特開 2024-96766 繊毛病の治療

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024096766

(43)【公開日】2024-07-17

(54)【発明の名称】繊毛病の治療

(51)【国際特許分類】

   A61K 31/7088 20060101AFI20240709BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240709BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240709BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20240709BHJP

   A61K 33/14 20060101ALI20240709BHJP

   A61K 31/198 20060101ALI20240709BHJP

   A61K 47/18 20170101ALI20240709BHJP

   A61K 47/10 20170101ALI20240709BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20240709BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240709BHJP

【ＦＩ】

A61K31/7088

A61P43/00 ZNA

A61K48/00

A61K38/17

A61K33/14

A61P43/00 121

A61K31/198

A61K47/18

A61K47/10

C12N15/11 Z

C12N5/10

【審査請求】有

【請求項の数】5

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2024060297

(22)【出願日】2024-04-03

(62)【分割の表示】P 2021547511の分割

【原出願日】2020-02-13

(31)【優先権主張番号】19157210.6

(32)【優先日】2019-02-14

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．プルロニック

(71)【出願人】

【識別番号】512024886

【氏名又は名称】エスリス ゲーエムベーハー

【氏名又は名称原語表記】ｅｔｈｒｉｓ ＧｍｂＨ

(74)【代理人】

【識別番号】100147485

【弁理士】

【氏名又は名称】杉村 憲司

(72)【発明者】

【氏名】カルステン ルドルフ

(72)【発明者】

【氏名】ベレナ ムマート

(72)【発明者】

【氏名】レベッカ クービッシュ－ドーメン

(72)【発明者】

【氏名】クリスチャン ドーメン

(72)【発明者】

【氏名】ヨハネス ガイガー

(72)【発明者】

【氏名】マニッシュ アネージャ

(72)【発明者】

【氏名】ルードヴィヒ ウェイス

(72)【発明者】

【氏名】ヘイムート オムラン

(72)【発明者】

【氏名】ペトラ ペネカンプ

(72)【発明者】

【氏名】カイ ウォールゲムート

(72)【発明者】

【氏名】サンドラ シンドリック

(72)【発明者】

【氏名】ニキ トーマス ローゲス

(72)【発明者】

【氏名】ヨハンナ レイド

(72)【発明者】

【氏名】アドリアン テア スティーグ

(57)【要約】      （修正有）

【課題】繊毛病の治療に使用する医薬組成物および毛様体形成に対する効果を分析する方法を提供する。
【解決手段】繊毛病に罹患している対象において繊毛病の治療に使用するためのポリリボヌクレオチドを含む医薬組成物であって、前記ポリリボヌクレオチドは、欠損が繊毛病に関連するタンパク質の機能的バージョンをコードし、かつ、前記医薬組成物の前記対象の呼吸器系への投与は、前記対象が呼吸器系の炎症を示す場合に行われる、医薬組成物を提供する。さらに、本開示は、ポリリボヌクレオチドの毛様体形成に対する効果を分析する方法であって、前記ポリリボヌクレオチドは、毛様体形成に関連するおよび／または必要とされるタンパク質をコードする、方法を提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

繊毛病に罹患している対象において繊毛病の治療に使用するためのポリリボヌクレオチ
ドを含む医薬組成物であって、前記ポリリボヌクレオチドは、欠損が前記繊毛病に関連す
るタンパク質の機能的バージョンをコードし、かつ、前記医薬組成物の前記患者の呼吸器
系への投与は、前記患者が前記呼吸器系の炎症を示す場合に行われる（ｅｆｆｅｃｔｅｄ
）、医薬組成物。

【請求項2】

前記繊毛病が、原発性繊毛機能不全症（ＰＣＤ）である、前出請求項のいずれかに記載
の繊毛病の治療に使用するためのポリリボヌクレオチドを含む医薬組成物。

【請求項3】

前記繊毛病が、コイルドコイルドメイン含有４０（ＣＣＤＣ４０）タンパク質の欠損お
よび／またはコイルドコイルドメイン含有３９（ＣＣＤＣ３９）タンパク質の欠損に関連
する、前出請求項のいずれかに記載の繊毛病の治療に使用するためのポリリボヌクレオチ
ドを含む医薬組成物。

【請求項4】

繊毛病に罹患している対象の呼吸器系の炎症の有無が、血液試料を分析することによっ
て、および／または吐き出された一酸化窒素の量を分析することによって決定される、前
出請求項のいずれかに記載の繊毛病の治療に使用するためのポリリボヌクレオチドを含む
医薬組成物。

【請求項5】

前記医薬組成物の投与が、鼻腔スプレーおよび／またはネブライザーを使用する投与お
よび／または吸入による投与を含む、前出請求項のいずれかに記載の繊毛病の治療に使用
するためのポリリボヌクレオチドを含む医薬組成物。

【請求項6】

前記医薬組成物が、週あたり少なくとも１回および／または少なくとも４週間の間投与
される、前出請求項のいずれかに記載の繊毛病の治療に使用するためのポリリボヌクレオ
チドを含む医薬組成物。

【請求項7】

前記医薬組成物が、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）および／または、塩化ナトリウ
ムを含む高張溶液をさらに含む、前出請求項のいずれかに記載の繊毛病の治療に使用する
ためのポリリボヌクレオチドを含む医薬組成物。

【請求項8】

前記医薬組成物が、ｍｕｌｔｉｃｉｌｉａｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａ
ｎｄ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ（Ｍ
ＣＩＤＡＳ）タンパク質をコードするポリリボヌクレオチドをさらに含み、かつ／または
、前記医薬組成物が、ＭＣＩＤＡＳタンパク質をコードするポリリボヌクレオチドを含む
第２の医薬組成物と一緒に投与される第１の医薬組成物である、前出請求項のいずれかに
記載の繊毛病の治療に使用するためのポリリボヌクレオチドを含む医薬組成物。

【請求項9】

前記医薬組成物が、式（Ｖ）：

【化1】

に示される構造を有するリピドイドをさらに含む、前出請求項のいずれかに記載の繊毛病
の治療に使用するためのポリリボヌクレオチドを含む医薬組成物。

【請求項10】

欠損が繊毛病に関連するタンパク質をコードするポリリボヌクレオチド、およびＮ－ア
セチルシステイン（ＮＡＣ）、塩化ナトリウムを含む高張溶液、ならびに／あるいはＬＦ
９２製剤を含む、医薬組成物。

【請求項11】

ポリリボヌクレオチドの毛様体形成に対する効果を分析する方法であって、前記ポリリ
ボヌクレオチドは、毛様体形成に関連するおよび／または必要とされるタンパク質をコー
ドし、該方法は、以下の工程を含む、方法：
（ａ） 繊毛病を有する対象の鼻ブラシを得る工程であって、該鼻ブラシは、未分化基底
細胞および分化した繊毛細胞を含む、工程、
（ｂ） 未分化基底細胞および脱分化繊毛細胞を得るために、工程（ａ）から得られた細
胞を、水中細胞培養物として培養する工程、
（ｃ） 工程（ｂ）から得られた未分化基底細胞および脱分化繊毛細胞を、気液界面細胞
培養物として培養し、エアリフトを実施する工程、
（ｄ） 工程（ｃ）から得られた細胞を、毛様体形成に関連および／または必要なタンパ
ク質をコードするポリリボヌクレオチドでトランスフェクトする工程、
（ｅ） 分化した繊毛細胞を得るために、工程（ｄ）から得られたトランスフェクトされ
た細胞を培養する工程、および
（ｆ） 前記ポリリボヌクレオチドの毛様体形成に対する効果を、乳酸デヒドロゲナーゼ
測定、ＮｕｃＧｒｅｅｎアッセイ、高速ビデオ顕微鏡法、毛様ビート周波数測定、粘膜毛
様クリアランスアッセイ、および／または免疫蛍光染色を用いて決定する工程。

【請求項12】

前記細胞が、工程（ｃ）において前記エアリフトを実施した後０～４８時間以内にトラ
ンスフェクトされる、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記細胞が、毛様体形成に関連するおよび／または必要とされるタンパク質をコードす
るポリリボヌクレオチドで、式（Ｖ）に示される構造を有するリピドイドを用いてトラン
スフェクトされる、請求項１１または１２に記載の方法。

【請求項14】

前記細胞が、工程（ｂ）～（ｅ）において培地Ｇを用いて培養される、請求項１１～１
３のいずれかに記載の方法。

【請求項15】

前記鼻ブラシが、線維芽細胞をさらに含み、かつ、前記線維芽細胞の増殖が、工程（ｂ
）～（ｅ）において阻害される、請求項１１～１４のいずれかに記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、繊毛病に罹患している対象において繊毛病の治療に使用するためのポリリボ
ヌクレオチドを含む医薬組成物であって、前記ポリリボヌクレオチドは、欠損が前記繊毛
病に関連するタンパク質の機能的バージョンをコードし、かつ、前記医薬組成物の前記対
象の呼吸器系への投与は、前記対象が前記呼吸器系の炎症を示す場合に行われる（ｅｆｆ
ｅｃｔｅｄ）、医薬組成物に関する。本発明はさらに、ポリリボヌクレオチドの毛様体形
成に対する効果を分析する方法であって、前記ポリリボヌクレオチドは、毛様体形成に関
連するおよび／または必要とされるタンパク質をコードする、方法に関する。

【背景技術】

【0002】

酸素は、細胞のエネルギー供給にとってきわめて重要であるため、多くの多細胞生物に
とってきわめて重要である。哺乳動物では、空気中に含まれる酸素が呼吸に関連する器官
を指す呼吸器系を介して生物に入ることができる。これらには、例えば、鼻、喉、喉頭、
気管、気管支、および肺が含まれる。後者において、環境からのガスは内部血液循環系に
含まれるガスと交換され、これは酸素を肺から生物の異なる部分の細胞に輸送する。しか
しながら、必要とされる酸素の他に、汚染物質、病気を引き起こす物質および病原体（例
えば、ウイルスおよび細菌）を含む、空気中に含まれる刺激物質のような他の成分も、呼
吸器系を介して生物に入り得る。したがって、呼吸器系から刺激剤を排出するための咳反
射やくしゃみ等の防御機構が存在する。排出のために、刺激剤は、呼吸器系の上皮細胞に
よって分泌され、その後、繊毛細胞によって上皮表面を横切って輸送される粘稠な粘液中
に埋め込まれる。

【0003】

繊毛細胞は、多動性の運動性繊毛の同期拍動によって、粘液や刺激剤を上皮表面を横切
って輸送することができる。毛様体は膜で囲まれた管状構造であり、上皮表面から、環境
と接触している呼吸器系の空間内に延びている。細胞内では、繊毛の軸糸は固定構造を介
して基底小体に固定されている。軸糸は微小管の中心束で、９本の外側のダブレット微小
管が中心の一対のシングレット微小管（すなわち呼吸繊毛）を取り囲んでいる。外側のダ
ブレット微小管と中心の微小管対は放射状のスポークでつながっている。９本の外側のダ
ブレット微小管はそれぞれＡ管およびＢ管からなり、そのダブレットはネキシン－ダイニ
ン調節複合体によって円周状に結合している。内ダイニン腕と外ダイニン腕はそれぞれの
Ａ管につながっている。これらのダイニンアームは微小管に沿って歩くことができるモー
タンパク質を含み、これは、曲がり、したがって繊毛の拍動をもたらす（例えば、Ｌｏｄ
ｉｓｈ ｅｔ ａｌ， ２０００， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，
４^ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｗ． Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ， Ｓ
ｅｃｔｉｏｎ １９．４を参照）。モデルＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｂｒｕｃｅｉを用い
た毛様体構造の研究は、これらの構造部品のいくつかが急速な代謝回転を示すのに対して
、放射状スポーク、中央対および外側ダイニンアームの骨格成分は発生の間に毛様体構造
の遠位端に主に組み込まれることを示した（Ｖｉｎｃｅｎｓｉｎｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂ
ｉｏｌ Ｃｅｌｌ， ２０１８， １１０：１－１５）。

【0004】

繊毛細胞の同期叩解は、上皮表面を横切る体液の輸送に不可欠であるため、繊毛構造の
乱れは重篤な障害を引き起こす可能性がある。拍動および／または非同期性の減少した振
幅および／または周波数を含む運動性欠損は例えば、ダイニンアームの減少または喪失、
ミスローカライゼーションを含む微小管配置の解体、および軸索あたりの微小管の総数の
変化、ならびにそれらの組合せの結果として生じ得る。既知の限り、これらの機能的軸糸
元素の変化は、根底にある遺伝的欠損によって引き起こされる。これらは主に、上記のも
のを含む軸糸成分をコードする遺伝子の配列の変化によるものである。遺伝子はｍＲＮＡ
のようなポリリボヌクレオチドに転写され、次にタンパク質に翻訳され得るので、遺伝子
のＤＮＡ配列は量および機能性の観点から、それぞれのタンパク質の合成に影響を及ぼす
。繊毛障害、すなわち、塩基配列の変化によって引き起こされる繊毛障害は遺伝するため
、胚または新生児を含むすべての発生段階における繊毛の運動障害と関連していることか
ら、繊毛障害は生体にとって重大な結果をもたらす可能性がある。

【0005】

繊毛障害の周知な例は、肺機能の低下としばしば関連する進行性疾患である原発性繊毛
ジスキネジア（ＰＣＤ）である。このように、周波数の増加に伴い粘液クリアランスを高
めるため、また重症例では肺移植でも、例えば胸部打診や体位ドレナージを含む長期治療
が必要である。さらに、ＰＣＤ患者はしばしば、低妊孕性、水頭症および身体の左右差、
すなわち、左右軸、欠損、ならびに網膜および／または神経学的問題からも、肺および／
または耳における再発性感染症に罹患している。しかし、ほとんどの繊毛病の深刻さにも
かかわらず、ＰＣＤのような繊毛病を扱うための標準化された効果的な戦略は、これまで
のところ存在していない。現在の治療法は例えば、嚢胞性線維症から外挿され、ほとんど
の場合、例えばＰＣＤのような、治療すべき特定の繊毛症について検証されていない。し
たがって、ＰＣＤのような繊毛病を患っている対象を効率的に治療することができるため
の解決策を手元に有する必要がある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本出願は、特許請求の範囲に記載の実施形態を提供することによって、ＰＣＤ等の繊毛
病に罹患している対象における繊毛機能を回復させる必要性に対処する。

【課題を解決するための手段】

【0007】

特に、本発明は、繊毛病に罹患している対象において繊毛病の治療に使用するためのポ
リリボヌクレオチドを含む医薬組成物であって、前記ポリリボヌクレオチドは、欠損が前
記繊毛病に関連するタンパク質の機能的バージョンをコードし、かつ、前記医薬組成物の
前記対象の呼吸器系への投与は、前記対象が前記呼吸器系の炎症を示す場合に行われる（
ｅｆｆｅｃｔｅｄ）、医薬組成物に関する。

【図面の簡単な説明】

【0008】

【図1】図１：ＣＣＤＣ４０ ｍＲＮＡの翻訳効率。２／１．４／０．３／０．２／０．０５ｘ１０＾６ ＨＥＫ２９３細胞を６ウェルプレートに播種した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いて、種苗細胞を、異なるＣＣＤＣ４０構築物（ＥＴＨ０３１Ｔ０６－Ｔ１０、２．５μｇ／９．５ｃｍ²）で２４時間トランスフェクトした。トランスフェクションの６、２４、４８、７２および１４４時間後に細胞溶解を行った。５０μｇの総タンパク質溶解物をＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットで分析した。ＣＣＤＣ４０はＡｔｌａｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ由来の抗ＣＣＤＣ４０抗体（ＨＰＡ０２２９７４）（１：２０００）を用いて検出され、ＧＡＰＤＨはローディング対照としての役割を担った。ＧＦＰは、トランスフェクションコントロールとしての役割を担った。

【図2】図２：ＢＥＡＳ－２Ｂ、ＲＰＭＩ２６５０、およびＨＥＫ２９３細胞におけるＣＣＤＣ４０ ｍＲＮＡ構築物の翻訳効率：２ｘ１０＾６ ＨＥＫ２９３、７．５ｘ１０＾５ ＢＥＡＳ－２Ｂ、および５ｘ１０＾５ ＲＰＭＩ ２６５０細胞を６ウェルプレートに播種した。播種の２４時間後、細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用して、異なるＣＣＤＣ４０構築物（２．５μｇ／９．５ｃｍ²）でトランスフェクトした。トランスフェクションの６時間後に細胞溶解を行った。タンパク質溶解物をＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット（ＨＥＫ２９３：５０μｇ、ＲＰＭＩ ２６５０：２０μｇ、ＢＥＡＳ－２Ｂ：総溶解物３０μｇ）で分析し、Ａｔｌａｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（１：２０００）からの抗ＣＣＤＣ４０抗体（ＨＰＡ０２２９７４）を用いてＣＣＤＣ４０を検出した。

【図3】図３：ＬＦ９２／ＣＣＤＣ４０トランスフェクション後の高速ビデオ顕微鏡（ＨＳＶＭ）結果。患者由来のＡＬＩ培養物を、３μｇのＬＦ９２／ＣＣＤＣ４０で１日おきにトランスフェクトした。トランスフェクションの前およびトランスフェクションの２４時間後ごとに、ビデオ（インサートあたり２０）を採取し、ＳＡＶＡ（Ｓｉｓｓｏｎ－Ａｍｍｏｎｓビデオ分析）ソフトウェアを用いてＣＦＢ（毛様拍動頻度）を計算した。１６個全部のトランスフェクション（１ヶ月）を行った。測定は、４０倍のマグニフィケーションを用いて３７℃で行った。毛様体拍動周波数測定値の平均値を計算する（全磁場解析、ＷＦＡ）。

【図4】図４：粘膜繊毛クリアランス（ＭＣＣ）は、Ｚ－投影およびポーラーグラフとして示される。ＣＣＤＣ４０患者ＡＬＩ培養物を、３μｇ／インサートの濃度のＣＣＤＣ４０ ｍＲＮＡ／ＬＦ９２で、エアリフトで１８日間トランスフェクトした。ＡＬＩ培養物を、実験の間、培地Ｇ中で維持した。トランスフェクション（ＴＦ）を週１回、４週間実施した（＝４ｘＴＦ）。粘膜繊毛クリアランス（ＭＣＣ）を、０．５μｍ蛍光ビーズを用いて２０倍の倍率で測定した。異なる領域の３０のビデオを撮影し、最後のＴＦの１週間後にニコンからのポーラーグラフソフトウェアで分析した。１つの例示的な写真が示されている。

【図5】図５：健常（右下）制御のｔｄＴｏｍａｔｏおよびポーラーグラフについて、Ｚ投影（左上）およびポーラーグラフ（右上）として示される粘膜繊毛クリアランス（ＭＣＣ）。上段：ＡＬＩ培養においてＣＣＤＣ４０変異を有する患者からの細胞を、エアリフトの１８日後に、３μｇ／インサートの濃度でｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＲＮＡ／ＬＦ１１１でトランスフェクトした。ＡＬＩ培養物を、実験の間、培地Ｇ中で維持した。トランスフェクション（ＴＦ）を週１回、４週間実施した（＝４ｘＴＦ）。粘膜繊毛クリアランス（ＭＣＣ）を、０．５μｍ蛍光ビーズを用いて３０倍の倍率で測定した。異なる領域の２０のビデオを撮影し、最後のＴＦの１週間後にニコンからのポーラーグラフソフトウェアで分析した。１つの例示的なビデオが示された。右下：健康なＷＴ ＡＬＩ培養物の粒子追跡。ＭＣＣは、０．５μｍの蛍光ビーズを用いて２０倍の倍率で測定した。異なる領域の２０のビデオを撮影し、最後のＴＦの１週間後にニコンからのポーラーグラフソフトウェアで分析した。１つの例示的な画像および２つの分析されたＲＯＩが示されている。

【図6】図６：ＡＬＩ培養におけるＣＣＤＣ４０変異を有する患者由来の細胞を、空気リフト時に１８ｄの３μｇ／挿入物の用量でｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＲＮＡ／ＬＦ１１１またはＣＣＤＣ４０ ｍＲＮＡ／ＬＦ９２のいずれかでトランスフェクトした。ＡＬＩ培養物を、実験の間、培地Ｇ中で維持した。トランスフェクション（ＴＦ）を週１回、４週間実施した（＝４ｘＴＦ）。対照として、健康な鼻ブラシからのＷＴ ＡＬＩを使用した。ＣＣＤＣ４０ ｍＲＮＡおよびｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＲＮＡで処理したＡＬＩ膜を２０μｍで切断し、抗ＧＡＳ８（赤色）、抗アセチル化チューブリン（緑色）およびＤＡＰＩ（青色）で染色した。共焦点顕微鏡で写真を撮った。１つの例示的な画像が示されている。スケールバーは１０μｍを表す。

【図7】図７：ＡＬＩ培養物中のＣＣＤＣ４０変異を有する患者由来の細胞を、３μｇ／挿入物の用量でｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＲＮＡ／ＬＦ１１１またはＣＣＤＣ４０ ｍＲＮＡ／ＬＦ９２のいずれかでトランスフェクトし、空気リフト時に１８ｄトランスフェクトした。ＡＬＩ培養物を、実験の間、培地Ｇ中で維持した。トランスフェクション（ＴＦ）を週１回、４週間実施した（＝４ｘＴＦ）。対照として、健常対照からのＡＬＩを使用した。ＣＣＤＣ４０ ｍＲＮＡおよびｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＲＮＡで処理したＡＬＩ膜を２０μｍで切断し、防ＤＮＡＬＩ１（赤色）、防アセチル化チューブリン（緑色）およびＤＡＰＩ（青色）で染色した。共焦点顕微鏡で写真を撮った。１つの例示的な画像が示されている。スケールバーは１０μｍを表す。

【図8】図８：ＡＬＩ培養におけるＣＣＤＣ４０変異を有する患者由来の細胞を、空気リフト時に１８ｄの３μｇ／挿入物の用量でｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＲＮＡ／ＬＦ１１１またはＣＣＤＣ４０ ｍＲＮＡ／ＬＦ９２のいずれかでトランスフェクトした。ＡＬＩ培養物を、実験の間、培地Ｇ中で維持した。トランスフェクション（ＴＦ）を週１回、４週間実施した（＝４ｘＴＦ）。対照として、健常対照からのＡＬＩを使用した。ＣＣＤＣ４０ ｍＲＮＡおよびｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＲＮＡで処理したＡＬＩ膜を２０μｍで切断し、抗ＣＣＤＣ３９（１：２００、赤）、抗アセチル化チューブリン（１：１０．０００、緑）およびＤＡＰＩ（青）で染色した。共焦点顕微鏡で写真を撮った。１つの例示的な画像が示されている。拡大率４０倍。

【図9】図９：ＨＥＫ－２９３およびＢＥＡＳ－２ＢにおけるＣＣＤＣ３９タンパク質（１１０ｋＤａ）発現、トランスフェクション後６時間および２４時間。１．４ｘ１０＾５ ＨＥＫ－２９３細胞および３．５ｘ１０＾５ ＢＥＡＳ－２Ｂ細胞を６つのウェルプレートでシードし、ＣＣＤＣ３９－ＲＮＡ（ＥＴＨ０４７Ｔ０２、ミニマル５’ＵＴＲ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ；比１：１．５）でトランスフェクトした。６時間および２４時間後、細胞をＭ－ＰＥＲおよびＴｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００緩衝液で溶解した。５０ μｇのタンパク質溶解物をウェスタンブロット分析に使用した。対照として、非トランスフェクト（ＵＴ）およびＥＧＦＰトランスフェクト細胞の溶解物を使用した。高用量＝０．５μｇ／ｃｍ^２、低用量＝０．２５μｇ／ｃｍ^２。

【図10】図１０：未処理ＡＬＩ培養物におけるＣＣＤＣ３９タンパク質（１１０ｋＤａ）式。２つの挿入を、軸索抽出プロトコールを使用して抽出した。３０、１０および５μＬのタンパク質溶解物をウェスタンブロット分析に使用した。Ａｃｔｉｖｅ Ａｒｅａ： Ｉｎｓｅｒｔ ３９．９ ＝ ７１．２５％、Ｉｎｓｅｒｔ ４１．２ ＝ ５９．８８％

【図11】図１１：プロテアソーム阻害剤処理後の１６ＨＢＥ１４におけるＣＣＤＣ３９タンパク質（１１０ｋＤａ）式。６．０ｘ１０＾５×１６ＨＢＥ１４ｏｃｅｌｌを６ウェルプレートに播種し、ＣＣＤＣ３９－ＲＮＡ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ；比 １：１．５）をトランスフェクトした。６時間後、細胞をＭ－ＰＥＲ緩衝液で溶解した。２０ μｇのタンパク質溶解物をウェスタンブロット分析に使用した。対照として、非トランスフェクト（ＵＴ）およびＥＧＦＰトランスフェクト細胞の溶解物を使用した。高用量＝０．５μｇ／ｃｍ^２、低用量＝０．２５μｇ／ｃｍ^２。ＲＮＡ：ＥＴＨ０４７Ｔ０２：ミニマル５’ＵＴＲ、ＥＴＨ０４７Ｔ０３：ＴＩＳＵ、ＥＴＨ０４７Ｔ０４：ＣＹＢＡ、ＥＴＨ０４７Ｔ０５：ＳＰ３０。

【図12】図１２：プロテアソーム阻害剤での１６ＨＢＥ１４ｏａｆｔｅｒ処理におけるＣＣＤＣ３９タンパク質（１１０ｋＤａ）式。６．０ｘ１０＾５ １６ＨＢＥ１４ｏｃｅｌｌを６ウェルプレートにシードし、ＣＣＤＣ３９－ＲＮＡ（ＥＴＨ０４７Ｔ０３、ＴＩＳＵ ５’ＵＴＲ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ Ｍａｘ；比１：１．５）でトランスフェクトした。２４時間後、細胞をＭ－ＰＥＲ緩衝液で溶解した。２０μｇのタンパク質溶解物をウェスタンブロット分析に使用した。対照として、非トランスフェクト（ＵＴ）およびＥＧＦＰトランスフェクト細胞の溶解物を使用した。高用量＝０．５μｇ／ｃｍ^２、低用量＝０．２５μｇ／ｃｍ^２。

【発明を実施するための形態】

【0009】

本発明は細胞（繊毛のタンパク質複合体の特定のタンパク質に欠損を示し、その欠損が
適正繊毛機能の喪失をもたらす）を、前記タンパク質の機能的バージョンをコードするポ
リリボヌクレオチドでトランスフェクトすることによって、適正繊毛機能を実際に回復さ
せることが可能であるという知見に基づく。しかし、この効果を得るためには、繊毛細胞
を分化の初期段階でトランスフェクトしなければならないこともわかった。このことは、
繊毛を担う上皮細胞の前駆細胞、すなわち基底細胞は上皮内のより深く下方に位置し、表
面に露出していないため、気道系を介したトランスフェクションのためにアクセスできな
いため、実用上の問題につながる。本発明によれば、ポリリボヌクレオチドの投与による
上皮細胞のトランスフェクションは、繊毛病を患う対象が呼吸器系の炎症を示す場合に行
われる。呼吸器系の炎症の間、気道上皮は繊毛細胞の前駆細胞、すなわち繊毛形成をまだ
開始していない基底細胞を接近できるようにする病変および傷を示す。それぞれのタンパ
ク質の機能的バージョンを発現する上記のようなポリリボヌクレオチドでこれらの細胞を
トランスフェクトすることは、これらの細胞を、それぞれの症状の実質的な軽減を導き得
る機能的繊毛または少なくとも部分的に機能的繊毛を形成する細胞にすることを可能にす
る。

【0010】

本発明の文脈において、用語「繊毛病」は、繊毛細胞の欠損に関連するおよび／または
それによって特徴付けられる疾患をいう。このように、毛様症は、毛様固定構造、毛様構
造が細胞内に固定されている基底小体、および／または毛様機能を含む、毛様構造の障害
を含む。繊毛病の例には、ＰＣＤ、Ｂａｒｄｅｔ－Ｂｉｅｄｌ症候群、Ｓｉｍｐｓｏｎ－
Ｇｏｌａｂｉ－Ｂｅｈｍｅｌ症候群（２型）、ｌｅｂｅｒ先天性黒内障、ネフロン癆、頭
蓋外胚葉形成異常症（Ｓｅｎｓｅｎｂｒｅｎｎｅｒ）が含まれる（例えば、Ｍｉｔｃｈｉ
ｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１７， Ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ Ｐａｔｈｏｌ
ｏｇｙ，４１（６）：４１５－４２７を参照）。

【0011】

本明細書中で使用される用語「繊毛病」は、対象のＤＮＡにおける遺伝的欠損、例えば
、染色体またはミトコンドリアＤＮＡによって引き起こされる繊毛病を指す。このような
遺伝的欠損は、変異によって引き起こされ得、配列部分の喪失、付加または交換を含み得
る。例は、コピー数変異、有無変異、欠損（全部または部分的）、挿入、ミスセンス変異
、ナンセンス変異、スプライス部位変異、またはそれらの組合せである。ＤＮＡにおける
このような変化は、コードされたタンパク質の利用可能性の変化（例えば、タンパク質の
損失または量の低下）、または改変された機能を有するタンパク質をもたらし得る。

