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特開2024-97745微細藻類増殖促進用微生物、微細藻類増殖促進剤、微細藻類の培養方法、微生物のスクリーニング方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024097745
(43)【公開日】2024-07-19
(54)【発明の名称】微細藻類増殖促進用微生物、微細藻類増殖促進剤、微細藻類の培養方法、微生物のスクリーニング方法
(51)【国際特許分類】
C12N 1/12 20060101AFI20240711BHJP
C12N 1/00 20060101ALI20240711BHJP
C12N 1/20 20060101ALI20240711BHJP
【ＦＩ】
C12N1/12 Z
C12N1/00 T ZNA
C12N1/12 A
C12N1/20 E
【審査請求】未請求
【請求項の数】10
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023166726
(22)【出願日】2023-09-28
(31)【優先権主張番号】P 2023000957
(32)【優先日】2023-01-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【新規性喪失の例外の表示】特許法第３０条第２項適用申請有り ・日本農芸化学会２０２２年度京都大会（開催日：令和４年３月１５日～令和４年３月１８日） ・２０２２年度生物工学若手研究者の集い（若手会）オンラインセミナー２０２２（開催日：令和４年５月２７日） ・第２２回マリンバイオテクノロジー学会大会（開催日：令和４年５月２８日～令和４年５月２９日） ・令和４年度 日本農芸化学会北海道・東北支部合同支部会・合同若手の会（開催日：令和４年９月２０日～令和４年９月２２日） ・創立１００周年記念第７４回日本生物工学会大会（２０２２）（開催日：令和４年１０月１７日～令和４年１０月２０日） ・Ｙｏｕｎｇ Ａｓｉａｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ’Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ２０２２（開催日：令和４年１２月９日） ・超異分野学会東京大会２０２３（開催日：令和５年３月３日～令和５年３月４日）
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和２年度、中小企業庁、戦略的基盤技術高度化支援事業（サポイン事業）、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】515021426
【氏名又は名称】環境大善株式会社
(71)【出願人】
【識別番号】504300088
【氏名又は名称】国立大学法人北海道国立大学機構
(74)【代理人】
【識別番号】110004222
【氏名又は名称】弁理士法人創光国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】小西 正朗
(72)【発明者】
【氏名】加藤 勇太
(72)【発明者】
【氏名】草野 友美
(72)【発明者】
【氏名】タン ペイ ユ
(72)【発明者】
【氏名】窪之内 誠
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA01X
4B065AA10X
4B065AA15X
4B065AA45X
4B065AA83X
4B065BA25
4B065CA41
4B065CA43
4B065CA44
4B065CA49
4B065CA60
(57)【要約】
【課題】微細藻類の増殖を促進する。
【解決手段】ロドコッカス属、キサントバクター属、アンサイロバクター属、シェワネラ属、又は、アエロモナス属に属する微生物である。前記微生物が、ロドコッカス属のロドコッカス・セラスティ、キサントバクター属のキサントバクター・フラヴス、又は、アンサイロバクター属のアンサイロバクター・ルドゲンシスであってもよい。前記微生物が、藍藻、緑藻、灰色藻又はユーグレナ藻の増殖を促進するためのものであってもよい。
【選択図】図４
【解決手段】ロドコッカス属、キサントバクター属、アンサイロバクター属、シェワネラ属、又は、アエロモナス属に属する微生物である。前記微生物が、ロドコッカス属のロドコッカス・セラスティ、キサントバクター属のキサントバクター・フラヴス、又は、アンサイロバクター属のアンサイロバクター・ルドゲンシスであってもよい。前記微生物が、藍藻、緑藻、灰色藻又はユーグレナ藻の増殖を促進するためのものであってもよい。
【選択図】図４
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ロドコッカス属、キサントバクター属、アンサイロバクター属、シェワネラ属、バシラス属、又は、アエロモナス属に属する微生物であることを特徴とする微細藻類増殖促進用微生物。
【請求項2】
前記微生物が、ロドコッカス属のロドコッカス・セラスティ、キサントバクター属のキサントバクター・フラヴス、又は、アンサイロバクター属のアンサイロバクター・ルドゲンシスである、請求項１に記載の微細藻類増殖促進用微生物。
【請求項3】
前記微生物が、バシラス属のバシラス・リケニフォルミス、バシラス・プミリス、バシラス・ジャンジョウエンシス、バシラス・アウストラリマリス、バシラス・サフェンシス、ペリバシラス・アカンティ、ロドコッカス属のロドコッカス・セラスティ、アエロモナス属のアエロモナス・サルモニシダ又はアエロモナス・ピシコラである、請求項１に記載の微細藻類増殖促進用微生物。
【請求項4】
藍藻、緑藻、灰色藻又はユーグレナ藻の増殖を促進するための請求項１～３のいずれか一項に記載の微細藻類増殖促進用微生物。
【請求項5】
シアノバクテリア門又はユーグレナ植物門に属する生物の増殖を促進するための請求項１～３のいずれか一項に記載の微細藻類増殖促進用微生物。
【請求項6】
請求項１～３のいずれか一項に記載の微細藻類増殖促進用微生物を含有する微細藻類増殖促進剤。
【請求項7】
ロドコッカス属、キサントバクター属、アンサイロバクター属、シェワネラ属、バシラス属、又は、アエロモナス属に属する微生物のうちの一つ以上の微生物を、微細藻類とともに共培養することを特徴とする、微細藻類の培養方法。
【請求項8】
スクリーニング対象となる微生物を、微細藻類とともに共培養するステップと、
共培養後の培地に含まれるクロロフィルを定量するステップと、
を備える、微生物のスクリーニング方法。
共培養後の培地に含まれるクロロフィルを定量するステップと、
を備える、微生物のスクリーニング方法。
【請求項9】
前記クロロフィルを定量するステップにおいて、励起波長を４８８ｎｍ、蛍光波長を６８３～７２０ｎｍとして、蛍光強度を測定するステップである請求項８に記載の微生物のスクリーニング方法。
【請求項10】
前記クロロフィルを定量するステップが、
微細藻類がPCC7972の場合は励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長６８３ｎｍとし、微細藻類がNIES-2173の場合は励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長６８５ｎｍとし、微細藻類がNIES-48の場合は励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長７００ｎｍとして蛍光強度を測定するステップである、
請求項８に記載の微生物のスクリーニング方法。
微細藻類がPCC7972の場合は励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長６８３ｎｍとし、微細藻類がNIES-2173の場合は励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長６８５ｎｍとし、微細藻類がNIES-48の場合は励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長７００ｎｍとして蛍光強度を測定するステップである、
請求項８に記載の微生物のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、微細藻類の増殖を促進する微細藻類増殖促進用微生物、微細藻類増殖促進剤、微細藻類増殖促進用微生物を用いた微細藻類の培養方法、及び、微細藻類の増殖を促進可能な微生物を分離するためのスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【0002】
微細藻類は、例えば、天然物由来の赤色を呈するカロチノイド色素の一種であるアスタキサンチン等の有用物質の工業生産に利用されている。微細藻類から有用物質を抽出し、食品、医薬品、飼料、肥料等の原材料とすることが行われている。最近では、微細藻類が細胞内に蓄積する糖質や脂質を有用物質として利用して、石油やバイオエタノールを生産することが注目されている。また、微細藻類の一つであるユーグレナはそれ自体が食品原料として工業生産されている。微細藻類は、光合成能力により二酸化炭素を固定することが可能である。このため、温暖化対策として微細藻類を培養することも有用である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0003】
【特許文献1】特表２０１４－５０９１８８号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
微細藻類の増殖速度は一般的な従属栄養微生物と比べ低い。例えば、特許文献１には、微細藻類を用いた有用物質等の生産の経済性を向上させるため、窒素及びリン等の栄養素のレベルを増大させることにより、微細藻類の増殖速度を上昇させることが記載されている。しかしながら、特許文献１に記載された方法では、微細藻類の増殖速度を十分に高くすることができないという問題があった。
【0005】
そこで、本発明はこれらの点に鑑みてなされたものであり、微細藻類の増殖を促進することができる微細藻類増殖促進用微生物、微生物を含む微細藻類増殖促進剤、微細藻類の培養方法、並びに、微細藻類の増殖を促進可能な微生物を分離するためのスクリーニング方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本発明の第１の態様の微細藻類増殖促進用微生物は、ロドコッカス属、キサントバクター属、アンサイロバクター属、シェワネラ属、バシラス属、又は、アエロモナス属に属する微生物である。
【0007】
前記微生物が、ロドコッカス属のロドコッカス・セラスティ、キサントバクター属のキサントバクター・フラヴス、又は、アンサイロバクター属のアンサイロバクター・ルドゲンシスであってもよい。また、前記微生物が、バシラス属のバシラス・リケニフォルミス、バシラス・プミリス、バシラス・ジャンジョウエンシス、バシラス・アウストラリマリス、バシラス・サフェンシス、ペリバシラス・アカンティ、ロドコッカス属のロドコッカス・セラスティ、アエロモナス属のアエロモナス・サルモニシダ又はアエロモナス・ピシコラであってもよい。前記微生物が、藍藻、緑藻、灰色藻又はユーグレナ藻の増殖を促進するためのものであってもよい。前記微生物が、シアノバクテリア門又はユーグレナ植物門に属する生物の増殖を促進するためのものであってもよい。
【0008】
本発明の第２の態様の微細藻類増殖促進剤は、前記微細藻類増殖促進用微生物を含有する。
【0009】
本発明の第３の態様の微細藻類の培養方法は、ロドコッカス属、キサントバクター属、アンサイロバクター属、シェワネラ属、バシラス属、又は、アエロモナス属に属する微生物のうちの一つ以上の微生物を、微細藻類とともに共培養することを特徴とする。
【0010】
本発明の第４の態様の微生物のスクリーニング方法は、スクリーニング対象となる微生物を、微細藻類とともに共培養するステップと、共培養後の培地に含まれるクロロフィルを定量するステップと、を備える。前記クロロフィルを定量するステップが、励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長６８０ｎｍ～７２０ｎｍで蛍光強度を測定するステップであってもよく、微細藻類がPCC7972の場合は励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長６８３ｎｍ、微細藻類がNIES-2173の場合は励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長６８５ｎｍとし、微細藻類がNIES-48の場合は励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長７００ｎｍで蛍光強度を測定することが好ましい。
【発明の効果】
【0011】
本発明によれば、微細藻類の増殖を促進するという効果を奏する。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】オーメロッド培地に添加したそれぞれの培地成分の濃度を示す。
【図2】共培養培地のそれぞれの培地成分の濃度を示す。
【図3】ＰＣＲ反応に使用したプライマーを示す。
【図4】共培養６日目においてクロロフィル蛍光強度の倍率が１．０を超えた分離株を示す。
【図5】共培養６日目においてクロロフィル蛍光強度の倍率が１．０を超えた分離株を示す。
【図6】PCC7942の純粋培養及びAF2108株との共培養時のクロロフィルａの経時変化を示す。
【図7】PCC7942の純粋培養及びAF2108株との共培養時の培養時間１６８時間目における細胞数、細胞の大きさ及びクロロフィル蛍光強度をフローサイトメトリーにより測定した結果を示す。
【図8】PCC7942の純粋培養及びAF2108株とのフラスコによる共培養の様子を時系列順に示す。
【図9】NIES-2173の純粋培養及びAF2108株との共培養時のクロロフィルａ＋ｂの経時変化を示す。
【図10】NIES-2173の純粋培養及びAF2108株との共培養時の培養時間１２０時間目における細胞数、細胞の大きさ及びクロロフィル蛍光強度をフローサイトメトリーにより測定した結果を示す。
