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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024096748
(43)【公開日】2024-07-17
(54)【発明の名称】アルファ－シヌクレイン病のアッセイ、方法、及び治療
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20240709BHJP
G01N 33/542 20060101ALI20240709BHJP
G01N 33/536 20060101ALI20240709BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 D ZNA
G01N33/542 A
G01N33/536 E
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024059363
(22)【出願日】2024-04-02
(62)【分割の表示】P 2020533605の分割
【原出願日】2018-12-19
(31)【優先権主張番号】PA201700738
(32)【優先日】2017-12-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】DK
(71)【出願人】
【識別番号】591143065
【氏名又は名称】ハー・ルンドベック・アクチエゼルスカベット
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100141195
【弁理士】
【氏名又は名称】西澤 恵美子
(72)【発明者】
【氏名】マリク，イブラヒム，ジョン
(72)【発明者】
【氏名】カルンキ，ペッカ
(72)【発明者】
【氏名】フォグ，カリナ
(57)【要約】 （修正有）
【課題】レビー小体、レビー神経突起、及び小シナプス封入体の形態をした凝集不溶性アルファ－シヌクレインの蓄積が脳中に存在するアルファ－シヌクレイン関連障害、すなわちアルファ－シヌクレイン病のための診断法において使用するためのアッセイを提供する。
【解決手段】対象のサンプル中のアルファ－シヌクレインを検出するための方法であって、
ａ）対象からサンプルを得るステップ、
ｂ）前記サンプルを発光アッセイにかけるステップ、及び
ｃ）任意選択で、結果を対照と比較するステップ
を含む方法。
【選択図】なし
【解決手段】対象のサンプル中のアルファ－シヌクレインを検出するための方法であって、
ａ）対象からサンプルを得るステップ、
ｂ）前記サンプルを発光アッセイにかけるステップ、及び
ｃ）任意選択で、結果を対照と比較するステップ
を含む方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象のサンプル中のアルファ－シヌクレインを検出するための方法であって、
ａ）対象からサンプルを得るステップ、
ｂ）前記サンプルを発光アッセイにかけるステップ、及び
ｃ）任意選択で、結果を対照と比較するステップ
を含む方法。
ａ）対象からサンプルを得るステップ、
ｂ）前記サンプルを発光アッセイにかけるステップ、及び
ｃ）任意選択で、結果を対照と比較するステップ
を含む方法。
【請求項2】
前記サンプルには、血液サンプル、血漿サンプル、又は血清サンプルがある、請求項１
に記載の方法。
に記載の方法。
【請求項3】
前記発光アッセイは、ｐＳ１２９アルファ－シヌクレイン又はアルファ－シヌクレイン
の１２０～１４０残基内に結合するアルファ－シヌクレイン抗体を使用している、請求項
１に記載の方法。
の１２０～１４０残基内に結合するアルファ－シヌクレイン抗体を使用している、請求項
１に記載の方法。
【請求項4】
前記発光アッセイは、ｐＳ１２９アルファ－シヌクレイン又はアルファ－シヌクレイン
の１２０～１４０残基内の異なるエピトープに結合する２つの異なるアルファ－シヌクレ
イン抗体を使用している、請求項１に記載の方法。
の１２０～１４０残基内の異なるエピトープに結合する２つの異なるアルファ－シヌクレ
イン抗体を使用している、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
使用される一方のフルオロフォアは、使用される他方のフルオロフォア（アクセプター
）よりも長い蛍光時間を有する（ドナー）、請求項３又は４に記載の方法。
）よりも長い蛍光時間を有する（ドナー）、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項6】
前記ドナーのフルオロフォアは、Ｌｕｍｉ４－Ｔｂ（Ｔｂ２＋クリプテート）、ユウロ
ピウムクリプテート（Ｅｕ３＋クリプテート）から選択される、請求項５に記載の方法。
ピウムクリプテート（Ｅｕ３＋クリプテート）から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記アクセプターのフルオロフォアは、ｄ２、ＸＬ６６５、又はフルオレセインから選
択される、請求項５に記載の方法。
択される、請求項５に記載の方法。
【請求項8】
前記ドナーと前記アクセプターとの間の近接度は、蛍光を測定することによってエネル
ギー移動のレベルを検出することによって判断される、請求項１に記載の方法。
ギー移動のレベルを検出することによって判断される、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記方法により、前記サンプル中のアルファ－シヌクレインレベルが、健康な対象由来
の対照サンプルよりも高いことが示される場合、前記対象は、アルファ－シヌクレインに
対する有効量の抗体で治療される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
の対照サンプルよりも高いことが示される場合、前記対象は、アルファ－シヌクレインに
対する有効量の抗体で治療される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記方法は、アルファ－シヌクレイン病を診断する又はモニターするために使用される
、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記方法は、アルファ－シヌクレイン病を治療するために使用される医薬の治療応答を
モニターするために使用される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
モニターするために使用される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記対象は、ヒトである、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
アルファ－シヌクレイン上のエピトープに結合する有効量の抗体を投与することによっ
て、パーキンソン病患者を治療する方法であって、前記患者は、請求項１～９に記載のア
ッセイによって診断されたことがある又はモニターされる方法。
て、パーキンソン病患者を治療する方法であって、前記患者は、請求項１～９に記載のア
ッセイによって診断されたことがある又はモニターされる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、患者におけるアルファ－シヌクレインレベルを判断し、モニターすることに
よって、パーキンソン病患者などのようなアルファ－シヌクレイン病の診断及び効率的な
治療を可能にするアッセイに関する。
よって、パーキンソン病患者などのようなアルファ－シヌクレイン病の診断及び効率的な
治療を可能にするアッセイに関する。
【背景技術】
