特開 2024-97078 Ｂ型肝炎ウイルスを強力に中和する抗体及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024097078

(43)【公開日】2024-07-17

(54)【発明の名称】Ｂ型肝炎ウイルスを強力に中和する抗体及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/08 20060101AFI20240709BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240709BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240709BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240709BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240709BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240709BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240709BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240709BHJP

   A61P 31/20 20060101ALI20240709BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20240709BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240709BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240709BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20240709BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20240709BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240709BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240709BHJP

   A61K 38/21 20060101ALI20240709BHJP

   A61K 31/513 20060101ALI20240709BHJP

   C07K 14/555 20060101ALN20240709BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20240709BHJP

【ＦＩ】

C07K16/08 ZNA

C12N15/13

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

A61P31/20

A61P31/14

A61K39/395 S

A61K39/395 D

A61K48/00

A61K35/12

A61P1/16

A61K45/00

A61P43/00 121

A61K38/21

A61K31/513

C07K16/08

C07K14/555

C07K16/28

【審査請求】未請求

【請求項の数】87

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2024074160

(22)【出願日】2024-05-01

(62)【分割の表示】P 2022175909の分割

【原出願日】2016-10-07

(31)【優先権主張番号】PCT/EP2015/001970

(32)【優先日】2015-10-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】516097907

【氏名又は名称】ヒューマブス バイオメド エスエー

(74)【代理人】

【識別番号】100107766

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠重

(74)【代理人】

【識別番号】100070150

【弁理士】

【氏名又は名称】伊東 忠彦

(74)【代理人】

【識別番号】100135079

【弁理士】

【氏名又は名称】宮崎 修

(72)【発明者】

【氏名】ダヴィデ・コルティ

(57)【要約】      （修正有）

【課題】Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）及びデルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）の両方を中和することができる抗体ベースの製品、更に、より優れた慢性Ｂ型肝炎治療を可能にする抗体ベースの製品を提供する。
【解決手段】本発明は、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）の抗原性ループ領域に結合し且つＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）及びデルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）の両方の感染を強力に中和する抗体及びその抗原結合断片を提供する。また、本発明は、抗体及び抗原結合断片が結合するエピトープ、並びにかかる抗体及び抗体断片をコードしている核酸及び産生する細胞を提供する。更に、本発明は、Ｂ型肝炎及びＤ型肝炎の診断、予防、及び治療における本発明の抗体及び抗体断片の使用を提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＨＢｓＡｇの抗原性ループ領域に結合し、且つＢ型肝炎ウイルス及びデルタ型肝炎ウイルスの感染を中和することを特徴とする単離抗体又はその抗原結合断片。

【請求項2】

ＨＢｓＡｇ及びＨＢＶのクリアランスを促進する請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項3】

Ｆｃ部分を含む請求項１から２のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項4】

ＨＢｓＡｇ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、及びＪのうちの少なくとも６個、好ましくは少なくとも８個、より好ましくは１０個全てに結合する請求項１から３のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項5】

抗原性ループ領域に突然変異を有するＨＢｓＡｇ突然変異体：ＨＢｓＡｇ Ｙ１００Ｃ／Ｐ１２０Ｔ、ＨＢｓＡｇ Ｐ１２０Ｔ、ＨＢｓＡｇ Ｐ１２０Ｔ／Ｓ１４３Ｌ、ＨＢｓＡｇ Ｃ１２１Ｓ、ＨＢｓＡｇ Ｒ１２２Ｄ、ＨＢｓＡｇ Ｒ１２２Ｉ、ＨＢｓＡｇ Ｔ１２３Ｎ、ＨＢｓＡｇ Ｑ１２９Ｈ、ＨＢｓＡｇ Ｑ１２９Ｌ、ＨＢｓＡｇ Ｍ１３３Ｈ、ＨＢｓＡｇ Ｍ１３３Ｌ、ＨＢｓＡｇ Ｍ１３３Ｔ、ＨＢｓＡｇ Ｋ１４１Ｅ、ＨＢｓＡｇ Ｐ１４２Ｓ、ＨＢｓＡｇ Ｓ１４３Ｋ、ＨＢｓＡｇ Ｄ１４４Ａ、ＨＢｓＡｇ Ｇ１４５Ｒ、及びＨＢｓＡｇ Ｎ１４６Ａのうちの少なくとも１２個、好ましくは少なくとも１５個、より好ましくは１８個全てに結合する請求項１から４のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項6】

前記ＨＢｓＡｇの抗原性ループ領域のうちの少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個、より好ましくは少なくとも３個、更により好ましくは少なくとも４個のアミノ酸を含むエピトープに結合し、前記少なくとも１個、好ましくは前記少なくとも２個、より好ましくは前記少なくとも３個、更により好ましくは前記少なくとも４個のアミノ酸が、ＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸１１５～１３３、好ましくは前記ＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸１２０～１３３、より好ましくは前記ＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸１２０～１３０から選択される請求項１から５のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項7】

前記ＨＢｓＡｇの抗原性ループ領域のうちの少なくとも２個、好ましくは少なくとも３個、より好ましくは少なくとも４個のアミノ酸を含むエピトープに結合し、前記少なくとも２個、好ましくは前記少なくとも３個、より好ましくは前記少なくとも４個のアミノ酸が、前記ＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸１２０～１３３、好ましくはアミノ酸１２０～１３０から選択され、前記少なくとも２個、好ましくは前記少なくとも３個、より好ましくは前記少なくとも４個のアミノ酸が、隣接する位置に位置する請求項６に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項8】

前記エピトープが、立体構造的エピトープである請求項６から７のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項9】

前記ＨＢｓＡｇの抗原性ループ領域のうちの少なくとも２個、好ましくは少なくとも３個、より好ましくは少なくとも４個のアミノ酸を含むエピトープに結合し、前記少なくとも２個、好ましくは前記少なくとも３個、より好ましくは前記少なくとも４個のアミノ酸が、前記ＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸１２０～１３３、好ましくはアミノ酸１２０～１３０から選択され、前記少なくとも２個、好ましくは前記少なくとも３個、より好ましくは前記少なくとも４個のアミノ酸のうちの少なくとも２個、好ましくは少なくとも３個が、隣接する位置には位置しない請求項６から８のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項10】

少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個、より好ましくは少なくとも３個、更により好ましくは少なくとも４個、最も好ましくは少なくとも５個のアミノ酸が、前記エピトープに含まれ且つ隣接する位置には位置しない前記少なくとも２個、好ましくは少なくとも３個のアミノ酸間に位置する請求項９に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項11】

前記ＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸Ｐ１２０、Ｃ１２１、Ｒ１２２、及びＣ１２４を少なくとも含むエピトープに結合する請求項６から１０のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項12】

配列番号８８：

【表1】

（式中、Ｘは、任意のアミノ酸であるか又はアミノ酸が存在せず；好ましくは、Ｘは、任意のアミノ酸であり、より好ましくは、Ｘは、Ｔ、Ｙ、Ｒ、Ｓ、又はＦであり；更により好ましくは、Ｘは、Ｔ、Ｙ、又はＲであり；最も好ましくは、Ｘは、Ｔ又はＲである）
に係るアミノ酸配列を含むエピトープに結合する請求項６から１１のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項13】

配列番号８０：

【表2】

に係るアミノ酸配列、又は配列番号８０と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含むエピトープに結合する請求項６から１２のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項14】

配列番号８５：

【表3】

に係るアミノ酸配列、又は配列番号８５と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含むエピトープに結合する請求項６から１３のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項15】

前記エピトープが、前記ＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸１４５～１５１（配列番号８１）を少なくとも含むアミノ酸配列を更に含む請求項６から１４のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項16】

前記エピトープが、配列番号８０に係るアミノ酸配列及び配列番号８１に係るアミノ酸配列を含む請求項６から１５のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項17】

前記エピトープが、配列番号８５に係るアミノ酸配列及び配列番号８７に係るアミノ酸配列を含む請求項６から１６のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項18】

配列番号１：

【表4】

（式中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、及びＸ_７は、任意のアミノ酸であり得る）
に係るアミノ酸配列によって形成される前記ＨＢｓＡｇの抗原性ループにおけるエピトープに結合する請求項１から１７のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項19】

配列番号２：

【表5】

（式中、Ｘ_１は、Ｐ、Ｔ、又はＳであり、
Ｘ_２は、Ｃ又はＳであり、
Ｘ_３は、Ｒ、Ｋ、Ｄ、又はＩであり、
Ｘ_４は、Ｍ又はＴであり、
Ｘ_５は、Ｔ、Ａ、又はＩであり、
Ｘ_６は、Ｔ、Ｐ、又はＬであり、
Ｘ_７は、Ｑ、Ｈ、又はＬである）
に係るアミノ酸配列によって形成される前記ＨＢｓＡｇの抗原性ループにおけるエピトープに結合する請求項１８に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項20】

配列番号５～３３から選択されるアミノ酸配列を有する前記ＨＢｓＡｇのＳドメインの抗原性ループ領域又はその配列変異体に結合する請求項１９に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項21】

モノクローナル抗体若しくはそのモノクローナル抗原結合断片及び／又はヒト抗体若しくはそのヒト抗原結合断片である請求項１から２０のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項22】

ＩｇＧ型、好ましくはＩｇＧ１型である請求項１から２１のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項23】

少なくとも１つのＣＤＲＨ１、少なくとも１つのＣＤＲＨ２、及び少なくとも１つのＣＤＲＨ３を含む重鎖と、少なくとも１つのＣＤＲＬ１、少なくとも１つのＣＤＲＬ２、及び少なくとも１つのＣＤＲＬ３を含む軽鎖とを含み、前記少なくとも１つの重鎖ＣＤＲＨ３が、配列番号３６に係るアミノ酸配列又はその機能性配列変異体を含む請求項１から２２のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項24】

前記少なくとも１つの重鎖ＣＤＲＨ３が、配列番号３６と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む請求項２３に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項25】

前記少なくとも１つの重鎖ＣＤＲＨ３が、配列番号３６に係るアミノ酸配列を含む請求項２３から２４のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項26】

少なくとも１つのＣＤＲＨ１、少なくとも１つのＣＤＲＨ２、及び少なくとも１つのＣＤＲＨ３を含む重鎖と、少なくとも１つのＣＤＲＬ１、少なくとも１つのＣＤＲＬ２、及び少なくとも１つのＣＤＲＬ３を含む軽鎖とを含み、前記少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲＬ３が、配列番号４０若しくは５８に係るアミノ酸配列又はその機能性配列変異体を含む請求項１から２５のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項27】

前記少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲＬ３が、配列番号４０又は５８と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む請求項２６に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項28】

前記少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲＬ３が、配列番号４０又は５８に係るアミノ酸配列を含む請求項２６から２７のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項29】

前記少なくとも１つの重鎖ＣＤＲＨ１が、配列番号３４に係るアミノ酸配列若しくはその機能性配列変異体を含む、前記少なくとも１つのＣＤＲＨ２が、配列番号３５に係るアミノ酸配列若しくはその機能性配列変異体を含む、及び／又は前記少なくとも１つの重鎖ＣＤＲＨ３が、配列番号３６に係るアミノ酸配列若しくはその機能性配列変異体を含む請求項２３から２８のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項30】

前記少なくとも１つの重鎖ＣＤＲＨ１が、配列番号３４と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％若しくは９９％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む；前記少なくとも１つの重鎖ＣＤＲＨ２が、配列番号３５若しくは６６と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％若しくは９９％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む；及び／又は前記少なくとも１つの重鎖ＣＤＲＨ３が、配列番号３６と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％若しくは９９％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む請求項２９に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項31】

前記少なくとも１つの重鎖ＣＤＲＨ１が、配列番号３４に係るアミノ酸配列を含む；前記少なくとも１つの重鎖ＣＤＲＨ２が、配列番号３５若しくは６６に係るアミノ酸配列を含む；及び／又は前記少なくとも１つの重鎖ＣＤＲＨ３が、配列番号３６に係るアミノ酸配列を含む請求項２９から３０のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項32】

前記少なくとも１つのＣＤＲＬ１が、配列番号３７に係るアミノ酸配列若しくはその機能性配列変異体を含む、前記少なくとも１つのＣＤＲＬ２が、配列番号３８若しくは３９に係るアミノ酸配列若しくはその機能性配列変異体を含む、及び／又は前記少なくとも１つのＣＤＲＬ３アミノが、配列番号４０に係るアミノ酸配列若しくはその機能性配列変異体を含む請求項２３から３１のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項33】

前記少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲＬ１が、配列番号３７に係るアミノ酸配列若しくはその機能性配列変異体を含む、前記少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲＬ２が、配列番号３８若しくは３９に係るアミノ酸配列又はその機能性配列変異体を含む、及び／又は前記少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲＬ３アミノが、配列番号５８に係るアミノ酸配列若しくはその機能性配列変異体を含む請求項２３から３１のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項34】

前記少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲＬ１が、配列番号３７と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％若しくは９９％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む；前記少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲＬ２が、配列番号３８若しくは３９と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％若しくは９９％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む；及び／又は前記少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲＬ３が、配列番号４０若しくは５８と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％若しくは９９％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む請求項３２から３３のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項35】

前記少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲＬ１が、配列番号３７に係るアミノ酸配列を含む；前記少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲＬ２が、配列番号３８若しくは３９に係るアミノ酸配列を含む；及び／又は前記少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲＬ３が、配列番号４０若しくは５８に係るアミノ酸配列を含む請求項３２から３４のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項36】

それぞれ、配列番号３４から３８及び４０に係るＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３アミノ酸配列並びにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３アミノ酸配列、若しくはこれらの機能性配列変異体、又は配列番号３４から３７及び３９から４０に係るＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３アミノ酸配列並びにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３アミノ酸配列、若しくはこれらの機能性配列変異体を含む請求項１から３２、３４、及び３５のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項37】

それぞれ、配列番号３４、３６から３８、４０、及び６６に係るＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３アミノ酸配列並びにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３アミノ酸配列、若しくはこれらの機能性配列変異体、又はそれぞれ、配列番号３４、３６から３７、３９から４０、及び６６に係るＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３アミノ酸配列並びにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３アミノ酸配列、若しくはこれらの機能性配列変異体を含む請求項１から３２、３４、及び３５のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項38】

それぞれ、配列番号３４から３８及び５８に係るＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３アミノ酸配列並びにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３アミノ酸配列、若しくはこれらの機能性配列変異体、又は配列番号３４から３７、３９、及び５８に係るＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３アミノ酸配列並びにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３アミノ酸配列、若しくはこれらの機能性配列変異体を含む請求項１から３１及び３３から３５のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項39】

それぞれ、配列番号３４、３６から３８、５８及び６６に係るＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３アミノ酸配列並びにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３アミノ酸配列、若しくはこれらの機能性配列変異体、又はそれぞれ、配列番号３４、３６から３７、３９、５８及び６６に係るＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３アミノ酸配列並びにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３アミノ酸配列、若しくはこれらの機能性配列変異体を含む請求項１から３１及び３３から３５のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項40】

（ｉ）それぞれ、配列番号３４から３８及び４０のそれぞれと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％若しくは９９％の配列同一性を共有するか；（ｉｉ）それぞれ、配列番号３４から３７、３９及び４０のそれぞれと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％若しくは９９％の配列同一性を共有するか；（ｉｉｉ）それぞれ、配列番号３４から３８及び５８のそれぞれと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％若しくは９９％の配列同一性を共有するか；（ｉｖ）それぞれ、配列番号３４から３７、３９及び５８のそれぞれと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％若しくは９９％の配列同一性を共有するか；（ｖ）それぞれ、配列番号３４、３６から３８、４０及び６６のそれぞれと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％若しくは９９％の配列同一性を共有するか；（ｖｉ）それぞれ、配列番号３４、３６から３７、３９、４０及び６６のそれぞれと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％若しくは９９％の配列同一性を共有するか；（ｖｉｉ）それぞれ、配列番号３４、３６から３８、５８及び６６のそれぞれと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％若しくは９９％の配列同一性を共有するか；（ｖｉｉｉ）それぞれ、配列番号３４、３６から３７、３９、５８及び６６のそれぞれと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％若しくは９９％の配列同一性を共有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３アミノ酸配列並びにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む請求項３６から３９のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項41】

（ｉ）それぞれ配列番号３４から３８及び４０に係るか；（ｉｉ）それぞれ配列番号３４から３７、３９及び４０に係るか；（ｉｉｉ）それぞれ配列番号３４から３８及び５８に係るか；（ｉｖ）それぞれ配列番号３４から３７、３９及び５８に係るか；（ｖ）それぞれ配列番号３４、３６から３８、４０及び６６に係るか；（ｖｉ）それぞれ配列番号３４、３６から３７、３９、４０及び６６に係るか；（ｖｉｉ）それぞれ配列番号３４、３６から３８、５８及び６６に係るか；（ｖｉｉｉ）それぞれ配列番号３４、３６から３７、３９、５８及び６６に係るＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３アミノ酸配列並びにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む請求項３６から４０のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項42】

配列番号４１に係る重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列又はその機能性配列変異体と、配列番号４２に係る軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列又はその機能性配列変異体とを含む請求項１から３２、３４から３７、及び４０から４１のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項43】

配列番号４１又は６７に係る重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列又はその機能性配列変異体と、配列番号４２に係る軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列又はその機能性配列変異体とを含む請求項１から３２、３４から３７、及び４０から４１のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項44】

（ｉ）配列番号４１又は６７と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を共有する重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列と、（ｉｉ）配列番号４２と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を共有する軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列とを含む請求項４２から４３のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項45】

配列番号４１又は６７に係る重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列と、配列番号４２に係る軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列とを含む請求項４２から４４のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項46】

配列番号４１又は６７に係る重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列又はその機能性配列変異体と、配列番号５９又は６５に係る軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列又はその機能性配列変異体とを含む請求項１から３１、３３から３５、及び３８から４１のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項47】

（ｉ）配列番号４１又は６７と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を共有する重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列と、（ｉｉ）配列番号５９又は６５と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を共有する軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列とを含む請求項４６に記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項48】

配列番号４１又は６７に係る重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列と、配列番号５９又は６５に係る軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列とを含む請求項４６から４７に係る抗体又はその抗原結合断片。

【請求項49】

ｇＨＢＣ３４、好ましくはＨＢＣ３４である請求項１から３２、３４から３６、及び４０から４５のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項50】

ｇＨＢＣ３４ｖ７又はｇＨＢＣ３４ｖ２３、好ましくは、ＨＢＣ３４ｖ７又はＨＢＣ３４ｖ２３である請求項１から３１、３３から３５、３８から４１、及び４６から４８のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項51】

ｇＨＢＣ３４ｖ３１、ｇＨＢＣ３４ｖ３２、又はｇＨＢＣ３４ｖ３３、好ましくは、ＨＢＣ３４ｖ３１、ＨＢＣ３４ｖ３２、又はＨＢＣ３４ｖ３３である請求項１から５０のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項52】

精製抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、又はｓｃＦｖである請求項１から５１のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項53】

医薬として使用するための、請求項１から５２のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項54】

Ｂ型肝炎及び／又はＤ型肝炎の予防、治療、又は軽減において使用するための、請求項１から５３のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片。

【請求項55】

請求項１から５４のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片をコードしているポリヌクレオチドを含むことを特徴とする核酸分子。

【請求項56】

前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号４３から５１のいずれかに記載の核酸配列又はその機能性配列変異体を含むか又はからなる請求項５１に記載の核酸分子。

【請求項57】

前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号４３から５１、６０から６４、及び６８から７８のいずれかと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を共有する核酸配列を含むか又はからなる請求項５５に記載の核酸分子。

【請求項58】

前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号４３から５１、６０から６４、及び６８から７８のいずれかに記載の核酸配列を含むか又はからなる請求項５５又は５７に記載の核酸分子。

【請求項59】

前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号７０から７８のいずれかと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を共有する核酸配列を含むか又はからなる請求項５５に記載の核酸分子。

【請求項60】

前記ポリヌクレオチド配列が、請求項７０から７８のいずれかに記載の核酸配列を含むか又はからなる請求項５５及び５７から５９のいずれかに記載の核酸分子。

【請求項61】

請求項５５から６０のいずれかに記載の核酸分子を含むことを特徴とするベクター。

【請求項62】

請求項１から５４のいずれかに記載の抗体若しくはその抗原結合断片を発現するか；又は請求項６１に記載のベクターを含むことを特徴とする細胞。

【請求項63】

請求項１から５４のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項５５から６０のいずれかに記載の核酸、請求項６１に記載のベクター、及び／又は請求項６２に記載の細胞を含むことを特徴とする医薬組成物。

【請求項64】

薬学的に許容し得る賦形剤、希釈剤、又は担体を含む請求項６３に記載の医薬組成物。

【請求項65】

（ｉ）Ｂ型肝炎及び／又はＤ型肝炎の予防、治療、又は軽減；又は（ｉｉ）Ｂ型肝炎及び／又はＤ型肝炎の診断において使用するための請求項１から５４のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項５５から６０のいずれかに記載の核酸、請求項６１に記載のベクター、請求項６２に記載の細胞、又は請求項６３から６４のいずれかに記載の医薬組成物。

【請求項66】

慢性Ｂ型肝炎の治療又は軽減において請求項６５に従って使用するための請求項１から５４のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項５５から６０のいずれかに記載の核酸、請求項６１に記載のベクター、請求項６２に記載の細胞、又は請求項６３から６４のいずれかに記載の医薬組成物。

【請求項67】

特にＢ型肝炎誘発性肝不全のための肝移植後のＢ型肝炎（再）感染の予防において請求項６５に従って使用するための請求項１から５４のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項５５から６０のいずれかに記載の核酸、請求項６１に記載のベクター、請求項６２に記載の細胞、又は請求項６３から６４のいずれかに記載の医薬組成物。

【請求項68】

非免疫被験体のＢ型肝炎の防止／予防において請求項６５に従って使用するための請求項１から５４のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項５５から６０のいずれかに記載の核酸、請求項６１に記載のベクター、請求項６２に記載の細胞、又は請求項６３から６４のいずれかに記載の医薬組成物。

【請求項69】

血液透析患者のＢ型肝炎の予防において請求項６５に従って使用するための請求項１から５４のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項５５から６０のいずれかに記載の核酸、請求項６１に記載のベクター、請求項６２に記載の細胞、又は請求項６３から６４のいずれかに記載の医薬組成物。

【請求項70】

新生児のＢ型肝炎の予防において請求項６５に従って使用するための請求項１から５４のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項５５から６０のいずれかに記載の核酸、請求項６１に記載のベクター、請求項６２に記載の細胞、又は請求項６３から６４のいずれかに記載の医薬組成物。

【請求項71】

Ｄ型肝炎、好ましくはＢ型肝炎及びＤ型肝炎の治療又は軽減において請求項６５に従って使用するための請求項１から５４のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項５５から６０のいずれかに記載の核酸、請求項６１に記載のベクター、請求項６２に記載の細胞、又は請求項６３から６４のいずれかに記載の医薬組成物。

【請求項72】

ポリメラーゼ阻害剤、インターフェロン、及び／又はチェックポイント阻害剤と組み合わせて投与される請求項６５から６６のいずれかに従って使用するための請求項１から５４のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項５５から６０のいずれかに記載の核酸、請求項６１に記載のベクター、請求項６２に記載の細胞、又は請求項６３から６４のいずれかに記載の医薬組成物。

【請求項73】

ポリメラーゼ阻害剤と組み合わせて投与される請求項７２に従って使用するための請求項１から５４のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項５５から６０のいずれかに記載の核酸、請求項６１に記載のベクター、請求項６２に記載の細胞、又は請求項６３から６４のいずれかに記載の医薬組成物。

【請求項74】

前記ポリメラーゼ阻害剤が、ラミブジンである請求項７２から７３のいずれかに従って使用するための請求項１から５４のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項５５から６０のいずれかに記載の核酸、請求項６１に記載のベクター、請求項６２に記載の細胞、又は請求項６３から６４のいずれかに記載の医薬組成物。

【請求項75】

前記ポリメラーゼ阻害剤、前記インターフェロン、及び／又は前記チェックポイント阻害剤と同じ又は異なる投与経路を介して投与される請求項７２から７４のいずれかに従って使用するための請求項１から５４のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項５５から６０のいずれかに記載の核酸、請求項６１に記載のベクター、請求項６２に記載の細胞、又は請求項６３から６４のいずれかに記載の医薬組成物。

【請求項76】

（ｉ）請求項１から５４のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項５５から６０のいずれかに記載の核酸、請求項６１に記載のベクター、請求項６２に記載の細胞、又は請求項６３から６４のいずれかに記載の医薬組成物と、
（ｉｉ）ポリメラーゼ阻害剤、インターフェロン、及び／又はチェックポイント阻害剤と
の組合せ。

【請求項77】

Ｂ型肝炎及び／又はＤ型肝炎の予防、治療、又は軽減において使用するため、特に、慢性Ｂ型肝炎及び／又は慢性Ｄ型肝炎の治療又は軽減において使用するための請求項７６に記載の組合せ。

【請求項78】

ＨＢＶ単独感染患者又はＨＢＶ／ＨＤＶ同時感染（ｃｏ－ｉｎｆｅｃｔｅｄ）患者において使用される請求項７７に従って使用するための組合せ。

【請求項79】

ＨＢｓＡｇのクリアランスを加速させる請求項７６に記載の組合せ又は請求項７７から７８のいずれかに従って使用するための組合せ。

【請求項80】

（ｉ）請求項１から５４のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項５５から６０のいずれかに記載の核酸、請求項６１に記載のベクター、請求項６２に記載の細胞、又は請求項６３から６４のいずれかに記載の医薬組成物と、
（ｉｉ）ポリメラーゼ阻害剤、インターフェロン、及び／又はチェックポイント阻害剤と
を含むことを特徴とするキット。

【請求項81】

抗Ｂ型肝炎又は抗Ｄ型肝炎ワクチンの抗原が正確な立体構造の特異的エピトープを含有していることを確認することによって前記ワクチンの品質をモニタリングするための請求項１から５４のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項５５から６０のいずれかに記載の核酸、請求項６１に記載のベクター、請求項６２に記載の細胞、又は請求項６３から６４のいずれかに記載の医薬組成物の使用。

【請求項82】

Ｂ型肝炎及び／又はＤ型肝炎の診断における請求項１から５４のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項５５から６０のいずれかに記載の核酸、請求項６１に記載のベクター、請求項６２に記載の細胞、又は請求項６３から６４のいずれかに記載の医薬組成物の使用。

【請求項83】

単離された血液サンプルがＢ型肝炎ウイルス及び／又はデルタ型肝炎ウイルスに感染しているかどうかの判定における請求項１から５４のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項５５から６０のいずれかに記載の核酸、請求項６１に記載のベクター、請求項６２に記載の細胞、又は請求項６３から６４のいずれかに記載の医薬組成物の使用。

【請求項84】

被験体におけるＢ型肝炎及び／又はＤ型肝炎を予防及び／又は治療する方法であって、請求項１から５４のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項５５から６０のいずれかに記載の核酸、請求項６１に記載のベクター、請求項６２に記載の細胞、及び／又は請求項６３から６４のいずれかに記載の医薬組成物を、それを必要としている被験体に投与することを含むことを特徴とする方法。

【請求項85】

肝移植を受けた被験体を治療する方法であって、治療的に有効な量の請求項１から５４のいずれかに記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項５５から６０のいずれかに記載の核酸、請求項６１に記載のベクター、請求項６２に記載の細胞、及び／又は請求項６３から６４のいずれかに記載の医薬組成物を、前記肝移植を受けた被験体に投与することを含むことを特徴とする方法。

【請求項86】

前記被験体が、慢性Ｂ型肝炎を有する請求項８４から８５のいずれかに記載の方法。

【請求項87】

前記抗体若しくはその抗原結合断片、前記核酸、前記ベクター、前記細胞、又は前記医薬組成物が、ポリメラーゼ阻害剤、インターフェロン、及び／又はチェックポイント阻害剤と組み合わせて投与される請求項８４から８６のいずれかに記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）及びデルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）に対する抗体、並びにその使用の分野に関する。本発明の強力な抗Ｂ型肝炎抗体は、本発明において同定された通り、ＨＢＶエンベロープタンパク質のＳドメインの抗原性ループ領域（ＨＢｓＡｇ）に位置するエピトープに結合する。また、本発明は、かかる抗体及び抗体断片をコードしている核酸、並びにかかる抗体及び抗体断片を産生する不死化Ｂ細胞及び培養プラズマ細胞に関する。更に、本発明は、スクリーニング方法、並びに疾患、具体的にはＢ型肝炎及びＤ型肝炎の診断、予防、及び治療における本発明の抗体及び抗体断片の使用に関する。

【背景技術】

【0002】

Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、（ｉ）３つの関連する表面タンパク質（Ｂ型肝炎表面抗原、ＨＢｓＡｇ）及び脂質を含有するエンベロープと、（ｉｉ）ウイルスＤＮＡゲノム及びＤＮＡポリメラーゼを封入する正二十面体ヌクレオカプシドとからなる。ＨＢＶカプシドは、ＲＮＡプレゲノム複製複合体のパッケージング中に感染細胞のサイトゾルにおいて形成され、粒子の内腔におけるプレゲノムの逆転写によるウイルスＤＮＡゲノムの合成中に出芽する能力を獲得する。３つのＨＢＶエンベロープタンパク質Ｓ－ＨＢｓＡｇ、Ｍ－ＨＢｓＡｇ、及びＬ－ＨＢｓＡｇは、小胞体で複雑に膜を貫通して折り畳まれ、ジスルフィド結合したホモ及びヘテロ二量体を形成する。細胞内の膜において出芽している間、サイトゾルのｐｒｅＳ領域における短い線形ドメインが、カプシド表面における結合部位と相互作用する。続いて、ビリオンが血液中に分泌される。更に、表面タンパク質は、カプシドが存在しなくても出芽し、ビリオンに対して３ｌｏｇ～４ｌｏｇ過剰に分泌されるサブウイルス粒子（ＳＶＰ）を形成することができる。高レベルのＨＢｓＡｇは、ＨＢｓＡｇ特異的Ｔ細胞応答を疲弊させることができ、慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）患者におけるウイルスの免疫寛容の重要な因子として提案されている（非特許文献１）。

【0003】

Ｂ型肝炎ウイルスは、生命を脅かす急性及び慢性の肝臓感染症を引き起こす可能性がある。急性Ｂ型肝炎は、症候性又は無症候性のウイルス血症を特徴とし、劇症肝炎が生じるリスクがある（非特許文献２）。Ｂ型肝炎に対する有効なワクチンが１９８２年から利用可能であるにもかかわらず、２億４０００万人がＢ型肝炎に慢性的に感染しており、毎年７８０，０００人超がＢ型肝炎の合併症で死亡していることがＷＨＯによって報告されている。慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）患者の約３分の１が、肝硬変、肝不全、及び肝細胞癌を発現し、毎年６００，０００人の死因となる（非特許文献２）。

【0004】

慢性Ｂ型肝炎の現在利用可能な治療法としては、（ペグ化）インターフェロン－アルファ（ＩＦＮ－α又はｐｅｇＩＦＮ－α）及びＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ＤＮＡポリメラーゼを阻害するヌクレオシ（チ）ドアナログ直接作用型抗ウイルス剤（ＤＡＡ）（「ポリメラーゼ阻害剤」）が挙げられる。ポリメラーゼ阻害剤としては、ラミブジン、アデホビル、エンテカビル、テルビブジン、及びテノホビルが挙げられる。ポリメラーゼ阻害剤（ラミブジン、アデホビル、エンテカビル、テルビブジン、及びテノホビル）は、ＨＢＶ ＤＮＡポリメラーゼの逆転写酵素機能を抑制するので、プレゲノムＲＮＡからのウイルスＤＮＡの合成に干渉する。この治療は、ウイルスの拡散、ｃｃｃＤＮＡの形成を阻止せず、ＨＢｓＡｇの放出に影響を与えない。更に、ポリメラーゼ阻害剤は、疾患の進行を制限するが、ウイルスを排除のは稀である。したがって、治療の中止後にウイルスの再発が一般的にみられるので、ポリメラーゼ阻害剤は、生涯に亘って使用しなければならない。更に、長期間治療後に薬物耐性変異体が生じる。ＰＥＧ－ＩＦＮ－αは、免疫調節効果を介して間接的に、またＨＢＶ転写物の定常状態レベルを低下させることによって直接ＨＢＶを阻害する（ｃｃｃＤＮＡ結合ヒストンのアセチル化を増加させる）。しかし、ＰＥＧ－ＩＦＮ－αは、有効性が限定されており、重篤な副作用を引き起こす。

【0005】

ｐｅｇＩＦＮ－αは、治療を受けた患者の約３分の１において有効であり、一方、ポリメラーゼ阻害剤は、治療を受けた患者の大部分でウイルス量を著しく低減する（非特許文献３）。インターフェロンαは、多くの有害反応に関連しているので、進行肝硬変又は医学的／精神医学的禁忌を有する患者において使用することはできない（非特許文献２）。エンテカビル及びテノホビル等のポリメラーゼ阻害剤は、有害作用が少ないと考えられ、これら薬物についてのＨＢｅＡＧセロコンバージョン及びＨＢｓＡｇ喪失の速度は遅い。したがって、殆どの患者は、関連するコスト、並びに有害反応、薬物耐性、及びノンアドヒアランスのリスクを伴う生涯に亘る治療を必要とすることが多い。したがって、現在利用可能な慢性Ｂ型肝炎の治療法は、未だ様々な制約による問題点を抱えており、病気を治癒させるとみなすことはできない。したがって、ＨＢＶの治療は改善されてきてはいるが、ＨＢＶ患者は、生涯に亘る治療を必要とすることが多く、治癒は未だ困難な目標である（非特許文献２）。慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）の治癒に最も近い転帰及び治療の理想のエンドポイントは、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を喪失させることであるが、これは、慢性Ｂ型肝炎の現在利用可能な治療法では未だ効率的に達成されてはいない（概説については、非特許文献４を参照）。

【0006】

急性肝炎又は肝細胞癌の重篤な非代償性ＨＢＶ患者には、同所性肝移植（ＯＬＴ）の適応がある。ＯＬＴ後、Ｂ型肝炎の再発率は、予防無しで＞８０％であるが、移植レシピエントの＞９０％は、複合Ｂ型肝炎免疫グロブリン（ＨＢＩＧ）及びヌクレオシ（チ）ドアナログによる治療で臨床的に管理される。Ｂ型肝炎免疫グロブリン（ＨＢＩＧ）は、ワクチンを接種したドナーから精製されたポリクローナルな免疫グロブリンである。しかし、長期に亘るＨＢＩＧの投与は、アベイラビリティの制限及び極めて高いコストを含む幾つかの未解決の問題に関連している（非特許文献５）。更に、極めて高用量を投与しなければならない。即ち、移植中のレシピエントに静脈内注入により１０グラム（結合アッセイに基づいて１０，０００ＩＵを含有）を投与する。続いて、８日間毎日２グラムを静脈内投与し、更に、抗ＨＢｓ血清レベルを１００ＩＵ／ｍＬ超で維持するために１ヶ月間～３ヶ月間毎に注入する。これも、生涯に亘る治療を必要とする。

【0007】

デルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）の同時感染（ｃｏｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）又は重複感染が生じたときに、更により重篤な合併症が観察される。ＷＨＯによれば、Ｄ型肝炎は世界中で約１，５００万人が感染している。ＨＤＶは、ＨＢＶの存在下でのみ増殖することができるので、サブウイルスサテライトであると考えられる。ＨＤＶは、最小の動物ウイルス（４０ｎｍ）の１つであるので、そのゲノムは僅か１．６ｋｂであり、Ｓ及びＬ ＨＤＡｇをコードしている。ＲＮＡポリメラーゼを含むＨＤＶのゲノム複製に必要な全ての他のタンパク質は、宿主細胞によって提供され、ＨＤＶエンベロープは、ＨＢＶによって提供される。言い換えれば、ＨＤＶは、自身のビリオンコートとしてＢ型肝炎エンベロープタンパク質（ＨＢｓＡｇ）を利用するので、その複製にＨＢＶとの同時感染を必要とする欠陥ウイルスである。許容細胞に導入されたとき、ＨＤＶ ＲＮＡゲノムが複製され、複数コピーのＨＤＶコードタンパク質と会合して、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を構築する。ＲＮＰは、分泌される前にプレゴルジコンパートメントの内腔に出芽するリポタンパク質ベシクルを構築することができる、ＨＢＶエンベロープタンパク質によって細胞から排出される。更に、ＨＢＶエンベロープタンパク質は、ＨＤＶのターゲティングの機構を未感染細胞に提供して、ＨＤＶの拡散を確保する。

