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特開2024-96146スキンケアのためのラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024096146
(43)【公開日】2024-07-12
(54)【発明の名称】スキンケアのためのラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉ）
(51)【国際特許分類】
A61K 35/747 20150101AFI20240705BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20240705BHJP
A61K 47/36 20060101ALI20240705BHJP
A61K 47/42 20170101ALI20240705BHJP
A61K 47/46 20060101ALI20240705BHJP
A61K 9/14 20060101ALI20240705BHJP
A61K 9/19 20060101ALI20240705BHJP
A61K 8/02 20060101ALI20240705BHJP
A61K 8/99 20170101ALI20240705BHJP
A61Q 19/00 20060101ALI20240705BHJP
A61K 9/08 20060101ALI20240705BHJP
A61K 9/06 20060101ALI20240705BHJP
A61P 17/10 20060101ALI20240705BHJP
A61P 17/04 20060101ALI20240705BHJP
【ＦＩ】
A61K35/747
A61P17/00
A61K47/36
A61K47/42
A61K47/46
A61K9/14
A61K9/19
A61K8/02
A61K8/99
A61Q19/00
A61K9/08
A61K9/06
A61P17/10
A61P17/04
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024063913
(22)【出願日】2024-04-11
(62)【分割の表示】P 2020573258の分割
【原出願日】2019-06-26
(31)【優先権主張番号】PCT/EP2018/067090
(32)【優先日】2018-06-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(71)【出願人】
【識別番号】511008850
【氏名又は名称】シムライズ アーゲー
(71)【出願人】
【識別番号】520509052
【氏名又は名称】プロビ アクチボラーグ
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100123766
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 七重
(72)【発明者】
【氏名】ペサロ マヌエル
(72)【発明者】
【氏名】シュトゥールマン ドミニク
(72)【発明者】
【氏名】ガルベ リーザ
(72)【発明者】
【氏名】シュマウス ゲルハルト
(72)【発明者】
【氏名】ホルムグレン ケルスティン
(72)【発明者】
【氏名】ラーソン ニクラス
(57)【要約】
【課題】本発明は、局所施用による皮膚症状の処置および／または予防における使用のための微生物、より詳細には、皮膚バリア機能の低下、炎症性皮膚症状および／または病原性微生物の増殖の処置および／または予防における使用を目的とする微生物を提供することを課題とする。
【解決手段】局所施用による皮膚症状の処置および／または予防における使用のための微生物または２種類の微生物を含むかまたはからなる混合物であって、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＨＥＡＬ１９（ＤＳＭ１５３１３）およびラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ９９（ＤＳＭ１５３１６）からなる群から選ばれる微生物または２種類の微生物を含むかまたはからなる混合物により上記課題は達成される。
【選択図】なし
【解決手段】局所施用による皮膚症状の処置および／または予防における使用のための微生物または２種類の微生物を含むかまたはからなる混合物であって、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＨＥＡＬ１９（ＤＳＭ１５３１３）およびラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ９９（ＤＳＭ１５３１６）からなる群から選ばれる微生物または２種類の微生物を含むかまたはからなる混合物により上記課題は達成される。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
局所施用による皮膚症状の処置および／または予防における使用のための微生物または２種類の微生物を含むかまたはからなる混合物であって、前記微生物は、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＨＥＡＬ１９（ＤＳＭ１５３１３）およびラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ９９（ＤＳＭ１５３１６）からなる群から選ばれる微生物または２種類の微生物を含むかまたはからなる混合物。
【請求項2】
前記微生物は、熱処理に付されており、好ましくは、無傷の物理的構造を有する弱毒化または死滅微生物である、請求項１に記載の使用のための微生物または混合物。
【請求項3】
前記皮膚症状は、皮膚バリア機能の低下、炎症性皮膚症状および／または病原性微生物の増殖であり、好ましくは、前記皮膚症状は、アトピー性皮膚炎、微生物感染症、乾燥肌、皮膚のかゆみ、敏感肌、アトピー肌、皮膚の炎症、微生物性腸内毒素症、酒さ、乾癬、発疹およびにきびからなる群から選ばれる、請求項１または２に記載の使用のための微生物または混合物。
【請求項4】
ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＨＥＡＬ１９（ＤＳＭ１５３１３）およびラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ９９（ＤＳＭ１５３１６）からなる群から選ばれた１種類の微生物または２種類の微生物の混合物とキャリアとを含むかまたはからなる調製物であって、前記調製物は、粒子状調製物、特に粒状体または粉体である調製物。
【請求項5】
前記微生物は、熱処理に付されており、好ましくは、無傷の物理的構造を有する弱毒化または死滅微生物である、請求項４に記載の調製物。
【請求項6】
前記キャリアは、イヌリン、デンプン、アラビアゴム、ホエータンパク質、脱脂粉乳およびマルトデキストリンならびにそれらの組み合わせ、好ましくはマルトデキストリンからなる群から選ばれる、請求項４または５に記載の調製物。
【請求項7】
キャリアに対する微生物の比は、１：９～３：７、好ましくは１．５：８．５～２．５～７．５の範囲にあり、および／または前記調製物は、それぞれの場合に前記調製物の総重量に対して１０～３０重量％の微生物および７０～９０重量％の前記キャリア、好ましくは、１５～２５重量％の微生物および７５～８５重量％の前記キャリアを含む、請求項４～６のいずれか１項に記載の調製物。
【請求項8】
ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＨＥＡＬ１９（ＤＳＭ１５３１３）およびラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ９９（ＤＳＭ１５３１６）からなる群から選ばれた１種類の微生物または２種類の微生物の混合物とキャリアとを含むかまたはからなる調製物、好ましくは、請求項４から７のいずれか１項に記載の調製物、を製造するための方法であって、
（ｉ）ラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ１９（ＤＳＭ１５３１３）およびラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ９９（ＤＳＭ１５３１６）からなる群から選ばれた１種類の微生物または２種類の微生物の混合物を準備するステップと、
（ｉｉ）任意選択として、ステップ（ｉ）の前記微生物を、好ましくは６０～１２１℃の範囲の温度で１秒～１２０分間の熱処理に付すステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）または（ｉｉ）からの前記微生物をキャリアと組み合わせ、粒状体または粉体を得るために前記組み合わせを、好ましくは凍結乾燥、スプレー乾燥または造粒によってさらに加工するステップと、
を含む方法。
（ｉ）ラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ１９（ＤＳＭ１５３１３）およびラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ９９（ＤＳＭ１５３１６）からなる群から選ばれた１種類の微生物または２種類の微生物の混合物を準備するステップと、
（ｉｉ）任意選択として、ステップ（ｉ）の前記微生物を、好ましくは６０～１２１℃の範囲の温度で１秒～１２０分間の熱処理に付すステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）または（ｉｉ）からの前記微生物をキャリアと組み合わせ、粒状体または粉体を得るために前記組み合わせを、好ましくは凍結乾燥、スプレー乾燥または造粒によってさらに加工するステップと、
を含む方法。
【請求項9】
ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＨＥＡＬ１９（ＤＳＭ１５３１３）およびラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ９９（ＤＳＭ１５３１６）からなる群から選ばれた１種類の微生物または２種類の微生物の混合物を含むかまたは請求項４～７のいずれか１項に記載の調製物を含む、皮膚への局所施用のための医薬品または化粧品組成物あるいは医薬品または化粧品製品であって、前記微生物の総量は、皮膚症状、特に炎症性皮膚症状、皮膚バリア機能の低下、および／または病原性微生物の増殖を処置および／または予防するために十分であり、好ましくは、前記微生物の総量は、それぞれの場合に前記組成物の総重量に対して０．０１～５乾燥重量％、好ましくは０．０２～１乾燥重量％の範囲にあり、および／または、前記微生物の総量は、前記総組成物のグラムあたり少なくとも１０8、好ましくは５×１０8細胞または少なくとも１０11細胞、例えば、前記総組成物のグラムあたり１０8～５×１０10、好ましくは、１０9～１０10細胞の範囲にある、皮膚への局所施用のための医薬品または化粧品組成物あるいは医薬品または化粧品製品。
【請求項10】
前記組成物または製品は、水中油または油中水乳化液、軟膏、クレーム、ローションおよびジェルからなる群から選ばれ、好ましくは、前記組成物または製品は、キャリア、賦形剤およびさらなる活性成分からなる群から選ばれた１種類以上の構成要素をさらに含む、請求項９に記載の医薬品または化粧品組成物あるいは製品。
【請求項11】
医薬品または化粧品組成物あるいは製品、好ましくは請求項９または１０に記載の医薬品または化粧品組成物あるいは製品を製造するための方法であって、
（ｉ）ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＨＥＡＬ１９（ＤＳＭ１５３１３）およびラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ９９（ＤＳＭ１５３１６）からなる群から選ばれた１種類または２種類の微生物の混合物を準備し、好ましくは、前記微生物は、熱処理に付されており、好ましくは、無傷の物理的構造を有する弱毒化または死滅微生物であるステップ、または請求項４～７のいずれか１項に記載の調製物または請求項８に記載の方法によって製造される調製物を準備するステップと、
（ｉｉ）医薬品または化粧品組成物あるいは製品を得るためにステップ（ｉ）の前記微生物または前記調製物をキャリア、賦形剤およびさらなる活性成分から選択された１種類以上の物質と組み合わせるステップと、
を含む方法。
（ｉ）ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＨＥＡＬ１９（ＤＳＭ１５３１３）およびラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ９９（ＤＳＭ１５３１６）からなる群から選ばれた１種類または２種類の微生物の混合物を準備し、好ましくは、前記微生物は、熱処理に付されており、好ましくは、無傷の物理的構造を有する弱毒化または死滅微生物であるステップ、または請求項４～７のいずれか１項に記載の調製物または請求項８に記載の方法によって製造される調製物を準備するステップと、
（ｉｉ）医薬品または化粧品組成物あるいは製品を得るためにステップ（ｉ）の前記微生物または前記調製物をキャリア、賦形剤およびさらなる活性成分から選択された１種類以上の物質と組み合わせるステップと、
を含む方法。
【請求項12】
特に皮膚の外観を改善する皮膚への局所施用のための微生物または２種類の微生物を含むかまたはからなる混合物の化粧使用であって、前記微生物は、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＨＥＡＬ１９（ＤＳＭ１５３１３）およびラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ９９（ＤＳＭ１５３１６）からなる群から選択され、好ましくは、前記微生物は、熱処理に付されており、および／または無傷の物理的構造を有する弱毒化または死滅微生物である化粧使用。
【請求項13】
皮膚刺激、乾燥肌、発疹、にきび、および／または皮膚老化を軽減または予防するための請求項１２に記載の化粧使用。
【請求項14】
前記微生物は、請求項４～７のいずれか１項に記載の調製物または請求項８に記載の方法によって製造された調製物の形で用いられる、請求項１２または１３に記載の化粧使用。
【請求項15】
皮膚の外観を改善する、特に皮膚刺激、乾燥肌、発疹、にきびおよび／または皮膚老化を軽減または予防する化粧方法であって、
ｉ）微生物または２種類の微生物を含むかまたはからなる混合物を局所的に皮膚に施用するステップであって、前記微生物は、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＨＥＡＬ１９（ＤＳＭ１５３１３）およびラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ９９（ＤＳＭ１５３１６）からなる群から選択されるステップ、または、請求項４～７のいずれか１項に記載の調製物または請求項８に記載の方法によって製造された調製物または請求項９または１０に記載の化粧品組成物または製品を皮膚に施用するステップであって、好ましくは、前記微生物は、熱処理に付されており、および／または無傷の物理的構造を有する弱毒化または死滅微生物であるステップと、
を含む方法。
ｉ）微生物または２種類の微生物を含むかまたはからなる混合物を局所的に皮膚に施用するステップであって、前記微生物は、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＨＥＡＬ１９（ＤＳＭ１５３１３）およびラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ９９（ＤＳＭ１５３１６）からなる群から選択されるステップ、または、請求項４～７のいずれか１項に記載の調製物または請求項８に記載の方法によって製造された調製物または請求項９または１０に記載の化粧品組成物または製品を皮膚に施用するステップであって、好ましくは、前記微生物は、熱処理に付されており、および／または無傷の物理的構造を有する弱毒化または死滅微生物であるステップと、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、局所施用による皮膚症状の処置および／または予防における使用のための微生物に関し、微生物は、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＨＥＡＬ１９（ＤＳＭ１５３１３）およびラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ９９（ＤＳＭ１５３１６）からなる群から選ばれる。詳しくは、微生物は、皮膚バリア機能の低下、炎症性皮膚症状および／または病原性微生物の増殖の処置および／または予防における使用を目的とする。本発明は、さらに、微生物およびキャリアを含む粒子状調製物ならびにこれらの微生物を含む医薬品または化粧品組成物または製品に関する。皮膚への施用のためのこれらの微生物または組成物の化粧使用ならびに特に皮膚の外観を改善しおよび／または体臭を予防する化粧方法も提供される。
【背景技術】
【0002】
プロバイオティクスは、腸－脳軸相関作用の高まりに帰される腸の健康状態を向上させ、乳糖不耐症を軽減することが良く知られ、膣または泌尿生殖器の感染症処置において有益であるか、または炎症性腸疾患を予防する。特にラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）は、食品発酵プロセスにおいて安全かつ長い伝統を有する。腸とは対照的に、表皮、皮膚微生物相および環境微生物の間の相互作用についてはほとんど知られていない。
【0003】
今日では、プロバイオティクスが皮膚の健康を含む他の健康促進効果を及ぼすことをますます多くの研究が示している。ビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａ）および乳酸菌が、用いられる最も普通のタイプのプロバイオティクスであり、これらを用いるスキンケアの分野がここ何年かにわたり活発に開発されてきた。
