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特開2024-97303ヌマダイコン抽出物を含む皮膚炎を治療するための医薬組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024097303
(43)【公開日】2024-07-18
(54)【発明の名称】ヌマダイコン抽出物を含む皮膚炎を治療するための医薬組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 36/28 20060101AFI20240710BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20240710BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240710BHJP
【ＦＩ】
A61K36/28
A61P17/00
A61P29/00
【審査請求】有
【請求項の数】15
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2023220363
(22)【出願日】2023-12-27
(31)【優先権主張番号】111150610
(32)【優先日】2022-12-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】TW
(71)【出願人】
【識別番号】390023582
【氏名又は名称】財團法人工業技術研究院
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＤＵＳＴＲＩＡＬ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ
【住所又は居所原語表記】Ｎｏ．１９５，Ｓｅｃ．４，ＣｈｕｎｇＨｓｉｎｇＲｄ．，Ｃｈｕｔｕｎｇ，Ｈｓｉｎｃｈｕ，Ｔａｉｗａｎ ３１０４０
(74)【代理人】
【識別番号】100149076
【弁理士】
【氏名又は名称】梅田 慎介
(74)【代理人】
【識別番号】100119183
【弁理士】
【氏名又は名称】松任谷 優子
(74)【代理人】
【識別番号】100173185
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 裕
(74)【代理人】
【識別番号】100162503
【弁理士】
【氏名又は名称】今野 智介
(74)【代理人】
【識別番号】100144794
【弁理士】
【氏名又は名称】大木 信人
(74)【代理人】
【識別番号】100204582
【弁理士】
【氏名又は名称】大栗 由美
(72)【発明者】
【氏名】クオ－クエイ フアン
(72)【発明者】
【氏名】イ－ホン パン
(72)【発明者】
【氏名】イ－フアン ル
(72)【発明者】
【氏名】シュ－ファン ウェン
(57)【要約】 （修正有）
【課題】副作用がほとんどまたは全く無い、皮膚炎のための天然薬品を提供する。
【解決手段】ヌマダイコンのエタノール抽出物と、薬学的に許容される担体または塩と、を含む、皮膚炎を治療するための医薬組成物である。
【選択図】図１
【解決手段】ヌマダイコンのエタノール抽出物と、薬学的に許容される担体または塩と、を含む、皮膚炎を治療するための医薬組成物である。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ヌマダイコン抽出物と、
薬学的に許容される担体または塩と、
を含む、皮膚炎を治療するための医薬組成物。
薬学的に許容される担体または塩と、
を含む、皮膚炎を治療するための医薬組成物。
【請求項2】
前記ヌマダイコン抽出物がヌマダイコンのエタノール抽出物である、請求項１に記載の皮膚炎を治療するための医薬組成物。
【請求項3】
前記ヌマダイコンのエタノール抽出物が抽出方法によって得られ、前記抽出方法が、
（ａ）ヌマダイコンの植物原料を準備するステップと、
（ｂ）前記ヌマダイコンの植物原料に熱抽出工程を行ってから固液分離工程を行って、抽出溶液を得ると共に前記ヌマダイコンの植物原料のラフィネートを生成するステップであって、前記熱抽出工程中、第１のエタノール溶媒を抽出溶媒として用い、前記第１のエタノール溶媒と前記ヌマダイコンの植物原料との重量比が５～１５：１である、ステップと、
を含む、請求項２に記載の皮膚炎を治療するための医薬組成物。
（ａ）ヌマダイコンの植物原料を準備するステップと、
（ｂ）前記ヌマダイコンの植物原料に熱抽出工程を行ってから固液分離工程を行って、抽出溶液を得ると共に前記ヌマダイコンの植物原料のラフィネートを生成するステップであって、前記熱抽出工程中、第１のエタノール溶媒を抽出溶媒として用い、前記第１のエタノール溶媒と前記ヌマダイコンの植物原料との重量比が５～１５：１である、ステップと、
を含む、請求項２に記載の皮膚炎を治療するための医薬組成物。
【請求項4】
ステップ（ｂ）において、前記熱抽出工程を４０～８０℃で１～１５時間行う、請求項３に記載の皮膚炎を治療するための医薬組成物。
【請求項5】
前記抽出方法が、
（ｃ）前記ヌマダイコンの植物原料の前記ラフィネートを前記ヌマダイコンの植物原料として用い、ステップ（ｂ）を少なくとも１回繰り返し、かつ全ての得られた抽出溶液を合わせて組合せ抽出溶液を得るステップ
をさらに含む、請求項３に記載の皮膚炎を治療するための医薬組成物。
（ｃ）前記ヌマダイコンの植物原料の前記ラフィネートを前記ヌマダイコンの植物原料として用い、ステップ（ｂ）を少なくとも１回繰り返し、かつ全ての得られた抽出溶液を合わせて組合せ抽出溶液を得るステップ
をさらに含む、請求項３に記載の皮膚炎を治療するための医薬組成物。
【請求項6】
前記抽出方法が、
（ｄ）前記組合せ抽出溶液に乾燥工程を行って乾燥抽出物を得るステップ
をさらに含む請求項５に記載の皮膚炎を治療するための医薬組成物。
（ｄ）前記組合せ抽出溶液に乾燥工程を行って乾燥抽出物を得るステップ
をさらに含む請求項５に記載の皮膚炎を治療するための医薬組成物。
【請求項7】
前記抽出方法が、
（ｅ）前記乾燥抽出物に対し第２のエタノール溶媒中で前記乾燥抽出物が溶解して混合物を形成するまで加熱工程を行うステップであって、前記第２のエタノール溶媒と前記乾燥抽出物との重量比が５～１５：１である、ステップ、および
（ｆ）カラムクロマトグラフィーを前記混合物に行い、細胞のＩＬ－４分泌を抑制する効果を有する少なくとも１つの画分を収集し、または収集して合わせ、活性画分とするステップであって、前記カラムクロマトグラフィーにおいてｎ－ヘキサン／酢酸エチルの混合溶媒を移動相として用いる、ステップ
をさらに含む請求項６に記載の皮膚炎を治療するための医薬組成物。
（ｅ）前記乾燥抽出物に対し第２のエタノール溶媒中で前記乾燥抽出物が溶解して混合物を形成するまで加熱工程を行うステップであって、前記第２のエタノール溶媒と前記乾燥抽出物との重量比が５～１５：１である、ステップ、および
（ｆ）カラムクロマトグラフィーを前記混合物に行い、細胞のＩＬ－４分泌を抑制する効果を有する少なくとも１つの画分を収集し、または収集して合わせ、活性画分とするステップであって、前記カラムクロマトグラフィーにおいてｎ－ヘキサン／酢酸エチルの混合溶媒を移動相として用いる、ステップ
をさらに含む請求項６に記載の皮膚炎を治療するための医薬組成物。
【請求項8】
前記加熱工程を３０～７０℃で行う、請求項７に記載の皮膚炎を治療するための医薬組成物。
【請求項9】
前記ヌマダイコンの植物原料がヌマダイコンの葉に由来する、請求項３に記載の皮膚炎を治療するための医薬組成物。
【請求項10】
前記ヌマダイコン抽出物がヌマダイコンの水抽出物である、請求項１に記載の皮膚炎を治療するための医薬組成物。
【請求項11】
前記ヌマダイコンの水抽出物が抽出方法によって得られ、前記抽出方法が、
（ａ）ヌマダイコンの植物原料を準備するステップと、
（ｂ）前記ヌマダイコンの植物原料に加圧抽出工程を行ってから固液分離工程を行って、抽出溶液を得ると共に前記ヌマダイコンの植物原料のラフィネートを生成するステップであって、前記加圧抽出工程中、水を抽出溶媒として用い、前記水と前記ヌマダイコンの植物原料との重量比が１０～５０：１である、ステップと、
（ｃ）前記ヌマダイコンの植物原料の前記ラフィネートを前記ヌマダイコンの植物原料として用い、ステップ（ｂ）を少なくとも１回繰り返し、かつ全ての得られた抽出溶液を合わせて組合せ抽出溶液を得るステップと、
（ｄ）第１のカラムクロマトグラフィーを前記組合せ抽出溶液に行うステップと、
を含み、前記第１のカラムクロマトグラフィーが、
（ｄ１）前記組合せ抽出溶液を、樹脂を詰めたカラムに装填するステップ、
（ｄ２）ステップ（ｄ１）の後、前記カラムを水で溶出し、前記カラムから流出する溶出液を捨てるステップ、
（ｄ３）ステップ（ｄ２）の後、前記カラムを第３のエタノール溶媒で溶出し、前記カラムから流出する溶出液を捨てるステップ、および
（ｄ４）ステップ（ｄ３）の後、前記カラムを第４のエタノール溶媒で溶出し、前記カラムから流出する溶出液を収集して初期精製抽出溶液とするステップ
を含む、請求項１０に記載の皮膚炎を治療するための医薬組成物。
（ａ）ヌマダイコンの植物原料を準備するステップと、
（ｂ）前記ヌマダイコンの植物原料に加圧抽出工程を行ってから固液分離工程を行って、抽出溶液を得ると共に前記ヌマダイコンの植物原料のラフィネートを生成するステップであって、前記加圧抽出工程中、水を抽出溶媒として用い、前記水と前記ヌマダイコンの植物原料との重量比が１０～５０：１である、ステップと、
（ｃ）前記ヌマダイコンの植物原料の前記ラフィネートを前記ヌマダイコンの植物原料として用い、ステップ（ｂ）を少なくとも１回繰り返し、かつ全ての得られた抽出溶液を合わせて組合せ抽出溶液を得るステップと、
（ｄ）第１のカラムクロマトグラフィーを前記組合せ抽出溶液に行うステップと、
を含み、前記第１のカラムクロマトグラフィーが、
（ｄ１）前記組合せ抽出溶液を、樹脂を詰めたカラムに装填するステップ、
（ｄ２）ステップ（ｄ１）の後、前記カラムを水で溶出し、前記カラムから流出する溶出液を捨てるステップ、
（ｄ３）ステップ（ｄ２）の後、前記カラムを第３のエタノール溶媒で溶出し、前記カラムから流出する溶出液を捨てるステップ、および
（ｄ４）ステップ（ｄ３）の後、前記カラムを第４のエタノール溶媒で溶出し、前記カラムから流出する溶出液を収集して初期精製抽出溶液とするステップ
を含む、請求項１０に記載の皮膚炎を治療するための医薬組成物。
【請求項12】
ステップ（ｂ）では、前記加圧抽出工程を１０１．４～１４０．０ｋＰａおよび１００～１４０℃で５～６０分行う、請求項１１に記載の皮膚炎を治療するための医薬組成物。
【請求項13】
前記抽出方法が、
（ｅ）第２のカラムクロマトグラフィーを前記初期精製抽出溶液に行い、細胞のＩＬ－４分泌を抑制する効果を有する少なくとも１つの画分を収集し、または収集して合わせ、活性画分とするステップであって、前記第２のカラムクロマトグラフィーにおいてｎ－ヘキサン／酢酸エチルの混合溶媒を移動相として用いる、ステップ
をさらに含む、請求項１１に記載の皮膚炎を治療するための医薬組成物。
（ｅ）第２のカラムクロマトグラフィーを前記初期精製抽出溶液に行い、細胞のＩＬ－４分泌を抑制する効果を有する少なくとも１つの画分を収集し、または収集して合わせ、活性画分とするステップであって、前記第２のカラムクロマトグラフィーにおいてｎ－ヘキサン／酢酸エチルの混合溶媒を移動相として用いる、ステップ
をさらに含む、請求項１１に記載の皮膚炎を治療するための医薬組成物。
【請求項14】
前記抽出方法が、
（ｆ）前記活性画分を濃縮して濃縮活性画分を得るステップ、
（ｇ）前記濃縮活性画分に加熱溶解工程を第５のエタノール溶媒で行って活性溶液を形成するステップ、
（ｈ）前記活性溶液を静置して、その中に結晶を形成させるステップ、および
（ｉ）前記結晶を収集するステップ、
をさらに含む、請求項１３に記載の皮膚炎を治療するための医薬組成物。
（ｆ）前記活性画分を濃縮して濃縮活性画分を得るステップ、
（ｇ）前記濃縮活性画分に加熱溶解工程を第５のエタノール溶媒で行って活性溶液を形成するステップ、
（ｈ）前記活性溶液を静置して、その中に結晶を形成させるステップ、および
（ｉ）前記結晶を収集するステップ、
をさらに含む、請求項１３に記載の皮膚炎を治療するための医薬組成物。
【請求項15】
前記ヌマダイコンの植物原料がヌマダイコンの葉に由来する、請求項１１に記載の皮膚炎を治療するための医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本技術分野はヌマダイコン（Adenostemma lavenia）抽出物を含む皮膚炎を治療するための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
アトピー性皮膚炎は、世界で最も一般的な慢性疾患の１つである。世界保健機関（ＷＨＯ）により示された世界の疾病負荷研究（Global Burden of Disease）によると、世界中で少なくとも２３０億人がアトピー性皮膚炎を患っており、かつそれは致命的ではない皮膚疾病負荷の一番の原因である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
現在入手可能なアトピー性皮膚炎用の外用薬のほとんどは副作用がある。例えば、ステロイドの使用は皮膚委縮、線状皮膚萎縮および毛細血管拡張のような副作用を引き起こし得る。よって、副作用がほとんどまたは全く無い皮膚炎のための天然薬品が、依然として緊急を要する開発の重点となっている。
【課題を解決するための手段】
【0004】
本開示は、皮膚炎を治療するための医薬組成物であって、ヌマダイコン抽出物と薬学的に許容される担体または塩とを含み、該皮膚炎にはアトピー性皮膚炎または接触性皮膚炎が含まれる、皮膚炎を治療するための医薬組成物を提供する。
【0005】
添付の図面を参照にしながら、以下の実施形態において詳細な説明を行う。
【図面の簡単な説明】
【0006】
添付の図面を参照にして、以下の詳細な説明および例を読むことにより、本発明をより充分に理解することができる。