【0008】

ＨＤＶによって引き起こされる合併症は、急性感染症における肝不全及び肝硬変への急速な進行を経験する可能性の増大を含み、慢性感染症において肝癌を発現する可能性も増大する。Ｂ型肝炎ウイルスと共同して、Ｄ型肝炎は、全ての肝炎感染症の中でも最も高い死亡率（２０％）を有する（非特許文献６）。慢性ＨＤＶ感染症について唯一承認されている治療法は、インターフェロン－アルファである。しかし、インターフェロン－アルファによるＨＤＶの治療は、比較的非効率であり、耐容性も高くない。インターフェロン－アルファにより治療すると、患者の４分の１において治療後６ヶ月間持続的ウイルス陰性化が生じる。また、ヌクレオシ（チ）ドアナログ（ＮＡ）は、デルタ型肝炎において広く試験されているが、効果がないと考えられる。ＮＡとインターフェロン－アルファとの併用治療も期待外れであることが証明されているので、新規の治療選択肢が必要とされている（非特許文献７）。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｃｈｉｓａｒｉ ＦＶ，Ｉｓｏｇａｗａ Ｍ，Ｗｉｅｌａｎｄ ＳＦ，Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｅ，２０１０；５８：２５８－６６

【非特許文献2】Ｌｉａｎｇ ＴＪ，Ｂｌｏｃｋ ＴＭ，ＭｃＭａｈｏｎ ＢＪ，Ｇｈａｎｙ ＭＧ，Ｕｒｂａｎ Ｓ，Ｇｕｏ ＪＴ，Ｌｏｃａｒｎｉｎｉ Ｓ，Ｚｏｕｌｉｍ Ｆ，Ｃｈａｎｇ ＫＭ，Ｌｏｋ ＡＳ．Ｐｒｅｓｅｎｔ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ：Ｆｒｏｍ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｔｏ ｃｕｒｅ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２０１５ Ａｕｇ ３．ｄｏｉ：１０．１００２／ｈｅｐ．２８０２５．［印刷物に先駆けたオンライン出版］

【非特許文献3】Ｔｉｍｏｔｈｙ Ｍ．Ｂｌｏｃｋ，Ｒｏｂｅｒｔ Ｇｉｓｈ，Ｈａｉｔａｏ Ｇｕｏ，Ａｎａｎｄ Ｍｅｈｔａ，Ａｎｄｒｅａ Ｃｕｃｏｎａｔｉ，Ｗ．Ｔｈｏｍａｓ Ｌｏｎｄｏｎ，Ｊｕ－Ｔａｏ Ｇｕｏ Ｃｈｒｏｎｉｃ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ：Ｗｈａｔ ｓｈｏｕｌｄ ｂｅ ｔｈｅ ｇｏａｌ ｆｏｒ ｎｅｗ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ？ Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ９８（２０１３）２７－３４

【非特許文献4】Ｇｉｓｈ Ｒ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２１：４７－５８

【非特許文献5】Ｔａｋａｋｉ Ａ，Ｙａｓｕｎａｋａ Ｔ，Ｙａｇｉ Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｔｏ ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ．Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．２０１５ Ｊｕｌ ３０；１６（８）：１７４９４－５１３

【非特許文献6】Ｆａｔｔｏｖｉｃｈ Ｇ，Ｇｉｕｓｔｉｎａ Ｇ，Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ Ｅ，Ｐａｎｔａｌｅｎａ Ｍ，Ｚａｇｎｉ Ｉ，Ｒｅａｌｄｉ Ｇ，Ｓｃｈａｌｍ ＳＷ．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｄｅｌｔａ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｎ ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ ａｎｄ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｉｎ ｃｏｍｐｅｎｓａｔｅｄ ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ ｔｙｐｅ Ｂ．Ｇｕｔ．２０００ Ｍａｒ；４６（３）：４２０－６

【非特許文献7】Ｚａｉｇｈａｍ Ａｂｂａｓ，Ｍｉｎａａｍ Ａｂｂａｓ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ ｄｅｌｔａ：Ｎｅｅｄ ｆｏｒ ｎｏｖｅｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｏｐｔｉｏｎｓ．Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ ２０１５ Ａｕｇｕｓｔ ２８；２１（３２）：９４６１－９４６５

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0010】

上記に鑑みて、本発明の目的は、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）及びデルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）の両方を中和することができる抗体ベースの製品を提供することにある。これによって、Ｂ型肝炎の予防及び治療を改善することができる。更に、現在Ｄ型肝炎に利用可能な治療法は存在しないので、Ｄ型肝炎を予防及び治療するための抗体ベースの製品を提供することも本発明の目的である。更に、本発明の目的は、より優れた慢性Ｂ型肝炎治療を可能にする抗体ベースの製品を提供することにある。この目的のために、（ｉ）ＨＢＶを強力に中和し、（ｉｉ）ＨＢｓＡｇ及びＨＢＶのクリアランスを促進し、（ｉｉｉ）セロコンバージョン、即ち、ウイルスに対する免疫応答を誘導することによって、単一の抗体ベースの製品が様々な方法で作用する場合が有利である。更に、抗体は、有利なことに、改善された抗原提示を促進し、それによって、抗ＨＢＶ Ｔ細胞応答の回復を促進することもできる。更に、本発明の目的は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の様々な（好ましくは全ての公知の）遺伝子型及びＢ型肝炎ウイルス表面抗原の様々な（好ましくは全ての公知の）感染性突然変異体に結合する抗体又はその抗原結合断片を提供することにある。要約すると、本発明の目的は、関連技術の上記問題点を克服する、改善された抗体又はその抗原結合断片に加えて、関連する核酸分子、ベクター、及び細胞、並びに医薬組成物を提供することにある。

【課題を解決するための手段】

【0011】

本発明の根底にある目的は、以下及び特許請求の範囲に記載される発明主題によって解決される。

【発明を実施するための形態】

【0012】

以下に、本発明の要素について説明する。これら要素は、具体的な実施形態と共に列挙されるが、これらを任意の方式で任意の数組み合わせて更なる実施形態を生み出すことができることを理解すべきである。この記載は、明示的に記載された実施形態を任意の数の開示された及び／又は好ましい要素と組み合わせる実施形態をサポート及び包含すると理解すべきである。更に、特に指定しない限り、本願における全ての記載された要素の任意の入れ換え及び組合せが本願の記載によって開示されるとみなすべきである。

【0013】

特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

【0014】

本明細書及びその後に続く特許請求の範囲全体を通して、特に必要としない限り、用語「含む」並びに「含み」及び「含んでいる」等の変形は、指定されている部材、整数、又は工程を含むが、任意の他の指定されていない部材、整数、又は工程を除外するものではないことを意味すると理解される。用語「からなる」は、任意の他の指定されていない部材、整数、又は工程が除外される、用語「含む」の具体的な実施形態である。本発明において、用語「含む」は、用語「からなる」を包含する。したがって、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えば、Ｘを「含む」組成物は、Ｘのみからなっていてもよく、追加の何かを含んでいてもよい（例えば、Ｘ＋Ｙ）。

【0015】

用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」、並びに本発明の説明（特に、特許請求の範囲）において使用される同様の参照は、本明細書に指定されているか又は文脈上明示的に否定されていない限り、単数及び複数の両方を網羅すると解釈すべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、単に、範囲内の各別個の値を個別に参照する簡易的な方法として機能することを意図する。本明細書において特に指定しない限り、各個別の値は、本明細書に個々に列挙されているかのように明細書に組み込まれる。明細書中のいずれの言語も、本発明の実施に必須の任意の請求されていない要素を示すと解釈されるべきではない。

【0016】

用語「実質的に」は、「完全に」を除外するものではなく、例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含んでいなくてもよい。必要な場合、用語「実質的に」は、本発明の定義から省略されることもある。

【0017】

数値ｘに関連する用語「約」は、ｘ±１０％を意味する。

【0018】

用語「疾患」は、本明細書で使用するとき、ヒト若しくは動物の身体又は正常な機能が損なわれているその部分のうちの１つの異常な状態を全て反映し、典型的には、識別可能な徴候及び症状によって顕在化し、且つヒト又は動物の寿命又は生活の質を低減するという点で、用語「疾病」及び（健康状態のような）「状態」と略同義であることを意図し、互換的に使用される。

【0019】

本明細書で使用するとき、被験体又は患者の「治療」に対する言及は、防止、予防、軽減、寛解、及び療法を含むことを意図する。用語「被験体」又は「患者」は、本明細書では互換的に使用されて、ヒトを含む全ての哺乳類を意味する。被験体の例としては、ヒト、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、及びウサギが挙げられる。一実施形態では、患者はヒトである。

【0020】

本明細書で使用するとき、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」、並びにこれら用語の変形は、通常のペプチド結合によって、又は例えば等配電子ペプチドの場合等、修飾ペプチド結合によって互いに結合している少なくとも２つのアミノ酸を含む分子、特に、それぞれペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、又は融合タンパク質を含むタンパク質を指す。例えば、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質は、好ましくは、通常のペプチド結合によって互いに結合している、遺伝子コードによって定義される２０種のアミノ酸から選択されるアミノ酸で構成される（「古典的」ポリペプチド）。ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質は、Ｌアミノ酸及び／又はＤアミノ酸で構成され得る。具体的には、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、「タンパク質」は、非ペプチド性構造要素を含有するペプチドアナログとして定義される「ペプチド模倣体」も含み、このペプチドは、天然親ペプチドの生物学的作用を模倣するか又は拮抗することができる。ペプチド模倣体は、酵素的に切断しやすいペプチド結合等、古典的なペプチドの特徴を有しない。具体的には、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質は、遺伝子コードによって定義される２０種のアミノ酸に加えてこれらアミノ酸以外のアミノ酸を含んでいてもよく、遺伝子コードによって定義されている２０種のアミノ酸以外のアミノ酸で構成されていてもよい。具体的には、本発明におけるペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質は、等しく、当業者に周知の翻訳後成熟プロセス等の天然プロセス又は化学的プロセスによって修飾されたアミノ酸で構成され得る。かかる修飾は、文献に十分詳述されている。これら修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸鎖、又は更にはカルボキシ末端若しくはアミノ末端等、ポリペプチドの何処に存在していてもよい。具体的には、ペプチド又はポリペプチドは、ユビキチン化後に分岐してもよく、分枝を有するか又は有しない環状であってもよい。この種の修飾は、当業者に周知の天然又は合成翻訳後プロセスの結果であり得る。本発明における用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、「タンパク質」は、具体的には、修飾ペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質も含む。例えば、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の修飾は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰリボシル化、アミド化、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体の共有結合性固定、脂質又は脂質誘導体の共有結合性固定、ホスファチジルイノシトールの共有結合性固定、共有結合性又は非共有結合性の架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル化、ペグ化を含むグリコシル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解プロセス、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セネロイル化、硫酸化、アルギニン化等のアミノ酸付加、又はユビキチン化を挙げることができる。かかる修飾は、文献に十分詳述されている（Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（１９９３）２ｎｄ Ｅｄ．，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８３）Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｓｅｉｆｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｎｏｎｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｆａｃｔｏｒｓ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６－６４６ ａｎｄ Ｒａｔｔａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ａｇｉｎｇ，Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ，６６３：４８－６２）。したがって、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、「タンパク質」は、好ましくは、例えば、リポペプチド、リポタンパク質、糖ペプチド、糖タンパク質等を含む。

【0021】

本明細書で使用するとき、「（ポリ）ペプチド」は、上に説明した通りペプチド結合によって結合されているアミノ酸モノマーの１本の鎖を含む。「タンパク質」は、本明細書で使用するとき、１以上、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、又は１０個の（ポリ）ペプチド、即ち、上に説明した通りペプチドによって結合されているアミノ酸モノマーの１本以上の鎖を含む。好ましくは、本発明に係るタンパク質は、１個、２個、３個、又は４個のポリペプチドを含む。

【0022】

用語「組み換え」とは、本明細書で使用するとき（例えば、組み換え抗体、組み換えタンパク質、組み換え核酸等）、組み換え手段によって調製、発現、作製、又は単離され、且つ自然界には存在しない任意の分子（抗体、タンパク質、核酸等）を指す。

【0023】

本明細書で使用するとき、用語「核酸」、「核酸分子」、及び「ポリヌクレオチド」は、互換的に使用され、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を含むことを意図する。核酸分子は、一本鎖であっても二本鎖であってもよいが、好ましくは、二本鎖ＤＮＡである。

【0024】

本明細書で使用するとき、用語「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養物」は、互換的に使用され、全てのかかる表記は後代を含む。したがって、「形質転換体」及び「形質転換細胞」という用語は、初代対象細胞及び転換数に関係なくそれに由来する培養物を含む。また、全ての後代は、故意の又は故意ではない突然変異に起因して、ＤＮＡ含量が正確に同一ではなくてもよいことが理解される。元々の形質転換細胞においてスクリーニングされたのと同じ機能又は生物活性を有する変異体後代が含まれる。異なる表記が意図される場合、文脈から明らかになるであろう。

【0025】

本明細書で使用するとき、用語「抗原結合断片」、「断片」、及び「抗体断片」は、抗体の抗原結合活性を保持している本発明の抗体の任意の断片を指すために互換的に使用される。抗体断片の例としては、単鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｖ、又はｓｃＦｖが挙げられるが、これらに限定されない。更に、用語「抗体」は、本明細書で使用するとき、抗体及びその抗原結合断片の両方を含む。

【0026】

本明細書で使用するとき、「中和抗体」は、宿主において感染を開始及び／又永続化させる病原体の能力を中和する、即ち、予防、阻害、低減、妨害、又は干渉することができるものである。用語「中和抗体」及び「中和する抗体」は、本明細書では互換的に使用される。これら抗体は、単独で使用してもよく、適切な製剤化に際して予防剤又は治療剤として、能動的ワクチン接種に関連して、診断ツールとして、又は本明細書に記載される生産ツールとして組み合わせて使用してもよい。

【0027】

用量は、多くの場合、体重に関連して表される。したがって、［ｇ、ｍｇ、又は他の単位］／ｋｇ（又はｇ、ｍｇ等）として表される用量は、たとえ用語「体重」が明示的に言及されていないとしても、通常「体重１ｋｇ（又はｇ、ｍｇ等）当たりの」［ｇ、ｍｇ、又は他の単位］を指す。

【0028】

用語「結合」及び「特異的結合」並びに類似の参照は、非特異的固着を包含しない。

【0029】

用語「ワクチン」とは、本明細書で使用するとき、典型的には、少なくとも１つの抗原、好ましくは免疫原を提供する予防又は治療的物質であると理解される。抗原又は免疫原は、ワクチン接種に好適な任意の物質に由来し得る。例えば、抗原又は免疫原は、細菌若しくはウイルス粒子等の病原体、又は腫瘍若しくは癌性組織に由来し得る。抗原又は免疫原は、身体の適応免疫系を刺激して適応免疫応答を提供する。具体的には、「抗原」又は「免疫原」は、典型的には、免疫系、好ましくは適応免疫系によって認識され得、且つ例えば、適応免疫応答の一部として抗体及び／又は抗原特異的Ｔ細胞を形成することによって、抗原特異的免疫応答を誘発することができる物質を指す。典型的には、抗原は、ＭＨＣ又はＴ細胞によって提示され得るペプチド又はタンパク質であってもよく、これらを含んでいてもよい。

【0030】

本明細書で使用するとき、用語「配列変異体」は、レファレンス配列と比較して１以上の変化を有する任意の配列を指し、レファレンス配列は、「配列の表及び配列番号」（配列表）に列挙されている配列、即ち、配列番号１～配列番号８８のいずれかである。したがって、用語「配列変異体」は、ヌクレオチド配列変異体及びアミノ酸配列変異体を含む。ヌクレオチド配列における配列変異体については、レファレンス配列もヌクレオチド配列であり、一方、アミノ酸配列における配列変異体については、レファレンス配列もアミノ酸配列である。「配列変異体」は、本明細書で使用するとき、レファレンス配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％又は９９％同一である。配列同一性は、通常、レファレンス配列（即ち、本願に列挙される配列）の完全長に対して計算される。本明細書において言及するとき、同一性パーセントは、例えば、ＮＣＢＩ（ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）によって指定されたデフォルトパラメータ［Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリクス；ギャップオープンペナルティ＝１１、及びギャップエクステンションペナルティ＝１］を用いるＢＬＡＳＴを使用して決定することができる。

【0031】

核酸（ヌクレオチド）配列における「配列変異体」は、レファレンス配列におけるヌクレオチドのうちの１以上が欠失若しくは置換されているか、又は１以上のヌクレオチドがレファレンスヌクレオチド配列の配列に挿入されている、変化した配列を有する。ヌクレオチドは、標準的な一文字表記（Ａ、Ｃ、Ｇ、又はＴ）によって本明細書に言及される。遺伝子コードの縮重に起因して、ヌクレオチド配列の「配列変異体」は、それぞれのレファレンスアミノ酸配列を変化させる、即ち、アミノ酸「配列変異体」を生じさせる場合もあり、そうではない場合もある。アミノ酸配列変異体を生じさせないヌクレオチド配列変異体が好ましい（サイレント突然変異）。しかし、「非サイレント」突然変異につながるヌクレオチド配列変異体も範囲内であり、具体的には、レファレンスアミノ酸配列と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を生じさせる、かかるヌクレオチド配列変異体も範囲内である。

【0032】

アミノ酸配列における「配列変異体」は、レファレンスアミノ酸と比べてアミノ酸のうちの１以上が欠失、置換、又は挿入されている、変化した配列を有する。変化の結果、かかる配列変異体は、レファレンスアミノ酸と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を有する。例えば、レファレンス配列の１００アミノ酸当たり１０以下の変化、即ち、欠失、挿入、又は置換の任意の組合せを有する変異体配列は、レファレンス配列と「少なくとも９０％同一」である。

【0033】

非保存的アミノ酸置換を有することが可能であるが、置換は、置換されたアミノ酸がレファレンス配列における対応するアミノ酸と類似の構造的又は化学的性質を有する保存的アミノ酸置換であることが好ましい。一例として、保存的アミノ酸置換は、ある脂肪族又は疎水性のアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、及びイソロイシン）の別の脂肪族又は疎水性のアミノ酸による置換；あるヒドロキシル含有アミノ酸（例えば、セリン及びトレオニン）の別のヒドロキシル含有アミノ酸による置換；ある酸性残基（例えば、グルタミン酸又はアスパラギン酸）の別の酸性残基による置換；あるアミド含有残基（例えば、アスパラギン及びグルタミン）の別のアミド含有残基による置換；ある芳香族残基（例えば、フェニルアラニン及びチロシン）の別の芳香族残基による置換；ある塩基性残基（例えば、リジン、アルギニン、及びヒスチジン）の別の塩基性残基による置換；並びにある小アミノ酸（例えば、アラニン、セリン、トレオニン、メチオニン、及びグリシン）の別の小アミノ酸による置換を含む。

【0034】

アミノ酸配列の挿入は、１残基から１００以上の残基を含有するポリペプチドに及ぶ長さの範囲のアミノ及び／又はカルボキシル末端融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、アミノ酸配列のＮ又はＣ末端のレポーター分子又は酵素への融合が挙げられる。

【0035】

重要なことに、配列変異体における変化は、それぞれのレファレンス配列の機能、本願の場合、例えば、抗体又はその抗原結合断片の配列が同じエピトープに結合する及び／又はＨＢＶ及びＨＤＶの感染を十分に中和する機能を消失させるものではない。かかる機能を消失させることなしにそれぞれどのヌクレオチド及びアミノ酸残基を置換、挿入、又は欠失させることができるかを決定するための指針は、当技術分野において周知のコンピュータプログラムを使用することによって見出すことができる。

【0036】

本明細書で使用するとき、指定の核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に「由来する」核酸配列又はアミノ酸配列は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の起源を指す。好ましくは、特定の配列に由来する核酸配列又はアミノ酸配列は、これらが由来する配列又はその一部と本質的に同一のアミノ酸配列を有し、「本質的に同一」とは、上に定義した配列変異体を含む。好ましくは、特定のペプチド又はタンパク質に由来する核酸配列又はアミノ酸配列は、特定のペプチド又はタンパク質における対応するドメインに由来する。それに関して、「対応する」とは、特に、同じ機能に言及する。例えば、「細胞外ドメイン」は、（別のタンパク質の）別の「細胞外ドメイン」に対応する、又は「膜貫通ドメイン」は、（別のタンパク質の）別の「膜貫通ドメイン」に対応する。したがって、ペプチド、タンパク質、及び核酸の「対応する」部分は、当業者によって容易に同定可能である。同様に、他の配列に「由来する」配列は、通常、前記配列中にその起源を有することが当業者によって容易に同定可能である。

【0037】

好ましくは、別の核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に由来する核酸配列又はアミノ酸配列は、（それが由来する）出発核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質と同一であり得る。しかし、別の核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に由来する核酸配列又はアミノ酸配列は、（それが由来する）出発核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に対して１以上の突然変異を有していてもよく、具体的には、別の核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に由来する核酸配列又はアミノ酸配列は、（それが由来する）出発核酸、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質の上記機能性配列変異体であってよい。例えば、ペプチド／タンパク質において、１以上のアミノ酸残基を他のアミノ酸残基で置換してもよく、１以上のアミノ酸残基の挿入又は欠失が生じていてもよい。

【0038】

本明細書で使用するとき、用語「突然変異」は、レファレンス配列、例えば、対応するゲノム配列と比較した、核酸配列及び／又はアミノ酸配列の変化に関する。例えばゲノム配列と比較した突然変異は、（自然界に存在する）体細胞突然変異、自然突然変異、例えば、酵素、化学物質、若しくは放射線によって誘導される誘導突然変異、又は部位特異的突然変異誘発（核酸配列及び／又はアミノ酸配列を特異的且つ故意に変化させるための分子生物学的方法）によって得られる突然変異であってよい。したがって、用語「突然変異」又は「突然変異する」とは、例えば、核酸配列及び／又はアミノ酸配列において突然変異を物理的に作製することも含むと理解されるものとする。突然変異は、１以上のヌクレオチド又はアミノ酸の置換、欠失、及び挿入に加えて、幾つかの連続するヌクレオチド又はアミノ酸の逆位も含む。アミノ酸配列に突然変異を生じさせるために、好ましくは、（組み換え）突然変異型ポリペプチドを発現させるために、前記アミノ酸配列をコードしているヌクレオチド配列に突然変異を導入してよい。突然変異は、例えば、あるアミノ酸をコードしている核酸分子のコドンを、例えば部位特異的突然変異誘発によって、変化させて異なるアミノ酸をコードしているコドンを生じさせることにより、又は核酸分子の１以上のヌクレオチドを突然変異させる必要無しに、ポリペプチドをコードしている核酸分子のヌクレオチド配列を理解し、ポリペプチドの変異体をコードしているヌクレオチド配列を含む核酸分子の合成を設計することによって、配列変異体を合成することにより行ってよい。

【0039】

本発明は、数ある知見の中でも、Ｂ型肝炎ウイルス及びデルタ型肝炎ウイルスの中和において非常に強力な抗体、及び本発明の抗体が結合するエピトープの発見及び単離に基づいている。かかる抗体は、Ｂ型肝炎ウイルスを中和するためにほんの少量の抗体しか必要としないので、望ましい。更に、現在Ｄ型肝炎に利用可能な治療法は存在しない。本発明に係る抗体は、ＨＢＶ及びＨＤＶの予防及び治療又は軽減において非常に有効である。更に、本発明に係る抗体は、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の様々な（好ましくは全ての公知の）遺伝子型及びＢ型肝炎ウイルス表面抗原の様々な（好ましくは全ての公知の）感染性突然変異体に結合する。

【0040】

抗体及びその抗原結合断片
本発明の第１の態様では、ＨＢｓＡｇの抗原性ループ領域に結合し、Ｂ型肝炎ウイルス及びデルタ型肝炎ウイルスの感染を中和する単離抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0041】

本明細書で使用するとき、用語「抗体」は、本発明に係る特徴的な性質が保持されている限り、抗体全体、抗体断片、具体的には、抗原結合断片、ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、組み換え抗体、及び遺伝子操作された抗体（変異体又は突然変異抗体）を含むがこれらに限定されない様々な形態の抗体を包含する。ヒト抗体及びモノクローナル抗体が好ましく、ヒトモノクローナル抗体、具体的には、組み換えヒトモノクローナル抗体が特に好ましい。

【0042】

ヒト抗体は、当技術分野において周知である（ｖａｎ Ｄｉｊｋ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｊ．Ｇ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５（２００１）３６８－３７４）。ヒト抗体は、免疫時に、内因性免疫グロブリンが産生されていなくてもヒト抗体の完全レパートリー又はセレクションを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）においても産生され得る。かかる生殖系列突然変異体マウスにヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイを移植すると、抗原チャレンジ時にヒト抗体が産生される（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０（１９９３）２５５１－２５５５；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６２（１９９３）２５５－２５８；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｙｅａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．７（１９９３）３３４０を参照）。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリでも産生され得る（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．，ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｇ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７（１９９２）３８１－３８８；Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２（１９９１）５８１－５９７）。Ｃｏｌｅ等及びＢｏｅｒｎｅｒ等の技術も、ヒトモノクローナル抗体を調製するために利用可能である（Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）；及びＢｏｅｒｎｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１９９１）８６－９５）。好ましくは、ヒトモノクローナル抗体は、Ｔｒａｇｇｉａｉ Ｅ，Ｂｅｃｋｅｒ Ｓ，Ｓｕｂｂａｒａｏ Ｋ，Ｋｏｌｅｓｎｉｋｏｖａ Ｌ，Ｕｅｍａｔｓｕ Ｙ，Ｇｉｓｍｏｎｄｏ ＭＲ，Ｍｕｒｐｈｙ ＢＲ，Ｒａｐｐｕｏｌｉ Ｒ，Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ Ａ．（２００４）：Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｍａｋｅ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｒｏｍ ｍｅｍｏｒｙ Ｂ ｃｅｌｌｓ：ｐｏｔｅｎｔ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＡＲＳ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．１０（８）：８７１－５に記載の通り、改善されたＥＢＶ－Ｂ細胞の不死化を使用することによって調製される。用語「ヒト抗体」は、本明細書で使用するとき、本明細書に記載されている本発明に係る性質を生じさせるために、例えば可変領域が改変されたかかる抗体も含む。本明細書で使用するとき、用語「可変領域」（軽鎖（Ｖ_Ｌ）の可変領域、重鎖（Ｖ_Ｈ）の可変領域）は、抗体の抗原に対する結合に直接関与する軽鎖及び重鎖の各対を意味する。

【0043】

本発明の抗体は、任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、即ち、α、γ、又はμ重鎖）であってよいが、好ましくは、ＩｇＧである。ＩｇＧアイソタイプの中でも、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４のサブクラスであってよく、ＩｇＧ１が好ましい。本発明の抗体は、κ又はλ軽鎖を有していてよい。ＩｇＧ型のＨＢｓＡｇ特異的抗体は、有利なことに、ＦｃＲＮ－ＩｇＧ受容体を介したＩｇＧの肝細胞への抗原非依存性取り込みに基づいて、感染細胞からＨＢＶ及びＨＢｓＡｇが放出されるのをブロックすることもできる。したがって、ＩｇＧ型のＨＢｓＡｇ特異的抗体は、細胞内で結合することができ、それによって、ＨＢＶビリオン及びＨＢｓＡＧの放出をブロックする。

【0044】

好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、精製抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、又はｓｃＦｖである。

【0045】

したがって、本発明の抗体は、好ましくは、ヒト抗体、モノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体、組み換え抗体、又は精製抗体であってよい。また、本発明は、本発明の抗体の断片、特に、前記抗体の抗原結合活性を保持している断片を提供する。かかる断片としては、単鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、又はｓｃＦｖを含むが、これらに限定されない。特許請求の範囲を含む明細書は、一部の箇所では、抗体の抗原結合断片、抗体断片、変異体、及び／又は誘導体に明示的に言及するが、用語「抗体」又は「本発明の抗体」は、抗体の全てのカテゴリー、即ち、抗体の抗原結合断片、抗体断片、変異体、及び誘導体を含むことが理解される。

【0046】

本発明の抗体の断片は、酵素、例えばペプシン若しくはパパインによる切断を含む方法によって、及び／又は化学還元によりジスルフィド結合を切断することによって前記抗体から得ることができる。或いは、抗体の断片は、重鎖又は軽鎖の配列の一部のクローニング及び発現によって得ることができる。抗体「断片」は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片を含む。また、本発明は、本発明の抗体の重鎖及び軽鎖に由来する単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）を包含する。例えば、本発明は、本発明の抗体由来のＣＤＲを含むｓｃＦｖを含む。また、重鎖又は軽鎖の単量体及び二量体、単一ドメイン重鎖抗体、単一ドメイン軽鎖抗体に加えて、単鎖抗体、例えば、重鎖及び軽鎖の可変ドメインがペプチドリンカーによって結合している単鎖Ｆｖも含まれる。

【0047】

本発明の抗体断片は、一価又は多価相互作用を付与し得、上記様々な構造に含有され得る。例えば、ｓｃＦｖ分子を合成して、三価「トリアボディ」又は四価「テトラボディ」を作製することができる。ｓｃＦｖ分子は、Ｆｃ領域のドメインを含んでいてよく、その結果、二価ミニボディが生じる。更に、本発明の配列は、本発明の配列が本発明のエピトープを標的とし、分子の他の領域が他の標的に結合する多重特異的分子の成分であってよい。例示的な分子としては、二重特異的Ｆａｂ２、三重特異的Ｆａｂ３、二重特異的ｓｃＦｖ、及びダイアボディが挙げられるが、これらに限定されない（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１１２６－１１３６）。

【0048】

本発明に係る抗体は、精製形態で提供されてもよい。典型的には、抗体は、他のポリペプチドを実質的に含まない組成物、例えば、前記組成物の９０（重量）％未満、通常６０％未満、より通常は５０％未満が他のポリペプチドで構成される組成物中に存在する。

【0049】

本発明に係る抗体は、ヒト及び／又は非ヒト（又は異種）宿主、例えば、マウスにおいて免疫原性であり得る。例えば、前記抗体は、非ヒト宿主では免疫原性であるが、ヒト宿主では免疫原性でないイディオトープを有し得る。ヒトで使用するための本発明の抗体は、マウス、ヤギ、ウサギ、ラット、非霊長類哺乳類等の宿主から容易には単離することができず、且つ一般的にヒト化によって又はゼノマウスから入手することができないものを含む。

【0050】

本発明に係る抗体及びその抗原結合断片は、ＨＢｓＡｇの抗原性ループ領域に結合する。Ｂ型肝炎ウイルスのエンベロープは、３つの「ＨＢＶ」エンベロープタンパク質」（「ＨＢｓＡｇ」、「Ｂ型肝炎表面抗原」としても知られている）：Ｓタンパク質（「小さい」場合、Ｓ－ＨＢｓＡｇとも称される）、Ｍタンパク質（「中程度」の場合、Ｍ－ＨＢｓＡｇとも称される）、及びＬタンパク質（「大きい」場合、Ｌ－ＨＢｓＡｇとも称される）を含有する。Ｓ－ＨＢｓＡｇ、Ｍ－ＨＢｓＡｇ、及びＬ－ＨＢｓＡｇは、同じＣ末端（「Ｓドメイン」とも称される、２２６アミノ酸）を共有しており、これは、Ｓタンパク質（Ｓ－ＨＢｓＡｇ）に対応し、ウイルスの構築及び感染力にとって重要である。Ｓ－ＨＢｓＡｇ、Ｍ－ＨＢｓＡｇ、及びＬ－ＨＢｓＡｇは、小胞体（ＥＲ）で合成され、構築され、ゴルジ装置を通って粒子として分泌される。Ｓドメインは、４つの予測膜貫通（ＴＭ）ドメインを含み、それによって、ＳドメインのＮ末端及びＣ末端の両方が内腔に露出される。膜貫通ドメインＴＭ１及びＴＭ２は、いずれも、同時翻訳されるタンパク質をＥＲ膜に組み込むのに必要であり、膜貫通ドメインＴＭ３及びＴＭ４は、ＳドメインのＣ末端側の３分の１に位置する。ＨＢｓＡｇの「抗原性ループ領域」は、ＨＢｓＡｇのＳドメインの予測ＴＭ３及びＴＭ４膜貫通ドメイン間に位置し、前記抗原性ループ領域は、合計２２６アミノ酸を含有するＳドメインのアミノ酸１０１～１７２を含む（Ｓａｌｉｓｓｅ Ｊ．ａｎｄ Ｓｕｒｅａｕ Ｃ．，２００９，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８３：９３２１－９３２８）。感染力の決定因子がＨＢＶエンベロープタンパク質の抗原性ループ領域に存在することに留意することが重要である。具体的には、ＨＢｓＡｇの１１９～１２５の残基は、ＣＸＸＣモチーフを含有しており、これは、ＨＢＶ及びＨＤＶの感染力に必要な最も重要な配列であることが証明されている（Ｊａｏｕｄｅ ＧＡ，Ｓｕｒｅａｕ Ｃ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００５；７９：１０４６０－６）。

【0051】

本明細書においてＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸配列における位置に言及するとき、配列番号３（以下に示す）に記載のアミノ酸配列又はその天然若しくは人工の配列変異体に言及する。

【表1】

【0052】

例えば、「Ｓドメインのアミノ酸１０１～１７２」という表現は、配列番号３に係るポリペプチドの１０１位～１７２位のアミノ酸残基を指す。しかし、当業者は、突然変異又は変異（置換、欠失、及び／又は付加を含むが、これらに限定されない、例えば、異なる遺伝子型のＨＢｓＡ又は本明細書に記載される異なるＨＢｓＡｇ突然変異体）が、ＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸配列に天然に生じる場合もあり、その生物学的性質に影響を与えることなしにＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸配列に人工的に導入される場合もあることを理解する。したがって、本発明では、用語「ＨＢｓＡｇのＳドメイン」は、例えば、配列番号３に係るポリペプチド及びその天然又は人工の突然変異体を含む、全てのかかるポリペプチドを含むことを意図する。更に、ＨＢｓＡｇのＳドメインの配列断片が本明細書に記載されるとき（例えば、ＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸１０１～１７２又はアミノ酸１２０～１３０）、配列番号３の対応する配列断片だけでなく、その天然又は人工の突然変異体の対応する配列断片も含む。例えば、「ＨＢｓＡｇのＳドメインの１０１位～１７２位のアミノ酸残基」という表現は、配列番号３の１０１位～１７２位のアミノ酸残基及びその突然変異体（天然又は人工の突然変異体）の対応する断片を含む。本発明によれば、「対応する配列断片」又は「対応する断片」という表現は、配列を最適化アラインメントに付したとき、即ち、最も高い同一性率が得られるように配列のアラインメントをとったとき、配列の同じ位置に配置される断片を指す。

【0053】

Ｍタンパク質（Ｍ－ＨＢｓＡｇ）は、「ｐｒｅ－Ｓ２」と呼ばれる５５アミノ酸のＮ末端ドメインによって伸長されたＳタンパク質に対応する。Ｌタンパク質（Ｌ－ＨＢｓＡｇ）は、「ｐｒｅ－Ｓ１」と呼ばれる１０８アミノ酸のＮ末端ドメインによって伸長されたＭタンパク質に対応する（遺伝子型Ｄ）。Ｌタンパク質のｐｒｅ－Ｓ１及びｐｒｅ－Ｓ２ドメインは、ウイルス粒子の内面（ＥＲの細胞質側）（ウイルス構築において重要な役割を果たす）又は外面（ＥＲの内腔側）（標的細胞との相互作用に利用可能であり且つウイルスの感染力に必須である）のいずれに存在していてもよい。更に、ＨＢＶ表面タンパク質（ＨＢｓＡｇ）は、ビリオンエンベロープに組み込まれるだけでなく、ＥＲ－ゴルジ中間コンパートメント膜から自発的に出芽して、分泌によって細胞から放出される空の「サブウイルス粒子」（ＳＶＰ）を形成する。

【0054】

３つのＨＢＶエンベロープタンパク質Ｓ－ＨＢｓＡｇ、Ｍ－ＨＢｓＡｇ、及びＬ－ＨＢｓＡｇは全てＳドメインを含むので、３つのＨＢＶエンベロープタンパク質Ｓ－ＨＢｓＡｇ、Ｍ－ＨＢｓＡｇ、及びＬ－ＨＢｓＡｇは全て「抗原性ループ領域」も含む。したがって、ＨＢＶを中和し、ＨＢｓＡｇの抗原性ループ領域に結合する本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、３つのＨＢＶエンベロープタンパク質Ｓ－ＨＢｓＡｇ、Ｍ－ＨＢｓＡｇ、及びＬ－ＨＢｓＡｇ全てに結合する。

【0055】

更に、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、Ｂ型肝炎ウイルス及びデルタ型肝炎ウイルスによる感染を中和する。言い換えれば、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、Ｂ型肝炎ウイルス及びデルタ型肝炎ウイルスのウイルス感染力を低下させる。

