知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024096518
(43)【公開日】2024-07-16
(54)【発明の名称】操作されたＴＧＦＢＲＩＩバリアント及びその使用方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20240708BHJP
C07K 14/705 20060101ALI20240708BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240708BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240708BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240708BHJP
C12P 21/00 20060101ALI20240708BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240708BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240708BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240708BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20240708BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240708BHJP
C07K 14/495 20060101ALN20240708BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20240708BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20240708BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12
C07K14/705 ZNA
C07K19/00
C12N15/63 Z
C12N5/10
C12P21/00 C
A61P35/00
A61P35/02
A61K48/00
A61K38/16
A61K39/395 E
A61K39/395 D
C07K14/495
C12N15/13
C12N15/62 Z
【審査請求】未請求
【請求項の数】50
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2023197259
(22)【出願日】2023-11-21
(31)【優先権主張番号】63/436,822
(32)【優先日】2023-01-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】523440260
【氏名又は名称】エフビーデー バイオロジクス リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100102978
【弁理士】
【氏名又は名称】清水 初志
(74)【代理人】
【識別番号】100205707
【弁理士】
【氏名又は名称】小寺 秀紀
(74)【代理人】
【識別番号】100160923
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 裕孝
(74)【代理人】
【識別番号】100119507
【弁理士】
【氏名又は名称】刑部 俊
(74)【代理人】
【識別番号】100142929
【弁理士】
【氏名又は名称】井上 隆一
(74)【代理人】
【識別番号】100148699
【弁理士】
【氏名又は名称】佐藤 利光
(74)【代理人】
【識別番号】100188433
【弁理士】
【氏名又は名称】梅村 幸輔
(74)【代理人】
【識別番号】100128048
【弁理士】
【氏名又は名称】新見 浩一
(74)【代理人】
【識別番号】100129506
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 智彦
(74)【代理人】
【識別番号】100114340
【弁理士】
【氏名又は名称】大関 雅人
(74)【代理人】
【識別番号】100214396
【弁理士】
【氏名又は名称】塩田 真紀
(74)【代理人】
【識別番号】100121072
【弁理士】
【氏名又は名称】川本 和弥
(74)【代理人】
【識別番号】100221741
【弁理士】
【氏名又は名称】酒井 直子
(74)【代理人】
【識別番号】100114926
【弁理士】
【氏名又は名称】枝松 義恵
(72)【発明者】
【氏名】ワン ジインタン
(72)【発明者】
【氏名】クオ パンシェン
(72)【発明者】
【氏名】チュオ ゾン シェン
(72)【発明者】
【氏名】ツェン チーリン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG20
4B064AG26
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE12
4B064DA01
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065CA24
4B065CA44
4C084AA02
4C084AA07
4C084AA13
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA21
4C084BA23
4C084CA53
4C084MA55
4C084MA65
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZB271
4C084ZB272
4C085AA13
4C085BB36
4C085BB42
4C085CC22
4C085DD62
4C085GG02
4C085GG03
4C085GG04
4C085GG05
4C085GG06
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA09
4H045BA41
4H045CA30
4H045DA51
4H045DA75
4H045EA20
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】 （修正有）
【課題】限定された毒性でＴＧＦβＲＩＩ経路を標的とするがん療法を提供する。
【解決手段】特定の配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記特定の配列のＳ４９及びＤ１１８に対応する位置に１つ以上のアミノ酸変異を含む、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドを提供する。また、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、又は操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドを含むタンパク質構築物を産生する方法を提供する。さらに、がんを有する対象を治療する方法であって、治療有効量の、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド又はタンパク質構築物を含む組成物を、対象に投与することを含む、方法を提供する。
【選択図】なし
【解決手段】特定の配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記特定の配列のＳ４９及びＤ１１８に対応する位置に１つ以上のアミノ酸変異を含む、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドを提供する。また、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、又は操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドを含むタンパク質構築物を産生する方法を提供する。さらに、がんを有する対象を治療する方法であって、治療有効量の、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド又はタンパク質構築物を含む組成物を、対象に投与することを含む、方法を提供する。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号７と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号７のＳ４９及びＤ１１８に対応する位置に１つ以上のアミノ酸変異を含む、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド。
【請求項2】
（ａ）配列番号７のＳ４９に対応するアミノ酸が、Ｇ、Ａ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｋ、Ｑ、Ｅ、Ｐ、Ｖ、Ｉ、Ｃ、Ｙ、Ｈ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、又はＴであること、及び
（ｂ）配列番号７のＤ１１８に対応するアミノ酸が、Ｇ、Ａ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｋ、Ｑ、Ｅ、Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｉ、Ｃ、Ｙ、Ｈ、Ｒ、Ｎ、又はＴであること
のうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド。
（ｂ）配列番号７のＤ１１８に対応するアミノ酸が、Ｇ、Ａ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｋ、Ｑ、Ｅ、Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｉ、Ｃ、Ｙ、Ｈ、Ｒ、Ｎ、又はＴであること
のうちの１つ以上を含む、請求項１に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド。
【請求項3】
配列番号７のＳ４９に対応するアミノ酸が、Ｅ又はＱである、請求項１又は２に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド。
【請求項4】
配列番号７のＤ１１８に対応するアミノ酸が、Ｅである、請求項１～３のいずれか一項に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド。
【請求項5】
配列番号７のＳ４９に対応するアミノ酸が、Ｅである、請求項１～４のいずれか一項に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド。
【請求項6】
配列番号７の３２位に対応するアミノ酸が、Ｄである、請求項１～４のいずれか一項に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド。
【請求項7】
配列番号７の１１９位に対応するアミノ酸が、Ｅである、請求項１～６のいずれか一項に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド。
【請求項8】
配列番号７～１２のいずれか１つと少なくとも８５％、９０％、９５％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド。
【請求項9】
配列番号８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド。
【請求項10】
配列番号９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド。
【請求項11】
配列番号１０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド。
【請求項12】
配列番号１１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド。
【請求項13】
配列番号１２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド。
【請求項14】
前記操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドとＴＧＦβ１との間のオフレートが、野生型ＴＧＦβＲＩＩとＴＧＦβ１との間のオフレートよりも低い、請求項１～１３のいずれか一項に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド。
【請求項15】
前記操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドとＴＧＦβ３との間のオフレートが、野生型ＴＧＦβＲＩＩとＴＧＦβ３との間のオフレートよりも低い、請求項１～１４のいずれか一項に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド。
【請求項16】
ＴＧＦβ２に結合しない、請求項１～１５のいずれか一項に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド。
【請求項17】
ＴＧＦβ１におけるＲ９４、Ｒ２５、Ｋ３７、及び／又はＫ３１と相互作用する、請求項１～１６のいずれか一項に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド。
【請求項18】
ＴＧＦβ３におけるＲ９４、Ｒ２５、Ｋ３７、及び／又はＫ３１と相互作用する、請求項１～１７のいずれか一項に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド。
【請求項19】
水素結合相互作用を介して、ＴＧＦβ１におけるＲ９４、Ｒ２５、Ｋ３７、及び／又はＫ３１と相互作用する、請求項１～１８のいずれか一項に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド。
【請求項20】
水素結合相互作用を介して、ＴＧＦβ３におけるＲ９４、Ｒ２５、Ｋ３７、及び／又はＫ３１と相互作用する、請求項１～１９のいずれか一項に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド。
【請求項21】
ＴＧＦβ（例えば、ＴＧＦβ１）を捕捉し得、それによって、腫瘍微小環境を改善し得る、請求項１～２０のいずれか一項に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド。
【請求項22】
ＴＧＦβ（例えば、ＴＧＦβ１）とＴＧＦβＲＩＩとの間の結合をブロックし得るか又はそれに干渉し得る、請求項１～２１のいずれか一項に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド。
【請求項23】
ＴＧＦβ（例えば、ＴＧＦβ１）と、腫瘍細胞、線維芽細胞、又は免疫細胞の表面上で発現されたＴＧＦβＲＩＩとの間の結合をブロックし得るか又はそれに干渉し得る、請求項１～２２のいずれか一項に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド。
【請求項24】
ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを更に含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド。
【請求項25】
ヒンジ領域を更に含む、請求項２４に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド。
【請求項26】
前記ＣＨ２ドメインが、ＩｇＧ ＣＨ２ドメインであり、前記ＣＨ３ドメインが、ＩｇＧ ＣＨ３ドメインである、請求項２４又は２５に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド。
【請求項27】
任意選択でリンカー配列を通して、（ａ）前記ヒンジ領域若しくはＣＨ２ドメインのＮ末端、又は（ｂ）前記ＣＨ３ドメインのＣ末端のいずれかに連結されている、請求項２４～２６のいずれか一項に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド。
【請求項28】
配列番号１～６のいずれか１つと同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２４～２７のいずれか一項に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド。
【請求項29】
請求項１～２８のいずれか一項に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドを含む、タンパク質構築物。
【請求項30】
２つ以上の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドを含む、請求項２９に記載のタンパク質構築物。
【請求項31】
前記操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドのうちの少なくとも２つが同一である、請求項３０に記載のタンパク質構築物。
【請求項32】
前記操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドのうちの少なくとも２つが異なる、請求項３０に記載のタンパク質構築物。
【請求項33】
Ｆｃ領域を更に含む、請求項２９～３２のいずれか一項に記載のタンパク質構築物。
【請求項34】
前記Ｆｃ領域が、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域である、請求項３３に記載のタンパク質構築物。
【請求項35】
前記Ｆｃ領域が、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域（例えば、ＬＡＬＡ変異又はＬＡＬＡ－ＰＧ変異を有する）である、請求項３４に記載のタンパク質構築物。
【請求項36】
前記操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドが、前記Ｆｃ領域のＣ末端に連結されている、請求項３３～３５のいずれか一項に記載のタンパク質構築物。
【請求項37】
前記操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドが、ペプチドリンカーを介して前記Ｆｃ領域のＣ末端に連結されている、請求項３３～３５のいずれか一項に記載のタンパク質構築物。
【請求項38】
請求項１～２８のいずれか一項に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、第１のＣＨ２ドメイン、及び第１のＣＨ３ドメインを含む、第１の融合ポリペプチドと、
第２のＣＨ２ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインを含む、第２の融合ポリペプチドと
を含み、
前記第１の融合ポリペプチド及び前記第２の融合ポリペプチドが、互いに会合し、二量体を形成する、
タンパク質構築物。
第２のＣＨ２ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインを含む、第２の融合ポリペプチドと
を含み、
前記第１の融合ポリペプチド及び前記第２の融合ポリペプチドが、互いに会合し、二量体を形成する、
タンパク質構築物。
【請求項39】
前記第２の融合ポリペプチドが、第２の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドを更に含む、請求項３８に記載のタンパク質構築物。
【請求項40】
請求項１～２８のいずれか一項に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド又は請求項２９～３９のいずれか一項に記載のタンパク質構築物と、
薬学的に許容される担体と
を含む、医薬組成物。
薬学的に許容される担体と
を含む、医薬組成物。
【請求項41】
請求項１～２８のいずれか一項に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド又は請求項２９～３９のいずれか一項に記載のタンパク質構築物をコードする、核酸。
【請求項42】
請求項４１に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項43】
請求項４１に記載の核酸又は請求項４２に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項44】
ＣＨＯ細胞である、請求項４３に記載の細胞。
【請求項45】
操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、又は前記操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドを含むタンパク質構築物を産生する方法であって、
（ａ）請求項４３又は４４に記載の細胞を、前記細胞が前記操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド又は前記タンパク質構築物を産生するのに十分な条件下で培養することと、
（ｂ）前記細胞によって産生された前記操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド又は前記タンパク質構築物を収集することと
を含む、前記方法。
（ａ）請求項４３又は４４に記載の細胞を、前記細胞が前記操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド又は前記タンパク質構築物を産生するのに十分な条件下で培養することと、
（ｂ）前記細胞によって産生された前記操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド又は前記タンパク質構築物を収集することと
を含む、前記方法。
【請求項46】
がんを有する対象を治療する方法であって、
治療有効量の、請求項１～２８のいずれか一項に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド又は請求項２９～３９のいずれか一項に記載のタンパク質構築物を含む組成物を、前記対象に投与することを含む、前記方法。
治療有効量の、請求項１～２８のいずれか一項に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド又は請求項２９～３９のいずれか一項に記載のタンパク質構築物を含む組成物を、前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項47】
前記対象が、固形腫瘍又は血液がんを有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項48】
