特開 2024-9853 遺伝子発現の調節及び脱制御されたタンパク質発現のスクリーニング

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024009853

(43)【公開日】2024-01-23

(54)【発明の名称】遺伝子発現の調節及び脱制御されたタンパク質発現のスクリーニング

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20180101AFI20240116BHJP

   C12Q 1/6827 20180101ALI20240116BHJP

   C12Q 1/6883 20180101ALI20240116BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20240116BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20240116BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240116BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20240116BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240116BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240116BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240116BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240116BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240116BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240116BHJP

   A61P 9/00 20060101ALI20240116BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240116BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20240116BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240116BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240116BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20240116BHJP

   C12N 15/54 20060101ALI20240116BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/68

C12Q1/6827 Z ZNA

C12Q1/6883 Z

C12N15/11 Z

C12N15/09 110

C12N15/63 Z

C12N15/113 130Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61P43/00 111

A61K45/00

A61P9/00

A61P35/00

A61P37/02

A61P43/00 121

A61K48/00

A61K31/7088

G01N33/53 M

C12N15/54

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2023171631

(22)【出願日】2023-10-02

(62)【分割の表示】P 2021123345の分割

【原出願日】2016-10-07

(31)【優先権主張番号】1517937.7

(32)【優先日】2015-10-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(31)【優先権主張番号】1614744.9

(32)【優先日】2016-08-31

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(71)【出願人】

【識別番号】304032273

【氏名又は名称】ユニバーシティ・オブ・サザンプトン

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100122644

【弁理士】

【氏名又は名称】寺地 拓己

(72)【発明者】

【氏名】ヴォアチョフスキー，イゴール

(72)【発明者】

【氏名】クラロヴィコヴァ，ヤナ

(57)【要約】      （修正有）

【課題】被験者を機能性ＡＴＭタンパク質欠損とその関連病態への感受性についてスクリーニングする方法、被験者を治療のために選択する方法、機能性ＡＴＭタンパク質欠損に関連した病態を治療又は予防する方法、ＤＮＡ傷害性の放射線療法及び化学療法に対する細胞感受性を改変する方法、がんを治療する方法、並びに関連する組成物及びキットを提供する。
【解決手段】機能性ＡＴＭタンパク質欠損への感受性に関して被験者をスクリーニングする方法であって、ヒト被験者のゲノムのＮＳＥ（ＡＴＭイントロン２８内のクリプティックエクソン）の３’スプライス部位に対して－３位に位置する非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１の存在を決定することを含み、非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１の存在は、該被験者が機能性ＡＴＭタンパク質欠損を有するか又はそれに感受性であることを示す、前記方法とする。
【選択図】図７

【特許請求の範囲】

【請求項1】

機能性ＡＴＭタンパク質欠損への感受性に関して被験者をスクリーニングする方法であって、
ヒト被験者のゲノムのＮＳＥ（ＡＴＭイントロン２８内のクリプティックエクソン）の３’スプライス部位に対して－３位に位置する非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１の存在を決定することを含み、
非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１の存在は、該被験者が機能性ＡＴＭタンパク質欠損を有するか又はそれに感受性であることを示す、前記方法。

【請求項2】

機能性ＡＴＭタンパク質欠損に感受性の被験者を治療のために選択する方法であって、
ヒト被験者のゲノムのＮＳＥ（ＡＴＭイントロン２８内のクリプティックエクソン）の３’スプライス部位に対して－３位に位置する非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１の存在を決定し、ここで、非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１の存在は、該被験者が機能性ＡＴＭタンパク質欠損を有するか又はそれに感受性であることを示し、そして
該被験者を薬剤による治療のために選択し、それにより該被験者における機能性ＡＴＭレベルを増加させる、
ことを含む、前記方法。

【請求項3】

選択された被験者へ薬剤を投与し、それにより該被験者を治療することをさらに含む、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

薬剤がＮＳＥリプレッサー剤を含む、請求項２又は３に記載の方法。

【請求項5】

被験者において機能性ＡＴＭタンパク質欠損を治療又は予防する方法であって、
ヒト被験者のゲノムのＮＳＥ（ＡＴＭイントロン２８内のクリプティックエクソン）の３’スプライス部位に対して－３位に位置する非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１の存在を同定し、ここで、非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１の存在は、該被験者が機能性ＡＴＭタンパク質欠損を有するか又はそれに感受性であることを示し、そして
該被験者へ機能性ＡＴＭレベルを増加させる薬剤を投与する、
ことを含む、前記方法。

【請求項6】

機能性ＡＴＭタンパク質欠損に関連した病態を治療又は予防する方法であって、
ＮＳＥリプレッサー剤を被験者へ投与し、それにより機能性ＡＴＭタンパク質レベルを増加させることを含み、
該薬剤は、プレｍＲＮＡ転写産物のＡＴＭイントロン２８内のＮＳＥへ結合し、それによりプレｍＲＮＡ転写産物の成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含を減少させる、前記方法。

【請求項7】

成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含の減少が、機能性ＡＴＭタンパク質発現を増加させる、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

機能性ＡＴＭタンパク質欠損に関連した病態又は症状の治療又は予防のためである、請求項５～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

病態が、毛細血管拡張性運動失調症、がん、免疫不全、細胞の放射線感受性、又は染色体の不安定性である、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

ＮＳＥが、ｔｃｔａｃａｇｇｔｔｇｇｃｔｇｃａｔａｇａａｇａａａａａｇを含む配列を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

ＮＳＥリプレッサー剤が：
ａｇＴＣＴＡＣＡＧＧＴＴＧＧＣＴＧＣＡＴＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＧｇｔａｇａｇ；又は
ｔｃｔｔａｇＴＣＴＡＣＡＧＧＴＴＧＧＣＴＧＣＡＴＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＧｇｔａｇａｇ；又は
ｔｃｔｃａｇＴＣＴＡＣＡＧＧＴＴＧＧＣＴＧＣＡＴＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＧｇｔａｇａｇ、
を含む配列内でＮＳＥへ結合する、請求項４～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

ＮＳＥリプレッサー剤が、ＮＳＥ又はＮＳＥのＡＴＭイントロン２８内の５’若しくは３’スプライス部位へ結合する、請求項４～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

被験者においてＡＴＭ発現の脱制御に関連した病態を治療又は予防する方法であって、
ＮＳＥアクチベーター剤を被験者へ投与することを含み、
ＮＳＥアクチベーター剤は、ＡＴＭイントロン２８内の調節モチーフへ結合することによって、又はＡＴＭプレｍＲＮＡ転写産物のＡＴＭイントロン２８内のＮＳＥの３’に位置するシュードエクソンの上流にあるＵ２ＡＦ６５結合部位へ結合することによって、ＡＴＭ成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含を増加させる、前記方法。

【請求項14】

該被験者においてがんを治療又は予防する方法であって、
ＮＳＥアクチベーター剤を被験者へ投与し、ここで、ＮＳＥアクチベーター剤は、放射線療法のようなＤＮＡ傷害剤による細胞傷害性療法へのがん細胞の感受性を増加させ、そして、ＡＴＭイントロン２８内の調節モチーフへ結合することによって、又はＡＴＭプレｍＲＮＡ転写産物のＡＴＭイントロン２８内のＮＳＥの３’に位置するシュードエクソンの上流にあるＵ２ＡＦ６５結合部位へ結合することによって、ＡＴＭ成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含を増加させ、そして
放射線療法又は化学療法のような細胞傷害性療法で被験者を治療する、
ことを含む、前記方法。

