌクレオチド配列の標的組込みを目的としたポリヌクレオチドは、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びＸＰ＿００３５１２３３１．２からなる群から選択される内因性遺伝子と、または少なくとも１つの選択マーカー及び少なくとも１つの外因性ＳＯＩに隣接する配列番号１～７から選択される配列と相同なヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、宿主細胞中への外因性ヌクレオチド配列の標的組込みを目的としたポリヌクレオチドは、ＤＮＡカセットに隣接する配列番号１～７から選択される配列と少なくとも５０％相同のヌクレオチド配列を含み、そのＤＮＡカセットは、２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの選択マーカー及び少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む。ある特定の実施形態では、宿主細胞中への外因性ヌクレオチド配列の標的組込みを目的としたポリヌクレオチドは、ＤＮＡカセットに隣接するＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びＸＰ＿００３５１２３３１．２からなる群から選択される内因性遺伝子と少なくとも５０％相同のヌクレオチド配列を含み、そのＤＮＡカセットは、２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの選択マーカー及び少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む。ある特定の実施形態では、隣接ヌクレオチド配列は、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びＸＰ＿００３５１２３３１．２からなる群から選択される内因性遺伝子と、または配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．９％相同である。
【0130】
ある特定の実施形態では、相同組換えは、いずれの補助因子も用いることなく実施される。ある特定の実施形態では、相同組換えは、組込み可能なベクターの存在によって促進される。ある特定の実施形態では、組込みベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、及び組込みファージベクターからなる群から選択される。
【0131】
５．３ 調節された標的組込み
主にコードされるタンパク質が発現困難であるという理由から、タンパク質発現レベルが最適ではない場合が多く存在する。発現困難なタンパク質の低発現レベルは原因が多岐にわたり、その特定が困難となり得る。ある１つの可能性は、宿主細胞中で発現されるタンパク質の毒性である。そのような場合、調節された発現システムは、タンパク質をコードする目的の配列が誘導性プロモーターの制御下にある場合に毒性タンパク質を発現させるために使用され得る。これらのシステムでは、発現困難なタンパク質の発現は、調節因子、例えば、小分子、例えば、これらに限定されないが、テトラサイクリンまたはその類似体であるドキシサイクリン（ＤＯＸ）などが培養物に添加される場合にのみ促される。毒性タンパク質の発現を調節すると、毒性作用を軽減することができ、培養物が産生前に所望の細胞増殖を達成することを可能にする。ある特定の実施形態では、調節された標的組込み（ＲＴＩ）システムは、特定の座位、例えば、１つ以上のＲＲＳを含む外因性核酸配列に組み込まれ、それに機能的に連結される調節プロモーター下で転写されるＳＯＩを含む。ある特定の実施形態では、ＲＴＩシステムは、発現困難な分子、例えば、これに限定されないが、抗体などの低タンパク質発現の根本的な原因を決定するために使用され得る。ある特定の実施形態では、ＲＴＩシステムにおけるＳＯＩの発現を選択的に止める能力は、ＳＯＩの発現を、観察された有害作用に関連付けるために使用され得る。
主にコードされるタンパク質が発現困難であるという理由から、タンパク質発現レベルが最適ではない場合が多く存在する。発現困難なタンパク質の低発現レベルは原因が多岐にわたり、その特定が困難となり得る。ある１つの可能性は、宿主細胞中で発現されるタンパク質の毒性である。そのような場合、調節された発現システムは、タンパク質をコードする目的の配列が誘導性プロモーターの制御下にある場合に毒性タンパク質を発現させるために使用され得る。これらのシステムでは、発現困難なタンパク質の発現は、調節因子、例えば、小分子、例えば、これらに限定されないが、テトラサイクリンまたはその類似体であるドキシサイクリン（ＤＯＸ）などが培養物に添加される場合にのみ促される。毒性タンパク質の発現を調節すると、毒性作用を軽減することができ、培養物が産生前に所望の細胞増殖を達成することを可能にする。ある特定の実施形態では、調節された標的組込み（ＲＴＩ）システムは、特定の座位、例えば、１つ以上のＲＲＳを含む外因性核酸配列に組み込まれ、それに機能的に連結される調節プロモーター下で転写されるＳＯＩを含む。ある特定の実施形態では、ＲＴＩシステムは、発現困難な分子、例えば、これに限定されないが、抗体などの低タンパク質発現の根本的な原因を決定するために使用され得る。ある特定の実施形態では、ＲＴＩシステムにおけるＳＯＩの発現を選択的に止める能力は、ＳＯＩの発現を、観察された有害作用に関連付けるために使用され得る。
【0132】
ある特定の実施形態では、発現困難な分子の根本的原因分析中における転写及び細胞株多様性の影響を最小限に抑えるために、調節された標的組込み（ＲＴＩ）システムが使用され得る。例えば、限定する意図はないが、ＴＩ宿主中におけるＳＯＩの発現は、調節因子、例えば、ドキシサイクリンの培養物に添加することによって誘導され得る。ある特定の実施形態では、ＲＴＩベクターは、テトラサイクリン調節プロモーターを利用してＳＯＩを発現し、これは、例えば、それ自体が宿主細胞のゲノムの組込み部位に組み込まれる、ＲＲＳを含む外因性核酸配列中に組み込まれ得、それによってＳＯＩの調節された発現を可能にする。
【0133】
ある特定の実施形態では、本開示に記載されるＲＴＩシステムは、対照細胞株と比較した場合の、ＳＯＩ、例えば、治療用抗体の低タンパク質発現に関する根本的な原因（複数可）の決定を成功させるために使用され得る。ある特定の実施形態では、ＲＴＩ細胞株中におけるＳＯＩ、例えば、治療用抗体の相対的発現が低いことが確認されると、ＳＯＩの細胞内蓄積及び分泌レベルは、タンパク質翻訳阻害剤処理、例えば、Ｄｏｘ及びシクロヘキシミドを活用することによって評価され得る。
【0134】
５．４ 調節されたシステム
本明細書で開示される主題は、ＴＩに使用するための調節されたシステムにも関する。例えば、限定する意図はないが、そのような調節は、転写抑制因子または活性化因子と構成的または最小プロモーターとの調節された結合によって、ｍＲＮＡ合成をブロックまたは活性化するための遺伝子スイッチに基づき得る。ある特定の非限定的な実施形態では、抑制は、例えば、タンパク質が転写開始を立体的にブロックするリプレッサータンパク質と結合することによって、または転写サイレンサーを介して転写を能動的に抑制することによって達成され得る。ある特定の非限定的な実施形態では、哺乳動物またはウイルスのエンハンサーレス最小プロモーターの活性化は、活性化ドメインへの調節された結合によって達成され得る。
本明細書で開示される主題は、ＴＩに使用するための調節されたシステムにも関する。例えば、限定する意図はないが、そのような調節は、転写抑制因子または活性化因子と構成的または最小プロモーターとの調節された結合によって、ｍＲＮＡ合成をブロックまたは活性化するための遺伝子スイッチに基づき得る。ある特定の非限定的な実施形態では、抑制は、例えば、タンパク質が転写開始を立体的にブロックするリプレッサータンパク質と結合することによって、または転写サイレンサーを介して転写を能動的に抑制することによって達成され得る。ある特定の非限定的な実施形態では、哺乳動物またはウイルスのエンハンサーレス最小プロモーターの活性化は、活性化ドメインへの調節された結合によって達成され得る。
【0135】
ある特定の実施形態では、転写抑制因子または活性化因子の条件付き結合は、外的刺激に応答してプロモーターと結合するアロステリックタンパク質を使用することによって達成され得る。ある特定の実施形態では、転写抑制因子または活性化因子の条件付き結合は、隔離タンパク質から放出されることにより、標的プロモーターと結合し得る細胞内受容体を使用することによって達成され得る。ある特定の実施形態では、転写抑制因子または活性化因子の条件付き結合は、化学的誘導二量体化因子を使用することによって達成され得る。
【0136】
ある特定の実施形態では、本開示のＴＩシステムに使用されるアロステリックタンパク質は、抗生物質、細菌クオラムセンシングメッセンジャー、異化代謝産物に、または温度、例えば、冷たさもしくは熱さなどの培養パラメータに応答して転写活性を調節するタンパク質であり得る。ある特定の実施形態では、そのようなＲＴＩシステムは、例えば、代替炭素源のための異化遺伝子を制御する細菌抑制因子が、哺乳動物細胞に移入されている場合に異化代謝産物に基づくものであり得る。ある特定の実施形態では、標的プロモーターの抑制は、リプレッサーＣｙｍＲのクマート応答性結合によって達成され得る。ある特定の実施形態では、異化代謝産物に基づくシステムは、単純ヘルペスＶＰ１６トランス活性化ドメインに融合した、原核生物リプレッサーＨｄｎｏＲの６－ヒドロキシニコチン応答性結合によるキメラプロモーターの活性化に依存し得る。
【0137】
ある特定の実施形態では、ＴＩシステムは、クオラムセンシング分子による集団内及び集団間コミュニケーションを管理する原核生物に由来するクオラムセンシングに基づく発現システムであり得る。これらのクオラムセンシング分子は標的細胞の受容体に結合し、特定のレギュロンスイッチの開始をもたらす同族プロモーターに対する受容体の親和性を調節する。ある特定の実施形態では、クオラムセンシング分子は、Ｎ－（３－オキソ－オクタノイル）－ホモセリンラクトンであり得、その存在下で、ＴｒａＲ－ｐ６５融合タンパク質は、ＴｒａＲ特異的オペレーター配列に融合した最小プロモーターからの発現を活性化する。ある特定の実施形態では、クオラムセンシング分子は、あるシステム中においてブチロラクトンＳＣＢ１（ラセミ２－（１’－ヒドロキシ－６－メチルヘプチル）－３－（ヒドロキシメチル）－ブタノリド）であり得、そのシステムとは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ Ａ３（２）ＳｃｂＲリプレッサーに基づき、これはＳＣＢ１の不存在下でその同族オペレーターＯＳｃｂＲと結合する。ある特定の実施形態では、クオラムセンシング分子は、ＲＴＩシステムに使用されるホモセリン由来の誘導物質であり得、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａクオラムセンシングリプレッサーＲｈｌＲ及びＬａｓＲは、ＳＶ４０ Ｔ抗原核局在化配列及び単純ヘルペスＶＰ１６ドメインに融合され、特定のオペレーター配列を含有するプロモーター（ｌａｓボックス）を活性化し得る。
【0138】
ある特定の実施形態では、本開示のＲＴＩシステムに使用されるアロステリックタンパク質を調節する誘導分子は、クマート、イソプロピル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、マクロライド、６－ヒドロキシニコチン、ドキシサイクリン、ストレプトグラミン、ＮＡＤＨ、テトラサイクリンであり得るが、これらに限定されない。
【0139】
ある特定の実施形態では、本開示のＲＴＩシステムに使用される細胞内受容体は、細胞質または核内受容体であり得る。ある特定の実施形態では、本開示のＲＴＩシステムは、小分子を使用することによって、タンパク質の隔離及び阻害から転写因子を解放することを利用し得る。ある特定の実施形態では、本開示のＲＴＩシステムはステロイド調節に依存し得、ホルモン受容体は、サイトゾルのＨＳＰ９０から放出されて核に移動し、選択されたプロモーターを活性化し得る天然または人工転写因子に融合される。ある特定の実施形態では、変異体受容体が使用され、これらは内因性ステロイドホルモンによるクロストークを回避するために、合成ステロイド類似体によって調節され得る。ある特定の実施形態では、受容体は、４－ヒドロキシタモキシフェンに応答するエストロゲン受容体バリアントまたはＲＵ４８６によって誘導可能なプロゲステロン受容体変異体であり得る。ある特定の実施形態では、ヒト核ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（ＰＰＡＲγ）に基づく核内受容体由来のロシグリタゾン応答性転写スイッチが、本開示のＲＴＩシステムに使用され得る。ある特定の実施形態では、ステロイド応答性受容体のバリアントはＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈであり得、これはＧａｌ４ ＤＮＡ結合ドメイン及びＶＰ１６トランス活性化因子に融合した改変Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ ｆｕｍｉｆｅｒａｎａエクジソン受容体及びマウスレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）に基づく。合成エクジソンの存在下で、ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈバリアントは、Ｇａｌ４応答エレメントのいくつかの反復配列に融合した最小プロモーターと結合し、それを活性化し得る。
【0140】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるＲＴＩシステムは、同族オペレーターと融合した最小コアプロモーターの活性化のために、ＤＮＡ結合タンパク質及び転写活性化因子の化学的誘導二量体化を利用し得る。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるＲＴＩシステムは、ＦＫＢＰとＦＲＢとのラパマイシン調節二量体化を利用し得る。このシステムでは、ＦＲＢはｐ６５トランス活性化因子に融合され、ＦＫＢＰは、操作された最小インターロイキン－１２プロモーターの上流に配置される同族オペレーター部位に特異的なジンクフィンガードメインに融合される。ある特定の実施形態では、ＦＫＢＰは変異され得る。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるＲＴＩシステムは、細菌ジャイレースＢサブユニット（ＧｙｒＢ）を利用し得、ＧｙｒＢは、抗生物質クーママイシンの存在下で二量体化し、ノボビオシンで解離する。
【0141】
ある特定の実施形態では、本開示のＲＴＩシステムは、調節されたｓｉＲＮＡ発現のために使用され得る。ある特定の実施形態では、調節されたｓｉＲＮＡ発現システムは、テトラサイクリン、マクロライド、またはＯＦＦ型及びＯＮ型のＱｕｏＲｅｘシステムであり得る。ある特定の実施形態では、ＲＴＩシステムは、Ｘｅｎｏｐｕｓ末端オリゴピリミジンエレメント（ＴＯＰ）を使用し得、これは５’非翻訳領域中にヘアピン構造を形成することによって翻訳開始をブロックする。
【0142】
ある特定の実施形態では、本開示に記載されるＲＴＩシステムは、気相制御発現、例えば、アセトアルデヒド誘導調節（ＡＩＲ）システムを利用し得る。ＡＩＲシステムは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ ＡｌｃＲ転写因子を用いることができ、これは、非毒性濃度の気体または液体アセトアルデヒドの存在下で、最小ヒトサイトメガロウイルスプロモーターに融合したＡｌｃＲ特異的オペレーターから組み立てられたＰＡＩＲプロモーターを特異的に活性化する。
【0143】
ある特定の実施形態では、本開示のＲＴＩシステムは、Ｔｅｔ－ＯｎまたはＴｅｔ－Ｏｆｆシステムを利用し得る。そのようなシステムでは、１つ以上のＳＯＩの発現は、テトラサイクリンまたはその類似体であるドキシサイクリンによって調節され得る。
【0144】
ある特定の実施形態では、本開示のＲＴＩシステムは、ＰＩＰ－ｏｎまたはＰＩＰ－ｏｆｆシステムを利用し得る。そのようなシステムでは、ＳＯＩの発現は、例えば、プリスチナマイシン、テトラサイクリン及び／またはエリスロマイシンによって調節され得る。
【0145】
６．ＴＩ宿主細胞の調製及び使用
本明細書で開示される主題は、宿主細胞中への外因性ヌクレオチド配列の標的組込み方法に関する。ある特定の実施形態では、方法は、外因性ヌクレオチド配列を宿主細胞中に組み込み、その後のＳＯＩの標的組込みに好適な宿主細胞を作製することに関する。ある特定の実施形態では、方法は、リコンビナーゼ媒介組換えを含む。ある特定の実施形態では、方法は、相同組換え、ＨＤＲ、及び／またはＮＨＥＪを含む。
本明細書で開示される主題は、宿主細胞中への外因性ヌクレオチド配列の標的組込み方法に関する。ある特定の実施形態では、方法は、外因性ヌクレオチド配列を宿主細胞中に組み込み、その後のＳＯＩの標的組込みに好適な宿主細胞を作製することに関する。ある特定の実施形態では、方法は、リコンビナーゼ媒介組換えを含む。ある特定の実施形態では、方法は、相同組換え、ＨＤＲ、及び／またはＮＨＥＪを含む。
【0146】
６．１ リコンビナーゼ媒介組換えを使用したＴＩ宿主細胞の調製
ある特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現するためのＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、本方法は、ａ）宿主細胞ゲノムの座位内における部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供し、その座位が、配列番号１～７と少なくとも約９０％相同であり、その外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含むこと、ｂ）ａ）で提供される細胞中に、組込み外因性ヌクレオチド配列上の２つのＲＲＳと一致し、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第２選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含むベクターを導入すること、ｃ）リコンビナーゼを導入し、そのリコンビナーゼがＲＲＳを認識すること、ならびにｄ）第２選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む。
ある特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現するためのＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、本方法は、ａ）宿主細胞ゲノムの座位内における部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供し、その座位が、配列番号１～７と少なくとも約９０％相同であり、その外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含むこと、ｂ）ａ）で提供される細胞中に、組込み外因性ヌクレオチド配列上の２つのＲＲＳと一致し、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第２選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含むベクターを導入すること、ｃ）リコンビナーゼを導入し、そのリコンビナーゼがＲＲＳを認識すること、ならびにｄ）第２選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む。
【0147】
ある特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現するためのＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、本方法は、ａ）ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれらの少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択される内因性遺伝子内における部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供し、その外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含むこと、ｂ）ａ）で提供される細胞中に、組込み外因性ヌクレオチド配列上の２つのＲＲＳと一致し、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第２選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含むベクターを導入すること、ｃ）リコンビナーゼを導入し、そのリコンビナーゼがＲＲＳを認識すること、ならびにｄ）第２選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む。
【0148】
ある特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現するためのＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、本方法は、ａ）ＴＩ宿主細胞ゲノムの座位内における部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供し、その座位が、配列番号１～７と少なくとも約９０％相同であり、その外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１選択マーカーに隣接する２つの異種特異的ＲＲＳを含む第１ＤＮＡカセットを含むこと、ｂ）ａ）で提供される細胞中に、組込み外因性ヌクレオチド配列上の２つのＲＲＳと一致し、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第２選択マーカーに隣接する２つの異種特異的ＲＲＳを含む第２ＤＮＡカセットを含むベクターを導入すること、ｃ）リコンビナーゼを導入し、そのリコンビナーゼが、ＲＲＳを認識してＲＭＣＥを１回実施すること、ならびにｄ）第２選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む。
【0149】
ある特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現するためのＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、本方法は、ａ）ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれらの少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択される内因性遺伝子内における部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供し、その外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１選択マーカーに隣接する２つの異種特異的ＲＲＳを含む第１ＤＮＡカセットを含むこと、ｂ）ａ）で提供される細胞中に、組込み外因性ヌクレオチド配列上の２つのＲＲＳと一致し、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第２選択マーカーに隣接する２つの異種特異的ＲＲＳを含む第２ＤＮＡカセットを含むベクターを導入すること、ｃ）リコンビナーゼを導入し、そのリコンビナーゼが、ＲＲＳを認識してＲＭＣＥを１回実施すること、ならびにｄ）第２選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む。
【0150】
ある特定の実施形態では、本開示は、目的の第１及び第２ポリペプチド（ここで第１及び第２ポリペプチドは、同じかまたは異なり得る）を発現するためのＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、本方法は、ａ）宿主細胞ゲノムの座位内における部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供し、その座位が、配列番号１～７と少なくとも約９０％相同であり、その外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１選択マーカーに隣接する第１及び第２ＲＲＳ、ならびに第１ＲＲＳと第２ＲＲＳとの間に位置する第３ＲＲＳを含み、全てのＲＲＳが異種特異的であること、ｂ）ａ）で提供される細胞中に、組込み外因性ヌクレオチド配列上の第１及び第３ＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第１外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第２選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含む第１ベクターを導入すること、ｃ）ａ）で提供される細胞中に、組込み外因性ヌクレオチド配列上の第２及び第３ＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第２外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳを含む第２ベクターを導入すること、ｄ）１つ以上のリコンビナーゼを導入し、その１つ以上のリコンビナーゼがＲＲＳを認識すること、ならびにｅ）第２選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、目的の第１及び第２ポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む。ある特定の実施形態では、第１ベクター上に選択マーカー全体を有するのではなく、第１ベクターは、第１ＳＯＩの上流に、かつＲＲＳの下流に隣接して配置されるコドンＡＴＧに機能的に連結されるプロモーター配列を含み、第２ベクターは、ＲＲＳの上流に、かつ第２ＳＯＩの下流に隣接するＡＴＧ転写開始コドンを欠く選択マーカーを含む。
【0151】
ある特定の実施形態では、本開示は、目的の第１及び第２ポリペプチド（ここで第１及び第２ポリペプチドは、同じかまたは異なり得る）を発現するためのＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、本方法は、ａ）ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれらの少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択される内因性遺伝子内における部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供し、その外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１選択マーカーに隣接する第１及び第２ＲＲＳ、ならびに第１ＲＲＳと第２ＲＲＳとの間に位置する第３ＲＲＳを含み、全てのＲＲＳが異種特異的であること、ｂ）ａ）で提供される細胞中に、組込み外因性ヌクレオチド配列上の第１及び第３ＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第１外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第２選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含む第１ベクターを導入すること、ｃ）ａ）で提供される細胞中に、組込み外因性ヌクレオチド配列上の第２及び第３ＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第２外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳを含む第２ベクターを導入すること、ｄ）１つ以上のリコンビナーゼを導入し、その１つ以上のリコンビナーゼがＲＲＳを認識すること、ならびにｅ）第２選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、目的の第１及び第２ポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む。ある特定の実施形態では、第１ベクター上に選択マーカー全体を有するのではなく、第１ベクターは、第１ＳＯＩの上流に、かつＲＲＳの下流に隣接して配置されるコドンＡＴＧに機能的に連結されるプロモーター配列を含み、第２ベクターは、ＲＲＳの上流に、かつ第２ＳＯＩの下流に隣接するＡＴＧ転写開始コドンを欠く選択マーカーを含む。
【0152】
ある特定の実施形態では、本開示は、目的の第１及び第２ポリペプチド（ここで第１及び第２ポリペプチドは、同じかまたは異なり得る）を発現するためのＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、本方法は、ａ）宿主細胞ゲノムの座位内における部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供し、その座位が、配列番号１～７と少なくとも約９０％相同であり、その外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１選択マーカーに隣接する第１及び第２ＲＲＳ、ならびに第１ＲＲＳと第２ＲＲＳとの間に位置する第３ＲＲＳを含む第１ＤＮＡカセットを含み、３つ全てのＲＲＳが異種特異的であること、ｂ）ａ）で提供される細胞中に、第２ＤＮＡカセットを含む第１ベクターを導入し、その第２ＤＮＡカセットが、第１ＤＮＡカセットの第１及び第３ＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第１外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第２選択マーカーに隣接する２つの異種特異的ＲＲＳを含むこと、ｃ）ａ）で提供される細胞中に、第３ＤＮＡカセットを含む第２ベクターを導入し、その第３ＤＮＡカセットが、第１ＤＮＡカセットの第２及び第３ＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第２外因性ＳＯＩに隣接する２つの異種特異的ＲＲＳを含むこと、ｄ）１つ以上のリコンビナーゼを導入し、その１つ以上のリコンビナーゼが、ＲＲＳを認識してＲＭＣＥを２回実施すること、ならびにｅ）第２選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、目的の第１及び第２ポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む。ある特定の実施形態では、第１ベクター上に選択マーカー全体を有するのではなく、第１ベクターは、第１ＳＯＩの上流に、かつＲＲＳの下流に隣接して配置されるコドンＡＴＧに機能的に連結されるプロモーター配列を含み、第２ベクターは、ＲＲＳの上流に、かつ第２ＳＯＩの下流に隣接するＡＴＧ転写開始コドンを欠く選択マーカーを含む。
【0153】
ある特定の実施形態では、本開示は、目的の第１及び第２ポリペプチド（ここで第１及び第２ポリペプチドは、同じかまたは異なり得る）を発現するためのＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、本方法は、ａ）ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれらと少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択される内因性遺伝子内における部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供し、その外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１選択マーカーに隣接する第１及び第２ＲＲＳ、ならびに第１ＲＲＳと第２ＲＲＳとの間に位置する第３ＲＲＳを含む第１ＤＮＡカセットを含み、３つ全てのＲＲＳが異種特異的であること、ｂ）ａ）で提供される細胞中に、第２ＤＮＡカセットを含む第１ベクターを導入し、その第２ＤＮＡカセットが、第１ＤＮＡカセットの第１及び第３ＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第１外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第２選択マーカーに隣接する２つの異種特異的ＲＲＳを含むこと、ｃ）ａ）で提供される細胞中に、第３ＤＮＡカセットを含む第２ベクターを導入し、その第３ＤＮＡカセットが、第１ＤＮＡカセットの第２及び第３ＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第２外因性ＳＯＩに隣接する２つの異種特異的ＲＲＳを含むこと、ｄ）１つ以上のリコンビナーゼを導入し、その１つ以上のリコンビナーゼが、ＲＲＳを認識してＲＭＣＥを２回実施すること、ならびにｅ）第２選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、目的の第１及び第２ポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む。ある特定の実施形態では、第１ベクター上に選択マーカー全体を有するのではなく、第１ベクターは、第１ＳＯＩの上流に、かつＲＲＳの下流に隣接して配置されるコドンＡＴＧに機能的に連結されるプロモーター配列を含み、第２ベクターは、ＲＲＳの上流に、かつ第２ＳＯＩの下流に隣接するＡＴＧ転写開始コドンを欠く選択マーカーを含む。
