特開 2024-96195 微生物検査方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024096195

(43)【公開日】2024-07-12

(54)【発明の名称】微生物検査方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/02 20060101AFI20240705BHJP

   C12M 1/00 20060101ALI20240705BHJP

   G01N 22/00 20060101ALI20240705BHJP

   G01N 15/01 20240101ALI20240705BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/02

C12M1/00 A

G01N22/00 V

G01N22/00 Y

G01N15/01

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2024069702

(22)【出願日】2024-04-23

(62)【分割の表示】P 2022526660の分割

【原出願日】2021-05-28

(31)【優先権主張番号】P 2020094081

(32)【優先日】2020-05-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP

(71)【出願人】

【識別番号】506208908

【氏名又は名称】学校法人兵庫医科大学

(71)【出願人】

【識別番号】504132272

【氏名又は名称】国立大学法人京都大学

(71)【出願人】

【識別番号】000001993

【氏名又は名称】株式会社島津製作所

(74)【代理人】

【識別番号】110001195

【氏名又は名称】弁理士法人深見特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】菊池 正二郎

(72)【発明者】

【氏名】小川 雄一

(57)【要約】

【課題】微生物の検査を正確に行うことが可能な微生物検査方法および微生物検査装置を提供すること。
【解決手段】微生物検査方法は、検体と培養液とを混合した試料を、疎水性の封止溶剤により、検体に含まれる微生物を検出するためのセンサの近接領域に封止しＳ１４、センサの出力に基づいて、検体に含まれる微生物の増殖度合いを示す情報を算出する。たとえば、分析ユニットは、多数の共振器がマトリクス状に配置されたアレイセンサを駆動しＳ１１、測定開始時に取得される共振器の共振周波数を初期周波数として記憶しＳ１５、この初期周波数と、所定時間ごとに測定される共振器の共振周波数との差分（周波数シフト）を、検体に含まれる微生物の増殖度合いを示す情報として算出する。
【選択図】図８

【特許請求の範囲】

【請求項1】

検体と培養液とを混合した試料を、疎水性の封止溶剤により、前記検体に含まれる微生物を検出するためのセンサの近接領域に封止し、
前記センサの出力に基づいて、前記検体に含まれる微生物の増殖度合いを示す情報を算出する、微生物検査方法。

【請求項2】

前記近接領域を含む収容領域に前記封止溶剤を導入した後、前記封止溶剤に挿入具を差し込み、前記挿入具を介して前記試料を導入することにより、前記試料を前記センサの近接領域に封止する、請求項１に記載の微生物検査方法。

【請求項3】

前記センサは、複数のセンサ素子がマトリクス状に隣接配置されたアレイセンサである、請求項１または２に記載の微生物検査方法。

【請求項4】

前記センサ素子は、ギガヘルツ帯で発振する発振器により構成され、
前記発振器の発振周波数の変動を、前記検体に含まれる微生物の増殖度合いを示す情報として算出する、請求項１ないし３の何れか一項に記載の微生物検査方法。

【請求項5】

前記センサの出力に基づいて、前記微生物の増殖の経時的変動を評価するための増殖曲線を表示部に表示させる、請求項１ないし４の何れか一項に記載の微生物検査方法。

【請求項6】

前記封止溶剤は、ガス溶解性を有し、
酸素を溶解させた前記封止溶剤により、前記試料を前記近接領域に封止する、請求項１ないし５の何れか一項に記載の微生物検査方法。

【請求項7】

前記封止溶剤は、フッ素系不活性溶剤またはミネラルオイルである、請求項１ないし６の何れか一項に記載の微生物検査方法。

【請求項8】

前記微生物は、結核菌を含む、請求項１ないし７の何れか一項に記載の微生物検査方法。

【請求項9】

検体と培養液とを混合した試料をギガヘルツ帯で発振する共振器に適用し、
前記共振器の共振周波数の変動を、前記検体に含まれる微生物の増殖度合いを示す情報として算出する、微生物検査方法。

【請求項10】

前記ギガヘルツ帯は、１０ＧＨｚ以上６００ＧＨｚ以下である、請求項９に記載の微生物検査方法。

【請求項11】

前記ギガヘルツ帯は、３０ＧＨｚ以上３００ＧＨｚ以下である、請求項１０に記載の微生物検査方法。

【請求項12】

前記共振器を構成する素子がマトリクス状に隣接配置されたアレイセンサに前記試料を適用する、請求項９ないし１１の何れか一項に記載の微生物検査方法。

【請求項13】

疎水性の封止溶剤により、前記試料を、前記共振器の近接領域に封止する、請求項９ないし１２の何れか一項に記載の微生物検査方法。

【請求項14】

前記封止溶剤は、ガス溶解性を有し、
前記封止溶剤には、酸素が溶解されている、請求項１３に記載の微生物検査方法。

【請求項15】

前記封止溶剤は、フッ素系不活性溶剤またはミネラルオイルである、請求項１３または１４に記載の微生物検査方法。

【請求項16】

検査対象の前記微生物は、結核菌、大腸菌および表皮ブドウ球菌の少なくとも１つを含む、請求項９ないし１５の何れか一項に記載の微生物検査方法。

【請求項17】

前記微生物に対する薬剤感受性を評価するための薬剤を含む前記試料について、前記共振器の共振周波数を算出し、
算出した前記共振周波数の経時的な変動を示す増殖曲線を表示部に表示させる、請求項９ないし１６の何れか一項に記載の微生物検査方法。

【請求項18】

前記微生物に対する薬剤感受性を評価するための薬剤を互いに異なる濃度で含む複数の前記試料を準備し、
前記試料ごとに前記共振器の共振周波数の変動を算出し、
算出した前記各試料の前記共振周波数の経時的な変動を表示部に表示させる、請求項９ないし１７の何れか一項に記載の微生物検査方法。

【請求項19】

液体を収容する収容部と、
検体と培養液とを混合した試料、および疎水性の封止溶剤を前記収容部に導入する導入部と、
前記収容部に接近して配置されたセンサと、
前記センサの出力に基づいて前記検体に含まれる微生物の増殖度合いを示す情報を算出する分析部と、を備え、
前記分析部は、前記導入部により、前記試料を前記封止溶剤で前記センサの近接領域に封止して、前記増殖度合いを示す情報を算出する処理を実行する、
る微生物検査装置。

【請求項20】

検体と培養液とを混合した試料を収容する収容部と、
前記収容部に接近して配置され、ギガヘルツ帯で発振する共振器と、
前記共振器の共振周波数に基づいて前記検体に含まれる微生物の増殖度合いを示す情報を算出する分析部と、を備える微生物検査装置。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、検体中の微生物の状況を検査するための微生物検査方法および微生物検査装置に関する。

【背景技術】

【0002】

現在、医学や農学の分野では、迅速で効率的かつ精度の高い微生物の検査が求められている。たとえば、難培養菌である結核菌では、寒天培地や培養液を用いた薬剤感受性の検査に２ヶ月程度を要する。このため、最適かつ的確な薬剤投与が難しく、種々の投薬を長期間に亘って繰り返す結果となっている。

【0003】

以下の特許文献１には、細胞内に含まれる水分量を、テラヘルツ波を用いて検査する検査方法が記載されている。この検査方法では、細胞の内水量がテラヘルツ波の周波数変動により検出され、その検出結果に基づいて、たとえば、細胞の癌化等が評価される。

【0004】

また、以下の特許文献２には、３０～２００ＧＨｚで発振するクロスカップル発振器と、発振器の周波数の変化を参照して被検査体の性質の変化を検知する検知部とを備えるセンサ回路が記載されている。このセンサ回路では、水分を含む被検査体の変化が、当該水分中のバルク水の変化に置き換えられて検知される。すなわち、水分子がタンパク質に置き換わることによるバルク水の減少が、発振器の周波数の変化として参照され、当該周波数の変化に基づいて、被検査体の性質の変化が検知される。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0005】

【特許文献1】特開２０１９－６０６０９号公報

【特許文献2】特許第特６４１６３９８号公報

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

結核菌や大腸菌等の微生物は、人や動物の細胞に比べて顕著に小さいため、これら微生物の内水量も、細胞に比べて顕著に少ない。このため、上記特許文献１の検査方法をこれら微生物の検査に用いた場合、テラヘルツ波の周波数変動が極めて小さくなってしまう。

【0007】

また、上記特許文献２には、水分を含む被検査体の性質の変化が検知されることが記載されている。しかし、当該特許文献２には、水分中の微生物を検査対象とすること、およびそのための方法については、特に記載がない。

【0008】

また、微生物の検査においては、温度変化等によって、試料に対流が起こり得る。この場合、試料中の微生物は、センサ付近に留まらず、対流とともに移動する。このため、センサからの出力によって、試料中の微生物の状態を精度良く検査することが困難である。

【0009】

かかる課題に鑑み、本発明は、微生物の検査を正確に行うことが可能な微生物検査方法および微生物検査装置を提供することを目的とする。

【課題を解決するための手段】

【0010】

本発明の第１の態様に係る微生物検査方法は、検体と培養液とを混合した試料を、疎水性の封止溶剤により、前記検体に含まれる微生物を検出するためのセンサの近接領域に封止し、前記センサの出力に基づいて、前記検体に含まれる微生物の増殖度合いを示す情報を算出する。

【0011】

本態様に係る微生物検査方法によれば、温度変化による対流等の影響を軽減することで、試料をセンサの近接領域に留めておくことができる。よって、試料中の微生物の増殖度合いの検査をより精度よく行うことができる。

【0012】

この場合、封止溶剤による試料の封止は、前記近接領域を含む収容領域に前記試料を導入した後、前記封止溶剤を前記収容領域に添加することにより行われてもよく、あるいは、記近接領域を含む収容領域に前記封止溶剤を導入した後、前記試料を前記収容領域に添加することにより行われてもよい。

【0013】

後者の場合、微生物検査方法は、たとえば、前記近接領域を含む収容領域に前記封止溶剤を導入した後、前記封止溶剤に挿入具を差し込み、前記挿入具を介して前記試料を導入することにより、前記試料を前記センサの近接領域に封止するよう調整され得る。

【0014】

本態様に係る微生物検査方法において、前記センサは、複数のセンサ素子がマトリクス状に隣接配置されたアレイセンサとされ得る。これにより、素子の位置ごとに微生物の増殖度合いを検査できる。また、アレイセンサの全検出範囲における微生物の増殖度合いの分布を検査することもできる。

【0015】

この場合、前記センサ素子は、ギガヘルツ帯で発振する発振器により構成され、前記発振器の発振周波数の変動を、前記検体に含まれる微生物の増殖度合いを示す情報として算出するよう調整され得る。これにより、発振器の発信周波数の変動により微生物の増殖度合いを正確に把握できる。

【0016】

本態様に係る微生物検査方法は、前記センサの出力に基づいて、前記微生物の増殖の経時的変動を評価するための増殖曲線を表示部に表示させる工程を含み得る。これにより、検査者は、表示された増殖曲線を参照することにより、微生物の増殖度合いを直感的に把握できる。

【0017】

本態様に係る微生物検査方法において、前記封止溶剤は、ガス溶解性を有し、酸素を溶解させた前記封止溶剤により、前記試料を前記近接領域に封止するよう調整され得る。これにより、微生物が結核菌のような好気性の微生物である場合に、封止溶剤によって封止された試料中の微生物に封止溶剤から酸素を供給できる。

【0018】

なお、前記封止溶剤として、フッ素系不活性溶剤またはミネラルオイルを用いることができる。

【0019】

また、検査対象の前記微生物は、結核菌を含み得る。結核菌は運動能を持たないが、培養液の対流により容易に共振器の近接領域から外れ得る。よって、結核菌の検査においては培養液の対流を防ぐために、封止溶剤により試料をセンサの近接領域に封止することが好ましい。

【0020】

本発明の第２の態様に係る微生物検査方法は、検体と培養液とを混合した試料をギガヘルツ帯で発振する共振器に適用し、前記共振器の共振周波数の変動を、前記検体に含まれる微生物の増殖度合いを示す情報として算出する。

【0021】

検体と培養液とを混合した試料中には、微生物の生体分子に結合していないバルク水と、微生物の生体分子に結合している結合水とが含まれる。ここで、バルク水と結合水は、それぞれの誘電損失が互いに相違する。一方、試料中において微生物の増殖が進むと、水分子の結合対象である生体分子が増える。このため、微生物の増殖に伴い、微生物周囲のバルク水が生体分子に結合して結合水となり、これにより、微生物周囲の水に対するバルク水の比率が減少する。したがって、微生物が増殖すると、微生物周囲の水の誘電損失が変化する。ここで、バルク水の誘電損失は、ギガヘルツの周波数帯において生じる。したがって、上記のように、ギガヘルツ帯で発振する共振器に試料を適用することにより、微生物の増殖に伴って、共振器の共振周波数が変動する。この変動を算出することにより、試料中の微生物の増殖度合いを把握できる。