【図11】Rhodococcus属の系統樹を示す。
【図12】PCC7942の純粋培養及びAF2111株との共培養時のクロロフィルａの経時変化を示す。
【図13】PCC7942の純粋培養及びAF2111株との共培養時の培養時間168時間目における細胞数、細胞の大きさ及びクロロフィル蛍光強度をフローサイトメトリーにより測定した結果を示す。
【図14】PCC7942の純粋培養及びAF2111株とのフラスコによる共培養の様子を時系列順に示す。
【図15】NIES-2173の純粋培養及びAF2111株との共培養時のクロロフィルａ＋ｂの経時変化を示す。
【図16】NIES-2173の純粋培養及びAF2111との共培養時の培養１２０時間目における細胞数、細胞の大きさ及びクロロフィル蛍光強度をフローサイトメトリーにより測定した結果を示す。
【図17】Xanthobacter属の系統樹を示す。
【図18】PCC7942の純粋培養及びGA1226株との共培養時のクロロフィルａの経時変化を示す。
【図19】PCC7942の純粋培養及びGA1226株との共培養時の培養１６８時間目における細胞数、細胞の大きさ及びクロロフィル蛍光強度をフローサイトメトリーにより測定した結果を示す。
【図20】PCC7942の純粋培養及びGA1226株とのフラスコによる共培養の様子を時系列順に示す。
【図21】NIES-2173の純粋培養及びGA1226株との共培養時のクロロフィルａ＋ｂの経時変化を示す。
【図22】NIES-2173の純粋培養及びGA1226株との共培養時の培養１２０時間目における細胞数、細胞の大きさ及びクロロフィル蛍光強度をフローサイトメトリーにより測定した結果を示す。
【図23】Ancylobacter属の系統樹を示す。
【図24】PCC7942の純粋培養及びOR151株との共培養時のクロロフィルａの経時変化を示す。
【図25】PCC7942の純粋培養及びOR121株との共培養時の培養１６８時間目での細胞数、細胞の大きさ及びクロロフィル蛍光強度をフローサイトメトリーにより測定した結果を示す。
【図26】PCC7942の純粋培養及びOR151株とのフラスコによる共培養の様子を時系列順に示す。
【図27】NIES-2173の純粋培養時及びOR151株との共培養時のクロロフィルａ＋ｂ濃度の経時変化を示す。
【図28】NIES-2173の純粋培養及びOR151株との共培養の培養１２０時間目における細胞数、細胞の大きさ及びクロロフィル蛍光強度をフローサイトメトリーにより測定した結果を示す。
【図29】Shewanella属の系統樹を示す。
【図30】ＪＣＭ培地の組成を示す。
【図31】改変ＣＭ培地の組成を示す。
【図32】実施例で得られた分離株の一部を示す。
【図33】単独培養又は共培養時のクロロフィル量の経時変化を示す。
【図34】フローサイトメトリーの結果を示す。
【図35】JM311と近縁のBacillus属の系統樹を示す。
【図36】単独培養又は共培養時のクロロフィル量の経時変化を示す。
【図37】フローサイトメトリーの結果を示す。
【図38】JM321と近縁のBacillus属の系統樹を示す。
【図39】単独培養又は共培養時のクロロフィル量の経時変化を示す。
【図40】フローサイトメトリーの結果を示す。
【図41】AF2108と近縁のRhodococcus属の系統樹を示す。
【図42】単独培養又は共培養時のクロロフィル量の経時変化を示す。
【図43】フローサイトメトリーの結果を示す。
【図44】JM202と近縁のAeromonas属の系統樹を示す。
【発明を実施するための形態】
【0013】
［微細藻類増殖促進用微生物］
本発明の微細藻類増殖促進用微生物は、ロドコッカス属（Rhodococcus属）、キサントバクター属（Xanthobacter属）、シェワネラ属（Shewanella属）、アンサイロバクター属（Ancylobacter属）、バシラス属（Bacillus属）、又は、アエロモナス属（Aeromonas属）に属する微生物である。これらの微生物は、牛の尿を微生物によって処理した牛尿発酵液（Fermented Cattle Urine, FCU）、FCUから製造される微細藻類増殖促進剤を使ったスクリーニングによって得られたものであるが、本発明の微細藻類増殖促進用微生物は、上記のいずれかの属に属する微生物で、微細藻類の増殖を促進する作用を有する微生物であれば、FCUから単離されたものに限定されない。好ましくは、微細藻類増殖促進用微生物は、ロドコッカス属のロドコッカス・セラスティ（Rhodococcus cerastii）、キサントバクター属のキサントバクター・フラヴス（Xanthobacter flavus）、アンサイロバクター属のアンサイロバクター・ルドゲンシス（Ancylobacter rudongensis）、又は、シェワネラ属（Shewanella sp.）である。
本発明の微細藻類増殖促進用微生物は、ロドコッカス属（Rhodococcus属）、キサントバクター属（Xanthobacter属）、シェワネラ属（Shewanella属）、アンサイロバクター属（Ancylobacter属）、バシラス属（Bacillus属）、又は、アエロモナス属（Aeromonas属）に属する微生物である。これらの微生物は、牛の尿を微生物によって処理した牛尿発酵液（Fermented Cattle Urine, FCU）、FCUから製造される微細藻類増殖促進剤を使ったスクリーニングによって得られたものであるが、本発明の微細藻類増殖促進用微生物は、上記のいずれかの属に属する微生物で、微細藻類の増殖を促進する作用を有する微生物であれば、FCUから単離されたものに限定されない。好ましくは、微細藻類増殖促進用微生物は、ロドコッカス属のロドコッカス・セラスティ（Rhodococcus cerastii）、キサントバクター属のキサントバクター・フラヴス（Xanthobacter flavus）、アンサイロバクター属のアンサイロバクター・ルドゲンシス（Ancylobacter rudongensis）、又は、シェワネラ属（Shewanella sp.）である。
【0014】
また、好ましくは、微細藻類増殖促進用微生物は、バシラス属のバシラス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バシラス・プミリス（Bacillus pumilus)、バシラス・ジャンジョウエンシス（Bacillus zhangzhouensis)、ペリバシラス・アカンティ（Peribacillus acanthi）、バシラス・アウストラリマリス(Bacillus australimaris)、バシラス・サフェンシス（Bacillus Safensis）、ロドコッカス属のロドコッカス・セラスティ(Rhodococcus cerastii)又はアエロモナス属のアエロモナス・サルモニシダ(Aeromonas salmonicida)、アエロモナス・ピシコラ（Aeromonas piscicola）である。本発明の微細藻類増殖促進用微生物は、微細藻類と共培養する、あるいは、微細藻類増殖促進用微生物を培養する培地を微細藻類の培地に添加や混合をすることで、微細藻類の増殖を促進することができる。
【0015】
［微細藻類］
本発明の微細藻類増殖促進用微生物は、微細藻類の増殖を促進する。微細藻類は、光合成可能な生物のうち、個体の識別に顕微鏡を要するものである。
本発明の微細藻類増殖促進用微生物は、微細藻類の増殖を促進する。微細藻類は、光合成可能な生物のうち、個体の識別に顕微鏡を要するものである。
【0016】
微細藻類は、例えば、シアノバクテリア門（例えば、藍藻）、不等毛植物門、ユーグレナ植物門（例えば、ユーグレナ藻）、クリプト植物門、ハプト植物門、ケルコゾア門、灰色植物門（例えば、灰色藻）、紅色植物門、緑藻植物門（例えば、緑藻）又はストレプト植物門に属する生物種である。微細藻類としては、藍藻などのシアノバクテリア門又はユーグレナ藻などのユーグレナ植物門に属する生物が好ましい。
【0017】
微細藻類は、例えば、シアノバクテリア門のクロオコッカス目、ユレモ目、ネンジュモ目、スティゴネマ目に属する生物種が挙げられ、具体的には、クロオコッカス（Chroococ cus sp.）、ミクロキスチス（Microcystis aeruginosa）、ユレモ（Oscillataria sp.）、ミクロコレウス（Microcoleus sp.）、ネンジュモ（Nostoc sp.）、キリンドロスペルムム（Cylindrospermum）、スティゴネマ（Stigonema）又はシネココッカス・エロンゲイタス（Synecochoccus elongatus）が挙げられる。
【0018】
微細藻類は、例えば、不等毛植物門の黄金色藻綱のオクロモナス目又はマロモナス目に属する生物種であってもよく、具体的には、ニセクスダマヒゲムシ（Uroglenopsis americana)、ウログレナ（Uroglena volvox)、マロモナス（Mallomonas）又はシヌラ（Synura sp.)が挙げられる。微細藻類は、例えば、不等毛植物門の珪藻綱に属する生物種であってもよく、具体的には、コアミケイソウ(Coscinodiscus sp.）又はディアトマ（Diatoma）が挙げられる。
【0019】
微細藻類は、例えば、不等毛植物門の黄緑色綱に属する生物種であってもよく、具体的には、シュードスタウラスツルム（Pseudostaurastrum sp.）又はカラキオプシス（Characiopsis sp.）が挙げられる。微細藻類は、例えば、不等毛植物門のディクチオカ藻綱に属する生物種であってもよく、具体的には、ディクチオカ（Dictyocha sp.）が挙げられる。微細藻類は、例えば、不等毛植物門の渦鞭毛藻綱に属する生物種であってもよく、具体的には、ウズオビムシ（Peridinium sp.）又はマルスズオビムシ（Scripp siella trochoidea）が挙げられる。
【0020】
微細藻類は、例えば、ユーグレナ植物門のユーグレナ藻綱に属する生物種であってもよく、具体的には、ユーグレナ（Euglena sp.）又はウチワヒゲムシ（Phacus sp.）が挙げられる。微細藻類は、例えば、クリプト植物門のクリプト藻綱に属する生物種であってもよく、具体的には、クリプトモナス（Cryptomonas sp.）又はロドモナス（Rhodomonas sp.）が挙げられる。
【0021】
微細藻類は、例えば、ハプト植物門のハプト藻綱に属する生物種であってもよく、具体的には、コロノスファエラ（Coronosphaera sp.）又はゲフィロカプサ（Gephyrocapsa sp.）が挙げられる。微細藻類は、例えば、ケルコゾア門の有殻糸状根足虫綱に属する生物種であってもよく、具体的には、パウリネラ クロマトフォラ(Paulinella chromatophora)が挙げられる。微細藻類は、例えば、灰色植物門の灰色藻綱に属する生物種であってもよく、具体的には、グラウコキスチス（Glaucocystis sp.）が挙げられる。
【0022】
微細藻類は、例えば、紅色植物門の紅藻綱に属する生物種であってもよく、具体的には、イデユコゴメ（Cyanidium sp.）又はガルディエリア（Galdieria sp.）が挙げられる。微細藻類は、例えば、緑藻植物門の緑藻綱に属する生物種であってもよく、具体的には、フタヅノクンショウモ（Pediastrum duplex）、ボルボックス（Volvox sp.）、クラミドモナス（Chlamydomonas sp.）又はアステロコックス（Asterococcus sp.）又はクロレラが挙げられる。微細藻類は、例えば、緑藻植物門のトレボウキシア藻綱に属する生物種であってもよく、具体的には、クロレラ属に属する単細胞緑藻類であってもよい。クロレラ属に属する単細胞緑藻類は、例えば、クロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）であってもよい。
【0023】
微細藻類は、例えば、ストレプト植物門のメソスティグマ藻綱に属する生物種であってもよく、具体的には、メソスティグマ（Mesostigma sp.）が挙げられる。微細藻類は、例えば、ストレプト植物門の接合藻綱に属する生物種であってもよく、具体的には、ホシミドロ（Zygnema sp.）が挙げられる。微細藻類は、一例としては、いわゆるラン藻の一種であるシアノバクテリア門のシネココッカス・エロンゲイタス（Synecochoccus elongatus）が挙げられる。
【0024】
［微細藻類増殖促進剤］
本発明の微細藻類増殖促進用微生物を含む微細藻類増殖促進剤は、剤型は限定されず、液体、固形又はスラリー等のいずれであってもよいが、液体であることが好ましい。また、本発明の微細藻類増殖促進剤は、剤型に応じた副成分、例えば、希釈剤、安定剤、増粘剤、造粒剤などを含んでいてもよい。微細藻類増殖促進剤は、例えば、微細藻類を培養するための培地に添加することで使用することができる。
本発明の微細藻類増殖促進用微生物を含む微細藻類増殖促進剤は、剤型は限定されず、液体、固形又はスラリー等のいずれであってもよいが、液体であることが好ましい。また、本発明の微細藻類増殖促進剤は、剤型に応じた副成分、例えば、希釈剤、安定剤、増粘剤、造粒剤などを含んでいてもよい。微細藻類増殖促進剤は、例えば、微細藻類を培養するための培地に添加することで使用することができる。
【0025】
本発明の微細藻類増殖促進剤は、上述した微細藻類増殖促進用微生物を含有する。微細藻類増殖促進剤は、そのまま用いてもよいが、使用前に微生物を除去してもよい。微生物を除去する方法としては特に制限されず、例えば、フィルターによる除去、遠心分離による除去、オートクレーブによる滅菌、紫外線照射による滅菌が挙げられる。本発明の微細藻類増殖促進剤を添加することにより、微細藻類の増殖を促進することができる。
【0026】
本発明の微細藻類の培養方法は、上述の微細藻類促進用微生物を、微細藻類とともに共培養する。例えば、微細藻類促進用微生物を、ＦＣＵ培地中において微細藻類とともに共培養する。このようにして、微細藻類の増殖を促進することができる。
【0027】
［スクリーニング方法］
本発明のスクリーニング方法は、微細藻類の増殖を促進することのできる微生物をスクリーニングする方法であり、以下の（１）及び（２）の工程を含む。