前記がんが、乳がん、卵巣がん、神経膠腫、結腸がん、肝細胞がん、前立腺がん、腎細胞がん、黒色腫、肺がん、膵臓がん、又は肝がんである、請求項４６に記載の方法。
【請求項49】
腫瘍増殖の速度を減少させる方法であって、
腫瘍細胞を、有効量の、請求項１～２８のいずれか一項に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド又は請求項２９～３９のいずれか一項に記載のタンパク質構築物を含む組成物と接触させることを含む、前記方法。
腫瘍細胞を、有効量の、請求項１～２８のいずれか一項に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド又は請求項２９～３９のいずれか一項に記載のタンパク質構築物を含む組成物と接触させることを含む、前記方法。
【請求項50】
腫瘍細胞を死滅させる方法であって、
腫瘍細胞を、有効量の、請求項１～２８のいずれか一項に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド又は請求項２９～３９のいずれか一項に記載のタンパク質構築物を含む組成物と接触させることを含む、前記方法。
腫瘍細胞を、有効量の、請求項１～２８のいずれか一項に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド又は請求項２９～３９のいずれか一項に記載のタンパク質構築物を含む組成物と接触させることを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０２３年１月３日に出願された、米国仮特許出願第６３／４３６，８２２号に対する優先権及びその利益を主張する。
本開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０２３年１月３日に出願された、米国仮特許出願第６３／４３６，８２２号に対する優先権及びその利益を主張する。
【0002】
配列表
本出願は、５２２４６－００１１ＷＯ１＿ＳＬ＿ＳＴ２６．ｘｍｌと名付けられたＸＭＬファイルとして電子的に提出された配列表を含む。２０２３年１０月４日に作成されたＸＭＬファイルは、サイズが１９，３３１バイトである。ＸＭＬファイル中の資料は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、５２２４６－００１１ＷＯ１＿ＳＬ＿ＳＴ２６．ｘｍｌと名付けられたＸＭＬファイルとして電子的に提出された配列表を含む。２０２３年１０月４日に作成されたＸＭＬファイルは、サイズが１９，３３１バイトである。ＸＭＬファイル中の資料は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0003】
技術分野
本開示は、操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント、及びその使用方法に関する。
本開示は、操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント、及びその使用方法に関する。
【背景技術】
【0004】
２型ＴＧＦベータ受容体（ＴＧＦΒＲ２、ＴＧＦβＲＩＩ、又はＴβＲＩＩ）は、ＴＧＦ－βファミリーの全てのメンバーのリガンド結合受容体であり、線維芽細胞を含む事実上全ての細胞型において発現される。
【0005】
トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）βシグナル伝達経路は、増殖、分化、接着、運動性及びアポトーシスを含む多くの細胞プロセスに関与する。これらの機能は、悪性細胞において頻繁に破壊され、ＩＩ型ＴＧＦβ受容体（ＴＧＦβＲＩＩ）は、その後、腫瘍抑制遺伝子（ＴＳＧ）であることが実証された。ＴＧＦβシグナル伝達経路は、正常細胞においてＴＳＧとしてのその役割に則して強力な増殖阻害を媒介し、がん細胞は、遺伝子機構及びエピジェネティック機構の両方を使用して、ＴＧＦβＲＩＩを不活性化する。
【0006】
正常細胞及びがん細胞の両方におけるその役割を考慮すると、限定された毒性でＴＧＦβＲＩＩ経路を標的とするがん療法を開発することの必要性が存在する。
【発明の概要】
【0007】
本開示は、操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント、及びその使用方法に関する。
【0008】
一態様では、本開示は、配列番号７と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号７のＳ４９及びＤ１１８に対応する位置に１つ以上のアミノ酸変異を含む、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドに関する。
【0009】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、
（ａ）配列番号７のＳ４９に対応するアミノ酸が、Ｇ、Ａ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｋ、Ｑ、Ｅ、Ｐ、Ｖ、Ｉ、Ｃ、Ｙ、Ｈ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、又はＴであること、及び
（ｂ）配列番号７のＤ１１８に対応するアミノ酸が、Ｇ、Ａ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｋ、Ｑ、Ｅ、Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｉ、Ｃ、Ｙ、Ｈ、Ｒ、Ｎ、又はＴであること
のうちの１つ以上を含む。
（ａ）配列番号７のＳ４９に対応するアミノ酸が、Ｇ、Ａ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｋ、Ｑ、Ｅ、Ｐ、Ｖ、Ｉ、Ｃ、Ｙ、Ｈ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、又はＴであること、及び
（ｂ）配列番号７のＤ１１８に対応するアミノ酸が、Ｇ、Ａ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｋ、Ｑ、Ｅ、Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｉ、Ｃ、Ｙ、Ｈ、Ｒ、Ｎ、又はＴであること
のうちの１つ以上を含む。
【0010】
いくつかの実施形態では、配列番号７のＳ４９に対応するアミノ酸は、Ｅ又はＱである。
【0011】
いくつかの実施形態では、配列番号７のＤ１１８に対応するアミノ酸は、Ｅである。
【0012】
いくつかの実施形態では、配列番号７のＳ４９に対応するアミノ酸は、Ｅである。
【0013】
いくつかの実施形態では、配列番号７の３２位に対応するアミノ酸は、Ｄである。
【0014】
いくつかの実施形態では、配列番号７の１１９位に対応するアミノ酸は、Ｅである。
【0015】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、配列番号７～１２のいずれか１つと少なくとも８５％、９０％、９５％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0016】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、配列番号８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0017】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、配列番号９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0018】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0019】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0020】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【0021】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドとＴＧＦβ１との間のオフレートは、野生型ＴＧＦβＲＩＩとＴＧＦβ１との間のオフレートよりも低い。
【0022】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドとＴＧＦβ３との間のオフレートは、野生型ＴＧＦβＲＩＩとＴＧＦβ３との間のオフレートよりも低い。
【0023】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、ＴＧＦβ２に結合しない。
【0024】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、ＴＧＦβ１におけるＲ９４、Ｒ２５、Ｋ３７、及び／又はＫ３１と相互作用する。
【0025】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、ＴＧＦβ３におけるＲ９４、Ｒ２５、Ｋ３７、及び／又はＫ３１と相互作用する。
【0026】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、水素結合相互作用を介して、ＴＧＦβ１におけるＲ９４、Ｒ２５、Ｋ３７、及び／又はＫ３１と相互作用する。
【0027】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、水素結合相互作用を介して、ＴＧＦβ３におけるＲ９４、Ｒ２５、Ｋ３７、及び／又はＫ３１と相互作用する。
【0028】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、ＴＧＦβ（例えば、ＴＧＦβ１）を捕捉し得、それによって、腫瘍微小環境を改善し得る。
【0029】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、ＴＧＦβ（例えば、ＴＧＦβ１）とＴＧＦβＲＩＩとの間の結合をブロックし得るか又はそれに干渉し得る。
【0030】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、ＴＧＦβ（例えば、ＴＧＦβ１）と、腫瘍細胞、線維芽細胞、又は免疫細胞の表面上で発現されたＴＧＦβＲＩＩとの間の結合をブロックし得るか又はそれに干渉し得る。
【0031】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを更に含む。
【0032】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、ヒンジ領域を更に含む。
【0033】
いくつかの実施形態では、ＣＨ２ドメインは、ＩｇＧ ＣＨ２ドメインであり、ＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ ＣＨ３ドメインである。
【0034】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、任意選択によりリンカー配列を通して、（ａ）ヒンジ領域若しくはＣＨ２ドメインのＮ末端、又は（ｂ）ＣＨ３ドメインのＣ末端のいずれかに連結される。
【0035】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１～６のいずれか１つと同一であるアミノ酸配列を含む。
【0036】
一態様では、本開示は、本明細書に記載される操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドを含む、タンパク質構築物に関する。
【0037】
いくつかの実施形態では、タンパク質構築物は、２つ以上の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドを含む。
【0038】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドのうちの少なくとも２つは同一である。
【0039】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドのうちの少なくとも２つは異なる。
【0040】
いくつかの実施形態では、タンパク質構築物は、Ｆｃ領域を更に含む。
【0041】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域である。
【0042】
Ｔいくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域（例えば、ＬＡＬＡ変異又はＬＡＬＡ－ＰＧ変異を有する）である。
【0043】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、Ｆｃ領域のＣ末端に連結される。
【0044】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、ペプチドリンカーを介してＦｃ領域のＣ末端に連結される。
【0045】
一態様では、本開示は、本明細書に記載される操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、第１のＣＨ２ドメイン、及び第１のＣＨ３ドメインを含む第１の融合ポリペプチドと、第２のＣＨ２ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインを含む第２の融合ポリペプチドと、を含み、第１の融合ポリペプチド及び第２の融合ポリペプチドが、互いに会合し、二量体を形成する、タンパク質構築物に関する。
【0046】
いくつかの実施形態では、第２の融合ポリペプチドは、第２の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドを更に含む。
【0047】
一態様では、本開示は、本明細書に記載される操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド又は本明細書に記載されるタンパク質構築物と、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物に関する。
【0048】
一態様では、本開示は、本明細書に記載される操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド又は本明細書に記載されるタンパク質構築物をコードする、核酸に関する。
【0049】
一態様では、本開示は、本明細書に記載される核酸を含む、ベクターに関する。
【0050】
一態様では、本開示は、本明細書に記載される核酸又は本明細書に記載されるベクターを含む、細胞に関する。
【0051】
いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＨＯ細胞である。
【0052】
一態様では、本開示は、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、又は操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドを含むタンパク質構築物を産生する方法であって、
（ａ）本明細書に記載される細胞を、細胞が操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド又はタンパク質構築物を産生するのに十分な条件下で培養することと、
（ｂ）細胞によって産生された操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド又はタンパク質構築物を収集することと
を含む、方法に関する。
（ａ）本明細書に記載される細胞を、細胞が操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド又はタンパク質構築物を産生するのに十分な条件下で培養することと、
（ｂ）細胞によって産生された操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド又はタンパク質構築物を収集することと
を含む、方法に関する。
【0053】
一態様では、本開示は、がんを有する対象を治療する方法であって、治療有効量の、本明細書に記載される操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド又は本明細書に記載されるタンパク質構築物を含む組成物を、対象に投与することを含む、方法に関する。
【0054】
いくつかの実施形態では、対象は、固形腫瘍又は血液がんを有する。
【0055】
いくつかの実施形態では、がんは、乳がん、卵巣がん、神経膠腫、結腸がん、肝細胞がん、前立腺がん、腎細胞がん、黒色腫、肺がん、膵臓がん、又は肝がんである。
【0056】
一態様では、本開示は、腫瘍増殖の速度を減少させる方法であって、腫瘍細胞を、有効量の、本明細書に記載される操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド又は本明細書に記載されるタンパク質構築物を含む組成物と接触させることを含む、方法に関する。
【0057】
一態様では、本開示は、腫瘍細胞を死滅させる方法であって、腫瘍細胞を、有効量の、本明細書に記載される操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド又は本明細書に記載されるタンパク質構築物を含む組成物と接触させることを含む、方法に関する。
【0058】
本明細書で使用される場合、「操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド」という用語は、１つ以上の変異（例えば、挿入、欠失、又は置換）を有する野生型ＴＧＦβＲＩＩポリペプチド又はその部分（例えば、ＴＧＦβＲＩＩの細胞外領域）に由来するポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、ＴＧＦβＲＩＩの細胞外領域又は細胞外領域の部分を含むか、又はそれからなる。
【0059】
本明細書で使用される場合、「タンパク質構築物」という用語は、１つ以上のポリペプチドを有する複合体を指す。いくつかの実施形態では、タンパク質構築物は、２つ以上のポリペプチドを有し、ここで、ポリペプチドは、互いに会合し得、二量体又は多量体を形成する。
【0060】
本明細書で使用される場合、「がん」という用語は、制御されない自律的増殖のための能力を有する細胞を指す。そのような細胞の例としては、迅速に増殖する細胞増殖によって特徴付けられる異常な状態又は状況を有する細胞が挙げられる。この用語は、組織病理学的な型又は侵襲性の段階にかかわらず、がん増殖、例えば、腫瘍、発がんプロセス、転移性組織、及び悪性に形質転換された細胞、組織、又は臓器を含むように意味される。呼吸器系、心血管系、腎臓系、生殖器系、血液系、神経系、肝臓系、胃腸系、及び内分泌系などの様々な臓器系の悪性腫瘍、並びに大部分の結腸がん、腎細胞がん、前立腺がん及び／又は精巣腫瘍、非小細胞肺がん、及び小腸のがんなどの悪性腫瘍を含む腺がんもまた含まれる。「自然に生じる」がんには、対象中へのがん細胞の移植によって実験的に誘導されていない任意のがんが含まれ、例えば、自発的に生じるがん、発がん物質への患者の曝露によって引き起こされるがん、トランスジェニックがん遺伝子の挿入又は腫瘍抑制遺伝子のノックアウトから生じるがん、及び感染、例えば、ウイルス感染によって引き起こされるがんが含まれる。「がん腫」という用語は、当該技術分野で認識されており、上皮組織又は内分泌組織の悪性腫瘍を指す。この用語はまた、がん組織及び肉腫組織で構成される悪性腫瘍を含む、がん肉腫を含む。「腺がん」は、腺組織に由来するか、又はその中で腫瘍細胞が認識可能な腺構造を形成するがん腫を指す。「肉腫」という用語は、当該技術分野で認識されており、間葉系由来の悪性腫瘍を指す。「造血器新生物性障害」という用語は、造血起源の過形成性／新生物性細胞を伴う疾患を含む。造血器新生物性障害は、骨髄系統、リンパ系統若しくは赤血球系統、又はその前駆細胞から生じ得る。血液がんは、骨髄などの、造血組織において、又は免疫系の細胞において始まるがんである。血液がんの例としては、例えば、白血病、リンパ腫、及び多発性骨髄腫などが挙げられる。
【0061】
本明細書で使用される場合、「対象」及び「患者」という用語は、本明細書全体を通して互換的に使用され、それに対して本発明の方法による治療が提供される動物、ヒト又は非ヒト、を記載する。獣医学的及び非獣医学的適用が、本開示において企図される。ヒト患者は、成人ヒト又は若年ヒト（例えば、１８歳未満のヒト）であり得る。ヒトに加えて、患者には、限定されないが、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、フェレット、ネコ、イヌ、及び霊長類が含まれる。例えば、非ヒト霊長類（例えば、サル、チンパンジー、ゴリラなど）、げっ歯類（例えば、ラット、マウス、スナネズミ、ハムスター、フェレット、ウサギ）、ウサギ目、イノシシ属（例えば、ブタ、ミニブタ）、ウマ、イヌ、ネコ、ウシ、及び他の家畜、農場動物、及び動物園動物が含まれる。
【0062】
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、少なくとも２つのアミノ酸の任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すように互換的に使用される。
【0063】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」、「核酸分子」、及び「核酸配列」という用語は、少なくとも２つのヌクレオチドの任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指すように本明細書で互換的に使用され、限定されないが、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、及びそれらの修飾を含む。
【0064】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本発明における使用のための方法及び材料が本明細書に記載され、当該技術分野で知られている他の好適な方法及び材料もまた使用され得る。材料、方法、及び例は、単に例示であり、限定することを意図しない。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリ、及び他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。矛盾の場合、本明細書が、定義を含めて、支配する。
【0065】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び図面から、そして特許請求の範囲から明らかになる。
【0066】
より具体的には、本発明は以下を提供する：