【0002】
パーキンソン病（ＰＤ）、認知症を伴うパーキンソン病（ＰＤＤ）、レビー小体型認知
症（ＤＬＢ）、及び多系統萎縮症（ＭＳＡ）は、α－シヌクレイン脳病変を伴う神経変性
障害の例である。ＰＤは、最も多く見られる運動障害であり、振戦、運動緩徐又は運動を
始めるのが困難、硬直、及び姿勢反射障害とも呼ばれるバランスの欠陥によって特徴づけ
られる。ＰＤは、世界全体でおよそ４～６００万人がかかっていると考えられる。ＰＤ患
者の約８０％は、ＰＤＤに至る認知症を発症する。典型的に、認知症は、パーキンソン病
の経過の後期に生じる。ＤＬＢでは、認知症は、最初の症状であるが、運動症状は、最初
の１年の間に現われる場合があり、これによってこれらの障害を臨床的に区別している。
ＤＬＢは、すべての認知症のうちの１５～２０％以下に相当し得る。
症（ＤＬＢ）、及び多系統萎縮症（ＭＳＡ）は、α－シヌクレイン脳病変を伴う神経変性
障害の例である。ＰＤは、最も多く見られる運動障害であり、振戦、運動緩徐又は運動を
始めるのが困難、硬直、及び姿勢反射障害とも呼ばれるバランスの欠陥によって特徴づけ
られる。ＰＤは、世界全体でおよそ４～６００万人がかかっていると考えられる。ＰＤ患
者の約８０％は、ＰＤＤに至る認知症を発症する。典型的に、認知症は、パーキンソン病
の経過の後期に生じる。ＤＬＢでは、認知症は、最初の症状であるが、運動症状は、最初
の１年の間に現われる場合があり、これによってこれらの障害を臨床的に区別している。
ＤＬＢは、すべての認知症のうちの１５～２０％以下に相当し得る。
【0003】
アルファ－シヌクレインは、主にシナプス前部に位置する小さな１４０アミノ酸の神経
細胞内タンパク質である。α－シヌクレインの神経細胞内蓄積は、大きな円形の細胞質内
封入体であるレビー小体及びペール小体（ｐａｌｅ ｂｏｄｙ）、軸索における糸状の封
入体であるレビー神経突起、並びに小シナプス封入体（ｓｍａｌｌ ｓｙｎａｐｔｉｃ
ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）などのような凝集体形成を神経細胞の内部にもたらす。
細胞内タンパク質である。α－シヌクレインの神経細胞内蓄積は、大きな円形の細胞質内
封入体であるレビー小体及びペール小体（ｐａｌｅ ｂｏｄｙ）、軸索における糸状の封
入体であるレビー神経突起、並びに小シナプス封入体（ｓｍａｌｌ ｓｙｎａｐｔｉｃ
ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ）などのような凝集体形成を神経細胞の内部にもたらす。
【0004】
α－シヌクレインの凝集及び毒性に至るプロセスは、十分に理解されていない。α－シ
ヌクレイン遺伝子の突然変異又は重複は、ＰＤ及びＤＬＢのまれな原因となる。病因性突
然変異Ａ３０Ｐ、Ａ５３Ｔ、Ｅ４６Ｋ（Ｋｒｕｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８）（Ｐｏ
ｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８）（Ｚａｒｒａｎｚ ｅｔ ａｌ．
，２００４）並びにα－シヌクレインの重複及び三重化（Ｃｈａｒｔｉｅｒ－Ｈａｒｌｉ
ｎ ｅｔ ａｌ．２００４）（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）は、ＰＤ
又はＤＬＢのいずれかを引き起こすことが報告された。これらの突然変異のほとんどは、
始原原線維（ｐｒｏｔｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ）の割合の増加に関係し、最終的に、原線維
化学種（ｆｉｂｒｉｌｌａｒ ｓｐｅｃｉｅｓ）が形成され、これらは、様々な有毒性を
有する可能性がある。凝集は、セリン１２９でのアルファ－シヌクレインのリン酸化に関
連する。通常のアルファ－シヌクレインは、わずか（４％）しかリン酸化されていないが
、原線維性のアルファ－シヌクレインは、８０％リン酸化されていることが推定され、ｐ
Ｓ１２９アルファ－シヌクレインに対する抗体は、最小の凝集体を検出する。
ヌクレイン遺伝子の突然変異又は重複は、ＰＤ及びＤＬＢのまれな原因となる。病因性突
然変異Ａ３０Ｐ、Ａ５３Ｔ、Ｅ４６Ｋ（Ｋｒｕｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８）（Ｐｏ
ｌｙｍｅｒｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８）（Ｚａｒｒａｎｚ ｅｔ ａｌ．
，２００４）並びにα－シヌクレインの重複及び三重化（Ｃｈａｒｔｉｅｒ－Ｈａｒｌｉ
ｎ ｅｔ ａｌ．２００４）（Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００３）は、ＰＤ
又はＤＬＢのいずれかを引き起こすことが報告された。これらの突然変異のほとんどは、
始原原線維（ｐｒｏｔｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ）の割合の増加に関係し、最終的に、原線維
化学種（ｆｉｂｒｉｌｌａｒ ｓｐｅｃｉｅｓ）が形成され、これらは、様々な有毒性を
有する可能性がある。凝集は、セリン１２９でのアルファ－シヌクレインのリン酸化に関
連する。通常のアルファ－シヌクレインは、わずか（４％）しかリン酸化されていないが
、原線維性のアルファ－シヌクレインは、８０％リン酸化されていることが推定され、ｐ
Ｓ１２９アルファ－シヌクレインに対する抗体は、最小の凝集体を検出する。
【0005】
少量のアルファ－シヌクレインは、脳の間質液中、脳脊髄液（ＣＳＦ）及び血液中、細
胞外で見つけられる。このアルファ－シヌクレインの発生源は、明らかではないが、アル
ファ－シヌクレインは、おそらく、細胞から、細胞体及びシナプスの両方から、たとえば
、神経細胞が活性化される時のシナプス放出の間に放出されるであろう。アルファ－シヌ
クレインの中には、おそらく、病気の細胞及び死細胞から生じるものもあるであろう。ア
ルファ－シヌクレインはまた、多くの血球及び血小板においても見つけられており、これ
らは、血液中のアルファ－シヌクレインの発生源である可能性が高い。エキソソーム中に
分泌されるアルファ－シヌクレインの割合は低く、細胞外液中のアルファ－シヌクレイン
の大部分は、エキソソームに関連しない遊離タンパク質として見つけられる。
胞外で見つけられる。このアルファ－シヌクレインの発生源は、明らかではないが、アル
ファ－シヌクレインは、おそらく、細胞から、細胞体及びシナプスの両方から、たとえば
、神経細胞が活性化される時のシナプス放出の間に放出されるであろう。アルファ－シヌ
クレインの中には、おそらく、病気の細胞及び死細胞から生じるものもあるであろう。ア
ルファ－シヌクレインはまた、多くの血球及び血小板においても見つけられており、これ
らは、血液中のアルファ－シヌクレインの発生源である可能性が高い。エキソソーム中に
分泌されるアルファ－シヌクレインの割合は低く、細胞外液中のアルファ－シヌクレイン
の大部分は、エキソソームに関連しない遊離タンパク質として見つけられる。
【0006】
α－シヌクレイン病変を伴う神経変性疾患の初期に患者を同定するための改善された診
断ツールが必要とされる。神経変性プロセスは、臨床診断の数年前、おそらく１０～２０
年前にスタートするという証拠がある。ＲＥＭ睡眠行動障害（ＲＢＤ）は、α－シヌクレ
イン病の前駆期として現在認識されている。ＲＤＢを有するほとんどの人は、ＲＢＤの診
断から２０年以内にＰＤ又はＤＬＢに転換するであろう。アルファ－シヌクレイン病の前
駆期の他の徴候は、嗅覚消失を含む。
