特開 2024-96692 クマリン系架橋試薬

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024096692

(43)【公開日】2024-07-17

(54)【発明の名称】クマリン系架橋試薬

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/53 20060101AFI20240709BHJP

   G01N 33/532 20060101ALI20240709BHJP

   C07K 16/00 20060101ALI20240709BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20240709BHJP

   C12N 9/04 20060101ALI20240709BHJP

   C12N 9/16 20060101ALI20240709BHJP

【ＦＩ】

G01N33/53 J

G01N33/532 A

C07K16/00

C12N15/11 Z

C12N9/04

C12N9/16 B

【審査請求】有

【請求項の数】10

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2024038577

(22)【出願日】2024-03-13

(62)【分割の表示】P 2021514981の分割

【原出願日】2019-09-18

(31)【優先権主張番号】62/733,814

(32)【優先日】2018-09-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＢＲＩＪ

(71)【出願人】

【識別番号】511286517

【氏名又は名称】ヴェンタナ メディカル システムズ， インク．

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】ホン， ルイ

(72)【発明者】

【氏名】ラフィーバー， マーク

(72)【発明者】

【氏名】メイ， エリック

(57)【要約】      （修正有）

【課題】本明細書に開示されるのは、新規のクマリン系試薬、例えばリンカー、および開示されるクマリン系試薬の１つ以上を含むコンジュゲートである。
【解決手段】いくつかの実施形態では、クマリン系試薬内のクマリン部分の存在は、典型的には検出が困難である標識、例えば特定のハプテンの検出を可能にする。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

式（ＩＡ）または（ＩＢ）：

（式中、
ＡおよびＢは、独立して、反応性官能基、検出可能な標識、または酵素反応性部分であり、
Ｌ^１およびＬ^２はリンカーであり、
Ｗは、置換もしくは非置換のクマリン部分、あるいはクマリンの置換もしくは非置換の誘導体または類縁体である部分を含み、
Ｚは結合、－ＣＨ－基、－ＣＨ－ＣＨ_２－基、または－ＣＨ_２－ＣＨ－基であり、
ｍおよびｎは、独立して１～４の範囲の整数である）
のいずれかの構造によって定義される、化合物。

【請求項2】

ＡおよびＢの両方が反応性官能基である、請求項１に記載の化合物。

【請求項3】

Ａが反応性官能基であり、Ｂが検出可能な標識である、請求項１に記載の化合物。

【請求項4】

前記検出可能な標識がハプテン、色素原、またはフルオロフォアである、請求項３に記載の化合物。

【請求項5】

前記ハプテンが、オキサゾール、ピラゾール、チアゾール、ベンゾフラザン、トリテルペン、尿素、ローダミンチオ尿素以外のチオ尿素、ジニトロフェニルまたはトリニトロフェニル以外のニトロアリール、ロテノイド、シクロリグナン、ヘテロビアリール、アゾアリール、およびベンゾジアゼピンからなる群から選択される、請求項４に記載の化合物。

【請求項6】

Ａが、チラミド部分、チラミド部分の誘導体である部分、およびキノンメチド前駆体部分からなる群から選択される酵素反応性部分である、請求項１に記載の化合物。

【請求項7】

前記酵素反応性部分が式（ＶＩＩＡ）：

（式中、各Ｒ^１１基は、Ｈまたは１～４個の炭素原子を有する低級アルキル基から独立して選択され、かつ式中、Ｒ^ｘは、ＨまたはＣ_１～Ｃ_４アルキル基である）
の構造を有する、請求項６に記載の化合物。

【請求項8】

前記酵素反応性部分が式（ＶＩＩＩＡ）：

（式中、
Ｒ^２は、ホスフェート、アミド、ニトロ、尿素、スルフェート、メチル、エステル、ベータ－ラクタム、または糖から選択される基であり、
Ｒ^１３はハロゲン化物であり、
Ｒ^１５、Ｒ^１６、Ｒ^１７、およびＲ^１８は、水素または１～４個の炭素原子を有する脂肪族基から独立して選択され、
Ｒ^１４は、－（ＣＨ_２）_ｗＮＨ－、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｗＮＨ－、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ｗＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（ＣＨ_２）_ｗＮＨ－、－（ＣＨ_２）_ｗＯ－、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｗＯ－、－Ｏ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ｗＯ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（ＣＨ_２）_ｗＯ－、－Ｃ（ｏ）Ｎ（Ｈ）（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（ＣＨ_２）_ｗＳ－、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｗＳ－、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ｗＳ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（ＣＨ_２）_ｗＳ－、－（ＣＨ_２）_ｗＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（ＣＨ_２）ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ_３）（ＣＨ_２）_ｗＮＨ－、または－Ｎ（Ｈ）（ＣＨ_２）_ｗＮＨ－であり、式中、ｗは１～１２の範囲の整数である）
によって提供される構造を有する、請求項６に記載の化合物。

【請求項9】

Ｂがハプテンである、請求項６～８のいずれかに記載の化合物。

【請求項10】

Ｂがクリックケミストリー反応に関与することができる反応性基である、請求項６～８のいずれかに記載の化合物。

【請求項11】

前記クリックケミストリー反応に関与することができる基が、ＤＢＣＯ基、アジド、ＴＣＯ基、アルケン基、またはテトラジン基である、請求項１０に記載の化合物。

【請求項12】

Ｗが式（ＩＶＡ）または（ＩＶＢ）：

（式中、Ｑは結合、または置換もしくは非置換の直鎖もしくは分岐鎖のＣ_１～Ｃ_１６アルキル基、－［（ＣＨ_２ＣＨ_２）_ｊ－Ｏ］_ｋ－ＣＨ_２－、－［（ＣＨ_２）_ｊ－Ｏ］_ｋ－ＣＨ_２－（ｊは１～４の範囲の整数であり、ｋは１～１６の範囲の整数である）；－Ｎ－Ｒ^ｘ－；－Ｃ（Ｏ）－Ｎ－Ｒ^ｘ－；または－Ｎ－Ｒ^ｘ－Ｃ（Ｏ）－であり、Ｒ^ｘはＨまたはＣ_１～Ｃ_４アルキル基であり、Ｙは置換もしくは非置換のクマリン部分、あるいはクマリンの置換もしくは非置換の誘導体または類縁体である部分である）
のいずれかの構造を有する、請求項１～１１のいずれかに記載の化合物。

【請求項13】

前記置換もしくは非置換のクマリン部分、あるいはクマリンの置換もしくは非置換の誘導体または類縁体である部分が、置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_６アルキル基；置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_６アルコキシ基；置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_６ヘテロアルキル基；トリフルオロメチル基；ヒドロキシル基；硫酸基；シアノ基；ハロゲン；リン酸基；糖類；カルボン酸基；ニトロ基；－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－Ｓ－Ｒ^ｘ；－ＳＯ_２；－ＳＯ_２Ｃｌ；－ＳＯ_３Ｈ；－ＳＯ_４Ｈ；－ＳＯ_２ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－Ｎ（Ｈ）－ＮＲ^ｘＲ^ｙ；および－ＮＲ^ｘＲ^ｙからなる群から選択される１つ以上の部分を含み、かつ式中、Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは独立してＨまたはＣ_１～Ｃ_４アルキル基である、請求項１～１１のいずれかに記載の化合物。

【請求項14】

Ｗが式（ＶＡ）または（ＶＢ）：

（式中、式（ＶＡ）の部分は、０、１、２、３、または４個のＲ^ｔ基で置換されてもよく、式（ＶＢ）の化合物は、０、１、２、３、４、または５個のＲ^ｔ基で置換されてもよく、各Ｒ^ｔは、置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_１２アルキル基；置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_１２アルコキシ基、置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_１２ヘテロアルキル基；トリフルオロメチル基；ヒドロキシル基；硫酸基；シアノ基；ハロゲン；リン酸基；糖類；カルボン酸基；ニトロ基；－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－Ｓ－Ｒ^ｘ；－ＳＯ_２；－ＳＯ_２Ｃｌ；－ＳＯ_３Ｈ；－ＳＯ_４Ｈ；－ＳＯ_２ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－Ｎ（Ｈ）－ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－ＮＲ^ｘＲ^ｙから独立して選択され、かつ式中、Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは独立してＨまたはＣ_１～Ｃ_４アルキル基であり、
Ｒ^１は、Ｃ_１～Ｃ_１０の置換または非置換の分岐鎖または非分岐鎖のアルキル基、－Ｏ－、－Ｏ－ＣＨ_２－、－Ｎ（Ｒ^ｘ）－、または－Ｓ－であり、
Ｒ^５は、Ｃ_１～Ｃ_１０の置換または非置換の分岐鎖または非分岐鎖のアルキル基、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｈ）－であり、
各Ｘは、独立して、結合、または置換もしくは非置換の直鎖もしくは分岐鎖のＣ_１～Ｃ_１６アルキル基；－［（ＣＨ_２）_ｊ－Ｏ］_ｋ－ＣＨ_２－（ｊは１～４の範囲の整数であり、ｋは１～１６の範囲の整数である）；－Ｎ－Ｒ^ｘ－；－Ｃ（Ｏ）－Ｎ－Ｒ^ｘ－；または－Ｎ－Ｒ^ｘ－Ｃ（Ｏ）－であり、式中、Ｒ^ｘはＨまたはＣ_１～Ｃ_４アルキル基である）
のいずれかの構造を有する、請求項１～１１のいずれかに記載の化合物。

【請求項15】

Ｗが式（ＶＣ）または（ＶＤ）：

（式中、
Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^６、およびＲ^７は、置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_６アルキル基；置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_６アルコキシ基；置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_６ヘテロアルキル基；トリフルオロメチル基；ヒドロキシル基；硫酸基；シアノ基；ハロゲン；リン酸基；糖類；カルボン酸基；ニトロ基；－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－Ｓ－Ｒ^ｘ；－ＳＯ_２；－ＳＯ_２Ｃｌ；－ＳＯ_３Ｈ；－ＳＯ_４Ｈ；－ＳＯ_２ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－Ｎ（Ｈ）－ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－ＮＲ^ｘＲ^ｙから独立して選択され、
Ｒ^５は、Ｃ_１～Ｃ_１０の置換または非置換の分岐鎖または非分岐鎖のアルキル基、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｈ）－であり、
Ｒ^１は、Ｃ_１～Ｃ_１０の置換または非置換の分岐鎖または非分岐鎖のアルキル基、－Ｏ－、－Ｏ－ＣＨ_２－、－Ｎ（Ｒ^ｘ）－、または－Ｓ－であり、
各Ｘは、独立して、結合、または置換もしくは非置換の直鎖もしくは分岐鎖のＣ_１～Ｃ_１６アルキル基；－［（ＣＨ_２）_ｊ－Ｏ］_ｋ－ＣＨ_２－（ｊは１～４の範囲の整数であり、ｋは１～１６の範囲の整数である）；－Ｎ－Ｒ^ｘ－；－Ｃ（Ｏ）－Ｎ－Ｒ^ｘ－；または－Ｎ－Ｒ^ｘ－Ｃ（Ｏ）－であり、
式中、各Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは、独立してＨまたはＣ_１～Ｃ_４アルキル基である）
のいずれかの構造を有する、請求項１～１１のいずれかに記載の化合物。

【請求項16】

各Ｌ^１および／またはＬ^２基が独立して式（ＶＩＡ）：

（式中、
ｆは０または１～２４の範囲の整数であり、
ｊは１～２４の範囲の整数であり、
Ｒ^８は結合またはＯ、Ｓ、－Ｎ（Ｒ^ｃ）（Ｒ^ｄ）、または－Ｎ^＋（Ｒ^ｃ）（Ｒ^ｄ）（Ｒ^ｅ）であり、
Ｒ^ａおよびＲ^ｂは独立してＨ、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基、Ｆ、Ｃｌ、または－Ｎ（Ｒ^ｃ）（Ｒ^ｄ）であり、
Ｒ^ｃ、Ｒ^ｄ、およびＲ^ｅは、ＨまたはＣ_１～Ｃ_４アルキル基から独立して選択され、
Ｒ^９およびＲ^１０は、独立して、結合、または最大６個の炭素原子を有し、カルボニル、アミド、イミド、エステル、エーテル、アミン、チオン、またはチオールを含む基である）
を有する、請求項１～１５のいずれかに記載の化合物。

【請求項17】

式（ＩＸＡ）または（ＩＸＢ）：

（式中、
Ｔは、特異的結合実体、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖類、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、薬物、脂質、またはナノ粒子から選択される置換基であり、
Ｒ^ｚは検出可能な標識であり、
ｏは１～１０の範囲の整数であり、
Ｌ^１およびＬ^２はリンカーであり、
Ｗは、置換もしくは非置換のクマリン部分、あるいはクマリンの置換もしくは非置換の誘導体または類縁体である部分を含み、
Ｚは結合、－ＣＨ－基、－ＣＨ－ＣＨ_２－基、または－ＣＨ_２－ＣＨ－基であり、
ｍおよびｎは、独立して１～４の範囲の整数である）
のいずれかの構造によって定義される、化合物。

【請求項18】

Ｔが抗体である、請求項１７に記載の化合物。

【請求項19】

前記抗体が一次抗体である、請求項１８に記載の化合物。

【請求項20】

前記抗体が二次抗体である、請求項１８に記載の化合物。

【請求項21】

Ｔが核酸である、請求項１７に記載の化合物。

【請求項22】

Ｒ^ｚがハプテンである、請求項１７～２１のいずれかに記載の化合物。

【請求項23】

Ｒ^ｚが酵素である、請求項１７～２１のいずれかに記載の化合物。

【請求項24】

前記酵素が、ペルオキシダーゼおよびホスファターゼからなる群から選択される、請求項２３に記載の化合物。

【請求項25】

Ｗが式（ＶＣ）または（ＶＤ）：

（式中、
Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^６、およびＲ^７は、置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_６アルキル基；置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_６アルコキシ基；置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_６ヘテロアルキル基；トリフルオロメチル基；ヒドロキシル基；硫酸基；シアノ基；ハロゲン；リン酸基；糖類；カルボン酸基；ニトロ基；－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－Ｓ－Ｒ^ｘ；－ＳＯ_２；－ＳＯ_２Ｃｌ；－ＳＯ_３Ｈ；－ＳＯ_４Ｈ；－ＳＯ_２ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－Ｎ（Ｈ）－ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－ＮＲ^ｘＲ^ｙから独立して選択され、
Ｒ^５は、Ｃ_１～Ｃ_１０の置換または非置換の分岐鎖または非分岐鎖のアルキル基、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｈ）－であり、
Ｒ^１は、Ｃ_１～Ｃ_１０の置換または非置換の分岐鎖または非分岐鎖のアルキル基、－Ｏ－、－Ｏ－ＣＨ_２－、－Ｎ（Ｒ^ｘ）－、または－Ｓ－であり、
各Ｘは、独立して、結合、または置換もしくは非置換の直鎖もしくは分岐鎖のＣ_１～Ｃ_１６アルキル基；－［（ＣＨ_２）_ｊ－Ｏ］_ｋ－ＣＨ_２－（ｊは１～４の範囲の整数であり、ｋは１～１６の範囲の整数である）；－Ｎ－Ｒ^ｘ－；－Ｃ（Ｏ）－Ｎ－Ｒ^ｘ－；または－Ｎ－Ｒ^ｘ－Ｃ（Ｏ）－であり、
式中、各Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは、独立してＨまたはＣ_１～Ｃ_４アルキル基である）
のいずれかの構造を有する、請求項１７～２３のいずれかに記載の化合物。

【請求項26】

各Ｌ^１および／またはＬ^２基が独立して式（ＶＩＡ）：

（式中、
ｆは０または１～２４の範囲の整数であり、
ｊは１～２４の範囲の整数であり、
Ｒ^８は結合またはＯ、Ｓ、－Ｎ（Ｒ^ｃ）（Ｒ^ｄ）、または－Ｎ^＋（Ｒ^ｃ）（Ｒ^ｄ）（Ｒ^ｅ）であり、
Ｒ^ａおよびＲ^ｂは独立してＨ、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基、Ｆ、Ｃｌ、または－Ｎ（Ｒ^ｃ）（Ｒ^ｄ）であり、
Ｒ^ｃ、Ｒ^ｄ、およびＲ^ｅは、ＨまたはＣ_１～Ｃ_４アルキル基から独立して選択され、
Ｒ^９およびＲ^１０は、独立して、結合、または最大６個の炭素原子を有し、カルボニル、アミド、イミド、エステル、エーテル、アミン、チオン、またはチオールを含む基である）
を有する、請求項１７～２５のいずれかに記載の化合物。

【請求項27】

生物学的サンプル内の１つ以上の標的を検出する方法であって、
（ａ）前記生物学的サンプル内の前記標的のうちの１つの第１の標的を、前記第１の標的に特異的な一次抗体で標識することと、
（ｂ）式（ＩＸＣ）または（ＩＸＤ）：

（式中、
Ａｂは二次抗体であり、
Ｒ^ｚは検出可能な標識であり、
ｏは１～１０の範囲の整数であり、
Ｌ^１およびＬ^２はリンカーであり、
Ｗは、置換もしくは非置換のクマリン部分、あるいはクマリンの置換もしくは非置換の誘導体または類縁体である部分を含み、
Ｚは結合、－ＣＨ－基、－ＣＨ－ＣＨ_２－基、または－ＣＨ_２－ＣＨ－基であり、
ｍおよびｎは、独立して１～４の範囲の整数である）のいずれかの化合物と前記サンプルを接触させることと、
（ｃ）前記サンプルを１つ以上の試薬と接触させて、前記検出可能な標識Ｒ^ｚを検出することと、
を含む、方法。

【請求項28】

前記Ａｂが抗一次抗体抗体である、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記一次抗体がハプテンに複合化されており、かつＡｂが抗ハプテン抗体である、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記化合物が、請求項２０、および２２～２６のいずれかの化合物である、請求項２７に記載の方法。

【請求項31】

生物学的サンプル内の１つ以上の標的を検出する方法であって、
（ａ）前記生物学的サンプル内の前記標的のうちの１つの第１の標的を、前記サンプルを酵素を含むコンジュゲートおよび前記第１の標的に特異的な一次抗体と接触させることにより、酵素で標識することと、
（ｂ）式（ＩＡ）または（ＩＢ）：

（式中、
Ａは酵素反応性部分であり、
Ｂは検出可能な標識であり、
Ｌ^１およびＬ^２はリンカーであり、
Ｗは、置換もしくは非置換のクマリン部分、あるいはクマリンの置換もしくは非置換の誘導体または類縁体である部分を含み、
Ｚは結合、－ＣＨ－基、－ＣＨ－ＣＨ_２－基、または－ＣＨ_２－ＣＨ－基であり、
ｍおよびｎは、独立して１～４の範囲の整数である）のいずれかの化合物と前記サンプルを接触させることと、
（ｃ）前記サンプルを１つ以上の試薬と接触させて、前記検出可能な標識Ｂを検出することと、
を含む、方法。

【請求項32】

前記Ｗが式（ＶＣ）または（ＶＤ）：

（式中、
Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^６、およびＲ^７は、置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_６アルキル基；置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_６アルコキシ基；置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_６ヘテロアルキル基；トリフルオロメチル基；ヒドロキシル基；硫酸基；シアノ基；ハロゲン；リン酸基；糖類；カルボン酸基；ニトロ基；－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－Ｓ－Ｒ^ｘ；－ＳＯ_２；－ＳＯ_２Ｃｌ；－ＳＯ_３Ｈ；－ＳＯ_４Ｈ；－ＳＯ_２ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－Ｎ（Ｈ）－ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－ＮＲ^ｘＲ^ｙから独立して選択され、
Ｒ^５は、Ｃ_１～Ｃ_１０の置換または非置換の分岐鎖または非分岐鎖のアルキル基、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｈ）－であり、
Ｒ^１は、Ｃ_１～Ｃ_１０の置換または非置換の分岐鎖または非分岐鎖のアルキル基、－Ｏ－、－Ｏ－ＣＨ_２－、－Ｎ（Ｒ^ｘ）－、または－Ｓ－であり、
各Ｘは、独立して、結合、または置換もしくは非置換の直鎖もしくは分岐鎖のＣ_１～Ｃ_１６アルキル基；－［（ＣＨ_２）_ｊ－Ｏ］_ｋ－ＣＨ_２－（ｊは１～４の範囲の整数であり、ｋは１～１６の範囲の整数である）；－Ｎ－Ｒ^ｘ－；－Ｃ（Ｏ）－Ｎ－Ｒ^ｘ－；または－Ｎ－Ｒ^ｘ－Ｃ（Ｏ）－であり、
式中、各Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは、独立してＨまたはＣ_１～Ｃ_４アルキル基である）
のいずれかの構造を有する、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

式（ＩＡ）または（ＩＢ）のいずれかの前記化合物が少なくとも１５，０００Ｍ－１ｃｍ－１の吸光係数を有する、請求項３１または３２に記載の方法。

【請求項34】

前記化合物が、請求項６から１１のいずれかに記載の化合物である、請求項３１に記載の方法。

【請求項35】

Ｗが式（ＩＶＡ）または（ＩＶＢ）：

（式中、Ｑは結合、または置換もしくは非置換の直鎖もしくは分岐鎖のＣ_１～Ｃ_１６アルキル基、－［（ＣＨ_２ＣＨ_２）_ｊ－Ｏ］_ｋ－ＣＨ_２－、－［（ＣＨ_２）_ｊ－Ｏ］_ｋ－ＣＨ_２－（ｊは１～４の範囲の整数であり、ｋは１～１６の範囲の整数である）；－Ｎ－Ｒ^ｘ－；－Ｃ（Ｏ）－Ｎ－Ｒ^ｘ－；または－Ｎ－Ｒ^ｘ－Ｃ（Ｏ）－であり、Ｒ^ｘはＨまたはＣ_１～Ｃ_４アルキル基であり、Ｙは置換もしくは非置換のクマリン部分、あるいはクマリンの置換もしくは非置換の誘導体または類縁体である部分である）
のいずれかの構造を有する、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記置換もしくは非置換のクマリン部分、あるいはクマリンの置換もしくは非置換の誘導体または類縁体である部分が、置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_６アルキル基；置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_６アルコキシ基；置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_６ヘテロアルキル基；トリフルオロメチル基；ヒドロキシル基；硫酸基；シアノ基；ハロゲン；リン酸基；糖類；カルボン酸基；ニトロ基；－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－Ｓ－Ｒ^ｘ；－ＳＯ_２；－ＳＯ_２Ｃｌ；－ＳＯ_３Ｈ；－ＳＯ_４Ｈ；－ＳＯ_２ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－Ｎ（Ｈ）－ＮＲ^ｘＲ^ｙ；および－ＮＲ^ｘＲ^ｙからなる群から選択される１つ以上の部分を含み、かつ式中、Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは独立してＨまたはＣ_１～Ｃ_４アルキル基である、請求項３４に記載の方法。

【請求項37】

Ｗが式（ＶＡ）または（ＶＢ）：

（式中、式（ＶＡ）の部分は、０、１、２、３、または４個のＲ^ｔ基で置換されてもよく、式（ＶＢ）の化合物は、０、１、２、３、４、または５個のＲ^ｔ基で置換されてもよく、各Ｒ^ｔは、置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_１２アルキル基；置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_１２アルコキシ基；置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_１２ヘテロアルキル基；トリフルオロメチル基；ヒドロキシル基；硫酸基；シアノ基；ハロゲン；リン酸基；糖類；カルボン酸基；ニトロ基；－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－Ｓ－Ｒ^ｘ；－ＳＯ_２；－ＳＯ_２Ｃｌ；－ＳＯ_３Ｈ；－ＳＯ_４Ｈ；－ＳＯ_２ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－Ｎ（Ｈ）－ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－ＮＲ^ｘＲ^ｙから独立して選択され、かつ式中、Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは独立してＨまたはＣ_１～Ｃ_４アルキル基であり、
Ｒ^１は、Ｃ_１～Ｃ_１０の置換または非置換の分岐鎖または非分岐鎖のアルキル基、－Ｏ－、－Ｏ－ＣＨ_２－、－Ｎ（Ｒ^ｘ）－、または－Ｓ－であり、
Ｒ^５は、Ｃ_１～Ｃ_１０の置換または非置換の分岐鎖または非分岐鎖のアルキル基、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｈ）－であり、
各Ｘは、独立して、結合、または置換もしくは非置換の直鎖もしくは分岐鎖のＣ_１～Ｃ_１６アルキル基；－［（ＣＨ_２）_ｊ－Ｏ］_ｋ－ＣＨ_２－（ｊは１～４の範囲の整数であり、ｋは１～１６の範囲の整数である）；－Ｎ－Ｒ^ｘ－；－Ｃ（Ｏ）－Ｎ－Ｒ^ｘ－；または－Ｎ－Ｒ^ｘ－Ｃ（Ｏ）－であり、式中、Ｒ^ｘはＨまたはＣ_１～Ｃ_４アルキル基である）
のいずれかの構造を有する、請求項３４に記載の方法。

【請求項38】

前記Ｗが式（ＶＣ）または（ＶＤ）：

（式中、
Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^６、およびＲ^７は、置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_６アルキル基；置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_６アルコキシ基；置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_６ヘテロアルキル基；トリフルオロメチル基；ヒドロキシル基；硫酸基；シアノ基；ハロゲン；リン酸基；糖類；カルボン酸基；ニトロ基；－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－Ｓ－Ｒ^ｘ；－ＳＯ_２；－ＳＯ_２Ｃｌ；－ＳＯ_３Ｈ；－ＳＯ_４Ｈ；－ＳＯ_２ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－Ｎ（Ｈ）－ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－ＮＲ^ｘＲ^ｙから独立して選択され、
Ｒ^５は、Ｃ_１～Ｃ_１０の置換または非置換の分岐鎖または非分岐鎖のアルキル基、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｈ）－であり、
Ｒ^１は、Ｃ_１～Ｃ_１０の置換または非置換の分岐鎖または非分岐鎖のアルキル基、－Ｏ－、－Ｏ－ＣＨ_２－、－Ｎ（Ｒ^ｘ）－、または－Ｓ－であり、
各Ｘは、独立して、結合、または置換もしくは非置換の直鎖もしくは分岐鎖のＣ_１～Ｃ_１６アルキル基；－［（ＣＨ_２）_ｊ－Ｏ］_ｋ－ＣＨ_２－（ｊは１～４の範囲の整数であり、ｋは１～１６の範囲の整数である）；－Ｎ－Ｒ^ｘ－；－Ｃ（Ｏ）－Ｎ－Ｒ^ｘ－；または－Ｎ－Ｒ^ｘ－Ｃ（Ｏ）－であり、
式中、各Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは、独立してＨまたはＣ_１～Ｃ_４アルキル基である）
のいずれかの構造を有する、請求項３４に記載の方法。

【請求項39】

各Ｌ^１および／またはＬ^２基が独立して式（ＶＩＡ）：

（式中、
ｆは０または１～２４の範囲の整数であり、
ｊは１～２４の範囲の整数であり、
Ｒ^８は結合またはＯ、Ｓ、－Ｎ（Ｒ^ｃ）（Ｒ^ｄ）、または－Ｎ^＋（Ｒ^ｃ）（Ｒ^ｄ）（Ｒ^ｅ）であり、
Ｒ^ａおよびＲ^ｂは独立してＨ、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基、Ｆ、Ｃｌ、または－Ｎ（Ｒ^ｃ）（Ｒ^ｄ）であり、
Ｒ^ｃ、Ｒ^ｄ、およびＲ^ｅは、ＨまたはＣ_１～Ｃ_４アルキル基から独立して選択され、
Ｒ^９およびＲ^１０は、独立して、結合、または最大６個の炭素原子を有し、かつカルボニル、アミド、イミド、エステル、エーテル、アミン、チオン、またはチオールを含む基である）
を有する、請求項３４～３８のいずれかに記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

免疫組織化学（ＩＨＣ）は、特定の抗原に特異的な抗体を使用して、生物学的サンプル中のタンパク質などの抗原を検出、局在化、および／または定量化するプロセスを指す。ＩＨＣは、特定のタンパク質が組織サンプル内のどこにあるかを正確に特定するという実質的な利点を提供する。組織自体を調べるのにも効果的な方法である。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）は、核酸を検出、局在化、および定量化するプロセスを指す。ＩＨＣとＩＳＨはどちらも、組織（新鮮凍結、ホルマリン固定、パラフィン包埋など）および細胞学的サンプルなどの様々な生物学的サンプルに対して実施することができる。標的の認識は、標的が核酸であるか抗原であるかに関わらず、様々な標識（例えば、発色性、蛍光性、発光性、放射性）を使用して検出することができる。臨床現場で標的を確実に検出し、場所を特定し、定量化するには、診断目的で存在量の少ない細胞マーカーを確実に検出する機能がますます重要になるため、認識イベントの増幅が望まれている。例えば、単一の抗原検出イベントに応答してマーカーの部位に数百または数千の標識分子を沈着させると、増幅を通じて、その認識イベントを検出する能力が増強される。

【0002】

組織の抗原および核酸を検出するためにハプテンなどの小分子を使用することは、ＩＨＣの主要な方法になっている。ハプテンは、抗ハプテン抗体と組み合わせて、特定の分子標的を検出するのに役立つ。例えば、一次抗体および核酸プローブなどの特異的結合部分は、１つ以上のハプテン分子で標識することができ、これらの特異的結合部分がそれらの分子標的に結合すると、発色ベースの検出システムまたは蛍光標識などの検出可能な標識の一部としての酵素を含む抗ハプテン抗体コンジュゲートを使用して検出することができる。検出可能な抗ハプテン抗体コンジュゲートのサンプルへの結合は、サンプル中の標的の存在を示す。

【0003】

一部のハプテンは検出が困難であり、その結果、ハプテン負荷において一般的に過大評価されて、コンジュゲート濃度の過小評価につながると考えられている。

【発明の概要】

【0004】

本開示の一態様では、式（ＩＡ）または（ＩＢ）：

【0005】

（式中、

【0006】

ＡおよびＢは、独立して、反応性官能基、検出可能な標識、または酵素反応性部分であり、

【0007】

Ｌ^１およびＬ^２はリンカーであり、

【0008】

Ｗは、置換もしくは非置換のクマリン部分、あるいはクマリンの置換もしくは非置換の誘導体または類縁体である部分を含み、

【0009】

Ｚは結合、－ＣＨ－基、－ＣＨ－ＣＨ_２－基、または－ＣＨ_２－ＣＨ－基であり、

【0010】

ｍおよびｎは、独立して１～４の範囲の整数である）
のいずれかの構造によって定義される化合物である。

【0011】

いくつかの実施形態においては、ＡおよびＢの両方が反応性官能基（例えば、カルボン酸基）である。いくつかの実施形態においては、Ａは反応性官能基であり、Ｂは検出可能な標識である。いくつかの実施形態においては、検出可能な標識はハプテン、色素原、またはフルオロフォアである。いくつかの実施形態では、Ｂはハプテンである。いくつかの実施形態において、ハプテンは、オキサゾール、ピラゾール、チアゾール、ベンゾフラザン、トリテルペン、尿素、ローダミンチオ尿素以外のチオ尿素、ジニトロフェニルまたはトリニトロフェニル以外のニトロアリール、ロテノイド、シクロリグナン、ヘテロビアリール、アゾアリール、およびベンゾジアゼピンからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ハプテンは、ベンゾフランハプテンおよびチアゾールスルホンアミドハプテンからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ハプテンは、５－ニトロ－３－ピラゾールカルバミド（ＮＰ）、２－アセトアミド－４－メチル－５－チアゾールスルホンアミド（ＴＳ）、７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－３－カルボン酸（ｃａｒｂｏｘｙｙｌｉｃ ａｃｉｄ）（ＤＣＣ）、および２，１，３－ベンゾオキサジアゾール－５－カルバミド（ＢＦ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、Ａは、チラミド部分、チラミド部分の誘導体である部分、およびキノンメチド前駆体部分からなる群から選択される酵素反応性部分である。

【0012】

いくつかの実施形態において、式（ＩＡ）または（ＩＢ）のいずれかの化合物は、少なくとも１０，０００Ｍ－１ｃｍ－１の吸光係数を有する。いくつかの実施形態において、式（ＩＡ）または（ＩＢ）のいずれかの化合物は、少なくとも１５，０００Ｍ－１ｃｍ－１の吸光係数を有する。さらに他の実施形態において、式（ＩＡ）または（ＩＢ）のいずれかの化合物は、少なくとも２０，０００Ｍ－１ｃｍ－１の吸光係数を有する。いくつかの実施形態において、式（ＩＡ）または（ＩＢ）のいずれかの化合物は、少なくとも２５，０００Ｍ－１ｃｍ－１の吸光係数を有する。

【0013】

いくつかの実施形態において、酵素反応性部分は式（ＶＩＩＡ）：

【0014】

（式中、各Ｒ^１１基は、Ｈまたは１～４個の炭素原子を有する低級アルキル基から独立して選択され、かつ式中、Ｒ^ｘは、ＨまたはＣ_１～Ｃ_４アルキル基である）
の構造を有する。

【0015】

いくつかの実施形態において、酵素反応性部分は式（ＶＩＩＩＡ）：

（式中、

【0016】

Ｒ^２は、ホスフェート、アミド、ニトロ、尿素、スルフェート、メチル、エステル、ベータ－ラクタム、または糖から選択される基であり、

【0017】

Ｒ^１３はハロゲン化物であり、

【0018】

Ｒ^１５、Ｒ^１６、Ｒ^１７、およびＲ^１８は、水素または１～４個の炭素原子を有する脂肪族基から独立して選択され、

【0019】

Ｒ^１４は、－（ＣＨ_２）_ｗＮＨ－、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｗＮＨ、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ｗＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（ＣＨ_２）_ｗＮＨ－、－（ＣＨ_２）_ｗＯ－、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｗＯ－、－Ｏ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ｗＯ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（ＣＨ_２）_ｗＯ－、－Ｃ（ｏ）Ｎ（Ｈ）（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（ＣＨ_２）_ｗＳ－、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｗＳ－、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ｗＳ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（ＣＨ_２）_ｗＳ－、－（ＣＨ_２）_ｗＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（ＣＨ_２）ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ_３）（ＣＨ_２）_ｗＮＨ－、または－Ｎ（Ｈ）（ＣＨ_２）_ｗＮＨ－であり、ｗは１～１２の範囲の整数である）
によって提供される構造を有する。