【図1】図１は、２，４－ジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）誘発皮膚炎の動物モデル実験において、感作処理していない群（Ｎａiｖｅ）、ビヒクルを投与した群、およびヌマダイコン抽出物０８０５を投与した群におけるマウスの背部皮膚組織部位のヘマトキシリン・エオシン染色結果を示している。矢印で印をつけたところは増生を示し、＊で印をつけたところは炎症を示す。
【図2】図２は、２，４－ジニトロクロロベンゼン誘発皮膚炎の動物モデル実験における感作処理していない群、ビヒクルを投与した群、およびヌマダイコン抽出物０８０５を投与した群におけるマウスの背部皮膚の表皮の厚さを示している。データは平均値±標準誤差（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ）（ｎ＝５）で示されている。統計分析はスチューデントのｔ検定により行った。ビヒクルを投与した群と比較し、ｐ＜０．０５は統計的に有意な差があることを表し、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１である。
【図3】図３は、２，４－ジニトロクロロベンゼン誘発皮膚炎の動物モデル実験における、感作処理していない群、ビヒクルを投与した群、およびヌマダイコン抽出物０８０５を投与した群におけるマウスの背部皮膚の総合組織学的スコアを示している。データは平均値±標準誤差（ｎ＝５）で示されている。統計分析はマンホイットニー検定により行った。ビヒクルを投与した群と比較し、ｐ＜０．０５は統計的に有意な差があることを表し、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１である。
【図4】図４は、２，４－ジニトロクロロベンゼン誘発皮膚炎の動物モデル実験における、実験３０日目の感作処理していない群、ビヒクルを投与した群、ヌマダイコン抽出物０８０５－Ｆを投与した群、およびシクロスポリンＡを投与した群におけるマウスの耳の写真を示している。
【図5】図５は、２，４－ジニトロクロロベンゼン誘発皮膚炎の動物モデル実験における、実験３０日目の感作処理していない群、ビヒクルを投与した群、ヌマダイコン抽出物０８０５－Ｆを投与した群、およびシクロスポリンＡを投与した群におけるマウスの耳の厚さの測定結果を示している。データは平均値±標準誤差（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ）（ｎ＝５）で示されている。それぞれの群の耳の厚さとビヒクルを投与した群の耳の厚さとを比較するため、統計分析は、２元配置分散分析（two-way ANOVA）をダネットの多重比較検定と組み合わせて行った。ビヒクルを投与した群と比較して、ｐ＜０．０５は統計的に有意な差があることを表し、＊＊＊ｐ＜０．００１である。ヌマダイコン抽出物０８０５－Ｆ ３００ｍｇ／ｋｇを投与した群の耳の厚さと、シクロスポリンＡを投与した群の耳の厚さとを比較するため、統計分析をスチューデントのｔ検定により行った。ｐ＜０．０５は統計的に有意な差があることを表し、＃＃＃ｐ＜０．００１である。
【図6】図６は、感作処理していない群、ビヒクルを投与した群、ヌマダイコン抽出物０８０５－Ｆを投与した群、およびシクロスポリンＡを投与した群におけるマウスの耳の皮膚組織切片のヘマトキシリン・エオシン染色結果を示している。矢印で印をつけたところは増生を示し、＊で印をつけたところは炎症を示す。
【図7】図７は、感作処理していない群、ビヒクルを投与した群、ヌマダイコン抽出物０８０５－Ｆを投与した群、およびシクロスポリンＡを投与した群におけるマウスの耳の皮膚の総合組織学的スコアを示している。データは平均値±標準誤差（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ）（ｎ＝５）で示されている。それぞれの群の総合組織学的スコアとビヒクルを投与した群の総合組織学的スコアとを比較するため、統計分析をマンホイットニー検定により行った。ｐ＜０．０５は統計的に有意な差があることを表し、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１である。ヌマダイコン抽出物０８０５－Ｆ ３００ｍｇ／ｋｇを投与した群の総合組織学的スコアと、シクロスポリンＡを投与した群の総合組織学的スコアとを比較するため、統計分析をマンホイットニー検定により行った。ｐ＜０．０５は統計的に有意な差があることを表し、＃ｐ＜０．０５である。
【図8】図８は、ＮＣ／Ｎｇａマウスのアトピー性皮膚炎モデル実験における各群のマウス血清ＩｇＥ濃度の測定結果を示している。データは平均値±標準誤差（ｎ＝５）で示されている。統計分析はスチューデントのｔ検定により行った。ヌマダイコン抽出物Ｆ４ＡＢを投与した群と、そのビヒクルを投与した群との比較において、ｐ＜０．０５は統計的に有意な差があることを表し、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１である。ウパダシチニブを投与した群と、そのビヒクルを投与した群との比較において、ｐ＜０．０５は統計的に有意な差があることを表し、＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１である。
【図10A】図１０Ａは、ＮＣ／Ｎｇａマウスのアトピー性皮膚炎モデル実験において、ヌマダイコン抽出物Ｆ４ＡＢを投与したマウスの背中の総合的皮膚炎臨床重症度スコアを示している。データは平均値±標準誤差（ｎ＝５）で示されている。統計分析はマンホイットニー検定により行った。そのビヒクルを投与した群と比較し、ｐ＜０．０５は統計的に有意な差があることを表し、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１である。
【図10B】図１０Ｂは、ＮＣ／Ｎｇａマウスのアトピー性皮膚炎モデル実験において、ウパダシチニブを投与したマウスの背中の総合的皮膚炎臨床重症度スコアを示している。データは平均値±標準誤差（ｎ＝５）で示されている。統計分析はマンホイットニー検定により行った。そのビヒクルを投与した群と比較し、ｐ＜０．０５は統計的に有意な差があることを表し、＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１である。
【図10C】図１０Ｃは、ＮＣ／Ｎｇａマウスのアトピー性皮膚炎モデル実験において、実験４２日目、犠牲死させる前のマウスの背中の総合的皮膚炎臨床重症度スコア（皮膚損傷のスコア）の結果を示している。データは平均値±標準誤差（ｎ＝５）で示されている。統計分析はマンホイットニー検定により行った。ヌマダイコン抽出物Ｆ４ＡＢを投与した群と、そのビヒクルを投与した群との比較において、ｐ＜０．０５は統計的に有意な差があることを表し、＊＊＊ｐ＜０．００１である。ウパダシチニブを投与した群と、そのビヒクルを投与した群との比較において、ｐ＜０．０５は統計的に有意な差があることを表し、＃＃＃ｐ＜０．００１である。
【図11】図１１は、ＮＣ／Ｎｇａマウスのアトピー性皮膚炎モデル実験における、感作処理していない群、ヌマダイコン抽出物Ｆ４ＡＢを投与した群、およびビヒクルを投与した群におけるマウスの背部皮膚組織切片のヘマトキシリン・エオシン染色結果を示している。矢印で印をつけたところは増生を示し、＊で印をつけたところは炎症を示す。
【図12】図１２は、ＮＣ／Ｎｇａマウスのアトピー性皮膚炎モデル実験における、感作処理していない群、ウパダシチニブを投与した群、およびビヒクルを投与した群のマウスの背部皮膚組織切片のヘマトキシリン・エオシン染色結果を示している。＊で印をつけたところは炎症を示す。
【図13】図１３は、ＮＣ／Ｎｇａマウスのアトピー性皮膚炎モデル実験における、感作処理していない群、ヌマダイコンのビヒクルを投与した群、ヌマダイコン抽出物Ｆ４ＡＢを投与した群、ウパダシチニブのビヒクルを投与した群、ウパダシチニブを投与した群のマウスの背部皮膚の表皮の厚さを示している。データは平均値±標準誤差（ｎ＝５）で示されている。統計分析はスチューデントのｔ検定により行った。ヌマダイコン抽出物Ｆ４ＡＢを投与した群と、そのビヒクルを投与した群との比較において、ｐ＜０．０５は統計的に有意な差があることを表し、＊＊ｐ＜０．０１である。ウパダシチニブを投与した群と、そのビヒクルを投与した群との比較において、ｐ＜０．０５は統計的に有意な差があることを表し、＃＃ｐ＜０．０１である。
【図14A】図１４Ａは、ＮＣ／Ｎｇａマウスのアトピー性皮膚炎モデル実験におけるマウスの背部皮膚の組織病理切片分析の炎症スコアを示している。データは平均値±標準誤差（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ）（ｎ＝５）で示されており、統計分析はマンホイットニー検定により行った。ヌマダイコン抽出物Ｆ４ＡＢを投与した群と、そのビヒクルを投与した群との比較において、ｐ＜０．０５は統計的に有意な差があることを表し、＊＊ｐ＜０．０１である。ウパダシチニブを投与した群と、そのビヒクルを投与した群との比較において、ｐ＜０．０５は統計的に有意な差があることを表し、＃＃ｐ＜０．０１である。
【図14B】図１４ＢはＮＣ／Ｎｇａマウスのアトピー性皮膚炎モデル実験におけるマウスの背部皮膚の組織病理切片分析の壊死スコアを示している。データは平均値±標準誤差（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ）（ｎ＝５）で示されており、統計分析はマンホイットニー検定により行った。ヌマダイコン抽出物Ｆ４ＡＢを投与した群と、そのビヒクルを投与した群との比較において、ｐ＜０．０５は統計的に有意な差があることを表し、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、である。ウパダシチニブを投与した群と、そのビヒクルを投与した群との比較において、ｐ＜０．０５は統計的に有意な差があることを表し、＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１である。
【図14C】図１４Ｃは、ＮＣ／Ｎｇａマウスのアトピー性皮膚炎モデル実験におけるマウスの背部皮膚の組織病理切片分析の増生スコアを示している。データは平均値±標準誤差（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ）（ｎ＝５）で示されており、統計分析はマンホイットニー検定により行った。ヌマダイコン抽出物Ｆ４ＡＢを投与した群と、そのビヒクルを投与した群との比較において、ｐ＜０．０５は統計的に有意な差があることを表し、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１である。ウパダシチニブを投与した群と、そのビヒクルを投与した群との比較において、ｐ＜０．０５は統計的に有意な差があることを表し、＃＃ｐ＜０．０１である。
【図14D】図１４Ｄは、ＮＣ／Ｎｇａマウスのアトピー性皮膚炎モデル実験におけるマウスの背部皮膚の組織病理切片分析の過角化（hyperkeratosis）スコアを示している。データは平均値±標準誤差（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ）（ｎ＝５）で示されており、統計分析はマンホイットニー検定により行った。ヌマダイコン抽出物Ｆ４ＡＢを投与した群と、そのビヒクルを投与した群との比較において、ｐ＜０．０５は統計的に有意な差があることを表し、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１である。ウパダシチニブを投与した群と、そのビヒクルを投与した群との比較において、ｐ＜０．０５は統計的に有意な差があることを表し、＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１である。
【発明を実施するための形態】
【0007】
以下の詳細な記載では、本開示が充分に理解されるよう、説明の目的で、多数の特定の詳細が示される。しかしながら、これら特定の詳細が無くとも１つまたはそれ以上の実施形態を実施することができるということは明らかであろう。また、図面を簡潔にするため、周知の構造および装置は概略的に示される。
【0008】
本開示はヌマダイコン抽出物を提供し得る。本開示により提供されるヌマダイコン抽出物は、細胞のＩＬ－４分泌を抑制する効果を有し、かつ皮膚炎の症状を少なくとも治療および／または軽減することができる。
【0009】
上述した皮膚炎の例には、限定はされないが、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、またはその任意の組み合わせが含まれ得る。一実施形態において、上述した皮膚炎はアトピー性皮膚炎であり得る。別の実施形態において、上述した皮膚炎は接触性皮膚炎であり得る。
【0010】
また、上述した皮膚炎の症状には、紅斑、出血、傷跡、乾燥、水腫、表皮剥脱、びらん、炎症、壊死、増生、過角化、表皮肥厚、かゆみ等、またはその任意の組み合わせが含まれ得るが、これに限定はされない。
【0011】
上述したヌマダイコン抽出物はヌマダイコンの任意の器官または部位に由来するものであってよく、特に限定はない。例えば、上述したヌマダイコン抽出物は、ヌマダイコンの全草、根、茎、葉、花、種子、またはその任意の組み合わせに由来するものであってよい。
【0012】
さらに、上述したヌマダイコン抽出物は、任意の抽出溶媒および／または任意の抽出方法を用いて得ることができるものであって、得られたヌマダイコン抽出物が皮膚炎の症状を治療および／または軽減することができ、かつ人体または動物体に害を及ぼさないものであればよい。例えば、上述したヌマダイコン抽出物は、抽出溶媒を用い１回の抽出を行うことにより得ることができる、または同じもしくは異なる抽出溶媒を順次用いて複数回の抽出を行うことにより得ることもできる。上述した抽出溶媒には、限定はされないが、水、アルコール、エステル、アルカン等、または任意の比率でのその任意の組み合わせが含まれ得る。上述したアルコールの例には、限定はされないが、メタノールまたはエタノールが含まれ得る。上述したエステルの例には酢酸エチルが含まれるが、これに限定はされない。上述したアルカンの例には、限定はされないが、ｎ－ヘキサン、シクロヘキサンまたはヘプタンが含まれ得る。