【0022】

よって、本態様に係る微生物検査方法によれば、ギガヘルツ帯で発振する共振器に試料を適用して、その共振周波数の変動を算出することにより、試料中の微生物の増殖度合いを検査できる。また、微生物の周囲には、十分な量の水（バルク水、結合水）が存在するため、共振器の共振周波数の変動と微生物の増殖度合いとを正確に対応させ得る。さらに、共振器の共振周波数の変動によって微生物の増殖度合いが数値化されるため、試料における微生物の増殖度合いを、迅速に見極めることができる。よって、正確かつ迅速に、微生物の検査を行うことができる。

【0023】

ここで、上記ギガヘルツ帯は、１０ＧＨｚ以上６００ＧＨｚ以下であることが好ましい。共振器の共振周波数を１０GＨｚ以上に設定することにより、試料中に存在するイオンが共振周波数の変動に影響することを抑制できる。また、共振器の共振周波数を６００GＨｚ以下に設定することにより、微生物の増殖によるバルク水の減少幅を大きくでき、微生物の増殖に伴う共振周波数の変動幅を大きくできる。

【0024】

また、上記ギガヘルツ帯は、３０ＧＨｚ以上３００ＧＨｚ以下であることがさらに好ましい。共振器の共振周波数を３０GＨｚ以上に設定することにより、試料中に存在するイオンの影響をほぼ無くすことができる。また、また、共振器の共振周波数を３００GＨｚ以下に設定することにより、所定の共振周波数で共振器を正確に発振させ易くなる。

【0025】

本態様に係る微生物検査方法は、前記共振器を構成する素子がマトリクス状に隣接配置されたアレイセンサに前記試料を適用するように調整され得る。これにより、素子の位置ごとに微生物の増殖度合いを検査できる。また、アレイセンサの全検出範囲における共振周波数の変動の分布を検査することもできる。

【0026】

本態様に係る微生物検査方法は、疎水性の封止溶剤により、前記試料を、前記共振器の近接領域に封止するよう調整され得る。これにより、温度変化による対流等の影響を軽減することで、試料の少なくとも一部を共振器の近接領域に留めておくことができる。よって、試料中の微生物の増殖度合いに応じた共振周波数の変動をより正確に算出でき、微生物の検査をより精度よく行うことができる。

【0027】

ここで、前記封止溶剤は、ガス溶解性を有し、前記封止溶剤には、酸素が溶解されているよう調整され得る。上記のように、検査対象の微生物が、結核菌のような好気性の微生物である場合、封止溶剤に酸素を溶解させておくことにより、封止溶剤により封止されている試料に封止溶剤から酸素を供給できる。

【0028】

この場合も、前記封止溶剤として、たとえば、フッ素系不活性溶剤またはミネラルオイルを用いることができる。

【0029】

また、検査対象の前記微生物は、結核菌、大腸菌および表皮ブドウ球菌の少なくとも１つを含み得る。結核菌は運動能を持たないが、培養液の対流により容易に共振器の近接領域から外れ得る。よって、検査対象の微生物が結核菌である場合は、封止溶剤を用いて試料を共振器の近接領域に封止することが好ましい。これに対し、大腸菌は、自ら運動能を持ち培養液中を移動するため、増殖に伴い、試料中に略均等に分布し得る。よって、検査対象の微生物が大腸菌である場合は、必ずしも封止溶剤を用いずとも、共振周波数の変動により増殖度合いを検査できる。このように、検査においては、検査対象の微生物が培養液中を移動する性質によって、封止溶剤を添加するか否かが選択されてもよい。

【0030】

また、本態様に係る微生物検査方法は、前記微生物に対する薬剤感受性を評価するための薬剤を含む前記試料について、前記共振器の共振周波数を算出し、算出した前記共振周波数の経時的な変動を示す増殖曲線を表示部に表示させてもよい。

【0031】

あるいは、本態様に係る微生物検査方法は、前記微生物に対する薬剤感受性を評価するための薬剤を互いに異なる濃度で含む複数の前記試料を準備し、前記試料ごとに前記共振器の共振周波数の変動を算出し、算出した前記各試料の前記共振周波数の経時的な変動を表示部に表示させてもよい。

【0032】

これにより、検査者は、表示された増殖曲線を参照することにより、当該薬剤に対する微生物の薬剤感受性を評価できる。たとえば、検査者は、表示された増殖曲線を参照することにより、作用機序の異なる抗微生物薬の濃度依存的作用あるいは時間依存的作用を定量的に評価することができる。濃度依存的作用とは、薬効が薬剤の濃度に依存する作用のことであり、時間依存的作用とは、所定時間が経過した後に薬効が発現する作用のことである。

【0033】

本発明の第３の態様は、微生物検査装置に関する。この態様に係る微生物検査装置は、液体を収容する収容部と、検体と培養液とを混合した試料、および疎水性の封止溶剤を前記収容部に導入する導入部と、前記収容部に接近して配置されたセンサと、前記センサの出力に基づいて前記検体に含まれる微生物の増殖度合いを示す情報を算出する分析部と、を備える。前記分析部は、前記導入部により、前記試料を前記封止溶剤で前記センサの近接領域に封止して、前記増殖度合いを示す情報を算出する処理を実行する。

【0034】

本態様に係る微生物検査装置によれば、上記第１の態様に係る微生物検査方法と同様、封止溶剤で試料をセンサの近接領域に封止することにより、温度変化による対流等の影響を軽減することで、試料をセンサの近接領域に留めておくことができる。よって、試料中の微生物の増殖度合いの検査をより精度よく行うことができる。

【0035】

本発明の第４の態様は、微生物検査装置に関する。この態様に係る微生物検査装置は、検体と培養液とを混合した試料を収容する収容部と、前記収容部に接近して配置され、ギガヘルツ帯で発振する共振器と、前記共振器の共振周波数に基づいて前記検体に含まれる微生物の増殖度合いを示す情報を算出する分析部と、を備える。

【0036】

本態様に係る微生物検査装置によれば、上記第２の態様に係る微生物検査方法と同様、ギガヘルツ帯で発振する共振器に試料を適用することにより、試料における微生物の増殖度合いを示す情報を、正確かつ迅速に算出することができる。

【0037】

上記各態様において、「近接領域」とは、センサで、検査対象を検知することが可能な領域を意味し、「封止溶剤」とは、試料を封止するための溶剤を意味し、「封止する」とは、近接領域に試料を封止溶剤にて閉じ込めることを意味する。

【発明の効果】

【0038】

以上のとおり、本発明によれば、微生物の検査を正確に行うことが可能な微生物検査方法および微生物検査装置を提供することができる。

【0039】

本発明の効果ないし意義は、以下に示す実施の形態の説明により更に明らかとなろう。ただし、以下に示す実施の形態は、あくまでも、本発明を実施化する際の一つの例示であって、本発明は、以下の実施の形態により何ら制限されるものではない。

【図面の簡単な説明】

【0040】

【図1】図１は、実施形態１に係る、微生物検査装置の構成を示す図である。

【図2】図２は、実施形態１に係る、センサ回路の構成を示す図である。

【図3】図３（ａ）は、実施形態１に係る、アレイセンサの構成を示す平面図である。図３（ｂ）は、実施形態１に係る、アレイセンサ上の１素子の部分を拡大して示す一部平面図である。

【図4】図４（ａ）は、実施形態１に係る、アレイセンサの１素子の近接領域に試料が適用された状態を模式的に示す斜視図である。図４（ｂ）は、実施形態１に係る、近接領域に適用された試料の誘電率が変化する前後における素子の共振周波数の変化を模式的に示す図である。

【図5】図５（ａ）、（ｂ）は、それぞれ、実施形態１に係る、バルク水および結合水の分子結合の状態を模式的に示す図である。

【図6】図６（ａ）は、実施形態１に係る、バルク水の誘電損失を示すグラフである。図６（ｂ）は、実施形態１に係る、微生物周囲の生体水の誘電損失を示すグラフである。

【図7】図７（ａ）～（ｄ）は、それぞれ、実施形態１に係る、試料に対する封止溶剤の添加工程を示す図である。図７（ｅ）は、実施形態１に係る、封止溶剤によって封止された試料の状態を模式的に示す断面図である。

【図8】図８は、実施形態１に係る、微生物検査方法の工程を示すフローチャートである。

【図9】図９（ａ）は、実施形態１に係る、各素子における共振周波数の変動を各素子の位置にマッピングした表示画像の構成例を示す図である。図９（ｂ）は、実施形態１に係る、微生物の増殖が見られる素子領域と、微生物の増殖が見られない素子領域とにおいて共振周波数の変動を算出した場合の算出結果の傾向を示すグラフである。

【図10】図１０（ａ）～（ｃ）は、実施例１に係る、ＢＣＧの薬剤感受性の実験結果を示すグラフである。

【図11】図１１（ａ）は、実施例２に係る、ＮＢＲＣ３３０１（大腸菌コントロール）に対する濃度依存的薬剤による感受性の実験結果を示すグラフである。図１１（ｂ）、（ｃ）は、それぞれ、実施例２に係る、実験で測定された各素子の周波数シフトを色により表示した表示画像を示す図である。

【図12】図１２（ａ）は、実施例３に係る、ＮＢＲＣ１２９９３（表皮ブドウ球菌コントロール）に対する時間依存的薬剤による感受性の実験結果を示すグラフである。図１２（ｂ）、（ｃ）は、それぞれ、実施例３に係る、実験で測定された各素子の周波数シフトを色により表示した表示画像を示す図である。

【図13】図１３（ａ）は、実施例４に係る、封止溶剤に対する酸素または窒素の溶解の実験に用いた構成を模式的に示す図である。図１３（ｂ）は、実施例４に係る、封止溶剤に対する酸素または窒素の溶解の実験結果を示すグラフである。

【図14】図１４（ａ）～（ｄ）は、それぞれ、実施形態２に係る、封止溶剤により試料を封止する封止工程を示す図である。図１４（ｅ）は、実施形態２に係る、封止溶剤によって封止された試料の状態を模式的に示す断面図である。

【図15】図１５は、実施形態２に係る、微生物検査方法の工程を示すフローチャートである。

【図16】図１６は、実施形態３に係る、微生物検査装置の構成を示す図である。

【図17】図１７（ａ）～（ｄ）は、それぞれ、実施形態４に係る、試料に対する封止溶剤の添加工程を示す図である。

【図18】図１８（ａ）は、実施例６に係る、解析対象素子の周波数シフトの実験結果を示すグラフである。図１８（ｂ）は、実施例６に係る、各素子の周波数シフトを色により示す表示画像である。

【図19】図１９（ａ）は、実施例５に係る、解析対象素子の周波数シフトの実験結果を示すグラフである。図１９（ｂ）は、実施例５に係る、各素子の周波数シフトを色により示す表示画像である。

【図20】図２０（ａ）は、実施例７に係る、解析対象素子の周波数シフトの実験結果を示すグラフである。図２０（ｂ）は、実施例７に係る、各素子の周波数シフトを色により示す表示画像である。

【図21】図２１（ａ）～（ｃ）は、それぞれ、実施例６、実施例５および実施例７に係る、測定試料の顕微鏡写真を示す図である。

【0041】

ただし、図面はもっぱら説明のためのものであって、この発明の範囲を限定するものではない。

【発明を実施するための形態】

【0042】

＜実施形態１＞
図１は、本実施形態に係る、微生物検査装置１の構成を示す図である。

【0043】

微生物検査装置１は、アレイセンサ１０と、制御ユニット３０と、分析ユニット４０と、容器６０と、を備える。アレイセンサ１０には、共振器を構成する素子がマトリクス状に隣接配置されている。制御ユニット３０は、分析ユニット４０からの指令に応じて、アレイセンサ１０を制御する。分析ユニット４０は、制御ユニット３０から入力される各素子の共振周波数に応じて、微生物の増殖度合いを分析し、分析結果をモニタ（表示部）４１に表示する。分析ユニット４０は、たとえば、パーソナルコンピュータにより構成される。この場合、パーソナルコンピュータには、微生物の増殖度合いを分析するためのアプリケーションプログラムがインストールされる。

【0044】

アレイセンサ１０は、たとえば、ＣＭＯＳにより構成され、基板１２上に実装される。基板１２には、アレイセンサ１０のドライバ等を含む回路部１１がさらに実装される。回路部１１と制御ユニット３０は、互いに通信可能に信号ケーブル２０で接続される。制御ユニット３０と分析ユニット４０は、信号ケーブル５０で接続される。