【0020】

いくつかの実施形態において、Ｂはクリックケミストリー反応に関与することができる反応性基（例えば、アジド基）である。いくつかの実施形態において、クリックケミストリー反応に関与することができる基は、ＤＢＣＯ基、アジド、ＴＣＯ基、アルケン基、またはテトラジン基である。

【0021】

いくつかの実施形態において、Ｗは式（ＩＶＡ）または（ＩＶＢ）：

【0022】

（式中、Ｑは結合、または置換もしくは非置換の直鎖もしくは分岐鎖のＣ_１～Ｃ_１６アルキル基、－［（ＣＨ_２ＣＨ_２）_ｊ－Ｏ］_ｋ－ＣＨ_２－、－［（ＣＨ_２）_ｊ－Ｏ］_ｋ－ＣＨ_２－（式中、ｊは１～４の範囲の整数であり、ｋは１～１６の範囲の整数である）；－Ｎ－Ｒ^ｘ－；－Ｃ（Ｏ）－Ｎ－Ｒ^ｘ－；または－Ｎ－Ｒ^ｘ－Ｃ（Ｏ）－であり、Ｒ^ｘはＨまたはＣ_１～Ｃ_４アルキル基であり、Ｙは置換もしくは非置換のクマリン部分、あるいはクマリンの置換もしくは非置換の誘導体または類縁体である部分である）。いくつかの実施形態において、置換もしくは非置換のクマリン部分、あるいはクマリンの置換もしくは非置換の誘導体または類縁体である部分が、置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_６アルキル基、置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_６アルコキシ基；置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_６ヘテロアルキル基；トリフルオロメチル基；ヒドロキシル基；硫酸基；シアノ基；ハロゲン；リン酸基；糖類；カルボン酸基；ニトロ基；－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－Ｓ－Ｒ^ｘ；－ＳＯ_２；－ＳＯ_２Ｃｌ；－ＳＯ_３Ｈ；－ＳＯ_４Ｈ；－ＳＯ_２ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－Ｎ（Ｈ）－ＮＲ^ｘＲ^ｙ；および－ＮＲ^ｘＲ^ｙからなる群から選択される１つ以上の部分を含み、かつ式中、Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは独立してＨまたはＣ_１～Ｃ_４アルキル基である）
のいずれかの構造を有する。

【0023】

いくつかの実施形態において、Ｗは式（ＶＡ）または（ＶＢ）：

【0024】

（式中、式（ＶＡ）の部分は、０、１、２、３、または４個のＲ^ｔ基で置換されてもよく、式（ＶＢ）の化合物は、０、１、２、３、４、または５個のＲ^ｔ基で置換されてもよく、各Ｒ^ｔは、置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_１２アルキル基；置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_１２アルコキシ基、置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_１２ヘテロアルキル基；トリフルオロメチル基；ヒドロキシル基；硫酸基；シアノ基；ハロゲン；リン酸基；糖類；カルボン酸基；ニトロ基；－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－Ｓ－Ｒ^ｘ；－ＳＯ_２；－ＳＯ_２Ｃｌ；－ＳＯ_３Ｈ；－ＳＯ_４Ｈ；－ＳＯ_２ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－Ｎ（Ｈ）－ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－ＮＲ^ｘＲ^ｙから独立して選択され、かつ式中、Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは独立してＨまたはＣ_１～Ｃ_４アルキル基であり、

【0025】

Ｒ^１は、Ｃ_１～Ｃ_１０の置換または非置換の分岐鎖または非分岐鎖のアルキル基、－Ｏ－、－Ｏ－ＣＨ_２－、－Ｎ（Ｒ^ｘ）－、または－Ｓ－であり、

【0026】

Ｒ^５は、Ｃ_１～Ｃ_１０の置換または非置換の分岐鎖または非分岐鎖のアルキル基、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｈ）－であり、

【0027】

各Ｘは、独立して、結合、または置換もしくは非置換の直鎖もしくは分岐鎖のＣ_１～Ｃ_１６アルキル基；－［（ＣＨ_２）_ｊ－Ｏ］_ｋ－ＣＨ_２－（ｊは１～４の範囲の整数であり、ｋは１～１６の範囲の整数である）；－Ｎ－Ｒ^ｘ－；－Ｃ（Ｏ）－Ｎ－Ｒ^ｘ－；または－Ｎ－Ｒ^ｘ－Ｃ（Ｏ）－（Ｒ^ｘはＨまたはＣ_１～Ｃ_４アルキル基である）である）
のいずれかの構造を有する。

【0028】

いくつかの実施形態において、Ｗは式（ＶＣ）または（ＶＤ）：

【0029】

（式中、

【0030】

Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^６、およびＲ^７は、置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_６アルキル基；置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_６アルコキシ基；置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_６ヘテロアルキル基；トリフルオロメチル基；ヒドロキシル基；硫酸基；シアノ基；ハロゲン；リン酸基；糖類；カルボン酸基；ニトロ基；－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－Ｓ－Ｒ^ｘ；－ＳＯ_２；－ＳＯ_２Ｃｌ；－ＳＯ_３Ｈ；－ＳＯ_４Ｈ；－ＳＯ_２ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－Ｎ（Ｈ）－ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－ＮＲ^ｘＲ^ｙから独立して選択され、

【0031】

Ｒ^５は、Ｃ_１～Ｃ_１０の置換または非置換の分岐鎖または非分岐鎖のアルキル基、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｈ）－であり、

【0032】

Ｒ^１は、Ｃ_１～Ｃ_１０の置換または非置換の分岐鎖または非分岐鎖のアルキル基、－Ｏ－、－Ｏ－ＣＨ_２－、－Ｎ（Ｒ^ｘ）－、または－Ｓ－であり、

【0033】

各Ｘは、独立して、結合、または置換もしくは非置換の直鎖もしくは分岐鎖のＣ_１～Ｃ_１６アルキル基；－［（ＣＨ_２）_ｊ－Ｏ］_ｋ－ＣＨ_２－（ｊは１～４の範囲の整数であり、ｋは１～１６の範囲の整数である）；－Ｎ－Ｒ^ｘ－；－Ｃ（Ｏ）－Ｎ－Ｒ^ｘ－；または－Ｎ－Ｒ^ｘ－Ｃ（Ｏ）－であり、

【0034】

式中、各Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは、独立してＨまたはＣ_１～Ｃ_４アルキル基である）
のいずれかの構造を有する。

【0035】

いくつかの実施形態では、各Ｌ^１および／またはＬ^２基は、独立して式（ＶＩＡ）：

【0036】

（式中、

【0037】

ｆは０または１～２４の範囲の整数であり、

【0038】

ｊは１～２４の範囲の整数であり、

【0039】

Ｒ^８は結合またはＯ、Ｓ、－Ｎ（Ｒ^ｃ）（Ｒ^ｄ）、または－Ｎ^＋（Ｒ^ｃ）（Ｒ^ｄ）（Ｒ^ｅ）であり、

【0040】

Ｒ^ａおよびＲ^ｂは独立してＨ、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基、Ｆ、Ｃｌ、または－Ｎ（Ｒ^ｃ）（Ｒ^ｄ）であり、

【0041】

Ｒ^ｃ、Ｒ^ｄ、およびＲ^ｅは、ＨまたはＣ_１～Ｃ_４アルキル基から独立して選択され、

【0042】

Ｒ^９およびＲ^１０は、独立して、結合、または最大６個の炭素原子を有し、カルボニル、アミド、イミド、エステル、エーテル、アミン、チオン、またはチオールを含む基である）
を有する。

【0043】

本開示の別の態様では、式（ＩＸＡ）または（ＩＸＢ）：

【0044】

（式中、

【0045】

Ｔは、特異的結合実体、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖類、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、薬物、脂質、またはナノ粒子から選択される置換基であり、

【0046】

Ｒ^ｚは検出可能な標識であり、

【0047】

ｏは１～１０の範囲の整数であり、

【0048】

Ｌ^１およびＬ^２はリンカーであり、

【0049】

Ｗは、置換もしくは非置換のクマリン部分、あるいはクマリンの置換もしくは非置換の誘導体または類縁体である部分を含み、

【0050】

Ｚは結合、－ＣＨ－基、－ＣＨ－ＣＨ_２－基、または－ＣＨ_２－ＣＨ－基であり、

【0051】

ｍおよびｎは、独立して１～４の範囲の整数である）
のいずれかの構造によって定義される化合物である。

【0052】

いくつかの実施形態において、Ｔは抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、一次抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、二次抗体である。いくつかの実施形態において、Ｔは核酸である。いくつかの実施形態では、Ｒ^ｚはハプテンである。いくつかの実施形態では、Ｒ^ｚは酵素である。いくつかの実施形態において、酵素は、ペルオキシダーゼおよびホスファターゼからなる群から選択される。

【0053】

いくつかの実施形態において、Ｗは式（ＶＣ）または（ＶＤ）：

【0054】

（式中、

【0055】

Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^６、およびＲ^７は、置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_６アルキル基；置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_６アルコキシ基；置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_６ヘテロアルキル基；トリフルオロメチル基；ヒドロキシル基；硫酸基；シアノ基；ハロゲン；リン酸基；糖類；カルボン酸基；ニトロ基；－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－Ｓ－Ｒ^ｘ；－ＳＯ_２；－ＳＯ_２Ｃｌ；－ＳＯ_３Ｈ；－ＳＯ_４Ｈ；－ＳＯ_２ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－Ｎ（Ｈ）－ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－ＮＲ^ｘＲ^ｙから独立して選択され、

【0056】

Ｒ^５は、Ｃ_１～Ｃ_１０の置換または非置換の分岐鎖または非分岐鎖のアルキル基、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｈ）－であり、

【0057】

Ｒ^１は、Ｃ_１～Ｃ_１０の置換または非置換の分岐鎖または非分岐鎖のアルキル基、－Ｏ－、－Ｏ－ＣＨ_２－、－Ｎ（Ｒ^ｘ）－、または－Ｓ－であり、

【0058】

各Ｘは、独立して、結合、または置換もしくは非置換の直鎖もしくは分岐鎖のＣ_１～Ｃ_１６アルキル基；－［（ＣＨ_２）_ｊ－Ｏ］_ｋ－ＣＨ_２－（ｊは１～４の範囲の整数であり、ｋは１～１６の範囲の整数である）；－Ｎ－Ｒ^ｘ－；－Ｃ（Ｏ）－Ｎ－Ｒ^ｘ－；または－Ｎ－Ｒ^ｘ－Ｃ（Ｏ）－であり、

【0059】

式中、各Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは、独立してＨまたはＣ_１～Ｃ_４アルキル基である）
のいずれかの構造を有する。

【0060】

いくつかの実施形態では、各Ｌ^１および／またはＬ^２基は、独立して式（ＶＩＡ）：

【0061】

（式中、

【0062】

ｆは０または１～２４の範囲の整数であり、

【0063】

ｊは１～２４の範囲の整数であり、

【0064】

Ｒ^８は結合またはＯ、Ｓ、－Ｎ（Ｒ^ｃ）（Ｒ^ｄ）、または－Ｎ^＋（Ｒ^ｃ）（Ｒ^ｄ）（Ｒ^ｅ）であり、

【0065】

Ｒ^ａおよびＲ^ｂは独立してＨ、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基、Ｆ、Ｃｌ、または－Ｎ（Ｒ^ｃ）（Ｒ^ｄ）であり、

【0066】

Ｒ^ｃ、Ｒ^ｄ、およびＲ^ｅは、ＨまたはＣ_１～Ｃ_４アルキル基から独立して選択され、

【0067】

Ｒ^９およびＲ^１０は、独立して、結合、または最大６個の炭素原子を有し、カルボニル、アミド、イミド、エステル、エーテル、アミン、チオン、またはチオールを含む基である）
を有する。

【0068】

本開示の別の態様では、生物学的サンプル内の１つ以上の標的を検出する方法であって、（ａ）生物学的サンプル内の標的のうちの１つに特異的な一次抗体でサンプルを標識することと、（ｂ）サンプルを式（ＩＸＣ）または（ＩＸＤ）：

【0069】

（式中、

【0070】

Ａｂは二次抗体であり、

【0071】

Ｒ^ｚは検出可能な標識であり、

【0072】

ｏは１～１０の範囲の整数であり、

【0073】

Ｌ^１およびＬ^２はリンカーであり、

【0074】

Ｗは、置換もしくは非置換のクマリン部分、あるいはクマリンの置換もしくは非置換の誘導体または類縁体である部分を含み、

【0075】

Ｚは結合、－ＣＨ－基、－ＣＨ－ＣＨ_２－基、または－ＣＨ_２－ＣＨ－基であり、

【0076】

ｍおよびｎは、独立して１～４の範囲の整数である）のいずれかの化合物とサンプルを接触させることと、

【0077】

（ｃ）サンプルを１つ以上の試薬と接触させて、検出可能な標識Ｒ^ｚを検出することと、
を含む、方法である。

【0078】

いくつかの実施形態において、Ａｂは、抗一次抗体抗体である。いくつかの実施形態では、一次抗体はハプテンに複合化されており、Ａｂは抗ハプテン抗体である。

【0079】

本開示の別の態様は、生物学的サンプル内の１つ以上の標的を検出する方法であって、（ａ）酵素および生物学的サンプル内の標的のうちの１つに特異的な一次抗体を含むコンジュゲートとサンプルを接触させることにより、サンプルを酵素で標識することと、（ｂ）サンプルを式（ＩＡ）または（ＩＢ）：

【0080】

（式中、

【0081】

Ａは酵素反応性部分であり、

【0082】

Ｂは検出可能な標識であり、

【0083】

Ｌ^１およびＬ^２はリンカーであり、

【0084】

Ｗは、置換もしくは非置換のクマリン部分、あるいはクマリンの置換もしくは非置換の誘導体または類縁体である部分を含み、
Ｚは結合、－ＣＨ－基、－ＣＨ－ＣＨ_２－基、または－ＣＨ_２－ＣＨ－基であり、

【0085】

ｍおよびｎは、独立して１～４の範囲の整数である）のいずれかの化合物とサンプルを接触させることと、

【0086】

（ｃ）サンプルを１つ以上の試薬と接触させて、検出可能な標識Ｂを検出することと、
を含む、方法である。

【0087】

いくつかの実施形態において、式（ＩＡ）または（ＩＢ）のいずれかの化合物は、少なくとも１０，０００Ｍ－１ｃｍ－１の吸光係数を有する。いくつかの実施形態において、式（ＩＡ）または（ＩＢ）のいずれかの化合物は、少なくとも１５，０００Ｍ－１ｃｍ－１の吸光係数を有する。さらに他の実施形態では、式（ＩＡ）または（ＩＢ）のいずれかの化合物は、少なくとも２０，０００Ｍ－１ｃｍ－１の吸光係数を有する。いくつかの実施形態において、式（ＩＡ）または（ＩＢ）のいずれかの化合物は、少なくとも２５，０００Ｍ－１ｃｍ－１の吸光係数を有する。

【0088】

いくつかの実施形態において、Ｗが式（ＶＣ）または（ＶＤ）：

【0089】

（式中、

【0090】

Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^６、およびＲ^７は、置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_６アルキル基；置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_６アルコキシ基；置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_６ヘテロアルキル基；トリフルオロメチル基；ヒドロキシル基；硫酸基；シアノ基；ハロゲン；リン酸基；糖類；カルボン酸基；ニトロ基；－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－Ｓ－Ｒ^ｘ；－ＳＯ_２；－ＳＯ_２Ｃｌ；－ＳＯ_３Ｈ；－ＳＯ_４Ｈ；－ＳＯ_２ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－Ｎ（Ｈ）－ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－ＮＲ^ｘＲ^ｙから独立して選択され、

【0091】

Ｒ^５は、Ｃ_１～Ｃ_１０の置換または非置換の分岐鎖または非分岐鎖のアルキル基、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｈ）－であり、

【0092】

Ｒ^１は、Ｃ_１～Ｃ_１０の置換または非置換の分岐鎖または非分岐鎖のアルキル基、－Ｏ－、－Ｏ－ＣＨ_２－、－Ｎ（Ｒ^ｘ）－、または－Ｓ－であり、

【0093】

各Ｘは、独立して、結合、または置換もしくは非置換の直鎖もしくは分岐鎖のＣ_１～Ｃ_１６アルキル基；－［（ＣＨ_２）_ｊ－Ｏ］_ｋ－ＣＨ_２－（ｊは１～４の範囲の整数であり、ｋは１～１６の範囲の整数である）；－Ｎ－Ｒ^ｘ－；－Ｃ（Ｏ）－Ｎ－Ｒ^ｘ－；または－Ｎ－Ｒ^ｘ－Ｃ（Ｏ）－であり、

【0094】

式中、各Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは、独立してＨまたはＣ_１～Ｃ_４アルキル基である）
のいずれかの構造を有する。

【図面の簡単な説明】

【0095】

本開示の特徴の一般的な理解のために、図面を参照する。図面では、同一の要素を特定するために、全体を通して同様の参照符号が使用されている。

【0096】

【図1】図１は、核酸プローブにコンジュゲートされたクマリン系の化合物によるサンプルの染色を示し、クマリン系の化合物は、ジゴキシゲニン（「ＤＩＧ」）に結合されており、ＤＩＧは、当技術分野で知られているように、適切な検出試薬の適用によって検出され得る。

【0097】

【図2】図２は、ヤギ抗ウサギ抗体およびＤＩＧハプテンを含むクマリン系コンジュゲートによるサンプルの染色を示す。ここでは、２つの扁桃腺組織サンプルをＰＤ－Ｌ１に特異的な一次抗体で標識した後、クマリン系コンジュゲートを導入して、サンプル内の標識をＤＩＧで標識した。次に、ペルオキシダーゼに結合した抗ＤＩＧ抗体の導入によってＤＩＧが検出され、ペルオキシダーゼは導入された３，３’－ジアミノベンジジン（「ＤＡＢ」）に作用する。

【0098】

【図3】図３は、ヤギ抗ウサギ抗体およびＤＩＧハプテンを含むクマリン系コンジュゲートによるサンプルの染色を示す。ここでは、２つの扁桃腺組織サンプルをエストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、ＨＥＲ２、およびＫｉ６７に特異的な一次抗体で標識し、続いてクマリン系コンジュゲートを導入してサンプル内の標的をＤＩＧで標識した。次に、ペルオキシダーゼに結合した抗ＤＩＧ抗体の導入によってＤＩＧが検出され、ペルオキシダーゼは導入された３，３’－ジアミノベンジジン（「ＤＡＢ」）に作用する。

【0099】

【図4】図４は、いくつかの実施形態による多重検出戦略の工程を示すフローチャートを示す。

【0100】

【図5】図５は、チラミド部分およびハプテン、例えばＤＩＧに結合した式（ＩＩＩＡ）、（ＩＩＩＢ）、（ＩＩＩＣ）、および（ＩＩＩＤ）のいずれかのクマリン系の部分の使用を示し、ＤＩＧに対して結合されたチラミド部分と染色性能を比較する。

【0101】

【図6】図６は、ＡＲ２Ｇバイオセンサー上でのタンパク質の共有結合による固定化と、それに続く分析物結合のためのスキームを提供する。活性化、固定化およびクエンチの後、固定化されたリガンドと分析物との間の会合および解離の動力学が測定される。

【0102】

【図7】図７は、上に示すマウス抗ハプテン抗体のＢＳＡ－ＣＬ－ＢＦ免疫原との会合および解離工程の代表的な交差反応性スクリーンを示す。Ｍｓ抗ＢＦ ｍＡｂ（Ｈ１、Ｈ６）、Ｍｓ抗ＰＰＴ ｍＡｂ（Ｃ１、Ｃ６）、およびＭｓ抗ＤＡＢＳＹＬ ｍＡｂ（Ｄ１、Ｄ６）の認識を示す。抗ＰＰＴまたは抗ＤＡＢＳＹＬ ｍＡｂとの有意な相互作用は観察されなかった。

【0103】

【図8】図８は、上に示すマウス抗ハプテン抗体のＢＳＡ－ＣＬ－ＢＦ免疫原との会合および解離工程の代表的な交差反応性スクリーンを示す。Ｍｓ抗ＮＰ ｍＡｂ（Ｂ１、Ｂ６；Ｃ１、Ｃ６）およびＭｓ抗ＴＳ ｍＡｂ（Ｈ１、Ｈ６；Ｇ１、Ｇ６）ＢＳＡ－ＣＬＢＦ認識を上に示す。

【0104】

【図9】図９は、上に示すマウス抗ハプテン抗体のＢＳＡ－ＣＬ－ＢＦ免疫原との会合および解離工程の代表的な交差反応性スクリーンを示す。Ｍｓ抗ＮＣＡ ｍＡｂ（Ｂ１、Ｂ６；Ｃ１、Ｃ６）およびＭｓ抗ＨＱ ｍＡｂ（Ｈ１、Ｈ６；Ｇ１、Ｇ６）ＢＳＡ－ＣＬＢＦ認識を上に示す。

【0105】

【図10】図１０は、上に示すマウス抗ハプテン抗体のＢＳＡ－ＣＬ－ＢＦ免疫原との会合および解離工程の代表的な交差反応性スクリーンを示す。Ｍｓ抗ＤＣＣ ｍＡｂ（Ｂ１、Ｂ６；Ｄ１、Ｄ６）およびＭｓ抗ＲＯＴ ｍＡｂ（Ｆ１、Ｆ６；Ｇ１、Ｇ６）ＢＳＡ－ＣＬＢＦ認識を上に示す。

【0106】

【図11】図１１は、上に示すマウス抗ハプテン抗体のＢＳＡ－ＣＬ－ＢＦ免疫原との会合および解離工程の代表的な交差反応性スクリーンを示す。Ｍｓ抗ＤＩＧ ｍＡｂ（Ｂ１、Ｂ６；Ｃ１、Ｃ６）およびＭｓ抗ＤＮＰ ｍＡｂ（Ｆ１、Ｆ６；Ｇ１、Ｇ６）ＢＳＡ－ＣＬＢＦ認識を上に示す。

【0107】

【図12】図１２は、上に示すマウス抗ハプテン抗体のＢＳＡ－ＣＬ－ＢＦ免疫原との会合および解離工程の代表的な交差反応性スクリーンを示す。Ｍｓ抗ＢＤ ｍＡｂ（Ｃ１、Ｃ６；Ｄ１、Ｄ６）およびＭｓ抗ＤＮＰ ｍＡｂ（Ｆ１、Ｆ６；Ｇ１、Ｇ６）ＢＳＡ－ＣＬＢＦ認識を上に示す。

【0108】

【図13】図１３は、分岐鎖色素原リンカーＧＡＲ－ｌｙｓ（ＤＣＣ）ｄＰＥＧ８ＴＳ（化合物Ａ）およびＧＡＲ－ｄＰＥＧ４－ｌｙｓ（ＤＣＣ）ｄＰＥＧ８ＴＳ（化合物Ｂ）を示す。

【0109】

【図14】図１４は、Ｒｂ ｍＡｂ固定化（６００～１８００秒）、ＧＡＲ－Ｒｂ認識（２４００～４２００秒）、および抗ＴＳ標識認識（６０００～７８００秒）により行われたＢＬＩ Ｅｌｉｓａアッセイプロファイルを示す。ＧＡＲ－ｌｙｓ（ＤＣＣ）ｄＰＥＧ８ＴＳコンジュゲート（Ｄ１、Ｃ１）、ＧＡＲ－ｄＰＥＧ４－ｌｙｓ（ＤＣＣ）ｄＰＥＧ８ＴＳコンジュゲート（Ｆ１、Ｅ１）、および未修飾のＧＡＲ ｐＡｂ（Ｇ１、Ｈ１）認識を示す。

【0110】

【図15】図１５は、ＧＡＲ－Ｒｂ認識（２４００～４２００秒）とその後の解離（４２００～６０００秒）を示すＢＬＩ Ｅｌｉｓａアッセイプロファイルを示す。ＧＡＲ－ｌｙｓ（ＤＣＣ）ｄＰＥＧ８ＴＳコンジュゲート（Ｃ１、Ｃ６；Ｄ１、Ｄ６）、ＧＡＲ－ｄＰＥＧ４－ｌｙｓ（ＤＣＣ）ｄＰＥＧ８ＴＳコンジュゲート（Ｆ１、Ｆ６；Ｅ１、Ｅ６）、および未修飾のＧＡＲ ｐＡｂ（Ｈ１、Ｈ６；Ｇ１、Ｇ６）Ｒｂ ｍＡｂ認識を示す。

【0111】

【図16】図１６は、ＴＳハプテン標識（６０００～７８００秒）のＭｓ抗ＴＳ ｍＡｂ認識およびその後のＡｂ解離（７８００～８８００秒）について示されるＢＬＩ Ｅｌｉｓａアッセイプロファイルを示す。ＧＡＲ－ｌｙｓ（ＤＣＣ）ｄＰＥＧ８ＴＳコンジュゲート（Ｃ１、Ｃ８；Ｄ１、Ｄ８）、ＧＡＲ－ｄＰＥＧ４－ｌｙｓ（ＤＣＣ）ｄＰＥＧ８ＴＳコンジュゲート（Ｅ１、Ｅ８；Ｆ１、Ｆ８）、および未修飾のＧＡＲ ｐＡｂ（Ｇ１、Ｇ８；Ｈ１、Ｈ８）認識を示す。

【0112】

【図17】図１７は、Ｒｂ ｍＡｂ固定化（６００～１８００秒）、ＧＡＲ－Ｒｂ認識（２４００～４２００秒）、および抗ＢＦ標識認識（６０００～７８００秒）により行われたＢＬＩ Ｅｌｉｓａアッセイプロファイルを示す。ＧＡＲ－ｄＰＥＧ８ＢＦコンジュゲート（Ｇ１、Ｂ１）およびＧＡＲ－ＣＬＢＦコンジュゲート（黄、ティール）を示す。Ｒｂ ｍＡｂ固定化のない陰性対照センサーを示す（Ｅ１、Ａ１）

【0113】

【図18】図１８は、ＧＡＲ－Ｒｂ認識（２４００～４２００秒）とその後の解離（４２００～６０００秒）を示すＢＬＩ Ｅｌｉｓａアッセイプロファイルを示す。ＧＡＲ－ｄＰＥＧ８ＢＦコンジュゲート（Ｂ１、Ｂ６；Ｇ１、Ｇ６）およびＧＡＲ－ＣＬＢＦコンジュゲート（Ａ１、Ａ８；Ｅ１、Ｅ８）を示す。

【0114】

【図19】図１９は、ＢＦハプテン標識（６０００～７８００秒）のＭｓ抗ＢＦ ｍＡｂ認識およびその後のＡｂ解離（７８００～８８００秒）について示されるＢＬＩ Ｅｌｉｓａアッセイプロファイルを示す。ＧＡＲ－ｄＰＥＧ８ＢＦコンジュゲート（Ｂ１、Ｂ８；Ｇ１、Ｇ８）およびＧＡＲ－ＣＬＢＦコンジュゲート（Ａ１、Ａ８；Ｅ１、Ｅ８）を示す。

【0115】

【図20】図２０は、マレイミド、ＮＨＳエステル、ヒドラジドおよびエチルカルボジアミドを含むがこれらに限定されない、生物学的タンパク質に対する標識試薬の例を示す。

【0116】

【図21】図２１は、本開示のクマリン系コンジュゲートの吸光度スペクトルを示す。

【0117】

【図22】図２２は、本開示のクマリン系コンジュゲートの吸光度スペクトルを示す。

【0118】

【図23】図２３は、２８０ｎｍおよび３４６ｎｍの波長での吸光度スペクトルの比を提供する表を示す。

【0119】

【図24】図２４は、本開示による図２３の３つのクマリン系コンジュゲートのサイズ排除クロマトグラフィー（ｃｈｏｒｏｇｒａｐｈｙ）スペクトルを示す。

【発明を実施するための形態】

【0120】

反対に明確に示されない限り、複数のステップまたは行為を含む本明細書において特許請求の範囲に記載される任意の方法において、方法のステップまたは行為の順序は、必ずしも方法のステップまたは行為が記載される順序に限定されないことも理解されたい。

【0121】

本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明確に指示しない限り、複数の指示対象を含む。同様に、「または」という単語は、文脈が明確に別のことを示さない限り、「および」を含むことを意図している。「含む」という用語は、「ＡまたはＢを含む」がＡ、Ｂ、またはＡおよびＢを含むことを意味するように、包括的に定義される。

【0122】

本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「または」は、上記で定義された「および／または」と同じ意味を有することを理解されたい。例えば、リスト内の項目を区切る場合、「または」または「および／または」は、包括的であると解釈されるものとし、すなわち、要素の数またはリストの少なくとも１つを含むが、複数、および必要に応じて追加のリストに記載されていない項目を含むと解釈される。「のうちの１つのみ」または「のうちの正確に１つ」、または特許請求の範囲で使用される場合、「からなる」など、反対に明確に示される用語のみは、数または要素のリストのうちの正確に１つの要素を含むことを指す。一般に、本明細書で使用される「または」という用語は、「いずれか」、「のうちの１つ」、「のうちの１つのみ」または「のうちの正確に１つ」など、排他性の用語が先行する場合にのみ、排他的な代替案（すなわち、「一方または他方であるが双方ではない」）を示すものとしてのみ解釈されるものとする。「から本質的になる」は、特許請求の範囲で使用される場合、特許法の分野で使用される通常の意味を有するものとする。

【0123】

「備える」、「含む」、「有する」などの用語は、交換可能に使用され、同じ意味を有する。同様に、「備える」、「含む」、「有する」などは、交換可能に使用され、同じ意味を有する。具体的には、各用語は、「含む」という一般的な米国特許法の定義と一致して定義されているため、「少なくとも以下」を意味するオープン用語（ｏｐｅｎ ｔｅｒｍ）として解釈され、また、追加の特徴、制限、態様などを排除することを意図するものではない。したがって、例えば、「構成要素ａ、ｂ、およびｃを有する装置」は、装置が少なくとも構成要素ａ、ｂ、およびｃを備えることを意味する。同様に、「工程ａ、ｂ、およびｃを含む方法」という句は、その方法が少なくとも工程ａ、ｂ、およびｃを含むことを意味する。さらに、工程およびプロセスは、本明細書において特定の順序で概説され得るが、当業者は、工程を順序づけすることおよびプロセスは変化し得ることを認識するであろう。

【0124】

本明細書の明細書および特許請求の範囲で使用される場合、１つ以上の要素のリストに関連する「少なくとも１つ」という句は、要素のリストの任意の１つ以上の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されるべきであるが、必ずしも要素のリスト内に具体的にリスト化されているありとあらゆる要素の少なくとも１つを含まなくてもなく、要素のリスト内の要素の任意の組み合わせを除外するものではない。この定義はまた、「少なくとも１つ」という句が参照する要素のリスト内で具体的に特定される要素以外の要素が、具体的に特定されるそれらの要素に関連するかどうかにかかわらず、必要に応じて存在し得ることを可能にする。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または、同等に、「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または同等に「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、一実施形態では、少なくとも１つ、必要に応じて１つを超えるＡを含み、Ｂが存在しない（および必要に応じて、Ｂ以外の要素を含む）を指すことができ、別の実施形態では、少なくとも１つ、必要に応じて１つを超えるＢを含み、Ａが存在しない（および必要に応じて、Ａ以外の要素を含む）を指すことができ、さらに別の実施形態では、少なくとも１つ、必要に応じて１つを超えるＡを含み、少なくとも１つ、必要に応じて１つを超えるＢを含む（および必要に応じて、他の要素を含む）などを指すことができる。

【0125】

「類縁体」または「誘導体」は、化学および生物学におけるその明白な通常の意味に従って使用され、別の化合物（すなわち、いわゆる「参照」化合物）と構造的に類似しているが、例えば、ある原子を異なる元素の原子で置き換える場合、または特定の官能基の存在下で、またはある官能基を別の官能基で置き換える場合、または参照化合物の１つ以上のキラル中心の絶対立体化学において、組成が異なる化合物を指す。したがって、類縁体は、機能および外観が類似または同等であるが、構造または起源が参照化合物と類似していない化合物である。

【0126】

「アルキル」という用語は、それ自体で、または別の置換基の一部として、特に明記しない限り、完全に飽和、モノまたはポリ不飽和であり得て、指定された炭素原子数（すなわち、Ｃ_１～Ｃ_１０は１～１０個の炭素を意味する）を持つジおよび多価ラジカルを含むことができる直鎖（すなわち、非分岐鎖）または分岐鎖、またはそれらの組み合わせを意味する。「アルキル」は環化されていない。アルキル基の例としては、限定されるものではないが、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｔ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、（シクロヘキシル）メチル、例えば、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシル、ｎ－ヘプチル、ｎ－オクチルなどのホモログおよび異性体などの基が挙げられる。不飽和アルキル基は、１つ以上の二重結合または三重結合を有するものである。不飽和アルキル基の例としては、限定されるものではないが、ビニル、２－プロペニル、クロチル、２－イソペンテニル、２－（ブタジエニル）、２，４－ペンタジエニル、３－（１，４－ペンタジエニル）、エチニル、１－および３－プロピニル、３－ブチニル、ならびにより高次のホモログおよび異性体が挙げられる。アルコキシは、酸素リンカー（－Ｏ－）を介して分子の残りの部分に結合したアルキルである。

【0127】

「アルキレン」という用語は、それ自体で、または別の置換基の一部として、特に明記しない限り、－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２－によって例示されるが、限定されるものではない、アルキルから誘導される二価ラジカルを意味する。典型的には、アルキル（またはアルキレン）基は、１～２４個の炭素原子を有し、１０個以下の炭素原子を有するそれらの基が本発明において好ましい。「低級アルキル」または「低級アルキレン」は、一般に８個以下の炭素原子を有する、より短い鎖のアルキルまたはアルキレン基である。