【0012】

好ましい実施形態では「繊毛病」という用語が運動性繊毛運動障害（ＰＣＤ）に関連す
る疾患を意味する。ＰＣＤが運動性繊毛の機能不全によって引き起こされるまれな疾患で
ある。ＰＣＤが遺伝的、機能的および超微細構造レベルでは不均一である。ＰＣＤに罹患
している対象は再発性の鼻閉、副鼻腔感染、耳感染、全逆位および異所性等の不妊症、な
らびに／または水頭症を示す。分子レベルではＰＣＤがほとんどの場合、呼吸器系の繊毛
の構造、機能、および生合成の異常と関連している。そのような異常の例はダイニンアー
ムの欠如または短縮、複合体、放射状スポークまたはネキシンリンクである。このような
異常、したがって、ＰＣＤに関連する毛様体運動性の欠損はそれぞれの構成要素をコード
する遺伝子の変異によって、特に、グループ「Ａ」および「Ａ」に列挙される遺伝子の変
異によって引き起こされる「Ｂ」は、それぞれＰＣＤ症例の少なくとも１％および１％未
満を占めると推定される病原性変異を有する遺伝子を指す（Ｚａｒｉｗａｌａ ｅｔ ａ
ｌ．， ＧｅｎｅＲｅｖｉｅｗｓ（登録商標） ， ２００７， ｕｐｄａｔｅｄ ２０
１５， Ｐｒｉｍａｒｙ Ｃｉｌｉａｒｙ Ｄｙｓｋｉｎｅｓｉａ， ｅｄｉｔｏｒｓ
Ａｄａｍ ｅｔ ａｌ．， Ｓｅａｔｔｌｅ （ＷＡ）： Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ
Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ， Ｓｅａｔｔｌｅ； １９９３－２０１８を参照）。

【0013】

したがって、本発明による医薬組成物に含まれるポリリボヌクレオチドは、好ましくは
表１に列挙されるタンパク質の機能的バージョンに翻訳され得るポリリボヌクレオチドで
ある。

【0014】

より好ましくは、本発明の医薬組成物に含まれるポリリボヌクレオチドは、ＤＮＡＨ５
、ＤＮＡＨ１１、ＣＣＤＣ３９、ＤＮＡＩ１、ＣＣＤＣ４０、ＣＣＤＣ１０３、ＳＰＡＧ
１、ＺＭＹＮＤ１０、ＡＲＭＣ４、ＣＣＤＣ１５１、ＤＮＡＩ２、ＲＳＰＨ１、ＣＣＤＣ
１１４、ＲＳＰＨ４Ａ、ＤＮＡＡＦ１（ＬＲＣ５０）、ＤＮＡＡＦ２（ＫＴＵ）、および
ＬＲＲＣ６からなる群より選択されるタンパク質の機能的バージョンに翻訳され得るｍＲ
ＮＡである。

【0015】

【表1】

【0016】

本開示の前記のまたは他の態様および実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、
ポリリボヌクレオチドまたは修飾ポリリボヌクレオチドは、配列番号１または５～１１の
１つ以上（例えば、配列番号１または５～１１に記載の配列）と少なくとも８５％、少な
くとも９０％、少なくとも９２％または少なくとも９５％同一（例えば、少なくとも９５
、９６、９７、９８、９９または１００％同一）である一次配列を含む。いくつかの実施
形態では、ポリリボヌクレオチドは、本明細書に記載の任意のそのようなレベルおよび／
またはタイプから選択される修飾のレベルおよび／またはタイプを有する修飾ポリリボヌ
クレオチドである。特定の実施形態において、ポリリボヌクレオチドのパーセント同一性
は、配列番号１または５～１１のＣＣＤＣ４０コード配列部分に関してのみ測定される（
例えば、パーセント同一性を計算する場合、ＵＴＲ、他の非コード配列およびＧＦＰまた
はエピトープタグは考慮されない）。前記のいずれかの特定の実施形態において、このよ
うなポリリボヌクレオチド（または修飾ポリリボヌクレオチド）は、機能的ＣＣＤＣ４０
タンパク質をコードする。

【0017】

本開示の前記のまたは他の態様および実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、
ポリリボヌクレオチドまたは修飾ポリリボヌクレオチドが配列番号２または１２～１４の
１つ以上（例えば、配列番号２または１２～１４に記載の配列）と少なくとも８５％、少
なくとも９０％、少なくとも９２％、または少なくとも９５％同一（例えば、少なくとも
９５、９６、９７、９８、９９または１００％同一）である一次配列を含む。いくつかの
実施形態では、ポリリボヌクレオチドが本明細書に記載の任意のそのようなレベルおよび
／またはタイプから選択される修飾のレベルおよび／またはタイプを有する修飾ポリリボ
ヌクレオチドである。特定の実施形態において、ポリリボヌクレオチドのパーセント同一
性は配列番号２または１２～１４のＣＣＤＣ３９コード配列部分に関してのみ測定される
（例えば、パーセント同一性を計算する場合、ＵＴＲ、他の非コード配列およびＧＦＰタ
グまたはエピトープタグは考慮されない）。前記のいずれかの特定の実施形態において、
このようなポリリボヌクレオチド（または修飾ポリリボヌクレオチド）は、機能的ＣＣＤ
Ｃ３９タンパク質をコードする。

【0018】

本開示の上記または他の態様および実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、ポ
リリボヌクレオチドまたは修飾ポリリボヌクレオチドが配列番号４（例えば、配列番号４
に示される配列に対して）と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、
または少なくとも９５％同一（例えば、少なくとも９５、９６、９７、９８、９９または
１００％同一）である一次配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチド
が本明細書に記載の任意のそのようなレベルおよび／またはタイプから選択される修飾の
レベルおよび／またはタイプを有する修飾ポリリボヌクレオチドである。特定の実施形態
において、ポリリボヌクレオチドのパーセント同一性は配列番号４のＭＣＩＤＡＳコード
配列部分に関してのみ測定される（例えば、パーセント同一性を計算する場合、ＵＴＲ、
他の非コード配列およびＧＦＰまたはエピトープタグは考慮されない）。前記のいずれか
の特定の実施形態では、そのようなポリリボヌクレオチド（または修飾ポリリボヌクレオ
チド）が機能性ＭＣＩＤＡＳタンパク質をコードする。

【0019】

特定の実施形態では、本開示が前記のポリリボヌクレオチドのいずれかを含む医薬組成
物を提供する。さらに、任意のこのようなポリリボヌクレオチド（または医薬組成物）は
、本明細書中に記載される任意の方法において使用され得る。

【0020】

繊毛病の治療に使用するためのポリリボヌクレオチドを含む医薬組成物の一実施形態で
は、前記繊毛病は、コイルドコイルドメイン含有４０（ＣＣＤＣ４０；ヒトｍＲＮＡおよ
びタンパク質ＣＣＤＣ４０配列についてはそれぞれ、例えば、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０
１７９５０．４およびＮＰ＿０６０４２０．２を参照）タンパク質の欠損、またはコイル
ドコイルドメイン含有３９（ＣＣＤＣ３９；ヒトｍＲＮＡおよびタンパク質ＣＣＤＣ３９
配列についてはそれぞれ、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿１８１４２６．２およびＮＰ＿８５２
０９１．１を参照）タンパク質の欠損に関連する。

【0021】

ＣＣＤＣ４０およびＣＣＤＣ３９は、放射状スポークとＡ管との間に位置する錯体を構
築する。ＣＣＤＣ４０またはＣＣＤＣ３９タンパク質の欠損版は、ＣＣＤＣ４０遺伝子、
または挿入、欠損、ナンセンスおよびスプライス部位変異等のＣＣＤＣ３９遺伝子の変異
によって引き起こされ得る。特に、ＣＣＤＣ４０タンパク質をコードするＤＮＡ配列中の
位置２４８の欠損および位置２８２４から２８２５の間のＴＧＴ挿入は、かなり高頻度で
あると思われる。ＣＣＤＣ４０またはＣＣＤＣ３９の欠損版は軸索の構造における欠損（
例えば、中央対の欠如または偏心、異常な放射状スポークおよびネキシン連結、ダイニン
調節複合体の異常なアセンブリ、および／または内側ダイニンアームの低下）を生じる。
したがって、本発明による医薬組成物に含まれるポリリボヌクレオチドは、好ましくはＣ
ＣＤＣ４０および／またはＣＣＤＣ３９の機能的バージョンに翻訳され得るｍＲＮＡであ
る。毛様体形成に関連するタンパク質、ならびに繊毛病に関連する遺伝子および分子経路
に関するさらなる情報は、例えば、Ｒｅｉｔｅｒ ａｎｄ Ｌｅｒｏｕｘの総説論文（Ｒ
ｅｉｔｅｒ ａｎｄ Ｌｅｒｏｕｘ， ２０１７， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ
Ｂｉｏｌ，１８（９）：５３３－５４７）に見出すことができる。

【0022】

本発明の医薬組成物は、繊毛病に罹患している対象に投与される。本明細書中、繊毛病
を患う対象は、患者と呼ばれることもある。患者は、気道における粘液およびバクテリア
の貯留をもたらす異常な毛様構造および／または機能、および／または生合成の欠損を示
すことがある。所与の対象についての繊毛病の診断は、例えば、Ｇｏｕｔａｋｉ ｅｔ
ａｌ． （Ｇｏｕｔａｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１６， Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ，
４８（４）：１０８１－１０９５）でも概説されているように、例えば、前記対象の生
検の臨床所見、分子分析および／または毛様超構造分析に基づいてもよい。

【0023】

本発明の文脈において、「ポリリボヌクレオチド」という用語はアデノシン、グアノシ
ン、シチジン、および／またはウリジン残基（修飾または非修飾形成、以下参照）から構
築された一本鎖配列を指す。本明細書において、「タンパク質をコードするポリリボヌク
レオチド」という用語はタンパク質をコードするコード領域を含むポリリボヌクレオチド
、すなわち、アミノ酸配列に翻訳することができるポリリボヌクレオチドを指す。したが
って、本発明の文脈において、「タンパク質をコードするポリリボヌクレオチド」という
用語は好ましくはｍＲＮＡを指し、ｍＲＮＡは細胞に入った場合、タンパク質の発現に適
しているか、またはタンパク質に翻訳可能である任意のポリリボヌクレオチド分子を意味
すると理解されるべきである。

【0024】

本明細書において、「タンパク質」という用語は、任意の種類のアミノ酸配列、すなわ
ち、それぞれペプチド結合を介して連結された２つ以上のアミノ酸の鎖を包含する。この
文脈において使用される「タンパク質」という用語は対象となる任意のアミノ酸配列を指
す。好ましくはコードされるアミノ酸配列が少なくとも５アミノ酸長、より好ましくは少
なくとも１０アミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも５０、１００、２００または５
００アミノ酸である。したがって、「タンパク質」という用語は短いペプチドおよびポリ
ペプチドを包含する。コードされるタンパク質の機能に関して、タンパク質の欠損変形例
が繊毛病に関連することを除いて、限定はない。本明細書において、「関連する」という
用語は「原因となる」、「関連する」および／または「増強する」という用語を包含する
ことを意図する。

【0025】

本明細書において、用語「その欠損を有するタンパク質」は、「欠損タンパク質」また
は「タンパク質の欠損バージョン」を指し、したがって、前記タンパク質の機能版と比較
して機能が変化したタンパク質の版を指す。しかし、この用語はまた、合成の完全なまた
は部分的な欠如、したがって、細胞における利用可能性を有する、該タンパク質のバージ
ョンを包含し得る。いずれの場合も、タンパク質バージョンの欠損は、タンパク質の天然
の機能を満たすことができない前記タンパク質のバージョンをもたらす。

【0026】

その天然の機能を満たすタンパク質のバージョンは、本明細書において「機能的タンパ
ク質」または「タンパク質の機能的バージョン」と呼ばれ、それぞれの欠損タンパク質と
同じＤＮＡ配列によってコードされるが、欠損がＤＮＡ配列の変化を引き起こすことなく
、したがってＤＮＡ配列の変異がない。

【0027】

したがって、本発明の文脈において、「機能性タンパク質」は、好ましくはＡ－チュー
ブルス、Ｂ－チューブルス、またはネキシン－ダイニン調節複合体、または放射状スポー
ク、内側ダイニンアーム、および／または外側ダイニンアームの構成単位である。

【0028】

したがって、用語「ポリリボヌクレオチドはその欠損が前記繊毛病に関連するタンパク
質の機能的バージョンをコードする」とは好ましくは繊毛軸索、軸索係留構造または基底
体の構造的構成に関連し、その本来の機能を果たす機能的タンパク質をコードするｍＲＮ
Ａを指す。したがって、本発明によるポリリボヌクレオチドは好ましくは機能性タンパク
質をコードするｍＲＮＡを指し、その存在は、繊毛病に罹患している対象の細胞において
、細胞のＤＮＡ配列によってコードされる前記タンパク質の欠損に関連する前記繊毛病の
発現を中和または予防するか、または関連する症状を軽減するために必要であるか、また
は有益である。

【0029】

さらに、本発明にしたがって使用されるポリリボヌクレオチドはまた、さらなる機能的
領域および／または３’もしくは５’ノンコーディング領域を含み得る。３’および／ま
たは５’ノンコーディング領域は、コードされたタンパク質に天然に隣接する配列、また
は前記ポリリボヌクレオチドの安定化および／または調節に寄与する人工配列であり得る
。適切な配列は、日常的な実験によって同定および調査され得る。さらに、前記ポリリボ
ヌクレオチドはさらなる機能領域を有することもでき、例えば、タンパク質をコードする
配列を含む所望のポリリボヌクレオチドの活性を、例えば、特定の細胞または細胞型およ
び／または発生段階または特定の時間枠に関して、空間的および時間的に制御するために
、マイクロＲＮＡの調節エレメントおよび標的配列と組み合わせることができる。

【0030】

本発明にしたがって使用されるポリリボヌクレオチドは、使用される天然配列に由来す
る部分的または完全なコドン最適化配列を含み得る。コドン最適化はいくつかの場合にお
いて、所定のアミノ酸についていくつかの種によって優先的に使用されるコドンが存在す
るように、それぞれのポリリボヌクレオチドの翻訳効率を増加させることによって、タン
パク質発現を最大化するために適用される技術をいう。さらに、前記ポリリボヌクレオチ
ドは、作用の持続時間を調節および／または延長するためのさらなる修飾を含んでもよい
。前記ポリリボヌクレオチドはまた、ｍ７ＧｐｐｐＧキャップ、内部リボソーム侵入部位
（ＩＲＥＳ）、および／または３’末端のポリＡテール、および／または翻訳を促進する
ためのさらなる配列を含み得る。

【0031】

本発明のいくつかの実施形態において、本発明に従って使用されるポリリボヌクレオチ
ドは、未修飾および修飾ヌクレオチドを含有し得る。本明細書で使用される用語「非修飾
ヌクレオチド」はＡ、Ｃ、ＧおよびＵヌクレオチドを指す。本明細書で使用される用語「
修飾ヌクレオチド」はＡ、Ｃ、ＧおよびＵヌクレオチドの任意の天然に存在するまたは天
然に存在しない異性体、ならびに任意の天然に存在するまたは天然に存在するアナログ、
例えば化学修飾または置換残基を有するその代替または修飾ヌクレオチドまたは異性体を
指す。修飾ヌクレオチドは、塩基修飾および／または糖修飾を有することができる。修飾
ヌクレオチドはまた、例えば、ｍＲＮＡ分子の５プライムキャップに関して、リン酸基修
飾を有することができる。修飾ヌクレオチドには、ヌクレオチドの共有結合修飾によって
転写後に合成されるヌクレオチドも含まれる。さらに、修飾されていないヌクレオチドと
修飾されたヌクレオチドとの任意の適切な混合物が可能である。修飾ヌクレオチドの無限
数の例は、文献（例えば、Ｃａｎｔａｒａ ｅｔ ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ， ２０１１， ３９（Ｉｓｓｕｅ ｓｕｐｐｌ＿１）：Ｄ１９５－Ｄ２０１
； Ｈｅｌｍ ａｎｄ Ａｌｆｏｎｚｏ， Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ， ２０１４， ２１（
２）：１７４－１８５； Ｃａｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎ
ｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ， ２０１２， ５１（２９）：７１１０－３１）に見出すことがで
き、いくつかの好ましい修飾ヌクレオチドが、それらのそれぞれのヌクレオシド残基に基
づいて例示的に言及されている：
１－メチルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデ
ノシン、２－メチルアデノシン、２’－Ｏ－リボシルホスフェートアデノシン、Ｎ６－メ
チル－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－アセチルアデノシン、Ｎ６－グ
リシニルカルバモイルアデノシン、
Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６－スレオニルカルバモ
イルアデノシン、
Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシ
ン、Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン、１，２’－Ｏ－ジメチルアデ
ノシン、Ｎ６，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン、２’－Ｏ－メチルアデノシン、Ｎ６，Ｎ
６，２’－Ｏ－トリメチルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソ
ペンテニル）アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－メチルアデノシン、
２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニル
カルバモイルアデノシン、Ｎ６－２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノ
シン、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、７－メ
チルアデノシン、２－メチルチオ－アデノシン、２－メトキシ－アデノシン、２’－アミ
ノ－２’－デオキシアデノシン、２’－アジド－２’－デオキシアデノシン、２’－フル
オロ－２’－デオキシアデノシン、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、７－デ
アザ－アデノシン、７－デアザ－８－アザ－アデノシン、７－デアザ－２－アミノプリン
、７－デアザ－８－アザ－２－アミノプリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７
－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン；２－チオシチジン、３－メチルシチジン
、Ｎ４－アセチルシチジン、５－ホルミルシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、
５－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－ヒドロキシシチジン、リシジ
ン、Ｎ４－アセチル－２’－Ｏ－メチルシチジン、５－ホルミル－２’－Ｏ－メチルシチ
ジン、５，２’－Ｏ－ジメチルシチジン、２－Ｏ－メチルシチジン、Ｎ４，２’－Ｏ－ジ
メチルシチジン、Ｎ４，Ｎ４，２’－Ｏ－トリメチルシチジン、イソシチジン、
シュードシチジン、シュードイソシチジン、２－チオ－シチジン、２’－メチル－２’－
デオキシシチジン、２’－アミノ－２’－デオキシシチジン、２’－フルオロ－２’－デ
オキシシチジン、５－ヨードシチジン、５－ブロモシチジン、
２’－アジド－２’－デオキシシチジン、２’－アミノ－２’－デオキシシチジン、２’
－フルオロ－２’－デオキシシチジン、５－アザ－シチジン、３－メチル－シチジン、１
－メチル－シュードイソシチジン、ピロロ－シチジン、ピロロ－シュードイソシチジン、
２－チオ－５－メチル－シチジン、４－チオ－シュードイソシチジン、４－チオ－ｌ－メ
チル－シュードイソシチジン、４－チオ－ｌ－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジ
ン、１－メチル－ｌ－デアザ－シュードイソシチジン、２－メトキシ－シチジン、２－メ
トキシ－５－メチル－シチジン、４－メトキシ－シュードイソシチジン、４－メトキシ－
ｌ－メチル－シュードイソシチジン、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－
ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン；１－メチルグア
ノシン、Ｎ２，７－ジメチルグアノシン、Ｎ２－メチルグアノシン、２’－Ｏ－リボシル
ホスフェートグアノシン、７－メチルグアノシン、ヒドロキシウィブトシン、７－アミノ
メチル－７－デアザグアノシン、７－シアノ－７－デアザグアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメ
チルグアノシン、Ｎ２，７，２’－Ｏ－トリメチルグアノシン、Ｎ２，２’－Ｏ－ジメチ
ルグアノシン、１，２’－Ｏ－ジメチルグアノシン、２’－Ｏ－メチルグアノシン、Ｎ２
，Ｎ２，２’－Ｏ－トリメチルグアノシン、
Ｎ２，Ｎ２Ｊ－トリメチルグアノシン、イソグアノシン、４－デメチルワイオシン、エポ
キシクエウオシン、
未修飾（ｕｎｄｅｒｍｏｄｉｆｉｅｄ）ヒドロキシウィブトシン、メチル化未修飾ヒドロ
キシウィブトシン、
イソウィオシン、ペルオキシウィブトシン、ガラクトシル－クエウオシン、マンノシル－
クエウオシン、
クエウオシン、アルケオシン、ウィブトシン、メチルウィオシン、ウィオシン、７－アミ
ノカルボキシプロピルデメチルウィオシン、７－アミノカルボキシプロピルウィオシン、
７－アミノカルボキシプロピルウィオシンメチルエステル、７－デアザ－グアノシン、７
－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－グア
ノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチル－グアノシン、６－
チオ－７－メチル－グアノシン、７－メチルイノシン、６－メトキシ－グアノシン、１－
メチルグアノシン、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、１
－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２，Ｎ２－
ジメチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ１－メチルグアノシン、２’－アミノ－３’－デオ
キシグアノシン、２’－アジド－２’－デオキシグアノシン、２’－フルオロ－２’－デ
オキシグアノシン、２－チオウリジン、３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）ウ
リジン、３－メチルウリジン、４－チオウリジン、５－メチル－２－チオウリジン、５－
メチルアミノメチルウリジン、５－カルボキシメチルウリジン、５－カルボキシメチルア
ミノメチルウリジン、５－ヒドロキシウリジン、５－メチルウリジン、５－タウリノメチ
ルウリジン、５－カルバモイルメチルウリジン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウ
リジンメチルエステル、ジヒドロウリジン、５－メチルジヒドロウリジン、５－メチルア
ミノメチル－２－チオウリジン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、５－（
カルボキシヒドロキシメチル）－２’－Ｏ－メチルウリジンメチルエステル、５－（イソ
ペンテニルアミノメチル）ウリジン、５－（イソペンテニルアミノメチル）－２－チオウ
リジン、３，２’－Ｏ－ジメチルウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－２’－
Ｏ－メチルウリジン、５－カルバモイルヒドロキシメチルウリジン、５－カルバモイルメ
チル－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－カルバモイルメチル－２－チオウリジン、５－メ
トキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－（イソペンテニルアミノムエ
チル）－２’－Ｏ－メチルウリジン、５，２’－Ｏ－ジメチルウリジン、２’－Ｏ－メチ
ルウリジン、２’－Ｏ－メチル－２－チオールジン、２－チオ－２’－Ｏ－メチルウリジ
ン、ウリジン５－オキシ酢酸、５－メトキシカルボニルメチルウリジン、
ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル、５－メトキシウリジン、５－アミノメチル－２
－チオウリジン、
５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－メチルアミノメチル－２－
セレノウリジン、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン、５－タウリノメチ
ル－２－チオウリジン、シュードウリジン、
１－メチル－３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）シュードウリジン、１－メチ
ルシュードウリジン、３－メチルシュードウリジン、２’－Ｏ－メチルシュードウリジン
、５－ホルミルウリジン、５－アミノメチル－２－ゲラニルウリジン、５－タウリノメチ
ルウリジン、５－ヨードウリジン、５－ブロモウリジン、２’－メチル－２’－デオキシ
ウリジン、２’－アミノ－２’－デオキシウリジン、２’－アジド－２’－デオキシウリ
ジン、２’－フルオロ－２’－デオキシウリジン、イノシン、１－メチルイノシン、１，
２’－Ｏ－ジメチルイノシン、２’－Ｏ－メチルイノシン、５－アザ－ウリジン、２－チ
オ－５－アザ－ウリジン、４－チオ－シュードウリジン、２－チオ－シュードウリジン、
５－カルボキシメチル－ウリジン、１－カルボキシメチル－シュードウリジン、５－プロ
ピニル－ウリジン、１－プロピニル－シュードウリジン、１－タウリノメチル－シュード
ウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン、１－タウリノメチル－４－チオ－
ウリジン、５－メチル－ウリジン、１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－ｌ－メチ
ル－シュードウリジン、２－チオ－ｌ－メチル－シュードウリジン、１－メチル－ｌ－デ
アザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、ジヒ
ドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリ
ジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－シュ
ードウリジン、４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジン、１，２’－Ｏ－ジメチルア
デノシン、１，２’－Ｏ－ジメチルグアノシン、１，２’－Ｏ－ジメチルイノシン、２，
８－ジメチルアデノシン、２－メチルチオメチレンチオ－Ｎ６－イソペンテニル－アデノ
シン、２－ゲラニルチオウリジン、２－リシジン、２－メチルチオ環状Ｎ６－スレオニル
カルバモイルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）
アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－ヒドロキシノルバリルカルバモイルアデノシン、２
－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、
２－セレノウリジン、２－チオ－２’－Ｏ－メチルウリジン、２’－Ｏ－メチルアデノシ
ン、２’－Ｏ－メチルシチジン、２’－Ｏ－メチルグアノシン、２’－Ｏ－メチルイノシ
ン、２’－Ｏ－メチルシュードウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジン、２’－Ｏ－メチル
ウリジン５－オキシ酢酸メチルエステル、２’－Ｏ－リボシルアデノシンリン酸、２’－
Ｏ－リボシルグアノシンリン酸、３，２’－Ｏ－ジメチルウリジン、
３－（３－アミノ－３－カルボキシプロピル）－５，６－ジヒドロウリジン、３－（３－
アミノ－３－カルボキシプロピル）シュードウリジン、５，２’－Ｏ－ジメチルシチジン
、５，２’－Ｏ－ジメチルウリジン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）－２’－Ｏ－
メチルウリジンメチルエステル、５５－（イソペンテニルアミノメチル）－２’－Ｏ－メ
チルウリジン、５－アミノメチル－２－ゲラニルチオウリジン、５－アミノメチル－２－
セレノウリジン、５－アミノメチルウリジン、５－カルバモイルメチル－２’－Ｏ－メチ
ルウリジン、５－カルボキシヒドロキシメチルウリジン、５－カルボキシメチル－２－チ
オウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－ゲラニルチオウリジン、５－カル
ボキシメチルアミノメチル－２－セレノウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－
２’－Ｏ－メチルウリジン、５－シアノメチルウリジン、５－ホルミル－２’－Ｏ－メチ
ルシチジン、５－メトキシカルボニルメチル－２’－Ｏ－メチルウリジン、５－メチルア
ミノメチル－２－ゲラニルチオウリジン、７－アミノカルボキシプロピル－デメチルウィ
オシン、７－メチルグアノシン、８－メチルアデノシン、Ｎ２，２’－Ｏ－ジメチルグア
ノシン、Ｎ２，７，２’－Ｏ－トリメチルグアノシン、Ｎ２，７－ジメチルグアノシン、
Ｎ２，Ｎ２，２’－Ｏ－トリメチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２，７－トリメチルグアノシン
、Ｎ２，Ｎ２，７－トリメチルグアノシン、Ｎ４，２’－Ｏ－ジメチルシチジン、Ｎ４，
Ｎ４，２’－Ｏ－トリメチルシチジン、Ｎ４，Ｎ４－ジメチルシチジン、Ｎ４－アセチル
－２’－Ｏ－メチルシチジン、Ｎ６，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン、
Ｎ６，Ｎ６，２’－Ｏ－トリメチルアデノシン、Ｎ６－ホルミルアデノシン、Ｎ６－ヒド
ロキシメチルアデノシン、
アグマチジン、２－メチルチオ環状Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、グルタミ
ル－クエオシン、
任意のヌクレオチドに付加されたグアノシン、グアニル化５’末端、ヒドロキシ－Ｎ６－
スレオニルカルバモイルアデノシン；最も好ましくは、シュードウリジン、Ｎ１－メチル
－シュードウリジン、２’－フルオロ－２’－デオキシシチジン、５－ヨードシチジン、
５－メチルシチジン、２－チオウリジン、５－ヨードウリジンおよび／または５－メチル
－ウリジン。

【0032】

さらに、用語「修飾ヌクレオチド」は重水素のような同位体を含有するヌクレオチドを
含む。用語「同位体」が同じ数の陽子を有するが、異なる数の中性子を有し、異なる質量
数をもたらす元素を指す。したがって、例えば水素の同位体は、重水素に限定されず、ト
リチウムも含む。さらに、ポリリボヌクレオチドはまた、例えば、炭素、酸素、窒素およ
び蛍光体を含む他の元素の同位体を含有することができる。修飾ヌクレオチドが重水素化
されているか、または水素もしくは酸素、炭素、窒素もしくは蛍光体の別の同位体を含有
することも可能である。

【0033】

ポリリボヌクレオチド中の修飾ヌクレオチド型の総数は、０、１、２、３、または４で
あり得る。したがって、いくつかの実施形態では１つのヌクレオチド型の少なくとも１つ
のヌクレオチド、例えば、少なくとも１つのＵヌクレオチドは修飾ヌクレオチドであり得
る。いくつかの実施形態では合計２つのヌクレオチド型のうちの少なくとも１つのヌクレ
オチド、例えば、少なくとも１つのＵヌクレオチドおよび少なくとも１つのＣヌクレオチ
ドは修飾ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では合計３つのヌクレオチド型の
うちの少なくとも１つのヌクレオチド、例えば、少なくとも１つのＧヌクレオチド、少な
くとも１つのＵヌクレオチドおよび少なくとも１つのＣヌクレオチドは修飾ヌクレオチド
であり得る。いくつかの実施形態では、４つ全てのヌクレオチド型のうちの少なくとも１
つのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドであり得る。これらのすべての実施形態において、
ヌクレオチド型あたり１つ以上のヌクレオチドが修正され得、ヌクレオチド型あたりの前
記修正されたヌクレオチドの割合は、０％、２．５％、５％、７．５％、１０％、１５％
、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％
、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または１００％である。

