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特開2024-97104ポリ（エチレングリコール）－ｂ－ポリ（４－ナイロン）及びそのナノ粒子
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024097104
(43)【公開日】2024-07-18
(54)【発明の名称】ポリ（エチレングリコール）－ｂ－ポリ（４－ナイロン）及びそのナノ粒子
(51)【国際特許分類】
C08G 69/40 20060101AFI20240710BHJP
C08J 3/14 20060101ALI20240710BHJP
A61P 25/24 20060101ALI20240710BHJP
A61K 31/785 20060101ALI20240710BHJP
【ＦＩ】
C08G69/40
C08J3/14 CEZ
A61P25/24
A61K31/785
【審査請求】未請求
【請求項の数】6
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2021084422
(22)【出願日】2021-05-19
(71)【出願人】
【識別番号】504171134
【氏名又は名称】国立大学法人 筑波大学
(74)【代理人】
【識別番号】110000741
【氏名又は名称】弁理士法人小田島特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】長崎 幸夫
(72)【発明者】
【氏名】ブイドク トリ
【テーマコード（参考）】
4C086
4F070
4J001
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086AA04
4C086FA03
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA12
4F070AA54
4F070AB08
4F070AC12
4F070AC40
4F070AE28
4F070DA22
4F070DA26
4F070DA42
4F070DB09
4F070DC07
4F070DC16
4J001DA02
4J001DB05
4J001DC05
4J001EA04
4J001EE26C
4J001FA01
4J001FB01
4J001FC01
4J001GB01
4J001GB02
4J001GD07
4J001GD08
4J001GD10
4J001JA20
4J001JB01
4J001JB50
4J001JC02
(57)【要約】
【課題】γ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の新規薬物デリバリー系を提供する。
【解決手段】
ポリ（エチレングリコール）（又はＰＥＧ）セグメントとポリ（ＧＡＢＡ）（又はＮｙｌｏｎ ４）セグメントを含むブロックコポリマー、並びに当該ブロックコポリマーのナノ粒子が提供される。当該ナノ粒子は、抑うつの予防又は治療に有用である。
【選択図】 なし
【解決手段】
ポリ（エチレングリコール）（又はＰＥＧ）セグメントとポリ（ＧＡＢＡ）（又はＮｙｌｏｎ ４）セグメントを含むブロックコポリマー、並びに当該ブロックコポリマーのナノ粒子が提供される。当該ナノ粒子は、抑うつの予防又は治療に有用である。
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
式Ｉ：
－（ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ）ｍ－ (I)
式中、ｍは２～５００の整数である、
で表される反復単位のセグメントと、
式ＩＩ:
－（ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ））ｎ－ (II)
式中、ｎは、５～１０００の整数である、
で表される反復単位のセグメントを、含むブロックコポリマー。
－（ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ）ｍ－ (I)
式中、ｍは２～５００の整数である、
で表される反復単位のセグメントと、
式ＩＩ:
－（ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ））ｎ－ (II)
式中、ｎは、５～１０００の整数である、
で表される反復単位のセグメントを、含むブロックコポリマー。
【請求項2】
次式IIIａ又は式IIIｂで表される請求項１のブロックコポリマー。
式IIIａ：
Ａ１－（ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ）ｍ１－Ｌ1－（ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ））ｎ１－Ｗ１
（IIIａ）
又は式IIIｂ:
Ａ２－（ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ）ｍ２－Ｌ２-（Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎ２－Ｗ２
（IIIｂ)
で表され、各式中、
Ａ1及びＡ2は独立して、非置換又は置換Ｃ1－Ｃ12アルキルオキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基又は式Ｒ'Ｒ"ＣＨ－基を表し、ここで、Ｒ'及びＲ"は独立してＣ1－Ｃ4アルコキシ又はＲ'とＲ"は一緒になって－ＯＣＨ2ＣＨ2Ｏ－、－Ｏ（ＣＨ2）3Ｏ－若しくは－Ｏ（ＣＨ2）4Ｏ－を表し、
Ｌ１及びＬ２は独立して、二価の連結基又は存在する場合には直接結合を表し、
Ｗ１は、ヒドロキシル基又は非置換若しくは置換Ｏ－Ｃ1－Ｃ６アルキルを表し、置換されている場合の置換基はハロゲン原子、ヒドロキシル基又はＣ1－Ｃ３アルキル基を表し、
Ｗ２は、水素原子又は非置換若しくは置換Ｃ1－Ｃ６アルキルを表し、置換されている場合の置換基はハロゲン原子、ヒドロキシル基又はＣ1－Ｃ３アルキルを表し、又は非置換若しくは置換Ｃ（＝Ｏ）Ｃ1－Ｃ６アルキルを表し、置換されている場合の置換基はハロゲン原子、ヒドロキシル基若しくはＣ1－Ｃ３アルキル基を表し、
ｍ１及びｍ２は独立して、前記ｍについて定義したとおりであり、かつ、
ｎ１及びｎ２は独立して、前記ｎについて定義したとおりである。
式IIIａ：
Ａ１－（ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ）ｍ１－Ｌ1－（ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ））ｎ１－Ｗ１