【0128】

「ヘテロアルキル」という用語は、それ自体でまたは別の用語との組み合わせで、特に明記しない限り、少なくとも１個の炭素原子、ならびにＯ、Ｎ、ＳｉおよびＳからなる群から選択される少なくとも１個のヘテロ原子からなる、安定した直鎖もしくは分岐鎖、またはそれらの組み合わせを意味し、窒素および硫黄原子は任意に酸化されてもよく、窒素ヘテロ原子は任意に四級化されてもよい。ヘテロ原子（複数の場合がある）Ｏ、Ｎ、Ｐ、ＳおよびＳｉは、ヘテロアルキル基の任意の内部位置、またはアルキル基が分子の残部に付加される位置に置かれてもよい。ヘテロアルキルは環化されていない。例として、限定されるものではないが、以下が挙げられる：－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＮＨ－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－Ｓ－ＣＨ_２－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－ＣＨ_２、－Ｓ（Ｏ）－ＣＨ_３、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｓ（Ｏ）_２－ＣＨ_３、－ＣＨ＝ＣＨ－Ｏ－ＣＨ_３、－Ｓｉ（ＣＨ_３）_３、－ＣＨ_２－ＣＨ＝Ｎ－ＯＣＨ_３、－ＣＨ＝ＣＨ－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＨ_３、－Ｏ－ＣＨ_３、－Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_３、および－ＣＮ。例えば、－ＣＨ_２－ＮＨ－ＯＣＨ_３などの、最大２個のヘテロ原子が連続している場合がある。

【0129】

「シクロアルキル」および「ヘテロシクロアルキル」という用語は、それ自体で、または他の用語と組み合わせて、特に明記しない限り、それぞれ、「アルキル」および「ヘテロアルキル」の環状バージョンを意味する。シクロアルキルおよびヘテロシクロアルキルは芳香族ではない。

【0130】

上記の用語のそれぞれ（例えば、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「シクロアルキル」など）は、示されるラジカルの置換形態および非置換形態の両方を含む。

【0131】

アルキルおよびヘテロアルキルのラジカル（しばしばアルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニルと呼ばれる基を含む）の置換基は、限定されるものではないが、０～（２ｍ’＋１）の範囲の数の－ＯＲ’、－Ｏ、－ＮＲ’、－Ｎ－ＯＲ’、－ＮＲ’Ｒ－ＳＲ’、－ハロゲン、－ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＣＯ_２Ｒ’、－ＣＯＮＲ’Ｒ’’、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、－ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＮＲ’－Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、－ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）_２Ｒ’、－ＮＲ－Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）－ＮＲ’’’’、－ＮＲ－Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）－ＮＲ’’’、－Ｓ（Ｏ）Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）_２Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’Ｒ’’、－ＮＲＳＯ_２Ｒ’、－ＣＮ、および－ＮＯ_２から選択される様々な基のうちの１つ以上であり得て、ｍ’はそのようなラジカルの炭素原子の総数である。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、およびＲ’’’’はそれぞれ、好ましくは独立して、水素、置換または非置換ヘテロアルキル、置換または非置換シクロアルキル、置換または非置換ヘテロシクロアルキル、置換または非置換アリール（例えば、１～３個のハロゲンで置換されたアリール）、置換または非置換のアルキル、アルコキシ、もしくはチオアルコキシ基、またはアリールアルキル基を指す。本発明の化合物が複数のＲ基を含む場合、例えば、Ｒ基のそれぞれは、これらの基が１つを超えて存在する場合、各Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’、およびＲ’’’’基と同様に独立して選択される。Ｒ’およびＲ’’が同じ窒素原子に付加される場合、それらは窒素原子と結合し、４、５、６、または７員環を形成することができる。例えば、－ＮＲ’Ｒには、限定されるものではないが、１－ピロリジニルおよび４－モルホリニルが含まれる。置換基の上記の検討より、当業者は、「アルキル」という用語が、ハロアルキル（例えば、－ＣＦ_３および－ＣＨ_２ＣＦ_３）およびアシル（例えば、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_３、－Ｃ（Ｏ）ＣＦ_３、－Ｃ（Ｏ）ＣＨ_２ＯＣＨ_３など）の水素基以外の基に結合した炭素原子を含む基を含むことを意味することを理解するであろう。

【0132】

本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様分子を指し、例として、限定されるものではないが、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、それらの組み合わせ、ならびに任意の脊椎動物における（例えば、ヒト、ヤギ、ウサギおよびマウスなどの哺乳動物における）免疫応答中に産生される類似の分子、ならびに他の分子への結合を実質的に排除するために、目的の分子（または目的の非常に類似する分子のグループ）に特異的に結合する抗体断片を指す。抗体は、さらに、抗原のエピトープを特異的に認識して結合する少なくとも軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドリガンドを指す。抗体は、重および軽鎖で構成されてもよく、それらの各々には可変重（ＶＨ）領域および可変軽（ＶＬ）領域と呼ばれる可変領域がある。まとまって、ＶＨ領域およびＶＬ領域は、抗体によって認識される抗原を結合することの原因となる。抗体という用語はまた、インタクトの免疫グロブリン、ならびに当技術分野でよく知られているそれらの変異体および部分を含む。

【0133】

本明細書で使用される場合、「生物学的サンプル」、「組織サンプル」、「標本」などの用語は、ウイルスを含む任意の生物から得られる生体分子（タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、炭水化物、またはそれらの組み合わせなど）を含む任意のサンプルを指す。生物の他の例は、哺乳類（人間、猫、犬、馬、牛、および豚などの獣医動物、ならびにマウス、ラット、霊長類などの実験動物など）、昆虫、環形動物、クモ形類動物、有袋類、爬虫類、両生類、細菌、および菌類などを含む。生物学的サンプルは、組織サンプル（組織切片や組織の針生検など）、細胞サンプル（Ｐａｐ塗抹標本もしくは血液塗抹標本などの細胞学的塗抹標本、またはマイクロダイセクションによって得られた細胞のサンプルなど）、または細胞分画、断片または細胞小器官（細胞を溶解し、遠心分離などによってそれらの成分を分離することによって得られる）を含む。生物学的サンプルの他の例は、血液、血清、尿、精液、糞便、脳脊髄液、間質液、粘膜、涙、汗、膿、生検組織（例えば、外科的生検または針生検によって得られる）、乳頭吸引物、耳垢、乳、膣液、唾液、ぬぐい液（頬スワブなど）、または最初の生物学的サンプルに由来する生体分子を含む任意の材料を含む。特定の実施形態では、本明細書で使用される「生物学的サンプル」という用語は、対象から得られた腫瘍またはその一部から調製されたサンプル（均質化または液化されたサンプルなど）を指す。

【0134】

本明細書で使用される場合、「コンジュゲート」という用語は、より大きな構築物に共有結合している２つ以上の分子または部分（高分子または超分子分子を含む）を指す。いくつかの実施形態において、コンジュゲートは、１つ以上の他の分子部分に共有結合された１つ以上の生体分子（ペプチド、タンパク質、酵素、糖、多糖類、脂質、糖タンパク質、およびリポタンパク質など）を含む。

【0135】

本明細書で使用される「クマリン」という用語は、蛍光誘導体化剤を指す。本明細書で使用される場合、クマリンは、例えば、ハロ置換クマリン（例えば、クロロクマリン、フルオロクマリン、ブロモクマリンおよびその誘導体）、ヒドロキシクマリンおよびその誘導体（ウンベリフェロンおよびその誘導体を含む）、シアノクマリンおよびその誘導体、メチルクマリンおよびその誘導体、エトキシクマリンおよびその誘導体、ベンゾクマリンおよびその誘導体、フェニルクマリンおよびその誘導体、アセチルクマリンおよびその誘導体を含む）、ならびにそれらのカルボキシル化誘導体およびスクシンイミジルエステルなどのその誘導体を含む。前述の誘導体は非限定的であり、単に例として提供されているにすぎない。

【0136】

本明細書で使用される場合、「結合」または「結合する」という用語は、ある分子または原子の別の分子または原子への結合（ｊｏｉｎｉｎｇ）、結合（ｂｏｎｄｉｎｇ）（例えば、共有結合）、または連結を指す。

【0137】

「ハロ」または「ハロゲン」という用語は、それら自体でまたは別の置換基の一部として、特に明記しない限り、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素原子を意味する。加えて、「ハロアルキル」などの用語は、モノハロアルキルおよびポリハロアルキルを含むことを意味する。例えば、「ハロ（Ｃ_１～Ｃ_４）アルキル」という用語は、これらに限定されないが、フルオロメチル、ジフルオロメチル、トリフルオロメチル、２，２，２－トリフルオロエチル、４－クロロブチル、３－ブロモプロピルなどを含む。

【0138】

本明細書で使用される場合、「ハプテン」は、抗体と特異的に結合することができるが、典型的には、担体分子との組み合わせを除いて免疫原性であることが実質的に不可能である小分子である。

【0139】

「ヘテロ原子」という用語は、本明細書で使用される場合、ホウ素（Ｂ）、酸素（Ｏ）、窒素（Ｎ）、硫黄（Ｓ）、およびケイ素（Ｓｉ）を含むことを意味する。

【0140】

本明細書で使用される「低級置換基（ｌｏｗｅｒ ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ）」または「低級置換基（ｌｏｗｅｒ ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ ｇｒｏｕｐ）」は、「置換基」について上記のすべての置換基から選択される基を意味し、各置換または非置換アルキルは、置換または非置換Ｃ_１～Ｃ_８アルキルであり、各置換または非置換ヘテロアルキルは、置換または非置換の２～８員のヘテロアルキルであり、各置換または非置換シクロアルキルは、置換または非置換Ｃ_５～Ｃ_７シクロアルキルであり、各置換または非置換ヘテロシクロアルキルは、置換または非置換の５～７員ヘテロシクロアルキルである。

【0141】

本明細書で使用される場合、「一次抗体」という用語は、組織サンプル中の標的タンパク質抗原に特異的に結合する抗体を指す。一次抗体は通常、免疫組織化学的手法で使用される第１の抗体である。

【0142】

本明細書で使用される「反応性基」または「反応性官能基」という用語は、異なる部分の官能基と化学的に反応して共有結合を形成することができる官能基を意味する。

【0143】

本明細書で使用される場合、本明細書での「二次抗体」という用語は、一次抗体に特異的に結合し、それにより、もしあれば、一次抗体と後続の試薬（例えば、標識、酵素など）との間に架橋を形成する抗体を指す。二次抗体は、一般的に免疫組織化学的手法で使用される第２の抗体である。

【0144】

本明細書で使用される場合、「特異的結合実体」という用語は、特異的結合対のメンバーを指す。特異的結合対は、他の分子への結合を実質的に排除して互いに結合することを特徴とする分子の対である（例えば、特異的結合対は、生物学的サンプル中の他の分子との結合対の２つのメンバーのいずれかの結合定数よりも少なくとも１０＾３Ｍ－１大きい、１０＾４Ｍ－１大きいまたは１０＾５Ｍ－１大きい結合定数を有することができる）。特異的結合部分の特定の例は、特異的結合タンパク質（例えば、抗体、レクチン、ストレプトアビジンなどのアビジン、およびプロテインＡ）を含む。特異的結合部分はまた、そのような特異的結合タンパク質によって特異的に結合される分子（またはその部分）を含むことができる。

【0145】

本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「染色」、「染色している」などの用語は、一般に、生物学的標本中の特定の分子（脂質、タンパク質、または核酸など）または特定の構造（正常または悪性の細胞、細胞質ゾル、核、ゴルジ装置、または細胞骨格など）の存在、位置、および／または量（濃度など）を検出および／または区別する生物学的標本の任意の処理を指す。例えば、染色は、特定の分子または特定の細胞構造と生物学的標本の周囲の部分との間のコントラストを提供することができ、染色の強度は、標本中の特定の分子の量の尺度を提供することができる。染色を、明視野顕微鏡だけでなく、位相差顕微鏡、電子顕微鏡、および蛍光顕微鏡などの他の観察ツールを使用して、分子、細胞構造、および生物の観察を支援するために使用することができる。システムによって実行されるいくつかの染色は、細胞の輪郭を視覚化するために使用されることができる。システムによって実行される他の染色は、他の細胞成分の染色なしで、または比較的少ない染色で、染色される特定の細胞成分（分子または構造など）に依存する場合がある。システムによって実行される染色方法のタイプの例は、これらに限定されるものではないが、組織化学的方法、免疫組織化学的方法、および核酸分子間のハイブリッド形成反応などの分子間の反応（非共有結合相互作用を含む）に基づく他の方法を含む。特定の染色法は、これらに限定されるものではないが、一次染色法（例えば、Ｈ＆Ｅ染色、Ｐａｐ染色など）、酵素結合免疫組織化学的方法、および蛍光原位置ハイブリッド形成（ＦＩＳＨ）などの原位置ＲＮＡおよびＤＮＡハイブリッド形成法を含む。

【0146】

本明細書で使用される場合、「標的」という用語は、存在、位置、および／または濃度が判定される、または判定されることができる任意の分子を指す。標的分子の例は、タンパク質、核酸配列、およびタンパク質に共有結合したハプテンなどのハプテンを含む。標的分子は、通常、特異的結合分子と検出可能な標識の１つ以上の共役を使用して検出される。

【0147】

本明細書全体を通して「一実施形態」または「実施形態」への言及は、実施形態に関連して説明される特定の特徴、構造または特性が少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書全体を通して様々な場所での「一実施形態において」または「実施形態において」という句の出現は、必ずしもすべてが同じ実施形態を指すとは限らない。さらにまた、特定の特徴、構造、または特性は、１つ以上の実施形態において、任意の適切な方法で組み合わせられることができる。
［００１００］ 本明細書で提供される見出しは、便宜上のものであり、開示される実施形態の範囲または意味を解釈するものではない。

【0148】

クマリン系試薬

【0149】

本明細書でさらに詳細に記載されるように、本開示は、新規のクマリン系試薬、例えばリンカー、および開示されるクマリン系試薬の１つ以上を含むコンジュゲートを提供する。いくつかの実施形態では、クマリン系試薬内のクマリン部分の存在は、典型的には検出が困難である標識、例えば特定のハプテンの検出を可能にする。いくつかの実施形態では、検出が困難なハプテンとしては、ベンゾフランハプテンおよびチアゾールスルホンアミドハプテンが挙げられる。いくつかの実施形態において、検出が困難なハプテンとしては、５－ニトロ－３－ピラゾールカルバミド（ＮＰ）、２－アセトアミド－４－メチル－５－チアゾールスルホンアミド（ＴＳ）、７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－３－カルボン酸（ｃａｒｂｏｘｙｙｌｉｃ ａｃｉｄ）（ＤＣＣ）、および２，１，３－ベンゾオキサジアゾール－５－カルバミド（ＢＦ）が挙げられる。抗体の変性および／または凝集は、一般に、これらの検出が困難な標識について分析された範囲でバックグラウンドＵＶ／ＶＩＳ吸収を引き起こすと考えられている。結果として、ハプテン標識を検出するのが難しいコンジュゲートは、一般的にハプテン負荷において過大評価され、コンジュゲート濃度の過小評価につながる。本明細書に開示されるクマリン系試薬の使用は、この問題を軽減すると考えられる。

【0150】

いくつかの実施形態では、本開示のクマリン系試薬は、少なくとも１０，０００Ｍ－１ｃｍ－１の吸光係数を有する。他の実施形態では、本開示のクマリン系試薬は、少なくとも１５，０００Ｍ－１ｃｍ－１の吸光係数を有する。さらに他の実施形態では、本開示のクマリン系試薬は、少なくとも２０，０００Ｍ－１ｃｍ－１の吸光係数を有する。さらなる実施形態では、本開示のクマリン系試薬は、少なくとも２５，０００Ｍ－１ｃｍ－１の吸光係数を有する。いくつかの実施形態では、本開示のクマリン系の化合物は、約３４０ｎｍ～約５００ｎｍの吸光度波長を有する。

【0151】

いくつかの実施形態において、本開示のクマリン系試薬は、式（ＩＡ）または（ＩＢ）：

【0152】

（式中、

【0153】

ＡおよびＢは、独立して、反応性官能基、検出可能な標識、または酵素反応性部分であり、

【0154】

Ｌ^１およびＬ^２はリンカーであり、

【0155】

Ｗは、置換もしくは非置換のクマリン部分、あるいはクマリンの置換もしくは非置換の誘導体または類縁体である部分を含み、

【0156】

Ｚは結合、－ＣＨ－基、－ＣＨ－ＣＨ_２－基、または－ＣＨ_２－ＣＨ－基であり、

【0157】

ｍおよびｎは、独立して１～４の範囲の整数である）
の構造を有する。

【0158】

いくつかの実施形態では、ｍおよびｎは独立して１または２である。いくつかの実施形態では、ｍまたはｎの少なくとも１つは１である。いくつかの実施形態では、ｍおよびｎの両方が１である。いくつかの実施形態では、ｍまたはｎの一方は１であり、ｍまたはｎの他方は２である。

【0159】

いくつかの実施形態では、ＡおよびＢの両方が反応性官能基である。そのような化合物の例は、本明細書では化合物（４２）として提示されている。そのような化合物は、例えば、架橋剤、例えば２つの抗体またはタンパク質を互いに架橋する、架橋剤として有用であり得る。

【0160】

基Ａ、Ｂ、Ｌ^１、Ｌ^２、Ｗ、ｍ、およびｎのそれぞれは、本明細書でさらに詳細に定義される。

【0161】

いくつかの実施形態において、本開示のクマリン系試薬は、式（ＩＩＡ）または（ＩＩＢ）：

【0162】

（式中、

【0163】

Ａ^１は反応性官能基であり、

【0164】

Ｂ^１は検出可能な標識であり、

【0165】

Ｌ^１およびＬ^２はリンカーであり、

【0166】

Ｗは、置換もしくは非置換のクマリン部分、あるいはクマリンの置換もしくは非置換の誘導体または類縁体である部分を含み、

【0167】

Ｚは結合、－ＣＨ－基、－ＣＨ－ＣＨ_２－基、または－ＣＨ_２－ＣＨ－基であり、

【0168】

ｍおよびｎは、独立して１～４の範囲の整数である）
の構造を有する。

【0169】

一部の実施形態では、検出可能な部分は、ハプテンである。他の実施形態では、検出可能な部分は、酵素である。他の実施形態では、検出可能な部分は、色素原である。さらなる実施形態では、検出可能な部分は、フルオロフォアである。これらのタイプの検出可能な標識のそれぞれの具体例が本明細書に開示されている。

【0170】

いくつかの実施形態では、式（ＩＩＡ）および（ＩＩＢ）の化合物は、別の高分子、薬物、または生体分子に結合することができる。例えば、反応性官能基は、タンパク質または抗体のアミン基と反応して、タンパク質または抗体とクマリン系試薬とのコンジュゲートを形成することができる場合がある。他の結合方法が想定され、本明細書に開示されている。いくつかの実施形態において、そのようなコンジュゲートは、組織標識または染色試薬として利用され得る。

【0171】

いくつかの実施形態において、本開示のクマリン系試薬は、式（ＩＩＣ）または（ＩＩＤ）：

【0172】

（式中、

【0173】

Ａ^１は反応性官能基であり、

【0174】

Ｂ^２はハプテンであり、

【0175】

Ｌ^１およびＬ^２はリンカーであり、

【0176】

Ｗは、置換もしくは非置換のクマリン部分、あるいはクマリンの置換もしくは非置換の誘導体または類縁体である部分を含み、

【0177】

Ｚは結合、－ＣＨ－基、－ＣＨ－ＣＨ_２－基、または－ＣＨ_２－ＣＨ－基であり、

【0178】

ｍおよびｎは、独立して１～４の範囲の整数である）
の構造を有する。

【0179】

いくつかの実施形態において、ハプテンは、オキサゾール、ピラゾール、チアゾール、ベンゾフラザン、トリテルペン、尿素、ローダミンチオ尿素以外のチオ尿素、ジニトロフェニルまたはトリニトロフェニル以外のニトロアリール、ロテノイド、シクロリグナン、ヘテロビアリール、アゾアリール、ベンゾジアゼピンである。他の実施形態では、ハプテンは、ベンゾフラザンまたはチアゾールスルホンアミドである。いくつかの実施形態において、ハプテンは、５－ニトロ－３－ピラゾールカルバミド、２－アセトアミド－４－メチル－５－チアゾールスルホンアミド、７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－３－カルボン酸（ｃａｒｂｏｘｙｙｌｉｃ ａｃｉｄ）、および２，１，３－ベンゾオキサジアゾール－５－カルバミドである。他の適切なハプテンが本明細書に開示されている。いくつかの実施形態において、Ａ^１は、マレイミド部分、またはＮＨＳ－エステル基を含む。いくつかの実施形態において、Ｌ^１またはＬ^２のうちの少なくとも１つは、リジン部分を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ^１またはＬ^２のうちの少なくとも１つは、少なくとも１個のｄＰＥＧ基を含む。

【0180】

式（ＩＩＣ）または（ＩＩＤ）を有する化合物の非限定的な例は、本明細書において、化合物（１６）、（２４）、（３４）、（５４）、および（６６）として提示される。

【0181】

いくつかの実施形態では、式（ＩＩＣ）および（ＩＩＤ）の化合物は、別の高分子、薬物、または生体分子に結合することができる。例えば、反応性官能基は、タンパク質または抗体のアミン基と反応して、タンパク質または抗体とクマリン系試薬とのコンジュゲートを形成することができる場合がある。そのようなコンジュゲートは、組織標識または染色試薬として利用され得る。

【0182】

いくつかの実施形態において、本開示のクマリン系の試薬は、式（ＩＩＩＡ）または（ＩＩＩＢ）：

【0183】

（式中、

【0184】

Ａ^２は酵素反応性部分であり、

【0185】

Ｂ^１は検出可能な標識であり、

【0186】

Ｌ^１およびＬ^２はリンカーであり、

【0187】

Ｗは、置換もしくは非置換のクマリン部分、あるいはクマリンの置換もしくは非置換の誘導体または類縁体である部分を含み、

【0188】

Ｚは結合、－ＣＨ－基、－ＣＨ－ＣＨ_２－基、または－ＣＨ_２－ＣＨ－基であり、

【0189】

ｍおよびｎは、独立して１～４の範囲の整数である）
の構造を有する。

【0190】

酵素反応性部分（チラミド部分、チラミド部分の誘導体である部分、およびキノンメチド前駆体部分を含む）、検出可能な標識、Ｌ^１、Ｌ^２、Ｗ、Ｚ、ｍ、およびｎのそれぞれは、本明細書でさらに詳細に記載されている。

【0191】

いくつかの実施形態において、Ａ^２は、本明細書に記載されるチラミド部分またはチラミド誘導体を含む部分である。他の実施形態では、Ａ^２は、本明細書に記載されるようなキノンメチド前駆体部分である。いくつかの実施形態では、Ｂ^１はハプテンである。いくつかの実施形態において、ハプテンは、オキサゾール、ピラゾール、チアゾール、ベンゾフラザン、トリテルペン、尿素、ローダミンチオ尿素以外のチオ尿素、ジニトロフェニルまたはトリニトロフェニル以外のニトロアリール、ロテノイド、シクロリグナン、ヘテロビアリール、アゾアリール、ベンゾジアゼピンである。他の実施形態では、Ｂ^１は色素原である。さらに他の実施形態では、Ｂ^１はフルオロフォアである。いくつかの実施形態において、Ｌ^１またはＬ^２のうちの少なくとも１つは、リジン部分を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ^１またはＬ^２のうちの少なくとも１つは、少なくとも１個のｄＰＥＧ基を含む。

【0192】

いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩＡ）および（ＩＩＩＢ）の化合物は、酵素、例えばホスファターゼまたはペルオキシダーゼで標識された、生物学的サンプル中の標的を検出するのに使用するのに適している。現在開示されている試薬を用いる使用に適合させることができるそのような検出プロセスは、米国特許出願公開第２０１７／００８９９１１号に記載されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0193】

いくつかの実施形態において、本開示のクマリン系試薬は、式（ＩＩＩＣ）または（ＩＩＩＤ）：

【0194】

（式中、

【0195】

Ａ^２は酵素反応性部分であり、

【0196】

Ｂ^２はハプテンであり、

【0197】

Ｌ^１およびＬ^２はリンカーであり、

【0198】

Ｗは、置換もしくは非置換のクマリン部分、あるいはクマリンの置換もしくは非置換の誘導体または類縁体である部分を含み、

【0199】

Ｚは結合、－ＣＨ－基、－ＣＨ－ＣＨ_２－基、または－ＣＨ_２－ＣＨ－基であり、

【0200】

ｍおよびｎは、独立して１～４の範囲の整数である）
の構造を有する。

【0201】

上記のように、酵素反応性部分（チラミド部分、チラミド部分の誘導体である部分、およびキノンメチド前駆体部分を含む）、検出可能な標識、Ｌ^１、Ｌ^２、Ｗ、Ｚ、ｍ、およびｎのそれぞれは、本明細書でさらに詳細に記載されている。いくつかの実施形態において、ハプテンは、オキサゾール、ピラゾール、チアゾール、ベンゾフラザン、トリテルペン、尿素、ローダミンチオ尿素以外のチオ尿素、ジニトロフェニルまたはトリニトロフェニル以外のニトロアリール、ロテノイド、シクロリグナン、ヘテロビアリール、アゾアリール、ベンゾジアゼピンである。他の実施形態では、ハプテンは、ベンゾフラザンまたはチアゾールスルホンアミドである。いくつかの実施形態において、ハプテンは、５－ニトロ－３－ピラゾールカルバミド、２－アセトアミド－４－メチル－５－チアゾールスルホンアミド、７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－３－カルボン酸（ｃａｒｂｏｘｙｙｌｉｃ ａｃｉｄ）、および２，１，３－ベンゾオキサジアゾール－５－カルバミドである。いくつかの実施形態において、Ｌ^１またはＬ^２のうちの少なくとも１つは、リジン部分を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ^１またはＬ^２のうちの少なくとも１つは、少なくとも１個のｄＰＥＧ基を含む。

【0202】

式（ＩＩＩＣ）または（ＩＩＩＤ）を有する化合物の非限定的な例は、本明細書において、化合物（１７）、（２５）、および（３５）として提示される。

【0203】

いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩＣ）および（ＩＩＩＤ）の化合物は、本明細書に記載されるように、酵素、例えばホスファターゼまたはペルオキシダーゼで標識された、生物学的サンプル中の標的を検出するのに使用するのに適している。

【0204】

いくつかの実施形態において、本開示のクマリン系試薬は、式（ＩＩＩＥ）または（ＩＩＩＦ）：

【0205】

（式中、

【0206】

Ａ^２は酵素反応性部分であり、

【0207】

Ｂ^３はクリックケミストリー反応に関与することができる反応性基であり、

【0208】

Ｌ^１およびＬ^２はリンカーであり、

【0209】

Ｗは、置換もしくは非置換のクマリン部分、あるいはクマリンの置換もしくは非置換の誘導体または類縁体である部分を含み、

【0210】

Ｚは結合、－ＣＨ－基、－ＣＨ－ＣＨ_２－基、または－ＣＨ_２－ＣＨ－基であり、

【0211】

ｍおよびｎは、独立して１～４の範囲の整数である）
の構造を有する。

【0212】

いくつかの実施形態では、Ｂ^３はＤＢＣＯ基である。他の実施形態では、Ｂ^３はアジド基である。クリックケミストリー反応に関与することができるさらに他の適切な官能基が本明細書に開示されている。いくつかの実施形態において、Ｌ^１またはＬ^２のうちの少なくとも１つは、リジン部分を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ^１またはＬ^２のうちの少なくとも１つは、少なくとも１個のｄＰＥＧ基を含む。

【0213】

いくつかの実施形態では、式（ＩＩＩＥ）および（ＩＩＩＦ）の化合物は、酵素、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ／２０１８／００２０１６（その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているような、レポーター部分に結合したクリックコンジュゲートを利用する実施形態を含むホスファターゼまたはペルオキシダーゼで標識された生物学的サンプル中の標的を検出するのに使用するのに適している。

【0214】

置換もしくは非置換クマリン部分、あるいはクマリンの置換もしくは非置換誘導体または類縁体である部分

【0215】

いくつかの実施形態において、Ｗは式（ＩＶＡ）または（ＩＶＢ）：

【0216】

（式中、Ｑは結合、または置換もしくは非置換の直鎖もしくは分岐鎖のＣ_１～Ｃ_１６アルキル基、－［（ＣＨ_２ＣＨ_２）_ｊ－Ｏ］_ｋ－ＣＨ_２－、－［（ＣＨ_２）_ｊ－Ｏ］_ｋ－ＣＨ_２－（ｊは１～４の範囲の整数であり、ｋは１～１６の範囲の整数である）；－Ｎ－Ｒ^ｘ－；－Ｃ（Ｏ）－Ｎ－Ｒ^ｘ－；または－Ｎ－Ｒ^ｘ－Ｃ（Ｏ）－であり、Ｒ^ｘはＨまたはＣ_１～Ｃ_４アルキル基であり、

【0217】

Ｙは、置換もしくは非置換のクマリン部分、あるいはクマリンの置換もしくは非置換の誘導体または類縁体である部分である）
のいずれかの構造を有する。

【0218】

いくつかの実施形態において、（ｉ）置換もしくは非置換のクマリン部分、あるいは（ｉｉ）クマリンの置換もしくは非置換の誘導体または類縁体である部分が、置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_６アルキル基、置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_６アルコキシ基；置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_６ヘテロアルキル基；トリフルオロメチル基；ヒドロキシル基；硫酸基；シアノ基；ハロゲン；リン酸基；糖類；カルボン酸基；ニトロ基；－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－Ｓ－Ｒ^ｘ；－ＳＯ_２；－ＳＯ_２Ｃｌ；－ＳＯ_３Ｈ；－ＳＯ_４Ｈ；－ＳＯ_２ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－Ｎ（Ｈ）－ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－ＮＲ^ｘＲ^ｙからなる群から選択される少なくとも１個の基を含み、かつ式中、Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは独立してＨまたはＣ_１～Ｃ_４アルキル基である。

【0219】

いくつかの実施形態において、Ｗは式（ＶＡ）または（ＶＢ）：

【0220】

（式中、式（ＶＡ）の部分は、０、１、２、３、または４個のＲ^ｔ基で置換されてもよく、式（ＶＢ）の化合物は、０、１、２、３、４、または５個のＲ^ｔ基で置換されてもよく、各Ｒ^ｔは、置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_１２アルキル基；置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_１２アルコキシ基、置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_１２ヘテロアルキル基；トリフルオロメチル基；ヒドロキシル基；硫酸基；シアノ基；ハロゲン；リン酸基；糖類；カルボン酸基；ニトロ基；－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－Ｓ－Ｒ^ｘ；－ＳＯ_２；－ＳＯ_２Ｃｌ；－ＳＯ_３Ｈ；－ＳＯ_４Ｈ；－ＳＯ_２ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－Ｎ（Ｈ）－ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－ＮＲ^ｘＲ^ｙから独立して選択され、かつ式中、Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは独立してＨまたはＣ_１～Ｃ_６アルキル基であり、

【0221】

式（ＶＡ）の部分は、１個の－Ｒ^１－Ｘ－基および１個の－Ｒ^５－Ｘ－基で置換され、式（ＶＢ）の部分は、１個の－Ｒ^５－Ｘ－基で置換され、

【0222】

Ｒ^１は、Ｃ_１～Ｃ_１０の置換または非置換の分岐鎖または非分岐鎖のアルキル基、－Ｏ－、－Ｏ－ＣＨ_２－、－Ｎ（Ｒ^ｘ）－、または－Ｓ－であり、

【0223】

Ｒ^５は、Ｃ_１～Ｃ_１０の置換または非置換の分岐鎖または非分岐鎖のアルキル基、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｈ）－であり、

【0224】

各Ｘは、独立して、結合、または置換もしくは非置換の直鎖もしくは分岐鎖のＣ_１～Ｃ_１６アルキル基；－［（ＣＨ_２）_ｊ－Ｏ］_ｋ－ＣＨ_２－（ｊは１～４の範囲の整数であり、ｋは１～１６の範囲の整数である）；－Ｎ－Ｒ^ｘ－；－Ｃ（Ｏ）－Ｎ－Ｒ^ｘ－；または－Ｎ－Ｒ^ｘ－Ｃ（Ｏ）－（Ｒ^ｘはＨまたはＣ_１～Ｃ_４アルキル基である）である）
のいずれかの構造を有する。

【0225】

いくつかの実施形態において、式（ＶＡ）および（ＶＢ）の化合物は、１個のＲ^ｔ基を含み、これは、クマリン部分のいずれかの環上にあり得る。いくつかの実施形態において、式（ＶＡ）および（ＶＢ）の化合物は、２個のＲ^ｔ基を含む。

【0226】

いくつかの実施形態において、Ｒ^１は、Ｃ_１～Ｃ_６分岐鎖または非分岐鎖アルキル基である。いくつかの実施形態において、Ｒ^５は、Ｃ_１～Ｃ_６分岐鎖または非分岐鎖アルキル基である。

【0227】

いくつかの実施形態において、Ｗは式（ＶＣ）または（ＶＤ）：

【0228】

（式中、

【0229】

Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^６、およびＲ^７は、置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_６アルキル基；置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_６アルコキシ基；置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_６ヘテロアルキル基；トリフルオロメチル基；ヒドロキシル基；硫酸基；シアノ基；ハロゲン；リン酸基；糖類；カルボン酸基；ニトロ基；－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－Ｓ－Ｒ^ｘ；－ＳＯ_２；－ＳＯ_２Ｃｌ；－ＳＯ_３Ｈ；－ＳＯ_４Ｈ；－ＳＯ_２ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－Ｎ（Ｈ）－ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－ＮＲ^ｘＲ^ｙから独立して選択され、かつ式中、Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは独立してＨまたはＣ_１～Ｃ_４アルキル基であり、

【0230】

Ｒ^５は、Ｃ_１～Ｃ_１０の置換または非置換の分岐鎖または非分岐鎖のアルキル基、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｈ）－であり、

