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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024096353
(43)【公開日】2024-07-12
(54)【発明の名称】ヘキソースの酵素的製造
(51)【国際特許分類】
C12P 19/02 20060101AFI20240705BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20240705BHJP
【ＦＩ】
C12P19/02 ZNA
C12P19/02
C12N15/09 Z
【審査請求】有
【請求項の数】16
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024075301
(22)【出願日】2024-05-07
(62)【分割の表示】P 2021523430の分割
【原出願日】2019-10-29
(31)【優先権主張番号】62/752,061
(32)【優先日】2018-10-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】62/857,543
(32)【優先日】2019-06-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】518059587
【氏名又は名称】ボヌモーズ、インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ウィチェレキー、ダニエル、ジョセフ
(57)【要約】
【課題】改善された酵素的方法によって糖類からヘキソースを製造する方法の提供。
【解決手段】
改善された酵素的方法によって糖類からヘキソースを製造する方法が本明細書に開示される。改善された方法は、デンプンもしくはデンプン誘導体、セルロースもしくはセルロース誘導体、又はスクロースをグルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）中間体に変換するために以前に報告された酵素よりも高い活性を有する酵素を利用する。
【選択図】図２
【解決手段】
改善された酵素的方法によって糖類からヘキソースを製造する方法が本明細書に開示される。改善された方法は、デンプンもしくはデンプン誘導体、セルロースもしくはセルロース誘導体、又はスクロースをグルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）中間体に変換するために以前に報告された酵素よりも高い活性を有する酵素を利用する。
【選択図】図２
【特許請求の範囲】
【請求項1】
デンプン又はデンプン誘導体からヘキソースを酵素的に製造するための改善された方法であって、該改善は、
ａ）ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される、グルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）をグルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）に変換するステップであって、該ＰＧＭは、配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、上記ステップ、
ｂ）α－グルカンホスホリラーゼ（ａＧＰ）によって触媒される、デンプン誘導体をＧ１Ｐに変換するステップであって、該ａＧＰは、配列番号１０～１３のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、上記ステップ、及び
ｃ）４－α－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）によって触媒される、デンプン誘導体をトランスグリコシル化するステップであって、該４ＧＴは、配列番号１５～１７のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、上記ステップ、
の少なくとも１つを含む、上記改善された方法。
ａ）ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される、グルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）をグルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）に変換するステップであって、該ＰＧＭは、配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、上記ステップ、
ｂ）α－グルカンホスホリラーゼ（ａＧＰ）によって触媒される、デンプン誘導体をＧ１Ｐに変換するステップであって、該ａＧＰは、配列番号１０～１３のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、上記ステップ、及び
ｃ）４－α－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）によって触媒される、デンプン誘導体をトランスグリコシル化するステップであって、該４ＧＴは、配列番号１５～１７のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、上記ステップ、
の少なくとも１つを含む、上記改善された方法。
【請求項2】
セルロース又はセルロース誘導体からヘキソースを酵素的に製造するための改善された方法であって、該改善は、ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される、Ｇ１Ｐをグルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）に変換するステップを含み、該ＰＧＭは、配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、上記改善された方法。
【請求項3】
スクロースからヘキソースを酵素的に製造するための改善された方法であって、該改善は、
ａ）ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される、グルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）をグルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）に変換するステップであって、該ＰＧＭが、配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、上記ステップ、及び
ｂ）スクロースホスホリラーゼを用いてスクロースをグルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）に変換するステップであって、該スクロースホスホリラーゼは、配列番号１９～２５のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、上記ステップ、
の少なくとも１つを含む、上記改善された方法。
ａ）ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される、グルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）をグルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）に変換するステップであって、該ＰＧＭが、配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、上記ステップ、及び
ｂ）スクロースホスホリラーゼを用いてスクロースをグルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）に変換するステップであって、該スクロースホスホリラーゼは、配列番号１９～２５のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、上記ステップ、
の少なくとも１つを含む、上記改善された方法。
【請求項4】
ヘキソースが、アロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、アルトロース、タロース、ソルボース、グロース、イドース、アルロース、イノシトール及びタガトースからなる群から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の改善された方法。
【請求項5】
デンプン誘導体が、アミロース、アミロペクチン、可溶性デンプン、アミロデキストリン、マルトトリオース、マルトース及びマルトデキストリンからなる群から選択される、請求項１に記載の改善された方法。
【請求項6】
ヘキソースリン酸ホスファターゼを使用してヘキソースリン酸を脱リン酸化するステップをさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の改善された方法。
【請求項7】
方法のステップが、単一の反応容器内で行われる、請求項６に記載の改善された方法。
【請求項8】
方法のステップが、ＡＴＰを含まず（ＡＴＰ－ｆｒｅｅ）、ＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）を含まず（ＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）－ｆｒｅｅ）に、約０．１ｍＭ～約１５０ｍＭのリン酸濃度で行われ、リン酸塩は再利用され、及び／又はヘキソースリン酸を脱リン酸化するステップは、エネルギー的に好適な化学反応を伴う、請求項７に記載の改善された方法。
【請求項9】
方法ステップが、
約３７℃～約８５℃の範囲の温度、
約５．０～約８．０の範囲のｐＨ、又は
約０．５時間～約４８時間、もしくは連続反応として、
のうちの少なくとも１つの方法条件下で行われる、
請求項１～８のいずれか一項に記載の改善された方法。
約３７℃～約８５℃の範囲の温度、
約５．０～約８．０の範囲のｐＨ、又は
約０．５時間～約４８時間、もしくは連続反応として、
のうちの少なくとも１つの方法条件下で行われる、
請求項１～８のいずれか一項に記載の改善された方法。
【請求項10】
ヘキソースをその糖アルコールに還元するステップをさらに含む、請求項４に記載の改善された方法。
【請求項11】
ＰＧＭは、テルモコックス・コダカラエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｏｅｎｓｉｓ）由来のＰＧＭ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ６８ＢＪ６）の活性と比較して少なくとも１０％高い活性を有する、請求項４に記載の改善された方法。
【請求項12】
ａＧＰは、テルモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）由来のａＧＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｇ４ＦＥＨ８）の活性と比較して少なくとも１０％高い活性を有する、請求項１に記載の改善された方法。
【請求項13】
４ＧＴは、テルモコックス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来の４ＧＴ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｏ３２４６２）の活性と比較して少なくとも１０％高い活性を有する、請求項１に記載の改善された方法。
【請求項14】
ＳＰは、テルモアナエロバクテリウム・テルモサッカロリティクム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来のＳＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｄ９ＴＴ０９）と比較して少なくとも１０％高い活性を有する、請求項３に記載の改善された方法。
【請求項15】
ＳＰは、テルモアナエロバクテリウム・テルモサッカロリティクム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来のＳＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｄ９ＴＴ０９）と比較して少なくとも１０％高い達成可能な収率を有する、請求項３に記載の改善された方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願との相互参照
本出願は、２０１８年１０月２９日に出願された米国特許出願第６２／７５２，０６１号及び２０１９年６月５日に出願された米国特許出願第６２／８５７，５４３号の優先権を主張し、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０１８年１０月２９日に出願された米国特許出願第６２／７５２，０６１号及び２０１９年６月５日に出願された米国特許出願第６２／８５７，５４３号の優先権を主張し、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は、ヘキソース単糖類の調製方法に関する。より具体的には、本発明は、以前に報告されたものよりも高い活性を有する酵素を使用して、中間体、グルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）を調製する改善された方法を提供する。
【背景技術】
【0003】
ヘキソースは、６個の炭素原子を有する単糖類である。ヘキソースは官能基によって分類することができ、アルドヘキソースは１位にアルデヒドを有し、ケトヘキソースは２位にそのケトンを有する。アルドヘキソース（又はアルドース）には、アロース、アルトロース、グルコース、グロース、ガラクトース、イドース、タロース及びマンノースが含まれる。ケトヘキソース（又はケトース）には、プシコース（アルロース）、フルクトース、タガトース、及びソルボースが含まれる。イノシトールは、アルデヒド基やケトース基を有さないヘキソースであり、炭素環式糖として特徴付けられる。
【0004】
参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１８／１６９９５７号は、酵素的変換によって糖類からヘキソースを調製する方法を記載している。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１７／０５９２７８号及び国際公開第２０１８／００４３１０号は、酵素的変換によって糖類からタガトースを調製する方法を記載している。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１８／１１２１３９号は、酵素的変換によって糖類からアルロースを調製する方法を記載している。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる韓国特許第２００４００９８７５７号明細書は、酵素的変換によって糖類からフルクトース６－リン酸を調製する方法を記載している。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる中国特許第１０６１４８４２５号は、酵素的変換によって糖類からイノシトールを調製する方法を記載している。これらの方法のそれぞれにおいて、グルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）は酵素的経路の中間体である。
【0005】
高収率での酵素的なヘキソース製造の開発にもかかわらず、例えば、より少量の酵素でより高い収率を得ることができる、さらに改善されたヘキソース製造方法を提供することが依然として必要とされている。ヘキソース製造のコスト低減に対する工業的及び商業的な強い関心があり、この低減は、酵素の使用量の低減、より高い活性を有する酵素、及び糖類をＧ６Ｐ中間体に変換するのにより効果的な酵素の組み合わせの使用を含む。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0006】
本明細書に記載の発明は、一般に、様々な糖類出発材料からの酵素的変換によってヘキソースを調製するための改善された方法（ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ）に関する。糖類は、デンプンもしくはデンプン誘導体、セルロースもしくはセルロース誘導体、又はスクロースから選択され得る。本発明の改善された方法では、示されるように、方法ステップに使用される酵素は、ヘキソースの調製のために以前に開示された酵素よりも改善された活性を有する。
【0007】
デンプン又はデンプン誘導体からヘキソースを酵素的に製造するための本発明のいくつかの改善された方法であって、改善は、ａ）ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される、グルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）をグルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）に変換するステップであり、ＰＧＭは、配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ステップ、ｂ）アルファ－グルカンホスホリラーゼ（αＧＰ）によって触媒される、デンプン誘導体をＧ１Ｐに変換するステップであり、αＧＰは、配列番号１０～１３のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ステップ、及び４－α－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）によって触媒される、デンプン誘導体をトランスグリコシル化するステップであり、４ＧＴは、配列番号１５～１７のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ステップ、の少なくとも１つを含む。
【0008】
セルロース又はセルロース誘導体からヘキソースを酵素的に製造するための本発明のいくつかの改善された方法であって、改善は、ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される、Ｇ１Ｐをグルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）に変換するステップを含み、ＰＧＭは、配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0009】
スクロースからヘキソースを酵素的に製造するための本発明のいくつかの改善された方法であって、改善は、ａ）ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される、グルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）をグルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）に変換するステップであり、ＰＧＭは、配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ステップ、及びｂ）スクロースホスホリラーゼを使用してスクロースをグルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）に変換するステップであり、スクロースホスホリラーゼは、配列番号１９～２５のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ステップ、の少なくとも１つを含む。