（IIIａ）
又は式IIIｂ:
Ａ２－（ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ）ｍ２－Ｌ２-（Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎ２－Ｗ２
（IIIｂ)
で表され、各式中、
Ａ1及びＡ2は独立して、非置換又は置換Ｃ1－Ｃ12アルキルオキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基又は式Ｒ'Ｒ"ＣＨ－基を表し、ここで、Ｒ'及びＲ"は独立してＣ1－Ｃ4アルコキシ又はＲ'とＲ"は一緒になって－ＯＣＨ2ＣＨ2Ｏ－、－Ｏ（ＣＨ2）3Ｏ－若しくは－Ｏ（ＣＨ2）4Ｏ－を表し、
Ｌ１及びＬ２は独立して、二価の連結基又は存在する場合には直接結合を表し、
Ｗ１は、ヒドロキシル基又は非置換若しくは置換Ｏ－Ｃ1－Ｃ６アルキルを表し、置換されている場合の置換基はハロゲン原子、ヒドロキシル基又はＣ1－Ｃ３アルキル基を表し、
Ｗ２は、水素原子又は非置換若しくは置換Ｃ1－Ｃ６アルキルを表し、置換されている場合の置換基はハロゲン原子、ヒドロキシル基又はＣ1－Ｃ３アルキルを表し、又は非置換若しくは置換Ｃ（＝Ｏ）Ｃ1－Ｃ６アルキルを表し、置換されている場合の置換基はハロゲン原子、ヒドロキシル基若しくはＣ1－Ｃ３アルキル基を表し、
ｍ１及びｍ２は独立して、前記ｍについて定義したとおりであり、かつ、
ｎ１及びｎ２は独立して、前記ｎについて定義したとおりである。
【請求項3】
請求項１又は２のブロックコポリマーであって、水性媒体中でポリマーのナノ粒子を形成する、前記ブロックコポリマー。
【請求項4】
請求項２のブロックコポリマーであって、
Ｌ１は、（ＣＨ２）ｐＣ（＝Ｏ）、Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｑ又はＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｒＣ（＝Ｏ）を表し、
Ｌ２は、直接結合、（ＣＨ２）ｓＯ又は（ＣＨ２）ｔＮＨを表し、
ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、及びｔは、それぞれ独立して、１～６の整数である、ブロックコポリマー。
Ｌ１は、（ＣＨ２）ｐＣ（＝Ｏ）、Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｑ又はＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｒＣ（＝Ｏ）を表し、
Ｌ２は、直接結合、（ＣＨ２）ｓＯ又は（ＣＨ２）ｔＮＨを表し、
ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、及びｔは、それぞれ独立して、１～６の整数である、ブロックコポリマー。
【請求項5】
請求項２のブロックコポリマーをギ酸（ＨＣＯＯＨ）含有水溶液に溶解するステップと、
前記ポリマーの溶解した溶液を透析膜を介して水に対して透析するステップと、
得られたポリマー懸濁液を超音波ホモジナイザー中で処理して懸濁液中の粒子を分割するステップと、
粒子を分割した分散液を細孔を備えた膜でろ過するステップを含む、ポリマーのナノ粒子の作製方法。
前記ポリマーの溶解した溶液を透析膜を介して水に対して透析するステップと、
得られたポリマー懸濁液を超音波ホモジナイザー中で処理して懸濁液中の粒子を分割するステップと、
粒子を分割した分散液を細孔を備えた膜でろ過するステップを含む、ポリマーのナノ粒子の作製方法。
【請求項6】
請求項１～４のいずれか一つに記載のブロックコポリマーを有効成分として含む、抑うつの予防又は治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、γ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の新規薬物デリバリー系に関し、より具体的には、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）－ｂ－ポリ（４－ナイロン）のコポリマー並びにその経口又は非経口投与に適するＧＡＢＡ含有ポリマーのナノ粒子に関する。
【背景技術】
【0002】
薬理学の観点に立つと、γ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）はヒトの幾つかの疾患において主としてシグナル伝達経路及び病理学に関与する脳内の重要な神経伝達物質である。そのため、ＧＡＢＡのデリバリー能を増大することはＧＡＢＡ関連疾患を処置する上で有益であることを意味する（非特許文献１、非特許文献２）。例えば、抑うつ病では、ＧＡＢＡは腸管神経系を介して気分や感情に影響を及ぼし得るとの証拠が増加しつつある。ところで、ＧＡＢＡは低分子量の親水性化合物であることから、経口摂取された後、迅速に全身の循環系に入り、次いで、体内から排泄されるので腸管神経系を標的とすることに限界がある。したがって、胃腸管で持続可能にＧＡＢＡを放出する新規薬物デリバリー系の開発は、神経疾患（又は障害）の処置にとって旧来のＧＡＢＡに比べてより有益であろう。
【0003】
本発明者等は、低分子量の作用物質をポリマー化し、さらに当該ポリマーを、所謂、ペグ化してコポリマーとし、さらにポリマーの性質をもつナノ粒子とすることにより、血液循環系をはじめとする、生体内での前記作用物質の滞留性を改善できることを見出し、公表した（例えば、特許文献１、特許文献２、参照。）。特許文献１では、ＰＥＧ－ｂ－ポリ（アルギニン）とポリアニオン性ポリマーとの組合せ物が水性媒体中でポリマーのナノ粒子を形成でき、特許文献２では、ポリ（Ｌ－ＤＯＰＡ）のＬ－ＤＯＰＡ中の３，４－ヒドロキシル基を低分子アルキルエステル化することで、親水－疎水性ブロックコポリマーとすることによりポリマーのナノ粒子を形成することでき、こうして形成されたナノ粒子は、それぞれ、生体内滞留性を改善するとともに、生体内でアルギニン及びＬ－ＤＯＰＡを放出でき、これらの低分子化合物それら自体が有する機能に基づく所期の効果を奏する旨報告されている。
【0004】
仮に、γ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）もアルギニン等と同様にポリマー化、ペグ化、かつ、ペグ化コポリマーをポリマーのナノ粒子とすることができ、さらに、当該ナノ粒子が生体内で遊離のＧＡＢＡを持続可能に放出できるものであれば、当該技術分野で有益な新規なＧＡＢＡデリバリー系を提供できるかも知れない。