【請求項15】

放射線療法又は化学療法のようなＤＮＡ傷害剤による細胞傷害性療法への細胞の感受性を増加させる方法であって、
ＮＳＥアクチベーター剤を投与することによってＡＴＭタンパク質発現を低下させることを含み、
ＮＳＥアクチベーター剤は、ＡＴＭイントロン２８内のモチーフへ結合することによって、又はＡＴＭプレｍＲＮＡ転写産物のＡＴＭイントロン２８内のＮＳＥの３’に位置するシュードエクソンの上流にあるＵ２ＡＦ６５結合部位へ結合することによって、ＡＴＭ成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含を増加させる、前記方法。

【請求項16】

成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含を増加させることが、機能性ＡＴＭタンパク質発現の減少を提供する、請求項１３～１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項17】

シュードエクソンが、配列ｔｃａｔｃｇａａｔａｃｔｔｔｔｇｇａａａｔａａｇを含む、請求項１３～１６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項18】

ＡＴＭイントロン２８内の調節モチーフが、スプライソソーム成分に対してＮＳＥと競合する、請求項１３～１７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項19】

ＡＴＭイントロン２８内の調節モチーフが、プレｍＲＮＡ転写産物のＡＴＭイントロン２８内のＮＳＥの３’に位置する２４ヌクレオチドのシュードエクソン（ＰＥ）を含む、
請求項１３～１８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項20】

被験者、細胞、又は組織において機能性ＡＴＭ発現を調整する方法であって、本明細書に記載のＮＳＥアクチベーター剤及び／又はＮＳＥリプレッサー剤を投与することを含む、前記方法。

【請求項21】

ＮＳＥリプレッサー剤及び／又はＮＳＥアクチベーター剤が、ポリ核酸ポリマーを含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項22】

ＮＳＥリプレッサー剤及び／又はＮＳＥアクチベーター剤が、ＳＳＯ（スプライススイッチングオリゴヌクレオチド）である、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項23】

ＮＳＥリプレッサー剤及び／又はＮＳＥアクチベーター剤が、ＮＳＥリプレッサー剤及び／又はＮＳＥアクチベーター剤を細胞へ送達するのに適した送達ビヒクルと結合している、請求項１～２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項24】

ＮＳＥリプレッサー剤が：
配列ｃｕｕｃｕａｕｇｃａｇｃｃａａｃｃｕｇｕａｇａｃｕのＳＳＯ（ＳＳＯ－ＮＳＥ３）若しくはその核酸類似体；又は
配列ａｃｃｕｕｕｕｕｃｕｕｃｕａｕｇｃａｇｃｃａａｃのＳＳＯ（ＳＳＯ－ＮＳＥ５）若しくはその核酸類似体を含むか、及び／又は
ＮＳＥリプレッサー剤が：ａａｃａｕｕｕｃｕａｕｕｕａｇｕｕａａａａｇｃ（ＳＳＯ
Ａ１１）；ｕｕａｇｕａｕｕｃｃｕｕｇａｃｕｕｕａ（ＳＳＯ Ａ１７）；ｇａｃｕｇｇｕａａａｕａａｕａａａｃａｕａａｕｕｃ（ＳＳＯ Ｂ２）；ａｕａｕａｕｕａｇａｇａｕａｃａｕｃａｇｃｃ（ＳＳＯ Ｂ４）；及び、ｕｕａｇａｇａａｕｃａｕｕｕｕａａａｕａａｇａｃ（ＳＳＯ ＡＮ３）、若しくはこれらの組合せを含む群より選択されるいずれか１つのＳＳＯを含むか又はそれから成る、請求項４～１２又は２０～２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項25】

ＮＳＥアクチベーター剤が、ＳＳＯ ＰＥｋｒ／ＰＥｄｅｌを含むか；及び／又は
ＮＳＥアクチベーター剤が：ａａｃｕｕａａａｇｇｕｕａｕａｕｃｕｃ（ＳＳＯ Ａ２）；ｕａｕａａａｕａｃｇａａｕａａａｕｃｇａ（ＳＳＯ Ａ４）；ｃａａｃａｃｇａｃａｕａａｃｃａａａ（ＳＳＯ Ａ９）；ｇｇｕａｕｇａｇａａｃｕａｕａｇｇａ（ＳＳＯ
Ａ２３）；ｇｇｕａａｕａａｇｕｇｕｃａｃａａａ（ＳＳＯ Ａ２５）；ｇｕａｕｃａｕａｃａｕｕａｇａａｇｇ（ＳＳＯ Ａ２６）；及び、ｕｇｕｇｇｇｇｕｇａｃｃａｃａｇｃｕｕ（ＳＳＯ Ｂ１１）、若しくはこれらの組合せを含む群より選択されるいずれか１つのＳＳＯを含むか又はそれから成る、請求項１３～１９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項26】

ＡＴＭ脱制御に関連した病態の治療に対する被験者の応答を予測するための、ｒｓ６０９２６１及び／又はｒｓ４９８８０００遺伝子型決定の使用。

【請求項27】

本明細書に記載のＮＳＥリプレッサー剤及び／又はＮＳＥアクチベーター剤を含む、組成物。

【請求項28】

医薬的に許容される製剤である、請求項２７に記載の組成物。

【請求項29】

被験者において機能性ＡＴＭタンパク質欠損を治療又は予防する方法であって、
ヒト被験者のゲノムのＮＳＥ（ＡＴＭイントロン２８内のクリプティックエクソン）の３’スプライス部位に対して－３位に位置する非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１の存
在を同定し、ここで、非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１の存在は、該被験者が機能性ＡＴＭタンパク質欠損を有するか又はそれに感受性であることを示し、そして
非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１をチミン残基に置換する薬剤を該被験者へ投与する、
ことを含む、前記方法。

【請求項30】

被験者において機能性ＡＴＭタンパク質欠損を治療又は予防する方法であって、ヒト被験者のゲノムのＮＳＥ（ＡＴＭイントロン２８内のクリプティックエクソン）の３’スプライス部位に対して－３位に位置する非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１をチミン残基に置換することを含む、前記方法。

【請求項31】

非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１を置換することが、非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１をチミン残基に置換するように整えられた薬剤を被験者へ投与することを含む、請求項２９又は３０に記載の方法。

【請求項32】

非チミン残基を置換するための薬剤が、ゲノム編集分子である、請求項２９～３１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項33】

非チミン残基を置換するための薬剤が、ｒｓ６０９２６１を標的とするＲＮＡ分子と一緒のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９又はその機能性同等物である、請求項２９～３２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項34】

被験者において機能性ＡＴＭタンパク質欠損を治療又は予防する方法であって、
ヒト被験者のゲノムのｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基の存在を同定し、ここで、ｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基の存在は、該被験者が機能性ＡＴＭタンパク質欠損を有するか又はそれに感受性であることを示し、そして
ｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基をアデニンに置換する薬剤を該被験者へ投与する、
ことを含む、前記方法。

【請求項35】

被験者において機能性ＡＴＭタンパク質欠損を治療又は予防する方法であって、
ヒト被験者のゲノムのｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基をアデニン残基に置換するか、又はｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基へＳＳＯを結合させることによってｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基を遮断する、
ことを含む、前記方法。

【請求項36】

ｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基を置換することが、ｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基をアデニン残基に置換するように整えられた薬剤を被験者へ投与することを含む、請求項３４又は３５に記載の方法。

【請求項37】

グアニン残基を置換するための薬剤が、ゲノム編集分子である、請求項３４～３６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項38】