【0010】
本発明のいくつかの改善された方法では、ヘキソースは、アロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、アルトロース、タロース、ソルボース、グロース、イドース、アルロース、イノシトール及びタガトースから選択される。本発明のいくつかの改善された方法は、ヘキソースリン酸ホスファターゼを使用してヘキソースリン酸を脱リン酸化するステップをさらに含む。
【0011】
本発明のいくつかの改善された方法では、方法ステップは単一の反応容器内で行われる。本発明の他の改善された方法では、方法ステップは２つ以上の反応容器内で行われる。本発明のいくつかの改善された方法では、方法ステップは、ＡＴＰなし（ＡＴＰ－ｆｒｅｅ）、ＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）なし（ＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）－ｆｒｅｅ）で、約０．１ｍＭ～約１５０ｍＭのリン酸濃度で行われ、リン酸塩は再利用され、及び／又はヘキソースリン酸を脱リン酸化するステップは、エネルギー的に好適な化学反応を伴う。本発明のいくつかの改善された方法では、方法ステップは、約３７℃～約８５℃の範囲の温度、約５．０～約８．０の範囲のｐＨ、又は約０．５時間～約４８時間のうちの少なくとも１つの方法条件下で行われる。本発明のいくつかの改善された方法では、方法ステップは連続反応として行われる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】スクロースをＧ６Ｐに変換する酵素的経路を示す概略図である。以下の略語が使用される：ＳＰ、スクロースリン酸、及びＰＧＭ、ホスホグルコムターゼ。本発明の改善された方法は、以下の改善の１つ又は複数を含む：ＳＰが、配列番号１９～２５のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む；及びＰＧＭが、配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0013】
【図2】デンプン誘導体、マルトデキストリンをＧ６Ｐに変換する酵素的経路を示す概略図である。以下の略語が使用される：ＩＡ、イソアミラーゼ；ＰＡ、プルラナーゼ；αＧＰ、α－グルカンホスホリラーゼ又はデンプンホスホリラーゼ；４ＧＴ、４－グルカントランスフェラーゼ；及びＰＧＭ、ホスホグルコムターゼ。本発明の改善された方法は、以下の改善の１つ又は複数を含む：ＰＧＭが、配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む；αＧＰが、配列番号１０～１３のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む；及び４ＧＴが、配列番号１５～１７のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0014】
【図3】セルロースをＧ６Ｐに変換する酵素的経路を示す概略図である。以下の略語が使用される：ＣＤＰ、セロデキストリンホスホリラーゼ、及びＰＧＭ、ホスホグルコムターゼ。本発明の改善された方法では、ＰＧＭは、配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0015】
【0016】
【0017】
【0018】
【0019】
【0020】
【0021】
【0022】
【0023】
【0024】
【0025】
【0026】
【0027】
【図16】グルコース１－リン酸を別のヘキソースに変換するための形成ギブスエネルギーに基づく中間体間の反応ギブスエネルギーを示す図である。
【0028】
【図17】ＨＰＬＣクロマトグラムによるマルトデキストリンのＧ６Ｐへの変換を示す図である。（破線）０時間クロマトグラム、（点線）先に開示されたαＧＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｇ４ＦＥＨ８）及びＰＧＭ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ６８ＢＪ６）による３０分間の方法、（実線）より高い活性のαＧＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｄ１Ｂ９２６）及びより高い活性のＰＧＭ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ１５０ＬＬＺ１）を有する３０分間の「改善された」方法。（１）ボイド及びマルトデキストリン、（２）Ｇ１Ｐ及びＧ６Ｐ、（３）マルトトリオース、ならびに（４）マルトース。
【0029】
【図18】スクロースホスホリラーゼ活性のクロマトグラムを示す図である。一番上のクロマトグラムは、より高い活性のＳＰ、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｆ６ＢＪＳ０と比較した、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｄ９ＴＴ０９（基準ＳＰ）との反応を示す。０時間の反応（スクロースからフルクトース）を破線で示し、同量のＳＰ及び他の酵素を使用した２時間の反応を基準（実線）及びより高い活性のＳＰ（点線）の両方について示す。２時間で、より高い活性のＳＰは、基準ＳＰとしてのフルクトース量の約１５０％を生成する。下のクロマトグラムは、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｄ９ＴＴ０９（基準ＳＰ）をより高い活性のＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｆ６ＢＪＳ０と比較する。０時間の反応（スクロースからフルクトース）を破線で示し、基準ＳＰ（実線）及びより高い活性のＳＰ（点線）の両方について、同量のＳＰ及び他の酵素を使用した６時間の反応を示す。６時間（両方の反応の最大収率）で、より高い活性のＳＰは、基準ＳＰとしてのフルクトース量の約１３０％を生成する。
【0030】
【図19】さらに高い活性のＰＧＭと比較した、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ１５０ＬＬＺ１との反応のクロマトグラムを示す図である。クロマトグラムは、限界ＰＧＭ、過剰なホスホグルコイソメラーゼ及び過剰なフルクトース６－リン酸ホスファターゼとのインキュベーション後のグルコース１－リン酸から作られたフルクトースのレベルを示す。他のすべてのＰＧＭを等量で使用すると、フルクトース生成が改善され、したがって、酵素的方法の制限酵素であるためにＰＧＭ活性が増強されることが明らかに分かる。図中、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ０Ｐ６ＹＫＹ９＝実線、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｅ８Ｎ４Ｙ６＝破線、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｒ７ＲＲ０４＝点線、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ０２３ＤＩ９５＝丸の線、ＵｎｉＰａｒｃ ＩＤ ＵＰＩ０００１Ｄ１７ＡＥ３＝三角形の線、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ１５０ＬＬＺ１＝四角形の線である。はるかに低い（表１参照）基準ＰＧＭ Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ６８ＢＪ６の活性は示されていない。
【発明を実施するための形態】
【0031】
本明細書に記載の発明は、生成物分離コスト及びヘキソース製造コストを大幅に低減しながら、高い生成物収率でヘキソースを合成するための酵素的経路又は方法を提供する。本明細書に記載の酵素的方法は、一般に、酵素的変換によって糖類からヘキソース単糖類を調製するための改善された方法に関する。無細胞酵素カクテルを使用して糖類をヘキソースに変換するための人工（非天然）ＡＴＰを含まない酵素的経路が提供される。細胞ベースの製造方法とは対照的に、本発明の酵素的方法は、ヘキソースの無細胞調製を含み、細胞内外への基質／生成物の輸送を遅らせることが多い細胞膜の除去に起因して比較的高い反応速度を有する。方法はまた、栄養豊富な発酵培地／細胞代謝産物を含まない最終生成物を有する。糖類は、デンプンもしくはデンプン誘導体、セルロースもしくはセルロース誘導体、又はスクロースから選択され得る。本発明の改善された方法では、示されるように、方法ステップに使用される酵素は、ヘキソースの調製のために以前に開示された酵素よりも改善された活性を有する。
一実施形態では、本発明は、先に開示されたαＧＰ、ＰＧＭ及び４ＧＴの代わりに、より高い活性を有するαＧＰ、ＰＧＭ及び４ＧＴの少なくとも１つを使用して、デンプン及びその誘導体をヘキソースに変換するための改善された方法に関する。テルモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）由来のアルファ－グルカンホスホリラーゼ（αＧＰ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｇ４ＦＥＨ８）、テルモコックス・コダカラエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）由来のホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ６８ＢＪ６）、及びテルモコックス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来の４－α－グルカノールトランスフェラーゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｏ３２４６２）を開示している国際公開第２０１８／１６９９５７号を参照のこと。デンプン又はデンプン誘導体からヘキソースを酵素的に製造するための本発明のいくつかの改善された方法であって、改善は、ａ）ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される、グルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）をグルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）に変換するステップであり、ＰＧＭは、配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ステップ、ｂ）アルファ－グルカンホスホリラーゼ（αＧＰ）によって触媒される、デンプン誘導体をＧ１Ｐに変換するステップであり、αＧＰは、配列番号１０～１３のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ステップ、及び４－α－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）によって触媒される、デンプン誘導体をトランスグリコシル化するステップであり、４ＧＴは、配列番号１５～１７のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ステップ、の少なくとも１つを含む。本発明の改善された方法において、方法は、ａ）ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される、グルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）をグルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）に変換するステップであり、ＰＧＭが、配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ステップと、ｂ）アルファ－グルカンホスホリラーゼ（αＧＰ）によって触媒される、デンプン誘導体をＧ１Ｐに変換するステップであり、αＧＰが、配列番号１０～１３のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ステップと、４－α－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）によって触媒される、デンプン誘導体をトランスグリコシル化するステップであり、４ＧＴが、配列番号１５～１７のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ステップと、を含む。
一実施形態では、本発明は、先に開示されたαＧＰ、ＰＧＭ及び４ＧＴの代わりに、より高い活性を有するαＧＰ、ＰＧＭ及び４ＧＴの少なくとも１つを使用して、デンプン及びその誘導体をヘキソースに変換するための改善された方法に関する。テルモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）由来のアルファ－グルカンホスホリラーゼ（αＧＰ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｇ４ＦＥＨ８）、テルモコックス・コダカラエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）由来のホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ６８ＢＪ６）、及びテルモコックス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来の４－α－グルカノールトランスフェラーゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｏ３２４６２）を開示している国際公開第２０１８／１６９９５７号を参照のこと。デンプン又はデンプン誘導体からヘキソースを酵素的に製造するための本発明のいくつかの改善された方法であって、改善は、ａ）ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される、グルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）をグルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）に変換するステップであり、ＰＧＭは、配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ステップ、ｂ）アルファ－グルカンホスホリラーゼ（αＧＰ）によって触媒される、デンプン誘導体をＧ１Ｐに変換するステップであり、αＧＰは、配列番号１０～１３のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ステップ、及び４－α－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）によって触媒される、デンプン誘導体をトランスグリコシル化するステップであり、４ＧＴは、配列番号１５～１７のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ステップ、の少なくとも１つを含む。本発明の改善された方法において、方法は、ａ）ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される、グルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）をグルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）に変換するステップであり、ＰＧＭが、配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ステップと、ｂ）アルファ－グルカンホスホリラーゼ（αＧＰ）によって触媒される、デンプン誘導体をＧ１Ｐに変換するステップであり、αＧＰが、配列番号１０～１３のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ステップと、４－α－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）によって触媒される、デンプン誘導体をトランスグリコシル化するステップであり、４ＧＴが、配列番号１５～１７のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ステップと、を含む。
【0032】
別の実施形態では、本発明は、テルモコックス・コダカラエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）由来のＰＧＭ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ６８ＢＪ６）の代わりに、より高い活性を有するＰＧＭを使用してセルロース及びその誘導体をヘキソースに変換するための改善された方法に関する。セルロース又はセルロース誘導体からヘキソースを酵素的に製造するための本発明のいくつかの改善された方法において、改善は、ＰＧＭによって触媒される、Ｇ１Ｐをグルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）に変換するステップを含み、ＰＧＭは、配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0033】
さらに別の実施形態では、本発明は、テルモアナエロバクテリウム・テルモサッカロリティクム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来の先に開示されたＳＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｄ９ＴＴ０９）の代わりにより高い活性を有するＳＰ、及びテルモコックス・コダカラエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）由来のＰＧＭ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ６８ＢＪ６）の代わりにより高い活性を有するＰＧＭのうちの少なくとも１つを使用してスクロースをヘキソースに変換するための改善された方法に関する。スクロースからヘキソースを酵素的に製造するための本発明のいくつかの改善された方法であって、改善は、ａ）ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される、グルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）をグルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）に変換するステップであり、ＰＧＭは、配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ステップ、及びｂ）スクロースホスホリラーゼを使用してスクロースをグルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）に変換するステップであり、スクロースホスホリラーゼは、配列番号１９～２５のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ステップ、の少なくとも１つを含む。本発明の改善された方法において、方法は、ａ）ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される、グルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）をグルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）に変換するステップであり、ＰＧＭが、配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むステップと、ｂ）スクロースホスホリラーゼを使用してスクロースをグルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）に変換するステップであり、スクロースホスホリラーゼが、配列番号１９～２５のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むステップと、を含む。