【0004】
しかし、すべてのプロバイオティク菌株が皮膚への有益な効果を示すわけではなく、単一の菌株が言及されることは稀である。それに、であったとしても、化粧品組成物中の活性成分としての抗炎症効果またはその他の効果と微生物自体によるいかなる炎症促進性の副作用の原因ともならないこととの間の均衡が得られることが必要である。
【0005】
皮膚は、細菌、微生物および潜在的病原体に絶えず曝露されている。これらの病原性細菌の感染または侵入を避けるために、皮膚は、多面的な防御戦略を発達させた。角質層の物理的および化学的バリアの他に、それは、この状況において必須である構成型および誘導型のＡＭＰバリアを備える（ハーダー（Ｈａｒｄｅｒ）ら、２０１３年、ヴィースナー（Ｗｉｅｓｎｅｒ）およびフィルシンスカス（Ｖｉｌｃｉｎｓｋａｓ）、２０１０年）。
【0006】
抗菌ペプチド（ＡＭＰ：Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｅｐｔｉｄｅｓ）は、多様かつ豊富な分子群である。小さなサイズ、アミノ酸組成、両親媒性および／または陽イオン電荷が特徴的である。それらのアミノ酸組成に基づいてそれらは、多くの場合に特徴的なサブグループに分けられる。それらの抗菌潜在力および作用機序の多様性は、それらの構造および組成と同じように多様である。それらは、無脊椎動物、動物種および植物のさまざまな組織および細胞型において検出することができる（ブログデン（Ｂｒｏｇｄｅｎ）２００５年、ザスロフ（Ｚａｓｌｏｆｆ）２００２年）。それらは、広い範囲のグラム陽性およびグラム陰性細菌、真菌、真核寄生生物および／またはウイルスに対して活性であるから、ヒトの皮膚において第１防御線として役立つ（ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）およびハンコック（Ｈａｎｃｏｃｋ）、２００６年）。
【0007】
ＡＭＰ発現は、病原体との接触または細胞内炎症経路のようなさまざまな環境刺激に応答して上方調節され得る。共生細菌および病原性細菌は、ＡＭＰ発現を誘導する能力が異なり、生来のヒトの免疫へのヒト皮膚中の異なる信号伝達経路を活性化させる。両者の間の特定の相互作用についてはほとんど知られていない。例えば、β－デフェンシンは、インターロイキン１または細菌リポ多糖のような炎症および／または感染症のさまざまな刺激によって上方調節される（チュング（Ｃｈｕｎｇ）およびデール（Ｄａｌｅ）、２００４年）。特許文献１は、脂質Ａを含むビトレオシラ・フィリフォルメス（Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ ｆｉｌｌｉｆｏｒｍｅｓ）由来のＬＰＳが、病原活性を有することなくケラチノサイト中のＡＭＰの発現を刺激する能力を有すると開示している。
【0008】
皮膚マイクロバイオームがさまざまな皮膚疾患および／または健康状況において重要な役割を演じ得ることは、公知である。マイクロバイオームの複雑さおよび個体間／個体内変化ならびに特性把握、分類および分析における困難な問題は、相互作用を理解し、局所治療および／または診断の適用および／またはマイクロバイオームに影響を及ぼし、相互作用および／または支援することを助ける治療を開発する上での難問である。それにもかかわらず、マイクロバイオームおよびマイクロバイオーム関連疾患は、ますます重要な側面となり、疾患および健康状況のマイクロバイオーム関連処置を開発することの必要を誘導する。
【0009】
例えば、アトピー性皮膚炎（ＡＤ：ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）は、さまざまな遺伝的リスクを有するが顕著な環境トリガーを有する多重機能複合障害である。ＡＤは、物理的バリア欠陥および／または腸内毒素症（微生物不均衡）と関係している。患者は、カテリシジンまたはβ－デフェンシンのようなさまざまなＡＭＰの抑制またはＴ－細胞恒常性における変化を示す。抗菌バリア欠陥と物理的バリア欠陥との組み合わせは、腸内毒素症を推進し、外部環境との均衡を確立するために再び必要である細胞免疫均衡のさらなる撹乱を生じる（オング（Ｏｎｇ）ら、２００２年、パーマー（Ｐａｌｍｅｒ）ら、２００６年、サカグチ（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ）ら、２０１０年）。
【0010】
さらに、酒さまたは乾癬などの他の普通のヒト皮膚疾患もＡＭＰ－発現の調節不全と関係している。これらの内因性ペプチドの特異的な操作および誘導によって、均衡の取れた皮膚マイクロバイオームを回復、維持および／または改善することができる。このことは、広い範囲の利用分野における皮膚の利点を作り出す新しい戦略を表す。
【0011】
さらに、ＡＤ患者の湿疹性皮膚損傷において黄色ブドウ球菌（スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ））が頻繁に見いだされ、この疾患症状の悪化にとって重要であり、かつ原因のようであることが知られている。ひっかき、日焼けまたは他の外傷によって刺激または損傷を受けている皮膚は、感染する可能性が高くなる。例えば、乾燥肌も容易に損傷を受ける。この種類の感染の回避は、代替治療処置を開発する上で２番目に関連性の高い出発点を示す。
【0012】
当分野の技術水準から、スキンケアおよび皮膚健康にとってのプロバイオティクスのさまざまな有益な効果を取り扱っているいくつかの刊行物が知られている。化粧利用においてさまざまな目的でラクトバチルス調製物が用いられてきた。これらのものは、主として、皮膚、体、髪または爪のための健康上の利益に基づくが、技術的な利用にも関する。記載されたほとんどの組成物は、好ましくは、発酵植物、食品または化学薬剤と組み合わせて用いられる、生きているかまたは生育不能な種々のプロバイオティク菌株の混合物を含有する。他方、単一の純粋な培養菌株の有益な効果が示されることは稀であった。
【0013】
特許文献２において、化粧利用および局所皮膚処置のためのラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ラムノスス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｕｎｏｓｕｓ）およびビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）の使用が記載されている。
【0014】
特許文献３は、ラクトバチルスまたはビフィドバクテリウム全般を含むプロバイオティク微生物の発酵由来の抽出物を含有する局所施用のための水性ローション組成物を開示している。
【0015】
皮膚バリア機能のための微生物の有益な効果が特許文献４に記載された。皮膚のバリア機能の低下を防ぎ、および／または皮膚のバリア機能を強化するためのヘスペリジンと組み合わせた少なくとも１種類のプロバイオティク微生物／画分の化粧使用が開示されている。
【0016】
２種類のＬ．プランタルム菌株による皮膚細胞中のβ－デフェンシン誘導の可能性が特許文献５に記載されている。皮膚に対する抗菌効果ならびににきびおよび敏感肌における改善が示されている。
【0017】
特許文献６は、Ｓ．アウレウスまたはシュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のような病原性微生物によって引き起こされる皮膚感染症、慢性創傷または皮膚疾患の局所処置および／または予防のための乳酸菌および／またはそれらを含有する組成物の化粧使用を記載している。効力は、乳酸細菌と病原体との特異的な細菌共凝集によって引き起こされる。
【0018】
特許文献７において、ヒト皮膚に対するスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）誘導感染症の処置のために有用である種々の生存可能α－ストレプトコッカス菌株とラクトバチルス菌株との組み合わせを含む医薬品調製物が開示されている。
【0019】
特許文献８は、ストレス誘導炎症性障害の処置および／または予防のためのＬ．プランタルムを含むプールから選択された少なくとも２種類の乳酸菌菌株を含む調合物を開示している。局所施用について請求された効果は、重度に傷ついた皮膚、すなわち潰瘍または火傷による傷に制限されている。
【0020】
重度のヒト火傷に対するラクトバチルス・プランタルムの局所施用は、組織修復を改善し、感染症を防ぐことが記載されている（ペラル（Ｐｅｒａｌ）ら、２００９年）。
【0021】
特許文献９は、活性物質、特にバクテリオシンまたはバクテリオシン様物質を産生する、ラクトバチルス・プランタルムを含む、広い範囲の乳酸菌を開示している。これらの菌株は、細菌によって引き起こされる皮膚感染症または炎症性皮膚疾患、例えばアトピー性皮膚炎またはにきびの予防および処置において用いられることが示唆されている。
【0022】
特許文献１０は、ラクトバチルス・プランタルムＣＮＣＭ１－４０２６を含む、皮膚感染症の予防または処置における使用のための組成物を記載している。特に、ラクトバチルス発酵後に回収された濃縮上清液が種々のグラム陽性およびグラム陰性細菌、とりわけ黄色ブドウ球菌または表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）の増殖を阻害または遅延させることが見いだされた。細菌細胞全体ではなく、増殖培地から得られた可溶性細菌成分だけが用いられた。
【0023】
黄色ブドウ球菌とラクトバチルス・プランタルムを含む種々の乳酸菌との阻害効果が無細胞上清液ならびに抽出物を用いて観測されている（ヨング（Ｙｏｎｇ）ら、２０１５年）。
【0024】
特許文献１１は、口腔中の炎症の処置および予防における、特に歯肉炎および歯周炎を処置または予防する使用のための微生物に関する。開示された微生物の中で、ラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ１９が、単球に対して抗炎症効果を有することが示されている。しかし、特許文献１１からそのような効果が口腔の外部の表皮皮膚細胞、すなわち非粘膜ケラチノサイトに及ぶと結論することはできない。非粘膜皮膚は、特に、保護層（例えば角質層）および関連する強いバリア機能に関して完全に異なる構造を有するので、単球において観測された同じ効果が皮膚に当てはまると期待することはできない。さらに、表皮は、いかなる単球または関連細胞形もまったく含有しない非血管化組織である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0025】
【特許文献1】米国特許出願公開第２００９／００３５２９４（Ａ１）号
【特許文献2】国際公開第２０１３１５３３５８号
【特許文献3】国際公開第２０１５０４８５１１号
【特許文献4】国際公開第２００９０３１１０６号
【特許文献5】国際公開第２００５０９１９３３号
【特許文献6】米国特許出願公開第２０１４１８６４０９号
【特許文献7】国際公開第２０１００５６１９８号
【特許文献8】国際公開第２００５０７７３９１号
【特許文献9】韓国公開特許第２０１１１３４１５１号
【特許文献10】国際公開第２０１６０２３６８８号
【特許文献11】国際公開第２０１７１２５４４７（Ａ１）号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0026】
皮膚症状、特に、皮膚バリア機能の低下、炎症性皮膚症状および病原性微生物の増殖の処置および／または予防に一役買うプロバイオティク細菌菌株を提供することが本発明の目的であった。
【0027】
化粧用途において有用であり、特に皮膚の外観を改善し体臭を予防することができるプロバイオティク細菌菌株を提供することが本発明のさらなる目的であった。
【0028】
詳しくは、本発明によって提供される菌株が、皮膚バリアの強化、皮膚の緩和および炎症の軽減または予防、ＡＭＰの上方調節による皮膚の免疫防御の増強、皮膚老化の遅延、皮膚上の病原性微生物の成長の阻害および感染症の予防から選ばれる効果のうちの１つまたは好ましくは２つ、いくつかまたはすべてを有することも目的であった。
【0029】
さらに、提供される菌株は、皮膚上で用いられるとき好ましくない副作用、例えば炎症誘発効果を有するべきでない。
【0030】
上記目的は、局所施用による皮膚症状の処置および／または予防における使用のための微生物または２種類の微生物を含むかもしくはからなる混合物によって満たされ、該微生物は、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＨＥＡＬ１９（ＤＳＭ１５３１３）およびラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ９９（ＤＳＭ１５３１６）からなる群から選ばれる。
【0031】
本発明によれば、あらゆる実施形態において、ラクトバチルス・プランタルム菌株ＨＥＡＬ１９とＨＥＡＬ９９との一方または両方の混合物のどちらも用いることができる。従って、表現「微生物または２種類の微生物を含むかもしくはからなる混合物」は、存在する２種類の菌株のどちらか一方または存在する両方の菌株を指す。
【0032】
一部のプロバイオティク細菌は、皮膚症状および皮膚外観の特定の側面を改善することができるが、すべての細菌菌株が皮膚に対して有益な効果を提供するわけではなく、一部は、有害なことさえあり得ることが先行技術から公知であった。さらに、重度の負傷または火傷を受けた皮膚ならびに口腔中の粘膜への微生物の施用の場合に有益な効果が示された。しかし、これらの効果は、強いバリア機能を有する非粘膜皮膚への施用に移行することも比較することもできない。本発明において記載される効果を誘導するためには、皮膚バリアの存在が前提条件である。
【0033】
ラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ１９およびＨＥＡＬ９９が、独自の組み合わせと、皮膚の臨床症状および化粧外観を決定的に改善するだけでなく健康な皮膚を支え異常を予防する助けとなる包括的な活性分野と、を提供することが今や見いだされた。これらの菌株の局所施用は、その抗炎症能力の他に、さまざまなＡＭＰの誘導による皮膚のバリアの支援だけでなく複数の経路による物理的な皮膚バリアの強化との組み合わせを提供することが示される。さらに、記載されるラクトバチルス・プランタルム菌株について黄色ブドウ球菌の増殖阻害効果も示すことができた。
【0034】
特に、水溶性成分と水不溶性成分との両方を含む熱処理されたラクトバチルス属が皮膚健康を改善することができることが示された。細菌懸濁液は、経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ：ｔｒａｎｓ－ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｗａｔｅｒ ｌｏｓｓ）の減少および／または自然保湿因子に関連する成分の増加によって皮膚の物理的バリアを強化する潜在能力を有する。同時に、皮膚のさまざまなＡＭＰ産生が誘導され、皮膚の自己防御を増進する。Ｓ．アウレウスのような病原体の増殖を阻害することによって潜在的な皮膚の感染症を予防することができる。さらに、Ｌ．プランタルムＨＥＡＬ１９およびＨＥＡＬ９９は、抗炎症効果を示した。
【0035】
結論として、Ｌ．プランタルムＨＥＡＬ１９および９９菌株は、局所施用されると皮膚特性および皮膚健康を改変する薬剤として高くかつ包括的な潜在能力を示す。
【0036】
本発明の状況において、用語「皮膚」は、非粘膜皮膚である皮膚を指す。詳しくは、例えば口腔などの体の空孔中に見いだされる粘膜、胃、腸、気管支、肛門または膣の粘膜は、用語「皮膚」によって包含されない。よって、用語「局所施用」は、皮膚に対する薬剤および／または調合物の施用を指し、粘膜によって包含される体腔の内部におけるあらゆる施用を除外する。好ましくは、皮膚は、例えば重度の負傷または火傷によって顕著に弱められなかった保護機能を依然として保持する。
【0037】
本発明の状況における「局所施用によって」は、本明細書に記載される微生物、あるいは該微生物を含む調製物、医薬品または化粧品組成物または製品が皮膚に対する局所施用によって直接、すなわち皮膚の表面に直接投与されることを意味する。
【0038】
本発明の状況における「皮膚症状」は、好ましくは負傷または火傷以外の、皮膚の病状と関連する皮膚のあらゆる状態を指す。「皮膚症状」は、好ましくは、かゆみなどの不快を特徴とする状態に関するか、または細菌増殖に起因する剥離、乾燥、発赤、発疹、にきび、脂性または体臭などの美容上の問題を表す。下記に皮膚症状の例が示される。
【0039】
菌株ラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ１９は、ブダペスト条約に基づいて、プロビ（Ｐｒｏｂｉ）ＡＢ、ソエルベガタン（Ｓｏｅｌｖｅｇａｔａｎ）、４１、２２３ ７０ ルント（Ｌｕｎｄ）、スエーデンにより２００２年１１月２７日にライプニッツ・インスティトゥート・ドイッチェ・サムルング・フュール・ミクロオルガニスメン・ウント・ツェルクルトゥーレン（Ｌｅｉｂｎｉｚ Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｄｅｕｔｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｆｕｅｒ Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ ｕｎｄ Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ）ＧｍｂＨ（ＤＳＭＺ）、インホッフェンシュトラーセ（Ｉｎｆｏｆｆｅｎｓｔｒ．）７Ｂ、３８１２４ ブラウンシュヴァイク（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）、ドイツにおいて寄託番号ＤＳＭ１５３１３により寄託されている。菌株ラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ９９は、ブダペスト条約に基づいて、プロビＡＢ、ソエルベガタン、４１、２２３ ７０ ルント、スエーデンにより２００２年１１月２７日にライプニッツ・インスティトゥート・ドイッチェ・サムルング・フュール・ミクロオルガニスメン・ウント・ツェルクルトゥーレン、インホッフェンシュトラーセ７Ｂ、３８１２４ ブラウンシュヴァイク、ドイツにおいて寄託番号ＤＳＭ１５３１６により寄託されている。