【0013】
一実施形態において、上述したヌマダイコン抽出物はヌマダイコンのエタノール抽出物であってよい。
【0014】
前述したヌマダイコンのエタノール抽出物の抽出方法に特に限定はなく、得られるヌマダイコンのエタノール抽出物が皮膚炎の症状を治療および／または軽減することができ、かつ人体または動物体に害を及ぼさないものであればよい。
【0015】
一実施形態において、前述したヌマダイコンのエタノール抽出物の抽出方法は次のステップを含んでいてよいが、これに限定はされない。
【0016】
先ず、ヌマダイコンの植物原料を準備する。前述のヌマダイコンの植物原料のソースにはヌマダイコンの全草、根、茎、葉、花、種子、またはその任意の組み合わせが含まれ得るが、これに限定はされない。一実施形態において、前述のヌマダイコンの植物原料のソースはヌマダイコンの葉であってよい。前述のヌマダイコンの植物原料のソースは、前述のヌマダイコンの植物原料として直接用いることができる。あるいは、前述のヌマダイコンの植物原料のソースは、前処理を行ってから、前述のヌマダイコンの植物原料として用いることもできる。上述した前処理には、限定はされないが、乾燥、スライス、粉砕、フィルターバッグへの装填等、または任意の順序でのその任意の組み合わせが含まれ得る。
【0017】
次いで、ヌマダイコンの植物原料に熱抽出工程を行うことができ、次に固液分離工程を行って抽出溶液を得ると共に、ヌマダイコンの植物原料のラフィネートを生成することができる。熱抽出工程では、第１のエタノール溶媒を抽出溶媒として用いることができる。また、当該抽出溶液を上述したヌマダイコンのエタノール抽出物として用いることができる。
【0018】
上述した熱抽出工程において、上記第１のエタノール溶媒のエタノール濃度に特に限定はなく、必要に応じて調整することができる。例えば、上記第１のエタノール溶媒のエタノール濃度は、抽出工程実施時の外部環境（外部環境の温度、湿度、圧力等）、ヌマダイコンの植物原料のソースの種類（全草、根、茎、葉、花、種子等）、ヌマダイコンの植物原料の状態（含水量、重量等）、用いられる第１のエタノール溶媒とヌマダイコンの植物原料との重量比、用いられる抽出温度および／または実施される抽出時間等に応じて調整することができるが、これに限定はされない。一実施形態において、上記第１のエタノール溶媒のエタノール濃度は、約３０～１００ｖｏｌ％、例えば約４０～９５ｖｏｌ％、約４５～９０ｖｏｌ％、約５０～８５ｖｏｌ％、約６０～８０ｖｏｌ％、約７０～７５ｖｏｌ％、約３０ｖｏｌ％、約４０ｖｏｌ％、約４５ｖｏｌ％、約５０ｖｏｌ％、約５５ｖｏｌ％、約６０ｖｏｌ％、約６５ｖｏｌ％、約７０ｖｏｌ％、約７５ｖｏｌ％、約８０ｖｏｌ％、約８５ｖｏｌ％、約９０ｖｏｌ％、約９５ｖｏｌ％とすることができるが、これに限定はされない。一実施形態において、上記第１のエタノール溶媒のエタノール濃度は約９５％であってよい。さらに、一実施形態において、上記第１のエタノール溶媒はエタノール水溶液であってよいが、これに限定はされない。
【0019】
加えて、上述の熱抽出工程において、前述した第１のエタノール溶媒と前述したヌマダイコンの植物原料との重量比にも特に限定はなく、必要に応じて調整することができる。例えば、前述した第１のエタノール溶媒と前述したヌマダイコンの植物原料と重量比は、抽出工程実施時の外部環境（外部環境の温度、湿度、圧力等）、ヌマダイコンの植物原料のソースの種類（全草、根、茎、葉、花、種子等）、ヌマダイコンの植物原料の状態（含水量、重量等）、用いられる第１のエタノール溶媒のエタノール濃度、用いられる抽出温度および／または実施される抽出時間等に応じて調整することができるが、これに限定はされない。一実施形態において、前述した第１のエタノール溶媒と前述したヌマダイコンの植物原料との重量比は約５～１５：１、例えば約６～１２：１、約７～１１：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１、約１１：１、約１２：１、約１３：１、約１４：１、約１５：１であってよいが、これに限定はされない。特定の一実施形態において、前述した第１のエタノール溶媒と前述したヌマダイコンの植物原料との重量比は約８：１であってよい。
【0020】
また、上述した熱抽出工程で用いられる抽出温度にも特に限定はなく、操作時における室温よりも高ければよく、かつ必要に応じて調整可能である。例えば、上述した熱抽出工程で用いられる抽出温度は、抽出工程実施時の外部環境（外部環境の温度、湿度、圧力等）、ヌマダイコンの植物原料のソースの種類（全草、根、茎、葉、花、種子等）、ヌマダイコンの植物原料の状態（含水量、重量等）、用いられる第１のエタノール溶媒のエタノール濃度、用いられる第１のエタノール溶媒とヌマダイコンの植物原料との重量比、および／または実施される抽出時間等に応じて調整することができるが、これに限定はされない。一実施形態において、上述した熱抽出工程に用いられる温度は約４０～８０℃、例えば約４５～７５℃、約５０～７０℃、約５５～６５℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃、約８０℃であってよいが、これに限定はされない。特定の一実施形態において、上述した熱抽出工程に用いられる温度は約６０℃であってよい。
【0021】
同様に、上述した熱抽出工程を実施する時間にも特に限定はなく、必要に応じて調整可能である。例えば、上述した熱抽出工程を実施する時間は、抽出工程実施時の外部環境（外部環境の温度、湿度、圧力等）、ヌマダイコンの植物原料のソースの種類（全草、根、茎、葉、花、種子等）、ヌマダイコンの植物原料の状態（含水量、重量等）、用いられる第１のエタノール溶媒のエタノール濃度、用いられる第１のエタノール溶媒とヌマダイコンの植物原料との重量比、および／または用いられる抽出温度等に応じて調整することができるが、これに限定はされない。一実施形態において、上述した熱抽出工程を実施する時間は約１～１５時間、例えば約２～１２時間、約３～１０時間、約４～８時間、約５～６時間、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間であってよいが、これに限定はされない。特定の一実施形態において、上述した熱抽出工程を実施する時間は約８時間であってよい。
【0022】
さらに、前述した固液分離工程にも特に限定はなく、上述した熱抽出工程の後に、前述した抽出溶液および前述したヌマダイコンの植物原料のラフィネートをそれぞれ得ることができればよい。前述した固液分離工程の例には、限定はされないが、遠心分離、濾過、またはその任意の組み合わせが含まれ得る。一実施形態において、前述した固液分離工程は濾過工程であり得る。
【0023】
別の実施形態において、上述したヌマダイコンのエタノール抽出物の抽出方法は、ヌマダイコンの植物原料に熱抽出工程を行ってから、固液分離工程を行う前述したステップの後に、上述の得られた抽出溶液に乾燥工程を行って乾燥抽出物を形成するステップをさらに含んでいてよいが、同様にこれに限定されることはない。加えて、ここで得られる乾燥抽出物は、上述したヌマダイコンのエタノール抽出物として使用することができる。
【0024】
前述した乾燥工程に特に限定はなく、上述の抽出溶液を乾燥させて乾燥抽出物にすることができ、かつ抽出溶液の皮膚炎の症状を治療および／または軽減する効果に悪い影響がないものであればよい。例えば、前述した乾燥工程にはオーブン乾燥、回転乾燥、減圧下での濃縮および乾燥が含まれ得るが、これに限定はされない。一実施形態において、上記乾燥工程は減圧下での濃縮および乾燥の工程であってよい。
【0025】
別の実施形態において、上述したヌマダイコンのエタノール抽出物の抽出方法は、ヌマダイコンの植物原料に熱抽出工程を行ってから、固液分離工程を行って抽出溶液を得ると共に、ヌマダイコンの植物原料のラフィネートを生成する前述したステップの後に、限定はされないが、上述したヌマダイコンの植物原料のラフィネートをヌマダイコンの植物原料として用い、ヌマダイコンの植物原料に熱抽出工程を行ってから、固液分離工程を行って抽出溶液を得ると共に、ヌマダイコンの植物原料のラフィネートを生成する前述したステップを少なくとも１回繰り返し、かつ全ての得られた抽出溶液を合わせて組合せ抽出溶液を得るステップをさらに含んでいてよい。
【0026】
繰り返しの、ヌマダイコンの植物原料に熱抽出工程を行ってから、固液分離工程を行って抽出溶液を得ると共に、ヌマダイコンの植物原料のラフィネートを生成するステップ中の熱抽出および固液分離工程に関する説明（例えば、用いられる方式、操作パラメータ／条件）は、上述した熱抽出工程および固液分離工程に関する記載を参照することができるため、ここで詳細は繰り返さない。
【0027】
加えて、繰り返されるときの、ヌマダイコンの植物原料に熱抽出工程を行ってから、固液分離工程を行って抽出溶液を得ると共にヌマダイコンの植物原料のラフィネートを生成するステップにおける熱抽出および／または固液分離工程に用いられる方式、操作パラメータ／条件（例えば、第１のエタノール溶媒のエタノール濃度、第１のエタノール溶媒とヌマダイコンの植物原料との重量比、熱抽出工程に用いる温度、熱抽出工程を実施する時間）と、初回に行うときの、ヌマダイコンの植物原料に熱抽出工程を行ってから、固液分離工程を行って抽出溶液を得ると共に、ヌマダイコンの植物原料のラフィネートを生成するステップにおける熱抽出および／または固液分離工程に用いられる方式、操作パラメータ／条件とは、必要に応じて、または操作時における条件に応じて、同じでもまたは異なっていてもよく、特に限定はない。一実施形態において、繰り返されるときの、ヌマダイコンの植物原料に熱抽出工程を行ってから、固液分離工程を行って抽出溶液を得ると共に、ヌマダイコンの植物原料のラフィネートを生成するステップにおける熱抽出および／または固液分離工程に用いられる方式、操作パラメータ／条件と、初回に行うときの、ヌマダイコンの植物原料に熱抽出工程を行ってから、固液分離工程を行って抽出溶液を得ると共に、ヌマダイコンの植物原料のラフィネートを生成するステップにおける熱抽出および／または固液分離工程に用いられる方式、操作パラメータ／条件とは、同じである。
【0028】
さらに、繰り返しの、ヌマダイコンの植物原料に熱抽出工程を行ってから、固液分離工程を行って抽出溶液を得ると共に、ヌマダイコンの植物原料のラフィネートを生成するそれぞれのステップにおけるそれぞれの熱抽出および／またはそれぞれの固液分離工程で用いられる方式、操作パラメータ／条件（例えば、第１のエタノール溶媒のエタノール濃度、第１のエタノール溶媒とヌマダイコンの植物原料との重量比、熱抽出工程に用いられる温度、熱抽出工程を実施する時間）も、必要に応じて、または操作時における条件に応じて、同じでもまたは異なっていてもよく、特に限定はない。一実施形態において、繰り返しの、ヌマダイコンの植物原料に熱抽出工程を行ってから、固液分離工程を行って抽出溶液を得ると共に、ヌマダイコンの植物原料のラフィネートを生成するそれぞれのステップにおけるそれぞれの熱抽出および／またはそれぞれの固液分離工程で用いられる方式、操作パラメータ／条件（例えば、第１のエタノール溶媒のエタノール濃度、第１のエタノール溶媒とヌマダイコンの植物原料との重量比、熱抽出工程に用いられる温度、熱抽出工程を実施する時間）は、同じである。
【0029】
さらなる別の実施形態では、上述したヌマダイコンのエタノール抽出物の抽出方法は、全ての得られた抽出溶液を合わせて組合せ抽出溶液を得る前述したステップの後に、組合せ抽出溶液に乾燥工程を行って乾燥抽出物を得るステップをさらに含んでいてよいが、同様にこれに限定はされない。ここに述べた乾燥工程に特に限定はなく、上述した組合せ抽出溶液を乾燥させて乾燥抽出物にすることができ、かつ組合せ抽出溶液の皮膚炎の症状を治療および／または軽減する効果に悪い影響がないものであればよい。例えば、ここに述べた乾燥工程にはオーブン乾燥、回転乾燥、減圧下での濃縮および乾燥が含まれ得るが、これに限定はされない。一実施形態において、ここに述べた乾燥工程は、減圧下での濃縮および乾燥の工程であってよい。また、ここで得られる乾燥抽出物は、上述したヌマダイコンのエタノール抽出物として用いることができる。
【0030】
加えて、特定の一実施形態において、上述したヌマダイコンのエタノール抽出物の抽出方法は、組合せ抽出溶液に乾燥工程を行って乾燥抽出物を得る前述したステップの後に、以下のステップをさらに含んでいてよいが、同様にこれに限定はされない。
【0031】
先ず、第２のエタノール溶媒中で前述した乾燥抽出物に、前述した乾燥抽出物が溶解して混合物が形成されるまで、加熱工程を行う。
【0032】
上述した加熱工程において、上記第２のエタノール溶媒のエタノール濃度にも特に限定はなく、必要に応じて調整することができる。例えば、上記第２のエタノール溶媒のエタノール濃度は、加熱工程実施時の外部環境（外部環境の温度、湿度、圧力等）、乾燥抽出物の状態（含水量、重量等）、用いられる第２のエタノール溶媒と乾燥抽出物との重量比、用いられる加熱温度および／または実施される加熱時間等に応じて調整することができるが、これに限定はされない。一実施形態において、上記第２のエタノール溶媒のエタノール濃度は、約３０～１００ｖｏｌ％、例えば約４０～９５ｖｏｌ％、約４５～９０ｖｏｌ％、約５０～８５ｖｏｌ％、約６０～８０ｖｏｌ％、約７０～７５ｖｏｌ％、約３０ｖｏｌ％、約４０ｖｏｌ％、約４５ｖｏｌ％、約５０ｖｏｌ％、約５５ｖｏｌ％、約６０ｖｏｌ％、約６５ｖｏｌ％、約７０ｖｏｌ％、約７５ｖｏｌ％、約８０ｖｏｌ％、約８５ｖｏｌ％、約９０ｖｏｌ％、約９５ｖｏｌ％であってよいが、これに限定はされない。一実施形態において、上記第２のエタノール溶媒のエタノール濃度は約９５％であってよい。また、一実施形態において、上記第２のエタノール溶媒はエタノール水溶液であってよいが、同様にこれに限定はされない。
【0033】