【0154】
ある特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現するためのＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、本方法は、ａ）宿主細胞ゲノムの座位内における部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供し、その座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、その外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１選択マーカーに隣接する１つのＲＲＳを含むこと、ｂ）ａ）で提供される細胞中に、組込み外因性ヌクレオチド配列上のＲＲＳと一致し、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第２選択マーカーに隣接する１つのＲＲＳを含むベクターを導入すること、ｃ）リコンビナーゼを導入し、そのリコンビナーゼがＲＲＳを認識すること、ならびにｄ）第２選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む。
【0155】
ある特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現するためのＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、本方法は、ａ）ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれらと少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択される内因性遺伝子内における部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供し、その外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１選択マーカーに隣接する１つのＲＲＳを含むこと、ｂ）ａ）で提供される細胞中に、組込み外因性ヌクレオチド配列上のＲＲＳと一致し、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第２選択マーカーに隣接する１つのＲＲＳを含むベクターを導入すること、ｃ）リコンビナーゼを導入し、そのリコンビナーゼがＲＲＳを認識すること、ならびにｄ）第２選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む。
【0156】
本明細書で開示される主題は、目的のポリペプチドを産生する方法にも関し、本方法は、ａ）本明細書に記載されるＴＩ宿主細胞を提供すること、ｂ）ＳＯＩを発現し、そこから目的のポリペプチドを回収するのに好適な条件下でａ）のＴＩ宿主細胞を培養することを含む。
【0157】
ある特定の実施形態では、本開示は、その後の標的組込みに好適なＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、本方法は、ａ）宿主細胞ゲノムの座位内における部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供し、その座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、その外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第１選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含むこと、ｂ）ａ）で提供される細胞中に、組込み外因性ヌクレオチド配列上の２つのＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第２選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含むベクターを導入すること、ｃ）リコンビナーゼを導入し、そのリコンビナーゼがＲＲＳを認識すること、ならびにｄ）第２選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、その後の標的組込みに好適なＴＩ宿主細胞を単離することを含む。
【0158】
ある特定の実施形態では、本開示は、その後の標的組込みに好適なＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、本方法は、ａ）ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれらと少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択される内因性遺伝子内における部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供し、その外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第１選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含むこと、ｂ）ａ）で提供される細胞中に、組込み外因性ヌクレオチド配列上の２つのＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第２選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含むベクターを導入すること、ｃ）リコンビナーゼを導入し、そのリコンビナーゼがＲＲＳを認識すること、ならびにｄ）第２選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、その後の標的組込みに好適なＴＩ宿主細胞を単離することを含む。
【0159】
ある特定の実施形態では、本開示は、その後の標的組込みに好適なＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、本方法は、ａ）宿主細胞ゲノムの座位内における部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供し、その座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、その外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第１選択マーカーに隣接する第１及び第２ＲＲＳを含むこと、ｂ）ａ）で提供される細胞中に、３つのＲＲＳを含むベクターを導入し、そのベクターの第１ＲＲＳが組込み外因性ヌクレオチド配列上の第１ＲＲＳと一致し、そのベクターの第２ＲＲＳが組込み外因性ヌクレオチド配列上の第２ＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第２選択マーカーが第１ＲＲＳと第２ＲＲＳとの間に位置すること、ｃ）リコンビナーゼを導入し、そのリコンビナーゼが、ベクター及び組込み外因性ヌクレオチド配列上の両方の第１及び第２ＲＲＳを認識すること、ならびにｄ）第２選択マーカーを発現するＴＩ宿主細胞を選択することによって、その後の標的組込みに好適なＴＩ宿主細胞を単離することを含む。
【0160】
ある特定の実施形態では、本開示は、その後の標的組込みに好適なＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、本方法は、ａ）ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれらと少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択される内因性遺伝子内における部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供し、その外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第１選択マーカーに隣接する第１及び第２ＲＲＳを含むこと、ｂ）ａ）で提供される細胞中に、３つのＲＲＳを含むベクターを導入し、そのベクターの第１ＲＲＳが組込み外因性ヌクレオチド配列上の第１ＲＲＳと一致し、そのベクターの第２ＲＲＳが組込み外因性ヌクレオチド配列上の第２ＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第２選択マーカーが第１ＲＲＳと第２ＲＲＳとの間に位置すること、ｃ）リコンビナーゼを導入し、そのリコンビナーゼが、ベクター及び組込み外因性ヌクレオチド配列上の両方の第１及び第２ＲＲＳを認識すること、ならびにｄ）第２選択マーカーを発現するＴＩ宿主細胞を選択することによって、その後の標的組込みに好適なＴＩ宿主細胞を単離することを含む。
【0161】
６．２ 相同組換え、ＨＤＲ、またはＮＨＥＪを使用した宿主細胞の標的改変方法
ある特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現するためのＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、本方法は、ａ）宿主細胞ゲノムの座位を含むＴＩ宿主細胞を提供し、その座位が、配列番号１～７と少なくとも約９０％相同であること、ｂ）ベクターをＴＩ宿主細胞中に導入し、そのベクターが、ＤＮＡカセットに隣接する配列番号１～７から選択される配列と少なくとも５０％相同のヌクレオチド配列を含み、そのＤＮＡカセットが、少なくとも１つの選択マーカー及び少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含むこと、ｃ）選択マーカーを選択し、ゲノム座位中に組み込まれたＳＯＩを有するＴＩ宿主細胞を単離して目的のポリペプチドを発現させることを含む。ある特定の実施形態では、ベクターのＤＮＡカセットは、２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの選択マーカー及び少なくとも１つの外因性ＳＯＩをさらに含む。
ある特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現するためのＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、本方法は、ａ）宿主細胞ゲノムの座位を含むＴＩ宿主細胞を提供し、その座位が、配列番号１～７と少なくとも約９０％相同であること、ｂ）ベクターをＴＩ宿主細胞中に導入し、そのベクターが、ＤＮＡカセットに隣接する配列番号１～７から選択される配列と少なくとも５０％相同のヌクレオチド配列を含み、そのＤＮＡカセットが、少なくとも１つの選択マーカー及び少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含むこと、ｃ）選択マーカーを選択し、ゲノム座位中に組み込まれたＳＯＩを有するＴＩ宿主細胞を単離して目的のポリペプチドを発現させることを含む。ある特定の実施形態では、ベクターのＤＮＡカセットは、２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの選択マーカー及び少なくとも１つの外因性ＳＯＩをさらに含む。
【0162】
ある特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現するためのＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、本方法は、ａ）宿主細胞ゲノムの座位を含むＴＩ宿主細胞を提供し、その座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であること、ｂ）ポリヌクレオチドを宿主細胞中に導入し、そのポリヌクレオチドが、ＤＮＡカセットに隣接する配列番号１～７から選択される配列と少なくとも５０％相同のヌクレオチド配列を含み、そのＤＮＡカセットが、少なくとも１つの選択マーカー及び少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含むこと、ｃ）選択マーカーを選択し、ゲノム座位中に組み込まれたＳＯＩを有するＴＩ宿主細胞を単離して目的のポリペプチドを発現させることを含む。ある特定の実施形態では、ベクターのＤＮＡカセットは、２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの選択マーカー及び少なくとも１つの外因性ＳＯＩをさらに含む。
【0163】
ある特定の実施形態では、相同組換えは、組込みベクターによって促進される。ある特定の実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、組込みファージベクター、非ウイルスベクター、トランスポゾン及び／またはトランスポザーゼベクター、インテグラーゼ基質、ならびにプラスミドからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、トランスポゾンは、ＰｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポゾンシステムであり得る。
【0164】
ある特定の実施形態では、組込みは、外因性ヌクレアーゼによって促進される。ある特定の実施形態では、外因性ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＺＦＮ二量体、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＴＡＬエフェクタードメイン融合タンパク質、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、操作されたメガヌクレアーゼ、及び規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼからなる群から選択される。
【0165】
ある特定の実施形態では、本開示は、その後の標的組込みに好適なＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、本方法は、ａ）宿主細胞ゲノムの座位を含むＴＩ宿主細胞を提供し、その座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であること、ｂ）ベクターをＴＩ宿主細胞中に導入し、そのベクターが、ＤＮＡカセットに隣接する配列番号１～７から選択される配列と少なくとも５０％相同のヌクレオチド配列を含み、そのＤＮＡカセットが、２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの選択マーカーを含むこと、ｃ）選択マーカーを選択し、その後の標的組込みに好適なＴＩ宿主細胞を単離することを含む。
【0166】
ある特定の実施形態では、本開示は、その後の標的組込みに好適なＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、本方法は、ａ）宿主細胞ゲノムの座位を含むＴＩ宿主細胞を提供し、その座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であること、ｂ）ポリヌクレオチドをＴＩ宿主細胞中に導入し、そのポリヌクレオチドが、ＤＮＡカセットに隣接する配列番号１～７から選択される配列と少なくとも５０％相同のヌクレオチド配列を含み、そのＤＮＡカセットが、２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの選択マーカーを含むこと、ｃ）選択マーカーを選択し、その後の標的組込みに好適なＴＩ宿主細胞を単離することを含む。
【0167】
ある特定の実施形態では、本開示は、その後の標的組込みに好適なＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、本方法は、ａ）宿主細胞ゲノムの座位を含むＴＩ宿主細胞を提供し、その座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であること、ｂ）ベクターを宿主細胞中に導入し、そのベクターが、ＤＮＡカセットに隣接する配列番号１～７から選択される配列と少なくとも５０％相同のヌクレオチド配列を含み、そのＤＮＡカセットが３つのＲＲＳを含み、第３ＲＲＳ及び少なくとも１つの選択マーカーが第１ＲＲＳと第２ＲＲＳとの間に位置すること、ならびにｃ）選択マーカーを選択し、その後の標的組込みに好適なＴＩ宿主細胞を単離することを含む。
【0168】
ある特定の実施形態では、本開示は、その後の標的組込みに好適なＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、本方法は、ａ）宿主細胞ゲノムの座位を含むＴＩ宿主細胞を提供し、その座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であること、ｂ）ポリヌクレオチドを宿主細胞中に導入し、そのポリヌクレオチドが、ＤＮＡカセットに隣接する配列番号１～７から選択される配列と少なくとも５０％相同のヌクレオチド配列を含み、そのＤＮＡカセットが３つのＲＲＳを含み、第３ＲＲＳ及び少なくとも１つの選択マーカーが第１ＲＲＳと第２ＲＲＳとの間に位置すること、ならびにｃ）選択マーカーを選択し、その後の標的組込みに好適なＴＩ宿主細胞を単離することを含む。
【0169】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つの目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、本方法は、ａ）ＴＩ宿主細胞ゲノムの１箇所以上の座位内における部位に組み込まれた少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供し、その１箇所以上の座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、その少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含むこと、ｂ）ａ）で提供される細胞中に、組込み外因性ヌクレオチド配列上の２つのＲＲＳと一致し、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第２選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含むベクターを導入すること、ｃ）リコンビナーゼまたはリコンビナーゼをコードする核酸を導入し、そのリコンビナーゼがＲＲＳを認識すること、ならびに第２選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、少なくとも１つの目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む。
【0170】
ある特定の実施形態では、本開示は、少なくとも１つの目的の第１及び第２ポリペプチド（ここで第１及び第２ポリペプチドは、同じかまたは異なり得る）を発現するＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、本方法は、ａ）宿主細胞ゲノムの１箇所以上の座位内における部位に組み込まれた少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供し、その１箇所以上の座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、その外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１選択マーカーに隣接する第１及び第２ＲＲＳ、ならびに第１ＲＲＳと第２ＲＲＳとの間に位置する第３ＲＲＳを含み、全てのＲＲＳが異種特異的であること、ｂ）ａ）で提供される細胞中に、少なくとも１つの組込み外因性ヌクレオチド配列上の第１及び第３ＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第１外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第２選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含む第１ベクターを導入すること、ｃ）ａ）で提供される細胞中に、少なくとも１つの組込み外因性ヌクレオチド配列上の第２及び第３ＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第２外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳを含む第２ベクターを導入すること、ｄ）１つ以上のリコンビナーゼ、または１つ以上のリコンビナーゼをコードする１つ以上の核酸を導入し、その１つ以上のリコンビナーゼがＲＲＳを認識すること、ならびにｅ）第２選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、少なくとも１つの目的の第１及び第２ポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む。ある特定の実施形態では、第１ベクター上に選択マーカー全体を有するのではなく、第１ベクターは、第１ＳＯＩの上流に、かつＲＲＳの下流に隣接して配置されるコドンＡＴＧに機能的に連結されるプロモーター配列を含み、第２ベクターは、ＲＲＳの上流に、かつ第２ＳＯＩの下流に隣接するＡＴＧ転写開始コドンを欠く選択マーカーを含む。
【0171】
ある特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、本方法は、ａ）ＴＩ宿主細胞ゲノムの１箇所以上の座位内における部位に組み込まれた少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供し、その１箇所以上の座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、その外因性ヌクレオチド配列が１つ以上のＲＲＳを含むこと、ｂ）ａ）で提供される細胞中に、組込み外因性ヌクレオチド配列上の１つ以上のＲＲＳと一致し、調節可能なプロモーターに機能的に連結される少なくとも１つの外因性ＳＯＩに隣接する１つ以上のＲＲＳを含むベクターを導入すること、ｃ）リコンビナーゼまたはリコンビナーゼをコードする核酸を導入し、そのリコンビナーゼがＲＲＳを認識すること、ならびにｄ）誘導物質の存在下で外因性ＳＯＩを発現するＴＩ細胞を選択することによって、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む。
【0172】
ある特定の実施形態では、本開示は、目的のポリペプチドを発現する方法を提供し、本方法は、ａ）宿主細胞ゲノムの座位内に組み込まれた２つのＲＲＳ及び調節可能なプロモーターに隣接する少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む宿主細胞を提供し、その座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であること、ならびにｂ）ＳＯＩを発現し、そこから目的のポリペプチドを回収するのに好適な条件下で細胞を培養することを含む。
【0173】
ある特定の実施形態では、本開示は、目的の第１及び第２ポリペプチド（ここで第１及び第２ポリペプチドは、同じかまたは異なり得る）を発現するＴＩ宿主細胞を調製する方法を提供し、本方法は、ａ）宿主細胞ゲノムの座位内における部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供し、その座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、その外因性ヌクレオチド配列が、第１、第２ＲＲＳ及び第１ＲＲＳと第２ＲＲＳとの間に位置する第３ＲＲＳを含み、全てのＲＲＳが異種特異的であること、ｂ）ａ）で提供される細胞中に、組込み外因性ヌクレオチド配列上の第１及び第３ＲＲＳと一致し、調節可能なプロモーターに機能的に連結される少なくとも１つの第１外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳを含む第１ベクターを導入すること、ｃ）ａ）で提供される細胞中に、組込み外因性ヌクレオチド配列上の第２及び第３ＲＲＳと一致し、調節可能なプロモーターに機能的に連結される少なくとも１つの第２ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳを含む第２ベクターを導入すること、ｄ）１つ以上のリコンビナーゼ、または１つ以上のリコンビナーゼをコードする１つ以上の核酸を導入し、その１つ以上のリコンビナーゼがＲＲＳを認識すること、ならびにｅ）誘導物質の存在下で少なくとも第１及び第２外因性ＳＯＩを発現するＴＩ細胞を選択することによって、目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む。ある特定の実施形態では、第１ベクター上に選択マーカー全体を有するのではなく、第１ベクターは、第１ＳＯＩの上流に、かつＲＲＳの下流に隣接して配置されるコドンＡＴＧに機能的に連結されるプロモーター配列を含み、第２ベクターは、ＲＲＳの上流に、かつ第２ＳＯＩの下流に隣接するＡＴＧ転写開始コドンを欠く選択マーカーを含む。
【0174】
７．産物
本開示の宿主細胞は、任意の目的の分子、例えば、目的のポリペプチドの発現に使用され得る。ある特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、ポリペプチド、例えば、哺乳動物ポリペプチドの発現に使用され得る。そのようなポリペプチドの非限定的な例としては、ホルモン、受容体、融合タンパク質、調節因子、成長因子、補体系因子、酵素、凝固因子、抗凝固因子、キナーゼ、サイトカイン、ＣＤタンパク質、インターロイキン、治療用タンパク質、診断用タンパク質及び抗体が挙げられる。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は治療用抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は診断用抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はヒト抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はヒト化抗体である。
本開示の宿主細胞は、任意の目的の分子、例えば、目的のポリペプチドの発現に使用され得る。ある特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、ポリペプチド、例えば、哺乳動物ポリペプチドの発現に使用され得る。そのようなポリペプチドの非限定的な例としては、ホルモン、受容体、融合タンパク質、調節因子、成長因子、補体系因子、酵素、凝固因子、抗凝固因子、キナーゼ、サイトカイン、ＣＤタンパク質、インターロイキン、治療用タンパク質、診断用タンパク質及び抗体が挙げられる。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は治療用抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は診断用抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はヒト抗体である。いくつかの実施形態では、抗体はヒト化抗体である。
【0175】
ある特定の実施形態では、本明細書における定義内に包含されるポリペプチドの例としては、例えば、レニンなどの哺乳動物ポリペプチド、ヒト成長ホルモン及びウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン、成長ホルモン放出因子、副甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、リポタンパク質、アルファ－１－アンチトリプシン、インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、プロインスリン、卵胞刺激ホルモン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、グルカゴン、レプチン、凝固因子、例えば、第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ因子、組織因子、及びフォンウィルブランド因子など、プロテインＣなどの抗凝固因子、心房性ナトリウム利尿因子、肺サーファクタント、プラスミノーゲン活性化因子、例えば、ウロキナーゼまたはヒト尿もしくは組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ－ＰＡ）など、ボンベシン、トロンビン、造血成長因子、腫瘍壊死因子－アルファ及び－ベータ、腫瘍壊死因子受容体、例えば、細胞死受容体５及びＣＤ１２０など、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、Ｂリンパ球刺激因子（ＢＬｙＳ）、増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）、エンケファリナーゼ、ＲＡＮＴＥＳ（活性化時に調節され、Ｔ細胞が正常に発現かつ分泌される）、ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ－１－アルファ）、ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン、ミュラー管抑制物質、リラキシンＡ鎖、リラキシンＢ鎖、プロリラキシン、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、ベータ－ラクタマーゼなどの微生物タンパク質、ＤＮａｓｅ、ＩｇＥ、ＣＴＬＡ－４などの細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）、インヒビン、アクチビン、血小板由来内皮細胞成長因子（ＰＤ－ＥＣＧＦ）、血管内皮増殖因子ファミリータンパク質（例えば、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、及びＰ１ＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）ファミリータンパク質（例えば、ＰＤＧＦ－Ａ、ＰＤＧＦ－Ｂ、ＰＤＧＦ－Ｃ、ＰＤＧＦ－Ｄ、及びそれらの二量体）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリー、例えば、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＦＧＦ４、及びＦＧＦ９など、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ホルモンまたは成長因子の受容体、例えば、ＶＥＧＦ受容体（複数可）（例えば、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、及びＶＥＧＦＲ３）、上皮成長因子（ＥＧＦ）受容体（複数可）（例えば、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、及びＥｒｂＢ４受容体）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）受容体（複数可）（例えば、ＰＤＧＦＲ－α及びＰＤＧＦＲ－β）、ならびに線維芽細胞増殖因子受容体（複数可）など、ＴＩＥリガンド（アンジオポエチン、ＡＮＧＰＴ１、ＡＮＧＰＴ２）、アンジオポエチン受容体、例えば、ＴＩＥ１及びＴＩＥ２など、プロテインＡまたはＤ、リウマチ因子、神経栄養因子、例えば、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン－３、－４、－５、もしくは－６（ＮＴ－３、ＮＴ－４、ＮＴ－５、もしくはＮＴ－６）など、またはＮＧＦ－ｂなどの神経成長因子、トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、例えば、ＴＧＦ－アルファ及びＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３、ＴＧＦ－β４、またはＴＧＦ－β５を含むＴＧＦ－ベータなど、インスリン様成長因子－Ｉ及び－ＩＩ（ＩＧＦ－Ｉ及びＩＧＦ－ＩＩ）、ｄｅｓ（１－３）－ＩＧＦ－Ｉ（脳ＩＧＦ－Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）、ＣＤタンパク質、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９及びＣＤ２０など、エリスロポエチン、骨誘導因子、免疫毒素、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、ケモカイン、例えば、ＣＸＣＬ１２及びＣＸＣＲ４など、インターフェロン、例えば、インターフェロン－アルファ、－ベータ、及び－ガンマなど、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えば、Ｍ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、及びＧ－ＣＳＦ、サイトカイン、例えば、インターロイキン（ＩＬ）、例えば、ＩＬ－１～ＩＬ－１０など、ミッドカイン、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｔ細胞受容体、表面膜タンパク質、崩壊促進因子、ウイルス抗原、例えば、ＡＩＤＳエンベロープの一部など、輸送タンパク質、ホーミング受容体、アドレシン、調節タンパク質、インテグリン、例えば、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ－４及びＶＣＡＭなど、エフリン、Ｂｖ８、デルタ様リガンド４（ＤＬＬ４）、Ｄｅｌ－１、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、フォリスタチン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）／散乱因子（ＳＦ）、Ａｌｋ１、Ｒｏｂｏ４、ＥＳＭ１、パールカン、ＥＧＦ様ドメインマルチプル７（ＥＧＦＬ７）、ＣＴＧＦ及びそのファミリーメンバー、トロンボスポンジン、例えば、トロンボスポンジン１及びトロンボスポンジン２など、コラーゲン、例えば、コラーゲンＩＶ及びコラーゲンＸＶＩＩＩなど、ニューロピリン、例えば、ＮＲＰ１及びＮＲＰ２など、プレイオトロフィン（ＰＴＮ）、プログラニュリン、プロリフェリン、Ｎｏｔｃｈタンパク質、例えば、Ｎｏｔｃｈ１及びＮｏｔｃｈ４など、セマフォリン、例えば、Ｓｅｍａ３Ａ、Ｓｅｍａ３Ｃ、及びＳｅｍａ３Ｆなど、腫瘍関連抗原、例えば、ＣＡ１２５（卵巣癌抗原）など、イムノアドヘシン、ならびに上に列挙したポリペプチドのいずれかの断片及び／またはバリアントに加えて、例えば、上に列挙したタンパク質のいずれかを含む１つ以上のタンパク質に結合する抗体断片を含む抗体が挙げられる。