【0056】

検査室でウイルス感染力（又は「中和」）を試験及び定量するために、当業者は、様々な標準的な「中和アッセイ」について理解している。中和アッセイでは、典型的には、動物ウイルスを細胞及び／又は細胞株において増殖させる。本発明においては、試験される抗体の存在（又は非存在）下で一定量のＨＢＶ又はＨＤＶと共に培養細胞をインキュベートする中和アッセイが好ましい。読み出し情報として、細胞培養上清に分泌されるＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）又はＢ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）のレベルを使用し得る及び／又はＨＢｃＡｇ染色をアッセイし得る。ＨＤＶについては、例えば、デルタ抗原免疫蛍光染色をアッセイしてよい。

【0057】

ＨＢＶ中和アッセイの好ましい実施形態では、培養細胞、例えばＨｅｐａＲＧ細胞、具体的には分化したＨｅｐａＲＧ細胞を、例えば３７℃で１６時間、試験される抗体の存在又は非存在下で一定量のＨＢＶと共にインキュベートする。このインキュベートは、好ましくは、（例えば、４％ ＰＥＧ８０００を添加した）培地中で実施される。インキュベート後、細胞を洗浄し、更に培養してよい。ウイルス感染力を測定するために、例えば、感染後７日目～１１日目に培養上清に分泌されるＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）及びＢ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）のレベルを、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって決定してよい。更に、ＨＢｃＡｇ染色を免疫蛍光アッセイで評価してよい。ＨＤＶ中和アッセイの好ましい実施形態では、（ＨＢＶの代わりに）ＨＤＶキャリア由来の血清を、分化したＨｅｐａＲｇ細胞へのＨＤＶ感染接種材料として用いてよいことを除いてＨＢＶと本質的に同一のアッセイを使用してよい。検出については、デルタ抗原免疫蛍光染色を読み出し情報として使用してよい。

【0058】

本発明の抗体及び抗原結合断片は、高い中和能を有する。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）及びデルタ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）を５０％中和するのに必要な本発明の抗体の濃度は、例えば、約１０μｇ／ｍＬ以下である。好ましくは、ＨＢＶ及びＨＤＶを５０％中和するのに必要な本発明の抗体の濃度は、約５μｇ／ｍＬであり、より好ましくは、ＨＢＶ及びＨＤＶを５０％中和するのに必要な本発明の抗体の濃度は、約１μｇ／ｍＬであり、更により好ましくは、ＨＢＶ及びＨＤＶを５０％中和するのに必要な本発明の抗体の濃度は、約７５０ｎｇ／ｍＬである。最も好ましくは、ＨＢＶ及びＨＤＶを５０％中和するのに必要な本発明の抗体の濃度は、５００ｎｇ／ｍＬ以下、例えば、４５０ｎｇ／ｍＬ以下、４００ｎｇ／ｍＬ以下、３５０ｎｇ／ｍＬ以下、３００ｎｇ／ｍＬ以下、２５０ｎｇ／ｍＬ以下、２００ｎｇ／ｍＬ以下、１７５ｎｇ／ｍＬ以下、１５０ｎｇ／ｍＬ以下、１２５ｎｇ／ｍＬ以下、１００ｎｇ／ｍＬ以下、９０ｎｇ／ｍＬ以下、８０ｎｇ／ｍＬ以下、７０ｎｇ／ｍＬ以下、６０ｎｇ／ｍＬ以下、又は約５０ｎｇ／ｍＬ以下である。これは、ＨＢＶ及びＨＤＶを５０％中和するのに低濃度の抗体しか必要としないことを意味する。特異性及び効力は、当業者に公知の標準的なアッセイを用いて測定することができる。

【0059】

ＨＢＤ及びＨＤＶの両方を強力に中和する本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、Ｂ型肝炎及びＤ型肝炎の予防及び治療において有用である。この状況では、ＨＤＶによる感染は、典型的には、ＨＢＶの感染と同時に又はＨＢＶの感染後に生じ（ＨＤＶは自身の複製のためにＨＢＶの支援を必要とするので、ＨＢＶの非存在下でＨＤＶを接種してもＤ型肝炎を引き起こさない）、Ｄ型肝炎は、典型的には、慢性ＨＢＶキャリアでみられることに留意すべきである。

【0060】

好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、ＨＢｓＡｇ及びＨＢＶのクリアランスを促進する。具体的には、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、ＨＢＶ及びＢ型肝炎ウイルスのサブウイルス粒子（ＳＶＰ）の両方のクリアランスを促進する。ＨＢｓＡｇ又はサブウイルス粒子のクリアランスは、例えばＢ型肝炎患者由来の血液サンプル中のＨＢｓＡｇレベルを測定することによって評価することができる。同様に、ＨＢＶのクリアランスは、例えばＢ型肝炎患者由来の血液サンプル中のＨＢＶレベルを測定することによって評価することができる。

【0061】

ＨＢＶに感染した患者の血清中には、感染粒子（ＨＢＶ）に加えて、典型的には、比較的小さな球形及び可変長のフィラメントの形態のＨＢＶエンベロープタンパク質（ＨＢｓＡｇ）のみで構成される空のサブウイルス粒子（ＳＶＰ）が過剰に（典型的には、１，０００倍～１００，０００倍）存在する。サブウイルス粒子は、ＨＢＶの細胞内ウイルス複製及び遺伝子発現を強く増強することが示されている（Ｂｒｕｎｓ Ｍ．ｅｔ ａｌ．１９９８ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２（２）：１４６２－１４６８）。感染力はウイルスの数だけではなくＳＶＰの数にも依存するので、ＨＢＶを含有する血清の感染力においてもこれは重要である（Ｂｒｕｎｓ Ｍ．ｅｔ ａｌ．１９９８ Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７２（２）：１４６２－１４６８）。更に、過剰のサブウイルス粒子は、中和抗体を吸収することによってデコイとして機能し得るので、感染のクリアランスを遅延させ得る。したがって、典型的には、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を喪失させることは、治療の理想のエンドポイントであり、慢性Ｂ型肝炎（ＣＨＢ）の治癒に最も近い転帰であると考えられる。

【0062】

したがって、好ましくはＨＢｓＡｇのクリアランス、具体的には、Ｂ型肝炎ウイルスのサブウイルス粒子及びＨＢＶのクリアランスを促進する本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、特に慢性Ｂ型肝炎の状況において、Ｂ型肝炎の治療を改善することができる。したがって、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、デコイとして作用するＳＶＰによって吸収される抗体が少ないので、その中和特性を更により強力に発揮させることができる。更に、好ましくはＢ型肝炎ウイルスのサブウイルス粒子のクリアランスを促進する本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、ＨＢＶを含有する血清の感染力を低下させる。

【0063】

好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、Ｆｃ部分を含む。より好ましくは、Ｆｃ部分は、ヒト起源、例えばヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及び／又はＩｇＧ４に由来し、ヒトＩｇＧ１が特に好ましい。

【0064】

本明細書で使用するとき、用語「Ｆｃ部分」とは、パパイン切断部位の直ぐ上流のヒンジ領域（例えば、重鎖定常領域の最初の残基が１１４であるとすると、ネイティブＩｇＧにおける残基２１６）で始まり、免疫グロブリン重鎖のＣ末端で終わる免疫グロブリン重鎖の部分に由来する配列を指す。したがって、Ｆｃ部分は、完全Ｆｃ部分又はその一部（例えば、ドメイン）であってよい。完全Ｆｃ部分は、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、及びＣＨ３ドメイン（例えば、ＥＵアミノ酸位置２１６～４４６）を少なくとも含む。時に、追加のリジン残基（Ｋ）がＦｃ部分のＣ末端に存在するが、多くの場合、成熟抗体から切断される。Ｆｃ部分内のアミノ酸位置には、それぞれ、当技術分野において認識されているＫａｂａｔのＥＵ付番システムに従って番号が振られている。例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９８３ ａｎｄ １９８７を参照。

【0065】

好ましくは、本発明において、Ｆｃ部分は、ヒンジ（例えば、上方、中央、及び／又は下方ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、又はこれらの変異体、一部、若しくは断片のうちの少なくとも１つを含む。好ましい実施形態では、Ｆｃ部分は、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン又はＣＨ３ドメインを少なくとも含む。より好ましくは、Ｆｃ部分は、完全Ｆｃ部分である。また、Ｆｃ部分は、天然Ｆｃ部分に対して１以上のアミノ酸挿入、欠失、又は置換を含んでいてもよい。例えば、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、又はＣＨ３ドメイン（又はこれらの一部）のうちの少なくとも１つが欠失していてもよい。例えば、Ｆｃ部分は、（ｉ）ＣＨ２ドメイン（又はその一部）に融合しているヒンジドメイン（又はその一部）、（ｉｉ）ＣＨ３ドメイン（又はその一部）に融合しているヒンジドメイン（又はその一部）、（ｉｉｉ）ＣＨ３ドメイン（又はその一部）に融合しているＣＨ２ドメイン（又はその一部）、（ｉｖ）ヒンジドメイン（又はその一部）、（ｖ）ＣＨ２ドメイン（又はその一部）、又は（ｖｉ）ＣＨ３ドメイン又はその一部を含んでいてもよく、これらからなっていてもよい。

【0066】

天然Ｆｃ部分によって付与される少なくとも１つの望ましい機能を保持しながら、天然免疫グロブリン分子の完全Ｆｃ部分とアミノ酸配列が異なるようにＦｃ部分を改変し得ることを当業者であれば理解するであろう。かかる機能としては、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）の結合、抗体の半減期の変更、ＡＤＣＣ機能、プロテインＡの結合、プロテインＧの結合、及び補体の結合が挙げられる。天然Ｆｃ部分のどこがかかる機能に関与する及び／又は必須であるかは、当業者に周知である。

【0067】

例えば、補体カスケードを活性化するために、Ｃ１ｑは、抗原性標的に結合している少なくとも２分子のＩｇＧ１又は１分子のＩｇＭに結合する（Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．，ａｎｄ Ｇｈｅｔｉｅ，Ｖ．，Ｔｈｅｒ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２（１９９５）７７－９４）。Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．は、アミノ酸残基３１８～３３７を含む重鎖領域が補体結合に関与していると記載している（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２（１９８５）１６１－２０６）。Ｄｕｎｃａｎ，Ａ．Ｒ．及びＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．（Ｎａｔｕｒｅ ３３２（１９８８）７３８－７４０）は、部位特異的突然変異誘発を使用して、Ｇｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０、及びＬｙｓ３２２がＣ１ｑに対する結合部位を形成すると報告した。Ｃ１ｑの結合におけるＧｌｕ３１８、Ｌｙｓ３２０、及びＬｙｓ３２２残基の役割は、これら残基を含有する短い合成ペプチドが補体媒介性溶解を阻害する能力によって確認された。

【0068】

例えば、ＦｃＲ結合は、造血細胞における特殊な細胞表面受容体であるＦｃ受容体（ＦｃＲ）と（抗体の）Ｆｃ部分との相互作用によって媒介され得る。Ｆｃ受容体は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、抗体でコーティングされた病原体の免疫複合体の食作用による除去と、抗体依存性細胞媒介細胞傷害作用（ＡＤＣＣ；Ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｊ．Ｇ．，ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ｌ．，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．４９（１９９１）５１１－５２４）を介する、対応する抗体でコーティングされた赤血球及び様々な他の細胞標的（例えば、腫瘍細胞）の溶解とを両方媒介することが示されている。ＦｃＲは、免疫グロブリンクラスに対する特異性によって定義される；ＩｇＧ抗体に対するＦｃ受容体はＦｃγＲと称され、ＩｇＥの場合はＦｃεＲと称され、ＩｇＡの場合はＦｃαＲと称され、新生児Ｆｃ受容体はＦｃＲｎと称される。Ｆｃ受容体結合は、例えば、Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．，ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ｊ．Ｐ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９（１９９１）４５７－４９２；Ｃａｐｅｌ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４（１９９４）２５－３４；ｄｅ Ｈａａｓ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６（１９９５）３３０－３４１；及びＧｅｓｓｎｅｒ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．７６（１９９８）２３１－２４８に記載されている。

【0069】

ネイティブＩｇＧ抗体のＦｃドメイン（ＦｃγＲ）による受容体の架橋は、食作用、抗体依存性細胞傷害作用、及び炎症メディエータの放出を含む広範なエフェクタ機能に加えて、免疫複合体のクリアランス及び抗体産生の調節も誘発する。したがって、受容体の架橋を提供するＦｃ部分（ＦｃγＲ）が好ましい。ヒトでは、３つのクラスのＦｃγＲが特徴付けられている。即ち、（ｉ）高い親和性で単量体ＩｇＧに結合し、マクロファージ、単球、好中球、及び好酸球で発現するＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）；（ｉｉ）中～低親和性で複合体化ＩｇＧに結合し、広く、特に白血球で発現し、抗体媒介性免疫において中心的な役割を果たすことが知られており、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＢ、及びＦｃγＲＩＩＣに分類することができ、免疫系において様々な機能を発揮するが、同様の低親和性でＩｇＧ－Ｆｃに結合し、これら受容体のエクトドメインが高度に相同であるＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）；並びに（ｉｉｉ）中～低親和性でＩｇＧに結合し、ＮＫ細胞、マクロファージ、好酸球、及び幾つかの単球、並びにＴ細胞でみられ、ＡＤＣＣを媒介するＦｃγＲＩＩＩＡ及び好中球で高度に発現するＦｃγＲＩＩＩＢの２つのタイプとして存在するＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）である。ＦｃγＲＩＩＡは、殺傷に関与する多くの細胞（例えば、マクロファージ、単球、好中球）でみられ、殺傷プロセスを活性化することができると考えられる。ＦｃγＲＩＩＢは、阻害プロセスにおいて役割を果たすと考えられ、Ｂ細胞、マクロファージ、並びに肥満細胞及び好酸球でみられる。重要なことに、全てのＦｃγＲＩＩＢのうちの７５％が肝臓でみられる（Ｇａｎｅｓａｎ，Ｌ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，２０１２：ＦｃγＲＩＩｂ ｏｎ ｌｉｖｅｒ ｓｉｎｕｓｏｉｄａｌ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ ｃｌｅａｒｓ ｓｍａｌｌ ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １８９：４９８１－４９８８）。ＦｃγＲＩＩＢは、ＬＳＥＣと呼ばれる肝臓洞様血管内皮及び肝臓のクッパー細胞で多量に発現し、ＬＳＥＣは、小免疫複合体のクリアランスの主な部位である（Ｇａｎｅｓａｎ，Ｌ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，２０１２：ＦｃγＲＩＩｂ ｏｎ ｌｉｖｅｒ ｓｉｎｕｓｏｉｄａｌ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ ｃｌｅａｒｓ ｓｍａｌｌ ｉｍｍｕｎｅ ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １８９：４９８１－４９８８）。

【0070】

したがって、本発明では、ＦｃγＲＩＩｂに結合することができるかかる抗体及びその抗原結合断片、例えば、ＦｃγＲＩＩｂに結合するためのＦｃ部分、特にＦｃ領域を含む抗体、例えば、ＩｇＧ型抗体が好ましい。更に、Ｃｈｕ，Ｓ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，２００８：Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｂ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ Ｂ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｃｏｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ＣＤ１９ ａｎｄ ＦｃｇａｍｍａＲＩＩｂ ｗｉｔｈ Ｆｃ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４５，３９２６－３９３３によって記載されている通り、突然変異Ｓ２６７Ｅ及びＬ３２８Ｆを導入することによってＦｃ部分を改変してＦｃγＲＩＩＢの結合を強化することが可能である。それによって、免疫複合体のクリアランスを強化することができる（Ｃｈｕ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，２０１４：Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ Ｃｌｅａｒａｎｃｅ ｏｆ ＩｇＥ Ｉｎ Ｃｈｉｍｐａｎｚｅｅｓ Ｉｓ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｂｙ Ｘｍａｂ７１９５，Ａｎ Ｆｃ－Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｗｉｔｈ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｆｏｒ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ＦｃγＲＩＩｂ．Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ，Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｈｏｒａｃｉｃ Ｓｏｃｉｅｔｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ Ａｂｓｔｒａｃｔｓ）。したがって、本発明では、特にＣｈｕ，Ｓ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，２００８：Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｂ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ Ｂ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｃｏｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ＣＤ１９ ａｎｄ ＦｃｇａｍｍａＲＩＩｂ ｗｉｔｈ Ｆｃ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ４５，３９２６－３９３３に記載されている通り、突然変異Ｓ２６７Ｅ及びＬ３２８Ｆを有する改変されたＦｃ部分を含む係る抗体又はその抗原結合断片が好ましい。

【0071】

Ｂ細胞では、更なる免疫グロブリン産生及び例えばＩｇＥクラスへのアイソタイプスイッチを抑制する機能を有すると考えられる。マクロファージでは、ＦｃγＲＩＩＢは、ＦｃγＲＩＩＡを介して媒介されたとき食作用を阻害する作用を有する。好酸球及び肥満細胞では、ｂ形態は、ＩｇＥのその別個の受容体への結合を通してこれら細胞の活性化を抑制するのに役立ち得る。

【0072】

ＦｃγＲＩ結合に関しては、ネイティブＩｇＧにおけるＥ２３３～Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、及びＰ３２９のうちの少なくとも１つを改変すると、ＦｃγＲＩへの結合が減少する。２３３位～２３６位におけるＩｇＧ２残基をＩｇＧ１及びＩｇＧ４に置換すると、ＦｃγＲＩへの結合が１０^３倍減少し、抗体感作赤血球に対するヒト単球応答が排除された（Ａｒｍｏｕｒ，Ｋ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（１９９９）２６１３－２６２４）。ＦｃγＲＩＩ結合に関しては、例えば、Ｅ２３３～Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｒ２９２、及びＫ４１４のうちの少なくとも１つのＩｇＧ突然変異について、ＦｃγＲＩＩＡの結合減少がみられる。ＦｃγＲＩＩＩ結合に関しては、例えば、Ｅ２３３～Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｓ２３９、Ｅ２６９、Ｅ２９３、Ｙ２９６、Ｖ３０３、Ａ３２７、Ｋ３３８、及びＤ３７６のうちの少なくとも１つの突然変異について、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合減少がみられる。Ｆｃ受容体についてのヒトＩｇＧ１における結合部位のマッピング、上述の突然変異部位、並びにＦｃγＩＲ及びＦｃγＲＩＩＡに対する結合を測定する方法は、Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１）６５９１－６６０４に記載されている。

【0073】

重要なＦｃγＲＩＩに対する結合に関しては、ネイティブＩｇＧ Ｆｃの２つの領域、即ち、（ｉ）ＩｇＧ Ｆｃの下方ヒンジ部位、特に、アミノ酸残基Ｌ、Ｌ、Ｇ、Ｇ（２３４～２３７、ＥＵ付番）、及び（ｉｉ）ＩｇＧ ＦｃのＣＨ２ドメインの隣接領域、特に、下方ヒンジ領域に隣接する上方ＣＨ２ドメイン、例えば、Ｐ３３１の領域におけるループ及び鎖は、ＦｃγＲＩＩ及びＩｇＧの相互作用にとって重要であると考えられる（Ｗｉｎｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００；１６４：５３１３－５３１８）。更に、ＦｃγＲＩは、ＩｇＧ Ｆｃにおける同じ部位に結合すると考えられ、一方、ＦｃＲｎ及びプロテインＡは、ＩｇＧ Ｆｃにおける異なる部位（ＣＨ２－ＣＨ３界面であると考えられる）に結合する（Ｗｉｎｅｓ，Ｂ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００；１６４：５３１３－５３１８）。

【0074】

例えば、Ｆｃ部分は、ＦｃＲｎの結合又は半減期の延長に必要であることが当技術分野において公知であるＦｃ部分の部分を少なくとも含んでいてもよく、又はからなっていてもよい。それに代えて又はそれに加えて、本発明の抗体のＦｃ部分は、プロテインＡの結合に必要であることが当技術分野において公知である部分を少なくとも含む、及び／又は本発明の抗体のＦｃ部分は、プロテインＧの結合に必要であることが当技術分野において公知であるＦｃｃ分子の一部を少なくとも含む。好ましくは、保持される機能は、ＨＢｓＡｇ及びＨＢＶのクリアランスであり、これはＦｃγＲの結合によって媒介されると考えられる。したがって、好ましいＦｃ部分は、ＦｃγＲの結合に必要であることが当技術分野において公知である部分を少なくとも含む。したがって、上に概説した通り、好ましいＦｃ部分は、（ｉ）ネイティブＩｇＧ Ｆｃの下方ヒンジ部位、特に、アミノ酸残基Ｌ、Ｌ、Ｇ、Ｇ（２３４～２３７、ＥＵ付番）、及び（ｉｉ）ネイティブＩｇＧ ＦｃのＣＨ２ドメインの隣接領域、特に、下方ヒンジ領域に隣接する上方ＣＨ２ドメイン、例えばＰ３３１の領域、例えば、ネイティブＩｇＧ Ｆｃのアミノ酸３２０～３４０（ＥＵ付番）等のＰ３３１周辺のネイティブＩｇＧ Ｆｃの上方ＣＨ２ドメインにおける少なくとも３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、又は１０個の連続するアミノ酸の領域におけるループ及び鎖を少なくとも含み得る。

【0075】

好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、Ｆｃ領域を含む。本明細書で使用するとき、用語「Ｆｃ領域」とは、抗体重鎖の２以上のＦｃ部分によって形成される免疫グロブリンの部分を指す。例えば、Ｆｃ領域は、単量体又は「単鎖」Ｆｃ領域（即ち、ｓｃＦｃ領域）であってよい。単鎖Ｆｃ領域は、（例えば、単一の連続する核酸配列にコードされている）単一のポリペプチド鎖内で結合しているＦｃ部分で構成される。例示的なｓｃＦｃ領域は、国際公開第２００８／１４３９５４ Ａ２号に開示されている。好ましくは、Ｆｃ領域は、二量体Ｆｃ領域である。「二量体Ｆｃ領域」又は「ｄｃＦｃ」は、２つの別個の免疫グロブリン重鎖のＦｃ部分によって形成される二量体を指す。二量体Ｆｃ領域は、２つの同一のＦｃ部分のホモ二量体（例えば、天然免疫グロブリンのＦｃ領域）又は２つの非同一のＦｃ部分のヘテロ二量体であってよい。

【0076】

Ｆｃ領域のＦｃ部分は、同じ又は異なるクラス及び／又はサブクラスであってよい。例えば、Ｆｃ部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４サブクラスの免疫グロブリン（例えば、ヒト免疫グロブリン）に由来していてよい。好ましくは、Ｆｃ領域のＦｃ部分は、同じクラス及びサブクラスである。しかし、Ｆｃ領域（又はＦｃ領域の１以上のＦｃ部分）はキメラであってもよく、キメラＦｃ領域は、異なる免疫グロブリンクラス及び／又はサブクラスに由来するＦｃ部分を含み得る。例えば、二量体又は単鎖Ｆｃ領域のＦｃ部分のうちの少なくとも２つは、異なる免疫グロブリンクラス及び／又はサブクラスに由来していてよい。それに加えて又はそれに代えて、キメラＦｃ領域は、１以上のキメラＦｃ部分を含み得る。例えば、キメラＦｃ領域又は部分は、第１のサブクラスの免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ３サブクラス）の免疫グロブリンに由来する１以上の部分を含み得るが、一方、Ｆｃ領域又は部分の残りは、異なるサブクラスである。例えば、ＦｃポリペプチドのＦｃ領域又は部分は、第１のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４サブクラス）の免疫グロブリンに由来するＣＨ２及び／又はＣＨ３ドメインと、第２のサブクラス（例えば、ＩｇＧ３サブクラス）の免疫グロブリンに由来するヒンジ領域とを含み得る。例えば、Ｆｃ領域又は部分は、第１のサブクラス（例えば、ＩｇＧ４サブクラス）の免疫グロブリンに由来するヒンジ及び／又はＣＨ２ドメインと、第２のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ３サブクラス）の免疫グロブリンに由来するＣＨ３ドメインとを含み得る。例えば、キメラＦｃ領域は、第１のサブクラス（例えば、ＩｇＧ４サブクラス）の免疫グロブリンに由来するＦｃ部分（例えば、完全Ｆｃ部分）と、第２のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ３サブクラス）の免疫グロブリンに由来するＦｃ部分とを含み得る。例えば、Ｆｃ領域又は部分は、ＩｇＧ４免疫グロブリンに由来するＣＨ２ドメインと、ＩｇＧ１免疫グロブリンに由来するＣＨ３ドメインとを含み得る。例えば、Ｆｃ領域又は部分は、ＩｇＧ４分子に由来するＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメインと、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ３ドメインとを含み得る。例えば、Ｆｃ領域又は部分は、抗体の特定のサブクラスに由来するＣＨ２ドメインの一部、例えば、ＣＨ２ドメインのＥＵ２９２位～３４０位を含み得る。例えば、Ｆｃ領域又は部分は、ＩｇＧ４部分に由来するＣＨ２の２９２位～３４０位のアミノ酸とＩｇＧ１部分に由来するＣＨ２の残りとを含み得る（或いは、ＣＨ２の２９２～３４０は、ＩｇＧ１部分に由来し、ＣＨ２の残りはＩｇＧ４部分に由来していてもよい）。

【0077】

更に、Ｆｃ領域又は部分は、（それに加えて又はそれに代えて）例えば、キメラヒンジ領域を含み得る。例えば、キメラヒンジは、例えば、一部はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、又はＩｇＧ４分子（例えば、上方及び下方の中央ヒンジ配列）に由来し得、一部はＩｇＧ３分子（例えば、中央ヒンジ配列）に由来し得る。別の例では、Ｆｃ領域又は部分は、一部がＩｇＧ１分子に由来し、一部がＩｇＧ４分子に由来するキメラヒンジを含み得る。別の例では、キメラヒンジは、ＩｇＧ４分子由来の上方及び下方ヒンジドメインと、ＩｇＧ１分子由来の中央ヒンジドメインとを含み得る。かかるキメラヒンジは、例えば、ＩｇＧ４ヒンジ領域の中央ヒンジドメインにおけるＥＵ２２８位にプロリン置換（Ｓｅｒ２２８Ｐｒｏ）を導入することによって作製され得る。別の実施形態では、キメラヒンジは、ＩｇＧ２抗体に由来するＥＵ２３３位～２３６位のアミノ酸及び／又はＳｅｒ２２８Ｐｒｏ突然変異を含み得、この場合、ヒンジの残りのアミノ酸は、ＩｇＧ４抗体由来である（例えば、配列ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰのキメラヒンジ）。更に、本発明に係る抗体のＦｃ部分において用いることができるキメラヒンジは、米国特許出願第２００５／０１６３７８３ Ａ１号に記載されている。

【0078】

本発明では、Ｆｃ部分又はＦｃ領域は、ヒト免疫グロブリン配列に由来するアミノ酸配列（例えば、ヒトＩｇＧ分子由来のＦｃ領域又はＦｃ部分）を含むか又はからなることが好ましい。しかし、ポリペプチドは、別の哺乳類種由来の１以上のアミノ酸を含み得る。例えば、霊長類Ｆｃ部分又は霊長類結合部位が被験体ポリペプチドに含まれていてもよい。或いは、１以上のマウスアミノ酸がＦｃ部分又はＦｃ領域に存在していてもよい。

【0079】

好ましくは、本発明に係る抗体は、特に上記Ｆｃ部分に加えて、定常領域、特にＩｇＧの定常領域、好ましくはＩｇＧ１の定常領域、より好ましくはヒトＩｇＧ１の定常領域に由来する他の部分を含む。より好ましくは、本発明に係る抗体は、特に上記Ｆｃ部分に加えて、定常領域の他の部分全て、特にＩｇＧの定常領域の他の部分全て、好ましくはＩｇＧ１の定常領域の他の部分全て、より好ましくはヒトＩｇＧ１の定常領域の他の部分全てを含む。

【0080】

上に概説した通り、本発明に係る特に好ましい抗体は、ヒトＩｇＧ１に由来する（完全）Ｆｃ領域を含む。より好ましくは、本発明に係る抗体は、特にヒトＩｇＧ１に由来する（完全）Ｆｃ領域に加えて、ＩｇＧの定常領域の他の部分全て、好ましくは、ＩｇＧ１の定常領域の他の部分全て、より好ましくはヒトＩｇＧ１の定常領域の他の部分全ても含む。

【0081】

また、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片が、ＨＢｓＡｇ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、及びＪのうちの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、又は１０個に結合することも好ましい。ＨＢｓＡｇの様々な遺伝子型の例としては、以下が挙げられる：ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ０２２０３（ＨＢＶ－Ｄ、ａｙｗ３）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＦＪ８９９７９２．１（ＨＢＶ－Ｄ、ａｄｗ２）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＭ２８２９８６（ＨＢＶ－Ａ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｄ２３６７８（ＨＢＶ－Ｂ１ Ｊａｐａｎ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ１１７７５８（ＨＢＶ－Ｃ１ Ｃａｍｂｏｄｉａ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ２０５１９２（ＨＢＶ－Ｅ Ｇｈａｎａ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ６９７９８（ＨＢＶ－Ｆ４ Ｂｒａｚｉｌ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ１６０５０１（ＨＢＶ－Ｇ ＵＳＡ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ０９０４５４（ＨＢＶ－Ｈ Ｎｉｃａｒａｇｕａ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２４１４０９（ＨＢＶ－Ｉ Ｖｉｅｔｎａｍ）、及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ４８６０１２（ＨＢＶ－Ｊ Ｂｏｒｎｅｏ）。様々な遺伝子型のＨＢｓＡｇのＳドメインの抗原性ループ領域のアミノ酸配列を表１（配列番号５～１５）に示す。

【0082】

より好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、ＨＢｓＡｇ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、及びＪのうちの少なくとも６種、更により好ましくは少なくとも８種、特に好ましくは１０種全てに結合する。ＨＢＶは、ゲノム配列に従って多くの遺伝子型に分化する。今日まで、ＨＢＶゲノムの８種の周知の遺伝子型（Ａ～Ｈ）が定義されている。更に、２種の新規遺伝子型Ｉ及びＪも同定された（Ｓｕｎｂｕｌ Ｍ．，２０１４，Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ ２０（１８）：５４２７－５４３４）。遺伝子型は、疾患の進行に影響を与えることが知られており、抗ウイルス治療に応答する遺伝子型間の差異が決定されている。例えば、遺伝子型Ａは慢性化の傾向があり、一方、遺伝子型Ｃではウイルスの突然変異が頻繁に生じる。遺伝子型Ｄでは、慢性化及び突然変異の頻発の両方が一般的である。更に、ＨＢＶの遺伝子型は、世界中で異なった分布を有する（Ｓｕｎｂｕｌ Ｍ．，２０１４，Ｗｏｒｌｄ Ｊ Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ ２０（１８）：５４２７－５４３４）。好ましくはＨＢｓＡｇ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、及びＪのうちの少なくとも６種、好ましくは少なくとも８種、より好ましくは１０種全てに結合する本発明に係る抗体又はその抗原結合断片を提供することによって、様々な遺伝子型に対して非常に広く結合する抗体が提供される。

【0083】

好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、抗原性ループ領域に突然変異を有するＨＢｓＡｇ突然変異体：ＨＢｓＡｇ Ｙ１００Ｃ／Ｐ１２０Ｔ、ＨＢｓＡｇ Ｐ１２０Ｔ、ＨＢｓＡｇ Ｐ１２０Ｔ／Ｓ１４３Ｌ、ＨＢｓＡｇ Ｃ１２１Ｓ、ＨＢｓＡｇ Ｒ１２２Ｄ、ＨＢｓＡｇ Ｒ１２２Ｉ、ＨＢｓＡｇ Ｔ１２３Ｎ、ＨＢｓＡｇ Ｑ１２９Ｈ、ＨＢｓＡｇ Ｑ１２９Ｌ、ＨＢｓＡｇ Ｍ１３３Ｈ、ＨＢｓＡｇ Ｍ１３３Ｌ、ＨＢｓＡｇ Ｍ１３３Ｔ、ＨＢｓＡｇ Ｋ１４１Ｅ、ＨＢｓＡｇ Ｐ１４２Ｓ、ＨＢｓＡｇ Ｓ１４３Ｋ、ＨＢｓＡｇ Ｄ１４４Ａ、ＨＢｓＡｇ Ｇ１４５Ｒ、及びＨＢｓＡｇ Ｎ１４６Ａのうちの１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、又は１８個に結合する。これら突然変異体は、ＨＢｓＡｇ遺伝子型ＤのＳドメインに基づく天然突然変異体、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＦＪ８９９７９２（配列番号４）であり、突然変異しているアミノ酸残基をその名称中に示す。

【表2】

【0084】

様々な突然変異体のＨＢｓＡｇのＳドメインの抗原性ループ領域のアミノ酸配列を表１に示す（配列番号１６～３３）。

【0085】

より好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、抗原性ループ領域に突然変異を有する感染性ＨＢｓＡｇ突然変異体：ＨＢｓＡｇ Ｙ１００Ｃ／Ｐ１２０Ｔ、ＨＢｓＡｇ Ｐ１２０Ｔ、ＨＢｓＡｇ Ｐ１２０Ｔ／Ｓ１４３Ｌ、ＨＢｓＡｇ Ｃ１２１Ｓ、ＨＢｓＡｇ Ｒ１２２Ｄ、ＨＢｓＡｇ Ｒ１２２Ｉ、ＨＢｓＡｇ Ｔ１２３Ｎ、ＨＢｓＡｇ Ｑ１２９Ｈ、ＨＢｓＡｇ Ｑ１２９Ｌ、ＨＢｓＡｇ Ｍ１３３Ｈ、ＨＢｓＡｇ Ｍ１３３Ｌ、ＨＢｓＡｇ Ｍ１３３Ｔ、ＨＢｓＡｇ Ｋ１４１Ｅ、ＨＢｓＡｇ Ｐ１４２Ｓ、ＨＢｓＡｇ Ｓ１４３Ｋ、ＨＢｓＡｇ Ｄ１４４Ａ、ＨＢｓＡｇ Ｇ１４５Ｒ、及びＨＢｓＡｇ Ｎ１４６Ａのうちの少なくとも１２種、更により好ましくは少なくとも１５種、特に好ましくは１８種全てに結合する。

【0086】

好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、ＨＢｓＡｇの抗原性ループ領域のうちの少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個、より好ましくは少なくとも３個のアミノ酸、更により好ましくは少なくとも４個のアミノ酸を含むエピトープに結合し、前記少なくとも２個、好ましくは前記少なくとも３個、より好ましくは前記少なくとも４個のアミノ酸は、ＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸１１５～１３３、好ましくはＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸１２０～１３３、より好ましくはＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸１２０～１３０から選択される。留意すべきことに、アミノ酸の位置（例えば、１１５～１３３、１２０～１３３、１２０～１３０）は、３つのＨＢＶエンベロープタンパク質Ｓ－ＨＢｓＡｇ、Ｍ－ＨＢｓＡｇ、及びＬ－ＨＢｓＡｇの全てに存在する上記ＨＢｓＡｇのＳドメインを指し、Ｓ－ＨＢｓＡｇは、典型的には、ＨＢｓＡｇのＳドメインに対応する。

【0087】

特に、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、ＨＢｓＡｇの抗原性ループ領域におけるエピトープに結合し、前記エピトープは、典型的には、ＨＢｓＡｇのＳドメインの１１５位～１３３位のアミノ酸から選択される、好ましくは１２０位～１３３位のアミノ酸から選択される、より好ましくは１２０位～１３０位のアミノ酸から選択される位置に位置する１以上のアミノ酸によって形成される。

【0088】

用語「によって形成される」とは、本明細書で使用するとき、エピトープに関して、本発明の抗体又はその抗原結合断片が結合するエピトープが線状であってもよく（連続）、立体構造をとってもよい（不連続）ことを意味する。線状、即ち連続エピトープは、そのアミノ酸の線状配列、即ち一次構造が抗体に認識されるエピトープである。対照的に、立体構造的エピトープは、特定の三次元形状及びタンパク質構造を有する。したがって、エピトープが線状エピトープであり且つＨＢｓＡｇのＳドメインの１１５位～１３３位のアミノ酸から選択される、好ましくは１２０位～１３３位のアミノ酸から選択される位置に位置する１超のアミノ酸を含む場合、エピトープに含まれるアミノ酸は、典型的には、一次構造の隣接する位置に位置する（即ち、アミノ酸配列における連続するアミノ酸）。立体構造的エピトープ（３Ｄ構造）の場合、対照的に、アミノ酸配列は、典型的には、エピトープとして３Ｄ構造を形成するので、エピトープを形成するアミノ酸（又はエピトープ「に含まれる」アミノ酸）は、一次構造の隣接する位置に位置していてもよく、位置していなくてもよい（即ち、アミノ酸配列における連続するアミノ酸であってもなくてもよい）。

【0089】

好ましくは、本発明の抗体又はその抗原結合断片が結合するエピトープは、ＨＢｓＡｇのＳドメインの１１５位～１３３位のアミノ酸から選択される、好ましくは１２０位～１３３位のアミノ酸から選択される、より好ましくは１２０位～１３０位のアミノ酸から選択されるアミノ酸のみによって形成される。言い換えれば、本発明の抗体又はその抗原結合断片が結合するエピトープを形成するために、１１５位～１３３位、好ましくは１２０位～１３３位、より好ましくは１２０位～１３０位の外側に位置する（更なる）アミノ酸を必要としないことが好ましい。