【0034】

いくつかの実施形態において、精製されるｍＲＮＡ分子中に含まれる修飾ヌクレオチド
の総割合は、０％、２．５％、５％、７．５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０
％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０
％、８５％、９０％または１００％である。

【0035】

したがって、ポリリボヌクレオチドは例えば、０．５～５０％、好ましくは５～５０％
のＵヌクレオチドおよび５～５０％のＣヌクレオチドが修飾されていることを特徴とする
ことができる。該修飾Ｕヌクレオチドは好ましくは５－ヨードウリジンであり、該修飾Ｃ
ヌクレオチドは、好ましくは５－ヨードシチジンである。

【0036】

いくつかの実施形態において、ポリリボヌクレオチドは１５～２５％のＵヌクレオチド
および３～１５％、好ましくは５～１５％のＣヌクレオチドが修飾されていることを特徴
とすることができ、ここで、前記修飾されたＵヌクレオチドは好ましくは５－メチルウリ
ジンであり、前記修飾されたＣヌクレオチドは好ましくは５－ヨードシチジンである。

【0037】

いくつかの実施形態において、ポリリボヌクレオチドは３０～５０％のＵヌクレオチド
および１０～２０％のＣヌクレオチドが修飾されていることを特徴とすることができ、こ
こで、前記修飾されたＵヌクレオチドは好ましくは５－ヨードウリジンであり、前記修飾
されたＣヌクレオチドは、好ましくは５－ヨードシチジンである。

【0038】

いくつかの実施形態において、ポリリボヌクレオチドは３０～５０％のＵヌクレオチド
および５～１５％のＣヌクレオチドが修飾されていることを特徴とすることができ、ここ
で、前記修飾されたＵヌクレオチドは好ましくは５－ヨードウリジンであり、前記修飾さ
れたＣヌクレオチドは、好ましくは５－ヨードシチジンである。

【0039】

いくつかの実施形態において、ポリリボヌクレオチドは０．５～５％のＵヌクレオチド
および２５～３５％のＣヌクレオチドが修飾されていることを特徴とすることができ、こ
こで、前記修飾されたＵヌクレオチドは好ましくは２－チオウリジンであり、前記修飾さ
れたＣヌクレオチドは好ましくは５－メチルシチジンである。

【0040】

ポリリボヌクレオチドは例えば、５０～１００％、好ましくは１００％のＵヌクレオチ
ドが修飾されていることを特徴とすることもできる。前記修飾Ｕヌクレオチドは、好まし
くはＮ１－メチル－シュードウリジンである。

【0041】

上記のように、本発明によれば、繊毛病を患う患者への医薬組成物の投与は、対象が呼
吸器系の炎症を示す場合に行われる。本発明の文脈において、「炎症」という用語は感染
、外傷、および過敏症を含む傷害に対する細胞応答を指し、「呼吸器系の炎症」は呼吸器
系、特に、限定するものではないが、鼻、咽頭、喉頭、気管、気管支および／または肺に
おける炎症反応を指す。呼吸器系における炎症反応は例えば、病原体、毒素、汚染物質、
および／またはアレルゲンのような刺激剤によって引き起こされ得る。炎症の間に、例え
ばサイトカインおよびメディエーターを放出して他の細胞の活性を修飾することができる
特定の細胞型が活性化される。これらのプロセスは以下の通りである。例えば、Ｉｗａｓ
ａｋｉ ｅｔ ａｌ． （Ｉｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１７， Ｎａｔ Ｒｅ
ｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ， １７（１）：７－２０）に記載されている。

【0042】

したがって、１つの実施形態において、ポリリボヌクレオチドが投与される繊毛病に罹
患している対象は対象が呼吸器系の炎症を患っているかどうかを決定するために、処理の
前にアッセイに供されており、ここで、対象は、呼吸器系の炎症を有すると積極的に決定
されている。

【0043】

好ましくは、呼吸器系の炎症は急性炎症である。急性炎症は数秒、数分間、数時間、お
よび数日にわたって生じ得るが、より長い期間にわたって生じ得ない。したがって、急性
炎症は、４週間までの時間範囲、好ましくは３週間未満の時間枠で起こる炎症である。局
所的な血流量の増加、毛細血管の局所的な透過性亢進、および／または好中球、マクロフ
ァージおよび／またはリンパ球の数の増加に基づいて、ルーチンの臨床検査法によって判
定することができる。一次毛様体ジスキネジアにおける気道炎症のマーカーについてのさ
らなる情報は例えば、Ｚｉｈｌｉｆ ｅｔ ａｌ． （Ｚｉｈｌｉｆ ｅｔ ａｌ．，
２００６， Ｐｅｄｉａｔｒ Ｐｕｌｍｏｎｏｌ， ４１（６）：５０９－１４）におい
て見出され得る。

【0044】

一般に、炎症は急性または慢性のいずれかに分類できる。急性炎症は有害な刺激に対す
る身体の反応であり、例えば、罹患組織への顆粒球の移動の増加によって特徴付けられる
。炎症の古典的符号は、熱、疼痛、発赤、腫脹、および機能喪失である。ＰＣＤ等の繊毛
障害は遺伝性疾患であり、未治療の場合、機能喪失によって永続的で生涯にわたる刺激を
受け、永続的で慢性的な炎症等を引き起こすが、典型的には上記の症状を示さない（機能
喪失の他に）。慢性炎症に関連する疾患のさらなる例は例えば、花粉症、歯周病、アテロ
ーム性動脈硬化症、および変形性関節症である。それにもかかわらず、このような疾患に
罹患した患者はさらに、例えば、追加の有害な刺激を受け、その結果として、炎症の古典
的な符号のような古典的な症状の１つまたは複数が、熱、疼痛、発赤、腫脹、およびさら
なる機能喪失であることによって、急性炎症を起こし得る。

【0045】

したがって、１つの実施形態において、ポリリボヌクレオチドが投与される繊毛病に罹
患している対象は対象が呼吸器系の急性炎症に罹患しているかどうかを決定するために、
そして対象が呼吸器系の急性炎症を有すると積極的に決定されている場合に、アッセイの
処置の前に供されている。

【0046】

あるいはまたはさらに、呼吸器系の炎症は炎症の増悪、好ましくは炎症の急性増悪を指
す。増悪とは、病気が悪化したり、その症状が増悪したりすることをいう。増悪は患者の
生活の質の低下をもたらし、肺機能の低下を加速し、疾患関連費用に実質的に寄与するた
め、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）との関連で最もよく検討される。

【0047】

臨床試験の場合、「呼吸器系増悪は、臨床試験において、細菌培養の結果にかかわらず
、全身性抗生物質処理の開始につながる気道症状、または抗生物質の処方の有無にかかわ
らず、スクリーニング時および無作為化時に予測されるＦＥＶ１％の平均と比較して１０
パーセントポイント以上で予測される１秒間努力呼気肺活量（ＦＥＶ１）％の低下のいず
れかと定義することができる。増悪の発生は、患者の問診、身体診察および肺活量測定に
よって評価できる。各治験訪問時、および増悪に起因する治験実施施設との特別な接触時
には、治験実施施設との最後の接触以降の症状および併用薬について参加者に聞き取り調
査を行うことができる。面接は、症状と抗生物質に関する週１回の患者日記によって補う
ことができる。参加者の全身状態、バイタルサイン、耳、心臓および肺をレビューする身
体診察は、すべての訪問時に行うことができる」と述べている （例えば、Ｋｏｂｂｅｒ
ｎａｇｅｌ ｅｔ ａｌ．， ２０１６， ＢＭＣ Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ Ｍｅｄｉｃｉ
ｎｅ， １６：１０４参照）。

【0048】

したがって、好ましい実施形態によれば、医薬組成物は繊毛病に罹患している対象にお
いて繊毛病を治療する際に使用するためのｍＲＮＡを含み、ｍＲＮＡはその欠損が前記繊
毛病に関連する毛様構造タンパク質の機能的バージョンをコードし、前記繊毛病に罹患し
ている対象の呼吸器系への前記医薬組成物の投与は、繊毛病に罹患している対象が呼吸器
系の急性炎症、好ましくは急性増悪を示す場合に行われる。

【0049】

したがって、一実施形態において、ポリリボヌクレオチドが投与される繊毛病に罹患し
ている対象は対象が呼吸器系の急性炎症、好ましくは急性増悪を患っているかどうかを決
定するために、処理の前にアッセイに供されており、ここで、対象は陽性である 呼吸器
系の慢性炎症、好ましくは急性増悪を有すると判定された。

【0050】

繊毛病に罹患している対象の呼吸器系の炎症の有無は常法によって、例えば、血液サン
プルを分析することによって、または患者が鼻を走らせること等を患っているかどうかを
決定することによって、決定され得る。

【0051】

呼吸器系では、炎症は一般に感染症、特にウイルスまたはバクテリア感染によって引き
起こされる。したがって、繊毛病患者における炎症の有無は、好ましくは感染、好ましく
は急性感染の有無を決定することによって評価することができる。好ましくは、感染はウ
イルスおよび／または細菌感染である。

【0052】

急性感染症は、聴診所見、化膿性咳嗽、浸潤影、喀血、発熱、血液炎症パラメータの上
昇（ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）＞２００ｍｇ／ｍｌ、血沈＜１００ｍｍ／時）を特徴
とする。慢性感染はさらに、移行性の浸潤、抗生物質耐性、持続性の全身症状および中等
度の血液炎症マーカー（ＣＲＰ ５０－１００ｍｇ／ｍｌ、血沈＜５０ｍｍ／ｈ）によっ
て特徴づけられる（Ｋｌｉｎｉｓｃｈｅ Ｐｎｅｕｍｏｎｏｌｏｇｉｅ， １． Ａｕｆ
ｌ． ２０１４ Ｇｅｏｒｇ Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ ＫＧ， ＩＳＢＮ ９７８
－３－１３－１２９７５１－８； Ｊａｒｏｓｚｅｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， ２０１２
， Ｔｈｏｒａｃ Ｓｕｒｇ Ｃｌｉｎ， ２２（３）：３０１－２４）。

【0053】

本発明の文脈において、「呼吸器系」という用語は鼻、咽頭、喉頭、気管、気管支およ
び肺のような呼吸に関連する器官を含む。特に、呼吸器系はヒトを含むいくつかの哺乳動
物の場合、呼吸器系とも呼ばれ、本明細書では対象とも呼ばれる。本明細書では「呼吸器
系」および「呼吸器系」という用語が互換的に使用される。気道は上気道と下気道に分け
ることができる。上気道には、鼻腔、鼻甲介、鼻前庭および鼻腔を含む鼻；副鼻腔；咽頭
、およびコード（コード）の上の喉頭の部分が含まれる。下気道には、声帯ヒダの下にあ
る喉頭の部分、気管、気管支および細気管支が含まれる。ここで、肺は下気道に含まれ、
呼吸細気管支、肺胞管、肺胞嚢、肺胞を含む。

【0054】

本発明の文脈において、用語「医薬組成物」は繊毛病を治療するために、対象に投与す
るための、少なくとも本発明に従うポリリボヌクレオチドを含む組成物を指す。ポリリボ
ヌクレオチドは好ましくは有効量、すなわち、医薬組成物が投与される対象において検出
可能な治療反応を誘導するのに十分な量で含まれる。本発明の医薬組成物は、滅菌水性ま
たは非水性溶液、懸濁液またはエマルジョンまたはエアロゾルの形成であり得る。好まし
くは、医薬組成物が例えば、吸入、噴霧、スプレーまたは液滴（例えば、鼻スプレーまた
は鼻液滴）を介して、呼吸器系への投与を可能にする形態である。

【0055】

これは、スプレー、液滴、ネブライザー、または吸入を使用する投与が患者によって容
易に行われ得、輸送が快適であり、したがって、作用の自由を制限することなく患者に容
易に利用可能であるので、患者にとって有利である。

【0056】

好ましい実施形態において、医薬組成物はＤＮＡＨ５、ＤＮＡＨ１１、ＣＣＤＣ３９、
ＤＮＡＩ１、ＣＣＤＣ４０、ＣＣＤＣ１０３、ＳＰＡＧ１、ＺＭＹＮＤ１０、ＡＲＭＣ４
、ＣＣＤＣ１５１、ＤＮＡＩ２、ＲＳＰＨ１、ＣＣＤＣ１１４、ＲＳＰＨ４Ａ、ＤＮＡＡ
Ｆ１（ＬＲＲＣ５０）、ＤＮＡＡＦ２（ＫＴＵ）、およびＬＲＲＣ６からなる群より選択
されるタンパク質の機能的バージョンに翻訳され得るｍＲＮＡを含み、スプレー、液滴、
ネブライザーを使用することによって、および／または吸入によって、前記タンパク質の
欠損によって引き起こされるＰＣＤを患う対象に投与される。より好ましくは、タンパク
質はＣＣＤＣ４０および／またはＣＣＤＣ３９である。

【0057】

医薬組成物は薬学的に許容可能な担体、すなわち、健全な医学的判断の範囲内で、過剰
な毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずに、ヒトおよび
動物の組織と接触して使用するのに適した、妥当な利益／リスク比に見合った、化学化合
物、材料、成分、および／または組成物を含むことができる。したがって、薬学的に許容
可能な担体は投薬量、吸着、溶解性または薬物動態学的考察を考慮して、その取り扱いを
容易にするために、薬学的に活性な物質と一緒に処方される不活性な物質である。適切な
薬学的に許容される担体の実施例は当技術分野で周知であり、リン酸緩衝生理食塩水溶液
、緩衝液、水、エマルジョン、実施例えば油／水エマルジョン、種々のタイプの湿潤剤、
および滅菌溶液を含む。特に、水性担体には、水、アルコール性／水溶液、エマルジョン
または懸濁液（生理食塩水および緩衝媒体を含む）が含まれる。非水性溶媒の例は、プロ
ピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油といった植物油、およびオレイ
ン酸エチルといった有機エステルである。薬学的に許容可能な担体のさらなる例としては
、生理食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液、クエン酸塩、リン酸塩、および他
の有機酸；塩形成対イオン、例、ナトリウムおよびカリウム；低分子量（＞１０アミノ酸
残基）ポリペプチド；タンパク質、例、血清アルブミン、またはゼラチン；親水性高分子
、例、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例、ヒスチジン、グルタミン、リジン、アスパ
ラギン、アルギニン、またはグリシン；グルコース、マンノース、またはデキストリンを
含めた炭水化物；単糖；二糖；他の糖、例、スクロース、マンニトール、トレハロースま
たはソルビトール；キレート剤、例、ＥＤＴＡ；非イオン性界面活性剤、例、Ｔｗｅｅｎ
（登録商標）の商標で市販されているポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、プ
ロピレングリコール、プルロニックまたはポリエチレングリコール；メチオニン、アスコ
ルビン酸およびトコフェロールを含めた酸化防止剤；および／または防腐剤、例、塩化オ
クタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウ
ム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラ
ベン、例、メチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサ
ノール；３－ペンタノール；およびｍ－クレゾール）が挙げられるがこれらに限定されな
い。適切な薬学的に許容可能な担体およびそれらの製剤化は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ
Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １７ｔｈ ｅｄ．， １９８５，
Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．により詳細に記載されている。さらに、防腐
剤、安定剤および他の添加剤、例えば、抗菌剤、老化防止剤、キレート剤、および不活性
ガス、ナノシステムまたはリポソーム等も存在し得る。

【0058】

本発明の医薬組成物は、スプレー、液滴、吸入器、ネブライザー等の使用等、呼吸器系
への投与に適していることが当業者に知られている広範囲のクラスの投与形態を介して患
者に投与することができる。作用の用量および持続時間は前記ポリリボヌクレオチドが満
たすべき機能に依存し、それぞれの場合において意図的に調整されなければならない。作
用の持続時間は例えば、前記ポリリボヌクレオチドがここでの場合のように、欠損遺伝子
、すなわち変化したＤＮＡ配列に起因する疾患の慢性治療のために使用される場合、可能
な限り長くなる。持続時間はまた、所定時間ウィンドウに調整されてもよい。

【0059】

一実施形態では、医薬組成物が週に少なくとも１回投与される。これは、前記ＰＣＤの
治療の効率的かつ持続的な効果を保証するために有利である。好ましくは、医薬組成物が
少なくとも２週間、より好ましくは少なくとも３週間、さらにより好ましくは少なくとも
４週間、毎週投与される。あるいは、医薬組成物が少なくとも１週間、好ましくは少なく
とも２週間、より好ましくは少なくとも３週間、さらにより好ましくは少なくとも４週間
、週２回投与することができる。一実施形態では、上記のように４週間の初期治療後にさ
らなる治療の必要がある場合、治療は週１回実施される。週１回の投与の代わりに、投与
はより長い期間、例えば、少なくとも２ヶ月間、好ましくは少なくとも３ヶ月間、より好
ましくは少なくとも４ヶ月間、さらにより好ましくは少なくとも５ヶ月間、最も好ましく
は少なくとも６ヶ月間、１ヶ月に１回の投与に切り替えることができる。

【0060】

１つの好ましい実施形態において、医薬組成物は対象が適宜溶液、好ましくは高張生理
食塩水またはＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）の溶液のような粘液溶解剤を吸入した後
、または粘液および潜在的に脱落した気道上皮細胞を除去するために、適宜溶液、好まし
くは高張生理食塩水またはＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）のような粘液溶解剤で、そ
れらの鼻腔および／または副鼻腔を適宜溶液、好ましくは粘液溶解剤で洗浄した後に、対
象の呼吸器系に投与される。したがって、医薬組成物は被験者が適切な溶液、好ましくは
高張食塩水またはＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）の溶液等の粘液溶解剤を吸入し、上
皮細胞上に位置する咳をした後に、被験者の呼吸器系に投与されることが好ましい。これ
は、医薬組成物を投与する前に上皮細胞を暴露するために、したがってポリリボヌクレオ
チドのトランスフェクション有効性を増強するために特に有利である。

【0061】

したがって、一実施形態では、ポリリボヌクレオチドが投与される繊毛病に罹患してい
る対象が治療前に、適宜溶液、好ましくは高張生理食塩水またはＮ－アセチルシステイン
（ＮＡＣ）の溶液等の粘液溶解剤を吸入することによって、またはそれらの鼻腔および／
または洞を適宜溶液、好ましくは高張生理食塩水またはＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ
）等の粘液溶解剤で洗浄することによってさらされた対象である。

【0062】

このような工程はポリリボヌクレオチドの投与前に、対象の呼吸器系から粘液を物理的
に除去することを目的とする。

【0063】

さらに、このような対象は好ましくは対象が呼吸器系の炎症、好ましくは急性炎症また
は炎症の悪化を患っているかどうかを決定するために、処理の前にアッセイに供された対
象であり、ここで、対象は、呼吸器系の炎症、好ましくは急性炎症または炎症の悪化を有
すると積極的に決定されている。

【0064】

好ましい実施形態では、前記溶液中のＮＡＣの濃度が３％～２０％、好ましくは５％～
１５％、より好ましくは８％～１２％、最も好ましくは１０％である。割合は重量／重量
に基づく。好ましくは、ＮＡＣを含有するソリューションはまた、エデト酸ナトリウム（
エデト酸塩はエチレンジアミンテトラアセテートを指す）および／または水酸化ナトリウ
ムを薬学的に許容される濃度で含有する。好ましくは、溶液は水溶液である。

【0065】

繊毛病の治療に使用するためのポリリボヌクレオチドを含む医薬組成物のいくつかの実
施形態において、医薬組成物は、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）等の粘液溶解剤およ
び／または塩化ナトリウムを含む高張溶液をさらに含む。痰として作用するＮＡＣおよび
塩化ナトリウムを含む高張溶液の両方は、ＰＣＤに罹患している対象における粘稠な粘液
の保持を減少させるために有利である。これにより、呼吸器系の感染症のリスク、ひいて
は患者にとってのさらなるストレスを減らすことができる。

【0066】

好ましい実施形態において、医薬組成物は、上記のような濃度のＮＡＣをさらに含む。

【0067】

好ましい実施形態では、医薬組成物が２％～８％、好ましくは３％～７％、より好まし
くは４％～７％の濃度の塩化ナトリウムを含む高張溶液をさらに含む。

【0068】

好ましい実施形態では、医薬組成物がＮＡＣを３％～２０％、好ましくは５％～１５％
、より好ましくは８％～１２％、最も好ましくは１０％、および／または塩化ナトリウム
を２％～８％、好ましくは３％～７％、より好ましくは４％～７％の濃度で含む高張溶液
をさらに含む。

【0069】

上記のように、本発明による医薬組成物の好ましい実施形態において、前記医薬組成物
は、ＤＮＡＨ５、ＤＮＡＨ１１、ＣＣＤＣ３９、ＤＮＡＩ１、ＣＣＤＣ４０、ＣＣＤＣ１
０３、ＳＰＡＧ１、ＺＭＹＮＤ１０、ＡＲＭＣ４、ＣＣＤＣ１５１、ＤＮＡＩ２、ＲＳＰ
Ｈ１、ＣＣＤＣ１１４、ＲＳＰＨ４Ａ、ＤＮＡＡＦ１（ＬＲＲＣ５０）、ＤＮＡＡＦ２（
ＫＴＵ）、およびＬＲＲＣ６、好ましくはＣＣＤＣ４０および／またはＣＣＤＣ３９から
なる群より選択されるタンパク質の機能的バージョンに翻訳され得るｍＲＮＡを含む。こ
のような医薬組成物は、以下において「第１の医薬組成物」とも呼ばれる。

【0070】

複数繊毛虫分化およびＤＮＡ合成関連細胞周期（ＭＣＩＤＡＳ）タンパク質は複数繊毛
虫細胞分化に特異的に必要とされる転写調節タンパク質であり、複数繊毛虫細胞分化には
複数動繊毛虫の繊毛虫形成が含まれる（例えば、ヒトｍＲＮＡおよびタンパク質ＭＣＩＤ
ＡＳ配列についてはそれぞれ、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１１９０７８７．１およびＮ
Ｐ＿００１１７７７１６．１；または配列番号４に示す最適化ポリリボヌクレオチド配列
を参照されたい）。

【0071】

したがって、繊毛病の治療に使用するためのポリリボヌクレオチドを含む医薬組成物の
いくつかの実施形態では、前記医薬組成物がｍｕｌｔｉｃｉｌｉａｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅ
ｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｅ
ｌｌ ｃｙｃｌｅ（ＭＣＩＤＡＳ）タンパク質の機能的バージョンをコードするポリリボ
ヌクレオチドをさらに含む。

【0072】

いくつかの実施形態において、医薬組成物は、ＭＣＩＤＡＳタンパク質をコードするポ
リリボヌクレオチドを含む第２の医薬組成物と一緒に投与される、上記の第１の医薬組成
物である。

【0073】

両方の医薬組成物、すなわち、ＭＣＩＤＡＳタンパク質をコードするポリリボヌクレオ
チドをさらに含む上記の第１の医薬組成物、またはＭＣＩＤＡＳタンパク質をコードする
ポリリボヌクレオチドを含む第２の医薬組成物と一緒に投与される第１の医薬組成物は、
本発明による医薬組成物の投与が毛様体形成の前および／またはその間に細胞に投与され
る場合、繊毛細胞構造および機能を回復させるのに特に有効であるので有利である。さら
に、両者は、好ましくは鼻スプレーおよび／またはネブライザーを使用することによって
、および／または吸入によって、好ましくは週に少なくとも１回および／または少なくと
も４週間、患者に投与される。

【0074】

いくつかの実施形態において、医薬組成物は、２つ以上のタンパク質の機能的バージョ
ンに翻訳され得るポリリボヌクレオチドを含む。これは、例えば、２つ以上の異なるタン
パク質をコードする単一のポリリボヌクレオチドである多シストロン性ポリリボヌクレオ
チドを用いて行うことができる。例えば２Ａペプチドを用いてこのような多シストロン性
ポリリボヌクレオチドを設計することは、文献に十分に記載されている。例として、Ｌｉ
ｕらは多シストロニックｍＲＮＡを生成するための２Ａペプチドの使用を実証した（Ｌｉ
ｕ ｅｔ ａｌ．， ２０１７， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ， ７：２１
９３）。これらの２Ａペプチドはさらに、例えば、リボソームスキッピング（２Ａペプチ
ドの機能的特徴）の結果として配列中の第１のタンパク質に付加される追加のアミノ酸（
２Ａペプチドの一部）を除去するために、フリン切断部位と組み合わせることができる。
一例として、２Ａペプチドによるフリン切断の使用は例えば、Ｃｈｎｇ ｅｔ ａｌ．
（Ｃｈｎｇ ｅｔ ａｌ．， ２０１５ ＭＡｂｓ， ７（２）：４０３－４１２）によ
って記載されている。したがって、２つ以上、好ましくは２つの治療タンパク質（例えば
、ＣＣＤＣ４０およびＭＣＩＤＡＳ）をコードする単一のポリリボヌクレオチドが設計さ
れ得、ここで、２つの治療タンパク質のコーディング領域は、（上記引用に記載されるよ
うに）２Ａペプチドによって分離される。

【0075】

したがって、いくつかの実施形態では、医薬組成物が２つ以上、好ましくは２つのタン
パク質の機能的バージョンに翻訳され得るポリリボヌクレオチドを含むことを除いて、上
記の実施形態について記載されるのと同じことが適用される。したがって、いくつかの実
施形態では、上記の実施形態に記載の医薬組成物がＤＮＡＨ５、ＤＮＡＨ１１、ＣＣＤＣ
３９、ＤＮＡＩ１、ＣＣＤＣ４０、ＣＣＤＣ１０３、ＳＰＡＧ１、ＺＭＹＮＤ１０、ＡＲ
ＭＣ４、ＣＣＤＣ１５１、ＤＮＡＩ２、ＲＳＰＨ１、ＣＣＤＣ１１４、ＲＳＰＨ４Ａ、Ｄ
ＮＡＡＦ１（ＬＲＲＣ５０）、ＤＮＡＡＦ２（ＫＴＵ）、およびＬＲＲＣ６、好ましくは
ＣＣＤＣ４０および／またはＣＣＤＣ３９からなる群より選択されるタンパク質の機能的
バージョンに翻訳され得る配列、ならびにＭＣＩＤＡＳタンパク質の機能的バージョンに
翻訳され得る配列を含む、多シストロン性ポリリボヌクレオチドを含む。

【0076】

いくつかの実施形態では、医薬組成物がＭＣＩＤＡＳタンパク質の機能版に翻訳するこ
とができ、配列番号４に示す最適化ポリリボヌクレオチド配列を含むポリリボヌクレオチ
ド、およびＣＣＤＣ４０および／またはＣＣＤＣ３９タンパク質の機能版に翻訳すること
ができ、配列番号１（または配列番号５～１１）および／または配列番号２（または配列
番号１２～１４）に示す最適化ポリリボヌクレオチド配列を含むポリリボヌクレオチドを
含む。好ましくは、それは鼻スプレーおよび／またはネブライザーを使用することによっ
て、および／または吸入によって、好ましくは少なくとも１週間に１回および／または少
なくとも４週間、患者に投与される。

【0077】

ＭＣＩＤＡＳの代わりに、またはそれに加えて、例えば、ＧｅｍＣ１、ＦｏｘＪ１、お
よび／またはＥ２ｆ４ＶＰ１６を使用することができる。ＧｅｍＣ１は繊毛上皮に特異的
に発現し、繊毛形成の中心的調整剤である。ＧｅｍＣ１の異所性発現は多毛様体形成の２
つの重要な転写調節因子であるＭＣＩＤＡＳおよびＦｏｘＪ１をアップレギュレートする
ことによって、ｅｘ ｖｉｖｏで気道上皮細胞における多毛様体形成の初期段階を誘導す
るのに十分であることが報告されている（Ａｒｂｉ Ｍ ｅｔ ａｌ．， ２０１６，
ＥＭＢＯ ｒｅｐｏｒｔｓ， １７（３）：４００－４１３）。さらに、同じ研究におい
て、ＧｅｍＣ１がＭＣＩＤＡＳおよびＦｏｘＪ１上流調節配列を直接トランス活性化でき
ることが報告された。Ｅ２ｆ４ＶＰ１６とは、ＨＳＶ１ ＶＰ１６からの一般的な活性化
ドメインを含み、多毛形成に関連する重要な遺伝子の発現の活性化に好影響を及ぼすこと
ができるＥ２ｆ４の一形態をいう（Ｋｉｍ Ｓ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ
Ｒｅｐｏｒｔｓ， ２０１８， ８：１２３６９）。

【0078】

したがって、繊毛病の治療に使用するためのポリリボヌクレオチドを含む医薬組成物の
いくつかの実施形態では、前記医薬組成物が上記の第１の医薬組成物であり、ＭＣＩＤＡ
Ｓタンパク質の機能版をコードするポリリボヌクレオチド、ＧｅｍＣ１タンパク質の機能
版をコードするポリリボヌクレオチド、ＦｏｘＪ１タンパク質の機能版をコードするポリ
リボヌクレオチド、および／またはＥ２ｆ４ＶＰ１６タンパク質の機能版をコードするポ
リリボヌクレオチドのうちの少なくとも１つをさらに含む。