【0231】

Ｒ^１は、Ｃ_１～Ｃ_１０の置換または非置換の分岐鎖または非分岐鎖のアルキル基、－Ｏ－、－Ｏ－ＣＨ_２－、－Ｎ（Ｒ^ｘ）－、または－Ｓ－であり、

【0232】

各Ｘは、独立して、結合、または置換もしくは非置換の直鎖もしくは分岐鎖のＣ_１～Ｃ_１６アルキル基；－［（ＣＨ_２）_ｊ－Ｏ］_ｋ－ＣＨ_２－（ｊは１～４の範囲の整数であり、ｋは１～１６の範囲の整数である）；－Ｎ－Ｒ^ｘ－；－Ｃ（Ｏ）－Ｎ－Ｒ^ｘ－；または－Ｎ－Ｒ^ｘ－Ｃ（Ｏ）－（Ｒ^ｘはＨまたはＣ_１～Ｃ_４アルキル基である）である）
のいずれかの構造を有する。

【0233】

いくつかの実施形態において、Ｒ^１は、Ｃ_１～Ｃ_６分岐鎖または非分岐鎖アルキル基である。いくつかの実施形態において、Ｒ^５は、Ｃ_１～Ｃ_６分岐鎖または非分岐鎖アルキル基である。

【0234】

リンカー

【0235】

いくつかの実施形態では、基Ｌ^１およびＬ^２は、それぞれ独立して、約２０ｇ／ｍｏｌ～約３０００ｇ／ｍｏｌの範囲の分子量を有する。他の実施形態では、Ｌ^１およびＬ^２は、それぞれ独立して、約４０ｇ／ｍｏｌ～約２０００ｇ／ｍｏｌの範囲の分子量を有する。他の実施形態では、Ｌ^１およびＬ^２は、それぞれ独立して、約５０ｇ／ｍｏｌ～約１５００ｇ／ｍｏｌの範囲の分子量を有する。他の実施形態では、Ｌ^１およびＬ^２は、それぞれ独立して、約５０ｇ／ｍｏｌ～約１２５０ｇ／ｍｏｌの範囲の分子量を有する。他の実施形態では、Ｌ^１およびＬ^２は、それぞれ独立して、約７５ｇ／ｍｏｌ～約１０００ｇ／ｍｏｌの範囲の分子量を有する。他の実施形態では、Ｌ^１およびＬ^２は、それぞれ独立して、約１００ｇ／ｍｏｌ～約８００ｇ／ｍｏｌの範囲の分子量を有する。他の実施形態では、Ｌ^１およびＬ^２は、それぞれ独立して、約１００ｇ／ｍｏｌ～約６００ｇ／ｍｏｌの範囲の分子量を有する。他の実施形態では、Ｌ^１およびＬ^２は、それぞれ独立して、約１００ｇ／ｍｏｌ～約４００ｇ／ｍｏｌの範囲の分子量を有する。他の実施形態では、Ｌ^１およびＬ^２は、それぞれ独立して、約１００ｇ／ｍｏｌ～約２００ｇ／ｍｏｌの範囲の分子量を有する。他の実施形態では、Ｌ^１およびＬ^２は、それぞれ独立して、約２５０ｇ／ｍｏｌ～約５００ｇ／ｍｏｌの範囲の分子量を有する。他の実施形態では、Ｌ^１およびＬ^２は、それぞれ独立して、約２０ｇ／ｍｏｌ～約１５０ｇ／ｍｏｌの範囲の分子量を有する。

【0236】

いくつかの実施形態では、基Ｌ^１およびＬ^２は、それぞれ独立して、約０．５ｎｍ～約１５０ｎｍの範囲の長さを有する。いくつかの実施形態では、基Ｌ^１およびＬ^２は、それぞれ独立して、約０．５ｎｍ～約１００ｎｍの範囲の長さを有する。いくつかの実施形態では、基Ｌ^１およびＬ^２は、それぞれ独立して、約０．５ｎｍ～約５０ｎｍの範囲の長さを有する。いくつかの実施形態では、基Ｌ^１およびＬ^２は、それぞれ独立して、約０．５ｎｍ～約３０ｎｍの範囲の長さを有する。他の実施形態では、基Ｌ^１およびＬ^２は、それぞれ独立して、約２０ｎｍ未満の長さを有する。さらに他の実施形態では、基Ｌ^１およびＬ^２は、それぞれ独立して、約１５ｎｍ未満の長さを有する。

【0237】

いくつかの実施形態では、Ｌ^１およびＬ^２は、それぞれ独立して荷電していてもよく、非荷電であってもよい。いくつかの実施形態では、基Ｌ^１およびＬ^２は、１つ以上の荷電基を含む。例えば、いくつかの実施形態において、基Ｌ^１およびＬ^２は、１つ以上の第四級アミン基、ピリジニウム基、環状尿素、または硫酸基を含み得る。

【0238】

他の実施形態では、Ｌ^１およびＬ^２は、単一のアミノ酸残基（例えば、リジン）、ペプチドまたはポリマーを含み得て、これらは、荷電または非荷電であり得る。いくつかの実施形態において、Ｌ^１およびＬ^２は、独立して、２～２０アミノ酸を有するペプチド、２～１０アミノ酸を有するペプチド、２～８アミノ酸を有するペプチド、または１～４アミノ酸を有するペプチドを含み得る。例として、ペプチドは、リジン－［Ｕ］_ｑ－リジンであり得て、Ｕはアミノ酸を表し、ｑは、０または１～１８の範囲の整数である。ｑが１以上である場合、Ｕは、均一または不均一なペプチド配列、すなわち、同じまたは異なるアミノ酸を含むものを表し得る。いくつかの実施形態において、Ｕは、リジン、アラニン、アルギニン、グアニン、グルタミン酸、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。適切な荷電ポリマーは、米国特許出願公開第２００２／００５２３３５号、同第２００４／００５８４４６号、同第２００４／０１９７３１８号、および同第２００４／０１６２２３５号に記載されており、これらの開示はそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0239】

いくつかの実施形態において、Ｌ^１およびＬ２基は、独立して、１つ以上の可溶化基を含む。いくつかの実施形態において、可溶化基は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基（または、Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎから入手可能な個別のＰＥＧＳ（ｄＰＥＧ））を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ^１およびＬ２基は、独立して、約２～約２４のＰＥＧ基を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ^１およびＬ２基は、独立して、約２～約１８のＰＥＧ基を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ^１およびＬ２基は、独立して、約２～約１２のＰＥＧ基を含む。いくつかの実施形態では、Ｌ^１およびＬ２基は、独立して、約２～約６のＰＥＧ基を含む。さらに他の実施形態では、Ｌ^１およびＬ２基は、独立して、４個のＰＥＧ基を含む。さらに他の実施形態では、Ｌ^１およびＬ２基は、独立して、８個のＰＥＧ基を含む。さらに他の実施形態では、Ｌ^１およびＬ２基は、独立して、１２個のＰＥＧ基を含む。さらに他の実施形態では、Ｌ^１およびＬ２基は、独立して、１６個のＰＥＧ基を含む。さらに他の実施形態では、Ｌ^１およびＬ２基は、独立して、２４個のＰＥＧ基を含む。そのようなアルキレンオキシドリンカーの組み込みは、クマリン系試薬の親水性を増加させると考えられている。

【0240】

いくつかの実施形態において、各Ｌ^１およびＬ^２は、独立して、分岐鎖または非分岐鎖、線状または環状、置換または非置換、飽和または不飽和の、２～２００個の炭素原子を有し、任意にＯ、Ｎ、またはＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する基である。いくつかの実施形態において、各Ｌ^１およびＬ^２は、独立して、分岐鎖または非分岐鎖、線状または環状、置換または非置換、飽和または不飽和の、２～１２０個の炭素原子を有し、任意にＯ、Ｎ、またはＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する基である。いくつかの実施形態において、各Ｌ^１およびＬ^２は、独立して、分岐鎖または非分岐鎖、線状または環状、置換または非置換、飽和または不飽和の、２～８０個の炭素原子を有し、任意にＯ、Ｎ、またはＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する基である。いくつかの実施形態において、各Ｌ^１およびＬ^２は、独立して、分岐鎖または非分岐鎖、線状または環状、置換または非置換、飽和または不飽和の、４～４０個の炭素原子を有し、任意にＯ、Ｎ、またはＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する基である。いくつかの実施形態において、各Ｌ^１およびＬ^２は、独立して、分岐鎖または非分岐鎖、線状または環状、置換または非置換、飽和または不飽和の、６～２０個の炭素原子を有し、任意にＯ、Ｎ、またはＳから選択される１つ以上のヘテロ原子を有する基である。

【0241】

いくつかの実施形態では、各Ｌ^１および／またはＬ^２基は、独立して式（ＶＩＡ）：

【0242】

（式中、

【0243】

ｆは０または１～２４の範囲の整数であり、

【0244】

ｊは１～２４の範囲の整数であり、

【0245】

Ｒ^８は結合またはＯ、Ｓ、－Ｎ（Ｒ^ｃ）（Ｒ^ｄ）、または－Ｎ^＋（Ｒ^ｃ）（Ｒ^ｄ）（Ｒ^ｅ）であり、

【0246】

Ｒ^ａおよびＲ^ｂは独立してＨ、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基、Ｆ、Ｃｌ、または－Ｎ（Ｒ^ｃ）（Ｒ^ｄ）であり、

【0247】

Ｒ^ｃ、Ｒ^ｄ、およびＲ^ｅは、ＨまたはＣ_１～Ｃ_４アルキル基から独立して選択され、

【0248】

Ｒ^９およびＲ^１０は、独立して、結合、または最大６個の炭素原子を有し、カルボニル、アミド、イミド、エステル、エーテル、アミン、チオン、またはチオールを含む基である）
を有する。

【0249】

いくつかの実施形態では、Ｒ^ａまたはＲ^ｂの少なくとも１つはＨである。いくつかの実施形態では、Ｒ^ａまたはＲ^ｂの少なくとも１つはＨであり、ｆは１または２である。いくつかの実施形態では、Ｒ^ａまたはＲ^ｂの少なくとも１つはＨであり、ｆは１であり、ｓは少なくとも２である。いくつかの実施形態では、Ｒ^ａおよびＲ^ｂはＨであり、Ｒ^８は結合である。いくつかの実施形態では、式（ＶＩＡ）のリンカーは、２～４０個の炭素原子を含む。いくつかの実施形態では、式（ＶＩＡ）のリンカーは、４～２０個の炭素原子を含む。いくつかの実施形態では、基Ｌ^１およびＬ^２は、それぞれ独立して、約１００ｇ／ｍｏｌ～約６００ｇ／ｍｏｌの範囲の分子量を有する。いくつかの実施形態では、基Ｌ^１およびＬ^２は、それぞれ独立して、約１００ｇ／ｍｏｌ～約４００ｇ／ｍｏｌの範囲の分子量を有する。いくつかの実施形態では、基Ｌ^１およびＬ^２は、それぞれ独立して、約１００ｇ／ｍｏｌ～約２００ｇ／ｍｏｌの範囲の分子量を有する。

【0250】

いくつかの実施形態では、各Ｌ^１および／またはＬ^２基は、独立して式（ＶＩＢ）：

【0251】

（式中、ｆはまたは１～１２の範囲の整数であり、

【0252】

Ｒ^８は結合またはＯ、Ｓ、－Ｎ（Ｒ^ｃ）（Ｒ^ｄ）、または－Ｎ^＋（Ｒ^ｃ）（Ｒ^ｄ）（Ｒ^ｅ）であり、

【0253】

Ｒ^ｃ、Ｒ^ｄ、およびＲ^ｅは独立してＣＨ_３またはＨである。

【0254】

Ｒ^９およびＲ^１０は、独立して、結合、またはカルボニル、アミド、イミド、エステル、エーテル、アミン、またはチオールから選択される基であり、

【0255】

ｊは１～２４の範囲の整数である）
を有する。

【0256】

いくつかの実施形態では、ｆは１であり、ｓは少なくとも２である。いくつかの実施形態では、Ｒ^８は結合であり、ｆは１であり、ｊは２～１６である。他の実施形態では、Ｒ^８は結合であり、ｆは１であり、ｊは２～１２である。他の実施形態では、Ｒ^８は結合であり、ｆは１であり、ｊは２～８である。

【0257】

いくつかの実施形態では、式（ＶＩＢ）のリンカーは、２～４０個の炭素原子を含む。いくつかの実施形態では、式（ＶＩＢ）のリンカーは、４～２０個の炭素原子を含む。いくつかの実施形態では、基Ｌ^１およびＬ^２は、それぞれ独立して、約１００ｇ／ｍｏｌ～約６００ｇ／ｍｏｌの範囲の分子量を有する。いくつかの実施形態では、基Ｌ^１およびＬ^２は、それぞれ独立して、約１００ｇ／ｍｏｌ～約４００ｇ／ｍｏｌの範囲の分子量を有する。いくつかの実施形態では、基Ｌ^１およびＬ^２は、それぞれ独立して、約１００ｇ／ｍｏｌ～約２００ｇ／ｍｏｌの範囲の分子量を有する。

【0258】

いくつかの実施形態では、各Ｌ^１および／またはＬ^２基は、独立して式（ＶＩＣ）：

【0259】

（式中、ｆは０または１～１２の範囲の整数であり、

【0260】

ｊは１～２４の範囲の整数であり、

【0261】

Ｒ^９およびＲ^１０は、独立して、結合、またはカルボニル、アミド、イミド、エステル、エーテル、アミン、またはチオールから選択される基である）
を有する。

【0262】

いくつかの実施形態では、ｆは１であり、ｊは少なくとも２である。いくつかの実施形態では、ｆは１であり、ｊは２である。いくつかの実施形態では、ｆは１であり、ｊは３である。いくつかの実施形態では、ｆは１であり、ｊは４である。いくつかの実施形態では、ｆは２であり、ｊは２～１６の範囲の整数である。いくつかの実施形態では、ｆは２であり、ｊは２～１２の範囲の整数である。いくつかの実施形態では、ｆは２であり、ｊは２～８の範囲の整数である。いくつかの実施形態では、ｆは２であり、ｊは少なくとも２である。いくつかの実施形態では、ｆは２であり、ｊは少なくとも３である。いくつかの実施形態では、ｆは２であり、ｊは少なくとも４である。

【0263】

当業者は、式（ＩＡ）および／または（ＩＩＢ）のｍおよびｎが１より大きい場合、それに応じて複数のＬ^１またはＬ^２基が結合されてもよく、各Ｌ^１またはＬ^２基が同じに異なる可能性があることを理解するであろう。例として、ｍが２の場合、基－［Ｌ^１］－［Ｌ^１］－の各Ｌ^１は同一または異なってもよい。例えば、基－［Ｌ^１］－［Ｌ^１］－の一方のＬ^１には繰り返しアルキレンオキシド基が含まれ、基－［Ｌ^１］－［Ｌ^１］－のもう一方のＬ^１には非置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルキル基が含まれ得る。別の例として、基－［Ｌ^１］－［Ｌ^１］－の一方のＬ^１には少なくとも１個のＰＥＧまたはｄＰＥＧ基が含まれ、基－［Ｌ^１］－［Ｌ^１］－のもう一方のＬ^１にはリジン残基が含まれ得る。別の例として、基－［Ｌ^１］－［Ｌ^１］－の一方のＬ^１には少なくとも１個のＰＥＧまたはｄＰＥＧ基が含まれ、基－［Ｌ^１］－［Ｌ^１］－のもう一方のＬ^１にはリジン残基が含まれ得て、Ｌ^２基は少なくとも１個のＰＥＧまたはｄＰＥＧ基を含み得る。

【0264】

反応性官能基

【0265】

一般に、反応性官能基は、２つの分子が一緒に結合して付加物を形成することを容易にする任意の基であり得る。いくつかの実施形態において、反応性官能基は、求核性置換（例えば、アミンおよびアルコールとハロゲン化アシル、活性エステルとの反応）、求電子性置換（例えば、エナミン反応）、ならびに炭素－炭素および炭素－ヘテロ原子の複数の結合への付加（例えば、マイケル反応、ディールス・アルダー付加）に関与することができるものである。これらおよび他の有用な反応は、例えば、Ｍａｒｃｈ，ＡＤＶＡＮＣＥＤ，ＯＲＧＡＮＩＣ ＣＨＥＭＩＳＴＲＹ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８５、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，ＢＩＯＣＯＮＪＵＧＡＴＥ，ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ，Ａｃａｄｅｍｉｃ，Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９６、およびＦｅｅｎｅｙ，ｅｔ，ａｌ．，ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ，ＯＦ，ＰＲＯＴＥＩＮＳ；Ａｄｖａｎｃｅｓ，ｉｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｓｅｒｉｅｓ，Ｖｏｌ．，１９８，Ａｍｅｒｉｃａｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９８２において検討されている。

【0266】

いくつかの実施形態において、反応性官能基は、カルボン酸、カルボン酸の活性化エステル、カルボジイミド、ハロゲン化スルホニル、ハロゲン化アシル、ハロゲン化シリル、アシルアジド、アシルニトリル、アクリルアミド、アミン、アルデヒド、ハロゲン化アルキル（ハロゲン化物は、後で、例えば、アミン、カルボキシレートアニオン、チオールアニオン、カルバニオン、またはアルコキシドイオンなどの求核性基で置換されてもよく、それにより、ハロゲン原子の部位に新たな基の共有結合をもたらす）、ハロゲン化アリール、スルホン酸アルキル、スルホン酸エステル、無水物、アジド、アジリジン、ジアゾアルカン、ハロアセトアミド、ハロトリアジン、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ホスホルアミデート、チオール（いくつかの実施形態では、ジスルフィドに変換されるか、ハロゲン化アシルと反応するか、または金属に結合することができる）、ヒドロキシル（エステル、エーテル、アルデヒドなどに変換することができる）、ヒドラジンおよびアルキン（例えば、付加環化、アシル化、マイケル付加を受けることができる）である。いくつかの実施形態において、反応性官能基は、カルボキシル基またはその様々な誘導体であり、限定されるものではないが、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ－ヒドロキシベンズトリアゾールエステル、酸ハロゲン化物、アシルイミダゾール、チオエステル、ｐ－ニトロフェニルエステル、アルキル、アルケニル、アルキニルおよび芳香族エステルである。いくつかの実施形態において、反応性官能基は、例えば、マレイミド基などのディールス・アルダー反応に関与することができるジエノフィル基である。いくつかの実施形態において、反応性官能基は、例えば、イミン、ヒドラゾン、セミカルバゾンもしくはオキシムなどのカルボニル誘導体の形成を介して、またはグリニャール付加もしくはアルキルリチウム付加などのメカニズムを介して、その後の誘導体化が可能であるようなアルデヒド基またはケトン基である。

【0267】

他の実施形態では、反応性官能基は、カルボン酸、カルボン酸の活性化エステル、ハロゲン化スルホニル、ハロゲン化アシル、アミン、ハロゲン化アルキルまたはハロゲン化アリール、無水物、アジド、ハロアセトアミド、ハロトリアジン、ヒドラジン、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ホスホルアミデート、チオール、ヒドロキシルおよびアルキンから選択される。さらに他の実施形態では、反応性官能基は、カルボン酸、カルボン酸の活性化エステル、アミン、アジド、ハロアセトアミド、ヒドラジン、イソシアネート、マレイミド、およびアルキンから選択される。

【0268】

いくつかの実施形態では、反応性官能基は、それらが本明細書に記載のコンジュゲートの化学的安定性に関与しない、または干渉しないように選択することができる。あるいは、反応性官能基は、保護基の存在によって架橋反応に関与することから保護することができる。

【0269】

いくつかの実施形態において、反応性官能基は、「クリックケミストリー」反応を受けることができる部分である。「クリックケミストリー」は、ＳｈａｒｐｌｅｓｓおよびＭｅｌｄａｌのグループによって独自に定義された化学哲学であり、小さなユニットを結合することによって物質を迅速かつ確実に生成するように調整された化学を説明する。「クリックケミストリー」は、信頼性が高く自律的な有機反応のコレクションに適用されている（Ｋｏｌｂ，Ｈ．Ｃ．Ｆｉｎｎ，Ｍ．Ｇ．；Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，Ｋ．Ｂ．Ａｎｇｅｗ）．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００１，４０，２００４－２０２１）。例えば、水中での信頼性の高い分子結合としての銅触媒によるアジド－アルキン［３＋２］環化付加の同定（Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖ，Ｖ．Ｖ．；ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００２，４１，２５９６－２５９９）は、生体分子相互作用のいくつかのタイプの調査を補強するために使用されてきた（Ｗａｎｇ，Ｑ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，１２５，３１９２－３１９３；Ｓｐｅｅｒｓ，Ａ．Ｅ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，１２５，４６８６－４６８７；Ｌｉｎｋ，Ａ．Ｊ．；Ｔｉｒｒｅｌｌ，Ｄ．Ａ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，１２５，１１１６４－１１１６５；Ｄｅｉｔｅｒｓ，Ａ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，１２５，１１７８２－１１７８３）。さらに、有機合成（Ｌｅｅ，Ｌ．Ｖ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，１２５，９５８８－９５８９）、創薬（Ｋｏｌｂ，Ｈ．Ｃ．；Ｓｈａｒｐｌｅｓｓ，Ｋ．Ｂ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ．Ｔｏｄａｙ ２００３，８，１１２８－１１３７；Ｌｅｗｉｓ，Ｗ．Ｇ．；ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００２，４１，１０５３－１０５７）、および表面の官能化（Ｍｅｎｇ，Ｊ．－Ｃ．；ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００４，４３，１２５５－１２６０；Ｆａｚｉｏ，Ｆ．；ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００２，１２４，１４３９７－１４４０２；Ｃｏｌｌｍａｎ，Ｊ．Ｐ．；ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｇｍｕｉｒ ２００４，ＡＳＡＰ，ｉｎ ｐｒｅｓｓ；Ｌｕｍｍｅｒｓｔｏｒｆｅｒ，Ｔ．；Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｈ．Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ ２００４，印刷中）への応用も登場している。一般に、クリックケミストリーは、範囲が広く、化学収率が高く、無害な副生成物を生成し、化学特異的で、単純な反応条件を必要とし、すぐに利用できる出発物質および試薬を使用する、無溶媒であるか温和な溶媒（水など）を使用しているため、生成物の分離が容易であり、単一の反応生成物との反応に有利な大きな熱力学的駆動力を持ち、および／またはアトムエコノミー（ａｔｏｍ ｅｃｏｎｏｍｙ）が高い、モジュラーアプリケーションを持つ反応を促進する。特定の一般的な基準は本質的に主観的なものである可能性があるが、すべての基準を満たす必要はない。

【0270】

当業者は、式（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＩＩＥ）、（ＩＩＩＦ）の化合物のいずれかが、適切に官能化された別の化合物（例えば、アジド基を有する化合物）とクリック付加物を形成し得る適切な反応性基（例えば、ＤＢＣＯ基）で終結し得ることを理解するであろう（ＰＣＴ公開ＷＯ／２０１８／００２０１５号に記載されているものを含み、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。クリックケミストリー反応で反応することができる反応性基のペアを次の表に示す。

【0271】

検出可能な標識

【0272】

一般に、検出可能な標識には、発色性、蛍光性、りん光性、発光性の分子および材料、ある物質を別の物質に変換して検出可能な差異を提供する（無色の物質を着色された物質に変換する、またはその逆、または沈殿物を生成するか、サンプルの濁度を増加させることなどによる）触媒（酵素など）、追加の検出可能な標識抗体コンジュゲートならびに常磁性および磁性分子または材料を使用する抗体－ハプテン結合相互作用により検出され得るハプテンが含まれる。もちろん、レポーター部分自体も間接的に検出することができ、例えば、検出可能な標識がハプテンである場合、当業者に知られているように、その検出可能な標識に特異的なさらに別の抗体を、検出可能な標識の検出に利用することができる。

【0273】

いくつかの実施形態では、適切なハプテンとしては、限定されるものではないが、ピラゾール（例えば、ニトロピラゾール）、ニトロフェニル化合物、ベンゾフラザン、トリテルペン、尿素（例えば、フェニル尿素）、チオ尿素（例えば、フェニルチオ尿素）、ロテノンおよびロテノン誘導体、オキサゾール（例えば、オキサゾールスルホンアミド）、チアゾール（例えば、チアゾールスルホンアミド）、クマリンおよびクマリン誘導体、ならびにシクロリグナンが挙げられる。ハプテンの追加の非限定的な例としては、チアゾール、ニトロアリール、ベンゾフラン、トリペルペン、およびシクロリグナンが挙げられる。ハプテンの特定の例としては、ジニトロフェニル、ビオチン、ジゴキシゲニン、およびフルオレセイン、ならびにそれらの任意の誘導体または類縁体が挙げられる。他の適切なハプテンは、米国特許第８，８４６，３２０号、同第８，６１８，２６５号、同第７，６９５，９２９号、同第８，４８１，２７０号、および同第９，０１７，９５４号に記載され、これらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。他の適切なハプテンは、米国特許出願公開第２０１３／０１０９０１９号および同第２０１０／０１８４０８７号に記載されており、それらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0274】

いくつかの実施形態において、適切なフルオロフォアは、クマリン、フルオレセイン（またはフルオレセイン誘導体および類縁体）、ローダミン、レゾルフィン、ルミノフォアおよびシアニンを含むいくつかの一般的な化学クラスに属する。蛍光分子の追加の例は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ－Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＴｈｅｒｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，１１ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎに見ることができる。他の実施形態では、フルオロフォアは、キサンテン誘導体、シアニン誘導体、スクアライン誘導体、ナフタレン誘導体、クマリン誘導体、オキサジアゾール誘導体、アントラセン誘導体、ピレン誘導体、オキサジン誘導体、アクリジン誘導体、アリールメチン誘導体、およびテトラピロール誘導体から選択される。他の実施形態では、蛍光部分は、ＣＦ色素（Ｂｉｏｔｉｕｍから入手可能）、ＤＲＡＱおよびＣｙＴＲＡＫプローブ（ＢｉｏＳｔａｔｕｓから入手可能）、ＢＯＤＩＰＹ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＤｙＬｉｇｈｔ Ｆｌｕｏｒ（例えば、ＤｙＬｉｇｈｔ ６４９）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｅｒｃｅから入手可能）、ＡｔｔｏおよびＴｒａｃｙ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈから入手可能）、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍから入手可能）、Ａｂｂｅｒｉｏｒ Ｄｙｅｓ（Ａｂｂｅｒｉｏｒから入手可能）、ＤＹ ａｎｄ ＭｅｇａＳｔｏｋｅｓ Ｄｙｅｓ（Ｄｙｏｍｉｃｓから入手可能）、Ｓｕｌｆｏ Ｃｙ ｄｙｅｓ（Ｃｙａｎｄｙｅから入手可能）、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（ＡｎａＳｐｅｃから入手可能）、Ｓｅｔａ、ＳｅＴａｕ およびＳｑｕａｒｅ Ｄｙｅｓ（ＳＥＴＡ ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌｓから入手可能）、ＱｕａｓａｒおよびＣａｌ Ｆｌｕｏｒ ｄｙｅｓ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能）、ＳｕｒｅＬｉｇｈｔ Ｄｙｅｓ（ＡＰＣ、ＲＰＥＰｅｒＣＰ、Ｐｈｙｃｏｂｉｌｉｓｏｍｅｓから入手可能）（Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ならびにＡＰＣ、ＡＰＣＸＬ、ＲＰＥ、ＢＰＥ（Ｐｈｙｃｏ－Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｇｒｅｅｎｓｅａ、Ｐｒｏｚｙｍｅ、Ｆｌｏｇｅｎから入手可能）から選択される。

【0275】

いくつかの実施形態において、適切な酵素としては、限定されるものではないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、酸性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、β－ガラクトシダーゼ、β－グルクロニダーゼまたはβ－ラクタマーゼが挙げられる。他の実施形態では、酵素には、オキシドレダクターゼまたはペルオキシダーゼ（例えば、ＨＲＰ、ＡＰ）が含まれる。これらの実施形態において、抗標識抗体に複合化された酵素は、発色基質の、標的の近位または直接のサンプルに共有結合する反応性部分への変換を触媒する。

【0276】

発色性化合物／基質の特定の非限定的な例としては、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、４－ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）、ファストレッド、ブロモクロロインドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、ファストレッド、ＡＰオレンジ、ＡＰブルー、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、２，２’－アジノ－ジ－［３－エチルベンゾチアゾリンスルホネート］（ＡＢＴＳ）、ｏ－ジアニシジン、４－クロロナフトール（４－ＣＮ）、ニトロフェニル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）、ｏ－フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－ガラクトピラノシド（Ｘ－Ｇａｌ）、メチルウンベリフェリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＭＵ－Ｇａｌ）、ｐ－ニトロフェニル－α－Ｄ－ガラクトピラノシド（ＰＮＰ）、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－グルクロニド（Ｘ－Ｇｌｕｃ）、３－アミノ－９－エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、フクシン、ヨードニトロテトラゾリウム（ＩＮＴ）、テトラゾリウムブルー、テトラゾリウムバイオレット、Ｎ，Ｎ’－ビスカルボキシペンチル－５，５’－ジスルホナト－インド－ジカルボシアニン（Ｃｙ５）、４－（ジメチルアミノ）アゾベンゼン－４’－スルホンアミド（ＤＡＢＳＹＬ）、テトラメチルローダミン（ＤＩＳＣＯパープル）、およびローダミン１１０（ローダミン）が挙げられる。ペルオキシダーゼおよび過酸化水素の存在下で酸化されるＤＡＢは、酵素活性の部位に褐色のアルコール不溶性沈殿物の沈着をもたらす。いくつかの実施形態において、発色性基質は、潜在的反応性部分および発色性部分を含むシグナル伝達コンジュゲートである。

【0277】

いくつかの実施形態において、シグナル伝達コンジュゲートの潜在的反応性部分は、触媒活性化を受けて、サンプルまたは他の検出成分と共有結合することができる反応性種を形成するように構成される。触媒活性化は、１つ以上の酵素（例えば、オキシドレダクターゼ酵素および西洋ワサビペルオキシダーゼのようなペルオキシダーゼ酵素）によって駆動され、反応種の形成をもたらす。これらの反応種は、それらの生成の近位、すなわち酵素の近くの発色部分と反応することができる。シグナル伝達コンジュゲートの具体例は、米国特許出願公開第２０１３／０２６０３７９号に記載されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0278】

他の適切な検出可能な標識は、米国特許出願公開第２０１８／００２０１５号に記載されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例えば、適切な標識には、互いに直接的または間接的に結合された少なくとも２つの発色団を有する多色素コンジュゲートが含まれる。

【0279】

検出可能な標識のさらに他の例としては、限定されるものではないが、ＤＡＢ、ＡＥＣ；ＣＮ；ＢＣＩＰ／ＮＢＴ；ファストレッド；ファストブルー；フクシン；ＮＢＴ；ＡＬＫ ＧＯＬＤ；カスケードブルーアセチルアジド；ダポキシルスルホン酸／カルボン酸スクシンイミジルエステル；ＤＹ－４０５；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４０５スクシンイミジルエステル；カスケードイエロースクシンイミジルエステル；ピリジルオキサゾールスクシンイミジルエステル（ＰｙＭＰＯ）；パシフィックブルースクシンイミジルエステル；ＤＹ－４１５；７－ヒドロキシクマリン－３－カルボン酸スクシンイミジルエステル；ＤＹＱ－４２５；６－ＦＡＭホスホルアミダイト；ルシファーイエロー；ヨードアセトアミド；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４３０スクシンイミジルエステル；ダブシルスクシンイミジルエステル；ＮＢＤ塩化物／フッ化物；ＱＳＹ ３５スクシンイミジルエステル；ＤＹ－４８５ＸＬ；Ｃｙ２スクシンイミジルエステル；ＤＹ－４９０；オレゴングリーン４８８カルボン酸スクシンイミジルエステル；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８スクシンイミジルエステル；ＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３Ｃ３スクシンイミジルエステル；ＤＹ－４８０ＸＬ；ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ Ｃ３スクシンイミジルエステル；ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ Ｃ５スクシンイミジルエステル；ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ－Ｘスクシンイミジルエステル；ＤＹＱ－５０５；オレゴングリーン５１４カルボン酸スクシンイミジルエステル；ＤＹ－５１０ＸＬ；ＤＹ－４８１ＸＬ；６－カルボキシ－４’，５’－ジクロロ－２’，７’－ジメトキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＪＯＥ）；ＤＹ－５２０ＸＬ；ＤＹ－５２１ＸＬ；ＢＯＤＩＰＹ Ｒ６Ｇ Ｃ３スクシンイミジルエステル；エリスロシンイソチオシアネート；５－カルボキシ－２’，４’，５’，７’－テトラブロモスルホンフルオレセインスクシンイミジルエステル；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５３２スクシンイミジルエステル；６－カルボキシ－２’，４，４’，５’７，７’－ヘキサクロロフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＨＥＸ）；ＢＯＤＩＰＹ ５３０／５５０ Ｃ３スクシンイミジルエステル；ＤＹ－５３０；ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ－Ｘスクシンイミジルエステル；ＤＹ－５５５；ＤＹＱ－１；ＤＹ－５５６；Ｃｙ３スクシンイミジルエステル；ＤＹ－５４７；ＤＹ－５４９；ＤＹ－５５０；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５スクシンイミジルエステル；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６スクシンイミジルエステル；ＤＹ－５４８；ＢＯＤＩＰＹ ５５８／５６８ Ｃ３スクシンイミジルエステル；ローダミンレッド－Ｘスクシンイミジルエステル；ＱＳＹ ７スクシンイミジルエステル；ＢＯＤＩＰＹ ５６４／５７０ Ｃ３スクシンイミジルエステル；ＢＯＤＩＰＹ ５７６／５８９ Ｃ３スクシンイミジルエステル；カルボキシ－Ｘ－ローダミン（ＲＯＸ）；スクシンイミジルエステル；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８スクシンイミジルエステル；ＤＹ－５９０；ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１ Ｃ３スクシンイミジルエステル；ＤＹ－５９１；ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ－Ｘスクシンイミジルエステル；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５９４スクシンイミジルエステル；ＤＹ－５９４；カルボキシナフトフルオレセインスクシンイミジルエステル；ＤＹ－６０５；ＤＹ－６１０；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６１０スクシンイミジルエステル；ＤＹ－６１５；ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０－Ｘスクシンイミジルエステル；エリオグラウシン；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３３スクシンイミジルエステル；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６３５スクシンイミジルエステル；ＤＹ－６３４；ＤＹ－６３０；ＤＹ－６３１；ＤＹ－６３２；ＤＹ－６３３；ＤＹＱ－２；ＤＹ－６３６；ＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５－Ｘスクシンイミジルエステル；ＤＹ－６３５；Ｃｙ５スクシンイミジルエステル；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７スクシンイミジルエステル；ＤＹ－６４７；ＤＹ－６４８；ＤＹ－６５０；ＤＹ－６５４；ＤＹ－６５２；ＤＹ－６４９；ＤＹ－６５１；ＤＹＱ－６６０；ＤＹＱ－６６１；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６６０スクシンイミジルエステル；Ｃｙ５．５スクシンイミジルエステル；ＤＹ－６７７；ＤＹ－６７５；ＤＹ－６７６；ＤＹ－６７８；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６８０スクシンイミジルエステル；ＤＹ－６７９；ＤＹ－６８０；ＤＹ－６８２；ＤＹ－６８１；ＤＹＱ－３；ＤＹＱ－７００；Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７００スクシンイミジルエステル；ＤＹ－７０３；ＤＹ－７０１；ＤＹ－７０４；ＤＹ－７００；ＤＹ－７３０；ＤＹ－７３１；ＤＹ－７３２；ＤＹ－７３４；ＤＹ－７５０；Ｃｙ７スクシンイミジルエステル；ＤＹ－７４９；ＤＹＱ－４；およびＣｙ７．５スクシンイミジルエステルが挙げられる。