【0176】
ある特定の実施形態では、目的のポリペプチドは、二重特異性、三重特異性または多重特異性ポリペプチド、例えば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体の様々な分子形式が当該技術分野において既知であり、本明細書に含まれる（例えば、Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６７（２０１５）９５－１０６を参照のこと）。本明細書にさらに含まれる多重特異性抗体の特定の種類は、標的細胞、例えば、腫瘍細胞上の表面抗原に、及びＴ細胞の再標的化により標的細胞を死滅させることを目的としたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の活性化インバリアント構成成分、例えば、ＣＤ３などに同時に結合するように設計された二重特異性抗体である。二重特異性抗体形式の他の例としては、２つのｓｃＦｖ分子が柔軟なリンカーによって融合されている、いわゆる「ＢｉＴＥ」（二重特異性Ｔ細胞誘導体）分子（例えば、ＷＯ２００４／１０６３８１、ＷＯ２００５／０６１５４７、ＷＯ２００７／０４２２６１、及びＷＯ２００８／１１９５６７、Ｎａｇｏｒｓｅｎ ａｎｄ Ｂａｕｅｒｌｅ，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ３１７，１２５５－１２６０（２０１１）を参照のこと）、ダイアボディ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，２９９－３０５（１９９６））及びそれらの誘導体、例えば、タンデムダイアボディ（「ＴａｎｄＡｂ」、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９３，４１－５６（１９９９））など、ダイアボディ形式に基づいているが、さらなる安定化のためにＣ末端ジスルフィド架橋を特徴とする「ＤＡＲＴ」（二重親和性再標的化）分子（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９９，４３６－４４９（２０１０））、ならびにいわゆるｔｒｉｏｍａｂという全ハイブリッドマウス／ラットＩｇＧ分子（Ｓｅｉｍｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｖ ３６，４５８－４６７（２０１０）に概説されている）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に含まれる特定のＴ細胞二重特異性抗体形式は、ＷＯ２０１３／０２６８３３、ＷＯ２０１３／０２６８３９、ＷＯ２０１６／０２０３０９、Ｂａｃａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５（８）（２０１６）ｅ１２０３４９８に記載されている。
【0177】
ある特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、構成的に、または調節された目的の治療用タンパク質または分子を発現しながら、シャペロン、タンパク質修飾酵素、ｓｈＲＮＡ、ｇＲＮＡまたは他のタンパク質もしくはペプチドの発現に使用され得る。
【0178】
いくつかの実施形態では、本開示の宿主細胞によって発現されるポリペプチドは、いずれかのタンパク質、例えば、８ＭＰＩ、８ＭＰ２、８ＭＰ３８（ＧＤＦＩＯ）、８ＭＰ４、８ＭＰ６、８ＭＰ８、ＣＳＦＩ（Ｍ－ＣＳＦ）、ＣＳＦ２（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＣＳＦ３（Ｇ－ＣＳＦ）、ＥＰＯ、ＦＧＦ１（αＦＧＦ）、ＦＧＦ２（βＦＧＦ）、ＦＧＦ３（ｉｎｔ－２）、ＦＧＦ４（ＨＳＴ）、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６（ＨＳＴ－２）、ＦＧＦ７（ＫＧＦ）、ＦＧＦ９、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１２Ｂ、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２３、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮ８１、ＩＦＮＧ、ＩＦＮＷＩ、ＦＥＬ１、ＦＥＬ１（イプシロン）、ＦＥＬ１（ゼータ）、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１７Ｂ、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２４、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８Ａ、ＩＬ２８Ｂ、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢ１、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢｂ３、ＬＴＡ（ＴＮＦ－β）、ＬＴＢ、ＴＮＦ（ＴＮＦ－α）、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬ）、ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド）、ＴＮＦＳＦ８（ＣＤ３０リガンド）、ＴＮＦＳＦ９（４－１ＢＢリガンド）、ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ）、ＴＮＦＳＦ１２（ＡＰＯ３Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１３（Ａｐｒｉｌ）、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４（ＨＶＥＭ－Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＩ）、ＴＮＦＳＦ１８、ＨＧＦ（ＶＥＧＦＤ）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１Ｒ２、ＩＬ１ＲＬ１、ＩＬ１ＲＬ２、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ８ＲＡ、ＩＬ８ＲＢ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＩＬ１１ＲＡ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１２ＲＢ２、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ１７Ｒ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２２Ｒ、ＩＬ１ＨＹ１、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ１ＲＡＰＬ１、ＩＬ１ＲＡＰＬ２、ＩＬ１ＲＮ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ１８ＢＰ、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＩＬ２２ＲＡ２、ＡＩＦ１、ＨＧＦ、ＬＥＰ（レプチン）、ＰＴＮ、及びＴＨＰＯ．ｋからなる群から選択されるサイトカイン、サイトカイン関連タンパク質、及びサイトカイン受容体を含むが、これらに限定されないタンパク質に結合する、またはそれと相互作用する場合がある。
【0179】
いくつかの実施形態では、本開示の宿主細胞によって発現されるポリペプチドは、ＣＣＬＩ（１－３０９）、ＣＣＬ２（ＭＣＰ－１／ＭＣＡＦ）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ－Ｉα）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ－Ｉβ）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ７（ＭＣＰ－３）、ＣＣＬ８（ｍｃｐ－２）、ＣＣＬ１１（エオタキシン）、ＣＣＬ１３（ＭＣＰ－４）、ＣＣＬ１５（ＭＩＰ－Ｉδ）、ＣＣＬ１６（ＨＣＣ－４）、ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）、ＣＣＬ１８（ＰＡＲＣ）、ＣＣＬ１９（ＭＤＰ－３ｂ）、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ－３α）、ＣＣＬ２１（ＳＬＣ／エクソダス－２）、ＣＣＬ２２（ＭＤＣ／ＳＴＣ－１）、ＣＣＬ２３（ＭＰＩＦ－１）、ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ－２／エオタキシン－２）、ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）、ＣＣＬ２６（エオタキシン－３）、ＣＣＬ２７（ＣＴＡＣＫ／ＩＬＣ）、ＣＣＬ２８、ＣＸＣＬＩ（ＧＲＯＩ）、ＣＸＣＬ２（ＧＲ０２）、ＣＸＣＬ３（ＧＲ０３）、ＣＸＣＬ５（ＥＮＡ－７８）、ＣＸＣＬ６（ＧＣＰ－２）、ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ１０）、ＣＸＣＬ１１（１－ＴＡＣ）、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦＩ）、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１６、ＰＦ４（ＣＸＣＬ４）、ＰＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）、ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤＩ）、ＳＣＹＥＩ、ＸＣＬＩ（リンホタクチン）、ＸＣＬ２（ＳＣＭ－Ｉβ）、ＢＬＲＩ（ＭＤＲ１５）、ＣＣＢＰ２（Ｄ６／ＪＡＢ６１）、ＣＣＲＩ（ＣＫＲＩ／ＨＭ１４５）、ＣＣＲ２（ｍｃｐ－ＩＲＢ ＩＲＡ）、ＣＣＲ３（ＣＫＲ３／ＣＭＫＢＲ３）、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５（ＣＭＫＢＲ５／ＣｈｅｍＲ１３）、ＣＣＲ６（ＣＭＫＢＲ６／ＣＫＲ－Ｌ３／ＳＴＲＬ２２／ＤＲＹ６）、ＣＣＲ７（ＣＫＲ７／ＥＢＩＩ）、ＣＣＲ８（ＣＭＫＢＲ８／ＴＥＲ１／ＣＫＲ－Ｌ１）、ＣＣＲ９（ＧＰＲ－９－６）、ＣＣＲＬ１（ＶＳＨＫ１）、ＣＣＲＬ２（Ｌ－ＣＣＲ）、ＸＣＲ１（ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲ１）、ＣＭＫＬＲ１、ＣＭＫＯＲ１（ＲＤＣ１）、ＣＸ３ＣＲ１（Ｖ２８）、ＣＸＣＲ４、ＧＰＲ２（ＣＣＲ１０）、ＧＰＲ３１、ＧＰＲ８１（ＦＫＳＧ８０）、ＣＸＣＲ３（ＧＰＲ９／ＣＫＲ－Ｌ２）、ＣＸＣＲ６（ＴＹＭＳＴＲ／ＳＴＲＬ３３／Ｂｏｎｚｏ）、ＨＭ７４、ＩＬ８ＲＡ（ＩＬ８Ｒα）、ＩＬ８ＲＢ（ＩＬ８Ｒβ）、ＬＴＢ４Ｒ（ＧＰＲ１６）、ＴＣＰ１０、ＣＫＬＦＳＦ２、ＣＫＬＦＳＦ３、ＣＫＬＦＳＦ４、ＣＫＬＦＳＦ５、ＣＫＬＦＳＦ６、ＣＫＬＦＳＦ７、ＣＫＬＦＳＦ８、ＢＤＮＦ、Ｃ５、Ｃ５Ｒ１、ＣＳＦ３、ＧＲＣＣ１０（Ｃ１０）、ＥＰＯ、ＦＹ（ＤＡＲＣ）、ＧＤＦ５、ＨＤＦ１、ＨＤＦ１α、ＤＬ８、ＰＲＬ、ＲＧＳ３、ＲＧＳ１３、ＳＤＦ２、ＳＬＩＴ２、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＲＥＭ１、ＴＲＥＭ２、及びＶＨＬからなる群から選択されるケモカイン、ケモカイン受容体、またはケモカイン関連タンパク質に結合する、またはそれと相互作用する場合がある。いくつかの実施形態では、本開示の宿主細胞によって発現されるポリペプチドは、０７７２Ｐ（ＣＡ１２５、ＭＵＣ１６）（すなわち、卵巣癌抗原）、ＡＢＣＦ１、ＡＣＶＲ１、ＡＣＶＲ１Ｂ、ＡＣＶＲ２、ＡＣＶＲ２Ｂ、ＡＣＶＲＬ１、ＡＤＯＲＡ２Ａ、アグリカン、ＡＧＲ２、ＡＩＣＤＡ、ＡＩＦ１、ＡＩＧ１、ＡＫＡＰ１、ＡＫＡＰ２、ＡＭＨ、ＡＭＨＲ２、アミロイドベータ、ＡＮＧＰＴＬ、ＡＮＧＰＴ２、ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ４、ＡＮＰＥＰ、ＡＰＣ、ＡＰＯＣ１、ＡＲ、ＡＳＬＧ６５９、ＡＳＰＨＤ１（アスパラギン酸ベータヒドロキシラーゼドメイン含有１、ＬＯＣ２５３９８２）、ＡＺＧＰ１（亜鉛－ａ－糖タンパク質）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＢＡＤ、ＢＡＦＦ－Ｒ（Ｂ細胞活性化因子受容体、ＢＬｙＳ受容体３、ＢＲ３、ＢＡＧ１、ＢＡＩ１、ＢＣＬ２、ＢＣＬ６、ＢＤＮＦ、ＢＬＮＫ、ＢＬＲＩ（ＭＤＲ１５）、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３Ｂ（ＧＤＦ１０）、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ８、ＢＭＰＲ１Ａ、ＢＭＰＲ１Ｂ（骨形成タンパク質受容体型ＩＢ）、ＢＭＰＲ２、ＢＰＡＧ１（プレクチン）、ＢＲＣＡ１、ブレビカン、Ｃ１９ｏｒｆ１０（ＩＬ２７ｗ）、Ｃ３、Ｃ４Ａ、Ｃ５、Ｃ５Ｒ１、ＣＡＮＴ１、ＣＡＳＰ１、ＣＡＳＰ４、ＣＡＶ１、ＣＣＢＰ２（Ｄ６／ＪＡＢ６１）、ＣＣＬ１（１－３０９）、ＣＣＬ１１（エオタキシン）、ＣＣＬ１３（ＭＣＰ－４）、ＣＣＬ１５（ＭＩＰ１δ）、ＣＣＬ１６（ＨＣＣ－４）、ＣＣＬ１７（ＴＡＲＣ）、ＣＣＬ１８（ＰＡＲＣ）、ＣＣＬ１９（ＭＩＰ－３β）、ＣＣＬ２（ＭＣＰ－１）、ＭＣＡＦ、ＣＣＬ２０（ＭＩＰ－３α）、ＣＣＬ２１（ＭＴＰ－２）、ＳＬＣ、エクソダス－２、ＣＣＬ２２（ＭＤＣ／ＳＴＣ－１）、ＣＣＬ２３（ＭＰＩＦ－１）、ＣＣＬ２４（ＭＰＩＦ－２／エオタキシン－２）、ＣＣＬ２５（ＴＥＣＫ）、ＣＣＬ２６（エオタキシン－３）、ＣＣＬ２７（ＣＴＡＣＫ／ＩＬＣ）、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ３（ＭＴＰ－Ｉα）、ＣＣＬ４（ＭＤＰ－Ｉβ）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＣＬ７（ＭＣＰ－３）、ＣＣＬ８（ｍｃｐ－２）、ＣＣＮＡ１、ＣＣＮＡ２、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＥ２、ＣＣＲ１（ＣＫＲＩ／ＨＭ１４５）、ＣＣＲ２（ｍｃｐ－ＩＲβ／ＲＡ）、ＣＣＲ３（ＣＫＲ／ＣＭＫＢＲ３）、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５（ＣＭＫＢＲ５／ＣｈｅｍＲ１３）、ＣＣＲ６（ＣＭＫＢＲ６／ＣＫＲ－Ｌ３／ＳＴＲＬ２２／ＤＲＹ６）、ＣＣＲ７（ＣＫＢＲ７／ＥＢＩ１）、ＣＣＲ８（ＣＭＫＢＲ８／ＴＥＲ１／ＣＫＲ－Ｌ１）、ＣＣＲ９（ＧＰＲ－９－６）、ＣＣＲＬ１（ＶＳＨＫ１）、ＣＣＲＬ２（Ｌ－ＣＣＲ）、ＣＤ１６４、ＣＤ１９、ＣＤ１Ｃ、ＣＤ２０、ＣＤ２００、ＣＤ２２（Ｂ細胞受容体ＣＤ２２－Ｂアイソフォーム）、ＣＤ２４、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３Ｚ、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４４、ＣＤ４５ＲＢ、ＣＤ５２、ＣＤ６９、ＣＤ７２、ＣＤ７４、ＣＤ７９Ａ（ＣＤ７９α、免疫グロブリン関連アルファ、Ｂ細胞特異的タンパク質）、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤＳ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤＨ１（Ｅ－カドヘリン）、ＣＤＨ１０、ＣＤＨ１２、ＣＤＨ１３、ＣＤＨ１８、ＣＤＨ１９、ＣＤＨ２０、ＣＤＨ５、ＣＤＨ７、ＣＤＨ８、ＣＤＨ９、ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＣＤＫ６、ＣＤＫ７、ＣＤＫ９、ＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１／ＷＡＦ１／Ｃｉｐ１）、ＣＤＫＮ１Ｂ（ｐ２７／Ｋｉｐ１）、ＣＤＫＮ１Ｃ、ＣＤＫＮ２Ａ（Ｐ１６ＩＮＫ４ａ）、ＣＤＫＮ２Ｂ、ＣＤＫＮ２Ｃ、ＣＤＫＮ３、ＣＥＢＰＢ、ＣＥＲ１、ＣＨＧＡ、ＣＨＧＢ、キチナーゼ、ＣＨＳＴ１０、ＣＫＬＦＳＦ２、ＣＫＬＦＳＦ３、ＣＫＬＦＳＦ４、ＣＫＬＦＳＦ５、ＣＫＬＦＳＦ６、ＣＫＬＦＳＦ７、ＣＫＬＦＳＦ８、ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ７（クローディン－７）、ＣＬＬ－１（ＣＬＥＣ１２Ａ、ＭＩＣＬ、及びＤＣＡＬ２）、ＣＬＮ３、ＣＬＵ（クラスタリン）、ＣＭＫＬＲ１、ＣＭＫＯＲ１（ＲＤＣ１）、ＣＮＲ１、ＣＯＬ１８Ａ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ６Ａ１、補体因子Ｄ、ＣＲ２、ＣＲＰ、ＣＲＩＰＴＯ（ＣＲ、ＣＲ１、ＣＲＧＦ、ＣＲＩＰＴＯ、ＴＤＧＦ１、奇形腫由来増殖因子）、ＣＳＦＩ（Ｍ－ＣＳＦ）、ＣＳＦ２（ＧＭ－ＣＳＦ）、ＣＳＦ３（ＧＣＳＦ）、ＣＴＬＡ４、ＣＴＮＮＢ１（ｂ－カテニン）、ＣＴＳＢ（カテプシンＢ）、ＣＸ３ＣＬ１（ＳＣＹＤＩ）、ＣＸ３ＣＲ１（Ｖ２８）、ＣＸＣＬ１（ＧＲＯ１）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ－１０）、ＣＸＣＬ１１（Ｉ－ＴＡＣ／ＩＰ－９）、ＣＸＣＬ１２（ＳＤＦ１）、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１４、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ２（ＧＲＯ２）、ＣＸＣＬ３（ＧＲＯ３）、ＣＸＣＬ５（ＥＮＡ－７８／ＬＩＸ）、ＣＸＣＬ６（ＧＣＰ－２）、ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＲ３（ＧＰＲ９／ＣＫＲ－Ｌ２）、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５（バーキットリンパ腫受容体１、Ｇタンパク質共役受容体）、ＣＸＣＲ６（ＴＹＭＳＴＲ／ＳＴＲＬ３３／Ｂｏｎｚｏ）、ＣＹＢ５、ＣＹＣ１、ＣＹＳＬＴＲ１、ＤＡＢ２ＩＰ、ＤＥＳ、ＤＫＦＺｐ４５１Ｊ０１１８、ＤＮＣＬＩ、ＤＰＰ４、Ｅ１６（ＬＡＴ１、ＳＬＣ７Ａ５）、Ｅ２Ｆ１、ＥＣＧＦ１、ＥＤＧ１、ＥＦＮＡ１、ＥＦＮＡ３、ＥＦＮＢ２、ＥＧＦ、ＥＧＦＲ、ＥＬＡＣ２、ＥＮＧ、ＥＮＯ１、ＥＮＯ２、ＥＮＯ３、ＥＰＨＢ４、ＥｐｈＢ２Ｒ、ＥＰＯ、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ－２）、ＥＲＥＧ、ＥＲＫ８、ＥＳＲ１、ＥＳＲ２、ＥＴＢＲ（エンドセリンＢ型受容体）、Ｆ３（ＴＦ）、ＦＡＤＤ、ＦａｓＬ、ＦＡＳＮ、ＦＣＥＲ１Ａ、ＦＣＥＲ２、ＦＣＧＲ３Ａ、ＦｃＲＨ１（Ｆｃ受容体様タンパク質１）、ＦｃＲＨ２（ＩＦＧＰ４、ＩＲＴＡ４、ＳＰＡＰ１Ａ（ＳＨ２ドメイン含有ホスファターゼアンカータンパク質１ａ）、ＳＰＡＰ１Ｂ、ＳＰＡＰ１Ｃ）、ＦＧＦ、ＦＧＦ１（αＦＧＦ）、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１１、ＦＧＦ１２、ＦＧＦ１２Ｂ、ＦＧＦ１３、ＦＧＦ１４、ＦＧＦ１６、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ１９、ＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ２０、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２２、ＦＧＦ２３、ＦＧＦ３（ｉｎｔ－２）、ＦＧＦ４（ＨＳＴ）、ＦＧＦ５、ＦＧＦ６（ＨＳＴ－２）、ＦＧＦ７（ＫＧＦ）、ＦＧＦ８、ＦＧＦ９、ＦＧＦＲ、ＦＧＦＲ３、ＦＩＧＦ（ＶＥＧＦＤ）、ＦＥＬｌ（イプシロン）、ＦＩＬｌ（ゼータ）、ＦＬＪ１２５８４、ＦＬＪ２５５３０、ＦＬＲＴＩ（フィブロネクチン）、ＦＬＴ１、ＦＯＳ、ＦＯＳＬ１（ＦＲＡ－１）、ＦＹ（ＤＡＲＣ）、ＧＡＢＲＰ（ＧＡＢＡａ）、ＧＡＧＥＢ１、ＧＡＧＥＣ１、ＧＡＬＮＡＣ４Ｓ－６ＳＴ、ＧＡＴＡ３、ＧＤＦ５、ＧＤＮＦ－Ｒａ１（ＧＤＮＦファミリー受容体アルファ１、ＧＦＲＡ１、ＧＤＮＦＲ、ＧＤＮＦＲＡ、ＲＥＴＬ１、ＴＲＮＲ１、ＲＥＴ１Ｌ、ＧＤＮＦＲ－アルファ１、ＧＦＲ－アルファ－１）、ＧＥＤＡ、ＧＦＩ１、ＧＧＴ１、ＧＭ－ＣＳＦ、ＧＮＡＳＩ、ＧＮＲＨＩ、ＧＰＲ２（ＣＣＲ１０）、ＧＰＲ１９（Ｇタンパク質共役受容体１９、Ｍｍ．４７８７）、ＧＰＲ３１、ＧＰＲ４４、ＧＰＲ５４（ＫＩＳＳ１受容体、ＫＩＳＳ１Ｒ、ＧＰＲ５４、ＨＯＴ７Ｔ１７５、ＡＸＯＲ１２）、ＧＰＲ８１（ＦＫＳＧ８０）、ＧＰＲ１７２Ａ（Ｇタンパク質共役受容体１７２Ａ、ＧＰＣＲ４１、ＦＬＪ１１８５６、Ｄ１５Ｅｒｔｄ７４７ｅ）、ＧＲＣＣＩＯ（Ｃ１０）、ＧＲＰ、ＧＳＮ（ゲルゾリン）、ＧＳＴＰ１、ＨＡＶＣＲ２、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７Ａ、ＨＤＡＣ９、ＨＧＦ、ＨＩＦ１Ａ、ＨＯＰ１、ヒスタミン及びヒスタミン受容体、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－ＤＯＢ（ＭＨＣクラスＩＩ分子（Ｉａ抗原）のベータサブユニット、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＨＭ７４、ＨＭＯＸＩ、ＨＵＭＣＹＴ２Ａ、ＩＣＥＢＥＲＧ、ＩＣＯＳＬ、１Ｄ２、ＩＦＮ－ａ、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＢ１、ＩＦＮガンマ、ＤＦＮＷ１、ＩＧＢＰ１、ＩＧＦ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＩＧＦ２、ＩＧＦＢＰ２、ＩＧＦＢＰ３、ＩＧＦＢＰ６、ＩＬ－ｌ、ＩＬ１０、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＩＬ１１、ＩＬ１１ＲＡ、ＩＬ－１２、ＩＬ１２Ａ、ＩＬ１２Ｂ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１２ＲＢ２、ＩＬ１３、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ１４、ＩＬ１５、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１７Ｂ、ＩＬ１７Ｃ、ＩＬ１７Ｒ、ＩＬ１８、ＩＬ１８ＢＰ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＩＬ１９、ＩＬ１Ａ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬＩＦ１０、ＩＬ１Ｆ５、ＩＬ１Ｆ６、ＩＬ１Ｆ７、ＩＬ１Ｆ８、ＩＬ１Ｆ９、ＩＬ１ＨＹ１、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１Ｒ２、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ１ＲＡＰＬ１、ＩＬ１ＲＡＰＬ２、ＩＬ１ＲＬ１、ＩＬ１ＲＬ２、ＩＬＩＲＮ、ＩＬ２、ＩＬ２０、ＩＬ２０Ｒα、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２２、ＩＬ－２２ｃ、ＩＬ２２Ｒ、ＩＬ２２ＲＡ２、ＩＬ２３、ＩＬ２４、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８Ａ、ＩＬ２８Ｂ、ＩＬ２９、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３、ＩＬ３０、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ４、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ５、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ６、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ（糖タンパク質１３０）、インフルエンザＡ型、インフルエンザＢ型、ＥＬ７、ＥＬ７Ｒ、ＥＬ８、ＩＬ８ＲＡ、ＤＬ８ＲＢ、ＩＬ８ＲＢ、ＤＬ９、ＤＬ９Ｒ、ＤＬＫ、ＩＮＨＡ、ＩＮＨＢＡ、ＩＮＳＬ３、ＩＮＳＬ４、ＩＲＡＫ１、ＩＲＴＡ２（免疫グロブリンスーパーファミリー受容体転座関連２）、ＥＲＡＫ２、ＩＴＧＡ１
、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ３、ＩＴＧＡ６（ａ６インテグリン）、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＧＢ３、ＩＴＧＢ４（ｂ４インテグリン）、α４β７及びαＥβ７インテグリンヘテロ二量体、ＪＡＧ１、ＪＡＫ１、ＪＡＫ３、ＪＵＮ、Ｋ６ＨＦ、ＫＡＩ１、ＫＤＲ、ＫＩＴＬＧ、ＫＬＦ５（ＧＣボックスＢＰ）、ＫＬＦ６、ＫＬＫＩＯ、ＫＬＫ１２、ＫＬＫ１３、ＫＬＫ１４、ＫＬＫ１５、ＫＬＫ３、ＫＬＫ４、ＫＬＫ５、ＫＬＫ６、ＫＬＫ９、ＫＲＴ１、ＫＲＴ１９（ケラチン１９）、ＫＲＴ２Ａ、ＫＨＴＨＢ６（毛髪特異的Ｈ型ケラチン）、ＬＡＭＡＳ、ＬＥＰ（レプチン）、ＬＧＲ５（ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体５、ＧＰＲ４９、ＧＰＲ６７）、Ｌｉｎｇｏ－ｐ７５、Ｌｉｎｇｏ－Ｔｒｏｙ、ＬＰＳ、ＬＴＡ（ＴＮＦ－ｂ）、ＬＴＢ、ＬＴＢ４Ｒ（ＧＰＲ１６）、ＬＴＢ４Ｒ２、ＬＴＢＲ、ＬＹ６４（リンパ球抗原６４（ＲＰ１０５）、ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ファミリーのＩ型膜タンパク質）、Ｌｙ６Ｅ（リンパ球抗原６複合体、座位Ｅ、Ｌｙ６７、ＲＩＧ－Ｅ、ＳＣＡ－２、ＴＳＡ－１）、Ｌｙ６Ｇ６Ｄ（リンパ球抗原６複合体、座位Ｇ６Ｄ、Ｌｙ６－Ｄ、ＭＥＧＴ１）、ＬＹ６Ｋ（リンパ球抗原６複合体、座位Ｋ、ＬＹ６Ｋ、ＨＳＪ００１３４８、ＦＬＪ３５２２６）、ＭＡＣＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＧまたはＯＭｇｐ、ＭＡＰ２Ｋ７（ｃ－Ｊｕｎ）、ＭＤＫ、ＭＤＰ、ＭＩＢ１、ミッドカイン、ＭＥＦ、ＭＩＰ－２、ＭＫＩ６７、（Ｋｉ－６７）、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＭＰＦ（ＭＰＦ、ＭＳＬＮ、ＳＭＲ、巨核球増強因子、メソテリン）、ＭＳ４Ａ１、ＭＳＧ７８３（ＲＮＦ１２４、仮想タンパク質ＦＬＪ２０３１５）、ＭＳＭＢ、ＭＴ３（メタロチオネクチン－１１１）、ＭＴＳＳ１、ＭＵＣ１（ムチン）、ＭＹＣ、ＭＹ０８８、Ｎａｐｉ３ｂ（ＮａＰｉ２ｂとしても知られる）（ＮＡＰＩ－３Ｂ、ＮＰＴＩＩｂ、ＳＬＣ３４Ａ２、溶質輸送体ファミリー３４（リン酸ナトリウム）、メンバー２、ＩＩ型ナトリウム依存性リン酸輸送体３ｂ）、ＮＣＡ、ＮＣＫ２、ニューロカン、ＮＦＫＢ１、ＮＦＫＢ２、ＮＧＦＢ（ＮＧＦ）、ＮＧＦＲ、ＮｇＲ－Ｌｉｎｇｏ、ＮｇＲ－Ｎｏｇｏ６６（Ｎｏｇｏ）、ＮｇＲ－ｐ７５、ＮｇＲ－Ｔｒｏｙ、ＮＭＥ１（ＮＭ２３Ａ）、ＮＯＸ５、ＮＰＰＢ、ＮＲ０Ｂ１、ＮＲ０Ｂ２、ＮＲ１Ｄ１、ＮＲ１Ｄ２、ＮＲ１Ｈ２、ＮＲ１Ｈ３、ＮＲ１Ｈ４、ＮＲ１１２、ＮＲ１１３、ＮＲ２Ｃ１、ＮＲ２Ｃ２、ＮＲ２Ｅ１、ＮＲ２Ｅ３、ＮＲ２Ｆ１、ＮＲ２Ｆ２、ＮＲ２Ｆ６、ＮＲ３Ｃ１、ＮＲ３Ｃ２、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、ＮＲ４Ａ３、ＮＲ５Ａ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ６Ａ１、ＮＲＰ１、ＮＲＰ２、ＮＴ５Ｅ、ＮＴＮ４、ＯＤＺＩ、ＯＰＲＤ１、ＯＸ４０、Ｐ２ＲＸ７、Ｐ２Ｘ５（プリン受容体Ｐ２Ｘリガンド依存性イオンチャネル５）、ＰＡＰ、ＰＡＲＴ１、ＰＡＴＥ、ＰＡＷＲ、ＰＣＡ３、ＰＣＮＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＤ－１、ＰＯＧＦＡ、ＰＯＧＦＢ、ＰＥＣＡＭ１、ＰＦ４（ＣＸＣＬ４）、ＰＧＦ、ＰＧＲ、ホスファカン、ＰＩＡＳ２、ＰＩＫ３ＣＧ、ＰＬＡＵ（ｕＰＡ）、ＰＬＧ、ＰＬＸＤＣ１、ＰＭＥＬ１７（シルバーホモログ、ＳＩＬＶ、Ｄ１２Ｓ５３Ｅ、ＰＭＥＬ１７、ＳＩ、ＳＩＬ）、ＰＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）、ＰＰＩＤ、ＰＲＩ、ＰＲＫＣＱ、ＰＲＫＤＩ、ＰＲＬ、ＰＲＯＣ、ＰＲＯＫ２、ＰＳＡＰ、ＰＳＣＡｈｌｇ（２７０００５０Ｃ１２Ｒｉｋ、Ｃ５３０００８Ｏ１６Ｒｉｋ、ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ２７０００５０Ｃ１２、ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ２７０００５０Ｃ１２遺伝子）、ＰＴＡＦＲ、ＰＴＥＮ、ＰＴＧＳ２（ＣＯＸ－２）、ＰＴＮ、ＲＡＣ２（ｐ２１ Ｒａｃ２）、ＲＡＲＢ、ＲＥＴ（ｒｅｔがん原遺伝子、ＭＥＮ２Ａ、ＨＳＣＲ１、ＭＥＮ２Ｂ、ＭＴＣ１、ＰＴＣ、ＣＤＨＦ１２、Ｈｓ．１６８１１４、ＲＥＴ５１、ＲＥＴ－ＥＬＥ１）、ＲＧＳＩ、ＲＧＳ１３、ＲＧＳ３、ＲＮＦ１１０（ＺＮＦ１４４）、ＲＯＢＯ２、Ｓ１００Ａ２、ＳＣＧＢ１Ｄ２（リポフィリンＢ）、ＳＣＧＢ２Ａ１（マンマグロビン２）、ＳＣＧＢ２Ａ２（マンマグロビン１）、ＳＣＹＥＩ（内皮単球活性化サイトカイン）、ＳＤＦ２、セマ５ｂ（ＦＬＪ１０３７２、ＫＩＡＡ１４４５、Ｍｍ．４２０１５、ＳＥＭＡ５Ｂ、ＳＥＭＡＧ、セマフォリン５ｂ Ｈｌｏｇ、セマドメイン、７回トロンボスポンジン反復配列（１型及び１型様）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）及び短い細胞質ドメイン、（セマフォリン）５Ｂ）、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＳＥＲＰ１ＮＢ５（マスピン）、ＳＥＲＰＩＮＥ１（ＰＡＩ－１）、ＳＥＲＰＤＭＦ１、ＳＨＢＧ、ＳＬＡ２、ＳＬＣ２Ａ２、ＳＬＣ３３Ａ１、ＳＬＣ４３Ａ１、ＳＬＩＴ２、ＳＰＰＩ、ＳＰＲＲ１Ｂ（Ｓｐｒｌ）、ＳＴ６ＧＡＬ１、ＳＴＡＢＩ、ＳＴＡＴ６、ＳＴＥＡＰ（前立腺の６回膜貫通上皮抗原）、ＳＴＥＡＰ２（ＨＧＮＣ＿８６３９、ＩＰＣＡ－１、ＰＣＡＮＡＰ１、ＳＴＡＭＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＳＴＭＰ、前立腺癌関連遺伝子１、前立腺癌関連タンパク質１、前立腺の６回膜貫通上皮抗原２、６回膜貫通前立腺タンパク質）、ＴＢ４Ｒ２、ＴＢＸ２１、ＴＣＰＩＯ、ＴＯＧＦＩ、ＴＥＫ、ＴＥＮＢ２（推定膜貫通プロテオグリカン）、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢＩ、ＴＧＦＢ１ＩＩ、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３、ＴＧＦＢＩ、ＴＧＦＢＲＩ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ３、ＴＨＩＬ、ＴＨＢＳＩ（トロンボスポンジン－１）、ＴＨＢＳ２、ＴＨＢＳ４、ＴＨＰＯ、ＴＩＥ（Ｔｉｅ－１）、ＴＭＰ３、組織因子、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＭＥＦＦ１（ＥＧＦ様及び２つのフォリスタチン様ドメインを有する膜貫通タンパク質１、トモレグリン－１）、ＴＭＥＭ４６（ｓｈｉｓａホモログ２）、ＴＮＦ、ＴＮＦ－ａ、ＴＮＦＡＥＰ２（Ｂ９４）、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＦＲＳＦＩＩＡ、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＴＮＦＲＳＦ５、ＴＮＦＲＳＦ６（Ｆａｓ）、ＴＮＦＲＳＦ７、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ）、ＴＮＦＳＦ１２（ＡＰ０３Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１３（Ａｐｒｉｌ）、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４（ＨＶＥＭ－Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＩ）、ＴＮＦＳＦ１８、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬ）、ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド）、ＴＮＦＳＦＳ（ＣＤ３０リガンド）、ＴＮＦＳＦ９（４－１ＢＢリガンド）、ＴＯＬＬＩＰ、Ｔｏｌｌ様受容体、ＴＯＰ２Ａ（トポイソメラーゼＥａ）、ＴＰ５３、ＴＰＭ１、ＴＰＭ２、ＴＲＡＤＤ、ＴＭＥＭ１１８（ｒｉｎｇフィンガータンパク質、膜貫通２、ＲＮＦＴ２、ＦＬＪ１４６２７）、ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ４、ＴＲＡＦ５、ＴＲＡＦ６、ＴＲＥＭ１、ＴＲＥＭ２、ＴｒｐＭ４（ＢＲ２２４５０、ＦＬＪ２００４１、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ４Ｂ、一過性受容体電位カチオンチャネル、サブファミリーＭ、メンバー４）、ＴＲＰＣ６、ＴＳＬＰ、ＴＷＥＡＫ、チロシナーゼ（ＴＹＲ、ＯＣＡＩＡ、ＯＣＡ１Ａ、チロシナーゼ、ＳＨＥＰ３）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、バーシカン、ＶＨＬＣ５、ＶＬＡ－４、ＸＣＬ１（リンホタクチン）、ＸＣＬ２（ＳＣＭ－１ｂ）、ＸＣＲＩ（ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲＩ）、ＹＹ１、及び／またはＺＦＰＭ２に結合する、またはそれと相互作用する場合がある。