断ツールが必要とされる。神経変性プロセスは、臨床診断の数年前、おそらく１０～２０
年前にスタートするという証拠がある。ＲＥＭ睡眠行動障害（ＲＢＤ）は、α－シヌクレ
イン病の前駆期として現在認識されている。ＲＤＢを有するほとんどの人は、ＲＢＤの診
断から２０年以内にＰＤ又はＤＬＢに転換するであろう。アルファ－シヌクレイン病の前
駆期の他の徴候は、嗅覚消失を含む。
【0007】
現在、運動症状がはっきり表われる前に臨床医の診断を支援する生化学的方法はない。
その時点で、脳への実質的な損傷が、おそらく既に生じている。正確な診断アッセイの重
要性は、うまくいけば疾患の進行を停止させる又は遅らせるであろう新たな疾患修飾療法
が出現するとともに、さらに大きくなるであろう。
その時点で、脳への実質的な損傷が、おそらく既に生じている。正確な診断アッセイの重
要性は、うまくいけば疾患の進行を停止させる又は遅らせるであろう新たな疾患修飾療法
が出現するとともに、さらに大きくなるであろう。
【0008】
総アルファ－シヌクレインを測定する数種のアッセイが、利用可能であり、それらのう
ちのいくつかは、検証済みである又は大規模な臨床研究において検証されているところで
ある（Ｇｏｌｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．２０１７）。これらの研究は、ＣＳＦにおける総ア
ルファ－シヌクレインのわずかな減少がパーキンソン病に関連することを示した。アルフ
ァ－シヌクレインのいくつかの種類のオリゴマー形態及びセリン－１２９のリン酸化形態
を測定するための数種の探索的アッセイもまた、存在し（Ｍａｊｂｏｕｒ ｅｔ ａｌ．
２０１６ａ）、予備的なデータは、これらの化学種がＰＤ ＣＳＦにおいて増加している
かもしれないことを示唆する。しかしながら、やはり、患者レベルと対照レベルとの間の
差はわずかで、個人間に大きなばらつきがある。現在のアッセイはすべて、わずかな差及
び個人間の大きなばらつきを欠点として持ち、これらのアッセイを、アルファ－シヌクレ
イン凝集を伴う疾患の診断の支援において有用でないものにしている。全体的に見て、現
在の証拠は、総ＣＳＦα－シヌクレインがＰＤにおいて低下しており、α－シヌクレイン
オリゴマー又はリン酸化アルファ－シヌクレインといった亜種が、ＰＤと対照を区別する
かもしれないことを示唆する。
ちのいくつかは、検証済みである又は大規模な臨床研究において検証されているところで
ある（Ｇｏｌｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．２０１７）。これらの研究は、ＣＳＦにおける総ア
ルファ－シヌクレインのわずかな減少がパーキンソン病に関連することを示した。アルフ
ァ－シヌクレインのいくつかの種類のオリゴマー形態及びセリン－１２９のリン酸化形態
を測定するための数種の探索的アッセイもまた、存在し（Ｍａｊｂｏｕｒ ｅｔ ａｌ．
２０１６ａ）、予備的なデータは、これらの化学種がＰＤ ＣＳＦにおいて増加している
かもしれないことを示唆する。しかしながら、やはり、患者レベルと対照レベルとの間の
差はわずかで、個人間に大きなばらつきがある。現在のアッセイはすべて、わずかな差及
び個人間の大きなばらつきを欠点として持ち、これらのアッセイを、アルファ－シヌクレ
イン凝集を伴う疾患の診断の支援において有用でないものにしている。全体的に見て、現
在の証拠は、総ＣＳＦα－シヌクレインがＰＤにおいて低下しており、α－シヌクレイン
オリゴマー又はリン酸化アルファ－シヌクレインといった亜種が、ＰＤと対照を区別する
かもしれないことを示唆する。
【0009】
末梢体液、血漿及び唾液中のアルファ－シヌクレインの測定は、ＣＳＦよりもさらに変
化しやすい結果をもたらした。最近の大きな研究では、血漿及び唾液のα－シヌクレイン
レベルは、ＰＤと健康な対照参加者を有意に識別せず、ＣＳＦ中のα－シヌクレインレベ
ルと末梢体液（血漿及び唾液）中のα－シヌクレインレベルとの有意な相関性はなかった
（Ｇｏｌｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．２０１７）。そのため、現在、ＣＳＦα－シヌクレイン
は、ＰＤにとって、末梢α－シヌクレインよりも、診断上大いに役に立つ。サンプルを得
るためのＣＳＦサンプリングは、侵襲性の手段であり、ＰＤについての血漿バイオマーカ
ーがあることは、このことが可能であれば、有益であろうと思われる。
化しやすい結果をもたらした。最近の大きな研究では、血漿及び唾液のα－シヌクレイン
レベルは、ＰＤと健康な対照参加者を有意に識別せず、ＣＳＦ中のα－シヌクレインレベ
ルと末梢体液（血漿及び唾液）中のα－シヌクレインレベルとの有意な相関性はなかった
（Ｇｏｌｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．２０１７）。そのため、現在、ＣＳＦα－シヌクレイン
は、ＰＤにとって、末梢α－シヌクレインよりも、診断上大いに役に立つ。サンプルを得
るためのＣＳＦサンプリングは、侵襲性の手段であり、ＰＤについての血漿バイオマーカ
ーがあることは、このことが可能であれば、有益であろうと思われる。
【発明の概要】
【0010】
アルファ－シヌクレイン凝集のモニタリングは、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体
型認知症（ＤＬＢ）、びまん性レビー小体病（ＤＬＢＤ）、及び多系統萎縮（ＭＳＡ）を
含む１つの神経変性疾患群であるシヌクレイン病の病因の研究に非常に重要である。した
がって、本発明の方法は、上記に述べられた疾患の疾患進行を診断する又はモニターする
ために使用することができる。その代わりに、方法は、治療応答をモニターする又は追跡
するために及び患者の治療に関する話し合いを行うために使用することができる。この治
療は、ある実施形態では、抗体治療又はアルファ－シヌクレインを含むワクチン接種など
のような、アルファ－シヌクレインに対して向けられる能動免疫療法又は受動免疫療法で
あってもよい。
型認知症（ＤＬＢ）、びまん性レビー小体病（ＤＬＢＤ）、及び多系統萎縮（ＭＳＡ）を
含む１つの神経変性疾患群であるシヌクレイン病の病因の研究に非常に重要である。した
がって、本発明の方法は、上記に述べられた疾患の疾患進行を診断する又はモニターする
ために使用することができる。その代わりに、方法は、治療応答をモニターする又は追跡
するために及び患者の治療に関する話し合いを行うために使用することができる。この治
療は、ある実施形態では、抗体治療又はアルファ－シヌクレインを含むワクチン接種など
のような、アルファ－シヌクレインに対して向けられる能動免疫療法又は受動免疫療法で
あってもよい。
【0011】
一実施形態では、本発明は、
ａ）患者からサンプルを得るステップ
ｂ）サンプルを本発明の発光アッセイにかけるステップ、及び
ｃ）任意選択で、結果を対照と比較するステップ
を含むインビトロにおける方法である。
ａ）患者からサンプルを得るステップ
ｂ）サンプルを本発明の発光アッセイにかけるステップ、及び
ｃ）任意選択で、結果を対照と比較するステップ
を含むインビトロにおける方法である。
【0012】
サンプルは、好ましくは、血液サンプル、血漿サンプル、又は血清サンプルである。
【0013】
使用される抗体は、フルオロフォアに連結されたアルファ－シヌクレイン抗体である。
アルファ－シヌクレインに対して結合性の２つの抗体に連結されてもよい２つの異なるフ
ルオロフォアが、本発明の方法において使用されてもよい。一方のフルオロフォアは、使
用される他方のフルオロフォア（アクセプター）よりも長い蛍光時間を有する（ドナー）
。
アルファ－シヌクレインに対して結合性の２つの抗体に連結されてもよい２つの異なるフ