【0045】

容器６０は、無底筒状の部材からなっており、内部に液体を収容するための収容部６１を有する。アレイセンサ１０は、表面を防水用の保護膜でシールされた状態で、容器６０の下面に装着される。収容部６１に収容された液体が漏れないように、容器６０の下面にアレイセンサ１０が保護膜を介して水密に装着される。容器６０は、有底であってもよい。この場合、容器６０の底部の厚みは、アレイセンサ１０による収容部６１のセンシングが可能なように薄く設定される。この構成では、容器６０の下面にアレイセンサ１０が直接装着可能であり、アレイセンサ１０の表面をシールする保護膜は、省略され得る。収容部６１は、アレイセンサ１０を内包するサイズであればよい。また、容器６０は、収容部６１に液体を収容した場合に、液体が漏れ出さない構成であれば、上記以外の構成であってもよい。

【0046】

図２は、アレイセンサ１０のセンサ回路１００の構成を示す図である。

【0047】

センサ回路１００は、共振器１１０と、差動回路１２０と、電流源１３０と、分周回路１４０と、を備える。

【0048】

共振器１１０は、ループ状のインダクタ１１１と、キャパシタ１１２とを備える。インダクタ１１１のインダクタンスとキャパシタ１１２のキャパシタンスによって、共振器１１０の共振周波数が決まる。共振器１１０は、ギガヘルツ帯に含まれる所定の共振周波数で共振する。なお、共振器１１０の構成は、図２の構成に限られない。たとえば、インダクタ１１１のループ回数は１回でなくてもよく、インダクタ１１１が複数回ループしていてもよい。また、キャパシタ１１２は、インダクタ１１１の互いに近接する両端部により構成されてもよく、図示しない配線の寄生容量等により構成されてもよい。

【0049】

差動回路１２０は、２つのトランジスタ１２１がクロスカップルされて構成されている。差動回路１２０の構成は、これに限られるものではなく、他の構成が用いられてもよい。電流源１３０は、回路部１１からの制御信号に従って、共振器１１０および差動回路１２０からなる発振器１５０にイネーブル信号を供給する。これにより、共振器１１０および発振器１５０が、ギガヘルツ帯に含まれる上記所定の共振周波数で発振する。共振器１１０の共振周波数が変動すると、変動後の共振周波数で発振器１５０が発信して信号を出力する。

【0050】

分周回路１４０は、共振器１１０の共振信号を数百分の１程度に分周し、分周後の信号を出力する。すなわち、分周回路１４０は、ギガヘルツ帯の共振信号を、メガヘルツ帯の共振信号に分周して出力する。分周後の信号は、図１の制御ユニット３０を介して、分析ユニット４０に供給される。分析ユニット４０は、入力された信号の周波数に分周比を乗じることにより、共振器１１０の共振周波数を算出する。

【0051】

なお、分周回路１４０は、必ずしも、共振器１１０ごとに配置されなくてもよい。たとえば、各共振器１１０の信号を時分割で個別に処理する場合、１つの分周回路１４０により時分割で各共振器１１０の信号を処理してもよい。また、分周回路１４０は、制御ユニット３０側に配置されてもよい。

【0052】

図３（ａ）は、アレイセンサ１０の構成を示す平面図である。図３（ｂ）は、アレイセンサ１０上の１素子の部分を拡大して示す一部平面図である。

【0053】

図３（ａ）に示すように、アレイセンサ１０には、図２の共振器１１０を構成する素子がマトリクス状に隣接配置されている。インダクタ１１１の大きさ（径）は、ギガヘルツ帯で共振可能な大きさに設定される。たとえば、共振器１１０が６４ＧＨｚで共振する場合、図３（ｂ）において、インダクタ１１１の縦横の幅Ｄ１、Ｄ２は、それぞれ、４５μmおよび５１μｍ程度に設定される。この場合、共振器１１０と差動回路１２０からなる発振器１５０の全長Ｄ３は、１１０μm程度になる。

【0054】

アレイセンサ１０には、たとえば、６２行および２４列に１４８８個の共振器１１０が並ぶように配置される。この場合、図３（ａ）に示すように、アレイセンサ１０の縦横の寸法は、それぞれ、３ｍｍ程度となる。ただし、図３（ａ）、（ｂ）に示した各部の寸法およびアレイセンサ１０における共振器１１０の配置数は一例であって、これに制限されるものではない。

【0055】

図３（ａ）に示したアレイセンサ１０を用いることにより、マトリクス状に並ぶ多数の共振器１１０に試料を適用することができる。

【0056】

図４（ａ）は、アレイセンサ１０の１素子の近接領域に試料２００が適用された状態を模式的に示す斜視図である。図４（ｂ）は、近接領域に適用された試料２００の誘電率が変化する前後における素子の共振周波数の変化を模式的に示す図である。

【0057】

図４（ａ）に示すように、共振器１１０の上面は、防水のための保護膜１３で被覆される。したがって、保護膜１３のキャパシタンスが、共振器１１０の共振周波数を決定するための寄生容量として加味される。さらに、この保護膜１３の上に試料２００が適用された場合は、共振器１１０に近接する領域（近接領域）の試料２００のキャパシタンスが、共振器１１０の共振周波数を決定するための寄生容量としてさらに加味される。したがって、試料２００が適用された場合の共振器１１０の共振周波数は、保護膜１３および試料２００のキャパシタンスを加味して決定される周波数となる。

【0058】

ここで、試料２００の誘電率が変化すると、共振器１１０（インダクタ１１１）にかかる試料２００からの寄生容量が変化する。このため、図４（ｂ）に示すように、試料２００の誘電率の変化に伴い、共振器１１０の共振周波数が、Δｆだけシフトすることになる。

【0059】

本実施形態では、試料２００中において、微生物の周囲の水の誘電率が、微生物の増殖に応じて変化することを利用して、微生物の増殖が検査される。具体的には、検体と培養液とを混合した試料２００をアレイセンサ１０に適用した後、各素子における共振周波数の変動（周波数シフトΔｆ）を時系列で取得し、取得した変動量に基づいて、微生物の増殖の度合いを検査する。以下、この検査方法について説明する。

【0060】

まず、微生物の周囲に存在する水の種類とその誘電損失について説明する。

【0061】

図５（ａ）、（ｂ）は、それぞれ、バルク水および結合水の分子結合の状態を模式的に示す図である。

【0062】

検体と培養液とを混合した試料２００には、バルク水と結合水とが含まれる。このうち、バルク水は、図５（ａ）に示すように、水分子が四面体型に分子間結合して形成され、サブピコ秒からピコ秒程度の寿命を有する。バルク水は、生体分子に結合していないため、試料２００中を自由に移動する。一方、結合水は、図５（ｂ）に示すように、水分子が生体分子に結合したものであり、ナノ秒からマイクロ秒程度の寿命を有する。

【0063】

微生物の周囲に存在するバルク水は、微生物に結合して結合水となり、その後、結合水としての寿命が終了すると、微生物から離れて、再びバルク水へと転換する。ここで、バルク水と結合水とでは、誘電損失が互いに相違する。したがって、微生物周囲の水に対するバルク水の比率が変化すると、微生物周囲の水の誘電率が変化し、これに応じて、共振器１１０の共振周波数が変化する。

【0064】

図６（ａ）は、バルク水の誘電損失を示すグラフである。図６（ｂ）は、微生物周囲の生体水の誘電損失を示すグラフである。図６（ａ）、（ｂ）の横軸は、対数軸である。

【0065】

図６（ａ）に示すように、バルク水の誘電損失は、主として、１～８００ＧＨｚの範囲のギガヘルツ帯において生じる。したがって、共振器１１０の共振周波数をギガヘルツ帯に含まれる周波数に設定することにより、バルク水の誘電損失の変化に基づく水の誘電率の変化を検出できる。図６（ａ）において、τdは、自由水緩和による誘電損失の波形を示し、τfは、分子間伸縮振動による誘電損失の波形を示している。なお、分子間伸縮振動の周波数帯域より大きい周波数帯域にも、他のパラメータによる誘電損失が存在するが、これについては、図示が省略されている。

【0066】

図６（ｂ）に示すように、微生物周囲の水（生体水）には、バルク水の他に、上述の結合水やイオン等による誘電損失の周波数帯域が存在する。ここで、微生物の増殖が進むと、水分子の結合対象である生体分子が増える。このため、微生物の増殖に伴い、微生物周囲のバルク水が生体分子に結合して結合水となり、これにより、微生物周囲の水に対するバルク水の比率が減少する。したがって、微生物が増殖すると、図６（ｂ）の破線の矢印で示すように、バルク水の誘電損失が減少し、微生物周囲の水の誘電損失が変化する。

【0067】

ここで、バルク水の誘電損失は、図６（ａ）、（ｂ）に示すように、ギガヘルツの周波数帯において生じる。したがって、上記のように、ギガヘルツ帯で発振する共振器に試料を適用することにより、微生物の増殖に伴って、共振器１１０の共振周波数が変動する。この変動を算出することにより、試料２００中の微生物の増殖度合いを把握できる。

【0068】

なお、図６（ｂ）に示すように、バルク水の誘電損失の帯域の一部に、イオンの誘電損失の帯域が重なっている。このため、共振器１１０の共振周波数をイオンの誘電損失が重なる周波数帯域に設定すると、共振器１１０の共振周波数が、試料２００中に含まれるイオンの影響を受けてしまい、共振周波数の変動を、微生物の増殖に伴うバルク水の減少に、正確に対応させにくくなる。したがって、微生物の増殖を共振周波数の変動に正確に対応させるためには、共振器１１０の共振周波数を、イオンの影響を受けにくい１０ＧＨｚ以上の波長帯に設定することが好ましく、また、イオンの影響を殆ど受けない３０ＧＨｚ以上の波長帯に設定することがさらに好ましい。

【0069】

また、図６（ｂ）に示すように、ギガヘルツの周波数帯であっても、周波数が１テラヘルツに近づくに伴い、バルク水の減少による誘電損失の下げ幅が徐々に小さくなる。このため、共振器１１０の共振周波数が１テラヘルツに近づくと、微生物の増殖に伴うバルク水の減少が、共振周波数の変動に効率的に反映されにくくなる。したがって、微生物の増殖を共振周波数の変動に効率的に反映させて、微生物の増殖を適正に検査するためには、共振器１１０の共振周波数を６００ＧＨｚ以下に設定することが好ましい。

【0070】

さらに、共振器１１０の共振周波数が３００ＧＨｚを超えると、インダクタ１１１を顕著に小型化する必要があり、回路的にも、所定の共振周波数で共振器１１０を共振させることが難しくなる。このため、所定の共振周波数で共振器１１０を適正に共振させて、微生物の増殖を正確に検査するためには、共振器１１０の共振周波数を３００ＧＨｚ以下に設定することがさらに好ましい。

【0071】

たとえば、共振器１１０の共振周波数は、６４ＧＨｚに設定される。これにより、微生物の増殖に伴うバルク水の減少を、共振器１１０の共振周波数の変動に正確かつ効率的に反映させることができる。

【0072】

次に、試料２００をアレイセンサ１０の近接領域に封止する工程について説明する。

【0073】

ギガヘルツ帯で共振器１１０が共振される場合、共振器１１０の共振周波数に影響し得る試料２００の範囲は、共振器１１０に近接した底部分の範囲に制限される。換言すると、アレイセンサ１０上方の近接領域が、微生物の増殖に伴う周波数シフトの検出領域となる。したがって、検査においては、この検出領域に試料２００を留めておくことが好ましい。たとえば、結核菌等のような動き回る性質のない微生物では、温度変化等に基づく試料２００の対流等によって、微生物が試料２００の上部に浮遊して、アレイセンサ１０の近接領域から離れてしまうことが起こり得る。こうなると、微生物の増殖を正確に検査することが困難になる。

【0074】

そこで、本実施形態では、検査の際に試料２００に封止溶剤が添加され、試料２００の一部が、封止溶剤によってアレイセンサ１０の近接領域に封止される。

【0075】

図７（ａ）～（ｄ）は、それぞれ、試料２００に対する封止溶剤３００の添加工程を示す図である。図７（ｅ）は、封止溶剤３００によって封止された試料２００の状態を模式的に示す断面図である。

【0076】

まず、図７（ａ）に示すように、容器６０に試料２００が導入される。容器６０の底面には、保護膜１３（図４（ａ）参照）で上面が被覆された状態で、アレイセンサ１０が配置されている。

【0077】

次に、図７（ｂ）に示すように、水より比重が高く、且つ、疎水性の封止溶剤３００が試料２００に添加される。封止溶剤３００は、分子間力および表面張力が小さく、且つ、ガス溶解性を有することが好ましい。検査対象の微生物が好気性である場合、予め封止溶剤３００に酸素が溶解される。封止溶剤３００として、たとえば、フッ素系不活性溶媒を用いることができる。たとえば、パーフルオロ化合物（ＰＦＣ）を、封止溶剤３００として用い得る。この他、シリコンオイル等を封止溶剤３００として用い得る。