【0034】
本発明のいくつかの改善された方法では、ヘキソースは、アロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、アルトロース、タロース、ソルボース、グロース、イドース、アルロース、イノシトール及びタガトースから選択される。本発明のいくつかの改善された方法は、ヘキソースリン酸ホスファターゼを使用してヘキソースリン酸を脱リン酸化するステップをさらに含む。
【0035】
デンプンもしくはデンプン誘導体、セルロースもしくはセルロース誘導体、又はスクロースからヘキソースを酵素的に製造するための本発明によるいくつかの改善された方法は、ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される、グルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）をグルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）に変換するステップを含み、ＰＧＭは、配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、ＰＧＭは、配列番号２～８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。より好ましくは、ＰＧＭは配列番号８のアミノ酸配列を含む。
【0036】
ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）（ＥＣ ５．４．２．２）は、グルコース１－リン酸とグルコース６－リン酸の相互変換を触媒する。糖からヘキソースを製造するための本発明の改善された方法では、反応はＧ６Ｐの方向に進行し、次にさらに下流で処理され、方法の最終的な酵素的ステップは、ヘキソースリン酸を脱リン酸化するエネルギー的に好適な不可逆的なステップである。
【0037】
本発明の改善された方法では、ＰＧＭは、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する、テルモコックス・コダカラエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）由来の前述のＰＧＭ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ６８ＢＪ６）と比較してより高い活性を有する。好ましくは、本発明の方法で使用されるＰＧＭは、テルモコックス・コダカラエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）由来のＰＧＭ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ６８ＢＪ６）の活性よりも少なくとも１０％、少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも５００％、少なくとも１０００％、少なくとも２０００％、少なくとも２５００％、少なくとも３０００％、少なくとも３５００％、少なくとも４０００％、少なくとも４５００％、少なくとも５０００％、又は少なくとも５５００％改善された酵素活性を有する。
【0038】
例えば、例１に示すように、本発明の方法で使用するためのＰＧＭは、テルモコックス・コダカラエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）由来のＰＧＭ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ６８ＢＪ６）よりも改善された活性を有し、ゲオバチルス・ステアロテルモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＮＵＢ３６２１由来のＰＧＭ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ０２３ＣＲＳ６）は、約７００％改善された酵素活性を有し、カルディバチルス・デビリス（Ｃａｌｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｂｉｌｉｓ）由来のＰＧＭ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ１５０ＬＬＺ１）は、約１９００％改善された酵素活性を有し、ゲオバチルス・テルモグルコシダシウス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ）由来のＰＧＭ（ＵｎｉＰａｒｃ ＩＤ ＵＰＩ０００１Ｄ１７ＡＥ３）は、約２１００％改善された酵素活性を有し、パラゲオバチルス・カルドキシロシリティクス（Ｐａｒａｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｘｙｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ）ＮＢＲＣ１０７７６２由来のＰＧＭ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ０２３ＤＩ９５）は、約１９８０％改善された酵素活性を有し、テルモブラキウム・セレレ（Ｔｈｅｒｍｏｂｒａｃｈｉｕｍ ｃｅｌｅｒｅ）ＤＳＭ８６８２由来のＰＧＭ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｒ７ＲＲ０４）は、約５１００％改善された酵素活性を有し、アナエロリネア・テルモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）由来のＰＧＭ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｅ８Ｎ４Ｙ６）は、約５８００％改善された酵素活性を有し、テルマナエロスリクス・ダキセンシス（Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｔｈｒｉｘ ｄａｘｅｎｓｉｓ）由来のＰＧＭ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ０Ｐ６ＹＫＹ９）は、約６５００％改善された酵素活性を有する。以下の例は、酵素的方法の一部としてＰＧＭの活性を決定するためのプロトコルを当業者に提供し、このプロトコルは、例えば、酵素をその基質と共にインキュベートし、次いで、ＨＰＬＣを介して反応物及び生成物又はその下流の生成物の量を測定することを含む。任意の２つの酵素の相対活性の測定は、緩衝液、ｐＨ、温度などの同一の反応条件下で行われる。
【0039】
本発明の改善された方法で使用するためのＰＧＭの例には、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するゲオバチルス・ステアロテルモフィルス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＮＵＢ３６２１由来のＰＧＭ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ０２３ＣＲＳ６）、配列番号３に記載のアミノ酸配列を有するカルディバチルス・デビリス（Ｃａｌｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｂｉｌｉｓ）由来のＰＧＭ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ１５０ＬＬＺ１）、配列番号４に記載のアミノ酸配列を有するゲオバチルス・テルモグルコシダシウス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｉｕｓ）由来のＰＧＭ（ＵｎｉＰａｒｃ ＩＤ ＵＰＩ０００１Ｄ１７ＡＥ３）、配列番号５に記載のアミノ酸配列を有するパラゲオバチルス・カルドキシロシリティクス（Ｐａｒａｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｘｙｌｏｓｉｌｙｔｉｃｕｓ）ＮＢＲＣ１０７７６２由来のＰＧＭ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ０２３ＤＩ９５）、配列番号６に記載のアミノ酸配列を有するテルモブラキウム・セレレ（Ｔｈｅｒｍｏｂｒａｃｈｉｕｍ ｃｅｌｅｒｅ）ＤＳＭ８６８２由来のＰＧＭ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｒ７ＲＲ０４）、配列番号７に記載のアミノ酸配列を有するアナエロリネア・テルモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）由来のＰＧＭ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｅ８Ｎ４Ｙ６）、配列番号８に記載のアミノ酸配列を有するテルマナエロスリクス・ダキセンシス（Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｔｈｒｉｘ ｄａｘｅｎｓｉｓ）由来のＰＧＭ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ０Ｐ６ＹＫＹ９）、及び配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＰＧＭのタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。
【0040】
本発明の改善された方法で使用するためのＰＧＭは、一般に、α－Ｄ－ホスホヘキソムターゼ・スーパーファミリー（ＩＰＲ００５８４１）の一部であり、酵素の活性部位を形成する４つのドメインを含む。最初の３つのドメインはαβコアからなり、第４のドメインはＴＡＴＡボックス結合タンパク質様フォールド（Ｍｅｈｒａ－Ｃｈａｕｄｈａｒｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ７９（４）：１２１５－２９，２０１１）を含む。第１のドメインは、活性部位へのホスホリル転移のための保存されたセリン残基に寄与する（配列番号３のＳｅｒ１４７）。第２のドメインは、活性部位に対する保存されたＭｇ２＋結合残基に寄与する（配列番号３のＡｓｐ３０６、Ａｓｐ３０８及びＡｓｐ３１０）。第３のドメインは、活性部位に対する基質特異性について保存された残基に寄与する（配列番号３のＧｌｕ４０６及びＳｅｒ４０８）。第４のドメインは、活性部位へのリン酸結合のための保存された残基に寄与する（配列番号３のＡｒｇ５３８）。さらに、正に荷電した残基（Ｌｙｓ／Ａｒｇ）は、配列番号３のＬｙｓ４２０での触媒作用において役割を果たして保存されている。保存された残基はＬｅｅら、ＦＥＢＳ Ｊ ２８０（１１）：２６２２－３２，２０１３及びＬｅｖｉｎら「タンパク質工学、設計及び選択（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」１２（９）：７３７－７４６，１９９９から引用した。
【0041】
本発明によるデンプン又はデンプン誘導体からヘキソースを製造するための本発明のいくつかの改善された方法は、αＧＰによって触媒される、デンプン誘導体をＧ１Ｐに変換するステップを含み、αＧＰは、配列番号１０～１３のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、αＧＰは、配列番号１０～１３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。より好ましくは、αＧＰは、配列番号１１のアミノ酸配列を含む。
【0042】
α－グルカンホスホリラーゼ又はデンプンホスホリラーゼ（αＧＰ）（ＥＣ ２．４．１．１）は、マルトオリゴ糖をリン酸分解的に切断してＧ１Ｐを生じる。デンプンホスホリラーゼはまた、リン酸の放出を伴う逆反応、すなわち、Ｇ１Ｐからα－１，４－Ｄ－グルカン鎖の非還元末端へのグルコシル単位の転移を触媒する。一般に、オリゴ糖鎖の重合度は４以上である。デンプン誘導体からヘキソースを製造するための本発明の改善された方法では、反応はＧ１Ｐの方向に進行し、次にさらに下流で処理され、方法の最終的な酵素的ステップは、ヘキソースリン酸を脱リン酸化するエネルギー的に好適な不可逆的なステップである。
【0043】
本発明の改善された方法では、αＧＰは、配列番号９に記載のアミノ酸配列を有する、テルモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）由来の前述のアルファ－グルカンホスホリラーゼ（αＧＰ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｇ４ＦＥＨ８）と比較してより高い活性を有する。好ましくは、本発明の方法で使用されるαＧＰは、テルモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）由来のαＧＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｇ４ＦＥＨ８）の活性よりも少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、又は少なくとも２００％改善された酵素活性を有する。例えば、例２に示すように、テルムス・テルモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のαＧＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ５ＳＪ４２）は、テルモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）由来のαＧＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｇ４ＦＥＨ８）よりも約７１％改善された酵素活性を有し、テルムス種（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐ）ＣＣＢ＿ＵＳ３＿ＵＦ１由来のαＧＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｇ８ＮＣＣ０）は、テルモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）由来のαＧＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｇ４ＦＥＨ８）よりも約１８６％改善された酵素活性を有し、テルモアナエロバクター・シューデタノリクス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｐｓｅｕｄｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ）株ＡＴＣＣ ３３２２３由来のαＧＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｂ０Ｋ７Ｖ８）は、テルモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）由来のαＧＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｇ４ＦＥＨ８）よりも約１２８％改善された酵素活性を有し、テルマナエロビブリオ・アキダミノボランス（Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ ａｃｉｄａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ）株ＡＴＣＣ４９９７８由来のαＧＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｄ１Ｂ９２６）は、テルモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）由来のαＧＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｇ４ＦＥＨ８）よりも約１１１％改善された酵素活性を有する。以下の例は、酵素的方法の一部としてαＧＰの活性を決定するためのプロトコルを当業者に提供し、このプロトコルは、例えば、酵素をその基質と共にインキュベートし、次いで、分光光度測定及びＨＰＬＣを介して反応物及び生成物又はその後の下流生成物の量を測定することを含む。任意の２つの酵素の相対活性の測定は、緩衝液、ｐＨ、温度などの同一の反応条件下で行われる。
【0044】
本発明の改善された方法で使用するためのαＧＰの例には、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を有するテルムス・テルモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のαＧＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ５ＳＪ４２）、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を有するテルムス種（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐ）ＣＣＢ＿ＵＳ３＿ＵＦ１由来のαＧＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｇ８ＮＣＣ０）、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有するテルモアナエロバクター・シューデタノリクス（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｐｓｅｕｄｅｔｈａｎｏｌｉｃｕｓ）株ＡＴＣＣ３３２２３由来のαＧＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｂ０Ｋ７Ｖ８）、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有するテルマナエロビブリオ・アキダミノボランス（Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｖｉｂｒｉｏ ａｃｉｄａｍｉｎｏｖｏｒａｎｓ）株ＡＴＣＣ４９９７８由来のαＧＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｄ１Ｂ９２６）、及び配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２又は配列番号１３と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するαＧＰのタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。
【0045】