グアニン残基を置換するための薬剤が、ｒｓ４９８８０００を標的とするＲＮＡ分子と一緒のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９又はその機能性同等物である、請求項３１～３４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項39】

被験者又は被験者の集団を機能性ＡＴＭタンパク質欠損への感受性についてスクリーニングする方法であって、
ヒト被験者のゲノムのｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基の存在を決定するこ
とを含み、
ｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基の存在は、該被験者（又は被験者群）が機能性ＡＴＭタンパク質欠損を有するか又はそれに感受性であることを示す、前記方法。

【請求項40】

機能性ＡＴＭタンパク質欠損に感受性である被験者又は被験者の集団を治療又は予防のために選択する方法であって、
ヒト被験者のゲノムのｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基の存在を決定し、ここで、ｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基の存在は、該被験者が機能性ＡＴＭタンパク質欠損を有するか又はそれに感受性であることを示し、そして
該被験者の機能性ＡＴＭレベルを増加させる薬剤で治療するために被験者を選択する、ことを含む、前記方法。

【請求項41】

被験者において機能性ＡＴＭタンパク質欠損を治療又は予防する方法であって、
ヒト被験者のゲノムのｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基の存在を同定し、ここで、ｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基の存在は、該被験者が機能性ＡＴＭタンパク質欠損を有するか又はそれに感受性であることを示し、そして
機能性ＡＴＭレベルを増加させる薬剤を該被験者へ投与する、
ことを含む、前記方法。

【請求項42】

ＣＧハプロタイプをＴＡへ修飾することを組み合わせた、請求項２９～３３及び３４～３８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項43】

被験者においてＣＧハプロタイプを同定すること、及び任意選択的に、請求項１～４２に従って被験者を治療すること又は治療のために被験者を選択することと組み合わせた、請求項１及び３６に記載の方法。

【請求項44】

成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含の調節を改変する方法であって、
スプライソソーム成分に対してＮＳＥと競合する、ＮＳＥの上流又は下流にある１以上のスプライシング調節モチーフを挿入又は欠失させることを含み、
前記１以上のスプライシング調節モチーフは、クリプティックスプライス部位又はシュードエクソンを含む、前記方法。

【請求項45】

機能性タンパク質をコードする遺伝子の成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含によって調節される機能性タンパク質の発現の調節を改変する方法であって、
スプライソソーム成分に対してＮＳＥと競合する、ＮＳＥの上流又は下流にある１以上のスプライシング調節モチーフを挿入又は欠失させることを含み、
前記１以上のスプライシング調節モチーフは、クリプティックスプライス部位又はシュードエクソンを含む、前記方法。

【請求項46】

１以上のスプライシング調節モチーフの挿入又は欠失が、ＡＴＭイントロン２８のゲノムＤＮＡ内である、請求項４４又は４５に記載の方法。

【請求項47】

１以上のスプライシング調節モチーフの挿入が、成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含の低下を引き起こす、請求項４４～４６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項48】

１以上のスプライシング調節モチーフの欠失が、成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含の増加を引き起こす、請求項４４～４６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項49】

１以上のスプライシング調節モチーフの挿入又は欠失が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９のようなゲノム編集技術の使用を含む、請求項４４～４８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項50】

ｒｓ６０９２６１変異体及び／又はｒｓ４９８８０００変異体を同定するための、１以上のオリゴヌクレオチドプローブを含むキット。

【請求項51】

１以上のオリゴヌクレオチドプローブが、ｒｓ６０９２６１変異体及び／又はｒｓ４９８８０００変異体を含む核酸の領域をＰＣＲ増幅する際に使用するためのプライマーである、請求項５０に記載のキット。

【請求項52】

ＮＳＥアクチベーター剤及び／又はＮＳＥリプレッサー剤をコードする核酸を含むベクター。

【請求項53】

遺伝子発現の調節を改変可能な薬剤をスクリーニングする方法であって：
機能性遺伝子の発現を制限するナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構のスイッチエクソン（ＮＳＥ）を同定し；
スプライソソーム成分に対してＮＳＥと競合する、ＮＳＥの上流又は下流にある１以上のスプライシング調節モチーフを同定し、前記１以上のスプライシング調節モチーフは、クリプティックスプライス部位又はシュードエクソンを含み；
該１以上のスプライシング調節モチーフの１つのスプライシング調節モチーフへワトソン－クリック塩基対合を介してハイブリダイズする配列を含むアンチセンスポリ核酸で、１以上のスプライシング調節モチーフを標的とし；そして
該遺伝子の成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含が増加するか又は減少するかを決定する、
ことを含む、前記方法。

【請求項54】

遺伝子の発現を調節する方法であって、スプライソソーム成分に対してナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構のスイッチエクソン（ＮＳＥ）と競合する、クリプティックスプライス部位又はシュードエクソンのようなスプライシング調節モチーフへ結合する薬剤を提供することを含む、前記方法。

【請求項55】

スプライソソーム成分に対してナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構のスイッチエクソン（ＮＳＥ）と競合する、クリプティックスプライス部位又はシュードエクソンのような遺伝子スプライシング調節モチーフへ結合する薬剤であって、
遺伝子スプライシング調節モチーフは、該遺伝子の成熟ＲＮＡ転写産物内へのＮＳＥの包含を制御する、前記薬剤。

【請求項56】

本明細書に実質的に記載され、添付の図面を参照してもよい、方法、使用、組成物、ベクター、又は薬剤。

【請求項57】

タンパク質発現を調節する方法であって：
ａ）単離ポリ核酸ポリマーを被験者の標的細胞へ接触させ；
ｂ）接触されたポリ核酸ポリマーを、予めプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物上の標的モチーフへハイブリダイズさせ、ここで、接触されたポリ核酸ポリマーの標的モチーフへのハイブリダイゼーションは、ナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構のスイッチエクソン（ＮＳＥ）の活性化を促進又は抑制し；
ｃ）予めプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物のｍＲＮＡ転写産物をプロセシングし、ここで、ＮＳＥは該ｍＲＮＡ転写産物内に存在するか又は存在せず；そして
ｄ）工程ｃ）のプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物を翻訳し、ここで、ＮＳＥの有無はタンパク質発現を調節する、
ことを含む、前記方法。

【請求項58】

タンパク質が、プロセシングされたｍＲＮＡ転写産物より発現される、請求項５７に記載の方法。

【請求項59】

ＮＳＥの存在が、タンパク質発現を下方制御する、請求項５７に記載の方法。

【請求項60】

ＮＳＥの不存在が、タンパク質発現を上方制御する、請求項５７に記載の方法。

【請求項61】

ポリ核酸ポリマーが、ＡＴＭイントロン２８内のモチーフへハイブリダイズする、請求項５７に記載の方法。

【請求項62】

モチーフが、スプライソソーム成分に対してＮＳＥと競合するスプライシング調節モチーフである、請求項６１に記載の方法。

【請求項63】

スプライシング調節モチーフが、クリプティックスプライス部位又はシュードエクソンを含む、請求項６２に記載の方法。

【請求項64】

シュードエクソンが、プレｍＲＮＡ転写産物のＡＴＭイントロン２８内のＮＳＥの３’に位置する２４ヌクレオチドのシュードエクソンである、請求項６３に記載の方法。

【請求項65】

モチーフが、Ｕ２ＡＦ６５結合部位である、請求項６２に記載の方法。

【請求項66】

モチーフが、転移因子の内部、転移因子の上流、又は転移因子の下流にあるモチーフである、請求項６２に記載の方法。

【請求項67】

転移因子が、Ａｌｕ又はＭＥＲ５１である、請求項６６に記載の方法。

【請求項68】

単離ポリ核酸ポリマーが、Ａｌｕ内の標的モチーフへハイブリダイズする、請求項６７に記載の方法。

【請求項69】

単離ポリ核酸ポリマーが、Ａｌｕの上流又は下流にある標的モチーフへハイブリダイズする、請求項６７に記載の方法。

【請求項70】

単離ポリ核酸ポリマーが、ＭＥＲ５１の下流にある標的モチーフへハイブリダイズする、請求項６７に記載の方法。

【請求項71】

ポリ核酸ポリマーが、長さ約１０～約５０ヌクレオチドである、請求項５７～７０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項72】