【0040】
好ましい実施形態において、該微生物は、好ましくは、該微生物の不活性化、弱毒化または死滅を招く熱処理に付されている。好ましくは、熱処理された該微生物は、無傷の物理的構造を有する。
【0041】
熱処理は、超音波、紫外線照射または加熱によって行われてよい。好ましくは、それは、６０～１２１℃の温度に１秒～１２０分間、例えば２０秒～１２０分間加熱することによって行われる。好ましい実施形態において、熱処理は、好ましくは、工業用低温殺菌装置を用いて７０～１００℃の間で２０秒～１５分間行われる。好ましくは、微生物は、死滅しており、従ってもはや繁殖することができない。好ましくは、熱処理された微生物は、依然として、無傷の物理的構造を有する。これは、細胞構造が熱処理によって破壊されておらず、微生物が代謝産物を含有して送達され得ることを意味する。有利な点として、熱処理時に、微生物は、典型的には本明細書に記載されている皮膚症状を処置するための有益な効果を与えるそれらの能力を維持するとともに、本発明の目的にとって生存可能な微生物は必要でないという事実に起因して、それらを防腐剤と組み合わせることが可能である。医薬品および化粧品製品が、多くの場合に製品が使い切られる間に繰り返される容器の開閉時に製品中の細菌または真菌の増殖を防ぐために防腐剤を含有するから、このことは、ほとんどの用途にとって非常に重要である。
【0042】
処置および／または予防される皮膚症状は、好ましくは、皮膚バリア機能の低下、炎症性皮膚症状および／または病原性微生物の増殖である。
【0043】
本発明の状況における「皮膚バリア」とは、一方では物質が体に入ることを妨げ、乾き切ることに対して保護する角質層の物理および化学バリアを指すが、他方では、ｐＨのような他の化学的性質とともに微生物病原体のコロニー形成または侵入に対する防御を提供する誘導ＡＭＰバリアも指す。よって、「皮膚バリア機能の減少」も含む「皮膚バリア機能の低下」は、正常なまたは健康な皮膚構造および／または機能が、上述の保護または防御を満足な程度に提供することがもはやできないほど撹乱されることを意味する。しかし、好ましくは、そのような撹乱は、切り傷または重度の火傷などの負傷ではない。
【0044】
「炎症性皮膚症状」とは、刺激物または病原性微生物などの有害な刺激（病原性毒素）に対する皮膚の生物応答によって引き起こされる症状であり、通常は、影響を受けた区域における発赤、膨潤、熱および／または痛みを生じる。炎症状態を評価するために、影響を受けた組織中で炎症性サイトカインまたはケモカイン、例えばインターロイキン８（ＩＬ－８）などの炎症媒介物質を測定することができる。
【0045】
皮膚上または皮膚中の細菌または真菌などの「病原性微生物の増殖」は、感染症および／または炎症を生じ得るだけでなく、発疹、にきびまたは体臭などの美容上の問題も引き起こし得る。特に、「病原性微生物の増殖」とは、皮膚上または皮膚中の健康なマイクロバイオームと関連するレベルを上回るほどの病原性微生物の量の増加を指す。特に、それは、微生物感染症を指す。
【0046】
上記の３つの側面は、密接につながり合っている。例えば、バリア機能の低下は、病原性微生物または有害物質の侵入を生じ得、病原性微生物または有害物質は、今度は、炎症を引き起こす。
【0047】
好ましい実施形態において、該微生物は、
（ａ）皮膚バリア機能を強化する薬剤、および／または
（ｂ）経表皮水分蒸散量を減少させる薬剤、および／または
（ｃ）フィラグリンの発現を誘導する薬剤、および／または
（ｄ）自然保湿因子に関連する成分を増加させる薬剤、および／または
（ｅ）抗炎症活性を提供する薬剤、特に、炎症パラメータを低下および／または抑制する薬剤、および／または
（ｆ）ケモカインによって誘導される抗炎症活性を提供する薬剤、および／または
（ｇ）外部病原性毒素、例えば病原性微生物、特に黄色ブドウ球菌、および／または空気汚染物、および／または紫外放射および／または界面活性剤によって誘導される抗炎症活性を提供する薬剤、および／または
（ｈ）病原性微生物、特に黄色ブドウ球菌の増殖および／または侵入および／または感染を阻害する薬剤、および／または
（ｉ）抗菌ペプチド（ＡＭＰ）の発現を誘導する薬剤、および／または
（ｊ）皮膚マイクロバイオームの健康な状態を維持および／または確立および／または修復する薬剤、および／または
（ｋ）皮膚の免疫応答を改善する薬剤
として用いられる。
（ａ）皮膚バリア機能を強化する薬剤、および／または
（ｂ）経表皮水分蒸散量を減少させる薬剤、および／または
（ｃ）フィラグリンの発現を誘導する薬剤、および／または
（ｄ）自然保湿因子に関連する成分を増加させる薬剤、および／または
（ｅ）抗炎症活性を提供する薬剤、特に、炎症パラメータを低下および／または抑制する薬剤、および／または
（ｆ）ケモカインによって誘導される抗炎症活性を提供する薬剤、および／または
（ｇ）外部病原性毒素、例えば病原性微生物、特に黄色ブドウ球菌、および／または空気汚染物、および／または紫外放射および／または界面活性剤によって誘導される抗炎症活性を提供する薬剤、および／または
（ｈ）病原性微生物、特に黄色ブドウ球菌の増殖および／または侵入および／または感染を阻害する薬剤、および／または
（ｉ）抗菌ペプチド（ＡＭＰ）の発現を誘導する薬剤、および／または
（ｊ）皮膚マイクロバイオームの健康な状態を維持および／または確立および／または修復する薬剤、および／または
（ｋ）皮膚の免疫応答を改善する薬剤
として用いられる。
【0048】
ラクトバチルス・プランタルム菌株ＨＥＡＬ１９およびＨＥＡＬ９９は、種々の方法で皮膚バリアを強化することができることが見いだされた。例えば、それらは、表皮恒常性、特に保湿性の調節にとって必須であるフィラグリンの発現を誘導することによって経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）を減少させることができる。さらに、該菌株は、適切な角質層水和およびバリア恒常性において同じように重要な役割を演じる自然保湿因子と関連する成分を増加させることが示された。他方で、皮膚バリア機能の強化に寄与するさらなる側面において、該菌株は、病原性微生物、例えば細菌および真菌の侵入に対する保護の増加という結果を生じる抗菌ペプチド（ＡＭＰ）の発現を誘導することができる。
【0049】
本発明の状況における遺伝子の発現の「誘導」または上方調節は、発現が種々の組織中または種々の条件において顕著に変化しない参照遺伝子、例えばいわゆるハウスキーピング遺伝子を用いて決定されてよい。ヒト細胞中の参照遺伝子として適する遺伝子は、当業者に公知である。下記の実験手順中で標準化のために参照遺伝子を用いる発現の誘導または上方調節の決定が説明される。
【0050】
ラクトバチルス・プランタルム菌株ＨＥＡＬ１９およびＨＥＡＬ９９は、外部毒素、例えば病原性微生物または汚染物質、のような種々の刺激に応答して放出される皮膚中のＩＬ－８などの炎症媒介物質を減少させることができることがさらに見いだされた。従って、それらは、炎症反応および関連する徴候を減少させることができる。
【0051】
さらに、ラクトバチルス・プランタルム菌株ＨＥＡＬ１９およびＨＥＡＬ９９は、病原性微生物、特に黄色ブドウ球菌の増殖に対して阻害効果を有することが示された。それらは、抗菌ペプチド（ＡＭＰ）の発現を誘導し、従って、皮膚の免疫応答を増強し、健康な皮膚マイクロバイオームを維持または確立することができる。健康なマイクロバイオームは、有害ではない、または有益でさえある（量の）特定の微生物の均衡の取れたコロニー化によって表される。この均衡が微生物ディスバイオーシスとして知られる状態の方へ移行すると有害な影響が生じ得る。
【0052】
多様であるが相互に関係する上記の効果に起因して、ラクトバチルス・プランタルム菌株ＨＥＡＬ１９およびＨＥＡＬ９９は、複数の病状の予防および／または処置のために有用であるだけでなく皮膚外観および体臭などの他の美容上の側面を改善する。
【0053】
好ましい実施形態において、皮膚症状は、アトピー性皮膚炎、微生物感染症、乾燥肌、皮膚のかゆみ、敏感肌、アトピー肌、皮膚の炎症、微生物ディスバイオーシス、酒さ、乾癬、発疹およびにきびからなる群から選ばれる。
【0054】
本発明は、ラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ１９（ＤＳＭ １５３１３）およびラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ９９（ＤＳＭ１５３１６）からなる群から選ばれた１種類の微生物または２種類の微生物の混合物とキャリアとを含むかもしくはからなる調製物であって、調製物は、粒子状調製物、好ましくは粒状体または粉体である調製物にも関する。
【0055】
本発明の目的にとって微生物をキャリアとの粒子状調製物の形で送達すると特に有利であることが見いだされた。粒子状調製物、特に乾燥粒状体または粉体は、例えば懸濁液より安定であり、施用の前に貯蔵されると顕著により長い貯蔵寿命を有する。よって、調製物を安定化する保存剤は必要でなく、冷却などの特別な貯蔵手段は必要でない。より長い貯蔵期間にわたっても、調製物は、退色またはその他の劣化徴候を示さない。さらに、粒子状調製物は、微生物の分布という点で均一であり、沈殿または凝塊のような望ましくない効果が均一性に影響を及ぼすことはない。従って、粒子状調製物は、容易にかつ効率的に医薬品または化粧品組成物または製品に加工することもできる。
【0056】
本発明の状況における「粒子状調製物」とは、明確な粒子からなる調製物である。好ましくは、粒子は、均一なサイズと微生物およびキャリアのむらのない分布とを有し、乾燥しかつ流動性であって塊を形成する傾向がない。詳しくは、粒子状調製物は、粒状体または粉体であってよい。そのような粒子状調製物あるいはそれぞれ粒状体または粉体は、０．１～２００μＭ、好ましくは１～１００μＭの範囲にある平均粒径を有する粒子を含むかまたはからなってよい。
【0057】
本発明による粒子状調製物は、微生物をキャリアとともに凍結乾燥、スプレー乾燥または造粒することによって得ることができる。
【0058】
上記の調製物の好ましい実施形態において、微生物は、熱処理に付されており、好ましくは、弱毒化または死滅微生物である。しかし、上記で説明したように、好ましくは、熱処理された微生物は、依然として無傷の物理的構造を有する。
【0059】
有利な点として、微生物は、熱処理時に皮膚症状の局所処置に関する自身の有益な特性を維持する。従って、生存可能な微生物は必要ないので、調製物は、保存剤を含む医薬品または化粧品製品中で用いることができる。
【0060】
本発明による調製物中に用いられるキャリアは、例えば凍結乾燥、スプレー乾燥または造粒によって粒子状の形で提供されるのに適している材料である。さらに、キャリアが薬学的におよび化粧品的に許容される材料であることが重要である。
【0061】
上記の調製物において、キャリアは、多糖、好ましくはイヌリン、デンプン、アラビアゴム、ホエータンパク質、脱脂粉乳およびマルトデキストリンならびにそれらの組み合わせ、好ましくはマルトデキストリンからなる群から選ばれてよい。
【0062】
本発明の状況において微生物とキャリアとの間の比が調製物の特性にとって決定的であることが見いだされた。少なすぎるキャリア、例えばマルトデキストリンが用いられた場合、調製物は、典型的には吸湿性となり、そのことが、安定性に悪影響を及ぼし塊を形成する傾向を増大させ得る。
【0063】
好ましい実施形態において、上記の調製物中でキャリアに対する微生物の比は、１：９～３：７、好ましくは１．５：８．５～２．５～７．５の範囲にあり、および／または調製物は、それぞれの場合に調製物の総重量に対して１０～３０重量％の微生物および７０～９０重量％のキャリア、好ましくは１５～２５重量％の微生物および７５～８５重量％のキャリアを含む。
【0064】
本発明は、局所施用による皮膚症状の処置および／または予防における使用のための、上記の実施形態のいずれかによる調製物にも関する。詳しくは、処置および／または予防されるべき皮膚症状は、皮膚バリア機能の低下、炎症性皮膚症状および／または病原性微生物の増殖であり、好ましくは、皮膚症状は、アトピー性皮膚炎、微生物感染症、乾燥肌、皮膚のかゆみ、敏感肌、アトピー肌、皮膚の炎症、微生物ディスバイオーシス、酒さ、乾癬、発疹およびにきびからなる群から選ばれる。
【0065】
本発明は、ラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ１９（ＤＳＭ１５３１３）およびラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ９９（ＤＳＭ１５３１６）からなる群から選ばれた１種類の微生物または２種類の微生物の混合物とキャリアとを含むかまたはからなる調製物、好ましくは、上記の実施形態のいずれかによる調製物を製造するための方法であって、
（ｉ）ラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ１９（ＤＳＭ１５３１３）およびラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ９９（ＤＳＭ１５３１６）からなる群から選ばれた1種類の微生物または２種類の微生物の混合物を準備するステップと、
（ｉｉ）任意選択として、ステップ（ｉ）の微生物を、好ましくは６０～１２１℃の範囲の温度で１秒～１２０分間の熱処理に付すステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）または（ｉｉ）からの微生物をキャリアと組み合わせ、さらに、粒状体または粉体を得るために、好ましくは凍結乾燥、スプレー乾燥または造粒によって該組み合わせを加工するステップと、
を含む方法にも関する。
（ｉ）ラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ１９（ＤＳＭ１５３１３）およびラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ９９（ＤＳＭ１５３１６）からなる群から選ばれた1種類の微生物または２種類の微生物の混合物を準備するステップと、
（ｉｉ）任意選択として、ステップ（ｉ）の微生物を、好ましくは６０～１２１℃の範囲の温度で１秒～１２０分間の熱処理に付すステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）または（ｉｉ）からの微生物をキャリアと組み合わせ、さらに、粒状体または粉体を得るために、好ましくは凍結乾燥、スプレー乾燥または造粒によって該組み合わせを加工するステップと、
を含む方法にも関する。
【0066】
上記の方法は、結果として得られる調製物が、上記のように非常に安定であって容易にかつ効率的に広い範囲の医薬品または化粧品製品に加工することができるため、本発明の目的に合わせて微生物を加工する非常に有利な方法を表す。
【0067】
さらなる側面によれば、本発明は、ラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ１９（ＤＳＭ１５３１３）およびラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ９９（ＤＳＭ１５３１６）からなる群から選ばれた１種類の微生物または２種類の微生物の混合物を含むか、または上記の実施形態のいずれかによる調製物を含む皮膚への局所施用のための医薬品または化粧品組成物あるいは医薬品または化粧品製品であって、微生物の総量は、皮膚症状、特に炎症性皮膚症状、皮膚バリア機能の低下、および／または病原性微生物の増殖を処置および／または予防するのに十分であり、好ましくは、微生物の総量は、それぞれの場合に組成物の総重量に対して、０．０１～５乾燥重量％、好ましくは０．０２～１乾燥重量％、例えば０．１～１乾燥重量％の範囲にあり、および／または、微生物の総量は、全組成物のグラムあたり少なくとも１０8、好ましくはグラムあたり５×１０8細胞または少なくとも１０10細胞、好ましくは１０11細胞（組成物のタイプに依存、例えば組成物が半製品であるかまたは最終製品であるかに依存）、例えば全組成物のグラムあたり１０8～５×１０10、好ましくは１０9～１０10細胞の範囲である、皮膚への局所施用のための医薬品または化粧品組成物あるいは医薬品または化粧品製品にも関する。
【0068】
驚くべきことに、ラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ１９およびラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ９９は、医薬品または化粧品組成物または製品の乾燥重量の０．０１または０．０２％という低い濃度で本明細書に記載される効果を既に提供することができることが見いだされた。
【0069】
例えば、ラクトバチルス懸濁液または、より好ましくは、上記の粒子状調製物は、さまざまな医薬品または化粧品の用途、例えば局所リーブオンまたはリンスオフ調合物のための活性成分として用いることができる。有効な量を含有する組成物は、皮膚感度の低下あるいは乾燥肌、皮膚のかゆみまたはアトピー性皮膚炎のような皮膚障害の処置にとって有用であり得る。これらの組成物は、アトピー性皮膚の連続処置にも、損傷、引っ掻き傷または創傷のような特定の皮膚患部への施用にも適している。さらに、これらの組成物は、無傷のバリアならびに健康な皮膚マイクロバイオーム状態を維持するために日常的に用いることができる。
【0070】
医薬品または化粧品組成物または製品の好ましい実施形態において、微生物は、熱処理に付されており、好ましくは弱毒化または死滅死んだ微生物であるが、依然として無傷の物理的構造を有する。熱処理の条件については、上記で定義したパラメータが適切に適用される。