本発明の改善された方法で使用するためのα－グルカンホスホリラーゼは、一般に、グリコシルトランスフェラーゼ、ファミリー３５（ＩＰＲ０００８１１）の一部であり、「αグルカンホスホリラーゼ」ドメイン（ＩＰＲ０１１８３４）を含む。いくつかのαＧＰは、ＰＬＰ結合、ＰＬＰ安定化、及びリン酸結合について保存された残基を有する。例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｄ１Ｂ９２６（配列番号１３）では、ＰＬＰ結合のためにＬｙｓ５８５が保存され、Ａｒｇ４８４及びＴｈｒ５８１はＰＬＰ安定化のために保存され、Ｇｌｙ１１０、Ａｒｇ４８５及びＬｙｓ４９０はリン酸結合のために保存されている（保存された残基はＷａｔｓｏｎら、ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｖｏｌ．１６ Ｎｏ．１ ｐｐ．１－１４、１９９７から引用した）。
【0046】
デンプン誘導体からヘキソースを製造するための本発明によるいくつかの改善された方法では、改善は、４－α－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）を使用してデンプン誘導体をトランスグリコシル化するステップを含み、４ＧＴは、配列番号１５～１７のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、４ＧＴは、配列番号１５～１７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。より好ましくは、αＧＰは、配列番号１７のアミノ酸配列を含む。
【0047】
４－α－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）（ＥＣ ２．４．１．２５）は、マルトオリゴ糖のトランスグリコシル化を触媒し、様々な長さのマルトオリゴ糖及びグルコースを生じる。マルトース及びグルコースを転移反応におけるアクセプターとして使用することができる。
【0048】
ヘキソースを製造するための本発明のいくつかの方法は、ヘキソースリン酸をヘキソースに変換するエネルギー的に好適な脱リン酸化ステップを含む。このような方法では、特に単一の反応容器で実施される場合、リン酸塩は再利用され、方法の上流で、例えばαＧＰがアミロデキストリンをＧ１Ｐに変換することによって触媒される反応で使用される。しかしながら、αＧＰは、重合度（ＤＰ）が４未満のアミロデキストリンに対して高い活性で反応しない。本発明によるそのような方法では、反応に４ＧＴを加えて、全体的な収率を改善する。４ＧＴは、４より小さいＤＰ、例えばマルトトリオースが、αＧＰによって分解され得る長鎖のアミロデキストリンに変換されるように、アミロデキストリンをトランスグリコシル化する。４ＧＴがなければ、マルトトリオースは、収率を高めるために方法に再び関与することができる長鎖のアミロデキストリンに再利用されることはなく、方法の最終生成物として蓄積される。４ＧＴは、アミロデキストリンがαＧＰによって十分に分解されて有意な量のマルトトリオースを生成する場合に、収率を増加させる。これは、エネルギー的に好適な脱リン酸化ステップ及びリン酸塩の再利用に起因して起こる。
【0049】
本発明の改善された方法では、４ＧＴは、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する、テルモコックス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来の前述の４－α－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｏ３２４６２）と比較して、より高い活性を有する。好ましくは、本発明の方法で使用される４ＧＴは、テルモコックス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来の４ＧＴ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｏ３２４６２）の活性よりも少なくとも１０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、又は少なくとも２００％改善された酵素活性を有する。例えば、例３に示すように、オセアニテルムス・プロフンダス（Ｏｃｅａｎｉｔｈｅｒｍｕｓ ｐｒｏｆｕｎｄｕｓ）ＤＳＭ１４９７７の４ＧＴ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｅ４Ｕ８Ｓ９）は、テルモコックス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）の４ＧＴ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｏ３２４６２）よりも約１２８％改善された酵素活性を有し、メイオテルムス・シルバヌス（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ ｓｉｌｖａｎｕｓ）株ＡＴＣＣ７００５４２由来の４ＧＴ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｄ７ＢＦ０７）は、テルモコックス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来の４ＧＴ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｏ３２４６２）よりも約２１２％改善された酵素活性を有し、アナエロリネア・テルモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）株ＤＳＭ１４５２３由来の４ＧＴ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｅ８ＭＸＰ８）は、テルモコックス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来の４ＧＴ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｏ３２４６２）よりも約１８４％改善された酵素活性を有する。以下の例は、酵素的方法の一部として４ＧＴの活性を決定するためのプロトコルを当業者に提供し、このプロトコルは、例えば、酵素をその基質と共にインキュベートし、次いで、分光光度測定によってグルコースの量を測定することを含む。任意の２つの酵素の相対活性の測定は、緩衝液、ｐＨ、温度などの同一の反応条件下で行われる。
【0050】
本発明の改善された方法で使用するための４ＧＴの例には、配列番号１５に記載のアミノ酸配列を有するオセアニテルムス・プロフンダス（Ｏｃｅａｎｉｔｈｅｒｍｕｓ ｐｒｏｆｕｎｄｕｓ）ＤＳＭ１４９７７由来の４ＧＴ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｅ４Ｕ８Ｓ９）、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を有するメイオテルムス・シルバヌス（Ｍｅｉｏｔｈｅｒｍｕｓ ｓｉｌｖａｎｕｓ）株ＡＴＣＣ７００５４２由来の４ＧＴ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｄ７ＢＦ０７）、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を有するアナエロリネア・テルモフィラ（Ａｎａｅｒｏｌｉｎｅａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）株ＤＳＭ１４５２３由来の４ＧＴ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｅ８ＭＸＰ８）、及び配列番号１５、配列番号１６又は配列番号１７と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する４ＧＴのタンパク質が含まれるがこれらに限定されない。
【0051】
本発明の改善された方法で使用するための４－グルカントランスフェラーゼは、遺伝的には、グリコシドトランスフェラーゼ・スーパーファミリー（ＩＰＲ０１７８５３）、より具体的にはグリコシドヒドロラーゼのファミリー７７（ＩＰＲ００３３８５）の一部である。一般に、４－グルカントランスフェラーゼは、活性部位がバレルβ鎖のｃ末端にある（β／α）８バレル触媒ドメインを含む。活性部位は、保存された触媒トライアドを含む。配列番号１７において、これらの保存された残基は、Ａｓｐ２９８（求核剤）、Ｇｌｕ３４５（プロトン供与体）及びＡｓｐ３９８（遷移状態安定剤）に対応する。本発明の改善された方法で使用するための４ＧＴはまた、基質結合に関連する保存された残基を含有する。例えば、配列番号１７において、これらの保存された残基は、Ｔｙｒ６０、Ａｓｐ２１８、Ａｒｇ２９６及びＨｉｓ３９７に対応する。Ｐｒｚｙｌａｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２９６（３）：８７３－８８６，２０００を参照されたい。
【0052】
スクロースからヘキソースを酵素的に製造するためのいくつかの改善された方法において、改善は、スクロースホスホリラーゼによって触媒される、スクロースをグルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）に変換するステップを含み、スクロースホスホリラーゼは、配列番号１９～２５のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、ＳＰは、配列番号１９～２５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。より好ましくは、ＳＰは配列番号２１のアミノ酸配列を含む。
【0053】
スクロースホスホリラーゼ（ＥＣ：２．４．１．７）は、スクロース及び無機リン酸のフルクトース及びＧ１Ｐへの変換を触媒する。スクロースからヘキソースを製造するための本発明の改善された方法では、反応はＧ１Ｐの方向に進行し、次にさらに下流で処理され、方法の最終的な酵素的ステップは、ヘキソースリン酸を脱リン酸化するエネルギー的に好適な不可逆的なステップである。
【0054】
本発明の改善された方法では、ＳＰは、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有する、テルモアナエロバクテリウム・テルモサッカロリティクム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来の前述のＳＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｄ９ＴＴ０９）と比較してより高い活性を有する。好ましくは、本発明の方法で使用されるＳＰは、テルモアナエロバクテリウム・テルモサッカロリティクム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来のＳＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｄ９ＴＴ０９）の活性よりも少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも１００％又は少なくとも２００％改善された酵素活性を有する。いくつかの実施形態では、本発明の方法で使用されるＳＰは、ヘキソース、特にフルクトースの改善された最大収率を示す。例えば、より高い活性を有するいくつかのＳＰを例４に示す。テルモアナエロバクテリウム種（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ）ＰＳＵ－２由来のＳＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ１Ｘ２ＦＷＣ２）は、テルモアナエロバクテリウム・テルモサッカロリティクム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来のＳＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｄ９ＴＴ０９）の活性よりも１１％改善された酵素活性、及び９％高いフルクトースの最大収率を有する。テルモアナエロバクテリウム・テルモサッカロリティクムＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来のＳＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｌ０ＩＬ１５）は、テルモアナエロバクテリウム・テルモサッカロリティクム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来のＳＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｄ９ＴＴ０９）よりも５０％向上した酵素活性、及び１％高いフルクトースの最大収率を有する。テルモアナエロバクテリウム・キシラノリティクム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｙｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来のＳＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｆ６ＢＪＳ０）は、テルモアナエロバクテリウム・テルモサッカロリティクム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来のＳＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｄ９ＴＴ０９）の活性よりも４９％向上した酵素活性、及び３２％高いフルクトースの最大収率を有する。テルモバチルス種（Ｔｈｅｒｍｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ）ＺＣＴＨ０２－Ｂ１由来のＳＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ１Ｙ３Ｑ６Ｑ６）は、テルモアナエロバクテリウム・テルモサッカロリティクム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来のＳＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｄ９ＴＴ０９）の活性よりも５０％改善された酵素活性、及び３％高いフルクトースの最大収率を有する。ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）由来のＳＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ８４ＨＱ２）は、テルモアナエロバクテリウム・テルモサッカロリティクム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来のＳＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｄ９ＴＴ０９）の活性よりも３１％改善された酵素活性、及び３７％高いフルクトースの最大収率を有する。パエニバチルス・テルモフィルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＳＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ３８８ＮＫ９１）は、テルモアナエロバクテリウム・テルモサッカロリティクム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来のＳＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｄ９ＴＴ０９）よりも２２％改善された酵素活性、及び、１９％高いフルクトースの最大収率を有する。テピディバチルス・デカツレンシス（Ｔｅｐｉｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｃａｔｕｒｅｎｓｉｓ）由来のＳＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ１３５Ｌ６Ｌ９）は、テルモアナエロバクテリウム・テルモサッカロリティクム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来のＳＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｄ９ＴＴ０９）の活性よりも４４％改善された酵素活性、及び９％高いフルクトースの最大収率を有する。最大収率の増加は、商業的方法において重要であり、各ＳＰによるフルクトースの達成可能な最大収率に関与する。おそらく寄与因子には、フルクトースによるスクロースホスホリラーゼの生成物阻害、逆反応の速度（Ｇ１Ｐ＋フルクトース⇔スクロース＋Ｐｉ）、より広くは反応の後期段階におけるフルクトースの形成とフルクトースの分解との間の平衡が含まれる。
【0055】
以下の例は、酵素的方法の一部としてＳＰの活性を決定するためのプロトコルを当業者に提供し、プロトコルは、例えば、酵素をその基質と共にインキュベートし、次いで、ＨＰＬＣを介して反応物及び生成物又はその後の下流生成物の量を測定することを含む。任意の２つの酵素の相対活性の測定は、緩衝液、ｐＨ、温度などの同一の反応条件下で行われる。
【0056】
本発明の改善された方法で使用するためのＳＰの例には、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有するテルモアナエロバクテリウム種（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ）ＰＳＵ－２由来のＳＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ１Ｘ２ＦＷＣ２）、配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有するテルモアナエロバクテリウム・テルモサッカロリティクム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来のＳＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｌ０ＩＬ１５）、配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有するテルモアナエロバクテリウム・キシラノリティクム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｘｙｌａｎｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来のＳＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｆ６ＢＪＳ０）、配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有するテルモバチルス属（Ｔｈｅｒｍｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ）ＺＣＴＨ０２－Ｂ１由来のＳＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ１Ｙ３Ｑ６Ｑ６）、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有するビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）由来のＳＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ８４ＨＱ２）、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有するパエニバチルス・テルモフィルス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＳＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ３８８ＮＫ９１）、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有するテピディバチルス・デカツレンシス（Ｔｅｐｉｄｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｃａｔｕｒｅｎｓｉｓ）由来のＳＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ１３５Ｌ６Ｌ９）、配列番号１９～２５のいずれか１つと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するＳＰのタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。