さらに、上述した加熱工程において、上記第２のエタノール溶媒と上記乾燥抽出物との重量比にも特に限定はなく、必要に応じて調整することができる。例えば、上記第１のエタノール溶媒と上記乾燥抽出物との重量比は、加熱工程実施時の外部環境（外部環境の温度、湿度、圧力等）、乾燥抽出物の状態（含水量、重量等）、用いられる第２のエタノール溶媒のエタノール濃度、用いられる加熱温度および／または実施される加熱時間等に応じて調整することができるが、これに限定はされない。一実施形態において、上記第２のエタノール溶媒と上記乾燥抽出物との重量比は約５～１５：１、例えば約６～１２：１、約７～１１：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１、約１１：１、約１２：１、約１３：１、約１４：１、約１５：１であってよいが、これに限定はされない。特定の一実施形態において、上記第２のエタノール溶媒と上記乾燥抽出物との重量比は約８：１であってよい。
【0034】
さらに、上述した加熱工程で用いられる温度にも特に限定はなく、操作時における室温よりも高ければよく、かつ必要に応じて調整可能である。例えば、上述した加熱工程で用いられる温度は、加熱工程実施時の外部環境（外部環境の温度、湿度、圧力等）、乾燥抽出物の状態（含水量、重量等）、用いられる第２のエタノール溶媒のエタノール濃度、用いられる第２のエタノール溶媒と乾燥抽出物との重量比、および／または実施される加熱時間等に応じて調整することができるが、これに限定はされない。一実施形態において、上述した加熱工程に用いられる温度は約３０～７０℃、例えば約３５～６５℃、約４０～６０℃、約４５～５５℃、約３０℃、約３５℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃であってよいが、これに限定はされない。特定の一実施形態において、上述した加熱工程に用いられる温度は約５０℃であり得る。
【0035】
次いで、上述した混合物を形成した後、カラムクロマトグラフィーを上述した混合物に行い、細胞のＩＬ－４分泌を抑制する効果を有する少なくとも１つの画分を収集し、または収集して合わせて、活性画分とする。また、ここで得られる活性画分は上述したヌマダイコンのエタノール抽出物として用いることができる。
【0036】
上述したカラムクロマトグラフィーにおいて、移動相として用いることのできる溶媒に特に限定はなく、細胞のＩＬ－４分泌を抑制する効果を有し、かつ人体または動物体に害を及ぼさない少なくとも１つの画分を得ることのできるものであればよい。移動相として用いることのできる溶媒には、限定はされないが、水、アルコール、エステル、アルカン等、または任意の比率でのその任意の組み合わせが含まれ得る。上述したアルコールの例には、限定はされないが、メタノールまたはエタノールが含まれ得る。上述したエステルの例には酢酸エチルが含まれ得るが、これに限定はされない。上述したアルカンの例には、限定はされないが、ｎ－ヘキサン、シクロヘキサンまたはヘプタンが含まれ得る。一実施形態では、上述したカラムクロマトグラフィーにおいて、メタノール溶媒が移動相として用いられてよい。別の実施形態では、上述したカラムクロマトグラフィーにおいて、ｎ－ヘキサン／酢酸エチルの混合溶媒が移動相として用いられてよい。上述したｎ－ヘキサン／酢酸エチルの混合溶媒のｎ－ヘキサンと酢酸エチルとの体積比にも特に限定はなく、細胞のＩＬ－４分泌を抑制する効果を有し、かつ人体または動物体に害を及ぼさない少なくとも１つの画分を得ることのできるものであればよい。例えば、上述したｎ－ヘキサン／酢酸エチルの混合溶媒のｎ－ヘキサンと酢酸エチルとの体積比は約０．１～１：１、例えば０．２～０．８：１、０．３～０．７：１、０．４～０．５：１、０．１：１、０．２：１、０．２５：１、０．３：１、０．４：１、０．５：１、０．６：１、０．７：１、０．８：１、０．９：１、１：１であってよいが、これに限定はされない。
【0037】
上述したカラムクロマトグラフィーの種類に特に限定はない。一実施形態において、上述したカラムクロマトグラフィーはシリカゲルカラムクロマトグラフィーであり得る。別の実施形態において、上述したカラムクロマトグラフィーは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）であってよいが、これに限定はされない。
【0038】
さらに別の特定の実施形態において、上述したヌマダイコンのエタノール抽出物の抽出方法は、細胞のＩＬ－４分泌を抑制する効果を有する少なくとも１つの画分を収集し、または収集して合わせて、活性画分とするステップの後に、活性画分に乾燥工程を行って乾燥活性画分を得るステップをさらに含んでいてよいが、同様にこれに限定はされない。さらに、ここで得られる乾燥活性画分は、上述したヌマダイコンのエタノール抽出物として用いることができる。
【0039】
加えて、本開示の別の実施形態では、上述したヌマダイコン抽出物はヌマダイコンの水抽出物であってよい。
【0040】
上述したヌマダイコンの水抽出物の抽出方法に特に限定はなく、得られるヌマダイコンの水抽出物が、皮膚炎の症状を治療および／または軽減することができ、かつ人体または動物体に害を及ぼさないものであればよい。
【0041】
一実施形態において、前述したヌマダイコンの水抽出物の抽出方法は以下のステップを含み得るが、これに限定はされない。
【0042】
先ず、ヌマダイコンの植物原料を準備する。前述のヌマダイコンの植物原料のソースにはヌマダイコンの全草、根、茎、葉、花、種子、またはその任意の組み合わせが含まれ得るが、これに限定はされない。一実施形態において、前述のヌマダイコンの植物原料のソースはヌマダイコンの葉であってよい。前述のヌマダイコンの植物原料のソースは、前述したヌマダイコンの植物原料として直接用いることができる。あるいは、前述したヌマダイコンの植物原料のソースは、前処理を行ってから、前述したヌマダイコンの植物原料として用いることもできる。上述した前処理には、限定はされないが、乾燥、スライス、粉砕、フィルターバッグへの装填等、または任意の順序でのその任意の組み合わせが含まれ得る。
【0043】
次いで、ヌマダイコンの植物原料に加圧抽出工程を行うことができ、次に固液分離工程を行って抽出溶液を得ると共に、ヌマダイコンの植物原料のラフィネートを生成することができる。加圧抽出工程では、水を抽出溶媒として用いることができる。また、ここで得られる抽出溶液を、上述したヌマダイコンの水抽出物として用いることができる。
【0044】
上述した加圧抽出工程において、上記水と上記ヌマダイコンの植物原料との重量比にも特に限定はなく、必要に応じて調整することができる。例えば、上記水と上記ヌマダイコンの植物原料との重量比は、抽出工程実施時の外部環境（外部環境の温度、湿度、圧力等）、ヌマダイコンの植物原料のソースの種類（全草、根、茎、葉、花、種子等）、ヌマダイコンの植物原料の状態（含水量、重量等）、用いられる抽出圧力、用いられる抽出温度および／または実施される抽出時間等に応じて調整することができるが、これに限定はされない。一実施形態において、上記水と上記ヌマダイコンの植物原料との重量比は約１０～５０：１、例えば約１５～４５：１、約２０～４０：１、約２５～３５：１、約１５：１、約２０：１、約２５：１、約３０：１、約３５：１、約４０：１、約４５：１、約５０：１であってよいが、これに限定はされない。特定の一実施形態において、上記水と上記ヌマダイコンの植物原料との重量比は約３０：１であってよい。
【0045】
上述した加圧抽出工程に用いられる圧力に特に限定はなく、必要に応じて調整することができる。例えば、上述した加圧抽出工程に用いられる圧力は、加圧抽出工程実施時の外部環境（外部環境の温度、湿度、圧力等）、ヌマダイコンの植物原料のソースの種類（全草、根、茎、葉、花、種子等）、ヌマダイコンの植物原料の状態（含水量、重量等）、用いられる水とヌマダイコンの植物原料との重量比、用いられる抽出温度および／または実施される抽出時間等に応じて調整することができるが、これに限定はされない。一実施形態において、上述した加圧抽出工程に用いられる圧力は約１０１．４～１４０．０ｋＰａ、例えば約１０１．５～１３５．０ｋＰａ、約１０１．６～１３０．０ｋＰａ、約１０１．８～１２５．０ｋＰａ、約１０２．０～１２０．０ｋＰａ、約１０２．２～１１５．０ｋＰａ、約１０２．４～１１０．０ｋＰａ、約１０２．６～１０５．０ｋＰａ、約１０２．８～１０４．０ｋＰａ、約１０１．５ｋＰａ、約１０１．６ｋＰａ、約１０１．７ｋＰａ、約１０１．８ｋＰａ、約１０１．９ｋＰａ、約１０２．０ｋＰａ、約１０２．１ｋＰａ、約１０２．２ｋＰａ、約１０２．２５ｋＰａ、約１０２．３ｋＰａ、約１０２．４ｋＰａ、約１０２．５ｋＰａ、約１０２．６ｋＰａ、約１０２．７ｋＰａ、約１０２．８ｋＰａ、約１０２．９ｋＰａ、約１０２．９２ｋＰａ、約１０２．９４ｋＰａ、約１０２．９６ｋＰａ、約１０２．９７ｋＰａ、約１０２．９８ｋＰａ、約１０３．０ｋＰａ、約１０５．０ｋＰａ、約１０７．０ｋＰａ、約１０８．０ｋＰａ、約１１０．０ｋＰａ、約１１２．０ｋＰａ、約１１５．０ｋＰａ、約１２０．０ｋＰａ、約１２５．０ｋＰａ、約１３０．０ｋＰａ、約１３５．０ｋＰａ、約１４０．０ｋＰａであってよいが、これに限定はされない。特定の一実施形態において、上述した加圧抽出工程に用いられる圧力は約１０２．９７ｋＰａであってよい。
【0046】
上述した加圧抽出工程に用いられる抽出温度に特に限定はなく、必要に応じて調整することができる。例えば、上述した加圧抽出工程に用いられる抽出温度は、加圧抽出工程実施時の外部環境（外部環境の温度、湿度、圧力等）、ヌマダイコンの植物原料のソースの種類（全草、根、茎、葉、花、種子等）、ヌマダイコンの植物原料の状態（含水量、重量等）、用いられる水とヌマダイコンの植物原料との重量比、用いられる抽出圧力および／または実施される抽出時間等に応じて調整することができるが、これに限定はされない。一実施形態において、上述した加圧抽出工程に用いられる抽出温度は、約１００～１４０℃、例えば約１０２～１３５℃、約１０５～１３０℃、約１０８～１２５℃、約１１０～１２０℃、約１００℃、約１０１℃、約１０３℃、約１０５℃、約１１０℃、約１１２℃、約１１５℃、約１２０℃等であってよいが、これに限定はされない。特定の一実施形態において、上述した加圧抽出工程に用いられる抽出温度は約１２０℃であってよい。
【0047】
上述した加圧抽出工程を実施する時間にも特に限定はなく、必要に応じて調整することができる。例えば、上述した加圧抽出工程を実施する時間は、加圧抽出工程実施時の外部環境（外部環境の温度、湿度、圧力等）、ヌマダイコンの植物原料のソースの種類（全草、根、茎、葉、花、種子等）、ヌマダイコンの植物原料の状態（含水量、重量等）、用いられる水とヌマダイコンの植物原料との重量比、用いられる抽出圧力および／または用いられる抽出温度等に応じて調整することができるが、これに限定はされない。一実施形態において、上述した加圧抽出工程を実施する時間は、約５～６０分、約１０～５５分、約１５～５０分、約２０～４５分、約２５～４０分、約３０～３５分、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分、約６０分等であってよいが、これに限定はされない。特定の一実施形態において、上述した加圧抽出工程を実施する時間は約２０分であってよい。
【0048】
別の実施形態において、上述したヌマダイコンの水抽出物の抽出方法は、ヌマダイコンの植物原料に加圧抽出工程を行ってから、固液分離工程を行う前述したステップの後、上述の得られた抽出溶液に乾燥工程を行って乾燥抽出物を形成するステップをさらに含んでいてよい。加えて、ここで得られる乾燥抽出物は、上述したヌマダイコンの水抽出物として使用することができる。
【0049】
同様に、ここに述べた乾燥工程に特に限定はなく、上述した抽出溶液を乾燥させて乾燥抽出物にすることができ、かつ抽出溶液の皮膚炎の症状を治療および／または軽減する効果に悪い影響がないものであればよい。例えば、ここに述べた乾燥工程にはオーブン乾燥、回転乾燥、減圧下での濃縮および乾燥が含まれ得るが、これに限定はされない。
【0050】
別の実施形態において、上述したヌマダイコンの水抽出物の抽出方法は、ヌマダイコンの植物原料に加圧抽出工程を行ってから、固液分離工程を行って抽出溶液を得ると共に、ヌマダイコンの植物原料のラフィネートを生成する前述したステップの後に、限定はされないが、上述したヌマダイコンの植物原料のラフィネートをヌマダイコンの植物原料として用い、ヌマダイコンの植物原料に加圧抽出工程を行ってから、固液分離工程を行って抽出溶液を得ると共に、ヌマダイコンの植物原料のラフィネートを生成する前述したステップを少なくとも１回繰り返し、かつ全ての得られた抽出溶液を合わせて組合せ抽出溶液を得るステップをさらに含んでいてよい。また、ここで得られる組合せ抽出溶液は、上述したヌマダイコンの水抽出物として用いることができる。特定の一実施形態において、ヌマダイコンの植物原料に加圧抽出工程を行ってから、固液分離工程を行って抽出溶液を得ると共に、ヌマダイコンの植物原料のラフィネートを生成する前述したステップを３回繰り返し、全ての抽出溶液を合わせて組合せ抽出溶液を得る。さらに、ここで得られる組合せ抽出溶液も上述したヌマダイコンの水抽出物として用いることができる。
【0051】
繰り返されるときの、ヌマダイコンの植物原料に加圧抽出工程を行ってから、固液分離工程を行って抽出溶液を得ると共に、ヌマダイコンの植物原料のラフィネートを生成するステップにおける加圧抽出工程および固液分離工程に関する記載（例えば用いられる方式、操作パラメータ／条件）については、上述した加圧抽出工程および固液分離工程に関する記載を参照とすることができるため、ここで詳細は繰り返さない。
【0052】
加えて、繰り返されるときの、ヌマダイコンの植物原料に熱抽出工程を行ってから、固液分離工程を行って抽出溶液を得ると共に、ヌマダイコンの植物原料のラフィネートを生成するステップにおける熱抽出および／または固液分離工程で用いられる方式、操作パラメータ／条件（例えば、水とヌマダイコンの植物原料との重量比、加圧抽出工程で用いられる圧力、加圧抽出工程で用いられる温度、加圧抽出工程を実施する時間）と、１回目に行われるときの、ヌマダイコンの植物原料に加圧抽出工程を行ってから、固液分離工程を行って抽出溶液を得ると共に、ヌマダイコンの植物原料のラフィネートを生成するステップにおける加圧抽出工程および／または固液分離工程で用いられる方式、操作パラメータ／条件とは、必要に応じて、または操作時の条件に応じて、同じであっても、または異なっていてもよく、特に限定はない。一実施形態において、繰り返されるときの、ヌマダイコンの植物原料に加圧抽出工程を行ってから、固液分離工程を行って抽出溶液を得ると共に、ヌマダイコンの植物原料のラフィネートを生成するステップにおける加圧抽出工程および／または固液分離工程で用いられる方式、操作パラメータ／条件と、１回目に行われるときの、ヌマダイコンの植物原料に熱抽出工程を行ってから、固液分離工程を行って抽出溶液を得ると共に、ヌマダイコンの植物原料のラフィネートを生成するステップにおける加圧抽出工程および固液分離工程で用いられる方式、操作パラメータ／条件と、は同じである。