、ＩＴＧＡ２、ＩＴＧＡ３、ＩＴＧＡ６（ａ６インテグリン）、ＩＴＧＡＶ、ＩＴＧＢ３、ＩＴＧＢ４（ｂ４インテグリン）、α４β７及びαＥβ７インテグリンヘテロ二量体、ＪＡＧ１、ＪＡＫ１、ＪＡＫ３、ＪＵＮ、Ｋ６ＨＦ、ＫＡＩ１、ＫＤＲ、ＫＩＴＬＧ、ＫＬＦ５（ＧＣボックスＢＰ）、ＫＬＦ６、ＫＬＫＩＯ、ＫＬＫ１２、ＫＬＫ１３、ＫＬＫ１４、ＫＬＫ１５、ＫＬＫ３、ＫＬＫ４、ＫＬＫ５、ＫＬＫ６、ＫＬＫ９、ＫＲＴ１、ＫＲＴ１９（ケラチン１９）、ＫＲＴ２Ａ、ＫＨＴＨＢ６（毛髪特異的Ｈ型ケラチン）、ＬＡＭＡＳ、ＬＥＰ（レプチン）、ＬＧＲ５（ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体５、ＧＰＲ４９、ＧＰＲ６７）、Ｌｉｎｇｏ－ｐ７５、Ｌｉｎｇｏ－Ｔｒｏｙ、ＬＰＳ、ＬＴＡ（ＴＮＦ－ｂ）、ＬＴＢ、ＬＴＢ４Ｒ（ＧＰＲ１６）、ＬＴＢ４Ｒ２、ＬＴＢＲ、ＬＹ６４（リンパ球抗原６４（ＲＰ１０５）、ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ファミリーのＩ型膜タンパク質）、Ｌｙ６Ｅ（リンパ球抗原６複合体、座位Ｅ、Ｌｙ６７、ＲＩＧ－Ｅ、ＳＣＡ－２、ＴＳＡ－１）、Ｌｙ６Ｇ６Ｄ（リンパ球抗原６複合体、座位Ｇ６Ｄ、Ｌｙ６－Ｄ、ＭＥＧＴ１）、ＬＹ６Ｋ（リンパ球抗原６複合体、座位Ｋ、ＬＹ６Ｋ、ＨＳＪ００１３４８、ＦＬＪ３５２２６）、ＭＡＣＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＧまたはＯＭｇｐ、ＭＡＰ２Ｋ７（ｃ－Ｊｕｎ）、ＭＤＫ、ＭＤＰ、ＭＩＢ１、ミッドカイン、ＭＥＦ、ＭＩＰ－２、ＭＫＩ６７、（Ｋｉ－６７）、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＭＰＦ（ＭＰＦ、ＭＳＬＮ、ＳＭＲ、巨核球増強因子、メソテリン）、ＭＳ４Ａ１、ＭＳＧ７８３（ＲＮＦ１２４、仮想タンパク質ＦＬＪ２０３１５）、ＭＳＭＢ、ＭＴ３（メタロチオネクチン－１１１）、ＭＴＳＳ１、ＭＵＣ１（ムチン）、ＭＹＣ、ＭＹ０８８、Ｎａｐｉ３ｂ（ＮａＰｉ２ｂとしても知られる）（ＮＡＰＩ－３Ｂ、ＮＰＴＩＩｂ、ＳＬＣ３４Ａ２、溶質輸送体ファミリー３４（リン酸ナトリウム）、メンバー２、ＩＩ型ナトリウム依存性リン酸輸送体３ｂ）、ＮＣＡ、ＮＣＫ２、ニューロカン、ＮＦＫＢ１、ＮＦＫＢ２、ＮＧＦＢ（ＮＧＦ）、ＮＧＦＲ、ＮｇＲ－Ｌｉｎｇｏ、ＮｇＲ－Ｎｏｇｏ６６（Ｎｏｇｏ）、ＮｇＲ－ｐ７５、ＮｇＲ－Ｔｒｏｙ、ＮＭＥ１（ＮＭ２３Ａ）、ＮＯＸ５、ＮＰＰＢ、ＮＲ０Ｂ１、ＮＲ０Ｂ２、ＮＲ１Ｄ１、ＮＲ１Ｄ２、ＮＲ１Ｈ２、ＮＲ１Ｈ３、ＮＲ１Ｈ４、ＮＲ１１２、ＮＲ１１３、ＮＲ２Ｃ１、ＮＲ２Ｃ２、ＮＲ２Ｅ１、ＮＲ２Ｅ３、ＮＲ２Ｆ１、ＮＲ２Ｆ２、ＮＲ２Ｆ６、ＮＲ３Ｃ１、ＮＲ３Ｃ２、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、ＮＲ４Ａ３、ＮＲ５Ａ１、ＮＲ５Ａ２、ＮＲ６Ａ１、ＮＲＰ１、ＮＲＰ２、ＮＴ５Ｅ、ＮＴＮ４、ＯＤＺＩ、ＯＰＲＤ１、ＯＸ４０、Ｐ２ＲＸ７、Ｐ２Ｘ５（プリン受容体Ｐ２Ｘリガンド依存性イオンチャネル５）、ＰＡＰ、ＰＡＲＴ１、ＰＡＴＥ、ＰＡＷＲ、ＰＣＡ３、ＰＣＮＡ、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＰＤ－１、ＰＯＧＦＡ、ＰＯＧＦＢ、ＰＥＣＡＭ１、ＰＦ４（ＣＸＣＬ４）、ＰＧＦ、ＰＧＲ、ホスファカン、ＰＩＡＳ２、ＰＩＫ３ＣＧ、ＰＬＡＵ（ｕＰＡ）、ＰＬＧ、ＰＬＸＤＣ１、ＰＭＥＬ１７（シルバーホモログ、ＳＩＬＶ、Ｄ１２Ｓ５３Ｅ、ＰＭＥＬ１７、ＳＩ、ＳＩＬ）、ＰＰＢＰ（ＣＸＣＬ７）、ＰＰＩＤ、ＰＲＩ、ＰＲＫＣＱ、ＰＲＫＤＩ、ＰＲＬ、ＰＲＯＣ、ＰＲＯＫ２、ＰＳＡＰ、ＰＳＣＡｈｌｇ（２７０００５０Ｃ１２Ｒｉｋ、Ｃ５３０００８Ｏ１６Ｒｉｋ、ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ２７０００５０Ｃ１２、ＲＩＫＥＮ ｃＤＮＡ２７０００５０Ｃ１２遺伝子）、ＰＴＡＦＲ、ＰＴＥＮ、ＰＴＧＳ２（ＣＯＸ－２）、ＰＴＮ、ＲＡＣ２（ｐ２１ Ｒａｃ２）、ＲＡＲＢ、ＲＥＴ（ｒｅｔがん原遺伝子、ＭＥＮ２Ａ、ＨＳＣＲ１、ＭＥＮ２Ｂ、ＭＴＣ１、ＰＴＣ、ＣＤＨＦ１２、Ｈｓ．１６８１１４、ＲＥＴ５１、ＲＥＴ－ＥＬＥ１）、ＲＧＳＩ、ＲＧＳ１３、ＲＧＳ３、ＲＮＦ１１０（ＺＮＦ１４４）、ＲＯＢＯ２、Ｓ１００Ａ２、ＳＣＧＢ１Ｄ２（リポフィリンＢ）、ＳＣＧＢ２Ａ１（マンマグロビン２）、ＳＣＧＢ２Ａ２（マンマグロビン１）、ＳＣＹＥＩ（内皮単球活性化サイトカイン）、ＳＤＦ２、セマ５ｂ（ＦＬＪ１０３７２、ＫＩＡＡ１４４５、Ｍｍ．４２０１５、ＳＥＭＡ５Ｂ、ＳＥＭＡＧ、セマフォリン５ｂ Ｈｌｏｇ、セマドメイン、７回トロンボスポンジン反復配列（１型及び１型様）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）及び短い細胞質ドメイン、（セマフォリン）５Ｂ）、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＳＥＲＰＩＮＡ３、ＳＥＲＰ１ＮＢ５（マスピン）、ＳＥＲＰＩＮＥ１（ＰＡＩ－１）、ＳＥＲＰＤＭＦ１、ＳＨＢＧ、ＳＬＡ２、ＳＬＣ２Ａ２、ＳＬＣ３３Ａ１、ＳＬＣ４３Ａ１、ＳＬＩＴ２、ＳＰＰＩ、ＳＰＲＲ１Ｂ（Ｓｐｒｌ）、ＳＴ６ＧＡＬ１、ＳＴＡＢＩ、ＳＴＡＴ６、ＳＴＥＡＰ（前立腺の６回膜貫通上皮抗原）、ＳＴＥＡＰ２（ＨＧＮＣ＿８６３９、ＩＰＣＡ－１、ＰＣＡＮＡＰ１、ＳＴＡＭＰ１、ＳＴＥＡＰ２、ＳＴＭＰ、前立腺癌関連遺伝子１、前立腺癌関連タンパク質１、前立腺の６回膜貫通上皮抗原２、６回膜貫通前立腺タンパク質）、ＴＢ４Ｒ２、ＴＢＸ２１、ＴＣＰＩＯ、ＴＯＧＦＩ、ＴＥＫ、ＴＥＮＢ２（推定膜貫通プロテオグリカン）、ＴＧＦＡ、ＴＧＦＢＩ、ＴＧＦＢ１ＩＩ、ＴＧＦＢ２、ＴＧＦＢ３、ＴＧＦＢＩ、ＴＧＦＢＲＩ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＦＢＲ３、ＴＨＩＬ、ＴＨＢＳＩ（トロンボスポンジン－１）、ＴＨＢＳ２、ＴＨＢＳ４、ＴＨＰＯ、ＴＩＥ（Ｔｉｅ－１）、ＴＭＰ３、組織因子、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＴＭＥＦＦ１（ＥＧＦ様及び２つのフォリスタチン様ドメインを有する膜貫通タンパク質１、トモレグリン－１）、ＴＭＥＭ４６（ｓｈｉｓａホモログ２）、ＴＮＦ、ＴＮＦ－ａ、ＴＮＦＡＥＰ２（Ｂ９４）、ＴＮＦＡＩＰ３、ＴＮＦＲＳＦＩＩＡ、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ２１、ＴＮＦＲＳＦ５、ＴＮＦＲＳＦ６（Ｆａｓ）、ＴＮＦＲＳＦ７、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＳＦ１０（ＴＲＡＩＬ）、ＴＮＦＳＦ１１（ＴＲＡＮＣＥ）、ＴＮＦＳＦ１２（ＡＰ０３Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１３（Ａｐｒｉｌ）、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＴＮＦＳＦ１４（ＨＶＥＭ－Ｌ）、ＴＮＦＳＦ１５（ＶＥＧＩ）、ＴＮＦＳＦ１８、ＴＮＦＳＦ４（ＯＸ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ５（ＣＤ４０リガンド）、ＴＮＦＳＦ６（ＦａｓＬ）、ＴＮＦＳＦ７（ＣＤ２７リガンド）、ＴＮＦＳＦＳ（ＣＤ３０リガンド）、ＴＮＦＳＦ９（４－１ＢＢリガンド）、ＴＯＬＬＩＰ、Ｔｏｌｌ様受容体、ＴＯＰ２Ａ（トポイソメラーゼＥａ）、ＴＰ５３、ＴＰＭ１、ＴＰＭ２、ＴＲＡＤＤ、ＴＭＥＭ１１８（ｒｉｎｇフィンガータンパク質、膜貫通２、ＲＮＦＴ２、ＦＬＪ１４６２７）、ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ４、ＴＲＡＦ５、ＴＲＡＦ６、ＴＲＥＭ１、ＴＲＥＭ２、ＴｒｐＭ４（ＢＲ２２４５０、ＦＬＪ２００４１、ＴＲＰＭ４、ＴＲＰＭ４Ｂ、一過性受容体電位カチオンチャネル、サブファミリーＭ、メンバー４）、ＴＲＰＣ６、ＴＳＬＰ、ＴＷＥＡＫ、チロシナーゼ（ＴＹＲ、ＯＣＡＩＡ、ＯＣＡ１Ａ、チロシナーゼ、ＳＨＥＰ３）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＢ、ＶＥＧＦＣ、バーシカン、ＶＨＬＣ５、ＶＬＡ－４、ＸＣＬ１（リンホタクチン）、ＸＣＬ２（ＳＣＭ－１ｂ）、ＸＣＲＩ（ＧＰＲ５／ＣＣＸＣＲＩ）、ＹＹ１、及び／またはＺＦＰＭ２に結合する、またはそれと相互作用する場合がある。
【0180】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される方法に従って産生される抗体（または二重特異性抗体）の標的分子としては、ＣＤタンパク質、例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤＳ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１（ＣＲ２（補体受容体２）またはＣ３ＤＲ（Ｃ３ｄ／エプスタインバーウイルス受容体）またはＨｓ．７３７９２）、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ６４、ＣＤ７２（Ｂ細胞分化抗原ＣＤ７２、Ｌｙｂ－２）、ＣＤ７９ｂ（ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ７９β、ＩＧｂ（免疫グロブリン関連ベータ）、Ｂ２９）など、ＥｒｂＢ受容体ファミリーのＣＤ２００メンバー、例えば、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、またはＨＥＲ４受容体など、細胞接着分子、例えば、ＬＦＡ－１、Ｍａｃ１、ｐ１５０．９５、ＶＬＡ－４、ＩＣＡＭ－１、ＶＣＡＭ、アルファ４／ベータ７インテグリン、及びアルファｖ／ベータ３インテグリンでそのアルファまたはベータサブユニットのいずれかを含むもの（例えば、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８、または抗ＣＤ１１ｂ抗体）など、成長因子、例えば、ＶＥＧＦ－Ａ、ＶＥＧＦ－Ｃなど、組織因子（ＴＦ）、アルファインターフェロン（アルファＩＦＮ）、ＴＮＦアルファ、インターロイキン、例えば、ＩＬ－１ベータ、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１３、ＩＬ１７ＡＦ、ＩＬ－１Ｓ、ＩＬ－１３Ｒアルファ１、ＩＬ１３Ｒアルファ２、ＩＬ－４Ｒ、ＩＬ－５Ｒ、ＩＬ－９Ｒ、ＩｇＥなど、血液型抗原、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体、肥満（ＯＢ）受容体、ｍｐｌ受容体、ＣＴＬＡ－４、ＲＡＮＫＬ、ＲＡＮＫ、ＲＳＶ Ｆタンパク質、プロテインＣなどが挙げられる。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、補体タンパク質Ｃ５（例えば、ヒトＣ５に特異的に結合する抗Ｃ５アゴニスト抗体）に特異的に結合する抗体（または二重特異性抗体などの多重特異性抗体）を産生するために使用され得る。
【0181】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、インフルエンザウイルスＢ赤血球凝集素、すなわち、「ｆｌｕＢ」に特異的に結合する抗体（または二重特異性抗体などの多重特異性抗体）（例えば、インフルエンザＢウイルスの山形系統に由来する赤血球凝集素と結合する抗体、インフルエンザＢウイルスのビクトリア系統に由来する赤血球凝集素と結合する抗体、インフルエンザＢウイルスの祖先系統に由来する赤血球凝集素と結合する抗体、またはインフルエンザＢウイルスの山形系統、ビクトリア系統、及び祖先系統に由来する赤血球凝集素とインビトロ及び／またはインビボで結合する抗体）を産生するために使用され得る。抗ＦｌｕＢ抗体に関するさらなる詳細は、ＷＯ２０１５／１４８８０６に記載されていて、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【0182】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って産生される抗体（または二重特異性抗体）は、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）－１もしくはＬＲＰ－８またはトランスフェリン受容体と、ならびにベータ－セクレターゼ（ＢＡＣＥ１またはＢＡＣＥ２）、アルファ－セクレターゼ、ガンマ－セクレターゼ、タウ－セクレターゼ、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、細胞死受容体６（ＤＲ６）、アミロイドベータペプチド、アルファ－シヌクレイン、パーキン、ハンチンチン、ｐ７５ＮＴＲ、ＣＤ４０及びカスパーゼ－６からなる群から選択される少なくとも１つの標的と結合する。
【0183】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って産生される抗体は、ＣＤ４０に対するヒトＩｇＧ２抗体である。ある特定の実施形態では、抗ＣＤ４０抗体は、ＲＧ７８７６である。
【0184】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って産生されるポリペプチドは、標的免疫サイトカインである。ある特定の実施形態では、標的免疫サイトカインは、ＣＥＡ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカインである。ある特定の実施形態では、ＣＥＡ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカインは、ＲＧ７８１３である。ある特定の実施形態では、標的免疫サイトカインは、ＦＡＰ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカインである。ある特定の実施形態では、ＦＡＰ－ＩＬ２ｖ免疫サイトカインは、ＲＧ７４６１である。
【0185】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って産生される多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、ＣＥＡ及び少なくとも１つの追加の標的分子と結合する。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って産生される多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、腫瘍標的サイトカイン及び少なくとも１つの追加の標的分子と結合する。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って産生される多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、ＩＬ２ｖ（すなわち、インターロイキン２バリアント）に融合され、ＩＬ１に基づく免疫サイトカイン及び少なくとも１つの追加の標的分子と結合する。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って産生される多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、Ｔ細胞二重特異性抗体（すなわち、二重特異性Ｔ細胞誘導体またはＢｉＴＥ）である。
【0186】
ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法に従って産生される多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、ＩＬ－１アルファ及びＩＬ－１ベータ、ＩＬ－１２及びＩＬ－１Ｓ、ＩＬ－１３及びＩＬ－９、ＩＬ－１３及びＩＬ－４、ＩＬ－１３及びＩＬ－５、ＩＬ－５及びＩＬ－４、ＩＬ－１３及びＩＬ－１ベータ、ＩＬ－１３及びＩＬ－２５、ＩＬ－１３及びＴＡＲＣ、ＩＬ－１３及びＭＤＣ、ＩＬ－１３及びＭＥＦ、ＩＬ－１３及びＴＧＦ－～、ＩＬ－１３及びＬＨＲアゴニスト、ＩＬ－１２及びＴＷＥＡＫ、ＩＬ－１３及びＣＬ２５、ＩＬ－１３及びＳＰＲＲ２ａ、ＩＬ－１３及びＳＰＲＲ２ｂ、ＩＬ－１３及びＡＤＡＭＳ、ＩＬ－１３及びＰＥＤ２、ＩＬ１７Ａ及びＩＬ１７Ｆ、ＣＥＡ及びＣＤ３、ＣＤ３及びＣＤ１９、ＣＤ１３８及びＣＤ２０、ＣＤ１３８及びＣＤ４０、ＣＤ１９及びＣＤ２０、ＣＤ２０及びＣＤ３、ＣＤ３Ｓ及びＣＤ１３Ｓ、ＣＤ３Ｓ及びＣＤ２０、ＣＤ３Ｓ及びＣＤ４０、ＣＤ４０及びＣＤ２０、ＣＤ－Ｓ及びＩＬ－６、ＣＤ２０及びＢＲ３、ＴＮＦアルファ及びＴＧＦ－ベータ、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１ベータ、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－２、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－３、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－４、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－５、ＴＮＦアルファ及びＩＬ６、ＴＮＦアルファ及びＩＬ８、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－９、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１０、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１１、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１２、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１３、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１４、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１５、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１６、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１７、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１８、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－１９、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－２０、ＴＮＦアルファ及びＩＬ－２３、ＴＮＦアルファ及びＩＦＮアルファ、ＴＮＦアルファ及びＣＤ４、ＴＮＦアルファ及びＶＥＧＦ、ＴＮＦアルファ及びＭＩＦ、ＴＮＦアルファ及びＩＣＡＭ－１、ＴＮＦアルファ及びＰＧＥ４、ＴＮＦアルファ及びＰＥＧ２、ＴＮＦアルファ及びＲＡＮＫリガンド、ＴＮＦアルファ及びＴｅ３８、ＴＮＦアルファ及びＢＡＦＦ、ＴＮＦアルファ及びＣＤ２２、ＴＮＦアルファ及びＣＴＬＡ－４、ＴＮＦアルファ及びＧＰ１３０、ＴＮＦａ及びＩＬ－１２ｐ４０、ＶＥＧＦ及びアンジオポエチン、ＶＥＧＦ及びＨＥＲ２、ＶＥＧＦ－Ａ及びＨＥＲ２、ＶＥＧＦ－Ａ及びＰＤＧＦ、ＨＥＲ１及びＨＥＲ２、ＶＥＧＦＡ及びＡＮＧ２、ＶＥＧＦ－Ａ及びＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｃ及びＶＥＧＦ－Ｄ、ＨＥＲ２及びＤＲ５、ＶＥＧＦ及びＩＬ－８、ＶＥＧＦ及びＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ及びＭＥＴ受容体、ＥＧＦＲ及びＭＥＴ、ＶＥＧＦＲ及びＥＧＦＲ、ＨＥＲ２及びＣＤ６４、ＨＥＲ２及びＣＤ３、ＨＥＲ２及びＣＤ１６、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）及びＨＥＲ２、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ４、ＩＬ－１４及びＩＬ－１３、ＩＬ－１３及びＣＤ４０Ｌ、ＩＬ４及びＣＤ４０Ｌ、ＴＮＦＲ１及びＩＬ－１Ｒ、ＴＮＦＲ１及びＩＬ－６ＲならびにＴＮＦＲ１及びＩＬ－１８Ｒ、ＥｐＣＡＭ及びＣＤ３、ＭＡＰＧ及びＣＤ２８、ＥＧＦＲ及びＣＤ６４、ＣＳＰＧｓ及びＲＧＭ Ａ、ＣＴＬＡ－４及びＢＴＮ０２、ＩＧＦ１及びＩＧＦ２、ＩＧＦ１／２及びＥｒｂ２Ｂ、ＭＡＧ及びＲＧＭ Ａ、ＮｇＲ及びＲＧＭ Ａ、ＮｏｇｏＡ及びＲＧＭ Ａ、ＯＭＧｐ及びＲＧＭ Ａ、ＰＯＬ－ｌ及びＣＴＬＡ－４、ならびにＲＧＭ Ａ及びＲＧＭ Ｂから選択される少なくとも２つの標的分子に結合する。
【0187】
ある特定の実施形態では、多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体である。ある特定の実施形態では、抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体は、ＲＧ７８０２である。抗ＣＥＡ／抗ＣＤ３二重特異性抗体に関するさらなる詳細は、ＷＯ２０１４／１２１７１２で提供されていて、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【0188】
ある特定の実施形態では、多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエチン二重特異性抗体である。ある特定の実施形態では、抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエチン二重特異性抗体二重特異性抗体は、ＣｒｏｓｓｍＡｂである。ある特定の実施形態では、抗ＶＥＧＦ／抗アンジオポエチン二重特異性抗体は、ＲＧ７７１６である。
【0189】
ある特定の実施形態では、多重特異性抗体（二重特異性抗体など）は、抗Ａｎｇ２／抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体である。ある特定の実施形態では、抗Ａｎｇ２／抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体は、ＲＧ７２２１である。ある特定の実施形態では、抗Ａｎｇ２／抗ＶＥＧＦ二重特異性抗体は、ＣＡＳ番号１４４８２２１－０５－３である。
【0190】
他の多くの抗体及び／または他のタンパク質が、本開示においては宿主細胞によって発現されてよく、上記の一覧は限定することを意図するものではない。
【0191】
本開示の宿主細胞は、製造規模における目的の分子の作製に用いられてよい。治療用タンパク質、または他のタンパク質の「製造規模」での作製は、作製されるタンパク質及び必要性に応じて、約４００Ｌ～約８０，０００Ｌの範囲の細胞培養物を利用する。通常、そのような製造規模での作製では、約４００Ｌ～約２５，０００Ｌの細胞培養サイズを利用する。この範囲内で、特定の細胞培養サイズ、例えば、４，０００Ｌ、約６，０００Ｌ、約８，０００、約１０，０００、約１２，０００Ｌ、約１４，０００Ｌ、または約１６，０００Ｌなどが利用されてよい。
【0192】
本開示の宿主細胞は、現在の細胞培養方法に使用される非ＴＩ細胞と比較した場合に、より短い時間枠での、大量の目的分子の作製に用いられ得る。ある特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、現在の細胞培養方法に使用される非ＴＩ細胞と比較した場合に、目的分子の質を改善するために用いられ得る。ある特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、細胞ストレス及びクローン不安定性を経時的に引き起こし得る産物によって引き起こされ得る慢性毒性を防止することにより、シードトレイン安定性を増強するために使用され得る。ある特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、急性毒性産物の最適発現に使用され得る。
【0193】
ある特定の実施形態では、本開示の宿主細胞、ＴＩシステムは、細胞培養プロセスの最適化及び／またはプロセス開発に使用され得る。
【0194】
ある特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、従来の細胞培養方法に使用される非ＴＩ細胞と比較した場合に、目的分子の作製を約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、約９週間、または約１０週間早めるために使用され得る。ある特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、従来の細胞培養方法に使用される非ＴＩ細胞と比較した場合に、目的分子の採取を約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、約９週間、または約１０週間早めるために使用され得る。
【0195】
ある特定の実施形態では、本実施形態の宿主細胞は、従来の細胞培養方法に使用される非ＴＩ細胞と比較した場合に、目的分子の凝集レベルを減少させるために用いられ得る。
【0196】
ある特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、ランダムに組み込まれた宿主細胞と比較して、目的のポリペプチド（または複数のポリペプチド）の発現増加を達成するために使用され得る。例えば、限定する意図はないが、本開示の宿主細胞は、少なくとも３ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、４．５ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、５．５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、６．５ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、７．５ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、８．５ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、９．５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１０．５ｇ／Ｌ、１１ｇ／Ｌ、またはそれを超える力価で標準抗体及び半抗体の発現を、ならびに少なくとも１．５ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、４．５ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、５．５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、またはそれを超える力価で多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体の発現を達成し得る。ある特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、ランダム組込み宿主細胞と比較して、二重特異性含量の増加を達成し得る。例えば、限定する意図はないが、本開示の宿主細胞は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％またはそれを超える二重特異性含量を達成し得る。
【0197】
ある特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、治療分子の選択されたサブユニットの構成的発現及び同じ治療分子の他の異なるサブユニットの調節された発現に使用され得る。ある特定の実施形態では、治療分子は、融合タンパク質であり得る。ある特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、完全に組み立てられた抗体分子の発現及び分泌における各抗体サブユニットの役割及び効果を理解するために使用され得る。
【0198】