【0090】

好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片が結合するＨＢｓＡｇの抗原性ループ領域におけるエピトープは、ＨＢｓＡｇのＳドメインの１１５位～１３３位のアミノ酸から選択される、好ましくは１２０位～１３３位のアミノ酸から選択される、より好ましくは１２０位～１３０位のアミノ酸から選択される位置に位置する２以上のアミノ酸によって形成される。より好ましくは、本発明の抗体又はその抗原結合断片が結合するＨＢｓＡｇの抗原性ループ領域におけるエピトープは、ＨＢｓＡｇのＳドメインの１１５位～１３３位のアミノ酸から選択される、好ましくは１２０位～１３３位のアミノ酸から選択される、より好ましくは１２０位～１３０位のアミノ酸から選択される位置に位置する３以上のアミノ酸によって形成される。更により好ましくは、本発明の抗体又はその抗原結合断片が結合するＨＢｓＡｇの抗原性ループ領域におけるエピトープは、ＨＢｓＡｇのＳドメインの１１５位～１３３位のアミノ酸から選択される、好ましくは１２０位～１３３位のアミノ酸から選択される、より好ましくは１２０位～１３０位のアミノ酸から選択される位置に位置する４以上のアミノ酸によって形成される。言い換えれば、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、ＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸１１５～アミノ酸１３３、好ましくはＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸１２０～アミノ酸１３３、より好ましくはＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸１２０～アミノ酸１３０から選択されるＨＢｓＡｇの抗原性ループ領域のうちの少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個、より好ましくは少なくとも３個、更により好ましくは少なくとも４個のアミノ酸に結合することが好ましい。

【0091】

より好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、ＨＢｓＡｇの抗原性ループ領域のうちの少なくとも２個、好ましくは少なくとも３個、より好ましくは少なくとも４個のアミノ酸を含むエピトープに結合し、前記少なくとも２個、好ましくは前記少なくとも３個、より好ましくは前記少なくとも４個のアミノ酸は、ＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸１２０～アミノ酸１３３、好ましくはアミノ酸１２０～１３０から選択され、前記少なくとも２個、好ましくは前記少なくとも３個、より好ましくは前記少なくとも４個のアミノ酸は、隣接する位置に位置する（即ち、アミノ酸配列／一次構造における連続するアミノ酸である）。

【0092】

本発明に係る抗体又はその抗原結合断片が結合するエピトープは、好ましくは、立体構造的エピトープである。したがって、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、ＨＢｓＡｇの抗原性ループ領域の少なくとも２個、好ましくは少なくとも３個、より好ましくは少なくとも４個のアミノ酸を含むエピトープに結合し、前記少なくとも２個、好ましくは前記少なくとも３個、より好ましくは前記少なくとも４個のアミノ酸は、ＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸１２０～アミノ酸１３３、好ましくはアミノ酸１２０～１３０から選択され、前記少なくとも２個、好ましくは前記少なくとも３個、より好ましくは前記少なくとも４個のアミノ酸のうちの少なくとも２個、好ましくは少なくとも３個は（一次構造の）隣接する位置に位置しないことが好ましい。

【0093】

言い換えれば、（ｉ）抗体が結合するアミノ酸（即ち、エピトープを形成するアミノ酸）のいずれも一次構造の隣接する位置に位置しないか、又は（ｉｉ）抗体が結合するアミノ酸（即ち、エピトープを形成するアミノ酸）の一部、例えば、２個若しくは３個は（一次構造の）隣接する位置に位置するが、抗体が結合するその他のアミノ酸（即ち、エピトープを形成するアミノ酸）は（一次構造の）隣接する位置に位置しない。

【0094】

一次構造の隣接する位置には位置していない、抗体が結合するアミノ酸（即ち、エピトープを形成するアミノ酸）は、典型的には、抗体が結合しない１以上のアミノ酸によって離間している。好ましくは、エピトープに含まれ且つ隣接する位置に位置していない少なくとも２個、好ましくは少なくとも３個のアミノ酸の間に少なくとも１個、より好ましくは少なくとも２個、更により好ましくは少なくとも３個、最も好ましくは少なくとも４個、特に好ましくは少なくとも５個のアミノ酸が位置していてよい。

【0095】

好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、ＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸Ｐ１２０、Ｃ１２１、Ｒ１２２、及びＣ１２４を少なくとも含むエピトープに結合する。より好ましくは、前記抗体又は前記抗原結合断片は、配列番号８８：

【表3】

（式中、Ｘは、任意のアミノ酸であるか又はアミノ酸が存在せず；好ましくは、Ｘは、任意のアミノ酸であり、より好ましくは、Ｘは、Ｔ、Ｙ、Ｒ、Ｓ、又はＦであり；更により好ましくは、Ｘは、Ｔ、Ｙ、又はＲであり；最も好ましくは、Ｘは、Ｔ又はＲである）
に係るアミノ酸配列を含むエピトープに結合する。

【0096】

更により好ましくは、前記抗体又は前記抗原結合断片は、配列番号８０：

【表4】

に係るアミノ酸配列を含むエピトープ、又は配列番号８０と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を共有するアミノ酸配列に結合する。

【0097】

最も好ましくは、前記抗体又は前記抗原結合断片は、配列番号８５：

【表5】

に係るアミノ酸配列を含むエピトープ、又は配列番号８５と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を共有するアミノ酸配列に結合する。

【0098】

また、前記抗体又は前記抗原結合断片は、ＨＢｓＡｇのＳドメインのアミノ酸１４５～１５１：

【表6】

を少なくとも含むアミノ酸配列を含むエピトープに結合することが好ましい。

【0099】

より好ましくは、前記抗体又は前記抗原結合断片は、配列番号８０に係るアミノ酸配列及び配列番号８１に係るアミノ酸配列を含むエピトープに結合する。

【0100】

より好ましくは、前記抗体又は前記抗原結合断片は、配列番号８５に係るアミノ酸配列及び／又は配列番号８７に係るアミノ酸配列を含むエピトープに結合する。

【0101】

上記の通り、本発明の抗体が結合するエピトープは、線状であってもよく（連続）、立体構造をとってもよい（不連続）。好ましくは、本発明の抗体及び抗体断片は、立体構造的エピトープに結合し、より好ましくは、立体構造的エピトープは、非還元条件下でのみ存在する。

【0102】

しかし、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、線状エピトープに結合することも好ましく、より好ましくは、線状エピトープは、非還元条件下及び還元条件下の両方で存在する。

【0103】

好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１：

【表7】

（式中、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、及びＸ_７は、任意のアミノ酸である）（配列番号１）
に係るアミノ酸配列によって形成されるＨＢｓＡｇの抗原性ループにおけるエピトープに結合する。

【0104】

好ましくは、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、及びＸ_７は、配列番号３のアミノ酸１２０～１３０と比較して保存的に置換されているアミノ酸である。また、Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６、及びＸ_７は、配列番号５～３３のいずれかのアミノ酸２０～３０と比較して保存的に置換されているアミノ酸であることも好ましい（表１；抗原性ループ領域、即ち、ＨＢｓＡｇの様々な変異体のＳドメインのアミノ酸１０１～１７２を参照）。

【0105】

好ましくは、配列番号１におけるＸ_１は、小アミノ酸である。「小」アミノ酸とは、本明細書で使用するとき、アラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、システイン、グリシン、プロリン、セリン、トレオニン、及びバリンからなる群から選択される任意のアミノ酸を指す。より好ましくは、Ｘ_１は、プロリン、セリン、又はトレオニンである。

【0106】

好ましくは、配列番号１におけるＸ_２は、小アミノ酸である。より好ましくは、Ｘ_２は、システイン又はトレオニンである。

【0107】

好ましくは、配列番号１におけるＸ_３は、荷電アミノ酸又は脂肪族アミノ酸である。「荷電」アミノ酸とは、本明細書で使用するとき、アルギニン、リジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、及びヒスチジンからなる群から選択される任意のアミノ酸を指す。「脂肪族」アミノ酸とは、本明細書で使用するとき、アラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、及びバリンからなる群から選択される任意のアミノ酸を指す。より好ましくは、Ｘ_３は、アルギニン、リジン、アスパラギン酸、又はイソロイシンである。

【0108】

好ましくは、配列番号１におけるＸ_４は、小アミノ酸及び／又は疎水性アミノ酸である。「疎水性」アミノ酸とは、本明細書で使用するとき、アラニン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、バリン、トリプトファン、チロシン、メチオニン、プロリン、及びグリシンからなる群から選択される任意のアミノ酸を指す。より好ましくは、Ｘ_４は、メチオニン又はトレオニンである。

【0109】

好ましくは、配列番号１におけるＸ_５は、小アミノ酸及び／又は疎水性アミノ酸である。より好ましくは、Ｘ_５は、トレオニン、アラニン、又はイソロイシンである。

【0110】

好ましくは、配列番号１におけるＸ_６は、小アミノ酸及び／又は疎水性アミノ酸である。より好ましくは、Ｘ_６は、トレオニン、プロリン、又はロイシンである。

【0111】

好ましくは、配列番号１におけるＸ_７は、極性アミノ酸又は脂肪族アミノ酸である。「極性」アミノ酸とは、本明細書で使用するとき、アスパラギン酸、アスパラギン、アルギニン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、グルタミン、トリプトファン、チロシン、セリン、及びトレオニンからなる群から選択される任意のアミノ酸を指す。より好ましくは、Ｘ_７は、グルタミン、ヒスチジン、又はロイシンである。

【0112】

したがって、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２：

【表8】

（式中、Ｘ_１は、Ｐ、Ｔ、又はＳであり、
Ｘ_２は、Ｃ又はＳであり、
Ｘ_３は、Ｒ、Ｋ、Ｄ、又はＩであり、
Ｘ_４は、Ｍ又はＴであり、
Ｘ_５は、Ｔ、Ａ、又はＩであり、
Ｘ_６は、Ｔ、Ｐ、又はＬであり、
Ｘ_７は、Ｑ、Ｈ、又はＬである）
（配列番号２）
に係るアミノ酸配列によって形成されるＨＢｓＡｇの抗原性ループにおけるエピトープに結合することがより好ましい。

【0113】

配列番号１又は２に係るアミノ酸配列によって形成される好ましいエピトープに関して、用語「によって形成される」とは、本明細書で使用するとき、特に、抗体が配列番号１又は２のそれぞれ及び全てのアミノ酸に必ず結合することを意味することを意図するものではないことに留意する。特に、好ましい立体構造的エピトープの場合、抗体は、配列番号１又は２のアミノ酸の一部のみに結合し得、他のアミノ酸残基は、単に「スペーサ」として作用し得、それによって、エピトープの３Ｄ構造を提供する。

【0114】

好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、以下の表１に示す配列番号５～３３から選択されるアミノ酸配列の１以上、好ましくは２以上、より好ましくは３以上、更により好ましくは４以上のアミノ酸によって形成されるＨＢｓＡｇの抗原性ループにおけるエピトープに結合する。

【0115】

より好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、以下の表１に示す配列番号５～３３のいずれかに係るアミノ酸配列を有するＨＢｓＡｇの抗原性ループ領域又はその配列変異体に結合する。更により好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、以下の表１に示す配列番号５～３３のいずれかに係るアミノ酸配列を有するＨＢｓＡｇの抗原性ループ変異体の全てに結合する。言い換えれば、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片が、配列番号５～３３のいずれかに係るアミノ酸配列を有するＨＢｓＡｇの様々な抗原性ループ領域の全てに結合し得る場合が特に好ましい。

【表9-1】

【表9-2】

【表9-3】

【0116】

一般に、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、好ましくは、重鎖に（少なくとも）３個の相補性決定領域（ＣＤＲ）及び軽鎖に（少なくとも）３個のＣＤＲを含む。一般に、相補性決定領域（ＣＤＲ）は、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインに存在する超可変性領域である。典型的には、抗体の重鎖及び接続された軽鎖のＣＤＲは共に抗原受容体を形成する。通常、３個のＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）は、可変ドメインに非連続的に配置される。抗原受容体は、典型的には、（２本の異なるポリペプチド鎖、即ち、重鎖及び軽鎖における）２つの可変ドメインで構成されるので、各抗原受容体につき６個のＣＤＲ（重鎖：ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３；軽鎖：ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３）が存在する。単一の抗体分子は、通常、２個の抗原受容体を有するので、１２個のＣＤＲを含有する。重鎖及び／又は軽鎖におけるＣＤＲは、フレームワーク領域によって分離され得、フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲよりも「可変性」の低い可変ドメインにおける領域である。例えば、鎖（又はそれぞれの各鎖）は、３個のＣＤＲによって分離されている４個のフレームワーク領域で構成され得る。

【0117】

重鎖に３個の異なるＣＤＲ及び軽鎖に３個の異なるＣＤＲを含む本発明の例示的な抗体の重鎖及び軽鎖の配列を決定した。ＣＤＲアミノ酸の位置は、ＩＭＧＴ付番システムに従って定義される（ＩＭＧＴ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／；Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．－Ｐ．ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３７，Ｄ１００６－Ｄ１０１２を参照）。

【表10】

【0118】

したがって、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、表２に示すＣＤＲ配列、ＶＨ配列、及び／又はＶＬ配列のうちの少なくとも１つに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことが好ましい。

【表11】

【0119】

したがって、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、表３に示すＣＤＲ配列、ＶＨ配列、及び／又はＶＬ配列のうちの少なくとも１つに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことも好ましい。

【表12】

【0120】

したがって、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、表４に示すＣＤＲ配列、ＶＨ配列、及び／又はＶＬ配列のうちの少なくとも１つに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことも好ましい。

【表13】

【0121】

したがって、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、表５に示すＣＤＲ配列、ＶＨ配列、及び／又はＶＬ配列のうちの少なくとも１つに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことが好ましい。

【表14】

【0122】

したがって、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、表６に示すＣＤＲ配列、ＶＨ配列、及び／又はＶＬ配列のうちの少なくとも１つに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことも好ましい。

【表15】

【0123】

したがって、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、表７に示すＣＤＲ配列、ＶＨ配列、及び／又はＶＬ配列のうちの少なくとも１つに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことも好ましい。

【表16】

【0124】

好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、少なくとも１つのＣＤＲＨ１、少なくとも１つのＣＤＲＨ２、及び少なくとも１つのＣＤＲＨ３を含む重鎖と、少なくとも１つのＣＤＲＬ１、少なくとも１つのＣＤＲＬ２、及び少なくとも１つのＣＤＲＬ３を含む軽鎖とを含み、少なくとも１つのＣＤＲ、好ましくは、少なくとも１つの重鎖ＣＤＲＨ３は、配列番号３６に係るアミノ酸配列又は本明細書に記載するその機能性配列変異体を含むか又はからなる。したがって、少なくとも１つの重鎖ＣＤＲＨ３は、配列番号３６と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含むことが好ましい。より好ましくは、少なくとも１つの重鎖ＣＤＲＨ３は、配列番号３６に係るアミノ酸配列を含む。

【0125】

また、前記抗体又はその抗原結合断片は、少なくとも１つのＣＤＲＨ１、少なくとも１つのＣＤＲＨ２、及び少なくとも１つのＣＤＲＨ３を含む重鎖と、少なくとも１つのＣＤＲＬ１、少なくとも１つのＣＤＲＬ２、及び少なくとも１つのＣＤＲＬ３を含む軽鎖とを含み、前記少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲＬ３が、配列番号４０若しくは配列番号５８に係るアミノ酸配列又はその機能性配列変異体を含むことも好ましい。したがって、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲＬ３は、配列番号４０又は配列番号５８と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含むことが好ましい。より好ましくは、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲＬ３は、配列番号４０又は配列番号５８に係るアミノ酸配列を含む。

【0126】

より好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、少なくとも１つのＣＤＲＨ１、少なくとも１つのＣＤＲＨ２、及び少なくとも１つのＣＤＲＨ３を含む重鎖と、少なくとも１つのＣＤＲＬ１、少なくとも１つのＣＤＲＬ２、及び少なくとも１つのＣＤＲＬ３を含む軽鎖とを含み、前記少なくとも１つの重鎖ＣＤＲＨ１は、配列番号３４に係るアミノ酸配列又はその機能性配列変異体を含む、前記少なくとも１つのＣＤＲＨ２は、配列番号３５に係るアミノ酸配列又はその機能性配列変異体を含む、及び／又は前記少なくとも１つのＣＤＲＨ３は、配列番号３６に係るアミノ酸配列又はその機能性配列変異体を含む。より好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、少なくとも１つのＣＤＲＨ１、少なくとも１つのＣＤＲＨ２、及び少なくとも１つのＣＤＲＨ３を含む重鎖と、少なくとも１つのＣＤＲＬ１、少なくとも１つのＣＤＲＬ２、及び少なくとも１つのＣＤＲＬ３を含む軽鎖とを含み、前記少なくとも１つの重鎖ＣＤＲＨ１は、配列番号３４に係るアミノ酸配列又はその機能性配列変異体を含む、前記少なくとも１つのＣＤＲＨ２は、配列番号３５若しくは６６に係るアミノ酸配列又はその機能性配列変異体を含む、及び／又は前記少なくとも１つの重鎖ＣＤＲＨ３は、配列番号３６に係るアミノ酸配列又はその機能性配列変異体を含む。したがって、前記少なくとも１つの重鎖ＣＤＲＨ１は、配列番号３４と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む；前記少なくとも１つの重鎖ＣＤＲＨ２は、配列番号３５又は６６と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む；及び／又は前記少なくとも１つの重鎖ＣＤＲＨ３は、配列番号３６と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む。より好ましくは、少なくとも１つの重鎖ＣＤＲＨ１は、配列番号３４に係るアミノ酸配列を含む；少なくとも１つの重鎖ＣＤＲＨ２は、配列番号３５若しくは６６に係るアミノ酸配列を含む；及び／又は少なくとも１つの重鎖ＣＤＲＨ３は、配列番号３６に係るアミノ酸配列を含む。

【0127】

好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、少なくとも１つのＣＤＲＨ１、少なくとも１つのＣＤＲＨ２、及び少なくとも１つのＣＤＲＨ３を含む重鎖と、少なくとも１つのＣＤＲＬ１、少なくとも１つのＣＤＲＬ２、及び少なくとも１つのＣＤＲＬ３を含む軽鎖とを含み、前記少なくとも１つのＣＤＲＬ１は、配列番号３７に係るアミノ酸配列又はその機能性配列変異体を含む、前記少なくとも１つのＣＤＲＬ２は、配列番号３８若しくは３９に係るアミノ酸配列又はその機能性配列変異体を含む、及び／又は前記少なくとも１つのＣＤＲＬ３アミノは、配列番号４０に係るアミノ酸配列又はその機能性配列変異体を含む。また、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、少なくとも１つのＣＤＲＨ１、少なくとも１つのＣＤＲＨ２、及び少なくとも１つのＣＤＲＨ３を含む重鎖と、少なくとも１つのＣＤＲＬ１、少なくとも１つのＣＤＲＬ２、及び少なくとも１つのＣＤＲＬ３を含む軽鎖とを含み、前記少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲＬ１は、配列番号３７に係るアミノ酸配列又はその機能性配列変異体を含む、前記少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲＬ２は、配列番号３８若しくは３９に係るアミノ酸配列又はその機能性配列変異体を含む、及び／又は前記少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲＬ３アミノは、配列番号５８に係るアミノ酸配列又はその機能性配列変異体を含むことも好ましい。したがって、前記少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲＬ１は、配列番号３７と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む；前記少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲＬ２は、配列番号３８又は３９と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含む；及び／又は前記少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲＬ３は、配列番号４０又は５８と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含むことが好ましい。より好ましくは、少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲＬ１は、配列番号３７に係るアミノ酸配列を含む；少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲＬ２は、配列番号３８若しくは３９に係るアミノ酸配列を含む；及び／又は少なくとも１つの軽鎖ＣＤＲＬ３は、配列番号４０若しくは５８に係るアミノ酸配列を含む。

【0128】

したがって、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ、配列番号３４～３８及び４０に係るＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３アミノ酸配列並びにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３アミノ酸配列若しくはこれらの抗原結合断片、又は配列番号３４～３７及び３９～４０に係るＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３アミノ酸配列並びにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３アミノ酸配列若しくはこれらの抗原結合断片を含むことも好ましい。また、前記抗体又は前記抗原結合断片は、それぞれ、配列番号３４、３６～３８、４０、及び６６に係るＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３アミノ酸配列並びにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３アミノ酸配列若しくはこれらの抗原結合断片、又は配列番号３４、３６～３７、３９～４０、及び６６に係るＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３アミノ酸配列並びにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３アミノ酸配列若しくはこれらの抗原結合断片を含むことも好ましい。また、前記抗体又は前記抗原結合断片は、それぞれ、配列番号３４～３８、及び５８に係るＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３アミノ酸配列並びにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３アミノ酸配列若しくはこれらの抗原結合断片、又は配列番号３４～３７、３９、及び５８に係るＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３アミノ酸配列並びにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３アミノ酸配列若しくはこれらの抗原結合断片を含むことも好ましい。更に、前記抗体又は前記抗原結合断片は、それぞれ、配列番号３４、３６～３８、５８、及び６６に係るＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３アミノ酸配列並びにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３アミノ酸配列若しくはこれらの抗原結合断片、又は配列番号３４、３６～３７、３９、５８、及び６６に係るＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３アミノ酸配列並びにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３アミノ酸配列若しくはこれらの抗原結合断片を含むことも好ましい。

【0129】

したがって、前記抗体又は前記抗原結合断片は、（ｉ）それぞれ配列番号３４～３８及び４０のそれぞれと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％若しくは９９％の配列同一性を共有するか；（ｉｉ）それぞれ配列番号３４～３７、３９、及び４０のそれぞれと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％若しくは９９％の配列同一性を共有するか；（ｉｉｉ）それぞれ配列番号３４～３８、及び５８のそれぞれと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％若しくは９９％の配列同一性を共有するか；（ｉｖ）それぞれ配列番号３４～３７、３９、及び５８のそれぞれと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％若しくは９９％の配列同一性を共有するか；（ｖ）それぞれ配列番号３４、３６～３８、４０、及び６６のそれぞれと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％若しくは９９％の配列同一性を共有するか；（ｖｉ）それぞれ配列番号３４、３６～３７、３９、４０、及び６６のそれぞれと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％若しくは９９％の配列同一性を共有するか；（ｖｉｉ）それぞれ配列番号３４、３６～３８、５８、及び６６のそれぞれと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％若しくは９９％の配列同一性を共有するか；（ｖｉｉｉ）それぞれ配列番号３４、３６～３７、３９、５８、及び６６のそれぞれと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％若しくは９９％の配列同一性を共有するＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３アミノ酸配列並びにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３アミノ酸配列を有することが好ましい。

【0130】

より好ましくは、前記抗体又は前記抗原結合断片は、（ｉ）それぞれ配列番号３４～３８、及び４０に係る；又は（ｉｉ）それぞれ配列番号３４～３７、３９、及び４０に係る；又は（ｉｉｉ）それぞれ配列番号３４～３８、及び５８に係る；又は（ｉｖ）それぞれ配列番号３４～３７、３９、及び５８に係る；又は（ｖ）それぞれ配列番号３４、３６～３８、４０、及び６６に係る；又は（ｖｉ）それぞれ配列番号３４、３６～３７、３９、４０、及び６６に係る；又は（ｖｉｉ）それぞれ配列番号３４、３６～３８、５８、及び６６に係る；又は（ｖｉｉｉ）それぞれ配列番号３４、３６～３７、３９、５８、及び６６に係るＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３アミノ酸配列並びにＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む。

【0131】

更に、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、配列番号４１に係る重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列若しくはその機能性配列変異体及び／又は配列番号４２に係る軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列若しくはその機能性配列変異体を含むことも好ましい。したがって、前記抗体又は前記抗原結合断片は、配列番号４１と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を共有する重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列と、配列番号４２と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を共有する軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列とを含むことが好ましい。より好ましくは、前記抗体又は前記抗原結合断片は、配列番号４１に係る重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列と、配列番号４２に係る軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列とを含む。

【0132】

更に、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、配列番号４１若しくは６７に係る重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列又はその機能性配列変異体及び／又は配列番号４２に係る軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列若しくはその機能性配列変異体を含むことも好ましい。したがって、前記抗体又は前記抗原結合断片は、配列番号４１又は６７と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を共有する重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列と、配列番号４２と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を共有する軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列とを含むことが好ましい。より好ましくは、前記抗体又は前記抗原結合断片は、配列番号４１又は６７に係る重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列と、配列番号４２に係る軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列とを含む。

【0133】

好ましくは、前記抗体又は前記抗原結合断片は、配列番号４１若しくは６７に係る重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列又はその機能性配列変異体と、配列番号５９若しくは６５に係る軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列又はその機能性配列変異体とを含む。したがって、前記抗体又は前記抗原結合断片は、（ｉ）配列番号４１又は６７と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を共有する重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列と、（ｉｉ）配列番号５９又は６５と少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を共有する軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列とを含むことが好ましい。より好ましくは、前記抗体又は前記抗原結合断片は、配列番号４１又は６７に係る重鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列と、配列番号５９又は６５に係る軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列とを含む。

【0134】

好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号３４～３８、及び４０のアミノ酸配列、又は配列番号３４～３７及び３９～４０のアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である少なくとも１つの重鎖ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３並びに軽鎖ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３アミノ酸配列とを含む。好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号３４～３８、及び５８のアミノ酸配列、又はそれぞれ配列番号３４～３７、３９、及び５８のアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である少なくとも１つの重鎖ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３並びに軽鎖ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３アミノ酸配列とを含む。好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号３４、３６～３８、４０、及び６６のアミノ酸配列、又はそれぞれ配列番号３４、３６～３７、３９～４０、及び６６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である少なくとも１つの重鎖ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３並びに軽鎖ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３アミノ酸配列とを含む。好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ配列番号３４、３６～３８、５８、及び６６のアミノ酸配列、又はそれぞれ配列番号３４、３６～３７、３９、５８、及び６６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である少なくとも１つの重鎖ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３並びに軽鎖ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３アミノ酸配列とを含む。

【0135】

また、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、配列番号４１～４２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である少なくとも１つの重鎖可変領域（ＶＨ）及び少なくとも１つの軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列を含むことも好ましい。

【0136】

また、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、配列番号４１及び５９のアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である少なくとも１つの重鎖可変領域（ＶＨ）及び少なくとも１つの軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列を含むことも好ましい。

【0137】

また、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、配列番号４１及び６５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一である少なくとも１つの重鎖可変領域（ＶＨ）及び少なくとも１つの軽鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列を含むことも好ましい。

【0138】

特に好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、ｇＨＢＣ３４であり、特に、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、ＨＢＣ３４である。

【0139】

本発明者らは、本発明に係るモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を単離した。これを本明細書ではＨＢＣ３４（実施例１を参照）と称する。この抗体ＨＢＣ３４、特に、ＨＢＣ３４のＶＨ及びＶＬ遺伝子に基づいて、用語「ｇＨＢＣ３４」とは、本明細書で使用するとき、それぞれの「ジェネリック」抗体又はその抗原結合断片を指す。即ち、「ｇＨＢＣ３４」とは、配列番号３４に係るＣＤＲＨ１アミノ酸配列、配列番号３５に係るＣＤＲＨ２アミノ酸配列、配列番号３６に係るＣＤＲＨ３アミノ酸配列、配列番号３７に係るＣＤＲＬ１アミノ酸配列、配列番号３８又は３９に係るＣＤＲＬ２アミノ酸配列、及び配列番号４０に係るＣＤＲＬ３アミノ酸配列を有する抗体又はその抗原結合断片を指す。特に、「ｇＨＢＣ３４」とは、配列番号３４に係るＣＤＲＨ１アミノ酸配列、配列番号３５又は６６に係るＣＤＲＨ２アミノ酸配列、配列番号３６に係るＣＤＲＨ３アミノ酸配列、配列番号３７に係るＣＤＲＬ１アミノ酸配列、配列番号３８又は３９に係るＣＤＲＬ２アミノ酸配列、及び配列番号４０に係るＣＤＲＬ３アミノ酸配列を有する抗体又はその抗原結合断片を指す。「ｇＨＢＣ３４」の重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）は、配列番号４１に係るアミノ酸配列を有し、「ｇＨＢＣ３４」の軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）は、配列番号４２に係るアミノ酸配列を有する。

【0140】

特に好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片はｇＨＢＣ３４ｖ７であり、特に、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片はＨＢＣ３４ｖ７である。

【0141】

本発明者らは、本発明に係る更なるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を同定した。これを本明細書ではＨＢＣ３４ｖ７（実施例１１を参照）と称する。この抗体ＨＢＣ３４ｖ７、特に、ＨＢＣ３４ｖ７のＶＨ及びＶＬ遺伝子に基づいて、用語「ｇＨＢＣ３４ｖ７」とは、本明細書で使用するとき、それぞれの「ジェネリック」抗体又はその抗原結合断片を指す。即ち、「ｇＨＢＣ３４ｖ７」とは、配列番号３４に係るＣＤＲＨ１アミノ酸配列、配列番号３５又は６６に係るＣＤＲＨ２アミノ酸配列、配列番号３６に係るＣＤＲＨ３アミノ酸配列、配列番号３７に係るＣＤＲＬ１アミノ酸配列、配列番号３８又は３９に係るＣＤＲＬ２アミノ酸配列、及び配列番号５８に係るＣＤＲＬ３アミノ酸配列を有する抗体又はその抗原結合断片を指す。「ｇＨＢＣ３４ｖ７」の重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）は、配列番号４１に係るアミノ酸配列を有し、「ｇＨＢＣ３４ｖ７」の軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）は、配列番号５９に係るアミノ酸配列を有する。

【0142】

特に好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片はｇＨＢＣ３４ｖ２３であり、特に、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片はＨＢＣ３４ｖ２３である。

【0143】

本発明者らは、本発明に係る更なるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を同定した。これを本明細書ではＨＢＣ３４ｖ２３（実施例１２を参照）と称する。この抗体ＨＢＣ３４ｖ２３、特に、ＨＢＣ３４ｖ２３のＶＨ及びＶＬ遺伝子に基づいて、用語「ｇＨＢＣ３４ｖ２３」とは、本明細書で使用するとき、それぞれの「ジェネリック」抗体又はその抗原結合断片を指す。即ち、「ｇＨＢＣ３４ｖ２３」とは、配列番号３４に係るＣＤＲＨ１アミノ酸配列、配列番号３５又は６６に係るＣＤＲＨ２アミノ酸配列、配列番号３６に係るＣＤＲＨ３アミノ酸配列、配列番号３７に係るＣＤＲＬ１アミノ酸配列、配列番号３８又は３９に係るＣＤＲＬ２アミノ酸配列、及び配列番号５８に係るＣＤＲＬ３アミノ酸配列を有する抗体又はその抗原結合断片を指す。「ｇＨＢＣ３４ｖ２３」の重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）は、配列番号４１に係るアミノ酸配列を有し、「ｇＨＢＣ３４ｖ２３」の軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）は、配列番号５９に係るアミノ酸配列を有する。

【0144】

特に好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片はｇＨＢＣ３４ｖ３１であり、特に、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片はＨＢＣ３４ｖ３１である。

【0145】

本発明者らは、本発明に係る更なるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を同定した。これを本明細書ではＨＢＣ３４ｖ３１（実施例１２を参照）と称する。この抗体ＨＢＣ３４ｖ３１、特に、ＨＢＣ３４ｖ３１のＶＨ及びＶＬ遺伝子に基づいて、用語「ｇＨＢＣ３４ｖ３１」とは、本明細書で使用するとき、それぞれの「ジェネリック」抗体又はその抗原結合断片を指す。即ち、「ｇＨＢＣ３４ｖ３１」とは、配列番号３４に係るＣＤＲＨ１アミノ酸配列、配列番号３５又は６６に係るＣＤＲＨ２アミノ酸配列、配列番号３６に係るＣＤＲＨ３アミノ酸配列、配列番号３７に係るＣＤＲＬ１アミノ酸配列、配列番号３８又は３９に係るＣＤＲＬ２アミノ酸配列、及び配列番号４０に係るＣＤＲＬ３アミノ酸配列を有する抗体又はその抗原結合断片を指す。「ｇＨＢＣ３４ｖ３１」の重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）は、配列番号６７に係るアミノ酸配列を有し、「ｇＨＢＣ３４ｖ３１」の軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）は、配列番号４２に係るアミノ酸配列を有する。

【0146】

特に好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片はｇＨＢＣ３４ｖ３２であり、特に、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片はＨＢＣ３４ｖ３２である。

【0147】

本発明者らは、本発明に係る更なるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を同定した。これを本明細書ではＨＢＣ３４ｖ３２（実施例１２を参照）と称する。この抗体ＨＢＣ３４ｖ３２、特に、ＨＢＣ３４ｖ３２のＶＨ及びＶＬ遺伝子に基づいて、用語「ｇＨＢＣ３４ｖ３２」とは、本明細書で使用するとき、それぞれの「ジェネリック」抗体又はその抗原結合断片を指す。即ち、「ｇＨＢＣ３４ｖ３２」とは、配列番号３４に係るＣＤＲＨ１アミノ酸配列、配列番号３５又は６６に係るＣＤＲＨ２アミノ酸配列、配列番号３６に係るＣＤＲＨ３アミノ酸配列、配列番号３７に係るＣＤＲＬ１アミノ酸配列、配列番号３８又は３９に係るＣＤＲＬ２アミノ酸配列、及び配列番号４０に係るＣＤＲＬ３アミノ酸配列を有する抗体又はその抗原結合断片を指す。「ｇＨＢＣ３４ｖ３２」の重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）は、配列番号６７に係るアミノ酸配列を有し、「ｇＨＢＣ３４ｖ３２」の軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）は、配列番号５９に係るアミノ酸配列を有する。

【0148】

特に好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片はｇＨＢＣ３４ｖ３３であり、特に、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片はＨＢＣ３４ｖ３３である。

【0149】

本発明者らは、本発明に係る更なるモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を同定した。これを本明細書ではＨＢＣ３４ｖ３３（実施例１２を参照）と称する。この抗体ＨＢＣ３４ｖ３３、特に、ＨＢＣ３４ｖ３３のＶＨ及びＶＬ遺伝子に基づいて、用語「ｇＨＢＣ３４ｖ３３」とは、本明細書で使用するとき、それぞれの「ジェネリック」抗体又はその抗原結合断片を指す。即ち、「ｇＨＢＣ３４ｖ３３」とは、配列番号３４に係るＣＤＲＨ１アミノ酸配列、配列番号３５又は６６に係るＣＤＲＨ２アミノ酸配列、配列番号３６に係るＣＤＲＨ３アミノ酸配列、配列番号３７に係るＣＤＲＬ１アミノ酸配列、配列番号３８又は３９に係るＣＤＲＬ２アミノ酸配列、及び配列番号４０に係るＣＤＲＬ３アミノ酸配列を有する抗体又はその抗原結合断片を指す。「ｇＨＢＣ３４ｖ３３」の重鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）は、配列番号６７に係るアミノ酸配列を有し、「ｇＨＢＣ３４ｖ３３」の軽鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）は、配列番号６５に係るアミノ酸配列を有する。

【0150】

好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、ヒト抗体、モノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体、精製抗体、単鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、又はｓｃＦｖである。

【0151】

したがって、本発明の抗体は、ヒト抗体、モノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体、組み換え抗体、又は精製抗体であってよい。また、本発明は、本発明の抗体の断片、特に、抗体の抗原結合活性を保持している断片を提供する。かかる断片としては、単鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、又はｓｃＦｖが挙げられるが、これらに限定されない。

【0152】

本発明の抗体の断片は、酵素、例えばペプシン又はパパインによる切断を含む方法によって、及び／又は化学還元によりジスルフィド結合を切断することによって、前記抗体から得ることができる。或いは、抗体の断片は、重鎖又は軽鎖の配列の一部のクローニング及び発現によって得ることができる。抗体「断片」は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片を含む。また、本発明は、本発明の抗体の重鎖及び軽鎖に由来する単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）を包含する。例えば、本発明は、本発明の抗体由来のＣＤＲを含むｓｃＦｖを含む。また、重鎖又は軽鎖の単量体及び二量体、単一ドメイン重鎖抗体、単一ドメイン軽鎖抗体に加えて、単鎖抗体、例えば、重鎖及び軽鎖の可変ドメインがペプチドリンカーによって結合されている単鎖Ｆｖも含まれる。

【0153】

本発明の抗体断片は、一価又は多価相互作用を付与し得、上記様々な構造に含有され得る。例えば、ｓｃＦｖ分子を合成して、三価「トリアボディ」又は四価「テトラボディ」を作製することができる。ｓｃＦｖ分子は、Ｆｃ領域のドメインを含んでいてよく、その結果、二価ミニボディが得られる。更に、本発明の配列は、本発明の配列が本発明のエピトープを標的とし、分子の他の領域が他の標的に結合する多重特異的分子の成分であってもよい。例示的な分子としては、二重特異的Ｆａｂ２、三重特異的Ｆａｂ３、二重特異的ｓｃＦｖ、及びダイアボディが挙げられるが、これらに限定されない（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１１２６－１１３６）。