【0071】
有利な点として、微生物は、典型的には、皮膚症状の局所処置に関するそれらの有益な特性を熱処理時に維持し、生存可能な微生物は必要ないので、医薬品または化粧品製品は、保存剤を含んでよい。
【0072】
従って、好ましい実施形態において、本明細書に記載される実施形態のいずれかによる医薬品または化粧品組成物または製品は、少なくとも１種類の保存剤を含む。
【0073】
本発明の状況における「保存剤」とは、微生物増殖を阻害または抑制する物質を指す。
【0074】
本発明は、局所施用による皮膚症状、特に皮膚バリア機能の低下、炎症性皮膚症状および／または病原性微生物の増殖の処置および／または予防における使用のための上記の医薬品または化粧品組成物または製品にも関する。
【0075】
ラクトバチルス・プランタルム菌株ＨＥＡＬ１９およびＨＥＡＬ９９は、皮膚に局所的に施用されると上記の効果ａ）～ｋ）を提供するので、有効な量の一方または両方の菌株を含む組成物および製品は、複数の皮膚症状を処置および／または予防し上記のように皮膚の外観を改善するのに効果がある。
【0076】
本発明による組成物および製品は、皮膚への局所施用が意図され、従って、好ましくは皮膚への局所施用に適した調合物中にある。そのような調合物は、リーブオンまたはリンスオフ調合物であってよい。
【0077】
さらなる好ましい実施形態において、上記の医薬品または化粧品組成物または製品は、水中油または油中水乳化液、軟膏、クレーム、ローションおよびジェルからなる群から選ばれる。
【0078】
これらの組成物および製品は、皮膚への施用のための適当な特性を提供するさらなる成分を含んでよい。従って、キャリア、賦形剤およびさらなる活性成分からなる群から選ばれた、好ましくはマルトデキストリン、イヌリン、緩和剤および植物油から選ばれた１種類以上の成分をさらに含む医薬品または化粧品組成物または製品が好ましい。
【0079】
本発明は、医薬品または化粧品組成物または製品、好ましくは本明細書に記載される実施形態のいずれかによる医薬品または化粧品組成物または製品を製造するための方法であって、
（ｉ）ラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ１９（ＤＳＭ１５３１３）およびラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ９９（ＤＳＭ１５３１６）からなる群から選ばれた１種類の微生物または２種類の微生物の混合物を準備するステップであって、好ましくは、微生物は、熱処理に付されており、好ましくは無傷の物理的構造を有する弱毒化または死滅微生物であるステップ、または上記の実施形態のいずれかによる調製物または上記の方法によって製造された調製物を準備するステップと、
（ｉｉ）医薬品または化粧品組成物または製品を得るためにステップ（ｉ）の微生物または調製物をキャリア、賦形剤およびさらなる活性成分から選ばれた１種類以上の物質と組み合わせるステップと、
を含む方法にも関する。
（ｉ）ラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ１９（ＤＳＭ１５３１３）およびラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ９９（ＤＳＭ１５３１６）からなる群から選ばれた１種類の微生物または２種類の微生物の混合物を準備するステップであって、好ましくは、微生物は、熱処理に付されており、好ましくは無傷の物理的構造を有する弱毒化または死滅微生物であるステップ、または上記の実施形態のいずれかによる調製物または上記の方法によって製造された調製物を準備するステップと、
（ｉｉ）医薬品または化粧品組成物または製品を得るためにステップ（ｉ）の微生物または調製物をキャリア、賦形剤およびさらなる活性成分から選ばれた１種類以上の物質と組み合わせるステップと、
を含む方法にも関する。
【0080】
本方法の好ましい実施形態において、ステップ（ｉｉ）において少なくとも１種類の保存剤がステップ（ｉ）の微生物または調製物と組み合わされる。
【0081】
本発明によれば、植物油は、アルガン油、チョークベリー（種子）油、アボカド油、ピーチ（ピット）油、カノーラ油、クロタネソウ油、カボチャ（カボチャ種子）油、野バラ（種子）油、ザクロ種子油、ホホバ油（液体ワックス）油、カカオ／カカオバター、小麦新芽油、ココナッツ／ココナッツバター、サフラワー油、コーン油、カメリナ油、アマ種子油、マカダミア油、ラズベリー種子油、メドウフォーム種子油、トケイソウ種子油、アーモンド油、ニーム油、モリンガ油、ルリジサ油、オリーブ油、ピーナッツ油、ヘイゼルナッツ油、胡桃油、パーム油、パパイア種子油、パセリ種子油、サジー油、ヒマシ油、米油、ゴマ油、シアバター／カリテバター、ヒマワリ油、大豆油、タマヌ油、イヴニングプリムローズ油、グレープ種子油、クランベリー種子油からなる群から選ばれてよい。
【0082】
本発明によれば、６～１８個、好ましくは８～１０個の炭素原子を有する脂肪族アルコールを主とするゲルベ（Ｇｕｅｒｂｅｔ）アルコール、直鎖Ｃ6～Ｃ22－脂肪酸と直鎖または分岐Ｃ6～Ｃ22－脂肪族アルコールとのエステルまたは分岐Ｃ6～Ｃ13－カルボン酸と直鎖または分岐Ｃ6～Ｃ22－脂肪族アルコールとのエステル、例えば、ミリスチルミリスチテート、ミリスチルパルミテート、ミリスチルステアレート、ミリスチルイソステアレート、ミリスチルオレエート、ミリスチルベヘネート、ミリスチルエルケート、セチルミリステート、セチルパルミテート、セチルステアレート、酸セチルイソステアレート、セチルオレエート、セチルベヘネート、セチルエルケート、ステアリルミリステート、ステアリルパルミテート、ステアリルステアレート、ステアリルイソステアレート、ステアリルオレエート、ステアリルベヘネート、ステアリルエルケート、イソステアリルミリステート、イソステアリルパルミテート、イソステアリルステアレート、イソステアリルイソステアレート、イソステアリルオレエート、イソステアリルベヘネート、イソステアリルオレエート、オレイルミリステート、オレイルパルミテート、オレイルステアレート、オレイルイソステアレート、オレイルオレエート、オレイルベヘネート、オレイルエルケート、ベヘニルミリステート、ベヘニルパルミテート、ベヘニルステアレート、ベヘニルイソステアレート、ベヘニルオレエート、ベヘニルベヘネート、ベヘニルエルケート、エルシルミリステート、エルシルパルミテート、エルシルステアレート、エルシルイソステアレート、エルシルオレエート、エルシルベヘネートおよびエルシルエルケートなどからなる群からさらなる適当な油体が選ばれてよい。直鎖Ｃ6～Ｃ22－脂肪酸と分岐アルコール、特に２－エチルヘキサノールとのエステル、Ｃ18～Ｃ38－アルキルヒドロキシカルボン酸と直鎖または分岐Ｃ6～Ｃ22－脂肪族アルコールとのエステル、特にジオクチルマレート、直鎖および／または分岐脂肪酸と多価アルコール（例えばプロピレングリコール、二量体ジオールまたは三量体トリオールなど）および／またはゲルベアルコールとのエステル、Ｃ6～Ｃ10－脂肪酸に基づくトリグリセリド、Ｃ6～Ｃ18－脂肪酸に基づく液体モノ－／ジ－／トリグリセリド混合物、Ｃ6～Ｃ22－脂肪族アルコールおよび／またはゲルベアルコールと芳香族カルボン酸、特に安息香酸とのエステル、Ｃ2～Ｃ12－ジカルボン酸と１～２２個の炭素原子を有する直鎖もしくは分岐アルコールまたは２～１０個の炭素原子および２～６個のヒドロキシル基を有するポリオールとのエステル、植物油、分岐一級アルコール、置換シクロヘキサン、直鎖および分岐Ｃ6～Ｃ22－脂肪族アルコール炭酸エステル、例えばジカプリリルカーボネート（セチオール（Ｃｅｔｉｏｌ）（登録商標）ＣＣ）など、６～１８個、好ましくは８～１０個の炭素原子を有する脂肪族アルコールに基づくゲルベ炭酸エステル、安息香酸と直鎖および／または分岐Ｃ6～Ｃ22－アルコールとのエステル（例えばフィンソルブ（Ｆｉｎｓｏｌｖ）（登録商標）ＴＮ）、アルキル基あたり６～２２個の炭素原子を有する直鎖または分岐、対称または非対称ジアルキルエーテル、例えばジカプリリルエーテル（セチオール（登録商標）ＯＥ）など、エポキシ化脂肪酸エステルとポリオールとの開環生成物、シリコーン油（シクロメチコーン、シリコーンメチコーングレード等）、脂肪族またはナフテン系炭化水素、例えばスクアラン、スクアレンまたはジアルキルシクロヘキサンおよび／または鉱油なども適している。
【0083】
本発明による組成物および製品において、好ましくは、ラクトバチルス・プランタルム菌株ＨＥＡＬ１９およびＨＥＡＬ９９は、乾燥肌および／または皮膚のかゆみ症状を予防、減少または軽減するための１種類以上の（さらなる）物質および／または１種類以上の皮層刺激低下剤、特に抗炎症剤、生理的清涼剤および発赤を軽減する化合物からなる群から選ばれた１種類以上の物質と組み合わされて用いられ、好ましくは、該１種類以上の追加の物質は、
（ｉ）かゆみ止め化合物、
（ｉｉ）コルチコステロイドタイプのステロイド系抗炎症物質、特にヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン誘導体、例えばヒドロコルチゾン１７－ブチレート、デキサメタゾン、リン酸デキサメタゾン、メチルプレドニゾロンまたはコルチゾン、
（ｉｉｉ）非ステロイド系抗炎症物質、特にピロキシカムまたはテノキシカムなどのオキシカム、アスピリン、ジサルシド、ソルプリンまたはフェンドサルなどのサリチレート、ジクロフェナク、フェンクロフェナク、インドメタシン、スリンダク、トルメチンまたはクリンダナクなどの酢酸誘導体、メフェナム、メクロフェナム、フルフェナムまたはニフルムなどのフェナメート、イブプロフェン、ナプロキセンまたはベノキサプロフェンなどのプロピオン酸誘導体、フェニルブタゾン、オキシフェニルブタゾン、フェブラゾンまたはアザプロパゾンなどのピラゾール、
（ｉｖ）発赤および／またはかゆみを軽減する天然または天然発生抗炎症物質、特にカモミール、アロエベラ、コンミフォラ属、ルビア属、ヤナギ、ヤナギソウ、エンバク、キンセンカ、アルニカ、セイヨウオトギリソウ、スイカズラ、ローズマリー、チャボトケイソウ、ウィッチヘーゼル、ショウガまたはエキヌス上目からの抽出物または画分、またはそれらの単一活性化合物、
（ｖ）好ましくは純物質の形状のα－ビサボロール、アピゲニン、アピゲニン－７－グルコシド、ギンゲロール、ショウガオール、ギンゲルジオール、デヒドロギンゲルジオン、パラドール、天然アベナンスラミド、非天然アベナンスラミド、好ましくはジヒドロアベナンスラミドＤ、ボスウェリア酸、フィトステロール、グリチルリジン、グラブリジンおよびリコカルコンＡ、
（ｖｉ）好ましくは、乳酸ナトリウム、尿素および誘導体、グリセロール、プロピレングリコール、１，２－ペンタンジオール、１，２－ヘキサンジオールおよび１，２－オクタンジオール、コラーゲン、エラスチンまたはヒアルウロン酸、ジアシルアジペート、ペトロラタム、ウロカニン酸、レシチン、アラントイン、パンテノール、フィタントリオール、リコペン、（プソイド）セラミド（好ましくはセラミド２、ヒドロキシプロピルビスパルミタミドＭＥＡ、セチルオキシプロピルグリセリルメトキシプロピルミリスタミド、Ｎ－（１－ヘキサデカノイル）－４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリン（１－ヘキサデシル）エステル、ヒドロキシエチルパルミチルオキシヒドロキシプロピルパルミタミド）、グリコスフィンゴリピド、コレステロール、フィトステロール、キトサン、コンドロイチン硫酸、ラノリン、ラノリンエステル、アミノ酸、ビタミンＥおよび誘導体（好ましくはトコフェロール、トコフェリルアセテート）、α－ヒドロキシ酸（好ましくはクエン酸、乳酸、リンゴ酸）およびそれらの誘導体、単糖、二糖およびオリゴ糖、好ましくはグルコース、ガラクトース、フルクトース、マンノース、果糖およびラクトース、多糖、例えばβ－グルカン、特にエンバクからの１，３－１，４－β－グルカン、α－ヒドロキシ－脂肪酸、トリテルペン酸、例えばベツリン酸またはウルソル酸、および藻類抽出物またはそれらの単一活性化合物からなる群から選ばれたスキンケア剤、好ましくは皮膚保湿調節剤または皮膚修復剤、
（ｖｉｉ）好ましくは、メントングリセロールアセタール、メンチルラクテート好ましくはｌ－メンチルラクテート、特にｌ－メンチルｌ－ラクテート）、メンチルエチルオキサメート、置換メンチル－３－カルボン酸アミド（例えばメンチル－３－カルボン酸Ｎ－エチルアミド、Ｎα－（Ｌ－メンタンカルボニル）グリシンエチルエステル、２－イソプロピル－Ｎ－２，３－トリメチルブタナミド、置換シクロヘキサンカルボン酸アミド、３－メントキシプロパン－１，２－ジオール、２－ヒドロキシエチルメンチルカーボネート、２－ヒドロキシプロピルメンチルカーボネート、Ｎ－アセチルグリシンメンチルエステル、イソプレゴール、メンチルヒドロキシカルボン酸エステル（例えばメンチル３－ヒドロキシブチレート）、モノメンチルスクシネート、モノメンチルグルタレート、２－メルカプトシクロデカノン、メンチル２－ピロリジン－５－オンカルボキシレート、２，３－ジヒドロキシ－ｐ－メンタン、３，３，５－トリメチルシクロヘキサノングリセロールケタール、３－メンチル３，６－ジ－およびトリオキサアルカノエート、３－メンチルメトキシアセテートおよびイシリンからなる群から選ばれた生理学的清涼剤、および
（ｖｉｉｉ）ヒスタミン受容体拮抗薬、セリンプロテアーゼ阻害剤、ＴＲＰＶ１拮抗薬、ＮＫ１アンタゴンシスト、カンナビノイド受容体作動薬およびＴＲＰＶ３拮抗薬、
からなる群から選ばれる。
（ｉ）かゆみ止め化合物、
（ｉｉ）コルチコステロイドタイプのステロイド系抗炎症物質、特にヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン誘導体、例えばヒドロコルチゾン１７－ブチレート、デキサメタゾン、リン酸デキサメタゾン、メチルプレドニゾロンまたはコルチゾン、
（ｉｉｉ）非ステロイド系抗炎症物質、特にピロキシカムまたはテノキシカムなどのオキシカム、アスピリン、ジサルシド、ソルプリンまたはフェンドサルなどのサリチレート、ジクロフェナク、フェンクロフェナク、インドメタシン、スリンダク、トルメチンまたはクリンダナクなどの酢酸誘導体、メフェナム、メクロフェナム、フルフェナムまたはニフルムなどのフェナメート、イブプロフェン、ナプロキセンまたはベノキサプロフェンなどのプロピオン酸誘導体、フェニルブタゾン、オキシフェニルブタゾン、フェブラゾンまたはアザプロパゾンなどのピラゾール、
（ｉｖ）発赤および／またはかゆみを軽減する天然または天然発生抗炎症物質、特にカモミール、アロエベラ、コンミフォラ属、ルビア属、ヤナギ、ヤナギソウ、エンバク、キンセンカ、アルニカ、セイヨウオトギリソウ、スイカズラ、ローズマリー、チャボトケイソウ、ウィッチヘーゼル、ショウガまたはエキヌス上目からの抽出物または画分、またはそれらの単一活性化合物、
（ｖ）好ましくは純物質の形状のα－ビサボロール、アピゲニン、アピゲニン－７－グルコシド、ギンゲロール、ショウガオール、ギンゲルジオール、デヒドロギンゲルジオン、パラドール、天然アベナンスラミド、非天然アベナンスラミド、好ましくはジヒドロアベナンスラミドＤ、ボスウェリア酸、フィトステロール、グリチルリジン、グラブリジンおよびリコカルコンＡ、
（ｖｉ）好ましくは、乳酸ナトリウム、尿素および誘導体、グリセロール、プロピレングリコール、１，２－ペンタンジオール、１，２－ヘキサンジオールおよび１，２－オクタンジオール、コラーゲン、エラスチンまたはヒアルウロン酸、ジアシルアジペート、ペトロラタム、ウロカニン酸、レシチン、アラントイン、パンテノール、フィタントリオール、リコペン、（プソイド）セラミド（好ましくはセラミド２、ヒドロキシプロピルビスパルミタミドＭＥＡ、セチルオキシプロピルグリセリルメトキシプロピルミリスタミド、Ｎ－（１－ヘキサデカノイル）－４－ヒドロキシ－Ｌ－プロリン（１－ヘキサデシル）エステル、ヒドロキシエチルパルミチルオキシヒドロキシプロピルパルミタミド）、グリコスフィンゴリピド、コレステロール、フィトステロール、キトサン、コンドロイチン硫酸、ラノリン、ラノリンエステル、アミノ酸、ビタミンＥおよび誘導体（好ましくはトコフェロール、トコフェリルアセテート）、α－ヒドロキシ酸（好ましくはクエン酸、乳酸、リンゴ酸）およびそれらの誘導体、単糖、二糖およびオリゴ糖、好ましくはグルコース、ガラクトース、フルクトース、マンノース、果糖およびラクトース、多糖、例えばβ－グルカン、特にエンバクからの１，３－１，４－β－グルカン、α－ヒドロキシ－脂肪酸、トリテルペン酸、例えばベツリン酸またはウルソル酸、および藻類抽出物またはそれらの単一活性化合物からなる群から選ばれたスキンケア剤、好ましくは皮膚保湿調節剤または皮膚修復剤、
（ｖｉｉ）好ましくは、メントングリセロールアセタール、メンチルラクテート好ましくはｌ－メンチルラクテート、特にｌ－メンチルｌ－ラクテート）、メンチルエチルオキサメート、置換メンチル－３－カルボン酸アミド（例えばメンチル－３－カルボン酸Ｎ－エチルアミド、Ｎα－（Ｌ－メンタンカルボニル）グリシンエチルエステル、２－イソプロピル－Ｎ－２，３－トリメチルブタナミド、置換シクロヘキサンカルボン酸アミド、３－メントキシプロパン－１，２－ジオール、２－ヒドロキシエチルメンチルカーボネート、２－ヒドロキシプロピルメンチルカーボネート、Ｎ－アセチルグリシンメンチルエステル、イソプレゴール、メンチルヒドロキシカルボン酸エステル（例えばメンチル３－ヒドロキシブチレート）、モノメンチルスクシネート、モノメンチルグルタレート、２－メルカプトシクロデカノン、メンチル２－ピロリジン－５－オンカルボキシレート、２，３－ジヒドロキシ－ｐ－メンタン、３，３，５－トリメチルシクロヘキサノングリセロールケタール、３－メンチル３，６－ジ－およびトリオキサアルカノエート、３－メンチルメトキシアセテートおよびイシリンからなる群から選ばれた生理学的清涼剤、および
（ｖｉｉｉ）ヒスタミン受容体拮抗薬、セリンプロテアーゼ阻害剤、ＴＲＰＶ１拮抗薬、ＮＫ１アンタゴンシスト、カンナビノイド受容体作動薬およびＴＲＰＶ３拮抗薬、
からなる群から選ばれる。
【0084】