[１] 配列番号７と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号７のＳ４９及びＤ１１８に対応する位置に１つ以上のアミノ酸変異を含む、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[２] （ａ）配列番号７のＳ４９に対応するアミノ酸が、Ｇ、Ａ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｋ、Ｑ、Ｅ、Ｐ、Ｖ、Ｉ、Ｃ、Ｙ、Ｈ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、又はＴであること、及び
（ｂ）配列番号７のＤ１１８に対応するアミノ酸が、Ｇ、Ａ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｋ、Ｑ、Ｅ、Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｉ、Ｃ、Ｙ、Ｈ、Ｒ、Ｎ、又はＴであること
のうちの１つ以上を含む、[１]の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[３] 配列番号７のＳ４９に対応するアミノ酸が、Ｅ又はＱである、[１]又は[２]の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[４] 配列番号７のＤ１１８に対応するアミノ酸が、Ｅである、[１]～[３]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[５] 配列番号７のＳ４９に対応するアミノ酸が、Ｅである、[１]～[４]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[６] 配列番号７の３２位に対応するアミノ酸が、Ｄである、[１]～[４]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[７] 配列番号７の１１９位に対応するアミノ酸が、Ｅである、[１]～[６]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[８] 配列番号７～１２のいずれか１つと少なくとも８５％、９０％、９５％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む、[１]～[７]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[９] 配列番号８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、[８]の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[１０] 配列番号９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、[８]の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[１１] 配列番号１０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、[８]の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[１２] 配列番号１１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、[８]の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[１３] 配列番号１２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、[８]の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[１４] 前記操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドとＴＧＦβ１との間のオフレートが、野生型ＴＧＦβＲＩＩとＴＧＦβ１との間のオフレートよりも低い、[１]～[１３]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[１５] 前記操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドとＴＧＦβ３との間のオフレートが、野生型ＴＧＦβＲＩＩとＴＧＦβ３との間のオフレートよりも低い、[１]～[１４]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[１６] ＴＧＦβ２に結合しない、[１]～[１５]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[１７] ＴＧＦβ１におけるＲ９４、Ｒ２５、Ｋ３７、及び／又はＫ３１と相互作用する、[１]～[１６]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[１８] ＴＧＦβ３におけるＲ９４、Ｒ２５、Ｋ３７、及び／又はＫ３１と相互作用する、[１]～[１７]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[１９] 水素結合相互作用を介して、ＴＧＦβ１におけるＲ９４、Ｒ２５、Ｋ３７、及び／又はＫ３１と相互作用する、[１]～[１８]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[２０] 水素結合相互作用を介して、ＴＧＦβ３におけるＲ９４、Ｒ２５、Ｋ３７、及び／又はＫ３１と相互作用する、[１]～[１９]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[２１] ＴＧＦβ（例えば、ＴＧＦβ１）を捕捉し得、それによって、腫瘍微小環境を改善し得る、[１]～[２０]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[２２] ＴＧＦβ（例えば、ＴＧＦβ１）とＴＧＦβＲＩＩとの間の結合をブロックし得るか又はそれに干渉し得る、[１]～[２１]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[２３] ＴＧＦβ（例えば、ＴＧＦβ１）と、腫瘍細胞、線維芽細胞、又は免疫細胞の表面上で発現されたＴＧＦβＲＩＩとの間の結合をブロックし得るか又はそれに干渉し得る、[１]～[２２]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[２４] ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを更に含む、[１]～[２３]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[２５] ヒンジ領域を更に含む、[２４]の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[２６] 前記ＣＨ２ドメインが、ＩｇＧ ＣＨ２ドメインであり、前記ＣＨ３ドメインが、ＩｇＧ ＣＨ３ドメインである、[２４]又は[２５]の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[２７] 任意選択でリンカー配列を通して、（ａ）前記ヒンジ領域若しくはＣＨ２ドメインのＮ末端、又は（ｂ）前記ＣＨ３ドメインのＣ末端のいずれかに連結されている、[２４]～[２６]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[２８] 配列番号１～６のいずれか１つと同一であるアミノ酸配列を含む、[２４]～[２７]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[２９] [１]～[２８]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドを含む、タンパク質構築物；
[３０] ２つ以上の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドを含む、[２９]のタンパク質構築物；
[３１] 前記操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドのうちの少なくとも２つが同一である、[３０]のタンパク質構築物；
[３２] 前記操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドのうちの少なくとも２つが異なる、[３０]のタンパク質構築物；
[３３] Ｆｃ領域を更に含む、[２９]～[３２]のいずれか１つのタンパク質構築物；
[３４] 前記Ｆｃ領域が、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域である、[３３]のタンパク質構築物；
[３５] 前記Ｆｃ領域が、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域（例えば、ＬＡＬＡ変異又はＬＡＬＡ－ＰＧ変異を有する）である、[３４]のタンパク質構築物；
[３６] 前記操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドが、前記Ｆｃ領域のＣ末端に連結されている、[３３]～[３５]のいずれか１つのタンパク質構築物；
[３７] 前記操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドが、ペプチドリンカーを介して前記Ｆｃ領域のＣ末端に連結されている、[３３]～[３５]のいずれか１つのタンパク質構築物；
[３８] [１]～[２８]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、第１のＣＨ２ドメイン、及び第１のＣＨ３ドメインを含む、第１の融合ポリペプチドと、
第２のＣＨ２ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインを含む、第２の融合ポリペプチドと
を含み、
前記第１の融合ポリペプチド及び前記第２の融合ポリペプチドが、互いに会合し、二量体を形成する、
タンパク質構築物；
[３９] 前記第２の融合ポリペプチドが、第２の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドを更に含む、[３８]のタンパク質構築物；
[４０] [１]～[２８]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド又は[２９]～[３９]のいずれか１つのタンパク質構築物と、
薬学的に許容される担体と
を含む、医薬組成物；
[４１] [１]～[２８]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド又は[２９]～[３９]のいずれか１つのタンパク質構築物をコードする、核酸；
[４２] [４１]の核酸を含む、ベクター；
[４３] [４１]の核酸又は[４２]のベクターを含む、細胞；
[４４] ＣＨＯ細胞である、[４３]の細胞；
[４５] 操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、又は前記操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドを含むタンパク質構築物を産生する方法であって、
（ａ）[４３]又は[４４]の細胞を、前記細胞が前記操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド又は前記タンパク質構築物を産生するのに十分な条件下で培養することと、
（ｂ）前記細胞によって産生された前記操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド又は前記タンパク質構築物を収集することと
を含む、前記方法；
[４６] がんを有する対象を治療する方法であって、
治療有効量の、[１]～[２８]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド又は[２９]～[３９]のいずれか１つのタンパク質構築物を含む組成物を、前記対象に投与することを含む、前記方法；
[４７] 前記対象が、固形腫瘍又は血液がんを有する、[４６]の方法；
[４８] 前記がんが、乳がん、卵巣がん、神経膠腫、結腸がん、肝細胞がん、前立腺がん、腎細胞がん、黒色腫、肺がん、膵臓がん、又は肝がんである、[４６]の方法；
[４９] 腫瘍増殖の速度を減少させる方法であって、
腫瘍細胞を、有効量の、[１]～[２８]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド又は[２９]～[３９]のいずれか１つのタンパク質構築物を含む組成物と接触させることを含む、前記方法；並びに
[５０] 腫瘍細胞を死滅させる方法であって、
腫瘍細胞を、有効量の、[１]～[２８]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド又は[２９]～[３９]のいずれか１つのタンパク質構築物を含む組成物と接触させることを含む、前記方法。
[１] 配列番号７と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号７のＳ４９及びＤ１１８に対応する位置に１つ以上のアミノ酸変異を含む、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[２] （ａ）配列番号７のＳ４９に対応するアミノ酸が、Ｇ、Ａ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｋ、Ｑ、Ｅ、Ｐ、Ｖ、Ｉ、Ｃ、Ｙ、Ｈ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、又はＴであること、及び
（ｂ）配列番号７のＤ１１８に対応するアミノ酸が、Ｇ、Ａ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｗ、Ｋ、Ｑ、Ｅ、Ｓ、Ｐ、Ｖ、Ｉ、Ｃ、Ｙ、Ｈ、Ｒ、Ｎ、又はＴであること
のうちの１つ以上を含む、[１]の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[３] 配列番号７のＳ４９に対応するアミノ酸が、Ｅ又はＱである、[１]又は[２]の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[４] 配列番号７のＤ１１８に対応するアミノ酸が、Ｅである、[１]～[３]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[５] 配列番号７のＳ４９に対応するアミノ酸が、Ｅである、[１]～[４]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[６] 配列番号７の３２位に対応するアミノ酸が、Ｄである、[１]～[４]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[７] 配列番号７の１１９位に対応するアミノ酸が、Ｅである、[１]～[６]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[８] 配列番号７～１２のいずれか１つと少なくとも８５％、９０％、９５％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む、[１]～[７]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[９] 配列番号８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、[８]の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[１０] 配列番号９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、[８]の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[１１] 配列番号１０と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、[８]の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[１２] 配列番号１１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、[８]の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[１３] 配列番号１２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、[８]の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[１４] 前記操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドとＴＧＦβ１との間のオフレートが、野生型ＴＧＦβＲＩＩとＴＧＦβ１との間のオフレートよりも低い、[１]～[１３]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[１５] 前記操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドとＴＧＦβ３との間のオフレートが、野生型ＴＧＦβＲＩＩとＴＧＦβ３との間のオフレートよりも低い、[１]～[１４]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[１６] ＴＧＦβ２に結合しない、[１]～[１５]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[１７] ＴＧＦβ１におけるＲ９４、Ｒ２５、Ｋ３７、及び／又はＫ３１と相互作用する、[１]～[１６]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[１８] ＴＧＦβ３におけるＲ９４、Ｒ２５、Ｋ３７、及び／又はＫ３１と相互作用する、[１]～[１７]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[１９] 水素結合相互作用を介して、ＴＧＦβ１におけるＲ９４、Ｒ２５、Ｋ３７、及び／又はＫ３１と相互作用する、[１]～[１８]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[２０] 水素結合相互作用を介して、ＴＧＦβ３におけるＲ９４、Ｒ２５、Ｋ３７、及び／又はＫ３１と相互作用する、[１]～[１９]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[２１] ＴＧＦβ（例えば、ＴＧＦβ１）を捕捉し得、それによって、腫瘍微小環境を改善し得る、[１]～[２０]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[２２] ＴＧＦβ（例えば、ＴＧＦβ１）とＴＧＦβＲＩＩとの間の結合をブロックし得るか又はそれに干渉し得る、[１]～[２１]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[２３] ＴＧＦβ（例えば、ＴＧＦβ１）と、腫瘍細胞、線維芽細胞、又は免疫細胞の表面上で発現されたＴＧＦβＲＩＩとの間の結合をブロックし得るか又はそれに干渉し得る、[１]～[２２]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[２４] ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを更に含む、[１]～[２３]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[２５] ヒンジ領域を更に含む、[２４]の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[２６] 前記ＣＨ２ドメインが、ＩｇＧ ＣＨ２ドメインであり、前記ＣＨ３ドメインが、ＩｇＧ ＣＨ３ドメインである、[２４]又は[２５]の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[２７] 任意選択でリンカー配列を通して、（ａ）前記ヒンジ領域若しくはＣＨ２ドメインのＮ末端、又は（ｂ）前記ＣＨ３ドメインのＣ末端のいずれかに連結されている、[２４]～[２６]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[２８] 配列番号１～６のいずれか１つと同一であるアミノ酸配列を含む、[２４]～[２７]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド；
[２９] [１]～[２８]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドを含む、タンパク質構築物；
[３０] ２つ以上の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドを含む、[２９]のタンパク質構築物；
[３１] 前記操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドのうちの少なくとも２つが同一である、[３０]のタンパク質構築物；
[３２] 前記操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドのうちの少なくとも２つが異なる、[３０]のタンパク質構築物；
[３３] Ｆｃ領域を更に含む、[２９]～[３２]のいずれか１つのタンパク質構築物；
[３４] 前記Ｆｃ領域が、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域である、[３３]のタンパク質構築物；
[３５] 前記Ｆｃ領域が、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域（例えば、ＬＡＬＡ変異又はＬＡＬＡ－ＰＧ変異を有する）である、[３４]のタンパク質構築物；
[３６] 前記操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドが、前記Ｆｃ領域のＣ末端に連結されている、[３３]～[３５]のいずれか１つのタンパク質構築物；
[３７] 前記操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドが、ペプチドリンカーを介して前記Ｆｃ領域のＣ末端に連結されている、[３３]～[３５]のいずれか１つのタンパク質構築物；
[３８] [１]～[２８]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、第１のＣＨ２ドメイン、及び第１のＣＨ３ドメインを含む、第１の融合ポリペプチドと、
第２のＣＨ２ドメイン及び第２のＣＨ３ドメインを含む、第２の融合ポリペプチドと
を含み、
前記第１の融合ポリペプチド及び前記第２の融合ポリペプチドが、互いに会合し、二量体を形成する、