【0079】

医薬組成物のいくつかの実施形態では、上記の第１の医薬組成物が以下の機能版をコー
ドするポリリボヌクレオチドのうちの少なくとも１つを含む第２の医薬組成物と一緒に投
与することができる：ＭＣＩＤＡＳタンパク質の機能版をコードするポリリボヌクレオチ
ド、ＧｅｍＣ１タンパク質の機能版をコードするポリリボヌクレオチド、ＦｏｘＪ１タン
パク質の機能版をコードするポリリボヌクレオチド、および／またはＥ２ｆ４ＶＰ１６タ
ンパク質。

【0080】

両方の医薬組成物、すなわち、ＭＣＩＤＡＳ、ＧｅｍＣ１、ＦｏｘＪ１、および／また
はＥ２ｆ４ＶＰ１６タンパク質をコードするポリリボヌクレオチドをさらに含む上記の第
１の医薬組成物、またはＭＣＩＤＡＳ、ＧｅｍＣ１、ＦｏｘＪ１、および／またはＥ２ｆ
４ＶＰ１６タンパク質をコードするポリリボヌクレオチドを含む第２の医薬組成物と一緒
に投与される第１の医薬組成物は細胞が毛様体形成を開始する前に、または毛様体形成中
に細胞に投与される場合、本発明による医薬組成物の投与が繊毛細胞構造および機能を回
復するのに特に有効であるため、有利である。さらに、両者は、好ましくは鼻スプレーお
よび／またはネブライザーを使用することによって、および／または吸入によって、好ま
しくは週に少なくとも１回および／または少なくとも４週間、患者に投与される。

【0081】

上記のように、いくつかの実施形態において、医薬組成物が、２つ以上、好ましくは２
つのタンパク質の機能的バージョンに翻訳され得るポリリボヌクレオチドを含むことを除
いて、上記の実施形態について記載されるのと同じことが適用される。したがって、いく
つかの実施形態において、上記の実施形態に記載される医薬組成物は、マルチシストロニ
ックポリリボヌクレオチドを含む。

【0082】

医薬組成物は、ポリリボヌクレオチドによる細胞のトランスフェクションを容易にする
化合物を含んでもよい。このような化合物の例は、国際公開第２０１４／２０７２３号に
開示されているものである。

【0083】

医薬組成物は、ＲＮＡを標的細胞または標的組織に送達および／または導入するための
１つ以上の薬剤または１つ以上の試薬をさらに含むことができる。特に、この／これらの
薬剤または試薬は、細胞または組織へのＲＮＡの送達および／または導入を支持すること
が想定される。この／これらの薬剤または試薬は、ＲＮＡと一緒に投与され得る。送達／
導入されるＲＮＡはまた、この／これらの薬剤（または試薬）とカップリング（例、共有
結合または複合体化）されてもよく、またはカップリングされなくてもよい（例えば、単
にこの／これらの薬剤（または試薬）と混合されてもよい）。それぞれの薬剤または、試
薬は当該分野で公知であり（例えば、Ｔａｖｅｒｎｉｅｒ、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ
ｅａｓｅ １５０（３）（２０１１），２３８-４７）、そして例えば、とりわけ、脂質
およびリポソーム、ミセル、重合体およびデンドリマーからなる群より選択される。
それぞれの薬剤または試薬の特定の例は、ＧＬ６７、ＥＤＭＰＣ、ＤＯＴＡＰ（ｌ，２－
ジオレイル－３－トリメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＤＡＰ（１，２－ジオレイル
－３－ジメチルアンモニウムプロパン）、ＤＯＴＭＡ（ｌ，２－ジ－０－オクタデセニル
－３－トリメチルアンモニウムプロパン）、ＸＴＣ（２，２－ジリノレイル－４－ジメチ
ルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン）およびＭＣ３（（（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，
３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジ
メチルアミノ）ブタノエート）、ＡＬＮＹ－１００（（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）－Ｎ、Ｎ
－ジメチル－２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニル）テトラ
ヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－アミン））、ＮＣ９
８－５（４，７，１３－トリス（３－オキソ－３－（ウンデシルアミノ）プロピル）－Ｎ
ｌ，Ｎ１６－ジウンデシル－４，７，１０，１３－テトラアザヘキサデカン－ｌ，１６－
ジアミド）、Ｃ１２－２００、ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ、ＤＯＤＡＰ、ｌ，２－ジステ
アリルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパンまたは「ＤＳＤＭＡ」、ｌ，２－
ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパンまたは「ＤＯＤＭＡ」、ｌ，
２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパンまたは「ＤＬｉｎＤＭ
Ａ」、１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパンまたは「Ｄ
ＬｅｎＤＭＡ」、Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリドまたは「ＤＯ
ＤＡＣ」、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミドまたは「ＤＤ
ＡＢ」、Ｎ－（ｌ，２－ジミリスチルオキシプロプ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ
－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミドまたは「ＤＭＲＩＥ」、３－ジメチルアミノ－
２－（コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシブタン－４－オキシ）－ｌ－（ｃｉｓ，
ｃｉｓ－９，１２－オクタデカジエノキシ）プロパンまたは「ＣＬｉｎＤＭＡ」、２－［
５’－（コレスト－５－エン－３－ベータ－オキシ）－３’－オキサペントキシ）－３－
ジメチルｌ－ｌ－（ｃｉｓ，ｃｉｓ－９’，１－２’－オクタデカジエノキシ）プロパン
または「ＣｐＬｉｎＤＭＡ」、Ｎ，Ｎ－ジメチル－３，４－ジオレイルオキシベンジルア
ミンまたは「ＤＭＯＢＡ」、ｌ，２－Ｎ，Ｎ’－ジオレイルカルバミル－３－ジメチルア
ミノプロパンまたは「ＤＯｃａｒｂＤＡＰ」、２，３－ジリノレオイルオキシ－Ｎ，Ｎ－
ジメチルプロピルアミンまたは「ＤＬｉｎＤＡＰ」、ｌ，２－Ｎ，Ｎ’－ジリノレイルカ
ルバミル－３－ジメチルアミノプロパンまたは「ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ」、ｌ，２－ジ
リノレオイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパンまたは「ＤＬｉｎＣＤＡＰ」、２
，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［ｌ，３］－ジオキソランまたは「Ｄ
Ｌｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ」、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［ｌ，３］
－ジオキソランまたは「ＤＬｉｎ－Ｋ－ＸＴＣ２－ＤＭＡ」、またはそれらの混合物であ
る（Ｈｅｙｅｓ， Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １０７ （２００５）
， ２７６－２８７； Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ， Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２
３（８） （２００５）， １００３－１００７；国際公開第２００５／１２１３４８号
）。さらなる例は、ＤＣ－Ｃｈｏｌ（Ｎ、Ｎ－ジメチル－Ｎ－エチルカルボキサミドコレ
ステロール）、ｌ，４－ビス（３－Ｎ－オレイルアミノ－プロピル）ピペラジンである（
Ｇａｏ， Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍ． １７９ （１
９９１）， ２８０； Ｗｏｌｆ， ｅｔ ａｌ ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３
（１９９７）， １３９； 米国特許第５，７４４，３３５号）。さらなる例は、ＬＩＰ
ＯＦＥＣＴＩＮ（ＤＯＴＭＡ：ＤＯＰＥ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ
， Ｃａｌｉｆ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＤＯＳＰＡ：ＤＯＰＥ）（Ｉｎｖｉｔ
ｒｏｇｅｎ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ２０００．（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＦＵ
ＧＥＮＥ、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（ＤＯＧＳ）、およびＥＦＦＥＣＴＥＮＥである。さ
らなる例は、改変および非改変ポリアクリレート、ポリアルキシアノアクリレート、ポリ
ラクチド、ポリラクチド－ポリグリコリドコポリマー、ポリカプロラクトン、デキストラ
ン、アルブミン、ゼラチン、アルギネート、コラーゲン、キトサン、シクロデキストリン
、ポリリジン（ｐｏｌｙｌｙｓｉｎ）、ポリアルギニン、オリゴ／ポリアミンおよびポリ
エチレンイミンである。

【0084】

薬剤または試薬は、オリゴマー、重合体またはリピドイドであり得る。それらは、例え
ば、ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０６３７５６に記載されているような特性オリゴ（アルキレ
ンアミン）部分のようなオリゴ（アルキレンアミン）部分を含み得る。特に、薬剤または
試薬は、ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０６３７５６に記載されているようなオリゴマー、重合
体またはリピドイドであってもよい。これらの特定の薬剤または試薬の１つの主な特徴は
、それらが以下の式（Ｉ）の共通の構造実体を含有することである：

【化1】

【0085】

このような薬剤または試薬は、（成分）から選択されるオリゴ（アルキレンアミン）で
あってもよい：
ａ）側鎖および／または末端基として式（ＩＩ）の複数の基を含むオリゴマーまたはポリ
マー：

【化2】

式中、変数ａ、ｂ、ｐ、ｍ、ｎおよびＲ^２～Ｒ^６は、複数のそのような基の中の式（ＩＩ
）の各基について、独立して以下のように定義される。
ａは１でありかつｂは２～４の整数であり；または、ａは２～４の整数でありかつｂは１
であり、
ｐは１または２であり、
ｍは１または２であり；ｎは０または１でありかつｍ＋ｎは≧２であり；かつ
Ｒ^２～Ｒ^５は、互いに独立して、水素；基－ＣＨ_２－ＣＨ（ＯＨ）－Ｒ^７、－ＣＨ（Ｒ^７
）－ＣＨ_２－ＯＨ、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－Ｒ^７、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－（Ｃ
＝Ｏ）－ＮＨ－Ｒ^７または－ＣＨ_２－Ｒ^７から選択され、式中、Ｒ^７は、１つのＣ－Ｃ二
重結合を有するＣ３－Ｃ１８アルキルまたはＣ３－Ｃ１８アルケニル；アミノ基の保護基
；およびポリ（エチレングリコール）鎖から選択され；
Ｒ^６は、水素、基－ＣＨ_２－ＣＨ（ＯＨ）－Ｒ^７、－ＣＨ（Ｒ^７）－ＣＨ_２－ＯＨ、－Ｃ
Ｈ_２－ＣＨ_２－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－Ｒ^７、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－（Ｃ＝Ｏ）－ＮＨ－Ｒ^７また
は－ＣＨ_２－Ｒ^７から選択され、式中、Ｒ^７は、１つのＣ－Ｃ二重結合を有するＣ３－Ｃ
１８アルキルまたはＣ３－Ｃ１８アルケニル；アミノ基の保護基；－Ｃ（ＮＨ）－ＮＨ_２
；ポリ（エチレングリコール）鎖、および受容体リガンドから選択され、
かつ、式中、式（ＩＩ）で示される窒素原子の１つ以上は、プロトン化されて式（ＩＩ）
のカチオン基を提供してもよい；
ｂ）繰り返し単位として式（ＩＩＩ）の複数のグループを含むオリゴマーまたはポリマー
：

【化3】

式中、変数ａ、ｂ、ｐ、ｍ、ｎおよびＲ^２～Ｒ^５は、複数のそのような基の中の式（ＩＩ
Ｉ）の各基について、独立して以下のように定義される：
ａは１でありかつｂは２～４の整数であり；または、ａは２～４の整数でありかつｂは１
であり、
ｐは１または２であり、
ｍは１または２であり；ｎは０または１でありかつｍ＋ｎは≧２であり；かつ
Ｒ^２～Ｒ^５は、互いに独立して、水素；基－ＣＨ_２－ＣＨ（ＯＨ）－Ｒ^７、－ＣＨ（Ｒ^７
）－ＣＨ_２－ＯＨ、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－Ｒ^７または－ＣＨ_２－ＣＨ_２－
（Ｃ＝Ｏ）－ＮＨ－Ｒ^７または－ＣＨ_２－Ｒ^７から選択され、式中、Ｒ^７は、１つのＣ－
Ｃ二重結合を有するＣ３－Ｃ１８アルキルまたはＣ３－Ｃ１８アルケニル；アミノ基の保
護基；－Ｃ（ＮＨ）－ＮＨ_２；およびポリ（エチレングリコール）鎖から選択され；
かつ、式中、式（ＩＩＩ）で示される窒素原子の１つ以上がプロトン化されて、式（ＩＩ
Ｉ）のカチオン性基を提供してもよい；および
ｃ）式（ＩＶ）の構造を有するリピドイド：

【化4】

式中、変数ａ、ｂ、ｐ、ｍ、ｎおよびＲ^１～Ｒ^６は、以下のように定義される：
ａは１でありかつｂは２～４の整数であり；または、ａは２～４の整数でありかつｂは１
であり、
ｐは１または２であり、
ｍは１または２であり；ｎは０または１でありかつｍ＋ｎは≧２であり；かつ
Ｒ^１～Ｒ^６は、互いに独立して、水素；基－ＣＨ_２－ＣＨ（ＯＨ）－Ｒ^７、－ＣＨ（Ｒ^７
）－ＣＨ_２－ＯＨ、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－Ｒ^７、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－（Ｃ
＝Ｏ）－ＮＨ－Ｒ^７または－ＣＨ_２－Ｒ^７から選択され、式中、Ｒ^７は、１つのＣ－Ｃ二
重結合を有するＣ３－Ｃ１８アルキルまたはＣ３－Ｃ１８アルケニル；アミノ基の保護基
；－Ｃ（ＮＨ）－ＮＨ_２；ポリエチレングリコール鎖；および受容体リガンド；ただし、
Ｒ^１～Ｒ^６のうち少なくとも２つの残基が、基－ＣＨ_２－ＣＨ（ＯＨ）－Ｒ^７、－ＣＨ（
Ｒ^７）－ＣＨ_２－ＯＨ、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－（Ｃ＝Ｏ）－Ｏ－Ｒ^７、－ＣＨ_２－ＣＨ_２－
（Ｃ＝Ｏ）－ＮＨ－Ｒ^７または－ＣＨ_２－Ｒ^７であり、式中、Ｒ^７は、１つのＣ－Ｃ二重
結合を有するＣ３－Ｃ１８アルキルまたはＣ３－Ｃ１８アルケニルから選択され；
かつ、式中、式（ＩＶ）で示される窒素原子の１つ以上がプロトン化されて、式（ＩＶ）
のカチオン性リピドイドを提供してもよい。

【0086】

好ましくは、このような薬剤または試薬が、ａ）およびｂ）から選択されるオリゴ（ア
ルキレンアミン）（を含む成分）であり得、
ａ）側鎖および／または末端基として式（ＩＩａ）の複数の基を含むオリゴマーまたはポ
リマーである：
－ＮＲ^２｛ＣＨ_２－（ＣＨ_２）_ａ－ＮＲ^３－ＣＨ_２－（ＣＨ_２）_ｂ－ＮＲ^４｝_ｍ－［
ＣＨ_２－（ＣＨ_２）_ａ－ＮＲ^５］_ｎ－Ｒ^６ （ＩＩａ）、
式中、ａ、ｂ、ｍ、ｎ、およびＲ^２～Ｒ^６は上記のように定義され、式（ＩＩａ）に示さ
れる窒素原子の１つ以上はプロトン化されて、カチオン性オリゴマーまたはポリマー構造
を提供し得る、および
ｂ）式（ＩＩＩａ）の複数のグループを繰り返し単位として含むオリゴマーまたはポリマ
ーである：
－ＮＲ^２｛ＣＨ_２－（ＣＨ_２）_ａ－ＮＲ^３－ＣＨ_２－（ＣＨ_２）_ｂ－ＮＲ^４｝_ｍ－［
ＣＨ_２－（ＣＨ_２）_ａ－ＮＲ^５］_ｎ－ （ＩＩＩａ）、
式中、ａ、ｂ、ｍ、ｎ、およびＲ^２～Ｒ^５は上記のように定義され、式（ＩＩＩａ）に示
される窒素原子の１つ以上はプロトン化されて、カチオン性オリゴマーまたはポリマー構
造を提供し得る。

【0087】

さらに、このような薬剤または試薬は、（式（ＩＶａ）の構造を有するリピドイドから
選択されるオリゴ（アルキレンアミン）を含む成分であってもよい：
Ｒ^１－ＮＲ^２｛ＣＨ_２－（ＣＨ_２）_ａ－ＮＲ^３－ＣＨ_２－（ＣＨ_２）_ｂ－ＮＲ^４｝_ｍ
－［ＣＨ_２－（ＣＨ_２）_ａ－ＮＲ^５］_ｎ－Ｒ^６ （ＩＶａ）、
式中、ａ、ｂ、ｍ、ｎ、およびＲ^６へのＲ^１は上記のように定義され、式（ＩＶａ）に示
される窒素原子の１つ以上はプロトン化されて、カチオン性リピドイドを提供し得る。

【0088】

このような薬剤または試薬に関して、式（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩＩ）、（ＩＩＩ
ａ）、（ＩＶ）または（ＩＶａ）において、ｎは１であってもよく；またはｍは１であっ
てもよく、ｎは１であってもよい。

【0089】

さらに、このような薬剤または試薬については、式（ＩＩ）、（ＩＩａ）、（ＩＩＩ）
、（ＩＩＩａ）、（ＩＶ）または（ＩＶａ）において、ａは１であり、ｂは２であっても
よく；またはａは２であり、ｂは１であってもよい。

【0090】

いくつかの実施形態では、オリゴマー、ポリマー、またはリピドイドはカチオン性（例
、プロトン化）オリゴマー、ポリマー、またはリピドイドであってもよい。

【0091】

使用されるこのようなオリゴマー、重合体またはリピドイドの非限定的な一例は、１０
０ｍｇのＮ，Ｎ’－ビス（２－アミノエチル）－１，３－プロパンジアミン（０．６２３
ｍｍｏｌ）を５７５．０７ｍｇの１，２－エポキシドデカン（３．１２ｍｍｏｌ）（Ｎ－
１）当量（ここで、Ｎは２×量の第１級アミンと１×量の第２級アミン／オリゴ（アルキ
レンアミン））と混合し、８０℃で一定の振盪下で９６時間混合することによって調製さ
れたカチオン性脂質である。このようなオリゴマー、重合体またはリピドイドは、リピド
イド「Ｃ１２－（２－３－２）」とも呼ばれる。

【0092】

使用される薬剤または試薬、特にポリマーは、コポリマー、特に統計的コポリマーであ
ってもよい。このようなコポリマーは（例えば、非交互長さのアルキレンアミン繰り返し
単位の類似の配置を含有するあまり好ましくないポリマーとは対照的に）交互長さのアル
キレンアミン繰り返し単位の統計的／ランダム配置を含有するコポリマーであってもよい
。コポリマーはカチオン性（例えば、プロトン化）コポリマーであってもよい。使用され
るコポリマーは当該技術分野で公知であり、例えば、ＥＰ １４ １９ ９４３９．２、
国際公開第０１／００７０８号、ＥＰ－Ａ１ １ １９８ ４８９およびＣＡ－Ａ１ ２
，３７７，２０７に記載されている。

【0093】

特に、コポリマーは、以下の式（ａ１）および（ａ２）の繰り返し単位から独立して選
択される複数の繰り返し単位（ａ）を含む統計的コポリマーであってもよい：

【化5】

、および
下記式（ｂ１）～（ｂ４）の繰り返し単位から独立して選択される複数の繰り返し単位（
ｂ）：

【化6】

式中、繰り返し単位（ａ）の合計と繰り返し単位（ｂ）の合計とのモル比は、０．７／
１．０～１．０／０．７の範囲内であり、かつ
式中、コポリマーに含まれる繰り返し単位（ａ）および／または（ｂ）の窒素原子の１
つ以上は、プロトン化されてカチオン性コポリマーを提供してもよい。

【0094】

コポリマーは、任意の繰り返し単位（ａ）および任意の繰り返し単位（ｂ）がコポリマ
ー高分子中に統計的に分布している統計的コポリマーであってもよい。それは、典型的に
は重合反応の間に、繰り返し単位（ａ）をモノマーと生じ、重合反応の間に、繰り返し単
位（ｂ）を生じるモノマーの混合物の共重合から得られる。好ましくは、コポリマーが任
意の繰り返し単位（ａ）および任意の繰り返し単位（ｂ）がポリマー高分子中にランダム
に分布しているランダムコポリマーである。

【0095】

このようなコポリマーは、線状、分岐または樹枝状コポリマーであり得る。当業者には
理解されるように、式（ａ１）、（ｂ１）または（ｂ３）の繰り返し単位は２つの原子価
（すなわち、隣接する単位への開放結合）を有し、線形様式でコポリマー構造の伝搬をも
たらす。したがって、線状コポリマーは式（ａ１）の繰り返し単位、ならびに式（ｂ１）
および（ｂ３）の繰り返し単位の１つ以上の型を含み得るが、式（ａ２）、（ｂ２）また
は（ｂ４）の繰り返し単位を含まない。さらに理解されるように、３つの原子価を有する
式（ａ２）、（ｂ２）または（ｂ４）の繰り返し単位の存在は、コポリマー構造中に分岐
点を提供する。したがって、分岐コポリマーは式（ａ２）、（ｂ２）および（ｂ４）の繰
り返し単位の１つまたは複数のタイプを含み、式（ａ１）、（ｂ１）および（ｂ３）の繰
り返し単位の１つまたは複数のタイプをさらに含むことができる。

【0096】

このようなコポリマーは、上記で定義された式（ａ１）および（ａ２）の繰り返し単位
から独立して選択される複数の繰り返し単位（ａ）と、上記で定義された式（ｂ１）～（
ｂ４）の繰り返し単位から独立して選択される複数の繰り返し単位（ｂ）とを含むことが
できる。好ましいのは、上記で定義された式（ａ１）および（ａ２）の繰り返し単位から
独立して選択される複数の繰り返し単位（ａ）と、上記で定義された式（ｂ１）および（
ｂ２）の繰り返し単位から独立して選択される複数の繰り返し単位（ｂ）とを含むコポリ
マーである。

【0097】

好ましくは、このようなコポリマーが繰り返し単位（ａ２）、（ｂ２）および（ｂ４）
から選択される１つ以上のタイプの繰り返し単位を含み、任意選択で式（ａ１）、（ｂ１
）および（ｂ３）の繰り返し単位の１つ以上のタイプをさらに含み、特に式（ａ２）の繰
り返し単位および式（ｂ２）および（ｂ４）の繰り返し単位の１つ以上のタイプを含み、
任意選択で式（ａ１）、（ｂ１）および（ｂ３）の繰り返し単位の１つ以上のタイプをさ
らに含むコポリマーである。したがって、上記に沿って、より好ましいコポリマーは式（
ａ２）の繰り返し単位および式（ｂ２）の繰り返し単位を含み、任意選択で式（ａ１）お
よび（ｂ１）の繰り返し単位の１つまたは複数のタイプをさらに含む分岐コポリマーであ
る。

【0098】

コポリマーにおいて、繰り返し単位（ａ）および繰り返し単位（ｂ）の総数は、典型的
には２０以上、好ましくは５０以上、より好ましくは１００以上である。典型的には、繰
り返し単位（ａ）および繰り返し単位（ｂ）の総数が１０，０００以下、好ましくは５，
０００以下、より好ましくは１，０００以下である。

【0099】

さらに、繰り返し単位（ａ）および（ｂ）が、コポリマー中の全ての繰り返し単位の８
０モル％以上、より好ましくは９０モル％以上を占めることが、コポリマーにとって好ま
しい。さらに好ましいのは、（ａ１）および（ａ２）から選択される繰り返し単位（ａ）
ならびに（ｂ１）および（ｂ２）から選択される繰り返し単位（ｂ）がコポリマー中のす
べての繰り返し単位の８０モル％以上、より好ましくは９０モル％以上をアカウントコポ
リマーである。コポリマー中の繰り返し単位の全てが繰り返し単位（ａ）または（ｂ）で
あることが最も好ましく、特にコポリマー中の繰り返し単位の全てが（ａ１）および（ａ
２）から選択される繰り返し単位（ａ）または（ｂ１）および（ｂ２）から選択される繰
り返し単位（ｂ）であることが最も好ましい。

【0100】

コポリマーの重量平均分子量は例えば、線状ポリ（エチレンオキシド）標準に対するサ
イズ排除クロマトグラフィーによって測定される場合、一般に、１，０００～５００，０
００Ｄａ、好ましくは２，５００～２５０，０００Ｄａ、より好ましくは５，０００～５
０，０００Ｄａ未満の範囲である。

【0101】

このようなコポリマーの末端基は典型的には下記の式（ｃ１）～（ｃ３）の群から、好
ましくは下記の式（ｃ１）および（ｃ２）の群から独立して選択される１つ以上のタイプ
の基（ｃ）を含む：

【化7】

。

【0102】

好ましくは、コポリマー中の末端基が以下の式（ｃ１）～（ｃ３）の群から、好ましく
は式（ｃ１）および（ｃ２）の群から独立して選択される１つ以上のタイプの基（ｃ）か
らなる。当業者には理解されるように、末端基の数はコポリマーの構造に依存する。線状
コポリマーは２つの末端のみを有するが、より多数の末端基が分岐、特に樹枝状コポリマ
ーに含まれる。さらに理解されるように、コポリマーに含まれる末端基（ｃ）の窒素原子
の１つ以上もプロトン化されて、カチオン性コポリマーを提供することができる。

【0103】

コポリマーにおいて、繰り返し単位（ａ）の合計と繰り返し単位（ｂ）の合計とのモル
比は０．７／１．０～１．０／０．７の範囲内にあり、好ましくは０．８／１．０～１．
０／０．８の範囲内にある。このモル比は、例えばＮＭＲによって決定することができる
。したがって、この比は通常、コポリマーの複数の高分子について決定され、典型的には
複数の高分子中の繰り返し単位（ａ）の合計と繰り返し単位（ｂ）の合計との全体的な比
を示すことが理解されるのであろう。

【0104】

上に示したように、コポリマーの窒素原子の１つ以上をプロトン化して、カチオン性形
態、典型的にはオリゴカチオン性形態またはポリカチオン性形態のコポリマーをもたらす
ことができる。繰り返し単位（ａ）もしくは（ｂ）または末端基（ｃ）中の第一級、第二
級、または第三級アミノ基は、特に水および水溶液（生理学的流体を含む）中でプロトン
受容体として作用し得ることが理解される。したがって、このようなコポリマーは、典型
的にはｐＨ７．５未満の水溶液中で全体的に正の電荷を有する。本明細書で言及される水
溶液は、溶媒が５０％（ｖｏｌ．／ｖｏｌ．）以上、好ましくは８０または９０％以上、
最も好ましくは１００％の水を含む溶液である。また、組成物が例えば血液および肺液を
含む、７．５未満のｐＨを有する生理学的流体と接触している場合、それらは、典型的に
は窒素原子がプロトン化されている繰り返し単位（ａ）および（ｂ）を含有する。組成物
中で使用されるコポリマーのｐＫ_ａ値は、自動ｐＫ_ａ滴定器を使用する酸－塩基滴定によ
って決定することができる。次いで、所与のｐＨ値における正味電荷を、例えば、Ｈｅｎ
ｄｅｒｓｏｎ－Ｈａｓｓｅｌｂａｃｈの式から計算することができる。任意の充電は、い
くつかの基本センターにわたって共有されてもよく、必ずしも単一のポイントに帰するこ
とができない。典型的には生理学的ｐＨの溶液において、組成物において使用されるコポ
リマーはプロトン化された状態のアミノ基を有する繰り返し単位およびプロトン化されて
いない状態のアミノ基を有する繰り返し単位を含む。

【0105】

しかしながら、当業者によって理解されるように、コポリマーならびに組成物はまた、
カチオン性形態でコポリマーを含有する乾燥塩形態として提供されてもよい。

【0106】

さらに理解されるように、コポリマーおよび核酸、特にＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡ等
の一本鎖ＲＮＡを含む組成物中のプロトン化されたアミノ基の正電荷に対する対イオン（
アニオン）は、典型的には核酸中に含有されるアニオン部分によって提供される。正に荷
電した基が、核酸中のアニオン性部分と比較して過度に存在する場合、正電荷は他のアニ
オン、特に、Ｃｌ^－またはＨＣＯ_３ ^－のような生理学的流体中で典型的に遭遇するアニ
オンによってバランスされ得る。

【0107】

上記にしたがって、好ましいコポリマーは、ランダムコポリマーである
全ての繰り返し単位の８０モル％以上、より好ましくは全ての繰り返し単位は、によって
形成される
下記式（ａ１）および（ａ２）の繰り返し単位から独立して選択される複数の繰り返し単
位（ａ）：

【化8】

、および
下記式（ｂ１）および（ｂ２）の繰り返し単位から独立して選択される複数の繰り返し単
位（ｂ）：

【化9】

、
式中、繰り返し単位（ａ）の合計と繰り返し単位（ｂ）の合計とのモル比は０．７／１．
０～１．０／０．７の範囲内にあり、より好ましくは０．８／１．０～１．０／０．８の
範囲内にある；
式中、コポリマーの末端基は、によって形成される
式（ｃ１）および（ｃ２）の群から独立して選択される群（ｃ）：

【化10】

；および
式中、コポリマーに含まれる繰り返し単位（ａ）および／または（ｂ）および／または末
端基（ｃ）の窒素原子の１つ以上は、プロトン化されてカチオン性コポリマーを提供して
もよい。コポリマーは、単位（ａ２）および（ｂ２）を、場合により単位（ａ１）および
／または（ｂ１）と一緒に含む分岐コポリマーであることがさらに好ましい。