さらなる側面によれば、本発明は、特に皮膚の外観を改善し、および／または体臭を予防する、皮膚への局所施用のための微生物または２種類の微生物を含むかまたはからなる混合物の化粧使用にも関し、微生物は、ラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ１９（ＤＳＭ１５３１３）およびラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ９９（ＤＳＭ１５３１６）からなる群から選ばれ、好ましくは、微生物は、熱処理に付されており、および／または無傷の物理的構造を有する弱毒化または死滅微生物である。
【0085】
「化粧使用」とは、非治療的な使用、すなわち例えば刺激、発赤、乾燥、フレーキング、発疹、加齢の徴候または軽症のにきびによって外観が影響を受け、美容上の問題または若干の不快感を表すが病理的であるとは特徴付けられない、皮膚への使用である。さらなる「化粧使用」は、悪臭の原因となるが患者の健康への差し迫った危険を表さない皮膚上の特定の微生物の増殖と関係する体臭の予防または減少である。
【0086】
よって、上記の化粧使用は、好ましくは、皮膚刺激、乾燥肌、発疹、にきび、体臭および／または皮膚老化を減少させるかまたは予防するためのものである。
【0087】
本発明による化粧使用において、微生物は、
（ａ）皮膚バリア機能を強化する薬剤、および／または
（ｂ）経表皮水分蒸散量を減少させる薬剤、および／または
（ｃ）フィラグリンの発現を誘導する薬剤、および／または
（ｄ）自然保湿因子に関連する成分を増加させる薬剤、および／または
（ｅ）抗炎症活性を提供する、特に炎症パラメータを減少および／または抑制する薬剤、および／または
（ｆ）ケモカインによって誘導される抗炎症活性を提供する薬剤、および／または
（ｇ）外部病原性毒素、例えば病原性微生物、特に黄色ブドウ球菌、および／または大気汚染物質、および／または紫外線および／または界面活性剤によって誘導される抗炎症活性を提供する薬剤、および／または
（ｈ）病原性微生物、特に黄色ブドウ球菌の増殖および／または侵入および／または感染を阻害する薬剤、および／または
（ｉ）抗菌ペプチド（ＡＭＰ）の発現を誘導する薬剤、および／または
（ｊ）皮膚マイクロバイオームの健康状態を維持および／または確立および／または回復する薬剤、および／または
（ｋ）皮膚の免疫応答を改善する薬剤、
として用いられる。
（ａ）皮膚バリア機能を強化する薬剤、および／または
（ｂ）経表皮水分蒸散量を減少させる薬剤、および／または
（ｃ）フィラグリンの発現を誘導する薬剤、および／または
（ｄ）自然保湿因子に関連する成分を増加させる薬剤、および／または
（ｅ）抗炎症活性を提供する、特に炎症パラメータを減少および／または抑制する薬剤、および／または
（ｆ）ケモカインによって誘導される抗炎症活性を提供する薬剤、および／または
（ｇ）外部病原性毒素、例えば病原性微生物、特に黄色ブドウ球菌、および／または大気汚染物質、および／または紫外線および／または界面活性剤によって誘導される抗炎症活性を提供する薬剤、および／または
（ｈ）病原性微生物、特に黄色ブドウ球菌の増殖および／または侵入および／または感染を阻害する薬剤、および／または
（ｉ）抗菌ペプチド（ＡＭＰ）の発現を誘導する薬剤、および／または
（ｊ）皮膚マイクロバイオームの健康状態を維持および／または確立および／または回復する薬剤、および／または
（ｋ）皮膚の免疫応答を改善する薬剤、
として用いられる。
【0088】
項目（ａ）～（ｋ）に記載され、さらに上記でより詳しく説明された効果は、化粧だけに関する複数の問題に対処する適当な組み合わせも表す。例えば、皮膚バリア機能の低下は、発赤またはフレーキングなどの刺激の徴候を示す乾燥肌を生じる結果となり、従って皮膚の外観に影響を及ぼす、経表皮水分蒸散量の増加につながることがある。フィラグリンの上方制御と自然保湿因子に関連する成分の増加とは、そのような問題を予防または軽減する。抗炎症活性は、皮膚の外観に影響を及ぼすが病理症状を表さない特定の刺激に対する皮膚反応によって引き起こされる膨潤または発赤の徴候を減少させる。例えばＡＭＰの発現を誘導することによって病原性微生物の増殖を阻害すると、穏やかな事例のにきびを解消するかまたは体臭を防止および減少させることができる。
【0089】
上記の化粧使用の好ましい実施形態において、微生物は、上記の実施形態のいずれかによる調製物の形で用いられる。
【0090】
さらなる側面において、本発明は、特に皮膚刺激、乾燥肌、発疹、にきび体臭および／または皮膚老化を減少または予防するために皮膚の外観を改善し、および／または体臭を予防する、化粧方法であって、
ｉ）微生物または２種類の微生物を含むかまたはからなる混合物を皮膚に局所施用するステップであって、微生物は、ラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ１９（ＤＳＭ１５３１３）およびラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ９９（ＤＳＭ１５３１６）からなる群から選ばれるステップ、あるいは上記の調製物または化粧品組成物または製品を皮膚に施用するステップであって、好ましくは、微生物は、熱処理に付されており、および／または無傷の物理的構造を有する弱毒化または死滅微生物であるステップ、
を含む方法にも関する。
ｉ）微生物または２種類の微生物を含むかまたはからなる混合物を皮膚に局所施用するステップであって、微生物は、ラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ１９（ＤＳＭ１５３１３）およびラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ９９（ＤＳＭ１５３１６）からなる群から選ばれるステップ、あるいは上記の調製物または化粧品組成物または製品を皮膚に施用するステップであって、好ましくは、微生物は、熱処理に付されており、および／または無傷の物理的構造を有する弱毒化または死滅微生物であるステップ、
を含む方法にも関する。
【0091】
「化粧方法」とは、上記で化粧使用の状況においてより詳しく説明されたように、美容上の問題を解決するが病理症状を処置することはない非治療的な方法である。本発明による化粧方法において、微生物は、項目（ａ）～（ｋ）における上記の効果を提供する剤として作用し、従って上記の化粧使用の状況において説明された複数の美容上の問題を解決することができる。
【図面の簡単な説明】
【0092】
【図1】ＨａＣａＴケラチノサイト中のＬ．プランタルムＨＥＡＬ１９による抗菌ペプチドの誘導を示す。顕著に誘導される遺伝子は、β－デフェンシン３、β－デフェンシン４、ペプチダーゼインヒビター３、ＲＮアーゼ７、ソリアシン、ラクトトランスフェリンおよび分泌性白血球ペプチダーゼインヒビターである。ＨａＣａＴケラチノサイト中の抗菌ペプチドの遺伝子発現は、遺伝子アレイを用いた０，０５％のＬ．プランタルムＨＥＡＬ１９による２４時間処理後に測定された。誘導は、＞２のＲＱ－計算値として定義された。
【図2】ＨａＣａＴケラチノサイト中のＬ．プランタルムＨＥＡＬ１９によるβ－デフェンシン３の濃度依存誘導を示す。ＨａＣａＴケラチノサイトは、さまざまな濃度のＬ．プランタルムＨＥＡＬ１９で２４時間処理された。これは、２４３．６（０．１％のＬ．プランタルムＨＥＡＬ１９）から２．３（０．０１２５％のＬ．プランタルムＨＥＡＬ１９）のＲＱ－計算値を生じる結果となる。
【図3】２４時間処理後のＡＭＰコーディング遺伝子のさまざまな誘導を示す。Ｌ．プランタルムＨＥＡＬ９９によってＲＮアーゼ７、β－デフェンシン３ペプチダーゼインヒビター３、ホスホリパーゼＡ２、および分泌性白血球ペプチダーゼインヒビターが濃度依存的に（０．１および０．０５％が試験された）誘導される。
【図4】Ｌ．プランタルムＨＥＡＬ１９および９９と陽性対照として含まれるデキサメタゾンとの抗炎症効果を示す。コンフルエントＨａＣａＴケラチノサイトは、試験材料０，１ｍｇ／ｍｌのＬ．プランタルムＨＥＡＬ９９、０．２５ｍｇ／ｍＬのＬ．プランタルムＨＥＡＬ１９および３０μＭのデキサメタゾンで予備処理された。４８時間のインキュベーション後、ケラチノサイトは、３０ｎｇ／ｍＬの炎症性ＩＬ－１αを用いて８時間刺激された。Ｌ．プランタルムＨＥＡＬ１９およびＨＥＡＬ９９による予備処理後のＩＬ－１α刺激に起因するＨａＣａＴケラチノサイトからのその後のインターロイキン８放出は、ＥＬＩＳＡを用いて細胞培養培地中で測定された。陽性対照デキサメタゾンおよび予備処理されていないケラチノサイト（ＩＬ－１α対照）との比較が示される。
【図5】プラセボおよびＬ．プランタルムＨＥＡＬ１９調合物による生体外ヒト皮膚モデルの処理とディーゼル微粒子１６５０ｂ（空気汚染をシミュレーションする）による刺激との後のＩＬ－８放出（縦軸）を示す
【図6】Ｌ．プランタルムＨＥＡＬ１９による予備処理後のＳ．アウレウス刺激に起因するＨａＣａＴケラチノサイトのインターロイキン－８放出を示す。予備処理されていないケラチノサイトとの比較が示される（Ｓ．アウレウス対照）。
【図7】用量依存的な方法で、すなわち０．１および／または０．０５％のＬ．プランタルムＨＥＡＬ１９で処理したときのＳ．アウレウスの増殖阻害効果を示す。陽性増殖対照および陰性対照（阻害対照、殺生物剤ファルネソールの添加）との比較が示される。
【図8】さまざまな濃度のＬ．プランタルムＨＥＡＬ１９（ｘ軸）による処理後の生体外ヒト皮膚モデルにおけるインボルクリンの産生（縦軸）を示す。ベヒクル（ＤＭＳＯ）だけを含む陰性対照との比較が示される。
【図9】さまざまな濃度のＬ．プランタルムＨＥＡＬ１９（ｘ軸）による処置後の生体外ヒト皮膚モデルにおけるサイトケラチン１４（ＣＫ１４）内容物の産生（縦軸）を示す。ベヒクル（ＤＭＳＯ）だけを含む陰性対照との比較が示される。
【図10】プラセボおよびＬ．プランタルムＨＥＡＬ１９調合物による生体外処理とディーゼル微粒子１６５０ｂによる刺激との後のローダミンＢ検出百分率（縦軸）を示す。
【図11】乾燥肌のための３Ｄ表皮模型系において測定した細胞間空間１０００ｎｍ２あたりの細胞間脂質ラメラの長さ（ｎｍ）を示す。ラメラは、ＳＤＳ処理に起因して撹乱された。スキンケア調合物中の０．５％のＬ．プランタルムＨＥＡＬ１９による処理後、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）によって皮膚修復性能が決定された。
【図12】Ｌ．プランタルムＨＥＡＬ１９およびＨＥＡＬ９９による処理後のＨＥＰＫｐ３次元皮膚モデルのヒアルロン酸放出（縦軸）を示す。細胞培養培地だけを含む陰性対照（培地対照）、ｘ軸との比較が示される。
【図13】Ｌ．プランタルムＨＥＡＬ１９およびＨＥＡＬ９９による処置後のＨＥＰＫｐ ３ Ｄ皮膚モデルからのフィラグリン放出（縦軸）を示す。細胞培養培地だけを含む陰性対照（培地対照）、x軸との比較が示される。
【図14】２つの異なる濃度のＬ．プランタルムＨＥＡＬ１９による処理後の生体外ヒトモデルにおけるフィラグリン含量を示す。ベヒクル（ＤＭＳＯ）だけを含む陰性対照との比較が示される。
【図15】静電容量によって決定された、化粧クリーム中１％濃度のＬ．プランタルムＨＥＡＬ１９による処理後の生体内ヒト皮膚における含水量を示す。灰色の影付き棒は、Ｌ．プランタルムＨＥＡＬ１９を有するクリームを表し、白色の棒は、プラセボクリームを表し、黒色の棒は、処理なしを示す。
【図16】経表皮水分蒸散量（ＴＥＭＬ）によって決定された、化粧クリーム中１％濃度のＬ．プランタルムＨＥＡＬ１９による処理後の生体内ヒト皮膚における皮膚バリア強度を示す。灰色の影付き棒は、Ｌ．プランタルムＨＥＡＬ１９を有するクリームを表し、白色の棒は、プラセボクリームを表し、黒色の棒は、処理なしを示す。
【図17】ＭＲＳ培地中のＬ．プランタルム属の１６時間にわたる増殖曲線を示す。開始－ＯＤ＝０．１；３つのキャビティの平均。
【実施例0093】
本発明は、下記の実施例によってさらに例示される。実施例は、範囲に関して限定すると理解されるべきでない。
【0094】
実施例においては以下の実験手順を用いた。
【0095】
熱処理したラクトバチルス属懸濁液の調製
【0096】
さまざまな培養培地中でＬ．プランタルム菌株ＨＥＡＬ１９ウントＨＥＡＬ９９の増殖を得ることができる。炭素源は、グルコースまたはデンプンであってよい。肉エキス、酵母エキス、ペプトンまたはプロテアーゼペプトン（野菜）等を窒素源として用いることができる。培地のｐＨは、約６であるべきである。培養温度は変化してよいが、好ましくは３７℃である。培養時間は、約８～２４ｈであってよい。振盪または通気振盪を追加することができる。
【0097】
培養後に洗浄プロセスを追加することができる。それは、以下のように実行することができる。最初に遠心分離によって細胞を回収し、上清液をデカンテーションし、細胞ペレットを液体ＰＢＳ、細胞培養培地または精製水で懸濁させることができる。必要なら記載された手順を繰り返すことができる。
【0098】
洗浄手順の前または後にラクトバチルス属懸濁液の熱処理を行うことができる。それは、超音波、紫外線照射または熱によって実現することができるが、熱処理が好ましい。それは、６０℃～１２１℃の温度で行うことができる。１００℃を超える温度の場合はオートクレーブを用いてよい。熱処理時間は、１秒～１２０分、例えば２０秒～１２０分の範囲にすることができる。工業用低温殺菌装置を用いた７０～１００℃の間での２０秒～１５分間の熱処理が好ましい。熱処理したラクトバチルス属のための任意選択のさらなる処理は、凍結乾燥、スプレー乾燥、造粒等を含んでよい。このことは、製品自体の利用可能性および／または安定性を改善する目的に役立ち得る。
【0099】
最終製品は、粉体、粒状体、懸濁液または溶液であってよく、化粧品組成物中０．００１～１０重量／体積％の濃度で施用されるように定められる。これは、１×１０7～１×１０11細胞／ｍＬ化粧品調合物の濃度と関係する。より好ましくは、最終製品は、０．０１～５％、さらに好ましくは０．０２～１重量／体積％、例えば０．１～１重量／体積％の濃度で施用される。
【0100】
単一層として増殖したケラチノサイト中のＡＭＰ遺伝子発現に対するラクトバチルス菌株の効果
【0101】
タックマン（Ｔａｑ－Ｍａｎ）（登録商標）アレイ高速９６ウェルプレートを用いたリアルタイムＰＣＲ分析でＡＭＰ誘導を測定した。
【0102】
ＨＫＧＳ（ジブコライフテクノロジーズ（Ｇｉｂｃｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を含むエピライフ（ＥｐｉＬｉｆｅ）培地（カスケードバイオロジクス（ｃａｓｃａｄｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）、ジブコ（Ｇｉｂｃｏ））中でＨａＣａＴケラチノサイトを培養した。試験物質を等量の培地中で希釈し、ウェルあたり２ｍＬの体積で６ウェルプレートに加えた。３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした１００％コンフルエント細胞に対してすべての試料を試験した。２４時間のインキュベーション時間後、すべての試料を取り出し、ＣａおよびＭｇを有するダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）のリン酸緩衝液（カプリコーン（Ｃａｐｒｉｃｏｒｎ））で細胞を２回洗浄した。ＲＮイージー（ＲＮｅａｓｙ）（登録商標）ミニキット（キアジェン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いてＲＮＡ分離を行った。この手順は、ＲＮイージーミニハンドブック中に記載されている通りに実行した。
【0103】
細胞を溶菌し、エタノールで沈殿させ、スピンカラムを用いてホモジェネートを３回洗浄し、精製水でｍＲＮＡを溶出させた。試料に応じて、この手順を若干調節した。
【0104】
マイクロキュベット（μＣｕｖｅｔｔｅ）Ｇ １．０およびバイオフォトメーター（ＢｉｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）（エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ））を用いて２６０ｎｍの吸収を測定することによりＲＮＡ濃度を測定した。Ｅ２６０／２８０またはE２６０／２３０のような対照値を同時に計算した。試料あたり０．５～１μg ＲＮＡの最小量で転写を行った。
【0105】
アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のＲＮＡからｃＤＮＡへの高容量キットを用いて逆転写を行った。手順は、提供されたプロトコルに基づいた。逆転写のために３７℃で６０分間、続いて９５℃で５分間（酵素不活性化）運転し、反応室中の温度を４℃に保持するＰＣＲサーモサイクラー（Ｔｈｅｒｍｏｃｙｌｅｒ）（バイオメトラ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ））中ですべての試料をインキュベートした。
【0106】
ステップワンプラスファストリアルタイム（ＳｔｅｐＯｎｅ Ｐｌｕｓ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ）ＰＣＲ装置（アプライド・バイオシステムズ）を用いて定量的リアルタイムＰＣＲを行った。ＲＴ－ＰＣＲの初期ステップは、９５℃に２０秒間保持する第１の加熱段階と、それに続く９５℃における３秒間のｃＤＮＡ変性および６０℃における３０秒間のアニーリング／伸長のサイクル４０回とを含む。
【0107】
２－ΔＣＴ法によって分析を行った。詳しくは、以下の通りである。
１．基準－ｇｅｎ（ＨＰＲＴ）を用いるＣｔ値の標準化
ΔＣT値遺伝子＝ＣT値遺伝子－ＣT値基準遺伝子(HPRT)
２．対照試料（処理なし）のΔＣT－値とΔＣT－値（処理あり）との減算
ΔΔＣT値遺伝子＝ΔＣT値処置あり－ΔＣT値対照
３．ＲＱ－比（相対定量値）の計算
ＲＱ－値＝２-ΔΔCT
１．基準－ｇｅｎ（ＨＰＲＴ）を用いるＣｔ値の標準化
ΔＣT値遺伝子＝ＣT値遺伝子－ＣT値基準遺伝子(HPRT)
２．対照試料（処理なし）のΔＣT－値とΔＣT－値（処理あり）との減算
ΔΔＣT値遺伝子＝ΔＣT値処置あり－ΔＣT値対照