ルオロフォアが、本発明の方法において使用されてもよい。一方のフルオロフォアは、使
用される他方のフルオロフォア（アクセプター）よりも長い蛍光時間を有する（ドナー）
。
【0014】
ドナーは、好ましくは、Ｌｕｍｉ４－Ｔｂ（Ｔｂ２＋クリプテート）又はユウロピウム
クリプテート（Ｅｕ３＋クリプテート）から選択され、アクセプターは、好ましくは、Ｘ
Ｌ６６５又はフルオレセイン若しくはｄ２から選択される。ドナーとアクセプターとの間
の近接度は、好ましくは、互換性のある読み取り装置において２つの異なる波長６６５ｎ
ｍ及び６２０ｎｍなどで、蛍光放射を測定することによってエネルギー移動のレベルを検
出することによって判断される。
クリプテート（Ｅｕ３＋クリプテート）から選択され、アクセプターは、好ましくは、Ｘ
Ｌ６６５又はフルオレセイン若しくはｄ２から選択される。ドナーとアクセプターとの間
の近接度は、好ましくは、互換性のある読み取り装置において２つの異なる波長６６５ｎ
ｍ及び６２０ｎｍなどで、蛍光放射を測定することによってエネルギー移動のレベルを検
出することによって判断される。
【図面の簡単な説明】
【0015】
【図1】図１は、６２０ｎＭ（Ｔｂ－クリプテート－ドナー）放射及び６６５ｎｍ（ｄ２－アクセプター）放射の両方の同時測定を可能にするＰＨＥＲＡｓｔａｒ ＦＳＸデバイスを使用して行われる測定を示す図である。６６５／６２０＊１００００の比率を、各ウェルについて計算する。相対的エネルギー移動率、デルタＦ ％は、その比率を使用して計算され、タンパクに対して補正することができる。棒グラフは、キット＃１及びキット＃２（凝集アルファシヌクレインを検出する）の両方を使用して測定した血漿サンプル（８倍希釈）のそれぞれについてタンパク質に対して補正されたデルタＦ ％を示す。３人のＰＤ患者と３人の健康対照との間に明らかな差異がある。この図は、ＰＤ患者の血漿において有意に高いレベルの凝集アルファシヌクレインがあり、この方法が、血液サンプルに基づき、ＰＤ患者において疾患進行を同定し、且つ診断し、且つモニターするために使用することができることを示す。
【発明を実施するための形態】
【0016】
発明の詳細な説明
本発明の目的は、レビー小体、レビー神経突起、及び小シナプス封入体の形態をした凝
集不溶性アルファ－シヌクレインの蓄積が脳中に存在するアルファ－シヌクレイン関連障
害、すなわちアルファ－シヌクレイン病のための診断法において使用するためのアッセイ
を提供することである。そのような障害は、パーキンソン病（ＰＤ）、認知症を伴うパー
キンソン病（ＰＤＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、多系統萎縮（ＭＳＡ）、及びＲ
ＥＭ睡眠行動異常症（ＲＢＤ）並びにアルファ－シヌクレイン病変を伴う他の神経変性障
害などのような１つ又はそれ以上の神経変性障害を含むが、これらに限定されない。
本発明の目的は、レビー小体、レビー神経突起、及び小シナプス封入体の形態をした凝
集不溶性アルファ－シヌクレインの蓄積が脳中に存在するアルファ－シヌクレイン関連障
害、すなわちアルファ－シヌクレイン病のための診断法において使用するためのアッセイ
を提供することである。そのような障害は、パーキンソン病（ＰＤ）、認知症を伴うパー
キンソン病（ＰＤＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、多系統萎縮（ＭＳＡ）、及びＲ
ＥＭ睡眠行動異常症（ＲＢＤ）並びにアルファ－シヌクレイン病変を伴う他の神経変性障
害などのような１つ又はそれ以上の神経変性障害を含むが、これらに限定されない。
【0017】
本発明は、一方は凝集アルファ－シヌクレインに基づき、一方はリン酸化アルファ－シ
ヌクレインに基づく２つのアッセイについての新たな使用を提供する。両方のアッセイは
、対照の個人由来の血漿と比較して、ＰＤ患者由来の血漿において大きな増加を示す（図
１）。
ヌクレインに基づく２つのアッセイについての新たな使用を提供する。両方のアッセイは
、対照の個人由来の血漿と比較して、ＰＤ患者由来の血漿において大きな増加を示す（図
１）。
【0018】
本発明の一態様によれば、本発明は、有効量のアルファ－シヌクレイン抗体により前記
患者を治療することによって、本発明の発光アッセイを使用して、パーキンソン病などの
ようなアルファ－シヌクレイン病を有すると診断された患者を治療するための方法に関す
る。
患者を治療することによって、本発明の発光アッセイを使用して、パーキンソン病などの
ようなアルファ－シヌクレイン病を有すると診断された患者を治療するための方法に関す
る。
【0019】
抗体治療の治療効果は、血液、血漿、又は血清中のアルファ－シヌクレインの患者レベ
ルを測定して評価されてもよい。評価は、抗体治療より前に（たとえば患者を診断する時
）又は１、２、３、４回、若しくはそれ以上の治療の後になされてもよい。たとえば、方
法はまた、一実施形態によれば、抗体治療の治療効果及び疾患進行をモニターするために
使用されてもよい。
ルを測定して評価されてもよい。評価は、抗体治療より前に（たとえば患者を診断する時
）又は１、２、３、４回、若しくはそれ以上の治療の後になされてもよい。たとえば、方
法はまた、一実施形態によれば、抗体治療の治療効果及び疾患進行をモニターするために
使用されてもよい。
【0020】
アッセイは、
ａ．適切な結合条件下で患者由来の血液、血漿、又は血清サンプルを発光アッセイにかけ
るステップ及び
ｂ．適用可能な場合、パーキンソン病を有していない人由来の対照とデータを比較するス
テップ又はたとえば、データを、同じ人から異なる（以前の）時点で得られたデータと比
較し、それによって、疾患進行をモニターするステップを含んでいてもよい。
ａ．適切な結合条件下で患者由来の血液、血漿、又は血清サンプルを発光アッセイにかけ
るステップ及び
ｂ．適用可能な場合、パーキンソン病を有していない人由来の対照とデータを比較するス
テップ又はたとえば、データを、同じ人から異なる（以前の）時点で得られたデータと比
較し、それによって、疾患進行をモニターするステップを含んでいてもよい。
【0021】
その結果に基づいて、患者が治療を継続するべきかどうか又はちょうど診断するところ
であれば、患者が治療を始めるべきかどうかが決定されてもよい。たとえば、アッセイに
よって得られるデータによって、対照と比較して存在するアルファ－シヌクレインが多い
ことが示される場合、治療の継続又は開始が勧められてもよい。
であれば、患者が治療を始めるべきかどうかが決定されてもよい。たとえば、アッセイに
よって得られるデータによって、対照と比較して存在するアルファ－シヌクレインが多い
ことが示される場合、治療の継続又は開始が勧められてもよい。
【0022】
【0023】
アッセイは、発光を測定するアッセイであり、ＨＴＲＦ（ホモジニアス時間分解蛍光法
）ベースのアッセイであってもよい。この技術は、時間分解測定（ＴＲ）と蛍光共鳴エネ
ルギー移動技術（ＦＲＥＴ）を組み合わせたものである（Ｄｅｇｏｒｃｅ ｅｔ ａｌ，
２００９，ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，３，２２－３２）。
ＴＲ－ＦＲＥＴアッセイでは、シグナルは、互いに隣接する場合に、ドナーとアクセプタ
ー分子（たとえば、抗体にカップルされた）との間の蛍光エネルギー移動を通して起きる
。
）ベースのアッセイであってもよい。この技術は、時間分解測定（ＴＲ）と蛍光共鳴エネ
ルギー移動技術（ＦＲＥＴ）を組み合わせたものである（Ｄｅｇｏｒｃｅ ｅｔ ａｌ，
２００９，ｃｕｒｒｅｎｔ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，３，２２－３２）。