単離ポリ核酸ポリマーが、配列番号１８～５２から成る群より選択される配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性がある配列を含む、請求項５７～７１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項73】

タンパク質発現を調節する方法であって：
ａ）単離ポリ核酸ポリマーを被験者の標的細胞へ接触させ；
ｂ）接触されたポリ核酸ポリマーを、転移因子内の標的モチーフへハイブリダイズさせ、ここで、接触されたポリ核酸ポリマーの標的モチーフへのハイブリダイゼーションは、ナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構のスイッチエクソン（ＮＳＥ）の活性化を促進又は抑制し；
ｃ）予めプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物のｍＲＮＡ転写産物をプロセシングし、ここで、ＮＳＥは該ｍＲＮＡ転写産物内に存在するか又は存在せず；そして
ｄ）工程ｃ）のプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物を翻訳し、ここで、ＮＳＥの有無はタンパク質発現を調節する、
ことを含む、前記方法。

【請求項74】

タンパク質発現を調節する方法であって：
ａ）単離ポリ核酸ポリマーを被験者の標的細胞へ接触させ；
ｂ）接触されたポリ核酸ポリマーを、転移因子の上流又は下流にある標的モチーフへハイブリダイズさせ、ここで、接触されたポリ核酸ポリマーの標的モチーフへのハイブリダイゼーションは、ナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構のスイッチエクソン（ＮＳＥ）の活性化を促進又は抑制し；
ｃ）予めプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物のｍＲＮＡ転写産物をプロセシングし、ここで、ＮＳＥは、ｍＲＮＡ転写産物内に存在するか又は存在せず；そして
ｄ）工程ｃ）のプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物を翻訳し、ここで、ＮＳＥの有無は、タンパク質発現を調節する、
ことを含む、前記方法。

【請求項75】

タンパク質が、プロセシングされたｍＲＮＡ転写産物より発現される、請求項７３又は７４に記載の方法。

【請求項76】

ＮＳＥの存在が、タンパク質発現を下方制御する、請求項７３又は７４に記載の方法。

【請求項77】

ＮＳＥの不存在が、タンパク質発現を上方制御する、請求項７３又は７４に記載の方法。

【請求項78】

転移因子が、Ａｌｕ又はＭＥＲ５１である、請求項７３又は７４に記載の方法。

【請求項79】

単離ポリ核酸ポリマーが、配列番号１８～５２から成る群より選択される配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性がある配列を含む、請求項７３又は７４に記載の方法。

【請求項80】

ポリ核酸ポリマーが、長さ約１０～約５０ヌクレオチドである、請求項７３、７４、又は７９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項81】

単離ポリ核酸ポリマーが、Ａｌｕ内の標的モチーフへハイブリダイズする、請求項７３に記載の方法。

【請求項82】

単離ポリ核酸ポリマーが、Ａｌｕの上流又は下流にある標的モチーフへハイブリダイズする、請求項７４に記載の方法。

【請求項83】

単離ポリ核酸ポリマーが、ＭＥＲ５１の下流にある標的モチーフへハイブリダイズする、請求項７４に記載の方法。

【請求項84】

ＮＳＥの活性化が、エクソンスキッピングをさらに誘導する、請求項７３又は７４に記載の方法。

【請求項85】

ＮＳＥが、イントロン２８内に位置している、請求項７３、７４、又は８４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項86】

ＮＳＥが、ＡＴＭタンパク質発現を調節する、請求項７３、７４、８４、又は８５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項87】

それを必要とする被験者においてＡＴＭ発現の脱制御に関連した疾患又は病態を治療又は予防する方法であって：
（ｉ）予めプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物と相互作用して、プロセシングされたｍＲＮＡ転写産物内へのＮＳＥの包含を促進させる、ナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構のスイッチエクソン（ＮＳＥ）アクチベーター剤；及び
（ｉｉ）医薬的に許容される賦形剤及び／又は送達ビヒクル、
を含む医薬組成物を該被験者へ投与することを含み、
ＡＴＭ発現の脱制御に関連した疾患又は病態は、該ＮＳＥアクチベーター剤の投与によって該被験者において治療又は予防される、前記方法。

【請求項88】

それを必要とする被験者において機能性ＡＴＭタンパク質欠損に関連した疾患又は病態を治療又は予防する方法であって：
（ｉ）予めプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物と相互作用して、プロセシングされたｍＲＮＡ転写産物内のＮＳＥの排除を促進させる、ナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構のスイッチエクソン（ＮＳＥ）リプレッサー剤；及び
（ｉｉ）医薬的に許容される賦形剤及び／又は送達ビヒクル、
を含む医薬組成物を該被験者へ投与することを含み、
機能性ＡＴＭタンパク質欠損に関連した疾患又は病態は、該ＮＳＥリプレッサー剤の投与によって該被験者において治療又は予防される、前記方法。

【請求項89】

ＮＳＥアクチベーター剤が、単離ポリ核酸ポリマーである、請求項８７に記載の方法。

【請求項90】

ＮＳＥリプレッサー剤が、単離ポリ核酸ポリマーである、請求項８８に記載の方法。

【請求項91】

ポリ核酸ポリマーが、ＡＴＭイントロン２８内のモチーフへハイブリダイズする、請求項８９又は９０に記載の方法。

【請求項92】

ポリ核酸ポリマーが、スプライソソーム成分に対してＮＳＥと競合するスプライシング調節モチーフへハイブリダイズする、請求項８９に記載の方法。

【請求項93】

スプライシング調節モチーフが、クリプティックスプライス部位又はシュードエクソンを含む、請求項９２に記載の方法。

【請求項94】

シュードエクソンが、プレｍＲＮＡ転写産物のＡＴＭイントロン２８内のＮＳＥの３’に位置する２４ヌクレオチドのシュードエクソンである、請求項９３に記載の方法。

【請求項95】

ポリ核酸ポリマーが、Ｕ２ＡＦ６５結合部位へハイブリダイズする、請求項８９に記載の方法。

【請求項96】

ポリ核酸ポリマーが、転移因子の内部、転移因子の上流、又は転移因子の下流にあるモチーフへハイブリダイズする、請求項８９又は９０に記載の方法。

【請求項97】

転移因子が、Ａｌｕ又はＭＥＲ５１である、請求項９６に記載の方法。

【請求項98】

単離ポリ核酸ポリマーが、Ａｌｕ内の標的モチーフへハイブリダイズする、請求項９７に記載の方法。

【請求項99】

単離ポリ核酸ポリマーが、Ａｌｕの上流又は下流にある標的モチーフへハイブリダイズする、請求項９７に記載の方法。

【請求項100】

単離ポリ核酸ポリマーが、ＭＥＲ５１の下流にある標的モチーフへハイブリダイズする、請求項９７に記載の方法。

【請求項101】

ポリ核酸ポリマーが、長さ約１０～約５０ヌクレオチドである、請求項８９～１００のいずれか１項に記載の方法。

【請求項102】

単離ポリ核酸ポリマーが、配列番号１８～５２から成る群より選択される配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性がある配列を含む、請求項８９～１０１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項103】