（１）スクリーニング対象となる微生物を、微細藻類とともに共培養するステップ。
（２）共培養後の培地に含まれるクロロフィルを定量するステップ。
本発明のスクリーニング方法は、微細藻類の増殖を促進することのできる微生物をスクリーニングする方法であり、以下の（１）及び（２）の工程を含む。
（１）スクリーニング対象となる微生物を、微細藻類とともに共培養するステップ。
（２）共培養後の培地に含まれるクロロフィルを定量するステップ。
【0028】
（１）のスクリーニング対象となる微生物を準備する方法は特に限定されないが、例えば、牛尿を曝気することにより発酵させた牛尿発酵液（Fermented Cattle Urine, ＦＣＵ）のように、微細藻類の増殖を促進することのできる自然由来の液から、候補となる微生物を単離することが可能である。牛尿の代わりに、馬、豚等の別の家畜の尿を発酵させた家畜尿発酵液に含まれる微生物をスクリーニング対象としてもよい。ＦＣＵを使用する場合、このＦＣＵを希釈した希釈液をオーメロッド培地に加えて培養する。図１は、オーメロッド培地に添加したそれぞれの培地成分の濃度を示す。オーメロッド培地において形成されたコロニーを別のオーメロッド培地に分離して培養する操作を繰り返すことにより、複数の単一コロニーを得る。形成された複数の単一コロニーのそれぞれを、微細藻類を含む複数の培地で共培養する。
【0029】
また、スクリーニング対象となる微生物は、オーメロッド培地やＪＣＭ５２０培地の代わりに、ＦＣＵ培地中において培養してもよい。この場合、ＦＣＵは、１２１℃、２０分のオートクレーブ殺菌したものを用いてもよく、０．２２μｍフィルターを通すことにより滅菌したものを用いてもよい。ＦＣＵと滅菌水とを混合することにより、完成したＦＣＵ培地における濃度がＦＣＵの濃度が２０％又は１０％となるようにＦＣＵの分量を調整する。ＦＣＵ培地には、完成したＦＣＵ培地における濃度が０．８％になるように調整したゲランガム、又は、完成したＦＣＵ培地における濃度が２％となるように調整した寒天を添加する。
【0030】
上述の（２）に示すように、スクリーニング対象の微生物と微細藻類との共培養後の微細藻類に含まれるクロロフィルを定量することにより、この微生物が微細藻類の増殖を促進する効果をどの程度発揮したかを評価することができる。クロロフィルを定量するステップでは、蛍光分光光度計を用いて、励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長が６８３ｎｍ～７２０ｎｍで蛍光強度を測定する。また、微細藻類の種類によって波長を変えることも可能であり、例えば、PCC7972の場合は励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長６８３ｎｍ、NIES-2173の場合は励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長６８５ｎｍ、NIES-48の場合は励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長７００ｎｍで蛍光強度を測定することが好ましい。このようにして、クロロフィルの蛍光に対応する波長の光を測定することにより、微生物が微細藻類の増殖をどの程度促進したかを精度よく評価することができる。
【0031】
特定したコロニーの微生物ゲノムにおいて１６ＳｒＲＮＡ等に対応するＤＮＡ配列をシーケンスにより解読する。一例としては、このＤＮＡ配列と最も一致度が高いＤＮＡ配列を有する既知の微生物をこのコロニーに対応する微生物又はこのコロニーに対応する微生物の候補として同定する。また、特定したコロニーの微生物ゲノムにおいて１６ＳｒＲＮＡ等に対応するＤＮＡ配列との一致度が閾値以上のＤＮＡ配列を有する既知の微生物をこのコロニーに対応する微生物として同定してもよい。閾値は、例えば、９７％から９８％の範囲内の値である。
【実施例0032】
［微細藻類増殖促進微生物の分離と培養方法］
オーメロッド培地を用いて、微細藻類増殖促進効果を有する微生物を分離した。図１に示した各培地成分に加えて２％寒天を添加し、１２１℃で２０分オートクレーブを実施することにより、オーメロッド寒天培地を作製した。発酵済のＦＣＵを分離源とし、分離源のＦＣＵを１０倍から１０５倍の範囲で希釈した液を作り、各シャーレに固まったオーメロッド培地に希釈したＦＣＵを１００μＬ播き、コンラージ棒で植菌し、ふたをし、好気条件、室温(２４℃)、１１５－１２０μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、２４時間のうち１２時間だけ光を照射する環境においてコロニー形成まで培養した。形成されたコロニーをディスポループで、ピックアップし、分離に使った培地と同様な培地に数回植え継ぎして、単独のコロニーを得た。
オーメロッド培地を用いて、微細藻類増殖促進効果を有する微生物を分離した。図１に示した各培地成分に加えて２％寒天を添加し、１２１℃で２０分オートクレーブを実施することにより、オーメロッド寒天培地を作製した。発酵済のＦＣＵを分離源とし、分離源のＦＣＵを１０倍から１０５倍の範囲で希釈した液を作り、各シャーレに固まったオーメロッド培地に希釈したＦＣＵを１００μＬ播き、コンラージ棒で植菌し、ふたをし、好気条件、室温(２４℃)、１１５－１２０μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、２４時間のうち１２時間だけ光を照射する環境においてコロニー形成まで培養した。形成されたコロニーをディスポループで、ピックアップし、分離に使った培地と同様な培地に数回植え継ぎして、単独のコロニーを得た。
【0033】
［ハイスループットな共培養評価系による微細藻類増殖促進細菌のスクリーニングの概要］
（１）藍藻
藍藻のモデル生物であるSynechococcus elongatus PCC 7942（以下、単にPCC7942ともいう）を微細藻類増殖促進効果を評価するために用いた。PCC7942の単独培養の場合、前培養として、共培養培地を用いて７日間で３０℃、１２０ｒｐｍ、光量子束密度１１５－１２０μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、２４時間連続光照射でフラスコ培養を行った。光量子束密度は、光の強さを表す。
（１）藍藻
藍藻のモデル生物であるSynechococcus elongatus PCC 7942（以下、単にPCC7942ともいう）を微細藻類増殖促進効果を評価するために用いた。PCC7942の単独培養の場合、前培養として、共培養培地を用いて７日間で３０℃、１２０ｒｐｍ、光量子束密度１１５－１２０μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、２４時間連続光照射でフラスコ培養を行った。光量子束密度は、光の強さを表す。
【0034】
図２は、共培養培地のそれぞれの培地成分の濃度を示す。図２中の微量元素は、１００ ｍＬの溶液中に０．２５ｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．３７ｇの（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ、２．４７ｇのＨ３ＢＯ３、０．２９ｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．５８ｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏをそれぞれ含む。PCC7942に分離株を混合することなく共培養培地に植菌し、３０℃、１２０ｒｐｍ、光量子束密度１１５－１２０μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、２４時間連続光照射で７日間本培養を行った。２４時間ごとにクロロフィルａ濃度（μｇ／ｍＬ）を測定した。
【0035】
ＦＣＵから分離された分離株とPCC7942とを共培養する場合、共培養のための前培養として、１００ｍＬフラスコを用いて、共培養培地４０ｍＬに５００μＬの菌株グリセロールストック液を植菌し、３０℃、１６０ｒｐｍ、で行った。本培養時、１００ｍＬのフラスコに共培養培地を４０ｍＬ分注し、PCC7942の波長６００ｎｍの光の吸光度A600が分離株との混合後に０．０５になるようにPC7942の分量を調整し、ＦＣＵから分離されたそれぞれの分離株の波長６００ｎｍの光の吸光度A600がPCC7942との混合後に０．０１、０．０５又は０．０８等になるようにそれぞれの分離株の分量を調整する。
【0036】
PCC7942と分離株とを混合した後に共培養培地に植菌し、３０℃、１２０ｒｐｍ、光量子束密度１１５－１２０μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、２４時間連続光照射で７日間本培養を行った。２４時間ごとにクロロフィルａ濃度（μｇ／ｍＬ）を定量した。それぞれの分離株について、PCC7942と同様なクロロフィル蛍光を持たないことを確認した。このことから、それぞれの分離株はPCC7942との共培養時に、PCC7942由来のクロロフィル蛍光強度の測定結果に影響を与えないことがわかる。
【0037】
＜クロロフィル定量＞
共培養後のサンプルを１ｍＬ回収し１５，０００×ｇで７分間遠心分離した。上澄み画分を除去し、沈殿として回収した細胞を１ｍＬの冷やした１００％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）メタノールに再懸濁した。細胞から色素を抽出するために、サンプルを４．０℃で１時間光のない場所に入れ、インキュベートした。インキュベーション後、サンプルを１５，０００×ｇで１０分間、４．０℃で遠心分離し、上清に含まれるクロロフィルａを分光光度法により定量した。ブランクとしてメタノールを使用して校正され、６６５ｎｍおよび７２ ０ｎｍでの吸光度が測定された。クロロフィルａ濃度は、式（クロロフィルａ濃度（μｇ／ｍＬ）＝１２．９４４７×（Ａ６６５－Ａ７２０））により求めた。
共培養後のサンプルを１ｍＬ回収し１５，０００×ｇで７分間遠心分離した。上澄み画分を除去し、沈殿として回収した細胞を１ｍＬの冷やした１００％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）メタノールに再懸濁した。細胞から色素を抽出するために、サンプルを４．０℃で１時間光のない場所に入れ、インキュベートした。インキュベーション後、サンプルを１５，０００×ｇで１０分間、４．０℃で遠心分離し、上清に含まれるクロロフィルａを分光光度法により定量した。ブランクとしてメタノールを使用して校正され、６６５ｎｍおよび７２ ０ｎｍでの吸光度が測定された。クロロフィルａ濃度は、式（クロロフィルａ濃度（μｇ／ｍＬ）＝１２．９４４７×（Ａ６６５－Ａ７２０））により求めた。
【0038】
＜フローサイトメトリー分析＞
フローサイトメータＣｕｂｅ８を用いて細胞数及び細胞ごとのクロロフィル蛍光を測定した。１０００倍希釈したそれぞれの培養液を１ｍＬずつ調整し、測定用試料とした。前方散乱(ＦＳＣ―Ｈ)、側方散乱（ＳＳＣ―Ｈ）、クロロフィル蛍光（ＦＬ２－Ｈ）の電圧は、それぞれ、２００．０Ｖ、２７５．０Ｖ、５２５．０Ｖ、６７５．０Ｖとした。
フローサイトメータＣｕｂｅ８を用いて細胞数及び細胞ごとのクロロフィル蛍光を測定した。１０００倍希釈したそれぞれの培養液を１ｍＬずつ調整し、測定用試料とした。前方散乱(ＦＳＣ―Ｈ)、側方散乱（ＳＳＣ―Ｈ）、クロロフィル蛍光（ＦＬ２－Ｈ）の電圧は、それぞれ、２００．０Ｖ、２７５．０Ｖ、５２５．０Ｖ、６７５．０Ｖとした。
【0039】
（２）クロレラ
＜培養方法＞
微細藻類の別の例としてクロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）NIES-2173（以下、単にNIES-2173ともいう）を用いて微細藻類増殖促進効果を評価した。グルコースを５ｇ／Ｌ添加した改変ＢＧ１１培地で前培養を３日間で３０℃、１２５ｒｐｍ、ＰＰＦＤ、１３３μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、明暗期２４ｈ／０ｈでフラスコ培養を行った。分離株の場合、前培養では、１００ｍＬフラスコを用いて、共培養培地４０ｍＬに１ｍＬの菌株グリスト液を植菌し、３０℃、１６８ｒｐｍで行った。
＜培養方法＞
微細藻類の別の例としてクロレラ・ソロキニアナ（Chlorella sorokiniana）NIES-2173（以下、単にNIES-2173ともいう）を用いて微細藻類増殖促進効果を評価した。グルコースを５ｇ／Ｌ添加した改変ＢＧ１１培地で前培養を３日間で３０℃、１２５ｒｐｍ、ＰＰＦＤ、１３３μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、明暗期２４ｈ／０ｈでフラスコ培養を行った。分離株の場合、前培養では、１００ｍＬフラスコを用いて、共培養培地４０ｍＬに１ｍＬの菌株グリスト液を植菌し、３０℃、１６８ｒｐｍで行った。
【0040】
本培養時、１００ｍＬのフラスコにグルコースを５ｇ／Ｌ添加した改変ＢＧ１１培地を４０ｍＬ分注し、クロレラ・ソロキニアナNIES-2173がＡ７５０：０．０２５になり、各株がＡ６００：０．００５、Ａ６００：０．０２５、Ａ６００：０．０４などになるように調整し、グルコースを５ｇ／Ｌ添加した改変ＢＧ１１培地に植菌し、３０℃、１２５ｒｐｍ、ＰＰＦＤ、１３３μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、明暗期２４ｈ／０ｈ、で４日間本培養を行った。（ｎ＝３）。
【0041】
＜クロロフィル定量＞