ある特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、調査ツールとして使用され得る。ある特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、様々な細胞中における問題となる分子の低タンパク質発現に関する根本的原因を解決するための診断ツールとして使用され得る。ある特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、観察された現象または細胞挙動を、細胞中の導入遺伝子発現と直接関連付けるために使用され得る。本開示の宿主細胞はまた、観察された挙動が細胞中において可逆的であるか否かを実証するために使用され得る。ある特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、細胞中における導入遺伝子（複数可）の転写及び発現に関する問題を同定して軽減するために活用され得る。
【0199】
ある特定の実施形態では、本開示の宿主細胞は、発現困難な分子の導入遺伝子サブユニット、例えば、これらに限定されないが、抗体のＨＣ及びＬＣサブユニットなどを、ＴＩシステム中の平均分子のサブユニットと交換して、問題となるサブユニット（複数可）を同定するために使用され得る。ある特定の実施形態では、次いで、アミノ酸配列分析が、低タンパク質発現の原因となる可能性があるアミノ酸残基または領域を絞り込み、それに注力するために使用され得る。
【0200】
８．例示的な非限定的実施形態
Ａ．標的組込み（ＴＩ）宿主細胞であって、前記宿主細胞ゲノムの特定の座位内における組込み部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含み、前記座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同である、前記ＴＩ宿主細胞。
Ａ．標的組込み（ＴＩ）宿主細胞であって、前記宿主細胞ゲノムの特定の座位内における組込み部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含み、前記座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同である、前記ＴＩ宿主細胞。
【0201】
Ａ１．前記組込み外因性ヌクレオチド配列のすぐ５’側の前記ヌクレオチド配列が、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４１１９０－４５２６９、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド６３５９０－２０７９１１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド２５３８３１－４９１９０９、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド６９３０３－７９７６８、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド２９３４８１－３１５２６５、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６５０４４３－２６６２０５４、またはＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド８２２１４－９７７０５と少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択される、Ａに記載のＴＩ宿主細胞。
【0202】
Ａ２．前記組込み外因性ヌクレオチド配列のすぐ５’側の前記ヌクレオチド配列が、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２６９、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９０９、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６８、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６５、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５４、またはＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０５からの少なくとも１５塩基対、少なくとも２０塩基対、少なくとも３０塩基対、少なくとも４０塩基対、少なくとも５０塩基対、少なくとも７５塩基対、少なくとも１００塩基対、少なくとも１５０塩基対、少なくとも２００塩基対、少なくとも３００塩基対、少なくとも４００塩基対、少なくとも５００塩基対、少なくとも１，０００塩基対、少なくとも１，５００塩基対、少なくとも２，０００塩基対、少なくとも３，０００塩基対の配列からなる群から選択される、Ａに記載のＴＩ宿主細胞。
【0203】
Ａ３．前記組込み外因性ヌクレオチド配列のすぐ３’側の前記ヌクレオチド配列が、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０－４５４９０、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２－７９２３７４、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０－６６７８１３、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９－１０００５９、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６－３６２４４２、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５－２７０１７６８、またはＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６－１０５１１７と少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択される、Ａに記載のＴＩ宿主細胞。
【0204】
Ａ４．前記組込み外因性ヌクレオチド配列のすぐ３’側の前記ヌクレオチド配列が、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５、またはＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６からの少なくとも１５塩基対、少なくとも２０塩基対、少なくとも３０塩基対、少なくとも４０塩基対、少なくとも５０塩基対、少なくとも７５塩基対、少なくとも１００塩基対、少なくとも１５０塩基対、少なくとも２００塩基対、少なくとも３００塩基対、少なくとも４００塩基対、少なくとも５００塩基対、少なくとも１，０００塩基対、少なくとも１，５００塩基対、少なくとも２，０００塩基対、少なくとも３，０００塩基対の配列からなる群から選択される、Ａに記載のＴＩ宿主細胞。
【0205】
Ａ５．前記組込み外因性ヌクレオチド配列が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列に機能的に連結される、Ａ～Ａ４のいずれか１項に記載のＴＩ宿主細胞。
【0206】
Ａ６．ＴＩ宿主細胞であって、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれらと少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択される内因性遺伝子内における組込み部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む、前記ＴＩ宿主細胞。
【0207】
Ａ７．ＴＩ宿主細胞であって、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれらと少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択される内因性遺伝子に機能的に連結された組込み部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む、前記ＴＩ宿主細胞。
【0208】
Ａ８．ＴＩ宿主細胞であって、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択される配列の全てまたは一部にすぐ隣接する組込み部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含む、前記ＴＩ宿主細胞。
【0209】
Ａ９．前記ＴＩ宿主細胞が、哺乳動物宿主細胞である、Ａ～Ａ８のいずれか１項に記載のＴＩ宿主細胞。
【0210】
Ａ１０．前記ＴＩ宿主細胞が、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、またはマウス宿主細胞である、Ａ９に記載のＴＩ宿主細胞。
【0211】
Ａ１１．前記ＴＩ宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１１宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、またはＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である、Ａ９またはＡ１０に記載のＴＩ宿主細胞。
【0212】
Ａ１２．前記外因性ヌクレオチド配列が、１つ以上の組換え認識配列（ＲＲＳ）を含み、前記ＲＲＳがリコンビナーゼによって認識され得る、Ａ～Ａ１１のいずれか１項に記載のＴＩ宿主細胞。
【0213】
Ａ１３．前記外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも２つのＲＲＳを含む、Ａ１２に記載のＴＩ宿主細胞。
【0214】
Ａ１４．前記リコンビナーゼが、ＣｒｅリコンビナーゼまたはＦＬＰリコンビナーゼである、Ａ１２またはＡ１３に記載のＴＩ宿主細胞。
【0215】
Ａ１５．前記リコンビナーゼが、Ｂｘｂ１インテグラーゼまたはφＣ３１インテグラーゼである、Ａ１２またはＡ１３に記載のＴＩ宿主細胞。
【0216】
Ａ１６．前記ＲＲＳが、ＬｏｘＰ配列、ＬｏｘＰ Ｌ３配列、ＬｏｘＰ ２Ｌ配列、ＬｏｘＦａｓ配列、Ｌｏｘ５１１配列、Ｌｏｘ２２７２配列、Ｌｏｘ２３７２配列、Ｌｏｘ５１７１配列、Ｌｏｘｍ２配列、Ｌｏｘ７１配列、Ｌｏｘ６６配列、ＦＲＴ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＰ配列、Ｂｘｂ１ ａｔｔＢ配列、φＣ３１ ａｔｔＰ配列、及びφＣ３１ ａｔｔＢ配列からなる群から選択される、Ａ１２～Ａ１５のいずれか１項に記載のＴＩ宿主細胞。
【0217】
Ａ１７．前記外因性ヌクレオチド配列が、第１及び第２ＲＲＳ、ならびに前記第１ＲＲＳと前記第２ＲＲＳとの間に位置する少なくとも１つの選択マーカーを含む、Ａ１３～Ａ１６のいずれか１項に記載のＴＩ宿主細胞。
【0218】
Ａ１８．第１選択マーカーを含み、前記第１選択マーカーが、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシン、Ｇ４１８ ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、アスパラギンシンテターゼ、トリプトファンシンテターゼ（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ）、ブラストサイジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、Ｚｅｏｃｉｎ、及びミコフェノール酸からなる群から選択される、Ａ１７に記載のＴＩ宿主細胞。
【0219】
Ａ１９．第２選択マーカーをさらに含み、前記第１及び前記第２選択マーカーが異なる、Ａ１７またはＡ１８に記載のＴＩ宿主細胞。
【0220】
Ａ２０．前記第２選択マーカーが、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＹＧ）、ネオマイシン、Ｇ４１８ ＡＰＨ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）、アスパラギンシンテターゼ、トリプトファンシンテターゼ（インドール）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ヒスチジノールＤ）、ブラストサイジン、ブレオマイシン、フレオマイシン、クロラムフェニコール、Ｚｅｏｃｉｎ、及びミコフェノール酸からなる群から選択される、Ａ１９に記載のＴＩ宿主細胞。
【0221】
Ａ２１．第３選択マーカー及び内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含み、前記ＩＲＥＳが、前記第３選択マーカーに機能的に連結される、Ａ１９またはＡ２０に記載のＴＩ宿主細胞。
【0222】
Ａ２２．前記第３選択マーカーが、前記第１または前記第２選択マーカーとは異なる、Ａ２１に記載のＴＩ宿主細胞。
【0223】
Ａ２３．前記第３選択マーカーが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）マーカー、改良型ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）マーカー、合成ＧＦＰマーカー、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）マーカー、改良型ＹＦＰ（ｅＹＦＰ）マーカー、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）マーカー、ｍＰｌｕｍマーカー、ｍＣｈｅｒｒｙマーカー、ｔｄＴｏｍａｔｏマーカー、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙマーカー、Ｊ－ｒｅｄマーカー、ＤｓＲｅｄ－モノマーマーカー、ｍＯｒａｎｇｅマーカー、ｍＫＯマーカー、ｍＣｉｔｒｉｎｅマーカー、Ｖｅｎｕｓマーカー、ＹＰｅｔマーカー、Ｅｍｅｒａｌｄ６マーカー、ＣｙＰｅｔマーカー、ｍＣＦＰｍマーカー、Ｃｅｒｕｌｅａｎマーカー、及びＴ－Ｓａｐｐｈｉｒｅマーカーからなる群から選択される、Ａ２１またはＡ２２に記載のＴＩ宿主細胞。
【0224】
Ａ２４．第３ＲＲＳをさらに含み、前記第３ＲＲＳが前記第１ＲＲＳと前記第２ＲＲＳとの間に位置し、前記第３ＲＲＳが、前記第１または前記第２ＲＲＳと比較して異種特異的である、Ａ１７～Ａ２３のいずれか１項に記載のＴＩ宿主細胞。
【0225】
Ａ２５．前記外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの選択マーカー及び少なくとも１つの目的の外因性配列（ＳＯＩ）を含む、Ａ１２～Ａ２４のいずれか１項に記載のＴＩ宿主細胞。
【0226】
Ａ２６．前記外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの外因性ＳＯＩをさらに含む、Ａ１２～Ａ２５のいずれか１項に記載のＴＩ宿主細胞。
【0227】
Ａ２７．前記外因性ＳＯＩが、前記第１ＲＲＳと前記第２ＲＲＳとの間に位置する、Ａ２６に記載のＴＩ宿主細胞。
【0228】
Ａ２８．前記ＳＯＩが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、またはＦｃ融合タンパク質をコードする、Ａ２６またはＡ２７に記載のＴＩ宿主細胞。
【0229】
Ａ２９．前記外因性ヌクレオチド配列が、前記第１ＲＲＳと前記第３ＲＲＳとの間に位置する少なくとも１つの外因性ＳＯＩ、及び前記第３ＲＲＳと前記第２ＲＲＳとの間に位置する少なくとも１つの外因性ＳＯＩをさらに含む、Ａ２４～Ａ２８のいずれか１項に記載のＴＩ宿主細胞。
【0230】
Ａ３０．前記ＳＯＩが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、またはＦｃ融合タンパク質をコードする、Ａ２９に記載のＴＩ宿主細胞。
【0231】
Ａ３１．前記ＳＯＩが、ランダムに組み込まれた宿主細胞と比較してより高いレベルで発現される抗体をコードする、Ａ２６に記載のＴＩ宿主細胞。
【0232】
Ａ３２．前記抗体が、少なくとも３ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、４．５ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、５．５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ、６．５ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ、７．５ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ、８．５ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ、９．５ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ、１０．５ｇ／Ｌ、１１ｇ／Ｌ、またはそれを超える力価で発現される標準抗体または半抗体である、Ａ３１に記載のＴＩ宿主細胞。
【0233】
Ａ３３．前記抗体が、少なくとも１．５ｇ／Ｌ、２ｇ／Ｌ、２．５ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ、３．５ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ、４．５ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ、５．５ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌの力価で発現される多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である、Ａ３１に記載のＴＩ宿主細胞。
【0234】
Ａ３４．前記抗体が二重特異性抗体であり、前記二重特異性含量が、ランダム組込み宿主細胞と比較して増加している、Ａ３１に記載のＴＩ宿主細胞。
【0235】
Ａ３５．前記抗体が二重特異性抗体であり、前記二重特異性含量が、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９８％、９９％またはそれを超える、Ａ１に記載のＴＩ宿主細胞。
【0236】
Ｂ．目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞の調製方法であって、前記ＴＩ宿主細胞ゲノムの座位内における部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供し、前記座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、前記外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含むこと、ａ）で提供される前記細胞中に、前記組込み外因性ヌクレオチド配列上の２つのＲＲＳと一致し、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第２選択マーカーに隣接する前記２つのＲＲＳを含むベクターを導入すること、リコンビナーゼまたはリコンビナーゼをコードする核酸を導入し、前記リコンビナーゼが前記ＲＲＳを認識すること、ならびに前記第２選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、前記ポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む、前記方法。
【0237】
Ｂ１．前記リコンビナーゼが、ＣｒｅリコンビナーゼまたはＦＬＰリコンビナーゼである、Ｂに記載の方法。
【0238】
Ｂ２．前記リコンビナーゼが、Ｂｘｂ１インテグラーゼまたはφＣ３１インテグラーゼである、Ｂに記載の方法。
【0239】
Ｂ３．前記ＳＯＩが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、またはＦｃ融合タンパク質をコードする、Ｂ～Ｂ２のいずれか１項に記載の方法。
【0240】
Ｂ４．前記ＴＩ宿主細胞が、哺乳動物宿主細胞である、請求項Ｂ～Ｂ３のいずれか１項に記載の方法。
【0241】
Ｂ５．前記ＴＩ宿主細胞が、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、またはマウス宿主細胞である、Ｂ４に記載の方法。
【0242】
Ｂ６．前記ＴＩ宿主細胞が、ＣＨＯ宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１１宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、またはＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である、Ｂ４またはＢ５に記載の方法。
【0243】
Ｃ．目的のポリペプチドの発現方法であって、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの選択マーカーを含むＴＩ宿主細胞を提供し、前記少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの選択マーカーが、前記ＴＩ宿主細胞ゲノムの座位内に組み込まれた２つのＲＲＳに隣接し、前記座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であること、ならびに前記目的のポリペプチドを発現し、そこから目的のポリペプチドを回収するのに好適な条件下でａ）の前記細胞を培養することを含む、前記方法。
【0244】
Ｃ１．前記少なくとも１つの外因性ＳＯＩが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、またはＦｃ融合タンパク質をコードする、Ｃに記載の方法。
【0245】
Ｄ．少なくとも目的の第１及び第２ポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞の調製方法であって、前記宿主細胞ゲノムの座位内における部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供し、前記座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、前記外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１選択マーカーに隣接する第１及び第２ＲＲＳ、ならびに前記第１ＲＲＳと前記第２ＲＲＳとの間に位置する第３ＲＲＳを含み、全ての前記ＲＲＳが異種特異的であること、ａ）で提供される前記細胞中に、前記組込み外因性ヌクレオチド配列上の前記第１及び前記第３ＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第１外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第２選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含む第１ベクターを導入すること、ａ）で提供される前記細胞中に、前記組込み外因性ヌクレオチド配列上の前記第２及び前記第３ＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第２外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳを含む第２ベクターを導入すること、１つ以上のリコンビナーゼ、または１つ以上のリコンビナーゼをコードする１つ以上の核酸を導入し、前記１つ以上のリコンビナーゼが前記ＲＲＳを認識すること、ならびに前記第２選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、前記目的の第１及び第２ポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む、前記方法。
【0246】
Ｄ１．前記リコンビナーゼが、ＣｒｅリコンビナーゼまたはＦＬＰリコンビナーゼである、Ｄに記載の方法。
【0247】
Ｄ２．前記リコンビナーゼが、Ｂｘｂ１インテグラーゼまたはφＣ３１インテグラーゼである、Ｄに記載の方法。
【0248】
Ｄ３．前記第１ベクターが、前記第１ＳＯＩの上流に、かつＲＲＳの下流に隣接して配置されるコドンＡＴＧに機能的に連結されるプロモーター配列をさらに含み、前記第２ベクターが、ＲＲＳの上流に、かつ前記第２ＳＯＩの下流に隣接するＡＴＧ転写開始コドンを欠く選択マーカーをさらに含む、Ｄに記載の方法。
【0249】
Ｄ４．前記第１ＳＯＩが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、またはＦｃ融合タンパク質をコードする、Ｄ～Ｄ３のいずれか１項に記載の方法。
【0250】
Ｄ５．前記第２ＳＯＩが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、またはＦｃ融合タンパク質をコードする、Ｄ～Ｄ３のいずれか１項に記載の方法。
【0251】
Ｄ６．前記ＴＩ宿主細胞が、哺乳動物宿主細胞である、ＣまたはＤ～Ｄ５のいずれか１項に記載の方法。
【0252】
Ｄ７．前記ＴＩ宿主細胞が、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、またはマウス宿主細胞である、Ｄ６に記載の方法。
【0253】
Ｄ８．前記ＴＩ宿主細胞が、ＣＨＯ宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１１宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、またはＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である、Ｄ７に記載の方法。
【0254】
Ｅ．目的のポリペプチドの発現方法であって、前記宿主細胞ゲノムの座位内に組み込まれた少なくとも２つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの選択マーカーを含む宿主細胞を提供し、前記座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び１つの選択マーカーが、第１及び第３ＲＲＳに隣接し、少なくとも１つの外因性ＳＯＩが、第２及び前記第３ＲＲＳに隣接すること、ならびに前記目的のポリペプチドを発現し、そこから目的のポリペプチドを回収するのに好適な条件下でａ）の前記細胞を培養することを含む、前記方法。
【0255】
Ｅ１．前記第１ＳＯＩが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、またはＦｃ融合タンパク質をコードする、Ｅに記載の方法。
【0256】
Ｅ２．前記第２ＳＯＩが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、またはＦｃ融合タンパク質をコードする、ＥまたはＥ１に記載の方法。
【0257】
Ｅ３．前記ＴＩ宿主細胞が、哺乳動物宿主細胞である、Ｅ～Ｅ２のいずれか１項に記載の方法。
【0258】
Ｅ４．前記ＴＩ宿主細胞が、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、またはマウス宿主細胞である、Ｅ３に記載の方法。
【0259】
Ｅ５．前記ＴＩ宿主細胞が、ＣＨＯ宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１１宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、またはＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である、Ｅ４に記載の方法。
【0260】
Ｆ．ベクターであって、
ａ）配列番号１の任意の部分から選択される２つの参照配列、
ｂ）配列番号２の任意の部分から選択される２つの参照配列、
ｃ）配列番号３の任意の部分から選択される２つの参照配列、
ｄ）配列番号４の任意の部分から選択される２つの参照配列、
ｅ）配列番号５の任意の部分から選択される２つの参照配列、
ｆ）配列番号６の任意の部分から選択される２つの参照配列、または
ｇ）配列番号７の任意の部分から選択される２つの参照配列
と少なくとも５０％相同の２つのヌクレオチド配列を含み、前記配列がＤＮＡカセットに隣接し、前記ＤＮＡカセットが、２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの選択マーカー及び少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む、前記ベクター。
ａ）配列番号１の任意の部分から選択される２つの参照配列、
ｂ）配列番号２の任意の部分から選択される２つの参照配列、
ｃ）配列番号３の任意の部分から選択される２つの参照配列、
ｄ）配列番号４の任意の部分から選択される２つの参照配列、
ｅ）配列番号５の任意の部分から選択される２つの参照配列、
ｆ）配列番号６の任意の部分から選択される２つの参照配列、または
ｇ）配列番号７の任意の部分から選択される２つの参照配列
と少なくとも５０％相同の２つのヌクレオチド配列を含み、前記配列がＤＮＡカセットに隣接し、前記ＤＮＡカセットが、２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの選択マーカー及び少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む、前記ベクター。
【0261】
Ｆ１．前記ベクターが、前記２つの参照配列と少なくとも６０％相同の２つのヌクレオチド配列を含む、Ｆに記載のベクター。
【0262】
Ｆ２．前記ベクターが、前記２つの参照配列と少なくとも７０％相同の２つのヌクレオチド配列を含む、Ｆに記載のベクター。
【0263】
Ｆ３．前記ベクターが、前記２つの参照配列と少なくとも８０％相同の２つのヌクレオチド配列を含む、Ｆに記載のベクター。
【0264】
Ｆ４．前記ベクターが、前記２つの参照配列と少なくとも９０％相同の２つのヌクレオチド配列を含む、Ｆに記載のベクター。
【0265】
Ｆ５．前記ベクターが、前記２つの参照配列と少なくとも９５％相同の２つのヌクレオチド配列を含む、Ｆに記載のベクター。
【0266】
Ｆ６．前記ベクターが、前記２つの参照配列と少なくとも９９％相同の２つのヌクレオチド配列を含む、Ｆに記載のベクター。
【0267】
Ｆ７．前記ベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、組込みファージベクター、非ウイルスベクター、トランスポゾン及び／またはトランスポザーゼベクター、インテグラーゼ基質、ならびにプラスミドからなる群から選択される、Ｆ～Ｆ６のいずれか１項に記載のベクター。
【0268】
Ｆ８．前記ＳＯＩが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、またはＦｃ融合タンパク質をコードする、Ｆ～Ｆ７のいずれか１項に記載のベクター。
【0269】
Ｇ．目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞の調製方法であって、前記宿主細胞ゲノムの座位を含む宿主細胞を提供し、前記座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であること、ベクターを前記宿主細胞中に導入し、前記ベクターが、ＤＮＡカセットに隣接する配列番号１～７から選択される配列と少なくとも５０％相同のヌクレオチド配列を含み、前記ＤＮＡカセットが、２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの選択マーカー及び少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含むこと、ならびに前記選択マーカーを選択し、前記ゲノムの前記座位中に組み込まれた前記ＳＯＩを有するＴＩ宿主細胞を単離して前記目的のポリペプチドを発現させることを含む、前記方法。
【0270】
Ｇ１．前記ベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、組込みファージベクター、非ウイルスベクター、トランスポゾン及び／またはトランスポザーゼベクター、インテグラーゼ基質、ならびにプラスミドからなる群から選択される、Ｇに記載の方法。
【0271】
Ｇ２．前記少なくとも１つのＳＯＩが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、またはＦｃ融合タンパク質をコードする、ＧまたはＧ１に記載の方法。
【0272】
Ｇ３．前記ＴＩ宿主細胞が、哺乳動物宿主細胞である、Ｇ～Ｇ２のいずれか１項に記載の方法。