【0280】

二次抗体に結合したものなどのレポーター部分を、上記の検出可能な標識のいずれかから選択することができる。

【0281】

酵素反応性部分

【0282】

いくつかの実施形態において、酵素反応性部分は、チラミド、チラミド誘導体、ならびにキノンメチド前駆体およびそれらの誘導体を含む。

【0283】

いくつかの実施形態において、酵素反応性部分は、チラミドまたはその誘導体もしくは類縁体である。適切なチラミド部分およびチラミド誘導体としては、米国特許出願公開第２０１２／０１７１６６８号に記載されるものが挙げられ、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、チラミド部分またはチラミド誘導体は、酵素の基質、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素であるペルオキシダーゼ酵素である。

【0284】

いくつかの実施形態において、酵素反応性部分は式（ＶＩＩＡ）：

（式中、各Ｒ^１１基は、Ｈまたは１～４個の炭素原子を有する低級アルキル基から独立して選択され、かつ式中、Ｒ^ｘは、ＨまたはＣ_１～Ｃ_４アルキル基である）
によって提供される構造を有する。

【0285】

いくつかの実施形態において、酵素反応性部分は式（ＶＩＩＢ）：

によって提供される構造を有する。

【0286】

いくつかの実施形態において、酵素反応性部分は、キノンメチド前駆体またはその誘導体である。適切なキノンメチド前駆体または誘導体は、米国特許出願公開第２０１７／００８９９１１号明細書に記載されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、キノンメチド前駆体またはその誘導体は、酵素の基質、例えばホスファターゼ、アルカリホスファターゼである。

【0287】

いくつかの実施形態において、酵素反応性部分は式（ＶＩＩＩＡ）：

（式中、
Ｒ^２は、ホスフェート、アミド、ニトロ、尿素、スルフェート、メチル、エステル、ベータ－ラクタム、または糖から選択される基であり、
Ｒ^１３はハロゲン化物であり、
Ｒ^１５、Ｒ^１６、Ｒ^１７、およびＲ^１８は、水素または１～４個の炭素原子を有する脂肪族基から独立して選択され、
Ｒ^１４は、－（ＣＨ_２）_ｗＮＨ－、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｗＮＨ－、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ｗＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（ＣＨ_２）_ｗＮＨ－、－（ＣＨ_２）_ｗＯ－、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｗＯ－、－Ｏ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ｗＯ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（ＣＨ_２）_ｗＯ－、－Ｃ（ｏ）Ｎ（Ｈ）（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（ＣＨ_２）_ｗＳ－、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｗＳ－、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ｗＳ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（ＣＨ_２）_ｗＳ－、－（ＣＨ_２）_ｗＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（ＣＨ_２）ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ_３）（ＣＨ_２）_ｗＮＨ－、または－Ｎ（Ｈ）（ＣＨ_２）_ｗＮＨ－であり、ｗは１～１２の範囲の整数である）
によって提供される構造を有する。

【0288】

いくつかの実施形態において、酵素反応性部分は式（ＶＩＩＩＢ）：

によって提供される構造を有する。

【0289】

いくつかの実施形態において、酵素反応性部分は式（ＶＩＩＩＣ）：

【0290】

（式中、Ｒ^１３－（ＣＨ_２）_ｗＮＨ－、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｗＮＨ－、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ｗＮＨ－、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（ＣＨ_２）_ｗＮＨ－、－（ＣＨ_２）_ｗＯ－、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｗＯ－、－Ｏ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ｗＯ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（ＣＨ_２）_ｗＯ－、－Ｃ（ｏ）Ｎ（Ｈ）（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗ－、－（ＣＨ_２）_ｗＳ－、－Ｏ（ＣＨ_２）_ｗＳ－、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２）_ｗＳ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（ＣＨ_２）_ｗＳ－、－（ＣＨ_２）_ｗＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ、－Ｃ（Ｏ）（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｗＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（ＣＨ_２）ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ（ＣＨ_３）（ＣＨ_２）_ｗＮＨ－、または－Ｎ（Ｈ）（ＣＨ_２）_ｗＮＨ－、ここでｗは独立して１～１２の範囲の整数である）によって提供される構造を有する。いくつかの実施形態では、Ｒ^７はＣ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（ＣＨ_２）_ｗＮＨであり、ｗは上記で定義されたとおりである。他の実施形態では、Ｒ^７はＣ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（ＣＨ_２）_ｗＮＨであり、ｗは２～６の範囲である。

【0291】

いくつかの実施形態において、酵素反応性部分は式（ＶＩＩＩＤ）：

（式中、ｗは１～１２の範囲である）によって提供される構造を有する。いくつかの実施形態において、ｗは１～８の範囲である。他の実施形態において、ｗは２～８の範囲である。さらに他の実施形態では、ｗは２～６の範囲である。さらなる実施形態では、ｗは６である。

【0292】

さらなるクマリン系試薬

【0293】

いくつかの実施形態において、クマリン系試薬は、以下：

（式中、Ｒ^ｖは酵素反応性部分または反応性官能基である）
の構造を有する。

【0294】

いくつかの実施形態において、クマリン系試薬は、以下：

（式中、Ｒ^ｖは酵素反応性部分または反応性官能基である）
の構造を有する。

【0295】

いくつかの実施形態において、クマリン系試薬は、以下：

【0296】

（式中、Ｒ^ｖは酵素反応性部分または反応性官能基である）
の構造を有する。

【0297】

いくつかの実施形態において、クマリン系試薬は、以下：

（式中、Ｒ^ｖは酵素反応性部分または反応性官能基である）
の構造を有する。

【0298】

いくつかの実施形態において、クマリン系試薬は、以下：

（式中、Ｒ^ｖは酵素反応性部分または反応性官能基である）
の構造を有する。

【0299】

いくつかの実施形態において、クマリン系試薬は、以下：

（式中、Ｒ^ｖは酵素反応性部分または反応性官能基である）
の構造を有する。

【0300】

クマリン系試薬を含むコンジュゲート

【0301】

本開示はまた、クマリン系試薬と別の置換基、例えば高分子、薬物、または生体分子、クマリン系試薬とのコンジュゲートを提供する。いくつかの実施形態において、式（ＩＡ）、（ＩＢ）、（ＩＩＡ）、（ＩＩＢ）、（ＩＩＣ）、または（ＩＩＤ）のクマリン系試薬を、高分子、薬物、または生体分子と反応させることができる。いくつかの実施形態において、コンジュゲートは、Ｔ－［クマリン系試薬］_ｏの一般的な構造を有し、Ｔは、特異的結合実体、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖類、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、薬物、脂質、またはナノ粒子であり、ｏは１～１０の範囲の整数である。

【0302】

クマリン系試薬を高分子、薬物、または生体分子に結合するために使用できる様々な方法が存在する。例えば、この結合を容易にするために、クマリン系試薬を、活性エステル基、アミノ基、スルフヒドリル基、炭水化物基、アジド基またはカルボキシ基などの生体分子反応性基に付着させることができる。生体分子反応性基を高分子または高分子フラグメントと反応させるための様々な方法論が存在する。そのような方法論の例は、光架橋およびグルタルアルデヒド架橋である。そのような結合を達成するためのさらに他の方法は、当業者に見出されるであろう。そのような方法の例については、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，２００８を参照のこと。

【0303】

本発明の活性エステル基は、それらがタンパク質または高分子への拡張連結基の結合を損なわないように選択されなければならない。当業者は、例えば、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドまたはＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミドなどの活性エステルを本発明で使用できることを理解するであろう。あるいは、拡張連結基の第一級アミノ基は、グルタルアルデヒドによってタンパク質の第一級アミノ基に結合され得る。タンパク質のアミノ基は、拡張連結基のカルボキシ基に結合している場合がある。さらに、拡張連結基は、可視光を照射したときにタンパク質へのカップリングが起こるように、ニトロフェニルアジドで修飾することができる。そのような結合を達成するためのさらに他の方法は、当業者に見出されるであろう。

【0304】

いくつかの実施形態において、本開示のコンジュゲートは、式（ＩＸＡ）または（ＩＸＢ）：

（式中、Ｔは、特異的結合実体、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖類、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、薬物、脂質、またはナノ粒子から選択される置換基であり、
Ｒ^ｚは、上記で定義されるような検出可能な標識であり、
ｏは１～１０の範囲の整数であり、
Ｌ^１およびＬ^２はリンカーであり、
Ｗは、置換もしくは非置換のクマリン部分、あるいはクマリンの置換もしくは非置換の誘導体または類縁体である部分を含み、
Ｚは結合、－ＣＨ－基、－ＣＨ－ＣＨ_２－基、または－ＣＨ_２－ＣＨ－基であり、
ｍおよびｎは、独立して１～４の範囲の整数である）
のいずれかの構造を有する。

【0305】

いくつかの実施形態において、特異的結合実体は、抗体、抗体断片、薬物／抗体複合体、または核酸である。いくつかの実施形態において、抗体は、一次抗体である。他の実施形態において、抗体は、二次抗体である。

【0306】

いくつかの実施形態では、Ｒ^ｚはハプテンである。いくつかの実施形態において、Ｒ^ｚは、オキサゾール、ピラゾール、チアゾール、ベンゾフラザン、トリテルペン、尿素、ローダミンチオ尿素以外のチオ尿素、ジニトロフェニルまたはトリニトロフェニル以外のニトロアリール、ロテノイド、シクロリグナン、ヘテロビアリール、アゾアリール、ベンゾジアゼピンである。他の実施形態では、Ｒ^ｚは、ベンゾフラザンまたはチアゾールスルホンアミドである。

【0307】

他の実施形態では、Ｒ^ｚは酵素、例えば、ペルオキシダーゼまたはホスファターゼである。さらに他の実施形態では、Ｒ^ｚはフルオロフォアである。

【0308】

いくつかの実施形態において、本開示のコンジュゲートは、式（ＩＸＣ）または（ＩＸＤ）：

Ａｂは、抗体であり、
Ｒ^ｚは、上記で定義されるような検出可能な標識であり、
ｏは１～１０の範囲の整数であり、
Ｌ^１およびＬ^２はリンカーであり、
Ｗは、置換もしくは非置換のクマリン部分、あるいはクマリンの置換もしくは非置換の誘導体または類縁体である部分を含み、
Ｚは結合、－ＣＨ－基、－ＣＨ－ＣＨ_２－基、または－ＣＨ_２－ＣＨ－基であり、
ｍおよびｎは、独立して１～４の範囲の整数である）
のいずれかの構造を有する。

【0309】

いくつかの実施形態において、本開示のコンジュゲートは、式（ＩＸＥ）または（ＩＸＦ）：

（式中、ＮＡは核酸であり、
Ｒ^ｚは、上記で定義されるような検出可能な標識であり、
ｏは１～１０の範囲の整数であり、
Ｌ^１およびＬ^２はリンカーであり、
Ｗは、置換もしくは非置換のクマリン部分、あるいはクマリンの置換もしくは非置換の誘導体または類縁体である部分を含み、
Ｚは結合、－ＣＨ－基、－ＣＨ－ＣＨ_２－基、または－ＣＨ_２－ＣＨ－基であり、
ｍおよびｎは、独立して１～４の範囲の整数である）
のいずれかの構造を有する。

【0310】

いくつかの実施形態では、Ｒ^ｚはハプテンである。いくつかの実施形態において、Ｒ^ｚは、オキサゾール、ピラゾール、チアゾール、ベンゾフラザン、トリテルペン、尿素、ローダミンチオ尿素以外のチオ尿素、ジニトロフェニルまたはトリニトロフェニル以外のニトロアリール、ロテノイド、シクロリグナン、ヘテロビアリール、アゾアリール、ベンゾジアゼピンである。他の実施形態では、Ｒ^ｚは、ベンゾフラザンまたはチアゾールスルホンアミドである。

【0311】

いくつかの実施形態において、クマリン系試薬（例えば、式（ＩＩＡ）または（ＩＩＢ）を有するもの）は、抗体の任意の部分に結合され得る。抗体の３個の官能基は、共有結合修飾の部位、アミン（－ＮＨ２）、チオール基（－ＳＨ）、および炭水化物残基（Ｓｈｒｅｓｔｈａ Ｄ，ｅｔ ａｌ，２０１２）である。したがって、本明細書に開示される少なくとも１個の反応性官能基を有するクマリン系試薬のいずれかは、アミン残基、チオール残基、および炭水化物残基、またはそれらの任意の組み合わせに結合され得る。いくつかの実施形態において、クマリン系試薬は、抗体のＦｃ部分に結合される。他の実施形態では、クマリン系試薬は、抗体のヒンジ領域に結合されている。いくつかの実施形態において、クマリン系試薬は、抗体の１つ以上のＦｃ領域および抗体の１つ以上のヒンジ領域に結合される。実際、本開示では、任意の組み合わせが企図されている。

【0312】

アミノ基は、主に抗体にこれらの部分が豊富にあるため、一般的に好まれる。ただし、アミノ基のランダム性は、抗体が不活性化されるリスクをもたらす。（Ａｄａｍｃｚｙｋ Ｍ，ｅｔ ａｌ，１９９９，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ；Ｊｅａｎｓｏｎ Ａ，ｅｔ ａｌ，１９８８，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ；Ｖｉｒａ Ｓ，ｅｔ ａｌ，２０１０，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ；Ｐｅａｒｓｏｎ ＪＥ ｅｔ ａｌ，１９９８，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ）。いくつかの実施形態において、１つ以上のクマリン系試薬は、抗体のアミノ基に結合される。

【0313】

一方、適切な反応条件下では、スルフヒドリル標識は、ヒンジ領域の抗体の２つの重鎖間のジスルフィド結合の高い特異性ターゲティングを提供する。ヒンジ領域は抗原結合部位から離れているため、この修飾は抗体の結合親和性をよりよく保存すると考えられている。いくつかの実施形態において、１つ以上のクマリン系試薬は、抗体のチオール基に結合される。

【0314】

抗体のＦｃ部分に存在する炭水化物部分での結合はチオール基の結合と類似しており、抗原結合部位から離れた－ＣＨＯ基で修飾が起こる。この場合も、炭水化物での複合化は、抗体の結合親和性に対する悪影響が少ないと考えられている。標識化の程度は、特定の抗体のグリコシル化状態によって異なる。しかしながら、抗体親和性の喪失は、Ｊｅａｎｓｏｎ Ａ，ｅｔ ａｌ，１９８８，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．によって依然として報告されている。いくつかの実施形態において、１つ以上のクマリン系試薬は、抗体の炭水化物基に結合される。

【0315】

クマリン系コンジュゲートの検出

【0316】

いくつかの実施形態では、式（ＩＸＡ）、（ＩＸＢ）、（ＩＸＣ）、および（ＩＸＤ）のいずれかのコンジュゲートは、コンジュゲートの直接検出を容易にする検出可能な標識を含む。例えば、クマリン系コンジュゲートの標識がフルオロフォアまたは発色団を含む場合、フルオロフォアまたは発色団は、当業者に知られている方法に従って直接検出することができる。

【0317】

他の実施形態では、特定の試薬を利用して、式（ＩＸＡ）、（ＩＸＢ）、（ＩＸＣ）、（ＩＸＤ）、（ＩＸＥ）、および（ＩＸＦ）の任意のコンジュゲート、したがって組織サンプル中の標的の検出を可能にする。いくつかの実施形態では、コンジュゲートの特定の検出可能な標識に特異的な検出試薬が利用される。いくつかの実施形態では、検出試薬は、コンジュゲートの標識、例えばコンジュゲートのハプテン部分に特異的な二次抗体を含む。例えば、二次抗体は、それ自体がレポーター部分に複合化されている抗標識抗体または抗ハプテン抗体であり得る。

【0318】

いくつかの実施形態において、二次抗体または抗ハプテン抗体は、式（ＩＸＡ）、（ＩＸＢ）、（ＩＸＣ）、（ＩＸＥ）、および（ＩＸＦ）のコンジュゲートの検出を達成するために「レポーター部分」にコンジュゲートされ得る。上記の検出可能な標識のいずれかがこの目的に適しており、すなわち、レポーター部分として機能し得る。いくつかの実施形態において、二次抗体のレポーター部分には、発色性、蛍光性、りん光性、発光性の分子および材料、ある物質を別の物質に変換して検出可能な差異を提供する（無色の物質を着色された物質に変換する、またはその逆、または沈殿物を生成するか、サンプルの濁度を増加させることなどによる）触媒（酵素など）、追加の検出可能な標識抗体コンジュゲートならびに常磁性および磁性分子または材料を使用する抗体－ハプテン結合相互作用により検出され得るハプテンが含まれる。もちろん、検出可能な標識自体も間接的に検出することができ、例えば、検出可能な標識がハプテンである場合、本明細書に記載されるように、当業者に知られている、そのハプテンに特異的なさらに別の抗体（例えば、抗ハプテン抗体）を、検出可能な標識の検出に利用することができる。

【0319】

式（ＩＸＡ）、（ＩＸＢ）、（ＩＸＣ）、および（ＩＸＤ）のいずれかのクマリン系コンジュゲートおよび検出試薬を用いて標的を検出する方法

【0320】

本開示はまた、本明細書に記載の式（ＩＸＡ）、（ＩＸＢ）、（ＩＸＣ）、（ＩＸＤ）、（ＩＸＥ）、および（ＩＸＦ）のコンジュゲートのいずれかを使用して、生物学的サンプル内の１つ以上の標的を検出する方法を提供する。いくつかの実施形態では、式（ＩＸＡ）、（ＩＸＢ）、（ＩＸＣ）、（ＩＸＤ）、（ＩＸＥ）、および（ＩＸＦ）のいずれかのコンジュゲートをシンプレックスアッセイで使用して、生物学的サンプル内の特定の標的（例えば、バイオマーカー）を直接的または間接的に検出することができる（例えば、ＰＤ－Ｌ１、ＥＲ、ＰＲ、ＨＥＲ２ ＣＤ６８、Ｋｉ６７、ＣＤ２０など）。いくつかの実施形態において、バイオマーカーは、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡなど）である。例えば、図１は、核酸プローブに複合化されたクマリン系試薬による染色を示している（式（ＩＸＥ）および（ＩＸＦ）のコンジュゲートを使用する場合など）（クマリン系試薬はＤＩＧに結合され、ＤＩＧは、当技術分野で知られている適切な検出試薬の適用によって検出され得る）。

【0321】

いくつかの実施形態において、式（ＩＸＡ）、（ＩＸＢ）、（ＩＸＣ）、および（ＩＸＤ）のいずれかのコンジュゲートは、一次抗体（例えば、ＰＤ－Ｌ１、ＥＲ、ＰＲ、ＨＥＲ２ ＣＤ６８、Ｋｉ６７、ＣＤ２０に特異的な抗体など）を含む。これらの実施形態では、一次抗体を含むコンジュゲートを使用して、コンジュゲートで標的を直接「標識」することができる。他の実施形態では、式（ＩＸＡ）、（ＩＸＢ）、（ＩＸＣ）、および（ＩＸＤ）のいずれかのコンジュゲートは、二次抗体を含む。これらの実施形態において、そして本明細書においてより詳細に論じられるように、標的（例えば、タンパク質標的または核酸標的）は、一次抗体（ＩＨＣの場合）または核酸コンジュゲート（例えば、ＩＳＨの場合、ハプテンに結合された核酸配列）で標識された後、一次抗体または核酸コンジュゲートを、二次抗体を含む式（ＩＸＡ）、（ＩＸＢ）、（ＩＸＣ）、および（ＩＸＤ）のいずれかのコンジュゲート（後で検出することができる）で「標識」することができる。これらおよび他の実施形態は、本明細書でさらに説明される。

【0322】

例として、図２および３は、組織上に沈着した一次抗体を標識するために利用される二次抗体－クマリン系試薬コンジュゲートを示す。これらの図では、二次抗体は抗抗体抗体であり、コンジュゲートはＤＩＧに結合される。ＤＩＧは、酵素に結合した抗ＤＩＧ抗体を使用し、続いて色素原、例えばＤＡＢを導入することで検出または視覚化することができる。

【0323】

いくつかの実施形態において、クマリン系コンジュゲートは一次抗体を含み、クマリン系の一次抗体コンジュゲートは目的の標的に特異的であり、クマリン系の一次抗体コンジュゲートを組織サンプルに適用すると、標的クマリン系一次抗体コンジュゲート複合体が形成される。クマリン系の一次抗体コンジュゲートの適用に続いて、標的－クマリン系の一次抗体コンジュゲート複合体が検出され得るように、検出試薬（例えば、抗標識抗体または抗ハプテン抗体）が続いて適用され得る。いくつかの実施形態において、検出試薬は、クマリン系の一次抗体コンジュゲートの特定のハプテン検出可能標識に特異的な抗ハプテン抗体を含み、抗ハプテン抗体は、レポーター部分を含む。次に、単一の標的を視覚化するか、そうでなければ検出することができる。

【0324】

他の実施形態では、組織サンプルを、最初に一次抗体または核酸プローブと接触させ、標的－一次抗体複合体または標的－核酸プローブ複合体のいずれかを形成する。続いて、二次抗体を含むクマリン系コンジュゲートを組織サンプルに導入し、クマリン系コンジュゲートの二次抗体部分は、（ｉ）一次抗体、（ｉｉ）一次抗体に複合化された標識、または（ｉｉｉ）核酸プローブに複合化された標識のいずれかに特異的である。クマリン系二次抗体コンジュゲートを適用すると、二次複合体の形成が可能になり、標的を「標識」することができる。クマリン系の二次抗体コンジュゲートの適用および二次複合体の形成に続いて、二次複合体が検出され得るように、検出試薬（例えば、抗標識抗体、抗ハプテン抗体）が適用され得る。いくつかの実施形態において、検出試薬は、クマリン系の二次抗体コンジュゲートの特定の標識に特異的な抗ハプテン抗体を含み、抗ハプテン抗体は、レポーター部分を含む。次に、標的は、結合されたレポーター部分を介して視覚化または他の方法で検出され得る。

【0325】

本開示のいくつかの態様において、自動化された多重検出を含む多重検出の方法が提供される。図４は、組織サンプルが複数のクマリン系コンジュゲートと同時に接触する（工程１００）、標的の多重検出のための１つの方法を示すフローチャートを提供し、各クマリン系コンジュゲートは特定の標的に特異的であり、各クマリン系コンジュゲートは、異なる検出可能な標識を含む。図４は、クマリン系コンジュゲートの適用を示しており、当業者は、クマリン系コンジュゲートが、サンプル内の標的（例えば、核酸配列、一次抗体クマリン系コンジュゲートによって認識されるタンパク質標的、または二次抗体クマリン系コンジュゲートによって認識される事前に沈着された一次抗体）に応じて、クマリン系核酸コンジュゲート、クマリン系一次抗体コンジュゲート、およびクマリン系二次抗体コンジュゲートを含み得ることを理解する。

【0326】

いくつかの実施形態において、サンプルを２つのクマリン系コンジュゲートと接触させることができ、各クマリン系コンジュゲートは、特定の標的に特異的であり、各クマリン系コンジュゲートは、異なる検出可能な標識を含む。他の実施形態において、サンプルを３つのクマリン系コンジュゲートと接触させることができ、各クマリン系コンジュゲートは、特定の標的に特異的であり、各クマリン系コンジュゲートは、異なる検出可能な標識を含む。

【0327】

クマリン系コンジュゲート（式（ＩＸＡ）、（ＩＸＢ）のコンジュゲートのいずれかなど）を、特定のアッセイに必要なクマリン系コンジュゲートのそれぞれを含む「プール」または「カクテル」として組織サンプルに供給することができる。クマリン系コンジュゲートは、少なくとも交差反応性が染色性能を妨げる程度までは、互いに交差反応性ではないと考えられているため、クマリン系コンジュゲートのプーリングが可能であると考えられている。各クマリン系コンジュゲートは、それぞれの標的に結合し、検出可能な標的－クマリン系コンジュゲート複合体を形成する。いくつかの実施形態において、そしてクマリンベーコンジュゲートの適用に続いて、ブロッキング工程が実施される。

【0328】

クマリン系コンジュゲートの同時適用（工程１００）に続いて、複数の検出試薬が組織サンプルに同時に適用され（工程１１０）、各検出試薬は、最初に適用されたクマリン系コンジュゲートの１つの検出を容易にし（工程１００）、各検出試薬は異なる検出可能な標識を含む。他の実施形態では、検出試薬は、クマリン系コンジュゲートの検出可能な標識に特異的な二次抗体（例えば、クマリン系コンジュゲートの標識に特異的な抗標識抗体）である。抗ハプテン抗体が使用される実施形態において、抗ハプテン抗体は、標的－クマリン系抗体コンジュゲート複合体の検出に必要な抗ハプテン抗体のそれぞれを含むプールまたはカクテルとして組織サンプルに供給され得る。検出試薬の適用に続いて、いくつかの実施形態では、組織サンプルは対比染色で染色され得る。レポーター部分のそれぞれからのシグナルは、視覚化されるか、そうでなければ検出され得る（例えば、同時に視覚化または検出され得る）。

【0329】

クマリン系コンジュゲートを利用したマルチプレックスアッセイの一例は次のとおりである。第１の検出可能であり、第１の標的に特異的（例えば、ＰＤ－Ｌ１、ＥＲ、ＰＲ、ＨＥＲ２、ＣＤ６８、Ｋｉ６７、ＣＤ２０などのうちの１つに特異的）な標識を含む第１のクマリン系の抗体コンジュゲートを組織サンプルに導入する。いくつかの実施形態において、第１のクマリン系抗体コンジュゲートは、検出可能な第１の標的－クマリン系抗体コンジュゲート複合体を形成する。同時に、検出可能な標識を含み、第２の標的（例えば、ＰＤ－Ｌ１、ＥＲ、ＰＲ、ＨＥＲ２、ＣＤ６８、Ｋｉ６７、ＣＤ２０などの別のもの）に特異的な第２のクマリン系の抗体コンジュゲートをサンプルに導入して、第２の標的－クマリン系抗体コンジュゲート複合体を形成する。他の標的に特異的であり（「ｎ」標的検出プローブ複合体を形成する）、異なる検出可能な標識を有する第３、第４、および^第ｎの追加のクマリン系コンジュゲートを、第１および第２のクマリン系コンジュゲートと同時にさらに導入する。

【0330】

クマリン系の抗体コンジュゲートが沈着した後、それらは、もちろん、それらの構成に応じて、直接的または間接的に検出され得る。いくつかの実施形態において、抗標識抗体は、標的－クマリン系の抗体コンジュゲート複合体のそれぞれの検出を可能にするために導入される。いくつかの実施形態において、抗標識抗体は、クマリン系コンジュゲートの異なるレポーター部分に特異的であり、抗標識抗体は、それぞれ、異なる検出可能な標識に複合化される。いくつかの実施形態では、検出可能な試薬は、それぞれフルオロフォアに複合化した抗標識抗体である。いくつかの実施形態では、第１、第２、および^第ｎの抗標識抗体が同時に導入され、第１、第２、および^第ｎの検出試薬はそれぞれ、異なるクマリン系コンジュゲートに特異的であり、抗標識抗体のそれぞれがフルオロフォアに複合化されている。他の実施形態では、第１、第２、および^第ｎの抗標識抗体が連続して導入され、第１、第２、および^第ｎの検出試薬はそれぞれ、異なるクマリン系コンジュゲートに特異的であり、抗標識抗体のそれぞれが酵素に複合化されている。

【0331】

本開示によるマルチプレックスアッセイのさらなる例として、第１の標的（例えば、ＰＤ－Ｌ１、ＥＲ、ＰＲ、ＨＥＲ２）に特異的な第１のクマリン系抗体コンジュゲートを組織サンプルに導入し、第１のクマリン系抗体は第１の検出可能な標識を有する。いくつかの実施形態において、第１のクマリン系抗体コンジュゲートは、検出可能な第１の標的－クマリン系抗体コンジュゲート複合体を形成する。同時に、あるいはその後に、第２の標的（例えば、ＰＤ－Ｌ１、ＥＲ、ＰＲ、ＨＥＲ２）に特異的な第２のクマリン系の抗体コンジュゲートをサンプルに導入して、第２の標的－クマリン系抗体コンジュゲート複合体を形成し、第２のクマリン系抗体コンジュゲートは第２の検出可能な標識を有する。第３、第４、および^第ｎの追加のクマリン系抗体コンジュゲートは、それぞれ他の標的に特異的であり（「ｎ」個の標的－クマリン系の抗体コンジュゲート複合体を形成する）、さらに第１および／または第２のクマリン系抗体コンジュゲートと連続してまたは同時に導入されてもよく、第３、第４、および^第ｎのクマリン系抗体コンジュゲートはそれぞれ異なる検出可能な標識をさらに持つ。クマリン系の抗体コンジュゲートは沈着した後に検出することができる。いくつかの実施形態において、標的の検出を可能にするために追加の検出試薬を導入し、追加の検出試薬としては、本明細書に記載されるもの（例えば、発色性検出試薬）が挙げられる。いくつかの実施形態では、第１、第２、および^第ｎの検出試薬が順次導入され、第１、第２、および^第ｎの検出試薬はそれぞれ、（ｉ）クマリン系抗体コンジュゲートの検出可能な標識のそれぞれに特異的な二次抗体、すなわち抗標識抗体、および二次抗体が酵素に複合化されている場合、（ｉｉ）発色基質を含み、第１、第２、および^第ｎの発色基質のそれぞれは異なる。

【0332】

さらに他の実施形態では、多重検出方法は、（ｉ）生物学的サンプルを第１のクマリン系の抗体コンジュゲートと接触させて、第１の標的クマリン系抗体コンジュゲート複合体を形成する工程、（ｉｉ）生物学的サンプルを第１の標識コンジュゲートと接触させる工程であって、第１の標識コンジュゲートは第１の酵素を含む（第１の標識コンジュゲートは第１のクマリン系の抗体コンジュゲートに特異的に結合する抗標識抗体であり、酵素で標的を標識するように構成される）工程、（ｉｉｉ）生物学的サンプルを、第１の潜在的反応性部分および第１の発色部分を含む第１のシグナル伝達コンジュゲートと接触させる工程（例えば、米国特許出願第１３／８４９，１６０号を参照されたい。その開示は、シグナル伝達コンジュゲートとそれらの構成成分の説明について参照により本明細書に組み込まれる）、（ｉｖ）サンプルを第１の酵素不活性化組成物と接触させて、生物学的サンプルに含まれる第１の酵素を実質的に不活性化または完全に不活性化することなどによって、第１の酵素を不活性化する工程を含む。

【0333】

第１の酵素が不活性化された後（任意に）、上記多重法は、（ｖ）生物学的サンプルを第２のクマリン系抗体コンジュゲートと接触させて第２の標的クマリン系抗体コンジュゲートを形成する工程、（ｖｉ）生物学的サンプルを第２の標識コンジュゲートと接触させる工程であって、第２の標識コンジュゲートが第２の酵素を含む（第２の標識コンジュゲートは、第２のクマリン系抗体コンジュゲートに特異的に結合する抗標識抗体であり、酵素により標的を標識するように構成される）工程、（ｖｉｉ）生物学的サンプルを、第２の潜在的反応性部分および第２の発色性部分を含む第２のシグナル伝達コンジュゲートと接触させる工程、（ｖｉｉｉ）サンプルを第１の酵素不活性化組成物と接触させて、生物学的サンプルに含まれる第１の酵素を実質的に不活性化または完全に不活性化するなどによって第２の酵素を不活性化する工程、を含む。

【0334】

第２の酵素が不活性化された後、追加のクマリン系抗体コンジュゲートが追加の検出試薬と共に導入されて、他の標的の検出を達成することができるように、この方法を繰り返すことができる。すべてのクマリン系抗体コンジュゲート（および他の検出プローブ）およびそれぞれの検出試薬またはキットの導入に続いて、この方法は、サンプルを対比染色する工程および／または第１、第２、および^第ｎの発色性部分からの（手動または自動化された方法を介して）シグナルを検出する工程をさらに含み、第１、第２、および第^ｎの発色性部分のそれぞれはそれぞれ異なる。あるいは、クマリン系の抗体コンジュゲートのそれぞれを同時にまたは連続して加えることができるが、標識コンジュゲートを加える前に加える。別の例として、３つのクマリン系抗体コンジュゲートを、任意の検出試薬の導入前に最初に連続して適用し、次に各検出試薬を連続して添加することができる。