１ｍＬの培養液を１．５ｍＬチューブに回収し、８，０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ．、４℃で遠心した。上清を除去した後１．５ｍＬの純メタノールを添加し、４℃，暗所で２４ｈ静置して細胞塊をメタノールに浸漬した。２４時間後、ボルテックスミキサーで攪拌して再度８，０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ、４℃で遠心した。上清をガラス製のキュベットに移し６５３ｎｍ、６６６ｎｍ及び７５０ｎｍにおける吸光度を測定した。クロロフィルａの色素量を計算式（１）ChlA(mg/L)=15.65(Abs666-Abs750)-7.34(Abs653-Abs750)により算出した。計算式（１）中、ChlAは、クロロフィルａの略号である。Abs653、Abs666、Abs750は、順に波長６５３ｎｍ、６６６ｎｍ、７５０ｎｍの吸光度である。クロロフィルｂの色素量を計算式（２）ChlB(mg/L)=27.05(Abs653-Abs750)-11.21(Abs666-Abs750)(2)により算出した。計算式（２）中、ChlBは、クロロフィルｂの略号である。
１ｍＬの培養液を１．５ｍＬチューブに回収し、８，０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ．、４℃で遠心した。上清を除去した後１．５ｍＬの純メタノールを添加し、４℃，暗所で２４ｈ静置して細胞塊をメタノールに浸漬した。２４時間後、ボルテックスミキサーで攪拌して再度８，０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ、４℃で遠心した。上清をガラス製のキュベットに移し６５３ｎｍ、６６６ｎｍ及び７５０ｎｍにおける吸光度を測定した。クロロフィルａの色素量を計算式（１）ChlA(mg/L)=15.65(Abs666-Abs750)-7.34(Abs653-Abs750)により算出した。計算式（１）中、ChlAは、クロロフィルａの略号である。Abs653、Abs666、Abs750は、順に波長６５３ｎｍ、６６６ｎｍ、７５０ｎｍの吸光度である。クロロフィルｂの色素量を計算式（２）ChlB(mg/L)=27.05(Abs653-Abs750)-11.21(Abs666-Abs750)(2)により算出した。計算式（２）中、ChlBは、クロロフィルｂの略号である。
【0042】
＜フローサイトメトリー分析＞
フローサイトメータＣｕｂｅ８を用いて細菌絶対数、細胞毎のクロロフィル蛍光を測定した。１００倍希釈したそれぞれの培養液を１ｍＬずつ調整し、測定用試料とした。前方散乱（ＦＳＣ－Ｈ）、側方散乱（ＳＳＣ－Ｈ）、クロロフィル蛍光（ＦＬ２－Ｈ）の電圧は、それぞれ、１２５．０Ｖ、１８０．０Ｖ、５２５．０Ｖ、４００．０Ｖとした。
フローサイトメータＣｕｂｅ８を用いて細菌絶対数、細胞毎のクロロフィル蛍光を測定した。１００倍希釈したそれぞれの培養液を１ｍＬずつ調整し、測定用試料とした。前方散乱（ＦＳＣ－Ｈ）、側方散乱（ＳＳＣ－Ｈ）、クロロフィル蛍光（ＦＬ２－Ｈ）の電圧は、それぞれ、１２５．０Ｖ、１８０．０Ｖ、５２５．０Ｖ、４００．０Ｖとした。
【0043】
［微細藻類増殖促進菌株のゲノム抽出］
各分離株を純粋培養し、ゲノム抽出に供した。菌体が入ったチューブを冷却遠心分離機により、１０，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離し、細胞ペレット（沈殿物）を回収した。ピペッターを用いて、上清を廃液溜めに捨てた。細胞ペレットに５６０μＬのＴＥバッファを入れ、よく攪拌して細胞を懸濁した。３０μＬの１０％ＳＤＳ並びに１０μＬのプロテイナーゼＫ溶液を添加し、よく混ぜた後、３７℃で１時間保温した。１００μＬの５ＭＮａＣｌを添加し、よく混ぜた。８０μＬのＣＴＡＢ／ＮａＣｌ溶液を添加し、よく混ぜて、６５℃で１０分間保温した。０．７ｍＬのクロロホルム／イソアミルアルコールを入れ、チューブのふたを閉めて、チューブを上下に５―６回反転させて、よく攪拌した後、冷却遠心分離機で１５，０００ｒｐｍ、５分間、４℃で遠心分離した。
各分離株を純粋培養し、ゲノム抽出に供した。菌体が入ったチューブを冷却遠心分離機により、１０，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離し、細胞ペレット（沈殿物）を回収した。ピペッターを用いて、上清を廃液溜めに捨てた。細胞ペレットに５６０μＬのＴＥバッファを入れ、よく攪拌して細胞を懸濁した。３０μＬの１０％ＳＤＳ並びに１０μＬのプロテイナーゼＫ溶液を添加し、よく混ぜた後、３７℃で１時間保温した。１００μＬの５ＭＮａＣｌを添加し、よく混ぜた。８０μＬのＣＴＡＢ／ＮａＣｌ溶液を添加し、よく混ぜて、６５℃で１０分間保温した。０．７ｍＬのクロロホルム／イソアミルアルコールを入れ、チューブのふたを閉めて、チューブを上下に５―６回反転させて、よく攪拌した後、冷却遠心分離機で１５，０００ｒｐｍ、５分間、４℃で遠心分離した。
【0044】
０．５～０．６ｍＬの上層の液を取り、新しい１．５ｍＬマイクロチューブに移した。移した液量と等量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを加え、よく攪拌した後、冷却遠心分離機で１５，０００ｒｐｍ、５分間、４℃で遠心分離した。上清を０．５～０．６ｍＬ取り、新しい１．５ｍＬマイクロチューブに移した。移した溶液の０．６倍体積のイソプロパノールを加え、ＤＮＡを沈殿させた後、冷却遠心分離機で１５，０００ｒｐｍ、５分間、４℃で遠心分離した。ピペッティングで静かに上清を捨て、１ｍＬの７０％エタノールを加え、再度冷却遠心分離機で１５，０００ｒｐｍ、５分間、４℃で遠心分離した。上清を捨て、チューブのふたを開けた状態で、１０分程度、乾燥させた。沈殿を１００μＬのＴＥバッファに溶解させた。
【0045】
２７Ｆプライマー、１４９２Ｒプライマー及びTaKaRa LA Taqポリメラーゼ等を含むＰＣＲ反応液を１９μＬ、沈殿をＴＥバッファに溶解させたＤＮＡサンプル１μＬを添加した。図３は、ＰＣＲ反応に使用したプライマーを示す。図３中には、ＰＣＲ反応に使用したプライマーの配列番号、プライマー名及びオリゴヌクレオチド配列を示す。図３の上から１行目に２７Ｆプライマーのオリゴヌクレオチド配列を示し、図３の上から２行目に１４９２Ｒプライマーのオリゴヌクレオチド配列を示す。簡易遠心分離機でチューブをスピンダウンし、サーマルサイクラーの恒温ブロックにチューブを挿し、３０サイクルのサーマルサイクル反応を行わせた。
【0046】
［カラム精製］
ＤＮＡサンプルと等量のメンブレンバインディングソリューションを添加した。ＳＶミニカラムを回収チューブに挿入した（カラムアセンブリともいう）。溶液を全量ＳＶミニカラムに移し、室温で１分程度放置した。このカラムアセンブリを冷却遠心分離機にセットし、１６，０００×ｇで１分間、４℃で遠心分離した。ＳＶミニカラムに５００μＬのメンブレンウォッシュソリューションを入れ、１６，０００×ｇで１分間、４℃で遠心分離した。
ＤＮＡサンプルと等量のメンブレンバインディングソリューションを添加した。ＳＶミニカラムを回収チューブに挿入した（カラムアセンブリともいう）。溶液を全量ＳＶミニカラムに移し、室温で１分程度放置した。このカラムアセンブリを冷却遠心分離機にセットし、１６，０００×ｇで１分間、４℃で遠心分離した。ＳＶミニカラムに５００μＬのメンブレンウォッシュソリューションを入れ、１６，０００×ｇで１分間、４℃で遠心分離した。
【0047】
回収チューブの液を廃液溜めに捨て、再びＳＶミニカラムを回収チューブに挿入した。 ＳＶミニカラムに５００μＬのメンブレンウォッシュソリューションを入れ、１６，０００×ｇで５分間、４℃で遠心分離した。回収チューブの液を廃液溜めに捨て、再びＳＶミニカラムを回収チューブに挿入したカラムアセンブリを１６，０００×ｇで１分間、４℃で遠心分離した。ＳＶミニカラムを新しい１．５ｍＬマイクロチューブに挿入した。滅菌水５０μＬをＳＶミニカラムに入れ、１分程度、室温で放置した後、１６，０００×ｇで１分間、４℃で遠心分離し、ＤＮＡを溶出させた。
【0048】
［サイクルシーケンス］
２７Ｆプライマー等を含むシーケンス反応液を作成し、これを８μＬとサンプルを２μＬ混合し、サーマルサイクラー（初期変性：９６℃１分間、［変性:９６℃１０秒、アニーリング：５０℃５秒、伸長：６０℃４秒］×２９回、最終伸長:４℃で時間無制限）で反応させた。シーケンス反応液には、図３中に示す配列番号１から配列番号８までのプライマーのいずれかを用いた。サーマルサイクラーの後に、１２５ｍＭのＥＤＴＡを５μＬ、９９．５％ＥｔＯＨを６０μＬ加え、転倒混合しアルミホイルで包んで１５分間放置した。その後、３７５０×ｇ、３０分間にわたって遠心分離し、反転したまま、１８５×ｇで１０秒間にわたって遠心分離した。
２７Ｆプライマー等を含むシーケンス反応液を作成し、これを８μＬとサンプルを２μＬ混合し、サーマルサイクラー（初期変性：９６℃１分間、［変性:９６℃１０秒、アニーリング：５０℃５秒、伸長：６０℃４秒］×２９回、最終伸長:４℃で時間無制限）で反応させた。シーケンス反応液には、図３中に示す配列番号１から配列番号８までのプライマーのいずれかを用いた。サーマルサイクラーの後に、１２５ｍＭのＥＤＴＡを５μＬ、９９．５％ＥｔＯＨを６０μＬ加え、転倒混合しアルミホイルで包んで１５分間放置した。その後、３７５０×ｇ、３０分間にわたって遠心分離し、反転したまま、１８５×ｇで１０秒間にわたって遠心分離した。
【0049】
７０％ＥｔＯＨを６０μＬ加え、３７５０×ｇで５分間にわたって遠心分離し、さらに１８５×ｇで１０秒間にわたって遠心分離した。ＨｉＤｉホルムアミド１５μＬを加え、２分間ボルテックスして、９５℃で２分間、４℃で２分間ヒートショックを与えて、キャピラリーシークエンスを実行した。ＤＮＡシーケンスした生データをＧＥＮＥＴＹＸのＡＴＧＣソフトウェアでＡＴＧＣデータ解析し、解析されたデータはＮＣＢＩでＢＬＡＳＴ解析を行った。それから、ＧＥＮＥＴＹＸソフトウェアで、ＮＣＢＩのデータベースを用いて近縁株のＦＡＳＴＡデータを取得し、各分離株の系統樹を作成した。
【0050】
［共培養評価系による微細藻類増殖促進細菌の選抜］
図４及び図５は、共培養６日目においてクロロフィル蛍光強度の倍率が１．０を超えた分離株を示す。図４及び図５の左から５列目には、PCC7942のみで培養した場合と比較したクロロフィル蛍光強度の倍率を示す。PCC7942のみで培養した場合のクロロフィル蛍光強度の平均、標準偏差、倍率及び標準偏差を図５の下から２行目（図５中のPCC7942A）及び１行目（図５中のPCC7942B）に示す。
図４及び図５は、共培養６日目においてクロロフィル蛍光強度の倍率が１．０を超えた分離株を示す。図４及び図５の左から５列目には、PCC7942のみで培養した場合と比較したクロロフィル蛍光強度の倍率を示す。PCC7942のみで培養した場合のクロロフィル蛍光強度の平均、標準偏差、倍率及び標準偏差を図５の下から２行目（図５中のPCC7942A）及び１行目（図５中のPCC7942B）に示す。
【0051】
図４及び図５の右から１列目の倍率の比較基準において「ａ」を付したものは、ネガティブコントロールであることを示す。図４及び図５の右から１列目の倍率の比較基準において「ｂ」を付したものでは、図５中のPCC7942Aと比較したクロロフィル蛍光強度の倍率を図４及び図５中の左から５列目の倍率の欄において示す。図４及び図５の右から１列目の倍率の比較基準において「ｃ」を付したものでは、図５中のPCC7942Bと比較したクロロフィル蛍光強度の倍率を図４及び図５中の左から５列目の倍率の欄において示す。
【0052】
ＦＣＵからの分離株１４４株のうち、３４株のクロロフィル蛍光強度が、１．０倍以上の倍率となった。図４及び図５には、この３４株を倍率が高い順に示す。図４の上から１行目の分離株「AF2108」は、７．５倍の最も高い倍率を示した。
【0053】
以下、クロロフィル蛍光強度の倍率が３．０を超えた分離株（AF2108株、GA1226株、AF2111株、OR151株）を選択し、フラスコによる共培養を用いて、PCC7942増殖促進効果及びNIES-2173増殖促進効果をそれぞれ確認した。
【0054】
［AF2108分離株］
図６（ａ）及び図６（ｂ）は、AF2108分離株とPCC7942と共培養後のクロロフィルａの測定結果を示す。図６（ａ）の左から１列目及び２列目は、PCC7942の単独培養中のクロロフィルａ濃度の平均値と標準偏差とを２４時間ごとに示す。図６の左から１列目及び２列目の例では、PCC7942の単独培養開始時の波長７３０ｎｍの吸光度が０．０５になるようにPCC7942の分量を調整した。
図６（ａ）及び図６（ｂ）は、AF2108分離株とPCC7942と共培養後のクロロフィルａの測定結果を示す。図６（ａ）の左から１列目及び２列目は、PCC7942の単独培養中のクロロフィルａ濃度の平均値と標準偏差とを２４時間ごとに示す。図６の左から１列目及び２列目の例では、PCC7942の単独培養開始時の波長７３０ｎｍの吸光度が０．０５になるようにPCC7942の分量を調整した。
【0055】
図６の左から３列目及び４列目には、PCC7942及びAF2108分離株の共培養後のクロロフィルａ濃度の平均値と標準偏差とを２４時間ごとに示す。図６の左から３列目及び４列目の例では、PCC7942とAF2108分離株とを混合した共培養培地において共培養開始時のPCC7942成分の波長７３０ｎｍの吸光度が０．０５となるようにPCC7942の分量を調整した。
【0056】
この共培養培地において共培養開始時のAF2108分離株成分の波長６００ｎｍの吸光度が ０．０５になるようにAF2108分離株の分量を調整した。PCC7942の１６８時間の単独培養後にクロロフィルａが９．０７９μｇ／ｍＬまで増加した。一方、PCC7942及びAF2108分離株の１６８時間の共培養後にクロロフィルａが６４．２４９μｇ／ｍＬまで増加した。
【0057】
図６（ｂ）は、PCC7942及びAF2108分離株の共培養中のクロロフィルａ濃度を、PCC7942単独培養中のクロロフィルａ濃度で除した倍率を示す。図６（ｂ）の上から２行目に示すように、PCC7942及びAF2108分離株の共培養中のクロロフィルａの濃度をPCC7942の単独培養と比較した倍率は、４８時間で最大の１５．６５±０．７２倍となり、１６８時間で最小の７．０８±４．９０倍になった。
【0058】