【0108】

コポリマーは、分岐または直鎖ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）のような、ポリアルキレ
ンイミンの調製について公知のものと類似の手順で都合よく調製することができる。コポ
リマーの製造に使用されるモノマーは、それに応じて調整されなければならないことが理
解されるのであろう。ここで、重合に供する単量体混合物において、単量体比を適宜調整
することにより、コポリマー中の単位（ａ）および（ｂ）の割合を調整できるように、単
量体を定量的に簡便に反応させることができることを見出した。ポリエチレンイミンは例
えばアジリジンの開環重合によって調製することができるが、コポリマーはアジリジン、
アゼチジン、および適用可能な場合にはピロリジン、または好ましい実施形態ではアジリ
ジンおよびアゼチジンを含むかまたはそれらからなるモノマー混合物の開環重合によって
調製することができる。「適用可能な場合」という表現は、ピロリジンによって形成され
る繰り返し単位（ｂ３）および（ｂ４）または末端基（ｃ３）の有無を指すことが理解さ
れるのであろう。非置換環状アミンの開環重合は、通常、分岐コポリマーをもたらす。線
状コポリマーは例えば、Ｋａｔｒｉｅｎ Ｆ． Ｗｅｙｔｓ， Ｅｒｉｃ Ｊ． Ｇｏｅ
ｔｈａｌｓ， Ｎｅｗ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｌｉｎｅａｒ ｐｏｌｙｅｔｈｙｌ
ｅｎｅｉｍｉｎｅ， Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ， １９８８， １９（１）：
１３－１９に公開された手順に類似して、例えば、適切なＮ－置換アジリジン、Ｎ－置換
アジリジンおよびＮ－置換ピロリジン、またはＮ－置換アジリジンおよびＮ－置換アジリ
ジンの重合を介して調製することができ、これに続いて、例えば、得られたポリアルキレ
ンイミン鎖に結合したＮ－置換基の加水分解開裂を行うことができる。デンドリマーは例
えば、Ｙｅｍｕｌ ｅｔ ａｌ， Ｃｏｌｌｏｉｄ ａｎｄ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ， ２００８， ２８６（６－７）：７４７－７５２， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａ
ｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ
） ｄｅｎｒｉｍｅｒｓに記載されている方法にしたがって合成することができる。

【0109】

デンドリマー（または樹枝状コポリマー）の調製のために、ポリエチレンイミンまたは
ポリプロピレンアミンデンドリマーの製造について知られている合成戦略を同様に適用す
ることができる。ポリプロピレニミンデンドリマーは第一級アミンへのマイケル付加の反
復配列を用いて、アクリロニトリル構成単位から合成することができ、次いで、不均一触
媒水素化を用いて合成することができる（Ｎｅｗｋｏｍｅ ａｎｄ Ｓｈｒｅｉｎｅｒ
Ｐｏｌｙ（ａｍｉｄｏａｍｉｎｅ）， ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｉｍｉｎｅ， ａｎｄ
ｒｅｌａｔｅｄ ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ ａｎｄ ｄｅｎｄｒｏｎｓ ｐｏｓｓｅｓｓ
ｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ １→２ ｂｒａｎｃｈｉｎｇ ｍｏｔｉｆｓ： Ａｎ ｏ
ｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ． Ｐｏｌ
ｙｍｅｒ ４９ （２００８） １－１７３； Ｄｅ Ｂｒａｂａｎｄｅｒ－Ｖａｎ Ｄ
ｅｎ Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ． Ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｉｍｉｎｅ ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ， Ｍａｃｒｏｍｏｌｅ
ｃｕｌａｒ Ｓｙｍｐｏｓｉａ （１９９４） ７７ （１） ５１-６２）。ポリエチ
レンイミンデンドリマーは臭化ビニルビルビルディングブロックを第一級アミンにマイケ
ル付加し、続いてガブリエルアミン合成方法を用いてアルキルブロミドをアミンに変換す
るというマイケル付加の反復配列を用いて製造することができる（Ｙｅｍｕｌ ＆ Ｉｍ
ａｅ， Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｏ
ｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｉｍｉｎｅ） ｄｅｎｄｒｉｍｅｒｓ， Ｃｏｌｌｏｉｄ Ｐｏ
ｌｙｍ Ｓｃｉ （２００８） ２８６：７４７-７５２）。したがって、当業者は、例
えばプロピレンイミンとエチレンイミンとの厳密に交互の層を有するデンドリマーを製造
することができるだけでなく、製造することができる。同様に、式（ａ２）、（ｂ２）お
よび（ｂ４）の繰り返し単位、および好ましくは繰り返し単位（ａ２）および（ｂ２）の
ランダム組成物を含むか、またはそれらからなる層を有するデンドリマー世代を生成する
ことができる。

【0110】

アジリジンおよびアゼチジン、またはアジリジン、アゼチジンおよびピロリジンの開環
重合は、溶液中、例えば水中で行うことができる。全モノマー濃度は特に限定されず、典
型的な濃度は、１０％ ｗｔ／ｗｔ～８０％ ｗｔ／ｗｔ、好ましくは３０％ ｗｔ／ｗ
ｔ～６０％ ｗｔ／ｗｔの範囲である。典型的には、重合はプロトンによって開始される
ので、ブレンステッド酸、特に硫酸のような鉱酸を反応系に添加することが好ましい。モ
ノマーの全濃度に基づいて、０．００１～０．０１当量等の少量の酸が一般に十分である
。反応は、好都合な速度、例えば５０～１５０℃、特に９０～１４０℃の温度域で進行す
る。これらの範囲において、より高分子量のコポリマーは通常、より高い温度であり、よ
り低い温度ではより低い分子量のコポリマーである。

【0111】

原則として、リピドイドは、特にオリゴマーと比較して、およびより具体的にはポリマ
ーに対して使用される好ましい薬剤または試薬である。

【0112】

ＲＮＡを標的細胞または標的組織に送達および／または導入するための１つ以上の薬剤
または１つ以上の試薬のさらなる例は、本明細書の他の箇所に記載されるようなリポソー
ムトランスフェクション試薬（ＬＴＲ’ｓ）および磁性粒子（ＭＰ）である。

【0113】

ＲＮＡをターゲット細胞またはターゲット組織に送達および／または導入するための１
つの特定の様式は、トランスフェクションである。したがって、使用されるＲＮＡは、（
標的）細胞または組織に）トランスフェクトされること、トランスフェクションを介して
送達／投与されること、および／またはトランスフェクションのために調製されることが
想定され得る。ＲＮＡをトランスフェクトするための手段および方法は当該分野で周知で
あり、そして例えば、Ｔａｖｅｒｎｉｅｒ（前出）、Ｙａｍａｍｏｔｏ（Ｅｕｒ Ｊ Ｐ
ｈａｒｍ Ｂｉｏｐｈａｒｍ．７１（３）（２００９）、４８４－９）およびＫｏｒｍａ
ｎｎ（Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９（２）（２０１１）、１５４－７）に記載さ
れる。トランスフェクションの特定の様式は、リポフェクション、マグネトフェクション
またはマグネトポリポフェクションである。

【0114】

したがって、使用されるＲＮＡは、リポフェクションのために調製され得、リポフェク
ションによってトランスフェクトされるように調製され得、リポフェクションによって送
達／導入され得、および／またはリポフェクションによって投与され得る。

【0115】

したがって、医薬組成物は、（さらに）少なくとも１つの脂質またはリポソームトラン
スフェクション試薬またはエンハンサー（ＬＴＲ；リポソームトランスフェクション試薬
）を含んでもよい。使用されるＲＮＡは、ＬＴＲに含まれ、ＬＴＲと複合体化され、およ
び／またはＬＴＲによって送達されてもよい。特に、使用されるＲＮＡは、ＲＮＡおよび
ＬＴＲを含む（それぞれの）リポフェクション錯体に含まれ、および／またはそれによっ
て送達され得る。医薬組成物は、（さらに）リポフェクション錯体を含み得る。

【0116】

ＬＴＲは当技術分野で公知であり、例えば、ＯｚＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｒｓｅ
ｉｌｌｅ、Ｆｒａｎｃｅによって販売されている。使用されるＬＴＲは、ＲＮＡを標的細
胞または標的組織に送達および／または導入するための上記の薬剤または試薬からなる群
から選択され得る。例えば、このようなＬＴＲはＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０６３７５６（
例えば、Ｃ１２－（２－３－２））に開示されるようなリピドイド、ＥＰ２２８５７７２
（例えば、Ｄｏｇｔｏｒ）に開示されるような脂質、およびＥＰ１００３７１１（例えば
、ＤｒｅａｍＦｅｃｔ（商標）およびＤｒｅａｍＦｅｃｔ Ｇｏｌｄ（商標））に開示さ
れるようなリポポリアミンのような、脂質またはリピドイド、好ましくはカチオン性脂質
またはカチオン性脂質であり得る。特定のＬＴＲはからなる群から選択されてもよい
（ｉ） Ｃ１２－（２－３－２）；
（ｉｉ） ＤｒｅａｍＦｅｃｔ（商標）、好ましくはドリームフェクトＧｏｌｄ（商標
）（ＤＦ（商標）／ＤＦ－Ｇｏｌｄ（商標）；ＯｚＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｒｓｅ
ｉｌｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）；
（ｉｉｉ） Ｄｏｇｔｏｒ （ＯｚＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ、Ｆｒ
ａｎｃｅ）；および
（ｉｖ） 例えば、リポフェクトアミン ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ、ＣＡ、
ＵＳＡ）のようなリポフェクトアミン。

【0117】

原則として、ドガーが好ましい、ＤｒｅａｍＦｅｃｔ（商標）がより好ましい、そして
ＤＦ－Ｇｏｌｄ（商標）とＣ１２－（２－３－２）はさらに好ましいＬＴＲである。

【0118】

ＤｏｇｔｏｒのようなＬＴＲは例えば、ＥＰ２２８５７７２に記載されている。たとえ
ば、ＤＦ（商標）やＤＦ－Ｇｏｌｄ（商標）等のＬＴＲはＥＰ１００３７１１ で説明さ
れている。原則として、ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０６３７５６に開示されているようなオ
リゴマー、重合体または脂質、ＥＰ２２８５７７２に開示されているような特定のカチオ
ン性脂質、およびＥＰ１００３７１１に開示されているような特定のリポポリアミンが好
ましいＬＴＲである。Ｃ１２－（２－３－２） やＤＦ－Ｇｏｌｄ（商標）等のＬＴＲが
最も優先される。

【0119】

リポフェクション錯体の非限定的な例は、ＤＦ－Ｇｏｌｄ（商標）／ＲＮＡリポプレッ
クスおよびＣ１２－（２－３－２）／ＲＮＡリポプレックスである。

【0120】

Ｃ１２－（２－３－２）は式（Ｖ）に示される構造を有する特に好ましいＬＴＲである
（Ｊａｒｚｅｂｉｎｓｋａら、Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．，２０
１６； ５５（３３）：９５９１－５を参照）：

【化11】

【0121】

Ｃ１２－（２－３－２）は好ましくは例えば、国際公開第２０１６／０７５１５４号パ
ンフレット、ＥＰ ３０１３９６４、およびＪａｒｚｅｂｉｎｓｋａら（Ａｎｇｅｗ Ｃ
ｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ．，２０１６；５５（３３）：９５９１－５）に記載さ
れるように調製される。カチオン性脂質はＮ１－（２－アミノエチル）－Ｎ３－（２－（
（３，４－ジメトキシベンジル）アミノ）エチル）プロパン－１，３－ジアミン（８．９
ｇ、１当量、２８．６７ｍｍｏｌ）を１，２－エポキシドデカン（４２．２７、８当量、
２２９．４ｍｍｏｌ）と混合し、一定の振盪下で８０℃で２４時間混合し、続いて精製し
、３，４－ジメトキシベンジル保護基を除去することによって調製することができる。

【0122】

ラセミ体、Ｓ－異性体、および／またはＲ－異性体等のＣ１２－（２－３－２）の異な
る異性体を使用することができる。好ましくは、Ｃ１２－（２－３－２）は純粋なＲ－異
性体として使用され、式（ＶＩ）に示される構造を有する。Ｃ１２－（２－３－２）の純
粋なＲ－異性体を得るために、合成のために１，２－エプキソイドデカンのＲ－異性体を
用いて、Ｃ１２－（２－３－２）について上記のように調製することができる。

【化12】

【0123】

したがって、好ましい実施形態において、医薬組成物は、繊毛病の治療に使用するため
のポリリボヌクレオチドを含み、式（Ｖ）に示される、好ましくは式（ＶＩ）に示される
ような、構造を有するリピドイドをさらに含む。

【0124】

さらに特に好ましいＬＴＲは式（ＶＩＩ）を有するカチオン性リピドイドであり、本明
細書では「ｄＬ＿Ｐ」とも呼ばれ、これは、触媒としてホウ酸を使用して、Ｎ，Ｎ’－ビ
ス（２－アミノエチル）－１，３－プロパンジアミンとＮ－ドデシルアクリルアミドとの
反応によって合成することができる。反応のために、混合物は、マイクロ波照射下で１０
０℃で撹拌することができる。

【0125】

したがって、さらなる好ましい実施形態では、医薬組成物が繊毛病の治療に使用するた
めのポリリボヌクレオチドを含み、さらにリピドイドを含む式（ＶＩＩ）で示される構造
を有する。

【化13】

【0126】

さらに、医薬組成物は、以下に記載する製剤に含まれる式（Ｖ）、（ＶＩ）および／ま
たは（ＶＩＩ）、好ましくはｄＬ＿Ｐおよび／またはＣ１２－（２－３－２）、より好ま
しくはｄＬ＿Ｐおよび／またはＣ１２－（２－３－２）のＲ－異性体を有するカチオン性
脂質を含む。特に、本明細書に記載のＲＮＡを標的細胞または標的組織に送達および／ま
たは導入するための薬剤および試薬、ならびに本明細書に記載のＬＴＲは１つ以上（例え
ば、２つ、３つ、または４つ）のさらなる脂質（例えば、コレステロール、ＤＰＰＣ、Ｄ
ＯＰＥおよび／またはＰＥＧ脂質（例えば、ＤＭＰＥ－ＰＥＧ、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００
））と組み合わせることができる。これらのさらなる脂質は薬剤／試薬およびＬＴＲの所
望の機能を支持し得（それぞれ、細胞または組織へのＲＮＡの送達および／または導入を
支持および／または増加させ、そしてトランスフェクション効率を改善し得る）、そして
それぞれの「ヘルパー脂質」として機能し得る；このような「ヘルパー脂質」の特定の例
はコレステロール、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥおよび／またはＰＥＧ脂質（例えば、ＤＭＰＥ－
ＰＥＧ、ＤＭＧ－ＰＥＧ（例えば、ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００））である。さらなる脂質（
例えば、「ヘルパー脂質」）はまた、本明細書中に開示される錯体／粒子の一部であり得
る。当業者は、本発明にしたがって錯体／粒子を調製する立場に容易にある。さらなる脂
質（例えば、「ヘルパー脂質」）の例もまた、当該分野で公知である。当業者は適切なさ
らなる脂質（例えば、「ヘルパー脂質」）および薬剤／試薬／ＬＴＲおよびさらなる脂質
（例えば、「ヘルパー脂質」）の比を選択する立場に容易にある。そのようなモル比１－
４ ： １－５、３－４ ： ４－６、約４：約５、約４：約５：薬剤／試薬／ ＬＴＲ
の約５．３：さらに脂質（ｓ）である（より狭い範囲が望ましい）。例えば、薬剤／試薬
／ＬＴＲはそれぞれ８ ： ５．３ ： ４．４ ： ０．９、またはより具体的にはそ
れぞれ８ ： ５．２９ ： ４．４１ ： ０．８８のモル比で、ＤＰＰＣ、コレステ
ロール、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２０００等の３つのさらなる脂質と組み合わせることがで
きる。

【0127】

好ましくは、ｄＬ＿Ｐおよび／またはＣ１２－（２－３－２）、より好ましくはｄＬ＿
Ｐおよび／またはＣ１２－（２－３－２）のＲ－異性体は上記のように生成され、リポイ
ド粒子を処方するために、ヘルパー脂質ＤＰＰＣおよびコレステロールならびにＰＥＧ－
脂質ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と共に８：５．２９：４．４１：０．８８のモル比で使用さ
れる。

【0128】

Ｃ１２－（２－３－２）のＲ－異性体（式ＶＩ）が脂質ＤＰＰＣおよびコレステロール
およびＰＥＧ－脂質ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と８：５．２９：４．４１：０．８８のモル
比で処方される組成物は本明細書では「ＬＦ９２」とも呼ばれる。ｄＬ＿Ｐ（式ＶＩＩ）
が脂質ＤＰＰＣおよびコレステロールおよびＰＥＧ－脂質ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と８：
５．２９：４．４１：０．８８のモル比で処方される組成物は本明細書では「ＬＦ１１１
」とも呼ばれる。

【0129】

また、例えば、国際公開第２０１６／０７５１５４ Ａ１号、ＥＰ ３０１３９６４、
およびＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． （ＴＥＲＭＩＳ， ２０１９， Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｎ
ｇｉｎｅｅｒｉｎｇ： Ｐａｒｔ Ａ， Ｖｏｌ． ２５， Ｎｕｍｂｅｒｓ １ ａｎ
ｄ ２）に例示的に記載されるように、ｄＬ＿Ｐおよび／またはＣ１２－（２－３－２）
は、ｍＲＮＡ分子のリピドイドおよびネガティブリン酸基の正アミノ基間の静電相互作用
に基づいて、ｍＲＮＡ分子との安定なリポプレックスを作製するための非ウイルスベクタ
ーとして使用され得る（Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ
１４， ２００３， １９１－２０２）。リポプレックス構造を安定化し、漏れを低減す
るために、ｄＬ＿Ｐおよび／またはＣ１２－（２～３～２）、より好ましくは、ｄＬ＿Ｐ
および／またはＣ１２－（２～３～２）のＲ－異性体に、１、２－ジパルミトイル－ｓｎ
－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）およびコレステロール（Ａｎｄｅｒｓｏｎ，
Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ １１， ２００４， ３３－３９； Ｌｉａｎｇ， Ｊ
ｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｌｌｉｏｄ ａｎｄ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ
２７８， ２００４， ５３－６２）と題する２つのヘルパー脂質を供給することができ
る。最後に、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロール、メトキシポリエチレングリ
コール（ＤＭＧ－ＰＥＧ）２ｋＤ（ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００）を脂質混合物に添加して、
ＰＥＧ化リポソームを提供する。ＰＥＧ化は水溶性を増加させ、酵素分解から保護し、免
疫原性および抗原性反応を制限することによって、リポソーム製剤の物理化学的特性を改
善することが既によく知られている（Ｍｉｌｌａ、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａ
ｂｏｌｉｓｍ １３、２０１２、１０５－１１９）。全体エタノール性脂質混合物の最終
Ｎ／Ｐ比は、ｍＲＮＡ分子の１つのリン酸基に対するｄＬ＿Ｐおよび／またはＣ１２－（
２－３－２）／ ＤＰＰＣ ／コレステロール／ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００のアミノ基のモ
ル比をそれぞれ表す８ ： ５．２９ ： ４．４１ ： ０．８８である。

【0130】

したがって、好ましい実施形態では、医薬組成物が繊毛病の治療に使用するためのポリ
リボヌクレオチドを含み、ＤＰＰＣ、コレステロール、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と
処方されたｄＬ＿Ｐおよび／またはＣ１２－（２－３－２）、好ましくはｄＬ＿Ｐおよび
／またはＣ１２－（２－３－２）のＲ－異性体をさらに含む。

【0131】

さらに、特に好ましい態様において、薬学的組成物は繊毛脂質の治療に使用するための
ポリリボヌクレオチドをさらに含み、好ましくはｄＬ＿Ｐおよび／またはＣ１２－（２－
３－２）、好ましくはｄＬ＿Ｐおよび／またはＣ１２－（２－３－２）のＲ－異性体を含
み、ＤＰＰＣ、コレステロール、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２０００とともに処方され、ｍＲ
ＮＡ分子の１つのリン酸基に対するｄＬ＿Ｐおよび／またはＣ１２－（２－３－２）／
ＤＰＰＣ ／コレステロール／ ＤＭＧ－ＰＥＧ２０００のアミノ基のモル比に対してそ
れぞれ８ ： ５．２９ ： ４．４１ ： ０．８８の最終Ｎ／Ｐ比を有する。

【0132】

上記のようにＤＰＰＣ、コレステロール、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と配合された
Ｃ１２－（２－３－２）のＲ－異性体は、ＬＦ９２配合物とも呼ばれる。

【0133】

したがって、繊毛病の治療に使用するためのポリリボヌクレオチドを含む医薬組成物の
特に好ましい実施形態において、前記医薬組成物は、ＬＦ９２配合をさらに含む。

【0134】

上記のようにＤＰＰＣ、コレステロール、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２０００と共に製剤化
されたｄＬ＿Ｐは、ＬＦ１１１製剤とも呼ばれる。

【0135】

したがって、繊毛病の治療に使用するためのポリリボヌクレオチドを含む医薬組成物の
特に好ましい実施形態において、前記医薬組成物は、ＬＦ１１１配合をさらに含む。

【0136】

繊毛病の治療に使用するためのポリリボヌクレオチドを含む医薬組成物の好ましい実施
形態において、前記医薬組成物は、ＬＦ９２および／またはＬＦ１１１配合をさらに含む
。ＬＦ９２および／またはＬＦ１１１は、細胞トランスフェクションに使用される担体製
剤を指す。これは、ＬＦ９２および／またはＬＦ１１１の使用が高いトランスフェクショ
ン効率に関連し、したがって、繊毛病に関連する欠損を有するタンパク質の機能的バージ
ョンをコードするポリリボヌクレオチドが細胞、好ましくは未分化毛様細胞または基底細
胞に効率的に入り、したがって、ＰＣＤに罹患している対象において毛様細胞機能を回復
することができることを確実にするので、有利である。

【0137】

特に好ましい実施形態において、医薬組成物は、ＬＦ９２および／またはＬＦ１１１配
合、以下のうちの少なくとも１つを含む：ＭＣＩＤＡＳタンパク質の機能的バージョンに
翻訳され得るｍＲＮＡ、ＧｅｍＣ１タンパク質の機能的バージョンに翻訳され得るｍＲＮ
Ａ、ＦｏｘＪ１タンパク質の機能的バージョンに翻訳され得るｍＲＮＡ、Ｅ２ｆ４ＶＰ１
６タンパク質の機能的バージョンに翻訳され得るｍＲＮＡ；ならびにＣＣＤＣ４０および
／またはＣＣＤＣ３９の機能的バージョンに翻訳され得るｍＲＮＡ。好ましくは、このよ
うな組成物がスプレー、液滴および／またはネブライザーを使用することによって、およ
び／または吸入によって、好ましくは１週間に少なくとも１回および／または少なくとも
４週間、患者に投与される。

【0138】

したがって、いくつかの実施形態では、医薬組成物が２つ以上、好ましくは２つのタン
パク質の機能的バージョンに翻訳され得るポリリボヌクレオチドを含むことを除いて、上
記の実施形態について記載されるのと同じことが適用される。したがって、いくつかの実
施形態において、上記の実施形態に記載される医薬組成物は、マルチシストロニックポリ
リボヌクレオチドを含む。

【0139】

本発明はまた、繊毛病に罹患している対象における繊毛病を治療する方法に関し、ポリ
リボヌクレオチドを含む医薬組成物の投与を含み、ポリリボヌクレオチドはその欠損が前
記繊毛病に関連するタンパク質の機能的バージョンをコードし、前記医薬組成物は、前記
対象の呼吸器系に投与され、対象が呼吸器系の炎症を示す場合に実施される。医薬組成物
の可能な実施形態および好ましい実施形態、ならびにその投与方法および投与時間に関し
て、本発明による医薬組成物に関連して本明細書中上記に記載されたのと同じことが適用
される。

【0140】

本発明はまた、欠損が繊毛病に関連するタンパク質をコードするポリリボヌクレオチド
、およびＮ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）、塩化ナトリウムを含む高張溶液、ならびに
／あるいはＬＦ９２および／もしくはＬＦ１１１配合を含む、医薬組成物に関する。

【0141】

医薬組成物およびその成分に関しては、繊毛病に罹患している対象における繊毛病の治
療に使用するためのポリリボヌクレオチドを含む医薬組成物に関連して上述したのと同じ
ことが当てはまる。さらに、そのような医薬組成物の他の特徴は、上記の通りであり得る
。

【0142】

したがって、好ましい実施形態では、医薬組成物がＭＣＩＤＡＳの機能的バージョンに
翻訳することができるｍＲＮＡをさらに含むことができる。

【0143】

本開示はまた、配列番号１または５～１１のいずれかに示されるヒトＣＣＤＣ４０をコ
ードするポリリボヌクレオチドに関する。

【0144】

本開示の前記のまたは他の態様および実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、
ポリリボヌクレオチドまたは修飾ポリリボヌクレオチドがヒトＣＣＤＣ４０（例えば、機
能的ヒトＣＣＤＣ４０）をコードし、配列番号１または５～１１の１つ以上（例えば、配
列番号１または５～１１に記載の配列）と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なく
とも９２％、または少なくとも９５％同一（例えば、少なくとも９５、９６、９７、９８
、９９または１００％同一）である一次配列を含む。

【0145】

特定の実施形態において、前記ポリリボヌクレオチドはその５’末端に、Ｔ７プロモー
ターの一部、Ｅｔｈｒｉｓ’ミニマル５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、ＣＹＢＡ ５’ＵＴＲ
、ヒトＣＣＤＣ４０タンパク質の機能的バージョンをコードするコドン最適化配列が続く
Ｋｏｚａｋエレメント、ＣＹＢＡ ３’ＵＴＲ、およびポリ（Ａ）テール（例えば、配列
番号１を参照）を含む。
特定の実施形態において、前記ポリリボヌクレオチドはその５’末端に、Ｔ７プロモータ
ーの一部、Ｅｔｈｒｉｓ’ミニマル５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、ヒトＣＣＤＣ４０タンパ
ク質の機能的バージョンをコードするコドン最適化配列が続くＫｏｚａｋエレメント、お
よびポリ（Ａ）テール（例えば、配列番号５を参照）を含む。

【0146】

特定の実施形態において、前記ポリリボヌクレオチドはその５’末端に、Ｔ７プロモー
ターの一部、Ｅｔｈｒｉｓ’ミニマル５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、さらなるＵヌクレオチ
ド、ヒトＣＣＤＣ４０タンパク質の機能的バージョンをコードするコドン最適化配列が続
くＴＩＳＵエレメント、およびポリ（Ａ）テール（例えば、配列番号６を参照）を含む。

【0147】

特定の実施形態において、前記ポリリボヌクレオチドはその５’末端に、Ｔ７プロモー
ターの一部、Ｅｔｈｒｉｓ’ミニマル５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、ｈＡｇ ５’ＵＴＲ、
ヒトＣＣＤＣ４０タンパク質の機能的バージョンをコードするコドン最適化配列が続くＫ
ｏｚａｋエレメント、およびポリ（Ａ）テール（例えば、配列番号７を参照）を含む。

【0148】

特定の実施形態において、前記ポリリボヌクレオチドはその５’末端に、Ｔ７プロモー
ターの一部、Ｅｔｈｒｉｓ’ミニマル５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、ヒトＣＭＶ ＩＥ９
５’ＵＴＲ、ヒトＣＣＤＣ４０タンパク質の機能的バージョンをコードするコドン最適化
配列、ヒト成長ホルモン３’ＵＴＲ、およびポリ（Ａ）テール（例えば、配列番号８を参
照）を含む。

【0149】

特定の実施形態において、前記ポリリボヌクレオチドはその５’末端に、Ｔ７プロモー
ターの一部、Ｅｔｈｒｉｓ’ミニマル５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、Ｋｏｚａｋエレメント
、ＥＧＦＰコード配列、Ｇ４Ｓスペーサー、続いてヒトＣＣＤＣ４０タンパク質の機能的
バージョンをコードするコドン最適化配列、およびポリ（Ａ）テール（例えば、配列番号
９を参照）を含む。

【0150】

特定の実施形態において、前記ポリリボヌクレオチドはその５’末端に、Ｔ７プロモー
ターの一部、Ｅｔｈｒｉｓ’ミニマル５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、ヒトＣＣＤＣ４０タン
パク質の機能的バージョンをコードするコドン最適化配列、Ｇ４Ｓスペーサー、ＥＧＦＰ
コード配列、およびポリ（Ａ）テール（例えば、配列番号１０を参照）を含む。

【0151】

特定の実施形態において、前記ポリリボヌクレオチドはその５’末端に、Ｔ７プロモー
ターの一部、Ｅｔｈｒｉｓ’ミニマル５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、ＣＹＢＡ ５’ＵＴＲ
、Ｋｏｚａｋエレメント、続いてＨＡタグ、Ｇ４Ｓスペーサー、ヒトＣＣＤＣ４０タンパ
ク質の機能的バージョンをコードするコドン最適化配列、Ｔ２Ａペプチド、ｔｄＴｏｍａ
ｔｏをコードする配列、ＣＹＢＡ ３’ＵＴＲ、およびポリ（Ａ）テール（例えば、配列
番号１１を参照）を含む。
いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドが本明細書に記載の任意のそのようなレ
ベルおよび／またはタイプから選択される修飾のレベルおよび／またはタイプを有する修
飾ポリリボヌクレオチドである。