【0053】
さらに、繰り返しの、ヌマダイコンの植物原料に加圧抽出工程を行ってから、固液分離工程を行って抽出溶液を得ると共に、ヌマダイコンの植物原料のラフィネートを生成するそれぞれのステップにおけるそれぞれの加圧抽出工程および／またはそれぞれの固液分離工程で用いられる方式、操作パラメータ／条件（例えば、水とヌマダイコンの植物原料との重量比、加圧抽出工程で用いられる圧力、加圧抽出工程で用いられる温度、加圧抽出工程を実施する時間）も、必要に応じて、または操作時における条件に応じて、同じでもまたは異なっていてもよく、特に限定はない。一実施形態において、繰り返しの、ヌマダイコンの植物原料に加圧抽出工程を行ってから、固液分離工程を行って抽出溶液を得ると共に、ヌマダイコンの植物原料のラフィネートを生成するそれぞれのステップにおけるそれぞれの加圧抽出工程および／またはそれぞれの固液分離工程で用いられる方式、操作パラメータ／条件は同じである。
【0054】
さらに別の実施形態では、上述したヌマダイコンの水抽出物の抽出方法は、全ての得られた抽出溶液を合わせて組合せ抽出溶液を得る前述したステップの後に、限定はされないが、組合せ抽出溶液に乾燥工程を行って乾燥抽出物を得るステップをさらに含んでいてよい。また、ここで得られる乾燥抽出物も、上述したヌマダイコンの水抽出物として用いることができる。ここに述べる乾燥工程に特に限定はなく、上述した組合せ抽出溶液を乾燥させて乾燥抽出物にすることができ、かつ組合せ抽出溶液の皮膚炎の症状を治療および／または軽減する効果に悪い影響がないものであればよい。例えば、ここに述べた乾燥工程にはオーブン乾燥、回転乾燥、減圧下での濃縮および乾燥が含まれ得るが、これに限定はされない。一実施形態において、ここに述べた乾燥工程は、減圧下での濃縮および乾燥の工程であってよい。
【0055】
さらに、特定の一実施形態において、上述したヌマダイコンの水抽出物の抽出方法は、全ての得られた抽出溶液を合わせて組合せ抽出溶液を得る前述したステップの後に、第１のカラムクロマトグラフィーを上述した組合せ抽出溶液に行うステップをさらに含んでいてよいが、これに限定はされない。前述した第１のカラムクロマトグラフィーは以下のステップを含んでいてよいが、これに限定はされない。
【0056】
先ず、上述した組合せ抽出溶液を、樹脂を詰めたカラムに装填する。上述したカラムに詰める樹脂の種類に特に限定はなく、組合せ抽出溶液中の有効成分を吸着できるものであればよい。例えば、上述したカラムに詰める樹脂の種類にはスチレン・ジビニルベンゼン系吸着樹脂（例えばHP20、DIAION）等が含まれ得るが、これに限定はされない。
【0057】
次いで、上述した組合せ抽出溶液を、樹脂を詰めたカラムに装填した後に、そのカラムを水で溶出し、カラムから流出する溶出液を捨てる。
【0058】
上述したカラムを溶出するのに用いられる水と上述したカラムに装填される組合せ抽出溶液との体積比にも特に限定はなく、必要に応じて調整することができる。例えば、上述したカラムを溶出するのに用いられる水と上述したカラムに装填される組合せ抽出溶液との体積比は、カラム溶出時の環境（環境の温度、湿度、圧力等）、カラムに装填される組合せ抽出溶液の量、カラム溶出時にカラムから流出する溶出液の状況に応じて調整することができるが、これに限定はされない。一実施形態において、上述したカラムを溶出するのに用いられる水と上述したカラムに装填される組合せ抽出溶液との体積比は約０．５～１０：１、例えば約１～８：１、約１．５～７：１、約２～６：１、約２．５～５：１、約３～４：１、約０．５：１、約１：１、約２：１、約２．５：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１であってよいが、これに限定はされない。特定の一実施形態において、上述したカラムを溶出するのに用いられる水と上述したカラムに装填される組合せ抽出溶液との体積比は１：１であってよい。
【0059】
次いで、カラムを水で溶出し、カラムから流出する溶出液を捨てた後、カラムを第３のエタノール溶媒で溶出し、カラムから流出する溶出液を捨てる。
【0060】
上述したカラムを溶出するのに用いられる第３のエタノール溶媒と上述したカラムに装填される組合せ抽出溶液との体積比にも特に限定はなく、必要に応じて調整することができる。例えば、上述したカラムを溶出するのに用いられる第３のエタノール溶媒と上述したカラムに装填される組合せ抽出溶液との体積比は、カラム溶出時の環境（環境の温度、湿度、圧力等）、カラムに装填される組合せ抽出溶液の量、第３のエタノール溶媒のエタノール濃度、水でカラムを溶出することによりカラムから流出する溶出液の前述した状況および／または第３のエタノール溶媒でカラムを溶出することによりカラムから溶出液が流出するときの状況に応じて調整することができるが、これに限定はされない。一実施形態において、上述したカラムを溶出するのに用いられる第３のエタノール溶媒と上述したカラムに装填される組合せ抽出溶液との体積比は、約０．５～１０：１、例えば約１～８：１、約１．５～７：１、約２～６：１、約２．５～５：１、約３～４：１、約０．５：１、約１：１、約２：１、約２．５：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１であってよいが、これに限定はされない。特定の一実施形態において、上述したカラムを溶出するのに用いられる第３のエタノール溶媒と上述したカラムに装填される組合せ抽出溶液との体積比は１：１であり得る。
【0061】
カラムを溶出するのに用いられる第３のエタノール溶媒のエタノール濃度にも特に限定はなく、必要に応じて調整することができる。例えば、第３のエタノール溶媒のエタノール濃度は、カラム溶出時の環境（環境の温度、湿度、圧力等）、カラムに装填される組合せ抽出溶液の量、上述したカラムを溶出するのに用いられる第３のエタノール溶媒と上述したカラムに装填される組合せ抽出溶液との体積比、水でカラムを溶出することによりカラムから流出する溶出液の前述した状況および／または第３のエタノール溶媒でカラムを溶出することによりカラムから溶出液が流出するときの状況に応じて調整することができるが、これに限定はされない。一実施形態において、上述した第３のエタノール溶媒のエタノール濃度は約３０～１００ｖｏｌ％、例えば約４０～９５ｖｏｌ％、約４５～９０ｖｏｌ％、約５０～８５ｖｏｌ％、約６０～８０ｖｏｌ％、約７０～７５ｖｏｌ％、約３０ｖｏｌ％、約４０ｖｏｌ％、約４５ｖｏｌ％、約５０ｖｏｌ％、約５５ｖｏｌ％、約６０ｖｏｌ％、約６５ｖｏｌ％、約７０ｖｏｌ％、約７５ｖｏｌ％、約８０ｖｏｌ％、約８５ｖｏｌ％、約９０ｖｏｌ％、約９５ｖｏｌ％であってよいが、これに限定はされない。一実施形態において、上述した第３のエタノール溶媒のエタノール濃度は約５０％であり得る。また、一実施形態において、上述した第３のエタノール溶媒はエタノール水溶液であってよいが、同様にこれに限定はされない。
【0062】
次いで、上述した第３のエタノール溶媒でカラムを溶出し、カラムから流出する溶出液を捨てた後、カラムを第４のエタノール溶媒で溶出し、カラムから流出する溶出液を初期精製（preliminary purified）抽出溶液として収集する。ここで得られる初期精製抽出溶液は、上述したヌマダイコンの水抽出物として用いることができる。
【0063】
同様に、上述したカラムを溶出するのに用いられる第４のエタノール溶媒と上述したカラムに装填される組合せ抽出溶液との体積比にも特に限定はなく、必要に応じて調整することができる。例えば、上述したカラムを溶出するのに用いられる第４のエタノール溶媒と上述したカラムに装填される組合せ抽出溶液との体積比は、カラム溶出時の環境（環境の温度、湿度、圧力等）、カラムに装填される組合せ抽出溶液の量、第４のエタノール溶媒のエタノール濃度、第３のエタノール溶媒でカラムを溶出することによりカラムから流出する溶出液の前述した状況および／または第４のエタノール溶媒でカラムを溶出することによりカラムから溶出液が流出するときの状況に応じて調整することができるが、これに限定はされない。一実施形態において、上述したカラムを溶出するのに用いられる第４のエタノール溶媒と上述したカラムに装填される組合せ抽出溶液との体積比は、約０．５～１０：１、例えば約１～８：１、約１．５～７：１、約２～６：１、約２．５～５：１、約３～４：１、約０．５：１、約１：１、約２：１、約２．５：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１０：１であってよいが、これに限定はされない。特定の一実施形態において、上述したカラムを溶出するのに用いられる第４のエタノール溶媒と上述したカラムに装填される組合せ抽出溶液との体積比は１：１であってよい。
【0064】
カラムを溶出するのに用いられる第４のエタノール溶媒のエタノール濃度にも特に限定はなく、必要に応じて調整することができる。例えば、第４のエタノール溶媒のエタノール濃度は、カラム溶出時の環境（環境の温度、湿度、圧力等）、カラムに装填される組合せ抽出溶液の量、上述したカラムを溶出するのに用いられる第４のエタノール溶媒と上述したカラムに装填される組合せ抽出溶液との体積比、第３のエタノール溶媒でカラムを溶出することによりカラムから流出する溶出液の前述した状況および／または第４のエタノール溶媒でカラムを溶出することによりカラムから溶出液が流出するときの状況に応じて調整することができるが、これに限定はされない。一実施形態において、上述した第４のエタノール溶媒のエタノール濃度は約３０～１００ｖｏｌ％、例えば約４０～９５ｖｏｌ％、約４５～９０ｖｏｌ％、約５０～８５ｖｏｌ％、約６０～８０ｖｏｌ％、約７０～７５ｖｏｌ％、約３０ｖｏｌ％、約４０ｖｏｌ％、約４５ｖｏｌ％、約５０ｖｏｌ％、約５５ｖｏｌ％、約６０ｖｏｌ％、約６５ｖｏｌ％、約７０ｖｏｌ％、約７５ｖｏｌ％、約８０ｖｏｌ％、約８５ｖｏｌ％、約９０ｖｏｌ％、約９５ｖｏｌ％であってよいが、これに限定はされない。一実施形態において、上述した第４のエタノール溶媒のエタノール濃度は約７５％であってよい。また、一実施形態において、上述した第４のエタノール溶媒はエタノール水溶液であってよいが、これに限定はされない。
【0065】
さらに別の実施形態では、上述したヌマダイコンの水抽出物の抽出方法は、カラムを第４のエタノール溶媒で溶出し、カラムから流出する溶出液を初期精製抽出溶液として収集した後、上述した初期精製抽出溶液に第２のカラムクロマトグラフィーを行い、かつ細胞のＩＬ－４分泌を抑制する効果を有する少なくとも１つの画分を収集し、または収集して合わせ、活性画分とするステップをさらに含んでいてよいが、これに限定はされない。さらに、ここで得られる活性画分は、上述したヌマダイコンの水抽出物として用いることができる。
【0066】
上述した第２のカラムクロマトグラフィーにおいて、移動相として用いることのできる溶媒に特に限定はなく、細胞のＩＬ－４分泌を抑制する効果を有し、かつ人体または動物体に悪い影響がない少なくとも１つの画分を得ることのできるものであればよい。移動相として用いることのできる溶媒には、限定はされないが、水、アルコール、エステル、アルカン等、または任意の比率でのその任意の組み合わせが含まれ得る。上述したアルコールの例には、限定はされないが、メタノールまたはエタノールが含まれ得る。上述したエステルの例には酢酸エチルが含まれ得るが、これに限定はされない。上述したアルカンの例には、限定はされないが、ｎ－ヘキサン、シクロヘキサンまたはヘプタンが含まれ得る。一実施形態では、上述した第２のカラムクロマトグラフィーにおいて、メタノール溶媒が移動相として用いられてよい。別の実施形態では、上述した第２のカラムクロマトグラフィーにおいて、ｎ－ヘキサン／酢酸エチルの混合溶媒が移動相として用いられてよい。上述したｎ－ヘキサン／酢酸エチルの混合溶媒のｎ－ヘキサンと酢酸エチルとの体積比にも特に限定はなく、細胞のＩＬ－４分泌を抑制する効果を有し、かつ人体または動物体に悪い影響がない少なくとも１つの画分を得ることのできるものであればよい。例えば、上述したｎ－ヘキサン／酢酸エチルの混合溶媒のｎ－ヘキサンと酢酸エチルとの体積比は約０．１～１：１、例えば０．２～０．８：１、０．３～０．７：１、０．４～０．５：１、０．１：１、０．２：１、０．２５：１、０．３：１、０．４：１、０．５：１、０．６：１、０．７：１、０．８：１、０．９：１、１：１であってよいが、これに限定はされない。特定の一実施形態において、上述したｎ－ヘキサン／酢酸エチルの混合溶媒のｎ－ヘキサンと酢酸エチルとの体積比は約１：１であってよい。
【0067】
上述した第２のカラムクロマトグラフィーの種類に特に限定はない。一実施形態において、上述した第２のカラムクロマトグラフィーはシリカゲルカラムクロマトグラフィーであってよい。別の実施形態において、上述した第２のカラムクロマトグラフィーは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）であってよい。
【0068】
さらに別の特定の実施形態において、上述したヌマダイコンの水抽出物の抽出方法は、第２のカラムクロマトグラフィーを初期精製抽出溶液に行い、細胞のＩＬ－４分泌を抑制する効果を有する少なくとも１つの画分を収集し、または収集して合わせ、活性画分とするステップの後に、上述した活性画分を濃縮して濃縮活性画分を得るステップをさらに含んでいてよいが、同様にこれに限定はされない。また、ここで得られる濃縮活性画分も、上述したヌマダイコンの水抽出物として用いることができる。
【0069】
加えて、この特定の実施形態において、上述したヌマダイコンの水抽出物の抽出方法は、上述した活性画分を濃縮して濃縮活性画分を得るステップの後に、以下のステップをさらに含んでいてよいが、これに限定はされない。