【0154】

別の態様では、本発明は、医薬として使用するための、本明細書に記載される本発明に係る抗体又はその抗原結合断片を提供する。好ましくは、本明細書に記載される本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、Ｂ型肝炎及び／又はＤ型肝炎の予防、治療、又は軽減において使用するためのものである。この態様の詳細な説明は、以下の「医学的処置及び使用」及び本発明の医薬組成物の説明において提供される。

【0155】

核酸分子
別の態様では、本発明は、また、上記本発明に係る抗体又はその抗原結合断片をコードしているポリヌクレオチドを含む核酸分子を提供する。核酸分子及び／又はポリヌクレオチドの例としては、例えば、組み換えポリヌクレオチド、ベクター、オリゴヌクレオチド、ＲＮＡ分子（例えば、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はｔＲＮＡ）又はＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ）が挙げられる。本発明の抗体の軽鎖、重鎖、及びＣＤＲの一部又は全てをコードしている核酸配列が好ましい。表２～８は、好ましくは本明細書に記載されるポリヌクレオチド／核酸配列によってコードされている本発明に係る例示的な抗体のＣＤＲ及びＶＨ及びＶＬのアミノ酸配列の配列番号を提供する。したがって、好ましくは、本発明の例示的な抗体の軽鎖及び重鎖、特にＶＨ及びＶＬ配列並びにＣＤＲの一部又は全てをコードしている核酸配列が本明細書に提供される。以下の表９は、本発明に係る例示的な抗体のＣＤＲ並びにＶＨ及びＶＬをコードしている核酸配列の配列番号を提供する。遺伝子コードの冗長性により、本発明は、これら核酸配列の配列変異体、特に、同じアミノ酸配列をコードしているかかる配列変異体も含む。

【0156】

核酸分子は、核酸成分を含む、好ましくはからなる分子である。核酸分子という用語は、好ましくは、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を指す。特に、用語「ポリヌクレオチド」と同義で用いられる。好ましくは、核酸分子は、糖／リン酸骨格のホスホジエステル結合によって互いに共有結合しているヌクレオチドモノマーを含むか又はからなるポリマーである。また、用語「核酸分子」は、修飾核酸分子、例えば、塩基修飾、糖修飾、又は骨格修飾されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子も包含する。

【表17-1】

【表17-2】

【表17-3】

【0157】

好ましくは、本発明に係る核酸分子の配列は、配列番号４３～５１のいずれか１つに係る核酸配列又はその機能性配列変異体を含むか又はからなる。また、本発明に係る核酸分子の配列は、配列番号４３～５１、６０～６４、及び６８～７８のいずれか１つに係る核酸配列を含むか又はからなることも好ましい。

【0158】

また、本発明に係る核酸配列は、本発明に係る（例示的な）抗体で使用されるＣＤＲ、ＶＨ配列及び／又はＶＬ配列をコードしている核酸配列、例えば、表９に示す配列に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の同一性を有する核酸配列を含むことも好ましい。したがって、ポリヌクレオチド配列が配列番号４３～５１のいずれか１つに係る核酸配列又はその機能性配列変異体を含むか又はからなる核酸分子が好ましい。ポリヌクレオチド配列が配列番号４３～５１、６０～６４、及び６８～７８のいずれかと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を共有する核酸配列を含むか又はからなる核酸分子も好ましい。より好ましくは、ポリヌクレオチド配列は、配列番号４３～５１、６０～６４、及び６８～７８のいずれか１つに係る核酸配列を含むか又はからなる。

【0159】

より好ましくは、ポリヌクレオチド配列は、配列番号７０～７８のいずれかと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、更により好ましくは少なくとも９５％、特に好ましくは少なくとも９８％又は９９％の配列同一性を共有する核酸配列を含むか又はからなる。配列番号７０～７８は、コドン最適化された核酸配列（表９を参照）である。特に好ましくは、ポリヌクレオチド配列は、配列番号７０～７８のいずれか１つに係る核酸配列を含むか又はからなる。

【0160】

一般に、核酸分子を操作して、特定の核酸配列を挿入、欠失、又は変更することができる。かかる操作による変化としては、制限酵素部位を導入する、コドン使用頻度を変更する、転写及び／又は翻訳調節配列を付加若しくは最適化する等の変化が挙げられるが、これらに限定されない。また、核酸を変化させて、コードされているアミノ酸を変更することも可能である。例えば、１以上の（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０等）のアミノ酸置換、欠失、又は挿入を抗体のアミノ酸配列に導入することが有用であり得る。かかる点突然変異は、エフェクタ機能、抗原結合親和性、翻訳後修飾、免疫原性等を変化させることができたり、共有結合基（例えば、標識）を結合させるためのアミノ酸を導入することができたり、（例えば、精製目的のための）タグを導入することができたりする。突然変異は、特異的部位に導入することもでき、ランダムに導入し、続いてセレクション（例えば、分子進化）することもできる。例えば、本発明の（例示的な）抗体のＣＤＲ領域、ＶＨ配列及び／又はＶＬ配列のいずれかをコードしている１以上の核酸をランダムに又は定向的に突然変異させて、コードされているアミノ酸に様々な性質を導入することができる。かかる変化は、初期変化が保持され、他のヌクレオチド位置に新たな変化が導入される反復プロセスの結果であり得る。更に、独立した工程で得られた変化を組み合わせてもよい。コードされているアミノ酸に導入される様々な性質としては、親和性の強化を挙げることができるが、これに限定されない。

【0161】

ベクター
本発明に係る核酸分子を含むベクター、例えば、発現ベクターも、本発明の範囲内に更に含まれる。好ましくは、ベクターは、上記核酸分子を含む。

【0162】

用語「ベクター」とは、核酸分子、好ましくは、組み換え核酸分子、即ち、自然界には存在しない核酸分子を指す。本発明におけるベクターは、所望の核酸配列を組み込むか又は保有させるのに好適である。かかるベクターは、ストレージベクター、発現ベクター、クローニングベクター、トランスファーベクター等であってよい。ストレージベクターは、核酸分子を便利に保管することができるベクターである。したがって、ベクターは、例えば、本発明にかかる所望の抗体又はその抗原断片に対応する配列を含み得る。発現ベクターは、例えばＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、又はペプチド、ポリペプチド、若しくはタンパク質等の発現産物を産生させるために使用することができる。例えば、発現ベクターは、プロモーター配列等のベクターの一続きの配列の転写に必要な配列を含んでいてよい。クローニングベクターは、典型的には、核酸配列をベクターに組み込むために用いることができるクローニングサイトを含むベクターである。クローニングベクターは、例えば、プラスミドベクター又はバクテリオファージベクターであってよい。トランスファーベクターは、細胞又は生物に核酸分子を移入するのに好適なベクター、例えば、ウイルスベクターであってよい。本発明におけるベクターは、例えば、ＲＮＡベクターであってもＤＮＡベクターであってもよい。好ましくは、ベクターは、ＤＮＡ分子である。例えば、本願におけるベクターは、クローニングサイト、選択マーカー（例えば、抗生物質耐性因子）、及びベクターの増殖に好適な配列（例えば、複製起点）を含む。好ましくは、本願におけるベクターは、プラスミドベクターである。

【0163】

細胞
更なる態様では、本発明は、本発明にかかる抗体又はその抗原結合断片を発現する及び／又は本発明にかかるベクターを含む細胞も提供する。

【0164】

かかる細胞の例としては、真核細胞、例えば、酵母細胞、動物細胞、又は植物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、細胞は、哺乳類細胞、より好ましくは、哺乳類細胞株である。好ましい例としては、ヒト細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、ＮＳ０細胞、ヒト肝細胞、例えば、Ｈｅｐａ ＲＧ細胞、骨髄腫細胞、又はハイブリドーマ細胞が挙げられる。

【0165】

特に、前記細胞に、本発明にかかるベクター、好ましくは発現ベクターをトランスフェクトしてよい。用語「トランスフェクション」とは、ＤＮＡ又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の分子等の核酸分子を細胞、好ましくは真核細胞に導入することを指す。本発明において、用語「トランスフェクション」は、核酸分子を細胞、好ましくは真核細胞、例えば哺乳類細胞に導入するための当業者に公知の任意の方法を含む。かかる方法は、例えば、エレクトロポレーション、（例えば、カチオン性脂質及び／又はリポソームに基づく）リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ナノ粒子に基づくトランスフェクション、ウイルスに基づくトランスフェクション、又はカチオン性ポリマー（例えば、ＤＥＡＥ－デキストラン又はポリエチレンイミン等）に基づくトランスフェクションを含む。好ましくは、導入は、非ウイルス的である。

【0166】

更に、例えば、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片を発現させるために、本発明の細胞に本発明に係るベクターを安定的に又は一過的にトランスフェクトしてよい。好ましくは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片をコードしている本発明に係るベクターを細胞に安定的にトランスフェクトする。或いは、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片をコードしている本発明に係るベクターを細胞に一過的にトランスフェクトすることも好ましい。

【0167】

抗体の任意の追加の特徴
本発明の抗体は、例えば、治療部位に送達するために薬物に結合させてもよく、対象となる細胞を含む部位のイメージングを容易にするために検出可能な標識に結合させてもよい。薬物及び検出可能な標識に抗体を結合させる方法は、検出可能な標識を使用するイメージング方法等、当技術分野において周知である。標識された抗体は、広範な標識を使用する広範なアッセイで使用することができる。本発明の抗体とＨＢｓＡｇ、特に、ＨＢｓＡｇの抗原性ループ領域における対象となるエピトープとの間の抗体－抗原複合体の形成の検出は、検出可能な物質を抗体に結合させることによって容易になり得る。好適な検出手段としては、放射性核種、酵素、補酵素、蛍光物質、化学発光物質、色素原、酵素物質又は補因子、酵素阻害剤、補欠分子族複合体、フリーラジカル、粒子、色素等の標識の使用が挙げられる。好適な酵素の例としては、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンステラーゼが挙げられ；好適な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが挙げられ；好適な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、又はフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例は、ルミノールであり；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが挙げられ；好適な放射活性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、又は３Ｈが挙げられる。かかる標識された試薬は、例えば、ラジオイムノアッセイ、酵素イムノアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、蛍光イムノアッセイ等の様々な周知のアッセイで使用することができる。したがって、本発明に係る標識された抗体は、例えば、米国特許第３，７６６，１６２号、同第３，７９１，９３２号、同第３，８１７，８３７号、及び同第４，２３３，４０２号に記載の通り、かかるアッセイにおいて使用することができる。

【0168】

本発明に係る抗体は、細胞毒、療法剤、又は放射性金属イオン若しくは放射性同位体等の治療部分にコンジュゲートさせることができる。放射性同位体の例としては、Ｉ－１３１、Ｉ－１２３、Ｉ－１２５、Ｙ－９０、Ｒｅ－１８８、Ｒｅ－１８６、Ａｔ－２１１、Ｃｕ－６７、Ｂｉ－２１２、Ｂｉ－２１３、Ｐｄ－１０９、Ｔｃ－９９、Ｉｎ－１１１等が挙げられるが、これらに限定されない。かかる抗体コンジュゲートは、所与の生物学的応答を調節するために用いることができ、薬物部分は、古典的な化学療法剤に限定されると解釈すべきではない。例えば、薬物部分は、所望の生物活性を有するタンパク質又はポリペプチドであってよい。かかるタンパク質としては、例えば、アブリン、リシンＡ、緑膿菌外毒素、又はジフテリア毒素等の毒素を挙げることができる。

【0169】

かかる治療部分を抗体にコンジュゲートさせる技術は、周知である。例えば、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｒｅｉｓｆｅｌｄ等編（Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）、ｐｐ．２４３－２５６におけるＡｒｎｏｎ等（１９８５）「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ等編（第２版；Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．）、ｐｐ．６２３－６５３におけるＨｅｌｌｓｔｒｏｍ等編（１９８７）「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ」；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ’８４：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｐｉｎｃｈｅｒａ等編、ｐｐ．４７５－５０６（Ｅｄｉｔｒｉｃｅ Ｋｕｒｔｉｓ，Ｍｉｌａｎｏ，Ｉｔａｌｙ，１９８５）におけるＴｈｏｒｐｅ（１９８５）「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ｂａｌｄｗｉｎ等編（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８５）、ｐｐ．３０３－３１６における「Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ」；及びＴｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９－１５８を参照。

【0170】

或いは、抗体又はその抗原結合断片は、二次抗体又はその抗体断片にコンジュゲートさせて、米国特許第４，６７６，９８０号に記載の通り抗体ヘテロコンジュゲートを形成することができる。更に、例えば米国特許第４，８３１，１７５号に記載の通り、標識と本発明の抗体との間にリンカーを使用してもよい。抗体又はその抗原結合断片は、放射性ヨウ素、インジウム、イットリウム、又は例えば米国特許第５，５９５，７２１号に記載の通り、当技術分野において公知の他の放射性粒子で直接標識し得る。治療は、例えば国際公開第００／５２０３１号、同第００／５２４７３号に記載の通り、同時に又は後で投与されるコンジュゲートした抗体及びコンジュゲートしていない抗体による治療との組合せからなっていてよい。

【0171】

また、本発明の抗体は、固体担持体に結合させてもよい。更に、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、例えば、その循環半減期を延長するために、共有結合によってポリマーにコンジュゲートさせることによって化学的に修飾してよい。ポリマー、及びそれをペプチドに結合させる方法の例は、米国特許第４，７６６，１０６号、同第４，１７９，３３７号、同第４，４９５，２８５号、及び同第４，６０９，５４６号に示されている。幾つかの実施形態では、ポリマーは、ポリオキシエチル化ポリオール及びポリエチレングリコール（ＰＥＧ）から選択され得る。ＰＥＧは、室温で水に可溶性であり、一般式：Ｒ（Ｏ－ＣＨ_２－ＣＨ_２）_ｎＯ－Ｒ（式中、Ｒは、水素、又はアルキル基若しくはアルカノール基等の保護基であってよい）を有する。好ましくは、保護基は、１個～８個の炭素を有し得る。例えば、保護基は、メチルである。記号ｎは、正の整数である。一実施形態では、ｎは、１～１，０００である。別の実施形態では、ｎは、２～５００である。好ましくは、ＰＥＧは、１，０００～４０，０００の平均分子量を有し、より好ましくは、ＰＥＧは、２，０００～２０，０００の分子量を有し、更により好ましくは、ＰＥＧは、３，０００～１２，０００の分子量を有する。更に、ＰＥＧは、少なくとも１つのヒドロキシ基を有し得、例えば、ＰＥＧは、末端ヒドロキシ基を有し得る。例えば、それは、活性化されて阻害剤の遊離アミノ基と反応する末端ヒドロキシ基である。しかし、本発明の共有結合によってコンジュゲートされたＰＥＧ／抗体を得るために、反応性基の種類及び量を変更してもよい。

【0172】

水溶性ポリオキシエチル化ポリオールも本発明において有用である。例えば、ポリオキシエチル化ソルビトール、ポリオキシエチル化グルコース、ポリオキシエチル化グリセロール（ＰＯＧ）等が挙げられる。一実施形態では、ＰＯＧが用いられる。任意の理論に縛られるものではないが、ポリオキシエチル化グリセロールのグリセロール骨格は、例えば、動物及びヒトにおいて、モノ－、ジ－、トリグリセリドに天然に存在するのと同じ骨格であるので、この分岐は、身体において必ずしも異物として認識される訳ではない。ＰＯＧは、ＰＥＧと同じ範囲の分子量を有し得る。循環半減期を延長するために用いることができる別の薬物送達系は、リポソームである。リポソーム送達系を調製する方法は、当業者に公知である。他の薬物送達系は、当技術分野において公知であり、例えば、Ｐｏｚｎａｎｓｋｙ ｅｔ ａｌ．（１９８０）及びＰｏｚｎａｎｓｋｙ（１９８４）に記載されている。

【0173】

本発明の抗体は、精製形態で提供され得る。典型的には、抗体は、他のポリペプチドを実質的に含まない組成物中に存在し、例えば、組成物の９０（重量）％未満、通常は６０％未満、より通常は５０％未満が他のポリペプチドで構成される。

【0174】

本発明の抗体は、非ヒト（又は異種）宿主、例えば、マウスにおいて免疫原性であり得る。特に、抗体は、非ヒト宿主において免疫原性であるが、ヒト宿主においては免疫原性でないイディオトープを有し得る。特に、ヒトで使用するための本発明の抗体は、マウス、ヤギ、ウサギ、ラット、非霊長類哺乳類等の宿主から容易に単離することができず、且つ一般にヒト化によってもゼノマウスからも得ることができないものが挙げられる。

【0175】

抗体の産生
本発明に係る抗体は、当技術分野において公知の任意の方法によって作製することができる。例えば、ハイブリドーマ技術を使用してモノクローナル抗体を作製するための一般的な方法論は、周知である（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ，．１９７５；Ｋｏｚｂａｒ ｅｔ ａｌ．１９８３）。一実施形態では、国際公開第２００４／０７６６７７号に記載されている別のＥＢＶ不死化法を使用する。

【0176】

好ましい方法は、国際公開第２００４／０７６６７７号に記載されている。この方法では、本発明の抗体を産生するＢ細胞を、ＥＢＶ及びポリクローナルＢ細胞活性化剤で形質転換する。任意で、効率を更に高めるために、細胞の成長及び分化の更なる刺激剤を形質転換工程中に添加してもよい。これら刺激剤は、ＩＬ－２及びＩＬ－１５等のサイトカインであってよい。一態様では、ＩＬ－２を不死化工程中に添加して、不死化効率を更に向上させるが、その使用は必須ではない。次いで、これら方法を用いて産生された不死化Ｂ細胞を、当技術分野において公知の方法及びそれから単離された抗体を用いて培養してよい。

【0177】

別の好ましい方法は、国際公開第２０１０／０４６７７５号に記載されている。この方法では、プラズマ細胞を限定数又は単一プラズマ細胞としてマイクロウェル培養皿で培養する。プラズマ細胞培養物から抗体を単離することができる。更に、プラズマ細胞培養物からＲＮＡを抽出することができ、当技術分野において公知の方法を使用してＰＣＲを実施することができる。抗体のＶＨ及びＶＬ領域をＲＴ－ＰＣＲ（逆転写酵素ＰＣＲ）によって増幅させ、配列を決定し、発現ベクターにクローニングし、次いで、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞又は他の宿主細胞にトランスフェクトすることができる。発現ベクターへの核酸のクローニング、宿主細胞のトランスフェクション、トランスフェクトされた宿主細胞の培養、及び産生された抗体の単離は、当業者に公知の任意の方法を使用して行うことができる。

【0178】

抗体は、必要に応じて、濾過、遠心分離、及び様々なクロマトグラフィー法、例えば、ＨＰＬＣ又はアフィニティクロマトグラフィーを用いて更に精製することができる。医薬品グレードの抗体を産生するための技術を含む抗体、例えば、モノクローナル抗体を精製する技術は、当技術分野において周知である。

【0179】

本発明の抗体の断片は、酵素、例えばペプシン又はパパインによる切断を含む方法によって、及び／又は化学還元によりジスルフィド結合を切断することによって前記抗体から得ることができる。或いは、抗体の断片は、重鎖又は軽鎖の配列の一部のクローニング及び発現によって得ることができる。抗体「断片」は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片を含む。また、本発明は、本発明の抗体の重鎖及び軽鎖に由来する単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）を包含する。例えば、本発明は、本発明の抗体由来のＣＤＲを含むｓｃＦｖを含む。また、重鎖又は軽鎖の単量体及び二量体、単一ドメイン重鎖抗体、単一ドメイン軽鎖抗体に加えて、単鎖抗体、例えば、重鎖及び軽鎖の可変ドメインがペプチドリンカーによって結合されている単鎖Ｆｖも含まれる。

【0180】

本発明の抗体断片は、一価又は多価相互作用を付与し得、上記様々な構造に含有され得る。例えば、ｓｃＦｖ分子を合成して、三価「トリアボディ」又は四価「テトラボディ」を作製することができる。ｓｃＦｖ分子は、Ｆｃ領域のドメインを含んでいてよく、その結果、二価ミニボディが生じる。更に、本発明の配列は、本発明の配列が本発明のエピトープを標的とし、分子の他の領域が他の標的に結合する多重特異的分子の成分であってよい。例示的な分子としては、二重特異的Ｆａｂ２、三重特異的Ｆａｂ３、二重特異的ｓｃＦｖ、及びダイアボディが挙げられるが、これらに限定されない（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９：１１２６－１１３６）。

【0181】

分子生物学の標準的な技術を用いて、本発明の抗体又は抗原断片をコードしているＤＮＡ配列を調製することができる。オリゴヌクレオチド合成技術を用いて所望のＤＮＡ配列を完全に又は部分的に合成することができる。部位特異的突然変異誘発及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を適宜使用してよい。

【0182】

任意の好適な宿主細胞／ベクター系を、本発明の抗体分子又はその断片をコードしているＤＮＡ配列を発現させるために用いることができる。一部では、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片等の抗体断片、特にＦｖ断片及び単鎖抗体断片、例えば単鎖Ｆｖを発現させるために細菌、例えば大腸菌及び他の微生物系を使用してよい。完全抗体分子を含むより大きな抗体分子を産生させるために、真核生物、例えば哺乳類の宿主細胞発現系を使用してよい。好適な哺乳類宿主細胞としては、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＮＳ０、骨髄腫、又はハイブリドーマ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。

【0183】

また、本発明は、本発明に係る抗体分子を産生させるプロセスであって、本発明の核酸をコードしているベクターを含む宿主細胞を、本発明の抗体分子をコードしているＤＮＡからタンパク質を発現させるのに好適な条件下で培養することと、前記抗体分子を単離することとを含むプロセスを提供する。

【0184】

抗体分子は、重鎖又は軽鎖ポリペプチドのみを含んでいてもよく、この場合、宿主細胞にトランスフェクトするために重鎖又は軽鎖ポリペプチドをコードしている配列のみを使用する必要がある。重鎖及び軽鎖の両方を含む産物を産生させる場合、第１のベクターが軽鎖ポリペプチドをコードしており、第２のベクターが重鎖ポリペプチドをコードしている２つのベクターを細胞株にトランスフェクトしてよい。或いは、軽鎖及び重鎖のポリペプチドをコードしている配列を含む単一のベクターを使用してもよい。或いは、本発明に係る抗体は、（ｉ）例えば、本発明に係るベクターを使用することによって、宿主細胞で本発明に係る核酸配列を発現させ、（ｉｉ）発現した抗体産物を単離することによって産生され得る。更に、前記方法は、（ｉｉｉ）単離抗体を精製することを含み得る。形質転換されたＢ細胞及び培養したプラズマ細胞を、所望の特異性又は機能の抗体を産生するものについてスクリーニングしてよい。

【0185】

スクリーニング工程は、任意のイムノアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡによって、組織若しくは細胞（トランスフェクトされた細胞を含む）を染色することによって、中和アッセイによって、又は所望の特異性若しくは機能を同定するための当技術分野において公知の多数の他の方法のうちの１つによって実施してよい。アッセイでは、１以上の抗原の単純な認識に基づいて選択することもでき、更に所望の機能に基づいて選択して、例えば、単なる抗原結合抗体ではなく中和抗体を選択したり、標的細胞の特徴（例えば、そのシグナル伝達カスケード、形状、成長速度、他の細胞に影響を与える能力、他の細胞又は他の試薬又は条件の変化による影響に対する応答、分化状態等）を変化させることができる抗体を選択したりすることもできる。

【0186】

次いで、陽性形質転換Ｂ細胞培養物から個々の形質転換Ｂ細胞クローンが産生され得る。陽性細胞の混合物から個々のクローンを分離するためのクローニング工程は、限界希釈、マイクロマニピュレーション、セルソーティングによる単一細胞沈着、又は当技術分野において公知の別の方法を使用して実施することができる。

【0187】

当技術分野において公知の方法を用いて、培養プラズマ細胞から核酸を単離し、クローニングし、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞又は他の公知の宿主細胞で発現させることができる。

【0188】

本発明の不死化Ｂ細胞クローン又はトランスフェクトされた宿主細胞は、例えば、モノクローナル抗体源として、対象となるモノクローナル抗体をコードしている核酸（ＤＮＡ又はｍＲＮＡ）源として、研究のため等、様々な方法で使用することができる。

【0189】

また、本発明は、本発明に係る抗体を産生する不死化記憶Ｂ細胞又はトランスフェクトされた宿主細胞を含む組成物を提供する。

【0190】

本発明の不死化Ｂ細胞クローン又は培養プラズマ細胞は、後で組み換え発現させるために抗体遺伝子をクローニングするための核酸源として使用することもできる。例えば、安定性、再現性、培養の容易さ等の理由から、Ｂ細胞又はハイブリドーマから発現させるよりも、組み換え源から発現させる方が医薬目的では一般的である。

【0191】

したがって、本発明は、また、組み換え細胞を調製する方法であって、（ｉ）対象となる抗体をコードしているＢ細胞クローン又は培養プラズマ細胞から１以上の核酸（例えば、重鎖及び／又は軽鎖ｍＲＮＡ）を得る工程と、（ｉｉ）前記核酸を発現ベクターに挿入する工程と、（ｉｉｉ）宿主細胞において対象となる抗体を発現させるために、前記ベクターを宿主細胞にトランスフェクトする工程とを含む方法を提供する。

【0192】

同様に、本発明は、組み換え細胞を調製する方法であって、（ｉ）対象となる抗体をコードしているＢ細胞クローン又は培養プラズマ細胞から核酸の配列を決定する工程と、（ｉｉ）工程（ｉ）で得られた配列情報を使用して、宿主細胞において対象となる抗体を発現させるために、前記宿主細胞に挿入するための核酸を調製する工程とを含む方法を提供する。工程（ｉ）と（ｉｉ）との間に、制限酵素部位を導入する、コドンの使用頻度を変更する、及び／又は転写及び／又は翻訳調節配列を最適化するために前記核酸を操作してもよいが、必須ではない。

【0193】

更に、本発明は、また、トランスフェクトされた宿主細胞を調製する方法であって、対象となる抗体をコードしている１以上の核酸を宿主細胞にトランスフェクトする工程を含み、前記核酸が、本発明の不死化Ｂ細胞クローン又は培養プラズマ細胞に由来する核酸である方法も提供する。したがって、まず核酸を調製し、次いで、それを使用して宿主細胞をトランスフェクトする手順は、異なる場所（例えば、異なる国）で異なる人々によって異なる時点で実施することができる。

【0194】

次いで、本発明のこれら組み換え細胞を発現及び培養目的のために使用することができる。前記組み換え細胞は、大規模に医薬品を生産するために抗体を発現させるのに特に有用である。また、前記組み換え細胞は、医薬組成物の活性成分として用いることもできる。静置培養、ローラーボトル培養、腹水液、中空繊維型バイオリアクタカートリッジ、モジュラーミニ発酵槽、撹拌槽、微粒子担体培養、セラミックコア灌流等が挙げられるがこれらに限定されない任意の好適な培養技術を使用することができる。

【0195】

Ｂ細胞又はプラズマ細胞から免疫グロブリン遺伝子を得、配列を決定する方法は、当技術分野において周知である（例えば、Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第４版、２０００年の第４章）。

【0196】

トランスフェクトされた宿主細胞は、酵母及び動物細胞を含む真核細胞、特に、哺乳類細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ヒト細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６又はＨＫＢ－１１細胞）、骨髄腫細胞、又はヒト肝細胞（例えば、Ｈｅｐａ ＲＧ））に加えて、植物細胞であってよく、哺乳類細胞が好ましい。好ましい発現宿主は、特にそれ自体ヒトにおいて免疫原性ではない炭水化物構造で本発明の抗体をグリコシル価することができる。一実施形態では、トランスフェクトされた宿主細胞は、無血清培地において増殖することができる。更なる実施形態では、トランスフェクトされた宿主細胞は、動物由来の生成物が存在しなくても培養物中で増殖することができる。また、トランスフェクトされた宿主細胞を培養して、細胞株を得ることもできる。

【0197】

また、本発明は、対象となる抗体をコードしている１以上の核酸分子（例えば、重鎖及び軽鎖遺伝子）を調製する方法であって、（ｉ）不死化Ｂ細胞クローンを調製するか又は本発明に係るプラズマ細胞を培養する工程と、（ｉｉ）対象となる抗体をコードしている核酸を、Ｂ細胞クローン又は培養プラズマ細胞から得る工程とを含む方法を提供する。更に、本発明は、対象となる抗体をコードしている核酸配列を得る方法であって、（ｉ）不死化Ｂ細胞クローンを調製するか又は本発明に係るプラズマ細胞を培養する工程と、（ｉｉ）対象となる抗体をコードしているＢ細胞クローン又は培養プラズマ細胞から得られた核酸の配列を決定する工程とを含む方法を提供する。

【0198】

本発明は、更に、対象となる抗体をコードしている核酸分子を調製する方法であって、本発明の形質転換Ｂ細胞クローン又は培養プラズマ細胞から得られた核酸を得る工程を含む方法を提供する。したがって、先ずＢ細胞クローン又は培養プラズマ細胞を得、次いで、前記Ｂ細胞クローン又は前記培養プラズマ細胞から核酸を得るための手順は、異なる場所（例えば、異なる国）で異なる人々によって異なる時点で実施することができる。

【0199】

また、本発明は、本発明に係る（例えば、製薬に使用するための）抗体を調製する方法であって、（ｉ）対象となる抗体を発現する選択されたＢ細胞クローン又は培養プラズマ細胞から１以上の核酸（例えば、重鎖及び軽鎖の遺伝子）を得る及び／又は配列を決定する工程と；（ｉｉ）前記核酸配列を発現ベクターに挿入するか又は前記核酸配列を使用して発現ベクターを調製する工程と；（ｉｉｉ）対象となる抗体を発現することができる宿主細胞にトランスフェクトする工程と；（ｉｖ）トランスフェクトされた宿主細胞を、前記対象となる抗体が発現する条件下で培養又は継代培養する工程と；任意で、（ｖ）前記対象となる抗体を精製する工程とを含む方法を含む。

【0200】

また、本発明は、トランスフェクトされた宿主細胞集団、例えば、安定的にトランスフェクトされた宿主細胞集団を、対象となる抗体が発現する条件下で培養又は継代培養する工程と；任意で、前記対象となる抗体を精製する工程とを含む、抗体を調製する方法であって、前記トランスフェクトされた宿主細胞集団が、（ｉ）上記の通り調製したＢ細胞クローン又は培養プラズマ細胞によって産生される、選択された対象となる抗体をコードしている核酸を提供し、（ｉｉ）前記核酸を発現ベクターに挿入し、（ｉｉｉ）前記対象となる抗体を発現することができる宿主細胞に前記ベクターをトランスフェクトし、（ｉｖ）挿入された核酸を含むトランスフェクトされた宿主細胞を培養又は継代培養して、前記対象となる抗体を産生させることによって調製される方法を提供する。したがって、先ず組み換え宿主細胞を調製し、次いで、それを培養して抗体を発現させるための手順は、異なる場所（例えば、異なる国）で異なる人々によって異なる時点で実施することができる。

【0201】

医薬組成物
また、本発明は、
（ｉ）本発明に係る抗体若しくはその抗原結合断片；
（ｉｉ）本発明に係る抗体若しくは抗体断片をコードしている核酸；
（ｉｉｉ）本発明に係る核酸を含むベクター；又は
（ｉｖ）本発明に係る抗体を発現するか若しくは本発明に係るベクターを含む細胞
のうちの１以上を含む医薬組成物を提供する。

【0202】

言い換えれば、本発明は、また、本発明に係る抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、及び／又は本発明に係る細胞を提供する。

【0203】

医薬組成物は、好ましくは、薬学的に許容し得る担体、希釈剤、及び／又は賦形剤を含有していてもよい。担体又は賦形剤は投与を容易にすることができるが、それ自体が、組成物を摂取する個体にとって有害な抗体の産生を誘導してはならない。また、毒性であってもならない。好適な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、高分子アミノ酸、アミノ酸コポリマー、及び不活性ウイルス粒子等の、大きく、ゆっくりと代謝される巨大分子であってよい。一般的に、本発明に係る医薬組成物中の薬学的に許容し得る担体は、活性成分であっても不活性成分であってもよい。好ましくは、本発明に係る医薬組成物中の薬学的に許容し得る担体は、Ｂ型又はＤ型肝炎に関して活性成分ではない。

【0204】

薬学的に許容し得る塩、例えば、鉱酸塩（例えば、塩酸塩、臭化水素塩、リン酸塩、及び硫酸塩）又は有機酸の塩（例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、及び安息香酸塩）を用いてもよい。

【0205】

医薬組成物中の薬学的に許容し得る担体は、水、生理食塩水、グリセロール、及びエタノール等の液体を更に含有していてもよい。更に、湿潤剤若しくは乳化剤等の補助物質、又はｐＨ緩衝物質がかかる組成物中に存在していてもよい。かかる担体によって、被験体に服用させるために、医薬組成物を錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、及び懸濁剤として製剤化することができるようになる。

【0206】

本発明の医薬組成物は、様々な形態で調製することができる。例えば、前記組成物は、液体溶液又は懸濁液のいずれかとして、注射液として調製してよい。注射する前に液体ビヒクルの溶液又は懸濁液にするのに好適な固体形態を調製してもよい（例えば、保存剤を含有する滅菌水で再構成するための、Ｓｙｎａｇｉｓ（商標）及びＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）と同様の凍結乾燥組成物）。前記組成物は、例えば軟膏剤、クリーム剤、又は粉剤として、局所投与用に調製してもよい。前記組成物は、例えば錠剤若しくはカプセル剤として、噴霧剤として、又はシロップ剤として（任意で、風味付けされる）経口投与用に調製してもよい。前記組成物は、例えば微粉末又はスプレーを用いる吸入器として、肺内投与用に調製してもよい。前記組成物は、坐剤又は膣坐剤として調製してもよい。前記組成物は、例えば点眼剤として、鼻腔内、耳内、又は眼内投与用に調製してもよい。前記組成物は、被験体に投与する直前に複合組成物が再構成されるように設計されたキット形態であってもよい。例えば、凍結乾燥した抗体を、滅菌水又は滅菌バッファと共にキット形態で提供してよい。

【0207】

前記組成物中の活性成分は、抗体分子、抗体断片、又はこれらの変異体及び誘導体であることが好ましく、特に、前記組成物中の活性成分は、本発明に係る抗体、抗体断片、又はこれらの変異体及び誘導体である。したがって、消化管において分解されやすい。したがって、前記組成物が消化管を使用する経路によって投与される場合、前記組成物は、前記抗体を分解から保護するが、一旦消化管から吸収されたら前記抗体を放出させる剤を含有していてよい。

【0208】

薬学的に許容し得る担体についての詳細な検討は、Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，ＩＳＢＮ：０６８３３０６４７２から入手可能である。

【0209】

本発明の医薬組成物は、一般的に、５．５～８．５のｐＨを有し、幾つかの実施形態では、これは、６～８であり、他の実施形態では、約７である。ｐＨは、バッファを使用することによって維持することができる。前記組成物は、無菌及び／又はパイロジェンフリーであってよい。前記組成物は、ヒトに対して等張であってよい。一実施形態では、本発明の医薬組成物は、密封容器で提供される。

【0210】

幾つかの投与形態で存在する組成物が、本発明の範囲内であり、前記形態としては、例えば、ボーラス注射又は持続点滴等の注射又は点滴による非経口投与に好適な形態が挙げられるが、これらに限定されない。製品が注射又は注入用である場合、油性又は水性のビヒクルの懸濁液、溶液、又はエマルションの形態をとってもよく、懸濁化剤、保存剤、安定剤、及び／又は分散剤等の調合剤を含有していてもよい。或いは、抗体分子は、適切な無菌液体を用いて使用前に再構成するために乾燥形態であってもよい。ビヒクルは、典型的には、薬学的活性化合物等の化合物、特に、本発明に係る抗体を保存、輸送、及び投与するのに好適な物質であると理解される。例えば、ビヒクルは、薬学的活性化合物、特に、本発明に係る抗体を保存、輸送、及び／又は投与するのに好適な生理学的に許容し得る液体であってよい。製剤化すると、本発明の組成物を被験体に直接投与することができる。一実施形態では、前記組成物は、哺乳類、例えば、ヒト被験体への投与に適応する。

【0211】

本発明の医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、腹腔内、髄腔内、脳室内、経皮、経皮、局所、皮下、鼻腔内、経腸、舌下、膣内、又は直腸内経路が挙げられるがこれらに限定されない、任意の数の経路によって投与することができる。また、皮下噴射器を用いて、本発明の医薬組成物を投与してもよい。好ましくは、医薬組成物は、例えば錠剤、カプセル剤等として経口投与用に、局所投与用に、又は例えば液体溶液又は懸濁液等の注射剤として調製することができ、前記医薬組成物は、注射剤であることが特に好ましい。注射前に液体ビヒクルの溶液又は懸濁液にするのに好適な固体形態も好ましく、例えば、医薬組成物は凍結乾燥形態である。