【0005】
ポリ（γ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ））について物質の観点に立つと、ポリＧＡＢＡ（又はナイロン４）は反復単位中に４個の炭素原子を有するポリアミドの一つである。現在のところ、ナイロン４は市場から入手できず、その用途も他のポリアミドファミリー群に比べ限定されている。ナイロンはバイオマスから、又は開環重合により合成できる。 Ｋａｍａｌ他は、低分子量開始剤を用いて２－ピロリドンとε－カプロラクタムのバルク開環重合によるナイロン４とナイロン６のコポリマーの合成について報告している（非特許文献３）。しかし、ナイロン４をベースとするブロックコポリマーは今までのところ報告されていない。別の観点に立てば、ナイロン４はポリアミドの同族体であるが、γ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）のポリマーであると考えることができる。したがって、ナイロン４は、加水分解されるとＧＡＢＡを放出するので、ＧＡＢＡの供給源として有力な候補材料であり得る。
【0006】
しかし、ポリアミドの一般的な性質として、ナイロン４は、ポリマー分子間及びポリマー分子内で強い水素結合性を有し、生物学的環境に適用するためのナノ粒子を調製することが困難である。今までのところ、本発明者が知る限りでは、界面活性剤や安定化剤を用いることなく、ナイロン４をベースとするナノ粒子の作製に成功したことを報告する刊行物の存在を知らない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0007】
【特許文献1】ＷＯ ２０１６／１６７３３３パンフレット
【特許文献2】ＷＯ ２０２０／１６６４７３パンフレット
【非特許文献】
【0008】
【非特許文献1】岡田・他，Nippon Shokuhin Kagaku Kaishi Vol. No. 8， 596－603 （2000）
【非特許文献2】Ngo, et. al., Molecules 24.15 （2019）： 2678
【非特許文献3】Kamal, et al，Fibers and Polymers 15.5 （2014）：899－907
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
本発明は、γ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の新規薬物デリバリー系を提供することを目的とし、具体的には、経口又は非経口投与に適するＧＡＢＡ含有ポリマーのナノ粒子を提供することを目的として鋭意研究を重ねた。本発明者は、所謂、トップ－ダウン法（ｔｏｐ－ｄｏｗｎ ｍｅｔｈｏｄ：超音波、マイクロフルイダイザーの使用)により得ることができた、ポリマー形状のＧＡＢＡ(ナイロン４)と親水性ポリマーであるポリ（エチレングリコール）（以下、また、ＰＥＧと略記する場合もある）の間を、アミド結合を介して連結した新規ブロックコポリマーである、ポリ（エチレングリコール）－ｂ－ナイロン４（以下、ＰＥＧ－ｂ－Ｎｙｌｏｎ４ともいう。）は、意外なことに、ポリマーのナノ粒子（ＮａｎｏＢＡＢＡと略記する場合もある）を効率よく形成できることを見出した。理論により、本発明の解釈に影響を受けるものでないが、ＰＥＧ－ｂ－Ｎｙｌｏｎ ４は、特許文献２に開示されるブロックコポリマーのように、親水－疎水性ブロックコポリマーの範疇に入らないものの、ＧＡＢＡそれ自体に何らの修飾を行わなくとも、ＰＥＧセグメントの存在が、ナイロン４における水素結合を介する相互作用を抑制し、水性環境下で大きな粒子の形成及び凝集を防ぐことができ、こうして、経口又非経口経路による投与に適する安定なナノ粒子を形成することができた、ものと理解できる。
【課題を解決するための手段】
【0010】
したがって、本発明は、主たる態様として次のものを挙げることができる
〔態様１〕式Ｉ：
－（ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ）ｍ－ (I)
式中、ｍは２～５００、好ましくは５～３００，より好ましくは１０～２００の整数である、
で表される反復単位のセグメントと、
式ＩＩ:
－（ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ））ｎ－ (II)
式中、ｎは、５～１０００，好ましくは１０～６００，より好ましくは１５～４００の整数である、
で表される反復単位のセグメントを、含むブロックコポリマー。
〔態様２〕次式IIIａ又は式IIIｂで表される態様１のブロックコポリマー。
式IIIａ：
Ａ１－（ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ）ｍ１－Ｌ1－（ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ））ｎ１－Ｗ１
（IIIａ）
又は式IIIｂ:
Ａ２－（ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ）ｍ２－Ｌ２-（Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎ２－Ｗ２
（IIIｂ)
で表され、各式中、
Ａ1及びＡ2は独立して、非置換又は置換Ｃ1－Ｃ12アルキルオキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基又は式Ｒ'Ｒ"ＣＨ－基を表し、ここで、Ｒ'及びＲ"は独立してＣ1－Ｃ4アルコキシ又はＲ'とＲ"は一緒になって－ＯＣＨ2ＣＨ2Ｏ－、－Ｏ（ＣＨ2）3Ｏ－若しくは－Ｏ（ＣＨ2）4Ｏ－を表し、
Ｌ１及びＬ２は独立して、二価の連結基又は存在する場合には直接結合を表し、
Ｗ１は、ヒドロキシル基、又は非置換若しくは置換Ｏ－Ｃ1－Ｃ６アルキルを表し、置換されている場合の置換基はハロゲン原子、ヒドロキシル基又はＣ1－Ｃ３アルキル基を表し、
Ｗ２は、水素原子、又は非置換若しくは置換Ｃ1－Ｃ６アルキルを表し、置換されている場合の置換基はハロゲン原子、ヒドロキシル基若しくはＣ1－Ｃ３アルキルを表し、又は非置換若しくは置換Ｃ（＝Ｏ）Ｃ1－Ｃ６アルキルを表し、置換されている場合の置換基はハロゲン原子、ヒドロキシル基若しくはＣ1－Ｃ３アルキル基を表し、
ｍ１及びｍ２は独立して、前記ｍについて定義したとおりであり、かつ、
ｎ１及びｎ２は独立して、前記ｎについて定義したとおりである。
〔態様３〕態様１又は２のブロックコポリマーであって、水性媒体中でポリマーのナノ粒子を形成する、前記ブロックコポリマー。