疾患又は病態が、がんである、請求項８７に記載の方法。

【請求項104】

それを必要とする被験者において疾患又は病態を治療又は予防する方法であって：
（ｉ）予めプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物と相互作用して、プロセシングされたｍＲＮＡ転写産物内へのＮＳＥの包含を促進させる、ナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構のスイッチエクソン（ＮＳＥ）アクチベーター剤；及び
（ｉｉ）医薬的に許容される賦形剤及び／又は送達ビヒクル、
を含む医薬組成物を該被験者へ投与することを含み、
該疾患又は病態は、該ＮＳＥアクチベーター剤の投与によって該被験者において治療又は予防される、前記方法。

【請求項105】

それを必要とする被験者において疾患又は病態を治療又は予防する方法であって：
（ｉ）予めプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物と相互作用して、プロセシングされたｍＲＮＡ転写産物内のＮＳＥの排除を促進させる、ナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構のスイッチエクソン（ＮＳＥ）リプレッサー剤；及び
（ｉｉ）医薬的に許容される賦形剤及び／又は送達ビヒクル、
を含む医薬組成物を該被験者へ投与することを含み、
該疾患又は病態は、該ＮＳＥリプレッサー剤の投与によって該被験者において治療又は予防される、前記方法。

【請求項106】

ＮＳＥアクチベーター剤が、単離ポリ核酸ポリマーである、請求項１０４に記載の方法。

【請求項107】

ＮＳＥリプレッサー剤が、単離ポリ核酸ポリマーである、請求項１０５に記載の方法。

【請求項108】

ポリ核酸ポリマーが、ＡＴＭイントロン２８内のモチーフへハイブリダイズする、請求項１０６又は１０７に記載の方法。

【請求項109】

ポリ核酸ポリマーが、スプライソソーム成分に対してＮＳＥと競合するスプライシング調節モチーフへハイブリダイズする、請求項１０６に記載の方法。

【請求項110】

スプライシング調節モチーフが、クリプティックスプライス部位又はシュードエクソンを含む、請求項１０９に記載の方法。

【請求項111】

シュードエクソンが、プレｍＲＮＡ転写産物のＡＴＭイントロン２８内のＮＳＥの３’に位置する２４ヌクレオチドのシュードエクソンである、請求項１１０に記載の方法。

【請求項112】

ポリ核酸ポリマーが、Ｕ２ＡＦ６５結合部位へハイブリダイズする、請求項１０８に記載の方法。

【請求項113】

ポリ核酸ポリマーが、転移因子の内部、転移因子の上流、又は転移因子の下流にあるモチーフへハイブリダイズする、請求項１０６又は１０７に記載の方法。

【請求項114】

転移因子が、Ａｌｕ又はＭＥＲ５１である、請求項１１３に記載の方法。

【請求項115】

単離ポリ核酸ポリマーが、Ａｌｕ内の標的モチーフへハイブリダイズする、請求項１１４に記載の方法。

【請求項116】

単離ポリ核酸ポリマーが、Ａｌｕの上流又は下流にある標的モチーフへハイブリダイズする、請求項１１４に記載の方法。

【請求項117】

単離ポリ核酸ポリマーが、ＭＥＲ５１の下流にある標的モチーフへハイブリダイズする、請求項１１４に記載の方法。

【請求項118】

ポリ核酸ポリマーが、長さ約１０～約５０ヌクレオチドである、請求項１０４～１１７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項119】

単離ポリ核酸ポリマーが、配列番号１８～５２から成る群より選択される配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性がある配列を含む、請求項１０４～１１８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項120】

疾患又は病態が、がんである、請求項１０４に記載の方法。

【請求項121】

疾患又は病態が、ＡＴＭ発現の脱制御に関連した疾患又は病態である、請求項１０４に記載の方法。

【請求項122】

疾患又は病態が、機能性ＡＴＭタンパク質欠損に関連した疾患又は病態である、請求項１０５に記載の方法。

【請求項123】

ポリ核酸ポリマーが、ヌクレオシド部分、リン酸エステル部分、５’末端、３’末端、又はこれらの組合せにおいて修飾されている、請求項５７～１２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項124】

ポリ核酸ポリマーが、人工ヌクレオチドを含む、請求項５７～１２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項125】

人工ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、Ｔ－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、Ｔ－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、１’，５’－アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオホスホネートヌクレオチド、及び２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホロアミダイトから成る群より選択される、請求項１２４に記載の方法。

【請求項126】

送達ビヒクルが、ナノ粒子ベースの送達ビヒクルを含む、請求項８７、８８、１０４、又は１０５に記載の方法。

【請求項127】

タンパク質発現を調節する方法であって：
ａ）単離ポリ核酸ポリマーを被験者の標的細胞へ接触させ；
ｂ）接触されたポリ核酸ポリマーを転移因子内の標的モチーフへハイブリダイズさせ、ここで、接触されたポリ核酸ポリマーの標的モチーフへのハイブリダイゼーションは、選択的スプライス部位の活性化を促進又は抑制し；
ｃ）予めプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物のｍＲＮＡ転写産物をプロセシングし、ここで、該選択的スプライス部位は、ｍＲＮＡ転写産物内に存在するか又は存在せず；そして
ｄ）工程ｃ）のプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物を翻訳し、ここで、該選択的スプライス部位の有無は、タンパク質発現を調節する、
ことを含む、前記方法。

【請求項128】

タンパク質発現を調節する方法であって：
ａ）単離ポリ核酸ポリマーを被験者の標的細胞へ接触させ；
ｂ）接触されたポリ核酸ポリマーを転移因子の上流又は下流にある標的モチーフへハイブリダイズさせ、ここで、接触されたポリ核酸ポリマーの標的モチーフへのハイブリダイゼーションは、選択的スプライス部位の活性化を促進又は抑制し；
ｃ）予めプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物のｍＲＮＡ転写産物をプロセシングし、ここで、該選択的スプライス部位は、ｍＲＮＡ転写産物内に存在するか又は存在せず；そして
ｄ）工程ｃ）のプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物を翻訳し、ここで、該選択的スプライス部位の有無は、タンパク質発現を調節する、
ことを含む、前記方法。

【請求項129】

トランスポゾン因子が、予めプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物上にある、請求項１２７又は１２８に記載の方法。

【請求項130】

タンパク質発現を調節する方法であって：
ａ）単離ポリ核酸ポリマーを被験者の標的細胞へ接触させ；
ｂ）接触されたポリ核酸ポリマーを予めプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物上の標的モチーフへハイブリダイズさせ、ここで、接触されたポリ核酸ポリマーの標的モチーフへのハイブリダイゼーションは、選択的スプライス部位の活性化を促進又は抑制し；
ｃ）予めプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物のｍＲＮＡ転写産物をプロセシングし、ここで、該選択的スプライス部位は、ｍＲＮＡ転写産物内に存在するか又は存在せず；そして
ｄ）工程ｃ）のプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物を翻訳し、ここで、該選択的スプライス部位の有無は、タンパク質発現を調節する、
ことを含む、前記方法。