【0078】

その後、封止溶剤３００は、図７（ｃ）に示すように、自重で試料２００の下方に垂下し、さらに、図７（ｄ）に示すように、その一部が分離して、容器６０の底面を覆う。これにより、図７（ｅ）に示すように、試料２００の一部が封止溶剤３００によりアレイセンサ１０上方の近接領域に封止され、試料２００中の微生物２０１がアレイセンサ１０の近接領域に滞留される。このとき、封止溶剤３００の自重による圧力により、試料２００とともに微生物２０１が、アレイセンサ１０（保護膜１３）の上面に押しつけられる。また、試料２００中の微生物が好気性の場合、封止溶剤３００に溶解されたガス（酸素）が試料２００へと溶出し、試料２００中の微生物２０１に酸素が供給される。これにより、アレイセンサ１０の各共振器１１０の周波数シフトにより、微生物の増殖を正確に検査することができる。

【0079】

なお、大腸菌等の試料２００中を動き回る性質の微生物が検査対象である場合は、必ずしも、封止溶剤３００の添加が行われなくてもよい。すなわち、微生物が試料２００中を動き回る場合、微生物は、増殖に伴い、試料中に略均等に分布し得るため、封止溶剤３００を用いずとも、アレイセンサ１０の近接領域において、増殖に伴う微生物の密度の変化が生じ得る。よって、この場合は、封止溶剤３００を用いることなく、共振周波数の変動により増殖度合いを検査できる。

【0080】

図８は、微生物検査方法の工程を示すフローチャートである。

【0081】

まず、検査者は、図７（ａ）に示した容器６０が空である状態において、分析ユニット４０に対し、検査開始の入力を行う。これにより、分析ユニット４０から制御ユニット３０に検査開始の指令が出力され、アレイセンサ１０が起動される（Ｓ１１）。

【0082】

次に、分析ユニット４０は、アレイセンサ１０の初期設定処理を実行する（Ｓ１２）。この処理において、分析ユニット４０は、アレイセンサ１０上の各素子（共振器１１０）の特性を取得する。すなわち、アレイセンサ１０の各素子は、それぞれ、共振周波数と、その変化傾向に、固有のばらつきを含み得る。また、周囲の温度や湿度等の影響により、素子ごとに、共振周波数と、その変化傾向に、ばらつきが生じ得る。このようなばらつきを補正するため、分析ユニット４０は、素子ごとに、共振周波数とその変化傾向を取得し、各素子の測定動作が一様となるように、素子ごとに補正係数を設定する。

【0083】

具体的には、分析ユニット４０は、容器６０が空の状態のまま、所定回数、各素子の共振周波数を測定し、さらに、検査者に超純水を容器６０に導入させて、所定回数、各素子の共振周波数を測定する。そして、分析ユニット４０は、容器６０が空のときの共振周波数と、容器６０に超純水が導入されたときの共振周波数とを、素子ごとに比較して、周波数シフトを算出する際の補正係数を、素子ごとに設定する。

【0084】

その後、分析ユニット４０は、表示画面等を通じて、検査者に、容器６０に対する試料の導入を促す。これに応じて、検査者は、容器６０から超純水を廃棄し、前処理済みの検体と、検査対象の微生物に適する培養液とを混合して調製された試料を、容器６０に導入する（Ｓ１３）。

【0085】

こうして、容器６０に試料が導入されると、分析ユニット４０は、さらに、容器６０に封止溶剤３００を添加することを、検査者に促す。これに応じて、検査者は、封止溶剤３００を容器６０に添加する（Ｓ１４）。これにより、図７（ａ）～図７（ｄ）に示したように、封止溶剤３００によって、アレイセンサ１０の近接領域に試料２００が封止される。なお、上記のように、検査対象が封止不要の微生物である場合は、図８の破線で示すように、ステップＳ１４の工程が省略されてもよい。

【0086】

その後、分析ユニット４０は、試料２００に対する周波数シフトの測定を実行する。具体的には、分析ユニット４０は、測定開始時における各素子の共振周波数を初期周波数として記憶する（Ｓ１５）。次いで、分析ユニット４０は、所定時間ごと（たとえば、１分ごと）に、各素子の共振周波数を取得し、取得した共振周波数と、ステップＳ１５で記憶した共振周波数との差分を素子ごとに算出する。そして、分析ユニット４０は、算出した差分を、各素子における周波数シフトとして記憶する（Ｓ１６）。ここで、周波数シフトは、たとえば、ステップＳ１６で取得した共振周波数を、ステップＳ１５で記憶した初期周波数から減算することにより算出される。

【0087】

分析ユニット４０は、測定が終了するまで（Ｓ１７）、所定時間ごとにステップＳ１６の処理を繰り返して、各素子の周波数シフトを蓄積する。その後、検査者から測定終了の入力を受け付けると（Ｓ１７：ＹＥＳ）、分析ユニット４０は、アレイセンサ１０を停止させ（Ｓ１８）、ステップＳ１６で蓄積されたデータの解析処理を実行する（Ｓ１９）。なお、測定の終了は、測定開始から所定の設定時間（たとえば、数十時間）が経過したことにより、なされてもよい。

【0088】

ステップＳ１９の解析処理において、分析ユニット４０は、たとえば、図９（ａ）に示すような表示画像７０をモニタ４１に表示させる。表示画像７０は、各素子について算出された周波数シフトの大きさに応じた表示色を、各素子の位置にマッピングした画像である。表示画像７０において、セル７１は、素子（インダクタ１１１）の位置を示している。たとえば、周波数シフトが最大値から最小値へと移行するに伴い、表示色が赤色から黄色を経て青色へと変化するように、各セル７１に表示色が割り当てられる。図９（ａ）では、便宜上、ハッチングの濃さにより周波数シフトが表現されている。ここでは、黒に近いほど、周波数シフトが大きくなる。

【0089】

分析ユニット４０は、たとえば、最終回のステップＳ１６の処理で取得された各素子の周波数シフトに基づいて、表示画像７０を生成し、モニタ４１に表示させる。検査者は、表示画像７０を参照することにより、アレイセンサ１０上における微生物の増殖状況と、微生物の増殖が進んだ領域を確認できる。なお、分析ユニット４０は、検査者からの操作に応じて、表示画像７０を生成するタイミングを変更可能であってもよい。これにより、検査者は、各タイミングにおける微生物の増殖状況を確認できる。

【0090】

さらに、表示画像７０において、検査者が、所定のセル領域を指定すると、分析ユニット４０は、そのセル領域における周波数シフトの経時変化を示すグラフをモニタ４１に表示させる。たとえば、図９（ａ）の表示画像７０において、検査者が、領域７２を指定すると、分析ユニット４０は、この領域７２に含まれる４つのセルに対応する素子の周波数シフトを、測定タイミングごとに平均化し、平均化した周波数シフトを、各測定タイミングにプロットしたグラフをモニタ４１に表示させる。

【0091】

これにより、たとえば、図９（ｂ）に示すようなグラフ（増殖曲線）が、モニタ４１に表示される。Ｌ１は、たとえば、図９（ａ）の領域７２が指定された場合のグラフである。他方、図９（ａ）の領域７３が指定された場合、たとえば、図９（ｂ）のグラフＬ２がモニタ４１に表示される。また、試料２００に時間依存性の薬剤が添加された場合、微生物の増殖領域の周波数シフトの経時的変化は、たとえば、図９（ｂ）のようなグラフＬ３となる。検査者は、これらのグラフを参照することにより、アレイセンサ１０上の各領域における微生物の増殖度合いを把握できる。

【0092】

図８の検査方法を微生物の薬剤感受性検査に用いる場合、検査者は、ステップＳ１３において、検体および培養液とともに薬剤を混合して試料２００を調製し、調製した試料２００を容器６０も導入する。その他の工程は、上記と同様である。

【0093】

当該薬剤に対して微生物が感受性を持つ場合、微生物は、試料２００中での増殖が抑制される。このため、各素子における周波数シフトは低く抑えられ、図９（ａ）の表示画像７０では、各セル７１の表示色が、低い周波数シフトの表示色に設定される。また、表示画像７０において何れのセル領域が指定されても、図９（ｂ）のグラフは、ゼロ付近の周波数に収束するようになる。

【0094】

他方、当該薬剤に対して微生物が耐性を持つ場合、微生物は、試料２００中で増殖を進める。このため、図９（ａ）の表示画像７０と同様、所定の素子領域において周波数シフトが高くなる。また、検査者により当該素子領域が指定されると、図９（ｂ）のグラフＬ１と同様のグラフが表示される。

【0095】

こうして、検査者は、評価対象の薬剤に対して微生物が感受性または耐性を有するか否かを適正に評価することができる。アレイセンサ１０により、経時的に細菌増殖を評価することが可能である。これにより、濃度依存性または時間依存性に増殖抑制作用を持つ薬剤に対する、微生物の感受性を精密に評価することが可能である。前者の代表的薬剤としてアミノグリコシド系、ニューキノロン系が、後者の代表的薬剤としてペニシリン系、セフェム系、カルバペネム系が知られている。

【0096】

なお、図８の検査方法では、分析ユニット４０が主導的に各工程を実行したが、検査者が主導的に各工程を実行してもよい。たとえば、ステップＳ１１、Ｓ１６の工程が、検査者によるスイッチ操作により行われてもよく、また、ステップＳ１３、Ｓ１４の工程が、分析ユニット４０から促されることなく、検査者が主導的に行い、これら工程の完了後に、その旨を、分析ユニット４０に入力してもよい。あるいは、ステップＳ１１～Ｓ１９の一連の工程が、検査者のマニュアル操作なく、自動化されてもよい。

【0097】

＜実施例１＞
発明者らは、難培養菌であるＢＣＧ（ウシ結核菌）を含む検体をコントロールとして用いて、上記検査方法によるＢＣＧの増殖および薬剤感受性の検証実験を行った。

【0098】

この実験では、ＢＣＧと培養液（ＭＧＩＴ ＰＡＮＴＡ）とが混合されたＢＣＧ懸濁液２００μＬと、未使用の培養液（ＭＧＩＴ ＰＡＮＴＡ）４００μＬとを混合してコントロール試料を調製した。また、調製したコントロール試料１９６μＬに、２５ｍｇ／ｍＬの濃度のＳＭ（スプレプトマイシン）４μＬを混合して、薬剤感受性評価用のＳＭ試料を調製した。さらに、上記のように調製したコントロール試料１９９．８ｍＬに、５０ｍｇ／ｍＬの濃度のＲＦＰ（リファンピシン）０．２μＬを混合して、薬剤感受性評価用のＲＦＰ試料を調製した。

【0099】

こうして調製した、コントロール試料２００μＬ、ＳＭ試料２００μＬおよびＲＦＰ試料２００μＬを、それぞれ、異なる容器６０に導入し、さらに、各容器６０に封止溶剤３００を添加して、試料ごとに、周波数シフトの測定を行った。ここでは、封止溶剤３００として、酸素が溶解されたパーフルオロ化合物（ＰＦＣ）を用いた。ＰＦＣに純酸素を５Ｌ／ｍｉｎで１分間吹き込んでＰＦＣを酸素化し、その直後に、ＦＰＣを容器６０に添加して密封した。

【0100】

測定時には、容器６０をインキュベータに収容し、さらに、ペルチェ素子により容器６０内の試料の温度を一定に保った。インキュベータの庫内温度は３７℃に設定し、ペルチェ素子の温度は３８℃に設定した。インキュベータ内の湿度は、１００％に設定した。

【0101】

解析処理は、アレイセンサ１０上の１４８８の素子のうち、初期周波数が６４～６５ＧＨｚの範囲内に含まれる素子について行った。各素子の周波数シフトは、１分ごとに繰り返し測定および算出した。測定は、測定開始から１２時間が経過するまで、継続して行った。

【0102】

図１０（ａ）～（ｃ）は、ＢＣＧの薬剤感受性の実験結果を示すグラフである。図１０（ａ）は、薬剤が添加されていないコントロール試料に対する測定結果を示すグラフであり、図１０（ｂ）、（ｃ）は、それぞれ、ＳＭおよびＲＦＰが添加されたＳＭ試料およびＲＦＰ試料に対する測定結果を示すグラフである。これらのグラフは、分析ユニット４０のモニタ４１に表示され得る。

【0103】

図１０（ａ）は、倍率５００倍の顕微鏡観察で菌塊が確認された２０素子を解析対象の素子とした場合の測定結果である。図１０（ｂ）、（ｃ）は、初期周波数が６４～６５ＧＨｚの範囲内に含まれる２０の素子を解析対象の素子とした場合の測定結果である。

【0104】

図１０（ａ）に示すように、薬剤を添加しなかったコントロール試料については、解析対象に設定した２０の素子のうち、半数程度の素子において、時間の経過とともに周波数シフトが急峻に増加し、３００～６００ＭＨｚ程度の周波数シフトへと収束した。また、これら２０の素子のうち、残り半数程度の素子においては、時間の経過とともに周波数シフトが緩やかに増加し、１００～２００ＭＨｚ程度の周波数シフトへと収束した。