〔態様４〕態様２のブロックコポリマーであって、
Ｌ１は、（ＣＨ２）ｐＣ（＝Ｏ）、Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｑ又はＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｒＣ（＝Ｏ）を表し、
Ｌ２は、直接結合、（ＣＨ２）ｓＯ又は（ＣＨ２）ｔＮＨを表し、
ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、及びｔは、それぞれ独立して、１～６の整数である、ブロックコポリマー。
〔態様５〕態様２のブロックコポリマーをギ酸（ＨＣＯＯＨ）含有水溶液に溶解するステップと、
前記ポリマーの溶解した溶液を透析膜を介して水に対して透析するステップと、
得られたポリマー懸濁液を超音波ホモジナイザー中で処理して懸濁液中の粒子を分割するステップと、
粒子を分割した分散液を細孔を備えた膜でろ過するステップを含む、ポリマーのナノ粒子の作製方法。
〔態様６〕態様１～４のいずれか一つに記載のブロックコポリマーを有効成分として含む、抑うつの予防又は治療用組成物。
〔態様１〕式Ｉ：
－（ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ）ｍ－ (I)
式中、ｍは２～５００、好ましくは５～３００，より好ましくは１０～２００の整数である、
で表される反復単位のセグメントと、
式ＩＩ:
－（ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ））ｎ－ (II)
式中、ｎは、５～１０００，好ましくは１０～６００，より好ましくは１５～４００の整数である、
で表される反復単位のセグメントを、含むブロックコポリマー。
〔態様２〕次式IIIａ又は式IIIｂで表される態様１のブロックコポリマー。
式IIIａ：
Ａ１－（ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ）ｍ１－Ｌ1－（ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（＝Ｏ））ｎ１－Ｗ１
（IIIａ）
又は式IIIｂ:
Ａ２－（ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ）ｍ２－Ｌ２-（Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎ２－Ｗ２
（IIIｂ)
で表され、各式中、
Ａ1及びＡ2は独立して、非置換又は置換Ｃ1－Ｃ12アルキルオキシを表し、置換されている場合の置換基は、ホルミル基又は式Ｒ'Ｒ"ＣＨ－基を表し、ここで、Ｒ'及びＲ"は独立してＣ1－Ｃ4アルコキシ又はＲ'とＲ"は一緒になって－ＯＣＨ2ＣＨ2Ｏ－、－Ｏ（ＣＨ2）3Ｏ－若しくは－Ｏ（ＣＨ2）4Ｏ－を表し、
Ｌ１及びＬ２は独立して、二価の連結基又は存在する場合には直接結合を表し、
Ｗ１は、ヒドロキシル基、又は非置換若しくは置換Ｏ－Ｃ1－Ｃ６アルキルを表し、置換されている場合の置換基はハロゲン原子、ヒドロキシル基又はＣ1－Ｃ３アルキル基を表し、
Ｗ２は、水素原子、又は非置換若しくは置換Ｃ1－Ｃ６アルキルを表し、置換されている場合の置換基はハロゲン原子、ヒドロキシル基若しくはＣ1－Ｃ３アルキルを表し、又は非置換若しくは置換Ｃ（＝Ｏ）Ｃ1－Ｃ６アルキルを表し、置換されている場合の置換基はハロゲン原子、ヒドロキシル基若しくはＣ1－Ｃ３アルキル基を表し、
ｍ１及びｍ２は独立して、前記ｍについて定義したとおりであり、かつ、
ｎ１及びｎ２は独立して、前記ｎについて定義したとおりである。
〔態様３〕態様１又は２のブロックコポリマーであって、水性媒体中でポリマーのナノ粒子を形成する、前記ブロックコポリマー。
〔態様４〕態様２のブロックコポリマーであって、
Ｌ１は、（ＣＨ２）ｐＣ（＝Ｏ）、Ｃ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｑ又はＣ（＝Ｏ）（ＣＨ２）ｒＣ（＝Ｏ）を表し、
Ｌ２は、直接結合、（ＣＨ２）ｓＯ又は（ＣＨ２）ｔＮＨを表し、
ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、及びｔは、それぞれ独立して、１～６の整数である、ブロックコポリマー。
〔態様５〕態様２のブロックコポリマーをギ酸（ＨＣＯＯＨ）含有水溶液に溶解するステップと、
前記ポリマーの溶解した溶液を透析膜を介して水に対して透析するステップと、
得られたポリマー懸濁液を超音波ホモジナイザー中で処理して懸濁液中の粒子を分割するステップと、
粒子を分割した分散液を細孔を備えた膜でろ過するステップを含む、ポリマーのナノ粒子の作製方法。
〔態様６〕態様１～４のいずれか一つに記載のブロックコポリマーを有効成分として含む、抑うつの予防又は治療用組成物。
【発明の効果】
【0011】
本発明は、本発明者が知る限り従来の刊行物に未載のブロックコポリマーであり、これ
らは理化学的にも、薬理学的にも特有の性質を有し、具体的には、前記ブロックコポリマーは特定の水性媒体中で、安定なポリマーのナノ粒子を形成でき、かようなナノ粒子は、特に、患者に経口投与すると、胃腸管においてそれらを徐々に崩壊させ、ＧＡＢＡを持続可能に放出することができるので、低分子量ＧＡＢＡそれ自体が効能を有する疾患又は障害を経口又は非経口投与により有効に予防又は治療できる。
らは理化学的にも、薬理学的にも特有の性質を有し、具体的には、前記ブロックコポリマーは特定の水性媒体中で、安定なポリマーのナノ粒子を形成でき、かようなナノ粒子は、特に、患者に経口投与すると、胃腸管においてそれらを徐々に崩壊させ、ＧＡＢＡを持続可能に放出することができるので、低分子量ＧＡＢＡそれ自体が効能を有する疾患又は障害を経口又は非経口投与により有効に予防又は治療できる。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】製造例１で得られたＰＥＧ－ｂ－Ｎｙｌｏｎ－４ブロックコポリマーの1Ｈ ＮＭＲスペクトルである。
【図2】製造例１で得られたＰＥＧ－ｂ－Ｎｙｌｏｎ－４ブロックコポリマーのＭＡＬＤＩ－ＴＯＦマススペクトルである。
【図3】製造例２で得られたＧＡＢＡ含有ポリマーのナノ粒子（ＮａｎｏＧＡＢＡ）溶液における粒子の流体力学的直径を測定した結果のグラフ表示及びＮａｎｏＧＡＢＡの水溶液のデジタル映像である。
【図4】試験例１におけるＮａｎｏＧＡＢＡの用量と抑うつ様挙動間の相関性を示すグラフ表示である。
【図5】試験例１におけるＮａｎｏＧＡＢＡ又はＧＡＢＡで処置したマウスの抑うつ様挙動を観察した結果のグラフ表示である。