【0335】

複数の標的が連続して検出され、検出が酵素の使用を採用するマルチプレックスアッセイの状況では、連続する検出工程の間に任意の試薬または内因性酵素を不活性化することが望ましい。結果として、いずれか１つの検出工程に存在する酵素は、後の検出工程の酵素に干渉しないと考えられている。これは次に、マルチプレックスアッセイで使用される異なる検出可能な部分の視覚化および検出を改善すると考えられている。当技術分野で知られている任意の酵素不活化組成物をこの目的に使用することができる。いくつかの実施形態において、酵素不活性化組成物は、各検出工程の後に試薬または内因性酵素を不活性化するために適用される。例示的な酵素不活性化組成物は、米国特許出願公開第２０１８／０１２０２０２号に開示されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0336】

いくつかの実施形態では、変性工程は、検出試薬の第１のセットで使用される酵素が第２の基質に作用するのを防ぐ。いくつかの実施形態では、変性剤は、第１の検出試薬セット中の酵素を変性させる物質である。いくつかの実施形態において、変性剤は、例えば、ホルムアミド、アルキル置換アミド、尿素または尿素系の変性剤、チオ尿素、塩酸グアニジン、またはそれらの誘導体である。アルキル置換アミドの例には、Ｎ－プロピルホルムアミド、Ｎ－ブチルホルムアミド、Ｎ－イソブチルホルムアミド、およびＮ，Ｎ－ジプロピルホルムアミドが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、変性剤は緩衝液中で提供される。例えば、ホルムアミドは、２０ｍＭデキストラン硫酸（５０～５７％％ホルムアミド（ＵｌｔｒａＰｕｒｅホルムアミド原液）、２×ＳＳＣ（０．３Ｍクエン酸塩および３Ｍ ＮａＣｌを含む２０×ＳＳＣ原液）、２．５ｍＭ ＥＤＴＡ（０．５Ｍ ＥＤＴＡス原液）、５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４（１ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４原液）、０．０５％Ｂｒｉｊ－３５（ポリオキシエチレン（２３）ラウリルエーテルを含む１０％原液）、ｐＨ７．４を含む。いくつかの実施形態では、サンプルを、第１の標的プローブ検出酵素、例えばアルカリホスファターゼを変性させるのに十分な条件下で、一定期間、変性剤で処理する。いくつかの実施形態において、サンプルを、約３７℃で約１５～約３０分間、好ましくは約２０～２４分間、変性剤で処理する。いくつかの実施形態において、サンプルを、標的への第２の核酸プローブのハイブリダイゼーションを維持しながら、標的酵素を変性させるのに十分な期間および条件下で、変性剤で処理する。

【0337】

酵素に複合化された抗標識抗体を使用するこれらの実施形態では、シグナル伝達コンジュゲートまたは発色基質を生物学的サンプルと共に導入するのに適した条件が使用され、典型的には、過酸化物（例えば、過酸化水素）を含み、酵素がその所望の機能を実行することを可能にするかまたは促進するのに適した塩濃度およびｐＨを有する反応緩衝液または溶液を提供することを含む。一般に、方法のこの工程は、約３５℃～約４０℃の範囲の温度で実施されるが、当業者は、選択された酵素およびシグナル伝達コンジュゲートに適切な、適切な温度範囲を選択することができる。例えば、これらの条件は、酵素と過酸化物が反応し、シグナル伝達コンジュゲートの潜在的な反応性部分でのラジカル形成を促進することを可能にすると考えられている。潜在的な反応性部分、したがって全体としてのシグナル伝達コンジュゲートは、生物学的サンプル、特に固定化酵素コンジュゲートの近位のチロシン残基、酵素コンジュゲートの酵素部分のチロシン残基、および／または酵素コンジュゲートの抗体部分のチロシン残基の１つ以上に共有結合により沈着する。次に、生物学的サンプルに光を照射し、シグナル伝達コンジュゲートの発色部分によって生成される光の吸光度によって標的を検出することができる。

【0338】

他の特異的結合実体と組み合わせて、式（ＩＸＡ）、（ＩＸＢ）、（ＩＸＣ）、（ＩＸＤ）、（ＩＸＥ）、および（ＩＸＦ）のいずれかのコンジュゲートを検出する方法

【0339】

本開示のいくつかの態様において、式（ＩＸＡ）、（ＩＸＢ）、（ＩＸＣ）、および（ＩＸＤ）のいずれかのコンジュゲートは、組織サンプル中の標的の多重検出をもたらすために他の特異的結合実体と組み合わせて使用される。当業者は、上記で特定された方法および手順のいずれかが、式（ＩＸＡ）、（ＩＸＢ）、（ＩＸＣ）、および（ＩＸＤ）のいずれかのコンジュゲート、ならびに他の特異的結合実体の両方を用いる任意のアッセイに適宜適合され得ることを理解することができよう。いくつかの実施形態において、他の特異的結合実体は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのための核酸およびＩＨＣのための未修飾抗体を含む。本明細書で使用される場合、「未修飾抗体」または「未修飾抗体」という用語は、本明細書に開示されるクマリン系試薬を含まないが、ハプテンまたは別の標識に結合した抗体を含む抗体を指す。本質的に、「未修飾抗体」は、ＩＨＣアッセイで伝統的に使用されているネイティブ抗体であり、特定の標的（例えば、抗ＣＤ３抗体）に特異的であり、抗種二次抗体、またはそれらが標識を含む場合には抗標識抗体などで検出することができる。例として、ウサギ抗ＣＤ３抗体は、ヤギ抗ウサギ抗体で検出することができる。同様に、ハプテンに結合したウサギ抗ＣＤ３抗体は、抗ハプテン抗体で検出することができる。例えば、ＥＲに特異的な未修飾抗体をサンプルに導入し、後で検出することができるのに対し、同時にまたは連続して、ＰＲに特異的な本開示のクマリン系コンジュゲートを同じサンプルに導入し、そして検出することができる。

【0340】

式（ＩＩＩＡ）、（ＩＩＩＢ）、（ＩＩＩＣ）、および（ＩＩＩＤ）のクマリン系試薬を使用してサンプル中の標的を検出する方法

【0341】

本開示はまた、クマリン系試薬、例えば、式（ＩＩＩＡ）、（ＩＩＩＢ）、（ＩＩＩＣ）、および（ＩＩＩＤ）のこれらの化合物を使用して組織サンプル内の１つ以上の標的を検出する方法を提供する。

【0342】

いくつかの実施形態において、酵素反応性部分（例えば、「Ａ」がチラミドの誘導体またはキノンメチド誘導体である場合）を有し、検出可能な標識（例えば、「Ｂ」がハプテンである場合）を有する式（ＩＩＩＡ）、（ＩＩＩＢ）、（ＩＩＩＣ）、および（ＩＩＩＤ）の化合物を、標的結合酵素（例えば、抗体－酵素コンジュゲートまたは生物学的サンプルにすでに沈着している核酸－酵素コンジュゲート）と接触させて、反応性中間体を生成する。例えば、抗体－ペルオキシダーゼコンジュゲートは、標的上に沈着されてもよく、そしてペルオキシダーゼ酵素は、式（ＩＩＩＡ）、（ＩＩＩＢ）、（ＩＩＩＣ）、および（ＩＩＩＤ）のサンプルへの導入時にいずれかの化合物の酵素反応性部分と反応し得る。別の例として、核酸－ホスファターゼコンジュゲートは、サンプル内の標的にハイブリダイズすることができ、複合化したホスファターゼ酵素は、式（ＩＩＩＡ）、（ＩＩＩＢ）、（ＩＩＩＣ）、および（ＩＩＩＤ）のサンプルへの導入時にいずれかの化合物の酵素反応性部分と反応することができる。

【0343】

いくつかの実施形態において、反応性中間体は、生物学的サンプル上またはその内部で求核試薬への共有結合を形成して、固定化された組織－クマリン系の化合物複合体を提供する。式（ＩＩＩＡ）、（ＩＩＩＢ）、（ＩＩＩＣ）、および（ＩＩＩＤ）の化合物の検出可能な標識のおかげで、組織－クマリン系の複合体を視覚化することができる。例えば、検出可能な標識がハプテンである場合、レポーターに複合化された抗ハプテン抗体（例えば、色素原またはフルオロフォア）を導入して、組織－クマリン系の化合物複合体を検出することができる。酵素反応性部分を有する化合物を使用する検出および視覚化の方法は、米国特許出願公開第２０１７／００８９９１１号および同第２０１２／０１７１６６８号に記載されており、それらの開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0344】

図５は、チラミド部分およびハプテン、例えばＤＩＧに結合した式（ＩＩＩＡ）、（ＩＩＩＢ）、（ＩＩＩＣ）、および（ＩＩＩＤ）のいずれかのクマリン系の部分の使用を示し、ＤＩＧに対して結合されたチラミド部分と染色性能を比較する。

【0345】

式（ＩＩＩＥ）および（ＩＩＩＦ）のクリックコンジュゲートを使用してサンプル内の標的を検出する方法

【0346】

式（ＩＩＩＥ）および（ＩＩＩＦ）の試薬は、特定のクリックコンジュゲートを使用してサンプル内の標的を検出するために使用され得る。いくつかの実施形態において、酵素反応性部分を含み、クリックケミストリー反応に関与することができる官能基をさらに含む、式（ＩＩＩＥ）または（ＩＩＩＦ）を有する試薬を標的結合酵素（例えば、標的結合酵素は、生物学的サンプルにすでに沈着している抗体－酵素コンジュゲートであり得る）と接触させて反応性中間体を生成する。いくつかの実施形態において、反応性中間体は、生物学的サンプル上またはその内部で求核試薬への共有結合を形成して、固定化された組織－クマリン系の化合物複合体を提供する。次に、固定化組織クリックコンジュゲート複合体は、レポーター部分を含み、クリックケミストリー反応に関与することができる官能基を含むクリックコンジュゲートと反応することができるが、ただし、クリックコンジュゲートおよび固定化組織クリックコンジュゲート複合体は、互いに反応して共有結合を形成することができる反応性官能基を有し得る。固定化された組織クリックコンジュゲート複合体とクリックコンジュゲートの反応生成物は、固定化された組織クリック付加物複合体を生成する。組織クリック付加物複合体は、連結されたレポーター部分から伝達されるシグナルによって検出され得る。固定化された組織クリックコンジュゲート複合体と反応するのに有用なクリックコンジュゲートには、ＰＣＴ公開番号ＷＯ／２０１８／００２０１６に記載されているものが含まれ、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。検出方法のさらなる詳細は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ／２０１８／００２０１６にも開示されており、これらの開示はそれぞれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

【0347】

クマリン系試薬の合成

【0348】

式（ＩＡ）または（ＩＢ）の試薬のいずれかなど、様々なタイプのクマリン系試薬を合成する方法を以下に説明する。

【0349】

２，５－ジオキソピロリジン－１－イル７－ヒドロキシ－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－３－カルボキシレートの合成

【0350】

７－ヒドロキシ－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－３－カルボン酸（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、５００ｍｇ、２．２７ｍｍｏｌ）を１０ｍｌの乾燥ＤＭＦに溶解し、その溶液にＤＳＣ（６４１ｍｇ、２．５０ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（４１６ｍｇ、３．４０ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を室温（ｒ．ｔ．）で１時間撹拌し、次に５０ｍｌのＤＣＭで希釈した。溶液を５０ｍｌの水で３回、そして５０ｍｌのブラインで１回洗浄し、次いで真空下で濃縮した後、シリカゲルクロマトグラフィー（２％イソプロパノール／ＤＣＭから１０％イソプロパノール／ＤＣＭ）により精製して、６３２ｍｇ（８６％収率）の２，５－ジオキソピロリジン－１－イル７－ヒドロキシ－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－３－カルボキシレート（化合物１０）を得た。

【0351】

ｔｅｒｔ－ブチル（１－（７－ヒドロキシ－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－３－イル）－１－オキソ－６，９，１２－トリオキサ－２－アザペンタデカン－１５－イル）カルバメートの合成

【0352】

この例では、リンカー基がクマリン部分に導入されている。

【0353】

２，５－ジオキソピロリジン－１－イル７－ヒドロキシ－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－３－カルボキシレート（５００ｍｇ、１．６５ｍｍｏｌ）を１０ｍｌのＤＣＭに溶解し、その溶液にｔｅｒｔ－ブチル（３－（２－（３－アミノプロポキシ）エトキシ）プロピル）カルバメート（５４７ｍｇ、１．９８ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（３３４ｍｇ、３．３ｍｍｏｌ）を加え、反応物を室温で１６時間撹拌した。完了したら、反応物を減圧下で濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（２％メタノール／ＤＣＭから１０％メタノール／ＤＣＭ）によって精製して、黄色の油として６８８ｍｇ（８２％収率）のｔｅｒｔ－ブチル（１－（７－ヒドロキシ－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－３－イル）－１－オキソ－６，９，１２－トリオキサ－２－アザペンタデカン－１５－イル）カルバメート（化合物１１）を得た。

【0354】

ｔｅｒｔ－ブチル２－（（３－（（２，２－ジメチル－４－オキソ－３，９，１２，１５－テトラオキサ－５－アザオクタデカン－１８－イル）カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）アセテートの合成

【0355】

ｔｅｒｔ－ブチル（１－（７－ヒドロキシ－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－３－イル）－１－オキソ－６，９，１２－トリオキサ－２－アザペンタデカン－１５－イル）カルバメート（４０７ｍｇ、０．８０ｍｍｏｌ）を１０ｍｌの乾燥ＤＭＦに溶解し、その溶液にｔｅｒｔ－ブチル２－ブロモアセテート（１７２ｍｇ、０．８８４ｍｍｏｌ）および炭酸カリウム（３３０ｍｇ、２．４１ｍｍｏｌ）を加え、反応物を６０℃の油浴上で撹拌した。３時間後、反応物を７０ｍｌのＤＣＭで希釈し、溶液を１００ｍｌの水で３回、１００ｍｌのブラインで１回洗浄した。溶液を真空下で濃縮した後、シリカゲルクロマトグラフィー（２％メタノール／ＤＣＭから１２％メタノール／ＤＣＭ）で精製して、３９８ｍｇ（８０％収率）のｔｅｒｔ－ブチル２－（（３－（（２，２－ジメチル－４－オキソ－３，９，１２，１５－テトラオキサ－５－アザオクタデカン－１８－イル）カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）アセテート（化合物１２）を得た。

【0356】

２－（（３－（（３－（２－（２－（３－アミノプロポキシ）エトキシ）エトキシ）プロピル）－カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）酢酸の合成

【0357】

ｔｅｒｔ－ブチル２－（（３－（（２，２－ジメチル－４－オキソ－３，９，１２，１５－テトラオキサ－５－アザオクタデカン－１８－イル）カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）アセテート（３９８ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）を２０ｍｌの３５％ＴＦＡ／ＤＣＭに溶解し、ＨＰＬＣで反応が完了するまで（約４時間）室温で撹拌した。次に、反応物を真空下で濃縮し、トルエンで３回共沸させ、高真空下で一晩乾燥させて、２－（（３－（（３－（２－（２－（３－アミノプロポキシ）エトキシ）エトキシ）プロピル）カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）酢酸（化合物１３）（１：１）と共に３７２ｍｇの２，２，２－トリフルオロ酢酸化合物を得て、これをさらに精製することなく使用した。

【0358】

２－（（３－（（１－（（（３Ｓ，１０Ｓ，１２Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｒ）－１２，１４－ジヒドロキシ－１０，１３－ジメチル－１７－（５－オキソ－２，５－ジヒドロフラン－３－イル）ヘキサデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル）オキシ）－２，１０－ジオキソ－１５，１８，２１－トリオキサ－３，１１－ジアザテトラコサン－２４－イル）カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）酢酸の合成

【0359】

この例では、ハプテン部分が導入されている。

【0360】

３ｍｌの乾燥ＤＭＦ中の２，５－ジオキソピロリジン－１－イル７－（２－（（（３Ｓ，１０Ｓ，１２Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｒ）－１２，１４－ジヒドロキシ－１０，１３－ジメチル－１７－（５－オキソ－２，５－ジヒドロフラン－３－イル）ヘキサデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル）オキシ）アセトアミド）ヘプタノエート（９０ｍｇ、０．１３７ｍｍｏｌ）の溶液に２－（（３－（（３－（２－（２－（３－アミノプロポキシ）エトキシ）エトキシ）プロピル）カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）酢酸２，２，２－トリフルオロ酢酸塩（１：１）（１２０ｍｇ、０．２０５ｍｍｏｌ）およびヒューニッヒ塩基（８２μＬ、０．４８０ｍｍｏｌ）を加え、反応物を室温で一晩（ｏ．ｎ．）攪拌した。粗反応物を０．２ミクロンフィルタでフィルタにかけ、分取ＨＰＬＣで精製した。純粋な画分を合わせて凍結乾燥し、１１６ｍｇ（８３％収率）の２（（３－（（１－（（（３Ｓ，１０Ｓ，１２Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｒ）－１２，１４－ジヒドロキシ－１０，１３－ジメチル－１７－（５－オキソ－２，５－ジヒドロフラン－３－イル）ヘキサデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル）オキシ）－２，１０－ジオキソ－１５，１８，２１－トリオキサ－３，１１－ジアザテトラコサン－２４－イル）カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）酢酸（化合物１４）を灰白色の粉末として得た。

【0361】

１－（（３－（（１－（（（３Ｓ，１０Ｓ，１２Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｒ）－１２，１４－ジヒドロキシ－１０，１３－ジメチル－１７－（５－オキソ－２，５－ジヒドロフラン－３－イル）ヘキサデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル）オキシ）－２，１０－ジオキソ－１５，１８，２１－トリオキサ－３，１１－ジアザテトラコサン－２４－イル）カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）－２－オキソ－６，９，１２，１５－テトラオキサ－３－アザオクタデカン－１８－オイック酸の合成

【0362】

この例では、第２のリンカーがクマリン部分に導入されている。

【0363】

１０ｍｌの乾燥ＤＣＭ中の２－（（３－（（１－（（（３Ｓ，１０Ｓ，１２Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｒ）－１２，１４－ジヒドロキシ－１０，１３－ジメチル－１７－（５－オキソ－２，５－ジヒドロフラン－３－イル）ヘキサデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル）オキシ）－２，１０－ジオキソ－１５，１８，２１－トリオキサ－３，１１－ジアザテトラコサン－２４－イル）カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）酢酸（１３０ｍｇ、０．１２９ｍｍｏｌ）の溶液にＮ－ヒドロキシスクシンイミド（１９ｍｇ、０．１６７ｍｍｏｌ）およびＤＣＭ中の１．０Ｍ ＤＣＣ（１６７μＬ、０．１６７ｍｍｏｌ）を加え、ＨＰＬＣによって決定されるように活性エステルの形成が完了するまで（約４時間）反応物を室温で攪拌した。尿素副生成物を濾過により除去し、溶液に１－アミノ－３，６，９，１２－テトラオキサペンタデカン－１５－オイック酸（４４ｍｇ、０．１６７ｍｍｏｌ）およびヒューニッヒ塩基（６６μＬ、０．１６７ｍｍｏｌ）を加え、反応物を室温で一晩撹拌した。反応物を濃縮し、最小のメタノールに取り、分取ＨＰＬＣによって精製した。純粋な画分を合わせて凍結乾燥し、１２５ｍｇ（７６％収率）の１－（（３－（（１－（（（３Ｓ，１０Ｓ，１２Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｒ）－１２，１４－ジヒドロキシ－１０，１３－ジメチル－１７－（５－オキソ－２，５－ジヒドロフラン－３－イル）ヘキサデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル）オキシ）－２，１０－ジオキソ－１５，１８，２１－トリオキサ－３，１１－ジアザテトラコサン－２４－イル）カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）－２－オキソ－６，９，１２，１５－テトラオキサ－３－アザオクタデカン－１８－オイック酸（化合物１５）を灰白色の粉末として得た。

【0364】

２，５－ジオキソピロリジン－１－イル１－（（３－（（１－（（（３Ｓ，１０Ｓ，１２Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｒ）－１２，１４－ジヒドロキシ－１０，１３－ジメチル－１７－（５－オキソ－２，５－ジヒドロフラン－３－イル）ヘキサデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル）オキシ）－２，１０－ジオキソ－１５，１８，２１－トリオキサ－３，１１－ジアザテトラコサン－２４－イル）カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）－２－オキソ－６，９，１２，１５－テトラオキサ－３－アザオクタデカン－１８－オエートの合成

【0365】

この例では、出発物質は、得られた試薬をタンパク質または抗体などの高分子に結合できるように誘導体化されている。

【0366】

１０ｍｌの乾燥ＤＣＭ中の１－（（３－（（１－（（（３Ｓ，１０Ｓ，１２Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｒ）－１２，１４－ジヒドロキシ－１０，１３－ジメチル－１７－（５－オキソ－２，５－ジヒドロフラン－３－イル）ヘキサデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル）オキシ）－２，１０－ジオキソ－１５，１８，２１－トリオキサ－３，１１－ジアザテトラコサン－２４－イル）カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）－２－オキソ－６，９，１２，１５－テトラオキサ－３－アザオクタデカン－１８－オイック酸（２５ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）の溶液にＮ－ヒドロキシスクシンイミド（２．３ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）およびＤＣＭ中の１．０Ｍ ＤＣＣ（３０μＬ、０．０３ｍｍｏｌ）を加え、ＨＰＬＣによって決定されるように活性エステルの形成が完了するまで（約４時間）反応物を室温で攪拌した。尿素副生成物をフィルタにより除去し、反応物を濃縮し、最小のメタノールに取り、分取ＨＰＬＣにより精製した。純粋な画分を合わせて凍結乾燥し、２２ｍｇ（８０％収率）の２，５－ジオキソピロリジン－１－イル１－（（３－（（１－（（（３Ｓ，１０Ｓ，１２Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｒ）－１２，１４－ジヒドロキシ－１０，１３－ジメチル－１７－（５－オキソ－２，５－ジヒドロフラン－３－イル）ヘキサデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル）オキシ）－２，１０－ジオキソ－１５，１８，２１－トリオキサ－３，１１－ジアザテトラコサン－２４－イル）カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）－２－オキソ－６，９，１２，１５－テトラオキサ－３－アザオクタデカン－１８－オエート（化合物１６）を灰白色の粉末として得た。

【0367】

４－ヒドロキシフェニルエチル１－（（３－（（１－（（（３Ｓ，１０Ｓ，１２Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｒ）－１２，１４－ジヒドロキシ－１０，１３－ジメチル－１７－（５－オキソ－２，５－ジヒドロフラン－３－イル）ヘキサデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル）オキシ）－２，１０－ジオキソ－１５，１８，２１－トリオキサ－３，１１－ジアザテトラコサン－２４－イル）カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）－２－オキソ－６，９，１２，１５－テトラオキサ－３－アザオクタデカン－１８－オエートの合成

【0368】

この例では、酵素反応性部分、具体的にはチラミド部分が導入されている。

【0369】

２ｍｌの乾燥ＤＭＦ中の２，５－ジオキソピロリジン－１－イル１－（（３－（（１－（（（３Ｓ、１０Ｓ、１２Ｒ、１３Ｓ、１４Ｓ、１７Ｒ）－１２，１４－ジヒドロキシ－１０，１３－ジメチル－１７－（５－オキソ－２，５－ジヒドロフラン－３－イル）ヘキサデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル）オキシ）－２，１０－ジオキソ－１５，１８，２１－トリオキサ－３，１１－ジアザテトラコサン－２４－イル）カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）－２－オキソ－６，９，１２，１５－テトラオキサ－３－アザオクタデカン－１８－オエート（２０ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ）の溶液にチラミン（４．１ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（４．２μＬ、０．０３０ｍｍｏｌ）を加え、反応物を室温で一晩撹拌した。粗反応物を０．２ミクロンフィルタでフィルタにかけ、分取ＨＰＬＣで精製した。純粋な画分を合わせて凍結乾燥し、１７ｍｇ（８１％収率）の４－ヒドロキシフェニルエチル１－（（３－（（１－（（（３Ｓ，１０Ｓ，１２Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｒ）－１２，１４－ジヒドロキシ－１０，１３－ジメチル－１７－（５－オキソ－２，５－ジヒドロフラン－３－イル）ヘキサデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル）オキシ）－２，１０－ジオキソ－１５，１８，２１－トリオキサ－３，１１－ジアザテトラコサン－２４－イル）カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）－２－オキソ－６，９，１２，１５－テトラオキサ－３－アザオクタデカン－１８－オエート（化合物１７）を灰白色の粉末として得た。

【0370】

２－（（３－（（２，２－ジメチル－４－オキソ－３，９，１２，１５－テトラオキサ－５－アザオクタデカン－１８－イル）カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）酢酸の合成

【0371】

５０ｍｌのジオキサン／水（１：１）中の２－（（３－（（３－（２－（２－（３－アミノプロポキシ）エトキシ）エトキシ）プロピル）カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）酢酸（１：１）（８．０３ｇ、１３．８３ｍｍｏｌ）の２，２，２－トリフルオロ酢酸塩の溶液に（Ｂｏｃ）２Ｏ（３．０２ｇ、１３．８３ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（４．３８ｍｌ、３１．４６）を加え、反応物を室温で一晩撹拌した。反応物を１００ｍｌのＤＣＭで希釈し、５０ｍｌの水で２回、ブラインで１回洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４のプラグを通してフィルタにかけることにより乾燥させ、次にシリカゲルクロマトグラフィー（４％メタノール／ＤＣＭから１５％メタノール／ＤＣＭ）による精製の前に濃縮して、６．４８ｇ（８３％収率）の２－（（３－（（２，２－ジメチル－４－オキソ－３，９，１２，１５－テトラオキサ－５－アザオクタデカン－１８－イル）カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）酢酸（化合物２０）を得た。

【0372】

１－（（３－（（２，２－ジメチル－４－オキソ－３，９，１２，１５－テトラオキサ－５－アザオクタデカン－１８－イル）カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）－２－オキソ－６，９，１２，１５－テトラオキサ－３－アザオクタデカン－１８－オイック酸の合成

【0373】

４０ｍｌの乾燥ＤＣＭ中の２－（（３－（（２，２－ジメチル－４－オキソ－３，９，１２，１５－テトラオキサ－５－アザオクタデカン－１８－イル）カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）酢酸（６．４８ｇ、１１．４ｍｍｏｌ）の溶液にＤＣＭ中の１．０Ｍ ＤＣＣ（１７．１６ｍｌ、１７．１６ｍｍｏｌ）およびＮＨＳ（１．９７ｇ、１７．１６ｍｍｏｌ）を加え、反応物をエステル形成が完了するまで（５時間）室温で撹拌した。尿素副生成物を濾過により除去し、溶液に１－アミノ－３，６，９，１２－テトラオキサペンタデカン－１５－オイック酸（４．５５ｇ、１７．１６ｍｍｏｌ）およびヒューニッヒ塩基（２．２２ｇ、１７．１６ｍｍｏｌ）を加え、反応物を室温で一晩撹拌した。反応物を濃縮し、最小のメタノールに取り、分取ＨＰＬＣによって精製した。純粋な画分を合わせて凍結乾燥し、７．４２ｇ（収率８０％）の１－（（３－（（２，２－ジメチル－４－オキソ－３，９，１２，１５－テトラオキサ－５－アザオクタデカン－１８）－イル）カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）－２－オキソ－６，９，１２，１５－テトラオキサ－３－アザオクタデカン－１８－オイック酸（化合物２１）を得た。

【0374】

１－（（３－（（３－（２－（２－（３－アミノプロポキシ）エトキシ）エトキシ）－プロピル）カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）－２－オキソ－６，９，１２，１５－テトラオキサ－３－アザオクタデカン－１８－オイック酸（１：１）の合成

【0375】

１－（（３－（（２，２－ジメチル－４－オキソ－３，９，１２，１５－テトラオキサ－５－アザオクタデカン－１８－イル）カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）－２－オキソ－６，９，１２，１５－テトラオキサ－３－アザオクタデカン－１８－オイック酸（７．４２ｇ、９．１２ｍｍｏｌ）を５０ｍｌの３５％ＴＦＡ／ＤＣＭに溶解し、ＨＰＬＣによって反応が完了するまで室温で撹拌した（約４時間）。次に、反応物を真空下で濃縮し、トルエンで３回共沸させ、高真空下で一晩乾燥させて、７．９２ｇの１－（（３－（（３－（２－（２－（３－アミノプロポキシ）エトキシ）エトキシ）プロピル）カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）－２－オキソ－６，９，１２，１５－テトラオキサ－３－アザオクタデカン－１８－オイック酸の２，２，２－トリフルオロ酢酸塩（化合物２２）（１：１）を淡黄色の油として得た。

【0376】

１－（（３－（（１－（ベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール－５－イル）－１－オキソ－６，９，１２－トリオキサ－２－アザペンタデカン－１５－イル）カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）－２－オキソ－６，９，１２，１５－テトラオキサ－３－アザオクタデカン－１８－オイック酸の合成

【0377】

５ｍｌの乾燥ＤＣＭ中のベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール－５－カルボン酸（１３ｍｇ、０．０７９ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＣＭ中の１．０Ｍ ＤＣＣ（１００ｕｌ、０．１０ｍｍｏｌ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（１２ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を加え、反応がＨＰＬＣによって完了するまで（約４時間）溶液を室温で撹拌した。尿素副生成物を濾過により除去し、溶液に

【0378】

１－（（３－（（３－（２－（２－（３－アミノプロポキシ）エトキシ）エトキシ）プロピル）カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）－２－オキソ－６，９，１２，１５－テトラオキサ－３－アザオクタデカン－１８－オイック酸の２，２，２－トリフルオロ酢酸塩（１：１）（８２．８ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（３０ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）を加え、反応物を室温で一晩撹拌した。反応物を濃縮し、最小のメタノールに取り、分取ＨＰＬＣによって精製した。純粋な画分を合わせて凍結乾燥し、４２ｍｇ（６２％の収率）の１－（（３－（（１－（ベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール－５－イル）－１－オキソ－６，９，１２－トリオキサ－２－アザペンタデカン－１５－イル）カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）－２－オキソ－６，９，１２，１５－テトラオキサ－３－アザオクタデカン－１８－オイック酸（化合物２３）を得た。

【0379】

２，５－ジオキソピロリジン－１－イル１－（（３－（（１－（ベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール－５－イル）－１－オキソ－６，９，１２－トリオキサ－２－アザペンタデカン－１５－イル）カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）－２－オキソ－６，９，１２，１５－テトラオキサ－３－アザオクタデカン－１８－オエートの合成

【0380】

１０ｍｌの乾燥ＤＣＭ中の１－（（３－（（１－（ベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール－５－イル）－１－オキソ－６，９，１２－トリオキサ－２－アザペンタデカン－１５－イル）カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）－２－オキソ－６，９，１２，１５－テトラオキサ－３－アザオクタデカン－１８－オイック酸（４２ｍｇ、０．０４９ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＣＭ中の１．０Ｍ ＤＣＣ（６０μＬ、０．０６ｍｍｏｌ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（１２ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）を加え、反応がＨＰＬＣによって完了するまで（約４時間）溶液を室温で撹拌した。尿素副生成物をフィルタにより除去し、反応物を濃縮し、最小のメタノールに取り、分取ＨＰＬＣにより精製した。純粋な画分を合わせて凍結乾燥し、３８ｍｇ（８１％収率）の２，５－ジオキソピロリジン－１－イル１－（（３－（（１－（ベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール－５－イル）－１－オキソ－６，９，１２－トリオキサ－２－アザペンタデカン－１５－イル）カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）－２－オキソ－６，９，１２，１５－テトラオキサ－３－アザオクタデカン－１８－オエート（化合物２４）を得た。

【0381】

Ｎ－（１－（７－（（２１－（４－ヒドロキシフェニル）－２，１８－ジオキソ－６，９，１２，１５－テトラオキサ－３，１９－ジアザヘニコシル）オキシ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－３－イル）－１－オキソ－６，９，１２－トリオキサ－２－アザペンタデカン－１５－イル）ベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール－５－カルボキサミドの合成

【0382】

５ｍｌの乾燥ＤＣＭ中のベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール－５－カルボン酸（１３ｍｇ、０．０７９ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＣＭ中の１．０Ｍ ＤＣＣ（１００ｕｌ、０．１０ｍｍｏｌ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（１２ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を加え、反応がＨＰＬＣによって完了するまで（約４時間）溶液を室温で撹拌した。尿素副生成物を濾過により除去し、溶液にＮ－（３－（２－（２－（３－アミノプロポキシ）エトキシ）エトキシ）プロピル）－７－（（２１－（４－ヒドロキシフェニル）－２，１８－ジオキソ－６，９，１２，１５－テトラオキサ－３，１９－ジアザヘニコシル）オキシ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－３－カルボキサミド２，２，２－トリフルオロアセテート（９４．７ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（３０ｍｇ、０．３０ｍｍｏｌ）を加え、反応物を室温で一晩撹拌した。反応物を濃縮し、最小のメタノールに取り、分取ＨＰＬＣによって精製した。純粋な画分を合わせて凍結乾燥し、４０ｍｇ（５２％の収率）のＮ－（１－（７－（（２１－（４－ヒドロキシフェニル）－２，１８－ジオキソ－６，９，１２，１５－テトラオキサ）－３，１９－ジアザヘニコシル）オキシ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－３－イル）－１－オキソ－６，９，１２－トリオキサ－２－アザペンタデカン－１５－イル）ベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール－５－カルボキサミド（化合物２５）を得た。