タンパク質構築物；
[３９] 前記第２の融合ポリペプチドが、第２の操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドを更に含む、[３８]のタンパク質構築物；
[４０] [１]～[２８]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド又は[２９]～[３９]のいずれか１つのタンパク質構築物と、
薬学的に許容される担体と
を含む、医薬組成物；
[４１] [１]～[２８]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド又は[２９]～[３９]のいずれか１つのタンパク質構築物をコードする、核酸；
[４２] [４１]の核酸を含む、ベクター；
[４３] [４１]の核酸又は[４２]のベクターを含む、細胞；
[４４] ＣＨＯ細胞である、[４３]の細胞；
[４５] 操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド、又は前記操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドを含むタンパク質構築物を産生する方法であって、
（ａ）[４３]又は[４４]の細胞を、前記細胞が前記操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド又は前記タンパク質構築物を産生するのに十分な条件下で培養することと、
（ｂ）前記細胞によって産生された前記操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド又は前記タンパク質構築物を収集することと
を含む、前記方法；
[４６] がんを有する対象を治療する方法であって、
治療有効量の、[１]～[２８]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド又は[２９]～[３９]のいずれか１つのタンパク質構築物を含む組成物を、前記対象に投与することを含む、前記方法；
[４７] 前記対象が、固形腫瘍又は血液がんを有する、[４６]の方法；
[４８] 前記がんが、乳がん、卵巣がん、神経膠腫、結腸がん、肝細胞がん、前立腺がん、腎細胞がん、黒色腫、肺がん、膵臓がん、又は肝がんである、[４６]の方法；
[４９] 腫瘍増殖の速度を減少させる方法であって、
腫瘍細胞を、有効量の、[１]～[２８]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド又は[２９]～[３９]のいずれか１つのタンパク質構築物を含む組成物と接触させることを含む、前記方法；並びに
[５０] 腫瘍細胞を死滅させる方法であって、
腫瘍細胞を、有効量の、[１]～[２８]のいずれか１つの操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド又は[２９]～[３９]のいずれか１つのタンパク質構築物を含む組成物と接触させることを含む、前記方法。
【図面の簡単な説明】
【0067】
【図1】図１Ａは、ＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメインとそのリガンドＴＧＦβ１との間の境界面の３Ｄ構造を示す。図１Ｂは、変異したＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメイン（Ｓ４９及びＤ１１８における変異）とそのリガンドＴＧＦβ１との間の境界面の３Ｄ構造を示す。
【図2】Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩタンパク質のアミノ酸配列を示す。
【図3】産生及びＣＭＣ分析の結果の要約を示す。
【図4A】ＥＬＩＳＡによって測定した、Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩタンパク質とヒトＴＧＦβとの間の結合親和性を示す。
【図4B】ＥＬＩＳＡによって測定した、Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩタンパク質とヒトＴＧＦβとの間の結合親和性を示す。
【図4C】ＥＬＩＳＡによって測定した、Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩタンパク質とヒトＴＧＦβとの間の結合親和性を示す。
【図5A】ＥＬＩＳＡによって測定した、Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩタンパク質とヒトＴＧＦβとの間のオンレート結合能力を示す。
【図5B】ＥＬＩＳＡによって測定した、Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩタンパク質とヒトＴＧＦβとの間のオフレート結合能力を示す。
【図5C】ＥＬＩＳＡによって測定した、Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩタンパク質とヒトＴＧＦβとの間のオンレート結合能力についてのＥＣ５０を示す。
【図6】ＢＬＩ結合アッセイの結果を示す。
【図7A】ｓｍａｄ２レポーター活性アッセイからの結果を示す。
【図7B】ｓｍａｄ２レポーター活性アッセイからの結果を示す。
【図7C】ｓｍａｄ２レポーター活性アッセイからの結果を示す。
【図8-1】本開示で考察される関係のあるタンパク質配列を列挙する。
【図8-2】本開示で考察される関係のあるタンパク質配列を列挙する。
【発明を実施するための形態】
【0068】
詳細な説明
トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）βシグナル伝達経路は、増殖、分化、接着、運動性及びアポトーシスを含む多くの細胞プロセスに関与する。これらの機能は、悪性細胞において頻繁に破壊され、ＩＩ型ＴＧＦβ受容体（ＴＧＦβＲＩＩ）は、その後、腫瘍抑制遺伝子（ＴＳＧ）であることが実証された。ＴＧＦβシグナル伝達経路は、正常細胞においてＴＳＧとしてのその役割に則して強力な増殖阻害を媒介し、がん細胞は、遺伝子機構及びエピジェネティック機構の両方を使用して、ＴＧＦβＲＩＩを不活性化する。しかしながら、ＴＧＦβシグナル伝達経路とがんの進行との間の関係は複雑である。ＴＧＦβシグナル伝達の廃止は、早期悪性腫瘍に増殖優位性を提供するが、ＴＧＦβは、進行した腫瘍における転移促進的役割を担う。したがって、ＴＧＦβＲＩＩの喪失は、不良な臨床成績と関連し、早期乳がんにおける不良な予後の予測因子であるが、ＴＧＦβリガンドの過剰発現は、多くの腫瘍における転移性表現型と関連している。ＴＧＦβのこの二重の性質は、増殖抑制効果を利用するためにＴＧＦβシグナル伝達を回復させることに関して課題を呈する。
トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）βシグナル伝達経路は、増殖、分化、接着、運動性及びアポトーシスを含む多くの細胞プロセスに関与する。これらの機能は、悪性細胞において頻繁に破壊され、ＩＩ型ＴＧＦβ受容体（ＴＧＦβＲＩＩ）は、その後、腫瘍抑制遺伝子（ＴＳＧ）であることが実証された。ＴＧＦβシグナル伝達経路は、正常細胞においてＴＳＧとしてのその役割に則して強力な増殖阻害を媒介し、がん細胞は、遺伝子機構及びエピジェネティック機構の両方を使用して、ＴＧＦβＲＩＩを不活性化する。しかしながら、ＴＧＦβシグナル伝達経路とがんの進行との間の関係は複雑である。ＴＧＦβシグナル伝達の廃止は、早期悪性腫瘍に増殖優位性を提供するが、ＴＧＦβは、進行した腫瘍における転移促進的役割を担う。したがって、ＴＧＦβＲＩＩの喪失は、不良な臨床成績と関連し、早期乳がんにおける不良な予後の予測因子であるが、ＴＧＦβリガンドの過剰発現は、多くの腫瘍における転移性表現型と関連している。ＴＧＦβのこの二重の性質は、増殖抑制効果を利用するためにＴＧＦβシグナル伝達を回復させることに関して課題を呈する。
【0069】
哺乳動物系において、ＴＧＦβは、異なる遺伝子によってコードされるＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、及びＴＧＦβ３として分類されるが、それらは全て同じ受容体シグナル伝達系を通じて機能する。ＴＧＦβは、細胞外マトリックス中にＴＧＦβを繋ぎ止める潜在型ＴＧＦβ結合タンパク質のような他の細胞外タンパク質に結合した潜在型複合体として分泌される。ＴＧＦβは、ＴＧＦβＲＩＩ受容体にリガンドを提示する細胞表面でＴＧＦβＲＩＩＩに結合する。細胞内シグナル伝達は、構成的に活性なＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼ活性を有するＴＧＦβＲＩＩホモ二量体への活性サイトカインの選択的結合に際して開始される。ＴＧＦβ結合に際して、ＴＧＦβＲＩＩは、ＴＧＦβＲＩとヘテロ四量体を形成し、二量体ＴＧＦβに結合した２つの同一のＴＧＦβＲＩ／ＴＧＦβＲＩＩ受容体ヘテロ二量体を構成する。一旦受容体複合体が形成されると、ＴＧＦβＲＩＩは、トランスリン酸化し、ＴＧＦβＲＩ Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼを活性化する。ＴＧＦβＲＩの活性化は、タンパク質のＳｍａｄファミリーを介して下流のシグナル伝達を伝播する。ＴＧＦβＲＩ受容体は、Ｓｍａｄ２及びＳｍａｄ３と直接相互作用し、これらをリン酸化する（受容体活性化Ｓｍａｄ又はＲ－Ｓｍａｄとも称される）。これらのＳｍａｄは、Ｓｍａｄ４に結合し（Ｃｏ－Ｓｍａｄとも称される）、これは、核へのこの複合体の移行をもたらし、ここで、ＳｍａｄはＴＧＦβ応答性遺伝子発現を調節する。ＴＧＦβ受容体トラップの全身投与は、腫瘍細胞増殖を阻害し得る。これは、ＴＧＦβが、腫瘍発生の比較的早期において、サプレッサーではなくプロモーターとして作用することを示唆する。
【0070】
ＴＧＦβ、ＴＧＦΒＲ２、及びがんを治療するためのＴＧＦβトラップの使用の詳細な説明は、例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｓａｎｊｉｂ，Ｓｕｄｈａｋａｒ Ａｍｍａｎａｍａｎｃｈｉ，ａｎｄ Ｇｉｌｌｉａｎ Ｍ．Ｈｏｗｅｌｌ．“Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ β ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＩＩ ａｎｄ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ．”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １．１（２００９）：５７、Ｂｉｅｒｉｅ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．“ＴＧＦβ：ｔｈｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｊｅｋｙｌｌ ａｎｄ Ｈｙｄｅ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ．”Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃａｎｃｅｒ ６．７（２００６）：５０６－５２０、Ｋｉｍ，Ｂ．，ｅｔ ａｌ．“Ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｉｎ ｏｎｃｏｌｏｇｙ ｔｏ ｔａｒｇｅｔ ｔｈｅ ＴＧＦ－β ｐａｔｈｗａｙ．”Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ＆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ １４．１（２０２１）：１－２０、及びＬｉｎｄ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．“Ｄｕａｌ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ＴＧＦ－β ａｎｄ ＰＤ－Ｌ１ ｖｉａ ａ ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｔｉ－ＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦ－βＲＩＩ ａｇｅｎｔ：ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｄｖａｎｃｅｓ．”Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ８．１（２０２０）に記載されており、これらの各々は参照によりその全体が組み込まれる。
【0071】
本開示は、操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアントを提供する。これらの操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアントは、ＴＧＦβＲＩＩ経路を標的にするために使用され得、一方、操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアントとＴＧＦβとの相互作用は、慎重に調節される。
【0072】
操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント
ＴＧＦβファミリーリガンドは、リガンド、２つのＩ型、及び２つのＩＩ型受容体からなる受容体複合体のアセンブリを通じてシグナル伝達を開始する。各受容体ＥＣＤは、３つのβストランドのスリーフィンガートキシン（ｔｈｒｅｅ－ｆｉｎｇｅｒ ｔｏｘｉｎ）折り畳みを示す約１００残基からなる。Ｉ型受容体及びＩＩ型受容体の両方は、コアβシートに隣接する伸長したループを除いて、高度の相同性を示す。５つのＩＩ型受容体ＥＣＤのうちの４つ及び７つのＩ型受容体ＥＣＤのうちの４つは、単独で（ＩＩ型：ＡｃｔＲＩＩＡ、ＴＢＲＩＩ、ＢＭＰＩＩ／Ｉ型：Ａｌｋ１、Ａｌｋ３、Ａｌｋ５）又はリガンド－受容体複合体において（ＩＩ型：ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＢＲＩＩ、ＢＭＰＩＩ／Ｉ型：Ａｌｋ１、Ａｌｋ３、Ａｌｋ５、Ａｌｋ６）のいずれかで構造的に特徴付けられている。これらの構造は、各受容体におけるβシート構造を安定化する４つのジスルフィド結合の共通のセットを明らかにした。加えて、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ、及びＩ型受容体は、β４－β５ループを安定化し、特にＩＩ型受容体について、リガンド結合を維持するために重大な領域である、受容体の表面の閉鎖を防止するための追加のジスルフィド結合を含む。ＴＧＦβＲＩＩは、リガンド相互作用のための位置においてβ１－β２ループを繋ぎ止めるために２つの追加のジスルフィド結合を有する点で独特である。
ＴＧＦβファミリーリガンドは、リガンド、２つのＩ型、及び２つのＩＩ型受容体からなる受容体複合体のアセンブリを通じてシグナル伝達を開始する。各受容体ＥＣＤは、３つのβストランドのスリーフィンガートキシン（ｔｈｒｅｅ－ｆｉｎｇｅｒ ｔｏｘｉｎ）折り畳みを示す約１００残基からなる。Ｉ型受容体及びＩＩ型受容体の両方は、コアβシートに隣接する伸長したループを除いて、高度の相同性を示す。５つのＩＩ型受容体ＥＣＤのうちの４つ及び７つのＩ型受容体ＥＣＤのうちの４つは、単独で（ＩＩ型：ＡｃｔＲＩＩＡ、ＴＢＲＩＩ、ＢＭＰＩＩ／Ｉ型：Ａｌｋ１、Ａｌｋ３、Ａｌｋ５）又はリガンド－受容体複合体において（ＩＩ型：ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＴＢＲＩＩ、ＢＭＰＩＩ／Ｉ型：Ａｌｋ１、Ａｌｋ３、Ａｌｋ５、Ａｌｋ６）のいずれかで構造的に特徴付けられている。これらの構造は、各受容体におけるβシート構造を安定化する４つのジスルフィド結合の共通のセットを明らかにした。加えて、ＡｃｔＲＩＩＡ、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＢＭＰＲＩＩ、及びＩ型受容体は、β４－β５ループを安定化し、特にＩＩ型受容体について、リガンド結合を維持するために重大な領域である、受容体の表面の閉鎖を防止するための追加のジスルフィド結合を含む。ＴＧＦβＲＩＩは、リガンド相互作用のための位置においてβ１－β２ループを繋ぎ止めるために２つの追加のジスルフィド結合を有する点で独特である。
【0073】
ＴＧＦβＲＩＩは、ＴＧＦβクラス（ＴＧＦβ１～３）への結合に高度に特異的である。ＴＧＦβとの複合体形成の間、ＴＧＦβＲＩＩはリガンドの遠位の指先で結合し、ここで、受容体のβシートは指のβストランドに対して直角である。具体的には、ＴＧＦβＲＩＩのβ２は、ＴＧＦβリガンドによって共有される特徴である、正に荷電した残基（ＴＧＦβ１におけるＡｒｇ３０３及びＡｒｇ３７２）から形成される間隙内で意義深い接触を形成し、結合する。これらの残基は、ＴＧＦβＲＩＩに対するＴＧＦβのリガンド特異性を説明し、ＢＭＰ又はアクチビンクラスのリガンドには存在しない。この相互作用は、ＴＧＦβＲＩＩに限定されるβ１－β２ループにおける伸長によって更に安定化される。
【0074】
ＩＩ型ＴＧＦ－β受容体、ＴＧＦβＲＩＩは、それが、別個の境界面、すなわち、より小さなβ１－β２シート、β２－ストランド、並びに隣接するβ１及びβ１’ストランド上のへりのβストランド（ｅｄｇｅ β－ｓｔｒａｎｄ）を通してその同族リガンドに結合するという点で、ファミリーのＩ型及びＩＩ型受容体の間で独特である。この代替の境界面の使用は、ＡｃｔＲＩＩ、ＡｃｔＲＩＩＢ、及びＢＭＰＲＩＩと比較しての、ＴＧＦβＲＩＩにおける２つの重要な構造的差異によって促進される。第一に、β４－β５ループは、他のＩＩ型受容体との比較で、ＴＧＦβＲＩＩにおいて７～８残基だけ伸長されており、ｆジスルフィドを欠いている。このジスルフィドの非存在は、伸長したβ４－β５ループがβ４－β３－β５シートの凹面表面上に折り畳まれることを可能にし、したがって、この境界面を通したリガンド結合をブロックする。第二に、ＴＧＦβＲＩＩにおけるβ１－β２ループは、ＡＭＨＲＩＩを除く、ファミリーの全ての他のＩ型及びＩＩ型受容体と比較して、１０超の残基だけ伸長されている。β１－β２ループは、Ｉ型受容体におけるのと同様の、その塩基におけるｅジスルフィド、及びその先端付近のＴＧＦβＲＩＩ特異的ｇジスルフィドの両方によって更に安定化される。伸長したループは、β４－β３－β５シートの凸面表面上を包み、それに対して堅固にパックする。この通常でない構造的特徴は、３つのＴＧＦ－βアイソフォームに結合するためにＴＧＦβＲＩＩによって使用される一次構造エレメントを形成する、短いβ２ストランドの適正な位置決め及び支えに重要であるようである。
【0075】
本開示において提供されるＴＧＦβＲＩＩと複合体形成しているＴＧＦβ１の構造に基づいて、相互作用する残基が決定される。図１Ａにおいて、ＴＧＦβ１と水素結合を形成するＴＧＦβＲＩＩのアミノ酸残基（Ｄ３２及びＥ１１９）が強調される。図１Ｂにおいて、ＴＧＦβ１と追加の水素結合を形成し得る変異したアミノ酸残基（Ｓ４９及びＤ１１８）が強調される。
【0076】
更なる分析は、ＴＧＦβＲＩＩにおける変異したＳ４９及びＤ１１８がＴＧＦβ１との相互作用に関与することを示す。したがって、いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、Ｓ４９及びＤ１１８に１つ以上のアミノ酸変異を含み得る。位置番号は、配列番号７に基づいて決定される。
【0077】
いくつかの実施形態では、配列番号７のＳ４９に対応するアミノ酸は、荷電した側鎖を有するアミノ酸、例えば、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、又はＥである。いくつかの実施形態では、配列番号７のＳ４９に対応するアミノ酸は、極性非荷電側鎖を有するアミノ酸、例えば、Ｔ、Ｎ、又はＱである。いくつかの実施形態では、配列番号７のＳ４９に対応するアミノ酸は、疎水性側鎖を有する、例えば、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｙ、又はＷ。いくつかの実施形態では、配列番号７のＳ４９に対応するアミノ酸は、Ｃ、Ｇ、又はＰである。いくつかの実施形態では、配列番号７のＳ４９に対応するアミノ酸は、Ｓでない。いくつかの実施形態では、配列番号７のＳ４９に対応するアミノ酸は、なお、Ｓである。
【0078】
いくつかの実施形態では、Ｓ４９に対応するアミノ酸は、ＴＧＦβ１におけるＫ３７と水素結合を形成する。いくつかの実施形態では、配列番号７のＳ４９に対応するアミノ酸は、Ｅである。いくつかの実施形態では、配列番号７のＳ４９に対応するアミノ酸は、Ｑである。
【0079】
いくつかの実施形態では、配列番号７のＤ１１８に対応するアミノ酸は、荷電した側鎖を有するアミノ酸、例えば、Ｒ、Ｈ、Ｋ、Ｄ、又はＥである。いくつかの実施形態では、配列番号７のＤ１１８に対応するアミノ酸は、極性非荷電側鎖を有するアミノ酸、例えば、Ｔ、Ｎ、又はＱである。いくつかの実施形態では、配列番号７のＤ１１８に対応するアミノ酸は、疎水性側鎖を有する、例えば、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｙ、又はＷ。いくつかの実施形態では、配列番号７のＤ１１８に対応するアミノ酸は、Ｃ、Ｇ、又はＰである。いくつかの実施形態では、配列番号７のＤ１１８に対応するアミノ酸は、Ｄでない。いくつかの実施形態では、配列番号７のＤ１１８に対応するアミノ酸は、なお、Ｄである。
【0080】
いくつかの実施形態では、配列番号７のＤ１１８に対応するアミノ酸は、ＴＧＦβ１におけるＫ３１と水素結合を形成する（配列番号１５に基づく）。いくつかの実施形態では、配列番号７のＤ１１８に対応するアミノ酸は、Ｅである。
【0081】
いくつかの実施形態では、配列番号７のＳ４９に対応するアミノ酸は、Ｅ又はＱである。いくつかの実施形態では、配列番号７のＤ１１８に対応するアミノ酸は、Ｅである。
【0082】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、以下の変異のうちの１つ以上を有し得る：（ａ）配列番号７のＳ４９に対応するアミノ酸がＥ又はＱである、変異、（ｂ）配列番号７のＤ１１８に対応するアミノ酸がＥである、変異。いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１０超の追加の変異を有し、ここで、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、ＴＧＦβ１及び／又はＴＧＦβ２との同様の又は改善された結合親和性を有する。
【0083】
加えて、本開示における分析は、ＴＧＦβＲＩＩのＤ３２（ＴＧＦβ１のＲ９４と相互作用する）及びＥ１１９（ＴＧＦβ１のＲ２５と相互作用する）が、ＴＧＦβ１及びＴＧＦβ３の結合親和性をＴＧＦβ２から区別するための鍵となる残基であることを示す。したがって、いくつかの実施形態では、これらのアミノ酸残基は保持される。いくつかの実施形態では、そこでアミノ酸残基は変異される。