ＴＲ－ＦＲＥＴアッセイでは、シグナルは、互いに隣接する場合に、ドナーとアクセプタ
ー分子（たとえば、抗体にカップルされた）との間の蛍光エネルギー移動を通して起きる
。
【0024】
ＨＴＲＦ技術は、抗体などのような生体分子間の反応をモニターするために、蛍光ドナ
ーとしてユウロピウムクリプテートを又はテルビウムクリプテート（Ｔｂ）を使用しても
よい。例として、ユウロピウムクリプテート（Ｅｕ３＋クリプテート）及びＬｕｍｉ４－
Ｔｂ（Ｔｂ２＋クリプテート）を含む。
ーとしてユウロピウムクリプテートを又はテルビウムクリプテート（Ｔｂ）を使用しても
よい。例として、ユウロピウムクリプテート（Ｅｕ３＋クリプテート）及びＬｕｍｉ４－
Ｔｂ（Ｔｂ２＋クリプテート）を含む。
【0025】
ＨＴＲＦのために開発されたアクセプターは、紅藻類から精製されるフィコビリンタン
パク質色素であるＸＬ６６５であってもよい。ＸＬ６６５は１０５ ｋＤａの大きなヘテ
ロ六量体の構造体（ｅｄｉｆｉｃｅ）であり、ＨＴＲＦアッセイにおけるその光物理学的
特性のよりよい安定性及び保存のために、単離の後に架橋される。ＸＬ６６５の光物理学
的特性に非常に類似している一連の光物理学的特性を持つが、ＸＬ６６５の１／１００の
大きさである有機構造物によって特徴づけられるアクセプターの一種は、たとえば土類キ
レート又はクリプテートである。より小さな実体を使用することによって、これにより、
ＸＬ６６５ベースのＴＲ－ＦＲＥＴ系において時に疑われる立体障害の問題が解決される
。これらの近赤外アクセプターはまた、典型的な化合物スクリーニングプロセスにおいて
発生する内因的な媒体又は化合物の自己蛍光によってそれらの放射が妨害されることが少
ないので、特にホモジニアスアッセイに適している。これらの赤色アクセプターの特性は
また、赤色アクセプターを、テルビウムクリプテートとのカップリングに適したものにす
る。そのうえ、その放射スペクトルにおけるさらなるピークにより、テルビウムクリプテ
ートは、たとえば２つの読み出し装置を用いる多重アッセイの設計を可能にしてもよい５
２０ｎｍの範囲で放射するフルオレセインなどのような緑色アクセプターとカップルする
ことができる。特に、希土類キレート又はクリプテートなどのような蛍光化合物、とりわ
けテルビウム、ユウロピウム、ジスプロシウム、サマリウム、又はネオジムキレート又は
クリプテートは、好都合に使用されるであろう。テルビウム又はユウロピウムクリプテー
トは、好ましくは使用されるであろう。
パク質色素であるＸＬ６６５であってもよい。ＸＬ６６５は１０５ ｋＤａの大きなヘテ
ロ六量体の構造体（ｅｄｉｆｉｃｅ）であり、ＨＴＲＦアッセイにおけるその光物理学的
特性のよりよい安定性及び保存のために、単離の後に架橋される。ＸＬ６６５の光物理学
的特性に非常に類似している一連の光物理学的特性を持つが、ＸＬ６６５の１／１００の
大きさである有機構造物によって特徴づけられるアクセプターの一種は、たとえば土類キ
レート又はクリプテートである。より小さな実体を使用することによって、これにより、
ＸＬ６６５ベースのＴＲ－ＦＲＥＴ系において時に疑われる立体障害の問題が解決される
。これらの近赤外アクセプターはまた、典型的な化合物スクリーニングプロセスにおいて
発生する内因的な媒体又は化合物の自己蛍光によってそれらの放射が妨害されることが少
ないので、特にホモジニアスアッセイに適している。これらの赤色アクセプターの特性は
また、赤色アクセプターを、テルビウムクリプテートとのカップリングに適したものにす
る。そのうえ、その放射スペクトルにおけるさらなるピークにより、テルビウムクリプテ
ートは、たとえば２つの読み出し装置を用いる多重アッセイの設計を可能にしてもよい５
２０ｎｍの範囲で放射するフルオレセインなどのような緑色アクセプターとカップルする
ことができる。特に、希土類キレート又はクリプテートなどのような蛍光化合物、とりわ
けテルビウム、ユウロピウム、ジスプロシウム、サマリウム、又はネオジムキレート又は
クリプテートは、好都合に使用されるであろう。テルビウム又はユウロピウムクリプテー
トは、好ましくは使用されるであろう。
【0026】
本発明の測定の方法を使用する検出及び／又は決定の蛍光分析法において、欧州特許出
願第１８０ ４９２号明細書及び第３２１ ３５３号明細書において記載される希土類ク
リプテートは、好都合に選ばれるであろう。
願第１８０ ４９２号明細書及び第３２１ ３５３号明細書において記載される希土類ク
リプテートは、好都合に選ばれるであろう。
【0027】
欧州特許出願第１８０ ４９２号明細書において記載されるテルビウムクリプテートＴ
ｂトリスビピリジン若しくはユウロピウムクリプテートＥｕトリスビピリジン又は欧州特
許出願第３２１ ３５３号明細書において記載されるクリプテートＥｕトリスビピリジン
ジアミン及びＴｂトリスビピリジンジアミンは、好ましくは使用されるであろう。
ｂトリスビピリジン若しくはユウロピウムクリプテートＥｕトリスビピリジン又は欧州特
許出願第３２１ ３５３号明細書において記載されるクリプテートＥｕトリスビピリジン
ジアミン及びＴｂトリスビピリジンジアミンは、好ましくは使用されるであろう。
【0028】
好都合な特徴によれば、蛍光ドナー化合物は、ユウロピウムクリプテートであり、蛍光
アクセプター化合物は、ｄ２、アロフィコシアニン、アロフィコシアニンＢ、フィコシア
ニンＣ、又はフィコシアニンＲから選択される。
アクセプター化合物は、ｄ２、アロフィコシアニン、アロフィコシアニンＢ、フィコシア
ニンＣ、又はフィコシアニンＲから選択される。
【0029】
発光ドナーとして、エオシン又はエリトロシンなどのようなリン光化合物を使用するこ
ともまた可能である。この場合、欧州特許出願第７１ ９９１号明細書及び第３１４ ４
０６号明細書において述べられるものなどのようなクロロフィリス（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙ
ｌｉｓ）又は欧州特許出願第７１ ９９１号明細書において述べられるものなどのような
ポルフィリン又は国際公開第８８ ０４７７７号パンフレットのものなどのような他のフ
タロシアニンから選択される蛍光アクセプター化合物を使用することが好都合であろう。
ともまた可能である。この場合、欧州特許出願第７１ ９９１号明細書及び第３１４ ４
０６号明細書において述べられるものなどのようなクロロフィリス（ｃｈｌｏｒｏｐｈｙ
ｌｉｓ）又は欧州特許出願第７１ ９９１号明細書において述べられるものなどのような
ポルフィリン又は国際公開第８８ ０４７７７号パンフレットのものなどのような他のフ
タロシアニンから選択される蛍光アクセプター化合物を使用することが好都合であろう。
【0030】
本発明の別の特徴によれば、媒体（たとえば血液、血漿、又は血清）中のアルファ－シ
ヌクレインを検出する及び／又は決定するための発光法は、
１）患者又は対象由来のアルファ－シヌクレインを含有する前記媒体に、発光ドナーとカ
ップルされたアルファ－シヌクレインに対する第１の抗体を追加するステップ、
２）発光アクセプターとカップルされた第２のアルファ－シヌクレイン抗体を追加するス
テップ、
３）試薬の追加の後に前記媒体をインキュベートするステップ、
４）結果として生じる媒体を蛍光ドナーの励起波長で励起するステップ、並びに
５）ある波長での蛍光ドナーのシグナル（この測定値は基準として果たす）及び異なる波
長でのエネルギー移動に起因するシグナルを測定するステップを含む。
ヌクレインを検出する及び／又は決定するための発光法は、
１）患者又は対象由来のアルファ－シヌクレインを含有する前記媒体に、発光ドナーとカ
ップルされたアルファ－シヌクレインに対する第１の抗体を追加するステップ、