【請求項131】

タンパク質が、プロセシングされたｍＲＮＡ転写産物より発現される、請求項１３０に記載の方法。

【請求項132】

ＮＳＥの存在が、タンパク質発現を下方制御する、請求項１３０に記載の方法。

【請求項133】

ＮＳＥの不存在が、タンパク質発現を上方制御する、請求項１３０に記載の方法。

【請求項134】

ポリ核酸ポリマーが、ＡＴＭイントロン２８内のモチーフへハイブリダイズする、請求項１３０に記載の方法。

【請求項135】

モチーフが、スプライソソーム成分に対してＮＳＥと競合するスプライシング調節モチーフである、請求項１３４に記載の方法。

【請求項136】

スプライシング調節モチーフが、クリプティックスプライス部位又はシュードエクソンを含む、請求項１３５に記載の方法。

【請求項137】

シュードエクソンが、プレｍＲＮＡ転写産物のＡＴＭイントロン２８内のＮＳＥの３’に位置する２４ヌクレオチドのシュードエクソンである、請求項１３６に記載の方法。

【請求項138】

モチーフが、Ｕ２ＡＦ６５結合部位である、請求項１３４に記載の方法。

【請求項139】

モチーフが、転移因子の内部、転移因子の上流、又は転移因子の下流にあるモチーフである、請求項１３４に記載の方法。

【請求項140】

転移因子が、Ａｌｕ又はＭＥＲ５１である、請求項１３９に記載の方法。

【請求項141】

単離ポリ核酸ポリマーが、Ａｌｕ内の標的モチーフへハイブリダイズする、請求項１４０に記載の方法。

【請求項142】

単離ポリ核酸ポリマーが、Ａｌｕの上流又は下流にある標的モチーフへハイブリダイズする、請求項１４０に記載の方法。

【請求項143】

単離ポリ核酸ポリマーが、ＭＥＲ５１の下流にある標的モチーフへハイブリダイズする、請求項１４０に記載の方法。

【請求項144】

ポリ核酸ポリマーが、長さ約１０～約５０ヌクレオチドである、請求項１３０～１４３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項145】

単離ポリ核酸ポリマーが、配列番号１８～５２から成る群より選択される配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性がある配列を含む、請求項１３０～１４４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項146】

ａ）予めプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物と相互作用して、プロセシングされたｍＲＮＡ転写産物内へのＮＳＥの包含を促進する、ナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構のスイッチエクソン（ＮＳＥ）アクチベーター剤、又は予めプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物と相互作用して、プロセシングされたｍＲＮＡ転写産物内のＮＳＥの排除を促進する、ナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構のスイッチエクソン（ＮＳＥ）リプレッサー剤；及び
ｂ）医薬的に許容される賦形剤及び／又は送達ビヒクル、
を含む医薬組成物。

【請求項147】

ＮＳＥアクチベーター剤が、単離ポリ核酸ポリマーである、請求項１４６に記載の医薬組成物。

【請求項148】

ＮＳＥリプレッサー剤が、単離ポリ核酸ポリマーである、請求項１４７に記載の医薬組成物。

【請求項149】

ポリ核酸ポリマーが、ＡＴＭイントロン２８内のモチーフへハイブリダイズする、請求項１４７又は１４８に記載の医薬組成物。

【請求項150】

ポリ核酸ポリマーが、スプライソソーム成分に対してＮＳＥと競合するスプライシング調節モチーフへハイブリダイズする、請求項１４７に記載の医薬組成物。

【請求項151】

スプライシング調節モチーフが、クリプティックスプライス部位又はシュードエクソンを含む、請求項１５０に記載の医薬組成物。

【請求項152】

シュードエクソンが、プレｍＲＮＡ転写産物のＡＴＭイントロン２８内のＮＳＥの３’に位置する２４ヌクレオチドのシュードエクソンである、請求項１５１に記載の医薬組成物。

【請求項153】

ポリ核酸ポリマーが、Ｕ２ＡＦ６５結合部位へハイブリダイズする、請求項１５０に記載の医薬組成物。

【請求項154】

ポリ核酸ポリマーが、転移因子の内部、転移因子の上流、又は転移因子の下流にあるモチーフへハイブリダイズする、請求項１４７又は１４８に記載の医薬組成物。

【請求項155】

転移因子が、Ａｌｕ又はＭＥＲ５１である、請求項１５４に記載の医薬組成物。

【請求項156】

単離ポリ核酸ポリマーが、Ａｌｕ内の標的モチーフへハイブリダイズする、請求項１５４に記載の医薬組成物。

【請求項157】

単離ポリ核酸ポリマーが、Ａｌｕの上流又は下流にある標的モチーフへハイブリダイズする、請求項１５４に記載の医薬組成物。

【請求項158】

単離ポリ核酸ポリマーが、ＭＥＲ５１の下流にある標的モチーフへハイブリダイズする、請求項１５４に記載の医薬組成物。

【請求項159】

ポリ核酸ポリマーが、長さ約１０～約５０ヌクレオチドである、請求項１４６～１５８のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項160】

単離ポリ核酸ポリマーが、配列番号１８～５２から成る群より選択される配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性がある配列を含む、請求項１４６～１５９のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項161】

請求項１４６～１６０のいずれか１項に記載の医薬組成物を含む細胞。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

相互参照
[0001] 本願は、２０１５年１０月９日出願の英国特許出願番号１５１７９３７．７及び２０１６年８月３１日出願の英国特許出願番号１６１４７４４．９の利益を請求するものであり、その全体が本明細書に援用される、。

【背景技術】

【0002】

[0002] ＡＴＭタンパク質は、ＰＩ３／ＰＩ４－キナーゼファミリーに属しており、神経系と免疫系の発生に関与している。ＡＴＭプロテインキナーゼは、ＤＮＡ傷害時に活性化され、その後ＤＮＡ修復機構を調整する。

【発明の概要】

【0003】

[0003] ある態様では、本明細書に記載されるものには、被験者を機能性ＡＴＭタンパク質欠損とその関連病態への感受性についてスクリーニングする方法、被験者を治療のために選択する方法、機能性ＡＴＭタンパク質欠損に関連した病態を治療又は予防する方法、ＤＮＡ傷害性の放射線療法及び化学療法に対する細胞感受性を改変する方法、がんを治療する方法、並びに関連する組成物及びキットが含まれる。

【0004】

[0004] ある態様では、本明細書に開示するのは、被験者について機能性ＡＴＭタンパク質欠損への感受性をスクリーニングする方法であって、該スクリーニングは、ヒトゲノムのＮＳＥ（ＡＴＭイントロン２８内のクリプティックエクソン）の３’スプライス部位に対して－３位に位置する非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１の存在を決定することを含み、非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１の存在は、該被験者が機能性ＡＴＭタンパク質欠損を有するか又はそれに感受性であることを示す。いくつかの態様では、ＮＳＥは、配列ｔｃｔａｃａｇｇｔｔｇｇｃｔｇｃａｔａｇａａｇａａａａａｇを含む。いくつかの態様では、ＮＳＥリプレッサー剤は、配列ａｇＴＣＴＡＣＡＧＧＴＴＧＧＣＴＧＣＡＴＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＧｇｔａｇａｇ；又はｔｃｔｔａｇＴＣＴＡＣＡＧＧＴＴＧＧＣＴＧＣＡＴＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＧｇｔａｇａｇ；又はｔｃｔｃａｇＴＣＴＡＣＡＧＧＴＴＧＧＣＴＧＣＡＴＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＧｇｔａｇａｇ内のＮＳＥへ結合するように整えられる。いくつかの態様では、ＮＳＥリプレッサー剤は、ＮＳＥ又はＡＴＭイントロン２８内のその５’又は３’スプライス部位へ結合するように整えられる。