【0105】

この測定結果から、薬剤を添加しなかったコントロール試料においては、素子の位置によって、周波数シフトの増加に差異が生じることが確認できた。そして、この差異は、ＢＣＧの増殖が菌の塊に応じて局在的に生じることと符合した。このことから、試料において局在的に生じるＢＣＧの増殖が、各素子の周波数シフトに適正に反映されることが確認できた。

【0106】

次に、図１０（ｂ）に示すように、コントロール試料にＳＭを添加したＳＭ試料については、何れの素子においても、一様に、周波数シフトは時間経過に伴う急峻な増加傾向を認めなかった。このことから、ＳＭ試料においては、薬剤ＳＭによってＢＣＧの増殖が抑制され、このことが、各素子の周波数シフトに適正に反映されることが確認できた。

【0107】

また、図１０（ｃ）に示すように、コントロール試料にＲＦＰを添加したＲＦＰ試料については、ＳＭ試料と同様に何れの素子においても、一様に、周波数シフトは時間経過に伴う急峻な増加傾向を認めなかった。このことから、ＲＦＰ試料においては、薬剤ＲＦＰによってＢＣＧの増殖が抑制され、このことが、各素子の周波数シフトに適正に反映されることが確認できた。

【0108】

このように、実施例１の実験結果から、上記実施形態の検査方法により、ＢＣＧの増殖と、ＳＭおよびＲＦＰに対するＢＣＧの薬剤感受性を、各素子の周波数シフトに基づいて確認できることが検証できた。しかも、これらの確認を、図１０（ａ）～（ｃ）に示すように、僅か１０時間程度で迅速に行うことができ、特に、ＢＣＧの薬剤感受性試験に要する時間を、従来の寒天培地や培養液を用いた薬剤感受性の検査に比べて、顕著に短縮化できることが確認できた。このように、実施例１の実験結果により、上記実施形態の検査方法の顕著な有効性を確認できた。

【0109】

＜実施例２＞
発明者らは、大腸菌のコントロールであるＮＢＲＣ３３０１を用いて、上記検査方法による大腸菌の増殖および薬剤感受性の検証実験を行った。

【0110】

この実験では、濃度依存性薬剤であるストレプトマイシン（アミノグリコシド系）を使用した。ＮＢＲＣ３３０１のコントロール試料１９６μＬに、２５ｍｇ／ｍＬの濃度のＳＭ（スプレプトマイシン）４μＬを混合して、ＳＭの濃度が５００μｇ／ｍＬの薬剤感受性評価用の試料（ＳＭ＿５００μｇ／ｍＬ）を調製した。また、コントロール試料に対するＳＭの添加量を調整して、ＳＭの濃度が２５０μｇ／ｍＬの薬剤感受性評価用の試料（ＳＭ＿２５０μｇ／ｍＬ）と、ＳＭの濃度が１２５μｇ／ｍＬの薬剤感受性評価用の試料（ＳＭ＿１２５μｇ／ｍＬ）を調製した。さらに、死菌の周波数シフトを検証するために、コントロール試料２００μＬに９８℃、３０ｍｉｎの加熱処理を行った試料を調製した。また、同様に死菌の周波数シフトを検証するために、コントロール試料２００μＬにリン酸緩衝４％ホルムアルデヒド液を添加して１０ｍｉｎ室温処理した後、超純水で置換した試料（４％＿ＦＡ）を調製した。

【0111】

こうして調製した各試料を、それぞれ、異なる容器６０に導入して、試料ごとに、周波数シフトの測定を行った。ここでは、各容器６０に、封止溶剤３００を添加しなかった。測定時のインキュベータおよびペルチェ素子の温度設定は、上記実施例１と同様とした。解析処理は、アレイセンサ１０上の１４８８の素子の全ての周波数シフトを１０秒ごとに測定し、測定した周波数シフトの平均値を５分ごとに算出して、各測定タイミングの周波数シフトとして抽出した。測定は、測定開始から６０分が経過するまで、継続して行った。

【0112】

図１１（ａ）は、ＮＢＲＣ３３０１の薬剤感受性の実験結果を示すグラフである。このグラフは、分析ユニット４０のモニタ４１に表示され得る。また、図１１（ｂ）は、ＳＭを添加しなかったコントロール試料を６０分経過時点で測定したときの各素子の周波数シフトを色により示す表示画像であり、図１１（ｃ）は、ＳＭの濃度が５００μｇ／ｍＬの薬剤感受性評価用の試料（ＳＭ＿５００μｇ／ｍＬ）を６０分経過時点で測定したときの各素子の周波数シフトを色により示す表示画像である。図１１（ｂ）、（ｃ）では、便宜上、カラーの画像がグレースケールで示されている。ここでは、周波数シフトの最大値である２０ＭＨｚが青色に設定され、周波数シフトの最小値である－２０ＭＨｚが赤色に設定されている。

【0113】

図１１（ａ）に示すように、ＳＭを添加しなかったコントロール試料については、時間の経過とともに周波数シフトが大きく増加した。これに対し、ＳＭを添加した３つの試料については、コントロール試料に比べて、周波数シフトの増加が抑制され、ＳＭの濃度が高まるほど、周波数シフトの増加が大きく抑制された。これにより、大腸菌に対するＳＭの薬剤感受性が、薬剤濃度依存的に各素子の周波数シフトに反映されることが確認できた。このことは、図１１（ｂ）、（ｃ）の表示画像を比較することによっても確認できた。すなわち、図１１（ｂ）に示すコントロール試料の表示画像では、周波数シフトが大きい素子が略均等に分散し、図１１（ｃ）に示すＳＭ＿５００μｇ／ｍＬ試料の表示画像では、全ての素子の周波数シフトが一様に低く抑制された。

【0114】

また、図１１（ａ）の測定結果から、加熱処理またはホルムアルデヒド処理された死菌については、全ての素子において周波数シフトが略生じておらず、大腸菌に増殖が生じなかったことが各素子の周波数シフトに反映されることが確認できた。よって、この測定結果からも、上記検査方法により、各素子の周波数シフトによって微生物の増殖を確認できることが検証できた。

【0115】

以上のように、実施例２の実験結果から、上記実施形態の検査方法により、大腸菌の増殖と、ＳＭに対する大腸菌の薬剤感受性を、各素子の周波数シフトに基づいて確認できることが検証できた。

【0116】

＜実施例３＞
発明者らは、表皮ブドウ球菌のコントロールであるＮＢＲＣ１２９９３を用いて、上記検査方法による表皮ブドウ球菌の増殖および薬剤感受性の検証実験を行った。

【0117】

この実験では、時間依存性薬剤であるピペラシリン（ペニシリン系）を使用した。すなわち、この薬剤は、有効薬剤濃度が一定時間維持されることで増殖抑制作用を示す。ＮＢＲＣ１２９９３のコントロール試料に、ＰＩＰＣ（ピペラシリン）を混合して、ＰＩＰＭの濃度が１０．０μｇ／ｍＬの薬剤感受性評価用の試料（ＰＩＰＣ＿１０．０μｇ／ｍＬ）を調製した。また、死菌の周波数シフトを検証するために、コントロール試料２００μＬに９８℃、３０ｍｉｎの加熱処理を行った試料を調製した。

【0118】

こうして調製した各試料を、それぞれ、異なる容器６０に導入して、試料ごとに、周波数シフトの測定を行った。ここでは、各容器６０に、封止溶剤３００を添加しなかった。測定時のインキュベータおよびペルチェ素子の温度設定は、上記実施例１と同様とした。解析処理は、アレイセンサ１０上の１４８８の素子の全ての周波数シフトを１０秒ごとに測定し、測定した周波数シフトの平均値を５分ごとに算出して、各測定タイミングの周波数シフトとして抽出した。この他、実施例３では、表示画像上において表皮ブドウ球菌の増殖が見られる領域を指定して、この増殖領域における周波数シフトの平均値を、５分ごとに算出した。測定は、測定開始から２４０分が経過するまで、継続して行った。

【0119】

図１２（ａ）は、ＮＢＲＣ１２９９３の薬剤感受性の実験結果を示すグラフである。図１２（ａ）において、「コントロール（増殖領域）」のグラフは、表示画像上において表皮ブドウ球菌の増殖が見られる領域を指定して算出された周波数シフトの変化を示し、「コントロール（全領域）」のグラフは、全ての素子の周波数シフトを平均化して算出された周波数シフトの変化を示している。これらのグラフは、分析ユニット４０のモニタ４１に表示され得る。

【0120】

また、図１２（ｂ）は、ＰＩＰＣを添加しなかったコントロール試料を２４０分経過時点で測定したときの各素子の周波数シフトを色により示す表示画像であり、図１２（ｃ）は、ＰＩＰＣを添加した薬剤感受性評価用の試料（ＰＩＰＣ＿１０．０μｇ／ｍＬ）を２４０分経過時点で測定したときの各素子の周波数シフトを色により示す表示画像である。図１２（ｂ）、（ｃ）では、便宜上、カラーの画像がグレースケールで示されている。実施例２と同様、図１２（ｂ）、（ｃ）では、周波数シフト２０ＭＨｚ以上が青色に設定され、周波数シフト－２０ＭＨｚ以下が赤色に設定されている。

【0121】

図１２（ａ）に示すように、ＰＩＰＣを添加しなかったコントロール試料については、増殖領域を指定して周波数シフトを算出した場合に、時間の経過とともに周波数シフトが大きく増加した。これに対し、ＰＩＰＣを添加した試料については、加熱処理が行われた場合よりも、さらに、周波数シフトの増加が抑制された。これにより、表皮ブドウ球菌に対するＰＩＰＣの薬剤感受性が、各素子の周波数シフトに反映されることが確認できた。このことは、図１２（ｂ）、（ｃ）の表示画像を比較することによっても確認できた。すなわち、図１２（ｂ）に示すコントロール試料の表示画像では、周波数シフトが大きい素子が連鎖的に広がり、図１２（ｃ）に示すＰＩＰＣ＿１０．０μｇ／ｍＬ試料の表示画像では、全ての素子の周波数シフトが一様に低く抑制された。

【0122】

また、図１２（ａ）の測定結果から、加熱処理された死菌については、全ての素子において周波数シフトが略発生しておらず、表皮ブドウ球菌において増殖が生じなかったことが各素子の周波数シフトに反映されることが確認できた。よって、この測定結果からも、上記検査方法により、各素子の周波数シフトによって微生物の増殖を確認できることが検証できた。

【0123】

また、図１２（ｂ）の測定結果から、表皮ブドウ球菌では、封止溶剤３００を用いなくても、アレイセンサ１０の近接領域において、表皮ブドウ球菌が連鎖状に広がって増殖されることが確認できた。このため、図１２（ａ）に示すように、全ての素子の周波数シフトを平均化して周波数シフトを算出すると、死菌（加熱処理）の場合との差異が僅かとなり、表皮ブドウ球菌の増殖を周波数シフトにより正確に判定できないことが確認できた。したがって、表皮ブドウ球菌に上記実施形態の検査方法を適用する場合は、増殖が見られる素子領域を指定して、表皮ブドウ球菌の増殖を評価する必要があると言える。

【0124】

以上のように、実施例３の実験結果から、上記実施形態の検査方法により、表皮ブドウ球菌の増殖と、ＰＩＰＣに対する表皮ブドウ球菌の薬剤感受性を、各素子の周波数シフトに基づいて確認できることが検証できた。

【0125】

また、図１２（ａ）において、ＰＩＰＣを添加した試料については、測定開始から１２０分程度が経過するまでは、周波数シフトが増加し、１２０分程度が経過した後に、周波数シフトが減少傾向を示した。これにより、表皮ブドウ球菌に対するＰＩＰＣの時間依存的作用が確認できた。

【0126】

＜実施例４＞
発明者らは、上記実施例１において封止溶剤３００として用いたパーフルオロ化合物（ＰＦＣ）に、酸素および窒素を溶解させる実験を行った。

【0127】

図１３（ａ）は、封止溶剤３００に対する酸素または窒素の溶解の実験に用いた構成を模式的に示す図である。図１３（ｂ）は、実施例４に係る、封止溶剤３００に対する酸素または窒素の溶解の実験結果を示すグラフである。

【0128】

図１３（ａ）に示すように、封止溶剤３００であるＰＦＣに、純酸素または純窒素を吹き込んで、ＰＦＣに溶解させた。ここでは、図１３（ｂ）の実線矢印のタイミングで、１Ｌ／ｍｉｎの流速で２分間、純酸素をＰＦＣに吹き込み、図１３（ｂ）の破線矢印のタイミングで２Ｌ／ｍｉｎの流速で５分間、純窒素をＰＦＣに吹き込んだ。ＰＦＣ中の酸素濃度は、所定の測定器を用いて測定した。