【0057】
本発明の改善された方法で使用するためのＳＰは、一般に、グリコシドヒドロラーゼ・スーパーファミリー（ＩＰＲ０１７８５３）の一部、より具体的にはスクロースホスホリラーゼファミリー（ＩＰＲ０２２５２７）であり、グリコシルヒドロラーゼ、ファミリー１３、触媒ドメイン（ＩＰＲ００６０４７）を含む。グリコシルヒドロラーゼドメインは、（β／α）８バレルからなり、触媒性ドメインである。全スクロースホスホリラーゼは、４つのドメイン、すなわち、Ｎ末端ドメイン、グリコシル加水分解酵素ドメイン、Ｂドメイン（グリコシルドメイン内の大きなループから形成される）、及びＣ末端ドメインからなる（Ｓｐｒｏｇｏｅ Ｄ，ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｒｏｅｋ ＬＡ，Ｍｉｒｚａ Ｏ，Ｋａｓｔｒｕｐ ＪＳ，Ｖｏｒａｇｅｎ ＡＧ，Ｇａｊｈｅｄｅ Ｍ，Ｓｋｏｖ ＬＫ（Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２００４）「ビフィドバクテリウム・アドレセンティス由来のスクロースホスホリラーゼの結晶構造（Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｆｒｏｍ Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．４３（５）：１１５６－６２．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｂｉ０３５６３９５．ＰＭＩＤ １４７５６５５１）。よく研究されているロイコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）由来のスクロースホスホリラーゼ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ５９４９５）への配列アラインメントを通して、触媒残基Ａｓｐ１９６の保存が見られる（Ｓｃｈｗａｒｚ Ａ，Ｎｉｄｅｔｚｋｙ Ｂ（Ｊｕｌｙ ２００６）「ロイコノストック・メセンテロイデス・スクロースホスホリラーゼのＡｓｐ－１９６－－＞Ａｌａ変異体はリン酸への及びリン酸からのグルコシル転移の立体化学的過程及び速度論的機構の変化を示す（Ａｓｐ－１９６－－＞Ａｌａ ｍｕｔａｎｔ ｏｆ Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｃｒｏｓｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｅｘｈｉｂｉｔｓ ａｌｔｅｒｅｄ ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｃｏｕｒｓｅ ａｎｄ ｋｉｎｅｔｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｏ ａｎｄ ｆｒｏｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）」ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ．５８０（１６）：３９０５－１０．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｆｅｂｓｌｅｔ．２００６．０６．０２０．ＰＭＩＤ １６７９７５４２．），Ｇｌｕ２３７（Ｓｃｈｗａｒｚ Ａ，Ｂｒｅｃｋｅｒ Ｌ，Ｎｉｄｅｔｚｋｙ Ｂ（Ｍａｙ ２００７）「部位特異的突然変異誘発及び野生型酵素とＧｌｕ２３７－＞Ｇｌｎ変異型酵素の詳細な速度論的比較によってプローブしたロイコノストック・メセンテロイデス・スクロースホスホリラーゼにおける酸塩基触媒（Ａｃｉｄ－ｂａｓｅ ｃａｔａｌｙｓｉｓ ｉｎ Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｃｒｏｓｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｐｒｏｂｅｄ ｂｙ ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｄｅｔａｉｌｅｄ ｋｉｎｅｔｉｃ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ａｎｄ Ｇｌｕ２３７－－＞Ｇｌｎ ｍｕｔａｎｔ ｅｎｚｙｍｅｓ）」Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ．４０３（３）：４４１－９．ｄｏｉ：１０．１０４２／ＢＪ２００７００４２．ＰＭＣ １８７６３７５．ＰＭＩＤ １７２３３６２８．），ａｎｄ Ａｓｐ ２９５（Ｍｕｅｌｌｅｒ Ｍ，Ｎｉｄｅｔｚｋｙ Ｂ（Ａｐｒｉｌ ２００７）「部位特異的突然変異誘発でプローブしたロイコノストック・メセンテロイデス・スクロースホスホリラーゼの触媒機構におけるＡｓｐ－２９５の役割（Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ Ａｓｐ－２９５ ｉｎ ｔｈｅ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｕｃｒｏｓｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｐｒｏｂｅｄ ｗｉｔｈ ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）」ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ．５８１（７）：１４０３－８．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｆｅｂｓｌｅｔ．２００７．０２．０６０．ＰＭＩＤ １７３５０６２０）。
【0058】
デンプンは、自然界で最も広く使用されているエネルギー貯蔵化合物であり、大部分は植物種子に貯蔵されている。天然デンプンは、線状アミロース及び分枝状アミロペクチンを含む。デンプン誘導体の例には、アミロース、アミロペクチン、可溶性デンプン、アミロデキストリン、マルトデキストリン、マルトース、フルクトース、グルコースが含まれる。デンプンの誘導体は、デンプンの酵素加水分解又はデンプンの酸加水分解によって調製することができる。具体的には、デンプンの酵素加水分解は、α－１，６－グルコシド結合を加水分解するイソアミラーゼ（ＩＡ、ＥＣ．３．２．１．６８）、α－１，６－グルコシド結合を加水分解するプルラナーゼ（ＰＡ、ＥＣ．３．２．１．４１）、又はα－１，４－グルコシド結合を切断するα－アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．１）によって触媒又は増強することができる。コーンスターチは、αＧＰ作用を妨げる多くの枝を含む。イソアミラーゼを使用してデンプンを脱分岐し、線状アミロデキストリンを得ることができる。イソアミラーゼで前処理されたデンプンは、最終生成物中により高いＦ６Ｐ濃度をもたらすことができる。イソアミラーゼ及びプルラナーゼは、α－１，６－グリコシド結合を切断し、α－グルカンホスホリラーゼによるデンプンのより完全な分解を可能にする。α－アミラーゼは、α－１，４－グリコシド結合を切断するので、α－アミラーゼは、ヘキソースへのより迅速な変換及び溶解性の向上のためにデンプンを断片に分解するために使用される。
【0059】
セルロースは、最も豊富な生物資源であり、植物細胞壁の主要な構成要素である。非食品リグノセルロース性バイオマスは、セルロース、ヘミセルロース及びリグニンならびに他の微量成分を含有する。Ａｖｉｃｅｌ（微結晶セルロース）、再生非晶質セルロース、細菌セルロース、濾紙などを含む純粋なセルロースは、一連の処理によって調製することができる。部分加水分解セルロース系基質としては、重合度が７を超える非水溶性セロデキストリン、重合度が３～６の水溶性セロデキストリン、セロビオース、グルコース、フルクトースなどが挙げられる。セルロース誘導体としては、前処理バイオマス、再生非晶質セルロース、セロデキストリン、セロビオース、フルクトース、グルコースなどが挙げられる。さらに、セルロースの誘導体は、セルラーゼ混合物によって触媒されるセルロースの酵素加水分解によって、酸によって、又はバイオマスの前処理によって調製することができる。本発明のいくつかの方法では、Ｇ１Ｐは、セルロースホスホリラーゼによってセルロースから製造される。いくつかの方法では、Ｇ１Ｐは、セロデキストリンホスホリラーゼ（ＣＤＰ）及びセロビオースホスホリラーゼ（ＣＢＰ）によって触媒されるセロデキストリン及びセロビオースならびに遊離リン酸から生成される。
【0060】
本発明のいくつかの改善された方法では、ヘキソースは、アロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、アルトロース、タロース、ソルボース、グロース、イドース、アルロース、イノシトール及びタガトースから選択される。ヘキソースは、６個の炭素原子を有する単糖類である。ヘキソースは官能基によって分類することができ、アルドヘキソースは１位にアルデヒドを有し、ケトヘキソースは２位にそのケトンを有する。アルドヘキソース（又はアルドース）には、アロース、アルトロース、グルコース、グロース、ガラクトース、イドース、タロース及びマンノースが含まれる。ケトヘキソース（又はケトース）には、プシコース（アルロース）、フルクトース、タガトース、及びソルボースが含まれる。イノシトールは、アルデヒド基もケトース基も有さず、炭素環式ヘキソースとして特徴付けられる。本発明の改善された方法を使用して、デンプン及びその誘導体を、アロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、アルトロース、タロース、ソルボース、グロース、タガトース、アルロース、イノシトール及びイドースから選択されるヘキソースに変換することができる。したがって、本発明の実施形態のいくつかは、これらの個々のヘキソースを製造するための改善された方法に関する。
【0061】
ヘキソースを製造するための本発明の改善された方法には、ヘキソースリン酸ホスファターゼを使用してヘキソースリン酸を脱リン酸化する追加のステップが含まれる。ヘキソースを製造するための本発明のいくつかの改善された方法では、方法ステップは単一の反応容器内で行われる。本発明の他の改善された方法では、方法ステップは２つ以上の単一反応容器内で行われる。いくつかの改善された方法では、方法ステップは、ＡＴＰなし、ＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）なしで、約０．１ｍＭ～約１５０ｍＭのリン酸濃度で行われ、リン酸塩は再利用され、及び／又はヘキソースリン酸を脱リン酸化するステップは、エネルギー的に好適な化学反応を伴う。本発明のいくつかの改善された方法では、方法ステップは、約３７℃～約８５℃の範囲の温度、約５．０～約８．０の範囲のｐＨ、又は約０．５時間～約４８時間のうちの少なくとも１つの方法条件下で行われる。本発明のいくつかの改善された方法では、方法ステップは連続反応として行われる。
【0062】
ヘキソースを調製するための本発明のいくつかの方法には、ヘキソースリン酸ホスファターゼを使用してヘキソースリン酸を脱リン酸化するさらなるステップが含まれる。本発明の方法で使用されるホスファターゼは、ヘキソースリン酸に特異的である。例えば、アロース６－リン酸は、アロース６－リン酸ホスファターゼによってアロースに変換され、マンノース６－リン酸は、マンノース６－リン酸ホスファターゼによってマンノースに変換され、ガラクトース６－リン酸は、ガラクトース６－リン酸ホスファターゼによってガラクトースに変換され、フルクトース６－リン酸は、フルクトース６－リン酸ホスファターゼによってフルクトースに変換され、アルトロース６－リン酸は、アルトロース６－リン酸ホスファターゼによってアルトロースに変換され、タロース６－リン酸は、タロース６－リン酸ホスファターゼによってタロースに変換され、ソルボース６－リン酸は、ソルボース６－リン酸ホスファターゼによってソルボースに変換され、グロース６－リン酸は、グロース６－リン酸ホスファターゼによってグロースに変換され、タガトース６－リン酸は、タガトース６－リン酸ホスファターゼによってタガトースに変換され、プシコース６－リン酸は、プシコース６－リン酸ホスファターゼによってプシコースに変換され、イノシトール３－リン酸は、イノシトールモノホスファターゼによってイノシトールに変換され、イドース６－リン酸は、イドース６－リン酸ホスファターゼによってイドースに変換される。本明細書で使用される場合、特異的とは、他のヘキソースよりも示されたヘキソースに対してより高い特異的活性を有することを意味する。例えば、アロース６－リン酸ホスファターゼは、例えば、ソルボース６－リン酸又はタロース６－リン酸よりも、アロース６－リン酸に対して高い特異的活性を有する。本発明の方法において、ヘキソースリン酸ホスファターゼは、その方法における他のヘキソースリン酸中間体と比較して、示されたヘキソースリン酸に対してより高い活性を有する。例示的な例として、マルトデキストリンをアロースに変換するための方法において、アロース６－リン酸ホスファターゼは、Ｇ１Ｐ、Ｇ６Ｐ、Ｆ６Ｐ及びプシコース６－リン酸など、方法における他のヘキソースリン酸中間体と比較して、アロース６－リン酸に対してより高い活性を有する。図２及び図４を参照されたい。
【0063】
糖アルコールは、本発明の改善された方法によって生成された様々なヘキソース糖から製造することができる。例えば、マンニトール及びソルビトールを製造することができ、これらは現在、医療及び食品産業にとって商業的な関心事である。これらの改善された酵素的方法のケトース又はアルドース生成物は、水素ガス又は水素化ホウ素ナトリウムなどの還元剤を使用して糖アルコール形態に還元され得る。好ましくは、米国特許第６，５７０，０４３号明細書、米国特許第８，８１６，０６８号明細書、又は米国特許第５，４６６，７９５号明細書に既に記載されているように、水素ガスが還元剤として使用される。
【0064】
一実施形態では、本発明の改善された方法は、アロースの製造に関する。デンプン又はデンプン誘導体が出発物質である場合、改善は、ａ）配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＰＧＭによって触媒される、Ｇ１ＰをＧ６Ｐに変換するステップ、ｂ）配列番号１０～１３のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するαＧＰによって触媒される、デンプン誘導体をＧ１Ｐに変換するステップ、及びｃ）配列番号１５～１７のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する４ＧＴによって触媒される、デンプン誘導体をトランスグリコシル化するステップ、の１つ又は複数から選択される。セルロース又はセルロース誘導体が出発材料である場合、改善は、配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＰＧＭによって触媒される、Ｇ１ＰをＧ６Ｐに変換するステップである。スクロースが出発物質である場合、改善は、ａ）配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＰＧＭによって触媒される、Ｇ１ＰをＧ６Ｐに変換するステップ、及びｂ）配列番号１９～２５のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＳＰによって触媒される、スクロースをＧ１Ｐに変換するステップ、の一方又は両方から選択される。方法はさらに、ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）によって触媒される、Ｇ６Ｐをフルクトース６－リン酸（Ｆ６Ｐ）に変換するステップと、プシコース６－リン酸３－エピメラーゼ（Ｐ６ＰＥ）によって触媒される、Ｆ６Ｐをプシコース６－リン酸（Ｐ６Ｐ）に変換するステップと、アロース６－リン酸イソメラーゼ（Ａ６ＰＩ）によって触媒される、Ｐ６Ｐをアロース６－リン酸（Ａ６Ｐ）に変換するステップと、アロース６－リン酸ホスファターゼ（Ａ６ＰＰ）によって触媒される、Ａ６Ｐをアロースに変換するステップと、を含む。
【0065】
一実施形態では、本発明の改善された方法は、マンノースの製造に関する。デンプン又はデンプン誘導体が出発物質である場合、改善は、ａ）配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＰＧＭによって触媒される、Ｇ１ＰをＧ６Ｐに変換するステップ、ｂ）配列番号１０～１３のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するαＧＰによって触媒される、デンプン誘導体をＧ１Ｐに変換するステップ、及びｃ）配列番号１５～１７のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する４ＧＴによって触媒される、デンプン誘導体をトランスグリコシル化するステップ、の１つ又は複数から選択される。セルロース又はセルロース誘導体が出発材料である場合、改善は、配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＰＧＭによって触媒される、Ｇ１ＰをＧ６Ｐに変換するステップである。スクロースが出発物質である場合、改善は、ａ）配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＰＧＭによって触媒される、Ｇ１ＰをＧ６Ｐに変換するステップ、及びｂ）配列番号１９～２５のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＳＰによって触媒される、スクロースをＧ１Ｐに変換するステップ、の一方又は両方から選択される。方法はさらに、ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）によって触媒される、Ｇ６Ｐをフルクトース６－リン酸（Ｆ６Ｐ）に変換するステップと、マンノース６－リン酸イソメラーゼ（Ｍ６ＰＩ）又はホスホグルコース／ホスホマンノースイソメラーゼ（ＰＧＰＭＩ）によって触媒される、Ｆ６Ｐをマンノース６－リン酸（Ｍ６Ｐ）に変換するステップと、マンノース６－リン酸ホスファターゼ（Ｍ６ＰＰ）によって触媒される、Ｍ６Ｐをマンノースに変換するステップと、を含む。
【0066】