【0084】
したがって、一態様では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、配列番号７～１２のいずれか１つと少なくとも６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
【0085】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、配列番号７と少なくとも６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
【0086】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、配列番号８と少なくとも６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
【0087】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、配列番号９と少なくとも６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
【0088】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１０と少なくとも６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
【0089】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１１と少なくとも６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
【0090】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１２と少なくとも６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
【0091】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアントは、配列番号７～１２のいずれか１つと比較して、少なくとも１個又は約１個（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０個、又は約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０個）のアミノ酸の挿入、欠失、又は置換を有し得る。
【0092】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、Ｓ４９及びＤ１１８に１つ以上の変異を有する。いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、Ｓ４９に変異を有する。いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、Ｄ１１８に変異を有する。位置番号は、配列番号７によって決定される。
【0093】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、以下の変異のうちの１つ以上を有する：
（ａ）配列番号７のＳ４９に対応するアミノ酸がＳでない、変異、
（ｂ）配列番号７のＤ１１８に対応するアミノ酸がＤでない、変異。
（ａ）配列番号７のＳ４９に対応するアミノ酸がＳでない、変異、
（ｂ）配列番号７のＤ１１８に対応するアミノ酸がＤでない、変異。
【0094】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、以下の変異のうちの１つ以上を有する：
（ａ）配列番号７のＳ４９に対応するアミノ酸がＥ又はＱである、変異、
（ｂ）配列番号７のＤ１１８に対応するアミノ酸が、Ｅである、変異。
（ａ）配列番号７のＳ４９に対応するアミノ酸がＥ又はＱである、変異、
（ｂ）配列番号７のＤ１１８に対応するアミノ酸が、Ｅである、変異。
【0095】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個の変異を有する配列番号７～１２のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
【0096】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、若しくは１４０個、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、若しくは１４０個のアミノ酸を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、又は１６０個以下のアミノ酸を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドの細胞外ドメインからの、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、若しくは１４０個、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、若しくは１４０個の近接したアミノ酸を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアントは、少なくとも１個又は約１個（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０個、又は約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０個）のアミノ酸の挿入、欠失、又は置換を有し得る。
【0097】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドにおけるＴＧＦβ結合ドメインは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、若しくは１４０個、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、若しくは１４０個のアミノ酸を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドにおけるＴＧＦβ結合ドメインは、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、又は１６０個以下のアミノ酸を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドにおけるＴＧＦβ結合ドメインは、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドの細胞外ドメインからの、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、若しくは１４０個、又は少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、若しくは１４０個の近接したアミノ酸を含むか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアントにおけるＴＧＦβ結合ドメインは、少なくとも１個又は約１個（例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０個又は約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０個）のアミノ酸の挿入、欠失、又は置換を有し得る。
【0098】
操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、追加の改変を有し得る。いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド（又はＴＧＦβ結合ドメイン）は、ＦｃのＣＨ２ドメイン及び／又はＣＨ３ドメインを有し得る。いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド（又はＴＧＦβ結合ドメイン）は、ＣＨ２ドメインのＮ末端に連結され得る（例えば、任意選択のヒンジ領域又はＧＳリンカーを通して）。いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチド（又はＴＧＦβ結合ドメイン）は、ＣＨ３ドメインのＣ末端に連結され得る（例えば、任意選択のＧＳリンカーを通して）。いくつかの実施形態では、ヒンジ領域は、ＩｇＧヒンジ領域（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４ヒンジ領域）である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２ドメインは、ＩｇＧ ＣＨ２ドメイン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４ ＣＨ２ドメイン）である。いくつかの実施形態では、ＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ ＣＨ３ドメイン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４ ＣＨ３ドメイン）である。
【0099】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、配列番号１～１２のいずれか１つと少なくとも６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、又はそれからなる。
【0100】
ＴＧＦβＲＩＩタンパク質構築物
本開示はまた、ＴＧＦβ（例えば、ＴＧＦβ１又はＴＧＦβ３）に特異的に結合し得る操作されたＴＧＦβＲＩＩタンパク質構築物を提供する。いくつかの実施形態では、これらのタンパク質構築物は、ＴＧＦβ２に結合しない。いくつかの実施形態では、これらのタンパク質構築物は、ＴＧＦβＲＩＩシグナル伝達経路をブロックし得る。いくつかの実施形態では、これらのタンパク質構築物は、腫瘍微小環境を改善し得る。
本開示はまた、ＴＧＦβ（例えば、ＴＧＦβ１又はＴＧＦβ３）に特異的に結合し得る操作されたＴＧＦβＲＩＩタンパク質構築物を提供する。いくつかの実施形態では、これらのタンパク質構築物は、ＴＧＦβ２に結合しない。いくつかの実施形態では、これらのタンパク質構築物は、ＴＧＦβＲＩＩシグナル伝達経路をブロックし得る。いくつかの実施形態では、これらのタンパク質構築物は、腫瘍微小環境を改善し得る。
【0101】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、Ｆｃに連結される。いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩポリペプチドは、ＦｃのＮ末端（例えば、ヒンジ領域を通して）又はＦｃのＣ末端（例えば、リンカー配列を通して）に連結される。
【0102】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩタンパク質構築物は、本明細書に記載の任意の操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアントを含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩタンパク質構築物は、配列番号１～６のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である配列を有する。
【0103】
本開示はまた、本明細書に記載の任意のアミノ酸配列、例えば、配列番号１～１４と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である配列を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を提供する。
【0104】
２つのアミノ酸配列の、又は２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するために、配列は、最適な比較目的のために整列させられる（例えば、ギャップが、最適なアラインメントのために第１及び第２のアミノ酸又は核酸配列の一方又は両方に導入され得、非相同配列が、比較目的のために無視され得る）。次いで、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドが比較される。第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占められているとき、分子はその位置において同一である。２つの配列の間の同一性パーセントは、２つの配列の最適なアラインメントのために導入される必要がある、ギャップの数、及び各ギャップの長さを考慮しての、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。例えば、２つの配列の間の配列の比較及び同一性パーセントの決定は、１２のギャップペナルティ、４のギャップ伸長ペナルティ、及び５のフレームシフトギャップペナルティを用いたＢｌｏｓｓｕｍ ６２スコアリングマトリックスを使用して達成され得る。加えて、「に対応する」という用語は、ポリペプチドにおけるアミノ酸残基又は核酸におけるヌクレオチド残基などの、ポリマーにおける残基の位置／同一性を指定するためにしばしば使用される。当業者は、簡略化の目的のために、そのようなポリマーにおける残基が、参照ポリマーに基づく番号付けシステムを使用してしばしば指定され、そのため、例えば、参照ポリマーにおける４９位における残基「に対応する」第１の配列における残基は、実際には第１のポリマーにおける４９番目の残基である必要はなく、むしろアラインメントに基づいて参照ポリマーにおける４９番目の位置に見出される残基に対応することを理解する。当業者は、特にポリマー配列比較のために設計された１つ以上の市販のアルゴリズムの使用を通じてのものを含めて、「対応する」アミノ酸を特定する方法を容易に理解する。
【0105】
操作されたＴＧＦβＲＩＩタンパク質構築物は、抗体のＦｃ領域を更に含む。これらの抗体は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス又はサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＥ１、ＩｇＥ２）のものであり得る。いくつかの実施形態では、ｈｅ Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）に由来する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４ Ｆｃ領域（例えば、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃ領域）である。
【0106】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアントは、抗体ヒンジ領域（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥヒンジ領域）を通してＦｃ領域に連結される。加えて、Ｆｃ領域は、所望のエフェクター機能又は血清半減期を提供するように改変され得る。
【0107】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアントは、リンカー配列（例えば、配列番号１４）を通してＦｃに連結される。
【0108】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩタンパク質構築物は、抗体（例えば、二重特異性抗体）を更に含む。いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアントは、抗体（例えば、二重特異性抗体）のＣ末端に連結される。いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアントは、ペプチドリンカーを介して、抗体（例えば、二重特異性抗体）のＣ末端に連結される。いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアントは、抗体（例えば、二重特異性抗体）のＮ末端に連結される。いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアントは、抗体の抗原結合ドメインに連結される。
【0109】
操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及びタンパク質構築物の特性
本明細書に記載される操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及びタンパク質構築物は、ＴＧＦβ（例えば、ＴＧＦβ１及び／又はＴＧＦβ２）と、腫瘍細胞、線維芽細胞、又は免疫細胞の表面上で発現されている内因性ＴＧＦβＲＩＩとの間の結合をブロックし得る。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβに結合することによって、操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及びタンパク質構築物は、ＴＧＦβの内因性ＴＧＦβＲＩＩへの結合を阻害し得、それによって、ＴＧＦＢ／ＴＧＦβＲＩＩ経路をブロックする。
本明細書に記載される操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及びタンパク質構築物は、ＴＧＦβ（例えば、ＴＧＦβ１及び／又はＴＧＦβ２）と、腫瘍細胞、線維芽細胞、又は免疫細胞の表面上で発現されている内因性ＴＧＦβＲＩＩとの間の結合をブロックし得る。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβに結合することによって、操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及びタンパク質構築物は、ＴＧＦβの内因性ＴＧＦβＲＩＩへの結合を阻害し得、それによって、ＴＧＦＢ／ＴＧＦβＲＩＩ経路をブロックする。
【0110】
いくつかの実装態様では、操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及びタンパク質構築物は、０．１ｓ－１未満、０．０１ｓ－１未満、０．００１ｓ－１未満、０．０００１ｓ－１未満、又は０．００００１ｓ－１未満の解離速度（ｋｏｆｆ）でＴＧＦβ（例えば、ヒトＴＧＦβ１、ヒトＴＧＦβ３）に結合し得る。いくつかの実施形態では、解離速度（ｋｏｆｆ）は、０．０１ｓ－１超、０．００１ｓ－１超、０．０００１ｓ－１超、０．００００１ｓ－１超、又は０．０００００１ｓ－１超である。
【0111】
いくつかの実施形態では、動力学的会合速度（ｋｏｎ）は、１×１０２／Ｍｓ超、１×１０３／Ｍｓ超、１×１０４／Ｍｓ超、１×１０５／Ｍｓ超、又は１×１０６／Ｍｓ超である。いくつかの実施形態では、動力学的会合速度（ｋｏｎ）は、１×１０５／Ｍｓ未満、１×１０６／Ｍｓ未満、又は１×１０７／Ｍｓ未満である。
【0112】
親和性は、動力学的速度定数の商から演繹され得る（ＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）。いくつかの実施形態では、ＫＤは、１×１０－６Ｍ未満、１×１０－７Ｍ未満、１×１０－８Ｍ未満、１×１０－９Ｍ未満、又は１×１０－１０Ｍ未満である。いくつかの実施形態では、ＫＤは、３００ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、３０ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、９００ｐＭ、８００ｐＭ、７００ｐＭ、６００ｐＭ、５００ｐＭ、４００ｐＭ、３００ｐＭ、２００ｐＭ、１００ｐＭ、９０ｐＭ、８０ｐＭ、７０ｐＭ、６０ｐＭ、５０ｐＭ、４０ｐＭ、３０ｐＭ、２０ｐＭ、又は１０ｐＭ未満である。いくつかの実施形態では、ＫＤは、１×１０－７Ｍ超、１×１０－８Ｍ超、１×１０－９Ｍ超、１×１０－１０Ｍ超、１×１０－１１Ｍ超、又は１×１０－１２Ｍ超である。
【0113】
親和性を測定するための一般的な技術としては、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、及びバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及びタンパク質構築物は、サルＴＧＦβ（例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３）、及び／又はマウスＴＧＦβ（例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３）に結合し得る。いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及びタンパク質構築物は、サルＴＧＦβ（例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３）、及び／又はマウスＴＧＦβ（例えば、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３）に結合し得ない。
【0114】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアントは、ＴＧＦβ２（例えば、ヒトＴＧＦβ２）に結合し得ない。
【0115】
いくつかの実施形態では、熱安定性が決定される。本明細書に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及びタンパク質構築物は、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、又は９５℃超のＴｍを有し得る。いくつかの実施形態では、Ｔｍは、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、又は９５℃未満である。
【0116】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及び／又はそのタンパク質構築物は、ＴＧＦβ１におけるＲ９４、Ｒ２５、Ｋ３７、及び／又はＫ３１と相互作用する。
【0117】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及び／又はそのタンパク質構築物は、ＴＧＦβ３におけるＲ９４、Ｒ２５、Ｋ３７、及び／又はＫ３１と相互作用する。
【0118】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及び／又はそのタンパク質構築物は、水素結合相互作用を介して、ＴＧＦβ１におけるＲ９４、Ｒ２５、Ｋ３７、及び／又はＫ３１と相互作用する。
【0119】
いくつかの実施形態では、操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及び／又はそのタンパク質構築物は、水素結合相互作用を介して、ＴＧＦβ３におけるＲ９４、Ｒ２５、Ｋ３７、及び／又はＫ３１と相互作用する。