【0129】

図１３（ｂ）に示すように、ＰＦＣに純酸素を吹き込むことにより、ＦＰＣ中の純酸素の濃度を高めることができ、ＰＦＣに純窒素を吹き込むことにより、ＦＰＣ中の純酸素の濃度を０付近に低下させることができた。また、ＰＦＣに純酸素を吹き込むと、ＰＦＣ中の酸素濃度が３０分程度維持され、その後、ＰＦＣ中の酸素濃度が次第に低下した。このことから、図８のステップＳ１４においてＦＰＣ（封止溶剤３００）を添加し、試料２００をＦＰＣで封止すると、ＦＰＣ中の酸素が試料に溶出して、試料に酸素を供給できることが確認できた。

【0130】

＜実施形態１の効果＞
以上、本実施形態によれば、ギガヘルツ帯で発振する共振器１１０に試料２００を適用して、その共振周波数の変動を算出することにより、試料２００中の微生物の増殖度合いを迅速かつ正確に検査できる。

【0131】

このとき、共振器１１０の発振周波数を１０ＧＨｚ以上６００ＧＨｚ以下に設定することにより、図６（ｂ）を参照して説明したように、試料２００中に存在するイオンが共振器１１０の共振周波数の変動に影響することを抑制でき、且つ、微生物の増殖に伴う共振周波数の変動幅を大きくできる。

【0132】

また、共振器１１０の発振周波数を３０ＧＨｚ以上３００ＧＨｚ以下に設定することにより、図６（ｂ）を参照して説明したように、試料２００中に存在するイオンの影響をほぼ無くすことができ、且つ、所定の共振周波数で共振器１１０を正確に発振させ易くなる。

【0133】

また、共振器１１０を構成する素子がマトリクス状に隣接配置されたアレイセンサ１０に試料２００を適用することにより、実施例１、３に示したように、素子の位置ごとに微生物の増殖度合いを検査できる。また、図１１（ｂ）、（ｃ）および図１２（ｂ）、（ｃ）に示したように、アレイセンサ１０の全検出範囲における各素子の周波数シフトの分布を検査することもできる。

【0134】

また、試料２００の一部を、封止溶剤３００により、共振器１１０の近接領域に封止することにより、温度変化による対流等の影響を軽減することで、試料２００を共振器１１０の近接領域に留めておくことができる。よって、上記実施例１に示したように、検査対象の微生物がＢＣＧ等であっても、試料２００中の微生物の増殖度合いに応じた周波数シフトを正確に算出でき、微生物の検査を精度よく行うことができる。

【0135】

また、試料中の微生物が好気性の場合、酸素を封止溶剤３００に溶解させた後、封止溶剤３００を試料２００に添加することにより、封止溶剤３００で封止された試料中の微生物に酸素を供給することができる。

【0136】

また、上記実施例１～３に示したように、検査対象の微生物が結核菌、大腸菌または表皮ブドウ球菌である場合、これらの微生物の増殖を、アレイセンサ１０の各素子の周波数シフトにより迅速かつ精度良く、検査することができる。

【0137】

＜実施形態２＞
上記実施形態１では、封止溶剤３００で試料２００を封止する場合、試料２００が容器６０に導入された後、封止溶剤３００が試料２００に添加された。これに対し、実施形態２では、先に、封止溶剤３００が容器６０に導入された後、挿入具が封止溶剤３００に差し込まれ、その後、挿入具を介して試料２００が導入されることにより、試料２００がアレイセンサ１０の近接領域に封止される。

【0138】

図１４（ａ）～（ｄ）は、それぞれ、実施形態２に係る、試料２００の封止工程を示す図である。図１４（ｅ）は、封止溶剤３００によって封止された試料２００の状態を模式的に示す断面図である。

【0139】

まず、図１４（ａ）に示すように、容器６０に封止溶剤３００が導入される。実施形態１と同様、容器６０の底面には、保護膜１３（図４（ａ）参照）で上面が被覆された状態で、アレイセンサ１０が配置されている。

【0140】

次に、図１４（ｂ）に示すように、容器６０に収容された封止溶剤３００に挿入具６２が差し込まれる。このとき、挿入具６２の出口は、アレイセンサ１０の表面付近の近接領域に試料２００が導入できるように位置付けられる。この状態で、挿入具６２に収容されている試料２００が、所定量だけ、挿入具６２から押し出される。これにより、図１４（ｃ）に示すように、アレイセンサ１０の表面付近の近接領域に、試料２００が添加される。

【0141】

その後、試料２００の押し出しが終了され、挿入具６２が封止溶剤３００から引き抜かれる。これにより、図１４（ｄ）に示すように、試料２００が、アレイセンサ１０の表面付近に維持されたまま、封止溶剤３００の下方に位置付けられる。こうして、図１４（ｅ）に示すように、試料２００が封止溶剤３００によりアレイセンサ１０上方の近接領域に封止され、試料２００中の微生物２０１がアレイセンサ１０の近接領域に滞留される。

【0142】

このとき、封止溶剤３００の自重による圧力により、試料２００とともに微生物２０１が、アレイセンサ１０（保護膜１３）の上面に押しつけられる。また、試料２００中の微生物が好気性の場合、封止溶剤３００に溶解されたガス（酸素）が試料２００へと溶出し、試料２００中の微生物２０１に酸素が供給される。これにより、アレイセンサ１０の各共振器１１０の周波数シフトにより、微生物の増殖を正確に検査することができる。

【0143】

図１５は、微生物検査方法の工程を示すフローチャートである。

【0144】

図１５のフローチャートは、図８のフローチャートのステップＳ１３、Ｓ１４が、それぞれ、ステップＳ２１、Ｓ２２に置き換えられている。図１５のフローチャートのその他のステップにおける処理は、図８の対応するステップの処理と同様である。

【0145】

ステップＳ１２の初期設定処理が終了すると、分析ユニット４０は、表示画面を通じて、検査者に、容器６０に対する封止溶剤３００の導入を促す。これに応じて、検査者は、ステップＳ１２の初期設定処理において容器６０に導入された超純水を容器６０から廃棄し、封止溶剤３００を容器６０に導入する（Ｓ２１）。

【0146】

こうして、容器６０に封止溶剤３００が導入されると、分析ユニット４０は、さらに、容器６０に前処理済みの検体と、検査対象の微生物に適する培養液とを混合して調製された試料２００を添加することを、表示画面等を通じて検査者に促す。これに応じて、検査者は、図１４（ｂ）、（ｃ）に示したように、ピペット等の挿入具６２を封止溶剤３００に差し込んで試料２００を導入し、アレイセンサ１０の表面付近に試料２００を添加する（Ｓ２２）。これにより、図１４（ｅ）に示したように、封止溶剤３００によって、アレイセンサ１０の近接領域に試料２００が封止される。

【0147】

その後、分析ユニット４０は、上記実施形態１と同様、ステップＳ１５以降の処理を実行する。これにより、分析ユニット４０は、所定時間ごとにアレイセンサ１０の各素子における周波数シフトを測定して、随時、記憶媒体に記憶する（Ｓ１５～Ｓ１７）。そして、測定が終了すると（Ｓ１７：ＹＥＳ）、分析ユニット４０は、アレイセンサ１０を停止させ（Ｓ１８）、測定の間に蓄積されたデータの解析処理を実行する（Ｓ１９）。この解析処理により、たとえば、図９（ａ）、（ｂ）に示した画像が表示部４１に表示される。

【0148】

なお、微生物の薬剤感受性を検査する場合は、ステップＳ２２で添加される試料２００に、検査対象の薬剤が混合される。

【0149】

実施形態２においても、上記実施形態１と同様、試料２００中の微生物の増殖度合いを迅速かつ正確に検査できる。

【0150】

また、実施形態２では、図１４（ａ）～（ｄ）に示したように、容器６０に封止溶剤３００を導入した後、挿入具６２により試料２００が添加されるため、アレイセンサ１０の近接領域に適量の試料２００をピンポイントで添加できる。このため、試料２００の添加量を抑制でき、且つ、試料２００の封止領域をアレイセンサ１０の近接領域に制限できる。よって、採取された検体が少量である場合も、迅速かつ正確に、検体中の微生物の増殖度合いを検査できる。

【0151】

＜実施形態３＞
実施形態３では、図８および図１５の処理を自動化する場合の構成例が示される。

【0152】

図１６は、図８および図１５の処理を自動化する場合の微生物検査装置１の構成を示すブロック図である。

【0153】

図１６に示すように、微生物検査装置１は、アレイセンサ１０、分析ユニット４０および容器６０の他、導入部８０と、封止溶剤貯留部９１と、酸素供給部９２と、を備えている。

【0154】

上記実施形態１と同様、アレイセンサ１０は、容器６０の下面に装着されている。容器６０の内部は、液体を収容するための収容部６１となっている。便宜上、図１６では、保護膜１３の図示が省略されている。

【0155】

分析ユニット４０は、表示部４１の他、入力部４２と、分析部４３と、記憶部４４とを備える。入力部４２は、操作ボタンや、キーボード、マウス等の入力手段を備える。入力部４２がタッチパネルであってもよい。

【0156】

分析部４３は、ＣＰＵ（CentralProcessing Unit）等の演算処理回路を備え、記憶部４４に記憶されたプログラムに従って各部を制御する。記憶部４４は、ＲＯＭ（Read Only Memory）、ＲＡＭ（Random Access Memory）やハードディスク等の記憶媒体を備え、分析部４３による制御のためのプログラムや、上述の周波数シフト等のデータを記憶する。また、記憶部４４は、分析部４３の処理におけるワークエリアとしても用いられる。

【0157】

導入部８０は、液体を吸引および吐出するためのノズル８１を備える。また、導入部８０は、試料２００を収容した試料容器Ｓ１の設置位置と、封止溶剤３００を貯留した封止溶剤貯留部９１の配置位置と、容器６０の配置位置とに、ノズル８１を移送させる移送機構８２と、各位置においてノズル８１を昇降させる昇降機構８３とを備える。

【0158】

封止溶剤貯留部９１は、収容部６１に導入される量より多い所定量の封止溶剤３００を貯留する。封止溶剤貯留部９１は、多量の封止溶剤３００を収容するタンク（図示せず）に接続され、所定量が満たされるように、タンクから封止溶剤３００が供給される。

【0159】

酸素供給部９２は、配管により封止溶剤貯留部９１に接続され、封止溶剤貯留部９１に貯留されている封止溶剤３００に酸素を供給する。上記のように、封止溶剤３００に酸素が供給されると、封止溶剤３００に酸素が溶解し、封止溶剤３００の酸素濃度が高められる。酸素供給部９２は、図示しない酸素ボンベに接続されている。

【0160】

測定に際して、検査者は、入力部４２を介して、測定開始の指示を入力する。このとき、同時に、検査者は、封止溶剤３００を用いるか否かの入力を行う。あるいは、検査者が検査対象の微生物の種類を入力することにより、分析部４３が、封止溶剤３００を用いるか否かを決定してもよい。この場合、たとえば、微生物の種類と封止溶剤３００の利用の要否とを対応付けた情報が、記憶部４４に予め記憶される。分析部４３は、この情報に基づいて、封止溶剤３００を用いるか否かを決定する。

【0161】

上記入力がなされたことに応じて、分析部４３は、図８または図１５のステップＳ１１、Ｓ１２の処理を実行する。その後、分析部４３は、試料２００を収容した試料容器Ｓ１を装置内の設置部Ｐ１に設置することを検査者に促す表示を表示部４１に出力させる。これに応じて、検査者は、設置部Ｐ１に試料容器Ｓ１を設置する。試料容器Ｓ１の設置は、たとえば、設置部Ｐ１に配置されたセンサにより検知される。あるいは、入力部４２を介して、試料容器Ｓ１を設置したことを示す入力を検査者が行うようにしてもよい。

【0162】

こうして、試料容器Ｓ１が設置されると、分析部４３は、導入部８０を制御して、試料２００および封止溶剤３００を、容器６０の収容部６１に導入する。封止溶剤３００を用いることなく測定が行われる場合、分析部４３は、試料２００のみが容器６０に導入されるように、導入部８０を制御する。

【0163】

図８のフローチャートに従って測定が行われる場合、分析部４３は、まず、ノズル８１を試料容器Ｓ１に降下させて所定量の試料２００を吸引し、吸引した試料２００を、容器６０の収容部６１に吐出させる（Ｓ１３）。次に、分析部４３は、ノズル８１を封止溶剤貯留部９１に降下させて所定量の封止溶剤３００を吸引し、吸引した封止溶剤３００を、容器６０の収容部６１に吐出させる（Ｓ１４）。これにより、図７（ａ）～（ｅ）に示したように、封止溶剤３００が沈下して、試料２００が、封止溶剤３００により、アレイセンサ１０の近接領域に封止される。