【0273】
Ｇ４．前記ＴＩ宿主細胞が、ハムスター宿主細胞、ヒト宿主細胞、ラット宿主細胞、またはマウス宿主細胞である、Ｇ３に記載の方法。
【0274】
Ｇ５．前記ＴＩ宿主細胞が、ＣＨＯ宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１宿主細胞、ＣＨＯ Ｋ１ＳＶ宿主細胞、ＤＧ４４宿主細胞、ＤＵＫＸＢ－１１宿主細胞、ＣＨＯＫ１Ｓ宿主細胞、またはＣＨＯ Ｋ１Ｍ宿主細胞である、Ｇ３またはＧ４に記載の方法。
【0275】
Ｇ６．前記少なくとも１つのＳＯＩ及び選択マーカーを含む前記核酸の前記組込みが、外因性ヌクレアーゼによって促進される、Ｇ１～Ｇ５のいずれか１項に記載の方法。
【0276】
Ｇ７．前記外因性ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＺＦＮ二量体、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＴＡＬエフェクタードメイン融合タンパク質、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、操作されたメガヌクレアーゼ、及び規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼからなる群から選択される、Ｇ６に記載の方法。
【0277】
Ｇ８．前記目的のポリペプチドが多重特異性抗体である、Ｇに記載の方法。
【0278】
Ｇ９．前記多重特異性抗体が二重特異性抗体である、Ｇ８に記載の方法。
【0279】
Ｈ．ＴＩ宿主細胞であって、前記宿主細胞ゲノムの、１箇所以上の特定の座位内における組込み部位に組み込まれた少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列を含み、前記座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同である、前記ＴＩ宿主細胞。
【0280】
Ｈ１．ＴＩ宿主細胞であって、ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれらと少なくとも約９０％相同の配列からなる群から選択される内因性遺伝子内における１箇所以上の組込み部位に組み込まれた少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列を含む、前記ＴＩ宿主細胞。
【0281】
Ｈ２．前記少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列が、１つ以上の組換え認識配列（ＲＲＳ）を含み、前記ＲＲＳがリコンビナーゼによって認識され得る、Ｈ～Ｈ１のいずれか１項に記載のＴＩ宿主細胞。
【0282】
Ｈ３．前記少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの外因性ＳＯＩをさらに含む、Ｈ２に記載のＴＩ宿主細胞。
【0283】
Ｈ４．前記宿主細胞が、前記宿主細胞の前記ゲノムの第１座位に少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列及び前記宿主細胞の前記ゲノムの２箇所以上の第２座位に少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列を含む、Ｈ～Ｈ３のいずれか１項に記載のＴＩ宿主細胞。
【0284】
Ｈ５．前記第１座位が、配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、または配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0285】
Ｈ５．１．前記第１座位が、配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0286】
Ｈ５．２．前記第１座位が、配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0287】
Ｈ５．３．前記第１座位が、配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0288】
Ｈ５．４．前記第１座位が、配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0289】
Ｈ５．５．前記第１座位が、配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0290】
Ｈ５．６．前記第１座位が、配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0291】
Ｈ６．前記第１座位が、配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、または配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0292】
Ｈ６．１．前記第１座位が、配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0293】
Ｈ６．２．前記第１座位が、配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0294】
Ｈ６．３．前記第１座位が、配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0295】
Ｈ６．４．前記第１座位が、配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0296】
Ｈ６．５．前記第１座位が、配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0297】
Ｈ６．６．前記第１座位が、配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0298】
Ｈ７．前記第１座位が、配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５、配列番号６、または配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0299】
Ｈ７．１．前記第１座位が、配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0300】
Ｈ７．２．前記第１座位が、配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0301】
Ｈ７．３．前記第１座位が、配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0302】
Ｈ７．４．前記第１座位が、配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0303】
Ｈ７．５．前記第１座位が、配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0304】
Ｈ７．６．前記第１座位が、配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0305】
Ｈ８．前記第１座位が、配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６、または配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0306】
Ｈ８．１．前記第１座位が、配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0307】
Ｈ８．２．前記第１座位が、配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0308】
Ｈ８．３．前記第１座位が、配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0309】
Ｈ８．４．前記第１座位が、配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0310】
Ｈ８．５．前記第１座位が、配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0311】
Ｈ８．６．前記第１座位が、配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0312】
Ｈ９．前記第１座位が、配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号６、または配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0313】
Ｈ９．１．前記第１座位が、配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0314】
Ｈ９．２．前記第１座位が、配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0315】
Ｈ９．３．前記第１座位が、配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0316】
Ｈ９．４．前記第１座位が、配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0317】
Ｈ９．５．前記第１座位が、配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0318】
Ｈ９．６．前記第１座位が、配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0319】
Ｈ１０．前記第１座位が、配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0320】
Ｈ１０．１．前記第１座位が、配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0321】
Ｈ１０．２．前記第１座位が、配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0322】
Ｈ１０．３．前記第１座位が、配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0323】
Ｈ１０．４．前記第１座位が、配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0324】
Ｈ１０．５．前記第１座位が、配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0325】
Ｈ１０．６．前記第１座位が、配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0326】
Ｈ１１．前記第１座位が、配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0327】
Ｈ１１．１．前記第１座位が、配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号１の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0328】
Ｈ１１．２．前記第１座位が、配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号２の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0329】
Ｈ１１．３．前記第１座位が、配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号３の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0330】
Ｈ１１．４．前記第１座位が、配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号４の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0331】
Ｈ１１．５．前記第１座位が、配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号５の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0332】
Ｈ１１．６．前記第１座位が、配列番号７の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の配列を含み、前記第２座位が、配列番号６の全てまたは一部と少なくとも９０％相同の少なくとも１つの配列を含む、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0333】
Ｈ１２．前記第１座位が、ＬＯＣ１０７９７７０６２遺伝子内の組込み部位であり、前記第２座位が、次の群：ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれらと少なくとも約９０％相同の配列から選択される遺伝子内の組込み部位である、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0334】
Ｈ１３．前記第１座位が、ＬＯＣ１００７６８８４５遺伝子内の組込み部位であり、前記第２座位が、次の群：ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれらと少なくとも約９０％相同の配列から選択される遺伝子内の組込み部位である、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0335】
Ｈ１４．前記第１座位が、ＩＴＰＲ２遺伝子内の組込み部位であり、前記第２座位が、次の群：ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれらと少なくとも約９０％相同の配列から選択される遺伝子内の組込み部位である、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0336】
Ｈ１５．前記第１座位が、ＥＲＥ６７０００．１遺伝子内の組込み部位であり、前記第２座位が、次の群：ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれらと少なくとも約９０％相同の配列から選択される遺伝子内の組込み部位である、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0337】
Ｈ１６．前記第１座位が、ＵＢＡＰ２遺伝子内の組込み部位であり、前記第２座位が、次の群：ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＭＴＭＲ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれらと少なくとも約９０％相同の配列から選択される遺伝子内の組込み部位である、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0338】
Ｈ１７．前記第１座位が、ＭＴＭＲ２遺伝子内の組込み部位であり、前記第２座位が、次の群ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＸＰ＿００３５１２３３１．２、及びそれらと少なくとも約９０％相同の配列から選択される遺伝子内の組込み部位である、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0339】
Ｈ１８．前記第１座位が、ＸＰ＿００３５１２３３１．２遺伝子内の組込み部位であり、前記第２座位が、次の群：ＬＯＣ１０７９７７０６２、ＬＯＣ１００７６８８４５、ＩＴＰＲ２、ＥＲＥ６７０００．１、ＵＢＡＰ２、ＭＴＭＲ２、及びそれらと少なくとも約９０％相同の配列から選択される遺伝子内の組込み部位である、Ｈ４に記載のＴＩ宿主細胞。
【0340】
Ｈ１９．前記第１座位に組み込まれた前記少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列が、調節可能なプロモーターを含む、Ｈ４～Ｈ１８に記載のＴＩ宿主細胞。
【0341】
Ｈ２０．前記第２座位に組み込まれた前記少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列が、調節可能なプロモーターを含む、Ｈ４～Ｈ１８に記載のＴＩ宿主細胞。
【0342】
Ｈ２１．前記第１座位に組み込まれた前記少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列及び前記第２座位に組み込まれた前記少なくとも１つのヌクレオチド配列が、調節可能なプロモーターを含む、Ｈ４～Ｈ１８に記載のＴＩ宿主細胞。
【0343】
Ｊ．少なくとも１つの目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞の調製方法であって、前記ＴＩ宿主細胞ゲノムの１箇所以上の座位内における部位に組み込まれた少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供し、前記１箇所以上の座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、前記少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含むこと、ａ）で提供される前記細胞中に、前記組込み外因性ヌクレオチド配列上の２つのＲＲＳと一致し、少なくとも１つの外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第２選択マーカーに隣接する前記２つのＲＲＳを含むベクターを導入すること、リコンビナーゼまたはリコンビナーゼをコードする核酸を導入し、前記リコンビナーゼが前記ＲＲＳを認識すること、ならびに前記第２選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、前記少なくとも１つの目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む、前記方法。
【0344】
Ｊ１．少なくとも１つの目的の第１及び第２ポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞の調製方法であって、前記宿主細胞ゲノムの１箇所以上の座位内における部位に組み込まれた少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供し、１箇所以上の座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、前記外因性ヌクレオチド配列が、少なくとも１つの第１選択マーカーに隣接する第１及び第２ＲＲＳ、ならびに前記第１ＲＲＳと前記第２ＲＲＳとの間に位置する第３ＲＲＳを含み、全ての前記ＲＲＳが異種特異的であること、ａ）で提供される前記細胞中に、前記少なくとも１つの組込み外因性ヌクレオチド配列上の前記第１及び前記第３ＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第１外因性ＳＯＩ及び少なくとも１つの第２選択マーカーに隣接する２つのＲＲＳを含む第１ベクターを導入すること、ａ）で提供される前記細胞中に、前記少なくとも１つの組込み外因性ヌクレオチド配列上の前記第２及び前記第３ＲＲＳと一致し、少なくとも１つの第２外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳを含む第２ベクターを導入すること、１つ以上のリコンビナーゼ、または１つ以上のリコンビナーゼをコードする１つ以上の核酸を導入し、前記１つ以上のリコンビナーゼが前記ＲＲＳを認識すること、ならびに前記第２選択マーカーを発現するＴＩ細胞を選択することによって、前記少なくとも１つの目的の第１及び第２ポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む、前記方法。
【0345】
Ｊ２．目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞の調製方法であって、ａ）前記ＴＩ宿主細胞ゲノムの１箇所以上の座位内における部位に組み込まれた少なくとも１つの外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供し、前記１箇所以上の座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、前記外因性ヌクレオチド配列が１つ以上のＲＲＳを含むこと、ｂ）ａ）で提供される前記細胞中に、前記組込み外因性ヌクレオチド配列上の１つ以上のＲＲＳと一致し、少なくとも１つの調節可能なプロモーターに機能的に連結される少なくとも１つの外因性ＳＯＩに隣接する前記１つ以上のＲＲＳを含むベクターを導入すること、ｃ）リコンビナーゼまたはリコンビナーゼをコードする核酸を導入し、前記リコンビナーゼが前記ＲＲＳを認識すること、ならびにｄ）誘導物質の存在下で前記目的の外因性ポリペプチドを発現するＴＩ細胞を選択することによって、前記目的のポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む、前記方法。
【0346】
Ｊ３．目的のポリペプチドの発現方法であって、ａ）前記宿主細胞ゲノムの座位内に組み込まれた２つのＲＲＳ及び調節可能なプロモーターに隣接する少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む宿主細胞を提供し、前記座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であること、ならびにｂ）前記ＳＯＩを発現し、そこから目的のポリペプチドを回収するのに好適な条件下で前記細胞を培養することを含む、前記方法。
【0347】
Ｊ４．目的の第１及び第２ポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞の調製方法であって、ａ）前記宿主細胞ゲノムの座位内における部位に組み込まれた外因性ヌクレオチド配列を含むＴＩ宿主細胞を提供し、前記座位が、配列番号１～７から選択される配列と少なくとも約９０％相同であり、前記外因性ヌクレオチド配列が、第１、第２ＲＲＳ及び前記第１ＲＲＳと前記第２ＲＲＳとの間に位置する第３ＲＲＳを含み、全ての前記ＲＲＳが異種特異的であること、ｂ）ａ）で提供される前記細胞中に、前記組込み外因性ヌクレオチド配列上の前記第１及び前記第３ＲＲＳと一致し、調節可能なプロモーターに機能的に連結される少なくとも１つの第１外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳを含む第１ベクターを導入すること、ｃ）ａ）で提供される前記細胞中に、前記組込み外因性ヌクレオチド配列上の前記第２及び前記第３ＲＲＳと一致し、調節可能なプロモーターに機能的に連結される少なくとも１つの第２外因性ＳＯＩに隣接する２つのＲＲＳを含む第２ベクターを導入すること、ｄ）１つ以上のリコンビナーゼ、または１つ以上のリコンビナーゼをコードする１つ以上の核酸を導入し、前記１つ以上のリコンビナーゼが前記ＲＲＳを認識すること、ならびにｅ）誘導物質の存在下で前記目的の第１及び第２外因性ポリペプチドを発現するＴＩ細胞を選択することによって、前記目的の第１及び第２ポリペプチドを発現するＴＩ宿主細胞を単離することを含む、前記方法。
【0348】
Ｊ５．少なくとも１つのＳＯＩを含む核酸の前記組込みが、外因性ヌクレアーゼによって促進される、請求項Ｊ、Ｊ２、及びＪ３のいずれか１項に記載の方法。
【0349】
Ｊ６．前記第１ＳＯＩが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、またはＦｃ融合タンパク質をコードし、前記第２ＳＯＩが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、またはＦｃ融合タンパク質をコードする、請求項Ｊ１またはＪ４に記載の方法。
【0350】
Ｊ７．前記外因性ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＺＦＮ二量体、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＴＡＬエフェクタードメイン融合タンパク質、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、操作されたメガヌクレアーゼ、及び規則的な間隔をもってクラスター化された短鎖反復回文配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連（Ｃａｓ）エンドヌクレアーゼからなる群から選択される、Ｊ５に記載の方法。
【0351】
Ｊ８．前記調節可能なプロモーターが、ＳＶ４０及びＣＭＶプロモーターからなる群から選択される、請求項Ｊ～Ｊ４のいずれか１項に記載の方法。
【0352】
Ｊ９．前記第１ベクターが、前記第１ＳＯＩの上流に、かつＲＲＳの下流に隣接して配置されるコドンＡＴＧに機能的に連結されるプロモーター配列をさらに含み、前記第２ベクターが、ＲＲＳの上流に、かつ前記第２ＳＯＩの下流に隣接するＡＴＧ転写開始コドンを欠く選択マーカーをさらに含む、請求項Ｊ２及びＪ４のいずれか１項に記載の方法。
【0353】
Ｋ．ベクターであって、
ａ）配列番号１の任意の部分から選択される２つの参照配列、
ｂ）配列番号２の任意の部分から選択される２つの参照配列、
ｃ）配列番号３の任意の部分から選択される２つの参照配列、
ｄ）配列番号４の任意の部分から選択される２つの参照配列、
ｅ）配列番号５の任意の部分から選択される２つの参照配列、
ｆ）配列番号６の任意の部分から選択される２つの参照配列、または
ｇ）配列番号７の任意の部分から選択される２つの参照配列
と少なくとも５０％相同の２つのヌクレオチド配列を含み、前記２つのヌクレオチド配列がＤＮＡカセットに隣接し、前記ＤＮＡカセットが、調節可能なプロモーターに機能的に連結され、２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む、前記ベクター。
ａ）配列番号１の任意の部分から選択される２つの参照配列、
ｂ）配列番号２の任意の部分から選択される２つの参照配列、
ｃ）配列番号３の任意の部分から選択される２つの参照配列、
ｄ）配列番号４の任意の部分から選択される２つの参照配列、
ｅ）配列番号５の任意の部分から選択される２つの参照配列、
ｆ）配列番号６の任意の部分から選択される２つの参照配列、または
ｇ）配列番号７の任意の部分から選択される２つの参照配列
と少なくとも５０％相同の２つのヌクレオチド配列を含み、前記２つのヌクレオチド配列がＤＮＡカセットに隣接し、前記ＤＮＡカセットが、調節可能なプロモーターに機能的に連結され、２つのＲＲＳに隣接する少なくとも１つの外因性ＳＯＩを含む、前記ベクター。
【0354】
Ｋ１．前記ベクターが、前記２つの参照配列と少なくとも６０％相同の２つのヌクレオチド配列を含む、Ｋに記載のベクター。
【0355】
Ｋ２．前記ベクターが、前記２つの参照配列と少なくとも７０％相同の２つのヌクレオチド配列を含む、Ｋに記載のベクター。
【0356】
Ｋ３．前記ベクターが、前記２つの参照配列と少なくとも８０％相同の２つのヌクレオチド配列を含む、Ｋに記載のベクター。
【0357】
Ｋ４．前記ベクターが、前記２つの参照配列と少なくとも９０％相同の２つのヌクレオチド配列を含む、Ｋに記載のベクター。
【0358】
Ｋ５．前記ベクターが、前記２つの参照配列と少なくとも９５％相同の２つのヌクレオチド配列を含む、Ｋに記載のベクター。
【0359】
Ｋ６．前記ベクターが、前記２つの参照配列と少なくとも９９％相同の２つのヌクレオチド配列を含む、Ｋに記載のベクター。
【0360】
Ｋ７．前記ベクターが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、組込みファージベクター、非ウイルスベクター、トランスポゾン及び／またはトランスポザーゼベクター、インテグラーゼ基質、ならびにプラスミドからなる群から選択される、Ｋ～Ｋ６のいずれか１項に記載のベクター。
【0361】
Ｋ８．前記ＳＯＩが、一本鎖抗体、抗体軽鎖、抗体重鎖、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、またはＦｃ融合タンパク質をコードする、Ｋ～Ｋ７のいずれか１項に記載のベクター。
【実施例0362】
以下の実施例は、本明細書で開示される主題の単なる例示であり、決して限定するものとして見なされるべきではない。
【0363】
実施例１：臨床用及び市販用細胞株開発を目的としたＣＨＯ宿主細胞の生産性の高い標的組込み部位の発見
この実施例は、高い生産性を有するＣＨＯゲノム中における標的組込み座位を同定する方法について記載する。従来の細胞株開発（ＣＬＤ）は、目的の配列（ＳＯＩ）を持つプラスミドのランダム組込み（ＲＩ）に基づく。このプロセスは、予測不能かつ多大な労力を要する。そのため、高産生ＲＩクローンを同定するには多大な努力が必要となる。従来のＲＩ ＣＬＤとは異なり、標的組込み（ＴＩ）ＣＬＤは、ＣＨＯゲノム中の所定の「ホットスポット」に規定のコピー数（通常は１～２コピー）を有する導入遺伝子を導入する。低コピー数及び予備試験した組込み部位を考慮すると、ＴＩ細胞株は、ＲＩ株と比較して優れた安定性を有するはずである。さらに、選択マーカーは、適切なＴＩを有する細胞を選択するためだけに使用され、高レベルの導入遺伝子発現を有する細胞を選択するためには使用されないため、低変異原性マーカーを適用すると、配列バリアント（ＳＶ）の可能性を最小限に抑える場合があり、これはメトトレキサート（ＭＴＸ）またはメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）のような選択剤の変異原性に部分的に起因する。
この実施例は、高い生産性を有するＣＨＯゲノム中における標的組込み座位を同定する方法について記載する。従来の細胞株開発（ＣＬＤ）は、目的の配列（ＳＯＩ）を持つプラスミドのランダム組込み（ＲＩ）に基づく。このプロセスは、予測不能かつ多大な労力を要する。そのため、高産生ＲＩクローンを同定するには多大な努力が必要となる。従来のＲＩ ＣＬＤとは異なり、標的組込み（ＴＩ）ＣＬＤは、ＣＨＯゲノム中の所定の「ホットスポット」に規定のコピー数（通常は１～２コピー）を有する導入遺伝子を導入する。低コピー数及び予備試験した組込み部位を考慮すると、ＴＩ細胞株は、ＲＩ株と比較して優れた安定性を有するはずである。さらに、選択マーカーは、適切なＴＩを有する細胞を選択するためだけに使用され、高レベルの導入遺伝子発現を有する細胞を選択するためには使用されないため、低変異原性マーカーを適用すると、配列バリアント（ＳＶ）の可能性を最小限に抑える場合があり、これはメトトレキサート（ＭＴＸ）またはメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）のような選択剤の変異原性に部分的に起因する。
【0364】
図１は、抗体の安定した高発現を可能にする、ＣＨＯ ＴＩ座位を同定するためのゲノムワイドスクリーニングステップの概要を示す略図である。ＣＨＯゲノム中の転写的に活性な配列をスクリーニングするために、２つのアプローチを利用して、抗体Ａまたは抗体Ｂのいずれかを発現し、抗体配列がＲＲＳ１及びＲＲＳ２に隣接する抗体カセットをＣＨＯゲノム中に導入した。１つのアプローチは従来のランダム組込み方法であって、他方は、トランスポザーゼ発現プラスミド及び抗体プラスミドの共トランスフェクションを必要とするトランスポザーゼに基づく組込みであった。１５ｋ～２０ｋのトランスフェクタントを、方法の各々についてスクリーニングした。インタクトなＩｇＧ ＥＬＩＳＡアッセイ及び遺伝子コピー解析に基づいて、抗体力価が高く、ＨＣ遺伝子コピー数が少ない合計で約３００のクローンを、振盪フラスコ中において流加評価のために増殖させた。次いで、許容される力価及び産物品質特性を有する、２つの方法で同定した４０の異なる可能性のある高度に転写的に活性な組込み部位を表す４０のクローンをＧＦＰランディングパッド交換のために選択し、ＴＩ宿主を生成した。
【0365】