図７は、PCC7942の細胞数、細胞の大きさ及びクロロフィル蛍光強度をフローサイトメトリーにより測定した結果を示す。図７の上から１行目にPCC7942の単独培養を１６８時間継続した時点でのPCC7942の細胞数等を示す。図７の上から２行目にPCC7942とAF2108分離株との共培養を１６８時間継続した時点でのPCC7942の細胞数等を示す。細胞の大きさは、フローサイトメトリーの前方散乱（ＦＳＣ－Ｈ）により測定した。PCC7942及びAF2108分離株の１６８時間の共培養後の細胞の大きさ及びクロロフィル蛍光強度は、PCC7942単独での培養と比較して、それぞれ２．４０±０．１２倍及び３．５３±０．４１倍になった。
【0059】
図８（ａ）から図８（ｇ）は、PCC7942及びAF2108分離株のフラスコによる共培養の様子を時系列順に示す。PCC7942及びAF2108分離株の２４時間以降の共培養中の試料（左から１番目から３番目）は、PCC7942の単独培養）中の試料（左から４番目から６番目よりはるかに緑色が濃いことが確認された。
【0060】
図９（ａ）及び図９（ｂ）は、AF2108分離株とNIES-2173との共培養中のクロロフィルａ及びクロロフィルｂの濃度の合計（以下、クロロフィルａ＋ｂ濃度ともいう）の測定結果を示す。図９（ａ）の左から１列目及び２列目は、クロレラNIES-2173の単独培養中のクロロフィルａ＋ｂ濃度の平均値と標準偏差とを２４時間ごとに示す。図９の左から１列目及び２列目の例では、NIES-2173の単独培養開始時の波長７５０ｎｍの吸光度が０．０２５になるようにNIES-2173の分量を調整した。
【0061】
図９の左から３列目及び４列目には、NIES-2173及びAF2108分離株の共培養中のクロロフィルａ＋ｂ濃度の平均値と標準偏差とを２４時間ごとに示す。図９の左から３列目及び４列目の例では、NIES-2173とAF2108分離株とを混合した共培養培地において共培養開始時のAF2108成分の波長６００ｎｍの吸光度が０．０４となるようにAF2108の分量を調整した。
【0062】
NIES-2173の１２０時間の単独培養後にクロロフィルａ＋ｂ濃度が１０．２２μｇ／ｍＬまで増加した。一方、NIES-2173及びAF2108分離株の１２０時間の共培養後にクロロフィルａ＋ｂ濃度が１７．６０μｇ／ｍＬまで増加した。
【0063】
図９（ｂ）は、NIES-2173及びAF2108分離株の共培養中のクロロフィルａ＋ｂ濃度を、NIES-2173単独培養中のクロロフィルａ＋ｂ濃度で除した倍率を示す。図９（ｂ）に示すように、NIES-2173及びAF2108分離株の共培養中のクロロフィルａ＋ｂの濃度をNIES-2173の単独培養中のものと比較した倍率は、９６時間で最大の２．０９±０．０８倍となり、２４時間で最小の１．２５±０．０９倍になった。したがって、AF2108分離株がNIES-2173の増殖を促進することが確認された。
【0064】
図１０は、NIES-2173の細胞数、細胞の大きさ及びクロロフィル蛍光強度をフローサイトメトリーにより測定した結果を示す。図１０の上から１行目にNIES-2173の単独培養後のNIES-2173の細胞数等を示す。図１０の上から２行目にNIES-2173とAF2108分離株との共培養後のNIES-2173の細胞数等を示す。細胞の大きさは、フローサイトメトリーの前方散乱（ＦＳＣ－Ｈ）により測定した。NIES-2173及びAF2108分離株の共培養後の細胞の大きさ及びクロロフィル蛍光強度は、NIES-2173単独での培養と比較して、それぞれ０．８±０．１倍及び１．０±０．１倍になった。
【0065】
図１１は、Rhodococcus属の系統樹を示す。Pseudonocardia dioxanivorans CP1190基準株を外群とした。図１１中の数値は、系統樹の形の信頼性を示すブートストラップ値である。ブートストラップ値は５０以上の値のもののみを示す。スケールバーは、アミノ酸の置換数の尺度を示す。この系統樹からみると、AF2108株は、ロドコッカス・セラスティ（Rhodococcus cerastii）と最も近い。AF2108株は、ロドコッカス・セラスティと相同性１ ００％で一致し、ロドコッカス・セラスティであると同定された（受託番号：NITE P-03678）。
【0066】
［AF2111分離株］
図１２（ａ）及び図１２（ｂ）は、PCC7942及びAF2111分離株の共培養中のクロロフィルａの測定結果を示す。図１２（ａ）の左から１列目及び２列目には、PCC7942の単独培養中のクロロフィルａ濃度の平均値と標準偏差とを２４時間ごとに示す。図１２中に示すPCC7942の単独培養の例では、PCC7942の単独培養開始時の波長７３０ｎｍの吸光度が０．０５になるようにPCC7942の分量を調整した。
図１２（ａ）及び図１２（ｂ）は、PCC7942及びAF2111分離株の共培養中のクロロフィルａの測定結果を示す。図１２（ａ）の左から１列目及び２列目には、PCC7942の単独培養中のクロロフィルａ濃度の平均値と標準偏差とを２４時間ごとに示す。図１２中に示すPCC7942の単独培養の例では、PCC7942の単独培養開始時の波長７３０ｎｍの吸光度が０．０５になるようにPCC7942の分量を調整した。
【0067】
図１２の左から３列目及び４列目は、PCC7942及びAF2111分離株の共培養中のクロロフィルａ濃度の平均値と標準偏差とを２４時間ごとに示す。図１２中のPCC7942及びAF2111分離株の共培養の例では、PCC7942とAF2111分離株とを混合した共培養培地において、PCC7942成分の共培養開始時の波長７３０ｎｍの吸光度が０．０５となるようにPCC7942の分量を調整し、PCC7942とAF2111分離株とを混合した共培養培地において、AF2108分離株成分の共培養開始時の波長６００ｎｍの吸光度が０．０１になるようにAF2108分離株の分量を調整した。
【0068】
図１２（ａ）の下から１行目に示すように、PCC7942の単独培養では、１６８時間の培養によりクロロフィルａが９．０７９μｇ／ｍＬまで増加した。一方、PCC7942及びAF2111分離株の共培養では、１６８時間の培養によりクロロフィルａが３３．６９９μｇ／ｍ Ｌまで増加した。
【0069】
図１２（ｂ）は、PCC7942及びAF2111分離株の共培養中のクロロフィルａ濃度を、PCC7942の単独培養中のクロロフィルａ濃度で除した倍率を示す。この倍率は、２４時間で最大の６．９２±０．４８倍となり、１４４時間で最小の３．２４±０．９９倍になった。
【0070】
図１３は、PCC7942の細胞数、細胞の大きさ及びクロロフィル蛍光強度をフローサイトメトリーにより測定した結果を示す。図１３の上から１行目にPCC7942の単独培養を１６８時間継続した時点でのPCC7942の細胞数等を示す。図１３の上から２行目にPCC794とAF2111分離株との共培養を１６８時間継続した時点でのPCC7942の細胞数等を示す。図１３の上から２行目に示すように、PCC7942及びAF2111分離株の共培養後の細胞の大きさ及びクロロフィル蛍光強度は、PCC7942の単独培養後の細胞の大きさ等と比較して、それぞれ２．１９±０．１１倍及び１．９８±０．１８倍になった。
【0071】
図１４（ａ）から図１４（ｇ）は、PCC7942及びAF2111分離株のフラスコによる共培養の様子を時系列順に示す。PCC7942及びAF2111分離株の２４時間以降の共培養中の試料（左から１番目から３番目）は、PCC7942の単独培養中の試料（左から４番目から６番目）よりはるかに緑色が濃いことが確認された。
【0072】
図１５（ａ）及び図１５（ｂ）は、AF2111分離株とNIES-2173との共培養中のクロロフィルａ＋ｂ濃度の測定結果を示す。図１５（ａ）の左から１列目及び２列目は、クロレラ NIES-2173の単独培養中のクロロフィルａ＋ｂ濃度の平均値と標準偏差とを２４時間ごとに示し、８４時間後のクロロフィルａ＋ｂ濃度の平均値等も示した。図１５の左から１列目及び２列目の例では、NIES-2173の単独培養開始時の波長７５０ｎｍの吸光度が０．０２５になるようにNIES-2173の分量を調整した。
【0073】
図１５の左から３列目及び４列目には、NIES-2173及びAF2111分離株の共培養中のクロロフィルａ＋ｂ濃度の平均値と標準偏差とを示した。図１５の左から３列目及び４列目の例では、NIES-2173とAF2111分離株とを混合した共培養培地において共培養開始時のAF2111成分の波長６００ｎｍの吸光度が０．００５となるようにAF2111の分量を調整した。
【0074】
NIES-2173の９６時間の単独培養後にクロロフィルａ＋ｂ濃度が８．４４μｇ／ｍＬまで増加した。一方、NIES-2173及びAF2111分離株の９６時間の共培養後にクロロフィルａ＋ｂ濃度が８．７７μｇ／ｍＬまで増加した。
【0075】
図１５（ｂ）は、NIES-2173及びAF2111分離株の共培養中のクロロフィルａ＋ｂ濃度を、NIES-2173単独培養中のクロロフィルａ＋ｂ濃度で除した倍率を示す。図１５（ｂ）に示すように、NIES-2173及びAF2111分離株の共培養中のクロロフィルａ＋ｂの濃度をNIES-2173の単独培養中のものと比較した倍率は、０時間の１．８６±０．１５倍を除外すると、９６時間で最大の１．０４±０．０６倍となり、４８時間で最小の０．８８±０．１０倍になった。
【0076】
図１６は、NIES-2173の細胞数、細胞の大きさ及びクロロフィル蛍光強度をフローサイトメトリーにより測定した結果を示す。図１６の上から１行目にNIES-2173の単独培養後のNIES-2173の細胞数等を示す。図１６の上から２行目にNIES-2173とAF2111分離株との共培養後のNIES-2173の細胞数等を示す。細胞の大きさは、フローサイトメトリーの前方散乱（ＦＳＣ－Ｈ）により測定した。NIES-2173及びAF2111分離株の共培養後の細胞の大きさ及びクロロフィル蛍光強度は、NIES-2173単独での培養と比較して、それぞれ０．９±０．０倍及び０．９±０．２倍になった。
【0077】
図１７は、Xanthobarcter属の系統樹を示す。Blastochloris gulmargensis JA248基準株を外群とした。この系統樹からみると、AF2111株は、キサントバクター・フラバス（Xanthobacter flavus）と最も近い。AF2111株は、キサントバクター・フラバスと相同性１００％で一致し、キサントバクター・フラバスであると同定された（受託番号：NITE P-03679）。したがって、キサントバクター・フラバスが微細藻類の増殖促進効果をもたらすことが示された。
【0078】
［GA1226分離株］
図１８（ａ）及び図１８（ｂ）は、PCC7942及びGA1226分離株の共培養中のクロロフィルａの測定結果を示す。図１８（ａ）の左から１列目及び２列目は、PCC7942の単独培養中のクロロフィルａ濃度の平均値と標準偏差とを２４時間ごとに示す。PCC7942の単独培養では、PCC7942の培養開始時の波長７３０ｎｍの吸光度が０．０５になるように調整した。
図１８（ａ）及び図１８（ｂ）は、PCC7942及びGA1226分離株の共培養中のクロロフィルａの測定結果を示す。図１８（ａ）の左から１列目及び２列目は、PCC7942の単独培養中のクロロフィルａ濃度の平均値と標準偏差とを２４時間ごとに示す。PCC7942の単独培養では、PCC7942の培養開始時の波長７３０ｎｍの吸光度が０．０５になるように調整した。
【0079】
図１８の左から３列目及び４列目は、PCC7942及びGA1226分離株の共培養中のクロロフィルａ濃度の平均値と標準偏差とを２４時間ごとに示す。PCC7942及びGA1226分離株の共培養では、PCC7942とGA1226分離株との混合した共培養培地において、PCC7942成分の共培養開始時の波長７３０ｎｍの吸光度が０．０５となるようにPCC7942の分量を調整した。この共培養培地においてGA1226分離株成分の共培養開始時の波長６００ｎｍの吸光度が０．０５になるようにGA1226分離株の分量を調整した。図１８（ａ）の下から１行目に示すように、PCC7942の単独培養では、１６８時間の培養後にクロロフィルａが９．０７９μｇ／ｍＬまで増加した。一方、PCC7942及びGA1226分離株の共培養では、１６８時間の培養後にクロロフィルａが２９．７３μｇ／ｍＬまで増加した。
【0080】
図１８（ｂ）は、PCC7942及びGA1226分離株の共培養後のクロロフィルａ濃度を、PCC7942単独での培養後のクロロフィルａ濃度で除した倍率を示す。この倍率は、最大で３．３１±１．８３倍（１２０時間）となり、最小でも１．５６±０．０６倍（２４時間）になった。
【0081】
図１９は、PCC7942の細胞数、細胞の大きさ及びクロロフィル蛍光強度をフローサイトメトリーにより測定した結果を示す。図１９の上から１行目にPCC7942の単独培養を１６８時間継続した時点でのPCC7942の細胞数等を示す。図１９の上から２行目にPCC794とGA1226分離株との共培養を１６８時間継続した時点でのPCC7942の細胞数等を示す。PCC7942及びGA1226分離株の共培養後の細胞の大きさ及びクロロフィル蛍光強度は、PCC7942単独培養後の細胞の大きさ等と比較して、それぞれ１．２５±０．１６倍及び１．４９±０倍になった。
【0082】
図２０（ａ）から図２０（ｇ）は、PCC7942及びGA1226分離株のフラスコによる共培養の様子を時系列順に示す。PCC7942及びGA1226分離株の４８時間以降の共培養中の試料（左から１番目から３番目）は、PCC7942の単独培養中の試料（左から４番目から６番目）よりはるかに緑色が濃いことが確認された。
【0083】
図２１（ａ）及び図２１（ｂ）は、GA1226分離株とNIES-2173との共培養中のクロロフィルａ＋ｂ濃度の測定結果を示す。図２１（ａ）の左から１列目及び２列目は、クロレラNIES-2173の単独培養中のクロロフィルａ＋ｂ濃度の平均値と標準偏差とを２４時間ごとに示し、８４時間後のクロロフィルａ＋ｂ濃度の平均値等も示した。図２１の左から１列目及び２列目の例では、NIES-2173の単独培養開始時の波長７５０ｎｍの吸光度が０．０２５になるようにNIES-2173の分量を調整した。
【0084】