【0164】

図１５のフローチャートに従って測定が行われる場合、分析部４３は、まず、ノズル８１を封止溶剤貯留部９１に降下させて所定量の封止溶剤３００を吸引し、吸引した封止溶剤３００を、容器６０の収容部６１に吐出させる（Ｓ２１）。次に、分析部４３は、ノズル８１を試料容器Ｓ１に降下させて所定量の試料２００を吸引し、吸引した試料２００を、容器６０内のアレイセンサ１０に接近した位置に吐出させる（Ｓ２２）。

【0165】

ここでは、ノズル８１を図１４（ｂ）の挿入具６２として用いて、試料２００の挿入が行われる。具体的には、容器６０の収容部６１にノズル８１を降下させて、ノズル８１を封止溶剤３００に差し込む。このとき、ノズル８１の先端が、アレイセンサ１０の表面に近接する位置に到達するまで、ノズル８１が降下される。この状態で、ノズル８１に吸引された試料２００がノズル８１から吐出され、その後、ノズル８１が、収容部６１から引き抜かれる。これにより、図１４（ａ）～（ｅ）に示したように、試料２００が、封止溶剤３００により、アレイセンサ１０の近接領域に封止される。

【0166】

その後、分析部４３は、図８または図１５のステップＳ１５～Ｓ１７の処理を実行して、所定時間ごとに、各素子の周波数シフトを算出し、算出した周波数シフトを、記憶部４４に記憶させる。そして、測定が終了すると（Ｓ１７：ＹＥＳ）、分析部４３は、アレイセンサ１０の動作を停止させ（Ｓ１８）、記憶部４４の記憶された周波数シフトに基づき、検体中の微生物の増殖度合いを解析する。解析の方法は、上記実施形態１と同様である。

【0167】

実施形態３の構成によれば、図８および図１５の処理が自動化されるため、より簡便に微生物の検査を行うことができる。

【0168】

なお、図１６の構成では、試料２００を収容した試料容器Ｓ１が検査者により設置部Ｐ１に設置されたが、搬送手段によって、試料容器Ｓ１が試料２００の吸引位置に搬送されてもよい。

【0169】

また、図１６の構成では、外部で調製された試料２００を収容する試料容器Ｓ１が微生物検査装置１に設置されたが、検体と培養液とを混合して試料を調製する試料調製部が、微生物検査装置１にさらに設けられてもよい。この場合、設置部Ｐ１には、検体を収容した検体容器が設置され、ノズル８１により検体容器から検体が吸引される。吸引された検体は、試料調製部に吐出され、試薬や培養液と混合される。こうして、試料調製部において、測定用の試料が調製される。その後、試料は、試料調製部からノズルにより吸引されて、容器６０に吐出される。

【0170】

また、図１６の構成では、容器６０およびアレイセンサ１０の組が１つだけ配置されたが、容器６０およびアレイセンサ１０の組が、複数、微生物検査装置１に配置されてもよい。この場合、たとえば、異なる薬剤を添加した複数の試料２００を、それぞれ、異なる容器６０に導入することにより、薬剤ごとに、微生物の増殖度合いを並行して測定できる。これにより、各薬剤に対する微生物の薬剤感受性を、より迅速に確認することができる。

【0171】

また、分析ユニット４０は、図１の構成のように、別体のパーソナルコンピュータとして構成されなくてもよく、微生物検査装置１に一体的に装備されていてもよい。この場合、表示部４１、入力部４２、分析部４３および記憶部４４は、ユニット化されていなくてもよく、それぞれ、個別に、微生物検査装置１に配置されてもよい。

【0172】

＜実施形態４＞
上記実施形態１では、疎水性の封止溶剤３００として、パーフルオロ化合物（ＰＦＣ）等のフッ素系不活性溶媒が用いられた。これに対し、本実施形態４では、疎水性の封止溶剤３００として、ミネラルオイルが用いられる。ミネラルオイルは、流動パラフィンとも称される。水より比重が低いミネラルオイルが封止溶剤３００として用いられる。使用されるミネラルオイルの比重は、たとえば、０．８５程度である。水より比重が高いミネラルオイルが用いられてもよい。

【0173】

図１７（ａ）～（ｄ）は、それぞれ、試料２００に対する封止溶剤３００の添加工程を示す図である。

【0174】

まず、図１７（ａ）、（ｂ）に示すように、アレイセンサ１０の表面付近の近接領域に、試料２００が添加される。次に、図１７（ｃ）に示すように、ミネラルオイルからなる封止溶剤３００が、容器６０に導入される。封止溶剤３００は疎水性であるため、試料２００に混ざることなく、試料２００を覆うように試料２００を封止する。その後、図１７（ｄ）に示すように、封止溶剤３００の上面に重なるように、水４００が容器６０に導入される。この場合も、封止溶剤３００の疎水性により、水４００は、封止溶剤３００と混ざることなく、封止溶剤３００の上面に堆積する。

【0175】

ミネラルオイルが封止溶剤３００である場合の封止溶剤３００の添加工程は、上記に限られるものではなく、試料２００を封止溶剤３００で封止可能な限りにおいて、他の方法であってもよい。また、ミネラルオイルが封止溶剤３００に用いられる場合も、図１６と同様の装置により、試料２００に対する封止溶剤３００の添加および試料の測定、分析を自動で行うことができる。

【0176】

＜実施例５＞
発明者らは、ミネラルオイルを封止溶剤３００として用いて、ＢＣＧ（ウシ結核菌）の増殖度合いを測定した。測定に用いる試料２００は、以下のように調製した。

【0177】

ＢＣＧと培養液（ＭＧＩＴ ＰＡＮＴＡ）とが混合されたＢＣＧ懸濁液をミキサーで攪拌した後、常温で１５分放置し、上清を新しい培養液で１０倍希釈して、ミキサーで再度、攪拌した。その後、ＢＣＧ懸濁液を常温で１５分放置し、上清を回収してミキサーで再度攪拌し、攪拌後のＢＣＧ懸濁液をバクテリア用セルカウンターで１０００ＣＦＵ／μＬに調整した。これにより、測定に用いる試料２００を調製した。

【0178】

こうして調製した試料２００を、図１７（ａ）～（ｄ）の方法で、アレイセンサ１０の表面付近の近接領域に、ミネラルオイルからなる封止溶剤３００で封止した。その後、試料２００においてＢＣＧを培養しながら、アレイセンサ１０からの出力を解析し、ＢＣＧの増殖度合いを上記実施例１と同様の手法で算出した（実施例５）。

【0179】

また、封止溶剤３００として上記実施例１と同様のパーフルオロ化合物（ＰＦＣ）を用いた場合について、同様の測定および解析を行った（実施例６）。この測定および解析では、図１７（ａ）～（ｄ）と同様の方法により、試料２００を封止溶剤３００で封止した。

【0180】

さらに、封止溶剤３００を用いない場合について、同様の測定および解析を行った（実施例７）。この測定および解析では、試料２００を容器６０に導入するのみとした。

【0181】

封止溶剤３００（ミネラルオイル／ＰＦＣ）を用いる各測定（実施例５、６）では、試料２００を容器６０に５μＬ導入した。また、封止溶剤を用いない測定（実施例７）では、試料２００を容器６０に３００μＬ導入した。

【0182】

封止溶剤３００としてパーフルオロ化合物（ＰＦＣ）を用いる場合（実施例６）、上記実施例１と同様、酸素を封止溶剤３００に溶解させた。すなわち、ＰＦＣに純酸素を５Ｌ／ｍｉｎで１分間吹き込んでＰＦＣを酸素化し、その直後に、ＦＰＣを容器６０に添加して密封した。封止溶剤３００としてミネラルオイルを用いる場合（実施例５）、酸素を封止溶剤３００に溶解させなかった。

【0183】

各測定では、上記実施例１と同様、倍率５００倍の顕微鏡観察で菌塊が確認された２０素子を解析対象の素子とした。なお、封止溶剤３００としてＰＦＣを用いる測定（実施例６）では、さらに、近接領域外に位置する封止溶剤３００が載った２０の素子を解析対象の素子に追加した。各測定では、これらの解析対象の素子の周波数シフトを、１０分ごとに繰り返し測定および算出した。各測定は、測定開始から１６８時間（７日間）が経過するまで、継続的に行った。

【0184】

図１８（ａ）は、封止溶剤３００としてＰＦＣを用いた実施例６の解析対象素子の周波数シフトを示すグラフである。ここでは、測定開始から４８時間が経過するまでの測定結果が示されている。図１８（ｂ）は、封止溶剤３００としてＰＦＣを用いた実施例６の１６８時間（７日間）経過時点における各素子の周波数シフトを色により示す表示画像である。

【0185】

図１８（ｂ）では、便宜上、カラーの画像がグレースケールで示されている。ここでは、周波数シフトのスケール最大値（ここでは４０ＭＨｚ）が青色に設定され、周波数シフトのスケール最小値（ここでは－３０ＭＨｚ）が赤色に設定されている。図１８（ｂ）の破線で囲まれた２０の素子が、上述の近接領域外に位置する封止溶剤３００が載った２０の素子である。これらの素子の周波数シフトの算出結果は、図１８（ａ）において、０付近で細かく変動するグラフで示されている。

【0186】

図１８（ａ）に示すように、封止溶剤３００としてＰＦＣを用いた場合、封止溶剤３００で封止された領域に含まれる２０の素子（菌塊が確認された素子）における周波数シフトは、上記実施例１と同様、時間の経過とともに増加した。よって、この測定結果からも、試料２００において局在的に生じるＢＣＧの増殖が、各素子の周波数シフトに適正に反映されることが確認できた。

【0187】

また、図１８（ｂ）の測定結果を参照すると、封止溶剤３００で試料２００が封止された領域が画像中央に楕円状に大きく広がっており、この領域に、周波数シフトが大きい素子が分布した。また、この領域の外側では、周波数シフトが大きい素子は僅かに散在する程度であり、殆どの素子では、周波数シフトが略生じていないか、僅かに生じている程度であった。このことから、ＰＦＣを封止溶剤３００として用いて試料２００を封止することにより、封止領域の素子の出力から、ＢＣＧの増殖度合いを効率的かつ精度良く検出できることが確認できた。

【0188】

図１９（ａ）は、封止溶剤３００としてミネラルオイルを用いた実施例５の解析対象素子の周波数シフトを示すグラフである。ここでは、測定開始から４８時間が経過するまでの測定結果が示されている。図１９（ｂ）は、封止溶剤３００としてミネラルオイルを用いた実施例５の１６８時間（７日間）経過時点における各素子の周波数シフトを色により示す表示画像である。

【0189】

図１８（ｂ）と同様、図１９（ｂ）においても、便宜上、カラーの画像がグレースケールで示されている。

【0190】

なお、封止溶剤３００としてミネラルオイルを用いた場合は、ＰＦＣを用いる場合に比べて、試料２００が封止される封止領域の面積が広がり、且つ、封止領域の高さ方向の幅（厚み）が小さくなる。このため、図１９（ｂ）の画像では、左下隅および左辺付近の一部の範囲を除く略全ての素子の範囲に試料２００の封止領域が広がっており、図１８（ｂ）のような封止領域を示す楕円状の境界は、画像上に見られない状態となっている。

【0191】

図１９（ａ）に示すように、封止溶剤３００としてミネラルオイルを用いた場合、封止溶剤３００で封止された領域に含まれる２０の素子（菌塊が確認された素子）における周波数シフトは、上記実施例１と同様、時間の経過とともに増加した。よって、封止溶剤３００としてミネラルオイルを用いた場合も、試料２００において局在的に生じるＢＣＧの増殖が、各素子の周波数シフトに適正に反映されることが確認できた。

【0192】

また、図１９（ｂ）の測定結果から、封止溶剤３００で試料２００が封止された領域において周波数シフトの大きい素子が密集する領域が確認できた。このことから、ミネラルオイルを封止溶剤３００として用いて試料２００を封止することにより、ＢＣＧの増殖度合いを精度良く検出できることが確認できた。

【0193】

なお、図１９（ａ）の測定結果では、図１８（ａ）の測定結果に比べて、時間の経過に伴う周波数シフトの変化が、素子間でばらつきにくいことが確認できた。これは、上記のように、封止溶剤３００としてミネラルオイルを用いた場合は、ＰＦＣを用いた場合に比べて、封止溶剤３００による試料２００の封止領域の高さ方向の幅（厚み）が小さいため、封止領域においてＢＣＧが素子から離れる方向に流動しにくいことによるものであると考えられる。よって、封止溶剤３００としてミネラルオイルを用いることにより、測定対象の素子から、より安定的な周波数シフトの測定結果を得ることができると考えられる。

【0194】

図２０（ａ）は、封止溶剤３００を用いなかった実施例７の解析対象素子の周波数シフトを示すグラフである。ここでは、測定開始から４８時間が経過するまでの測定結果が示されている。図２０（ｂ）は、封止溶剤３００を用いなかった実施例７の１６８時間（７日間）経過時点における各素子の周波数シフトを色により示す表示画像である。