一実施形態では、本発明の改善された方法は、ガラクトースの製造に関する。デンプン又はデンプン誘導体が出発物質である場合、改善は、ａ）配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＰＧＭによって触媒される、Ｇ１ＰをＧ６Ｐに変換するステップ、ｂ）配列番号１０～１３のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するαＧＰによって触媒される、デンプン誘導体をＧ１Ｐに変換するステップ、及びｃ）配列番号１５～１７のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する４ＧＴによって触媒される、デンプン誘導体をトランスグリコシル化するステップ、の１つ又は複数から選択される。セルロース又はセルロース誘導体が出発材料である場合、改善は、配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＰＧＭによって触媒される、Ｇ１ＰをＧ６Ｐに変換するステップである。スクロースが出発物質である場合、改善は、ａ）配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＰＧＭによって触媒される、Ｇ１ＰをＧ６Ｐに変換するステップ、及びｂ）配列番号１９～２５のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＳＰによって触媒される、スクロースをＧ１Ｐに変換するステップ、の一方又は両方から選択される。方法はさらに、ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）によって触媒される、Ｇ６Ｐをフルクトース６－リン酸（Ｆ６Ｐ）に変換するステップと、フルクトース６－リン酸４－エピメラーゼ（Ｆ６ＰＥ）によって触媒される、Ｆ６Ｐをタガトース６－リン酸（Ｔ６Ｐ）に変換するステップと、ガラクトース６－リン酸イソメラーゼ（Ｇａｌ６ＰＩ）によって触媒される、Ｔ６Ｐをガラクトース６－リン酸（Ｇａｌ６Ｐ）に変換するステップと、ガラクトース６－リン酸ホスファターゼ（Ｇａｌ６ＰＰ）によって触媒される、Ｇａｌ６Ｐをガラクトースに変換するステップと、を含む。
【0067】
一実施形態では、本発明の改善された方法は、フルクトースの製造に関する。デンプン又はデンプン誘導体が出発物質である場合、改善は、ａ）配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＰＧＭによって触媒される、Ｇ１ＰをＧ６Ｐに変換するステップ、ｂ）配列番号１０～１３のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するαＧＰによって触媒される、デンプン誘導体をＧ１Ｐに変換するステップ、及びｃ）配列番号１５～１７のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する４ＧＴによって触媒される、デンプン誘導体をトランスグリコシル化するステップ、の１つ又は複数から選択される。セルロース又はセルロース誘導体が出発材料である場合、改善は、配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＰＧＭによって触媒される、Ｇ１ＰをＧ６Ｐに変換するステップである。スクロースが出発物質である場合、改善は、ａ）配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＰＧＭによって触媒される、Ｇ１ＰをＧ６Ｐに変換するステップ、及びｂ）配列番号１９～２５のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＳＰによって触媒される、スクロースをＧ１Ｐに変換するステップ、の一方又は両方から選択される。方法はさらに、ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）によって触媒される、Ｇ６Ｐをフルクトース６－リン酸（Ｆ６Ｐ）に変換するステップと、フルクトース６－リン酸ホスファターゼ（Ｆ６ＰＰ）によって触媒される、Ｆ６Ｐをフルクトースに変換するステップと、を含む。
【0068】
一実施形態では、本発明の改善された方法は、アルトロースの製造に関する。デンプン又はデンプン誘導体が出発物質である場合、改善は、ａ）配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＰＧＭによって触媒される、Ｇ１ＰをＧ６Ｐに変換するステップ、ｂ）配列番号１０～１３のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するαＧＰによって触媒される、デンプン誘導体をＧ１Ｐに変換するステップ、及びｃ）配列番号１５～１７のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する４ＧＴによって触媒される、デンプン誘導体をトランスグリコシル化するステップ、の１つ又は複数から選択される。セルロース又はセルロース誘導体が出発材料である場合、改善は、配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＰＧＭによって触媒される、Ｇ１ＰをＧ６Ｐに変換するステップである。スクロースが出発物質である場合、改善は、ａ）配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＰＧＭによって触媒される、Ｇ１ＰをＧ６Ｐに変換するステップ、及びｂ）配列番号１９～２５のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＳＰによって触媒される、スクロースをＧ１Ｐに変換するステップ、の一方又は両方から選択される。方法はさらに、ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）によって触媒される、Ｇ６Ｐをフルクトース６－リン酸（Ｆ６Ｐ）に変換するステップと、Ｐ６ＰＥによって触媒される、Ｆ６ＰをＰ６Ｐに変換するステップと、アルトロース６－リン酸イソメラーゼ（Ａｌｔ６ＰＩ）によって触媒される、Ｐ６Ｐをアルトロース６－リン酸（Ａｌｔ６Ｐ）に変換するステップと、アルトロース６－リン酸ホスファターゼ（Ａｌｔ６ＰＰ）によって触媒される、生成されたＡｌｔ６Ｐをアルトロースに変換するステップと、を含む。
【0069】
一実施形態では、本発明の改善された方法は、タロースの製造に関する。デンプン又はデンプン誘導体が出発物質である場合、改善は、ａ）配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＰＧＭによって触媒される、Ｇ１ＰをＧ６Ｐに変換するステップ、ｂ）配列番号１０～１３のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するαＧＰによって触媒される、デンプン誘導体をＧ１Ｐに変換するステップ、及びｃ）配列番号１５～１７のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する４ＧＴによって触媒される、デンプン誘導体をトランスグリコシル化するステップ、の１つ又は複数から選択される。セルロース又はセルロース誘導体が出発材料である場合、改善は、配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＰＧＭによって触媒される、Ｇ１ＰをＧ６Ｐに変換するステップである。スクロースが出発物質である場合、改善は、ａ）配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＰＧＭによって触媒される、Ｇ１ＰをＧ６Ｐに変換するステップ、及びｂ）配列番号１９～２５のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＳＰによって触媒される、スクロースをＧ１Ｐに変換するステップ、の一方又は両方から選択される。方法はさらに、ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）によって触媒される、Ｇ６Ｐをフルクトース６－リン酸（Ｆ６Ｐ）に変換するステップと、Ｆ６ＰＥによって触媒される、Ｆ６ＰをＴ６Ｐに変換するステップと、タロース６－リン酸イソメラーゼ（Ｔａｌ６ＰＩ）によって触媒される、Ｔ６Ｐをタロース６－リン酸（Ｔａｌ６Ｐ）に変換するステップと、タロース６－リン酸ホスファターゼ（Ｔａｌ６ＰＰ）によって触媒される、Ｔａｌ６Ｐをタロースに変換するステップと、を含む。
【0070】
一実施形態では、本発明の改善された方法は、ソルボースの製造に関する。デンプン又はデンプン誘導体が出発物質である場合、改善は、ａ）配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＰＧＭによって触媒される、Ｇ１ＰをＧ６Ｐに変換するステップ、ｂ）配列番号１０～１３のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するαＧＰによって触媒される、デンプン誘導体をＧ１Ｐに変換するステップ、及びｃ）配列番号１５～１７のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する４ＧＴによって触媒される、デンプン誘導体をトランスグリコシル化するステップ、の１つ又は複数から選択される。セルロース又はセルロース誘導体が出発材料である場合、改善は、配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＰＧＭによって触媒される、Ｇ１ＰをＧ６Ｐに変換するステップである。スクロースが出発物質である場合、改善は、ａ）配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＰＧＭによって触媒される、Ｇ１ＰをＧ６Ｐに変換するステップ、及びｂ）配列番号１９～２５のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＳＰによって触媒される、スクロースをＧ１Ｐに変換するステップ、の一方又は両方から選択される。方法はさらに、ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）によって触媒される、Ｇ６Ｐをフルクトース６－リン酸（Ｆ６Ｐ）に変換するステップと、Ｆ６ＰＥによって触媒される、Ｆ６ＰをＴ６Ｐに変換するステップと、ソルボース６－リン酸エピメラーゼ（Ｓ６ＰＥ）によって触媒される、Ｔ６Ｐをソルボース６－リン酸（Ｓ６Ｐ）に変換するステップと、ソルボース６－リン酸ホスファターゼ（Ｓ６ＰＰ）によって触媒される、Ｓ６Ｐをソルボースに変換するステップと、を含む。
【0071】
一実施形態では、本発明の改善された方法は、グロースの製造に関する。デンプン又はデンプン誘導体が出発物質である場合、改善は、ａ）配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＰＧＭによって触媒される、Ｇ１ＰをＧ６Ｐに変換するステップ、ｂ）配列番号１０～１３のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するαＧＰによって触媒される、デンプン誘導体をＧ１Ｐに変換するステップ、及びｃ）配列番号１５～１７のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する４ＧＴによって触媒される、デンプン誘導体をトランスグリコシル化するステップ、の１つ又は複数から選択される。セルロース又はセルロース誘導体が出発材料である場合、改善は、配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＰＧＭによって触媒される、Ｇ１ＰをＧ６Ｐに変換するステップである。スクロースが出発物質である場合、改善は、ａ）配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＰＧＭによって触媒される、Ｇ１ＰをＧ６Ｐに変換するステップ、及びｂ）配列番号１９～２５のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＳＰによって触媒される、スクロースをＧ１Ｐに変換するステップ、の一方又は両方から選択される。方法はさらに、ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）によって触媒される、Ｇ６Ｐをフルクトース６－リン酸（Ｆ６Ｐ）に変換するステップと、Ｆ６ＰＥによって触媒される、Ｆ６ＰをＴ６Ｐに変換するステップと、グロース６－リン酸イソメラーゼ（Ｇｕｌ６ＰＩ）によって触媒される、Ｓ６Ｐをグロース６－リン酸（Ｇｕｌ６Ｐ）に変換するステップと、グロース６－リン酸ホスファターゼ（Ｇｕｌ６ＰＰ）によって触媒される、Ｇｕｌ６Ｐをグロースに変換するステップと、を含む。
【0072】
一実施形態では、本発明の改善された方法は、イドースの製造に関する。デンプン又はデンプン誘導体が出発物質である場合、改善は、ａ）配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＰＧＭによって触媒される、Ｇ１ＰをＧ６Ｐに変換するステップ、ｂ）配列番号１０～１３のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するαＧＰによって触媒される、デンプン誘導体をＧ１Ｐに変換するステップ、及びｃ）配列番号１５～１７のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する４ＧＴによって触媒される、デンプン誘導体をトランスグリコシル化するステップ、の１つ又は複数から選択される。セルロース又はセルロース誘導体が出発材料である場合、改善は、配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＰＧＭによって触媒される、Ｇ１ＰをＧ６Ｐに変換するステップである。スクロースが出発物質である場合、改善は、ａ）配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＰＧＭによって触媒される、Ｇ１ＰをＧ６Ｐに変換するステップ、及びｂ）配列番号１９～２５のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＳＰによって触媒される、スクロースをＧ１Ｐに変換するステップ、の一方又は両方から選択される。方法はさらに、ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）によって触媒される、Ｇ６Ｐをフルクトース６－リン酸（Ｆ６Ｐ）に変換するステップと、Ｆ６ＰＥによって触媒される、Ｆ６ＰをＴ６Ｐに変換するステップと、ソルボース６－リン酸エピメラーゼ（Ｓ６ＰＥ）によって触媒される、Ｔ６Ｐをソルボース６－リン酸（Ｓ６Ｐ）に変換するステップと、イドース６－リン酸イソメラーゼ（Ｉ６ＰＩ）によって触媒される、Ｓ６Ｐをイドース６－リン酸（Ｉ６Ｐ）に変換するステップと、イドース６－リン酸ホスファターゼ（Ｉ６ＰＰ）によって触媒される、Ｉ６Ｐをイドースに変換するステップと、を含む。
【0073】
一実施形態では、本発明の改善された方法は、タガトースの製造に関する。デンプン又はデンプン誘導体が出発物質である場合、改善は、ａ）配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＰＧＭによって触媒される、Ｇ１ＰをＧ６Ｐに変換するステップ、ｂ）配列番号１０～１３のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するαＧＰによって触媒される、デンプン誘導体をＧ１Ｐに変換するステップ、及びｃ）配列番号１５～１７のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する４ＧＴによって触媒される、デンプン誘導体をトランスグリコシル化するステップ、の１つ又は複数から選択される。セルロース又はセルロース誘導体が出発材料である場合、改善は、配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＰＧＭによって触媒される、Ｇ１ＰをＧ６Ｐに変換するステップである。スクロースが出発物質である場合、改善は、ａ）配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＰＧＭによって触媒される、Ｇ１ＰをＧ６Ｐに変換するステップ、及びｂ）配列番号１９～２５のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＳＰによって触媒される、スクロースをＧ１Ｐに変換するステップ、の一方又は両方から選択される。方法はさらに、ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）によって触媒される、Ｇ６Ｐをフルクトース６－リン酸（Ｆ６Ｐ）に変換するステップと、フルクトース６－リン酸エピメラーゼ（Ｆ６ＰＥ）によって触媒される、Ｆ６Ｐをタガトース６－リン酸（Ｔ６Ｐ）に変換するステップと、タガトース６－リン酸ホスファターゼ（Ｔ６ＰＰ）によって触媒される、Ｔ６Ｐをタガトースに変換するステップと、を含む。
【0074】
一実施形態では、本発明の改善された方法は、プシコースの製造に関する。デンプン又はデンプン誘導体が出発物質である場合、改善は、ａ）配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＰＧＭによって触媒される、Ｇ１ＰをＧ６Ｐに変換するステップ、ｂ）配列番号１０～１３のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するαＧＰによって触媒される、デンプン誘導体をＧ１Ｐに変換するステップ、及びｃ）配列番号１５～１７のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する４ＧＴによって触媒される、デンプン誘導体をトランスグリコシル化するステップ、の１つ又は複数から選択される。セルロース又はセルロース誘導体が出発材料である場合、改善は、配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＰＧＭによって触媒される、Ｇ１ＰをＧ６Ｐに変換するステップである。スクロースが出発物質である場合、改善は、ａ）配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＰＧＭによって触媒される、Ｇ１ＰをＧ６Ｐに変換するステップ、及びｂ）配列番号１９～２５のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＳＰによって触媒される、スクロースをＧ１Ｐに変換するステップ、の一方又は両方から選択される。方法はさらに、ホスホグルコイソメラーゼ（ＰＧＩ）によって触媒される、Ｇ６Ｐをフルクトース６－リン酸（Ｆ６Ｐ）に変換するステップと、プシコース６－リン酸エピメラーゼ（Ｐ６ＰＥ）によって触媒される、Ｆ６Ｐをプシコース６－リン酸（Ｐ６Ｐ）に変換するステップと、プシコース６－リン酸ホスファターゼ（Ｐ６ＰＰ）によって触媒される、Ｐ６Ｐをプシコースに変換するステップと、を含む。
【0075】
一実施形態では、本発明の改善された方法は、イノシトールの製造に関する。デンプン又はデンプン誘導体が出発物質である場合、改善は、ａ）配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＰＧＭによって触媒される、Ｇ１ＰをＧ６Ｐに変換するステップ、ｂ）配列番号１０～１３のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するαＧＰによって触媒される、デンプン誘導体をＧ１Ｐに変換するステップ、及びｃ）配列番号１５～１７のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する４ＧＴによって触媒される、デンプン誘導体をトランスグリコシル化するステップ、の１つ又は複数から選択される。セルロース又はセルロース誘導体が出発材料である場合、改善は、配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＰＧＭによって触媒される、Ｇ１ＰをＧ６Ｐに変換するステップである。スクロースが出発物質である場合、改善は、ａ）配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＰＧＭによって触媒される、Ｇ１ＰをＧ６Ｐに変換するステップ、及びｂ）配列番号１９～２５のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＳＰによって触媒される、スクロースをＧ１Ｐに変換するステップ、の一方又は両方から選択される。方法はさらに、イノシトールリン酸シンターゼを使用してＧ６Ｐをイノシトール３－リン酸（Ｉ３Ｐ）に変換するステップと、イノシトールモノホスファターゼを使用してＩ３Ｐをイノシトールに変換するステップと、を含む。別の実施形態では、本発明の改善された方法は、スクロースからのイノシトールの製造に関する。