図２１の左から３列目及び４列目には、NIES-2173及びGA1226分離株の共培養中のクロロフィルａ＋ｂ濃度の平均値と標準偏差とを示した。図２１の左から３列目及び４列目の例では、NIES-2173とGA1226分離株とを混合した共培養培地において共培養開始時のGA1226成分の波長６００ｎｍの吸光度が０．０２５となるようにGA1226の分量を調整した。NIES-2173の９６時間の単独培養後にクロロフィルａ＋ｂ濃度が８．４４μｇ／ｍＬまで増加した。一方、NIES-2173及びGA1226分離株の９６時間の共培養後にクロロフィルａ＋ｂ濃度が８．０５μｇ／ｍＬまで増加した。
【0085】
図２１（ｂ）は、NIES-2173及びGA1226分離株の共培養中のクロロフィルａ＋ｂ濃度を、NIES-2173単独培養中のクロロフィルａ＋ｂ濃度で除した倍率を示す。図２１（ｂ）に示すように、NIES-2173及びGA1226分離株の共培養中のクロロフィルａ＋ｂの濃度をNIES-2173の単独培養中のものと比較した倍率は、０時間の１．６０±０．２８倍を除外すると、８４時間で最大の０．９７±０．００倍となり、７２時間で最小の０．９４±０．１１倍になった。
【0086】
図２２は、NIES-2173の細胞数、細胞の大きさ及びクロロフィル蛍光強度をフローサイトメトリーにより測定した結果を示す。図２２の上から１行目にNIES-2173の単独培養後のNIES-2173の細胞数等を示す。図２１の上から２行目にNIES-2173とGA1226分離株との共培養後のNIES-2173の細胞数等を示す。細胞の大きさは、フローサイトメトリーの前方散乱（ＦＳＣ－Ｈ）により測定した。NIES-2173及びGA1226分離株の共培養後の細胞の大きさ及びクロロフィル蛍光強度は、NIES-2173単独での培養と比較して、それぞれ０．９±０．０倍及び０．７±０．０倍になった。
【0087】
図２３は、Ancylobacter属の系統樹を示す。Blastochloris gulmargensis JA248T基準株を外群とした。この系統樹からみると、GA1226分離株は、アンサイロバクター・ルドゲンシス（Ancylobacter rudongensis）に最も近い。GA1226分離株は、アンサイロバクター・ルドゲンシスと相同性９９．４２％で一致し、アンサイロバクター・ルドゲンシスであると同定された（受託番号：NITE P-03779）。したがって、アンサイロバクター・ルドゲンシスが微細藻類の増殖を促進する効果をもたらすことが示された。
【0088】
［OR151分離株］
図２４（ａ）及び図２４（ｂ）は、PCC7942及びOR151分離株の共培養中のクロロフィルａの測定結果を示す。図２４（ａ）の左から１列目及び２列目は、PCC7942の単独培養中のクロロフィルａ濃度の平均値と標準偏差とを２４時間ごとに示す。PCC7942の単独培養では、PCC7942の培養開始時の波長７３０ｎｍの吸光度が０．０５になるようにPCC7942の分量を調整した。
図２４（ａ）及び図２４（ｂ）は、PCC7942及びOR151分離株の共培養中のクロロフィルａの測定結果を示す。図２４（ａ）の左から１列目及び２列目は、PCC7942の単独培養中のクロロフィルａ濃度の平均値と標準偏差とを２４時間ごとに示す。PCC7942の単独培養では、PCC7942の培養開始時の波長７３０ｎｍの吸光度が０．０５になるようにPCC7942の分量を調整した。
【0089】
図２４の左から１列目及び２列目は、PCC7942及びOR151分離株の共培養中のクロロフィルａ濃度の平均値と標準偏差とを２４時間ごとに示す。PCC7942及びOR151分離株の共培養では、PCC7942とOR151分離株との混合した共培養培地において、PCC7942成分の培養開始時の波長７３０ｎｍの吸光度が０．０５となるようにPCC7942の分量を調整した。この共培養培地において、OR151分離株成分の培養開始時の波長６００ｎｍの吸光度が０．０５になるようにOR151分離株の分量を調整した。図２４（ａ）の下から１行目に示すように、PCC7942単独培養では、１６８時間の培養後にクロロフィルａが７．２１μｇ／ｍＬまで増加したのに対し、PCC7942及びOR151分離株の共培養では、１６８時間の培養後にクロロフィルａが８．９５８μｇ／ｍＬまで増加した。
【0090】
図２４（ｂ）は、PCC7942及びOR151分離株の共培養中のクロロフィルａの濃度を、PCC7942の単独培養中のクロロフィルａの濃度で除した倍率を示す。この倍率は、最大で２．３６±０．１４倍（４８時間）、２．３６±０．０８倍（７２時間）、となり、最小で１．２４±０．０２倍（１６８時間）になった。
【0091】
図２５は、PCC7942の細胞数、細胞の大きさ及びクロロフィル蛍光強度をフローサイトメトリーにより測定した結果を示す。図２５の上から１行目にPCC7942の単独培養を１６８時間継続した時点でのPCC7942の細胞数等を示す。図２５の上から２行目にPCC794とOR151分離株との共培養を１６８時間継続した時点でのPCC7942の細胞数等を示す。PCC7942及びOR151分離株の１６８時間の共培養後の細胞の大きさ及びクロロフィル蛍光強度は、PCC 7942の単独培養後の細胞の大きさ等と比較して、それぞれ２．０４±０．０９倍及び２．４４±０倍になった。
【0092】
図２６（ａ）から図２６（ｇ）は、PCC7942及びOR151分離株のフラスコによる共培養の様子を時系列順に示す。PCC7942及びOR151分離株の２４時間以降の共培養中の試料（左から１番目から３番目）は、PCC7942の単独培養中の試料（左から４番目から６番目）よりはるかに緑色が濃いことが確認された。
【0093】
図２７（ａ）及び図２７（ｂ）はOR151分離株とNIES-2173との共培養中のクロロフィル ａ＋ｂ濃度の測定結果を示す。図２７（ａ）の左から１列目及び２列目は、クロレラNIES-2173の単独培養中のクロロフィルａ＋ｂ濃度の平均値と標準偏差とを２４時間ごとに示し、８４時間後のクロロフィルａ＋ｂ濃度の平均値等も示した。図２７の左から１列目及び２列目の例では、NIES-2173の単独培養開始時の波長７５０ｎｍの吸光度が０．０２５になるようにNIES-2173の分量を調整した。
【0094】
図２７左から３列目及び４列目には、NIES-2173及び、OR151分離株の共培養中のクロロフィルａ＋ｂ濃度の平均値と標準偏差とを示した。図２１の左から３列目及び４列目の例では、NIES-2173とOR151分離株とを混合した共培養培地において共培養開始時のOR151成分の波長６００ｎｍの吸光度が０．０４となるようにOR151の分量を調整した。NIES-2173の９６時間の単独培養後にクロロフィルａ＋ｂ濃度が８．４４μｇ／ｍＬまで増加した。一方、NIES-2173及びOR151分離株の９６時間の共培養後にクロロフィルａ＋ｂ濃度が１３．０６μｇ／ｍＬまで増加した。
【0095】
図２７（ｂ）は、NIES-2173及びOR151分離株の共培養中のクロロフィルａ＋ｂ濃度を、 NIES-2173単独培養中のクロロフィルａ＋ｂ濃度で除した倍率を示す。図２７（ｂ）に示すように、NIES-2173及びOR151分離株の共培養中のクロロフィルａ＋ｂの濃度をNIES-2173の単独培養と比較した倍率は、９６時間で最大の１．５５±０．０７倍となり、０時間の１．３１±０．３１倍を除くと、４８時間で最小の１．１０±０．０６倍になった。したがって、OR151分離株がNIES-2173の増殖促進効果をもたらすことが分かった。
【0096】
図２８は、NIES-2173の細胞数、細胞の大きさ及びクロロフィル蛍光強度をフローサイトメトリーにより測定した結果を示す。図２８の上から１行目にNIES-2173の単独培養後のNIES-2173の細胞数等を示す。図２８の上から２行目にNIES-2173とOR151分離株との共培養後のNIES-2173の細胞数等を示す。細胞の大きさは、フローサイトメトリーの前方散乱（ＦＳＣ－Ｈ）により測定した。NIES-2173及びOR151分離株の共培養後の細胞の大きさ及びクロロフィル蛍光強度は、NIES-2173単独での培養と比較して、それぞれ１．０±０．１倍及び０．８±０．１倍になった。
【0097】
図２９は、Shewanella属の系統樹を示す。Psychromonas antarctica star-1基準株を外群とした。この系統樹からみると、OR151分離株は、シェワネラ・オニデンシス（Shewanella oneidensis）という種と比較的近い。しかしながら、OR151分離株とシェワネラ・オニデンシスとの相同性は、OR151分離株とシェワネラ・プトレファシエンス（Shewanella putrefaciens）との相同性、又は、OR151分離株とシェワネラ・プロファンダ（Shewanella profunda）との相同性より低い。OR151分離株は、シェワネラ属に分類される微生物であることがわかっているが、その種名は特定されていない（受託番号：NITE P-03682）。 OR151分離株は、したがって、シェワネラ属の微生物が微細藻類の増殖を促進する効果をもたらすことが示された。
【0098】
［微細藻類増殖促進微生物の分離と培養方法］
ＪＣＭ５２０培地を用いて、微細藻類増殖促進効果を有する微生物を分離した。ＪＣＭ５２０培地の成分を図３０に示す。図３０に示した各培地成分に加えて２％になるように寒天を添加し、１２１℃で２０分オートクレーブを実施することにより、ＪＣＭ５２０寒天培地を作製した。発酵済のＦＣＵを分離源とし、分離源のＦＣＵを１０倍から１０５倍の範囲で希釈した液を作り、各シャーレに固まったＪＣＭ５２０培地に希釈したＦＣＵを１００μＬ播き、コンラージ棒で植菌し、ふたをし、好気条件、室温（２４℃）、１１５－１２０μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、２４時間のうち１２時間だけ光を照射する環境においてコロニー形成まで培養した。形成されたコロニーをディスポループで、ピックアップし、分離に使った培地と同様な培地に数回植え継ぎして、単独のコロニーを得た。
ＪＣＭ５２０培地を用いて、微細藻類増殖促進効果を有する微生物を分離した。ＪＣＭ５２０培地の成分を図３０に示す。図３０に示した各培地成分に加えて２％になるように寒天を添加し、１２１℃で２０分オートクレーブを実施することにより、ＪＣＭ５２０寒天培地を作製した。発酵済のＦＣＵを分離源とし、分離源のＦＣＵを１０倍から１０５倍の範囲で希釈した液を作り、各シャーレに固まったＪＣＭ５２０培地に希釈したＦＣＵを１００μＬ播き、コンラージ棒で植菌し、ふたをし、好気条件、室温（２４℃）、１１５－１２０μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、２４時間のうち１２時間だけ光を照射する環境においてコロニー形成まで培養した。形成されたコロニーをディスポループで、ピックアップし、分離に使った培地と同様な培地に数回植え継ぎして、単独のコロニーを得た。
【0099】
［ハイスループットな共培養評価系による微細藻類増殖促進細菌のスクリーニングの概要］
（１）ユーグレナ藻
ユーグレナ藻のモデル生物であるEuglena gracilis NIES-48（以下、単に「NIES-48」ともいう）を微細藻類増殖促進効果を評価するために用いた。NIES-48の単独培養の場合、前培養として、改変ＣＭ培地を用いて７日間で２５℃、１００ｒｐｍ、光量子束密度１５０μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、２４時間連続光照射でフラスコ培養を行った。光量子束密度は、光の強さを表す。
（１）ユーグレナ藻
ユーグレナ藻のモデル生物であるEuglena gracilis NIES-48（以下、単に「NIES-48」ともいう）を微細藻類増殖促進効果を評価するために用いた。NIES-48の単独培養の場合、前培養として、改変ＣＭ培地を用いて７日間で２５℃、１００ｒｐｍ、光量子束密度１５０μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、２４時間連続光照射でフラスコ培養を行った。光量子束密度は、光の強さを表す。
【0100】
NIES-48に分離株を混合することなく改変ＣＭ培地（組成は図３１）に植菌した。改変ＣＭ培地の組成を図３１に示す。NIES-48を改変ＣＭ培地に植菌した後、２５℃、１００ｒｐｍ、光量子束密度１５０μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、２４時間連続光照射で７日間本培養を行った。２４時間ごとにクロロフィルａ濃度（μｇ／ｍＬ）とクロロフィルｂ濃度（μｇ／ｍＬ）を測定した。
【0101】
ＦＣＵから分離された分離株とNIES-48とを共培養する場合、共培養のための前培養として、１００ｍＬフラスコを用いて、改変ＣＭ培地４０ｍＬに２ｍＬの菌株グリセロールストック液を植菌し、３０℃、１６８ｒｐｍ、で２日間培養した。本培養時、１００ｍＬのフラスコに共培養培地を４０ｍＬ分注し、NIES-48の波長７３０ｎｍの光の吸光度A730が分離株との混合後に０．０５になるようにNIES-48の分量を調整し、ＦＣＵから分離されたそれぞれの分離株の波長６００ｎｍの光の吸光度A600がNIES-48との混合後に０．０１又は０．０５等になるようにそれぞれの分離株の分量を調整した。
【0102】
NIES-48と分離株とを混合した後に改変ＣＭ培地に植菌し、２５℃、１００ｒｐｍ、光量子束密度１５０μｍｏｌ／ｍ２／ｓ、２４時間連続光照射で７日間本培養を行った。２４時間ごとにクロロフィルａ濃度（ｍｇ／Ｌ）とクロロフィルｂ濃度（ｍｇ／Ｌ）を定量した。それぞれの分離株について、NIES-48と同様なクロロフィル蛍光を持たないことを確認した。このことから、それぞれの分離株はNIES-48との共培養時に、NIES-48由来のクロロフィル蛍光強度の測定結果に影響を与えないことがわかる。
【0103】
＜クロロフィル定量＞
共培養後のサンプルを１ｍＬ回収し４℃、６，０００×ｇで１０分間遠心分離した。上澄み画分を除去し、沈殿として回収した細胞を８０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）アセトン水溶液に再懸濁した。４℃で１時間静置したのち、４℃、６，０００×ｇで１０分間遠心し、上製を１．５ｍLチューブに回収して色素抽出物とした。キュベット表面での結露を防止するために、抽出物を室温に戻したのち、ガラス製キュベットに移し、６４６ｎｍ、６６３ｎｍ、７５０ｎｍにおける吸光度を測定した。なお、濁りや有色化合物の影響を補正するため、分光光度計において７５０ｎｍをゼロ点とした。