【0005】

[0005] ある態様では、本明細書に開示するのは、機能性ＡＴＭタンパク質欠損に感受性である被験者を治療のために選択する方法であって、該方法は、ヒトゲノムのＮＳＥ（ＡＴＭイントロン２８内のクリプティックエクソン）の３’スプライス部位に対して－３位に位置する非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１の存在を決定し、ここで、非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１の存在は、該被験者が機能性ＡＴＭタンパク質欠損を有するか又はそれに感受性であることを示し、そして該被験者の機能性ＡＴＭレベルを増加させるように整えられた薬剤で治療するためにそのような被験者を選択することを含む。いくつかの態様では、該方法は、選択された被験者を治療するために該薬剤を投与することを含む。いくつかの態様では、該薬剤は、ＮＳＥリプレッサー剤を含む。いくつかの態様では、ＮＳＥは、配列ｔｃｔａｃａｇｇｔｔｇｇｃｔｇｃａｔａｇａａｇａａａａａｇを含む。いくつかの態様では、ＮＳＥリプレッサー剤は、配列ａｇＴＣＴＡＣＡＧＧＴＴＧＧＣＴＧＣＡＴＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＧｇｔａｇａｇ；又はｔｃｔｔａｇＴＣＴＡＣＡＧＧＴＴＧＧＣＴＧＣＡＴＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＧｇｔａｇａｇ；又はｔｃｔｃａｇＴＣＴＡＣＡＧＧＴＴＧＧＣＴＧＣＡＴＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＧｇｔａｇａｇ内のＮＳＥへ結合するように整えられる。いくつかの態様では、ＮＳＥリプレッサー剤は、ＮＳＥ又はＡＴＭイントロン２８内のその５’又は３’スプライス部位へ結合するように整えられる。

【0006】

[0006] ある態様では、本明細書に開示するのは、被験者において機能性ＡＴＭタンパク質欠損を治療又は予防する方法であって、該方法は、ヒトゲノムのＮＳＥ（ＡＴＭイントロン２８内のクリプティックエクソン）の３’スプライス部位に対して－３位に位置する非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１の存在を同定し、ここで、非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１の存在は、該被験者が機能性ＡＴＭタンパク質欠損を有するか又はそれに感受性であることを示し、そして機能性ＡＴＭレベルを増加させるように整えられた薬剤を該被験者へ投与することを含む。いくつかの態様では、ＮＳＥは、配列ｔｃｔａｃａｇｇｔｔｇｇｃｔｇｃａｔａｇａａｇａａａａａｇを含む。いくつかの態様では、ＮＳＥリプレッサー剤は、配列ａｇＴＣＴＡＣＡＧＧＴＴＧＧＣＴＧＣＡＴＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＧｇｔａｇａｇ；又はｔｃｔｔａｇＴＣＴＡＣＡＧＧＴＴＧＧＣＴＧＣＡＴＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＧｇｔａｇａｇ；又はｔｃｔｃａｇＴＣＴＡＣＡＧＧＴＴＧＧＣＴＧＣＡＴＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＧｇｔａｇａｇ内のＮＳＥへ結合するように整えられる。いくつかの態様では、ＮＳＥリプレッサー剤は、ＮＳＥ又はＡＴＭイントロン２８内のその５’又は３’スプライス部位へ結合するように整えられる。

【0007】

[0007] ある態様では、本明細書に開示するのは、機能性ＡＴＭタンパク質欠損に関連した病態を治療又は予防する方法であって、機能性ＡＴＭタンパク質レベルを増加させるように整えられたＮＳＥリプレッサー剤の投与を含み、該薬剤は、プレｍＲＮＡ転写産物のＡＴＭイントロン２８内のＮＳＥへ結合して成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含を減少させるように整えられる。いくつかの態様では、成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含を減少させることが、機能性ＡＴＭタンパク質発現の増加を提供する。いくつかの態様では、被験者又はリスク状態の被験者集団において機能性ＡＴＭタンパク質欠損の治療又は予防する方法は、機能性ＡＴＭタンパク質欠損に関連した病態又は症状を治療又は予防するためである。いくつかの態様では、該病態は、毛細血管拡張性運動失調症、がん、免疫不全、細胞の放射線感受性、又は染色体の不安定性である。いくつかの態様では、ＮＳＥは、配列ｔｃｔａｃａｇｇｔｔｇｇｃｔｇｃａｔａｇａａｇａａａａａｇを含む。いくつかの態様では、ＮＳＥリプレッサー剤は、配列ａｇＴＣＴＡＣＡＧＧＴＴＧＧＣＴＧＣＡＴＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＧｇｔａｇａｇ；又はｔｃｔｔａｇＴＣＴＡＣＡＧＧＴＴＧＧＣＴＧＣＡＴＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＧｇｔａｇａｇ；又はｔｃｔｃａｇＴＣＴＡＣＡＧＧＴＴＧＧＣＴＧＣＡＴＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＧｇｔａｇａｇ内のＮＳＥへ結合するように整えられる。いくつかの態様では、ＮＳＥリプレッサー剤は、ＮＳＥ又はＡＴＭイントロン２８内のその５’又は３’スプライス部位へ結合するように整えられる。

【0008】

[0008] ある態様では、本明細書に開示するのは、被験者においてＡＴＭ発現の脱制御に関連した病態を治療又は予防する方法であって、ＮＳＥアクチベーター剤の投与を含み、ここで、ＮＳＥアクチベーター剤は、ＡＴＭイントロン２８内の調節モチーフへ結合することによってＡＴＭ成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含を増加させるように整えられ、場合により、ＡＴＭイントロン２８内の調節モチーフは、スプライソソーム成分についてＮＳＥと競合し、さらに場合により、そのようなモチーフは、プレｍＲＮＡ転写産物のＡＴＭイントロン２８内のＮＳＥの３’に位置する２４ヌクレオチドのシュードエクソン（ＰＥ）を含むか又は該シュードエクソンの上流にあるＵ２ＡＦ６５結合部位へ結合する。

【0009】

[0009] ある態様では、本明細書に開示するのは、該被験者においてがんを治療又は予防する方法であり、該方法は、放射線療法のようなＤＮＡ傷害剤での細胞傷害性療法へのがん細胞の感受性を増加させるように整えられたＮＳＥアクチベーター剤を投与し、ここで、ＮＳＥアクチベーター剤は、ＡＴＭイントロン２８内の調節モチーフへ結合することによってＡＴＭ成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含を増加させるように整えられ、
場合により、ＡＴＭイントロン２８内の調節モチーフは、スプライソソーム成分についてＮＳＥと競合し、さらに場合により、そのようなモチーフは、プレｍＲＮＡ転写産物のＡＴＭイントロン２８内のＮＳＥの３’に位置する２４ヌクレオチドのシュードエクソン（ＰＥ）を含むか又は該シュードエクソンの上流にあるＵ２ＡＦ６５結合部位へ結合し、そして放射線療法又は化学療法のような細胞傷害性療法で被験者を治療することを含む。いくつかの態様では、成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含を増加させることが、機能性ＡＴＭタンパク質発現の減少を提供する。いくつかの態様では、シュードエクソンは、配列ｔｃａｔｃｇａａｔａｃｔｔｔｔｇｇａａａｔａａｇを含む。