３．ＲＱ－比（相対定量値）の計算
ＲＱ－値＝２-ΔΔCT
【0108】
妥当な遺伝子の誘導として＞２のＲＱ－値を定義した。
【0109】
ラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ１９およびＨＥＡＬ９９の抗炎症効果
【0110】
ろ過滅菌し、Ｌ－グルタミン（カプリコーン（Ｃａｐｒｉｃｏｒｎ））を加え、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（カプリコーン）で補ったＲＰＭＩ－Ａ培地を用いて９６ウェルプレート中でＨａＣａＴケラチノサイトを培養した。３７℃および５％ＣＯ２でプレートをインキュベートした。細胞培養培地（ＲＰＭＩ、１％ＦＣＳ）による２４時間飢餓培養の後、細胞を１回洗浄した。抗炎症性物質／不活性化細菌懸濁液を飢餓培養培地中に懸濁し、上記のパラメータで２４／４８時間施用し、インキュベートした。１０μＭの濃度のデキサメタゾンを陽性対照として用いた。予備インキュベーション後に細菌細胞を除去するためにすべてのウェルを細胞培養培地で３回洗浄した。ＩＬ－１α（ジブコライフテクノロジーズ）を蒸留Ｈ2Ｏに溶解し、飢餓培養培地中に希釈し、好ましくは３０ｎｇ／ｍＬの濃度でウェルにピペット注入した。あるいは、熱不活性化した黄色ブドウ球菌（ＤＳＭ７９９）懸濁液を０．１ｍｇ／ｍＬ～１ｍｇ／ｍＬ乾燥質量の濃度で炎症誘発剤として用いた。８時間のインキュベーション後、上清液を分離した。以降の分析まですべての試料を－８０℃で貯蔵した。
【0111】
ヒトＣＸＣＬ８／ＩＬ-８、デュオセット（ＤｕｏＳｅｔ）ＥＬＩＳＡ（デベロップメント・システムズ（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｒ＆Ｄシステムズ）でＩＬ－８濃度を測定した。提供プロトコルに記載の通りに実験手順を実行した。
【0112】
２連／３連値の平均値および平均ゼロ標準光学密度の減算を計算した後に、標準曲線を作成するために４パラメータ・ロジスティック曲線当て嵌めを用いて計算を行った。
【0113】
ヒアルロン酸の誘導
【0114】
ヒト表皮ケラチノサイト前駆体（ＨＥＰＫｐ）発生３ｄヒト皮膚モデルを培養し、試験物質で全身的に処理した。手短には、定められた濃度の試験物質を細胞培養培地に加え、各皮膚モデルを細胞培養皿中３７℃および５％ＣＯ2で最長９日間処理した。処理後、回収した上清液を以降の分析まで－８０℃で貯蔵した。ＭＴＴ標準方法によって細胞の生存能力を制御した。
【0115】
ＴＥＣＯメディカル（ＴＥＣＯｍｅｄｉｃａｌ）ヒアルロン酸プラスＥＬＩＳＡによってヒアルロン酸濃度を測定した。提供プロトコルに記載の通りに実験手順を実行した。
【0116】
ラクトバチルス菌株の抗菌効果
【0117】
光度測定法により６２０ｎｍでさまざまな細菌の増殖曲線を測定した。
【0118】
黄色ブドウ球菌の阻害：
オートクレーブ処理したＣＡＳＯ培地（メルク（ＭＥＲＣＫ）１．０５４５９）およびＤＭＳＯまたは蒸留水に溶解した試験物質を用い、ＤＩＮ５８９４０－８に従って９６ウェルＭＴＰを調製した。１０％グリセリン中－２０℃に維持した保存培養物を用いてＳ．アウレウス（ＤＳＭ７９９／ＡＴＣＣ６５３８）を関連するウェルに接種した。ウェルあたり１～６×１０6ｃｆｕの接種材料を加えた。３７℃で１６時間のインキュベーション時に３つまたは４つの繰り返しウェルを用いて試験物質を分析した。サンライズフォトメーター（Ｓｕｎｒｉｓｅ Ｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）（テカン（Ｔｅｃａｎ）、オーストリア）およびマゼラン（Ｍａｇｅｌｌａｎ）ソフトウエアを用いて６２０ｎｍの吸収により各ウェルの増殖曲線を決定した。共にＤＭＳＯ（メルク（Ｍｅｒｃｋ）８０２９１２）に前もって溶解した１２５ｐｐｍファルネソールおよび４ｐｐｍトリクロサンの濃度を増殖阻害の陽性対照として用いた。
オートクレーブ処理したＣＡＳＯ培地（メルク（ＭＥＲＣＫ）１．０５４５９）およびＤＭＳＯまたは蒸留水に溶解した試験物質を用い、ＤＩＮ５８９４０－８に従って９６ウェルＭＴＰを調製した。１０％グリセリン中－２０℃に維持した保存培養物を用いてＳ．アウレウス（ＤＳＭ７９９／ＡＴＣＣ６５３８）を関連するウェルに接種した。ウェルあたり１～６×１０6ｃｆｕの接種材料を加えた。３７℃で１６時間のインキュベーション時に３つまたは４つの繰り返しウェルを用いて試験物質を分析した。サンライズフォトメーター（Ｓｕｎｒｉｓｅ Ｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）（テカン（Ｔｅｃａｎ）、オーストリア）およびマゼラン（Ｍａｇｅｌｌａｎ）ソフトウエアを用いて６２０ｎｍの吸収により各ウェルの増殖曲線を決定した。共にＤＭＳＯ（メルク（Ｍｅｒｃｋ）８０２９１２）に前もって溶解した１２５ｐｐｍファルネソールおよび４ｐｐｍトリクロサンの濃度を増殖阻害の陽性対照として用いた。
【0119】
計算のために、検出した吸収の平均を計算し、ブランク値を用いて規格化した。グラフ表示のためにこれらのＯＤ値を時間の関数としてプロットした。
【0120】
３Ｄ皮膚モデルにおける保湿因子フィラグリンの誘導
【0121】
ヒト表皮ケラチノサイト前駆体（ＨＥＰＫｐ）から誘導した３次元皮膚モデルをＣｎＴ－ＰＲ－３Ｄ培地中で験物質により９日間全身的に処理した。フィラグリン用ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（酵素結合免疫収着媒アッセイ））キット（クラウド－クローン社（Ｃｌｏｕｄ－Ｃｌｏｎｅ Ｃｏｒｐ．））によって培地中のフィラグリン放出を検出した。
【0122】
乾燥肌のためのＳＤＳ損傷３Ｄ皮膚モデルに対するバリア改善効力
【0123】
この目的で、乾燥肌のための３Ｄ表皮モデル系に対して試験管内研究を行った。モデル系は、ＳＤＳ処理に起因する撹乱を受けた表皮皮膚バリアを有する１４日齢の成熟表皮細胞培養物からなっていた。表皮バリアの撹乱を細胞間脂質ラメラの低下として測定した。化粧品乳濁液またはプラセボ乳濁液中に調合したＬ．プランタルムＨＥＡＬ１９による処理の後と、次に細胞間脂質ラメラの再形成を観察するためにさらに培養された後の透過型電子顕微鏡観察（ＴＥＭ）によって皮膚修復性能を決定した。
【0124】
生体外測定
【0125】
キューテック（Ｃｕｔｅｃｈ）Ｓｒｌ（イタリア）によって生体外試行が行われた。生体外皮膚モデルにおいてさまざまなパラメータに対する記載のラクトバチルス菌株の効果を分析した。腹部整形手術由来のヒト皮膚を用いた。調合物中でまたは細胞培養培地に溶解して全身法または局所法により熱不活性化細菌懸濁液の施用を行ったテープストリッピングを用いてよい。濃度およびインキュベーション回数は、変化してよい。
【0126】
すべてのデータを、各処置に関する平均、標準偏差および標準誤差（ＳＥＭ）に関して処理した。
【0127】
表皮フィラグリン、インボルクリンおよびサイトケラチン１４
分析のために、選ばれた抗体フィラグリンイエウサギポリクローナル［Ｈ－３００］、インボルクリンマウスモノクローナル（ＳＹ５）および／またはサイトケラチン１４（ＣＫ１４）イエウサギモノクローナル（ＥＰＲ１７３５０）でモデルを免疫染色した。表皮内の赤色色素の強さおよび分布を評価することによって各スライド中に存在する抗原の量を評価した。得られたデータを基底層の長さについて規格化した。
分析のために、選ばれた抗体フィラグリンイエウサギポリクローナル［Ｈ－３００］、インボルクリンマウスモノクローナル（ＳＹ５）および／またはサイトケラチン１４（ＣＫ１４）イエウサギモノクローナル（ＥＰＲ１７３５０）でモデルを免疫染色した。表皮内の赤色色素の強さおよび分布を評価することによって各スライド中に存在する抗原の量を評価した。得られたデータを基底層の長さについて規格化した。
【0128】
皮膚バリア健常性（ローダミンＢ）
ディーゼル微粒子（すなわち１６５０ｂ）の施用前に生体外皮膚モデルをＬ．プランタルム菌株で局所処理した。３５℃、５％ＣＯ２および環境湿度においてすべての皮膚試料をインキュベートした。この実験段階の終りに皮膚試料を集め、ローダミンＢで染色し、結果の画像取得および解析のためにクライオスタットにおいて低温固定および切削した。各皮膚モデルについて表皮区域のうち２つの区画内でローダミンＢ蛍光の分析を行った。イメージ－Ｊ（Ｉｍａｇｅ－Ｊ）アプリケーション（ＮＩＨ、米国）によって蛍光を評価することにより画像を解析した。
ディーゼル微粒子（すなわち１６５０ｂ）の施用前に生体外皮膚モデルをＬ．プランタルム菌株で局所処理した。３５℃、５％ＣＯ２および環境湿度においてすべての皮膚試料をインキュベートした。この実験段階の終りに皮膚試料を集め、ローダミンＢで染色し、結果の画像取得および解析のためにクライオスタットにおいて低温固定および切削した。各皮膚モデルについて表皮区域のうち２つの区画内でローダミンＢ蛍光の分析を行った。イメージ－Ｊ（Ｉｍａｇｅ－Ｊ）アプリケーション（ＮＩＨ、米国）によって蛍光を評価することにより画像を解析した。
【0129】
抗炎症効果
Ｌ．プランタルム菌株の抗炎症潜在能力を確かめるために上記の生体外ヒト皮膚モデルを用いた。モデルをＬ．プランタルムＨＥＡＬ１９化粧品乳化液で処理した後に、外部毒素薬剤および空気汚染をシミュレーションする汚染物質１６５０ｂを施用した。選ばれた終点において、ウェルから器官細胞培養培地を吸い出し、バイオレジェンド（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）（登録商標）社（Ｉｎｃ．）デラックスセット（Ｄｅｌｕｘｅ ｓｅｔ）ヒトＩＬ－８を用いてＩＬ－８を分析した。
Ｌ．プランタルム菌株の抗炎症潜在能力を確かめるために上記の生体外ヒト皮膚モデルを用いた。モデルをＬ．プランタルムＨＥＡＬ１９化粧品乳化液で処理した後に、外部毒素薬剤および空気汚染をシミュレーションする汚染物質１６５０ｂを施用した。選ばれた終点において、ウェルから器官細胞培養培地を吸い出し、バイオレジェンド（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）（登録商標）社（Ｉｎｃ．）デラックスセット（Ｄｅｌｕｘｅ ｓｅｔ）ヒトＩＬ－８を用いてＩＬ－８を分析した。
【0130】
生体内測定
【0131】
ブラジルのコスモサイエンス・シエンシア・アンド・テクノロジア・コスメティカ社（Ｋｏｓｍｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｃｉｅｎｃｉａ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉａ Ｃｏｓｍｅｔｉｃａ Ｌｔｄａ）において生体内試行が行われた。それらは、Ｌ．プランタルムＨＥＡＬ１９凍結乾燥物を含有する化粧品油／水調合物の施用後の関連皮膚パラメータを評価した。
【0132】
油／水乳化液は、以下の組成を有した。
【0133】
【表1】
【0134】
重度の乾燥肌を有する２２名の被験者がこの調査に参加した。乳化液の局所施用を１日２回内側前腕に行った。０、７、１４および２１日目に測定を行った。
【0135】
角質測定法による皮膚水和度
マルチプローブアダプター（Ｍｕｌｔｉ Ｐｒｏｂｅ Ａｄａｐｔｅｒ）ＭＰＡ５（ＣＫエレクトロニクス（ＣＫｅｌｅｃｔｒｏｎｉｓ、ドイツ））と結合したコルネオメーター（Ｃｏｒｎｅｏｍｅｔｅｒ）（登録商標）８２５プローブを用いて静電容量の測定を行った。Ｌ．プランタルムＨＥＡＬ１９調合物によって提供される静電容量および皮膚水和度のプラセボに対する変動を計算した。
マルチプローブアダプター（Ｍｕｌｔｉ Ｐｒｏｂｅ Ａｄａｐｔｅｒ）ＭＰＡ５（ＣＫエレクトロニクス（ＣＫｅｌｅｃｔｒｏｎｉｓ、ドイツ））と結合したコルネオメーター（Ｃｏｒｎｅｏｍｅｔｅｒ）（登録商標）８２５プローブを用いて静電容量の測定を行った。Ｌ．プランタルムＨＥＡＬ１９調合物によって提供される静電容量および皮膚水和度のプラセボに対する変動を計算した。
【0136】
エバポリメトリーによる皮膚バリアの有効性
マルチプローブアダプターＭＰＡ５（ＣＫエレクトロニクス、ドイツ）と結合したテバメーター（Ｔｅｗａｍｅｔｅｒ）（登録商標）３００プローブを用いて経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）を測定した。Ｌ．プランタルムＨＥＡＬ１９調合物によって提供されるＴＥＷＬ値および経皮バリア強化のプラセボに対する変動を計算した。ＴＥＷＬ値の減少として皮膚バリアの強化を観測することができる。
マルチプローブアダプターＭＰＡ５（ＣＫエレクトロニクス、ドイツ）と結合したテバメーター（Ｔｅｗａｍｅｔｅｒ）（登録商標）３００プローブを用いて経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）を測定した。Ｌ．プランタルムＨＥＡＬ１９調合物によって提供されるＴＥＷＬ値および経皮バリア強化のプラセボに対する変動を計算した。ＴＥＷＬ値の減少として皮膚バリアの強化を観測することができる。
【0137】
以下の結果は、本発明の有効性を示す。単独の実験は、本発明の効果を例示するべきであるが限定するべきでない。
【0138】
実施例１：ＨａＣａケラチノサイト中のＡＭＰ遺伝子発現
Ｌ．プランタルムＨＥＡＬ１９は、ヒトケラチノサイト中の広い範囲の抗菌ペプチドの放出を誘導する。すべてのこれらのペプチドは、一緒になってヒト皮膚の複雑な防御システムを代表する。例えば、グラム陽性細菌を殺すことができるデフェンシンは、上方調節された。要するに、上方調節されたペプチドは、広い範囲の潜在的に病原性のグラム陽性およびグラム陰性細菌、真菌、真核寄生生物および／またはウイルスに対して効果がある。
Ｌ．プランタルムＨＥＡＬ１９は、ヒトケラチノサイト中の広い範囲の抗菌ペプチドの放出を誘導する。すべてのこれらのペプチドは、一緒になってヒト皮膚の複雑な防御システムを代表する。例えば、グラム陽性細菌を殺すことができるデフェンシンは、上方調節された。要するに、上方調節されたペプチドは、広い範囲の潜在的に病原性のグラム陽性およびグラム陰性細菌、真菌、真核寄生生物および／またはウイルスに対して効果がある。
【0139】
図１は、０．０５％のＬ．プランタルムＨＥＡＬ１９による２４時間処理後のＨａＣａＴケラチノサイト中の抗菌ペプチドの遺伝子発現を示す。遺伝子発現は、遺伝子アレイを用いて測定した。誘導は、＞２の計算ＲＱ－値として定義した。
【0140】
結果は、Ｌ．プランタルムＨＥＡＬ１９による処理によってβ－デフェンシン１、３または４および／またはソリアシンおよび／またはカルプロテクチンのような重要なＡＭＰが誘導されることを示す。この処理は、ヒト皮膚中のより強い第１防御線に関連し、それによって皮膚バリアを支えるヒト皮膚中のＡＭＰのより高い発現をもたらす結果となる。さらに、β－デフェンシンまたはカテリシジンの誘導発現は、アトピー性皮膚炎におけるような疾患におけるＡＭＰフィンガープリントを均衡させることができる。従って、Ｌ．プランタルムＨＥＡＬ１９の処置によって皮膚マイクロバイオームを回復させ、維持および／または改善することができる。
【0141】
Ｌ．プランタルムＨＥＡＬ１９によるＡＭＰの誘導は、濃度依存性である。図２に、β－デフェンシン３の濃度依存性誘導を示す。さまざまな濃度のＬ．プランタルムＨＥＡＬ１９でＨａＣａＴケラチノサイトを２４時間処理した。これは、２４３．６（０，１％のＬ．プランタルムＨＥＡＬ１９による）から２．３（０．０１２５％のＬ．プランタルムＨＥＡＬ１９）のＲＱ計算値を得る結果となる。
【0142】
ＨａＣａＴケラチノサイトを処理するときＬ．プランタルムＨＥＡＬ９９を用いて同様な効果を観測することができる。図３は、２４時間処理後のＡＭＰコード化遺伝子の例示的なさまざまな誘導を示す。ＲＮアーゼ７、β－デフェンシン３ペプチダーゼインヒビター３、ホスホリパーゼＡ２、および分泌型白血球ペプチダーゼインヒビターは、Ｌ．プランタルムＨＥＡＬ９９によって濃度依存的に誘導される（０．１および０．０５％を試験した）。Ｌ．プランタルムＨｅａｌ１９を用いて同様な結果が見いだされた。
【0143】
表皮３Ｄヒト皮膚モデルにおいて、さまざまなＡＭＰコード化遺伝子が同様に誘導されることが示された（データ示さず）。
【0144】
実施例２：ラクトバチルス菌株の抗炎症効果（試験管内／生体外）
皮膚疾患、損傷または刺激は、大部分、患部皮膚の炎症と相関する。ラクトバチルス菌株の記載の有益な効果の他に、それらの局所施用は、抗炎症効果をもたらす結果となることが示された。この点について、本ラクトバチルス菌株は、さらなる機序によって皮膚健康を支える。
皮膚疾患、損傷または刺激は、大部分、患部皮膚の炎症と相関する。ラクトバチルス菌株の記載の有益な効果の他に、それらの局所施用は、抗炎症効果をもたらす結果となることが示された。この点について、本ラクトバチルス菌株は、さらなる機序によって皮膚健康を支える。
【0145】
図４は、Ｌ．プランタルムＨＥＡＬ１９および９９と陽性対照として含まれたデキサメタゾンとの抗炎症効果を示す。試験材料０．１ｍｇ／ｍＬのＬ．プランタルムＨＥＡＬ９９、０．２５ｍｇ／ｍＬのＬ．プランタルムＨＥＡＬ１９および３０μＭのデキサメタゾンでコンフルエントＨａＣａＴケラチノサイトを前処理した。４８時間のインキュベーション後、３０ｎｇ／ｍＬの炎症誘発性ＩＬ－１αを用いてケラチノサイトを８時間刺激した。ＥＬＩＳＡを用いて以後の細胞培養培地中のＩＬ－８の放出を測定した。ラクトバチルス菌株の施用によって、前処理しなかったＩＬ－１α対照と比較してＨａＣａＴのＩＬ－８放出をそれぞれ１２．６％および５．１％（Ｈｅａｌ９９およびＨｅａｌ１９）に減少させることができた。これらの抗炎症効果は、デキサメタゾンのもの（２０．４％への減少）と同様であり、これら２種類の菌株の抗炎症潜在力を示し、皮膚緩和における使用へのそれらの潜在能力を強調する。
【0146】
生体外ヒト皮膚モデルにおいてＬ．プランタルムＨＥＡＬ１９の同様な抗炎症効果を見ることができることが示された。図５に示すように、空気汚染をシミュレーションするディーゼル微粒子（１６５０ｂ）による刺激後、細胞培養培地中のＩＬ－８検出はＬ．プランタルムＨＥＡＬ１９処理モデルにおいてプラセボ対照と比較して７５％に減少した。Ｌ．プランタルムＨＥＡＬ１９を含有する化粧品調合物による局所処置が原因となって皮膚のバリア健全性が改善され、皮膚は、静められ緩和される。