【0076】
図１は、スクロースをＧ６Ｐ中間体に変換するための酵素的経路を示す。本発明の改善された方法は、以下の改善の１つ又は複数を含む：ＳＰが、配列番号１９～２５のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む；及びＰＧＭが、配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。本発明の好ましい方法では、ＳＰは配列番号１９～２５のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、ＰＧＭは配列番号２～８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。より好ましい方法では、ＳＰは配列番号２１のアミノ酸配列を含み、ＰＧＭは配列番号８のアミノ酸配列を含む。
【0077】
図２は、デンプン誘導体、マルトデキストリンをＧ６Ｐ中間体に変換する酵素的経路を示す概略図である。以下の略語が使用される：ＩＡ、イソアミラーゼ；ＰＡ、プルラナーゼ；αＧＰ、α－グルカンホスホリラーゼ又はデンプンホスホリラーゼ；４ＧＴ、４－グルカントランスフェラーゼ；及びＰＧＭ、ホスホグルコムターゼ。本発明の改善された方法は、以下の改善の１つ又は複数を含む：ＰＧＭが、配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む；αＧＰが、配列番号１０～１３のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む；及び４ＧＴが、配列番号１５～１７のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。本発明の好ましい方法では、ＰＧＭは配列番号２～８のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、αＧＰは配列番号１０～１３のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、４ＧＴは配列番号１５～１７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。本発明のより好ましい方法では、ＰＧＭは配列番号８のアミノ酸配列を含み、αＧＰは配列番号１１のアミノ酸配列を含み、４ＧＴは配列番号１７のアミノ酸配列を含む。
【0078】
図３は、セルロースをＧ６Ｐ中間体に変換するための酵素的経路を示す。本発明の改善された方法では、ＰＧＭは、配列番号２～８のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。好ましくは、ＰＧＭは、配列番号２～８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。より好ましくは、ＰＧＭは配列番号８のアミノ酸配列を含む。ヘキソースを製造するための本発明のいくつかの改善された方法では、方法ステップの１つ又は複数は、単一の反応容器内で行われる。本発明の他の改善された方法では、方法ステップは２つ以上の反応容器内で行われる。その後、ヘキソースリン酸の脱リン酸化によって生成されたリン酸イオンは、特にすべての方法ステップが単一のバイオリアクター又は反応容器内で行われる場合、デンプン誘導体をＧ１Ｐに変換する方法ステップで再利用することができる。リン酸塩を再利用する能力は、非化学量論量のリン酸塩を使用することを可能にし、反応リン酸濃度を低く保つ。これは、全体的な経路及び方法の全体的な速度に影響を及ぼすが、個々の酵素の活性を制限せず、ヘキソース製造方法の全体的な効率を可能にする。
【0079】
ヘキソースを製造するための本発明の改善された方法では、方法ステップは、ＡＴＰなし、ＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）なしで、約０．１ｍＭ～約１５０ｍＭのリン酸濃度で行われ、リン酸塩は再利用され、及び／又はヘキソースリン酸を脱リン酸化するステップは、エネルギー的に好適な化学反応を伴う。本発明の改善された方法では、方法ステップは、約３７℃～約８５℃の範囲の温度、約５．０～約８．０の範囲のｐＨ、又は約０．５時間～約４８時間、又は連続方法、のうちの少なくとも１つの方法条件下で行われる。
【0080】
例えば、各方法における反応リン酸濃度は、約０ｍＭ～約３００ｍＭ、約０．１ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１ｍＭ～約５０ｍＭ、好ましくは約５ｍＭ～約５０ｍＭ、又はより好ましくは約１０ｍＭ～約５０ｍＭの範囲であり得る。例えば、各方法における反応リン酸濃度は、約０．１ｍＭ、約０．５ｍＭ、約１ｍＭ、約１．５ｍＭ、約２ｍＭ、約２．５ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、又は約５５ｍＭであり得る。リン酸濃度が低いと、全リン酸が低いために製造コストが低下し、リン酸除去コストが低下する。また、高濃度の遊離リン酸による方法中のホスファターゼ又は他の酵素の阻害を防ぎ、リン汚染の可能性が低下する。
【0081】
さらに、本明細書に開示される方法の各々は、リン酸の供給源としてＡＴＰを添加せずに、すなわちＡＴＰを含まずに行うことができる。各方法は、ＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）を添加する必要なく、すなわちＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）を含まずに行うこともできる。
【0082】
当技術分野で公知の任意の適切な生物学的に適合性の緩衝剤、例えばＨＥＰＥＳ、ＰＢＳ、ＢＩＳ－ＴＲＩＳ、ＭＯＰＳ、ＤＩＰＳＯ、Ｔｒｉｚｍａなどを本発明の各方法で使用することができる。本発明による方法のための反応緩衝液は、５．０～８．０の範囲のｐＨを有することができる。より好ましくは、反応緩衝液ｐＨは、約６．０～約７．３の範囲であり得る。例えば、反応緩衝液ｐＨは、６．０、６．２、６．４、６．６、６．８、７．０、７．２又は７．３であり得る。
【0083】
反応緩衝液は、二価金属カチオンを含むこともできる。いくつかの方法では、ステップは、Ｍｇ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｏ２＋、Ｍｎ２＋、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される二価金属カチオンの存在下で行われる。当技術分野で知られているように、適切な塩を使用して、所望の金属カチオンを導入することができる。
【0084】
本発明の各方法において、方法ステップが行われる反応温度は、３７～８５℃の範囲であり得る。より好ましくは、ステップは、約４０℃～約８０℃の範囲の温度で行うことができる。温度は、例えば、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃、約８０℃、又は約８５℃であり得る。好ましくは、反応温度は、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、又は約６５℃である。より好ましくは、反応温度は約５０℃～約５５℃の範囲である。
【0085】
本発明の改善された方法のいくつかについて、反応時間は必要に応じて調整することができ、約０．５時間～約４８時間の範囲であり得る。例えば、反応時間は、約１時間、約２時間、約４時間、約８時間、約１２時間、約１６時間、約１８時間、約２０時間、約２２時間、約２４時間、約２６時間、約２８時間、約３０時間、約３２時間、約３４時間、約３６時間、約３８時間、約４０時間、約４２時間、約４４時間、約４６時間、又は約４８時間であり得る。より好ましくは、反応時間は約２４時間である。
【0086】
この方法は、設定された時間制限なしに、連続方法として１つ又は複数の反応器で行うこともできる。連続方法では、例えば、マルトデキストリン溶液は、溶液が下流処理のために１つ又は複数のカラムを離れるときにタガトースへの変換が完了するような速度で、固定化酵素の床を通してポンプ輸送される。例えば、２００ｇ／Ｌのマルトデキストリンを、マルトデキストリンがカラムを離れるときに最大のタガトース収率が達成されるように、固定化酵素（例えば５０℃に維持）が充填されたカラムを通してポンプ輸送することができる。この方法論は、バッチ法よりも大きな体積生産性を提供する。これにより、生成物がカラム及び反応条件と接触する時間が制限され、生成物の分解（例えば、潜在的なヒドロキシメチルフルフラール形成）の可能性が減少する。また、製造の自動化が促進されるため、運転費用が削減される。
【0087】
本発明のステップで使用される酵素は、可溶性、固定化、集合化、捕捉、又は凝集タンパク質の形態をとり得る。これらの酵素は、当技術分野で公知のように、機能性を改善するために一般的に使用される不溶性の有機又は無機支持体に吸着され得る。これらの支持体には、アガロース、メタクリレート、ポリスチレン、又はデキストランなどのポリマー支持体、ならびにガラス、金属、又は炭素系材料などの無機支持体が含まれる。これらの材料は、多くの場合、大きな表面対体積比、ならびに固定化酵素の付着及び活性を促進する特殊化された表面で製造される。酵素は、共有結合、イオン又は疎水性相互作用を介してこれらの固体支持体に固定され得る。酵素はまた、固体支持体、ほとんどの場合ポリヒスチジン配列に親和性を有する別のタンパク質又はペプチド配列への共有結合融合など、遺伝子操作された相互作用によって固定され得る。酵素は、表面又は表面コーティングに直接固定され得るか、又は表面又は表面コーティング上に既に存在する他のタンパク質に固定され得る。酵素は、すべてが１つの担体に、個々の担体に、又は２つの組み合わせ（例えば、担体あたり２つの酵素が固定され、次いでそれらの担体が混合される）に固定化することができる。これらのバリエーションを均一に又は定義された層で混合して、連続方法におけるターンオーバーを最適化することができる。例えば、反応器の開始時には、高い初期Ｇ１Ｐ増加を確実にするためにαＧＰの層を有することができる。酵素は、すべてが１つの担体上に、個々の担体上に、又はグループで固定化され得る。これらの酵素を均一に又は定義された層もしくはゾーンで混合して、ターンオーバーを最適化してもよい。
【0088】
本発明による方法の各々は、反応全体の非常に好ましい平衡定数により、高収率を達成することができる。理論的には、出発物質がリン酸化中間体に完全に変換される場合、最大９９％の収率が達成され得る。
【0089】
本発明の方法は、低コストの出発材料を使用し、原料及び生成物分離に関連するコストを低減することによって製造コストを低減する。デンプン及びその誘導体は、例えばラクトースよりも安価な原料である。ヘキソースをラクトースから製造する場合、グルコースと他のヘキソースをクロマトグラフィーを介して分離するため、製造コストが高くなる。また、ホスファターゼによってヘキソースを脱リン酸化するステップは、原料にかかわらず、不可逆的なホスファターゼ反応である。したがって、後続の生成物分離コストを効果的に最小限に抑えながら、ヘキソースが非常に高い収率で製造される。
【0090】
本発明による方法は、ヘキソースの容易な回収を可能にし、分離コストが最小限に抑えられる。本発明のいくつかの好ましい方法では、所望のヘキソースの回収はクロマトグラフィー分離なしで行われる。連続反応でヘキソースを生成した後には、生成物を精密濾過、イオン交換（カチオン、次いでアニオン、研磨用の可能な混合床）、濃縮、結晶化、結晶単離、及び乾燥に通す。ヘキソースの収率が高いため、ヘキソースを精製するために必要なのは結晶化のステップだけである。結晶化の前にヘキソースをさらに精製するために、ナノ濾過を使用して結晶化方法に酵素が存在するリスクを排除し、ヘキソースと共結晶化するか又は母液の再利用可能性を制限し得る未変換デキストリンを除去することができる（マルトデキストリン、マルトテトラオース、マルトトリオース、マルトースなど）。
【0091】
本発明の改善された方法はまた、スクロース、デンプンもしくはデンプン誘導体、又はセルロースもしくはセルロース誘導体からのＧ６Ｐの製造を含む。本発明の方法から製造されたＧ６Ｐは、例えばクロマトグラフィーなどの当技術分野で公知の技術によって単離及び精製することができる。
【0092】
例
以下の例は、より高い活性を有する酵素を使用する改善された方法を記載する。
以下の例は、より高い活性を有する酵素を使用する改善された方法を記載する。
【0093】
材料及び方法
【0094】
グルコース１－リン酸、塩化マグネシウム、マルトデキストリンＤＥ４－７、リン酸ナトリウム（一塩基性及び二塩基性）を含むすべての化学物質は、試薬グレード以上であり、特に明記しない限り、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（米国ミズーリ州セントルイス）又はＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（米国ペンシルベニア州ピッツバーグ）から購入した。マルトトリオースは、Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ（英国バークシャー）から購入した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州セントルイス）を組換えタンパク質発現のための宿主細胞として使用した。５０ｍｇのＬ－１カナマイシンを含むＺＹＭ－５０５２培地を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞増殖及び組換えタンパク質発現に使用した。
【0095】
組換え酵素の製造及び精製
【0096】
タンパク質発現プラスミド（ｐＥＴ２８ａ）を有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）株を、５０ｍｇ Ｌ－１カナマイシンを含有する１００ｍＬのＺＹＭ－５０５２培地を含む１Ｌ三角フラスコ中でインキュベートした。細胞を、２２０ｒｐｍで回転振盪しながら３０℃で１６～２４時間増殖させた。細胞を１２℃での遠心分離によって回収し、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）を含む、３００ｍＭのＮａＣｌ及び５ｍＭのイミダゾールを含む、いずれかの２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）で１回洗浄した（Ｎｉ精製）。細胞ペレットを同じ緩衝液に再懸濁し、超音波処理によって溶解した。遠心分離後、上清中の標的タンパク質を標準的な方法によって精製した。Ｈｉｓタグ化タンパク質を、先に記載された緩衝液中でイマダゾールを増加させる勾配を用いてＰｒｏｆｉｎｉｔｙ ＩＭＡＣ Ｎｉ－Ｃｈａｒｇｅｄ Ｒｅｓｉｎ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）によって精製した。組換えタンパク質の純度を、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって調べた。
【0097】
例１ より高い活性のＰＧＭを有する改善された方法
【0098】
様々なホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）を単離し、多段階酵素反応でＧ１ＰからＧ６Ｐへの変換についてアッセイした。各ＰＧＭの相対活性を以下のようにして測定した。５０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．２、５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのグルコース１－リン酸、０．０２ｇ／ＬのＰＧＭ、０．１ｇ／ＬのＰＧＩ、及び０．１ｇ／ＬのＦ６ＰＰの反応物を調製し、５０℃で３０分間インキュベートした。Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２濃縮器（１万 ＭＷＣＯ）を用いた酵素の濾過によって反応を停止した。生成物であるフルクトースを、Ｈｉ－Ｐｌｅｘ Ｈ＋カラム及び屈折率検出器を使用して評価した。試料を５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４中、０．６ｍＬ／分で、６５℃で１５．５分間評価した。３０分で生成されたフルクトースの量を使用して、酵素的方法における各ＰＧＭの相対効率を決定した。フルクトースのピーク面積及びピーク高さの増加の平均を使用して、活性の増加を決定した。
【0099】
図１９は、様々なＰＧＭの活性を示すクロマトグラムである。クロマトグラムは、様々なＰＧＭ、過剰なホスホグルコイソメラーゼ及び過剰なフルクトース６－リン酸ホスファターゼとのインキュベーション後のグルコース１－リン酸から作られたフルクトースのレベルを示す。ＰＧＭはカスケードの制限酵素である。表１は、本発明の改善された方法で使用するためのＰＧＭが、テルモコックス・コダカラエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒａｅｎｓｉｓ）由来の先に開示されたＰＧＭ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ６８ＢＪ６）と比較して改善された活性を有することを示す。国際公開第２０１７／０５９２７８号を参照されたい。
【表1】
【0100】
例２ より高い活性のαＧＰを有する改善された方法
【0101】
各αＧＰの相対活性を以下のようにして測定した。２５ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．２、５ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｇ／ＬのマルトデキストリンＤＥ４－７、９μｇのαＧＰ、及び０．１ｇ／ＬのＰＧＭの２００μＬ反応液を調製し、５０℃でインキュベートした。試料を様々な時点で１．５ｍＭのＮＡＤ＋及び３Ｕ／ｍＬのグルコース６－リン酸デヒドロゲナーゼと混合した。各時点での３４０ｎｍでの吸光度を用いて反応速度を得た。この速度を使用して各αＧＰの比活性を確認し、相対活性比較のために使用した。
【0102】
表２は、本発明の改善された方法で使用するためのαＧＰが、テルモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）由来の先に開示されたαＧＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｇ４ＦＥＨ８）と比較して改善された活性を有することを示す。国際公開第２０１７／０５９２７８号を参照されたい。
【表2】
【0103】
例３ より高い活性の４ＧＴを有する改善された方法
【0104】
各４ＧＴの相対活性を以下のようにして測定した。５０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．２、５ｍＭのＭｇＣｌ２、２０ｇ／Ｌのマルトトリオース、及び９μｇの４ＧＴの２００μＬ反応液を調製し、５０℃でインキュベートした。様々な時点で、試料を１．５ｍＭのＮＡＤ＋、１ｍＭのＡＴＰ、１Ｕ／ｍＬのヘキソキナーゼ、及び１Ｕ／ｍＬのグルコース６－リン酸デヒドロゲナーゼと混合した。各時点での３４０ｎｍでの吸光度を用いて反応速度を得た。この速度を使用して各４ＧＴの比活性を確認し、相対活性比較のために使用した。