【図6】試験例２における各処置例の抑うつモデルおける血清中ストレスホルモン濃度のグラフ表示である。
【図7】試験例２における抑うつモデルマウスにおける抑うつ挙動の観察結果のグラフ表示である。
【図8】試験例３におけるＮａｎｏＧＡＢＡのマウスに対する急性毒性を示す指標としての被験動物の体重変化のグラフ表示である。
【図9】前記急性毒性を示す指標としての被験動物の各種臓器の重量変化、並びに臓器の機能関連バイオマーカー及び血液の組成の量の測定結果を表すグラフ表示である。
【発明の具体的な記述】
【0013】
本願発明に関して記述された用語等は、特に言及しない限り当該技術分野で常用されている意味又は内容を有するものとして使用されている。本発明について、さらに、以下の説明を行う。
【0014】
本発明にいうブロックコポリマーは、当該コポリマーを構成するブロックとして、ＰＥＧセグメントとＮｙｌｏｎ－４セグメントを含み、具体的には後述するように、水性媒体（例えば、ギ酸含有水溶液）中でポリマーのナノ粒子を形成できるものであれば、限定されることなく、そのα末端やω末端や両セグメントの二価の連結基が如何なる有機の基、部分、等であることもできる。ポリマーのナノ粒子は、かようなブロックコポリマーとしては、限定されるものでないが、例えば、ＰＥＧ－ｂ－Ｎｙｌｏｎ－４ブロックコポリマーから構成されるナノ粒子を挙げることができ、粒子の平均直径がナノメーターのサイズにある粒子を意味する。ナノメーターのサイズは、粒子の水溶液における、動的散乱光により測定される流体力学的直径として、４０ｎｍ～４００ｎｍ、好ましくは４０ｎｍ～２５０ｎｍ、より好ましくは６０ｎｍ～２００ｎｍの範囲内にあることができる。
【0015】
前記の連結基は、一般的には、最大３４個、好ましくは最大１８個、より好ましくは最大１０個の炭素原子、並びに任意に酸素及び窒素原子を含有する基を意味する。より具体的には、前記態様４において、Ｌ１及びＬ２について定義した基であることができる。これらの連結基の方向性は、それぞれ、式IIIａ及び式IIIｂにおけるＬ１及びＬ２の記載方向に適合するものとして記載している。例えば、式IIIａにあっては、Ｌ１の（ＣＨ２）ｐＣ（＝Ｏ）は、（ＣＨ２）ｐのα末端のメチレン基の炭素原子がＣＨ２ＣＨ２－Ｏ単位の酸素原子に結合し、カルボニル基Ｃ（＝Ｏ）の炭素原子がＮＨＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（
＝Ｏ）単位の窒素原子に結合する方向性を有する。
＝Ｏ）単位の窒素原子に結合する方向性を有する。
【0016】
本発明のブロックコポリマーは、ＰＥＧのいずれかの末端のＯＨを当該技術分野で周知の保護基で必要があれば保護しておき、別に、Ｎｙｌｏｎ－４のいずれかの末端（ＮＨ２又はＣＯＯＨ）を当該技術分野で周知の保護基で必要があれば保護しておき、他の末端を必要があれば相互に連結し得る官能基を導入しておき、これらの両セグメント又はブロックを含む化合物、それ自体当該技術分野で周知のカップリング又は連結方法により連結することにより、製造できる。しかし、都合よくは、次のスキーム1に従って製造できる。
【0017】
【化1】
【0018】
スキーム１に従えば、簡潔には、ＰＥＧイニシエーターを用意し、これに２－ピロリドンをアニオン開環重合することにより、ナイロン４セグメントを伸長させることにより、目的のブロックコポリマーを得ることができる。
【0019】
本発明に従う、ポリマーのナノ粒子（ＮａｎｏＧＡＢＡ）は、都合よくは、次のスキーム２に従って作製できる。
【0020】
【化2】
【0021】
スキーム２に従えば、例えば、態様２のブロックコポリマーをギ酸（ＨＣＯＯＨ）含有水溶液、例えば、２０容量％～９０容量％、好ましくは、３０容量％～７５容量％、より好ましくは、３５容量％～６０容量％のギ酸含有液に溶解するステップと、
前記ポリマーの溶解した溶液を透析膜、例えば、１ｋＤａ～３．５ｋＤａのカットオフ細孔を備えたダイアライシスメンブラン、を介して水に対してギ酸が実質的に存在しなくなるまで透析するステップと、
得られたポリマー懸濁液を超音波ホモジナイザー中で処理して、懸濁液を再度懸濁させるステップと、
再懸濁液をマイクロフルイダイザ―中で懸濁液中の微粒子を分割するステップと、次いで、必要により、
粒子を分割した分散液を、例えば、細孔径０．１μｍ～１．０μｍを備えた膜でろ過するステップを利用することができる。
前記ポリマーの溶解した溶液を透析膜、例えば、１ｋＤａ～３．５ｋＤａのカットオフ細孔を備えたダイアライシスメンブラン、を介して水に対してギ酸が実質的に存在しなくなるまで透析するステップと、
得られたポリマー懸濁液を超音波ホモジナイザー中で処理して、懸濁液を再度懸濁させるステップと、
再懸濁液をマイクロフルイダイザ―中で懸濁液中の微粒子を分割するステップと、次いで、必要により、
粒子を分割した分散液を、例えば、細孔径０．１μｍ～１．０μｍを備えた膜でろ過するステップを利用することができる。
【0022】
ポリマーのナノ粒子（ＮａｎｏＧＡＢＡ）は、例えば、凍結乾燥、遠心分離、等によりそれらの溶液又は分散液から分離できるので、必要により、生理食塩水中に再溶解又は懸濁させ、経口又は非経口投与用の製剤とすることができる。経口投与用の製剤とするときは、必要があれば、当該技術分野で常用されている、添加剤、希釈剤、等を利用して、錠剤、丸薬、顆粒剤として提供できる。添加剤又は希釈剤としては、限定されるものでないが、クロロカルメロースナトリウム、結晶セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、マクロゴール４０００、酸化チタン、等を挙げることができる。
【0023】
このようなナノ粒子を有効成分として含む組成物は、処置対処たる疾患の重篤度、投与対象たる患者の年齢、性別、体重により、最適の用量が変動し得るので、一義的に特定できないが、小規模の臨床試験等を通して得られる有効のデータ等に基づいて専門医が決定することができる。
【0024】
以下、説明が煩雑になることを避けるため、本発明の典型例に基づいて、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの例に限定されるものではない。
【0025】
製造例１：ＰＥＧ－ｂ－Ｎｙｌｏｎ－4ブロックコポリマー：
CH3O-(CH2CH2O)n-CH2-CO-(NHCH2CH2CH2CO)m-
の合成
ステップ１：ＰＥＧマクロイニシエーター（ＣＨ３Ｏ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＯＣｌ）の合成