【0152】

特定の実施形態において、ポリリボヌクレオチドのパーセント同一性は配列番号１また
は５～１１のＣＣＤＣ４０コード配列部分に関してのみ測定される（例えば、パーセント
同一性を計算する場合、ＵＴＲ、他の非コード配列およびＧＦＰまたはエピトープタグは
考慮されず、ポリリボヌクレオチドは、このような領域を含んでも含まなくてもよい）。

【0153】

前記のいずれかの特定の実施形態において、このようなポリリボヌクレオチド（または
修飾ポリリボヌクレオチド）は、機能的ＣＣＤＣ４０タンパク質をコードする。

【0154】

本開示はまた、配列番号２または１２～１４のいずれかに示されるヒトＣＣＤＣ３９を
コードするポリリボヌクレオチドに関する。

【0155】

本開示の前記のまたは他の態様および実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、
ポリリボヌクレオチドまたは修飾ポリリボヌクレオチドがヒトＣＣＤＣ３９をコードし、
配列番号２または１２～１４の１つ以上（例えば、配列番号２または１２～１４に記載の
配列）と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％または少なくとも９５
％同一（例えば、少なくとも９５、９６、９７、９８、９９または１００％同一）である
一次配列を含む。

【0156】

特定の実施形態において、前記ポリリボヌクレオチドはその５’末端に、Ｔ７プロモー
ターの一部、Ｅｔｈｒｉｓ’ミニマル５’ＵＴＲ、ＣＹＢＡ ５’ＵＴＲ、ヒトＣＣＤＣ
３９タンパク質の機能的バージョンをコードするコドン最適化配列が続くＫｏｚａｋエレ
メント、ＣＹＢＡ ３’ＵＴＲ、およびポリ（Ａ）テール（例えば、配列番号２を参照）
を含む。

【0157】

特定の実施形態において、前記ポリリボヌクレオチドはその５’末端に、Ｔ７プロモー
ターの一部、Ｅｔｈｒｉｓ’ミニマル５’ＵＴＲ、ヒトＣＣＤＣ３９タンパク質の機能的
バージョンをコードするコドン最適化配列が続くＫｏｚａｋエレメント、およびポリ（Ａ
）テール（例えば、配列番号１２を参照）を含む。

【0158】

特定の実施形態において、前記ポリリボヌクレオチドはその５’末端に、Ｔ７プロモー
ターの一部、Ｅｔｈｒｉｓ’ミニマル５’ＵＴＲ、さらなるＵヌクレオチド、ヒトＣＣＤ
Ｃ３９タンパク質の機能的バージョンをコードするコドン最適化配列が続くＴＩＳＵエレ
メント、およびポリ（Ａ）テール（例えば、配列番号１３を参照）を含む。

【0159】

特定の実施形態において、前記ポリリボヌクレオチドはその５’末端に、Ｔ７プロモー
ターの一部、Ｅｔｈｒｉｓ’ミニマル５’ＵＴＲ、５’ＵＴＲとしてのＳＰ３０（すなわ
ち、３０ヌクレオチドのランダム配列）、Ｋｏｚａｋ元素、続いてヒトＣＣＤＣ３９タン
パク質の機能的バージョンをコードするコドン最適化配列、およびポリ（Ａ）テール（例
えば、配列番号１４を参照）を含む。

【0160】

いくつかの実施形態では、ポリリボヌクレオチドが本明細書に記載の任意のそのような
レベルおよび／またはタイプから選択される修飾のレベルおよび／またはタイプを有する
修飾ポリリボヌクレオチドである。

【0161】

特定の実施形態では、ポリリボヌクレオチドのパーセント同一性が配列番号２または１
２～１４のＣＣＤＣ３９コード配列部分に関してのみ測定される（例えば、パーセント同
一性を計算する場合、ＵＴＲ、他の非コード配列およびＧＦＰまたはエピトープタグは考
慮されず、ポリリボヌクレオチドはそのような領域を含んでも含まなくてもよい）。

【0162】

前記のいずれかの特定の実施形態において、このようなポリリボヌクレオチド（または
修飾ポリリボヌクレオチド）は、機能的ＣＣＤＣ３９タンパク質をコードする。

【0163】

本開示はまた、配列番号４に示されるヒトＭＣＩＤＡＳをコードするポリリボヌクレオ
チドに関する。本開示の上記または他の態様および実施形態のいずれかのいくつかの実施
形態では、ポリリボヌクレオチドまたは修飾ポリリボヌクレオチドがヒトＭＣＩＤＡＳを
コードし、配列番号４（例えば、配列番号４に示される配列に対して）と少なくとも８５
％、少なくとも９０％、少なくとも９２％または少なくとも９５％同一（例えば、少なく
とも９５、９６、９７、９８、９９または１００％同一）である一次配列を含む。特定の
実施形態では、前記ポリリボヌクレオチドがその５’末端に、Ｔ７プロモーターの一部、
Ｅｔｈｒｉｓ’ミニマル５’ＵＴＲ、ヒトＭＣＩＤＡＳタンパク質の機能的バージョンを
コードするコドン最適化配列、ＰＣＲベースの鋳型製造のためのリバースプライマー結合
部位としても機能する任意の３’ＵＴＲ、ならびにポリ（Ａ）尾部を含む。いくつかの実
施形態では、ポリリボヌクレオチドが本明細書に記載の任意のそのようなレベルおよび／
またはタイプから選択される修飾のレベルおよび／またはタイプを有する修飾ポリリボヌ
クレオチドである。特定の実施形態において、ポリリボヌクレオチドのパーセント同一性
は配列番号４のＭＣＩＤＡＳコード配列部分に関してのみ測定される（例えば、パーセン
ト同一性を計算する場合、ＵＴＲ、他の非コード配列およびＧＦＰまたはエピトープタグ
は考慮されず、ポリリボヌクレオチドは、このような領域を含んでも含まなくてもよい）
。前記のいずれかの特定の実施形態では、そのようなポリリボヌクレオチド（または修飾
ポリリボヌクレオチド）が機能性ＭＣＩＤＡＳタンパク質をコードする。

【0164】

第２の配列に対する第１の配列の同一性パーセンテージを決定する目的のために、アナ
ログ（例えば、メチルシチジン）は、シチジン等と一致する。特定の実施形態では、用語
「一次配列」がＣＵＣＵＣＵＡと同一の一次配列が列挙されたヌクレオチドのいずれかま
たはすべてが修飾されているかどうかにかかわらず、その配列を含むように（例えば、Ｃ
、ＵおよびＡのいずれか以上のアナログが存在し得、そして同じ一次配列とみなされ得る
）、修飾の有無または量にかかわらず、ポリヌクレオチド配列をいうために使用され得る
。

【0165】

特定の実施形態では、同一性パーセントが例えば、ＣＣＤＣ４０またはＣＣＤＣ３９の
コード配列に対応する所与の列挙された配列の部分を参照することによってのみ決定され
る。他の実施形態では、同一性パーセントがコード配列および１つ以上の非コード配列の
両方を参照することによって決定される。特定の実施形態では、同一性パーセントが列挙
された配列の全長にわたって決定される（例えば、本明細書の配列表に列挙された配列の
全長を参照することによって）。

【0166】

本発明はさらに、ポリリボヌクレオチドの毛様体形成に対する効果を分析する方法であ
って、前記ポリリボヌクレオチドは、毛様体形成に関連するおよび／または必要とされる
タンパク質をコードし、該方法は、以下の工程を含む、方法に関する：
（ａ） 繊毛病を有する対象の鼻ブラシを取得する工程であって、該鼻ブラシは、未分
化基底細胞および分化した繊毛細胞を含む、工程、
（ｂ） 未分化基底細胞および脱分化繊毛細胞を得るために、工程（ａ）から得られた
細胞を、水中細胞培養物として培養する工程、
（ｃ） 工程（ｂ）から得られた未分化基底細胞および脱分化繊毛細胞を、気液界面細
胞培養物として培養し、エアリフトを実施する工程、
（ｄ） 工程（ｃ）から得られた細胞を、毛様体形成に関連および／または必要なタン
パク質をコードするポリリボヌクレオチドでトランスフェクトする工程、
（ｅ） 分化した繊毛細胞を得るために、工程（ｄ）から得られたトランスフェクトさ
れた細胞を培養する工程、および
（ｆ） 前記ポリリボヌクレオチドの毛様体形成に対する効果を、乳酸デヒドロゲナー
ゼ測定、ＮｕｃＧｒｅｅｎアッセイ、高速ビデオ顕微鏡法、毛様ビート周波数測定、粘膜
毛様クリアランスアッセイ、および／または免疫蛍光染色を用いて決定する工程。

【0167】

患者の気道上皮の細胞を得るために、鼻ブラシは取り扱いが容易であり、患者にとって
迅速かつ無痛であるため有利である。鼻刷子から得られた細胞は、未分化基底細胞および
サブマーゼ細胞培養物として培養され得る分化繊毛細胞を含む。水中細胞培養により、上
皮細胞の脱分化が誘導され、未分化な基底細胞と脱分化した繊毛細胞が得られる。このよ
うにして得られた脱分化繊毛細胞ならびに鼻刷子の未分化基底細胞を、次いで、空気液体
界面（ＡＬＩ）細胞培養物として培養する。

【0168】

工程（ｃ）の空気液体界面細胞培養物は細胞の基底表面が液体培養培地と接触し、一方
、先端表面が空気に曝されることを特徴とする細胞培養物を指す。細胞は例えば、細胞培
養インサートの隔膜上に播種することができ、細胞培養インサートは最初に、頂端区画お
よび基底区画の両方に培養培地が供給される。これは「空気細胞培養」とも呼ばれ、合流
部に達すると、細胞は「エアリフト」工程にかけられ、そこで培地は基底チャンバーにの
み供給される。これは、例えば呼吸器系に見られる条件を模倣し、未分化な毛様体細胞に
おいて毛様体形成を含む細胞分化を誘導する。したがって、例えば、基底細胞および繊毛
細胞を含む、呼吸器系の上皮を模倣する細胞を、インビトロでのさらなる研究のために得
ることができる。

【0169】

次いで、得られた上皮模倣細胞を得ることができる ポリリボヌクレオチドは生産に
関連し、また／または、生産に必要とされるたんぱく質をコードするポリリボヌクレオチ
ドでトランスフェクトされた。したがって、前記ポリリボヌクレオチドは、ウイルス感染
またはウイルス感染以外の手段によって人工的に行うことができる細胞に導入されて、細
胞内に外因性ポリリボヌクレオチドを発現させる。次に、トランスフェクトされた細胞を
培養して、基底および未分化の繊毛細胞から分化した繊毛細胞を得る。したがって、毛様
体形成に対するｍＲＮＡのようなポリリボヌクレオチドの効果は例えば、対象において見
出され得るように、気道系の上皮を模倣する細胞の環境を保存しながら、インビトロで決
定され得る。

【0170】

毛様体形成に対するポリリボヌクレオチドの影響は、当業者に公知の種々の方法によっ
て決定され得る。これらの方法は例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ測定、ＮｕｃＧｒｅｅｎ
アッセイ、高速ビデオ顕微鏡検査、毛様体拍動周波数測定、粘膜毛様体クリアランスアッ
セイ、および／または免疫蛍光染色を含む。したがって、乳酸デヒドロゲナーゼ測定（Ｌ
ＤＨ）を実施して、細胞を取り囲む環境中で放出されるＬＤＨの量を決定することができ
る。それぞれのアッセイは比色アッセイであることができ、ここで、放出されたＬＤＨの
量は、例えばヨードニトロテトラゾリウムまたはテトラゾリウム塩を赤色ホルマザンに変
換する酵素反応で測定される。したがって、アッセイは、分光法によって容易に読み取る
ことができる。

【0171】

あるいは、またはさらに、ＮｕｃＧｒｅｅｎアッセイを行うことができる。ＮｕｃＧｒ
ｅｅｎは核酸に結合すると永久的な緑色蛍光核酸染色であり、例えば、トランスフェクシ
ョンの毒性関連効果を調べるために使用することができる。あるいは、またはさらに、ト
ランスフェクトされたポリリボヌクレオチドによってコードされるタンパク質の免疫蛍光
染色を行って、その量および他のタンパク質との共局在化を含む細胞局在化を決定するこ
とができる。発現されたタンパク質の量を決定するために、ウェスタンブロット技術を使
用することも可能である。
さらに、毛様構造の欠損または毛様体の欠如は例えば、特殊な顕微鏡法を用いて検出する
ことができる。スクリーニング試験は、鼻の一酸化窒素産生速度、鼻細胞の高速ビデオ顕
微鏡による毛様体運動性の測定、または例えばサッカリン試験を含むインビボ試験を含む
。より特異的な診断には、例えば、免疫蛍光法および透過型電子顕微鏡による繊毛の検査
が必要である。

【0172】

代替的に又は追加的に、毛様体拍動周波数測定を適用して、高速ビデオ顕微鏡を用いて
拍動周波数、拍動繊毛および繊毛細胞の数、および拍動同期性を調査することができる。
同じことは、繊毛機能によって影響を受ける粘液クリアランス速度を測定するために実施
できる粘液繊毛クリアランスアッセイにも当てはまる。

【0173】

記載された方法で使用されるポリリボヌクレオチドに関しては、繊毛病を治療するのに
使用するための本発明の医薬組成物に関連して上述されたものと同様である。さらに、こ
のようなポリリボヌクレオチドの他の特徴もまた、上記の通りであり得る。

【0174】

さらに、ポリリボヌクレオチドは、マーカーをコードする配列を含み得る。例としては
、添付の実施例に記載されるｔｄＴｏｍａｔｏ（例えば、配列番号３に含まれる）、緑色
蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、および増強ＧＦＰ（ｅＧＦＰ）、ならびにそれぞれの検出方
法が挙げられる。これは、ポリリボヌクレオチドによる細胞の成功したトランスフェクシ
ョンを確認するために特に有利である。

【0175】

毛様体形成に対するポリリボヌクレオチドの影響を分析する方法のいくつかの実施形態
において、細胞は、工程（ｃ）においてエアリフトが行われた後、０～１２日以内、好ま
しくは０～１１日以内、より好ましくは０～６日以内、さらにより好ましくは０～４日以
内、最も好ましくは０～４８時間以内にトランスフェクトされる。これは、エアリフト工
程が基底および未分化毛様体細胞の毛様体形成を誘導するので有利である。

【0176】

毛様体形成に対するポリリボヌクレオチドの効果を分析する方法のいくつかの実施形態
において、細胞は、式（Ｖ）、（ＶＩ）、および／または（ＶＩＩ）に示される構造を有
するリピドイドを使用して、毛様体形成に関連するおよび／または必要とされるタンパク
質をコードするポリリボヌクレオチド、好ましくはｍＲＮＡでトランスフェクトされる。

【0177】

毛様体形成に対するポリリボヌクレオチドの効果を分析する方法のいくつかの実施形態
において、細胞は、培地Ｇを用いて工程（ｂ）～（ｅ）において培養される。培地Ｇの組
成が典型的には表２に示されるとおりである。）。

【0178】

【表2】

【0179】

毛様体形成に対するポリリボヌクレオチドの効果を分析する方法のいくつかの実施形態
において、細胞は、表３に示される培地の１つを使用して、工程（ｂ）～（ｅ）において
培養される。表３に示す培地は、ＡＬＩ培養物を増殖させるために使用することができる
市販の培地である。

【0180】

【表3】

【0181】

毛様体形成に対するポリリボヌクレオチドの効果を分析する方法のいくつかの実施形態
において、鼻刷子は線維芽細胞をさらに含み、前記線維芽細胞の成長は、工程（ｂ）～（
ｅ）において阻害される。これは、線維芽細胞が基底および未分化毛様体細胞と比較して
より速く増殖し、したがって、上記のような毛様体形成に対するポリリボヌクレオチドの
効果の研究を妨げ得るため、有利である。

【0182】

細胞を固定相のフラスコに移す前に、１～２時間の短いインキュベーション時間のため
に、線維芽細胞を残りの細胞から分離することができる。その間に、線維芽細胞は沈降し
、細胞フラスコに付着することができる。全ての他の細胞は懸濁細胞として培地中に残り
、その後、「固定相フラスコ」に容易に移すことができる。

【0183】

本発明による方法は好ましくは毛様体形成に対して好影響を有し、機能において繊毛細
胞構造を回復させるために、したがって第２の態様による医薬組成物において使用するこ
とができるポリリボヌクレオチドの同定、および本発明の第１の態様による繊毛病を患う
対象における繊毛病の治療におけるその使用をもたらす。したがって、ポリリボヌクレオ
チドの特徴に関しては、繊毛病の治療における使用のための本発明の医薬組成物に関連し
て上記したのと同じことが当てはまる。さらに、このようなポリリボヌクレオチドの他の
特徴もまた、上記の通りであり得る。

【0184】

図１：ＣＣＤＣ４０ ｍＲＮＡの翻訳効率。２／１．４／０．３／０．２／０．０５ｘ
１０＾６ ＨＥＫ２９３細胞を６ウェルプレートに播種した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ
ｅ２０００を用いて、種苗細胞を、異なるＣＣＤＣ４０構築物（ＥＴＨ０３１Ｔ０６－Ｔ
１０、２．５μｇ／９．５ｃｍ²）で２４時間トランスフェクトした。トランスフェクシ
ョンの６、２４、４８、７２および１４４時間後に細胞溶解を行った。５０μｇの総タン
パク質溶解物をＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットで分析した。ＣＣＤＣ４０は
Ａｔｌａｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ由来の抗ＣＣＤＣ４０抗体（ＨＰＡ０２２９７４）（
１：２０００）を用いて検出され、ＧＡＰＤＨはローディング対照としての役割を担った
。ＧＦＰは、トランスフェクションコントロールとしての役割を担った。

【0185】

図２：ＢＥＡＳ－２Ｂ、ＲＰＭＩ２６５０、およびＨＥＫ２９３細胞におけるＣＣＤＣ
４０ ｍＲＮＡ構築物の翻訳効率：２ｘ１０＾６ ＨＥＫ２９３、７．５ｘ１０＾５ Ｂ
ＥＡＳ－２Ｂ、および５ｘ１０＾５ ＲＰＭＩ ２６５０細胞を６ウェルプレートに播種
した。播種の２４時間後、細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を使用して、異
なるＣＣＤＣ４０構築物（２．５μｇ／９．５ｃｍ²）でトランスフェクトした。トラン
スフェクションの６時間後に細胞溶解を行った。タンパク質溶解物をＳＤＳ－ＰＡＧＥお
よびウェスタンブロット（ＨＥＫ２９３：５０μｇ、ＲＰＭＩ ２６５０：２０μｇ、Ｂ
ＥＡＳ－２Ｂ：総溶解物３０μｇ）で分析し、Ａｔｌａｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（１：
２０００）からの抗ＣＣＤＣ４０抗体（ＨＰＡ０２２９７４）を用いてＣＣＤＣ４０を検
出した。

【0186】

図３：ＬＦ９２／ＣＣＤＣ４０トランスフェクション後の高速ビデオ顕微鏡（ＨＳＶＭ
）結果。患者由来のＡＬＩ培養物を、３μｇのＬＦ９２／ＣＣＤＣ４０で１日おきにトラ
ンスフェクトした。トランスフェクションの前およびトランスフェクションの２４時間後
ごとに、ビデオ（インサートあたり２０）を採取し、ＳＡＶＡ（Ｓｉｓｓｏｎ－Ａｍｍｏ
ｎｓビデオ分析）ソフトウェアを用いてＣＦＢ（毛様拍動頻度）を計算した。１６個全部
のトランスフェクション（１ヶ月）を行った。測定は、４０倍のマグニフィケーションを
用いて３７℃で行った。毛様体拍動周波数測定値の平均値を計算する（全磁場解析、ＷＦ
Ａ）。

【0187】

図４：粘膜繊毛クリアランス（ＭＣＣ）は、Ｚ－投影およびポーラーグラフとして示さ
れる。ＣＣＤＣ４０患者ＡＬＩ培養物を、３μｇ／インサートの濃度のＣＣＤＣ４０ ｍ
ＲＮＡ／ＬＦ９２で、エアリフトで１８日間トランスフェクトした。ＡＬＩ培養物を、実
験の間、培地Ｇ中で維持した。トランスフェクション（ＴＦ）を週１回、４週間実施した
（＝４ｘＴＦ）。粘膜繊毛クリアランス（ＭＣＣ）を、０．５μｍ蛍光ビーズを用いて２
０倍の倍率で測定した。異なる領域の３０のビデオを撮影し、最後のＴＦの１週間後にニ
コンからのポーラーグラフソフトウェアで分析した。１つの例示的な写真が示されている
。

【0188】

図５：健常（右下）制御のｔｄＴｏｍａｔｏおよびポーラーグラフについて、Ｚ投影（
左上）およびポーラーグラフ（右上）として示される粘膜繊毛クリアランス（ＭＣＣ）。
上段：ＡＬＩ培養においてＣＣＤＣ４０変異を有する患者からの細胞を、エアリフトの１
８日後に、３μｇ／インサートの濃度でｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＲＮＡ／ＬＦ１１１でトラ
ンスフェクトした。ＡＬＩ培養物を、実験の間、培地Ｇ中で維持した。トランスフェクシ
ョン（ＴＦ）を週１回、４週間実施した（＝４ｘＴＦ）。粘膜繊毛クリアランス（ＭＣＣ
）を、０．５μｍ蛍光ビーズを用いて３０倍の倍率で測定した。異なる領域の２０のビデ
オを撮影し、最後のＴＦの１週間後にニコンからのポーラーグラフソフトウェアで分析し
た。１つの例示的なビデオが示された。右下：健康なＷＴ ＡＬＩ培養物の粒子追跡。Ｍ
ＣＣは、０．５μｍの蛍光ビーズを用いて２０倍の倍率で測定した。異なる領域の２０の
ビデオを撮影し、最後のＴＦの１週間後にニコンからのポーラーグラフソフトウェアで分
析した。１つの例示的な画像および２つの分析されたＲＯＩが示されている。

【0189】

図６：ＡＬＩ培養におけるＣＣＤＣ４０変異を有する患者由来の細胞を、空気リフト時
に１８ｄの３μｇ／挿入物の用量でｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＲＮＡ／ＬＦ１１１またはＣＣ
ＤＣ４０ ｍＲＮＡ／ＬＦ９２のいずれかでトランスフェクトした。ＡＬＩ培養物を、実
験の間、培地Ｇ中で維持した。トランスフェクション（ＴＦ）を週１回、４週間実施した
（＝４ｘＴＦ）。対照として、健康な鼻ブラシからのＷＴ ＡＬＩを使用した。ＣＣＤＣ
４０ ｍＲＮＡおよびｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＲＮＡで処理したＡＬＩ膜を２０μｍで切断
し、抗ＧＡＳ８（赤色）、抗アセチル化チューブリン（緑色）およびＤＡＰＩ（青色）で
染色した。共焦点顕微鏡で写真を撮った。１つの例示的な画像が示されている。スケール
バーは１０μｍを表す。

【0190】

図７：ＡＬＩ培養物中のＣＣＤＣ４０変異を有する患者由来の細胞を、３μｇ／挿入物
の用量でｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＲＮＡ／ＬＦ１１１またはＣＣＤＣ４０ ｍＲＮＡ／ＬＦ
９２のいずれかでトランスフェクトし、空気リフト時に１８ｄトランスフェクトした。Ａ
ＬＩ培養物を、実験の間、培地Ｇ中で維持した。トランスフェクション（ＴＦ）を週１回
、４週間実施した（＝４ｘＴＦ）。対照として、健常対照からのＡＬＩを使用した。ＣＣ
ＤＣ４０ ｍＲＮＡおよびｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＲＮＡで処理したＡＬＩ膜を２０μｍで
切断し、防ＤＮＡＬＩ１（赤色）、防アセチル化チューブリン（緑色）およびＤＡＰＩ（
青色）で染色した。共焦点顕微鏡で写真を撮った。１つの例示的な画像が示されている。
スケールバーは１０μｍを表す。

【0191】

図８：ＡＬＩ培養におけるＣＣＤＣ４０変異を有する患者由来の細胞を、空気リフト時
に１８ｄの３μｇ／挿入物の用量でｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＲＮＡ／ＬＦ１１１またはＣＣ
ＤＣ４０ ｍＲＮＡ／ＬＦ９２のいずれかでトランスフェクトした。ＡＬＩ培養物を、実
験の間、培地Ｇ中で維持した。トランスフェクション（ＴＦ）を週１回、４週間実施した
（＝４ｘＴＦ）。対照として、健常対照からのＡＬＩを使用した。ＣＣＤＣ４０ ｍＲＮ
ＡおよびｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＲＮＡで処理したＡＬＩ膜を２０μｍで切断し、抗ＣＣＤ
Ｃ３９（１：２００、赤）、抗アセチル化チューブリン（１：１０．０００、緑）および
ＤＡＰＩ（青）で染色した。共焦点顕微鏡で写真を撮った。１つの例示的な画像が示され
ている。拡大率４０倍。

【0192】

図９：ＨＥＫ－２９３およびＢＥＡＳ－２ＢにおけるＣＣＤＣ３９タンパク質（１１０
ｋＤａ）発現、トランスフェクション後６時間および２４時間。１．４ｘ１０＾５ ＨＥ
Ｋ－２９３細胞および３．５ｘ１０＾５ ＢＥＡＳ－２Ｂ細胞を６つのウェルプレートで
シードし、ＣＣＤＣ３９－ＲＮＡ（ＥＴＨ０４７Ｔ０２、ミニマル５’ＵＴＲ、Ｌｉｐｏ
ｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ；比１：１．５）でトランスフェクトし
た。６時間および２４時間後、細胞をＭ－ＰＥＲおよびＴｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－
１００緩衝液で溶解した。５０ μｇのタンパク質溶解物をウェスタンブロット分析に使
用した。対照として、非トランスフェクト（ＵＴ）およびＥＧＦＰトランスフェクト細胞
の溶解物を使用した。高用量＝０．５μｇ／ｃｍ^２、低用量＝０．２５μｇ／ｃｍ^２。

【0193】

図１０：
未処理ＡＬＩ培養物におけるＣＣＤＣ３９タンパク質（１１０ｋＤａ）式。２つの挿入
を、軸索抽出プロトコールを使用して抽出した。３０、１０および５μＬのタンパク質溶
解物をウェスタンブロット分析に使用した。Ａｃｔｉｖｅ Ａｒｅａ： Ｉｎｓｅｒｔ
３９．９ ＝ ７１．２５％、Ｉｎｓｅｒｔ ４１．２ ＝ ５９．８８％

【0194】

図１１：
プロテアソーム阻害剤処理後の１６ＨＢＥ１４におけるＣＣＤＣ３９タンパク質（１１
０ｋＤａ）式。６．０ｘ１０＾５×１６ＨＢＥ１４ｏｃｅｌｌを６ウェルプレートに播種
し、ＣＣＤＣ３９－ＲＮＡ（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ；
比 １：１．５）をトランスフェクトした。６時間後、細胞をＭ－ＰＥＲ緩衝液で溶解し
た。２０ μｇのタンパク質溶解物をウェスタンブロット分析に使用した。対照として、
非トランスフェクト（ＵＴ）およびＥＧＦＰトランスフェクト細胞の溶解物を使用した。
高用量＝０．５μｇ／ｃｍ^２、低用量＝０．２５μｇ／ｃｍ^２。ＲＮＡ：ＥＴＨ０４７Ｔ
０２：ミニマル５’ＵＴＲ、ＥＴＨ０４７Ｔ０３：ＴＩＳＵ、ＥＴＨ０４７Ｔ０４：ＣＹ
ＢＡ、ＥＴＨ０４７Ｔ０５：ＳＰ３０。

【0195】

図１２：プロテアソーム阻害剤での１６ＨＢＥ１４ｏａｆｔｅｒ処理におけるＣＣＤＣ
３９タンパク質（１１０ｋＤａ）式。６．０ｘ１０＾５ １６ＨＢＥ１４ｏｃｅｌｌを６
ウェルプレートにシードし、ＣＣＤＣ３９－ＲＮＡ（ＥＴＨ０４７Ｔ０３、ＴＩＳＵ ５
’ＵＴＲ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ Ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ Ｍａｘ；比１：１．５）
でトランスフェクトした。２４時間後、細胞をＭ－ＰＥＲ緩衝液で溶解した。２０μｇの
タンパク質溶解物をウェスタンブロット分析に使用した。対照として、非トランスフェク
ト（ＵＴ）およびＥＧＦＰトランスフェクト細胞の溶解物を使用した。高用量＝０．５μ
ｇ／ｃｍ^２、低用量＝０．２５μｇ／ｃｍ^２。

【0196】

本発明の他の態様および利点は以下の実施例において記載され、これらは説明の目的の
ために与えられ、そして限定のためではない。本出願において引用される各刊行物、特許
、特許出願、または他の文書は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【実施例0197】

本開示において使用するための方法および材料が本明細書に記載されている；当技術分
野で公知の他の適切な方法および材料も使用することができる。材料、方法、および実施
例は、例示にすぎず、限定を意図するものではない。