【0383】

ｔｅｒｔ－ブチル３－（２－アセトアミド－５－メチルチアゾール－４－スルホンアミド）プロパノエートの合成

【0384】

３０ｍｌの乾燥ＤＣＭ中の２－アセトアミド－５－メチルチアゾール－４－スルホニルクロリド（１．０１ｇ、３．９７ｍｍｏｌ）の溶液に、ｔｅｒｔ－ブチル３－アミノプロパノエート（１．４４ｇ、７．９４ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２．２１ｍｌ、１５．８８ｍｍｏｌ）を加え、反応物を室温で１時間撹拌した。反応物を約５ｍｌに濃縮し、次いでシリカゲルクロマトグラフィー（１％メタノール／ＤＣＭから１５％メタノール／ＤＣＭ）により精製して、１．３３ｇ（９２％収率）のｔｅｒｔ－ブチル３－（２－アセトアミド－５－メチルチアゾール）－４－スルホンアミド）プロパノエート（化合物３０）を得た。

【0385】

３－（２－アセトアミド－５－メチルチアゾール－４－スルホンアミド）プロパン酸の合成

【0386】

ｔｅｒｔ－ブチル３－（２－アセトアミド－５－メチルチアゾール－４－スルホンアミド）プロパノエート（１．３３ｇ、３．６５ｍｍｏｌ）を３０ｍｌの３０％ＴＦＡ／ＤＣＭに取り、反応がＨＰＬＣによって完了するまで（約３時間）反応物を室温で撹拌した。次に、反応物を真空下で濃縮し、トルエンで３回共沸させ、高真空下で一晩乾燥させて、３－（２－アセトアミド－５－メチルチアゾール－４－スルホンアミド）プロパン酸（化合物３１）を得て、これをさらに精製することなく使用した。

【0387】

２－（（３－（（１７－（２－アセトアミド－５－メチルチアゾール－４－スルホンアミド）－１５－オキソ－４，７，１０－トリオキサ－１４－アザヘプタデシル）カルバモイル－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）酢酸の合成

【0388】

２０ｍｌの乾燥ＤＣＭ中の３－（２－アセトアミド－５－メチルチアゾール－４－スルホンアミド）プロパン酸）（３２５ｍｇ、１．０６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＣＭ中の１．０Ｍ ＤＣＣ（１．２７ｍｌ、１．２７ｍｍｏｌ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（１４６ｍｇ、１．２７ｍｍｏｌ）を加え、反応がＨＰＬＣによって完了するまで（約４時間）溶液を室温で撹拌した。尿素副生成物を濾過により除去し、溶液に２－（（３－（（３－（２－（２－（３－アミノプロポキシ）エトキシ）エトキシ）プロピル）カルバモイル－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）酢酸２，２，２－トリフルオロ酢酸塩（１：１）（８５０ｍｇ、１．４６ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（４４２μＬ、３．１７ｍｍｏｌ）を加え、反応物を室温で撹拌した。粗反応物を０．２ミクロンフィルタでフィルタにかけ、分取ＨＰＬＣで精製した。純粋な画分を合わせて凍結乾燥し、６２７ｍｇ（７９％収率）の２－（（３－（（１７－（２－アセトアミド－５－メチルチアゾール－４－スルホンアミド）－１５－オキソ－４，７，１０）－トリオキサ－１４－アザヘプタデシル）カルバモイル－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）酢酸（化合物３２）を得た。

【0389】

１－（（３－（（１７－（２－アセトアミド－５－メチルチアゾール－４－スルホンアミド）－１５－オキソ－４，７，１０－トリオキサ－１４－アザヘプタデシル）カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）－２－オキソ－６，９，１２，１５－テトラオキサ－３－アザオクタデカン－１８－オイック酸の合成

【0390】

１０ｍｌの乾燥ＤＣＭ中の２－（（３－（（１７－（２－アセトアミド－５－メチルチアゾール－４－スルホンアミド）－１５－オキソ－４，７，１０－トリオキサ－１４－アザヘプタデシル）カルバモイル－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）酢酸（１４２ｍｇ、０．１８８ｍｍｏｌ）の溶液にＤＣＭ中の１．０Ｍ ＤＣＣ（０．２２６μＬ、０．２２６ｍｍｏｌ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（２６ｍｇ、０．２２６ｍｍｏｌ）に加え、ＨＰＬＣによって反応が完了するまで（約３．５時間）、溶液を室温で撹拌した。尿素副生成物を濾過により除去し、溶液に１－アミノ－３，６，９，１２－テトラオキサペンタデカン－１５－オイック酸（６０ｍｇ、０．２２６ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（７９μＬ、０．５６４ｍｍｏｌ）を加え、反応を室温で一晩撹拌した。反応物を濃縮し、最小のメタノールに取り、分取ＨＰＬＣによって精製した。純粋な画分を合わせて凍結乾燥し、１５８ｍｇ（収率８４％）の１－（（３－（（１７－（２－アセトアミド－５－メチルチアゾール－４－スルホンアミド）－１５－オキソ－４，７，１０－トリオキサ－１４－アザヘプタデシル）カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）－２－オキソ－６，９，１２，１５－テトラオキサ－３－アザオクタデカン－１８－オイック酸（化合物３３）を得た。

【0391】

２，５－ジオキソピロリジン－１－イル１－（（３－（（１７－（２－アセトアミド－５－メチルチアゾール－４－スルホンアミド）－１５－オキソ－４，７，１０－トリオキサ－１４－アザヘプタデシル））カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）－２－オキソ－６，９，１２，１５－テトラオキサ－３－アザオクタデカン－１８－オエートの合成

【0392】

１０ｍｌの乾燥ＤＣＭ中の１－（（３－（（１７－（２－アセトアミド－５－メチルチアゾール－４－スルホンアミド）－１５－オキソ－４，７，１０－トリオキサ－１４－アザヘプタデシル）カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）－２－オキソ－６，９，１２，１５－テトラオキサ－３－アザオクタデカン－１８－オイック酸（２５０ｍｇ、０．２１６ｍｍｏｌ）の溶液にＤＣＭ中の１．０Ｍ ＤＣＣ（２７５μＬ、０．２７５ｍｍｏｌ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（３２ｍｇ、０．２７５ｍｍｏｌ）を加え、反応がＨＰＬＣによって完了するまで（約３時間）溶液を室温で撹拌した。尿素副生成物をフィルタにより除去し、反応物を濃縮し、最小のメタノールに取り、分取ＨＰＬＣにより精製した。純粋な画分を合わせて凍結乾燥し、１９３ｍｇ（８３％の収率）の２，５－ジオキソピロリジン－１－イル１－（（３－（（１７－（２－アセトアミド－５－メチルチアゾール－４－スルホンアミド）－１５－オキソ－４，７，１０－トリオキサ－１４－アザヘプタデシル）カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）－２－オキソ－６，９，１２，１５－テトラオキサ－３－アザオクタデカン－１８－オエート（化合物３４）を得た。

【0393】

Ｎ－（１７－（２－アセトアミド－５－メチルチアゾール－４－スルホンアミド）－１５－オキソ－４，７，１０－トリオキサ－１４－アザヘプタデシル）－７－（（２１－（４－ヒドロキシフェニル）－２，１８－ジオキソ－６，９，１２，１５－テトラオキサ－３，１９－ジアザヘニコシル）オキシ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－３－カルボキサミドの合成

【0394】

５ｍｌの乾燥ＤＣＭ中の２，５－ジオキソピロリジン－１－イル１－（（３－（（１７－（２－アセトアミド－５－メチルチアゾール－４－スルホンアミド）－１５－オキソ－４，７，１０－トリオキサ－１４－アザヘプタデシル）カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）－２－オキソ－６，９，１２，１５－テトラオキサ－３－アザオクタデカン－１８－オエート（５０ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）の溶液にチラミン（８ｍｇ、０．０５９ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１９μＬ、０．１３５ｍｍｏｌ）を加え、反応物を室温で一晩撹拌した。粗反応物を０．２ミクロンフィルタでフィルタにかけ、分取ＨＰＬＣで精製した。純粋な画分を合わせて凍結乾燥し、４３ｍｇ（収率８６％）のＮ－（１７－（２－アセトアミド－５－メチルチアゾール－４－スルホンアミド）－１５－オキソ－４，７，１０－トリオキサ－１４－アザヘプタデシル）－７－（（２１－（４－ヒドロキシフェニル）－２，１８－ジオキソ－６，９，１２，１５－テトラオキサ－３，１９－ジアザヘニコシル）オキシ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－３－カルボキサミド（化合物３５）を得た。

【0395】

２－（（３－（（１７－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－１５－オキソ－４，７，１０－トリオキサ－１４－アザヘプタデシル）カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）酢酸の合成

【0396】

２０ｍｌの乾燥ＤＣＭ中の３－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）プロパン酸（５００ｍｇ、２．９６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＣＭ中の１．０Ｍ ＤＣＣ（３．５５ｍｌ、３．５５ｍｍｏｌ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（４０８ｍｇ、３．５５ｍｍｏｌ）を加え、反応がＨＰＬＣによって完了するまで（約１時間）溶液を室温で撹拌した。尿素副生成物を濾過により除去し、溶液に２－（（３－（（３－（２－（２－（３－アミノプロポキシ）エトキシ）エトキシ）プロピル）カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）酢酸２，２，２－トリフルオロ酢酸塩（１：１）（１．２０ｇ、２．００ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（７００μＬ、５．００ｍｍｏｌ）を加え、反応物を室温で一晩（ｏ．ｎ．）撹拌した。粗反応物を０．２ミクロンフィルタでフィルタにかけ、分取ＨＰＬＣで精製した。純粋な画分を合わせて凍結乾燥し、８８９ｍｇ（７２％収率）の２－（（３－（（１７－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－１５）を得た。－オキソ－４，７，１０－トリオキサ－１４－アザヘプタデシル）カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）酢酸（化合物４０）を得た。

【0397】

１－（（３－（（１７－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－１５－オキソ－４，７，１０－トリオキサ－１４－アザヘプタデシル）カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）－２－オキソ－６，９，１２，１５－テトラオキサ－３－アザオクタデカン－１８－オイック酸の合成

【0398】

２０ｍｌの乾燥ＤＣＭ中の２－（（３－（（１７－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－１５－オキソ－４，７，１０－トリオキサ－１４－アザヘプタデシル）カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）酢酸（５７３ｍｇ、０．９２８ｍｍｏｌ）の溶液にＤＣＭ中の１．０Ｍ ＤＣＣ（１．２０ｍｌ、０１．２０ｍｍｏｌ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（１３９ｍｇ、０１．２６ｍｍｏｌ）を加え、反応がＨＰＬＣによって完了するまで（約３時間）溶液を室温で撹拌した。尿素副生成物を濾過により除去し、溶液に１－アミノ－３，６，９，１２－テトラオキサペンタデカン－１５－オイック酸（３６９ｍｇ、１．８０ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（３８８μＬ、０．５６４ｍｍｏｌ）を加え、反応を室温で一晩撹拌した。反応物を濃縮し、最小のメタノールに取り、分取ＨＰＬＣによって精製した。純粋な画分を合わせて凍結乾燥し、５８６ｍｇ（７３％の収率）の１－（（３－（（１７－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－１５）－オキソ－４，７，１０－トリオキサ－１４－アザヘプタデシル）カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）－２－オキソ－６，９，１２，１５－テトラオキサ－３－アザオクタデカン－１８－オイック酸（化合物４１）を得た。

【0399】

２０ｍｌの乾燥ＤＣＭ中の２－（（３－（（１７－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－１５－オキソ－４，７，１０－トリオキサ－１４－アザヘプタデシル）カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）酢酸（５７３ｍｇ、０．９２８ｍｍｏｌ）の溶液にＤＣＭ中の１．０Ｍ ＤＣＣ（１．２０ｍｌ、０１．２０ｍｍｏｌ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（１３９ｍｇ、０１．２６ｍｍｏｌ）を加え、反応がＨＰＬＣによって完了するまで（約３時間）溶液を室温で撹拌した。尿素副生成物を濾過により除去し、溶液に１－アミノ－３，６，９，１２－テトラオキサペンタデカン－１５－オイック酸（３６９ｍｇ、１．８０ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（３８８μＬ、０．５６４ｍｍｏｌ）を加え、反応を室温で一晩撹拌した。反応物を濃縮し、最小のメタノールに取り、分取ＨＰＬＣによって精製した。純粋な画分を合わせて凍結乾燥し、５８６ｍｇ（７３％の収率）の１－（（３－（（１７－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－１５）－オキソ－４，７，１０－トリオキサ－１４－アザヘプタデシル）カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）－２－オキソ－６，９，１２，１５－テトラオキサ－３－アザオクタデカン－１８－オイック酸（化合物４１）を得た。

【0400】

２，５－ジオキソピロリジン－１－イル１－（（３－（（１７－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－１５－オキソ－４，７，１０－トリオキサ－１４－アザヘプタデシル）カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）－２－オキソ－６，９，１２，１５－テトラオキサ－３－アザオクタデカン－１８－オエートの合成

【0401】

５ｍｌの乾燥ＤＭＦ中の１－（（３－（（１７－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ－ピロール－１－イル）－１５－オキソ－４，７，１０－トリオキサ－１４－アザヘプタデシル）カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）－２－オキソ－６，９，１２，１５－テトラオキサ－３－アザオクタデカン－１８－オイック酸（３６７ｍｇ、０．４２４ｍｍｏｌ）の溶液にＤＳＣ（ビス（２，５－ジオキソピロリジン－１－イル）カーボネート）（１２０ｍｇ、０．４６７）およびＤＭＡＰ（７８ｍｇ、０．６３６ｍｍｏｌ）に加え、ＨＰＬＣで反応が完了するまで（約３０分）溶液を室温で撹拌した。粗反応物を０．２ミクロンフィルタでフィルタにかけ、分取ＨＰＬＣで精製した。純粋な画分を合わせて凍結乾燥し、３５１ｍｇ（８６％収率）の２，５－ジオキソピロリジン－１－イル１－（（３－（（１７－（２，５－ジオキソ－２，５－ジヒドロ－１Ｈ）－ピロール－１－イル）－１５－オキソ－４，７，１０－トリオキサ－１４－アザヘプタデシル）カルバモイル）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）オキシ）－２－オキソ－６，９，１２，１５－テトラオキサ－３－アザオクタデカン－１８－オエート（化合物４２）を得た。

【0402】

Ｎ－（１－（７－アミノ－４－メチル－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－３－イル）－２－オキソ－７，１０，１３－トリオキサ－３－アザヘキサデカン－１６－イル）ベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール－５－カルボキサミドの合成

【0403】

５ｍｌの乾燥ＤＭＦ中の２－（７－アミノ－４－メチル－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－３－イル）酢酸（１５２ｍｇ、０．６５２ｍｍｏｌ）の溶液にＤＳＣ（１７６ｍｇ、０．６８５）およびＤＭＡＰ（１２０ｍｇ、０．９７８ｍｍｏｌ）を加え、ＨＰＬＣで反応が完了するまで（約３０分）溶液を室温で撹拌した。次に、Ｎ－（３－（２－（２－（３－アミノプロポキシ）エトキシ）エトキシ）プロピル）ベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール－５－カルボキサミド２，２，２－トリフルオロ酢酸塩（３６０ｍｇ、０．７４９ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２７３μＬ、１．９５６ｍｍｏｌ）を加え、反応物を室温で一晩撹拌した。反応物を濃縮し、最小のメタノールに取り、分取ＨＰＬＣによって精製した。純粋な画分を合わせて凍結乾燥し、２６９ｍｇ（７１％の収率）のＮ－（１－（７－アミノ－４－メチル－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－３－イル）－２－オキソ－７，１０，１３－トリオキサ－３－アザヘキサデカン－１６－イル）ベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール－５－カルボキサミド（化合物５０）を得た。

【0404】

ｔｅｒｔ－ブチル２－（（３－（１－（ベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール－５－イル）－１，１７－ジオキソ－６，９，１２－トリオキサ－２，１６－ジアザオクタデカン－１８－イル）－４－メチル－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）アミノ）アセテートの合成

【0405】

１０ｍｌの乾燥ＤＭＦ中のＮ－（１－（７－アミノ－４－メチル－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－３－イル）－２－オキソ－７，１０，１３－トリオキサ－３－アザヘキサデカン－１６－イル）ベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール－５－カルボキサミド（２００ｍｇ、０．３４４ｍｍｏｌ）の溶液にｔｅｒｔ－ブチル２－ブロモアセテート（６７ｍｇ、０．３４４ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１４４μＬ、１．０３ｍｍｏｌ）を加え、反応物を６０℃で一晩撹拌した。反応物を５０ｍｌのＤＣＭで希釈し、５０ｍｌの飽和重炭酸ナトリウムで２回洗浄し、次に５０ｍｌのブラインで２回洗浄した。有機相を約５ｍｌに濃縮し、次にシリカゲルクロマトグラフィー（２％メタノール／ＤＣＭから１６％メタノール／ＤＣＭ）により精製して、２１８ｍｇ（９１％収率）のｔｅｒｔ－ブチル２－（（３－（１－（ベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール－５－イル）－１，１７－ジオキソ－６，９，１２－トリオキサ－２，１６－ジアザオクタデカン－１８－イル）－４－メチル－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）アミノ）アセテート（５１）を得た。

【0406】

２－（（３－（１－（ベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール－５－イル）－１，１７－ジオキソ－６，９，１２－トリオキサ－２，１６－ジアザオクタデカン－１８－イル）－４－メチル－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）アミノ）酢酸の合成

【0407】

ｔｅｒｔ－ブチル２－（（３－（１－（ベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール－５－イル）－１，１７－ジオキソ－６，９，１２－トリオキサ－２，１６－ジアザオクタデカン－１８－イル）－４－メチル－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）アミノ）アセテート（２１８ｍｇ、０．３１３ｍｍｏｌ）を２０ｍｌの３０％ＴＦＡ／ＤＣＭに取り、反応がＨＰＬＣによって完了するまで（約４．５時間）反応物を室温で撹拌した。次に、反応物を真空下で濃縮し、トルエンで３回共沸させ、高真空下で一晩乾燥させて、２２０ｍｇ（定量的収率）の２－（（３－（１－（ベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール－５））－イル）－１，１７－ジオキソ－６，９，１２－トリオキサ－２，１６－ジアザオクタデカン－１８－イル）－４－メチル－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）アミノ）酢酸を得て、これを、さらに精製せずに使用した（５２）。

【0408】

１－（（３－（１－（ベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール－５－イル）－１，１７－ジオキソ－６，９，１２－トリオキサ－２，１６－ジアザオクタデカン－１８－イル）－４－メチル－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）アミノ）－２－オキソ－６，９，１２，１５－テトラオキサ－３－アザオクタデカン－１８－オイック酸の合成

【0409】

１０ｍｌの乾燥ＤＣＭ中の２－（（３－（１－（ベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール－５－イル）－１，１７－ジオキソ－６，９，１２－トリオキサ－２，１６－ジアザオクタデカン－１８－イル）－４－メチル－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）アミノ）酢酸（２２０ｍｇ、０．３４５ｍｍｏｌ）の溶液にＤＣＭ中の１．０Ｍ ＤＣＣ（４１３μＬ、０．４１３ｍｍｏｌ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（４７ｍｇ、０．４１３ｍｍｏｌ）を加え、反応がＨＰＬＣによって完了するまで（約４時間）溶液を室温で撹拌した。尿素副生成物を濾過により除去し、溶液に１－アミノ－３，６，９，１２－テトラオキサペンタデカン－１５－オイック酸（１８２ｍｇ、０．６８６ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２００μＬ、１．４４ｍｍｏｌ）を加え、反応を室温で一晩撹拌した。反応物を濃縮し、最小のメタノールに取り、分取ＨＰＬＣによって精製した。純粋な画分を合わせて凍結乾燥し、５１７ｍｇ（８５％の収率）の１－（（３－（１－（ベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール－５－イル）－１，１７－ジオキソ）－６，９，１２－トリオキサ－２，１６－ジアザオクタデカン－１８－イル）－４－メチル－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）アミノ）－２－オキソ－６，９，１２，１５－テトラオキサ－３－アザオクタデカン－１８－オイック酸（化合物５３）を得た。

【0410】

２，５－ジオキソピロリジン－１－イル１－（（３－（１－（ベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール－５－イル）－１，１７－ジオキソ－６，９，１２）－トリオキサ－２，１６－ジアザオクタデカン－１８－イル）－４－メチル－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）アミノ）－２－オキソ－６，９，１２，１５－テトラオキサ－３－アザオクタデカン－１８－オエートの合成

【0411】

１０ｍｌの乾燥ＤＣＭ中の１－（（３－（１－（ベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール－５－イル）－１，１７－ジオキソ－６，９，１２－トリオキサ－２，１６－ジアザオクタデカン－１８－イル）－４－メチル－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）アミノ）－２－オキソ－６，９，１２，１５－テトラオキサ－３－アザオクタデカン－１８－オイック酸（１２０ｍｇ、０．１３５ｍｍｏｌ）の溶液にＤＣＭ中の１．０Ｍ ＤＣＣ（１５６μＬ、０．１５６ｍｍｏｌ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（１８ｍｇ、０．１５６ｍｍｏｌ）に加え、反応がＨＰＬＣによって完了するまで（約５時間）溶液を室温で撹拌した。尿素副生成物をフィルタにより除去し、反応物を濃縮し、最小のメタノールに取り、分取ＨＰＬＣにより精製した。純粋な画分を合わせて凍結乾燥し、１０９ｍｇ（８２％収率）の２，５－ジオキソピロリジン－１－イル１－（（３－（１－（ベンゾ［ｃ］［１，２，５］オキサジアゾール－５）－イル）－１，１７－ジオキソ－６，９，１２－トリオキサ－２，１６－ジアザオクタデカン－１８－イル）－４－メチル－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－７－イル）アミノ）－２－オキソ－６，９，１２，１５－テトラオキサ－３－アザオクタデカン－１８－オエート（化合物５４）を得た。

【0412】

２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－６－（７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－３－カルボキサミド）ヘキサン酸の合成

【0413】

２５ｍｌの乾燥ＤＣＭ中の７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－３－カルボン酸（１．５７ｇ、６．０２ｍｍｏｌ）の溶液にＤＣＭ中の１．０Ｍ ＤＣＣ ７．２２ｍｌ、７．２２ｍｍｏｌ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（８３０ｍｇ、７．２２ｍｍｏｌ）を加え、反応がＨＰＬＣによって完了するまで（約４時間）溶液を室温で撹拌した。尿素副生成物を濾過により除去し、溶液に６－アミノ－２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）ヘキサン酸（１．７７ｇ、０．６８６ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（２．５２ｍｌ、１８．０６ｍｍｏｌ）を加え、反応物を室温で一晩撹拌した。反応物を５０ｍｌのＤＣＭで希釈し、５０ｍｌの飽和重炭酸ナトリウムで２回洗浄し、次に５０ｍｌのブラインで２回洗浄した。有機相を約５ｍｌに濃縮し、次いでシリカゲルクロマトグラフィー（３％メタノール／ＤＣＭから１６％メタノール／ＤＣＭ）により精製して、２．６２ｇ（８９％収率）の２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－６－（７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－３－カルボキサミド）ヘキサン酸（化合物６０）を得た。

【0414】

２－アミノ－６－（７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－３－カルボキサミド）ヘキサン酸の合成

【0415】

２－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－６－（７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－３－カルボキサミド）ヘキサン酸（２．６２ｇ、５．３６ｍｍｏｌ）を５０ｍｌの３５％ＴＦＡ／ＤＣＭに溶解して、ＨＰＬＣで反応が完了するまで（約３時間）室温で撹拌した。次に、反応物を真空下で濃縮し、トルエンで３回共沸させ、高真空下で一晩乾燥させて、２－アミノ－６－（７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－３－カルボキサミド）ヘキサン酸（化合物６１）の２，２，２－トリフルオロ酢酸塩（１：１）を得て、これをさらに精製せずに使用した。

【0416】

１－（２－アセトアミド－５－メチルチアゾール－４－スルホンアミド）－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４－オクタオキサヘプタコサン－２７－オイック酸の合成

【0417】

１５ｍｌの乾燥ＤＣＭ中の２－アセトアミド－５－メチルチアゾール－４－スルホニルクロリド（２４６ｍｇ、０．９６７ｍｍｏｌ）の溶液に、１－アミノ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４－オクタオキサヘプタコサン－２７－オイック酸（５０７ｍｇ、０．９６７ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（３５０μＬ、２．５０ｍｍｏｌ）を加え、反応物を室温で一晩撹拌した。反応物を２０ｍｌのＤＣＭで希釈し、３０ｍｌの飽和重炭酸ナトリウムで２回洗浄し、次に３０ｍｌのブラインで２回洗浄した。有機相を約５ｍｌに濃縮し、次にシリカゲルクロマトグラフィー（４％メタノール／ＤＣＭから１５％メタノール／ＤＣＭ）で精製して、５３０ｍｇ（８３％収率）の１－（２－アセトアミド－５－メチルチアゾール－４－スルホンアミド）－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４－オクタオキサヘプタコサン－２７－オイック酸（化合物６２）を得た。

【0418】

２，５－ジオキソピロリジン－１－イル１－（２－アセトアミド－５－メチルチアゾール－４－スルホンアミド）－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４－オクタオキサヘプタコサン－２７－オエートの合成

【0419】

２０ｍｌの乾燥ＤＣＭ中の１－（２－アセトアミド－５－メチルチアゾール－４－スルホンアミド）－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４－オクタオキサヘプタコサン－２７－オイック酸（５３０ｍｇ、０．８０３ｍｍｏｌ）の溶液にＤＣＭ中の１．０Ｍ ＤＣＣ（９６４μＬ、０．９６４ｍｍｏｌ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（１１１ｍｇ、０．９６４ｍｍｏｌ）を加え、反応がＨＰＬＣによって完了するまで（約３時間）溶液を室温で撹拌した。尿素副生成物をフィルタにより除去し、反応物を濃縮し、最小のメタノールに取り、分取ＨＰＬＣにより精製した。純粋な画分を合わせて凍結乾燥し、５１０ｍｇ（収率８４％）の２，５－ジオキソピロリジン－１－イル１－（２－アセトアミド－５－メチルチアゾール－４－スルホンアミド）－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４－オクタオキサヘプタコサン－２７－オエート（化合物６３）を得た。

【0420】

［１－（２－アセトアミド－５－メチルチアゾール－４－スルホンアミド）－２９－（４－（７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－３－カルボキサミド）ブチル）－２７－オキソ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４－オクタオキサ－２８－アザトリアコンタン－３０－オイック酸の合成

【0421】

２５ｍｌの乾燥ＤＣＭ中の２，５－ジオキソピロリジン－１－イル１－（２－アセトアミド－５－メチルチアゾール－４－スルホンアミド）－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４－オクタオキサヘプタコサン－２７－オエート（６０８ｍｇ、０．８０３ｍｍｏｌ）の溶液に、２－アミノ－６－（７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－３－カルボキサミド）ヘキサン酸の２，２，２－トリフルオロ酢酸塩（１：１）（４８５、０．９６３６ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（３３６μＬ、２．４０９ｍｍｏｌ）を加え、反応がＨＰＬＣによって完了するまで（約６時間）溶液を室温で撹拌した。反応物を３０ｍｌのＤＣＭで希釈し、４０ｍｌの飽和重炭酸ナトリウムで２回洗浄し、次に４０ｍｌのブラインで２回洗浄した。有機相を濃縮し、最小のメタノールに取り、分取ＨＰＬＣで精製した。純粋な画分を合わせて凍結乾燥し、６３７ｍｇ（７７％収率）の１－（２－アセトアミド－５－メチルチアゾール－４－スルホンアミド）－２９－（４－（７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ）－クロメン－３－カルボキサミド）ブチル）－２７－オキソ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４－オクタオキサ－２８－アザトリアコンタン－３０－オイック酸（化合物６４）を得た。

【0422】

１－（２－アセトアミド－５－メチルチアゾール－４－スルホンアミド）－２９－（４－（７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－３－カルボキサミド）ブチル）－２７，３０－ジオキソ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，３４，３７，４０，４３－ドデカオキサ－２８，３１－ジアザヘキサテトラコンタン－４６－オイック酸の合成

【0423】

２０ｍｌの乾燥ＤＣＭ中の１－（２－アセトアミド－５－メチルチアゾール－４－スルホンアミド）－２９－（４－（７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－３－カルボキサミド）ブチル）－２７－オキソ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４－オクタオキサ－２８－アザトリアコンタン－３０－オイック酸（３１０ｍｇ、０．３０１ｍｍｏｌ）の溶液にＤＣＭ中の１．０Ｍ ＤＣＣ（４５０μＬ、０．４５０ｍｍｏｌ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（５２ｍｇ、０．４５０ｍｍｏｌ）を加え、反応がＨＰＬＣによって完了するまで（約３．５時間）溶液を室温で撹拌した。尿素副生成物を濾過により除去し、反応物に１－アミノ－３，６，９，１２－テトラオキサペンタデカン－１５－オイック酸（９６ｍｇ、０．３６１ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１２６μＬ、０．９０３ｍｍｏｌ）を加え、反応物を室温で一晩攪拌した。反応物を３０ｍｌのＤＣＭで希釈し、５０ｍｌの飽和重炭酸ナトリウムで２回洗浄し、次に５０ｍｌのブラインで２回洗浄した。有機相を濃縮し、最小のメタノールに取り、分取ＨＰＬＣで精製した。純粋な画分を合わせて凍結乾燥し、３２７ｍｇ（９７％収率）の１－（２－アセトアミド－５－メチルチアゾール－４－スルホンアミド）－２９－（４－（７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ）－クロメン－３－カルボキサミド）ブチル）－２７，３０－ジオキソ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，３４，３７，４０，４３－ドデカオキサ－２８，３１－ジアザヘキサテトラコンタン－４６－オイック酸（化合物６５）を得た。

【0424】

２，５－ジオキソピロリジン－１－イル１－（２－アセトアミド－５－メチルチアゾール－４－スルホンアミド）－２９－（４－（７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－３－カルボキサミド））ブチル）－２７，３０－ジオキソ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，３４，３７，４０，４３－ドデカオキサ－２８，３１－ジアザヘキサテトラコンタン－４６－オエートの合成

【0425】

１５ｍｌ乾燥ＤＣＭ中の１－（２－アセトアミド－５－メチルチアゾール－４－スルホンアミド）－２９－（４－（７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－３－カルボキサミド）ブチル）－２７，３０－ジオキソ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，３４，３７，４０，４３－ドデカオキサ－２８，３１－ジアザヘキサテトラコンタン－４６－オイック酸（１７８ｍｇ、０．１３９ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＣＭ中の１．０Ｍ ＤＣＣ（１６７μＬ、０．１６７ｍｍｏｌ）およびＮ－ヒドロキシスクシンイミド（１９ｍｇ、０．１６７ｍｍｏｌ）を加え、反応がＨＰＬＣによって完了するまで（約４．５時間）溶液を室温で撹拌した。尿素副生成物をフィルタにより除去し、反応物を濃縮し、最小のメタノールに取り、分取ＨＰＬＣにより精製した。純粋な画分を合わせて凍結乾燥し、１６８ｍｇ（８８％収率）の２，５－ジオキソピロリジン－１－イル１－（２－アセトアミド－５－メチルチアゾール－４－スルホンアミド）－２９－（４－（７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－３－カルボキサミド）ブチル）－２７，３０－ジオキソ－３，６，９，１２，１５，１８，２１，２４，３４，３７，４０，４３－ドデカオキサ－２８，３１－ジアザヘキサテトラコンタン－４６－オエート（化合物６６）を得た。

【0426】

自動化

【0427】

マルチプレックスアッセイおよび方法を自動化することができ、検体処理装置と組み合わせることができる。標本処理装置は、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．によって販売されているＢＥＮＣＨＭＡＲＫ ＸＴ機器およびＳＹＭＰＨＯＮＹ機器などの自動装置とすることができ、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．は、米国特許第５，６５０，３２７号明細書、第５，６５４，２００号明細書、第６，２９６，８０９号明細書、第６，３５２，８６１号明細書、第６，８２７，９０１号明細書および第６，９４３，０２９号明細書、ならびに米国特許出願公開第２００３／０２１１６３０号明細書および第２００４／００５２６８５号明細書を含む、自動分析を実行するシステムおよび方法を開示する複数の米国特許の譲受人であり、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。あるいは、標本を手動で処理することもできる。

【0428】

標本処理装置は、標本に固定剤を塗布することができる。固定剤は、架橋剤（例えば、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、およびグルタルアルデヒドなどのアルデヒド、ならびに非アルデヒド架橋剤）、酸化剤（例えば、四酸化オスミウムおよびクロム酸などの金属イオンおよび複合体）、タンパク質変性剤（例えば、酢酸、メタノール、エタノール）、メカニズム不明の固定剤（例えば、塩化水銀、アセトン、およびピクリン酸）、配合試薬（例えば、カルノイ固定剤、メタカーン、ブアン液、Ｂ５固定剤）、ロスマンの液体、およびゲンドレの液体、マイクロ波、およびその他の固定剤（例えば、容積固定および蒸気固定を除外）を含むことができる。

【0429】

標本がパラフィンに埋め込まれたサンプルである場合、適切な脱パラフィン液を使用して、標本処理装置によりサンプルを脱パラフィン化することができる。廃液除去剤が脱パラフィン液（複数の場合がある）を除去した後、任意の数の物質を連続して標本に塗布することができる。物質は、前処理（例えば、タンパク質架橋、核酸を露出させるなど）、変性、ハイブリッド形成、洗浄（例えば、厳密洗浄）、検出（例えば、視覚的またはマーカー分子のプローブへの連結）、増幅（例えば、タンパク質、遺伝子などの増幅）、逆染色、カバースリップなどのためのものとすることができる。

【0430】

標本処理装置は、標本に幅広い物質を塗布することができる。物質は、これらに限定されるものではないが、染色剤、プローブ、試薬、リンス、および／またはコンディショナを含む。物質は、流体（例えば、気体、液体、または気体／液体混合物）などとすることができる。液体は、溶媒（例えば、極性溶媒、非極性溶媒など）、溶液（例えば、水溶液または他のタイプの溶液）などとすることができる。試薬は、これらに限定されるものではないが、染色剤、湿潤剤、抗体（例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体など）、抗原回収液（例えば、水性または非水性ベースの抗原回収溶液、抗原回収緩衝液など）を含むことができる。プローブは、検出可能な標識またはレポーター分子に付着した、単離された核酸または単離された合成オリゴヌクレオチドとすることができる。標識は、放射性同位元素、酵素基質、補因子、リガンド、化学発光または蛍光剤、ハプテン、および酵素を含むことができる。