（１）市販のＣＨ３Ｏ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－Ｈ (ｍＰＥＧ－ＯＨ、 ＭＷ＝２，０００、２０ ｇ, １０ ｍｍｏｌ)を、減圧下で２時間１１０ ℃で加熱し、予め水分を除去した。反応系を５５℃に冷却した。窒素流下でテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）の５０ｍＬを反応系に加え、ｍＰＥＧ－ＯＨを完全に溶解した。室温で、ブチルリチウムの１．６ Ｍ－ヘキサン（ＢｕＬｉ, １０ ｍＬ, １６ ｍｍｏｌ）とブロモ化酢酸エチル（３．６ ｍＬ, ３０ ｍｍｏｌ）を窒素流下で前記反応系に加えた。反応混合物を室温下で１日撹拌した。その後、反応混合物を３℃で貯蔵した２－プロパノール（冷ＩＰＡ）に滴下することにより沈殿を形成させた。沈殿物を遠心 （９０００ ｒｐｍ, ５ 分） により集め、次いで、メタノール（１００ ｍＬ）に溶解させた。ＩＰＡ中での沈殿、遠心による収集、メタノールへの溶解を３回繰り返した。その後、ＩＰＡ中の沈殿物を遠心により集め、次いで、ｎ－ヘキサン中に再分散させ、遠心し、さらに減圧下で完全に乾燥するまで乾燥した。生成物は、 ＣＨ３Ｏ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＯＯＣ２Ｈ５, １８．５ ｇであった。
（２）前記 ＣＨ３Ｏ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＯＯＣ２Ｈ５（１８ ｇ, ９ ｍｍｏｌ）を、５０ｍＬのミリＱ水（ＭｉｌｉＱ Ｗａｔｅｒ）で溶解し、１．５Ｍの水
酸化ナトリウム溶液（１０ ｍＬ、１５ ｍｍｏｌ）を用いて加水分解した。１日撹拌した後、塩酸を用いて反応系のｐＨを１～２に調節し、ジクロロメタン（ＤＣＭ, ３ ℃, 各６０ ｍＬ ）により有機相に生成物を抽出し、ＤＣＭ部を集め、次いで、ロータリーエバポラーターによりＤＣＭの量を減少させた。このＤＣＭ溶液を冷ＩＰＡにより沈殿させ、遠心（９０００ ｒｐｍ, ５ 分）により集め、メタノール中に再溶解し、冷ＩＰＡで再沈殿させた。これらの精製ステップは３回繰り返した。最後に、沈殿物をヘキサン中に分散し、遠心分離し、完全に乾燥するまで減圧下で乾燥した。生成物は、 ＣＨ３Ｏ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＯＯＨ，１６ｇであった。
（３）前記 ＣＨ３Ｏ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＯＯＨ （６．６ｇ, ２ ｍｍｏｌ）を、３０分間７５℃で予備加熱して水分を除去し、室温の窒素流下でＴＨＦ（１５ｍＬ）に溶解した。得られた溶液に塩化チオニル（ＳＯＣｌ２, ０．５ ｍＬ, ６．９ ｍｍｏｌ） を窒素流下で加え一夜撹拌した。反応フラスコ中のＴＨＦと過剰のＳＯＣｌ２を６０℃の減圧下で３０分間留去した。その後、この反応混合物を１５ｍＬのＴＨＦに再溶解して、生成物：マクロイニシエーターＣＨ３Ｏ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＯＣｌのＴＨＦ溶液を得た。
CH3O-(CH2CH2O)n-CH2-CO-(NHCH2CH2CH2CO)m-
の合成
ステップ１：ＰＥＧマクロイニシエーター（ＣＨ３Ｏ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＯＣｌ）の合成
（１）市販のＣＨ３Ｏ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－Ｈ (ｍＰＥＧ－ＯＨ、 ＭＷ＝２，０００、２０ ｇ, １０ ｍｍｏｌ)を、減圧下で２時間１１０ ℃で加熱し、予め水分を除去した。反応系を５５℃に冷却した。窒素流下でテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）の５０ｍＬを反応系に加え、ｍＰＥＧ－ＯＨを完全に溶解した。室温で、ブチルリチウムの１．６ Ｍ－ヘキサン（ＢｕＬｉ, １０ ｍＬ, １６ ｍｍｏｌ）とブロモ化酢酸エチル（３．６ ｍＬ, ３０ ｍｍｏｌ）を窒素流下で前記反応系に加えた。反応混合物を室温下で１日撹拌した。その後、反応混合物を３℃で貯蔵した２－プロパノール（冷ＩＰＡ）に滴下することにより沈殿を形成させた。沈殿物を遠心 （９０００ ｒｐｍ, ５ 分） により集め、次いで、メタノール（１００ ｍＬ）に溶解させた。ＩＰＡ中での沈殿、遠心による収集、メタノールへの溶解を３回繰り返した。その後、ＩＰＡ中の沈殿物を遠心により集め、次いで、ｎ－ヘキサン中に再分散させ、遠心し、さらに減圧下で完全に乾燥するまで乾燥した。生成物は、 ＣＨ３Ｏ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＯＯＣ２Ｈ５, １８．５ ｇであった。
（２）前記 ＣＨ３Ｏ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＯＯＣ２Ｈ５（１８ ｇ, ９ ｍｍｏｌ）を、５０ｍＬのミリＱ水（ＭｉｌｉＱ Ｗａｔｅｒ）で溶解し、１．５Ｍの水
酸化ナトリウム溶液（１０ ｍＬ、１５ ｍｍｏｌ）を用いて加水分解した。１日撹拌した後、塩酸を用いて反応系のｐＨを１～２に調節し、ジクロロメタン（ＤＣＭ, ３ ℃, 各６０ ｍＬ ）により有機相に生成物を抽出し、ＤＣＭ部を集め、次いで、ロータリーエバポラーターによりＤＣＭの量を減少させた。このＤＣＭ溶液を冷ＩＰＡにより沈殿させ、遠心（９０００ ｒｐｍ, ５ 分）により集め、メタノール中に再溶解し、冷ＩＰＡで再沈殿させた。これらの精製ステップは３回繰り返した。最後に、沈殿物をヘキサン中に分散し、遠心分離し、完全に乾燥するまで減圧下で乾燥した。生成物は、 ＣＨ３Ｏ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＯＯＨ，１６ｇであった。
（３）前記 ＣＨ３Ｏ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＯＯＨ （６．６ｇ, ２ ｍｍｏｌ）を、３０分間７５℃で予備加熱して水分を除去し、室温の窒素流下でＴＨＦ（１５ｍＬ）に溶解した。得られた溶液に塩化チオニル（ＳＯＣｌ２, ０．５ ｍＬ, ６．９ ｍｍｏｌ） を窒素流下で加え一夜撹拌した。反応フラスコ中のＴＨＦと過剰のＳＯＣｌ２を６０℃の減圧下で３０分間留去した。その後、この反応混合物を１５ｍＬのＴＨＦに再溶解して、生成物：マクロイニシエーターＣＨ３Ｏ－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ－ＣＨ２－ＣＯＣｌのＴＨＦ溶液を得た。