転写的に活性な座位の抗体カセットを置き換えるために、同じＲＲＳ１及びＲＲＳ２に隣接するＧＦＰ遺伝子及び適切な選択マーカーをコードするランディングパッドをＲＭＣＥ用に構築した。ＲＭＣＥを開始するために、リコンビナーゼ及びＧＦＰランディングパッドを上位４０のクローンの各々に共トランスフェクトした。２つの選択マーカーを使用して、標的組込み事象を増強した。ＲＭＣＥが成功すると、ＧＦＰランディングパッドが転写的に活性な座位を標的として抗体カセットを置き換えて、ＧＦＰ発現の増加及び抗体発現の喪失をもたらすはずである。ＧＦＰ－／ｍＡＢ＋からＧＦＰ＋／ｍＡｂ－への表現型の変化は、ＦＡＣＳ分析を使用して容易に検出可能なはずである。ＧＦＰ＋／ｍＡｂ－濃縮を、ＦＡＣＳ分析を使用して４０のＲＭＣＥプールのうち１４で検出した。次いで、個々のＴＩ宿主候補を単離するために、これらの１４のＲＭＣＥプールの各々を単一細胞クローン化した。１４のプールから合計で９０の有力なＴＩ宿主候補をＦＡＣＳ及びゲノムＰＣＲの確認に基づいて選択し、元の抗体カセットが除去されて、目的の組込み部位においてＧＦＰランディングパッドで置き換えた。続いて、これらの候補宿主のいくつかを、同じＲＲＳ１及びＲＲＳ２に隣接する試験抗体Ｃを使用して、それらのＲＭＣＥの能力及び効率について評価した。転写的に活性な座位を同定した方法に応じて、２つの二重選択スキームを利用し、標的抗体を発現する集団を生成した（図２Ａ及び図２Ｂ）。ランディングパッドの構成は、２つのスクリーニング方法でわずかに異なっていた。ＴＩトランスフェクションプールのＲＭＣＥ効率に加えて抗体生産性に基づいて、７つの最終宿主を選択し、これらは抗体の高発現についてＣＨＯＫ１Ｍ宿主中で７つの特有の組込み部位を表した。
【0366】
これらの７つの宿主を、標的座位増幅／次世代シーケンシング（ＴＬＡ／ＮＧＳ）によって分析し、組込み部位に隣接するＣＨＯゲノム配列を同定することにより、目的の組込み部位が存在する可能性のある遺伝子配列を提供した。
表２－ＴＩ宿主細胞の組込み部位
表２－ＴＩ宿主細胞の組込み部位
【0367】
組込み部位に基づいて、５’隣接配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４１１９０－４５２６９、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド６３５９０－２０７９１１、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド２５３８３１－４９１９０９、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド６９３０３－７９７６８、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド２９３４８１－３１５２６５、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６５０４４３－２６６２０５４、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド８２２１４－９７７０５を含み得る。
【0368】
組込み部位に基づいて、３’隣接配列は、ＮＷ＿００６８７４０４７．１のヌクレオチド４５２７０－４５４９０、ＮＷ＿００６８８４５９２．１のヌクレオチド２０７９１２－７９２３７４、ＮＷ＿００６８８１２９６．１のヌクレオチド４９１９１０－６６７８１３、ＮＷ＿００３６１６４１２．１のヌクレオチド７９７６９－１０００５９、ＮＷ＿００３６１５０６３．１のヌクレオチド３１５２６６－３６２４４２、ＮＷ＿００６８８２９３６．１のヌクレオチド２６６２０５５－２７０１７６８、及びＮＷ＿００３６１５４１１．１のヌクレオチド９７７０６－１０５１１７を含み得る。
【0369】
宿主のうち２つ、すなわち、宿主４及び７では、さらに分析したところ、単一のＧＦＰランディングパッドがＣＨＯ宿主ゲノム中に挿入されていたことが示された。これらの２つの宿主では抗体配列が全く見られなかったため、このことは転写的に活性な座位を同定するために使用した最初の抗体カセットが完全に除去されたことを示していた。加えて、これらの２つのＴＩ宿主から単離したゲノムＤＮＡの全ゲノムシーケンシングを自社で実施した。これらの２つのＴＩ宿主中では抗体特異的配列を一切検出しなかったが、ＧＦＰ配列（ランディングパッドからの）は容易に検出した。ＴＩ宿主では、６３倍超のゲノムカバレッジを達成した。ＴＩ宿主中に抗体Ａ及びＢが存在しないことをさらに保証するために、抗体Ａ及びＢ以外の抗体を発現するＴＩ細胞株からの複数のＨＣＣＦ試料を、ＬＣ－ＭＳ実験を使用して評価した。ＬＣ－ＭＳデータを、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる配列バリアント分析と同様のアプローチを使用して分析し、これは０．５％超のレベルでバリアントペプチドを検出する能力を有する。ＴＩ細胞株から採取した全ての試料中で、抗体ＡまたはＢペプチドを一切検出しなかった。最後に、蛍光ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）分析もＣｈｒｏｍｂｉｏｓによって実施し、これらの２つのＴＩ宿主ゲノム中におけるＧＦＰランディングパッドの染色体位置を決定した。
【0370】
これらの２つの十分に特徴付けしたＴＩ宿主を、合計で１６の異なる標準抗体を用いて、臨床用細胞株開発におけるそれらのＲＭＣＥのロバスト性についてさらに評価した。図３は、これらのＴＩ宿主によって生成された上位クローンの生産性を示す。歴史的に、ランダム組込みによって生成された細胞株の平均生産性は約３ｇ／Ｌであった。試験したほとんどの場合で、ＴＩ細胞株は、平均してＲＩクローンと同等またはそれよりも良好な生産性を示した。
【0371】
ＴＩ細胞株は、抗体遺伝子コピー数が少ないため、ＲＩ細胞株よりも安定性が高く、ＳＶが低いと予想した。クローン安定性のために、毎月の流加産生を４か月間毎月設定し、生産性をモニターした。表３は、ＴＩ宿主のうち１つによって生成されたＴＩ細胞株の１０％のみで、ＰＳＢから１２０日後に力価が２０％を超えて低下したことを示した。歴史的に、ＲＩ細胞株の６０％が同様の力価低下を有することとなる。このことは、同定した組込み部位が、安定した抗体発現に非常に好適であることを強く示唆している。ＴＩ細胞株を、ＮＡＴベースの配列バリアント分析にも供した。ＲＩ細胞株と比較した場合に、ＴＩ細胞株では５％超のＳＶ頻度が有意に低かった（４％対１５％、表３）。
表３ ＴＩ対ＲＩの利点
表３ ＴＩ対ＲＩの利点
【0372】
実施例２：２プラスミドＲＭＣＥ方針
標準抗体の高力価発現を達成し、多重鎖複合体形式を発現するという課題に対処するために、革新的な２プラスミドＲＭＣＥ方針を開発した。２プラスミドＲＭＣＥ方法では、８つ以上の鎖が同時にＴＩ部位を標的とすることを可能にする。このアプローチは、抗体のＨＣ及びＬＣ鎖比を調節する柔軟性を向上させて生産性を改善するだけでなく、複数の鎖を有する複合分子に加えて、導入遺伝子、内因性遺伝子またはＲＮＡｉを抗体で標的し、細胞経路を変更することも可能である。
標準抗体の高力価発現を達成し、多重鎖複合体形式を発現するという課題に対処するために、革新的な２プラスミドＲＭＣＥ方針を開発した。２プラスミドＲＭＣＥ方法では、８つ以上の鎖が同時にＴＩ部位を標的とすることを可能にする。このアプローチは、抗体のＨＣ及びＬＣ鎖比を調節する柔軟性を向上させて生産性を改善するだけでなく、複数の鎖を有する複合分子に加えて、導入遺伝子、内因性遺伝子またはＲＮＡｉを抗体で標的し、細胞経路を変更することも可能である。
【0373】
２プラスミドＲＭＣＥ方針は、３つのＲＲＳ部位を使用し、２つの独立したＲＭＣＥを同時に実施することを含む（図４）。したがって、上に記載されるＴＩ宿主中のＧＦＰランディングパッドを、ＲＲＳ１またはＲＲＳ２部位のいずれかと交差活性しない第３ＲＲＳ部位（ＲＲＳ３）を含むように置き換えた。標的化する２つの発現プラスミドは、効率的標的化のために同じ隣接ＲＲＳ部位を必要とし、一方の発現プラスミド（前方）はＲＲＳ１及びＲＲＳ３に隣接し、他方（後方）はＲＲＳ３及びＲＲＳ２に隣接する。２プラスミドＲＭＣＥの効率は低いと予想しているため、ストリンジェントな選択スキームが、稀なＲＭＣＥ特有の事象を強化するのに有用である。２プラスミドＲＭＣＥには、少なくとも２つの選択マーカーが必要である。ある特定の実施形態では、３つの選択マーカーを用いて、その１つの選択マーカー発現カセットを２つの部分に分割する（例えば、図４を参照のこと）。分割選択マーカー発現カセットを含むある特定の実施形態では、前方プラスミドは、プロモーターに続いて開始コドン及びＲＲＳ３配列を含有することになる。後方プラスミドは、ＡＴＧ開始を除いた選択マーカーコード領域のＮ末端に融合したＲＲＳ３配列を有することになる。追加のヌクレオチドを、確実に融合タンパク質のインフレーム翻訳を行うために、ＲＲＳ３部位と選択マーカー配列との間に挿入することが必要となる場合がある。２つのプラスミドが正確に標的する場合に限り、選択マーカーの完全な発現カセットが組み立てられ、それゆえ選択に対する耐性を細胞に付与することになる。図４は、２プラスミドＲＭＣＥ方針を示す概略図である。当然のことながら、単一プラスミドＲＭＣＥを、必要であれば、ＲＲＳ１及びＲＲＳ２を使用して引き続き実施することができる。
【0374】
２プラスミドＲＭＣＥアプローチのロバスト性を試験するために、元のＧＦＰランディングパッドを、以前に同定したＴＩ宿主、すなわち、宿主４を使用して、３つのＲＲＳ部位を有する新しいＧＦＰランディングパッドで置き換えた。単一プラスミドＲＭＣＥと比較して２プラスミドＲＭＣＥでは、より深刻な生存能力の低下及びより長い回収時間を観察し、これは２プラスミドＲＭＣＥの初期ＲＭＣＥ効率の低下と一致した。プールを回収したら、ＦＡＣＳ、ゲノムＰＣＲ及び遺伝子コピー解析を評価し、両方のプラスミドカセットが正確にＴＩ部位を標的としたかを確認した。合計で、５つの標準抗体（Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、及びＵ）を、単一プラスミドＲＭＣＥ及び２プラスミドＲＭＣＥの両方を使用して生産性について試験した（図５）。２プラスミドＲＭＣＥでは、単一プラスミドＲＭＣＥと比較して、より多くの総ＨＣ及びＬＣコピーがＴＩ部位を標的とした。５つ全ての場合で、２プラスミドＴＩトランスフェクションプールの生産性が一貫して高く、単一プラスミドプールの生産性と比較して最大２００％増加した。２プラスミドＲＭＣＥでの力価増加は、主に比生産性に起因し、そのレベルが単一プラスミドＲＭＣＥのレベルと比較して３００％もはるかに高く改善したことが分かった。
【0375】
十分に特徴付けしたＴＩ宿主、例えば、宿主４を、５つの異なる抗体で高い力価を達成するそれらの能力について、異なる細胞培養プラットフォームでさらに評価した。図６は、これらのＴＩ宿主によるこれらの抗体の生産性を示す。大半の抗体で、１４日目に１０ｇ／Ｌよりも高い生産性を達成し、１６日目には１２ｇ／Ｌよりも高い生産性を達成した。
【0376】
２プラスミドＲＭＣＥを使用して複合ｍＡｂ形式の発現を評価するために、４本の異なる鎖（２本のＨＣ及び２本のＬＣ）を二重特異性アセンブリのために同じ細胞中で発現することが必要な２つの二重特異性分子を試験した。２つの別個の発現プラスミドを同時に標的化することを可能にすることで、異なる鎖のプラスミド構成を操作し、バランスのとれた発現に最適な鎖比を達成することができる。どちらの場合も、２プラスミドＲＭＣＥを使用して、８０％超の二重特異性含量で１．５ｇ／Ｌ超を有する（図７）宿主４に由来する細胞株を開発した。
【0377】
４本の異なる鎖（２本のＨＣ及び２本のＬＣ）を二重特異性アセンブリのために同じ細胞中で発現することが必要な４つの二重特異性分子に関する１４日目の力価も評価した。２プラスミドＲＭＣＥを使用して、８０％超の二重特異性含量で１．５ｇ／Ｌ超の力価を有する（図８）全ての細胞株を開発し、これらは宿主４に由来していた。
【0378】
実施例３：ｍＡｂ－Ｉ（発現困難）対ｍＡｂ－ＩＩ（平均発現）抗体分子を発現するＲＴＩ細胞株の発現及び増殖分析
発現困難な分子を、数回のＣＬＤ試行後に生成した全ての細胞株が、標準ＣＬＤプラットフォームプロセスから通常予想される力価未満の力価を達成する場合のものとして定義する。既に同定した１つの発現困難な抗体（ｍＡｂ－Ｉ）について、例えば、４回の別個のＣＬＤ試行から１２０を超える細胞株を流加産生培養で評価した。それにもかかわらず、わずか２４細胞株をスクリーニングしただけの平均的な抗体分子（ｍＡｂ－ＩＩ）と比較した場合に、最も高いｍＡｂ－Ｉ発現細胞株でも、通常の力価を５０％達成しただけであった（図９Ａ表）。残念なことに、ランダム組込みシステム中で分子を発現困難にする可能性のある根本的な原因（複数可）を調べることは、主に異なる細胞株間での導入遺伝子コピー数及び遺伝子組込み部位の違いによって非常に困難である。
発現困難な分子を、数回のＣＬＤ試行後に生成した全ての細胞株が、標準ＣＬＤプラットフォームプロセスから通常予想される力価未満の力価を達成する場合のものとして定義する。既に同定した１つの発現困難な抗体（ｍＡｂ－Ｉ）について、例えば、４回の別個のＣＬＤ試行から１２０を超える細胞株を流加産生培養で評価した。それにもかかわらず、わずか２４細胞株をスクリーニングしただけの平均的な抗体分子（ｍＡｂ－ＩＩ）と比較した場合に、最も高いｍＡｂ－Ｉ発現細胞株でも、通常の力価を５０％達成しただけであった（図９Ａ表）。残念なことに、ランダム組込みシステム中で分子を発現困難にする可能性のある根本的な原因（複数可）を調べることは、主に異なる細胞株間での導入遺伝子コピー数及び遺伝子組込み部位の違いによって非常に困難である。
【0379】
ｍＡｂ－Ｉを発現困難にする根本的な要因（複数可）を同定するために、ＲＴＩシステムを使用して、ｍＡｂ－Ｉ及びｍＡｂ－ＩＩ分子の両方についてＣＬＤを開始した。ＨＣ及びＬＣ構築物の両方を、誘導性ＣＭＶ－ＴＯプロモーター制御下で発現ベクターにクローニングし、これらのベクターを、導入遺伝子転写レベルが同様の細胞株の単離可能性を高めるためにＴＩ宿主にトランスフェクトした。ｍＡｂ－Ｉ及びｍＡｂ－ＩＩのＲＴＩ ＣＬＤアプローチの全体的な概略図を図９Ｂに示す。トランスフェクト細胞株を、２つの別個の条件を使用して選択に供し、その条件下で細胞株は、ＣＬＤプロセス全体を通じて、１）Ｄｏｘの存在下で誘導した（誘導）か、または２）Ｄｏｘの不存在下で誘導した（非誘導）かのいずれかであった。Ｄｏｘの不存在下で誘導した細胞株は一時的に誘導されたにすぎず、シードトレイン力価に基づいて、または示した場合の産生アッセイ中に順位付けした。これにより、選択プロセス中における抗体発現の役割（発現圧力）の評価が可能となった（図９Ｂ）。
【0380】
産生アッセイを、ドキシサイクリンの存在下または不存在下で「誘導」及び「非誘導」シードトレイン群の両方から、宿主７に由来する２つの代表的なｍＡｂ－Ｉ及びｍＡｂ－ＩＩ細胞株を使用して実施した。後者を使用して、誘導のない場合におけるプロモーター漏出性及び基底抗体産生レベルを評価した。ドキシサイクリンの不存在下では、かなり厳しく調節された抗体発現を観察し、これは調節された発現システムがこれらの細胞株で効果的に機能したことを示唆していた（図１０Ａ及び図１０Ｃ）。ドキシサイクリンの存在下または不存在下における全ての細胞株の増殖（図１０Ｂ）プロファイルは同等であったが、ドキシサイクリンの不存在下で、増殖プロファイルはわずかに良好に見えた。「誘導」または「非誘導」シードトレイン条件下で誘導した細胞株は、産生中に比較的同等の力価及び比生産性を示し（図１０Ａ及び図１０Ｃ、ｍＡｂ－ＩまたはｍＡｂ－ＩＩの細胞株１及び２と３及び４を比較）、これは選択中の構成的抗体発現が、高力価の細胞株の単離において大きな役割を果たしていなかったことを示していた（図１０）。加えて、ＲＩ ＣＬＤ試行と同様に、ｍＡｂ－Ｉ ＲＴＩ細胞株の力価及び比生産性は、ｍＡｂ－ＩＩ ＲＴＩ細胞株よりもさらに５０％低かった（図１０Ａ及び図１０Ｃ）。ｍＡｂ－Ｉの「誘導」及び「非誘導」ＲＴＩ培養物の両方とも、ｍＡｂ－ＩＩ対照細胞株と比較して同様に低い力価を示したため、この観察によって、ｍＡｂ－Ｉの低発現の原因として慢性毒性が除外された。
【0381】
実施例４：ｍＡｂ－Ｉ細胞株のより低い抗体発現は、より低い転写に起因したものではなかった
ｍＡｂ－Ｉ発現細胞株で観察したより低い抗体発現を分析するために、ｑＲＴ－ＰＣＲ実験を行い、ドキシサイクリン誘導及び非誘導条件下で、ｍＡｂ－ＩまたはｍＡｂ－ＩＩを発現するＲＴＩ細胞株中の抗体ＨＣ及びＬＣのｍＲＮＡレベルを測定した。Ｄｏｘの不存在下では、ｍＡｂ－ＩまたはｍＡｂ－ＩＩ細胞株は、ＨＣまたはＬＣ ｍＲＮＡをほとんどまたは全く発現せず、このことは誘導性プロモーターによる比較的厳しい転写調節を示していた（図１１）。Ｄｏｘの存在下では、ｍＡｂ－Ｉ発現細胞株の抗体ＨＣ及びＬＣ転写レベルは、ｍＡｂ－ＩＩ発現細胞株のレベルと同等か、またはそれよりも高かった（図１１Ａ及び図１１Ｂ）。これらの結果によって、導入遺伝子転写レベルの低下が、ｍＡｂ－Ｉ発現細胞株の抗体発現低下の理由ではなかったことが確認された。さらに、ＣＬＤプロセス中のシードトレイン培養におけるドキシサイクリンの有無は、導入遺伝子転写率に対して全く影響を与えず、このことは「誘導」または「非誘導」条件下で単離した細胞株が、同等のＨＣまたはＬＣ ｍＲＮＡレベルを有していたからであった（図１１Ａ及び図１１Ｂ）。
ｍＡｂ－Ｉ発現細胞株で観察したより低い抗体発現を分析するために、ｑＲＴ－ＰＣＲ実験を行い、ドキシサイクリン誘導及び非誘導条件下で、ｍＡｂ－ＩまたはｍＡｂ－ＩＩを発現するＲＴＩ細胞株中の抗体ＨＣ及びＬＣのｍＲＮＡレベルを測定した。Ｄｏｘの不存在下では、ｍＡｂ－ＩまたはｍＡｂ－ＩＩ細胞株は、ＨＣまたはＬＣ ｍＲＮＡをほとんどまたは全く発現せず、このことは誘導性プロモーターによる比較的厳しい転写調節を示していた（図１１）。Ｄｏｘの存在下では、ｍＡｂ－Ｉ発現細胞株の抗体ＨＣ及びＬＣ転写レベルは、ｍＡｂ－ＩＩ発現細胞株のレベルと同等か、またはそれよりも高かった（図１１Ａ及び図１１Ｂ）。これらの結果によって、導入遺伝子転写レベルの低下が、ｍＡｂ－Ｉ発現細胞株の抗体発現低下の理由ではなかったことが確認された。さらに、ＣＬＤプロセス中のシードトレイン培養におけるドキシサイクリンの有無は、導入遺伝子転写率に対して全く影響を与えず、このことは「誘導」または「非誘導」条件下で単離した細胞株が、同等のＨＣまたはＬＣ ｍＲＮＡレベルを有していたからであった（図１１Ａ及び図１１Ｂ）。
【0382】
実施例５：ｍＡｂ－Ｉ発現の誘導は、細胞内ＢｉＰの可逆的蓄積及び抗体ＨＣ分解の遅延をもたらした
ｍＡｂ－Ｉ発現に影響を及ぼす根本的な要因を同定するために、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）処理及び除去と共にＤｏｘ誘導を使用して、抗体の分泌、折り畳み及び分解を調査した。これらの実験では、「誘導」培養物をＣＨＸで処理してタンパク質合成を停止させ、５時間後、細胞を洗浄してＤｏｘのみを含有する培地（ＣＨＸ無し）中に再懸濁してタンパク質合成を再開した（図１２Ａ）。ＣＨＸ除去後のおよそ６０分間、これらの培養物の上清中ではＨＣまたはＬＣを検出せず、抗体分泌の漸増だけを１２０分後に同様の割合で検出した（図１２Ｂ、上部パネル）。このことは、適切に折り畳まれ、かつ組み立てられた抗体分子の分泌が、ＣＨＸ除去後のｍＡｂ－Ｉ細胞株とｍＡｂ－ＩＩ細胞株との間で同等であったことを示唆していた。抗体ＬＣの細胞内レベルも、ｍＡｂ－Ｉ発現細胞株とｍＡｂ－ＩＩ発現細胞株との間でかなり同等であった（図１２Ｂ、ＬＣパネル）。しかしながら、ＣＨＸ処理の５時間後であっても、ｍＡｂ－ＩＩ発現株と比較してｍＡｂ－Ｉ発現細胞株で著しく高いレベルの細胞内抗体ＨＣを検出した（図１２Ｂ、ＨＣパネル）。これは、ｍＡｂ－Ｉ発現細胞株の折り畳まれていない、または誤って折り畳まれた抗体ＨＣの分解及びクリアランスの遅延または問題に関与していた。興味深いことに、ＣＨＸ処理の前後で、ｍＡｂ－ＩＩ細胞株と比較してｍＡｂ－Ｉで非常に高いレベルの細胞内ＢｉＰを検出した（図１２Ｂ、下部パネル、ＢｉＰ）。シャペロンとしてのＢｉＰは、小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）に加えて抗体ＨＣまたはＬＣの折り畳みにも関与していて、シードトレイン培養におけるその存在は、ＥＲ関連細胞ストレスの指標となり得た。
ｍＡｂ－Ｉ発現に影響を及ぼす根本的な要因を同定するために、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）処理及び除去と共にＤｏｘ誘導を使用して、抗体の分泌、折り畳み及び分解を調査した。これらの実験では、「誘導」培養物をＣＨＸで処理してタンパク質合成を停止させ、５時間後、細胞を洗浄してＤｏｘのみを含有する培地（ＣＨＸ無し）中に再懸濁してタンパク質合成を再開した（図１２Ａ）。ＣＨＸ除去後のおよそ６０分間、これらの培養物の上清中ではＨＣまたはＬＣを検出せず、抗体分泌の漸増だけを１２０分後に同様の割合で検出した（図１２Ｂ、上部パネル）。このことは、適切に折り畳まれ、かつ組み立てられた抗体分子の分泌が、ＣＨＸ除去後のｍＡｂ－Ｉ細胞株とｍＡｂ－ＩＩ細胞株との間で同等であったことを示唆していた。抗体ＬＣの細胞内レベルも、ｍＡｂ－Ｉ発現細胞株とｍＡｂ－ＩＩ発現細胞株との間でかなり同等であった（図１２Ｂ、ＬＣパネル）。しかしながら、ＣＨＸ処理の５時間後であっても、ｍＡｂ－ＩＩ発現株と比較してｍＡｂ－Ｉ発現細胞株で著しく高いレベルの細胞内抗体ＨＣを検出した（図１２Ｂ、ＨＣパネル）。これは、ｍＡｂ－Ｉ発現細胞株の折り畳まれていない、または誤って折り畳まれた抗体ＨＣの分解及びクリアランスの遅延または問題に関与していた。興味深いことに、ＣＨＸ処理の前後で、ｍＡｂ－ＩＩ細胞株と比較してｍＡｂ－Ｉで非常に高いレベルの細胞内ＢｉＰを検出した（図１２Ｂ、下部パネル、ＢｉＰ）。シャペロンとしてのＢｉＰは、小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）に加えて抗体ＨＣまたはＬＣの折り畳みにも関与していて、シードトレイン培養におけるその存在は、ＥＲ関連細胞ストレスの指標となり得た。
【0383】
ｍＡｂ－Ｉ発現と細胞内ＢｉＰ蓄積との間の相関関係をさらに調査するために、「誘導」シードトレイン培養物を、ドキシサイクリンを含有する培地中でＣＨＸと共に、またはそれ無しで一晩処理し、これらの試料中の細胞内ＨＣ、ＬＣ及びＢｉＰレベルを評価した。ＣＨＸ処理を行わない場合、細胞内抗体ＨＣ分子の基底レベルは、ｍＡｂ－ＩＩ細胞株と比較してｍＡｂ－Ｉでより高かったが、細胞内ＬＣのレベルは全ての試料セット間で同等であった。他方では、ＢｉＰレベルは、ｍＡｂ－ＩＩ発現細胞株と比較してｍＡｂ－Ｉで非常に高かった（図１２Ｃ、－ＣＨＸ試料）。これらの培養物をＣＨＸで一晩処理すると、全ての細胞株でＨＣ及びＬＣのレベルが低下し、同様にｍＡｂ－Ｉ発現細胞株で特にＢｉＰレベルが同時に低下した（図１２Ｃ、＋ＣＨＸ試料）。これは、先の知見と一致していた（図１２Ｂ）。シクロヘキシミドは、無差別に全ての真核生物タンパク質の合成を阻害するため、ｍＡｂ－Ｉ細胞株のより高いＢｉＰレベルを、抗体ＨＣまたはＬＣサブユニットの蓄積と直接関連付けることはできなかった。しかしながら、調節された発現システムは、細胞内ＢｉＰと抗体ＨＣまたはＬＣレベルとの間の関連を直接試験する能力を提供した。そのために、ドキシサイクリンを培地から６日間除去し、他の内因性タンパク質の発現に影響を与えることなく特異的に抗体発現を止めて、細胞内ＨＣ、ＬＣ、及びＢｉＰレベルをモニターした。ｍＡｂ－Ｉ細胞株の抗体（ＨＣ及びＬＣ）発現と細胞内ＢｉＰの蓄積との間の直接的かつ特定の関連を観察したが、ｍＡｂ－ＩＩの発現は、細胞内ＢｉＰレベルに対する影響を一切示さなかった（図１２Ｄ）。
【0384】
実施例６：ｍＡｂ－Ｉ ＬＣ発現は細胞内ＢｉＰ蓄積を誘導したが、ｍＡｂ－Ｉ ＨＣも、この抗体の低発現に明確に寄与した
ｍＡｂ－Ｉ ＬＣが細胞内ＢｉＰの蓄積に役割を果たしたかどうかを決定するために、ＬＣを構成的に発現しながら、調節プロモーター下でｍＡｂ－Ｉ ＨＣを発現する構築物を生成した。この構築物を、ｍＡｂ－ＩまたはｍＡｂ－ＩＩ（対照）の調節されたＨＣ／ＬＣを発現する構築物と共にＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、各トランスフェクションから２つの別個のプールを得た。プール力価を産生培養中で評価した（図１３Ａ）一方で、シードトレイン培養物をドキシサイクリンの存在下及び不存在下でウェスタンブロット分析によって評価した（図１３Ｂ）。産生アッセイ中、各プールをＤｏｘで誘導したか、または誘導しないままとした。非誘導プールは、産生中に抗体をほとんど発現せず、これは厳しい発現調節を示していた（図１３Ａ、－Ｄｏｘ）。産生中のＤｏｘ誘導培養物の分析によって、「非誘導」シードトレイン培養物に由来する調節されたＨＣ／構成的ＬＣ ｍＡｂ－Ｉ発現プールは、調節されたＨＣ／ＬＣ ｍＡｂ－Ｉプール及びシードトレイン中に「誘導」した調節されたＨＣ／構成的ＬＣ ｍＡｂ－Ｉプールと比較して、力価が大幅に低かったことが明らかとなった（図１３Ａ）。「非誘導」培養物のウェスタンブロット分析は、全ての条件下でＤｏｘを培地に添加した場合に限り、抗体ＨＣを発現したことを示した。加えて、ｍＡｂ－Ｉ ＨＣを含まないｍＡｂ－Ｉ ＬＣのみの構成的発現は、細胞内ＢｉＰの蓄積を誘導した（図１３Ｂ）。これらの結果は、ｍＡｂ－Ｉ ＬＣサブユニットの発現と細胞内ＢｉＰの蓄積との間の直接的関連を示唆していた。ＨＣの不存在下で構成的に発現した場合、ｍＡｂ－ＩのＬＣ分子は、ＢｉＰシャペロンと相互作用するＥＲ内の折り畳まれていない凝集体を形成する可能性があり、これらの細胞中でＢｉＰの細胞内レベルの増加を引き起こす。産生段階中のｍＡｂ－Ｉ ＨＣの発現は、これらの細胞にさらに負荷をかけ、ＨＣ及びＬＣ分子の両方の折り畳みに対応する細胞内ＢｉＰの需要が高まり、非効率的な抗体のアセンブリ、折り畳み及び分泌効率をもたらし得た（図１３Ａ）。
ｍＡｂ－Ｉ ＬＣが細胞内ＢｉＰの蓄積に役割を果たしたかどうかを決定するために、ＬＣを構成的に発現しながら、調節プロモーター下でｍＡｂ－Ｉ ＨＣを発現する構築物を生成した。この構築物を、ｍＡｂ－ＩまたはｍＡｂ－ＩＩ（対照）の調節されたＨＣ／ＬＣを発現する構築物と共にＣＨＯ細胞にトランスフェクトし、各トランスフェクションから２つの別個のプールを得た。プール力価を産生培養中で評価した（図１３Ａ）一方で、シードトレイン培養物をドキシサイクリンの存在下及び不存在下でウェスタンブロット分析によって評価した（図１３Ｂ）。産生アッセイ中、各プールをＤｏｘで誘導したか、または誘導しないままとした。非誘導プールは、産生中に抗体をほとんど発現せず、これは厳しい発現調節を示していた（図１３Ａ、－Ｄｏｘ）。産生中のＤｏｘ誘導培養物の分析によって、「非誘導」シードトレイン培養物に由来する調節されたＨＣ／構成的ＬＣ ｍＡｂ－Ｉ発現プールは、調節されたＨＣ／ＬＣ ｍＡｂ－Ｉプール及びシードトレイン中に「誘導」した調節されたＨＣ／構成的ＬＣ ｍＡｂ－Ｉプールと比較して、力価が大幅に低かったことが明らかとなった（図１３Ａ）。「非誘導」培養物のウェスタンブロット分析は、全ての条件下でＤｏｘを培地に添加した場合に限り、抗体ＨＣを発現したことを示した。加えて、ｍＡｂ－Ｉ ＨＣを含まないｍＡｂ－Ｉ ＬＣのみの構成的発現は、細胞内ＢｉＰの蓄積を誘導した（図１３Ｂ）。これらの結果は、ｍＡｂ－Ｉ ＬＣサブユニットの発現と細胞内ＢｉＰの蓄積との間の直接的関連を示唆していた。ＨＣの不存在下で構成的に発現した場合、ｍＡｂ－ＩのＬＣ分子は、ＢｉＰシャペロンと相互作用するＥＲ内の折り畳まれていない凝集体を形成する可能性があり、これらの細胞中でＢｉＰの細胞内レベルの増加を引き起こす。産生段階中のｍＡｂ－Ｉ ＨＣの発現は、これらの細胞にさらに負荷をかけ、ＨＣ及びＬＣ分子の両方の折り畳みに対応する細胞内ＢｉＰの需要が高まり、非効率的な抗体のアセンブリ、折り畳み及び分泌効率をもたらし得た（図１３Ａ）。
【0385】
これらの知見が、細胞内ＢｉＰの蓄積によって示されるように、ｍＡｂ－Ｉ ＬＣ発現と細胞ＥＲストレスとの間の関連を示していたが、ｍＡｂ－Ｉ ＬＣ発現とｍＡｂ－Ｉ細胞株の低力価との間の直接的関連を確立する必要があった。そのために、抗体分子を生成したが、それはｍＡｂ－Ｉ及びｍＡｂ－ＩＩの重鎖及び軽鎖を交換して、ＨＣＩＬＣＩ、ＨＣＩＩＬＣＩＩ、ＨＣＩＬＣＩＩ、及びＨＣＩＩＬＣＩ抗体の組合せを生成した。ＨＣＩＬＣＩＩ構築物は、ｍＡｂ－Ｉ ＨＣ及びｍＡｂ－ＩＩ ＬＣを有する抗体を発現したが、ＨＣＩＩＬＣＩ構築物は、ｍＡｂ－ＩＩ ＨＣ及びｍＡｂ－Ｉ ＬＣを有する抗体を発現した。これらの全ての構築物に関する抗体ＨＣ及びＬＣ発現は、ＲＴＩベクターシステムにおいてＣＭＶ－ＴＯプロモーターの制御下にあった（図１３Ｃ）。次いで、これらの構築物を発明者らのＣＨＯ ＴＩ宿主細胞にトランスフェクトし、各構築物ごとに２つの別個のＲＴＩプールを生成し、ｍＡｂ－Ｉ、もしくはｍＡｂ－ＩＩ、またはこれらの抗体のハイブリッド型の発現を試験した。先に言及した通り（図１３Ｂ）、ｍＡｂ－Ｉ ＬＣ発現と細胞内ＢｉＰの蓄積との間に明確で直接的な相関関係を観察した（図１３Ｄ、ＬＣ及びＢｉＰブロット）。興味深いことに、細胞内ＢｉＰはまた、ＨＣＩＩＬＣＩＩと比較してＨＣＩＬＣＩＩハイブリッド抗体を発現するプール中で決して強くはないが、顕著な手法で蓄積し、これらのプール中で、ＨＣＩの発現に起因する可能性がある、ある程度のレベルのＥＲストレスを示唆していた（図１３Ｄ、ＨＣＩＩＬＣＩＩ及びＨＣＩＬＣＩ試料中での長時間曝露ＢｉＰレベルを比較）。Ｄｏｘ除去による抗体発現の停止によって、ｍＡｂ－ＩＩ（ＨＣＢＬＣＢ）プールを除く全てのＲＴＩプールで細胞内ＢｉＰレベルの低下がもたらされ、Ｄｏｘ除去前であっても細胞内ＨＣ及びＢｉＰの両方の初期レベルが、大幅に低下した（図１３Ｄ、ＨＣＩＩＬＣＩＩプールと他のプールの０日目のＨＣ及びＢｉＰレベルを比較）。
【0386】
抗体発現全体に対するｍＡｂ－Ｉ ＨＣ及びＬＣの役割を評価するために、ＨＣＩＬＣＩ、ＨＣＩＩＬＣＩＩ、ＨＣＩＬＣＩＩ、及びＨＣＩＩＬＣＩＲＴＩプールを産生アッセイで評価した。ドキシサイクリンの不存在下では、全てのＲＴＩプールがほとんど抗体を発現せず、抗体発現の厳しい調節を示していた（図１４Ａ、－Ｄｏｘ）。全てのＲＴＩプールの増殖率は類似していて、誘導培養物は、非誘導培養物と比較してわずかに低い増殖率を有していた（図１４Ｂ）。先に観察した通り、ｍＡｂ－Ｉ及びｍＡｂ－ＩＩ ＲＴＩプールは、それぞれ最低及び最高の力価及び比生産性を有した（図１４Ａ及び図１４Ｃ）。興味深いことに、ＨＣＩＩＬＣＩ及びＨＣＩＬＣＩＩＲＴＩプールの両方が、ＨＣＩＬＣＩよりも高かったが、ＨＣＩＩＬＣＩＩＲＴＩプールよりは低い力価及び比生産性を示した（図１４Ａ及び図１４Ｃ）。これらの結果は、ｍＡｂ－Ｉ ＨＣ及びＬＣサブユニットの両方が、ｍＡｂ－ＩＩと比較して、この抗体の発現低下に個別に寄与していたことを示していた。発明者らの予想に反して、ＬＣＩサブユニットを発現したハイブリッドＲＴＩプールは、ＨＣＩサブユニットを発現するプールと比較して、わずかに高い力価及び比生産性を有した（図１４Ａ及び図１４Ｃ）。これは、ｍＡｂ－Ｉ ＨＣが、ＬＣサブユニットと比較して、この抗体の発現低下にわずかにより重要な役割を果たしたことを示していた。ＲＴＩシステムと組み合わせた抗体鎖交換アプローチの使用によって、生物学的ストレス（細胞内ＢｉＰ蓄積など）の明確な指標を特定できなかった場合であっても、ｍＡｂ－Ｉ ＨＣサブユニットの発現と関連する負の効果が明らかとなった。
【0387】
実施例７：ｍＡｂ－Ｉ及びｍＡｂ－ＩＩのＨＣ及びＬＣサブユニット間のアミノ酸配列の違い
ある特定のアミノ酸残基が、ｍＡｂ－Ｉ ＨＣ及びＬＣの問題となる発現に寄与する可能性があるかどうかを評価するために、ｍＡｂ－Ｉ及びｍＡｂ－ＩＩのＬＣ（図１５Ａ）及びＨＣ（図１５Ｂ）サブユニットのアミノ酸配列をアラインメントした。ｍＡｂ－Ｉ及びｍＡｂ－ＩＩのＨＣ及びＬＣ分子に関する全てのＣＤＲ領域のアミノ酸組成は、それらが異なる抗原を標的とするように開発されたため、互いに異なっていた。ＬＣサブユニットでは、可変領域の残部及び全ての定常領域について、ｍＡｂ－Ｉ分子とｍＡｂ－ＩＩ分子との間にアミノ酸配列差は全くない。ＬＣＩのＣＤＲ１セグメントは、ＬＣＩＩよりも６アミノ酸長いが、ＬＣＩＩのＣＤＲ３セグメントは、ＬＣＩよりも１アミノ酸長い（図１５Ａ）。抗体ＨＣサブユニットに関しては、ＣＤＲセグメントを除き、４つのアミノ酸残基を除いて、ＨＣＩ及びＨＣＩＩの可変領域の残部及び定常領域は同一である（図１５Ｂ）。これらのアミノ酸変化のうち２つはかなり保守的であり（Ｔ→Ｓ及びＬ→Ａ）、それゆえＨＣＩの低発現に寄与する可能性はない。ＨＣＩのＮ→Ｇ変化によって、抗体ＨＣグリコシル化が防止される。したがって、ＨＣＩの発現に対するＨＣＩＩとＨＣＩとの間のＮ→Ｇ及びＹ→Ｖアミノ酸差の影響を調査した。２つの点変異が生成され、ＨＣＩのＧ及びＶアミノ酸残基が、それぞれＮ及びＹに変化した（ＨＣＡ二重変異体またはＨＣＩｄｍ）。ＨＣＩｄｍをＬＣＩ及びＬＣＩＩと共に使用してＲＴＩプールを生成し、これらのプール中での抗体発現を産生培養中で評価した（図１６Ａ）。その結果、ＨＣＩｄｍをＬＣＩと共に共発現したことにより、抗体発現をＨＣＩＩＬＣＩＩで観察したレベルまで増加させたことが分かり、このことは、これらの変異がＨＣＡ抗体の低発現レベルを回復できることを示唆していた（図１６Ａ）。興味深いことに、ＬＣＩＩと共発現した場合、ＨＣＩｄｍはＨＣＩＩＬＣＩＩの力価よりもさらに高い力価を達成し、このことは、ＨＣＩｄｍがＨＣＩＩと比較して発現及び折り畳みに優れていることを示唆していた（図１６Ａ）。先に観察した通り、ＨＣＩＬＣＩが最も低い力価を有した一方で、ＨＣＩＬＣＩＩは中間の抗体発現プロファイルを示した（図１６Ａ）。ウェスタンブロット分析により、ＨＣＩｄｍと共発現させた場合であっても、ＬＣＩの発現が、依然として細胞内ＢｉＰ蓄積の増加と関連していたことが明らかとなった（図１６Ｂ）。図１６Ｃは、ＲＴＩシステムを使用して、発現困難な分子を発現する細胞株における問題の原因を分析かつ特定し得る方法の診断ロードマップを示す。