【0198】

（Ｉ．材料および方法）
使用する材料、装置、ソフトウェア、試験系
材料を表４に列挙する。

【0199】

【表4-1】

【表4-2】

【表4-3】

【表4-4】

【表4-5】

【0200】

デバイスを表５に列挙する。

【0201】

【表5】

【0202】

ソフトウェアを表６に示す。

【0203】

【表6】

【0204】

試験系を表７に列挙する。

【0205】

【表7】

【0206】

（Ｉ． 水中細胞培養物）
１．培養
細胞株を、３７℃および５％ ＣＯ_２含量の加湿大気下で、細胞インキュベーター中で
培養した。全ての試薬および溶液を、利用前に水浴中で３７℃に加熱した。

【0207】

コンフルエント細胞（約９０％）を最初に２０ｍＬのＤＰＢＳ（ｗ／ｏ Ｍｇ^２＋／Ｃ
ａ^２＋）で洗浄して、死滅細胞を除去した。細胞を分離するために、２ｍＬのトリプシン
／ＥＤＴＡ溶液（０．０５％）をフラスコ当たり添加した。次いで、細胞の剥離が生じる
まで、細胞を３７℃でインキュベートした。それぞれの培地８ｍＬを用いてトリプシンを
停止させた。ＬＨＣ－９培地はほとんど無血清であったので、トリプシン処理を不活性化
するために、少なくとも等容量のトリプシン阻害剤を分離したＢＥＡＳ－２Ｂ細胞に添加
した。その後、トリプシン阻害剤を再び除去するために、細胞溶液を毎分１１００回転（
ｒｐｍ）で５分間遠心分離しなければならなかった。次いで、ペレットを培地中で分解し
た。継代のために、細胞を次の使用にしたがって異なる比率に分割した。

【0208】

ＨＥＫ ２９３（ＤＳＭＺ番号： ＡＣＣ３０５）
この樹立細胞株は、アデノウイルス５型（ＡＤ ５）により形質転換したヒト初代胎児
腎臓由来であった。これをダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）－１０％熱不活化（
ｈ．ｉ．）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ
）を含むグルタＭＡＸ（商標）サプリメント中で培養した。この細胞株を週に２回分割し
た。

【0209】

ＲＰＭＩ ２６５０（ＤＳＭＺ番号： ＡＣＣ２０７）
この細胞系は、鼻中隔の未分化扁平上皮癌の５２歳男性の胸水から起源を持っていた。
類上皮繊毛形態と細気管支上皮との類似性から選択した。また、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ
Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）－１０％熱不活化（ｈ．ｉ．
）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）＋１ｘ非必
須アミノ酸溶液（ＮＥＡＡ）を含むＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）サプリメント中で培養した
。この細胞株を週に１～２回分割した。

【0210】

ＢＥＡＳ－２Ｂ（ＡＴＣＣ番号：ＣＲＬ９６０９）
ＢＥＡＳ－２Ｂ 細胞は非がん性個々の剖検から得られた正常気管支上皮に由来した。
次いで、細胞を複製欠損ＳＶ４０／アデノウイルス１２ハイブリッドで感染させ、クロー
ニングした。使用した培養培地は、ｗ／ｏ添加剤を修飾したＬＨＣ－９であった。それら
はまた、合流部に依存して、週に１～２回分割された。

【0211】

ＢＥＡＳ－２Ｂ細胞に使用したフラスコを、ＬＨＣ－９に溶解した０．０１ｍｇ／ｍＬ
フィブロネクチン、０．０３ｍｇ／ｍＬコラーゲンおよび０．０１ｍｇ／ｍＬウシ血清ア
ルブミンの混合物でコーティングした。この混合物を^２表面積当たり０．２ｍＬの割合で
添加した。その後、３７℃で少なくとも６時間のインキュベーションが必要であった。細
胞を加える前に、フラスコを、Ｍｇ^２＋／Ｃａ^２＋を含まないダルベッコリン酸緩衝生理
食塩水で３回洗浄した。

【0212】

２． Ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写
インビトロ転写のための鋳型を作製するために、環状プラスミドをＢｓｔＢＩによる制
限消化によって線状化し、クロロホルムエタノール沈殿によってさらに精製した。

【0213】

ｍＲＮＡは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、無機ピロホスファターゼ、およびＲＮａｓｅ
阻害剤を含有する標準的なｉｎ ｖｉｔｒｏ転写混合（示された修飾トリホスフェートヌ
クレオチドを含む）を用いて産生した。共転写キャッピングは、ＡＲＣＡキャップ類似体
の添加によって達成された。化学修飾ＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のために、７．５％
のシチジン－５’－トリホスフェートを５－ヨードシチジン－５’－トリホスフェートで
置換し、３０％のウリジン－５’－トリホスフェートを５－ヨードウリジン－５’－トリ
ホスフェート（Ｊｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で置換した（例えば配列番号１参照
）。別の化学修飾ＲＮＡ製造セットアップでは、３％のシチジン－５’－トリホスフェー
トを５－ヨードシチジン－５’－トリホスフェートで置き換え、１５％のウリジン－５’
－トリホスフェートを５－メチル－ウリジン－５’－トリホスフェート（Ｊｅｎａ Ｂｉ
ｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で置き換えた（例えば、配列番号２参照）。続いて、ｍＲＮＡを酢
酸アンモニウム沈殿によって精製し、続いて７０％エタノールを用いて洗浄工程を行った
。

【0214】

残留するキャップされていないｍＲＮＡの脱リン酸化はクイック脱リン酸化キットを使
用して実施し、続いて酢酸アンモニウム沈殿による精製、続いて７０％エタノールを使用
する洗浄工程、および１００ ＭＷＣＯカットのフィルターを使用する限外濾過を行った
。

【0215】

ポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いてｍＲＮＡをさらにポリアデニル化した。再び、ｍＲＮ
Ａを、酢酸アンモニウム沈殿、続いて７０％エタノールを使用する洗浄工程、および１０
０ ＭＷＣＯカットのフィルターを使用する限外濾過によって精製した。ポリ（Ａ）長さ
は、キャピラリーゲル電気泳動によって１００～２５０ヌクレオチドであると決定された
。

【0216】

特に、この実験で調査されたＣＣＤＣ４０ ｍＲＮＡ構築物は５’ＡＲＣＡキャップお
よびＰＰＡを含み、以下のものであった：Ｅｔｈｒｉｓ’ミニマルＵＴＲ（ＥＴＨ０３１
０６；Ｔ０６；配列番号５）、ＴＩＳＵ ５’ＵＴＲを伴うが３’ＵＴＲを伴わない（Ｅ
ＴＨ０３１０７；Ｔ０７；配列番号６）、ｈＡｇ ５’ＵＴＲを伴うが３’ＵＴＲを伴わ
ない（ＥＴＨ０３１０８；Ｔ０８；配列番号７）、ＣＹＢＡ ５’および３’ＵＴＲを伴
う（ＥＴＨ０３１０Ｔ０；Ｔ０９；配列番号１）、ならびにヒトＣＭＶ ＩＥ９由来の５
’ＵＴＲおよびヒト成長ホルモン由来の３’ＵＴＲを伴う（ＥＴＨ０３１Ｔ０；Ｔ１０；
配列番号８）。

【0217】

３． トランスフェクション
少なくとも９０％のコンフルエンシーを提供するために、細胞をトランスフェクション
の２４時間前に６ウェルプレートに播種した。細胞数は、読み出しの時点および細胞型に
よって異なっていた（表８を比較されたい）。

【0218】

【表8】

【0219】

トランスフェクションはトランスフェクションコントロールとして、増強された緑色蛍
光タンパク質（ｅＧＦＰ）をコードするｍＲＮＡと同様に、異なるＣＣＤＣ４０ ｍＲＮ
Ａ構築物を用いて行った。トランスフェクション前にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録
商標） ２０００を用いてトランスフェクションを実施し、培養培地を交換して、細胞に
最適条件を提供した。リポプレックスは、ｍＲＮＡ／ＷＦＩ混合物ならびにＬｉｐｏｆｅ
ｃｔａｍｉｎｅ（登録商標） ２０００／培地混合物を必要とした。それぞれの混合物の
１２５μＬを、ｍＲＮＡが１μｇ／μｌのストック濃度を示したので、ｍＲＮＡ対Ｌｉｐ
ｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標） ２０００の容積比１：２で使用した。異なるｍＲＮ
Ａ濃度を使用し、それに応じて混合物を調整した（例示的なピペッティングスキームにつ
いては表９を参照されたい）。

【0220】

【表9】

【0221】

両方の混合物を調製した後、ｍＲＮＡ／ＷＦＩ混合物をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（
登録商標） ２０００／培地混合物に添加し、該溶液を≧５分間インキュベートした後、
それを播種した細胞に滴下して添加した。細胞のより良好な生存率を得るために、トラン
スフェクションの４時間後に追加の培地交換を行った。

【0222】

４． ＣＣＤＣ４０ウェスタンブロット
ａ． ウェスタンブロットのためのサンプリング
細胞溶解のために、トランスフェクションからの培養培地を除去し、細胞をＤＰＢＳ（
Ｍｇ^２＋／Ｃａ^２＋なし）で洗浄し、次いでＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標） Ｃｅｌｌ Ｓ
ｃｒａｐｅｒｓを用いて掻き取った。細胞を１００μＬの溶解緩衝液［１０ｘ Ｔｒｉｔ
ｏｎ（登録商標）Ｘ－１００溶解緩衝液（２５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１％ Ｔｒｉ
ｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、ｐＨ： ７．８）をＷＦＩ中で１ｘに調整し、プロテア
ーゼインヒビターｃＯｍｐｌｅｔｅで補完した後、試料を－２０℃で凍結した］で溶解し
た。

【0223】

総タンパク質濃度は、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡタンパク質アッセイキット（ＢＣＡ
アッセイ）を用いて決定した。アッセイは、製造業者のプロトコールにしたがって行った
。簡単に述べると、１：５０のＢＣＡ作業試薬（ＷＲ）希釈液を調製した。５ 各サンプ
ルのμＬを９６ウェルプレート（平底、透明）に移し、２００μＬのＷＲをウェル当たり
添加した。最後の工程は、３７℃で３０分間のインキュベーションであった。結果は、Ｍ
ａｇｅｌｌａｎ（商標）データ解析ソフト使用して、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登
録商標） ２００ ＰＲＯプレートリーダーで測定した。

【0224】

ｂ． ＮＥＴ－ゼラチンの調製

【0225】

【表10】

【0226】

ｃ． ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット
ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）を実
施するために、溶解物を５μＬのボルトＬＤＳ試料緩衝液（４ｘ）および２μＬのボルト
試料還元剤（１０ｘ）と混合し、次いで、Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ（登録商標） Ｃ中で
１０分間および３５０回転で７０℃に加熱した。７ μＬのマーカー（Ｐｒｅｃｉｓｉｏ
ｎ Ｐｌｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）Ｄｕａｌ Ｃｏｌｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ）を
各ゲルの第１のポケットに充填し、その後、正確なタンパク質サイズ推定を可能にした。
次いで、ゲルタンクを、１Ａで３０分間、電力供給（Ｐｏｗｅｒ ＰＡＣ ３００）に接
続した。続いて、カセットをへらで開き、ゲルをブロッティングステーションに移動させ
た。

【0227】

転写システム（Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｔｒａｎｓｆｅｒ －Ｂｌｏｔ（
登録商標） Ｔｕｒｂｏ（商標）Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｓｙｓｔｅｍ、３０分、２５ Ｖ、
１Ａ）および好適な膜（Ｔｒａｎｓｆｅｒ－Ｂｌｏｔ Ｔｕｒｂｏ Ｔｒａｎｓｆｅｒ
Ｐａｃｋ Ｍｉｎｉ ０．２μｍ ＰＶＤＦ）を、製造業者の指示にしたがってブロッテ
ィングに使用した。「サンドイッチ」上でローラーをスクロールさせることによって、タ
ンパク質移動を妨害し得る任意の気泡が排除された。遊離結合部位をブロックするために
、膜をＮＥＴ－ゼラチンに入れ、プレートシェーカー上で６０分間振盪した。ゲルを７５
ｋＤバンドで切断して、ＣＣＤＣ４０およびグリセリンアルデヒド－３－ホスファ－デ
ヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を同時に検出した。抗体をＮＥＴ－ゼラチン（６ｍＬ中の
抗ＣＣＤＣ４０ １：２０００、１０ｍＬのＮＥＴ－ゼラチン中のＧＡＰＤＨ １：１０
０００）で希釈し、膜をプレートシェーカー上で４℃で一晩インキュベートした。ＧＡＰ
ＤＨは負荷制御として機能する。使用した抗体のリストを表１１に示した。翌日、膜をＮ
ＥＴ－ゼラチンで１０分間３回洗浄して、非特異的に結合または残留した抗体を除去した
。二次抗体ヤギ抗ウサギＩｇＧ－ＨＲＰをＮＥＴ－ゼラチンで１：１０，０００に希釈し
た。室温（ＲＴ）でプレートシェーカー上で６０分間インキュベートした後、膜を時間Ｎ
ＥＴ－ゼラチンで１０分間３回洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼＨＲＰ結合二次抗
体は、分子撮像部（ＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）ＸＲＳシステム）を介して検出することが
できた。したがって、５ｍＬのＬｕｍｉｎａｔａ Ｃｒｅｓｃｅｎｄｏ Ｗｅｓｔｅｒｎ
ＨＲＰ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅをゲル上に添加し、５分間インキュベートした。次に、未
だ露光過多ではなかった最後の写真と比色写真をマージし、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂ（商標）
ソフトウェアで図示した。さらに、その後、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂ（商標）を用いてバンド
強度を測定した。

【0228】

【表11】

【0229】

（ＩＩ． ＡＬＩ培養）
１． ヒト呼吸器上皮細胞（ｈＲＥＣ）のサンプリング
ａ． 鼻ブラッシング
ＲＰＭＩ培地を室温に加熱し、ブラシを滅菌等張食塩水で湿らせた。保護チップを有す
るＣｅｌｌｅｔｔａ（商標）ブラシセルコレクターを適用した。患者に鼻をきれいにする
ように頼んだ後、彼は頭部を壁に当てて椅子に座って頭部を保持しなければならなかった
。回転運動と直線運動を用いて、下鼻道の内側と上側にブラシを数回迅速に擦過した。ブ
ラシを取り出したら、直ちに、５ｍｌの予め温めたＲＰＭＩ培地を含む収集チューブ（１
５ｍＬコルニクル）に入れた。ブラシをチューブ内で少なくとも４０回激しく振盪して、
ブラシから細胞を分離した。

【0230】

ｂ． 静止培養
チューブを９００ｒｐｍで５分間室温で回転させた。上清を捨てた後、ペレットをＵＧ
培地［ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２ １：１、５ｍＬの滅菌１００ｘ ａｎｉｂｉｏ
ｔｉｃｓ／ｍｙｃｏｔｉｃｓおよび１０ｍＬの滅菌Ｕｌｔｒｏｓｅｒ Ｇ］に溶解した。
５ｍＬの培地をＴ２５に使用し、２５ｍＬをＴ７５フラスコに使用した。

【0231】

細胞を細胞培養フラスコに移した後、細胞を、５％ ＣＯ_２を含む加湿インキュベータ
ー中、３７℃で一晩インキュベートした。細胞は２０～２４時間後に付着することはずで
ある。ＵＧ培地を週に３回交換した（月曜日、水曜日および金曜日）。

【0232】

２． ＡＬＩ培養物の生成およびトランスフェクション
ａ． トランスウェルインサートのコーティング（０．３３ｃｍ²）
以下のプレートをＡＬＩ培養に使用した：透明なポリエステル膜（０．４μｍ孔、６．
５ｍｍ直径のインサート、２４ウェルプレート）を有するＣｏｒｎｉｎｇ Ｔｒａｎｓｗ
ｅｌｌ。ラット尾コラーゲンを酢酸中で１：５に希釈し、２５０μＬを各インサートの先
端側に負荷した。プレートを室温で一晩インキュベートした後、残りの液体を低温ピペッ
トで吸引し、次いでプレートを少なくとも５分間開放蓋で乾燥させた（滅菌）。最後に、
インサートをＤＰＢＳ（ｗ／ｏ Ｃａ^２＋／Ｍｇ^２＋）で２回洗浄し、次いで室温で一晩
乾燥させた（滅菌）。インサートを４℃で１ヶ月まで保存した。

【0233】

ｂ． 浸漬培養（静止培養）としてのｈＲＥＣの細胞増殖
細胞に、２～３日毎（月曜日、水曜日および金曜日）に、１５ｍＬの予め温めたＵＧ培
地を与えた。コラーゲン層の損傷および細胞の剥離を防止するために、新しい培地をコラ
ーゲン層上に直接添加しないように注意しなければならなかった。細胞が８０％コンフル
エントであったか、またはコラーゲン層が剥離し始めた直後に、細胞をＡＬＩフィルター
に移した（およそ３週間後、水中培養）。

【0234】

ｃ． 培地Ｇの調製
異なるＡＬＩ培地を試験したが、自己作製培地Ｇが好ましい。

【0235】

この培地を１週間調製したが、４℃で保存する必要があった。バッチを、来るべき実験
サイズに基づいてアリコートで凍結した。表２は、培地Ｇの組成を示す。

【0236】

ｄ． ｈＲＥＣ （ＡＬＩ培養）の播種とエアリフト
１． ＵＧ培地を吸引し、洗浄培地［ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ Ｆ－１２ １：１（１×
無菌抗生物質／抗真菌剤）］又はＤＰＢＳ（ｗ／ｏ Ｃａ^２＋／Ｍｇ^２＋）で１回洗浄す
る
２． 自作ラット尾コラーゲンをコーティングしたフラスコの場合：
ａ． コラゲナーゼ９ｍＬ（１×）を加えてコラーゲン層を溶解し、３７℃で４５～
６０分間インキュベートする
ｂ． 細胞を１５ｍＬコルニクチューブに移し、１０００ｒｐｍ、室温で５分間遠心
分離する
ｃ． 洗浄バッファー（１０００ｒｐｍ、室温、５分間）で細胞を洗浄する
ｄ． ２ｍＬのトリプシンＥＤＴＡ（１ｘ）を添加し、細胞を分離するために穏やか
に上下にピペットで移し、細胞を３７℃でインキュベートし、細胞クラスターが崩壊する
まで角質を振盪する（約５分）
ｇｉｂｃｏから購入したコラーゲンでコーティングしたフラスコの場合：
ａ． ３ｍｌのトリプシンＥＤＴＡ（１ｘ）を、細胞が分離するまで（約５分）細胞
培養フラスコに添加する
３． ０．５ｍＬのＦＢＳおよび５ｍＬの洗浄培地を添加することによって、トリプシ
ンを停止させる
４． 細胞を１５ｍｌのファルコンに移し、細胞を洗浄培地（１０００ｒｐｍ、室温、
５分間）で２回洗浄する
５． ペレットを適量のＡＬＩ培地（１～２ｍＬ、ペレットサイズに依存する）に再懸
濁し、細胞カウンターを用いて細胞をカウントする
６． ２５０μＬの細胞懸濁液（４００，０００細胞／ｍＬ）を、基底外側に５００μ
ＬのＡＬＩ培地でコートした各コラーゲントランスウェルに添加する
７． 細胞を３７℃、加湿した５％ ＣＯ_２インキュベーター中で一晩インキュベート
する
３～５日目： ＡＬＩ－増殖
８． 顕微鏡下でインサートを一貫して確認する
９． ８０～１００％合流部（３～４日）まで毎日ＡＬＩ培地を細胞に供給する
ＡＬＩ分化
１０． ８０～１００％コンフルエンシーに達したときのエアリフト細胞
ａ． 頂端側と側底側の両方からＡＬＩ培地を吸引する
ｂ． ５００μＬの新鮮なＡＬＩ培地を基底外側区画に添加する
ｃ． 細胞を３７℃、加湿した５％ ＣＯ_２インキュベーター中でインキュベートす
る
１１． １週間に１回、予熱した洗浄培地（先端）で細胞を洗浄し、ＡＬＩ培地で細胞
を２～３日毎（または月曜日～水曜日～金曜日）に供給する

【0237】

ｅ． ｈＲＥＣのトランスフェクション
製剤（ＬＦ１１１－ｍＲＮＡ）を、３μｇ／インサート（＝９μｇ／ｃｍ²）の最終濃
度まで２％スクロース中に希釈した。粘液を除去するために、インサートを先端側で２０
０μＬのＤＰＢＳ（ｗ／ｏ Ｃａ^２＋／Ｍｇ^２＋）で洗浄し、先端側で３７℃（上皮ＡＬ
Ｉ）または２００μＬのＤＰＢＳ（ｗ／ｏ Ｃａ^２＋／Ｍｇ^２＋）で２０分間インキュベ
ートし、トランスフェクション前に室温で５分間インキュベートした。その後、頂端面か
らのＤＰＢＳ（ｗ／ｏ Ｃａ^２＋／Ｍｇ^２＋）を、上皮を損傷することなく穏やかな吸引
によって除去した。粘液洗浄の直後に、細胞を再度ＷＦＩ（１００μＬ）で洗浄して、微
量のＤＰＢＳ（ｗ／ｏ Ｃａ^２＋／Ｍｇ^２＋）を除去した。２５ μＬの配合を、細胞取
り込みを可能にするためにインサートの先端側に添加した。６時間インキュベートした後
、担体の除去を行い、細胞を２００μＬのＤＰＢＳ（ｗ／ｏ Ｃａ^２＋／Ｍｇ^２＋）で１
回洗浄し、培養物を、頂端側に液なしでＡＬＩとして維持した。

【0238】

３． 読み出しアッセイ
種々の読み出しアッセイが使用される。ＬＤＨ測定およびＮｕｃＧｒｅｅｎアッセイを
用いて、トランスフェクションの毒性関連効果を調べた。毛様体叩解周波数測定（ＣＢＦ
）は、叩解周波数および繊毛面積の割合に関して毛様体叩解の様式を調べるために必要で
あった。繊毛の拍動が方向性のある流れを導く場合は、粘液繊毛クリアランス（ＭＣＣ）
アッセイを用いて研究することができる。ＣＣＤＣ４０、そのヘテロダイマーパートナー
ＣＣＤＣ３９および繊毛マーカーアセチル化α－チューブリンについての免疫蛍光（ＩＦ
）染色を利用して、処理後に、ＣＣＤＣ４０タンパク質またはそのパートナーＣＣＤＣ３
９が繊毛中で検出され得るかどうかを検出した。さらに、ＧＡＳ８およびＤＮＡＬＩ１の
ようなダイニンレギュレーター錯体（ＤＲＣ）のタンパク質を染色した。ＤＲＣは、ＣＣ
ＤＣ４０／ＣＣＤＣ３９によって固定され、ＣＣＤＣ４０／ＣＣＤＣ３９が繊毛軸索に正
しく組み込まれている場合にのみ存在する。

【0239】

ａ． ＬＤＨ測定
ＬＤＨ濃度を、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）Ｌａｃｔａｔｅ Ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ
Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いて測定する。この手順は、製造者
のプロトコールに記載されているように行われる。ＡＬＩ培養は、３７°Ｃおよび５％
ＣＯ_２で３０分間、１００μＬのＤＰＢＳ（Ｍｇ^２＋／Ｃａ^２＋付き）を用いて頂面にイ
ンキュベートした。５０ ＬＤＨ反応混合物のμＬおよび５０μＬのインキュベーション
培地を９６ウェルフォーマットを利用して混合し、５０μＬの停止溶液を添加して、室温
で３０分間、光から保護してインキュベートした。ホルマザンの吸光度を、マイクロプレ
ートリーダー（ＴｒｉＳｔａｒ２ Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ ＬＢ ９４２）
を用いて４９０ｎｍおよび６８０ｎｍで測定した。６８０ｎｍの値を、バックグラウンド
正規化のために４９０ｎｍから差し引いた。各インサートについて二重測定を行った。

【0240】

ｂ． 毛様体拍動周波数（ＣＢＦ）測定
ｈＲＥＣの毛様体拍動周波数（ＣＢＦ）分析を高速ビデオ顕微鏡およびＳｉｓｓｏｎ－
Ａｍｍｏｎｓビデオ分析によって行った。Ｍｉｎｉｔｕｂｅ ＳＣ３００加熱装置により
３６℃に温度を維持することにより、生理学的条件下でＥＬＷＤ ４０ｘ Ｓ Ｐｌａｎ
Ｆｌｕｏｒ目的を装着した倒立位相差顕微鏡に取り付けたＭｅｇａｐｌｕｓカメラモデ
ルＥＳ ３１０ターボを用いてビデオ（１２５ ｆｐｓ、６４０×４８０画素解像度）を
記録した。

【0241】

ｃ． 粘液繊毛クリアランスアッセイ（ＭＣＣ、蛍光ビーズ）
ＡＬＩ培地およびＤＰＢＳ（ｗ／ｏ Ｃａ^２＋／Ｍｇ^２＋）を室温に予熱し、顕微鏡の
板を３７℃に加熱した。ＡＬＩ挿入を新しい平板に移し、予め温めたＡＬＩ培地（代替Ｄ
ＰＢＳ ｗ／ｏ Ｃａ^２＋ ／Ｍｇ^２＋）で先端を２回洗浄した。１００μＬのＡＬＩ培
地を先端区画に添加した後、挿入あたり２０枚のビデオ（倍率４０倍、Ｐｈ２）を記録し
て、挿入の総合的な印象を得た（ＳＡＶＡソフトウェア）。粒径０．５μｍの赤色蛍光粒
子をＤＰＢＳ（ｗ／ｏ Ｃａ^２＋／Ｍｇ^２＋）で１：１０００に希釈し、少なくとも１分
間ボルテックスし、１０μＬの粒子希釈物を１００μＬのＡＬＩ培地に添加し、ボルテッ
クスし、１１０μＬを先端区画に添加した。ビードを取り扱う間、凝集を防ぐために各ス
テップの前にボルテックスすることが重要であった。さらに、漂白を避けるために、薄暗
い光での作業が必要であった。

【0242】

蛍光粒子の流れを、ＮＩＳ－Ｅｌｅｍｅｎｔｓ Ｂａｓｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈソフト
ウェアで記録した。４８８ｎｍレーザーで粒子を励起しながら、２０ｘマグニファイカチ
オン（Ｐｈ１）を用いて２０～３０ｓにわたって移動を記録した。露光時間は、毎秒記録
フレーム数（ｆｐｓ）に調整されなければならなかった。７．５ ｆｐｓの場合、露光時
間は１００ｍｓに設定され、１５ ｆｐｓから５０ｍｓに設定された。正確な観察領域を
ＳＡＶＡ（２０倍拡大、Ｐｈ１）で分析し、細胞層の繊毛運動と３Ｄ構造を可視化した。

【0243】

評価およびデータ解析のために、Ｎｉｋｏｎ ＮＩＳ Ｅｌｅｍｅｔｓ ＡＲ Ｓｏｆ
ｔｗａｒｅ、ＮＩＳ ＰＬＵＧ－ＩＮ ＜ＡＤＶＡＮＣＥＤ ２Ｄ ＴＲＡＣＫＩＮＧ＞
＜ＡＲ＞（上記ＮＩＳ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ＡＲ Ｔｒａｃｋｉｎｇ Ｍｏｄｕｌを参照
）を使用する。

【0244】

ｄ． ＡＬＩ培養のＩＦ
ＡＬＩ培養の埋め込み
膜調製の前に、ＡＬＩ挿入物をＤＰＢＳ（ｗ／ｏ Ｍｇ^２＋／Ｃａ^２＋、２００μＬ、
１分間、室温）で２回洗浄して粘液を除去した。以下の膜調製は、以下のプロトコル（以
下を参照）にしたがって実施される。

【0245】

外科用メスまたはシリンジを用いてトランスウェルフィルター膜を切り出した後、膜を
３ｍｌのＤＰＢＳ（Ｃａ^２＋／Ｍｇ^２＋）を含むペトリ皿に移した。膜を等片（４～６）
に切断し、Ｓｈａｎｄｏｎ Ｃｒｙｏｍａｔｒｉｘ（商標）凍結包埋培地（中間サイズ）
を用いてクリオモールドを調製した。クライオマトリックスが硬化するまでクライオモー
ルドをドライアイス上でインキュベートする前に、膜片をクライオマトリックスに入れ、
互いに平行に配置した。クライオスタットで切断する前に、クライオモールドを－８０℃
で少なくとも２時間保存した。

【0246】

ＡＬＩ膜の切断
Ｓｈａｎｄｏｎ Ｃｒｙｏｍａｔｒｉｘ（商標）に包埋されたＡＬＩ膜を、クライオス
タットＭｉｃｒｏｍ ＨＭ５６０を使用して切断した。したがって、クライオスタットを
－２０℃（－２１℃のテーブルおよび－２５℃のチャンバー）に予備冷却した（切断の２
～３時間前）。クライオモルズを含むＡＬＩ膜を－８０℃から－２０℃に少なくとも１時
間移した。膜の切断は、膜の取り扱い条件に応じて、２０μｍで行った。膜スライスをＳ
ｕｐｅｒｆｒｏｓｔ Ｕｌｔｒａ Ｐｌｕｓスライドに移し、室温で少なくとも１時間乾
燥させ、－８０℃で一晩または－８０℃で使用するまで保存した。