【0026】
ステップ２：重合
（１）使用する前に市販の２－ピロリドンを減圧下、２時間１１０℃で加熱し、水分を除去して精製した。
（２）反応フラスコ中で、カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド（ｔ－ＢｕＯＫ, １．３５ ｇ,
１２ ｍｍｏｌ）を減圧下、２時間１１０℃で加熱乾燥した。次いで、精製２－ピロリドン （７．６ ｍＬ, １００ ｍｍｏｌ）を、５０℃の窒素流下で反応フラスコに加えてｔ－ＢｕＯＫを完全に溶解した。この反応フラスコを減圧にして泡立ちが何ら残存しなくなるまで副産物を留去した。この反応系を窒素流下に戻し、前記で生成したＰＥＧマクロイニシエーター（１５ ｍＬ, ２ ｍｍｏｌ）を加えた。当該反応系を再度減圧下に戻してＴＨＦを除去し、反応混合物が不動化し、撹拌棒が動かなくなるまで減圧を維持した。最後に、窒素流下に戻し、反応系を２日間密封した。
（３）精製プロセス：４０ｍＬの８０％ＨＣＯＯＨに前記反応混合物を溶解し、３５０ｍＬのアセトンで沈殿させ、沈殿物を１３０００ｒｐｍで遠心して沈殿物を集めた。次いで、沈殿物をヘキサンに再分散させ、再度、遠心分離により集めた（２回繰り返す）。最後に、粗生成物が完全に乾燥するまで減圧下で乾燥した。生成物は、図１及び図２のデータから同定できるとおり、４．６ｇのＰＥＧ－ｂ－Ｎｙｌｏｎ－４であった。
図１の1Ｈ ＮＭＲスペクトルから換算された分子量：Ｍ＝５，０００（３５単位のＧＡＢＡを含む)であった。図２のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦマススペクトルの高マス領域は、それぞれ、４４ｍ／ｚ及び８５ｍ/ｚの間隔を伴うＰＥＧ及びＮｙｌｏｎ ４の反復シグナルを示す。
（１）使用する前に市販の２－ピロリドンを減圧下、２時間１１０℃で加熱し、水分を除去して精製した。
（２）反応フラスコ中で、カリウムｔｅｒｔ－ブトキシド（ｔ－ＢｕＯＫ, １．３５ ｇ,
１２ ｍｍｏｌ）を減圧下、２時間１１０℃で加熱乾燥した。次いで、精製２－ピロリドン （７．６ ｍＬ, １００ ｍｍｏｌ）を、５０℃の窒素流下で反応フラスコに加えてｔ－ＢｕＯＫを完全に溶解した。この反応フラスコを減圧にして泡立ちが何ら残存しなくなるまで副産物を留去した。この反応系を窒素流下に戻し、前記で生成したＰＥＧマクロイニシエーター（１５ ｍＬ, ２ ｍｍｏｌ）を加えた。当該反応系を再度減圧下に戻してＴＨＦを除去し、反応混合物が不動化し、撹拌棒が動かなくなるまで減圧を維持した。最後に、窒素流下に戻し、反応系を２日間密封した。
（３）精製プロセス：４０ｍＬの８０％ＨＣＯＯＨに前記反応混合物を溶解し、３５０ｍＬのアセトンで沈殿させ、沈殿物を１３０００ｒｐｍで遠心して沈殿物を集めた。次いで、沈殿物をヘキサンに再分散させ、再度、遠心分離により集めた（２回繰り返す）。最後に、粗生成物が完全に乾燥するまで減圧下で乾燥した。生成物は、図１及び図２のデータから同定できるとおり、４．６ｇのＰＥＧ－ｂ－Ｎｙｌｏｎ－４であった。
図１の1Ｈ ＮＭＲスペクトルから換算された分子量：Ｍ＝５，０００（３５単位のＧＡＢＡを含む)であった。図２のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦマススペクトルの高マス領域は、それぞれ、４４ｍ／ｚ及び８５ｍ/ｚの間隔を伴うＰＥＧ及びＮｙｌｏｎ ４の反復シグナルを示す。
【0027】
製造例２：ＧＡＢＡ含有ポリマーのナノ粒子（ＮａｎｏＧＡＢＡ）の作製
３．０ｇのＰＥＧ－ｂ－Ｎｙｌｏｎ－４を４０ｍＬの８０％ＨＣＯＯＨに完全に溶解し、３．５ｋＤａ ＲＣ ダイアライシスメンブランを介して３日間２Ｌの ＭｉｌｉＱ 水に対して透析した（水は1日に２回交換した）。その後、ポリマー懸濁液を超音波ホモジナイザーの影響下で再度物理的に分散させた（パルス：５０％、持続時間：３００秒、反復：３回、出力４，氷冷却）。綿により大きな粒子を除去した後、ポリマー懸濁液をマイクロフルイダイザ―中に移し、高圧力によりより小さな粒子に粒子を分割した（１５０００ｐｓｉ, ２００００ｐｓｉ, ２００００ｐｓｉのシステム圧で連続して３回）。最終ステップでは、ナノ粒子の溶液（分散液）を０．２μｍの膜で濾過した。濾過された粒子を集め、さらなる使用に備えて４℃で保存した。生成物：ＮａｎｏＧＡＢＡの溶液、２００ｍＬ、１１．２ｍｇ/ｍＬ、図３参照。）
図３は、流体力学的直径のデータのグラフ表示とＮａｎｏＧＡＢＡの水溶液のデジタル映像である。これらから、作製された溶液中のナノ粒子は８０ｎｍの流体力学的直径を有し
、水溶液中で安定であり、かつ、経口及び非経口注入経路による投与に適することが判る。
３．０ｇのＰＥＧ－ｂ－Ｎｙｌｏｎ－４を４０ｍＬの８０％ＨＣＯＯＨに完全に溶解し、３．５ｋＤａ ＲＣ ダイアライシスメンブランを介して３日間２Ｌの ＭｉｌｉＱ 水に対して透析した（水は1日に２回交換した）。その後、ポリマー懸濁液を超音波ホモジナイザーの影響下で再度物理的に分散させた（パルス：５０％、持続時間：３００秒、反復：３回、出力４，氷冷却）。綿により大きな粒子を除去した後、ポリマー懸濁液をマイクロフルイダイザ―中に移し、高圧力によりより小さな粒子に粒子を分割した（１５０００ｐｓｉ, ２００００ｐｓｉ, ２００００ｐｓｉのシステム圧で連続して３回）。最終ステップでは、ナノ粒子の溶液（分散液）を０．２μｍの膜で濾過した。濾過された粒子を集め、さらなる使用に備えて４℃で保存した。生成物：ＮａｎｏＧＡＢＡの溶液、２００ｍＬ、１１．２ｍｇ/ｍＬ、図３参照。）
図３は、流体力学的直径のデータのグラフ表示とＮａｎｏＧＡＢＡの水溶液のデジタル映像である。これらから、作製された溶液中のナノ粒子は８０ｎｍの流体力学的直径を有し
、水溶液中で安定であり、かつ、経口及び非経口注入経路による投与に適することが判る。
【0028】
試験例１：急性モデルにおける抗抑うつ様効果
雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６～１０週令）を異なる用量のＮａｎｏＧＡＢＡ又はＧＡＢＡでフリードリンク瓶を介して３日間処置した。３日処置後、これらのマウスに若干改変したＰｏｒｓｏｌｔ 他 （Ｎａｔｕｒｅ １９７７, ２６６： ７３０－７３２）に記載されているフォースド・スイム・テスト（Ｆｏｒｃｅｄ Ｓｗｉｍ Ｔｅｓｔｓ ）を受けさせた。この試験では、マウスが彼らの尾を底に届くことができない水のレベルまでに２５℃の水を充填した２Ｌのプラスチックビーカー内に各マウスを置き、モデル動物の挙動を６分間ビデオレコーダーで録画し、泳いでいる（可動性）期間及び浮遊挙動（不動性）期間を測定した。