２）発光アクセプターとカップルされた第２のアルファ－シヌクレイン抗体を追加するス
テップ、
３）試薬の追加の後に前記媒体をインキュベートするステップ、
４）結果として生じる媒体を蛍光ドナーの励起波長で励起するステップ、並びに
５）ある波長での蛍光ドナーのシグナル（この測定値は基準として果たす）及び異なる波
長でのエネルギー移動に起因するシグナルを測定するステップを含む。
【0031】
一実施形態によれば、アッセイは、ＨＴＲＦ技術を使用してアルファ－シヌクレイン凝
集を検出することを目的とする。凝集アルファ－シヌクレインは、Ｔｂ－クリプテートな
どのようなドナー又はアクセプターにより標識された特異的アルファ－シヌクレインモノ
クローナル抗体を使用して検出される。色素が隣接している場合、光源（レーザー又はフ
ラッシュランプ）によるドナーの励起は、アクセプターへの蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆ
ＲＥＴ）を引き起こし、これは次に特定の波長（６６５ｎｍ）で蛍光を発する。アクセプ
ター又はＴｂにより標識された抗体は、アルファ－シヌクレインに結合する。アルファ－
シヌクレインが凝集すると、アクセプター又はＴｂにより標識された抗体は、次いで隣接
状態になり、ＦＲＥＴを起こす。シグナル強度は、形成された凝集体の数に比例する。
集を検出することを目的とする。凝集アルファ－シヌクレインは、Ｔｂ－クリプテートな
どのようなドナー又はアクセプターにより標識された特異的アルファ－シヌクレインモノ
クローナル抗体を使用して検出される。色素が隣接している場合、光源（レーザー又はフ
ラッシュランプ）によるドナーの励起は、アクセプターへの蛍光共鳴エネルギー移動（Ｆ
ＲＥＴ）を引き起こし、これは次に特定の波長（６６５ｎｍ）で蛍光を発する。アクセプ
ター又はＴｂにより標識された抗体は、アルファ－シヌクレインに結合する。アルファ－
シヌクレインが凝集すると、アクセプター又はＴｂにより標識された抗体は、次いで隣接
状態になり、ＦＲＥＴを起こす。シグナル強度は、形成された凝集体の数に比例する。
【0032】
アルファ－シヌクレイン凝集のモニタリングは、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体
型認知症（ＤＬＢ）、びまん性レビー小体病（ＤＬＢＤ）、及び多系統萎縮（ＭＳＡ）を
含む１つの神経変性疾患群であるシヌクレイン病の病因の研究にとって非常に興味深い。
したがって、本発明の方法は、上記に述べられた疾患を診断する又はモニターするために
使用することができる。その代わりに、方法は、治療応答をモニターする又は追跡するた
めに及び患者の治療に関する決定を行うために使用することができる。一実施形態では、
この治療は、アルファ－シヌクレイン抗体治療である。
型認知症（ＤＬＢ）、びまん性レビー小体病（ＤＬＢＤ）、及び多系統萎縮（ＭＳＡ）を
含む１つの神経変性疾患群であるシヌクレイン病の病因の研究にとって非常に興味深い。
したがって、本発明の方法は、上記に述べられた疾患を診断する又はモニターするために
使用することができる。その代わりに、方法は、治療応答をモニターする又は追跡するた
めに及び患者の治療に関する決定を行うために使用することができる。一実施形態では、
この治療は、アルファ－シヌクレイン抗体治療である。
【0033】
したがって、本発明は、患者においてパーキンソン病などのようなシヌクレイン病を診
断する又は追跡するための方法であって、
ａ）患者からサンプルを得るステップ
ｂ）上記に記載されるように、発光アッセイにサンプルをかけるステップ、及び
ｃ）任意選択で、結果を対照と比較するステップ
を含む方法に関する。
断する又は追跡するための方法であって、
ａ）患者からサンプルを得るステップ
ｂ）上記に記載されるように、発光アッセイにサンプルをかけるステップ、及び
ｃ）任意選択で、結果を対照と比較するステップ
を含む方法に関する。
【0034】
サンプルは、好ましくは、血液サンプル、血清サンプル、又は血漿サンプルである。
【0035】
使用される抗体は、フルオロフォアに連結されたアルファ－シヌクレイン抗体であって
もよい。使用されるフルオロフォアは、使用される他方のフルオロフォア（アクセプター
）よりも長い蛍光時間を有する（ドナー）。ドナーは、好ましくは、Ｌｕｍｉ４－Ｔｂ（
Ｔｂ２＋クリプテート）又はユウロピウムクリプテート（Ｅｕ３＋クリプテート）から選
択され、アクセプターは、好ましくは、ｄ２、ＸＬ６６５、又はフルオレセインから選択
される。
もよい。使用されるフルオロフォアは、使用される他方のフルオロフォア（アクセプター
）よりも長い蛍光時間を有する（ドナー）。ドナーは、好ましくは、Ｌｕｍｉ４－Ｔｂ（
Ｔｂ２＋クリプテート）又はユウロピウムクリプテート（Ｅｕ３＋クリプテート）から選
択され、アクセプターは、好ましくは、ｄ２、ＸＬ６６５、又はフルオレセインから選択
される。
【0036】
ドナーとアクセプターとの間の近接度は、好ましくは、互換性のある読み取り装置にお
いて２つの異なる波長（６６５ｎｍ及び６２０ｎｍなど）で、蛍光放射を測定することに
よってエネルギー移動のレベルを検出することによって判断される。
いて２つの異なる波長（６６５ｎｍ及び６２０ｎｍなど）で、蛍光放射を測定することに
よってエネルギー移動のレベルを検出することによって判断される。
【0037】
本明細書において使用されるように、用語「アルファ－シヌクレイン」は、「アルファ
－シヌクレインタンパク質」と同義であり、アルファ－シヌクレインタンパク質アイソフ
ォームのいずれかを指す（たとえばＵｎｉＰｒｏｔでＰ３７８４０、１～３として同定さ
れる）。アルファ－シヌクレインのアミノ酸のナンバリングは、下記に示されるような配
列を基準にして定められており、メチオニン（Ｍ）は、アミノ酸残基１である（配列番号
１）。
－シヌクレインタンパク質」と同義であり、アルファ－シヌクレインタンパク質アイソフ
ォームのいずれかを指す（たとえばＵｎｉＰｒｏｔでＰ３７８４０、１～３として同定さ
れる）。アルファ－シヌクレインのアミノ酸のナンバリングは、下記に示されるような配
列を基準にして定められており、メチオニン（Ｍ）は、アミノ酸残基１である（配列番号
１）。
【化1】
【0038】
アルファシヌクレイン抗体は、いくつかの実施形態において、ｐＳ１２９アルファ－シ
ヌクレイン又はアルファシヌクレインの１２０～１４０の間のＣ末端残基に結合していて
もよい。
ヌクレイン又はアルファシヌクレインの１２０～１４０の間のＣ末端残基に結合していて
もよい。
【0039】
本発明はまた、アルファ－シヌクレイン上のエピトープに結合する有効量の抗体を投与
することによって、パーキンソン病患者を治療するための方法であって、患者は、本発明
のアッセイによって診断されたことがある又はモニターされる方法にも関する。
することによって、パーキンソン病患者を治療するための方法であって、患者は、本発明
のアッセイによって診断されたことがある又はモニターされる方法にも関する。
【実施例0040】
このアッセイは、血液サンプルを使用して、アルファシヌクレイン病、たとえばパーキ
ンソン病に罹患している患者を同定し、診断し、且つモニターするために使用することが
できる。
ンソン病に罹患している患者を同定し、診断し、且つモニターするために使用することが
できる。
【0041】
アッセイの原理：
このアッセイは、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ＴＲ－ＦＲＥＴ）技術の使用に基
づく。
このアッセイは、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ＴＲ－ＦＲＥＴ）技術の使用に基