【0212】

静脈内、皮膚、若しくは皮下への注射、又は罹患部位への注射等の注射については、活性成分は、好ましくは、パイロジェンフリーであり且つ好適なｐＨ、等張性、及び安定性を有する非経口的に許容し得る水溶液の形態である。当業者は、例えば、生食注射、リンゲル液、乳酸加リンゲル液等の等張ビヒクルを用いて好適な溶液をうまく調製することができる。必要に応じて、保存剤、安定剤、緩衝剤、抗酸化剤、及び／又は他の添加剤が含まれていてもよい。個体に投与されるのが本発明に係るポリペプチドであろうと、ペプチドであろうと、核酸分子であろうと、他の薬学的に有用な化合物であろうと、個体に対して効果を示すのに十分な「予防的に有効な量」又は「治療的に有効な量」（場合による）が投与されることが好ましい。実際に投与される量、並びに投与の速度及び時間推移は、処置されるものの性質及び重篤度に依存する。注射の場合、本発明に係る医薬組成物を、例えばプレフィルドシリンジで提供してよい。

【0213】

上に定義された本発明の医薬組成物は、カプセル剤、錠剤、水性懸濁剤、又は液剤が挙げられるがこれらに限定されない任意の経口的に許容し得る剤形で経口投与してよい。経口使用するための錠剤の場合、一般的に使用される担体としては、ラクトース及びコーンスターチが挙げられる。ステアリン酸マグネシウム等の滑沢剤も典型的に添加される。カプセル形態で経口投与する場合、有用な希釈剤としては、ラクトース及び乾燥コーンスターチが挙げられる。経口使用のために水性懸濁剤が必要な場合、活性成分、即ち、上に定義された本発明のトランスポータ－カーゴコンジュゲート分子を乳化剤及び懸濁化剤と合わせる。必要に応じて、特定の甘味剤、着香剤、又は着色剤を添加してもよい。

【0214】

また、特に、治療の標的が、例えば皮膚又は任意の他のアクセス可能な上皮組織の疾患を含む、局所適用によって容易にアクセス可能な領域又は器官を含むとき、本発明の医薬組成物を局所的に投与してもよい。これら領域又は器官のそれぞれに好適な局所製剤が容易に調製される。局所適用の場合、本発明の医薬組成物は、１以上の担体に懸濁又は溶解している本発明の医薬組成物、特に、上に定義されたその成分を含有する好適な軟膏剤に製剤化してよい。局所投与用の担体としては、鉱油、流動ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックス及び水が挙げられるが、これらに限定されない。或いは、本発明の医薬組成物は、好適なローション又はクリームに製剤化することもできる。本発明において、好適な担体としては、鉱油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリールアルコール、２－オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、及び水が挙げられるが、これらに限定されない。

【0215】

投薬治療は、単回投与スケジュールであっても複数回投与スケジュールであってもよく、本発明では、複数回投与スケジュールが好ましい。公知の抗体ベース医薬、特に、抗ＨＢＶベース医薬、例えば、Ｈｅｐａｔｅｃｔ（登録商標）ＣＰは、特に様々な適応症に関する投与頻度に関する指針、例えば、医薬を毎日、毎週、毎月投与すべきかどうか等を提供する。また、頻度及び投薬量は、症状の重篤度にも依存し得る。

【0216】

例えば、本発明に係る医薬組成物は、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、若しくは２１日間、又はそれ以上の期間に亘って毎日、例えば、１日間当たり１回又は数回、例えば、１日間当たり１回、２回、３回、又は４回、好ましくは、１日間当たり１回又は２回、より好ましくは、１日間当たり１回、例えば、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間の期間に亘って毎日投与してよい。好ましくは、本発明に係る医薬組成物は、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間、若しくは２１週間、又はそれ以上の期間の期間に亘って毎週、例えば、１週間当たり１回又は２回、例えば、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、若しくは１２ヶ月間の期間の期間に亘って毎週、又は２年間、３年間、４年間、若しくは５年間の期間の期間に亘って毎週投与してよい。更に、本発明に係る医薬組成物は、好ましくは、１年間、２年間、３年間、４年間、若しくは５年間、又はそれ以上の期間の期間に亘って毎月、例えば、１ヶ月間当たり１回、又はより好ましくは２ヶ月間毎に投与してよい。投与の好ましいエンドポイントは、セロコンバーションに達したときであり、好ましくは、治療のエンドポイントは、抗ＨＢＶ抗体へのセロコンバーションを伴う、ＨＢｓＡｇの血清からの永続的消失である。また、生涯投与を継続することも好ましい。更に、特に特定の適応症に関しては、例えば、非免疫被験体における偶発的曝露の場合にＢ型肝炎を予防するために１回だけ投与することも企図される。

【0217】

特に、単一用量、例えば、日用量、用量、又は月用量、好ましくは週用量については、本発明に係る医薬組成物中の抗体又はその抗原結合断片の量は、１ｇを超えない、好ましくは５００ｍｇを超えない、より好ましくは２５０ｍｇを超えない、更により好ましくは、１００ｍｇを超えない、特に好ましくは５０ｍｇを超えないことが好ましい。

【0218】

医薬組成物は、典型的には、本発明の１以上の抗体を「有効」量、即ち、所望の疾患若しくは状態を治療、寛解、軽減、若しくは予防するか、又は検出可能な治療効果を呈するのに十分な量含む。治療効果は、病原性効力又は身体症状を低減又は軽減することも含む。任意の特定の被験体についての正確な有効量は、前記被験体の身長、体重、及び健康、状態の性質及び程度、並びに投与のために選択された治療法又は治療法の組合せに依存する。所与の状況についての有効量は、ルーチンな実験によって決定され、臨床医の判断の範囲内である。本発明の目的のために、本発明の抗体の有効量（例えば、医薬組成物中の抗体の量）は、一般的に、投与される個体の体重（例えば、ｋｇ）に関連して、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．００７５ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、更により好ましくは、約０．０２ｍｇ／ｋｇ～約５ｍｇ／ｋｇである。

【0219】

例えば、Ｂ型肝炎誘発性肝不全に起因する肝臓移植の状況では、本発明に係る医薬組成物中の抗体又はその抗原結合断片の量は、移植日の単一用量については、好ましくは５０ｍｇを超えず、より好ましくは１０ｍｇ以下であってよく、次いで、周術期には、７日間に亘って１日間当たり１０ｍｇ～５０ｍｇ以下、好ましくは、２ｍｇ～１０ｍｇ以下であってよく、そして、抗ＨＢ血清レベルを約１００ＩＵ／Ｌで維持するために１ヶ月間～３ヶ月間毎に投与される単一用量当たり、１０ｍｇ～５０ｍｇ以下、好ましくは、２ｍｇ～１０ｍｇ以下であってよい。

【0220】

慢性Ｂ型肝炎の治療の場合、例えば、本発明に係る抗体若しくはその抗原結合断片、又は医薬組成物は、好ましくは皮下に投与され、単一用量は、本発明に係る抗体５００ｍｇ以下、好ましくは２５０ｍｇ以下、より好ましくは１００ｍｇ以下である。かかる単一用量は、上記の通り、毎日、毎週、又は毎月投与してよい。

【0221】

更に、本発明に係る医薬組成物は、更なる抗体であってよい追加の活性成分又は抗体ではない成分を含んでいてもよい。追加の活性成分は、好ましくは、ポリメラーゼ阻害剤、インターフェロン及び／又はチェックポイント阻害剤から選択される。好ましいポリメラーゼ阻害剤としては、ラミブジン、アデホビル、エンテカビル、テルビブジン、及びテノホビルが挙げられる。ポリメラーゼ阻害剤は、ＤＮＡのプラス鎖の逆転写及び合成を抑制する。ポリメラーゼ阻害剤は、ウイルスの拡散、ｃｃｃＤＮＡの形成を予防せず、ＨＢｓＡｇの放出に影響を与えない。インターフェロンとしては、ＩＦＮアルファ及びＩＦＮベータ、ＩＦＮベータが好ましい。好ましいチェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１及び／又はＣＴＬＡ４のブロックを目的とし、したがって、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、及び抗ＣＴＬＡ４抗体を含む。本発明に係る医薬組成物は、追加の活性成分のうちの１以上を含み得る。

【0222】

本発明に係る抗体又は抗原結合断片は、追加の活性成分と同じ医薬組成物中に存在していてもよく、又は好ましくは、本発明に係る抗体又は抗原結合断片は、第１の医薬組成物に含まれ、追加の活性成分は、第１の医薬組成物とは異なる第２の医薬組成物に含まれる。したがって、１超の追加の活性成分が企図される場合、各追加の活性成分と本発明に係る抗体又は抗原結合断片とは、好ましくは、異なる医薬組成物に含まれる。かかる異なる医薬組成物は、合わせて／同時に、又は別々の時点で若しくは別々の箇所（例えば、身体の別々の部分）に投与してよい。

【0223】

好ましくは、本発明に係る抗体又は抗原結合断片と追加の活性成分とは、相加的治療効果、又は好ましくは相乗的治療効果を提供する。用語「相乗作用」とは、２以上の活性剤の併用効果が、各活性剤の個々の効果の合計よりも大きいことを説明するために用いられる。したがって、２以上の剤の併用効果によって活性又はプロセスの「相乗的阻害」が生じる場合、前記活性又はプロセスの阻害が、各活性剤の阻害効果の合計よりも大きいことを意図する。用語「相乗的治療効果」とは、（多数のパラメータのうちのいずれかによって測定される）治療効果が、それぞれの個々の治療で観察される個々の治療効果の合計よりも大きい、２以上の治療の組合せで観察される治療効果を指す。

【0224】

ｇＨＣＢ３４に係る抗体又はその抗原結合断片と薬学的に許容し得る担体とを含む医薬組成物が好ましい。

【0225】

一実施形態では、本発明の組成物は、本発明の抗体を含んでいてよく、前記抗体は、前記組成物中の全タンパク質の少なくとも５０重量％（例えば、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上）を構成し得る。かかる組成物では、抗体は、好ましくは、精製形態である。

【0226】

また、本発明は、医薬組成物を調製する方法であって、（ｉ）本発明の抗体を調製する工程と、（ｉｉ）精製抗体を１以上の薬学的に許容し得る担体と混合する工程とを含む方法を提供する。

【0227】

別の実施形態では、医薬組成物を調製する方法は、抗体を１以上の薬学的に許容し得る担体と混合する工程を含み、前記抗体は、本発明の形質転換Ｂ細胞又は培養プラズマ細胞から得られたモノクローナル抗体である。

【0228】

治療目的のために抗体又はＢ細胞を送達する代りに、Ｂ細胞又は培養プラズマ細胞に由来する対象となるモノクローナル抗体（又はその活性断片）をコードしている核酸（典型的には、ＤＮＡ）を被験体に送達することもでき、その結果、前記核酸は、被験体においてインサイチュで発現して所望の治療効果を提供することができる。好適な遺伝子療法及び核酸送達ベクターは、当技術分野において公知である。

【0229】

医薬組成物は、特に複数回投与フォーマットにパッケージ化されている場合、抗微生物剤を含んでいてよい。前記医薬組成物は、洗浄剤、例えばＴｗｅｅｎ８０等のＴｗｅｅｎ（ポリソルベート）を含んでいてよい。洗浄剤は、一般的に、低濃度、例えば、０．０１％未満で存在する。また、組成物は、等張にするためにナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム）を含んでいてもよい。例えば、１０±２ｍｇ／ｍＬのＮａＣｌ濃度が典型的である。

【0230】

更に、医薬組成物は、特に、凍結乾燥される場合又は凍結乾燥物質から再構成された物質を含む場合、例えば、約１５ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬ（例えば、２５ｍｇ／ｍＬ）の糖アルコール（例えば、マンニトール）又は二糖（例えば、スクロース又はトレハロース）を含んでいてよい。凍結乾燥用組成物のｐＨは、凍結乾燥前に５～８、又は５．５～７、又は約６．１に調整してよい。

【0231】

また、本発明の組成物は、１以上の免疫調節剤を含んでいてもよい。一実施形態では、免疫調節剤のうちの１以上は、アジュバントを含む。

【0232】

医学的処置及び使用
更なる態様では、本発明は、（ｉ）Ｂ型肝炎及び／又はＤ型肝炎の予防、治療、若しくは軽減、又は（ｉｉ）Ｂ型肝炎及び／又はＤ型肝炎の診断における、本発明に係る抗体若しくはその抗原結合断片、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物の使用を提供する。

【0233】

医薬組成物に関して上に記載した通り、抗体若しくはその抗原結合断片、核酸、ベクター、細胞、又は医薬組成物の幾つかの形態及び投与経路も本発明の範囲内である。これは、特に好ましい形態及び投与経路に関して、本明細書に記載される抗体又はその抗原結合断片、核酸、ベクター、及び細胞の使用にも当てはまる。

【0234】

診断方法は、抗体又は抗体断片をサンプルと接触させることを含んでいてよい。かかるサンプルは、被験体から単離することができ、例えば、鼻道、鼻腔、唾液腺、肺、肝臓、膵臓、腎臓、眼、耳、胎盤、消化管、心臓、卵巣、脳下垂体、副腎、甲状腺、脳、皮膚、又は血液、好ましくは血清から採取した単離組織サンプルであってよい。また、前記診断方法は、特に抗体又は抗体断片をサンプルと接触させた後に、抗原／抗体複合体を検出することを含んでいてよい。かかる検出工程は、典型的には、作業台で、即ち、ヒト又は動物の身体と全く接触することなしに実施される。検出方法の例は、当業者に周知であり、例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）が挙げられる。

【0235】

また、本発明は、（ａ）Ｂ型肝炎及び／又はＤ型肝炎の予防、治療、又は軽減のための医薬の製造又は（ｂ）Ｂ型肝炎及び／又はＤ型肝炎の診断における（ｉ）本発明に係る抗体、抗体断片、若しくはこれらの変異体及び誘導体；（ｉｉ）本発明に係る不死化Ｂ細胞クローン；（ｉｉｉ）本発明に係る核酸若しくはベクター；又は（ｉｖ）本発明の医薬組成物の使用を提供する。

【0236】

また、本発明は、特にＢ型肝炎及び／又はＤ型肝炎の予防又は治療のために、医薬として使用するための、本発明に係る抗体若しくはその抗原結合断片、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物を提供する。また、被験体を治療するための医薬の製造及び／又は被験体の診断における本発明の抗体の使用を提供する。また、本発明の組成物を被験体に投与する工程を含む、被験体を治療する方法を提供する。幾つかの実施形態では、被験体は、ヒトであってよい。治療的処置の有効性を確認する１つの方法は、本発明の組成物の投与後に疾患の症状をモニタリングすることを含む。治療は、単回投与スケジュールであってもよく、複数回投与スケジュールであってもよい。

【0237】

一実施形態では、本発明に係る抗体、抗体断片、不死化Ｂ細胞クローン、又は医薬組成物は、かかる治療を必要とする被験体に投与される。かかる被験体としては、特にＢ型肝炎及び／又はＤ型肝炎のリスクを有するか又は罹患しやすい被験体が挙げられるが、これらに限定されない。

【0238】

本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、Ｂ型肝炎及び／又はＤ型肝炎を診断するためのキットにおいて使用することもできる。更に、本明細書に記載される本発明の抗体に結合することができるＨＢｓＡｇの抗原性ループ領域におけるエピトープは、抗ＨＢＶ保護抗体の存在を検出するか又は力価を測定することによって、適用手順の有効性をモニタリングするためのキットにおいて使用することもできる。

【0239】

好ましくは、本発明に係る抗体若しくはその抗原結合断片、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、慢性Ｂ型肝炎の治療又は軽減において使用される。

【0240】

興味深いことに、本発明に係る抗体は、（ｉ）ＨＢＶ感染を強力に中和する、（ｉｉ）Ｌ－ＨＢｓＡｇ（感染性ＨＢＶ粒子に存在するラージＨＢＶエンベロープタンパク質）に結合して、ＨＢＶの拡散を防ぐ、（ｉｉｉ）Ｓ－ＨＢｓＡｇに結合して、サブウイルス粒子（ＳＶＰ）のクリアランスを促進する、及び（ｉｖ）セロコンバーション、即ち、ウイルスに対する能動的免疫応答を誘導することができる。

【0241】

好ましくは、本発明に係る抗体若しくはその抗原結合断片、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、特に、Ｂ型肝炎誘発性肝不全について、肝移植後のＢ型肝炎の（再）感染の予防において使用される。

【0242】

この目的のために、好ましくは、移植日には肝移植を受けた患者に高用量を投与してよく、周術期には約１週間に亘って日用量を投与する。その後、好ましくは、抗ＨＢ抗体の血清レベルを１００ＩＵ／ｍＬ超で維持するために１ヶ月間～３ヶ月間毎に更なる用量を投与してよい。

【0243】

別の好ましい実施形態では、本発明に係る抗体若しくはその抗原結合断片、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、非免疫被験体におけるＢ型肝炎の防止／予防において用いられる。これは、例えば、ＨＢＶへの（想定上の）偶発的曝露の場合である（曝露後予防）。用語「非免疫被験体」としては、ワクチン接種を受けたことがないので免疫されていない被験体及びワクチン接種後に免疫応答（測定可能な抗Ｂ型肝炎抗体）を示さなかった被験体が挙げられる。特に後者の群では、本発明に係る抗体若しくはその抗原結合断片、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、Ｂ型肝炎の（持続）予防において用いられる、即ち、「曝露後予防」とは対照的に、（持続）予防は、ワクチン接種後に免疫応答（測定可能な抗Ｂ型肝炎抗体）を示さず且つ持続予防が必要な被験体にとって好ましい。

【0244】

好ましくは、本発明に係る抗体若しくはその抗原結合断片、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、血液透析患者におけるＢ型肝炎の予防に用いられる。

【0245】

好ましくは、本発明に係る抗体若しくはその抗原結合断片、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、新生児におけるＢ型肝炎の予防に用いられる。したがって、特に、Ｂ型肝炎ウイルスキャリアの母／非免疫母の新生児が好ましい。更に、本発明に係る抗体若しくはその抗原結合断片、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、出産時、又は出産後可能な限り速やかに投与することが好ましい。好ましくは、ワクチン接種後にセロコンバーションが生じるまで投与を繰り返してよい。

【0246】

好ましくは、本発明に係る抗体若しくはその抗原結合断片、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、Ｄ型肝炎、好ましくはＢ型肝炎及びＤ型肝炎（特にＢ型肝炎及びＤ型肝炎の共存症）の治療又は軽減において用いられる。興味深いことに、本発明に係る抗体は、Ｂ型肝炎ウイルスだけでなく、デルタ型肝炎ウイルスも強力に中和する。したがって、本発明に係る抗体は、Ｄ型肝炎の第一選択治療を提供することができる。

【0247】

併用療法
本発明に係る方法及び使用における本発明に係る抗体若しくはその抗原結合断片、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物の投与は、単独で実施してもよく、治療又は抑制される疾患又は疾病を治療及び／又は安定化するのに有用な助剤（本明細書では「追加の活性成分」とも称される）と組み合わせて実施してもよい。

【0248】

本発明は、Ｂ型肝炎を治療及び／又は予防するのに有用な他の治療レジメン又は助剤の前、同時、又は後に被験体に投与される、本発明に係る抗体若しくはその抗原結合断片、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物の投与を包含する。前記助剤と同時に投与される前記抗体、核酸、ベクター、細胞、又は医薬組成物は、同じ又は異なる組成物で、また、同じ又は異なる投与経路で投与してよい。

【0249】

前記他の治療レジメン又は助剤は、ポリメラーゼ阻害剤、インターフェロン、及び／又はチェックポイント阻害剤からなる群から選択してよい。

【0250】

したがって、本発明の別の態様では、本発明に係る抗体若しくはその抗原結合断片、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、上記（医学的）使用のために、ポリメラーゼ阻害剤、インターフェロン、及び／又はチェックポイント阻害剤と組み合わせて投与される。

【0251】

好ましいポリメラーゼ阻害剤としては、ラミブジン、アデホビル、エンテカビル、テルビブジン、及びテノホビルが挙げられる。ラミブジンが、最も好ましいポリメラーゼ阻害剤である。ポリメラーゼ阻害剤は、ＤＮＡのプラス鎖の逆転写及び合成を抑制する。ポリメラーゼ阻害剤は、ウイルスの拡散、ｃｃｃＤＮＡの形成を予防せず、ＨＢｓＡｇの放出に影響を与えない。

【0252】

インターフェロンとしては、ＩＦＮアルファ及びＩＦＮベータが挙げられ、ＩＦＮベータが好ましい。

【0253】

好ましいチェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１及び／又はＣＴＬＡ４のブロックを目的とし、したがって、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、及び抗ＣＴＬＡ４抗体を含む。したがって、本発明に係る医薬組成物は、追加の活性成分のうちの１以上を含み得る。

【0254】

本発明に係る抗体若しくはその抗原結合断片、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物と組み合わせて投与される更に好ましい助剤（追加の活性成分）としては、ＬＴβＲアゴニストが挙げられる。

【0255】

好ましくは、本発明に係る抗体若しくはその抗原結合断片、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、ポリメラーゼ阻害剤と組み合わせて投与される。これは、特に、Ｂ型肝炎及び／又はＤ型肝炎の予防、治療、又は軽減におけるかかる組合せの使用にも当てはまる。この状況では、好ましいポリメラーゼ阻害剤としては、ラミブジン、アデホビル、エンテカビル、テルビブジン、及びテノホビルが挙げられる。最も好ましいポリメラーゼ阻害剤は、ラミブジンである。

【0256】

好ましくは、前記抗体又はその抗原結合断片、前記核酸、前記ベクター、前記細胞、又は前記医薬組成物は、ポリメラーゼ阻害剤、インターフェロン、及び／又はチェックポイント阻害剤と同じ又は異なる投与経路を介して投与される。

【0257】

したがって、更なる態様では、本発明は、また、
（ｉ）本発明に係る抗体若しくはその抗原結合断片、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物と、
（ｉｉ）ポリメラーゼ阻害剤、インターフェロン、及び／又はチェックポイント阻害剤と
の組合せを提供する。

【0258】

かかる組合せは、好ましくは、Ｂ型肝炎及び／又はＤ型肝炎の予防、治療、又は軽減、特に、慢性Ｂ型肝炎及び／又は慢性Ｄ型肝炎の治療又は軽減において使用される。より好ましくは、前記組合せは、ＨＢＶ単独感染患者又はＨＢＶ／ＨＤＶ同時感染患者において使用される。

【0259】

かかる組合せは、好ましくは、ＨＢｓＡｇのクリアランスを加速させる。

【0260】

これらに鑑みて、本発明は、また、
（ｉ）本発明に係る抗体若しくはその抗原結合断片、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物と、
（ｉｉ）ポリメラーゼ阻害剤、インターフェロン、及び／又はチェックポイント阻害剤と
を含むキットを提供する。

【0261】

更に、前記キットは、シリンジ若しくは容器等、本発明に係る抗体若しくはその抗原結合断片、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物の投与手段、及び／又は例えば、本発明に係る抗体若しくはその抗原結合断片、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、若しくは本発明に係る医薬組成物、及び／又はポリメラーゼ阻害剤、インターフェロン、及び／又はチェックポイント阻害剤の使用法が説明されているリーフレットを含んでいてよい。

【0262】

本発明に係る抗体若しくは抗原結合断片は、追加の活性成分（助剤）と同じ医薬組成物中に存在していてもよく、又は好ましくは、本発明に係る抗体若しくは抗原結合断片は、第１の医薬組成物に含まれ、追加の活性成分（助剤）は、第１の医薬組成物とは異なる第２の医薬組成物に含まれる。したがって、１超の追加の活性成分（助剤）が企図される場合、各追加の活性成分（助剤）及び本発明に係る抗体又は抗原結合断片は、好ましくは、異なる医薬組成物に含まれる。かかる異なる医薬組成物は、合わせて／同時に、又は別々の時点で若しくは別々の箇所（例えば、身体の別々の部分）に投与してよい。

【0263】

好ましくは、本発明に係る抗体又は抗原結合断片と追加の活性成分（助剤）とは、相加的治療効果、又は好ましくは相乗的治療効果を提供する。上記の通り、用語「相乗作用」とは、２以上の活性剤の併用効果が、各活性剤の個々の効果の合計よりも大きいことを説明するために用いられる。したがって、２以上の剤の併用効果によって活性又はプロセスの「相乗的阻害」を生じる場合、前記活性又はプロセスの阻害が、各活性剤の阻害効果の合計よりも大きいことを意図する。用語「相乗的治療効果」とは、（多数のパラメータのうちのいずれかによって測定される）治療効果が、それぞれの個々の治療で観察される個々の治療効果の合計よりも大きい、２以上の治療の組合せで観察される治療効果を指す。

【0264】

使用及び方法
別の態様では、本発明は、抗Ｂ型肝炎又は抗Ｄ型肝炎ワクチンの抗原が正確な立体構造の特異的エピトープを含有していることを確認することによって前記ワクチンの品質をモニタリングするための、本発明に係る抗体若しくはその抗原結合断片、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物の使用を提供する。

【0265】

更に、本発明は、また、Ｂ型肝炎及び／又はＤ型肝炎の診断における、本発明に係る抗体若しくはその抗原結合断片、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物の使用を提供する。

【0266】

更に、単離された血液サンプルがＢ型肝炎ウイルス及び／又はデルタ型肝炎ウイルスに感染しているかどうかの判定における、本発明に係る抗体若しくはその抗原結合断片、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物の使用も提供される。

【0267】

上記の通り、診断方法は、抗体又は抗体断片をサンプルと接触させることを含んでいてよい。かかるサンプルは、被験体から単離することができ、例えば、鼻道、鼻腔、唾液腺、肺、肝臓、膵臓、腎臓、耳、眼、胎盤、消化管、心臓、卵巣、脳下垂体、副腎、甲状腺、脳、皮膚、又は血液、好ましくは血清から採取した単離組織サンプルであってよい。また、前記診断方法は、特に抗体又は抗体断片をサンプルと接触させた後に、抗原／抗体複合体を検出することを含んでいてもよい。かかる検出工程は、典型的には、作業台で、即ち、ヒト又は動物の身体と全く接触することなしに実施される。検出方法の例は、当業者に周知であり、例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着測定法）が挙げられる。

【0268】

また、本発明は、被験体におけるＢ型肝炎及び／又はＤ型肝炎を予防及び／又は治療する方法であって、本発明に係る抗体若しくはその抗原結合断片、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物を、それを必要としている被験体に投与することを含む方法を提供する。

【0269】

また、本発明は、肝移植を受けた被験体を治療する方法であって、治療的に有効な量の本発明に係る抗体若しくはその抗原結合断片、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物を、前記肝移植を受けた被験体に投与することを含む方法を提供する。

【0270】

上記方法では、慢性Ｂ型肝炎に罹患している被験体が好ましい。

【0271】

更に、特に医薬組成物及び医学的使用に関して既に記載した詳細は、本明細書に記載される方法にも当てはまる。例えば、上記方法において、本発明に係る抗体若しくはその抗原結合断片、本発明に係る核酸、本発明に係るベクター、本発明に係る細胞、又は本発明に係る医薬組成物は、好ましくは、本明細書に記載されるポリメラーゼ阻害剤、インターフェロン、及び／又はチェックポイント阻害剤と組み合わせて投与される。

【0272】

添付図面の簡単な説明を以下に記載する。図面は、本発明を更に詳細に説明することを意図する。しかし、如何なる方法でも本発明の発明主題を限定することを意図するものではない。

【図面の簡単な説明】

【0273】

【図1】実施例１について、ＥＬＩＳＡによって測定される３つの異なるＨＢｓＡｇ血清型（ａｄｗ、ａｄｙ、及びａｙｗ）に対するＨＢＣ３４モノクローナル抗体の結合を示す。

【図2】実施例２について、様々な抗ＨＢ抗体、即ち、ＨＢＶ免疫グロブリン（ＨＢＩＧ）、ＨＢＣ３４、及びＰｒｅＳ１（１８／７）又はＨＢｓＡｇに対する更なるモノクローナル抗体の、インビトロにおいてＨｅｐａＲＧ細胞のＨＢＶ感染を中和する能力を示す。５，０００μｇ／ｍＬ、５００μｇ／ｍＬ、及び５０μｇ／ｍＬで試験したＨＢＩＧを除いて、各抗体を３つの異なる濃度、即ち、５μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、及び０．０５μｇ／ｍＬで試験した。

【図3】実施例２について、３つの異なる濃度（５μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、又は０．０５μｇ／ｍＬ）のＨＢＣ３４モノクローナル抗体の存在下において感染したＨｅｐａＲＧ細胞におけるＨＢｃＡｇの染色、及びレファレンスとしての核染色を示す。

【図4】実施例２について、感染性ＨＤＶに対する様々な濃度のＨＢＣ３４の中和活性を示す。０．１２μｇ／ｍＬの濃度のＨＢＣ３４では、ＨＤＶ陽性細胞は検出されず、これは、ＨＤＶの強力な中和を示す。対照的に、ＨＢＩＧは、ＨＤＶを中和しなかった（１：１，０００希釈、即ち、５０μｇ／ｍＬで試験）。

【図5】実施例３について、１０個のＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、及びＪのＨＢｓＡｇの抗原性ループのアミノ酸配列を示す。これら配列は、ＨＢＣ３４抗体によって認識されるエピトープ（灰色でハイライト）を含む。一番上の配列（ＨＢＶ－Ｄ Ｊ０２２０３）を用いて、実施例５、図７のペプチドライブラリを設計した。

【図6】実施例３について、図に示す通り様々なＨＢｓＡｇ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、及びＪを発現するプラスミドを一過的にトランスフェクトした透過処理Ｈｅｐ２細胞に対する、ヒトモノクローナル抗体ＨＢＣ３４及び対照抗体（いずれも５μｇ／ｍＬ）の結合（細胞蛍光測定法によって測定）を示す。

【図7】実施例４について、試験した１９個のＨＢｓＡｇ突然変異体の抗原性ループのアミノ酸配列を示す。ＨＢＣ３４抗体に弱くしか（点線円）又は全く結合しなかったＨＢｓＡｇ突然変異体の残基を丸で囲む。

【図8】実施例４について、図に示す通り様々なＨＢｓＡｇ遺伝子型Ｄ突然変異体を発現するプラスミドをトランスフェクトしたＨｅｐ２細胞における、ヒトモノクローナル抗体ＨＢＣ３４及び２つの他のＨＢｓＡｇ特異的抗体（Ａｂ５及びＡｂ６）（全て５μｇ／ｍＬで試験）の結合を示す（「ＷＴ」：ＨＢｓＡｇ遺伝子型Ｄ、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＦＪ８９９７９２）。

【図9】実施例５について、Ｐｅｐｓｃａｎ技術を用いて測定した６５０個の直鎖状及びループ状ペプチドのライブラリに対するＨＢＣ３４の結合、並びにＨＢＣ３４が結合する４個のペプチドの配列を示す。１と示される残基は、立体構造的エピトープを再構築するためにスカフォールドに化学結合することができるように導入されたシステインである。新たに導入されたシステインに加えて他のシステインが存在する場合、それはアラニンによって置換される（下線付きアラニン残基）。

【図10】実施例５について、還元条件下のＨＢＶウイルス粒子におけるＡｂ４及びＨＢＣ３４によるウエスタンブロット染色を示す。Ａｂ４は、比較抗体であり、同様に抗原性ループに対して反応性である。

【図11】実施例６について、６週間に亘ってＨＢＣ３４（１週間に２回、１ｍｇ／ｋｇをｉ．ｐ．投与）、対照抗体（対照ＡＢ）、又はエンテカビル（ＥＴＶ；１μｇ／ｍＬで経口投与）のいずれかにより感染の３週間後から処理を受けた、５×１０^７コピーのＨＢＶゲノム等価物（遺伝子型Ｄ）を接種されたヒト化ｕＰＡ／ＳＣＩＤマウスにおけるＨＢＶウイルス血症のレベルを示す。ＨＢＶ感染の拡散相（ｐ．ｉ．（感染後）３週間目～６週間目）において、対照抗体を投与した群ではウイルス血症が＞２ｌｏｇ増加したが、ＨＢＣ３４又はエンテカビルで処理したマウスではＨＢＶ力価が低下した。

【図12】実施例６について、実験の最後（９週間目）における、実施例６のマウス中のＨＢｓＡｇの存在についての肝細胞の染色（肝内分析）を示す。対照抗体を投与したマウスでは殆ど全ての肝細胞がＨＢｓＡｇ陽性に染色されたが、エンテカビルによる処理及びＨＢＣ３４による処理ではいずれも拡散が効率的にブロックされた（ＨＢｓＡｇ陽性細胞は約１％～約５％）。

【図13】実施例６のｃｃｃＤＮＡ測定について、ＨＢＶ感染の３週間後に屠殺されたマウス（「３週間ｈｂｖ」；即ち、非処理）と感染後３週間目から９週間目までＨＢＣ３４又はエンテカビルで処理されたマウスとの間に著しい差は存在しなかった。対照的に、感染の９週間後に屠殺したとき、対照抗体を投与した群ではｃｃｃＤＮＡ／細胞の推定量が最高２ｌｏｇ増加した。

【図14】実施例６について、ベースライン（ＢＬ）、処理の３週間目（感染後６週間目）、及び処理の６週間目（感染後９週間目）における循環ＨＢｓＡｇのレベルを示す。ＨＢＣ３４を投与したマウスでは循環ＨＢｓＡｇのレベルが＞１ｌｏｇ（及び検出限界未満に）低下したが、エンテカビルで処理したマウスでは低下せず、一方、対照群ではＨＢｓＡｇのレベルが＞２ｌｏｇ増加した（５，０００ＩＵ／ｍＬ～１０，０００ＩＵ／ｍＬのレベルに達した）。

【図15】実施例７について、ベースライン（ＢＬ）、処理の３週間目（感染後１５週間目、「３週間目」）、及び処理の６週間目（感染後１８週間目、「６週間目」）における慢性Ｂ型肝炎の状況のＨＢＶ力価（左図）及び循環ＨＢｓＡｇのレベル（右図）を示す。ＨＢＶ力価及び循環ＨＢｓＡｇのレベルは、処理の３週間目及び６週間目においてＨＢＣ３４を投与したマウスで低下した。個々の曲線は、個々の動物を表す。対照抗体：点線、ＨＢＣ３４：連続線。

【図16】実施例８について、一次ヒト肝細胞を再増殖させ、ＨＤＶ－ＲＮＡ及びＨＢＶ－ＤＮＡを含有する患者由来の血清を同時感染させたｕＰＡ／ＳＣＩＤマウスにおけるＨＢＶ力価（左図）及びＨＤＶ力価（右図）を示す。感染後５週間目に、ＨＢＣ３４又は対照抗体（「対照」）による感染処理を開始した。ベースライン（３週間目、５週間目のＢＬ）、処理の３週間目（感染後８週間目－「８週間目」）、及び処理の６週間目（感染後１１週間目－「１１週間目」）におけるＨＢＶ力価（左図）及びＨＤＶ力価（右図）を示す。個々の曲線は、個々の動物を表す。対照抗体：点線、ＨＢＣ３４：連続線。

【図17-1】実施例９について、ＨＢＶ－ｓ－抗原の抗原性ループの概略図を示し、ＨＢＣ３４のエピトープを灰色でハイライトする。ＨＢＣ３４のエピトープをマッピングするために、Ｐｅｐｓｃａｎ技術を用いて測定した通り、１，５２０個の異なるペプチドのライブラリを試験した。

【図17-2】実施例９について、１６種の異なるペプチドセットに対するＨＢＣ３４の結合の規模（ＥＬＩＳＡ強度）を示す。不連続エピトープの２つの部分を表すコンビナトリアルＣＬＩＰＳコンストラクトで構成されるセット１３～１６のペプチド（図１７－２）及びループ状ペプチドで構成されるセット９～１２のペプチド（図１７－３）に対する結合によって証明される通り、ＨＢＣ３４は、立体構造的エピトープに結合している。

【図17-3】実施例９について、１６種の異なるペプチドセットに対するＨＢＣ３４の結合の規模（ＥＬＩＳＡ強度）を示す。不連続エピトープの２つの部分を表すコンビナトリアルＣＬＩＰＳコンストラクトで構成されるセット１３～１６のペプチド（図１７－２）及びループ状ペプチドで構成されるセット９～１２のペプチド（図１７－３）に対する結合によって証明される通り、ＨＢＣ３４は、立体構造的エピトープに結合している。

【図17-4】実施例９について、１６種の異なるペプチドセットに対するＨＢＣ３４の結合の規模（ＥＬＩＳＡ強度）を示す。直鎖状ペプチド１～４（図１７－４）及び５～８（図１７－５）のセットではＨＢＣ３４の結合が観察されず、これは、ＨＢＣ３４が不連続な立体構造的エピトープに結合するという考えを更に支持する。