【0070】
先ず、上述した濃縮活性画分に第５のエタノール溶媒で加熱溶解工程を行って、活性溶液を形成する。
【0071】
第５のエタノール溶媒と上記濃縮活性画分との重量比にも特に限定はなく、必要に応じて調整することができる。例えば、第５のエタノール溶媒と上記濃縮活性画分との重量比は、加熱溶解工程実施時の外部環境（外部環境の温度、湿度、圧力等）、および／または上述した濃縮活性画分の状態（含水量、重量等）等に応じて調整することができるが、これに限定はされない。一実施形態において、第５のエタノール溶媒と上記濃縮活性画分との重量比は約１～１０：１、例えば約１．５～８：１、約２～５：１、約２．５～４．５：１、約１：１、約１．５：１、約２：１、約２．５：１、約３：１、約４：１、約５：１、約６：１、約７：１、約８：１、約９：１、約１：１０であってよいが、これに限定はされない。特定の一実施形態において、第５のエタノール溶媒と上記活性溶液との重量比は約４：１であってよい。
【0072】
上述した加熱溶解工程に用いられる温度に特に限定はなく、室温より高く、かつ上述した濃縮活性画分を溶解させることができるものであればよく、必要に応じて調整することができる。例えば、上述した加熱溶解工程に用いられる温度は、加熱溶解工程実施時の外部環境（外部環境の温度、湿度、圧力等）、濃縮活性画分の状態（含水量、重量等）、第５のエタノール溶媒と上記濃縮活性画分との重量比および／または実施される加熱時間等に応じて調整することができるが、これに限定はされない。一実施形態において、加熱溶解工程に用いられる温度は、約４０～１００℃、例えば約４５～９５℃、約５０～９０℃、約５５～８５℃、約６０～８０℃、約６５～７５℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃、約８０℃、約８５℃、約９０℃、約９５℃、約１００℃であってよいが、これに限定はされない。特定の一実施形態において、加熱溶解工程に用いられる温度は約６０℃であってよい。
【0073】
上述した加熱溶解工程を実施する時間に特に限定はなく、上述した濃縮活性画分を溶解させることができるものであればよく、必要に応じて調整することができる。例えば、上述した加熱溶解工程を実施する時間は、加熱溶解工程実施時の外部環境（外部環境の温度、湿度、圧力等）、濃縮活性画分の状態（含水量、重量等）、第５のエタノール溶媒と上記濃縮活性画分との重量比および／または用いられる加熱温度等に応じて調整することができるが、これに限定はされない。一実施形態において、上述した加熱溶解工程を実施する時間は、約５～６０分、例えば約１０～５５分、約１５～５０分、約２０～４５分、約２５～４０分、約３０～３５分、約５分、約１０分、約１５分、約２０分、約２５分、約３０分、約３５分、約４０分、約４５分、約５０分、約５５分、約６０分であってよいが、これに限定はされない。特定の一実施形態において、上述した加熱溶解工程を実施する時間は６０分であってよい。
【0074】
次いで、上述した濃縮活性画分に第５のエタノール溶媒で加熱溶解工程を行って、活性溶液を形成した後に、その活性溶液を静置してその中に結晶を形成させる。
【0075】
上述した活性溶液を静置する時間にも特に限定はなく、上述した活性溶液に結晶を形成させることができるものであればよく、必要に応じて調整することができる。例えば、上述した活性溶液を静置する時間は、加熱溶解工程実施時の外部環境（外部環境の温度、湿度、圧力等）、活性溶液の状態（重量等）に応じて調整することができるが、これに限定はされない。一実施形態において、上述した活性溶液を静置する時間は、約６～４８時間、約９～４５時間、約１２～４２時間、約１５～３９時間、約１８～３６時間、約２１～３３時間、約２４～３０時間、約６時間、約９時間、約１２時間、約１５時間、約１８時間、約２１時間、約２４時間、約２７時間、約３０時間、約３３時間、約３６時間、約３９時間、約４２時間、約４５時間、約４８時間であってよいが、これに限定はされない。特定の一実施形態において、上述した活性溶液を静置する時間は約２４時間であってよい。
【0076】
上述した結晶を形成した後、上述した結晶を収集する。ここで収集した結晶は、上述したヌマダイコンの水抽出物として用いることができる。
【0077】
加えて、収集した結晶に乾燥工程を行うことができる。
【0078】
上述したいずれかの抽出方法により得られる本開示のヌマダイコン抽出物は、細胞のＩＬ－４分泌を抑制する効果を有し、かつ皮膚炎の症状を少なくとも治療および／または軽減することができる。
【0079】
さらに、本開示は、皮膚炎を治療するための薬剤の製造におけるヌマダイコン抽出物の用途も提供する。
【0080】
本開示の皮膚炎を治療するための薬剤の製造におけるヌマダイコン抽出物の用途において、ヌマダイコン抽出物に特に限定はなく、皮膚炎の症状を治療および／または軽減する効果を有するものであればよい。例えば、上述した本開示の任意のヌマダイコン抽出物を、本開示の皮膚炎を治療するための薬剤の製造におけるヌマダイコン抽出物の用途におけるヌマダイコン抽出物として用いることができる。
【0081】
加えて、本開示の皮膚炎を治療するための薬剤の製造におけるヌマダイコン抽出物の用途において、皮膚炎を治療するための薬剤は、薬学的に許容される担体または塩をさらに含んでいてよいが、これに限定はされない。
【0082】
本開示は、皮膚炎を治療するための医薬組成物も提供する。
【0083】
本開示の上記皮膚炎を治療するための医薬組成物は、限定はされないが、ヌマダイコン抽出物を含んでいてよい。本開示の皮膚炎を治療するための医薬組成物中のヌマダイコン抽出物にも特に限定はなく、皮膚炎の症状を治療および／または軽減する効果を有するものであればよい。例えば、本開示の上記皮膚炎を治療するための医薬組成物中のヌマダイコン抽出物は、上述した本開示のヌマダイコン抽出物のいずれかであってよい。
【0084】
加えて、本開示の皮膚炎を治療するための医薬組成物は、薬学的に許容される担体または塩をさらに含んでいてよいが、これに限定はされない。
【0085】
上述した薬学的に許容される担体には、限定はされないが、溶剤、分散媒体、コーティング、抗菌および抗真菌剤、または等張および吸収遅延剤等、医薬投与に適したものが含まれ得る。医薬組成物は、従来の方法を利用して、異なる投与経路に合う剤型（dosage forms）に製剤することができる。
【0086】
さらに、上述した薬学的に許容される塩には、限定はされないが、無機カチオンを含む塩、例えばナトリウム塩、カリウム塩またはアミン塩のようなアルカリ金属塩、例えばマグネシウム塩またはカルシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、例えば亜鉛塩、アルミニウム塩、またはジルコニウム塩のような二価または四価カチオンを含む塩が含まれ得る。加えて、薬学的に許容される塩は、ジシクロヘキシルアミン塩、メチル－Ｄ－グルカミンのような有機塩、およびアルギニン、リジン、ヒスチジンまたはグルタミンのようなアミノ酸塩であってもよい。
【0087】
加えて、本開示のヌマダイコン抽出物、本開示の皮膚炎を治療するための医薬組成物、および／または本開示の皮膚炎を治療するための薬剤の製造におけるヌマダイコン抽出物の用途において作製される薬剤は、それを必要とする対象被験体に投与することができるが、これに限定はされない。
【0088】
本開示のヌマダイコン抽出物、本開示の皮膚炎を治療するための医薬組成物、および／または本開示の皮膚炎を治療するための薬剤の製造におけるヌマダイコン抽出物の用途において作製される薬剤は、非経口、経口、吸入噴霧（inhalation spray）により、または埋込型リザーバー（implanted reservoir）を介して投与することができるが、これに限定はされない。非経口の方法には、患部への塗抹、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、関節滑液嚢内、胸骨内、くも膜下腔内および病巣内注射、ならびに注入技術等が含まれ得る。
【0089】
塗抹の局部使用の形式には、軟膏、乳剤、液剤、ゲル、ムース等が含まれ得るが、これに限定はされない。
【0090】
また、本開示のヌマダイコン抽出物、本開示の皮膚炎を治療するための医薬組成物、および／または本開示の皮膚炎を治療するための薬剤の製造におけるヌマダイコン抽出物の用途において作製される薬剤を投与することが必要な被験体には、限定はされないが、脊椎動物が含まれ得る。さらに、上述した脊椎動物には、魚類、両生類、爬虫類、鳥類または哺乳類が含まれ得るが、これに限定はされない。哺乳類の例には、限定はされないが、ヒト、オラウータン、サル、ウマ、ロバ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラットおよびマウスが含まれ得る。一実施形態において、上述した被験体はヒトであり得る。
【0091】
加えて、本開示は、皮膚炎を治療するための方法も提供し得る。本開示の皮膚炎を治療するための方法は、限定はされないが、それを必要とする被験者に、有効量のヌマダイコン抽出物を投与する、または有効量の皮膚炎を治療するための医薬組成物を投与するステップを含んでいてよい。
【0092】
上記皮膚炎の例には、限定はされないが、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、またはその任意の組み合わせが含まれ得る。一実施形態において、上記皮膚炎はアトピー性皮膚炎であってよい。別の実施形態において、上記皮膚炎は接触性皮膚炎であってよい。
【0093】
さらに、本開示の皮膚炎を治療するための方法に用いられるヌマダイコン抽出物 は、上述した本開示の任意のヌマダイコン抽出物である。同様に、本開示の皮膚炎を治療するための方法中で用いられる皮膚炎を治療するための医薬組成物は、上述した本開示の任意の皮膚炎を治療するための医薬組成物であってよい。
【0094】
また、本開示の皮膚炎を治療するための方法において、本開示のヌマダイコン抽出物または本開示の皮膚炎を治療するための医薬組成物を必要とする被験体には、限定はされないが、脊椎動物が含まれ得る。さらに、上述した脊椎動物には、魚類、両生類、爬虫類、鳥類または哺乳類が含まれ得るが、これに限定はされない。哺乳類の例には、限定はされないが、ヒト、オラウータン、サル、ウマ、ロバ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ラットおよびマウスが含まれ得る。一実施形態において、被験体はヒトであり得る。
【0095】
実施例
【0096】
Ａ．方法
【0097】
１．ＥＬ４細胞によるＩＬ－４分泌抑制活性の評価
【0098】
ＥＬ４細胞を９６－ウェル培養プレート（１×１０５細胞／ウェル）中に播種した。次いで、適度な濃度の被試験サンプルをその細胞に加え（１０μＬ／ウェル）、よく混合した。その後、その９６－ウェル培養プレートを、３７℃、５％ＣＯ２の細胞培養器中で２時間培養した。次いで、刺激物Ａ２３１８７およびホルボール１２－ミリステート－１３－アセテート（phorbol 12-myristate -13-acetate, ＰＭＡ）をその９６－ウェル培養プレート中の細胞に加えた。よく混合した後、その９６－ウェル培養プレートを細胞培養器中で１８時間培養した。
【0099】
その後、上述した９６－ウェル培養プレートを１，２００ｒｐｍで５分遠心分離し、上清を新たな９６－ウェル培養プレートに収集した。
【0100】
元の９６－ウェル培養プレート中に残っている細胞にＭＴＴを加えてから、その元の９６－ウェル培養プレートを３７℃、５％ＣＯ２の細胞培養器中に１時間置いた。その後、ＤＭＳＯをその細胞に加え、クリスタルバイオレットを溶出させた。均一に混合した後、各ウェルの５７０ｎｍにおける吸光度を測定し、細胞生存率を算出した。そして、新たな９６－ウェルプレート中にある上述の上清を希釈し、そのＩＬ－４含量をＭｏｕｓｅ ＩＬ－４ ＥＬＩＳＡキット（R&D systems, Mouse IL-4 DuoSet ELISA, Catalog ＃: DY404）で検出した。
【0101】
全ての実験結果について、Ａ２３１８７およびＰＭＡのみを加えた群を１００％として用いて、ＩＬ－４分泌の抑制率を算出し、さらに半数阻害濃度（ＩＣ５０）および半数細胞毒性濃度（ＣＣ５０）を算出した。
【0102】
２． ２，４－ジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）誘発皮膚炎の動物モデルの実験
【0103】
２．１ 実験動物
【0104】
６週齢のＢＡＬＢ／ｃ雄マウスを国家実験動物センター（National Laboratory Animal Center）（台湾、台北市）より購入した。工業技術研究院の動物実験ステーション（Animal Experiment Station）の一般マウス実験エリア（general mouse experiment area）に入った後、マウスに標識を付け、ケージ分けし、体重を測定し、一週間検疫を行った。
【0105】
検疫期間中に動物を環境に慣れさせ、その活動力を観察した。動物の体重が正常に増加していたら、その動物を給餌エリアに移し、実施される実験に備えた。飼育エリアでは、照明を１２時間の明暗サイクル（午前７：３０～午後７：３０が明サイクル）に設定し、室温は２３±２℃に設定した。動物に自由に摂食および摂水させた。飼育条件は国家実験動物基準（national laboratory animal standards）に従った。この系統の実験動物については豊富な基礎参考資料およびデータがあり、それらはアトピー性皮膚炎および／または接触性皮膚炎の機能性評価試験に用いるのに適している。実験方法は、工業技術研究院の実験動物ケアおよび使用委員会（Institutional Animal Care and Use Committee，ＩＡＣＵＣ）による審査を経て承認を受けたものである。
【0106】
２．２ ２，４－ジニトロクロロベンゼンでマウスのアトピー性皮膚炎を誘発する方法
【0107】