づく。
【0042】
ＦＲＥＴは、２つの色素、ドナーとアクセプターとの間のエネルギーの移動に基づく。
ドナーが励起されると、ドナーはアクセプターにエネルギーを移動させ、次にアクセプタ
ーが蛍光を放射し、その蛍光を測定する。これは、色素が互いに非常に接近している場合
のみ起こり得る。きわめて瞬間的なものである通常のＦＲＥＴ試験は、バックグラウンド
の蛍光による限界がある。これは、ＦＲＥＴと時間分解測定を組み合わせて、バックグラ
ウンドの蛍光及び非特異的な蛍光を回避することによって克服することができる。さらに
、ＴＲ－ＦＲＥＴにおけるアクセプターは、アクセプターがＦＲＥＴに関与した場合に、
長寿命の蛍光を放射するように設計されている。
ドナーが励起されると、ドナーはアクセプターにエネルギーを移動させ、次にアクセプタ
ーが蛍光を放射し、その蛍光を測定する。これは、色素が互いに非常に接近している場合
のみ起こり得る。きわめて瞬間的なものである通常のＦＲＥＴ試験は、バックグラウンド
の蛍光による限界がある。これは、ＦＲＥＴと時間分解測定を組み合わせて、バックグラ
ウンドの蛍光及び非特異的な蛍光を回避することによって克服することができる。さらに
、ＴＲ－ＦＲＥＴにおけるアクセプターは、アクセプターがＦＲＥＴに関与した場合に、
長寿命の蛍光を放射するように設計されている。
【0043】
アルファシヌクレイン凝集キットでは、特異的なモノクローナル抗体は、ドナー分子又
はアクセプター分子のいずれかにより標識される。ホスホシヌクレインキット（Ｓ１２９
Ｐ）では、２つの抗体が使用され、一方はアルファシヌクレイン抗体であり、他方はホス
ホシヌクレイン特異的抗体（Ｓ１２９Ｐ）であり、一方の抗体はドナーにより標識され、
他方はアクセプター色素により標識される。抗体（ドナー色素及びアクセプター色素によ
り標識された）がヒトアルファシヌクレイン凝集体に結合すると、それらは互いに非常に
接近し合うようになり、励起と同時にＦＲＥＴを起こす。
はアクセプター分子のいずれかにより標識される。ホスホシヌクレインキット（Ｓ１２９
Ｐ）では、２つの抗体が使用され、一方はアルファシヌクレイン抗体であり、他方はホス
ホシヌクレイン特異的抗体（Ｓ１２９Ｐ）であり、一方の抗体はドナーにより標識され、
他方はアクセプター色素により標識される。抗体（ドナー色素及びアクセプター色素によ
り標識された）がヒトアルファシヌクレイン凝集体に結合すると、それらは互いに非常に
接近し合うようになり、励起と同時にＦＲＥＴを起こす。
【0044】
患者
患者は、Ｂｉｓｐｅｂｊｅｒｇ－Ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｂｅｒｇ Ｈｏｓｐｉｔａｌの神
経内科の外来診療所から募集した。ＰＤについての臨床診断は、ＵＫ Ｐａｒｋｉｎｓｏ
ｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｂｒａｉｎ Ｂａｎｋ臨床診断基準に従って
確定した。患者は継続的に組み入れ、臨床追跡調査をすべての患者について実行した。追
跡調査時に、確実なＰＤ診断についての診断基準を満たす患者のみを試験に受け入れた。
対照群の対象は、中枢神経系を冒している可能性のある疾患はなかった。
患者は、Ｂｉｓｐｅｂｊｅｒｇ－Ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｂｅｒｇ Ｈｏｓｐｉｔａｌの神
経内科の外来診療所から募集した。ＰＤについての臨床診断は、ＵＫ Ｐａｒｋｉｎｓｏ
ｎ’ｓ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｂｒａｉｎ Ｂａｎｋ臨床診断基準に従って
確定した。患者は継続的に組み入れ、臨床追跡調査をすべての患者について実行した。追
跡調査時に、確実なＰＤ診断についての診断基準を満たす患者のみを試験に受け入れた。
対照群の対象は、中枢神経系を冒している可能性のある疾患はなかった。
【0045】
血漿サンプル
静脈血をそれぞれの診療所で採取し、同じ日にＢｉｓｐｅｂｊｅｒｇ Ｍｏｖｅｍｅｎ
ｔ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ Ｂｉｏｂａｎｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、ＤＫで処理した。血
漿サンプルはすべて、組み入れ時に収集した。サンプルは、ＥＤＴＡコーティングポリプ
ロピレンチューブ中に収集し、４℃で１０分間２０００ｘｇで回転させ、次いで血漿上清
を分取し、分析の日まで－８０℃で４００μＬポリプロピレン（ＰＰ）チューブ中で保管
し、分析の日に３０分間氷上で解凍した。
静脈血をそれぞれの診療所で採取し、同じ日にＢｉｓｐｅｂｊｅｒｇ Ｍｏｖｅｍｅｎ
ｔ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ Ｂｉｏｂａｎｋ、Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、ＤＫで処理した。血
漿サンプルはすべて、組み入れ時に収集した。サンプルは、ＥＤＴＡコーティングポリプ
ロピレンチューブ中に収集し、４℃で１０分間２０００ｘｇで回転させ、次いで血漿上清
を分取し、分析の日まで－８０℃で４００μＬポリプロピレン（ＰＰ）チューブ中で保管
し、分析の日に３０分間氷上で解凍した。
【0046】
実施例１
患者由来のサンプル（３×対照及び３×ＰＤ患者）を分析した。サンプルを比較するた
めに、Ｃｉｓｂｉｏの２種類の市販のキット、アルファシヌクレイン凝集キット（キット
＃１）及びホスホシヌクレインキット（キット＃２）を使用した。それぞれのサンプルは
、３つの異なる希釈液においてテストした。サンプルは、キットに備えられたバッファー
中で希釈し、３８６ウェルプレートの中に二通りピペッティングした。抗体混合物をウェ
ルに追加し、ＲＴでインキュベートする。陽性対照及び陰性対照をプレートに含める。
患者由来のサンプル（３×対照及び３×ＰＤ患者）を分析した。サンプルを比較するた
めに、Ｃｉｓｂｉｏの２種類の市販のキット、アルファシヌクレイン凝集キット（キット
＃１）及びホスホシヌクレインキット（キット＃２）を使用した。それぞれのサンプルは
、３つの異なる希釈液においてテストした。サンプルは、キットに備えられたバッファー
中で希釈し、３８６ウェルプレートの中に二通りピペッティングした。抗体混合物をウェ
ルに追加し、ＲＴでインキュベートする。陽性対照及び陰性対照をプレートに含める。
【0047】
測定は、６２０ｎＭ（Ｔｂ－クリプテート－ドナー）放射及び６６５ｎｍ（ｄ２－アク
セプター）放射の両方の同時測定を可能にするＰＨＥＲＡｓｔａｒ ＦＳＸデバイスを使
用して行った。６６５／６２０＊１００００の比率を、各ウェルについて計算する。相対
的エネルギー移動率、デルタＦ ％は、その比率を使用して計算し、タンパクに対して補
正することができる。棒グラフは、キット＃１及びキット＃２の両方を使用して測定した
サンプル（８倍希釈）のそれぞれについてタンパク質に対して補正されたデルタＦ ％を
示す。３人のＰＤ患者と３人の健康対照との間に明らかな差異がある。本実施例は、ＰＤ
患者の血漿において有意に高いレベルの凝集アルファシヌクレイン及びホスホシヌクレイ
ンがあり、この方法が、血液サンプルに基づき、ＰＤの症例を同定し、且つ診断するため
に使用することができることを示す。
セプター）放射の両方の同時測定を可能にするＰＨＥＲＡｓｔａｒ ＦＳＸデバイスを使
用して行った。６６５／６２０＊１００００の比率を、各ウェルについて計算する。相対
的エネルギー移動率、デルタＦ ％は、その比率を使用して計算し、タンパクに対して補