【0120】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及び／又はそのタンパク質構築物は、ＴＧＦβ（例えば、ＴＧＦβ１又はＴＧＦβ３）を捕捉し得、それによって、腫瘍微小環境を改善し得る。
【0121】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及び／又はそのタンパク質構築物は、腫瘍増殖を阻害し得る。
【0122】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及び／又はタンパク質構築物は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、又は２００％超である腫瘍増殖阻害パーセンテージ（ＴＧＩ％）を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及び／又はタンパク質構築物は、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１１０％、１２０％、１３０％、１４０％、１５０％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、又は２００％未満である腫瘍増殖阻害パーセンテージを有する。ＴＧＩ％は、例えば、治療開始後３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、若しくは３０日、又は治療開始後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、若しくは１２ヶ月で決定され得る。本明細書で使用される場合、腫瘍増殖阻害パーセンテージ（ＴＧＩ％）は、以下の式を使用して計算される。
Ｔｉは、ｉ日目の治療群における平均腫瘍体積である。Ｔ０は、０日目の治療群における平均腫瘍体積である。Ｖｉは、ｉ日目の対照群における平均腫瘍体積である。Ｖ０は、０日目の対照群における平均腫瘍体積である。
【数1】
【0123】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質構築物は、機能的Ｆｃ領域を有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、又はヒトＩｇＧ４である。いくつかの実施形態では、機能的Ｆｃ領域のエフェクター機能は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。いくつかの実施形態では、機能的Ｆｃ領域のエフェクター機能は、食作用である。いくつかの実施形態では、機能的Ｆｃ領域のエフェクター機能は、ＡＤＣＣ及び食作用である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のタンパク質構築物は、エフェクター機能なしのＦｃ領域を有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃは、ヒトＩｇＧ４ Ｆｃである。いくつかの実施形態では、Ｆｃは、機能的Ｆｃ領域を有しない。例えば、Ｆｃ領域は、ＬＡＬＡ変異（ＥＵ番号付けにおけるＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ変異）、又はＬＡＬＡ－ＰＧ変異（ＥＵ番号付けにおけるＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ変異）を有する。
【0124】
Ｆｃ領域に対するいくつかの他の改変がなされ得る。例えば、システイン残基がＦｃ領域中に導入され得、それによって、この領域における鎖間ジスルフィド結合の形成が可能になる。このようにして生成されたホモ二量体融合タンパク質は、インビトロ及び／又はインビボでの任意の増加した半減期を有し得る。
【0125】
いくつかの実施形態では、ＩｇＧ４は、Ｓ２２８Ｐ変異を有する（ＥＵ番号付け）。Ｓ２２８Ｐ変異は、インビボ及びインビトロでのＩｇＧ４ Ｆａｂアーム交換を防止する。
【0126】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域に付着した（直接的又は間接的に）フコースを欠く炭水化物構造を有するＦｃ領域が提供される。例えば、そのようなＦｃ領域組成におけるフコースの量は、１％～８０％、１％～６５％、５％～６５％又は２０％～４０％であり得る。フコースの量は、例えば、ＷＯ２００８／０７７５４６に記載されるように、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析によって測定されるＡｓｎ２９７に付着した全ての糖構造（例えば、複合、ハイブリッド及び高マンノース構造）の合計に対して相対的な、Ａｓｎ２９７における糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域における約２９７位（Ｆｃ領域残基のＥｕ番号付け、又はＫａｂａｔ番号付けにおける３１４位）に位置するアスパラギン残基を指す。しかしながら、Ａｓｎ２９７はまた、Ｆｃ領域配列におけるマイナーな配列変動に起因して、２９７位の約±３アミノ酸上流又は下流、すなわち、２９４～３００位に位置し得る。そのようなフコシル化バリアントは、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。いくつかの実施形態では、グリカンの不均一性を低下させるために、Ｆｃ領域は、２９７位におけるアスパラギンをアラニンに置き換えるように（Ｎ２９７Ａ）更に操作され得る。
【0127】
いくつかの実施形態では、ＴＧＦβ（例えば、ＴＧＦβ１及び／又はＴＧＦβ３）と本明細書に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及び／又はタンパク質構築物との間の結合親和性は、ＴＧＦβと野生型ＴＧＦβＲＩＩ又はそのタンパク質構築物との間のものと比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、又は５０倍強い。
【0128】
いくつかの実施形態では、ＨＰＬＣ－ＳＥＣの主ピークは、プロテインＡカラムによる精製後の本明細書に記載される操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及び／又はタンパク質構築物の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％を占める。
【0129】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及び／又はタンパク質構築物は、５０ｍｇ／Ｌ超、１００ｍｇ／Ｌ超、２００ｍｇ／Ｌ超、３００ｍｇ／Ｌ超、又は４００ｍｇ／Ｌ超である発現収量を有する。
【0130】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及び／又はそのタンパク質構築物は、ヒトＴＧＦβとヒトＴＧＦβＲＩＩとの間の相互作用をブロックし得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及び／又はそのタンパク質構築物は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＴＧＦβ誘導性シグナル伝達を阻害し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及び／又はそのタンパク質構築物のブロック能力は、その抗ＴＧＦβ参照抗体と比較して、少なくとも少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１１０％、少なくとも１２０％、少なくとも１３０％、少なくとも１４０％、又は少なくとも１５０％である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及び／又はそのタンパク質構築物のブロック能力は、その野生型ＴＧＦβＲＩＩ又はそのタンパク質構築物と比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、４５倍、又は５０倍強い。いくつかの実施形態では、ＴＧＦβ／ＴＧＦβＲＩＩ相互作用をブロックする、操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及び／又はそのタンパク質構築物のＩＣ５０値は、２ｎＭ未満、１ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．４ｎＭ未満、０．３ｎＭ未満、０．２ｎＭ未満、又は０．１ｎＭ未満である。
【0131】
操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及びタンパク質構築物を作製する方法
本明細書に記載されるＴＧＦβＲＩＩのバリアントは、適切なヌクレオチド変化をＴＧＦβＲＩＩペプチド若しくはその一部をコードするＤＮＡ中に導入することによって、又はペプチド合成によって調製され得る。そのようなバリアントとしては、例えば、アミノ酸配列内の残基の欠失、挿入、又は置換が挙げられる。
本明細書に記載されるＴＧＦβＲＩＩのバリアントは、適切なヌクレオチド変化をＴＧＦβＲＩＩペプチド若しくはその一部をコードするＤＮＡ中に導入することによって、又はペプチド合成によって調製され得る。そのようなバリアントとしては、例えば、アミノ酸配列内の残基の欠失、挿入、又は置換が挙げられる。
【0132】
スクリーニングが行われ得る。そのようなバリアントの集団において、いくつかの操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアントは、ＴＧＦβに対する増加した親和性を有する。欠失、挿入、及び／又は組み合わせの任意の組み合わせが、標的に対する増加した結合親和性を有するバリアントに到達するためになされ得る。バリアント中に導入されたアミノ酸変化はまた、グリコシル化部位の数を変化させること（例えば、増加若しくは減少させること）、グリコシル化部位の型を変化させること（例えば、細胞中に存在する酵素によって異なる糖が付着されるようにアミノ酸配列を変化させること）、又は新たなグリコシル化部位を導入することなど、ポリペプチド中への新たな翻訳後修飾を変更又は導入し得る。
【0133】
操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアントは、哺乳動物を含む、動物の任意の種に由来し得る。ＴＧＦβＲＩＩバリアントの非限定的な例としては、ヒト、霊長類、例えば、サル及び類人猿、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ラクダ科（例えば、ラクダ及びラマ）、ニワトリ、ヤギ、並びにげっ歯類（例えば、ラット、マウス、ハムスター及びウサギ）に由来するＴＧＦβＲＩＩバリアントが挙げられる。
【0134】
本開示はまた、本明細書に開示される単離されたポリヌクレオチド（例えば、本明細書に開示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）を含む組換えベクター（例えば、発現ベクター）、その中に組換えベクターが導入される（すなわち、宿主細胞がポリヌクレオチド及び／又はポリヌクレオチドを含むベクターを含むように）宿主細胞、並びに組換え技術による組換えポリペプチド又はその断片の産生を提供する。
【0135】
本明細書で使用される場合、「ベクター」は、ベクターが宿主細胞に導入されるときに、１つ以上の目的のポリヌクレオチドを宿主細胞に送達することができる任意の構築物である。「発現ベクター」は、１つ以上の目的のポリヌクレオチドを、コードされたポリペプチドとして、その中に発現ベクターが導入されている宿主細胞において送達し、発現させることができる。したがって、発現ベクターにおいて、目的のポリヌクレオチドは、目的のポリヌクレオチドが発現ベクターを用いて導入された宿主細胞において翻訳されるように、目的のポリヌクレオチドの組み込み部位において、又はその付近で若しくはそれに隣接して、ベクター内又は宿主細胞のゲノム中のいずれかで、プロモーター、エンハンサー、及び／又はポリＡテールなどの調節エレメントと作動可能に連結されることによって、ベクターにおける発現のために配置される。
【0136】
ベクターは、当該技術分野で知られている方法、例えば、エレクトロポレーション、化学トランスフェクション（例えば、ＤＥＡＥ－デキストラン）、形質転換、トランスフェクション、及び感染及び／又は形質導入（例えば、組換えウイルスを用いる）によって宿主細胞中に導入され得る。したがって、ベクターの非限定的な例としては、ウイルスベクター（これは、組換えウイルスを生成するために使用され得る）、裸のＤＮＡ又はＲＮＡ、プラスミド、コスミド、ファージベクター、及びカチオン性縮合剤と会合したＤＮＡ又はＲＮＡ発現ベクターが挙げられる。
【0137】
いくつかの実装態様では、本明細書に開示されるポリヌクレオチド（例えば、本明細書に開示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）は、ウイルス発現系（例えば、ワクシニア若しくは他のポックスウイルス、レトロウイルス、又はアデノウイルス）を使用して導入され、これは、非病原性（欠陥）の、複製能のあるウイルスの使用を伴い得るか、又は複製欠陥ウイルスを使用し得る。そのような発現系中にＤＮＡを組み込むための技術は、当業者によく知られている。ＤＮＡはまた、「裸」であり得る。裸のＤＮＡの取り込みは、細胞中に効率的に輸送される生分解性ビーズ上にＤＮＡをコーティングすることによって増加され得る。
【0138】
発現のために、本明細書に開示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡインサートは、いくつか例を挙げると、ファージラムダＰＬプロモーター、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ） ｌａｃ、ｔｒｐ及びｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期及び後期プロモーター並びにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターなどの、適切なプロモーター（例えば、異種プロモーター）に作動可能に連結され得る。他の好適なプロモーターは当業者に知られている。いくつかの実施形態では、プロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターである。発現構築物は、転写開始、終結のための部位及び、転写される領域において、翻訳のためのリボソーム結合部位を更に含み得る。構築物によって発現される成熟転写物のコード部分は、最初に翻訳開始を、そして翻訳されるポリペプチドの末端に適切に配置された終止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡ、又はＵＡＧ）を含み得る。
【0139】
示されるように、発現ベクターは、少なくとも１つの選択可能なマーカーを含み得る。そのようなマーカーとしては、真核細胞培養のためのジヒドロ葉酸レダクターゼ又はネオマイシン耐性、並びに大腸菌及び他の細菌における培養のためのテトラサイクリン又はアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。適切な宿主の代表的な例としては、限定されないが、大腸菌、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、及びサルモネラ・チフィリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）細胞などの、細菌細胞、酵母細胞などの、真菌細胞、ドロソフィラ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ） Ｓ２及びスポドプテラ属（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ） Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｂｏｗｅｓメラノーマ、及びＨＫ２９３細胞などの動物細胞、並びに植物細胞が挙げられる。本明細書に記載される宿主細胞のための適切な培養培地及び条件は、当該技術分野で知られている。
【0140】
細菌における使用のための非限定的なベクターとしては、Ｑｉａｇｅｎから入手可能な、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０及びｐＱＥ－９、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能な、ｐＢＳベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、並びにＰｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３－３、ｐＫＫ２３３－３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５が挙げられる。非限定的な真核生物ベクターとしては、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅから入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１及びｐＳＧ、並びにＰｈａｒｍａｃｉａから入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ及びｐＳＶＬが挙げられる。他の好適なベクターは当業者に容易に明らかとなる。
【0141】
使用に好適な非限定的な細菌プロモーターとしては、大腸菌 ｌａｃＩ及びｌａｃＺプロモーター、Ｔ３及びＴ７プロモーター、ｇｐｔプロモーター、ラムダＰＲ及びＰＬプロモーター並びにｔｒｐプロモーターが挙げられる。好適な真核生物プロモーターとしては、ＣＭＶ即時早期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、早期及び後期ＳＶ４０プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のものなどの、レトロウイルスＬＴＲのプロモーター、並びにマウスメタロチオネイン－Ｉプロモーターなどの、メタロチオネインプロモーターが挙げられる。
【0142】
酵母のサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において、アルファファクター、アルコールオキシダーゼ、及びＰＧＨなどの構成的又は誘導性プロモーターを含むいくつかのベクターが使用され得る。
【0143】
宿主細胞中への構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染又は他の方法によってもたらされ得る。そのような方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８６）などの、多くの標準的な実験室マニュアルに記載されている。
【0144】
高等真核生物による本開示のポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、エンハンサー配列をベクター中に挿入することによって増加され得る。エンハンサーは、所与の宿主細胞型においてプロモーターの転写活性を増加させるように作用する、通常、約１０～３００ｂｐの、ＤＮＡのシス作用エレメントである。エンハンサーの例としては、ＳＶ４０エンハンサー（これは、塩基対１００～２７０における複製起点の後期側に位置する）、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。
【0145】
翻訳されたタンパク質の、小胞体の内腔中への、細胞周辺腔中への又は細胞外環境中への分泌のために、適切な分泌シグナルが、発現されるポリペプチド中に組み込まれ得る。シグナルは、ポリペプチドに対して内在性であり得るか、又は異種シグナルであり得る。
【0146】
ポリペプチド（例えば、ＴＧＦβＲＩＩバリアント）は、融合タンパク質（例えば、ＧＳＴ融合物）として又はヒスチジンタグを有してなど、改変された形態で発現され得、分泌シグナルだけでなく、追加の異種機能性領域もまた含み得る。例えば、宿主細胞における、精製の間の、又はその後の取り扱い及び貯蔵の間の安定性及び持続性を改善するために、追加のアミノ酸、特に荷電アミノ酸の領域が、ポリペプチドのＮ末端に付加され得る。また、ペプチド部分が、精製を容易にするために、ポリペプチドに付加され得る。そのような領域は、ポリペプチドの最終的な調製の前に除去され得る。とりわけ、分泌又は排出を生み出すため、安定性を改善するため、及び精製を容易にするための、ペプチド部分のポリペプチドへの付加は、当該技術分野においてよく知られた日常的な技術である。
【0147】
治療の方法
本開示の操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及びタンパク質構築物は、様々な治療目的のために使用され得る。
本開示の操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及びタンパク質構築物は、様々な治療目的のために使用され得る。
【0148】
一態様では、本開示は、対象におけるがんを治療する方法、対象における腫瘍の体積の増加の速度を経時的に低下させる方法、転移が発達するリスクを低下させる方法、又は対象における追加の転移が発達するリスクを低下させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、治療は、がんの進行を中断させ得る、減速させ得る、遅延させ得る、又は阻害し得る。いくつかの実施形態では、治療は、対象におけるがんの１つ以上の症状の数、重症度、及び／又は持続時間の低下をもたらし得る。
【0149】
一態様では、本開示は、治療有効量の本明細書に開示される操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及びタンパク質構築物を、それを必要とする対象（例えば、がんを有するか、又はがんを有するとして特定若しくは診断された対象）、例えば、乳がん（例えば、トリプルネガティブ乳がん）、カルチノイドがん、子宮頸がん、子宮内膜がん、神経膠腫、頭頸部がん、肝臓がん、肺がん、小細胞肺がん、リンパ腫、黒色腫、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、腎臓がん、結腸直腸がん、胃がん、精巣がん、甲状腺がん、膀胱がん、尿道がん、又は血液悪性腫瘍に投与することを含む方法を特徴とする。いくつかの実施形態では、がんは、切除不能な黒色腫若しくは転移性黒色腫、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、膀胱がん、又は転移性ホルモン不応性前立腺がんである。いくつかの実施形態では、対象は、固形腫瘍を有する。いくつかの実施形態では、がんは、頭頸部扁平上皮がん（ＳＣＣＨＮ）、腎細胞がん（ＲＣＣ）、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）、又は結腸直腸がんである。いくつかの実施形態では、がんは、黒色腫、膵がん、中皮腫、血液悪性腫瘍、特に非ホジキンリンパ腫、リンパ腫、慢性リンパ性白血病、又は進行固形腫瘍である。いくつかの実施形態では、がんは、乳がん、卵巣がん、神経膠腫、結腸がん、肝細胞がん、前立腺がん、腎細胞がん、黒色腫、肺がん、膵臓がん、又は肝がんである。