共培養後のサンプルを１ｍＬ回収し４℃、６，０００×ｇで１０分間遠心分離した。上澄み画分を除去し、沈殿として回収した細胞を８０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）アセトン水溶液に再懸濁した。４℃で１時間静置したのち、４℃、６，０００×ｇで１０分間遠心し、上製を１．５ｍLチューブに回収して色素抽出物とした。キュベット表面での結露を防止するために、抽出物を室温に戻したのち、ガラス製キュベットに移し、６４６ｎｍ、６６３ｎｍ、７５０ｎｍにおける吸光度を測定した。なお、濁りや有色化合物の影響を補正するため、分光光度計において７５０ｎｍをゼロ点とした。
【0104】
各色素量は以下の計算式に基づいて算出した。ChlAはクロロフィルAであり、ChlBはクロロフィルBである。
ChlA(mg/L)＝12.21(Abs663－Abs750)－2.81(Abs646－Abs750）
ChlB(mg/L)＝20.13(Abs646－Abs750)－5.03(Abs663－Abs750)
各波長の吸光度を測定する際には、80％（v／v）アセトン水溶液でブランクを測定してから、測定を行った。
ChlA(mg/L)＝12.21(Abs663－Abs750)－2.81(Abs646－Abs750）
ChlB(mg/L)＝20.13(Abs646－Abs750)－5.03(Abs663－Abs750)
各波長の吸光度を測定する際には、80％（v／v）アセトン水溶液でブランクを測定してから、測定を行った。
【0105】
＜フローサイトメトリー分析＞
フローサイトメータＣｕｂｅ８を用いて細胞数及び細胞ごとのクロロフィル蛍光を測定した。２０倍希釈したそれぞれの培養液を１ｍＬずつ調製し、測定用試料とした。前方散乱(ＦＳＣ―Ｈ)、側方散乱（ＳＳＣ―Ｈ）、クロロフィル蛍光（ＦＬ２－Ｈ）の電圧は、それぞれ、１２５．０Ｖ、１８０．０Ｖ、５２５．０Ｖ、３５０．０Ｖとした。
フローサイトメータＣｕｂｅ８を用いて細胞数及び細胞ごとのクロロフィル蛍光を測定した。２０倍希釈したそれぞれの培養液を１ｍＬずつ調製し、測定用試料とした。前方散乱(ＦＳＣ―Ｈ)、側方散乱（ＳＳＣ―Ｈ）、クロロフィル蛍光（ＦＬ２－Ｈ）の電圧は、それぞれ、１２５．０Ｖ、１８０．０Ｖ、５２５．０Ｖ、３５０．０Ｖとした。
【0106】
［微細藻類増殖促進菌株のゲノム抽出］
各分離株を純粋培養し、ゲノム抽出に供した。菌体が入ったチューブを冷却遠心分離機により、１０，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離し、細胞ペレット（沈殿物）を回収した。ピペッターを用いて、上清を廃液溜めに捨てた。細胞ペレットに５６０μＬのＴＥバッファを入れ、よく攪拌して細胞を懸濁した。３０μＬの１０％ＳＤＳ並びに１０μＬのプロテイナーゼＫ溶液を添加し、よく混ぜた後、３７℃で１時間保温した。１００μＬの５ＭＮａＣｌを添加し、よく混ぜた。８０μＬのＣＴＡＢ／ＮａＣｌ溶液を添加し、よく混ぜて、６５℃で１０分間保温した。０．７ｍＬのクロロホルム／イソアミルアルコールを入れ、チューブのふたを閉めて、チューブを上下に５―６回反転させて、よく攪拌した後、冷却遠心分離機で１５，０００ｒｐｍ、５分間、４℃で遠心分離した。
各分離株を純粋培養し、ゲノム抽出に供した。菌体が入ったチューブを冷却遠心分離機により、１０，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離し、細胞ペレット（沈殿物）を回収した。ピペッターを用いて、上清を廃液溜めに捨てた。細胞ペレットに５６０μＬのＴＥバッファを入れ、よく攪拌して細胞を懸濁した。３０μＬの１０％ＳＤＳ並びに１０μＬのプロテイナーゼＫ溶液を添加し、よく混ぜた後、３７℃で１時間保温した。１００μＬの５ＭＮａＣｌを添加し、よく混ぜた。８０μＬのＣＴＡＢ／ＮａＣｌ溶液を添加し、よく混ぜて、６５℃で１０分間保温した。０．７ｍＬのクロロホルム／イソアミルアルコールを入れ、チューブのふたを閉めて、チューブを上下に５―６回反転させて、よく攪拌した後、冷却遠心分離機で１５，０００ｒｐｍ、５分間、４℃で遠心分離した。
【0107】
０．５～０．６ｍＬの上層の液を取り、新しい１．５ｍＬマイクロチューブに移した。移した液量と等量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールを加え、よく攪拌した後、冷却遠心分離機で１５，０００ｒｐｍ、５分間、４℃で遠心分離した。上清を０．５～０．６ｍＬ取り、新しい１．５ｍＬマイクロチューブに移した。移した溶液の０．６倍体積のイソプロパノールを加え、ＤＮＡを沈殿させた後、冷却遠心分離機で１５，０００ｒｐｍ、５分間、４℃で遠心分離した。ピペッティングで静かに上清を捨て、１ｍＬの７０％エタノールを加え、再度冷却遠心分離機で１５，０００ｒｐｍ、５分間、４℃で遠心分離した。上清を捨て、チューブのふたを開けた状態で、１０分程度、乾燥させた。沈殿を１００μＬのＴＥバッファに溶解させた。
【0108】
２７Ｆプライマー、１４９２Ｒプライマー及びTaKaRa LA Taqポリメラーゼ等を含むＰＣＲ反応液を１９μＬ、沈殿をＴＥバッファに溶解させたＤＮＡサンプル１μＬを添加した。図３は、ＰＣＲ反応に使用したプライマーを示す。図３中には、ＰＣＲ反応に使用したプライマーの配列番号、プライマー名及びオリゴヌクレオチド配列を示す。図３の上から１行目に２７Ｆプライマー（配列番号１）のオリゴヌクレオチド配列を示し、図３の上から２行目に１４９２Ｒプライマー（配列番号２）のオリゴヌクレオチド配列を示す。簡易遠心分離機でチューブをスピンダウンし、サーマルサイクラーの恒温ブロックにチューブを挿し、３０サイクルのサーマルサイクル反応を行わせた。
【0109】
［カラム精製］
ＤＮＡサンプルと等量のメンブレンバインディングソリューションを添加した。ＳＶミニカラムを回収チューブに挿入した（カラムアセンブリともいう）。溶液を全量ＳＶミニカラムに移し、室温で１分程度放置した。このカラムアセンブリを冷却遠心分離機にセットし、１６，０００×ｇで１分間、４℃で遠心分離した。ＳＶミニカラムに５００μＬのメンブレンウォッシュソリューションを入れ、１６，０００×ｇで１分間、４℃で遠心分離した。
ＤＮＡサンプルと等量のメンブレンバインディングソリューションを添加した。ＳＶミニカラムを回収チューブに挿入した（カラムアセンブリともいう）。溶液を全量ＳＶミニカラムに移し、室温で１分程度放置した。このカラムアセンブリを冷却遠心分離機にセットし、１６，０００×ｇで１分間、４℃で遠心分離した。ＳＶミニカラムに５００μＬのメンブレンウォッシュソリューションを入れ、１６，０００×ｇで１分間、４℃で遠心分離した。
【0110】
回収チューブの液を廃液溜めに捨て、再びＳＶミニカラムを回収チューブに挿入した。ＳＶミニカラムに５００μＬのメンブレンウォッシュソリューションを入れ、１６，０００×ｇで５分間、４℃で遠心分離した。回収チューブの液を廃液溜めに捨て、再びＳＶミニカラムを回収チューブに挿入したカラムアセンブリを１６，０００×ｇで１分間、４℃で遠心分離した。ＳＶミニカラムを新しい１．５ｍＬマイクロチューブに挿入した。滅菌水５０μＬをＳＶミニカラムに入れ、１分程度、室温で放置した後、１６，０００×ｇで１分間、４℃で遠心分離し、ＤＮＡを溶出させた。
【0111】
［サイクルシーケンス］
２７Ｆプライマー等を含むシーケンス反応液を作成し、これを８μＬとサンプルを２μＬ混合し、サーマルサイクラー（初期変性：９６℃１分間、［変性:９６℃１０秒、アニーリング：５０℃５秒、伸長：６０℃４秒］×２９回、最終伸長:４℃で時間無制限）で反応させた。シーケンス反応液には、図３中に示す配列番号１～配列番号８までのプライマーのいずれかを用いた。サーマルサイクラーの後に、１２５ｍＭのＥＤＴＡを５μＬ、９９．５％ＥｔＯＨを６０μＬ加え、転倒混合しアルミホイルで包んで１５分間放置した。その後、３７５０×ｇ、３０分間にわたって遠心分離し、反転したまま、１８５×ｇで１０秒間にわたって遠心分離した。
２７Ｆプライマー等を含むシーケンス反応液を作成し、これを８μＬとサンプルを２μＬ混合し、サーマルサイクラー（初期変性：９６℃１分間、［変性:９６℃１０秒、アニーリング：５０℃５秒、伸長：６０℃４秒］×２９回、最終伸長:４℃で時間無制限）で反応させた。シーケンス反応液には、図３中に示す配列番号１～配列番号８までのプライマーのいずれかを用いた。サーマルサイクラーの後に、１２５ｍＭのＥＤＴＡを５μＬ、９９．５％ＥｔＯＨを６０μＬ加え、転倒混合しアルミホイルで包んで１５分間放置した。その後、３７５０×ｇ、３０分間にわたって遠心分離し、反転したまま、１８５×ｇで１０秒間にわたって遠心分離した。
【0112】
７０％ＥｔＯＨを６０μＬ加え、３７５０×ｇで５分間にわたって遠心分離し、さらに１８５×ｇで１０秒間にわたって遠心分離した。ＨｉＤｉホルムアミド１５μＬを加え、２分間ボルテックスして、９５℃で２分間、４℃で２分間ヒートショックを与えて、キャピラリーシークエンスを実行した。ＤＮＡシーケンスした生データをＧＥＮＥＴＹＸのＡＴＧＣソフトウェアでＡＴＧＣデータ解析し、解析されたデータはＮＣＢＩでＢＬＡＳＴ解析を行った。それから、ＧＥＮＥＴＹＸソフトウェアで、ＮＣＢＩのデータベースを用いて近縁株のＦＡＳＴＡデータを取得し、各分離株の系統樹を作成した。
【0113】
［共培養評価系による微細藻類増殖促進細菌の選抜］
図３２は、共培養１６８時間目においてクロロフィル蛍光強度の倍率が１．０を超えた分離株のうち、５．６倍以上となったものを、増加倍率が高いものから順にしたものを示す。分離株名は、本発明者等が便宜的に付したものである。図３２の「倍率」は、NIES-48のみで培養した場合と比較したクロロフィル蛍光強度の倍率を示す。
図３２は、共培養１６８時間目においてクロロフィル蛍光強度の倍率が１．０を超えた分離株のうち、５．６倍以上となったものを、増加倍率が高いものから順にしたものを示す。分離株名は、本発明者等が便宜的に付したものである。図３２の「倍率」は、NIES-48のみで培養した場合と比較したクロロフィル蛍光強度の倍率を示す。
【0114】
図３２中に示すクロロフィル蛍光強度は、複数回のクロロフィル蛍光強度の測定結果の平均値を示す。比較対象の欄に「ａ」を付したものは、図３２中の下から３番目に示すＮＩＥＳ－４８(1)と比較した倍率を示す。比較対象の欄に「ｂ」を付したものは、図３２中の下から２番目に示すＮＩＥＳ－４８(2)と比較した倍率を示す。比較対象の欄に「ｃ」を付したものは、図３２中の下から１番目に示すＮＩＥＳ－４８(3)と比較した倍率を示す。
【0115】
ＦＣＵからの分離株１４４株のうち、２１株のクロロフィル蛍光強度が、５．６倍以上の倍率となった。
【0116】
以下、クロロフィル蛍光強度の倍率が５．６を超えた分離株のうち、JM311株、JM321株、AF2108株、JM202株を選択し、フラスコによる共培養を用いて、NIES-48増殖促進効果を確認した。
【0117】
［JM311分離株］
図３３は、JM311分離株とNIES-48の共培養後のクロロフィルａ＋ｂの測定結果を示すものである。図３３において＊印は、NIES-48の単独培養と有意に差があることを示す（ｐ＜０．０５）。NIES-48とJM311株とを共培養することで培養１６８時間目にはクロロフィル量が３０．４７ｍｇ／Ｌとなり単独培養時の９．５２ｍｇ／Ｌに比べて３．２０倍に増加した。
図３３は、JM311分離株とNIES-48の共培養後のクロロフィルａ＋ｂの測定結果を示すものである。図３３において＊印は、NIES-48の単独培養と有意に差があることを示す（ｐ＜０．０５）。NIES-48とJM311株とを共培養することで培養１６８時間目にはクロロフィル量が３０．４７ｍｇ／Ｌとなり単独培養時の９．５２ｍｇ／Ｌに比べて３．２０倍に増加した。
【0118】
図３４は、NIES-48単独培養時又はJM311との共培養時のNIES-48の細胞数、細胞の大きさ及びクロロフィル蛍光強度をフローサイトメトリーにより測定した結果を示す。細胞の大きさは、フローサイトメトリーの前方散乱（ＦＳＣ－Ｈ）により測定した。図３４において＊印は、NIES-48の単独培養と有意に差があることを示す（ｐ＜０．０５）。NIES-48及びJM311分離株の１６８時間の共培養後の細胞数は、NIES-48単独での培養と比較して、３．７４倍に増加した。細胞ごとのクロロフィル蛍光強度０．７８倍と変化がなかった。前方光散乱については０．８８倍とわずかに減少した。このことから、NIES-48とJM311を共培養することで増殖が促進され、細胞数が増加することが明らかとなった。
【0119】
シークエンスによってJM311株のほぼ完全な１６ＳｒＲＮＡ配列を決定した（１３８３ｂｐ）。Ｂｒａｓｔ ｎによる配列解析の結果、相同性の高い上位５株は、Bacillus pumilus ATCC7061、Bacillus pumilus NBRC12092、Bacillus zhangzhouensis MCCC1A08372、Peribacillus acanthi L28、Bacillus australimaris MCCC1A05787であり、それぞれ、９９．８６％、９９．８６％、９９．７８％、９９．７８％、９９．７１％であった。JM311と近縁のBacillus属の系統樹を図３５に示す。図３５に示す系統樹は、ＪＭ３１１の１６ＳｒＲＮＡ配列に基づいて作成した。ブーストラップ値５０以上を示す。Outgroupには、Streptococcus intermedius 1877基準株を用いた。JM311は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託した（受託番号：NITE P-03919）。
【0120】
［JM321分離株］
図３６は、JM321分離株とNIES-48の共培養後のクロロフィルａ＋ｂの測定結果を示すものである。図３６において＊印は、NIES-48の単独培養と有意に差があることを示す（ｐ＜０．０５）。NIES-48とJM321株とを共培養することで培養１６８時間目にはクロロフィル量が３４．２２ｍｇ／Ｌとなり単独培養時の９．０６ｍｇ／Ｌに比べて３．７８倍に増加した。