【0431】

標本が処理された後、ユーザは、標本を含むスライドを画像化装置に輸送することができる。ここで使用するイメージング装置は、明視野撮像装置ライドスキャナーである。明視野撮像装置の１つは、Ｖｅｎｔａｎａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．が販売しているｉＳｃａｎ Ｃｏｒｅｏ（商標）明視野スキャナーである。自動化された実施形態では、画像化装置は、「ＩＭＡＧＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭ ＡＮＤ ＴＥＣＨＮＩＱＵＥＳ」と題された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／００２７７２号（国際公開第２０１１／０４９６０８号パンフレット）、または２０１１年９月９日に出願された「ＩＭＡＧＩＮＧ ＳＹＳＴＥＭＳ，ＣＡＳＳＥＴＴＥＳ，ＡＮＤ ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＵＳＩＮＧ ＴＨＥ ＳＡＭＥ」と題された米国特許出願公開第２０１４／０１７８１６９号明細書に開示されているようなデジタル病理学装置である。

【0432】

対比染色

【0433】

対比染色は、顕微鏡下で標的の構造をより簡単に視覚化できるように、サンプルを薬剤で染色した後、サンプルを後処理して１つ以上の標的を検出する方法である。例えば、免疫組織化学的染色をより明確にするために、任意に、封入の前に対比染色を使用する。対比染色は、一次染色とは色が異なる。ヘマトキシリン、エオシン、メチルグリーン、メチレンブルー、ギムザ、アルシアンブルー、ニュークリアファストレッドなど、数多くの対比染色がよく知られている。ＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）は、使用できる蛍光染色剤である。

【0434】

いくつかの例では、複数の染色剤を一緒に混合して対比染色剤を生成することができる。これにより、柔軟性と染色を選択する機能が提供される。例えば、最初の染色は、特定の属性を持っているが、別の望ましい属性を持っていない混合物に対して選択することができる。不足している目的の属性を表示する２回目の染色を混合物に追加することができる。例えば、トルイジンブルー、ＤＡＰＩ、およびポンタミンスカイブルーを混合して対比染色を形成することができる。

【0435】

イメージング

【0436】

開示される実施形態の特定の態様、またはすべてをコンピュータ分析および／または画像分析システムによって自動化し、容易にすることができる。一部の適用では、正確な色または蛍光比が測定される。いくつかの実施形態では、光学顕微鏡法を画像分析に利用する。特定の開示される実施形態は、デジタル画像の取得を含む。これは、デジタルカメラを顕微鏡に連関させることによって行うことができる。染色されたサンプルから得られたデジタル画像を、画像分析ソフトウェアを使用して分析する。色または蛍光をいくつかの異なる方法で測定できる。例えば、色を赤色、青色、緑色の値；色相、彩度、および強度の値；および／またはスペクトルイメージングカメラを使用して特定の波長もしくは波長範囲を測定することによって測定することができる。サンプルを、定性的および半定量的に評価することもできる。定性的評価には、染色強度の評価、染色に関与する陽性染色細胞および細胞内コンパートメントの特定、ならびにサンプル全体またはスライドの品質の評価が含まれる。試験サンプルに対して個別の評価を実行し、この分析には、サンプルが異常な状態を表しているかどうかを判断するための既知の平均値との比較を含めることができる。

【0437】

サンプルおよび標的

【0438】

サンプルには生物学的成分が含まれており、一般に、対象となる１つ以上の標的分子が含まれていることが疑われる。標的分子は細胞の表面にあってもよく、細胞は懸濁液または組織切片にあってもよい。また標的分子は細胞内にあってもよく、細胞溶解またはプローブによる細胞の浸透時に検出することができる。当業者は、サンプル内の標的分子を検出する方法が、使用されるサンプルおよびプローブのタイプに応じて変化することを理解するであろう。サンプルを収集および調製する方法は当技術分野で知られている。

【0439】

組織または他の生物学的サンプルなど、本明細書に開示される組成物を用いる方法の実施形態で使用するサンプルは、当業者によって当技術分野で知られている任意の方法を使用して調製することができる。サンプルを、定期的なスクリーニングのための対象から、または遺伝的異常、感染もしくは新生物などの障害を有することが疑われる対象から得ることができる。開示される方法の記載される実施形態はまた、「正常な」サンプルと呼ばれる、遺伝的異常、疾患、障害などを有さないサンプルに適用することができる。このような正常サンプルは、他のサンプルと比較するための対照として、とりわけ有用である。サンプルを様々な目的で分析することができる。例えば、サンプルは、科学的研究で、もしくは疑わしい病気の診断のために、または治療の成功、生存などの予後指標として使用することができる。

【0440】

サンプルは、プローブまたはレポーター分子によって特異的に結合できる複数の標的を含む場合がある。標的は、核酸配列またはタンパク質であり得る。いくつかの例では、標的は、ウイルス、細菌などの病原体、またはウイルスゲノムなどの細胞内寄生体に由来するタンパク質若しくは核酸分子である。例えば、標的タンパク質は、疾患に関連する（例えば、相関する、因果関係があるなど）標的核酸配列から産生され得る。

【0441】

当業者は、以下の標的のいずれかに特異的なクマリン系コンジュゲートが開発され得ることを理解するであろう。

【0442】

特定の非限定的な例において、標的タンパク質は、新生物（例えば、癌）に関連する標的核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）によって産生される。腫瘍細胞、特にＢ細胞およびＴ細胞白血病、リンパ腫、乳癌、結腸癌、神経癌などの癌細胞において、多数の染色体異常（転座および他の再配列、増幅または欠失を含む）が確認されている。したがって、いくつかの例では、標的分子の少なくとも一部は、サンプル中の細胞の少なくともサブセットにおいて増幅または欠失された核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）によって産生される。

【0443】

他の例では、標的タンパク質は、悪性細胞において欠失（喪失）される腫瘍抑制遺伝子である核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）から産生される。例えば、染色体９ｐ２１にあるｐ１６領域（Ｄ９Ｓ１７４９、Ｄ９Ｓ１７４７、ｐ１６（ＩＮＫ４Ａ）、ｐ１４（ＡＲＦ）、Ｄ９Ｓ１７４８、ｐ１５（ＩＮＫ４Ｂ）、およびＤ９Ｓ１７５２を含む）は、特定の膀胱癌で欠失される。第１染色体の短腕の遠位領域（例えば、ＳＨＧＣ５７２４３、ＴＰ７３、ＥＧＦＬ３、ＡＢＬ２、ＡＮＧＰＴＬ１、およびＳＨＧＣ－１３２２を包含する）、および第１９染色体のセントロメア周辺領域（例えば、１９ｐ１３－１９ｑ１３）（例えば、ＭＡＮ２Ｂ１、ＺＮＦ４４３、ＺＮＦ４４、ＣＲＸ、ＧＬＴＳＣＲ２、およびＧＬＴＳＣＲ１を包含する）が関与する染色体欠失は、中枢神経系の特定のタイプの固形腫瘍の特徴的な分子的特徴である。

【0444】

腫瘍性形質転換および／または増殖と相関する他の多くの細胞遺伝学的異常が、当業者に知られている。また、腫瘍性形質転換と相関しており、開示される方法において有用である核酸配列（例えば、ゲノム標的核酸配列）によって産生される標的タンパク質としては、ＥＧＦＲ遺伝子（７ｐ１２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－０００００７、ヌクレオチド５５０５４２１９－５５２４２５２５）、Ｃ－ＭＹＣ遺伝子（８ｑ２４．２１；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－０００００８、ヌクレオチド１２８８１７４９８－１２８８２２８５６）、Ｄ５Ｓ２７１（５ｐ１５．２）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）遺伝子（８ｐ２２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－０００００８、ヌクレオチド１９８４１０５８－１９８６９０４９）、ＲＢ１（１３ｑ１４；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－００００１３、ヌクレオチド４７７７５９１２－４７９５４０２３）、ｐ５３（１７ｐ１３．１；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－００００１７、補体、ヌクレオチド７５１２４６４－７５３１６４２））、Ｎ－ＭＹＣ（２ｐ２４；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－０００００２、補体、ヌクレオチド１５１８３５２３１－１５１８５４６２０）、ＣＨＯＰ（１２ｑ１３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－００００１２、補体、ヌクレオチド５６１９６６３８－５６２００５６７）、ＦＵＳ（１６ｐ１１．２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－００００１６、ヌクレオチド３１０９８９５４－３１１１０６０１）、ＦＫＨＲ（１３ｐ１４；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－００００１３、補体、ヌクレオチド４００２７８１７－４０１３８７３４）、と並んで、例えば、ＡＬＫ（２ｐ２３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－０００００２、補体、ヌクレオチド２９２６９１４４－２９９９７９３６）、Ｉｇ重鎖、ＣＣＮＤ１（１１ｑ１３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－００００１１、ヌクレオチド６９１６５０５４．６９１７８４２３）、ＢＣＬ２（１８ｑ２１．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－００００１８、補体、ヌクレオチド５８９４１５５９－５９１３７５９３）、ＢＣＬ６（３ｑ２７；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－０００００３、補体、ヌクレオチド１８８９２１８５９－１８８９４６１６９）、ＭＡＬＦ１、ＡＰ１（１ｐ３２－ｐ３１；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－０００００１、補体、ヌクレオチド５９０１９０５１－５９０２２３７３）、ＴＯＰ２Ａ（１７ｑ２１－ｑ２２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－００００１７、補体、ヌクレオチド３５７９８３２１－３５８２７６９５）、ＴＭＰＲＳＳ（２１ｑ２２．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－００００２１、補体、ヌクレオチド４１７５８３５１－４１８０１９４８）、ＥＲＧ（２１ｑ２２．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－００００２１、補体、ヌクレオチド３８６７５６７１－３８９５５４８８）；ＥＴＶ１（７ｐ２１．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－０００００７、補体、ヌクレオチド１３８９７３７９－１３９９５２８９）、ＥＷＳ（２２ｑ１２．２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－００００２２、ヌクレオチド２７９９４２７１－２８０２６５０５）；ＦＬＩ１（１１ｑ２４．１－ｑ２４．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－００００１１、ヌクレオチド１２８０６９１９９－１２８１８７５２１）、ＰＡＸ３（２ｑ３５－ｑ３７；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－０００００２、補体、ヌクレオチド２２２７７２８５１－２２２８７１９４４）、ＰＡＸ７（１ｐ３６．２－ｐ３６．１２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－０００００１、ヌクレオチド１８８３００８７－１８９３５２１９）、ＰＴＥＮ（１０ｑ２３．３；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－００００１０、ヌクレオチド８９６１３１７５－８９７１６３８２）、ＡＫＴ２（１９ｑ１３．１－ｑ１３．２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－００００１９、補体、ヌクレオチド ４５４３１５５６－４５４８３０３６）、ＭＹＣＬ１（１ｐ３４．２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－０００００１、補体、ヌクレオチド４０１３３６８５－４０１４０２７４）、ＲＥＬ（２ｐ１３－ｐ１２；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－０００００２、ヌクレオチド６０９６２２５６－６１００３６８２）およびＣＳＦ１Ｒ（５ｑ３３－ｑ３５；例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＣ－０００００５、補体、ヌクレオチド１４９４１３０５１－１４９４７３１２８）が挙げられる。

【0445】

［実施例］

【0446】

バイオコンジュゲートの合成および精製

【0447】

ＢＳＡ－ハプテンコンジュゲート

【0448】

ＢＳＡタンパク質固体（画分Ｖ、６０ｍｇ）を３ｍＬのＰＢＳ（１００ｍＭリン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ＝７．５）に溶解し、室温で１時間回転させた。得られた溶液を０．２μ Ｐａｌｌ ＧＨＰシリンジフィルタでフィルタにかけ、ＵＶ－ＶＩＳで濃度を分析して、１８．１ｍｇ／ｍＬの溶液を得た。ＢＳＡ原液（１ｍＬ）を、無水ＤＭＦ中の適切な標識試薬のＮＨＳエステル２０当量で処理した。ＤＭＦの量を約１５％（ｖ／ｖ）以下に維持した。得られた混合物を室温で一晩回転させた。得られた混合物を０．２μ Ｐａｌｌ ＧＨＰシリンジフィルタでフィルタにかけ、サイズ排除クロマトグラフィーで精製した。得られたコンジュゲート画分を合わせ、ＵＶ－ＶＩＳで濃度および標識／タンパク質比を分析した。サンプルを使用するまで２～６℃で保存した。

【0449】

ＧＡＲ－ハプテンコンジュゲート

【0450】

ヤギ抗ウサギｐＡｂ（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬ）を、無水ＤＭＦ中の適切な標識試薬の３０当量のＮＨＳエステルで処理した。ＤＭＦの量を約１５％（ｖ／ｖ）以下に維持した。得られた混合物を室温で一晩回転させた。得られた混合物を０．２μ ｐａｌｌ ＧＨＰシリンジフィルタでフィルタにかけ、サイズ排除クロマトグラフィーで精製した。得られたコンジュゲート画分を合わせ、ＵＶ－ＶＩＳで濃度および標識／タンパク質比を分析した。サンプルを使用するまで２～６℃で保存した。

【0451】

バイオレイヤー干渉（ＢＬＩ）分析

【0452】

個々のタンパク質コンジュゲート（抗体コンジュゲートまたはＢＳＡ免疫原）を、本明細書に開示される新たなクマリン系試薬、ならびにチラミド－ｄＰＥＧ８－ハプテンおよびＮＨＳ－ｄＰＥＧ８－ハプテン標識試薬（図２０を参照）（およびＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０４２８４９号、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）で標識した。バイオレイヤー干渉（ＢＬＩ）を使用して、アミン反応性第２世代（ＡＲ２Ｇ）バイオセンサーを備えたＰａｌｌ－ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｏｃｔｅｔ Ｒｅｄ機器でのタンパク質相互作用に対するタンパク質標識の影響を特徴付けた（図６）。ＡＲ２Ｇバイオセンサーは、表面に高密度のカルボン酸を提供し、非特異的な相互作用の傾向を低くする。タンパク質の固定化は、タンパク質上の反応性アミンとカルボキシ末端バイオセンサー表面との間に共有結合を作るための、標準的なＥＤＣ触媒アミド結合形成によって達成された。カルボン酸は、ＥＤＣ（１－エチル－３－［３－ジメチル－アミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩）およびｓ－ＮＨＳ（Ｎ－ヒドロキシスルホスクシンイミド）との反応によって活性化され、反応性の高いＮＨＳエステルを生成した。エステルはタンパク質の第一級アミンと急速に反応して、非常に安定したアミド結合を形成した。共有結合による固定化により、タンパク質がバイオセンサー表面に固定され、結合イベントの分析および速度論的特性評価が可能になる。

【0453】

代表的なＢＬＩアッセイ

【0454】

Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ ＢＬＩ分析アッセイを、Ｐａｌｌ－ＦｏｒｔｅＢｉｏ ＡＲ２Ｇバイオセンサーチップを使用して実施した。アッセイ条件を、Ｐａｌｌ－ＦｏｒｔｅＢｉｏ ＤｉｐおよびＲｅａｄ（商標）アミン反応性第２世代テクニカルノート２６に提案されているように、わずかな変更を加えて実行した。テクニカルノート２６で示唆されているように、ＡＲ２Ｇバイオセンサーの活性化およびクエンチングを行った。バックグラウンド結合イベントを最小限に抑えながらシグナル対ノイズ比を最大化するために、必要に応じて各アッセイで必要に応じて個々の試薬濃度を変更した。すべてのＢＬＩアッセイステップを３７℃で実施した。それぞれの代表的なアッセイについて以下に説明する。

【0455】

クマリン系試薬抗体交差反応性研究

【0456】

このアッセイを、本明細書に記載のクマリン系試薬との任意の潜在的な交差反応性にアクセスするために実施した。ＢＳＡ－ＣＬＢＦ免疫原を、１００ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ＝５）中の１．２５μｇ／ｍＬ濃度でＡＲ２Ｇバイオセンサーに固定化した。抗ハプテン交差反応性の評価を、Ｐａｌｌ－ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ Ａｄｄｉｔｉｖｅを使用してＰＢＳ（１００ｍＭリン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ＝７．５）中の７２５ｎｇ／ｍＬの抗ハプテンｍＡｂで実施した。次の表に時間ステップを示す。

【0457】

クマリン系試薬が抗原および抗標識認識に与える影響［Ｒｂ固定化－標識ＧＡＲ認識－抗標識認識］

【0458】

このアッセイは、クマリン系試薬構造が、標識抗体の抗原検出能力にどのように影響するかをよりよく理解するために実施された。加えて、リンカー構造が標識検出にどのように影響するかをよりよく理解するために、二次抗標識抗体を使用した。ウサギｐＡｂを、１００ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ＝５）中の２５μｇ／ｍＬ濃度でＡＲ２Ｇバイオセンサーに固定化した。Ｒｂ ｍＡｂのＧＡＲ認識を、Ｐａｌｌ－ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ Ａｄｄｉｔｉｖｅを使用してＰＢＳ（１００ｍＭリン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ＝７．５）中の３μｇ／ｍＬで行った。抗標識認識を、Ｐａｌｌ－ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｋｉｎｅｔｉｃｓ Ａｄｄｉｔｉｖｅを用いてＰＢＳ（１００ｍＭリン酸、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ＝７．５）中３μｇ／ｍＬで行った。次の表に時間ステップを示す。

【0459】

結果および考察

【0460】

クマリン系試薬の抗体交差反応性研究

【0461】

本開示のクマリン系試薬の使用は、検出が困難なハプテン標識の検出を可能にする。ハプテン標識は、抗ハプテン抗体ライブラリとの相互作用が観察されるかどうかを理解するための要件を設定する多重染色アッセイで一般的に使用される。ＢＳＡ－ＣＬＢＦ免疫原が先端に固定化された場所でバイオレイヤー干渉研究を実施した。次に、抗ハプテン抗体ライブラリを、可能性のある交差反応性についてスクリーニングした。図７は、ＭＳ抗ＢＦ ｍＡｂ（Ｈ１、Ｈ６）と修飾されたチップとの予想される相互作用の例を示している。センサーチップに結合するＭＳ抗ＢＦ ｍＡｂは、チップ上の層成長の正味の増加を引き起こし、４８００秒の間、正の会合シグナルをもたらす。正味の解離は、４８００秒後の最後のフレームに表示される。Ｍｓ抗ＰＰＴ ｍＡｂ（Ｃ１、Ｃ６）およびＭｓ抗ＤＡＢＳＹＬ ｍＡｂ（Ｄ１、Ｄ６）抗体は、クマリンリンカー修飾バイオセンサーチップとの有意な相互作用を示さない。

【0462】

残りのＭｓ抗ハプテンライブラリを、別のＢＬＩ実験で同様のＢＳＡ－ＣＬＢＦ修飾バイオセンサーチップに対してスクリーニングした。クマリン系試薬修飾バイオセンサーチップ、ならびにＭｓ抗ＮＰ ｍＡｂ（Ｂ１、Ｂ６；Ｃ１、Ｃ６）およびＭｓ抗ＴＳ ｍＡｂ（Ｈ１、Ｈ６；Ｇ１、Ｇ６）抗体では、図８において有意な相互作用は観察されなかった。Ｍｓ抗ＮＣＡ ｍＡｂ（Ｂ１、Ｂ６；Ｃ１、Ｃ６）およびＭｓ抗ＨＱ ｍＡｂ（Ｈ１、Ｈ６；Ｇ１、Ｇ６）抗体も、クマリン系試薬修飾バイオセンサーチップとの有意な相互作用を示さなかった（図８を参照）。クマリン系試薬修飾バイオセンサーチップ、ならびにＭｓ抗ＤＣＣ ｍＡｂ（Ｂ１、Ｂ６；Ｄ１、Ｄ６）およびＭｓ抗ＲＯＴ ｍＡｂ（Ｆ１、Ｆ６；Ｇ１、Ｇ６）抗体では、図１０において有意な相互作用は観察されなかった。図１１のＢＬＩの結果はＭｓ抗ＤＩＧ ｍＡｂ、（赤色、光青色）との相互作用が観察されなかったことを示しているが、Ｍｓ抗ＤＮＰ ｍＡｂ（Ｂ１、Ｂ６；Ｃ１、Ｃ６）抗体は、クマリン系試薬との正の相互作用を示した。観察されたＭｓ抗ＤＮＰ ｍＡｂ ＢＬＩ結合応答（８０ｐｍ）は、ＭＳ抗ＢＦ ｍＡｂ ＢＬＩ結合応答（５２０ｐｍ、図７）の約１５％であった。さらに、Ｍｓ抗ＤＮＰ ｍＡｂ抗体の非特異的結合は、バイオセンサーの先端から容易に解離できず、組織のバックグラウンド染色が観察されることを示唆している。Ｍｓ抗ＤＮＰ ｍＡｂ（Ｆ１、Ｆ６；Ｇ１、Ｇ６）クマリンリンカー認識は、図１１に示される別のＢＬＩ実験で確認された。この場合も、Ｍｓ抗ＤＮＰ ｍＡｂ抗体はバイオセンサーチップから容易に解離できなかった。図１２のＢＬＩの結果はまた、Ｍｓ抗ＢＤ ｍＡｂ（Ｃ１、Ｃ６；Ｄ１、Ｄ６）およびバイオセンサーチップとの相互作用が観察されなかったことを示した。

【0463】

リンカーが抗原および抗標識認識に与える影響［Ｒｂ固定化－標識ＧＡＲ認識－抗標識認識］

【0464】

ＧＡＲ－ｌｙｓ（ＤＣＣ）ｄＰＥＧ８ＴＳ対ＧＡＲ－ｄＰＥＧ４－ｌｙｓ（ＤＣＣ）ｄＰＥＧ８ＴＳコンジュゲート：

【0465】

ＧＡＲ－ｌｙｓ（ＤＣＣ）ｄＰＥＧ８ＴＳおよびＧＡＲ－ｄＰＥＧ４－ｌｙｓ（ＤＣＣ）ｄＰＥＧ８ＴＳコンジュゲートは、分岐リガンドとしてリジンアミノ酸コアを利用した。検出が容易なＤＣＣクマリンハプテンを潜在的な発色団として使用し、リジン一級アミンに直接結合させた。第２－ｄＰＥＧＴＳハプテン基は、標識の定量が困難なため、リジンコアの第二級アミンに結合して使用した（図１３－化合物Ａを参照）。この基を、リジン分岐鎖に直接ＮＨＳ基を付けてタンパク質に直接複合化した。リジン架橋からの分離を提供するためにｄＰＥＧ４ハンドルが付加された第２の架橋リジンリンカーコアを生成した（図１３－化合物Ｂを参照）。余分なｄＰＥＧ４スペーサー基は、立体相互作用を減少させ、標識基により多くの柔軟性を提供し、タンパク質ローディング能力とアッセイ検出性能（１次抗原および抗標識認識）の両方を容易にすることが期待された。

【0466】

ＧＡＲ ｐＡｂ（１ｍｇ、１ｍｇ／ｍＬ）は、３０当量の両方のリンカーコンストラクトと結合した。ＧＡＲ－ｌｙｓ（ＤＣＣ）ｄＰＥＧ８ＴＳコンジュゲート（ＧＡＲ＋化合物Ａ）により、リンカー／ＧＡＲ比＝３．３（９１３ｍｇ、８９％の収率）を得た。ＧＡＲ－ｄＰＥＧ４－ｌｙｓ（ＤＣＣ）ｄＰＥＧ８ＴＳコンジュゲート（ＧＡＲ＋化合物Ｂ）により、リンカー／ＧＡＲ比＝５．４（９１３ｍｇ、８４％の収率）を得た。リジン架橋とＮＨＳエステルとの間の余分なｄＰＥＧ４スペーサーは、予想通りに作用して、より高い抗体標識ローディングを提供した。両方のコンジュゲートで同等の収率が得られた。

【0467】

ＢＬＩアッセイは、組織染色アッセイを模倣して設計された。ウサギｍＡｂをバイオセンサーチップに結合させ、上記のコンジュゲートで認識した。さらに、ウサギの認識に対する標識の影響を比較するために、変更されていないＧＡＲ標準を使用した。ＴＳハプテン標識の三次認識は、Ｍｓ抗ＴＳ ｍＡｂを使用して実施した（図１４を参照）。ＧＡＲ抗体コンジュゲートは、未修飾のＧＡＲ抗体と同様に、ウサギ抗体をロードしたバイオセンサーチップを認識した。ＧＡＲ－ｌｙｓ（ＤＣＣ）ｄＰＥＧ８ＴＳコンジュゲートよりもＧＡＲ－ｄＰＥＧ４－ｌｙｓ（ＤＣＣ）ｄＰＥＧ８ＴＳコンジュゲートの方にわずかに厚いＥｌｉｓａ層が観察された（図１５を参照）。修飾されたＧＡＲコンジュゲートの解離速度に違いは観察されなかった。ＧＡＲ－ｄＰＥＧ４－ｌｙｓ（ＤＣＣ）ｄＰＥＧ８ＴＳのリジン架橋とＮＨＳエステルとの間の追加のｄＰＥＧ４スペーサーも、より多くのＭｓ抗ＴＳ ｍＡｂを提供した（図１６を参照）。

【0468】

ＧＡＲ－ＣＬＢＦコンジュゲート

【0469】

ＧＡＲ ｐＡ（２ｍｇ、１ｍｇ／ｍＬ）を、３０当量のＢＦｄＰＥＧ８ＮＨＳおよびＢＦＣＬＮＨＳ試薬で標識した。ＧＡＲ－ＣＬＢＦコンジュゲートＵＶ／ＶＩＳ分析は、ＢＦ／ＧＡＲ比＝５．８５（１．６ｍｇ、８０％収率）を示した。ＣＬクマリンの検出可能な部分は、予想される範囲の標識／Ａｂ比および収率を持つコンジュゲートを提供した。ＧＡＲ－ｄＰＥＧ８ＢＦコンジュゲートＵＶ／ＶＩＳ分析では、予想どおりＢＦ／ＧＡＲ比＝３８．１（８６０ｍｇ、収率４３％）を過大評価していた。ＧＡＲ－ｄＰＥＧ８ＢＦ共役データは不正確であり、相対的な近似値として使用する必要がある。

【0470】

ＢＬＩアッセイは、ここでも組織染色アッセイを模倣して設計された。ウサギｍＡｂをバイオセンサーチップに結合させ、上記のコンジュゲートで認識した。ＢＦハプテン標識の三次認識を、Ｍｓ抗ＢＦ ｍＡｂを使用して実施した（図１７を参照）。ＧＡＲ抗体コンジュゲートは、同様にウサギ抗体をロードしたバイオセンサーチップを認識した（図１８を参照）。ＧＡＲ－ｄＰＥＧ８ＢＦコンジュゲートよりもＧＡＲ－ＣＬＢＦコンジュゲートの方にわずかに厚いＥｌｉｓａ層が観察された。修飾されたＧＡＲコンジュゲートの解離速度に顕著な違いは観察されなかった。－ｄＰＥＧ４－クマリン－ｄＰＥＧ４－ＢＦリンカーは、－ｄＰＥＧ－ＢＦ標識よりも剛性が高いと考えられている。ＧＡＲ－ＣＬＢＦコンジュゲートは、Ｍｓ抗ＢＦ ｍＡｂによって認識された場合に、バイオセンサーの先端に厚いＥｌｉｓａ層を提供した（図１９を参照）。Ｍｓ抗ＢＦ ｍＡｂは、ＧＡＲ－ｄＰＥＧ８ＢＦコンジュゲートよりもＧＡＲ－ＣＬＢＦコンジュゲートからわずかに速く解離した。

【0471】

このＧＡＲ－ＣＬＢＦコンジュゲートからのＭｓ抗ＢＦ ｍＡｂ解離の増加は、Ｍｓ抗ＢＦ ｍＡｂ親和性相互作用とアビディティーの相互作用の増加によって引き起こされる結合の緩み（より速いｋｏｆｆ）の結果である可能性がある。前に述べたように、ＣＬクマリンリンカーはより剛性であると予想されている。－ｄＰＥＧ－ＢＦ標識の追加された柔軟性により、非結合ＢＦ標識が曲がって、Ｍｓ抗ＢＦ ｍＡｂの他の相補的ドメインに親和性相互作用により結合して、より強い結合力をもたらす可能性がある。アビディティー性結合（２－１）は、クマリンリンカーと競合する可能性のある親和性相互作用（１－１）よりも常に解離が少なくなる。同様の解離現象が交差反応性研究で観察された（上記の図７を参照）。

【0472】

本明細書中で言及されるおよび／または出願データシートにおいてリスト化されるすべての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。実施形態の態様は、必要に応じて、様々な特許、出願、および刊行物の概念を使用してさらに別の実施形態を提供するように修正することができる。

【0473】

本開示は、いくつかの例示的な実施形態を参照して説明されてきたが、本開示の原理の精神および範囲内に含まれるであろう多くの他の変更および実施形態が当業者によって考案されることができることを理解されたい。より具体的には、合理的な変形および変更は、本開示の精神から逸脱することなく、前述の開示、図面、および添付の特許請求の範囲内の主題の組み合わせ構成の構成部品および／または配置において可能である。構成部品および／または配置の変形および変更に加えて、代替の使用法も当業者にとって明らかであろう。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【手続補正書】

【提出日】2024-04-10

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

式（ＩＸＡ）または（ＩＸＢ）：

（式中、
Ｔは、特異的結合実体、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、糖類、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、薬物、脂質、またはナノ粒子から選択される置換基であり、
Ｒ^ｚは検出可能な標識であり、
ｏは１～１０の範囲の整数であり、
Ｌ^１およびＬ^２はリンカーであり、
Ｗは、置換もしくは非置換のクマリン部分、あるいはクマリンの置換もしくは非置換の誘導体または類縁体である部分を含み、
Ｚは結合、－ＣＨ－基、－ＣＨ－ＣＨ_２－基、または－ＣＨ_２－ＣＨ－基であり、
ｍおよびｎは、独立して１～４の範囲の整数である）
のいずれかの構造によって定義される、化合物。

【請求項2】

Ｔが抗体である、請求項１に記載の化合物。

【請求項3】

前記抗体が一次抗体である、請求項２に記載の化合物。

【請求項4】

前記抗体が二次抗体である、請求項２に記載の化合物。

【請求項5】

Ｔが核酸である、請求項１に記載の化合物。

【請求項6】

Ｒ^ｚがハプテンである、請求項１～５のいずれかに記載の化合物。

【請求項7】

Ｒ^ｚが酵素である、請求項１～５のいずれかに記載の化合物。

【請求項8】

前記酵素が、ペルオキシダーゼおよびホスファターゼからなる群から選択される、請求項７に記載の化合物。

【請求項9】

Ｗが式（ＶＣ）または（ＶＤ）：

（式中、
Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^６、およびＲ^７は、置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_６アルキル基；置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_６アルコキシ基；置換または非置換の直鎖または分岐鎖のＣ_１～Ｃ_６ヘテロアルキル基；トリフルオロメチル基；ヒドロキシル基；硫酸基；シアノ基；ハロゲン；リン酸基；糖類；カルボン酸基；ニトロ基；－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－Ｓ－Ｒ^ｘ；－ＳＯ_２；－ＳＯ_２Ｃｌ；－ＳＯ_３Ｈ；－ＳＯ_４Ｈ；－ＳＯ_２ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－Ｎ（Ｈ）－ＮＲ^ｘＲ^ｙ；－ＮＲ^ｘＲ^ｙから独立して選択され、
Ｒ^５は、Ｃ_１～Ｃ_１０の置換または非置換の分岐鎖または非分岐鎖のアルキル基、－Ｃ（Ｏ）－Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｈ）－であり、
Ｒ^１は、Ｃ_１～Ｃ_１０の置換または非置換の分岐鎖または非分岐鎖のアルキル基、－Ｏ－、－Ｏ－ＣＨ_２－、－Ｎ（Ｒ^ｘ）－、または－Ｓ－であり、
各Ｘは、独立して、結合、または置換もしくは非置換の直鎖もしくは分岐鎖のＣ_１～Ｃ_１６アルキル基；－［（ＣＨ_２）_ｊ－Ｏ］_ｋ－ＣＨ_２－（ｊは１～４の範囲の整数であり、ｋは１～１６の範囲の整数である）；－Ｎ－Ｒ^ｘ－；－Ｃ（Ｏ）－Ｎ－Ｒ^ｘ－；または－Ｎ－Ｒ^ｘ－Ｃ（Ｏ）－であり、
式中、各Ｒ^ｘおよびＲ^ｙは、独立してＨまたはＣ_１～Ｃ_４アルキル基である）
のいずれかの構造を有する、請求項１～７のいずれかに記載の化合物。

【請求項10】

各Ｌ^１および／またはＬ^２基が独立して式（ＶＩＡ）：

（式中、
ｆは０または１～２４の範囲の整数であり、
ｊは１～２４の範囲の整数であり、
Ｒ^８は結合またはＯ、Ｓ、－Ｎ（Ｒ^ｃ）（Ｒ^ｄ）、または－Ｎ^＋（Ｒ^ｃ）（Ｒ^ｄ）（Ｒ^ｅ）であり、
Ｒ^ａおよびＲ^ｂは独立してＨ、Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基、Ｆ、Ｃｌ、または－Ｎ（Ｒ^ｃ）（Ｒ^ｄ）であり、
Ｒ^ｃ、Ｒ^ｄ、およびＲ^ｅは、ＨまたはＣ_１～Ｃ_４アルキル基から独立して選択され、
Ｒ^９およびＲ^１０は、独立して、結合、または最大６個の炭素原子を有し、カルボニル、アミド、イミド、エステル、エーテル、アミン、チオン、またはチオールを含む基である）
を有する、請求項１～９のいずれかに記載の化合物。

【外国語明細書】