【0147】
皮膚における炎症は、炎症誘発性サイトカインだけでなく細菌、詳しくは皮膚に対して病原性の細菌によって、細胞から細胞への接触によっても誘導され得る。図６は、０．２５ｍｇ／ｍＬのＬ．プランタルムＨＥＡＬ１９で４８時間前処理したＨａＣａＴケラチノサイトがＳ．アウレウス誘導炎症を急激に減少させることを示す。培地中のＩＬ－８濃度は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓだけで刺激した対照と比較して３１％に減少させることができる。
【0148】
ＡＤ患者の湿疹性皮膚損傷においてＳ．アウレウスが頻繁に見いだされ、多くの場合にこの疾病状態の悪化および／または炎症の促進の原因となる。Ｌ．プランタルム菌株による皮膚への処置は、炎症を低下させる結果となり、それは、同時に発赤を減少させ、皮膚は緩和され、静められる。
【0149】
実施例３：ラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ１９およびＨＥＡＬ９９の抗菌効果
例えばＡＤ患者の湿疹性皮膚損傷において一貫してＳ．ａｕｒｅｕｓが見いだされ、この疾病状態の悪化にとって重要であり原因となることが知られている。Ｌ．プランタルム菌株の皮膚への施用によりＳ．アウレウスのような病原体の増殖を阻害することによって皮膚の潜在的な感染を予防することができる。
例えばＡＤ患者の湿疹性皮膚損傷において一貫してＳ．ａｕｒｅｕｓが見いだされ、この疾病状態の悪化にとって重要であり原因となることが知られている。Ｌ．プランタルム菌株の皮膚への施用によりＳ．アウレウスのような病原体の増殖を阻害することによって皮膚の潜在的な感染を予防することができる。
【0150】
１６時間インキュベーション時に光学密度を測定することによってＳ．アウレウスの増殖曲線を作成した。図７は、０．１および／または０．０５％のＬ．プランタルムＨＥＡＬ１９で処理したときのＳ．アウレウスの増殖阻害効果を示す。要するに、記載の発明を用いる皮膚の局所処置は、Ｓ．アウレウスの増殖を阻害することによって炎症および感染を減少および／または予防することに貢献することができる。
【0151】
実施例４：バリア強化
Ａ：生体外測定におけるインボルクリンおよびサイトケラチン１４（ＣＤＫ１４）の誘導
インボルクリンは、皮膚細胞に構造支持を提供し、それによって細胞が微生物による侵入に抵抗することを可能にするタンパク質である。サイトケラチン１４は、通常、異種二量体として見いだされ、表皮細胞の細胞骨格を形成する。生体外においてさまざまな濃度のＬ．プランタルムＨＥＡＬ１９を用いる局所処理によって増加した両マーカータンパク質は、図８および図９に示すようにヒト皮膚モデルを再生させた。
Ａ：生体外測定におけるインボルクリンおよびサイトケラチン１４（ＣＤＫ１４）の誘導
インボルクリンは、皮膚細胞に構造支持を提供し、それによって細胞が微生物による侵入に抵抗することを可能にするタンパク質である。サイトケラチン１４は、通常、異種二量体として見いだされ、表皮細胞の細胞骨格を形成する。生体外においてさまざまな濃度のＬ．プランタルムＨＥＡＬ１９を用いる局所処理によって増加した両マーカータンパク質は、図８および図９に示すようにヒト皮膚モデルを再生させた。
【0152】
これにより、記載の発明による皮膚の局所処置が皮膚バリア機能の強化の直接導くことが示される。
【0153】
Ｂ：皮膚バリア健常性
本発明は、Ｌ．プランタルムＨＥＡＬ１９による処理とディーゼル微粒子（１６５０ｂ）による刺激との後の生体外モデルにおけるローダミンＢ浸透の減少によって皮膚バリアへの保護活性を示す。皮膚形態の評価は、処理された皮膚試料の構造に化合物が影響を及ぼすかどうかの決定を可能にする。この評価を実行するために、皮膚区分をローダミンＢ染色で染色した。皮膚試料毎の染色後に、表皮の健常性を評価した。図１０は、Ｌ．プランタルムＨＥＡＬ１９による処置が皮膚健常性を改善し、皮膚バリア機能への保護活性を有することを示す。
本発明は、Ｌ．プランタルムＨＥＡＬ１９による処理とディーゼル微粒子（１６５０ｂ）による刺激との後の生体外モデルにおけるローダミンＢ浸透の減少によって皮膚バリアへの保護活性を示す。皮膚形態の評価は、処理された皮膚試料の構造に化合物が影響を及ぼすかどうかの決定を可能にする。この評価を実行するために、皮膚区分をローダミンＢ染色で染色した。皮膚試料毎の染色後に、表皮の健常性を評価した。図１０は、Ｌ．プランタルムＨＥＡＬ１９による処置が皮膚健常性を改善し、皮膚バリア機能への保護活性を有することを示す。
【0154】
Ｃ：バリア改善効力
表皮バリアの品質指標として用いた角質層の細胞間空間中の細胞間脂質ラメラを分析し、定量的に評価した。スキンケア調合物中０．５％のＬ．プランタルムＨＥＡＬ１９による局所処理は、乾燥肌の３Ｄ表皮モデルシステムの修復性能の増加を生じる（図１１）。本発明を含有するスキンケア調合物の局所施用は、表皮バリア機能を強化し、皮膚の修復性能を支援する。
表皮バリアの品質指標として用いた角質層の細胞間空間中の細胞間脂質ラメラを分析し、定量的に評価した。スキンケア調合物中０．５％のＬ．プランタルムＨＥＡＬ１９による局所処理は、乾燥肌の３Ｄ表皮モデルシステムの修復性能の増加を生じる（図１１）。本発明を含有するスキンケア調合物の局所施用は、表皮バリア機能を強化し、皮膚の修復性能を支援する。
【0155】
実施例５：３Ｄ皮膚モデルにおけるヒアルロン酸誘導
ヒアルロン酸（ＨＹＡ）は、皮膚において一連の重要な役割を演じる。それは、皮膚において表皮バリア機能および角質層の構造を維持するために必要である。さらに、それは、組織中の水の固定、組織修復または細胞分化や増殖への影響において重要な役割を演じる（バインドル（Ｗｅｉｎｄｌ）ら、２００４年）。これは、すべて、記載のＬ．プランタルム菌株の処置によって実現することができる。
ヒアルロン酸（ＨＹＡ）は、皮膚において一連の重要な役割を演じる。それは、皮膚において表皮バリア機能および角質層の構造を維持するために必要である。さらに、それは、組織中の水の固定、組織修復または細胞分化や増殖への影響において重要な役割を演じる（バインドル（Ｗｅｉｎｄｌ）ら、２００４年）。これは、すべて、記載のＬ．プランタルム菌株の処置によって実現することができる。
【0156】
図１２は、細胞培養培地中０．００５％のＬ．プランタルムＨＥＡＬ１９またはＨＥＡＬ９９による８日間の処理後のＨＥＰＫｐ３次元皮膚モデルにおけるヒアルロン酸の放出増加を示す。培地対照と比較すると、ヒアルロン酸放出は、１４５および１１５％に増加した。
【0157】
実施例６：皮膚の水和
Ａ：３Ｄ皮膚モデルからのフィラグリン放出
３～９日のインキュベーション後に培地中へのタンパク質フィラグリンの放出増加を検出することができた。図１３は、ラクトバチルス処置ＨＥＰＫｐ３次元皮膚モデルの培地中の８日後のフィラグリン（ＦＬＧ）放出増加を示す。０．０５％Ｌ．プランタルムＨＥＡＬ１９およびＨＥＡＬ９９の使用濃度でＦＬＧは、培地中でそれぞれ２１５および１５０％に増加した。
Ａ：３Ｄ皮膚モデルからのフィラグリン放出
３～９日のインキュベーション後に培地中へのタンパク質フィラグリンの放出増加を検出することができた。図１３は、ラクトバチルス処置ＨＥＰＫｐ３次元皮膚モデルの培地中の８日後のフィラグリン（ＦＬＧ）放出増加を示す。０．０５％Ｌ．プランタルムＨＥＡＬ１９およびＨＥＡＬ９９の使用濃度でＦＬＧは、培地中でそれぞれ２１５および１５０％に増加した。
【0158】
記載の発明の局所施用は、ヒト皮膚中のフィラグリン上方制御を生じ、続いて皮膚バリアの強化および皮膚保湿への陽性効果を生じる。
【0159】
Ｂ：生体外フィラグリン誘導
生体外ヒト皮膚モデルを用いる検討において本発明による局所処理に起因するフィラグリンの誘導を確認した。図１４は、さまざまな濃度のＬ．プランタルムＨＥＡＬ１９による処理後のフィラグリン放出の濃度依存誘導を示す。施用濃度が高いほど生体外ヒト皮膚モデルのフィラグリン放出が高い。
生体外ヒト皮膚モデルを用いる検討において本発明による局所処理に起因するフィラグリンの誘導を確認した。図１４は、さまざまな濃度のＬ．プランタルムＨＥＡＬ１９による処理後のフィラグリン放出の濃度依存誘導を示す。施用濃度が高いほど生体外ヒト皮膚モデルのフィラグリン放出が高い。
【0160】
ＨＥＰＫｐ３Ｄヒト皮膚モデルを検討する試験管内実験において同様な濃度依存効果を観測した（データは示さず）。
【0161】
実施例７：生体内データ
モデル系において観測した効果を確認するために、強い乾燥肌の症状を有する被験者のパネルによって生体内研究を行った。熱処理したＬ．プランタルムＨＥＡＬ１９を化粧クリームに組込み、パネリストの前腕内側に施用した。０、７、１４および２１日後に皮膚保湿能力（静電容量）および経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）への効果を未処置およびプラセボ処置区域と比較して観測した。
モデル系において観測した効果を確認するために、強い乾燥肌の症状を有する被験者のパネルによって生体内研究を行った。熱処理したＬ．プランタルムＨＥＡＬ１９を化粧クリームに組込み、パネリストの前腕内側に施用した。０、７、１４および２１日後に皮膚保湿能力（静電容量）および経表皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）への効果を未処置およびプラセボ処置区域と比較して観測した。
【0162】
この生体内研究は、分子生物学的検討によって示唆される効果を確認した。静電容量は、処置時間につれて定常的に増加し、効果は、すべての時点でプラセボ処置の場合より顕著に強かった。ＴＥＷＬは、処置ラクトバチルス属含有クリームにおいて顕著に減少したが、プラセボは効果がなかった。
【0163】
これらの結果は、本発明の熱処理したラクトバチルス属菌株の、皮膚の保湿およびバリア強さを増加させ皮膚健康の顕著に改善を生じる能力を示す。
【0164】
図１５および１６は、静電容量およびＴＥＷＬによって決定した含水量および皮膚バリア強さを時間の経過とともに示す。
【0165】
実施例８：Ｌ．プランタルム属の増殖曲線
オートクレーブ処理したＭＲＳ培地（オキソイド（Ｏｘｏｉｄ）ＣＭ０３５９）を用いて９６ウェルＭＴＰを調製した。１０％グリセリン中に－２０℃で維持したストック培養物を用いて各Ｌ．プランタルム属菌株を３連反復ウェルに接種した。ウェルあたりＯＤ＝０．１の接種材料を加え、９６ウェルＭＴＰを３７℃で１６時間インキュベートした。サンライズ（Ｓｕｎｒｉｓｅ）フォトメーター（テカン、オーストリア）およびマジェランソフトウェアを用いて６２０ｎｍの吸収により各ウェルの増殖曲線を決定した。陰性増殖対照として食塩水（０．９％塩化ナトリウム溶液）を用いた。
オートクレーブ処理したＭＲＳ培地（オキソイド（Ｏｘｏｉｄ）ＣＭ０３５９）を用いて９６ウェルＭＴＰを調製した。１０％グリセリン中に－２０℃で維持したストック培養物を用いて各Ｌ．プランタルム属菌株を３連反復ウェルに接種した。ウェルあたりＯＤ＝０．１の接種材料を加え、９６ウェルＭＴＰを３７℃で１６時間インキュベートした。サンライズ（Ｓｕｎｒｉｓｅ）フォトメーター（テカン、オーストリア）およびマジェランソフトウェアを用いて６２０ｎｍの吸収により各ウェルの増殖曲線を決定した。陰性増殖対照として食塩水（０．９％塩化ナトリウム溶液）を用いた。
【0166】
計算のために、検出した吸収値の平均を計算し、グラフ表示のために時間の関数としてプロットした。試験した菌株ならびに得られた増殖曲線を図１７に見ることができる。
【0167】
調合物実施例１～１５
皮膚緩和およびバリア強化効果を有する本発明によるラクトバチルス属を含む調合物（組成物）：
１．スキンライトニングデイクリーム油／水
２：スキンスージングローション
３：アフターサンバーム、かゆみ低下
４：カーミングボディースプレー
５：サンスクリーンローション（油／水、広波長域保護）
６：油／水ナイトクリーム
７：頭皮スージングフケ防止シャンプー
８：自己なめしクリーム
９：かゆみ防止バリア修復クリーム
１０：制汗／デオドラントロールオン
１１：紫外線Ａ／Ｂ広波長域保護を有する乳化液
１２：低油含量を有する紫外線Ａ／Ｂ広波長域保護を有するサンスプレー
１３：紫外線Ａ／紫外線Ｂを有するスキンライトニングバーム
１４：紫外線Ｂ／紫外線Ａ保護を有する頭皮スージングヘアコンディショナー、リンスオフ
１５：かゆみ止めヘアコンディショナー、リーブオン
皮膚緩和およびバリア強化効果を有する本発明によるラクトバチルス属を含む調合物（組成物）：
１．スキンライトニングデイクリーム油／水
２：スキンスージングローション
３：アフターサンバーム、かゆみ低下
４：カーミングボディースプレー
５：サンスクリーンローション（油／水、広波長域保護）
６：油／水ナイトクリーム
７：頭皮スージングフケ防止シャンプー
８：自己なめしクリーム
９：かゆみ防止バリア修復クリーム
１０：制汗／デオドラントロールオン
１１：紫外線Ａ／Ｂ広波長域保護を有する乳化液
１２：低油含量を有する紫外線Ａ／Ｂ広波長域保護を有するサンスプレー
１３：紫外線Ａ／紫外線Ｂを有するスキンライトニングバーム
１４：紫外線Ｂ／紫外線Ａ保護を有する頭皮スージングヘアコンディショナー、リンスオフ
１５：かゆみ止めヘアコンディショナー、リーブオン
【0168】
【表2】
【0169】
Cited references:
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Peral MC, Huaman Martinez MA, Valdez JC: Bacteriotherapy with Lactobacillus plantarum in burns. Int Wound J, 6:73-81, 2009
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Zasloff M: Antimicrobial peptides of multicellular organism. Nature, 415:389-395, 2012
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【手続補正書】
【提出日】2024-05-09
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
局所施用による皮膚症状の処置および／または予防における使用のための微生物または２種類の微生物を含むかまたはからなる混合物であって、前記微生物は、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＨＥＡＬ１９（ＤＳＭ１５３１３）およびラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ９９（ＤＳＭ１５３１６）からなる群から選ばれる微生物または２種類の微生物を含むかまたはからなる混合物。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0169】
Cited references:
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Palmer CN, Irvine AD, Terron-Kwiatkowski A, Zhao Y, Liao H, Lee SP, Goudie DR, Sandilands A, Campbell LE, Smith FJ, O'Regan GM, Watson RM, Cecil JE, Bale SJ, Compton JG, DiGiovanna JJ, Fleckman P, Lewis-Jones S, Arseculeratne G, Sergeant A, Munro CS, El Houate B, McElreavey K, Halkjaer LB, Bisgaard H, Mukhopadhyay S, McLean WH: Common loss-of-function variants of the epidermal barrier protein filaggrin are a major predisposing factor for atopic dermatitis. Nat Genet, 38:441-6, 2006
Peral MC, Huaman Martinez MA, Valdez JC: Bacteriotherapy with Lactobacillus plantarum in burns. Int Wound J, 6:73-81, 2009
Sakaguchi S, Miyara M, Costantino CM Hafler DA: FOXP3+ regulatory T cells in the human immune system. Nature Reviews Immunology, 10:490-500, 2010
Weindl G, Schaller M, Schaefer-Korting M, Korting HC: Hyaluronic acid in the treatment and prevention of skin diseases: molecular biological, pharmaceutical and clinical aspects.Skin Pharmacol Physiol. 17(5):207-13, 2004
Wiesner J, Vilcinskas A: Antimicrobial peptides. The ancient arm of the human immune system. Virulence, 1:5, 440-464, 2010