＜結果＞
ＮａｎｏＧＡＢＡの自由摂取群は、フォースド・スイム・テストを通して抑うつ様挙動が用量依存的に減少した。この結果はＮａｎｏＧＡＢＡの抗抑うつ様効果の証左である（図４（実験動物：１群７又は８匹）参照。）。３日間自由摂取の別の同様な試験群と比べてみると、ＮａｎｏＧＡＢＡ群は、同様なＧＡＢＡ含有濃度（それぞれ、６ｍＭ）を用いる従来のＧＡＢＡ処置よりも統計的に有意に優れた抗抑うつ効果を示した（図５（実験動物：１群８匹）参照。）。なお、図５において、＊：ｐ ＜ ０．００５、＊＊： ｐ ＜ ０．００５ である。
雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６～１０週令）を異なる用量のＮａｎｏＧＡＢＡ又はＧＡＢＡでフリードリンク瓶を介して３日間処置した。３日処置後、これらのマウスに若干改変したＰｏｒｓｏｌｔ 他 （Ｎａｔｕｒｅ １９７７, ２６６： ７３０－７３２）に記載されているフォースド・スイム・テスト（Ｆｏｒｃｅｄ Ｓｗｉｍ Ｔｅｓｔｓ ）を受けさせた。この試験では、マウスが彼らの尾を底に届くことができない水のレベルまでに２５℃の水を充填した２Ｌのプラスチックビーカー内に各マウスを置き、モデル動物の挙動を６分間ビデオレコーダーで録画し、泳いでいる（可動性）期間及び浮遊挙動（不動性）期間を測定した。
＜結果＞
ＮａｎｏＧＡＢＡの自由摂取群は、フォースド・スイム・テストを通して抑うつ様挙動が用量依存的に減少した。この結果はＮａｎｏＧＡＢＡの抗抑うつ様効果の証左である（図４（実験動物：１群７又は８匹）参照。）。３日間自由摂取の別の同様な試験群と比べてみると、ＮａｎｏＧＡＢＡ群は、同様なＧＡＢＡ含有濃度（それぞれ、６ｍＭ）を用いる従来のＧＡＢＡ処置よりも統計的に有意に優れた抗抑うつ効果を示した（図５（実験動物：１群８匹）参照。）。なお、図５において、＊：ｐ ＜ ０．００５、＊＊： ｐ ＜ ０．００５ である。
【0029】
試験例２：抑うつモデルにおける治療効果
抑うつモデルを誘発するために、雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６～１０週令）を５０ｍＬの透明な遠沈管の狭い場所に１４日の期間中、１日当たり３時間閉じ込めた。ＮａｎｏＧＡＢＡの自由摂取処置は第７日から開始しこの試験の最終日まで続けた。第１５日目に、尾の静脈中の血液を集め、ストレスホルモン（コルチコステロン）の濃度を測定した。別に同様な試験をテイル・サスペンション・テスト（Ｔｉａｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｔｅｓｔ）により抑うつ挙動を測定した。このテストでは、マウスの正面の後ろ脚が底面に触れない高さで水平棒にマウスの尾を接着テープで差し込み、付着することにより各マウスを吊るし、６分間マウスの挙動をビデオレコーダーで録画した。
＜結果＞
ＮａｎｏＧＡＢＡ処置群はストレスホルモンの濃度が低下し（図６参照（実験動物：１群６匹）。）、抑うつモデルマウスにおける抑うつ挙動を弱めた（図７（実験動物：１群８又は９匹）参照。）。なお、図６及び図７において、それぞれ、＊＊：ｐ ＜ ０．００５、＊＊＊：ｐ ＜ ０．０００５である。
抑うつモデルを誘発するために、雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（６～１０週令）を５０ｍＬの透明な遠沈管の狭い場所に１４日の期間中、１日当たり３時間閉じ込めた。ＮａｎｏＧＡＢＡの自由摂取処置は第７日から開始しこの試験の最終日まで続けた。第１５日目に、尾の静脈中の血液を集め、ストレスホルモン（コルチコステロン）の濃度を測定した。別に同様な試験をテイル・サスペンション・テスト（Ｔｉａｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｔｅｓｔ）により抑うつ挙動を測定した。このテストでは、マウスの正面の後ろ脚が底面に触れない高さで水平棒にマウスの尾を接着テープで差し込み、付着することにより各マウスを吊るし、６分間マウスの挙動をビデオレコーダーで録画した。
＜結果＞
ＮａｎｏＧＡＢＡ処置群はストレスホルモンの濃度が低下し（図６参照（実験動物：１群６匹）。）、抑うつモデルマウスにおける抑うつ挙動を弱めた（図７（実験動物：１群８又は９匹）参照。）。なお、図６及び図７において、それぞれ、＊＊：ｐ ＜ ０．００５、＊＊＊：ｐ ＜ ０．０００５である。
【0030】
試験例３：インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）毒性
ＩＣＲ雄マウス（５週令、一群３匹）に高用量のＮａｎｏＧＡＢＡ、ＧＡＢＡ又はＭｉｌｉＱ 水を腹腔内に注入した。３日後、マウスを安楽死させ、血液と臓器を集めた。血液の組成と臓器の機能関連バイオマーカーをも測定し、ＮａｎｏＧＡＢＡの急性毒性評価した。
＜結果＞
ＮａｎｏＧＡＢＡ処置群は、７２ｍＭ ＧＡＢＡ含有量の用量において、体重に顕著な影響を及ぼさず（図８参照。）、さらに、臓器の重量、臓器の機能関連バイオマーカー及び血液の組成にも顕著な影響を及ぼさなかった。このことは、この試験では、ＮａｎｏＧＡＢＡがマウスに対して急性毒性を誘発しなかったことを示す（図９参照。）。
ＩＣＲ雄マウス（５週令、一群３匹）に高用量のＮａｎｏＧＡＢＡ、ＧＡＢＡ又はＭｉｌｉＱ 水を腹腔内に注入した。３日後、マウスを安楽死させ、血液と臓器を集めた。血液の組成と臓器の機能関連バイオマーカーをも測定し、ＮａｎｏＧＡＢＡの急性毒性評価した。
＜結果＞
ＮａｎｏＧＡＢＡ処置群は、７２ｍＭ ＧＡＢＡ含有量の用量において、体重に顕著な影響を及ぼさず（図８参照。）、さらに、臓器の重量、臓器の機能関連バイオマーカー及び血液の組成にも顕著な影響を及ぼさなかった。このことは、この試験では、ＮａｎｏＧＡＢＡがマウスに対して急性毒性を誘発しなかったことを示す（図９参照。）。
【産業上の利用可能性】
【0031】
本願発明従うＰＥＧ－ｂ－Ｎｙｌｏｎ－４ブロックコポリマーは、それ自体特有の物理化学的性質又は薬理学的性質を有し、また、それ自体若しくはそれから作製されたポリマ
ーのナノ粒子は、例えば、経口又は非経口投与することにより患者の抑うつを予防又は治療できるので、各所有機材料を提供若しくは利用する産業又は医薬製造業で利用できる可能性をもつ。
ーのナノ粒子は、例えば、経口又は非経口投与することにより患者の抑うつを予防又は治療できるので、各所有機材料を提供若しくは利用する産業又は医薬製造業で利用できる可能性をもつ。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