【0150】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物及び方法は、がんのリスクがある患者の治療のために使用され得る。がんを有する患者は、当該技術分野で知られている様々な方法を用いて特定され得る。
【0151】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、重篤な血液障害、例えば、貧血を治療するために使用され得る。
【0152】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法又は本開示の操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及びタンパク質構築物は、がん、嚢胞性線維症、及び／又は無効な赤血球生成によって引き起こされる貧血（例えば、骨髄異形成症候群関連貧血、後天性再生不良性貧血、若しくはファンコーニ貧血）を治療するために使用され得る。
【0153】
本明細書で使用される場合、「有効量」によって、有益な又は所望の結果をもたらすのに十分な量又は投薬量が意味される。いくつかの実施形態では、所望の結果は、疾患、例えば、がんの進行を中断させること、減速させること、遅延させること、又は阻害することを含み得る。有効量は、例えば、操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及びタンパク質構築物、操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及びタンパク質構築物をコードするポリヌクレオチドを含むベクター、並びに／又はその組成物が投与される対象の年齢及び体重、症状の重症度並びに投与経路に応じて変動し、したがって、投与は個別に決定され得る。
【0154】
有効量は、１つ以上の投与において投与され得る。例として、操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及び／又はタンパク質構築物の有効量は、患者におけるがんの進行を寛解、停止、安定化、逆転、阻害、減速及び／若しくは先延ばしさせるのに十分な量であるか、又はインビトロで細胞（例えば、生検細胞、本明細書に記載されるがん細胞のいずれか、若しくは細胞株（例えば、がん細胞株））の増殖を寛解、停止、安定化、逆転、減速及び／又は先延ばしさせるのに十分な量である。当該技術分野で理解されるように、有効量は、とりわけ、患者病歴並びに使用される操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及びタンパク質構築物の型（及び／又は投薬量）などの他の要因に応じて、変動し得る。
【0155】
操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及びタンパク質構築物、操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及びタンパク質構築物をコードするポリヌクレオチド、並びに／又は本明細書に開示される組成物を投与するための有効量及びスケジュールは経験的に決定され得、そのような決定を行うことは当該技術分野の技能の範囲内である。当業者は、投与されなければならない投薬量が、例えば、本明細書に開示される操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及びタンパク質構築物、ポリヌクレオチド、及び／若しくは組成物を受ける哺乳動物、投与経路、ポリヌクレオチドの特定の型、並びに／又は使用される本明細書に開示される組成物及び哺乳動物に投与される他の薬物に応じて変動することを理解する。
【0156】
操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及び／又はタンパク質構築物の有効量の典型的な１日投薬量は、０．１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ（患者体重ｋｇ当たりのｍｇ）である。いくつかの実施形態では、投薬量は、１００ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、又は０．１ｍｇ／ｋｇ未満であり得る。いくつかの実施形態では、投薬量は、１０ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、又は０．１ｍｇ／ｋｇ超であり得る。いくつかの実施形態では、投薬量は、約１０ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、又は１ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、投薬量は、約１～１０ｍｇ／ｋｇ、約１～５ｍｇ／ｋｇ、又は約２～５ｍｇ／ｋｇである。
【0157】
本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及びタンパク質構築物は、少なくとも１週に１回（例えば、１週に１回、１週に２回、１週に３回、１週に４回、１日に１回、１日に２回、又は１日に３回）対象に投与され得る。
【0158】
いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の治療用物質が、操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及びタンパク質構築物を投与する前、又は後に、対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の治療用物質は、対象において１つ以上の追加の治療用物質と操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及びタンパク質構築物との生理活性期間の重複が存在するように対象に投与される。
【0159】
いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の治療用物質が対象に投与され得る。追加の治療用物質は、Ｂ－Ｒａｆの阻害物質、ＥＧＦＲ阻害物質、ＭＥＫの阻害物質、ＥＲＫの阻害物質、Ｋ－Ｒａｓの阻害物質、ｃ－Ｍｅｔの阻害物質、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）の阻害物質、ホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の阻害物質、Ａｋｔの阻害物質、ｍＴＯＲの阻害物質、二重ＰＩ３Ｋ／ｍＴＯＲ阻害物質、ブルトン型チロシンキナーゼ（ＢＴＫ）の阻害物質、並びにイソクエン酸デヒドロゲナーゼ１（ＩＤＨ１）及び／又はイソクエン酸デヒドロゲナーゼ２（ＩＤＨ２）の阻害物質からなる群から選択される１つ以上の阻害物質を含み得る。いくつかの実施形態では、追加の治療用物質は、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ－１）（ＩＤＯ１）の阻害物質（例えば、エパカドスタット）である。
【0160】
いくつかの実施形態では、追加の治療用物質は、ＨＥＲ３の阻害物質、ＬＳＤ１の阻害物質、ＭＤＭ２の阻害物質、ＢＣＬ２の阻害物質、ＣＨＫ１の阻害物質、活性化ヘッジホッグシグナル伝達経路の阻害物質、及びエストロゲン受容体を選択的に分解する作用物質からなる群から選択される１つ以上の阻害物質を含み得る。
【0161】
いくつかの実施形態では、追加の治療用物質は、トラベクテジン、ｎａｂ－パクリタキセル、トレバナニブ、パゾパニブ、セジラニブ、パルボシクリブ、エベロリムス、フルオロピリミジン、ＩＦＬ、レゴラフェニブ、レオリシン、アリムタ、ジカディア、スーテント、テムシロリムス、アキシチニブ、エベロリムス、ソラフェニブ、ヴォトリエント、パゾパニブ、ＩＭＡ－９０１、ＡＧＳ－００３、カボザンチニブ、ビンフルニン、Ｈｓｐ９０阻害物質、Ａｄ－ＧＭ－ＣＳＦ、テマゾロミド（Ｔｅｍａｚｏｌｏｍｉｄｅ）、ＩＬ－２、ＩＦＮａ、ビンブラスチン、サロミド、ダカルバジン、シクロホスファミド、レナリドミド、アザシチジン、レナリドミド、ボルテゾミド（ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｄ）、アムルビシン（ａｍｒｕｂｉｃｉｎｅ）、カルフィルゾミブ、プララトレキサート、及びエンザスタウリンからなる群から選択される１つ以上の治療用物質を含み得る。
【0162】
いくつかの実施形態では、追加の治療用物質は、アジュバント、ＴＬＲアゴニスト、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）アルファ、ＩＬ－１、ＨＭＧＢ１、ＩＬ－１０アンタゴニスト、ＩＬ－４アンタゴニスト、ＩＬ－１３アンタゴニスト、ＩＬ－１７アンタゴニスト、ＨＶＥＭアンタゴニスト、ＩＣＯＳアゴニスト、ＣＸ３ＣＬ１を標的とする治療、ＣＸＣＬ９を標的とする治療、ＣＸＣＬ１０を標的とする治療、ＣＣＬ５を標的とする治療、ＬＦＡ－１アゴニスト、ＩＣＡＭ１アゴニスト、及びセレクチンアゴニストからなる群から選択される１つ以上の治療用物質を含み得る。
【0163】
いくつかの実施形態では、カルボプラチン、ｎａｂ－パクリタキセル、パクリタキセル、シスプラチン、ペメトレキセド、ゲムシタビン、ＦＯＬＦＯＸ、又はＦＯＬＦＩＲＩが対象に投与される。
【0164】
いくつかの実施形態では、追加の治療用物質は、抗ＯＸ４０抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＰＤ－Ｌ２抗体、抗ＴＧＦβＲＩＩ抗体、抗ＴＧＦβ抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、又は抗ＧＩＴＲ抗体である。いくつかの実施形態では、追加の治療用物質は、抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）又は抗ＥＧＦ受容体抗体（例えば、セツキシマブ）である。
【0165】
医薬組成物及び投与経路
本明細書に記載される操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及びタンパク質構築物を含有する医薬組成物もまた本明細書で提供される。医薬組成物は、当該技術分野で知られている任意の方法で製剤化され得る。
本明細書に記載される操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及びタンパク質構築物を含有する医薬組成物もまた本明細書で提供される。医薬組成物は、当該技術分野で知られている任意の方法で製剤化され得る。
【0166】
医薬組成物は、それらの意図される投与経路（例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、又は腹腔内）と適合性であるように製剤化される。組成物は、無菌希釈剤（例えば、無菌水若しくは生理食塩水）、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール若しくは他の合成溶媒、抗菌若しくは抗真菌剤、例えば、ベンジルアルコール若しくはメチルパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなど、抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸若しくは亜硫酸水素ナトリウム、キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸、緩衝剤、例えば、酢酸、クエン酸、若しくはリン酸、及び等張剤、例えば、糖（例えば、デキストロース）、ポリアルコール（例えば、マンニトール若しくはソルビトール）、又は塩（例えば、塩化ナトリウム）、あるいはそれらの任意の組み合わせを含み得る。リポソーム懸濁物もまた薬学的に許容される担体として使用され得る。組成物の調製物は、製剤化され、アンプル、使い捨てシリンジ、又は複数回投与バイアル中に封入され得る。必要とされる場合（例えば、注射用製剤におけるような）、適正な流動性が、例えば、レシチンなどのコーティング、又は界面活性剤の使用によって維持され得る。前記剤の吸収は、吸収を先延ばしさせる作用物質（例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン）を含めることによって延長され得る。あるいは、制御放出は、生分解性、生体適合性ポリマー（例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸）を含み得る、移植物及びマイクロカプセル化送達システムによって達成され得る。
【0167】
本明細書に記載される操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及びタンパク質構築物を含有する組成物は、非経口（例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、又は腹腔内）投与のために、投薬量単位形態（すなわち、投与の容易さ及び投薬量の均一性のために予め決定された量の活性化合物を含有する物理的に分離した単位）で製剤化され得る。
【0168】
非経口投与のための医薬組成物は、好ましくは無菌であり、実質的に等張であり、適正製造規範（ＧＭＰ）条件下で製造される。医薬組成物は、単位剤形（すなわち、単回投与のための投薬量）で提供され得る。医薬組成物は、１つ以上の生理学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤又は補助剤を使用して製剤化され得る。製剤化は、選ばれた投与経路に依存する。注射のために、操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及びタンパク質構築物は、注射の部位における不快感を低下させるために、水溶液中、好ましくは生理学的に適合性の緩衝液中で製剤化され得る。溶液は、懸濁剤、安定化剤及び／又は分散剤などの製剤化物質（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔ）を含有し得る。あるいは、操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及びタンパク質構築物は、使用前の、好適なビヒクル、例えば、無菌パイロジェンフリー水を用いた構成のための凍結乾燥形態であり得る。
【0169】
組成物の毒性及び治療有効性は、細胞培養物又は実験動物（例えば、サル）において標準的な薬学的手順によって決定され得る。例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定し得、治療指数は、ＬＤ５０：ＥＤ５０の比率である。高い治療指数を示す剤が好ましい。剤が望ましくない副作用を示す場合、潜在的な損傷を最小化する（すなわち、望まれない副作用を低下させる）ように注意すべきである。毒性及び治療有効性は、他の標準的な薬学的手順によって決定され得る。
【0170】
例示的な用量としては、対象の体重１キログラム当たりの本明細書に記載される操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及びタンパク質構築物のいずれかのミリグラム又はマイクログラム量（例えば、約１μｇ／ｋｇ～約５００ｍｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ～約５００ｍｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ、約１０μｇ／ｋｇ～約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１μｇ／ｋｇ～約５０μｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、又は約１ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇ）が挙げられる。これらの用量は広い範囲をカバーするが、当業者は、治療用物質はその効力が変動し得、有効量は当該技術分野で知られている方法によって決定され得ることを理解する。典型的には、比較的低い用量が初めに投与され、主治医療専門家若しくは獣医専門家（治療適用の場合）又は研究者（まだ開発段階で研究しているとき）は、適切な応答が得られるまで、その後徐々に用量を増加させ得る。加えて、任意の特定の対象に特異的な用量レベルは、用いられる特定の化合物の活性、対象の年齢、体重、健康全般、性別、及び食事、投与の時間、投与経路、排泄の速度、並びにインビボでの操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及びタンパク質構築物の半減期を含む種々の要因に依存することが理解される。
【0171】
医薬組成物は、容器、パック、又はディスペンサー中に、投与のための説明書と一緒に含まれ得る。本開示はまた、本明細書に記載の様々な使用のための操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント及びタンパク質構築物を製造する方法を提供する。
【実施例0172】
本発明を、以下の実施例において更に説明する。これは、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
【0173】
実施例１．操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアントの設計
ＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメインとそのリガンドＴＧＦβ１との間の境界面の３Ｄ構造を図１Ａに示す。
ＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメインとそのリガンドＴＧＦβ１との間の境界面の３Ｄ構造を図１Ａに示す。
【0174】
ＴＧＦβＲＩＩ／ＴＧＦβ１複合体構造の詳細な分析を行った。構造から、ＴＧＦβＲＩＩのＤ３２（ＴＧＦβ１のＲ９４と相互作用する）及びＥ１１９（ＴＧＦβ１のＲ２５と相互作用する）が、ＴＧＦβ１及びＴＧＦβ３の結合親和性をＴＧＦβ２から区別するための鍵となる残基であることが決定された。したがって、分析は、操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアントが、好ましくはＤ３２及びＥ１１９を保持するべきであることを示す。
【0175】
ＴＧＦβＲＩＩとＴＧＦβ１との間には、２つの主要な水素結合相互作用（Ｄ３２－Ｒ９４及びＥ１１９－Ｒ２５）が存在する。ＴＧＦβＲＩＩのＴＧＦβ１への結合能力を増加させるために、追加の水素結合相互作用を加えることが望ましい。
【0176】
上記の知見に基づいて、ＴＧＦβＲＩＩのＳ４９及びＤ１１８における変異が、ＴＧＦβＲＩＩのＴＧＦβ１への結合親和性を増加させるために重要であり得ると判定された。なぜなら、変異したＴＧＦβＲＩＩは、２つの追加の水素結合相互作用（Ｓ４９Ｅ／Ｑ－Ｋ３７及びＤ１１８Ｅ－Ｋ３１）を有するからである。
【0177】
Ｋ３１は、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、及びＴＧＦβ３の間で保存されている。変異したＴＧＦβＲＩＩのＴＧＦβ２への結合親和性が変化するかどうかを判定するために、結合親和性を調べた。
【0178】
野生型ＴＧＦβＲＩＩよりも高いＴＧＦβ１への結合親和性を有する操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアントを見出すために、Ｓ４９及び／又はＤ１１８を変異させた。アミノ酸位置は、野生型ＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメインの配列（配列番号７）に基づく。
【0179】
操作されたＴＧＦβＲＩＩバリアント（Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩタンパク質）を、図２に列挙される配列に従って、変異したＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメインをＩｇＧ４のＦｃ領域に連結することによって設計した。
【0180】
実施例２．Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩタンパク質についての産生及びＣＭＣ分析
Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩタンパク質を、図２に列挙される配列に従って発現させた。
Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩタンパク質を、図２に列挙される配列に従って発現させた。
【0181】
発現されたタンパク質をプロテインＡカラムによって精製し、続いてＨＰＬＣ－ＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィーと結合した高速液体クロマトグラフィー、Ａｇｉｌｅｎｔ）を行い、高分子量ピークのパーセンテージ（ＨＭＷ％）、主要ピークのパーセンテージ（主要（Ｍａｊｏｒ）％）、及び低分子量ピークのパーセンテージ（ＬＭＷ％）を測定した。アミノ酸配列を、脱免疫化ツール（Ｉｍｍｕｎｅ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｄａｔａｂａｓｅ Ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ、Ｄｈａｎｄａ ｅｔ ａｌ．“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｓｔｒａｔｅｇｙ ａｎｄ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｔｏ ｓｅｌｅｃｔ ｃａｎｄｉｄａｔｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎａｌｏｇｕｅｓ ｗｉｔｈ ｒｅｄｕｃｅｄ ＨＬＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．”Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５３．１（２０１８）：１１８－１３２）を使用して分析して、免疫原性領域を特定した。免疫原性は特定されなかった。
【0182】
図３は、産生及びＣＭＣ分析の結果の要約である。ＨＭＷ％は、プロテインＡ精製後の試料中の高分子量種のパーセンテージを示した。主要％は、プロテインＡ精製後の試料中の主要分子量種のパーセンテージを示した。ＬＭＷ％は、プロテインＡ精製後の試料中の低分子量種のパーセンテージを示した。