図３６は、JM321分離株とNIES-48の共培養後のクロロフィルａ＋ｂの測定結果を示すものである。図３６において＊印は、NIES-48の単独培養と有意に差があることを示す（ｐ＜０．０５）。NIES-48とJM321株とを共培養することで培養１６８時間目にはクロロフィル量が３４．２２ｍｇ／Ｌとなり単独培養時の９．０６ｍｇ／Ｌに比べて３．７８倍に増加した。
【0121】
図３７は、NIES-48単独培養時又はJM321との共培養時のNIES-48の細胞数、細胞の大きさ及びクロロフィル蛍光強度をフローサイトメトリーにより測定した結果を示す。細胞の大きさは、フローサイトメトリーの前方散乱（ＦＳＣ－Ｈ）により測定した。図３７において＊印は、NIES-48の単独培養と有意に差があることを示す（ｐ＜０．０５）。NIES-48及びJM321分離株の１６８時間の共培養後の細胞数及びクロロフィル蛍光強度は、NIES-48単独での培養と比較して、それぞれ３．４８倍及び１．１６倍になった。前方光散乱については０．９５倍になった。このことから、NIES-48とJM321を共培養することで細胞ごとのクロロフィル量が僅かに増加し、増殖が促進され、細胞数が増加することが明らかとなった。
【0122】
シークエンスによってJM321株のほぼ完全な１６ＳｒＲＮＡ配列を決定した（１４８３ｂｐ）。Ｂｒａｓｔ ｎによる配列解析の結果、相同性の高い上位５株は、Bacillus licheniformis DSM13、Bacillus licheniformis BCRC11702、Bacillus paralicheniformis KJ-16、Bacillus licheniformis NRRL B-41327、Bacillus licheniformis ATCC14580であり、それぞれ、９９．８５％、９９．８５％、９９．７６％、９９．６９％、９９．６９１％であった。JM321と近縁のBacillus属の系統樹を図３８に示す。図３８に示す系統樹は、JM321の16SrRNA遺伝子配列に基づいて作成された。ブーストラップ値５０以上を示す。Outgoupには、Streptococcus intermedius 1877基準株を用いた。JM321はBacillus licheniformisと同定された。JM321は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託した（受託番号：NITE P-03920）。
【0123】
［AF2108分離株］
図３９は、AF2108分離株とNIES-48の共培養後のクロロフィルａ＋ｂの測定結果を示すものである。図３９において＊印は、NIES-48の単独培養と有意に差があることを示す（ｐ＜０．０５）。NIES-48とAF2108株とを共培養することで培養１６８時間目にはクロロフィル量が３２．６６ｍｇ／Ｌとなり単独培養時の９．３２ｍｇ／Ｌに比べて３．３６倍に増加した。
図３９は、AF2108分離株とNIES-48の共培養後のクロロフィルａ＋ｂの測定結果を示すものである。図３９において＊印は、NIES-48の単独培養と有意に差があることを示す（ｐ＜０．０５）。NIES-48とAF2108株とを共培養することで培養１６８時間目にはクロロフィル量が３２．６６ｍｇ／Ｌとなり単独培養時の９．３２ｍｇ／Ｌに比べて３．３６倍に増加した。
【0124】
図４０は、NIES-48単独培養時又はAF2108との共培養時のNIES-48の細胞数、細胞の大きさ及びクロロフィル蛍光強度をフローサイトメトリーにより測定した結果を示す。細胞の大きさは、フローサイトメトリーの前方散乱（ＦＳＣ－Ｈ）により測定した。図４０において＊印は、NIES-48の単独培養と有意に差があることを示す（ｐ＜０．０５）。NIES-48及びAF2108分離株の１６８時間の共培養後の細胞数は、NIES-48単独での培養と比較して、２．９３倍に増加した。クロロフィル蛍光強度は１．１２倍と変化がなかった。前方光散乱については０．９２倍と減少していた。このことから、NIES-48とAF2108を共培養することで増殖が促進され、細胞数が増加することが明らかとなった。
【0125】
シークエンスによってAF2018株のほぼ完全な１６ＳｒＲＮＡ配列を決定した（１３９４ｂｐ）。Ｂｒａｓｔ ｎによる配列解析の結果、相同性の高い上位５株は、Rhodococcus cerastii C5、Rhodococcus cercidiphylli YIM65003、Rhodococcus yunnanensis YIM 70056，Rhodococcus fascians ATCC 12974，Rhodococcus fascians CF17であり、それぞれ、１００．００％、９９．５８％、９９．３１％、９９．１６％、９９．１５％であった。AF2108と近縁のRhodococcus属の系統樹を図４１に示す。図４１に示す系統樹は、AE2108の16SrRNA遺伝子配列に基づいて作成された。ブーストラップ値５０以上を示す。Outgroupには、Pseudonocardia dioxanivorans CB1190基準株を用いた。AF2108はRhodococcus cerastiiと同定された。
【0126】
［JM202分離株］
図４２は、JM202分離株とNIES-48の共培養後のクロロフィルａ＋ｂの測定結果を示すものである。図４２において＊印は、NIES-48の単独培養と有意に差があることを示す（ｐ＜０．０５）。NIES-48とJM202株とを共培養することで培養１６８時間目にはクロロフィル量が２６．３８ｍｇ／Ｌとなり単独培養時の９．０６ｍｇ／Ｌに比べて２．９１倍に増加した。
図４２は、JM202分離株とNIES-48の共培養後のクロロフィルａ＋ｂの測定結果を示すものである。図４２において＊印は、NIES-48の単独培養と有意に差があることを示す（ｐ＜０．０５）。NIES-48とJM202株とを共培養することで培養１６８時間目にはクロロフィル量が２６．３８ｍｇ／Ｌとなり単独培養時の９．０６ｍｇ／Ｌに比べて２．９１倍に増加した。
【0127】
図４３は、NIES-48単独培養時又はJM202との共培養時のNIES-48の細胞数、細胞の大きさ及びクロロフィル蛍光強度をフローサイトメトリーにより測定した結果を示す。細胞の大きさは、フローサイトメトリーの前方散乱（ＦＳＣ－Ｈ）により測定した。図４３において＊印は、NIES-48の単独培養と有意に差があることを示す（ｐ＜０．０５）。NIES-48及びJM202分離株の１６８時間の共培養後の細胞数及びクロロフィル蛍光強度は、NIES-48単独での培養と比較して、それぞれ３．１７倍及び０．８８倍になった。前方光散乱については１．０１倍と変化がなかった。このことから、ＮＩＥＳ－４８とJM202を共培養することで、僅かに細胞ごとにクロロフィル量が減少するものの、増殖が促進され、細胞数が増加することが明らかとなった。
【0128】
シークエンスによってJM202株のほぼ完全な１６ＳｒＲＮＡ配列を決定した（１４５８ｂｐ）。Ｂｒａｓｔ ｎによる配列解析の結果、相同性の高い上位５株は、Aeromonas salmonicida CECT 894，Aeromonas salmonicida ATCC 33658，Aeromonas salmonicida NCIMB 1102，Aeromonas salmonicida ATCC 33658，Aeromonas salmonicida subsp. masoucida NBRC 13784でであり、それぞれ、９９．８６％、９９．８４％、９９．７９％、９９．７９％、９９．７９％であった。JM202と近縁のAeromonas属の系統樹を図４４に示す。図４４に示す系統樹は、JM202の16SrRNA遺伝子配列に基づいて作成された。ブーストラップ値５０以上を示す。Outgroupには、Succinatimonas hippei YIT 12066基準株を用いた。JM202は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託した（受託番号：NITE P-03835）。
【0129】
［本発明による効果］
本発明のロドコッカス属、キサントバクター属、アンサイロバクター属、シェワネラ属、バシラス属、又は、アエロモナス属に属する微細藻類増殖促進用微生物は、微細藻類の増殖を促進することができる。
本発明のロドコッカス属、キサントバクター属、アンサイロバクター属、シェワネラ属、バシラス属、又は、アエロモナス属に属する微細藻類増殖促進用微生物は、微細藻類の増殖を促進することができる。
【0130】
以上、本発明を実施の形態を用いて説明したが、本発明の技術的範囲は上記実施の形態に記載の範囲には限定されず、その要旨の範囲内で種々の変形及び変更が可能である。例えば、装置の全部又は一部は、任意の単位で機能的又は物理的に分散・統合して構成することができる。また、複数の実施の形態の任意の組み合わせによって生じる新たな実施の形態も、本発明の実施の形態に含まれる。組み合わせによって生じる新たな実施の形態の効果は、もとの実施の形態の効果を併せ持つ。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】
【図44】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2024-01-11
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ロドコッカス属、キサントバクター属、アンサイロバクター属、シェワネラ属、バシラス属、又は、アエロモナス属に属する微生物であることを特徴とする微細藻類増殖促進用微生物。
【請求項2】
前記微生物が、ロドコッカス属のロドコッカス・セラスティ、キサントバクター属のキサントバクター・フラヴス、又は、アンサイロバクター属のアンサイロバクター・ルドゲンシスである、請求項１に記載の微細藻類増殖促進用微生物。
【請求項3】
前記微生物が、バシラス属のバシラス・リケニフォルミス、バシラス・プミリス、バシラス・ジャンジョウエンシス、バシラス・アウストラリマリス、バシラス・サフェンシス、ペリバシラス・アカンティ、ロドコッカス属のロドコッカス・セラスティ、アエロモナス属のアエロモナス・サルモニシダ又はアエロモナス・ピシコラである、請求項１に記載の微細藻類増殖促進用微生物。
【請求項4】
藍藻、緑藻、灰色藻又はユーグレナ藻の増殖を促進するための請求項１～３のいずれか一項に記載の微細藻類増殖促進用微生物。
【請求項5】
シアノバクテリア門又はユーグレナ植物門に属する生物の増殖を促進するための請求項１～３のいずれか一項に記載の微細藻類増殖促進用微生物。
【請求項6】
請求項１～３のいずれか一項に記載の微細藻類増殖促進用微生物を含有する微細藻類増殖促進剤。
【請求項7】
ロドコッカス属、キサントバクター属、アンサイロバクター属、シェワネラ属、バシラス属、又は、アエロモナス属に属する微生物のうちの一つ以上の微生物を、微細藻類とともに共培養することを特徴とする、微細藻類の培養方法。
【請求項8】
スクリーニング対象となる微生物を、微細藻類とともに共培養するステップと、
共培養後の培地に含まれるクロロフィルを定量するステップと、
を備える、微生物のスクリーニング方法。
共培養後の培地に含まれるクロロフィルを定量するステップと、
を備える、微生物のスクリーニング方法。
【請求項9】
前記クロロフィルを定量するステップにおいて、励起波長を４８８ｎｍ、蛍光波長を６８０～７２０ｎｍとして、蛍光強度を測定するステップである請求項８に記載の微生物のスクリーニング方法。
【請求項10】
前記クロロフィルを定量するステップが、
微細藻類がPCC7972の場合は励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長６８３ｎｍとし、微細藻類がNIES-2173の場合は励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長６８５ｎｍとし、微細藻類がNIES-48の場合は励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長７００ｎｍとして蛍光強度を測定するステップである、
請求項８に記載の微生物のスクリーニング方法。
微細藻類がPCC7972の場合は励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長６８３ｎｍとし、微細藻類がNIES-2173の場合は励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長６８５ｎｍとし、微細藻類がNIES-48の場合は励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長７００ｎｍとして蛍光強度を測定するステップである、
請求項８に記載の微生物のスクリーニング方法。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0030】
上述の（２）に示すように、スクリーニング対象の微生物と微細藻類との共培養後の微細藻類に含まれるクロロフィルを定量することにより、この微生物が微細藻類の増殖を促進する効果をどの程度発揮したかを評価することができる。クロロフィルを定量するステップでは、蛍光分光光度計を用いて、励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長が６８０ｎｍ～７２０ｎｍで蛍光強度を測定する。また、微細藻類の種類によって波長を変えることも可能であり、例えば、PCC7972の場合は励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長６８３ｎｍ、NIES-2173の場合は励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長６８５ｎｍ、NIES-48の場合は励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長７００ｎｍで蛍光強度を測定することが好ましい。このようにして、クロロフィルの蛍光に対応する波長の光を測定することにより、微生物が微細藻類の増殖をどの程度促進したかを精度よく評価することができる。