【図17-5】実施例９について、１６種の異なるペプチドセットに対するＨＢＣ３４の結合の規模（ＥＬＩＳＡ強度）を示す。直鎖状ペプチド１～４（図１７－４）及び５～８（図１７－５）のセットではＨＢＣ３４の結合が観察されず、これは、ＨＢＣ３４が不連続な立体構造的エピトープに結合するという考えを更に支持する。

【図18-1】実施例９について、８１２個の不連続な、即ちループ状のＴ３ ＣＬＩＰＳペプチドで構成されるペプチドライブラリに対するＨＢＣ３４の結合を示す。図１７－１に記載したエピトープマッピングを微調整するために、完全置換分析を用いて前述のセット（図１７－２～図１７－５）に基づいて３セットのペプチド（ＲＮ１、ＲＮ２、及びＲＮ３と称する）を作製した。図１８－１～図１８－１０は、枠で囲まれた位置における残基を、シリーズＡＥＦＧＨＫＬＰＱＲＳＶＹ＿（式中、「＿」は、残基の欠失を意味する）から選択される１３個のアミノ酸のうちの１個で置換したセット１～３に対するＨＢＣ３４の結合を示す。並び替えられた位置における元の残基を、各図の左に加えて（ｉ）水平方向の枠付き配列内（元のアミノ酸が並び替えシリーズの一部であるとき）又は（ｉｉ）配列の下（元のアミノ酸が並び替えシリーズの一部ではないとき）のいずれかに示す。

【図18-2】実施例９について、８１２個の不連続な、即ちループ状のＴ３ ＣＬＩＰＳペプチドで構成されるペプチドライブラリに対するＨＢＣ３４の結合を示す。図１７－１に記載したエピトープマッピングを微調整するために、完全置換分析を用いて前述のセット（図１７－２～図１７－５）に基づいて３セットのペプチド（ＲＮ１、ＲＮ２、及びＲＮ３と称する）を作製した。図１８－１～図１８－１０は、枠で囲まれた位置における残基を、シリーズＡＥＦＧＨＫＬＰＱＲＳＶＹ＿（式中、「＿」は、残基の欠失を意味する）から選択される１３個のアミノ酸のうちの１個で置換したセット１～３に対するＨＢＣ３４の結合を示す。並び替えられた位置における元の残基を、各図の左に加えて（ｉ）水平方向の枠付き配列内（元のアミノ酸が並び替えシリーズの一部であるとき）又は（ｉｉ）配列の下（元のアミノ酸が並び替えシリーズの一部ではないとき）のいずれかに示す。

【図18-3】実施例９について、８１２個の不連続な、即ちループ状のＴ３ ＣＬＩＰＳペプチドで構成されるペプチドライブラリに対するＨＢＣ３４の結合を示す。図１７－１に記載したエピトープマッピングを微調整するために、完全置換分析を用いて前述のセット（図１７－２～図１７－５）に基づいて３セットのペプチド（ＲＮ１、ＲＮ２、及びＲＮ３と称する）を作製した。図１８－１～図１８－１０は、枠で囲まれた位置における残基を、シリーズＡＥＦＧＨＫＬＰＱＲＳＶＹ＿（式中、「＿」は、残基の欠失を意味する）から選択される１３個のアミノ酸のうちの１個で置換したセット１～３に対するＨＢＣ３４の結合を示す。並び替えられた位置における元の残基を、各図の左に加えて（ｉ）水平方向の枠付き配列内（元のアミノ酸が並び替えシリーズの一部であるとき）又は（ｉｉ）配列の下（元のアミノ酸が並び替えシリーズの一部ではないとき）のいずれかに示す。

【図18-4】実施例９について、８１２個の不連続な、即ちループ状のＴ３ ＣＬＩＰＳペプチドで構成されるペプチドライブラリに対するＨＢＣ３４の結合を示す。図１７－１に記載したエピトープマッピングを微調整するために、完全置換分析を用いて前述のセット（図１７－２～図１７－５）に基づいて３セットのペプチド（ＲＮ１、ＲＮ２、及びＲＮ３と称する）を作製した。図１８－１～図１８－１０は、枠で囲まれた位置における残基を、シリーズＡＥＦＧＨＫＬＰＱＲＳＶＹ＿（式中、「＿」は、残基の欠失を意味する）から選択される１３個のアミノ酸のうちの１個で置換したセット１～３に対するＨＢＣ３４の結合を示す。並び替えられた位置における元の残基を、各図の左に加えて（ｉ）水平方向の枠付き配列内（元のアミノ酸が並び替えシリーズの一部であるとき）又は（ｉｉ）配列の下（元のアミノ酸が並び替えシリーズの一部ではないとき）のいずれかに示す。

【図18-5】実施例９について、８１２個の不連続な、即ちループ状のＴ３ ＣＬＩＰＳペプチドで構成されるペプチドライブラリに対するＨＢＣ３４の結合を示す。図１７－１に記載したエピトープマッピングを微調整するために、完全置換分析を用いて前述のセット（図１７－２～図１７－５）に基づいて３セットのペプチド（ＲＮ１、ＲＮ２、及びＲＮ３と称する）を作製した。図１８－１～図１８－１０は、枠で囲まれた位置における残基を、シリーズＡＥＦＧＨＫＬＰＱＲＳＶＹ＿（式中、「＿」は、残基の欠失を意味する）から選択される１３個のアミノ酸のうちの１個で置換したセット１～３に対するＨＢＣ３４の結合を示す。並び替えられた位置における元の残基を、各図の左に加えて（ｉ）水平方向の枠付き配列内（元のアミノ酸が並び替えシリーズの一部であるとき）又は（ｉｉ）配列の下（元のアミノ酸が並び替えシリーズの一部ではないとき）のいずれかに示す。

【図18-6】実施例９について、８１２個の不連続な、即ちループ状のＴ３ ＣＬＩＰＳペプチドで構成されるペプチドライブラリに対するＨＢＣ３４の結合を示す。図１７－１に記載したエピトープマッピングを微調整するために、完全置換分析を用いて前述のセット（図１７－２～図１７－５）に基づいて３セットのペプチド（ＲＮ１、ＲＮ２、及びＲＮ３と称する）を作製した。図１８－１～図１８－１０は、枠で囲まれた位置における残基を、シリーズＡＥＦＧＨＫＬＰＱＲＳＶＹ＿（式中、「＿」は、残基の欠失を意味する）から選択される１３個のアミノ酸のうちの１個で置換したセット１～３に対するＨＢＣ３４の結合を示す。並び替えられた位置における元の残基を、各図の左に加えて（ｉ）水平方向の枠付き配列内（元のアミノ酸が並び替えシリーズの一部であるとき）又は（ｉｉ）配列の下（元のアミノ酸が並び替えシリーズの一部ではないとき）のいずれかに示す。

【図18-7】実施例９について、８１２個の不連続な、即ちループ状のＴ３ ＣＬＩＰＳペプチドで構成されるペプチドライブラリに対するＨＢＣ３４の結合を示す。図１７－１に記載したエピトープマッピングを微調整するために、完全置換分析を用いて前述のセット（図１７－２～図１７－５）に基づいて３セットのペプチド（ＲＮ１、ＲＮ２、及びＲＮ３と称する）を作製した。図１８－１～図１８－１０は、枠で囲まれた位置における残基を、シリーズＡＥＦＧＨＫＬＰＱＲＳＶＹ＿（式中、「＿」は、残基の欠失を意味する）から選択される１３個のアミノ酸のうちの１個で置換したセット１～３に対するＨＢＣ３４の結合を示す。並び替えられた位置における元の残基を、各図の左に加えて（ｉ）水平方向の枠付き配列内（元のアミノ酸が並び替えシリーズの一部であるとき）又は（ｉｉ）配列の下（元のアミノ酸が並び替えシリーズの一部ではないとき）のいずれかに示す。

【図18-8】実施例９について、８１２個の不連続な、即ちループ状のＴ３ ＣＬＩＰＳペプチドで構成されるペプチドライブラリに対するＨＢＣ３４の結合を示す。図１７－１に記載したエピトープマッピングを微調整するために、完全置換分析を用いて前述のセット（図１７－２～図１７－５）に基づいて３セットのペプチド（ＲＮ１、ＲＮ２、及びＲＮ３と称する）を作製した。図１８－１～図１８－１０は、枠で囲まれた位置における残基を、シリーズＡＥＦＧＨＫＬＰＱＲＳＶＹ＿（式中、「＿」は、残基の欠失を意味する）から選択される１３個のアミノ酸のうちの１個で置換したセット１～３に対するＨＢＣ３４の結合を示す。並び替えられた位置における元の残基を、各図の左に加えて（ｉ）水平方向の枠付き配列内（元のアミノ酸が並び替えシリーズの一部であるとき）又は（ｉｉ）配列の下（元のアミノ酸が並び替えシリーズの一部ではないとき）のいずれかに示す。

【図18-9】実施例９について、８１２個の不連続な、即ちループ状のＴ３ ＣＬＩＰＳペプチドで構成されるペプチドライブラリに対するＨＢＣ３４の結合を示す。図１７－１に記載したエピトープマッピングを微調整するために、完全置換分析を用いて前述のセット（図１７－２～図１７－５）に基づいて３セットのペプチド（ＲＮ１、ＲＮ２、及びＲＮ３と称する）を作製した。図１８－１～図１８－１０は、枠で囲まれた位置における残基を、シリーズＡＥＦＧＨＫＬＰＱＲＳＶＹ＿（式中、「＿」は、残基の欠失を意味する）から選択される１３個のアミノ酸のうちの１個で置換したセット１～３に対するＨＢＣ３４の結合を示す。並び替えられた位置における元の残基を、各図の左に加えて（ｉ）水平方向の枠付き配列内（元のアミノ酸が並び替えシリーズの一部であるとき）又は（ｉｉ）配列の下（元のアミノ酸が並び替えシリーズの一部ではないとき）のいずれかに示す。

【図18-10】実施例９について、８１２個の不連続な、即ちループ状のＴ３ ＣＬＩＰＳペプチドで構成されるペプチドライブラリに対するＨＢＣ３４の結合を示す。図１７－１に記載したエピトープマッピングを微調整するために、完全置換分析を用いて前述のセット（図１７－２～図１７－５）に基づいて３セットのペプチド（ＲＮ１、ＲＮ２、及びＲＮ３と称する）を作製した。図１８－１～図１８－１０は、枠で囲まれた位置における残基を、シリーズＡＥＦＧＨＫＬＰＱＲＳＶＹ＿（式中、「＿」は、残基の欠失を意味する）から選択される１３個のアミノ酸のうちの１個で置換したセット１～３に対するＨＢＣ３４の結合を示す。並び替えられた位置における元の残基を、各図の左に加えて（ｉ）水平方向の枠付き配列内（元のアミノ酸が並び替えシリーズの一部であるとき）又は（ｉｉ）配列の下（元のアミノ酸が並び替えシリーズの一部ではないとき）のいずれかに示す。

【図19】実施例１０について、感染の８週間後から開始して４週間に亘って対照抗体（対照）、ＨＢＣ３４のみ（ＨＢＣ３４）、ラミブジンのみ（ラミブジン）、又は併用処理（ＨＢＣ３４及びラミブジン）による処理を受けた、２×１０^９コピーのＨＢＶゲノム等価物（遺伝子型Ｄ）を接種したヒト化ｕＰＡ／ＳＣＩＤマウスにおける、ＨＢＶウイルス血症（Ａ図）及び循環ＨＢＶ－ｓ－抗原（Ｂ図）のレベルの低下に対するＨＢＣ３４（１ｍｇ／ｋｇ ｉ．ｐ １週間に２回）及びラミブジン（飲料水に０．４ｍｇ／ｍＬで添加）による併用処理の効果を示す。併用療法は、薬物のみと比較してウイルス血症を大きく低減した。

【図20】実施例１１及び１２について、抗体変異体１～３２を得るために作製された２セットのＶＨ（Ａ図）及びＶＬ（Ｂ図）の配列のアラインメントを示す。ＣＤＲ（ＩＭＧＴに従って定義）を灰色でハイライトする。

【図21】実施例１１について、ＥＬＩＳＡによって測定された、１８個の改変ＨＢＣ３４変異体（カラム２及び３に示す通り突然変異型ＶＨ及びＶＬ配列を合わせることによって得られた）のＨＢｓＡｇ（ａｄｗサブタイプ）に対する結合を示す。カラム４では、結合の喪失を「－」で示し、強く減少した結合を「＋／－」で示し、減少した結合を「＋／～」で示し、元の抗体と同様又は等しい結合を「＋」で示す。

【図22】実施例１１について、直接抗原ベースＥＬＩＳＡアッセイにおいて測定した、ＨＢＣ３４の８個の異なる改変変異体のＨＢｓＡｇ（ａｄｗ）に対する結合を示す。これら８個の変異体は、図２１に記載する１８個のＨＢＣ３４突然変異体の中から選択され；ＨＢｓＡｇの親和性をより深く特性評価するために、前記８個の抗体を滴定し、親抗体配列と比較した。

【図23】実施例１１について、図２２に記載した８個の抗体の特徴の概要を示す。ＥＣ５０は、Ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍを使用して図２２の曲線をフィッティングすることによって求めた。８個の変異体及び親抗体のそれぞれの２９３ Ｅｘｐｉ細胞へのトランスフェクト産物３００ｍＬの上清中に分泌されたＩｇＧの（ＥＬＩＳＡ）定量によって生産性を決定した。

【図24】実施例１１及び１２について、フレームワークに更なる突然変異を導入することにより前述のセットの結果に基づいて設計されたＨＢＣ３４の１２個の更なる改変変異体を含む１５個の変異体の特徴を要約する表を示す（Ａ図）。抗原ベースのＥＬＩＳＡアッセイにおいて抗体を滴定することによって結合曲線を得、Ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍを用いて曲線をフィッティングすることによってＥＣ５０を計算した。１５個の変異体及び親抗体のそれぞれの２９３ Ｅｘｐｉ細胞へのトランスフェクト産物３０ｍＬの上清中に分泌されたＩｇＧの定量に基づいて生産性を計算した。倍数変化をプロットし、Ｂ図に示す。

【図25】実施例１１及び１２について、ＨＢＣ３４並びに変異体６、７、１９、２３、及び２４の細胞蛍光測定分析によって測定したときの結合を示す。全ての抗体を５μｇ／ｍＬから開始して滴定したところ、異なるＨＢｓＡｇ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、及びＪを発現するプラスミドを一過的にトランスフェクトした透過処理Ｈｅｐ２細胞に対して結合した。

【実施例0274】

本発明の様々な実施形態及び態様を示す具体例を以下に提示する。しかし、本発明は、本明細書に記載される特定の実施形態によって範囲が限定されるものではない。以下の調製及び実施例は、当業者に本発明をより明確に理解させ、実施させるために与えられる。しかし、本発明は、例示される実施形態によって範囲が限定されるものではなく、前記実施形態は本発明の単一の態様の単なる例示を意図するものであり、機能的に等価である方法は本発明の範囲内である。実際、本明細書に記載されているものに加えて、本発明の様々な変形例が、前述の明細書、添付図面、及び下記実施例から当業者に容易に明らかになる。全てのかかる変形例は、添付の特許請求の範囲の範囲内である。

【0275】

実施例１：ヒトモノクローナル抗体ＨＢＣ３４の同定及び特性評価
ヒト患者からＴｒａｇｇｉａｉ Ｅ．ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｎａｔ Ｍｅｄ １０（８）：８７１－５に記載されているのと同様の方法でヒトモノクローナル抗体を単離した。その可変領域（表２及び３）及び相補性決定領域（ＣＲＤ）のヌクレオチド及びアミノ酸配列を決定することによって抗体を特性評価し、「ＨＢＣ３４」と命名した。したがって、ＨＢＣ３４は、上の表２及び３に示すＣＤＲ、ＶＨ、及びＶＬの配列を有するＩｇＧ１型完全ヒトモノクローナル抗体である。

【0276】

次に、３つのＨＢｓＡｇ血清型ａｄｗ、ａｄｙ、及びａｙｗのうちのどれにヒトモノクローナル抗体ＨＢＣ３４が結合するのかを決定した。興味深いことに、ＥＬＩＳＡによって測定したとき、ＨＢＣ３４は、３つのＨＢｓＡｇ血清型（ａｄｗ、ａｄｙ、及びａｙｗ）に対して高い親和性で結合し、ＥＣ５０値は同様であり、且つ低かった（図１）。

【0277】

ＨＢＶ抗体の保護力価は、様々なアッセイに亘って標準化可能な国際単位（ＩＵ）で表される。１９７７年に、抗ＨＢ免疫グロブリンの国際標準品（Ｗ１０４２）が樹立された。この標準品の調製で使用された血漿は、Ｂ型肝炎に自然に感染していた個体に由来していた（Ｂａｒｋｅｒ，Ｌ．Ｆ．，Ｄ．Ｌｏｒｅｎｚ，Ｓ．Ｃ．Ｒａｓｔｏｇｉ，Ｊ．Ｓ．Ｆｉｎｌａｙｓｏｎ，ａｎｄ Ｅ．Ｂ．Ｓｅｌｉｇｍａｎｎ．１９７７．Ｓｔｕｄｙ ｏｆ ａ ｐｒｏｐｏｓｅｄ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ａｎｔｉｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ．ＷＨＯ Ｅｘｐｅｒｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｒｅｐｏｒｔ ｓｅｒｉｅｓ．ＷＨＯ Ｅｘｐｅｒｔ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｉｓａｔｉｏｎ ２９ｔｈ Ｒｅｐｏｒｔ ＢＳ ７７．１ １６４．Ｇｅｎｅｖａ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ，１９７７；Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ：Ａｎｔｉ－ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ．ＷＨＯ Ｔｅｃｈ Ｒｅｐ Ｓｅｒ １９７８；６２６：１８）。イムノアッセイ（Ａｂｂｏｔｔ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ診断的イムノアッセイ）によって診断的に測定されたＨＢＣ３４の活性は、５，０００ＩＵ／ｍＬである。比較として、ＨＢＩＧの活性は～１ＩＵ／ｍｇである。

【0278】

実施例２：抗体ＨＢＣ３４は感染性ＨＢＶ及びＨＤＶを強力に中和する
実施例２の第１の目的は、ＨＢＣ３４が感染性ＨＢＶを中和するかどうかを判定し、ＨＢＣ３４の中和活性を他の抗ＨＢ抗体の中和活性と比較することにあった。この目的のために、分化したＨｅｐａＲＧ細胞を、３７℃で１６時間、４％ ＰＥＧ８０００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した培地中において、抗体（ＨＢＣ３４、１８／７、Ａｂ２、Ａｂ３、及びＨＢＩＧ）の存在下又は非存在下で一定量のＨＢＶと共にインキュベートした。インキュベーションの最後に、細胞を洗浄し、更に培養した。３日間毎に培地を交換した。感染後７日目から１１日目までに培養上清に分泌されたＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）及びＢ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）のレベルを酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）で測定し、免疫蛍光アッセイでＨＢｃＡｇ染色を検出することによって、感染を検出した。

【0279】

図２及び３に示す通り、５μｇ／ｍＬ及び０．５μｇ／ｍＬで試験したとき、ＨＢＣ３４はＨＢＶの感染を完全に中和し、一方、同様にＨＢｓＡｇに結合している比較ヒトモノクローナル抗ＨＢ抗体Ａｂ２及びＡｂ３は、完全には中和しなかった。これは、ＨＢｓＡｇに結合する抗体の全てがＨＢＶ感染を中和することができる訳ではない（例えば、Ａｂ２及びＡｂ３）ことを示す。注目すべきことに、ＨＢＩＧは、５，０００μｇ／ｍＬ及び５００μｇ／ｍＬで試験したときのみＨＢＶ感染を中和した、即ち、ＨＢＣ３４と比較して１，０００倍効力が低かった。１８／７は、ＨＢｓＡｇのｐｒｅ－Ｓ１領域に対するマウスモノクローナル抗体である。

【0280】

実施例２の第２の目的は、分化したＨｅｐａＲｇ細胞におけるＨＤＶに対するＨＢＣ３４の中和活性を測定することにあった。ＨＤＶキャリア由来の血清をＨＤＶ感染接種材料として使用した。デルタ型抗原の免疫蛍光染色を読み出し値として使用した。図４に示す通り、０．１２μｇ／ｍＬで試験したとき、ＨＢＣ３４はＨＤＶ感染を完全にブロックした。比較として、ＨＢＩＧについても試験したところ、効果がなかった（１／１，０００、即ち、５０μｇ／ｍＬで試験）。

【0281】

実施例３：抗体ＨＢＣ３４は、１０種のＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、及びＪ全てを認識する
１０種のＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、及びＪ（図５に示す）を認識する能力についてＨＢＣ３４をフローサイトメトリー分析によって試験した。具体的には、１０種のＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、及びＪ（図５に示す）の各ＨＢｓＡｇを発現するプラスミドをヒト上皮細胞（Ｈｅｐ２細胞）にトランスフェクトした。一過的にトランスフェクトされた透過処理細胞を染色するためにヒトモノクローナル抗体ＨＢＣ３４（５μｇ／ｍＬ）及び対照抗体（５μｇ／ｍＬ）を使用した。トランスフェクトの２日間後、ＨＢＣ３４又は対照Ａｂで免疫染色するために、Ｈｅｐ２細胞を回収し、固定し、サポニンで透過処理した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を備えるＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ２（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、トランスフェクトされた細胞に対する抗体の結合を分析した。図６に示す通り、ＨＢＣ３４は、同様の染色パターンを有する１０種のＨＢＶ ＨＢｓＡｇ遺伝子型全てを認識した。

【0282】

実施例４：抗体ＨＢＣ３４は全ての機能的ＨＢｓＡｇ突然変異体を認識する
１９種の異なるＨＢｓＡｇ遺伝子型Ｄ突然変異体（ＨＢｓＡｇ遺伝子型Ｄに基づく、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＦＪ８９９７９２、図７に図示）ＨＢｓＡｇ Ｙ１００Ｃ／Ｐ１２０Ｔ、ＨＢｓＡｇ Ｐ１２０Ｔ、ＨＢｓＡｇ Ｐ１２０Ｔ／Ｓ１４３Ｌ、ＨＢｓＡｇ Ｃ１２１Ｓ、ＨＢｓＡｇ Ｒ１２２Ｄ、ＨＢｓＡｇ Ｒ１２２Ｉ、ＨＢｓＡｇ Ｔ１２３Ｎ、ＨＢｓＡｇ Ｔ１２３Ｎ／Ｃ１２４Ｒ、ＨＢｓＡｇ Ｑ１２９Ｈ、ＨＢｓＡｇ Ｑ１２９Ｌ、ＨＢｓＡｇ Ｍ１３３Ｈ、ＨＢｓＡｇ Ｍ１３３Ｌ、ＨＢｓＡｇ Ｍ１３３Ｔ、ＨＢｓＡｇ Ｋ１４１Ｅ、ＨＢｓＡｇ Ｐ１４２Ｓ、ＨＢｓＡｇ Ｓ１４３Ｋ、ＨＢｓＡｇ Ｄ１４４Ａ、ＨＢｓＡｇ Ｇ１４５Ｒ、及びＨＢｓＡｇ Ｎ１４６Ａ（これら突然変異体の抗原性ループ領域のアミノ酸配列については、配列番号１６～３３を参照）に結合する能力についてＨＢＣ３４をフローサイトメトリー分析によって試験した。具体的には、実施例３と同様に、様々なＨＢｓＡｇ突然変異体を発現するプラスミドをヒト上皮細胞（Ｈｅｐ２細胞）にトランスフェクトし、分析した。トランスフェクトされたＨｅｐ２細胞に対するＨＢＣ３４の結合を試験するために５μｇ／ｍＬのヒトモノクローナル抗体ＨＢＣ３４及び２種の他のＨＢｓＡｇ特異的抗体（Ａｂ５及びＡｂ６）を使用した。

【0283】

図８に示す通り、ＨＢＣ３４は、１９種のＨＢｓＡｇ突然変異体のうちの１８種に結合することが見出された。突然変異体ＨＢｓＡｇ Ｔ１２３Ｎ/Ｃ１２４Ｒにおいてのみ、即ち、残基１２３及び１２４が両方突然変異型であるときのみ、ＨＢＣ３４の結合が完全に消滅したが、Ａｂ５及びＡｂ６の結合は消滅しなかった。注目すべきことに、これら２つの残基（即ち、Ｔ１２３及びＣ１２４）のアラニンへの突然変異が、ＨＢＶ感染力の喪失に関連することが示されており、これは、抗原性ループの立体構造を変化させ得るＣ１２４によって形成されるジスルフィド架橋が失われることによるものである可能性が最も高い（Ｓａｌｉｓｓｅ Ｊ．ａｎｄ Ｓｕｒｅａｕ Ｃ．，２００９，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ８３：９３２１－９３２８）。したがって、ヒトモノクローナル抗体ＨＢＣ３４は、１８種のＨＢｓＡｇ突然変異体に結合する。

【0284】

実施例５：抗体ＨＢＣ３４は、抗原性ループにおける保存された立体構造的エピトープに結合する
ＨＢｓＡｇの抗原性ループ領域を完全に網羅するように設計された６５０個の直鎖状及びループ状ペプチドのライブラリ（Ｐｅｐｓｃａｎ（Ｌｅｌｙｓｔａｄ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）製の「ＣＬＩＰＳ Ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ Ｅｐｉｔｏｐｅ Ｍａｐｐｉｎｇ」技術）を使用することによって、ＨＢＣ３４に認識されるエピトープを同定した。標準的なＦｍｏｃケミストリーに基づいて直鎖状及びＣＬＩＰＳペプチドを合成する。ループ状ペプチドは、Ｔｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ２０：２８３－９９に記載の通り、ＣＬＩＰＳ（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｌｉｎｋｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｎ Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）技術を使用して、立体構造的エピトープを再構築するために化学スカフォールドにおいて合成する。例えば、２つのシステインを含有する単一のループ状ペプチドを合成し、可変間隔でシステイン残基を導入することによってループのサイズを変化させる。新たに導入されたシステインに加えて他のシステインが存在する場合、アラニンに置換する。クレジットカード型のポリプロピレンＰＥＰＳＣＡＮカード（４５５個のペプチドフォーマット／カード）上において重炭酸アンモニウム中１，３－ビス（ブロモメチル）ベンゼン等のＣＬＩＰＳテンプレートの０．５ｍＭ溶液と反応させることによって、ペプチドにおける複数のシステインの側鎖をＣＬＩＰＳテンプレートに結合させる。各ペプチドに対する抗体の結合を、ＰＥＰＳＣＡＮベースのＥＬＩＳＡにおいて試験する。共有結合しているペプチドを含有する４５５ウェルのクレジットカード型のポリプロピレンカードを、ブロッキング溶液中で試験抗体（１μｇ／ｍＬ）と共にインキュベートする。洗浄した後、ペルオキシダーゼ基質２，２’－アジノ－ジ－３－エチルベンズチアゾリンサルフェート（ＡＢＴＳ）及び２μＬの３％ Ｈ_２Ｏ_２を添加する。１時間後、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ及び画像処理システムを用いて発色を測定する。生データは、光学値であり、０～３，０００の範囲である（標準的な９６ウェルプレートＥＬＩＳＡリーダの１～３と同様のログスケール）。

【0285】

図９に示す通り、ＨＢＣ３４は、配列番号５２に係るアミノ酸配列を有する二重ループ状ペプチドを認識することが見出された：

【表18】

（式中、Ｘと記載されている残基は、システインで置換されており、下線付き残基は、ＣからＡに置換されている）（配列番号５２）。

【0286】

３つの更なるペプチドがより低いシグナルで認識された：
（ａ）配列番号５３に係るアミノ酸配列を有する直鎖状１５ｍｅｒペプチド：

【表19】

（ｂ）配列番号５４に係るアミノ酸配列を有する別の直鎖状ペプチド：

【表20】

及び（ｃ）配列番号５５に係るアミノ酸配列を有する二重ループ状ペプチド：

【表21】

（式中、Ｘと記載されている残基は、システインで置換されており、下線付き残基は、ＣからＡに置換されている）（配列番号５５）。

【0287】

この分析は、ＨＢＣ３４のコアエピトープが、配列番号５６に係るアミノ酸配列によって形成される立体構造的エピトープによって形成されることを示した。

【表22】

【0288】

更に、図１０に示す通り、ヒトモノクローナル抗体ＨＢＣ３４は、還元条件下のＨＢＶウイルス粒子におけるウエスタンブロットにおいて全く反応しない。

【0289】

これら結果は、ＨＢＣ３４が結合するＨＢｓＡｇのエピトープが立体構造的エピトープであることを確認する。

【0290】

これら結果は、ＨＢＣ３４の結合がＴ１２３Ｎ／Ｃ１２４Ｒ突然変異の存在下で失われるという実施例４の所見と一致している。

【0291】

ＨＢＣ３４が結合する立体構造的エピトープを含むＨＢｓＡｇの領域は、様々なＨＢＶ遺伝子型において多形である。ＨＢｓＡｇのエピトープ領域の以下の遺伝子配列では、様々な遺伝子型において突然変異している残基をＸで示す：

【表23】

（式中、Ｘ_１は、好ましくは、Ｒ又はＫであり、
Ｘ_２は、好ましくは、Ｍ又はＴであり、
Ｘ_３は、好ましくは、Ｔ又はＩであり、
Ｘ_４は、好ましくは、Ｔ、Ｐ又はＬである）
（配列番号５７）。

【0292】

更に、上記配列をヒトモノクローナル抗体ＨＢＣ３４が結合する１８種のＨＢｓＡｇ突然変異体と更に比較すると、ＨＢＣ３４が配列番号２に係るアミノ酸配列によって形成されるエピトープに結合することが示される：

【表24】

（式中、Ｘ_１は、Ｐ、Ｔ又はＳであり、
Ｘ_２は、Ｃ又はＳであり、
Ｘ_３は、Ｒ、Ｋ、Ｄ又はＩであり、
Ｘ_４は、Ｍ又はＴであり、
Ｘ_５は、Ｔ、Ａ又はＩであり、
Ｘ_６は、Ｔ、Ｐ又はＬであり、
Ｘ_７は、Ｑ、Ｈ又はＬである）。

【0293】

実施例６：ＨＢＶ感染の３週間後に開始するＨＢＣ３４の投与はヒト化ｕＰａマウスにおけるウイルスの拡散を防ぐ
実施例６の目的は、ヒトモノクローナル抗体ＨＢＣ３４がＨＢＶの拡散を防ぐことができるかどうかを調べることにあった。言い換えれば、初期感染確立後にマウスを処理することによって、侵入阻害剤ＨＢＣ３４抗体のインビボでヒト肝細胞の感染を阻害する能力を調べることが目的であった。この目的のために、一次ヒト肝細胞を再増殖させたナイーブｕＰＡ／ＳＣＩＤマウス（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２６：３３５－３４１を参照）を使用した。脾臓内注射によって、冷凍保存していたヒト肝細胞をこれらマウスに移植した。８週間後、移植されたヒト肝細胞でしか発現しないヒト血清アルブミンを測定して、宿主肝臓におけるヒト肝細胞の再増殖が成功したと判定された。適切なヒトアルブミンレベルのマウスに５×１０^７コピーのＨＢＶゲノム等価物（遺伝子型Ｄ、ＨＢｅＡｇ陽性）をｉ．ｐ．接種して、ウイルスを侵入させた。感染の３週間後、処理プロトコールを開始して、ＨＢＣ３４処理（１ｍｇ／ｋｇ、１週間に２回ｉ．ｐ．投与）、対照抗体、又はエンテカビル（ＥＴＶ；水中１μｇ／ｍＬで経口投与、Ｂａｒａｃｌｕｄｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）のいずれかをマウスに６週間投与した。屠殺時に採取した肝臓試料を、免疫蛍光アッセイ用に液体窒素で急速冷凍した。

【0294】

ＱｉＡｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｖｉｒｕｓ ｓｐｉｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して血清サンプルからＨＢＶ ＤＮＡを抽出した。ＨＢＶ特異的プライマー及びハイブリダイゼーションプローブを使用して、既に記載した通り、ＨＢＶ ＤＮＡウイルス血症及びｃｃｃＤＮＡ量を定量的に測定した（Ｖｏｌｚ Ｔ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ２００７；１３３：８４３－８５２）。Ｍａｓｔｅｒ Ｐｕｒｅ ＤＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ，Ｂｉｏｚｙｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）及びＲＮｅａｓｙ ＲＮＡ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、肝臓試料からＤＮＡ及びＲＮＡを抽出した。ベータ－グロビン遺伝子キット（Ｒｏｃｈｅ ＤＮＡ ｃｏｎｔｒｏｌ Ｋｉｔ；Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を使用して、肝内ＨＢＶ ＤＮＡ値を細胞内ＤＮＡ含量に対して正規化した。合計ＨＢＶ ＤＮＡからｃｃｃＤＮＡ量を減じることによって、ｒｃＤＮＡのレベルを推定した。オリゴｄＴプライマー及びＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用してウイルスＲＮＡ及びゲノムＲＮＡを逆転写し、全ウイルスＲＮＡに特異的なプライマーを使用することによって定量した。ＨＢＶ ＲＮＡレベルをヒト特異的ＧＡＰＤＨ ＲＮＡに対して正規化した。製造業者によって推奨されている通り、Ａｂｂｏｔｔ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ ｐｌａｔｆｏｒｍ（ｑｕａｎｔ．ＨＢｓＡｇ ｋｉｔ，Ａｂｂｏｔｔ，Ｉｒｅｌａｎｄ，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）を使用して血液サンプルからＨＢｓＡｇの定量を実施した。ヒト特異的サイトケラチン－１８モノクローナル（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用してキメラマウス肝臓のクリオスタット切片を免疫染色して、ヒト肝細胞を染色した。ＨＢＶコア抗原（ＨＢｃＡｇ）を検出するために、ポリクローナルウサギ抗ＨＢｃＡｇを使用した。Ａｌｅｘａ標識二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）又はＴＳＡ－Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ（ＨＢｃＡｇ）Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，Ｊｕｅｇｅｓｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用することによって特異的シグナルを可視化し、一方、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して核染色を得た。染色された切片を蛍光顕微鏡によって分析した。

【0295】

処理開始時のＨＢＶ ＤＮＡの中央ベースラインレベルは、２×１０^６ＤＮＡコピー／ｍＬであった。ＨＢＶ感染の拡散相（ｐ．ｉ．（感染後）３週間目～６週間目）において、対照抗体を投与した群ではウイルス血症が＞２ｌｏｇ増加したが、ＨＢＣ３４又はエンテカビルで処理したマウスではＨＢＶ力価が低下した（図１１）。

【0296】

また、実験の最後（即ち、９週間目）にＨＢｓＡｇの存在について肝細胞を染色することによって、マウスの肝内分析を行った。対照抗体を投与したマウスでは殆ど全ての肝細胞がＨＢｓＡｇ陽性に染色されたが、エンテカビルによる処理及びＨＢＣ３４による処理ではいずれも拡散が効率的にブロックされた（ＨＢｓＡｇ陽性細胞は約１％～約５％）。これら結果は、ＨＢＣ３４がＨＢＶ感染の増加相中にウイルスの拡散を効率的にブロックできることを示す（図１２）。

【0297】

組織学的及び血清学的データと一致して、ｃｃｃＤＮＡ測定は、ＨＢＶ感染の３週間後に屠殺したマウスと感染後３週間目から９週間目まで処理したマウスとの間で肝内ｃｃｃＤＮＡ量が著しく異なってはいないことを示した。比較すると、ｃｃｃＤＮＡ／細胞の推定量は感染の９週間後に屠殺した対照群において最高２ｌｏｇ増加した。これは、処理マウスでは、新たに形成されたｒｃＤＮＡをｃｃｃＤＮＡに効率的に変換することができなかったことを示唆する（図１３）。また、弛緩環状ＤＮＡ（ｒｃＤＮＡ）及びＨＢＶ ＲＮＡ転写産物のレベル等、他の肝内ウイルスパラメータを測定することによっても同じ傾向がみられた。

【0298】

更に、ベースライン（ＢＬ）、処理の３週間目（感染後６週間目）及び処理の６週間目（感染後９週間目）に血液循環ＨＢｓＡｇのレベルを測定した。ＨＢＣ３４を投与したマウスでは循環ＨＢｓＡｇのレベルが＞１ｌｏｇ（及び検出限界未満に）低下したが、エンテカビルで処理したマウスでは低下せず、一方、対照群ではＨＢｓＡｇのレベルが＞２ｌｏｇ増加した（５，０００ＩＵ／ｍＬ～１０，０００ＩＵ／ｍＬのレベルに達した）ことは注目に値する（図１４）。ＨＢＣ３４抗体をＨＢｓＡｇ陽性マウスの血清に添加してもＡｂｂｏｔｔ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙを使用した予測測定値が変化しなかったｓｐｉｋｅ－ｉｎ実験において測定された通り、ＨＢｓＡｇの測定値は、ＨＢＣ３４抗体の存在によって影響を受けなかった。