【0183】
発現収量を、ＣｕＢｉＡｎＸＣ（ＯＰＴＯＣＥＬＬ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用し、高感度（ｈｓ）ＩｇＧ Ａｓｓａｙキット（４ＢｉｏＣｅｌｌ、カタログ番号：２００１１２、８００３１２）によって決定した。ＨＰＬＣ ＳＥＣプロファイルを、ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ ＳＥＣ ２．７ ｕｍ Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、Ｗａｔｅｒｓ Ｅ２６９５ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｍｏｄｕｌｅ（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によって決定及び分析した。
【0184】
図３におけるデータは、Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩ＿ｍｔ５が、比較的より低い発現収量及びより低い主要分子量種を有することを示した。Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩ＿ｍｔ５を、更なるインビトロ機能分析において使用しなかった。
【0185】
実施例３．ＥＬＩＳＡ結合アッセイ
Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩタンパク質のヒトＴＧＦβへの結合能力を決定するために、結合タイトレーションＥＬＩＳＡアッセイを、示された濃度（１．１ｐＭ、６．４ｐＭ、３８．６ｐＭ、２３１．５ｐＭ、１．４ｎＭ、８．３ｎＭ、５０ｎＭ、又は３００ｎＭ）のＧ４＿ＴＧＦβＲＩＩタンパク質を使用して行った。Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩ（ｗｔ）を、陽性対照として使用した。ＩｇＧ４アイソタイプ対照を、陰性対照として使用した。９６ウェルＥＩＡマイクロプレートを、０．５μｇ／ｍｌのヒトＴＧＦβ（ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、又はＴＧＦβ３）で一晩４℃でコーティングした。５％の脱脂乳を含有する１×ＰＢＳでのブロッキングの後、希釈したＧ４＿ＴＧＦβＲＩＩタンパク質（ｍｔ１、ｍｔ２、ｍｔ３、ｍｔ４）を添加し、室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。非結合タンパク質を、ウェルを１×ＰＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有する１×ＰＢＳ）で３回洗浄することによって除去した。ＨＲＰコンジュゲート二次抗体（１：５０００）を、ウェルに室温（ＲＴ）で１時間添加した。インキュベーション後、過剰な二次抗体を、ウェルを１×ＰＢＳＴで３回洗浄することによって除去した。最後に、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を発色のために添加した。反応を停止し、ＨＲＰ活性を、分光光度計を使用して４５０ｎｍで測定した。
Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩタンパク質のヒトＴＧＦβへの結合能力を決定するために、結合タイトレーションＥＬＩＳＡアッセイを、示された濃度（１．１ｐＭ、６．４ｐＭ、３８．６ｐＭ、２３１．５ｐＭ、１．４ｎＭ、８．３ｎＭ、５０ｎＭ、又は３００ｎＭ）のＧ４＿ＴＧＦβＲＩＩタンパク質を使用して行った。Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩ（ｗｔ）を、陽性対照として使用した。ＩｇＧ４アイソタイプ対照を、陰性対照として使用した。９６ウェルＥＩＡマイクロプレートを、０．５μｇ／ｍｌのヒトＴＧＦβ（ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、又はＴＧＦβ３）で一晩４℃でコーティングした。５％の脱脂乳を含有する１×ＰＢＳでのブロッキングの後、希釈したＧ４＿ＴＧＦβＲＩＩタンパク質（ｍｔ１、ｍｔ２、ｍｔ３、ｍｔ４）を添加し、室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。非結合タンパク質を、ウェルを１×ＰＢＳＴ（０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含有する１×ＰＢＳ）で３回洗浄することによって除去した。ＨＲＰコンジュゲート二次抗体（１：５０００）を、ウェルに室温（ＲＴ）で１時間添加した。インキュベーション後、過剰な二次抗体を、ウェルを１×ＰＢＳＴで３回洗浄することによって除去した。最後に、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を発色のために添加した。反応を停止し、ＨＲＰ活性を、分光光度計を使用して４５０ｎｍで測定した。
【0186】
図４Ａ～４Ｃは、ＥＬＩＳＡによって測定した、Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩタンパク質とヒトＴＧＦβとの間の結合親和性を示す。データは、全ての試験したＧ４＿ＴＧＦβＲＩＩタンパク質が、ＴＧＦβ１及びＴＧＦβ３に結合し得ることを示した。図４Ａに示すように、ＴＧＦβ１について、Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩ＿ｍｔ１及びＧ４＿ＴＧＦβＲＩＩ＿ｍｔ４は、Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩ（ｗｔ）と比較して、より良い結合親和性を示した。Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩ＿ｍｔ２、Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩ＿ｍｔ３、及びＧ４＿ＴＧＦβＲＩＩ（ｗｔ）は、同様の結合親和性を示した。図４Ｃに示すように、ＴＧＦβ３について、Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩ＿ｍｔ１及びＧ４＿ＴＧＦβＲＩＩ＿ｍｔ４は、Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩ（ｗｔ）よりも良い結合親和性を示した。Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩ＿ｍｔ２及びＧ４＿ＴＧＦβＲＩＩ＿ｍｔ３は、Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩ（ｗｔ）よりも悪い結合親和性を示した。図４Ｂに示すように、試験したＴＧＦβＲＩＩタンパク質はいずれもＴＧＦβ２への結合を示さなかった。
【0187】
実施例４．ＥＬＩＳＡ結合アッセイ（オンレート及びオフレート）
Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩタンパク質のヒトＴＧＦβ１へのオンレート及びオフレート結合能力を決定するために、結合タイトレーションＥＬＩＳＡアッセイを、示された濃度（１．１ｐＭ、６．４ｐＭ、３８．６ｐＭ、２３１．５ｐＭ、１．４ｎＭ、８．３ｎＭ、５０ｎＭ、又は３００ｎＭ）のＧ４＿ＴＧＦβＲＩＩタンパク質を使用して行った。Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩ（ｗｔ）を、陽性対照として使用した。ＩｇＧ４アイソタイプ対照を、陰性対照として使用した。オンレート結合能力については、９６ウェルＥＩＡマイクロプレートを、０．５μｇ／ｍｌのヒトＴＧＦβ（ＴＧＦβ１）で一晩４℃でコーティングした。５％の脱脂乳を含有する１×ＰＢＳでのブロッキングの後、希釈したＧ４＿ＴＧＦβＲＩＩタンパク質を添加し、室温（ＲＴ）で５分間インキュベートした。非結合タンパク質を、ウェルを１×ＰＢＳＴ（０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有する１×ＰＢＳ）で３回洗浄することによって除去した。ＨＲＰコンジュゲート二次抗体（１：５０００）を、ウェルにＲＴで１時間添加した。インキュベーション後、過剰な二次抗体を、ウェルを１×ＰＢＳＴで３回洗浄することによって除去した。最後に、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を発色のために添加した。反応を停止し、ＨＲＰ活性を、分光光度計を使用して４５０ｎｍで測定した。
Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩタンパク質のヒトＴＧＦβ１へのオンレート及びオフレート結合能力を決定するために、結合タイトレーションＥＬＩＳＡアッセイを、示された濃度（１．１ｐＭ、６．４ｐＭ、３８．６ｐＭ、２３１．５ｐＭ、１．４ｎＭ、８．３ｎＭ、５０ｎＭ、又は３００ｎＭ）のＧ４＿ＴＧＦβＲＩＩタンパク質を使用して行った。Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩ（ｗｔ）を、陽性対照として使用した。ＩｇＧ４アイソタイプ対照を、陰性対照として使用した。オンレート結合能力については、９６ウェルＥＩＡマイクロプレートを、０．５μｇ／ｍｌのヒトＴＧＦβ（ＴＧＦβ１）で一晩４℃でコーティングした。５％の脱脂乳を含有する１×ＰＢＳでのブロッキングの後、希釈したＧ４＿ＴＧＦβＲＩＩタンパク質を添加し、室温（ＲＴ）で５分間インキュベートした。非結合タンパク質を、ウェルを１×ＰＢＳＴ（０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有する１×ＰＢＳ）で３回洗浄することによって除去した。ＨＲＰコンジュゲート二次抗体（１：５０００）を、ウェルにＲＴで１時間添加した。インキュベーション後、過剰な二次抗体を、ウェルを１×ＰＢＳＴで３回洗浄することによって除去した。最後に、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を発色のために添加した。反応を停止し、ＨＲＰ活性を、分光光度計を使用して４５０ｎｍで測定した。
【0188】
オフレート結合能力については、９６ウェルＥＩＡマイクロプレートを、０．５μｇ／ｍｌのヒトＴＧＦβ（ＴＧＦβ１）で一晩４℃でコーティングした。５％の脱脂乳を含有する１×ＰＢＳでのブロッキングの後、希釈したＧ４＿ＴＧＦβＲＩＩタンパク質を添加し、室温（ＲＴ）でＩ時間インキュベートした。非結合タンパク質を、ウェルを１×ＰＢＳＴ（０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含有する１×ＰＢＳ）で、半時間ごとに洗浄緩衝液を交換しながら２時間８００ｒｐｍシェーカーで洗浄することによって除去した。ＨＲＰコンジュゲート二次抗体（１：５０００）を、ウェルにＲＴで１時間添加した。インキュベーション後、過剰な二次抗体を、ウェルを１×ＰＢＳＴで３回洗浄することによって除去した。最後に、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を発色のために添加した。反応を停止し、ＨＲＰ活性を、分光光度計を使用して４５０ｎｍで測定した。
【0189】
図５Ａは、ＥＬＩＳＡによって測定した、Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩタンパク質とヒトＴＧＦβ１との間のオンレート結合能力を示す。図５Ｂは、ＥＬＩＳＡによって測定した、Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩタンパク質とヒトＴＧＦβ１との間のオフレート結合能力を示す。図５Ａに示すように、オンレートについて、Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩ＿ｍｔ１及びＧ４＿ＴＧＦβＲＩＩ＿ｍｔ４は、Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩ（ｗｔ）よりも良い結合能力を示した。Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩ＿ｍｔ２、Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩ＿ｍｔ３及びＧ４＿ＴＧＦβＲＩＩ（ｗｔ）は、同様の結合能力を示した。図５Ｂに示すように、オフレートについて、Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩ＿ｍｔ１及びｍ４は、Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩ（ｗｔ）よりも良い結合能力を示した。Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩ＿ｍｔ３及びＧ４＿ＴＧＦβＲＩＩ（ｗｔ）は、同様の結合能力を示した。Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩ＿ｍｔ２は、Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩ（ｗｔ）よりも悪い結合能力を示した。図５Ｃは、オンレート結合のＥＣ５０を示す。
【0190】
実施例５．ＢＬＩを使用する結合親和性決定
ＴＧＦβ結合親和性を、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ９６（Ｆｏｒｅｂｉｏ）を使用するバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）によって更に決定した。Ｇ４＿ＴＧＦＢＲＩＩタンパク質を、ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ ｃａｐｔｕｒｅ（ＡＨＣ）Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ、カタログ番号１８－５０６０）上に固定化した。アッセイ緩衝液（ｐＨ７．４の、０．１％のＢＳＡを含む、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含有する１×ＰＢＳ）中で１８．８ｎＭ～７５ｎＭに段階希釈したＴＧＦβ１又はＴＧＦβ３を、Ｇ４＿ＴＧＦＢＲＩＩタンパク質のための分析物として使用した。結合動力学を、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ １１．０ Ｓｏｆｔｗａｒｅ中の１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルを使用して評価した。
ＴＧＦβ結合親和性を、Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ９６（Ｆｏｒｅｂｉｏ）を使用するバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）によって更に決定した。Ｇ４＿ＴＧＦＢＲＩＩタンパク質を、ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ ｃａｐｔｕｒｅ（ＡＨＣ）Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ、カタログ番号１８－５０６０）上に固定化した。アッセイ緩衝液（ｐＨ７．４の、０．１％のＢＳＡを含む、０．０５％のＴｗｅｅｎ－２０を含有する１×ＰＢＳ）中で１８．８ｎＭ～７５ｎＭに段階希釈したＴＧＦβ１又はＴＧＦβ３を、Ｇ４＿ＴＧＦＢＲＩＩタンパク質のための分析物として使用した。結合動力学を、Ｆｏｒｔｅｂｉｏ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ １１．０ Ｓｏｆｔｗａｒｅ中の１：１ Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルを使用して評価した。
【0191】
ＢＬＩ結合アッセイの結果を図６に示す。図６に示すように、Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩ＿ｍｔ１及びＧ４＿ＴＧＦβＲＩＩ＿ｍｔ４は、最も良いＴＧＦβ１及びＴＧＦβ３結合親和性を示した。更に、Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩ＿ｍｔ１及びＧ４＿ＴＧＦβＲＩＩ＿ｍｔ４は、最も良いＴＧＦβ１及びＴＧＦβ３保持時間（ｋｏｆｆ）を示した。
【0192】
実施例６．ＴＧＦβ誘導性ｓｍａｄ２レポーター活性の阻害
Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩタンパク質がＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、又はＴＧＦβ３誘導性ｓｍａｄ２レポーター活性を阻害する能力を決定した。Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩタンパク質を、６．４ｐＭ、３２ｐＭ、１６０ｐＭ、０．８ｎＭ、４ｎＭ、２０ｎＭ、１００ｎＭ、及び５００ｎＭの最終濃度に段階希釈（５倍）した。Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩ（ｗｔ）を、陽性対照として使用した。ＩｇＧ４アイソタイプ対照を、陰性対照として使用した。ｓｍａｄ２レポーターを発現するトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞４×１０３個を、２０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、又はＴＧＦβ３のそれぞれと一緒に、希釈したＧ４＿ＴＧＦβＲＩＩタンパク質とともにインキュベートした。５％ＣＯ２インキューベータ中３７℃での２４時間のインキュベーションの後に、発光シグナルを、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ（商標）ＬＵＸマルチモードマイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ）によって検出した。
Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩタンパク質がＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、又はＴＧＦβ３誘導性ｓｍａｄ２レポーター活性を阻害する能力を決定した。Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩタンパク質を、６．４ｐＭ、３２ｐＭ、１６０ｐＭ、０．８ｎＭ、４ｎＭ、２０ｎＭ、１００ｎＭ、及び５００ｎＭの最終濃度に段階希釈（５倍）した。Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩ（ｗｔ）を、陽性対照として使用した。ＩｇＧ４アイソタイプ対照を、陰性対照として使用した。ｓｍａｄ２レポーターを発現するトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞４×１０３個を、２０ｎｇ／ｍＬのＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、又はＴＧＦβ３のそれぞれと一緒に、希釈したＧ４＿ＴＧＦβＲＩＩタンパク質とともにインキュベートした。５％ＣＯ２インキューベータ中３７℃での２４時間のインキュベーションの後に、発光シグナルを、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ（商標）ＬＵＸマルチモードマイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ）によって検出した。
【0193】
ｓｍａｄ２レポーター活性アッセイからの結果を図７Ａ～７Ｃに示す。図７Ａに示すように、４つ全てのＧ４－ＴＧＦβＲＩＩタンパク質は、ＴＧＦβ１媒介性ｓｍａｄ２レポーター活性を阻害し得る。Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩ＿ｍｔ４及びＧ４＿ＴＧＦβＲＩＩ＿ｍｔ１は、Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩ（ｗｔ）よりも良い阻害効果を示した。Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩ＿ｍｔ２及びＧ４＿ＴＧＦβＲＩＩ＿ｍｔ３は、Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩ（ｗｔ）よりも悪い阻害効果を示した。図７Ｂに示すように、Ｇ４－ＴＧＦβＲＩＩタンパク質はいずれもＴＧＦβ２誘導性ｓｍａｄ２レポーター活性を阻害しなかった。図７Ｃに示すように、４つ全てのＧ４－ＴＧＦβＲＩＩタンパク質は、ＴＧＦβ３媒介性ｓｍａｄ２レポーター活性を阻害し得る。Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩ＿ｍｔ４、Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩ＿ｍｔ１及びＧ４＿ＴＧＦβＲＩＩ＿ｍｔ３は、Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩ（ｗｔ）よりも良い阻害効果を示した。Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩ＿ｍｔ２は、Ｇ４＿ＴＧＦβＲＩＩ（ｗｔ）よりも悪い阻害効果を示した。
【0194】
他の実施形態
本発明を、その詳細な説明と併せて説明したが、前述の説明は、例証することを意図しており、本発明の範囲を限定することは意図しておらず、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲の範囲によって定義されることを理解されたい。他の態様、利点、及び改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内にある。
本発明を、その詳細な説明と併せて説明したが、前述の説明は、例証することを意図しており、本発明の範囲を限定することは意図しておらず、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲の範囲によって定義されることを理解されたい。他の態様、利点、及び改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内にある。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8-1】
【図8-2】
【配列表】
【外国語明細書】