実験の前に電気シェーバーでＢＡＬＢ／ｃ雄マウスの背部の毛を剃った。実験期間の１日目（Ｄａｙ１）に、１％ ２，４－ジニトロクロロベンゼン１００μＬ（アセトンとオリーブオイルとを体積比４：１で混合することにより作った溶液中で調製）で、マウスの背中の面積約２×３ｃｍ２の皮膚に感作／刺激を行った。その後、０．５％ ２，４－ジニトロクロロベンゼン１００μＬおよび２０μＬ（アセトンとオリーブオイルとを体積比４：１で混合することにより作った溶液中で調製）でそれぞれマウスの背部皮膚および耳の皮膚に感作／刺激を週に２回の頻度で行い、３週間続け（Ｄａｙ４～Ｄａｙ２８）、マウスにアトピー性皮膚炎の症状を発症させた。
【0108】
感作処理していない群（何らの処理もしていない（Ｎａiｖｅ））を除く、他の群のマウスに、試験サンプルまたは対照薬剤を実験期間の１０日目から３週間、毎日経口投与した（１０日目（Ｄａｙ１０））から３０日目（Ｄａｙ３０）まで）。２，４－ジニトロクロロベンゼンで誘発したアトピー性皮膚炎の動物モデル実験において、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）（Sandimmun, Capsules）を対照薬剤として用い、３０ｍｇ／ｋｇを毎日経口投与した。
【0109】
実験期間中、定期的に写真を撮って、マウス皮膚の腫脹（swelling）および損傷（皮膚病変）の状況を記録した。実験３１日目に、動物を過剰量のＣＯ２で犠牲死させた。マウスの背中および耳の皮膚サンプルを収集し、ヘマトキシリンおよびエオジン（Ｈ＆Ｅ）染色を行って、マウスの表皮の厚さおよび総合組織学的スコアを分析した。
【0110】
２．３ 皮膚組織病理分析
【0111】
犠牲死させたときに収集したマウスの背部皮膚検体を小さな紙片に載せ、平らにした。耳皮膚検体と共に、中性ホルマリン溶液中でそれらの組織形状および構造を固定した。次いで、固定された検体を脱水し、パラフィンで包埋し、完成したパラフィン検体をミクロトームでカットして３～４μｍのパラフィン切片にしてから、ヘマトキシリン・エオジンで染色した。そのヘマトキシリン・エオジン染色切片について、文献Shackelford C, Long G, Wolf J, Okerberg C, Herbert R. Qualitative and quantitative analysis of nonneoplastic lesions in toxicology studies. Toxicologic pathology. 2002;30(1）:93-6. 中に挙げられている方法に基づき、病理専門医が表皮の厚さを測定し、かつ皮膚組織病理学的重症度を評価した。
【0112】
組織病理学的グレード分類基準は次のとおりである。グレード０＝存在せず（not present）、グレード１＝極微(minimal)（＜１％）、グレード２＝軽微(slight)（１～２５％）、グレード３＝中度(moderate)（２６～５０％）、グレード４＝中重度(moderately severe)（５１～７５％）、グレード５＝重度/高度(severe/high)（７６～１００％）。
【0113】
２．４ データ分析
【0114】
本実験におけるデータは平均値の標準誤差（ＳＥＭ）＝平均値±標準誤差で表す。全ての群を主にビヒクルを投与した群と比較した。データの性質に応じ、１元配置分散分析（one-way ANOVA）または２元配置分散分析(two-way ANOVA)をダネットの多重比較検定、スチューデントのt検定またはマンホイットニー検定と組み合わせて用い、差があるか否かを計算した。ｐ値が０．０５未満であると、それは群間で統計的に有意な差があることを表す。
【0115】
３．ＮＣ／Ｎｇａマウスのアトピー性皮膚炎モデルの実験
【0116】
３．１ 実験動物
６週齢 ＮＣ／ＮｇａＴｎｄＣｒｌｊ雄マウスをCharles River Japan（日本、東京）より購入した。工業技術研究院の動物実験ステーション（Animal Experiment Station）の一般マウス実験エリア（general mouse experiment area）に入った後、マウスに標識を付け、ケージ分けし、体重を測定し、一週間検疫を行った。
６週齢 ＮＣ／ＮｇａＴｎｄＣｒｌｊ雄マウスをCharles River Japan（日本、東京）より購入した。工業技術研究院の動物実験ステーション（Animal Experiment Station）の一般マウス実験エリア（general mouse experiment area）に入った後、マウスに標識を付け、ケージ分けし、体重を測定し、一週間検疫を行った。
【0117】
検疫期間中に動物を環境に慣れさせ、その活動力を観察した。動物の体重が正常に増加していたら、その動物を給餌エリアに移し、実施される実験に備えた。飼育エリアでは、照明を１２時間の明暗サイクル（午前７：３０～午後７：３０が明サイクル）に設定し、室温は２３±２℃に設定した。動物に自由に摂食および摂水させた。飼育条件は国家実験動物基準（national laboratory animal standards）に従った。この系統の実験動物については豊富な基礎参考資料およびデータがあり、それらはアトピー性皮膚炎の機能性評価試験に用いるのに適している。実験方法は、工業技術研究院の実験動物ケアおよび使用委員会（Institutional Animal Care and Use Committee，ＩＡＣＵＣ）による審査を経て承認を受けたものである。
【0118】
３．２．ＮＣ／Ｎｇａマウスのアトピー性皮膚炎を誘発する方法
【0119】
実験開始時、およそ１０～１２週齢となったＮＣ／Ｎｇａマウスについて、体重に応じてＳ型のグループ分けを行い、各群の平均体重および体重分布のトレンドを似通ったものとした。
【0120】
実験開始の１日前に実験動物の背部の毛を剃った。毛を剃った面積は約４×２ｃｍ２であった。実験初日（Ｄａｙ０）に、４％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）１５０μＬおよび２０μＬを、皮膚への塗抹（skin smearing）によりマウスの背部皮膚および耳の皮膚にそれぞれ投与した。３時間後、コナヒョウヒダニ虫体（Ｄｆｂ）軟膏（Biostir AD）（Biostir（日本、大阪）より購入）１００ｍｇおよび１０ｍｇを同じ方式で投与して、マウスの背部皮膚および耳の皮膚に感作／刺激を行った。感作／刺激の頻度は、連続する６週間で、週に２回とした。
【0121】
試験サンプルまたは溶媒を実験計画に基づいて投与し、投与量は１０ｍＬ／ｋｇとした。Ｆ４ＡＢを３０、１００、２００または４００ｍｇ／ｋｇで毎日経口投与した。ＪＡＫ阻害薬であるウパダシチニブ（MedChemExpress（Monmouth Junction, NJ, USA）より購入）を対照薬剤として用い、１、３または１０ｍｇ／ｋｇで毎日経口投与した。Ｄａｙ０の感作／刺激後に動物に試験薬剤を与え、Ｄａｙ０、７日目（Ｄａｙ７）、１４日目（Ｄａｙ１４）、２１日目（Ｄａｙ２１），２８日目（Ｄａｙ２８）、３５日目（Ｄａｙ３５）および４２日目（Ｄａｙ４２）に背部皮膚の臨床観察採点を行った。実験４２日目（Ｄａｙ４２）に、動物を犠牲死させ、血液を収集し、ＩｇＥ分析を行うと共に、背部皮膚組織を取って病理分析を行った。
【0122】
３．３ 皮膚臨床症状の観察
【0123】
コナヒョウヒダニ虫体により誘発したＮＣ／Ｎｇａマウスのアトピー性皮膚炎の皮膚臨床観察採点は、背部皮膚に生じる紅斑／出血、傷跡／乾燥、水腫、表皮剥脱／びらん等の皮膚損傷症状を対象とし、観察、評価および記録をそれぞれ行った。上記臨床症状のスケーリング基準は次のとおりである。スケール０は症状無し(no symptoms)、スケール１は軽微(mild)、スケール２は中度(moderate)、スケール３は重度（severe）。皮膚炎の臨床重症度の総合スコア（皮膚病変（skin lesion）のスコア）は、上述した臨床症状採点項目のスコアの合計である。
【0124】
３．４ 皮膚組織病理分析
【0125】
犠牲死させたときに収集したマウスの背部皮膚検体を小さな紙片に載せ、平らにした。耳皮膚検体と共に、中性ホルマリン溶液中でそれらの組織形状および構造を固定した。次いで、固定された検体を脱水し、パラフィンで包埋し、完成したパラフィン検体をミクロトームでカットして３～４μｍのパラフィン切片にしてから、ヘマトキシリン・エオジンで染色した。そのヘマトキシリン・エオジン染色切片について、文献Shackelford C, Long G, Wolf J, Okerberg C, Herbert R. Qualitative and quantitative analysis of nonneoplastic lesions in toxicology studies. Toxicologic pathology. 2002;30(1）:93-6. 中に挙げられている方法に基づき、病理専門医が表皮の厚さを測定し、かつ皮膚組織病理学的重症度、炎症、壊死、増生、過角化等の項目を評価した。
【0126】
組織病理学的グレード分類基準は次のとおりである。グレード０＝存在せず（not present）、グレード１＝極微(minimal)（＜１％）、グレード２＝軽微(slight)（１～２５％）、グレード３＝中度(moderate)（２６～５０％）、グレード４＝中重度(moderately severe)（５１～７５％）、グレード５＝重度/高度(severe/high)（７６～１００％）。
【0127】
３．５ データ分析
【0128】
本実験におけるデータは平均値の標準誤差（ＳＥＭ）＝平均値±標準誤差で表す。全ての群を主にビヒクルを投与した群と比較した。データの性質に応じ、１元配置分散分析（one-way ANOVA）または２元配置分散分析(two-way ANOVA)をダネットの多重比較検定、スチューデントのt検定またはマンホイットニー検定と組み合わせて用い、差があるか否かを計算した。ｐ値が０．０５未満であると、それは群間で統計的に有意な差があることを表す。
【0129】
Ｂ．ヌマダイコン抽出物の調製
【0130】
１．ヌマダイコンのエタノール抽出物の調製
【0131】
１．１ ヌマダイコン抽出物０８０５の調製
【0132】
先ず、乾燥したヌマダイコンの葉を粉砕してヌマダイコンの植物原料を得た。
【0133】
次に、上述したヌマダイコンの植物原料を、その８倍の重量の９５％エタノールを用い、６０℃で８時間抽出してから、濾過し、１回目の抽出の抽出溶液およびヌマダイコンの植物原料のラフィネートを得た。
【0134】
その後、前述したヌマダイコンの植物原料のラフィネートを、その８倍の重量の９５％エタノールを用い、再び６０℃で８時間抽出してから、濾過し、２回目の抽出の抽出溶液およびヌマダイコンの植物原料のラフィネートを得た。
【0135】
２回の抽出の抽出溶液を合わせ、組合せ抽出溶液を得た。最後に、その組合せ抽出溶液をロータリーエバポレーター中で減圧下、濃縮し、溶媒を除去して抽出物を得た。それをヌマダイコン抽出物０８０５と命名した。
【0136】
１．２ ヌマダイコン抽出物０８０５－Ｆの調製
【0137】
上述で得られたヌマダイコン抽出物０８０５ ５０ｇを、その８倍の重量の９５％エタノールで５０℃に加熱してそれを溶解させ、混合溶液を得た。
【0138】
５倍の重量のシリカゲル（２５０ｇ）をその混合溶液に加えて固定化を行い、ｎ－ヘキサン／酢酸エチルの混合溶媒を移動相として用い、カラムクロマトグラフィー（２ｋｇのシリカゲルが充填された内径１０ｃｍのガラスカラム、）を行った。
【0139】
カラムクロマトグラフィー中に６個の画分を得ると共に、順次０８０５－ｆ１、０８０５－ｆ２、０８０５－ｆ３、０８０５－ｆ４、０８０５－ｆ５および０８０５－ｆ６と命名した。
【0140】
その後、上の「Ａ．方法」の「１．ＥＬ４細胞によるＩＬ－４分泌抑制活性の評価」に記載されている方法に基づき、ＥＬ４細胞によりヌマダイコン抽出物０８０５およびその６個の画分のＩＬ－４分泌抑制活性を評価した。その結果は表１に示されている。
【0141】
【表1】
【0142】
表１は、ヌマダイコン抽出物０８０５がＩＬ－４分泌を抑制できる（ＩＣ５０＝５５．４μｇ／ｍＬ）ことを示している。上記６個の画分のうち、０８０５－ｆ３および０８０５－ｆ４はより優れたＩＬ－４分泌抑制活性を有しており、それぞれＩＣ５０が４．６±１．２μｇ／ｍＬおよび４．４±０．５μｇ／ｍＬであった。よって、画分０８０５－ｆ３および画分０８０５－ｆ４を合わせ、組合せ画分を得た。
【0143】
その後、その組合せ画分をロータリーエバポレーターにより減圧下で濃縮し、溶媒を除去し、生成物を得た。それをヌマダイコン抽出物０８０５－Ｆと命名した。
【0144】
２．ヌマダイコンの水抽出物の調製
【0145】
２．１ ヌマダイコン抽出物Ｗの調製
【0146】
先ず、ヌマダイコンの葉を粉砕してからフィルターバッグに入れて、ヌマダイコンの植物原料を得た。
【0147】
次に、上述したヌマダイコンの植物原料を加圧反応槽中で、その重量の３０倍の純水で抽出して（抽出条件：１０２．９７ｋＰａ、１２０℃、２０分）抽出物を得、その抽出物を加圧反応槽から取り出し、同じ条件で上述したヌマダイコンの植物原料を繰り返し抽出した。トータルで３回の抽出を行った。３回の抽出より得られた抽出物を合わせ、組合せ抽出物を得ると共に、ヌマダイコン抽出物Ｗと命名した。
【0148】
２．２ヌマダイコン抽出物Ｆ４ＡＢの調製
【0149】
カラムクロマトグラフィーＩ
【0150】
上記ヌマダイコン抽出物Ｗをカラム（直径１２インチ、ＨＰ２０樹脂１００Ｌ含有）にロードした。その後、そのカラムを純水（２００Ｌ）で溶出し、溶出液を捨ててから、そのカラムを５０％エタノール水溶液（２００Ｌ）で溶出し、溶出液を捨てた。次いで、そのカラムを７５％エタノール水溶液（２００Ｌ）で溶出し、溶出液を収集して初期精製抽出溶液とした。
【0151】
その初期精製抽出物をさらに濃縮し、濃縮初期精製抽出溶液を得た。
【0152】
カラムクロマトグラフィーＩＩ
【0153】
濃縮初期精製抽出溶液を、その固形分重量の５倍の重量のシリカゲルで固定した後、シリカゲルカラム（濃縮初期精製抽出溶液の固形分重量の２０倍の重量のシリカゲルが充填された直径１０ｃｍのカラム）を用い、ｎ－ヘキサン／酢酸エチル（１：１）を移動相とし、カラムクロマトグラフィーを行った。画分をセクションごとに収集した。
【0154】