Yong CC, Khoo BY, Sasidharan S, Piyawattanametha W, Kim SH, Khemthongcharoen N, Chuah LO, Ang MY, Liong MT: Activity of crude and fractionated extracts by lactic acid bacteria (LAB) isolated from local dairy, meat, and fermented products against Staohylococcus aureus. Ann Microbiol, 65:1037-1047, 2015
Zasloff M: Antimicrobial peptides of multicellular organism. Nature, 415:389-395, 2012
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕局所施用による皮膚症状の処置および／または予防における使用のための微生物または２種類の微生物を含むかまたはからなる混合物であって、前記微生物は、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＨＥＡＬ１９（ＤＳＭ１５３１３）およびラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ９９（ＤＳＭ１５３１６）からなる群から選ばれる微生物または２種類の微生物を含むかまたはからなる混合物。
〔２〕前記微生物は、熱処理に付されており、好ましくは、無傷の物理的構造を有する弱毒化または死滅微生物である、前記〔１〕に記載の使用のための微生物または混合物。
〔３〕前記皮膚症状は、皮膚バリア機能の低下、炎症性皮膚症状および／または病原性微生物の増殖であり、好ましくは、前記皮膚症状は、アトピー性皮膚炎、微生物感染症、乾燥肌、皮膚のかゆみ、敏感肌、アトピー肌、皮膚の炎症、微生物性腸内毒素症、酒さ、乾癬、発疹およびにきびからなる群から選ばれる、前記〔１〕または〔２〕に記載の使用のための微生物または混合物。
〔４〕ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＨＥＡＬ１９（ＤＳＭ１５３１３）およびラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ９９（ＤＳＭ１５３１６）からなる群から選ばれた１種類の微生物または２種類の微生物の混合物とキャリアとを含むかまたはからなる調製物であって、前記調製物は、粒子状調製物、特に粒状体または粉体である調製物。
〔５〕前記微生物は、熱処理に付されており、好ましくは、無傷の物理的構造を有する弱毒化または死滅微生物である、前記〔４〕に記載の調製物。
〔６〕前記キャリアは、イヌリン、デンプン、アラビアゴム、ホエータンパク質、脱脂粉乳およびマルトデキストリンならびにそれらの組み合わせ、好ましくはマルトデキストリンからなる群から選ばれる、前記〔４〕または〔５〕に記載の調製物。
〔７〕キャリアに対する微生物の比は、１：９～３：７、好ましくは１．５：８．５～２．５～７．５の範囲にあり、および／または前記調製物は、それぞれの場合に前記調製物の総重量に対して１０～３０重量％の微生物および７０～９０重量％の前記キャリア、好ましくは、１５～２５重量％の微生物および７５～８５重量％の前記キャリアを含む、前記〔４〕～〔６〕のいずれか１項に記載の調製物。
〔８〕ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＨＥＡＬ１９（ＤＳＭ１５３１３）およびラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ９９（ＤＳＭ１５３１６）からなる群から選ばれた１種類の微生物または２種類の微生物の混合物とキャリアとを含むかまたはからなる調製物、好ましくは、前記〔４〕から〔７〕のいずれか１項に記載の調製物、を製造するための方法であって、
（ｉ）ラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ１９（ＤＳＭ１５３１３）およびラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ９９（ＤＳＭ１５３１６）からなる群から選ばれた１種類の微生物または２種類の微生物の混合物を準備するステップと、
（ｉｉ）任意選択として、ステップ（ｉ）の前記微生物を、好ましくは６０～１２１℃の範囲の温度で１秒～１２０分間の熱処理に付すステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）または（ｉｉ）からの前記微生物をキャリアと組み合わせ、粒状体または粉体を得るために前記組み合わせを、好ましくは凍結乾燥、スプレー乾燥または造粒によってさらに加工するステップと、
を含む方法。
〔９〕ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＨＥＡＬ１９（ＤＳＭ１５３１３）およびラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ９９（ＤＳＭ１５３１６）からなる群から選ばれた１種類の微生物または２種類の微生物の混合物を含むかまたは前記〔４〕～〔７〕のいずれか１項に記載の調製物を含む、皮膚への局所施用のための医薬品または化粧品組成物あるいは医薬品または化粧品製品であって、前記微生物の総量は、皮膚症状、特に炎症性皮膚症状、皮膚バリア機能の低下、および／または病原性微生物の増殖を処置および／または予防するために十分であり、好ましくは、前記微生物の総量は、それぞれの場合に前記組成物の総重量に対して０．０１～５乾燥重量％、好ましくは０．０２～１乾燥重量％の範囲にあり、および／または、前記微生物の総量は、前記総組成物のグラムあたり少なくとも１０ 8 、好ましくは５×１０ 8 細胞または少なくとも１０ 11 細胞、例えば、前記総組成物のグラムあたり１０ 8 ～５×１０ 10 、好ましくは、１０ 9 ～１０ 10 細胞の範囲にある、皮膚への局所施用のための医薬品または化粧品組成物あるいは医薬品または化粧品製品。
〔１０〕前記組成物または製品は、水中油または油中水乳化液、軟膏、クレーム、ローションおよびジェルからなる群から選ばれ、好ましくは、前記組成物または製品は、キャリア、賦形剤およびさらなる活性成分からなる群から選ばれた１種類以上の構成要素をさらに含む、前記〔９〕に記載の医薬品または化粧品組成物あるいは製品。
〔１１〕医薬品または化粧品組成物あるいは製品、好ましくは前記〔９〕または〔１０〕に記載の医薬品または化粧品組成物あるいは製品を製造するための方法であって、
（ｉ）ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＨＥＡＬ１９（ＤＳＭ１５３１３）およびラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ９９（ＤＳＭ１５３１６）からなる群から選ばれた１種類または２種類の微生物の混合物を準備し、好ましくは、前記微生物は、熱処理に付されており、好ましくは、無傷の物理的構造を有する弱毒化または死滅微生物であるステップ、または前記〔４〕～〔７〕のいずれか１項に記載の調製物または前記〔８〕に記載の方法によって製造される調製物を準備するステップと、
（ｉｉ）医薬品または化粧品組成物あるいは製品を得るためにステップ（ｉ）の前記微生物または前記調製物をキャリア、賦形剤およびさらなる活性成分から選択された１種類以上の物質と組み合わせるステップと、
を含む方法。
〔１２〕特に皮膚の外観を改善する皮膚への局所施用のための微生物または２種類の微生物を含むかまたはからなる混合物の化粧使用であって、前記微生物は、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＨＥＡＬ１９（ＤＳＭ１５３１３）およびラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ９９（ＤＳＭ１５３１６）からなる群から選択され、好ましくは、前記微生物は、熱処理に付されており、および／または無傷の物理的構造を有する弱毒化または死滅微生物である化粧使用。
〔１３〕皮膚刺激、乾燥肌、発疹、にきび、および／または皮膚老化を軽減または予防するための前記〔１２〕に記載の化粧使用。
〔１４〕前記微生物は、前記〔４〕～〔７〕のいずれか１項に記載の調製物または前記〔８〕に記載の方法によって製造された調製物の形で用いられる、前記〔１２〕または〔１３〕に記載の化粧使用。
〔１５〕皮膚の外観を改善する、特に皮膚刺激、乾燥肌、発疹、にきびおよび／または皮膚老化を軽減または予防する化粧方法であって、
ｉ）微生物または２種類の微生物を含むかまたはからなる混合物を局所的に皮膚に施用するステップであって、前記微生物は、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＨＥＡＬ１９（ＤＳＭ１５３１３）およびラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ９９（ＤＳＭ１５３１６）からなる群から選択されるステップ、または、前記〔４〕～〔７〕のいずれか１項に記載の調製物または前記〔８〕に記載の方法によって製造された調製物または前記〔９〕または〔１０〕に記載の化粧品組成物または製品を皮膚に施用するステップであって、好ましくは、前記微生物は、熱処理に付されており、および／または無傷の物理的構造を有する弱毒化または死滅微生物であるステップと、
を含む方法。
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本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕局所施用による皮膚症状の処置および／または予防における使用のための微生物または２種類の微生物を含むかまたはからなる混合物であって、前記微生物は、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＨＥＡＬ１９（ＤＳＭ１５３１３）およびラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ９９（ＤＳＭ１５３１６）からなる群から選ばれる微生物または２種類の微生物を含むかまたはからなる混合物。
〔２〕前記微生物は、熱処理に付されており、好ましくは、無傷の物理的構造を有する弱毒化または死滅微生物である、前記〔１〕に記載の使用のための微生物または混合物。
〔３〕前記皮膚症状は、皮膚バリア機能の低下、炎症性皮膚症状および／または病原性微生物の増殖であり、好ましくは、前記皮膚症状は、アトピー性皮膚炎、微生物感染症、乾燥肌、皮膚のかゆみ、敏感肌、アトピー肌、皮膚の炎症、微生物性腸内毒素症、酒さ、乾癬、発疹およびにきびからなる群から選ばれる、前記〔１〕または〔２〕に記載の使用のための微生物または混合物。
〔４〕ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＨＥＡＬ１９（ＤＳＭ１５３１３）およびラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ９９（ＤＳＭ１５３１６）からなる群から選ばれた１種類の微生物または２種類の微生物の混合物とキャリアとを含むかまたはからなる調製物であって、前記調製物は、粒子状調製物、特に粒状体または粉体である調製物。
〔５〕前記微生物は、熱処理に付されており、好ましくは、無傷の物理的構造を有する弱毒化または死滅微生物である、前記〔４〕に記載の調製物。
〔６〕前記キャリアは、イヌリン、デンプン、アラビアゴム、ホエータンパク質、脱脂粉乳およびマルトデキストリンならびにそれらの組み合わせ、好ましくはマルトデキストリンからなる群から選ばれる、前記〔４〕または〔５〕に記載の調製物。
〔７〕キャリアに対する微生物の比は、１：９～３：７、好ましくは１．５：８．５～２．５～７．５の範囲にあり、および／または前記調製物は、それぞれの場合に前記調製物の総重量に対して１０～３０重量％の微生物および７０～９０重量％の前記キャリア、好ましくは、１５～２５重量％の微生物および７５～８５重量％の前記キャリアを含む、前記〔４〕～〔６〕のいずれか１項に記載の調製物。
〔８〕ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＨＥＡＬ１９（ＤＳＭ１５３１３）およびラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ９９（ＤＳＭ１５３１６）からなる群から選ばれた１種類の微生物または２種類の微生物の混合物とキャリアとを含むかまたはからなる調製物、好ましくは、前記〔４〕から〔７〕のいずれか１項に記載の調製物、を製造するための方法であって、
（ｉ）ラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ１９（ＤＳＭ１５３１３）およびラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ９９（ＤＳＭ１５３１６）からなる群から選ばれた１種類の微生物または２種類の微生物の混合物を準備するステップと、
（ｉｉ）任意選択として、ステップ（ｉ）の前記微生物を、好ましくは６０～１２１℃の範囲の温度で１秒～１２０分間の熱処理に付すステップと、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉ）または（ｉｉ）からの前記微生物をキャリアと組み合わせ、粒状体または粉体を得るために前記組み合わせを、好ましくは凍結乾燥、スプレー乾燥または造粒によってさらに加工するステップと、
を含む方法。
〔９〕ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＨＥＡＬ１９（ＤＳＭ１５３１３）およびラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ９９（ＤＳＭ１５３１６）からなる群から選ばれた１種類の微生物または２種類の微生物の混合物を含むかまたは前記〔４〕～〔７〕のいずれか１項に記載の調製物を含む、皮膚への局所施用のための医薬品または化粧品組成物あるいは医薬品または化粧品製品であって、前記微生物の総量は、皮膚症状、特に炎症性皮膚症状、皮膚バリア機能の低下、および／または病原性微生物の増殖を処置および／または予防するために十分であり、好ましくは、前記微生物の総量は、それぞれの場合に前記組成物の総重量に対して０．０１～５乾燥重量％、好ましくは０．０２～１乾燥重量％の範囲にあり、および／または、前記微生物の総量は、前記総組成物のグラムあたり少なくとも１０ 8 、好ましくは５×１０ 8 細胞または少なくとも１０ 11 細胞、例えば、前記総組成物のグラムあたり１０ 8 ～５×１０ 10 、好ましくは、１０ 9 ～１０ 10 細胞の範囲にある、皮膚への局所施用のための医薬品または化粧品組成物あるいは医薬品または化粧品製品。
〔１０〕前記組成物または製品は、水中油または油中水乳化液、軟膏、クレーム、ローションおよびジェルからなる群から選ばれ、好ましくは、前記組成物または製品は、キャリア、賦形剤およびさらなる活性成分からなる群から選ばれた１種類以上の構成要素をさらに含む、前記〔９〕に記載の医薬品または化粧品組成物あるいは製品。
〔１１〕医薬品または化粧品組成物あるいは製品、好ましくは前記〔９〕または〔１０〕に記載の医薬品または化粧品組成物あるいは製品を製造するための方法であって、
（ｉ）ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＨＥＡＬ１９（ＤＳＭ１５３１３）およびラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ９９（ＤＳＭ１５３１６）からなる群から選ばれた１種類または２種類の微生物の混合物を準備し、好ましくは、前記微生物は、熱処理に付されており、好ましくは、無傷の物理的構造を有する弱毒化または死滅微生物であるステップ、または前記〔４〕～〔７〕のいずれか１項に記載の調製物または前記〔８〕に記載の方法によって製造される調製物を準備するステップと、
（ｉｉ）医薬品または化粧品組成物あるいは製品を得るためにステップ（ｉ）の前記微生物または前記調製物をキャリア、賦形剤およびさらなる活性成分から選択された１種類以上の物質と組み合わせるステップと、
を含む方法。
〔１２〕特に皮膚の外観を改善する皮膚への局所施用のための微生物または２種類の微生物を含むかまたはからなる混合物の化粧使用であって、前記微生物は、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＨＥＡＬ１９（ＤＳＭ１５３１３）およびラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ９９（ＤＳＭ１５３１６）からなる群から選択され、好ましくは、前記微生物は、熱処理に付されており、および／または無傷の物理的構造を有する弱毒化または死滅微生物である化粧使用。
〔１３〕皮膚刺激、乾燥肌、発疹、にきび、および／または皮膚老化を軽減または予防するための前記〔１２〕に記載の化粧使用。
〔１４〕前記微生物は、前記〔４〕～〔７〕のいずれか１項に記載の調製物または前記〔８〕に記載の方法によって製造された調製物の形で用いられる、前記〔１２〕または〔１３〕に記載の化粧使用。
〔１５〕皮膚の外観を改善する、特に皮膚刺激、乾燥肌、発疹、にきびおよび／または皮膚老化を軽減または予防する化粧方法であって、
ｉ）微生物または２種類の微生物を含むかまたはからなる混合物を局所的に皮膚に施用するステップであって、前記微生物は、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）ＨＥＡＬ１９（ＤＳＭ１５３１３）およびラクトバチルス・プランタルムＨＥＡＬ９９（ＤＳＭ１５３１６）からなる群から選択されるステップ、または、前記〔４〕～〔７〕のいずれか１項に記載の調製物または前記〔８〕に記載の方法によって製造された調製物または前記〔９〕または〔１０〕に記載の化粧品組成物または製品を皮膚に施用するステップであって、好ましくは、前記微生物は、熱処理に付されており、および／または無傷の物理的構造を有する弱毒化または死滅微生物であるステップと、
を含む方法。
【外国語明細書】