【0195】

図２０（ａ）に示すように、封止溶剤３００を用いなかった場合、各素子における周波数シフトを安定的に検出することができなかった。よって、解析対象がＢＣＧの場合、封止溶剤３００を用いることなく、ＢＣＧの増殖度合いを各素子の周波数シフトに反映させることは、困難であることが確認できた。

【0196】

図２１（ａ）～（ｃ）は、それぞれ、封止溶剤３００としてＰＦＣを用いた場合（実施例６）、封止溶剤３００としてミネラルオイルを用いた場合（実施例５）、および封止溶剤３００を用いなかった場合（実施例７）の顕微鏡写真を示す図である。図２１（ａ）、（ｂ）では、封止溶剤３００で試料２００が封止された領域が観察されている。図２１（ｂ）の顕微鏡写真は、他の顕微鏡写真に比べて、顕微鏡の倍率が高められている。

【0197】

図２１（ｃ）の顕微鏡観察では、破線矢印で模式的に示すように、液体培地中で菌塊が流動するため、全体としての菌の増殖は評価できるものの、個々の菌体の増殖を評価することはできない。これに対し、図２１（ａ）、（ｂ）に示す顕微鏡観察では、封止溶剤３００が用いられるため、菌塊の流動が少ない。このため、長時間に亘って精緻に菌塊の顕微鏡観察が可能である。よって、封止溶剤３００を用いることにより、個々の菌体の分裂および増殖を経時的に観察できる。

【0198】

なお、図２１（ｂ）に示すように、封止溶剤３００としてミネラルオイルを用いた場合は、ミネラルオイルの屈折率との関係から、顕微鏡写真の解像度がやや低下する。これに対し、封止溶剤３００としてＰＦＣを用いた場合は、図２１（ａ）に示すように、顕微鏡写真の解像度が高く維持される。よって、顕微鏡により菌体の増殖を観察する場合は、封止溶剤３００としてＰＦＣを用いるのが好ましいと言える。

【0199】

この他、封止溶剤３００を用いる場合は、試料２００が封止溶剤３００で封止されるため、試料２００の乾燥を防ぐことができる。また、封止溶剤３００を用いる場合は、試料２００と封止溶剤３００との間で酸素等のガス交換が行われるため、試料２００中の微生物の増殖性を維持することができる。これらのことから、封止溶剤３００を用いる場合は、長時間に亘って微生物の増殖度合いを安定的に測定することができる。

【0200】

＜変更例＞
以上、本発明の実施の形態ついて説明したが、本発明は、上記実施の形態に制限されるものではなく、また、本発明の実施の形態も上記以外に種々の変更が可能である。

【0201】

たとえば、検査対象の微生物は、上記実施例１～３に示した微生物に限られるものではなく、他の微生物であってもよい。たとえば、アフリカヌム（M.africanum）、ゴルドネ（M.gordonae）、アビウム（M.avium）、イントラセルラーレ（M.intracellulare）、カンサシ（M.kansasi）、マリウム（M.marinum）、アブセッサス（M.abscessus）、ミルロティ（M. microti）、ウルセランス（M.ulcerance）等の抗酸菌が検査対象であってもよい。上記検査方法は、未知の菌に対する薬剤感受性評価にも利用され得る。

【0202】

また、微生物の薬剤感受性を評価する薬剤も、上記実施例１～３に示した薬剤に限られるものではなく、他の薬剤に対する微生物の薬剤感受性が評価されてもよい。

【0203】

さらに、微生物の薬剤感受性に限らず、食品管理における微生物の増殖評価に、上記実施形態の検査方法が用いられてもよい。本発明は、微生物の増殖を評価する分野において、有効に利用され得る。

【0204】

また、図８および図１５の検査方法では、測定が終了するまで各素子の周波数シフトが蓄積された後、蓄積された周波数シフトを解析して、微生物の増殖に関する解析結果がモニタ４１に表示されたが、測定中にリアルタイムで周波数シフトが解析され、随時、図９（ａ）、（ｂ）に示すような解析結果がモニタ４１に表示されてもよい。

【0205】

また、測定開始から測定終了まで時系列で各共振器１１０の共振周波数を分析ユニット４０の記憶部に記憶しておき、分析時に、分析ユニット４０において、記憶部に記憶されている各タイミングの共振周波数と測定開始時の共振周波数との間の周波数シフトを算出してもよい。

【0206】

また、上記実施形態では、底部にアレイセンサ１０が設置された容器６０に試料２００を導入することにより、試料２００がアレイセンサ１０（共振器１１０）に適用されたが、試料２００をアレイセンサ１０に適用する方法は、これに限られない。たとえば、容器６０の収容された試料２００にアレイセンサ１０を漬けることにより、試料２００をアレイセンサ１０に適用してもよい。

【0207】

また、図７（ａ）～（ｅ）および図１４（ａ）～（ｅ）に示した封止方法は、共振器１１０の周波数シフトを検出する方式以外のセンサが用いられる場合も有効である。たとえば、半導体で作製された他の方式のセンサＩＣが用いられてもよい。他の方式のセンサが用いられる場合も、図７（ａ）～（ｅ）、図１４（ａ）～（ｅ）および図１７（ａ）～（ｄ）に示した封止方法を用いることにより、センサの近接領域に試料を封止でき、試料中の微生物の状況を正確に検査できる。

【0208】

さらに、微生物検査装置１の構成は、図１および図１６に示した構成に限定される物ではなく、アレイセンサ１０上に試料２００を封止溶剤３００で封止できる構成であれば、他の構成であってもよい。また、封止溶剤３００を用いる必要がない微生物を検査対象とする微生物検査装置１では、図１６の封止溶剤貯留部９１および酸素供給部９２が省略されてもよい。

【0209】

この他、本発明の実施形態は、種々の変更可能である。

【符号の説明】

【0210】

１ … 微生物検査装置
１０ … アレイセンサ
４０ … 分析ユニット（分析部）
４１ … 表示部
４３ … 分析部
６０ … 容器
６１ … 収容部
８０ … 導入部
１１０ … 共振器
１５０ … 発振器
２００ … 試料
３００ … 封止溶剤
２０１ … 微生物

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【手続補正書】

【提出日】2024-05-22

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

検体と培養液とを混合した試料を、ギガヘルツ帯で発振する共振器の近接領域に封止し、
前記共振器の共振周波数の変動を、前記検体に含まれる微生物の増殖度合いを示す情報として算出する、微生物検査方法。

【手続補正3】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0012】

この場合、封止溶剤による試料の封止は、前記近接領域を含む収容領域に前記試料を導入した後、前記封止溶剤を前記収容領域に添加することにより行われてもよく、あるいは、前記近接領域を含む収容領域に前記封止溶剤を導入した後、前記試料を前記収容領域に添加することにより行われてもよい。

【手続補正4】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００１５

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0015】

この場合、前記センサ素子は、ギガヘルツ帯で発振する発振器により構成され、前記発振器の発振周波数の変動を、前記検体に含まれる微生物の増殖度合いを示す情報として算出するよう調整され得る。これにより、発振器の発振周波数の変動により微生物の増殖度合いを正確に把握できる。

【手続補正5】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００２４

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0024】

また、上記ギガヘルツ帯は、３０ＧＨｚ以上３００ＧＨｚ以下であることがさらに好ましい。共振器の共振周波数を３０GＨｚ以上に設定することにより、試料中に存在するイ
オンの影響をほぼ無くすことができる。また、共振器の共振周波数を３００GＨｚ以下に
設定することにより、所定の共振周波数で共振器を正確に発振させ易くなる。

【手続補正6】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００４９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0049】

差動回路１２０は、２つのトランジスタ１２１がクロスカップルされて構成されている。差動回路１２０の構成は、これに限られるものではなく、他の構成が用いられてもよい。電流源１３０は、回路部１１からの制御信号に従って、共振器１１０および差動回路１２０からなる発振器１５０にイネーブル信号を供給する。これにより、共振器１１０および発振器１５０が、ギガヘルツ帯に含まれる上記所定の共振周波数で発振する。共振器１１０の共振周波数が変動すると、変動後の共振周波数で発振器１５０が発振して信号を出力する。

【手続補正7】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００９２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0092】

図８の検査方法を微生物の薬剤感受性検査に用いる場合、検査者は、ステップＳ１３において、検体および培養液とともに薬剤を混合して試料２００を調製し、調製した試料２００を容器６０に導入する。その他の工程は、上記と同様である。

【手続補正8】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００９８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0098】

この実験では、ＢＣＧと培養液（ＭＧＩＴ ＰＡＮＴＡ）とが混合されたＢＣＧ懸濁液２００μＬと、未使用の培養液（ＭＧＩＴ ＰＡＮＴＡ）４００μＬとを混合してコントロール試料を調製した。また、調製したコントロール試料１９６μＬに、２５ｍｇ／ｍＬの濃度のＳＭ（ストレプトマイシン）４μＬを混合して、薬剤感受性評価用のＳＭ試料を調製した。さらに、上記のように調製したコントロール試料１９９．８ｍＬに、５０ｍｇ／ｍＬの濃度のＲＦＰ（リファンピシン）０．２μＬを混合して、薬剤感受性評価用のＲＦＰ試料を調製した。

【手続補正9】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００９９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0099】

こうして調製した、コントロール試料２００μＬ、ＳＭ試料２００μＬおよびＲＦＰ試料２００μＬを、それぞれ、異なる容器６０に導入し、さらに、各容器６０に封止溶剤３００を添加して、試料ごとに、周波数シフトの測定を行った。ここでは、封止溶剤３００
として、酸素が溶解されたパーフルオロ化合物（ＰＦＣ）を用いた。ＰＦＣに純酸素を５Ｌ／ｍｉｎで１分間吹き込んでＰＦＣを酸素化し、その直後に、ＰＦＣを容器６０に添加して密封した。

【手続補正10】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１０９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0109】

＜実施例２＞
発明者らは、大腸菌のコントロール株であるＮＢＲＣ３３０１を用いて、上記検査方法による大腸菌の増殖および薬剤感受性の検証実験を行った。

【手続補正11】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１１０

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0110】

この実験では、濃度依存性薬剤であるストレプトマイシン（アミノグリコシド系）を使用した。ＮＢＲＣ３３０１のコントロール試料１９６μＬに、２５ｍｇ／ｍＬの濃度のＳＭ（ストレプトマイシン）４μＬを混合して、ＳＭの濃度が５００μｇ／ｍＬの薬剤感受性評価用の試料（ＳＭ＿５００μｇ／ｍＬ）を調製した。また、コントロール試料に対するＳＭの添加量を調整して、ＳＭの濃度が２５０μｇ／ｍＬの薬剤感受性評価用の試料（ＳＭ＿２５０μｇ／ｍＬ）と、ＳＭの濃度が１２５μｇ／ｍＬの薬剤感受性評価用の試料（ＳＭ＿１２５μｇ／ｍＬ）を調製した。さらに、死菌の周波数シフトを検証するために、コントロール試料２００μＬに９８℃、３０ｍｉｎの加熱処理を行った試料を調製した。また、同様に死菌の周波数シフトを検証するために、コントロール試料２００μＬにリン酸緩衝４％ホルムアルデヒド液を添加して１０ｍｉｎ室温処理した後、超純水で置換した試料（４％＿ＦＡ）を調製した。

【手続補正12】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１１６

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0116】

＜実施例３＞
発明者らは、表皮ブドウ球菌のコントロール株であるＮＢＲＣ１２９９３を用いて、上記検査方法による表皮ブドウ球菌の増殖および薬剤感受性の検証実験を行った。

【手続補正13】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１２９

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0129】

図１３（ｂ）に示すように、ＰＦＣに純酸素を吹き込むことにより、ＰＦＣ中の純酸素の濃度を高めることができ、ＰＦＣに純窒素を吹き込むことにより、ＰＦＣ中の純酸素の濃度を０付近に低下させることができた。また、ＰＦＣに純酸素を吹き込むと、ＰＦＣ中の酸素濃度が３０分程度維持され、その後、ＰＦＣ中の酸素濃度が次第に低下した。このことから、図８のステップＳ１４においてＰＦＣ（封止溶剤３００）を添加し、試料２００をＰＦＣで封止すると、ＰＦＣ中の酸素が試料に溶出して、試料に酸素を供給できることが確認できた。

【手続補正14】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１８２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【0182】

封止溶剤３００としてパーフルオロ化合物（ＰＦＣ）を用いる場合（実施例６）、上記実施例１と同様、酸素を封止溶剤３００に溶解させた。すなわち、ＰＦＣに純酸素を５Ｌ／ｍｉｎで１分間吹き込んでＰＦＣを酸素化し、その直後に、ＰＦＣを容器６０に添加して密封した。封止溶剤３００としてミネラルオイルを用いる場合（実施例５）、酸素を封止溶剤３００に溶解させなかった。

【手続補正15】

【補正対象書類名】図面

【補正対象項目名】図１０

【補正方法】変更

【補正の内容】

【図10】