上の「Ａ．方法」の「１．ＥＬ４細胞によるＩＬ－４分泌抑制活性の評価」に記載されている方法に基づき、カラムクロマトグラフィーで得られた全ての画分のＩＬ－４分泌抑制活性をＥＬ４細胞により評価し、ＩＬ－４分泌抑制活性を有する画分を合わせて活性画分を得た。
【0155】
上記活性画分をさらに濃縮して濃縮活性画分を得た。
【0156】
上述した濃縮活性画分を、その４倍の重量の９５％エタノール水溶液を用い、６０℃で加熱溶解し、活性溶液を形成した。
【0157】
上記活性溶液を２４時間静置してその中に結晶を形成させた。最後に、その結晶を収集して乾燥させた。得られた乾燥結晶をヌマダイコン抽出物Ｆ４ＡＢと命名した。
【0158】
Ｃ．ヌマダイコン抽出物０８０５の動物実験
【0159】
上の「Ａ．方法」の「２．２，４－ジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）誘発皮膚炎の動物モデルの実験」に記載されている方法に基づき、ヌマダイコン抽出物０８０５の動物実験を行った。
【0160】
マウスを２，４－ジニトロクロロベンゼンで感作した後、実験の１０日目から連続する３週間（１０日目（Ｄａｙ１０）から３０日目（Ｄａｙ３０）まで）、ヌマダイコン抽出物０８０５ ３００ｍｇ／ｋｇを毎日経口投与した。
【0161】
【0162】
図１は、感作処理していない群（Ｎａiｖｅ）、ビヒクルを投与した群、およびヌマダイコン抽出物０８０５を投与した群におけるマウスの背部皮膚組織切片のヘマトキシリン・エオシン染色結果を示している。矢印で印をつけたところは増生を示し、＊で印をつけたところは炎症を示す。
【0163】
図２は、感作処理していない群（Ｎａiｖｅ）、ビヒクルを投与した群、およびヌマダイコン抽出物０８０５を投与した群におけるマウスの背部皮膚の表皮の厚さを示しており、図３は、感作処理していない群（Ｎａiｖｅ）、ビヒクルを投与した群、およびヌマダイコン抽出物０８０５を投与した群におけるマウスの背部皮膚の総合組織学的スコアを示している。データは平均値±標準誤差（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ）（ｎ＝５）で示されている。スチューデントのｔ検定（表皮厚さの測定）またはマンホイットニー検定（組織病理採点）を用い、統計分析を行った。ビヒクルを投与した群との比較で、ｐ＜０．０５は統計的に有意な差があることを表し、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１である。
【0164】
【0165】
Ｄ．ヌマダイコン抽出物０８０５－Ｆの動物実験
【0166】
上の「Ａ．方法」の「２．２，４－ジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）誘発皮膚炎の動物モデルの実験」に記載されている方法に基づき、ヌマダイコン抽出物０８０５－Ｆについて動物実験を行った。
【0167】
マウスを２，４－ジニトロクロロベンゼンで感作した後、実験の１０日目から連続する３週間（１０日目（Ｄａｙ１０）から３０日目（Ｄａｙ３０）まで）、ヌマダイコン抽出物０８０５－Ｆ ３００ｍｇ／ｋｇ、または対照薬剤であるシクロスポリンＡ ３０ｍｇ／ｋｇを毎日経口投与した。
【0168】
実験期間中、マウスの耳の写真を撮って、マウスの耳の皮膚の腫脹（swelling）および損傷（皮膚病変）の状況を記録すると共に、マウスの耳の厚さを測定した。実験３０日目のマウスの耳の写真が図４に示されている。
【0169】
また、実験３０日目のマウスの耳の厚さの測定結果が図５に示されている。データは平均値±標準誤差（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ）（ｎ＝５）で示されている。図５中、それぞれの群の耳の厚さと、ビヒクルを投与した群の耳の厚さとを比較するため、２元配置分散分析にダネットの多重比較検定を合わせて統計分析を行った。ｐ＜０．０５は統計的に有意な差があることを表し、＊＊＊ｐ＜０．００１である。図５中、ヌマダイコン抽出物０８０５－Ｆ ３００ｍｇ／ｋｇを投与した群の耳の厚さと、シクロスポリンＡを投与した群の耳の厚さとを比較するため、統計分析をスチューデントのｔ検定により行った。ｐ＜０．０５は統計的に有意な差があることを表し、＃＃＃ｐ＜０．００１である。
【0170】
実験３１日目に、動物を過剰量のＣＯ２で犠牲死させてから、マウスの耳の皮膚組織切片染色および病理切片分析、ならびに耳の皮膚の総合病理的重症度採点を行った。実験結果が図６および７に示されている。
【0171】
図６は、感作処理していない群（Ｎａｉｖｅ）、ビヒクルを投与した群、ヌマダイコン抽出物０８０５－Ｆを投与した群、およびシクロスポリンＡを投与した群におけるマウスの耳皮膚組織切片のヘマトキシリン・エオシン染色結果を示している。矢印で印をつけたところは増生を示し、＊で印をつけたところは炎症を示す。
【0172】
図７は、未感作処理群、ビヒクル投与群、ヌマダイコン抽出物０８０５－Ｆ投与群、およびシクロスポリンＡ投与群におけるマウスの耳の皮膚の総合組織学的スコアを示している。データは平均値±標準誤差（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ）（ｎ＝５）で示されている。それぞれの群の総合組織学的スコアと、ビヒクルを投与した群の総合組織学的スコアとを比較するため、統計分析をマンホイットニー検定により行った。ｐ＜０．０５は統計的に有意な差があることを表し、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１である。ヌマダイコン抽出物０８０５－Ｆ ３００ｍｇ／ｋｇを投与した群の総合組織学的スコアと、シクロスポリンＡを投与した群の総合組織学的スコアとを比較するために、統計分析をマンホイットニー検定により行った。ｐ＜０．０５は統計的に有意な差があることを表し、＃ｐ＜０．０５である。
【0173】
図４から図７に示される実験結果によれば、ヌマダイコン抽出物０８０５－Ｆは、マウスの耳の皮膚の臨床的外観、病理的症状および耳の厚さを著しく改善することができ、かつ用量効果（dose effect）を示し、その効能は臨床薬であるシクロスポリンＡよりも優れている。
【0174】
Ｅ．ヌマダイコン抽出物Ｆ４ＡＢの動物実験
【0175】
上の「Ａ．方法」の「ＮＣ／Ｎｇａマウスのアトピー性皮膚炎モデルの実験」に記載されている方法に基づき、ヌマダイコン抽出物Ｆ４ＡＢについて動物実験を行った。
【0176】
Ｆ４ＡＢを３０、１００、２００または４００ｍｇ／ｋｇで毎日経口投与した。ＪＡＫ阻害剤であるウパダシチニブを対照薬剤として用い、１、３または１０ｍｇ／ｋｇで毎日経口投与した。Ｄａｙ０の感作／刺激後に動物に試験薬剤を与え、Ｄａｙ０、７日目（Ｄａｙ７），１４日目（Ｄａｙ１４）、２１日目（Ｄａｙ２１）、２８日目（Ｄａｙ２８）、３５日目（Ｄａｙ３５）および４２日目（Ｄａｙ４２）に背部皮膚に対する臨床観察採点を行った。実験４２日目（Ｄａｙ４２）に、動物を犠牲死させ、血液を収集し、ＩｇＥ分析を行うと共に、背部皮膚組織を取って病理分析を行った。
【0177】
各群のマウス血清ＩｇＥ濃度の測定結果が図８に示されている。図８中、データは平均値±標準誤差（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ）（ｎ＝５）で示されており、統計分析はスチューデントのｔ検定により行った。ヌマダイコン抽出物Ｆ４ＡＢを投与した群と、そのビヒクルを投与した群との比較で、ｐ＜０．０５は統計的に有意な差があることを表し、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１である。ウパダシチニブを投与した群と、そのビヒクルを投与した群との比較で、ｐ＜０．０５は統計的に有意な差があることを表し、＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１である。
【0178】
実験４２日目、マウスを犠牲死させる前に、背中の写真を撮り、皮膚外観の落屑および損傷（皮膚病変）を記録した。その結果が図９に示されている。
【0179】
実験期間中毎週、マウスの背中に対し、総合的皮膚炎臨床重症度採点（皮膚病変のスコア）を行った。結果が図１０Ａおよび１０Ｂに示されている。図１０Ａは、ヌマダイコン抽出物Ｆ４ＡＢを投与したマウスの背中の総合的皮膚炎臨床重症度スコアを示している。データは平均値±標準誤差（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ）（ｎ＝５）で示しており、統計分析はマンホイットニー検定により行った。そのビヒクルを投与した群との比較で、ｐ＜０．０５は統計的に有意な差があることを表し、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１である。図１０Ｂは、ウパダシチニブを投与したマウスの背中の総合的皮膚炎臨床重症度スコアを示している。データは平均値±標準誤差（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ）（ｎ＝５）で示しており、統計分析はマンホイットニー検定により行った。そのビヒクルを投与した群との比較で、ｐ＜０．０５は統計的に有意な差があることを表し、＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１である。
【0180】
実験４２日目、マウスを犠牲死させる前に、総合的皮膚炎臨床重症度採点（皮膚病変のスコア）をマウスの背中に対して行った。その結果が図１０Ｃに示されている。データは平均値±標準誤差（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ）（ｎ＝５）で示しており、統計分析はマンホイットニー検定により行った。ヌマダイコン抽出物Ｆ４ＡＢを投与した群と、そのビヒクルを投与した群との比較で、ｐ＜０．０５は統計的に有意な差があることを表し、＊＊＊ｐ＜０．００１である。ウパダシチニブを投与した群と、そのビヒクルを投与した群との比較で、ｐ＜０．０５は統計的に有意な差があることを表し、＃＃＃ｐ＜０．００１である。
【0181】
マウスを犠牲死させた後、マウスに皮膚組織切片染色、表皮厚さの測定および病理切片分析を行った。これら実験結果は図１１、１２、１３および１４Ａから１４Ｅに示されている。
【0182】
図１１は、感作処理していない群、ヌマダイコン抽出物Ｆ４ＡＢを投与した群、およびビヒクルを投与した群におけるマウスの背部皮膚組織切片のヘマトキシリン・エオシン染色結果を示している。矢印で印をつけたところは増生を示し、＊で印をつけたところは炎症を示す。
【0183】
図１２は、感作処理していない群、ウパダシチニブを投与した群、およびビヒクルを投与した群におけるマウスの背部皮膚組織切片のヘマトキシリン・エオシン染色結果を示している。＊で印をつけたところは炎症を示している。
【0184】
図１３は、感作処理していない群、ヌマダイコンのビヒクルを投与した群、ヌマダイコン抽出物Ｆ４ＡＢを投与した群、ウパダシチニブのビヒクルを投与した群、ウパダシチニブを投与した群におけるマウスの背部皮膚の表皮の厚さを示している。データは平均値±標準誤差（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ）（ｎ＝５）で示しており、統計分析はスチューデントのｔ検定により行った。ヌマダイコン抽出物Ｆ４ＡＢを投与した群と、そのビヒクルを投与した群との比較で、ｐ＜０．０５は統計的に有意な差があることを表し、＊＊ｐ＜０．０１である。ウパダシチニブを投与した群と、そのビヒクルを投与した群との比較で、ｐ＜０．０５は統計的に有意な差があることを表し、＃＃ｐ＜０．０１である。
【0185】
図１４Ａから図１４Ｅは、マウスの背部皮膚組織の組織病理切片分析における炎症スコア、壊死スコア、増生スコア、過角化スコアおよび皮膚総合組織病理学的重症度スコアをそれぞれ示している。データは平均値±標準誤差（Ｍｅａｎ±ＳＥＭ）（ｎ＝５）で示しており、統計分析はマンホイットニー検定により行った。ヌマダイコン抽出物Ｆ４ＡＢを投与した群と、そのビヒクルを投与した群との比較で、ｐ＜０．０５は統計的に有意な差があることを表し、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１である。ウパダシチニブを投与した群と、そのビヒクルを投与した群との比較で、ｐ＜０．０５は統計的に有意な差があることを表し、＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１である。
【0186】
上記実験結果によれば、ビヒクルを投与した群と比較して、ヌマダイコン抽出物Ｆ４ＡＢ ３０～４００ｍｇ／ｋｇを投与した群におけるマウスの血液のＩｇＥ濃度は大幅に低下し、対照薬剤であるウパダシチニブ１～１０ｍｇ／ｋｇを投与した群は同じ効果を有している。
【0187】
マウスの背部皮膚に対する効果については、ヌマダイコン抽出物Ｆ４ＡＢおよびウパダシチニブの経口投与はいずれも、実験期間中において背部皮膚の臨床的外観および皮膚損傷を著しく改善させることができており、かつその著しい改善および用量効果（dose effect）は犠牲死の日まで維持された。組織病理分析については、ヌマダイコン抽出物Ｆ４ＡＢ ３０～４００ｍｇ／ｋｇおよびウパダシチニブ１～１０ｍｇ／ｋｇの経口投与はいずれも、背部皮膚の表皮の厚さを著しく改善させると同時に、炎症、過角化、増生、壊死および総合病理的損傷を著しく低減させることができていた。
【0188】
上の全ての実験は、本開示のヌマダイコン抽出物が皮膚炎、特にアトピー性皮膚炎および接触性皮膚炎の治療に有効に使用され得ることを、明らかに証明している。
【0189】
当業者には、開示された実施形態に各種の修飾および変更を加えることができる、ということが明らかであろう。詳述および例は単なる例示としてみなされるよう意図されており、本開示の真の範囲は、以下のクレームおよびそれらの均等物によって示される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図14D】
【図14E】
【外国語明細書】