【0105】
表３は、本発明の改善された方法で使用するための４ＧＴが、テルモコックス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来の先に開示された４ＧＴ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｏ３２４６２）と比較して改善された活性を有することを示す。国際公開第２０１８／１６９９５７号を参照されたい。
【表3】
【0106】
例４ より高い活性のＳＰを有する改善された方法
【0107】
Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｄ９ＴＴ０９との相同性（Ｖｅｒｈａｅｇｈｅら「熱安定性スクロースホスホリラーゼの探求により、新規な特異性としてのスクロース６’－リン酸ホスホリラーゼを示す（Ｔｈｅ ｑｕｅｓｔ ｆｏｒ ａ ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ｓｕｃｒｏｓｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ｒｅｖｅａｌｓ ｓｕｃｒｏｓｅ ６’－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）」Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４ Ａｕｇ；９８（１６）：７０２７－３７）によって想定される様々なスクロースホスホリラーゼを単離し、スクロースからグルコース６－リン酸への変換についてアッセイした。
【0108】
各ＳＰの相対効率を以下のようにして測定した。２５ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．２、５ｍＭのＭｇＣｌ２、２００ｇ／Ｌのスクロース、０．１５ｇ／ＬのＳＰ、０．１ｇ／ＬのＰＧＭ、０．１ｇ／ＬのＰＧＩ、及び０．３ｇ／ＬのＦ６ＰＰの反応物を調製し、５０℃でインキュベートした。試料を０時間、２時間、６時間、及び８時間で採取した。Ｖｉｖａｓｐｉｎ ２濃縮器（１万 ＭＷＣＯ）を用いた酵素の濾過によって反応を停止した。生成物であるフルクトースを、Ｓｕｐｅｌ Ｃｏｇｅｌ Ｐｂカラム及び屈折率検出器を使用して評価した。試料を超純水中、０．６ｍＬ／分で、８０℃で２５分間評価した。２時間で作られたフルクトースの量を使用して、各ＳＰの相対活性を決定する。６時間で作られたフルクトースの量（８時間で完了確認）は、各ＳＰの最大達成可能収率の差を示す。
【0109】
スクロースからフルクトースへの完全な変換に対する効果も調べた。 基準（以下の表）と比較して試験した８つの酵素のうち、７つはＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｄ９ＴＴ０９よりも改善された活性を示し、１つはスクロースからフルクトースを製造する場合の予想外の利点を示す。 図１８は、Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｄ９ＴＴ０９（基準ＳＰ）をＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｆ６ＢＪＳ０と比較した、スクロースホスホリラーゼ活性のクロマトグラムを示す。 ２時間で、より高い活性のＳＰは、基準ＳＰとしてのフルクトースの量の約１５０％を生成する。下部クロマトグラムは、最大収率に関してＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｄ９ＴＴ０９（基準ＳＰ）をＵｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｆ６ＢＪＳ０と比較する。 ６時間（両方の反応の最大収率）で、より高い活性のＳＰは、基準ＳＰとしてのフルクトースの量の約１３０％を生成する。興味深いことに、相対収率は相対活性と直接相関しない。 おそらく、寄与因子には、フルクトースによるスクロースホスホリラーゼの生成物阻害、逆反応の速度（Ｇ１Ｐ＋フルクトース⇔スクロース＋Ｐｉ）、より広くは反応の後期段階におけるフルクトースの形成とフルクトースの分解との間の平衡が含まれる。 配列番号２６に示されるアミノ酸配列を有するテルマナエロスリクス・ダキセンシス（Ｔｈｅｒｍａｎａｅｒｏｔｈｒｉｘ ｄａｘｅｎｓｉｓ）由来の比較ＳＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ０Ｎ８ＧＰＺ６）は、先に開示されたＳＰと比較してより低い相対活性及びより低いフルクトースの最大収率を示した。
【表4】
【0110】
例５ Ｇ６Ｐの改善された酵素的製造
【0111】
酵素活性の改善を可視化するために、マルトデキストリンのＧ６Ｐへの変換を、先に開示されたαＧＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｇ４ＦＥＨ８）及びＰＧＭ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ６８ＢＪ６）を使用して行い、その方法を、より高い活性を有するαＧＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｄ１Ｂ９２６）及びＰＧＭ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ１５０ＬＬＺ１）を使用する方法と比較した。 ２０ｇ／ＬのマルトデキストリンＤＥ５、５０ｍＭのリン酸緩衝液ｐＨ７．２、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０５ｇ／ＬのαＧＰ、及び０．００５ｇ／ＬのＰＧＭを含有する２００μＬの反応混合物を５０℃で３０分間インキュベートした。酵素をＶｉｖａｓｐｉｎ ２濃縮器（３万 ＭＷＣＯ）で濾過することによって反応を停止させ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｈｉ－Ｐｌｅｘ Ｈ－カラム及び屈折率検出器を使用してＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズ）によって分析した。 試料を５ｍＭ Ｈ２ＳＯ４中、０．６ｍＬ／分で、６５℃で１５．５分間評価した。 ボイド、マルトデキストリン、及びＧ６Ｐのピークが近すぎて個々の成分を確実に定量することができないため、結果は定量されなかったが（図１７）、酵素αＧＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｄ１Ｂ９２６）及びＰＧＭ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ａ０Ａ１５０ＬＬＺ１）を用いて明らかにより多くのＧ６Ｐが生成される。
【配列表フリーテキスト】
【0112】
配列表１０ ＜２２３＞Ｘａａは任意の自然発生アミノ酸であり得る
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18-1】
【図18-2】
【図19】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-05-13
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
デンプン又はデンプン誘導体からヘキソースを酵素的に製造するための改善された方法であって、該改善された方法は、
ａ）ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される、グルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）をグルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）に変換するステップであって、該ＰＧＭは、配列番号８又は２～７のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
該ＰＧＭは、該改善された方法においてテルモコックス・コダカラエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｏｅｎｓｉｓ）由来のＰＧＭ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ６８ＢＪ６）の活性と比較して少なくとも１０％高い活性を有する、
上記ステップ
を含む、改善された方法。
ａ）ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される、グルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）をグルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）に変換するステップであって、該ＰＧＭは、配列番号８又は２～７のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
該ＰＧＭは、該改善された方法においてテルモコックス・コダカラエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｏｅｎｓｉｓ）由来のＰＧＭ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ６８ＢＪ６）の活性と比較して少なくとも１０％高い活性を有する、
上記ステップ
を含む、改善された方法。
【請求項2】
前記改善された方法が、
ｂ）α－グルカンホスホリラーゼ（ａＧＰ）によって触媒される、デンプン誘導体をＧ１Ｐに変換するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
ｂ）α－グルカンホスホリラーゼ（ａＧＰ）によって触媒される、デンプン誘導体をＧ１Ｐに変換するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記改善された方法が、
ｃ）４－α－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）によって触媒される、デンプン誘導体をトランスグリコシル化するステップを更に含む、請求項２に記載の方法。
ｃ）４－α－グルカントランスフェラーゼ（４ＧＴ）によって触媒される、デンプン誘導体をトランスグリコシル化するステップを更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
セルロース又はセルロース誘導体からヘキソースを酵素的に製造するための改善された方法であって、
該改善された方法は、ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される、Ｇ１Ｐをグルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）に変換するステップであって、該ＰＧＭは、配列番号８又は２～７のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
該ＰＧＭは、該改善された方法においてテルモコックス・コダカラエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｏｅｎｓｉｓ）由来のＰＧＭ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ６８ＢＪ６）の活性と比較して少なくとも１０％高い活性を有する、
上記ステップ
を含む、改善された方法。
該改善された方法は、ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される、Ｇ１Ｐをグルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）に変換するステップであって、該ＰＧＭは、配列番号８又は２～７のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
該ＰＧＭは、該改善された方法においてテルモコックス・コダカラエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｏｅｎｓｉｓ）由来のＰＧＭ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ６８ＢＪ６）の活性と比較して少なくとも１０％高い活性を有する、
上記ステップ
を含む、改善された方法。
【請求項5】
スクロースからヘキソースを酵素的に製造するための改善された方法であって、該改善された方法は、
ａ）ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される、グルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）をグルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）に変換するステップであって、該ＰＧＭが、配列番号８、又は２～７のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
該ＰＧＭは、該改善された方法においてテルモコックス・コダカラエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｏｅｎｓｉｓ）由来のＰＧＭ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ６８ＢＪ６）の活性と比較して少なくとも１０％高い活性を有する、
上記ステップ、及び
ｂ）スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）を用いてスクロースをグルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）に変換するステップを含む、
改善された方法。
ａ）ホスホグルコムターゼ（ＰＧＭ）によって触媒される、グルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）をグルコース６－リン酸（Ｇ６Ｐ）に変換するステップであって、該ＰＧＭが、配列番号８、又は２～７のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、
該ＰＧＭは、該改善された方法においてテルモコックス・コダカラエンシス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｋｏｄａｋａｒｏｅｎｓｉｓ）由来のＰＧＭ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｑ６８ＢＪ６）の活性と比較して少なくとも１０％高い活性を有する、
上記ステップ、及び
ｂ）スクロースホスホリラーゼ（ＳＰ）を用いてスクロースをグルコース１－リン酸（Ｇ１Ｐ）に変換するステップを含む、
改善された方法。
【請求項6】
ヘキソースが、アロース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、アルトロース、タロース、ソルボース、グロース、イドース、アルロース、イノシトール及びタガトースからなる群から選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の改善された方法。
【請求項7】
デンプン誘導体が、アミロース、アミロペクチン、可溶性デンプン、アミロデキストリン、マルトトリオース、マルトース及びマルトデキストリンからなる群から選択される、請求項１に記載の改善された方法。
【請求項8】
ヘキソースリン酸ホスファターゼを使用してヘキソースリン酸を脱リン酸化するステップをさらに含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の改善された方法。
【請求項9】
前記方法のステップが、単一の反応容器内で行われる、請求項８に記載の改善された方法。
【請求項10】
前記方法のステップが、ＡＴＰを含まず（ＡＴＰ－ｆｒｅｅ）、ＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）を含まず（ＮＡＤ（Ｐ）（Ｈ）－ｆｒｅｅ）に、０．１ｍＭ～１５０ｍＭのリン酸濃度で行われ、リン酸塩は再利用され、及び／又はヘキソースリン酸を脱リン酸化するステップは、エネルギー的に好適な化学反応を伴う、請求項９に記載の改善された方法。
【請求項11】
前記方法のステップが、
３７℃～８５℃の範囲の温度、
５．０～８．０の範囲のｐＨ、又は
０．５時間～４８時間、もしくは連続反応として、
のうちの少なくとも１つの方法条件下で行われる、
請求項１～１０のいずれか一項に記載の改善された方法。
３７℃～８５℃の範囲の温度、
５．０～８．０の範囲のｐＨ、又は
０．５時間～４８時間、もしくは連続反応として、
のうちの少なくとも１つの方法条件下で行われる、
請求項１～１０のいずれか一項に記載の改善された方法。
【請求項12】
ヘキソースをその糖アルコールに還元するステップをさらに含む、請求項６に記載の改善された方法。
【請求項13】
ａＧＰは、配列番号１１、１０、１２及び１３のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつテルモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）由来のａＧＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｇ４ＦＥＨ８）の活性と比較して少なくとも１０％高い活性を有する、請求項２に記載の改善された方法。
【請求項14】
４ＧＴは、配列番号１７、１５及び１６のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつテルモコックス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来の４ＧＴ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｏ３２４６２）の活性と比較して少なくとも１０％高い活性を有する、請求項３に記載の改善された方法。
【請求項15】
ＳＰは、配列番号２３、１９～２２、及び２４～２５のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつテルモアナエロバクテリウム・テルモサッカロリティクム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来のＳＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｄ９ＴＴ０９）と比較して少なくとも１０％高い活性を有する、請求項５に記載の改善された方法。
【請求項16】
ＳＰは、配列番号２３、１９～２２、及び２４～２５のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、かつテルモアナエロバクテリウム・テルモサッカロリティクム（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）由来のＳＰ（Ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｄ９ＴＴ０９）と比較して少なくとも１０％高い達成可能な収率を有する、請求項５に記載の改善された方法。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
【外国語明細書】