【0247】

染色手順
適用された抗体については、表１２を参照のこと。
１日目：
１． １ｘＤＰＢＳ（Ｃａ^２＋／Ｍｇ^２＋）で室温で５分間洗浄
２． 固定： 室温で４％ＰＦＡ／１ｘＤＰＢＳ（Ｃａ^２＋／Ｍｇ^２＋）１５分間
３． 洗浄３ｘ ＤＰＢＳ（Ｃａ^２＋／Ｍｇ^２＋）（２ｘ 高速、１ｘ５分）
４． 透過性：
ａ． ０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００ ｆｕｒ ５分または
ｂ． ０．２％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００ ｆｕｒ １０分（使用す
る抗体によって異なる）
５． 室温で３ｘ ＤＰＢＳ（Ｃａ^２＋／Ｍｇ^２＋）（２ｘクイック、１ｘ５分）を洗
浄する
６． ブロッキング：５％正常ヤギ血清＋ＤＰＢＳ（Ｃａ^２＋／Ｍｇ^２＋）で２％ＢＳ
Ａ、またはＤＰＢＳ（Ｃａ^２＋／Ｍｇ^２＋）で５％スキムミルク→室温で２ｈ
７． １次抗体２００μｌを４℃で一晩

２日目：
８． ＤＰＢＳ（Ｃａ^２＋／Ｍｇ^２＋）で４５分間洗浄（３ｘ１５分）
９． ２次抗体：室温で１時間２００μＬ
１０． 暗所の室温で１０分間ＤＰＢＳ（Ｃａ^２＋／Ｍｇ^２＋）のＨｏｅｃｈｓｔ３３
３４２ １：１０００
１１． ＤＰＢＳ（Ｃａ^２＋／Ｍｇ^２＋）で６ｘ５分洗浄
１２． Ｄａｋｏアンチフェード付きマウントカバースリップ

【0248】

【表12】

【0249】

ｅ． ＡＬＩ培養物のエアブラシ
エアブラシモデルを用いて、分化ＡＬＩ培養物を作製した。プロトコールは、Ｃｒｅｓｐ
ｉｎ ｅｔ ａｌ。２０１１（Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ Ｓｔｕｄｙ Ｄｉｆｆｅｒ
ｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｐａｉｒ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ａｉｒｗａｙ Ｅｐｉ
ｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌｓ）の後に確立された。

【0250】

細胞を、前もって温めたＤＰＢＳ（Ｍｇ^２＋／Ｃａ^２＋）で先端側で短時間洗浄した。
エアブラシに接続されたコンプレッサはエアブラシを回転させ、小型車輪を回転させるこ
とにより、１ｋｇ／ｃｍ^２に設定した。エアブラシは一定の値にとどまるために、ある時
間にわたって動作する必要があるかもしれない。次に、エアブラシの上にある小さなリザ
ーバをＤＰＢＳ（Ｍｇ^２＋／Ｃａ^２＋）で満たし、挿入部を基礎培地なしの新しいプレー
トに入れた。エアブラシは最初の圧力ポイントまで押して開始し、圧縮機の圧力が一定に
保たれるまで待機した。それから、エアブラシを挿入物の頂部に垂直に置き、エアブラシ
のてこを第１の圧点を越えて非常にわずかに押圧した（ＤＰＢＳ（Ｍｇ^２＋／Ｃａ^２＋）
をリザーバから２秒間分散させる）。その後、インサートの先端側を、予め温めたＤＰＢ
Ｓ（Ｍｇ^２＋／Ｃａ^２＋）で短時間洗浄し、インサートを、ＡＬＩ分化に適用可能な新し
い培地に入れた。創傷を顕微鏡観察によりチェックした。それが小さすぎる（挿入面積の
１／３未満）か、または創傷内の細胞がほんのわずかに分離した場合、この手順を繰り返
した。培養物を３７℃、５％ＣＯ_２の加湿大気中でインキュベートし、ＡＬＩとして培養
した。

【0251】

（ＩＩＩ． 標識ＣＣＤＣ４０ ｍＲＮＡ）
検討中のｍＲＮＡを表１３に示す。

【0252】

【表13】

【0253】

ａ． 細胞培養
ＨＥＫ－２９３細胞を、ＭＥＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ
／ｍｌ Ｐ／Ｓ（＝培養培地）中、３７℃、５％ＣＯ_２で培養する。

【0254】

播種前に、細胞をＤＰＢＳで洗浄し、トリプシンを用いて分離する。トリプシン処理後
、ＦＢＳを含有する培養培地を用いてトリプシンを不活性化する。したがって、同量以上
の培養培地が使用される。１１００×ｇで５分間遠心分離し、正常な増殖培地に再懸濁し
た後、細胞を、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｄｅｖｉｃｅを用いて
カウントする。

【0255】

ｂ． Ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写
インビトロ転写のための鋳型を作製するために、環状プラスミドをＢｓｔＢＩによる制
限消化によって線状化し、クロロホルムエタノール沈殿によってさらに精製した。
ｍＲＮＡは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、無機ピロホスファターゼ、およびＲＮａｓｅ阻
害剤を含有する標準的なｉｎ ｖｉｔｒｏ転写混合を用いて産生した。共転写キャッピン
グは、ＡＲＣＡキャップ類似体の添加によって達成された。化学修飾ＲＮＡのｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ転写のために、７．５％のシチジン－５’－トリホスフェートを５－ヨードシチジ
ン－５’－トリホスフェートに、３０％のウリジン－５’－トリホスフェートを５－ヨー
ドウリジン－５’－トリホスフェートにそれぞれ置換した。別のＳＮＩＭ（登録商標）の
ＲＮＡ産生設定では、３％のシチジン－５’－トリホスフェートが５－ヨードシチジン－
５’－トリホスフェートに、１５％のウリジン－５’－トリホスフェートが５－メチル－
ウリジン－５’－トリホスフェートにそれぞれ置換された。残留鋳型ＤＮＡをＤＮａｓｅ
Ｉを用いて消化した。続いて、ｍＲＮＡを酢酸アンモニウム沈殿によって精製し、続いて
７０％エタノールを用いて洗浄工程を行った。

【0256】

残留するキャップされていないｍＲＮＡの脱リン酸化はクイック脱リン酸化キットを使
用して実施し、続いて酢酸アンモニウム沈殿による精製、続いて７０％エタノールを使用
する洗浄工程、および１００ ＭＷＣＯカットのフィルターを使用する限外濾過を行った
。

【0257】

ポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いてｍＲＮＡをさらにポリアデニル化した。再び、ｍＲＮ
Ａを、酢酸アンモニウム沈殿、続いて７０％エタノールを使用する洗浄工程、および１０
０ ＭＷＣＯカットのフィルターを使用する限外濾過によって精製した。ポリ（Ａ）長さ
は、キャピラリーゲル電気泳動によって１００～２５０ヌクレオチドであると決定された
。

【0258】

ｃ． 播種、トランスフェクションおよび読み出し
細胞を、処理の２４時間前に９６ウェルブラックマイクロプレート（ウェルあたり２５
，０００細胞）に播種した。播種の２４時間後、新鮮な培地を各ウェルに添加した（１０
０μＬ）。ｍＲＮＡを、１：１．５（ｗ／ｖ）のＲＮＡ対リポフェクトアミン比率でＬｉ
ｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標） ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ（商標）を用いてトラ
ンスフェクトした。２５０ｎｇ／９６ウェル（７５８ｎｇ／ｃｍ^２）ｅＧＦＰ－ＣＣＤＣ
４０（ＥＴＨ０３１Ｔ２８またはＥＴＨ０３１Ｔ３０）またはＨＡ－ＣＣＤＣ４０－Ｔ２
Ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏ（ＥＴＨ０３１Ｔ２６）ｍＲＮＡを用いた。全てのＲＮＡは、１ｍ
ｇ／ｍＬのストック濃度を有していた。リポプレックス形成のために、ｍＲＮＡを水中で
最も希釈した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標） ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ（
商標）をＳＦＭ（無血清培地）で希釈し、ピペッティングによって混合した。ＲＴで１０
分間インキュベートした後、ＲＮＡ溶液をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）Ｍｅ
ｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ（商標）溶液に添加し、混合し、ＲＴでさらに５分間インキュベー
トした。その後、混合物をＳＦＭで２倍希釈した後、Ｌｉｐｏｐｌｅｘ溶液をウェルに添
加した。表１４において、１つのＲＮＡについての例を計算した。

【0259】

【表14】

【0260】

トランスフェクションの６時間後および２４時間後に、トランスフェクション効率を蛍
光顕微鏡によって調べ、１０倍の倍率で写真を撮った。

【0261】

（ＩＶ． ＣＣＤＣ３９）
検討中のｍＲＮＡ（ＥＴＨ０４７Ｔ０２；配列番号１２）はｈＣＣＤＣ３９をコードし
、ＥｔｈｒｉｓミニマルＵＴＲを含んでいた。全体では、ウリジン－５’－トリホスフェ
ートの１５％が５－メチル－ウリジン－５’－トリホスフェートに、シチジン－５’－ト
リホスフェートの計３％が５－ヨード－シチジン－５’－トリホスフェートに置き換わっ
ていた。使用した抗体を表１５に示す。

【0262】

【表15】

【0263】

１． ＣＣＤＣ３９トランスフェクションおよび水中細胞培養におけるウェスタンブロッ
ト
ａ． 細胞培養
ＢＥＡＳ－２Ｂ 細胞を、コーティングされたフラスコ中のＬＨＣ－９培地中で培養し
た。詳細については、上記Ｉ１を参照されたい。実験は、コーティングされていない板で
行った。

【0264】

ＨＥＫ－２９３ 細胞を、熱不活性化ＦＢＳおよびペニシリン／ストレプトマイシン（
Ｐ／Ｓ）を補充したＭＥＭ ＧｌｕｔａＭａｘ培地中で培養した。

【0265】

播種前に、細胞をＤＰＢＳで洗浄し、トリプシンを用いて分離した。トリプシン処理後
、トリプシンを、ＢＥＡＳ－２Ｂに対するトリプシン阻害剤またはＨＥＫ－２９３に対す
るＦＢＳを含有する培養培地のいずれかを用いて不活性化した。したがって、等しい体積
またはそれ以上の体積のトリプシンインヒビター／培養培地を使用した。１１００×ｇで
５分間遠心分離し、正常な増殖培地に再懸濁した後、細胞を、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ Ｃｅｌ
ｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｄｅｖｉｃｅを用いてカウントした。播種量２ｍｌおよび６ウェ
ルプレートフォーマットを考慮して、５．０ｘ１０^５播種ＢＥＡＳ－２Ｂ細胞および１．
４ｘ１０^６播種ＨＥＫ－２９３細胞を得た。

【0266】

ｂ． トランスフェクション
細胞を、処理の２４時間前にそれぞれの密度で播種した。播種の２４時間後、２ｍＬの
新鮮な培地を各ウェルに添加した。ｍＲＮＡを、１：１．５（ｗ／ｖ）のＲＮＡ対リポフ
ェクトアミン比率でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標） ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡ
Ｘ（商標）を用いてトランスフェクトした。全てのＲＮＡは、１ｍｇ／ｍＬのストック濃
度を有していた。リポプレックス形成のために、ｍＲＮＡをａｑｕａ ｂｉｄｅｓｔで希
釈した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標） ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ（商標）
をＳＦＭで希釈し、ピペッティングによって混合した。室温で１０分間インキュベートし
た後、ＲＮＡ溶液をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標） ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡ
Ｘ（商標）溶液に添加し、混合し、室温でさらに５分間インキュベートした。その後、リ
ポプレックス溶液をウェルに添加した。表１６において、トランスフェクションのための
実施例は、１つの６ウェルプレートについて計算される。

【0267】

【表16】

【0268】

ｃ． 細胞溶解
最適な細胞溶解を得るために、２つの異なる溶解緩衝液（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）
Ｘ－１００緩衝液および市販の溶解緩衝液Ｍ－ＰＥＲ（商標））を比較し、これらの両方
は、プロテアーゼインヒビターｃＯｍｐｌｅｔｅ、完成不含、および４０μＬ／ｍＬ Ｄ
Ｎａｓｅ Ｉ溶液（２３：１：１の混合物中）で補完された。したがって、細胞を６ウェ
ルプレートに播種し、６時間および２４時間処理した。処理後、細胞を回収した。したが
って、１ｍＬのＤＰＢＳを用いてプレートを１回洗浄した。板から細胞を除去するために
、さらに１ｍＬのＤＰＢＳを添加し、細胞を板からき取り、エッペンドルフチューブに移
した。ＤＰＢＳを除去するために、細胞を６２５０×ｇで２分間、４℃で遠心分離した。
細胞溶解は、２００μＬのそれぞれの緩衝液を添加することによって行った。完全な溶解
を確実にするために、細胞を氷上で３０分間インキュベートした。溶解後、ＢＣＡアッセ
イを行って、ＢＣＡタンパク質アッセイキットを使用して、製造業者の指示にしたがって
、以下の変更を加えて、総タンパク質濃度を決定した：
● ５μＬの細胞溶解物に２００μＬの作業試薬を添加した
● 試料および標準物質を３回測定した
● 試料を３７℃で３０分間インキュベートする前に、プレートを４５０ｒｐｍで３０
秒間振盪した

【0269】

ｄ． 試料調製
試料を５μＬのＢｏｌｔ（登録商標） ＬＤＳ試料緩衝液および２μＬのＢｏｌｔ（登
録商標）試料還元剤と混合し、次いで７０℃で１０分間加熱した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを
行った。３０ 総タンパク質μｇをＳＤＳ－ＰＡＧＥに使用し、ボルト（商標）４～１２
％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル、１０ウェルを使用した。

【0270】

ｅ． ＳＤＳ Ｐａｇｅ ａｎｄ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ方法
Ｔｒａｎｓ －Ｂｌｏｔ（登録商標） Ｔｕｒｂｏ（商標）システムトランスファーを
使用した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥを、２００ Ｖを４０分間印加して行った。移送は、Ｔｒａ
ｎｓＢｌｏｔ（登録商標）ターボＴＭ移送システムを用いて３０分間行った。

【0271】

ｆ． 抗体およびブロッキング方法
転写後、膜を室温で１時間ブロックした。ＮＥＴ－ゼラチンをブロッキング試薬として
使用した。アトラス抗体由来の抗体ＨＰＡ０３５３６４をＣＣＤＣ３９の検出に使用し、
ａｂｃａｍ由来の抗体ａｂ８２２７をアクチンの検出に使用した。抗体を添加する前に、
膜を約６０ｋＤａで切断した。膜を一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。室温
でブロッキング溶液で３回（各１０分）洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ共役二
次抗体を室温で１時間（１：２０ ０００に希釈）加えた。膜を、室温で１０分毎にブロ
ッキング溶液で再び３回洗浄した。

【0272】

ｇ． 化学発光信号現像
シグナルは、化学発光基質キット（シグナルの強度に応じて、Ｌｕｍｉｎａｔａ Ｃｒ
ｅｓｃｅｎｄｏ、ＣｌａｓｓｉｃｏまたはＦｏｒｔｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＨＲＰ基質）お
よびＣｈｅｍｉＤｏｃＴＭ ＭＰ Ｓｙｓｔｅｍを用いて可視化した。

【0273】

２． 分化ＡＬＩ培養における内因性ＣＣＤＣ３９のウェスタンブロット
ａ． 細胞溶解
２５０μＬのＡＬＩ溶解緩衝液（組成物の詳細については表１７を参照）を挿入当たり
添加し、氷上で１５分間インキュベートした。インキュベーションの前、間（５分毎）お
よび端部に、ＡＬＩ溶解緩衝液を前後にピペットで移した。エッペンドルフチューブに移
し、各インサートを１５０μＬのＡＬＩ溶解緩衝液でリンスした後、試料を完全にボルテ
ックスした。この工程において、試料は任意に、さらなる処理まで－２０℃で保存され得
る。

【0274】

【表17】

【0275】

ｂ． 全細胞溶解物からの軸糸溶解物の分離
試料をＬｙｓｉｎｇ Ｍａｔｒｉｘ Ａチューブに添加した（チューブを洗浄した後、
７０％ ＥｔｈＯＨで洗浄し、ガーネットを除去した）。チューブを固定し、チューブを
動かしながら２０秒間液体窒素中で凍結させた。チューブをＭＰ ＦａｓｔＰｒｅｐ－２
４（ＨＯＭ－１）に迅速に挿入し、設定：６．５ｍ／ｓ、３×１分。続いて、チューブを
氷上で１５分間凝縮させた後、液体を新鮮なエッペンドルフチューブに移し、１１００ｒ
ｐｍ、４℃で２０分間回転させた。上清を新しいＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブに移し、ペ
レットおよび上清をさらに処理するまで－２０℃で保存した。

【0276】

ｃ． 軸糸抽出物溶解物の調製：繊毛軸糸タンパク質の高塩抽出
各ペレットを５０μｌのＭＭＲＢ ＋ ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１
００（ＭＭＲＢ ＋ ０．１％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００の組成物の詳細
については表１８を参照）に再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした（時折穏やか
にボルテックスしながら）。４℃で１０分間１４，０００ｒｐｍで回転させた後、上清を
新しいエッペンドルフチューブに移し、さらなる処理まで－２０℃で保存した。

【0277】

【表18】

【0278】

【表19】

【0279】

ｄ． ウェスタンブロットのための溶解物の調製
試料を氷上で解凍し、３０μｌの試料を新しいエッペンドルフチューブに移した。１２
試料を７０℃、３５０ｒｐｍで１０分間加熱する前に、ＬＤＳ試料緩衝液μＬおよび１
０×還元剤５μｌを添加した。ウェルあたり５、１０および３０μｌを、Ｂｏｌｔ（商標
）４～１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル、１０ウェルに適用した。

【0280】

ｅ． ＳＤＳ Ｐａｇｅおよびブロッティング方法：ＩＶ １ｅ参照

【0281】

ｆ． 抗体とブロッキング方法：ＩＶ １ ｆ参照

【0282】

ｇ． 化学発光シグナル発生：ＩＶ １ｇ参照

【0283】

（ＩＩ． 結果）
ＣＣＤＣ４０発現を、トランスフェクションの６時間、２４時間、４８時間、７２時間
および１４４時間後にＨＥＫ２９３細胞において決定した。特に、２／１．４／０．３／
０．２／０．０５ｘ１０^６細胞を６ウェルプレートでシーディングし、Ｌｉｐｏｆｅｃｔ
ａｍｉｎｅ（登録商標） ２０００を用いて種々のＣＣＤＣ４０構築物（２．５μｇ／９
．５ｃｍ²）でシーディング後２４ｈに細胞をトランスフェクトした。この実験で使用し
たＣＣＤＣ４０ ｍＲＮＡ構築物は、Ｔ０６～Ｔ１０（配列番号１、および配列番号５～
配列番号８）であった。トランスフェクションの６、２４、４８、７２および１４４時間
後に細胞溶解を行い、総タンパク質溶解物５０μｇをＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびウェスタン
ブロットで分析した。

【0284】

図１に見られるように、ピーク翻訳効率は、ＨＥＫ細胞におけるＣＣＤＣ４０ ｍＲＮ
Ａのトランスフェクションの６時間後に検出可能であった。

【0285】

このケースでは、２ｘ１０ ^６ ＨＥＫ２９３、７．５ｘ１０ ^５ ＢＥＡＳ－２Ｂ
および５ｘ１０ ^５ ＲＰＭＩ ２６５０ 細胞を６ ウェルプレートにシードし、ＳＤ
Ｓ－ＰＡＧＥ およびウェスタンブロット（ＨＥＫ２９３： ５０μｇ、ＲＰＭＩ ２６
５０： ２０μｇ、ＢＥＡＳ－２Ｂ： ３０μｇ の全解析）を用いてタンパク質解析を
行ったところ、アトラスアンチボディ（１：２０００）のＡｎｔｉ－ＣＣＤＣ４０ Ａｎ
ｔｉｂｏｄｙ（ＨＰＡ０２２９７４）を用いてＣＣＤＣ４０を検出した。

【0286】

ここで、Ｔ０９（ＣＹＢＡ；配列番号１）およびＴ１０（ヒト成長ホルモン配列番号８
からのヒトＣＭＶ ＩＥ９および３’ＵＴＲ）ＵＴＲが、ＢＥＡＳ－２Ｂ、ＲＰＭＩ２６
５０およびＨＥＫ２９３細胞におけるトランスフェクションの６時間後に最高の翻訳効率
をもたらしたことが観察され得る（図２）。

【0287】

次いで、患者由来ＡＬＩ培養物における繊毛運動性の回復を調べるために、２つの実験
を行った。特に、第１の実験では非分化ＡＬＩ培養物（データは示されていない）を用い
た（繊毛細胞はエクソン１および２の欠損があり、結果として非常にショートポジション
運動性の低い繊毛を生じた）一方、第２の実験では分化ＡＬＩ培養物を用いた。いずれの
場合も、ＡＬＩ培養には３μｇ ＬＦ９２／ＣＣＤＣ４０（ＥＴＨ０３１Ｔ０９；配列番
号１）を隔日に１ヶ月ごとに、計１６回のトランフェクトを施した。読み出しとして、高
速ビデオ顕微鏡（ＨＳＶＭ）を２４時間毎に、免疫蛍光免疫細胞化学（ＩＦ－ＩＣＣ）で
行った。トランスフェクションの前およびトランスフェクションの２４時間後ごとに、ビ
デオ（インサートあたり２０）を採取し、ＣＦＢ（毛様体拍動頻度）をＳＡＶＡソフトウ
ェアを用いて計算した。１６個全部のトランスフェクション（１ヶ月）を行った。測定は
、４０倍の倍率を用いて３７℃で行った。繊毛拍動頻度（ＣＢＦ）の平均値を計算する。

【0288】

ＬＦ９２／ＣＣＤＣ４０の反復トランスフェクションは、患者由来の完全に分化したＡ
ＬＩ培養物において忍容性が高かった。ＣＣＤＣ４０タンパク質はＩＦ－ＩＣＣによる２
２日後の気道上皮細胞の自然発生細胞下領域、すなわち繊毛で検出でき、繊毛運動性はＬ
Ｆ９２／ＣＣＤＣ４０トランスフェクション後に、分化ＡＬＩ培養による実験のための図
３で見るように、正常な繊毛拍動頻度の１８日目から約５０％まで増加した。

【0289】

材料および方法の節に記載されるように、未分化ＡＬＩ培養物を、培地Ｇを使用して得
、そしてトランスフェクション（ＴＦ）を、エアリフトの１８日後に開始した。ＣＣＤＣ
４０ ｍＲＮＡ／ＬＦ９２によるＣＣＤＣ４０患者ＡＬＩ培養のトランスフェクション（
ＴＦ）を週１回、４週間実施した（＝４ｘ ＴＦ）。粘膜繊毛クリアランス（ＭＣＣ）を
、０．５μｍ蛍光ビーズを用いて２０倍の倍率で測定した。異なる領域の３０枚のビデオ
を撮影し、最後のＴＦの１週間後にニコンからのポーラーグラフソフトウェアで分析する
。

【0290】

重要なことに、４週間のＣＣＤＣ４０ ｍＲＮＡ／ＬＦ９２トランスフェクション後の
ＣＣＤＣ４０患者ＡＬＩにおける繊毛拍動の回復が検出できた。さらに、繊毛の拍動を同
期させ、図４に見られるように指向性粒子輸送を可能にした。比較のために、制御、すな
わちｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＲＮＡ／ＬＦ１１１トランスフェクションの４倍、および健常
制御の場合の粒子輸送を図５に示す。

【0291】

このように、毛様体細胞の分化期に、ｔｄＴｏｍａｔｏ制御との比較によって示される
ように、ＬＦ９２による患者ＡＬＩ培養のＣＣＤＣ４０ ｍＲＮＡ／ＬＦ９２ＴＦの成功
は、成功裏の繊毛成長、成功裏の繊毛拍動、成功裏の指向性粒子輸送、および成功裏のタ
ンパク質検出（ＤＲＣ錯体の一部としてのＣＣＤＣ４０ ＋ ＧＡＳ８／ＤＮＡＬＩ１の
結合パートナーとしてのＣＣＤＣ３９）をもたらした。さらに、ｔｄＴｏｍａｔｏ制御挿
入は、上記の効果のいずれも示さなかった。

【0292】

図６は制御（ｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＲＮＡ）処理患者ＡＬＩに存在しない健常制御と同
様に、ＣＣＤＣ４０ ｍＲＮＡによる反復患者ＡＬＩ処理後の軸糸内へのＧＡＳ８タンパ
ク質の取り込みの成功を示す。図７は対照（ｔｄＴｏｍａｔｏ ｍＲＮＡ）処理患者ＡＬ
Ｉに存在しない健常対照と同様に、ＣＣＤＣ４０ ｍＲＮＡによる反復患者ＡＬＩ処理後
の軸糸内へのＤＮＡＬＩ－１タンパク質の取り込みの成功を示す。図８は制御（ｔｄＴｏ
ｍａｔｏ ｍＲＮＡ）処理患者ＡＬＩに存在しない健常制御と同様に、ＣＣＤＣ４０ ｍ
ＲＮＡによる反復患者ＡＬＩ処理後の軸糸内へのＣＣＤＣ３９タンパク質の取り込みが成
功したことを示している。

【0293】

要約すると、繊毛運動性は分化ＡＬＩ培養を用いると有意なレベルに回復できなかった
が、分化ＡＬＩ培養を用いると部分的に回復した。

【0294】

ＣＣＤＣ３９実験に関して、ＣＣＤＣ３９タンパク質は図９に見られるように、ＨＥＫ
－２９３およびＢＥＡＳ－２Ｂ細胞におけるトランスフェクションの６時間後および２４
時間後にウェスタンブロット分析によって検出することができた。図１１に示すように、
ＣＣＤＣ３９（ＥＴＨ０４７Ｔ０３；配列番号１３）式は、１６ＨＢＥ１４ｏ使用プロテ
アソーム阻害剤において６時間後に検出することができた。ＥＴＨ０４７Ｔ０２（配列番
号１２）、ＥＴＨ０４７Ｔ０４（配列番号２）、およびＥＴＨ０４７Ｔ０５（配列番号１
４）についても同様の実験を行い、同等の結果を得た。図１２に示されるように、ＣＣＤ
Ｃ３９（ＥＴＨ０４７Ｔ０３；配列番号１３）式はまた、１６ＨＢＥ１４ｏ使用プロテア
ソーム阻害剤において２４時間後に検出され得た。

【0295】

本出願に記載される例示的な配列を以下に提供する。本開示はいくつかの実施形態にお
いて、例えば、配列番号１または２に示されるＵＴＲ配列、またはそのような配列に少な
くとも９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一の配列、または前記のいず
れかに対応するかまたはそれによってコードされるｍＲＮＡ等のポリリボヌクレオチド配
列を含むポリリボヌクレオチドを提供する。前記のいずれかの特定の実施形態では、ポリ
ヌクレオチドまたはポリリボヌクレオチドは修飾される（例えば、本明細書に記載のヌク
レオチド類似体を含む）。

【0296】

配列番号１

【0297】

配列番号２

【0298】

配列番号３

【0299】

配列番号４

【0300】

配列番号５

【0301】

配列番号６

【0302】

配列番号７

【0303】

配列番号８

【0304】

配列番号９

【0305】

配列番号１０

【0306】

配列番号１１

【0307】

配列番号１２

【0308】

配列番号１３

【化26-3】

【0309】

配列番号１４

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【配列表】

2024096766000001.xml

【手続補正書】

【提出日】2024-04-23

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項1】

ポリリボヌクレオチドの毛様体形成に対する効果を分析する方法であって、前記ポリリボヌクレオチドは、毛様体形成に関連するおよび／または必要とされるタンパク質をコードし、該方法は、以下の工程を含む、方法：
（ａ） 繊毛病を有する対象の鼻ブラシを得る工程であって、該鼻ブラシは、未分化基底細胞および分化した繊毛細胞を含む、工程、
（ｂ） 未分化基底細胞および脱分化繊毛細胞を得るために、工程（ａ）から得られた細胞を、水中細胞培養物として培養する工程、
（ｃ） 工程（ｂ）から得られた未分化基底細胞および脱分化繊毛細胞を、気液界面細胞培養物として培養し、エアリフトを実施する工程、
（ｄ） 工程（ｃ）から得られた細胞を、毛様体形成に関連および／または必要なタンパク質をコードするポリリボヌクレオチドでトランスフェクトする工程、
（ｅ） 分化した繊毛細胞を得るために、工程（ｄ）から得られたトランスフェクトされた細胞を培養する工程、および
（ｆ） 前記ポリリボヌクレオチドの毛様体形成に対する効果を、乳酸デヒドロゲナーゼ測定、ＮｕｃＧｒｅｅｎアッセイ、高速ビデオ顕微鏡法、毛様ビート周波数測定、粘膜毛様クリアランスアッセイ、および／または免疫蛍光染色を用いて決定する工程。

【請求項2】

前記細胞が、工程（ｃ）において前記エアリフトを実施した後０～４８時間以内にトランスフェクトされる、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記細胞が、毛様体形成に関連するおよび／または必要とされるタンパク質をコードするポリリボヌクレオチドで、式（Ｖ）：

【化1】

に示される構造を有するリピドイドを用いてトランスフェクトされる、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記細胞が、工程（ｂ）～（ｅ）において以下の組成：

【表1】

を有する培地Ｇを用いて培養される、請求項１～３のいずれかに記載の方法。

【請求項5】

前記鼻ブラシが、線維芽細胞をさらに含み、かつ、前記線維芽細胞の増殖が、工程（ｂ）～（ｅ）において阻害される、請求項１～４のいずれかに記載の方法。

【外国語明細書】