【0299】

これら結果は、ＨＢＣ３４がＨＢＶウイルスの拡散をブロックし、ＨＢｓＡｇのクリアランスを促進できることを示す。

【0300】

実施例７：慢性的にＨＢＶに感染しているヒト化ｕＰａマウスにＨＢＣ３４を投与すると、ＨＢＶ及びＨＢｓＡｇのクリアランスを促進した
Ｂ型肝炎の慢性状況を模倣するために、ナイーブヒト化ｕＰａ／ＳＣＩＤマウスにＨＢＶを感染させたところ、感染の１２週間後、ＨＢＶ ＤＮＡの中央レベルは２×１０^９コピー／ｍＬ、ＨＢｓＡｇのレベルは１０，０００ＩＵ／ｍＬに達した。これらレベルは、慢性ＨＢＶ感染ヒト患者において一般的にみられるレベルと同等である。

【0301】

その後、感染後１２週間目から開始して６週間に亘ってＨＢＣ３４又は対照抗体のいずれかでマウスを処理した（１ｍｇ／ｋｇ、１週間に２回ｉ．ｐ．）。図１５に示す通り、３週間（感染後１５週間目）及び６週間（感染後１８週間目）ＨＢＣ３４を投与したマウスでは、ＨＢＶ力価及び血液循環ＨＢｓＡｇのレベルが低下した。したがって、６週間処理した後、ＨＢＣ３４は、ＨＢＶウイルス血症及びＨＢｓＡｇレベルの両方の明らかな減少を促進した。ＨＢｅＡｇ及びヒトアルブミンレベルはＨＢＣ３４処理マウスで変化せず、これは、肝毒性が存在しないことを示す。

【0302】

実施例８：ＨＢＣ３４の投与はインビボでＨＤＶ感染をブロックする
ナイーブヒト化ｕＰａ／ＳＣＩＤマウスに、ＨＤＶ－ＲＮＡ及びＨＢＶ－ＤＮＡを含有する患者由来血清を同時感染させた。感染の５週間後（ＨＢＶ力価は１０^７～１０^９のレベルに達し、ＨＤＶ ＲＮＡは１０^３コピー／ｍＬ～１０^６コピー／ｍＬのレベルに達した）、６週間に亘ってＨＢＣ３４又は対照抗体でマウスを処理した（１ｍｇ／ｋｇ、１週間に２回ｉ．ｐ．）。

【0303】

実施例６及び７に記載の通りＨＢＶ ＤＮＡウイルス血症を測定した。ウイルスＲＮＡ（ＱｉＡｍｐ ＭｉｎＥｌｕｔｅ Ｖｉｒｕｓ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖｅｎｌｏ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して血清サンプルから抽出）の逆転写、並びにＡＢＩ Ｆａｓｔ １－Ｓｔｅｐ Ｖｉｒｕｓ Ｍａｓｔｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ））、ＨＤＶ特異的プライマー、及びＡＢＩ Ｖｉｉａ７におけるプローブ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ））を使用する定量ＲＴ－ＰＣＲを介してウイルス血症を測定した。

【0304】

図１６に示す通り、処理の３週間後及び６週間後（それぞれ８週間目及び１１週間目）の両方において、ＨＢＣ３４はＨＤＶウイルスの拡散を効率的にブロックした。ＨＢＶに慢性的に感染しているマウスにおける所見と同様に、ＨＢＣ３４は、ＨＢＶウイルスＤＮＡ力価の２ｌｏｇ減少を促進した（図１３）。

【0305】

実施例９：ＨＢＣ３４不連続エピトープの精細エピトープマッピング
実施例５に記載されたＨＢＣ３４抗体によって認識されるエピトープを更に精密にするために、１６種の異なるセットで構成される１，５２０個のペプチドの新規ライブラリを作製した：
－ セット１（ＬＩＮ１５と称する）：１個の残基がオフセットしている標的配列（配列番号５：ＱＧＭＬＰＶＣＰＬＩＰＧＳＳＴＴＳＴＧＰＣＲＴＣＭＴＴＡＱＧＴＳＭＹＰＳＣＣＣＴＫＰＳＤＧＮＣＴＣＩＰＩＰＳＳＷＡＦＧＫＦＬＷＥＷＡＳＡＲＦＳＷ；Ｊ０２２０３（Ｄ、ａｙｗ３））に由来する直鎖状１５ｍｅｒペプチド。ネイティブＣｙｓ残基はアセトアミドメチル基（「Ａｃｍ」とも称される；それぞれのアミノ酸配列において「２」と表される）によって保護されている。
－ セット２（ＬＩＮ２２と称する）：１個の残基がオフセットしている標的配列（配列番号５：ＱＧＭＬＰＶＣＰＬＩＰＧＳＳＴＴＳＴＧＰＣＲＴＣＭＴＴＡＱＧＴＳＭＹＰＳＣＣＣＴＫＰＳＤＧＮＣＴＣＩＰＩＰＳＳＷＡＦＧＫＦＬＷＥＷＡＳＡＲＦＳＷ；Ｊ０２２０３（Ｄ、ａｙｗ３））に由来する直鎖状２２ｍｅｒペプチド。ネイティブＣｙｓ残基はＡｃｍ（「２」と表される）によって保護されている。
－ セット３（ＬＩＮ３０と称する）：１個の残基がオフセットしている標的配列（配列番号５：ＱＧＭＬＰＶＣＰＬＩＰＧＳＳＴＴＳＴＧＰＣＲＴＣＭＴＴＡＱＧＴＳＭＹＰＳＣＣＣＴＫＰＳＤＧＮＣＴＣＩＰＩＰＳＳＷＡＦＧＫＦＬＷＥＷＡＳＡＲＦＳＷ；Ｊ０２２０３（Ｄ、ａｙｗ３））に由来する直鎖状３０ｍｅｒペプチド。ネイティブＣｙｓ残基はＡｃｍ（「２」と表される）によって保護されている。
－ セット４（ＬＩＮ１５．ＡＡと称する）：９位及び１０位の残基がＡｌａによって置換されていることを除いてセット１のペプチド。ネイティブＡｌａがいずれかの位置に存在していたとき、Ｇｌｙによって置換した。
－ セット５（ＬＩＮ２２．ＡＡと称する）：１２位及び１３位の残基がＡｌａによって置換されていることを除いてセット２のペプチド。ネイティブＡｌａがいずれかの位置に存在していたとき、Ｇｌｙによって置換した。
－ セット６（ＬＩＮ３０．ＡＡと称する）：１６位及び１７位の残基がＡｌａによって置換されていることを除いてセット３のペプチド。ネイティブＡｌａがいずれかの位置に存在していたとき、Ｇｌｙによって置換した。
－ セット７（ＣＹＳ．Ａと称する）：長さ２７のコンビナトリアルペプチド。１位～１１位及び１７位～２７位では、対合しているＣｙｓ残基を含有する直鎖状配列である。これら１１ｍｅｒ配列は、「ＧＧＳＧＧ」（配列番号７９）リンカーを介して結合していた。ジスルフィド架橋の形成に関与していないＣｙｓ残基は、Ａｃｍによって保護されている（「２」と表される）。
－ セット８（ＣＹＳ．Ｂと称する）：ジスルフィド架橋を形成する２個のＣｙｓを含有する直鎖状２２ｍｅｒ配列。ジスルフィド架橋の形成に関与していないＣｙｓ残基は、Ａｃｍによって保護されている（「２」と表される）。
－ セット９（ＬＯＯＰ１２と称する）：長さ１２の拘束性ペプチド。２位～１１位では、ＨＢＶ－Ｓ－Ａｇの抗原性ループの標的配列に由来する１０ｍｅｒ配列である。１位及び１２位は、ｍＰ２ ＣＬＩＰＳによって結合されているＣｙｓ残基である。ネイティブＣｙｓ残基は、Ａｃｍによって保護されている（「２」と表される）。
－ セット１０（ＬＯＯＰ１５と称する）：長さ１５の拘束性ペプチド。２位～１４位では、ＨＢＶ－Ｓ－Ａｇの抗原性ループの標的配列に由来する１３ｍｅｒ配列である。１位及び１５位は、ｍＰ２ ＣＬＩＰＳによって結合されているＣｙｓ残基である。ネイティブＣｙｓ残基は、Ａｃｍによって保護されている（「２」と表される）。
－ セット１１（ＬＯＯＰ２１と称する）：長さ２１の拘束性ペプチド。２位～２０位では、ＨＢＶ－Ｓ－Ａｇの抗原性ループの標的配列に由来する１９ｍｅｒ配列である。１位及び２１位は、ｍＰ２ ＣＬＩＰＳによって結合されているＣｙｓ残基である。ネイティブＣｙｓ残基は、Ａｃｍによって保護されている（「２」と表される）。
－ セット１２（ＬＯＯＰ３１と称する）：長さ３１の拘束性ペプチド。２位～３０位では、ＨＢＶ－Ｓ－Ａｇの抗原性ループの標的配列に由来する２９ｍｅｒ配列である。１位及び３１位は、ｍＰ２ ＣＬＩＰＳによって結合されているＣｙｓ残基である。ネイティブＣｙｓ残基は、Ａｃｍによって保護されている（「２」と表される）。
－ セット１３（ＭＡＴ．Ａと称する）：長さ２５のコンビナトリアルペプチド。２位～１２位及び１４位～２４位では、ＨＢＶ－Ｓ－Ａｇの抗原性ループの標的配列に由来する１１ｍｅｒペプチドである。１位、１３位、及び２５位は、Ｔ３ ＣＬＩＰＳによって結合されているＣｙｓ残基である。ネイティブＣｙｓ残基は、Ａｃｍによって保護されている（「２」と表される）。
－ セット１４（ＭＡＴ．Ｂと称する）：長さ２８のコンビナトリアルペプチド。２位～１２位及び１４位～２７位では、それぞれ１１ｍｅｒ及び１４ｍｅｒペプチドである。１位、１３位、及び２８位は、Ｔ３ ＣＬＩＰＳによって結合されているＣｙｓ残基である。ネイティブＣｙｓ残基は、Ａｃｍによって保護されている（「２」と表される）。
－ セット１５（ＭＡＴ．Ｃと称する）：長さ２８のコンビナトリアルペプチド。２位～１５位及び１７位～２７位では、それぞれ１４ｍｅｒ及び１１ｍｅｒのペプチドである。１位、１６位、及び２８位は、Ｔ３ ＣＬＩＰＳによって結合されているＣｙｓ残基である。ネイティブＣｙｓ残基は、Ａｃｍによって保護されている（「２」と表される）。
－ セット１６（ＭＡＴ．Ｄと称する）：長さ３１のコンビナトリアルペプチド。２位～１５位及び１７位～３０位では、ＨＢＶ－Ｓ－Ａｇの抗原性ループの標的配列に由来する１４ｍｅｒペプチドである。１位、１６位、及び３１位は、Ｔ３ ＣＬＩＰＳによって結合されているＣｙｓ残基である。ネイティブＣｙｓ残基は、Ａｃｍによって保護されている（「２」と表される）。

【0306】

高ストリンジェンシー条件下で試験したとき、抗体ＨＢＣ３４は、アレイ上に存在するいずれのペプチドにも結合しなかった。低ストリンジェンシー条件下（０．１％Ｐｅｐｓｃａｎバッファ及びウマ血清及びオボアルブミンの組合せを含有するプレコンティショニング中５μｇ／ｍＬ）で試験したとき、抗体が結合している拘束性及びコンビナトリアルペプチド（セット１４及びセット１６に由来するペプチドに結合している）は、セット１３及びセット１５と比較して若干少なかった。直鎖状ペプチド模倣体では結合が記録されなかった。データを図１７に示す。これらデータは、抗体ＨＢＣ３４がペプチド伸長_１８ＴＧＰＣＲＴＣ_２４（配列番号８０）及び_４５ＧＮＣＴＣＩＰ_５１（配列番号８１）で構成される立体構造的不連続エピトープを認識することを示し、ここで、ペプチド伸長_１８ＴＧＰＣＲＴＣ_２４（配列番号８０）がエピトープのドミナントな部分である（図１７）。

【0307】

上記結果に基づく完全置換分析を用いて抗体ＨＢＣ３４のエピトープを精細にマッピングするために、３つの異なるセットで構成される８１２個の不連続又はループ状のＴ３ ＣＬＩＰＳペプチドを合成した：
－ セット１（ＲＮ１と称する；不連続Ｔ３ ＣＬＩＰＳ）：不連続模倣体Ｃ２ＩＰＩＰＳＳＷＡＦＧＣＳＴＴＳＴＧＰ２ＲＴ２Ｃ（配列番号８２）に由来するエピトープ突然変異体シリーズ。この配列の各位置について、置換分析を実施した。言い換えれば、ペプチド配列の各位置について、かかる位置における元のアミノ酸が、アラニン（Ａ）、グルタミン酸（Ｅ）、フェニルアラニン（Ｆ）、グリシン（Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、ロイシン（Ｌ）、プロリン（Ｐ）、グルタミン（Ｑ）、アルギニン（Ｒ）、セリン（Ｓ）、バリン（Ｖ）、チロシン（Ｙ）、及び「＿」（「＿」は、残基の欠失を意味する）からなる群から選択される１３種のアミノ酸のうちの１つによって置換されている変異体を作製した。ネイティブＣｙｓ残基は、Ａｃｍによって保護されている（「２」と表される）。
－ セット２（ＲＮ２と称する；不連続Ｔ３ ＣＬＩＰＳ）：不連続模倣体ＣＧＮ２Ｔ２ＩＰＩＰＳＳＷＡＦＣＳＴＴＳＴＧＰ２ＲＴ２Ｃ（配列番号８３）に由来するエピトープ突然変異体シリーズ。この配列の各位置について、セット１と同様に置換分析を実施した（即ち、ＧＮ２Ｔ残基は突然変異していなかった）。ネイティブＣｙｓ残基は、Ａｃｍによって保護されている（「２」と表される）。
－ セット３（ＲＮ３と称する；Ｌｏｏｐ Ｔ３ ＣＬＩＰＳ）：ループ状模倣体ＣＧＧＧＣＳＴＴＳＴＧＰ２ＲＴ２Ｃ＿（配列番号８４）に由来するエピトープ突然変異体シリーズ。この配列の６位～１６位について、セット１と同様に置換分析を実施した。ネイティブＣｙｓ残基は、Ａｃｍによって保護されている（「２」と表される）。

【0308】

０．１％ＳＱ（ウマ血清及びオボアルブミンの組合せを０．１％含有するＰｅｐｓｃａｎバッファ）でプレコンティショニングしたペプチドアレイ上にて２０μｇ／ｍＬでＨＢＣ３４抗体をＰＥＰＳＣＡＮベースのＥＬＩＳＡにおいて試験した。ペプチドアレイをＨＢＣ３４抗体溶液と共にインキュベートした（４℃で一晩）。洗浄後、２５℃で１時間、適切な抗体ペルオキシダーゼコンジュゲート（ＳＢＡ）の１／１，０００希釈物と共にペプチドアレイをインキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ基質２，２’－アジノ－ジ－３－エチルベンズチアゾリンスルホネート（ＡＢＴＳ）及び２０μＬ／ｍＬ ３％Ｈ_２Ｏ_２を添加した。１時間後、発色を測定した。電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ及び画像処理システムを用いて発色を定量した。

【0309】

予測通り、低ストリンジェンシー条件下で試験したとき、抗体ＨＢＣ３４は、全てのセットのペプチドに結合した。実験の結果は、残基_１２０ＰＣＲ_１２２及びＣ_１２４が結合にとって重要であるが、特定の残基Ｉ１５０、Ｉ１５２、Ｗ１５６、及びＦ１５８の置換のみが結合を顕著に減少させることを示す（図１８）。更に、３つ全てのアレイに記録されたデータは、領域_１１４ＳＴＴＳＴＧＰＣＲＴＣ_１２４（配列番号８５）内の任意の残基をＥで置換すると結合が減少するが、Ｒ又はＹで逆置換すると結合が増加することを明確に示した。しかし、これは領域_１４５ＧＮＣＴＣＩＰＩＰＳＳＷＡＦＣ_１５９（配列番号８６）では観察されなかった。

【0310】

まとめると、これら結果は、抗体ＨＢＣ３４が不連続エピトープを認識し、残基_１２０ＰＣＲ_１２２及びＣ_１２４が結合にとって重要であることを示唆する。残基_１４５ＧＮＣＴＣＩＰＩＰＳＳＷＡＦ_１５８（配列番号８７）の存在は、エピトープを確立及び安定化するための構造的状況を提供することが示された（パラトープ相互作用）。この結論は、不連続エピトープ模倣体（_１４５ＧＮＣＴＣＩＰＩＰＳＳＷＡＦ_１５８（配列番号８７）及び_１１４ＳＴＴＳＴＧＰＣＲＴＣ_１２４（配列番号８５）が１つの模倣体中に存在するとき）が、配列_１１４ＳＴＴＳＴＧＰＣＲＴＣ_１２４（配列番号８５）のみ（セット３、ＲＮ３）よりも置換に対する抵抗性が強いという知見から得られた。更に、ねじれ角を固定して立体構造の剛性を提供するＰ１５１は、特に逆の特性で知られているＧによって置換されたとき、結合に影響を与えることが示された。置換Ｇ１４５Ｐは、同様に、ＨＢＣ３４の結合に影響を与える。Ｒ／Ｙ置換はモチーフ_１１４ＳＴＴＳＴＧＰＣＲＴＣ_１２４（配列番号８５）内の任意の位置に対する結合を改善するが、モチーフ_１４５ＧＮＣＴＣＩＰＩＰＳＳＷＡＦ_１５８（配列番号８７）内では改善せず、一方、Ｅ置換は結合を減少させることが繰り返し観察された。この所見は、残基_１１４ＳＴＴＳＴＧＰＣＲＴＣ_１２４（配列番号８５)が抗体ＨＢＣ３４内の負に帯電しているパラトープに結合し（即ち、負電荷のクラスタに近接し）、結合の改善及び静電力からの減少した結果であり、むしろ、エピトープではなくパラトープの特徴を特徴付けることを示唆し得る。

【0311】

実施例１０：ＨＢＣ３４及びラミブジンの組合せで処理された慢性的にＨＢＶに感染しているヒト化ｕＰＡマウスにおけるＨＢｓＡｇの減少増大
更なる研究では、抗体ＨＢＣ３４を含む併用療法の有効性について調べた。ＨＢＣ３４との組合せでは、ポリメラーゼ阻害剤、即ち、ラミブジンを選択した。

【0312】

慢性Ｂ型肝炎の状況を模倣するために、ナイーブヒト化ｕＰａ／ＳＣＩＤマウスにＨＢＶを感染させたところ、感染の８週間後、ＨＢＶ ＤＮＡの中央レベルは２×１０^９コピー／ｍＬ、ＨＢｓＡｇのレベルは９，０００ＩＵ／ｍＬに達した。これらレベルは、慢性的にＨＢＶに感染しているヒト患者において一般的にみられるレベルと同等である。

【0313】

その後、感染後８週間目から開始して４週間に亘って、抗体ＨＢＣ３４のみ、ポリメラーゼ阻害剤であるラミブジンのみ、ＨＢＣ３４とラミブジンとの組合せ、又は対照抗体のいずれかでマウスを処理した（ＨＢＣ３４：１ｍｇ／ｋｇ、１週間に２回ｉ．ｐ．；ラミブジン：飲料水中に０．４ｍｇ／ｍＬで添加）。

【0314】

処理の０週間目（処理前）、処理の２週間目、処理の４週間目、及び処理の６週間目、又は処理の０週間目（処理前）、処理の３週間目、及び処理の６週間目にＨＢＶウイルス血症及び血清中のＨＢｓＡｇレベルを評価した。結果を図１９Ａ（ＨＢＶウイルス血症）及びＢ（ＨＢｓＡＧ）に示す。

【0315】

図１９に示す通り、ＨＢＣ３４、ラミブジン、又は両薬物の組合せによる処理は、それぞれ、ウイルス血症（Ａ）を平均０．７ｌｏｇ、１．３ｌｏｇ、及び２．４ｌｏｇ減少させた。尚、ＨＢｓＡｇ（Ｂ）は、ＨＢＣ３４のみを投与したマウスにおいて１．３ｌｏｇ（平均ＢＬ＝１５，６００ＩＵ／ｍＬ）、組合せ群において２．６ｌｏｇ（平均ＢＬ＝２，６００ＩＵ／ｍＬ）低下したが、ラミブジンのみで処理したマウスでは著しいＨＢｓＡｇ減少は検出されなかった（０．２ｌｏｇ；平均ＢＬ＝９，０００ＩＵ／ｍＬ）。

【0316】

要約すると、ＨＢＣ３４とラミブジンとの組合せによって、最も強い効果が明らかに得られた。興味深いことに、ラミブジンのみが有効ではなかった場合さえも、ＨＢＣ３４とラミブジンとの組合せのかかる強力な効果が観察された。それに鑑みて、ＨＢＣ３４とラミブジンとの組合せの観察された強力な効果は、明らかに、予想外の相乗効果である。

【0317】

要約すると、併用療法において達成された驚くほど強力なＨＢｓＡｇの減少は、ＨＢＶ単独感染患者及びＨＢＶ／ＨＤＶ同時感染患者の両方においてＨＢｓＡｇのクリアランスを促進するために、ポリメラーゼ阻害剤と組み合わせて、例えば慢性の状況において、ＨＢＣ３４抗体を使用できることを証明する。

【0318】

実施例１１：ＨＢＣ３４抗体の配列操作：ＶＨ及びＶＬのＣＤＲ３
（ｉ）ＶＨ ＣＤＲ３の残基Ｗ１０７のＡ又はＦへの、（ｉｉ）ＶＨ ＣＤＲ３の残基Ｍ１１５のＩ又はＬへの、及び／又は（ｉｉｉ）ＶＬ ＣＤＲ３の残基Ｗ１０７のＡ又はＦへの突然変異によって、ＶＨ及びＶＬのＣＤＲ３に突然変異を有するＨＢＣ３４突然変異体の第１のシリーズを作製した。図２０及び図２１に示す通り、ＨＢＣ３４の突然変異していないＶＨ又はＶＬ（以後ＷＴ、野生型、又は親抗体と称する）とＶＨ及びＶＬ突然変異体の様々な組合せとを合わせることによって合計１８種のＨＢＣ３４変異体を作製した。

【0319】

実施例１と同様に、作製したＨＢＣ３４抗体変異体をＨＢｓＡｇ ａｄｗ抗原への結合についてＥＬＩＳＡによって試験した。結果を図２１に示す。

【0320】

注目すべきことに、ＶＨ ＣＤＲ３のＷ１０７のＡへの突然変異（ＨＢＣ３４－Ｖ５、ＨＢＣ３４－Ｖ８、ＨＢＣ３４－Ｖ９、ＨＢＣ３４－Ｖ１０、ＨＢＣ３４－Ｖ１２、及びＨＢＣ３４－Ｖ１７変異体において、図２１）は、ＨＢＣ３４のＨＢｓＡｇへの結合を完全に消失させた。これは、Ｗ１０７が抗原を認識するためのＨＢＣ３４パラトープにおいて重要な残基であることを示す。ＶＨ ＣＤＲ３のＷ１０７のＦ（Ｗと同様の芳香族特徴を有するアミノ酸）への突然変異は、ＨＢＣ３４の結合に部分的に影響を与え（ＨＢＣ３４－Ｖ１）、これは、ＨＢＣ３４のＨＢｓＡｇに対する結合親和性を損なわせることなしにＷを突然変異させることはできないことを示す。

【0321】

ＶＨ ＣＤＲ３のＭ１１５のＬへの突然変異はＨＢＣ３４の結合に影響を与えなかった（ＨＢＣ３４－Ｖ１３）が、Ｉへの突然変異（ＨＢＣ３４－Ｖ１１）は、ＨＢＣ３４の結合を部分的に減少させた。このことは、ＨＢＣ３４の結合を損なわせることなしにＭ１１５をＬによって置換することはできるが、Ｉによって置換することはできないことを示す。単一突然変異Ｗ１０７Ａで得られた結果と一致して、二重突然変異Ｗ１０７Ａ及びＭ１１５Ａ（ＨＢＣ３４－Ｖ１０）はＨＢＣ３４の結合を完全に消失させた。

【0322】

ＶＬ ＣＤＲ３のＷ１０７のＦへの突然変異は、ＨＢＣ３４の結合に影響を与えなかった（ＨＢＣ３４－Ｖ７）が、Ａへの突然変異（ＨＢＣ３４－Ｖ１５）は、ＨＢＣ３４の結合を部分的に減少させた。このことは、ＨＢＣ３４の結合を損なわせることなしにＶＬ ＣＤＲ３のＷ１０７をＦによって置換することはできるが、Ａによって置換することができないことを示す。予測通り、ＶＨのＣＤＲ３におけるＷ１０７Ｆ及びＶＬのＣＤＲ３におけるＷ１０７Ａの突然変異の組合せは、結合を完全に消失させた（ＨＢＣ３４－ｖ２）。ＶＨ ＣＤＲ３におけるＭ１１５Ｌ及びＶＬ ＣＤＲ３におけるＷ１０７Ｆの突然変異の組合せ（ＨＢＣ３４－Ｖ６）、ＶＨ ＣＤＲ３におけるＭ１１５Ｉ及びＶＬ ＣＤＲ３におけるＷ１０７Ｆの突然変異の組合せ（ＨＢＣ３４－ｖ４）、並びにＶＨ ＣＤＲ３におけるＷ１０７Ｆ及びＶＬ ＣＤＲ３におけるＷ１０７Ｆの突然変異の組合せは、ＨＢＣ３４のＨＢｓＡｇへの結合に部分的に影響を与えた。このことは、個々の突然変異ではなく、これら２つの突然変異の組合せが、親ＨＢＣ３４抗体の結合親和性を保持するために適合しないことを示す。

【0323】

次の工程では、（ｉ）最初の結果を確認するため；（ｉｉ）ＥＬＩＳＡによる結合親和性を測定するため（即ち、結合のＥＣ５０を測定するため）；及び（ｉｉｉ）一過的にトランスフェクトされた２９３－Ｅｘｐｉ細胞からのこれらＨＢＣ３４変異体の生産性を評価するために、上記１８種のＨＢＣ３４変異体のうちの６種を更なる特性評価のために選択した（ＨＢＣ３４－Ｖ１、Ｖ３、Ｖ４、Ｖ６、Ｖ７、Ｖ１１、及びＶ１３）（図２２及び図２３）。

【0324】

最初の実験で観察された通り、ＨＢＣ３４－Ｖ３変異体（二重突然変異ＶＨ ＣＤＲ３のＷ１０７Ｆ及びＶＬ ＣＤＲ３のＷ１０７Ｆを保有）は、親ＨＢＣ３４抗体と比べて９倍高いＥＣ５０でＨＢｓＡｇ（ａｄｗ血清型）に結合した。更に、ＨＢＣ３４－Ｖ３は、ＨＢＣ３４と比べて略５倍低い濃度で産生される。それぞれ単一突然変異Ｍ１１５Ｉ及びＭ１１５Ｌを保有しているＨＢＣ３４－Ｖ１１及びＨＢＣ３４－Ｖ１３変異体は、ＨＢＣ３４と同一であるか又は僅かに高いＥＣ５０でＨＢｓＡｇに結合した。しかし、両変異体の生産性はＨＢＣ３４よりも僅かに低かった（ＨＢＣ３４と比較したとき、０．６倍及び０．３倍生産性が低い）。これら結果は、ＨＢＣ３４－Ｖ１１及び更にはＨＢＣ３４－Ｖ１３変異体が、ＨＢｓＡｇに対して高い親和性で結合するが、哺乳類細胞における産生効率は低いことを示す。同様に、ＶＨ ＣＤＲ３における単一突然変異Ｗ１０７Ｆを保有しているＨＢＣ３４－Ｖ１変異体は、ＨＢＣ３４と同等にＨＢｓＡｇと結合した（１．６倍高いＥＣ５０）が、ＨＢＣ３４と比較して産生効率は４倍低かった（即ち、０．２５倍）。ＶＬ ＣＤＲ３のＷ１０７とＶＨ ＣＤＲ３のＷ１０７、Ｍ１１５Ｉ、又はＭ１１５Ｌとの組合せ（ＨＢＣ３４－Ｖ３、ＨＢＣ３４－Ｖ４、及びＨＢＣ３４－Ｖ６）は、結合親和性（１．６倍～９．０倍高いＥＣ５０）及び生産性（培養上清中の抗体濃度が０．２０倍～０．３５倍低い）の両方を低下させた。驚くべきことに、ＶＬ ＣＤＲ３の単一突然変異Ｗ１０７Ｆ（ＨＢＣ３４－Ｖ７）は、ＨＢＣ３４と同様にＨＢｓＡｇに結合し、ＨＢＣ３４よりも更に高い効率で（最高１．７倍）産生され、培養上清中５３３μｇ／ｍＬという顕著に高い濃度に達した（図２３）。

【0325】

実施例１２：ＨＢＣ３４抗体の配列操作：フレームワーク領域
ＨＢＣ３４非突然変異型の共通祖先（ＨＢＣ３４－ＵＣＡ）でみられる残基に対応するＶＨ及びＶＬの両方のフレームワーク領域（ＦＲ）に幾つかの突然変異を導入し（図２０）、ＶＨ ＣＤＲ３突然変異Ｍ１１５Ｌ及びＶＬ ＣＤＲ３突然変異Ｗ１０７Ｆと組み合わせた１２種の追加のＨＢＣ３４変異体を作製した（ＨＢＣ３４－Ｖ１９～ＨＢＣ３４－Ｖ３０；図２４Ａ）。

【0326】

結果を図２４に示す。ＶＬ ＣＤＲ３におけるＷ１０７突然変異の存在下でＶＬのＦＲに９個の突然変異を導入し（ＨＢＣ３４－２７、ＨＢＣ３４－Ｖ２８、ＨＢＣ３４－Ｖ２９、及びＨＢＣ３４－Ｖ３０）、ＷＴ、Ｍ１１５Ｌと組み合わせると、ＨＢＣ３４のＨＢｓＡｇへの結合が著しく減少した。したがって、これは、ＶＬにおける突然変異型残基の重要な役割を示す（図２４Ａ～Ｂ）。上記と同じＶＬ変異体（即ち、Ｗ１０７Ｆ／ＦＲ１２３４－ＧＬ）をＭ１１５Ｌ突然変異及びＦＲにおける更なる９個の突然変異を保有しているＶＨと組み合わせたＨＢＣ３４変異体は、ＨＢｓＡｇに結合しなかった。このことは、ＶＨ及びＶＬの両方における突然変異がＨＢｓＡｇ結合に本質的に寄与していることを示す。

【0327】

重要なことに、ＨＢＣ３４-Ｖ２３及びＨＢＣ３４-Ｖ２４におけるＶＬのＦＲに導入された９個の突然変異のうちの１つだけ（即ち、Ｋ６６Ｙ）を除去すると、Ｙ６６Ｋ突然変異を保有している対応する変異体（ＨＢＣ３４-Ｖ２７及びＨＢＣ３４-Ｖ２８）と比較してＨＢｓＡｇに対する結合が著しく増加した（ＥＣ５０が１００倍低い）。同様に、ＨＢＣ３４-Ｖ２５及びＨＢＣ３４-Ｖ２６においてＫ６６Ｙ突然変異を除去すると、Ｙ６６Ｋ突然変異を保有している対応する非結合変異体（ＨＢＣ３４-Ｖ２７及びＨＢＣ３４-Ｖ２８）と比較してＨＢｓＡｇの結合が回復した。

【0328】

これらの中でも、ＨＢＣ３４－Ｖ２３変異体は、高親和性結合を保持しており（ＨＢＣ３４と比べてＥＣ５０が１．５倍高い）、親ＨＢＣ３４抗体と同様に産生された。注目すべきことに、ＨＢＣ３４－Ｖ２３変異体とアミノ酸が１つだけ異なるＨＢＣ３４－Ｖ２４（即ち、ＶＨにおけるＭ１１５Ｌ）は、ＨＢＣ３４－Ｖ２３と同様のＥＣ５０でＨＢｓＡｇに結合したが、効率的には産生されなかった（ＨＢＣ３４と比べて生産性が僅か０．１４倍）。これら結果は、ＨＢＣ３４変異体のＨＢｓＡｇに対する結合に著しく影響を与えることはないが、１１５位におけるＬの存在がこの突然変異を保有しているＨＢＣ３４変異体の生産性に対して負の影響を有していることを示す。実際に、Ｍ１１５Ｌ突然変異を保有している全てのＨＢＣ３４変異体（ＨＢＣ３４－Ｖ６、ＨＢＣ３４－Ｖ１３、ＨＢＣ３４－Ｖ１９、ＨＢＣ３４－Ｖ２０、ＨＢＣ３４－Ｖ２１、ＨＢＣ３４－Ｖ２２、ＨＢＣ３４－Ｖ２４、ＨＢＣ３４－Ｖ２５、ＨＢＣ３４－Ｖ２６、ＨＢＣ３４－Ｖ２８、ＨＢＣ３４－Ｖ２９、及びＨＢＣ３４－Ｖ３０）は、平均して、親ＨＢＣ３４抗体と比較して０．３倍の平均生産性を有する。

【0329】

注目すべきことに、ＶＨ ＣＤＲ３におけるＭ１１５Ｌ突然変異の存在下でＶＨのＦＲに５個又は９個の突然変異を導入しても（それぞれ、ＨＢＣ３４－Ｖ１９及びＨＢＣ３４－Ｖ２０）、ＨＢｓＡｇへの結合は感知できるほどには減少しなかった。これは、突然変異型残基がＨＢＣ３４抗体による高親和性抗原認識において重要な役割を有していないことを示唆する。ＨＢＣ３４－Ｖ２１及びＨＢＣ３４－Ｖ２２におけるＨＢＣ３４Ｖ１９及びＨＢＣ３４－Ｖ２０変異体の骨格にＷ１０７Ｆ突然変異を導入すると、ＨＢｓＡｇに対する結合が２０倍～３０倍減少した。興味深いことに、同じ突然変異（即ち、ＶＬ ＣＤＲ３におけるＷ１０７）は、ＶＨのＦＲに同じ５個又は９個の突然変異を保有していない他の変異体の結合には影響を与えず、この結果は、ＶＨ ＦＲにおける残基がＨＢｓＡｇに対する結合においてＶＨの残基１０７と（例えば、可変領域のスカフォールドの特定の立体構造を安定化させることによって）協調的役割を有することを示し得る。

【0330】

最後に、図２３に示す実施例１１の結果と一致して、ＶＬ ＣＤＲ３に単一突然変異Ｗ１０７を保有しているＨＭＢ３４－Ｖ７抗体は、ＨＢＣ３４と比較してＨＢｓＡｇに対して同等の結合（即ち、１．４倍）を示し、ＨＢＣ３４よりも効率的に（１．２倍）産生された（実施した２回の実験の平均で、ＨＢＣ３４－Ｖ７は、ＨＢＣ３４抗体よりも１．５倍、即ち５０％効率的に産生された）。この結果は、ＶＬ ＣＤＲ３におけるＷ１０７Ｆ突然変異が、ＨＢｓＡｇに対する結合親和性には感知できるほどの影響は与えないが、ＨＢＣ３４抗体の生産性に対しては正の影響を有することを示唆する。

【0331】

最後に、ＨＢＣ３４並びに変異体ＨＢＣ３４－Ｖ６、ＨＢＣ３４－Ｖ７、ＨＢＣ３４－Ｖ１９、ＨＢＣ３４－Ｖ２３、及びＨＢＣ３４－Ｖ２４を、１０種のＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、及びＪ（図２５に示す）を認識する能力についてフローサイトメトリー分析によって試験した。具体的には、１０種のＨＢＶ遺伝子型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、及びＪの各ＨＢｓＡｇを発現するプラスミドをヒト上皮細胞（Ｈｅｐ２細胞）にトランスフェクトした。一過的にトランスフェクトされた透過処理細胞を染色するために、複数の濃度（５，０００ｎｇ／ｍＬ～７ｎｇ／ｍＬの８つの連続希釈物）で全ての抗体を試験した。トランスフェクションの２日間後、ＨＢＣ３４及び５つの選択された変異体で免疫染色するために、Ｈｅｐ２細胞を回収し、固定し、サポニンで透過処理した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を備えるＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳＣａｎｔｏ２（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、トランスフェクトされた細胞に対する抗体の結合を分析した。図２５に示す通り、ＨＢＣ３４及び試験した５つの変異体全てが、同様のレベルで１０種のＨＢＶ ＨＢｓＡｇ遺伝子型全てを認識した。

【表25-1】

【表25-2】

【表25-3】

【表25-4】

【表25-5】

【表25-6】

【表25-7】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17-1】

【図17-2】

【図17-3】

【図17-4】

【図17-5】

【図18-1】

【図18-2】

【図18-3】

【図18-4】

【図18-5】

【図18-6】

【図18-7】

【図18-8】

【図18-9】

【図18-10】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【配列表】

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