ある特定のアミノ酸残基が、ｍＡｂ－Ｉ ＨＣ及びＬＣの問題となる発現に寄与する可能性があるかどうかを評価するために、ｍＡｂ－Ｉ及びｍＡｂ－ＩＩのＬＣ（図１５Ａ）及びＨＣ（図１５Ｂ）サブユニットのアミノ酸配列をアラインメントした。ｍＡｂ－Ｉ及びｍＡｂ－ＩＩのＨＣ及びＬＣ分子に関する全てのＣＤＲ領域のアミノ酸組成は、それらが異なる抗原を標的とするように開発されたため、互いに異なっていた。ＬＣサブユニットでは、可変領域の残部及び全ての定常領域について、ｍＡｂ－Ｉ分子とｍＡｂ－ＩＩ分子との間にアミノ酸配列差は全くない。ＬＣＩのＣＤＲ１セグメントは、ＬＣＩＩよりも６アミノ酸長いが、ＬＣＩＩのＣＤＲ３セグメントは、ＬＣＩよりも１アミノ酸長い（図１５Ａ）。抗体ＨＣサブユニットに関しては、ＣＤＲセグメントを除き、４つのアミノ酸残基を除いて、ＨＣＩ及びＨＣＩＩの可変領域の残部及び定常領域は同一である（図１５Ｂ）。これらのアミノ酸変化のうち２つはかなり保守的であり（Ｔ→Ｓ及びＬ→Ａ）、それゆえＨＣＩの低発現に寄与する可能性はない。ＨＣＩのＮ→Ｇ変化によって、抗体ＨＣグリコシル化が防止される。したがって、ＨＣＩの発現に対するＨＣＩＩとＨＣＩとの間のＮ→Ｇ及びＹ→Ｖアミノ酸差の影響を調査した。２つの点変異が生成され、ＨＣＩのＧ及びＶアミノ酸残基が、それぞれＮ及びＹに変化した（ＨＣＡ二重変異体またはＨＣＩｄｍ）。ＨＣＩｄｍをＬＣＩ及びＬＣＩＩと共に使用してＲＴＩプールを生成し、これらのプール中での抗体発現を産生培養中で評価した（図１６Ａ）。その結果、ＨＣＩｄｍをＬＣＩと共に共発現したことにより、抗体発現をＨＣＩＩＬＣＩＩで観察したレベルまで増加させたことが分かり、このことは、これらの変異がＨＣＡ抗体の低発現レベルを回復できることを示唆していた（図１６Ａ）。興味深いことに、ＬＣＩＩと共発現した場合、ＨＣＩｄｍはＨＣＩＩＬＣＩＩの力価よりもさらに高い力価を達成し、このことは、ＨＣＩｄｍがＨＣＩＩと比較して発現及び折り畳みに優れていることを示唆していた（図１６Ａ）。先に観察した通り、ＨＣＩＬＣＩが最も低い力価を有した一方で、ＨＣＩＬＣＩＩは中間の抗体発現プロファイルを示した（図１６Ａ）。ウェスタンブロット分析により、ＨＣＩｄｍと共発現させた場合であっても、ＬＣＩの発現が、依然として細胞内ＢｉＰ蓄積の増加と関連していたことが明らかとなった（図１６Ｂ）。図１６Ｃは、ＲＴＩシステムを使用して、発現困難な分子を発現する細胞株における問題の原因を分析かつ特定し得る方法の診断ロードマップを示す。
【0388】
実施例８：２つの異なる独立したランディングパッドを含有するＴＩ宿主細胞の生成。
宿主８は、２つの異なる独立したランディングパッドを含有する標的組込み（ＴＩ）宿主であり、これは抗体遺伝子の発現を個別に、または同時に標的化し得る。宿主８の親細胞株は、単一のランディングパッドを含有する宿主７（表２を参照のこと）である。第２ランディングパッドを、ランディングパッドが宿主４ＴＩ宿主中に位置するゲノム位置で宿主８に挿入した（表２を参照のこと）。この挿入を、宿主７ＴＩ宿主内における宿主４ＴＩ部位位置への新しいランディングパッドのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくノックインによって実施した。
宿主８は、２つの異なる独立したランディングパッドを含有する標的組込み（ＴＩ）宿主であり、これは抗体遺伝子の発現を個別に、または同時に標的化し得る。宿主８の親細胞株は、単一のランディングパッドを含有する宿主７（表２を参照のこと）である。第２ランディングパッドを、ランディングパッドが宿主４ＴＩ宿主中に位置するゲノム位置で宿主８に挿入した（表２を参照のこと）。この挿入を、宿主７ＴＩ宿主内における宿主４ＴＩ部位位置への新しいランディングパッドのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくノックインによって実施した。
【0389】
これを達成するために、宿主４ＴＩ部位のゲノム領域を、ＴＩ宿主４及びＴＩ宿主７内で特徴付けた。この情報に基づいて、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくノックインを促進するために、この特定のゲノム領域を標的とするようにガイドＲＮＡを構築した。別に、新たに作製したランディングパッドを含有するドナープラスミドをこの部位にノックインするように生成し、ノックインを促進するために標的ノックイン部位の上流及び下流のゲノム領域に対応する相同性アーム、ならびにノックインクローンのスクリーニングを可能にする追加の遺伝子と共に構築した。ｇＲＮＡ及びＣａｓ９の遺伝子を含有するプラスミド、ならびにドナープラスミドの共トランスフェクションを、新しいランディングパッドのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくノックインを促進するために実施した。
【0390】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９に基づくノックインを受けたクローンの選択及びスクリーニング後、宿主８を最終的に同定し、さらに評価を行った。既存の宿主７ランディングパッドをインタクトであると決定し、宿主４部位位置に新しくノックインしたランディングパッドが存在し、インタクトであり、かつ正しい位置にあるかも確認した。
【0391】
次いで、両部位でのリコンビナーゼ媒介カセット交換（ＲＭＣＥ）の実現可能性を、各部位について個別に評価し、次いで同時に評価した。クローンを、宿主７のランディングパッドのみ、宿主４のランディングパッドのみ、及び両部位で同時にＲＭＣＥによって生成し、次いで１４日間の流加振盪フラスコ評価で評価した。両部位で同時に抗体を発現するクローンの力価及び比生産性は、各部位での個別の発現と比較して高かった。異なる細胞培養プロセスの細胞培養プラットフォームＢでさらに評価を実施し、細胞培養プラットフォームＡと比較して全てのクローンで力価がさらに上昇したことを示した（図１７）。宿主４部位の１４日目の平均力価は、プラットフォームＡ細胞培養において３．０ｇ／Ｌであって、宿主７部位は１．９ｇ／Ｌであって、両部位は同時に３．９ｇ／Ｌであった。
【0392】
最終的に、ＴＩ宿主８を、ＴＩ宿主４のランディングパッドのゲノム位置に位置する第２ランディングパッドを追加することによってＴＩ宿主７から作製した。さらなる調査によって、ランディングパッドのノックイン及び既存かつ新規の両方のランディングパッドにおけるＲＭＣＥの実現可能性を確認する。さらに、宿主８から生成したクローンを各部位で個別に、かつ両部位で同時に評価すると、抗体発現の生産性が示される。個々の部位と対比して、両部位で同時に抗体遺伝子を発現することは、細胞培養プラットフォームＡ及び細胞培養プラットフォームＢの両方に見られる生産性の相加効果を有する（図１７）。
【0393】
方法
抗体プラスミドＤＮＡ構築物構成：１プラスミド抗体構築物を構築するために、抗体ＨＣ及びＬＣ断片を、Ｌ３及び２Ｌ配列に加えてピューロマイシンＮ－アセチル－トランスフェラーゼ（ｐａｃ）選択マーカーを含有するベクター骨格にクローニングした。２プラスミド抗体構築物を構築するために、抗体ＨＣ及びＬＣ断片を、Ｌ３及びＬｏｘＦＡＳ配列を含有する前方ベクター骨格、ならびにＬｏｘＦＡＳ及び２Ｌ配列ならびにｐａｃ選択マーカーを含有する後方ベクターにクローニングした。ＣｒｅリコンビナーゼプラスミドｐＯＧ２３１（Ｗｏｎｇ ＥＴ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２００５，３３，（１７），ｅ１４７、Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １９９７，９４，（２６），１４６０２－７、各々の内容が参照によって本明細書に組み込まれる）を、全てのＲＭＣＥプロセスに使用した。
抗体プラスミドＤＮＡ構築物構成：１プラスミド抗体構築物を構築するために、抗体ＨＣ及びＬＣ断片を、Ｌ３及び２Ｌ配列に加えてピューロマイシンＮ－アセチル－トランスフェラーゼ（ｐａｃ）選択マーカーを含有するベクター骨格にクローニングした。２プラスミド抗体構築物を構築するために、抗体ＨＣ及びＬＣ断片を、Ｌ３及びＬｏｘＦＡＳ配列を含有する前方ベクター骨格、ならびにＬｏｘＦＡＳ及び２Ｌ配列ならびにｐａｃ選択マーカーを含有する後方ベクターにクローニングした。ＣｒｅリコンビナーゼプラスミドｐＯＧ２３１（Ｗｏｎｇ ＥＴ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２００５，３３，（１７），ｅ１４７、Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ Ｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １９９７，９４，（２６），１４６０２－７、各々の内容が参照によって本明細書に組み込まれる）を、全てのＲＭＣＥプロセスに使用した。
【0394】
細胞培養：ＣＨＯ細胞を、１２５ｍＬの振盪フラスコ容器中における独自のＤＭＥＭ／Ｆ１２ベースの培地中で、１５０ｒｐｍ、３７℃及び５％ＣＯ２で振盪して培養した。細胞を、３～４日ごとに３×１０５細胞／ｍＬの播種密度で継代した。
【0395】
ＲＭＣＥの安定した細胞株開発：発現プラスミドを、ＭａｘＣｙｔｅ ＳＴＸ（登録商標）エレクトロポレーション（ＭａｘＣｙｔｅ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）によってＴＩ宿主にトランスフェクトした。次いで、ＲＭＣＥトランスフェクションプールを、ピューロマイシン及び１－（２’－デオキシ－２’－フルオロ－１－ベータ－Ｄ－アラビノフラノシル－５－ヨード）ウラシル（ＦＩＡＵ）（Ｍｏｒａｖｅｋ）で選択した。プール選択後、単一細胞クローニング（ＳＣＣ）を実施し、ＴＩ細胞株をさらに評価するために生成した。
【0396】
流加産生アッセイ：流加産生培養を、独自の化学的に規定した産生培地を用いて振盪フラスコまたはａｍｂｒ１５容器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ）中で実施した。細胞を０日目に１×１０６細胞／ｍｌで播種し、３日目に３７℃から３５℃に温度を変えた。培養物に、３日目、７日目、及び１０日目に独自のフィード培地を加えた。培養細胞の生細胞数（ＶＣＣ）及びパーセント生存能を、Ｖｉ－Ｃｅｌｌ（商標）ＸＲ機器（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して、０日目、３日目、７日目、１０日目、及び１４日目に測定した。グルコース及び乳酸濃度を、Ｂｉｏｐｒｏｆｉｌｅ ４００ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｎｏｖａ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を使用して、７日目、１０日目及び１４日目に測定した。１４日目の力価を、ＵＶ検出を用いたプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して決定した。
【0397】
液滴ＰＣＲによる遺伝子コピー数の決定：液滴ＰＣＲアッセイを、ｄｄＰＣＲ（商標）Ｓｕｐｅｒｍｉｘキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して実施した。ｄｄＰＣＲマスターミックス、９００ｎＭのフォワードプライマー、９００ｎＭのリバースプライマー、２５０ｕＭのプローブ、３単位のＨａｅＩＩＩ制限酵素及び試料ＤＮＡを含有する各ｄｄＰＣＲ反応物。室温で１０分間インキュベートした後、液滴をＡｕｔｏｍａｔｉｃ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で生成した。ＰＣＲ熱サイクル条件は、９５℃で１０分間、続いて９４℃を３０秒間及び６０℃を１分間の４０サイクル、次いで９８℃を１０分間で酵素を不活性化させた。ＰＣＲ反応後、液滴をＱＸ２００（商標）Ｄｒｏｐｌｅｔ ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上で読み取った。データを、Ｑｕａｎｔａｓｏｆｔｗａｒｅを使用して収集かつ分析した。ＨＣ及びＬＣ遺伝子コピー数を、参照遺伝子Ｂａｘ、アルブミン、Ｈｐｒｔ及びｂ－ミクログロブリンの規定コピー数に基づいて正規化した。この実験で使用したプライマーは、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｖ３．０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して設計した。プライマーの配列を表４に列挙する。
表４．液滴ＰＣＲのプライマー配列。
表４．液滴ＰＣＲのプライマー配列。
【0398】
定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ－ＰＣＲまたはＴａｑｍａｎ）分析：シードトレイン培養物からのＲＮＡ試料を、製造業者の指示に従ってＱｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙ ｐｌｕｓ ｍｉｎｉ ｋｉｔを使用して精製した。ＴａｑＭａｎ ＲＴ－ＰＣＲアッセイを、ＴａｑＭａｎ Ｏｎｅ（登録商標）Ｓｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ ｍｉｘ ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して実施した。各ＲＴ－ＴａｑＭａｎ ＰＣＲ反応物は、ＲＴ－ＰＣＲマスターミックス、逆転写酵素、３００ｎＭのフォワードプライマー、３００ｎＭのリバースプライマー、１００ｎＭのプローブ、及び１０ｎｇの精製ＲＮＡ試料を含有していた。熱サイクル条件は、４８℃で３０分間及び９５℃で１０分間、続いて９５℃を１５秒間及び６０℃を１分間の４０サイクルであった。全ての反応物を、７９００ ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で処理した。データを、ＴａｑＭａｎ ＲＴ－ＰＣＲ増幅後にＳＤＳ ｖ２．４ソフトウェア（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して分析した。ＨＣ及びＬＣの相対的発現レベルを、デルタＣｔ分析法に基づいて決定した。ハウスキーピング遺伝子であるシクロフィリンの発現レベルを参照遺伝子として使用し、各反応物で異なるＲＮＡ試料を正規化した。この実験で使用したプライマーは、ｐｒｉｍｅｒ ｅｘｐｒｅｓｓ ｖ３．０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して設計した。プライマーの配列を表５に列挙する。
表５．定量的リアルタイムＰＣＲのプライマー配列
表５．定量的リアルタイムＰＣＲのプライマー配列
【0399】
ウェスタンブロット分析：シードトレイン培養物からの細胞ペレットをＰＢＳで洗浄し、プロテアーゼ阻害剤のｍｉｎｉ ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含むＮＰ－４０溶解緩衝液中に再懸濁した。細胞溶解物を１３０００ＲＰＭで１０分間遠心分離し、上清を収集した。各溶解物のタンパク質濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して決定した。等しいタンパク質濃度の各溶解物を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ緩衝液及びＮｕＰａｇｅ Ｓａｍｐｌｅ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と混合してから、５分間９５℃で熱変性させた。次いで、溶解物をＮｕＰａｇｅプレキャスト４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上に負荷して電気泳動した。ｉＢｌｏｔシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、タンパク質をニトロセルロース膜に移した。膜を、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するｔｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ－Ｔ）中の５％脱脂乳溶液を使用して、室温で１時間ブロックした。ブロック後、特異的一次抗体を使用して膜を室温で１時間インキュベートし、次いでＴＢＳ－Ｔで１０分間３回洗浄した。二次西洋ワサビペルオキシダーゼ複合化抗体を室温で１時間添加し、続いてＴＢＳ－Ｔで１５分間の洗浄を３回行った。Ａｍｅｒｓｈａｍ ＥＣＬ検出試薬またはＡｍｅｒｓｈａｍ ＥＣＬ Ｐｒｉｍｅ検出試薬（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）のいずれかを使用して、膜で発現させた。Ｉｍａｇｅ Ｌａｂ５．１（Ｂｉｏｒａｄ）をバンドシグナルの定量化に使用した。以下の一次抗体を使用した：１：３０００のヤギ抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰ（ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）及び１：２５００のマウス抗βアクチン（Ｓｉｇｍａ Ａｌｒｄｉｃｈ）。以下の二次抗体を使用した：１：１００００のヒツジ抗マウス（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＵＫ）。
【0400】
実施例９：１本の重鎖、１本の軽鎖プラスミドＤＮＡ構成への追加の軽鎖付加は、抗体力価及び比生産性を改善する。
ＴＩ宿主の生産性に対する抗体コピー数の影響を調査するために、ＲＭＣＥプールを、１本の重鎖及び１本の軽鎖（ＨＬ構成）または１本の重鎖及び２本の軽鎖（ＨＬＬ構成）のいずれかを含有する単一プラスミドをトランスフェクトすることによって生成した。フローサイトメトリーによるＲＭＣＥの選択、回収、及び検証後、プールの生産性を１４日間の流加産生アッセイで評価した。３つの別個の抗体（ｍＡｂ－Ｑ、ｍＡｂ－Ｓ、及びｍＡｂ－Ｔ）では、ＨＬプールと比較してＨＬＬプールの力価がおよそ２倍増加したことを観察し、主に比生産性の１．５～２．５倍の増加によって引き起こされた（図１８Ａ及び図１８Ｂ）。追加の単一細胞クローンを、限界希釈法を使用することによってトランスフェクトプールから生成し、力価及び比生産性が、ＨＬ構成のものよりもＨＬＬ構成由来のクローンでも高いことを確認した（図１８Ｃ、図１８Ｄ）。
ＴＩ宿主の生産性に対する抗体コピー数の影響を調査するために、ＲＭＣＥプールを、１本の重鎖及び１本の軽鎖（ＨＬ構成）または１本の重鎖及び２本の軽鎖（ＨＬＬ構成）のいずれかを含有する単一プラスミドをトランスフェクトすることによって生成した。フローサイトメトリーによるＲＭＣＥの選択、回収、及び検証後、プールの生産性を１４日間の流加産生アッセイで評価した。３つの別個の抗体（ｍＡｂ－Ｑ、ｍＡｂ－Ｓ、及びｍＡｂ－Ｔ）では、ＨＬプールと比較してＨＬＬプールの力価がおよそ２倍増加したことを観察し、主に比生産性の１．５～２．５倍の増加によって引き起こされた（図１８Ａ及び図１８Ｂ）。追加の単一細胞クローンを、限界希釈法を使用することによってトランスフェクトプールから生成し、力価及び比生産性が、ＨＬ構成のものよりもＨＬＬ構成由来のクローンでも高いことを確認した（図１８Ｃ、図１８Ｄ）。
【0401】
実施例１０：ＲＭＣＥプールにおける最大７つの抗体鎖によるトランスフェクションは、抗体の比生産性及び力価を増加させる。
抗体の発現に対する抗体鎖数増加の効果を評価した。５つの抗体について、ＨＬＬ単一プラスミド構成をＨＬＬ－ＨＬまたはＨＬＬ－ＨＬＬ二重プラスミド構成と比較した。
抗体の発現に対する抗体鎖数増加の効果を評価した。５つの抗体について、ＨＬＬ単一プラスミド構成をＨＬＬ－ＨＬまたはＨＬＬ－ＨＬＬ二重プラスミド構成と比較した。
【0402】
ｍＡｂ ＹのＨＬＬ－ＨＬ（５鎖）、ＨＬＬ－ＨＬＬ（６鎖）及びＨＬＬ－ＨＬＨＬ（７鎖）構成を比較した。産生中のＲＭＣＥプールの力価及びＱｐは、一般にＨＬＬ－ＨＬ構成からＨＬＬ－ＨＬＬ及びＨＬＬ－ＨＬＨＬ構成へと増加した（図１９Ａ、図１９Ｂ）が、異なるプールの中でも増殖（生細胞数の積分、ＩＶＣＣとして表される）は相対的に同等であった（図１９Ｃ）。これらのプールにおけるシードトレイン抗体ｍＲＮＡ発現を見ると、ＨＬＬ－ＨＬからＨＬＬ－ＨＬＬ及びＨＬＬ－ＨＬＨＬへの軽鎖ｍＲＮＡの増加に加えて、ＨＬＬ－ＨＬ及びＨＬＬ－ＨＬＬプールと比較したＨＬＬ－ＨＬＨＬプールでの重鎖ｍＲＮＡの増加を観察した（図１９Ｄ）。これらのＲＭＣＥプールからの重鎖及び軽鎖の細胞内タンパク質レベルも、ウェスタンブロットを使用して測定した。細胞内軽鎖タンパク質レベルは、軽鎖ｍＲＮＡで観察したものと非常に一致し、５つから６つ及び７つの鎖構成へと増加した（図１９Ｅ、図１９Ｆ）。
【0403】
実施例１１：７鎖のＨＬＬ－ＨＬＨＬ構成を有する単一細胞クローンは、２つの試験抗体において高い力価及び比生産性を有する。
７鎖構成ＨＬＬ－ＨＬＨＬの高い力価及び生産性が、単一細胞クローニング後に維持されるかどうかを評価するために、ｍＡｂ ＹのＨＬＬ－ＨＬ、ＨＬＬ－ＨＬＬ、及びＨＬＬ－ＨＬＨＬ ＲＭＣＥプールから単一細胞単クローンを生成した。次いで、これらの単クローンを１４日間の流加産生アッセイで評価した。各構成の上位６クローンを見ると、力価及びＱｐが、ＨＬＬ－ＨＬ構成からＨＬＬ－ＨＬＬ及びＨＬＬ－ＨＬＨＬへとわずかに増加した（図２０Ａ、図２０Ｂ）が、増殖は同様のままであった（図２０Ｃ）ことが見出された。
７鎖構成ＨＬＬ－ＨＬＨＬの高い力価及び生産性が、単一細胞クローニング後に維持されるかどうかを評価するために、ｍＡｂ ＹのＨＬＬ－ＨＬ、ＨＬＬ－ＨＬＬ、及びＨＬＬ－ＨＬＨＬ ＲＭＣＥプールから単一細胞単クローンを生成した。次いで、これらの単クローンを１４日間の流加産生アッセイで評価した。各構成の上位６クローンを見ると、力価及びＱｐが、ＨＬＬ－ＨＬ構成からＨＬＬ－ＨＬＬ及びＨＬＬ－ＨＬＨＬへとわずかに増加した（図２０Ａ、図２０Ｂ）が、増殖は同様のままであった（図２０Ｃ）ことが見出された。
【0404】
ＨＬＬ－ＨＬＨＬ構成が高い単クローン力価をもたらすことを確認するために、異なるｍＡｂであるｍＡｂ ＩＩＩを使用して、ＨＬＬ－ＨＬ（５鎖）及びＨＬＬ－ＨＬＨＬ（７鎖）のＲＭＣＥプールから、宿主４に由来する単一細胞クローンを生成した。１４日間の流加産生アッセイでの評価後、ＨＬＬ－ＨＬクローンに対するＨＬＬ－ＨＬＨＬクローンの明確な力価の利点を観察し（図２０Ｄ）、それはｍＡｂ Ｕで見られたものよりも高かった。力価増加は、ＨＬＬ－ＨＬＨＬクローンのＱｐがより高いことによって主として誘導されると思われ（図２０Ｅ）、２つの構成間におけるＩＶＣＣの平均差はほとんどなかった（図２０Ｆ）。
【0405】
実施例１２：トランスフェクトプラスミドにおける抗体鎖の位置は、その生産性に影響を及ぼす。
トランスフェクトプラスミドにおける重鎖及び軽鎖の位置または配置が、抗体発現に及ぼす影響も評価した。これを行うために、ＲＭＣＥプールを、ｍＡｂ Ｚの１本の重鎖及び１本の軽鎖を持ついくつかの異なる構成を含有するプラスミドで生成した。本開示のＴＩ宿主は、同じ組込み部位における２つの異なるプラスミドの組込みを支援するため、重鎖及び軽鎖の両方が同じプラスミドから発現される場合に加えて、それらが前方または後方のいずれか異なるプラスミド上で分離されている場合の位置効果を調査した（図２１Ａ）。
トランスフェクトプラスミドにおける重鎖及び軽鎖の位置または配置が、抗体発現に及ぼす影響も評価した。これを行うために、ＲＭＣＥプールを、ｍＡｂ Ｚの１本の重鎖及び１本の軽鎖を持ついくつかの異なる構成を含有するプラスミドで生成した。本開示のＴＩ宿主は、同じ組込み部位における２つの異なるプラスミドの組込みを支援するため、重鎖及び軽鎖の両方が同じプラスミドから発現される場合に加えて、それらが前方または後方のいずれか異なるプラスミド上で分離されている場合の位置効果を調査した（図２１Ａ）。
【0406】
ＲＭＣＥプールを生成した後、シードトレイン培養物における抗体Ｚ重鎖及び軽鎖のｍＲＮＡ発現レベルを測定した。重鎖のｍＲＮＡ発現は、重鎖よりも軽鎖が先行した場合に減少し、前方及び後方の両プラスミドのＬＨ構成は、ＨＬ構成よりも低い重鎖ｍＲＮＡ発現を有していた。しかしながら、軽鎖に対する位置の効果は、それが発現されたプラスミドに依存した：前方プラスミドでは、軽鎖ｍＲＮＡの発現は、ＨＬに対してＬＨ構成で増加したが、後方プラスミドのＬＨ構成も増加した。前方プラスミドの軽鎖カセットはそれ自体で高レベルの軽鎖ｍＲＮＡを発現したが、後方プラスミドの単一軽鎖カセットは、あらゆる構成の中で最も低い軽鎖ｍＲＮＡレベルを有したことも観察した（図２１Ｂ）。概して、前方プラスミドと比較して、後方プラスミドでは重鎖及び軽鎖の両方のｍＲＮＡ発現レベルが低かったことを観察した。
【0407】
これらの異なるＲＭＣＥプールの流加産生アッセイにより、抗体ｍＲＮＡ発現の傾向に類似した一連の力価及び比生産性が得られた（図２１Ｃ、図２１Ｄ）。ＬＨ－ｍＡｂ無し構成は、ＨＬ－ｍＡｂ無しよりも高いＱｐ及び力価を有していたが、最も低いレベルのＬＣ ｍＲＮＡ発現を有するプールのＨ－Ｌ及びｍＡｂ無し－ＬＨもまた、最も低いＱｐ及び力価を有した。
【0408】
観測したｍＲＮＡ及び抗体の生産性の違いが抗体鎖の位置に起因するものであり、絶対コピー数の変動によるものではないことを確認するために、デジタル液滴ＰＣＲを使用してプールの重鎖及び軽鎖コピー数を測定した。予想通り、全てのプールがおよそ１本の重鎖及び１本の軽鎖ＤＮＡコピーを有した（図２１Ｅ）。
【0409】
実施例１３：ｍＡｂ上の％高分子量種に対するＨＣ対ＬＣ比の影響。
抗体のＨＣ：ＬＣ比が生産性及び凝集体などの高分子量種（ＨＭＷＳ）に及ぼす影響を評価した。さらに、ＴＩ部位に対する影響を、異なるＴＩ部位を有する細胞を使用することによって評価した。これを行うために、ＲＭＣＥプールを、ＴＩ宿主４または宿主７の位置に１本の重鎖及び１本の軽鎖（ＨＬ構成）または１本の重鎖及び２本の軽鎖（ＨＬＬ構成）のいずれかを含有する単一プラスミドをトランスフェクトすることによって生成した。プールの生産性を、１４日間の流加産生アッセイで評価した（図２２Ａ及び図２２Ｂ）。％ＨＭＷＳを評価すると（図２２Ｂ及び図２２Ｄ）、ＨＣ：ＬＣ比の影響が組込み部位に依存しないことを示していた。
抗体のＨＣ：ＬＣ比が生産性及び凝集体などの高分子量種（ＨＭＷＳ）に及ぼす影響を評価した。さらに、ＴＩ部位に対する影響を、異なるＴＩ部位を有する細胞を使用することによって評価した。これを行うために、ＲＭＣＥプールを、ＴＩ宿主４または宿主７の位置に１本の重鎖及び１本の軽鎖（ＨＬ構成）または１本の重鎖及び２本の軽鎖（ＨＬＬ構成）のいずれかを含有する単一プラスミドをトランスフェクトすることによって生成した。プールの生産性を、１４日間の流加産生アッセイで評価した（図２２Ａ及び図２２Ｂ）。％ＨＭＷＳを評価すると（図２２Ｂ及び図２２Ｄ）、ＨＣ：ＬＣ比の影響が組込み部位に依存しないことを示していた。
【0410】
抗体のＬＣコピーの増加が生産性及び高分子量種（ＨＭＷＳ）に及ぼす影響を、ｍＡｂ ＩＶに関連して評価した。これを行うために、ＲＭＣＥプールを、宿主４部位の位置に、または宿主４及び７部位の位置に１本の重鎖及び１本の軽鎖（ＨＬ構成）、１本の重鎖及び２本の軽鎖（ＨＬＬ構成）、２本の重鎖及び３本の軽鎖（ＨＬＬ－ＨＬ構成）、２本の重鎖及び４本の軽鎖（ＨＬＬ－ＨＬＬ構成）、２本の重鎖及び５本の軽鎖（ＨＬＬ－ＨＬＬＬ構成）、３本の重鎖及び６本の軽鎖（ＨＬＬＬ－ＨＬＬＨＬ構成）、または３本の重鎖及び７本の軽鎖（ＨＬＬＬ－ＨＬＬＨＬＬ構成）のいずれかを含有する単一プラスミドをトランスフェクトすることによって生成した（図２３及び図２４）。
【0411】
多数の力価及び産生評価アッセイを通じて、多数のクローンを同定し、特定の産生プロセスを用いてａｍｂｒ１５産生評価で評価した。この評価から、細胞培養の性能、力価、及び産物品質特性（パーセント凝集を含む）によって同定した上位１０クローンを選択し、さらに評価するためにバンク化した。最終的に、高力価でパーセント凝集が低く、以前に生成したｍＡｂ－ＶＩ細胞株と同等の産物品質でｍＡｂ－ＶＩを発現する２部位組込み細胞株を生成した。図２５は、上位２つのクローンが、それぞれ８．４及び８．７ｇ／Ｌの力価を有し、７．４％及び５．６％の凝集体を含むことを示す。
【0412】
実施例１４：調節された標的組込み：クローン評価。
この実験では、宿主４の調節された誘導体における抗体Ｚの発現を、抗体をコードする配列の調節された標的組込みを実施した後に評価した。抗体Ｚの発現調節に用いたシステムは、３つの主要な構成要素で構成される：１）シグナル配列前にタンデムｔｅｔ－オペロン配列を含む調節プロモーター、２）プロモーター及びＴｅｔ－リプレッサータンパク質コード配列、ならびに３）抗体Ｚの発現を可能にするドキシサイクリンなどの誘導物質。
この実験では、宿主４の調節された誘導体における抗体Ｚの発現を、抗体をコードする配列の調節された標的組込みを実施した後に評価した。抗体Ｚの発現調節に用いたシステムは、３つの主要な構成要素で構成される：１）シグナル配列前にタンデムｔｅｔ－オペロン配列を含む調節プロモーター、２）プロモーター及びＴｅｔ－リプレッサータンパク質コード配列、ならびに３）抗体Ｚの発現を可能にするドキシサイクリンなどの誘導物質。
【0413】
抗体Ｚをコードする配列の標的組込みを確認したら、クローン評価を振盪フラスコプロセスで実施した。３日目、７日目及び１０日目に１０％フィード（総体積の）を実施した。１つの産生培養アッセイを、クローンを評価するために実施した。全てのクローンを、０日目に３×１０６細胞／ｍＬの播種密度で播種した。３日目、７日目、及び１０日目に１μｇ／ｍＬのドキシサイクリンを３６の培養物全てに添加し、抗体Ｚの発現を誘導した。
【0414】
最終的な力価及び比生産性（Ｑｐ）をそれぞれ図２６及び図２７に示す。１４日目の採取細胞培養液（ＨＣＣＦ）を力価分析にかけた。力価は、１～３．６８ｇ／Ｌの範囲であった（クローン７を除外）。バンク化のためのクローン選択を、最初に力価によって順位付けし、最終的な選択は、Ｑｐ及び他のパラメータを含む細胞培養性能に基づいた。バンク化のために選択したクローンは、２．６９～３．６８ｇ／Ｌの範囲の力価をもたらした。
【0415】
示される、かつ請求される様々な実施形態に加えて、開示される主題は、本明細書に開示される、かつ請求される特徴の他の組合せを有する他の実施形態も対象とする。そのため、本明細書に提示される特定の特徴は、開示される主題が本明細書に開示される特徴の任意の好適な組合せを含むように、開示される主題の範囲内において他の手法で互いに組み合わされ得る。開示される主題の特定の実施形態に関する前述の記載は、例示及び説明を目的として提示されている。網羅的であること、または開示される主題を開示されるそれらの実施形態に限定することを意図するものではない。
【0416】
様々な修正及び変更が、開示される主題の趣旨または範囲から逸脱することなく、開示される主題の組成物及び方法で行われ得ることが、当業者には明らかとなる。したがって、開示される主題が、添付の特許請求及びそれらの等価物の範囲内にある修正及び変更を含むことを意図する。
【0417】
様々な刊行物、特許及び特許出願が本明細書で引用され、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図11】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図12D】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図13D】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図17-1】
【図17-2】
【図18】
【図19A】
【図19B】
【図19C】
【図19D】
【図19E】
【図19F】
【図20A】
【図20B】
【図20C】
【図20D】
【図20E】
【図20F】
【図21A】
【図21B】
【図21C】
【図21D】
【図21E】
【図22A】
【図22B】
【図22C】
【図22D】
【図23A】
【図23B】
【図24A】
【図24B】
【図25】
【図26】
【図27】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-04-11
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
明細書に記載の一発明。
【外国語明細書】