正することができる。棒グラフは、キット＃１及びキット＃２の両方を使用して測定した
サンプル（８倍希釈）のそれぞれについてタンパク質に対して補正されたデルタＦ ％を
示す。３人のＰＤ患者と３人の健康対照との間に明らかな差異がある。本実施例は、ＰＤ
患者の血漿において有意に高いレベルの凝集アルファシヌクレイン及びホスホシヌクレイ
ンがあり、この方法が、血液サンプルに基づき、ＰＤの症例を同定し、且つ診断するため
に使用することができることを示す。
【図1】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-04-19
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象のサンプル中のアルファ－シヌクレインを検出するための方法であって、
ａ）対象からサンプルを得るステップ、
ｂ）前記サンプルを発光アッセイにかけるステップ、及び
ｃ）任意選択で、結果を対照と比較するステップ
を含む方法。
ａ）対象からサンプルを得るステップ、
ｂ）前記サンプルを発光アッセイにかけるステップ、及び
ｃ）任意選択で、結果を対照と比較するステップ
を含む方法。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0047】
測定は、６２０ｎＭ（Ｔｂ－クリプテート－ドナー）放射及び６６５ｎｍ（ｄ２－アクセプター）放射の両方の同時測定を可能にするＰＨＥＲＡｓｔａｒ ＦＳＸデバイスを使用して行った。６６５／６２０＊１００００の比率を、各ウェルについて計算する。相対的エネルギー移動率、デルタＦ ％は、その比率を使用して計算し、タンパクに対して補正することができる。棒グラフは、キット＃１及びキット＃２の両方を使用して測定したサンプル（８倍希釈）のそれぞれについてタンパク質に対して補正されたデルタＦ ％を示す。３人のＰＤ患者と３人の健康対照との間に明らかな差異がある。本実施例は、ＰＤ患者の血漿において有意に高いレベルの凝集アルファシヌクレイン及びホスホシヌクレインがあり、この方法が、血液サンプルに基づき、ＰＤの症例を同定し、且つ診断するために使用することができることを示す。
本発明は以下の態様を含み得る。
［１］
対象のサンプル中のアルファ－シヌクレインを検出するための方法であって、
ａ）対象からサンプルを得るステップ、
ｂ）前記サンプルを発光アッセイにかけるステップ、及び
ｃ）任意選択で、結果を対照と比較するステップ
を含む方法。
［２］
前記サンプルには、血液サンプル、血漿サンプル、又は血清サンプルがある、請求項１に記載の方法。
［３］
前記発光アッセイは、ｐＳ１２９アルファ－シヌクレイン又はアルファ－シヌクレインの１２０～１４０残基内に結合するアルファ－シヌクレイン抗体を使用している、請求項１に記載の方法。
［４］
前記発光アッセイは、ｐＳ１２９アルファ－シヌクレイン又はアルファ－シヌクレインの１２０～１４０残基内の異なるエピトープに結合する２つの異なるアルファ－シヌクレイン抗体を使用している、請求項１に記載の方法。
［５］
使用される一方のフルオロフォアは、使用される他方のフルオロフォア（アクセプター）よりも長い蛍光時間を有する（ドナー）、請求項３又は４に記載の方法。
［６］
前記ドナーのフルオロフォアは、Ｌｕｍｉ４－Ｔｂ（Ｔｂ２＋クリプテート）、ユウロピウムクリプテート（Ｅｕ３＋クリプテート）から選択される、請求項５に記載の方法。［７］
前記アクセプターのフルオロフォアは、ｄ２、ＸＬ６６５、又はフルオレセインから選択される、請求項５に記載の方法。
［８］
前記ドナーと前記アクセプターとの間の近接度は、蛍光を測定することによってエネルギー移動のレベルを検出することによって判断される、請求項１に記載の方法。
［９］
前記方法により、前記サンプル中のアルファ－シヌクレインレベルが、健康な対象由来の対照サンプルよりも高いことが示される場合、前記対象は、アルファ－シヌクレインに対する有効量の抗体で治療される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
［１０］
前記方法は、アルファ－シヌクレイン病を診断する又はモニターするために使用される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
［１１］
前記方法は、アルファ－シヌクレイン病を治療するために使用される医薬の治療応答をモニターするために使用される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
［１２］
前記対象は、ヒトである、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
［１３］
アルファ－シヌクレイン上のエピトープに結合する有効量の抗体を投与することによって、パーキンソン病患者を治療する方法であって、前記患者は、請求項１～９に記載のアッセイによって診断されたことがある又はモニターされる方法。
本発明は以下の態様を含み得る。
［１］
対象のサンプル中のアルファ－シヌクレインを検出するための方法であって、
ａ）対象からサンプルを得るステップ、
ｂ）前記サンプルを発光アッセイにかけるステップ、及び
ｃ）任意選択で、結果を対照と比較するステップ
を含む方法。
［２］
前記サンプルには、血液サンプル、血漿サンプル、又は血清サンプルがある、請求項１に記載の方法。
［３］
前記発光アッセイは、ｐＳ１２９アルファ－シヌクレイン又はアルファ－シヌクレインの１２０～１４０残基内に結合するアルファ－シヌクレイン抗体を使用している、請求項１に記載の方法。
［４］
前記発光アッセイは、ｐＳ１２９アルファ－シヌクレイン又はアルファ－シヌクレインの１２０～１４０残基内の異なるエピトープに結合する２つの異なるアルファ－シヌクレイン抗体を使用している、請求項１に記載の方法。
［５］
使用される一方のフルオロフォアは、使用される他方のフルオロフォア（アクセプター）よりも長い蛍光時間を有する（ドナー）、請求項３又は４に記載の方法。
［６］
前記ドナーのフルオロフォアは、Ｌｕｍｉ４－Ｔｂ（Ｔｂ２＋クリプテート）、ユウロピウムクリプテート（Ｅｕ３＋クリプテート）から選択される、請求項５に記載の方法。［７］
前記アクセプターのフルオロフォアは、ｄ２、ＸＬ６６５、又はフルオレセインから選択される、請求項５に記載の方法。
［８］
前記ドナーと前記アクセプターとの間の近接度は、蛍光を測定することによってエネルギー移動のレベルを検出することによって判断される、請求項１に記載の方法。
［９］
前記方法により、前記サンプル中のアルファ－シヌクレインレベルが、健康な対象由来の対照サンプルよりも高いことが示される場合、前記対象は、アルファ－シヌクレインに対する有効量の抗体で治療される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
［１０］
前記方法は、アルファ－シヌクレイン病を診断する又はモニターするために使用される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
［１１］
前記方法は、アルファ－シヌクレイン病を治療するために使用される医薬の治療応答をモニターするために使用される、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
［１２］
前記対象は、ヒトである、先行請求項のいずれか一項に記載の方法。
［１３］
アルファ－シヌクレイン上のエピトープに結合する有効量の抗体を投与することによって、パーキンソン病患者を治療する方法であって、前記患者は、請求項１～９に記載のアッセイによって診断されたことがある又はモニターされる方法。
【外国語明細書】