【0010】

[0010] ある態様では、本明細書に開示するのは、放射線療法又は化学療法のようなＤＮＡ傷害剤での細胞傷害性療法への細胞の感受性を増加させる方法であって、該方法は、ＡＴＭイントロン２８内のモチーフへ結合することによってＡＴＭ成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含を増加させるように整えられたＮＳＥアクチベーター剤を投与することによりＡＴＭタンパク質発現を低下させることを含み、場合により、ＡＴＭイントロン２８内の調節モチーフは、スプライソソーム成分についてＮＳＥと競合し、さらに場合により、そのようなモチーフは、プレｍＲＮＡ転写産物のＡＴＭイントロン２８内のＮＳＥの３’に位置する２４ヌクレオチドのシュードエクソン（ＰＥ）を含むか又は該シュードエクソンの上流にあるＵ２ＡＦ６５結合部位へ結合する。

【0011】

[0011] ある態様では、本明細書に開示するのは、被験者、細胞、又は組織において機能性ＡＴＭ発現を増減させる方法であり、該方法は、本明細書に記載のＮＳＥアクチベーター剤及び／又はＮＳＥリプレッサー剤を投与することを含む。いくつかの態様では、ＮＳＥリプレッサー剤及び／又はＮＳＥアクチベーター剤は、ポリ核酸ポリマーを含む。いくつかの態様では、ＮＳＥリプレッサー剤及び／又はＮＳＥアクチベーター剤は、ＳＳＯ（スプライススイッチングオリゴヌクレオチド）である。いくつかの態様では、ＮＳＥリプレッサー剤及び／又はＮＳＥアクチベーター剤は、ＮＳＥリプレッサー剤及び／又はＮＳＥアクチベーター剤を細胞へ送達するのに適した送達ビヒクルと会合している。いくつかの態様では、ＮＳＥリプレッサー剤は、配列ｃｕｕｃｕａｕｇｃａｇｃｃａａｃｃｕｇｕａｇａｃｕのＳＳＯ（ＳＳＯ－ＮＳＥ３）若しくはその核酸類似体；又は配列ａｃｃｕｕｕｕｕｃｕｕｃｕａｕｇｃａｇｃｃａａｃのＳＳＯ（ＳＳＯ－ＮＳＥ５）若しくはその核酸類似体を含む；及び／又はＮＳＥリプレッサー剤は、ａａｃａｕｕｕｃｕａｕｕｕａｇｕｕａａａａｇｃ（ＳＳＯ Ａ１１）；ｕｕａｇｕａｕｕｃｃｕｕｇａｃｕｕｕａ（ＳＳＯ Ａ１７）；ｇａｃｕｇｇｕａａａｕａａｕａａａｃａｕａａｕｕｃ（ＳＳＯ Ｂ２）；ａｕａｕａｕｕａｇａｇａｕａｃａｕｃａｇｃｃ（ＳＳＯ Ｂ４）；及びｕｕａｇａｇａａｕｃａｕｕｕｕａａａｕａａｇａｃ（ＳＳＯ ＡＮ３）、又はこれらの組合せを含む群より選択されるいずれか１つのＳＳＯを含むか又はそれから成る。又は、本明細書に開示するのは、ＮＳＥアクチベーター剤がＳＳＯ ＰＥｋｒ／ＰＥｄｅｌを含む；及び／又はＮＳＥアクチベーター剤が、ａａｃｕｕａａａｇｇｕｕａｕａｕｃｕｃ（ＳＳＯ Ａ２）；ｕａｕａａａｕａｃｇａａｕａａａｕｃｇａ（ＳＳＯ Ａ４）；ｃａａｃａｃｇａｃａｕａａｃｃａａａ（ＳＳＯ Ａ９）；ｇｇｕａｕｇａｇａａｃｕａｕａｇｇａ（ＳＳＯ Ａ２３）；ｇｇｕａａｕａａｇｕｇｕｃａｃａａａ（ＳＳＯ Ａ２５）；ｇｕａｕｃａｕａｃａｕｕａｇａａｇｇ（ＳＳＯ Ａ２６）；及びｕｇｕｇｇｇｇｕｇａｃｃａｃａｇｃｕｕ（ＳＳＯ Ｂ１１）、又はこれらの組合せを含む群より選択されるいずれか１つのＳＳＯを含むか又はそれから成る、請求項１３～２２のいずれか１項に記載の方法である。

【0012】

[0012] ある態様では、本明細書に開示するのは、ＡＴＭ脱制御に関連した病態への治療に対する被験者の応答を予測するためのｒｓ６０９２６１及び／又はｒｓ４９８８０００遺伝子型決定の使用である。

【0013】

[0013] ある態様では、本明細書に開示するのは、本明細書に記載のＮＳＥリプレッサー剤及び／又はＮＳＥアクチベーター剤を含む組成物である。いくつかの態様では、該組成物は、医薬的に許容される製剤である。

【0014】

[0014] ある態様では、本明細書に開示するのは、被験者において機能性ＡＴＭタンパク質欠損を治療又は予防する方法であって、該方法は、そのヒトゲノムのＮＳＥ（ＡＴＭイントロン２８内のクリプティックエクソン）の３’スプライス部位に対して－３位に位置する非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１の存在を同定し、ここで、非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１の存在は、該被験者が機能性ＡＴＭタンパク質欠損を有するか又はそれに感受性であることを示し、そして非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１をチミン残基に置換するように整えられた薬剤を該被験者へ投与することを含む。

【0015】

[0015] ある態様では、本明細書に開示するのは、機能性ＡＴＭタンパク質欠損の被験者において治療又は予防する方法であって、該方法は、ヒトゲノムのＮＳＥ（ＡＴＭイントロン２８内のクリプティックエクソン）の３’スプライス部位に対して－３位に位置する非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１をチミン残基に置換することを含む。いくつかの態様では、非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１を置換することは、非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１をチミン残基に置換するように整えられた薬剤を該被験者へ投与することを含む。いくつかの態様では、非チミン残基を置換するための薬剤は、ゲノム編集分子である。いくつかの態様では、非チミン残を置換するための薬剤は、ｒｓ６０９２６１を標的とするように整えられた適正なＲＮＡ分子と一緒の、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９又はその機能性同等物である。

【0016】

[0016] ある態様では、本明細書に開示するのは、被験者において機能性ＡＴＭタンパク質欠損を治療又は予防する方法であって、該方法は、ヒトゲノムのｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基の存在を同定し、ここで、ｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基の存在は、該被験者が機能性ＡＴＭタンパク質欠損を有するか又はそれに感受性であることを示し、そして、ｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基をアデニンに置換するように整えられた薬剤を該被験者へ投与することを含む。

【0017】

[0017] ある態様では、本明細書に開示するのは、被験者において機能性ＡＴＭタンパク質欠損を治療又は予防する方法であって、該方法は、ヒトゲノムのｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基をアデニン残基に置換すること、又はＳＳＯの結合によって該グアニン残基を遮断することを含む。いくつかの態様では、ｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基を置換することは、ｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基をアデニン残基に置換するように整えられた薬剤を該被験者へ投与することを含む。いくつかの態様では、グアニン残基を置換するための薬剤は、ゲノム編集分子である。いくつかの態様では、グアニン残基を置換するための薬剤は、ｒｓ４９８８０００を標的とするように整えられた適正なＲＮＡ分子と一緒の、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９又はその機能性同等物である。

【0018】

[0018] ある態様では、本明細書に開示するのは、被験者又は被験者の集団において機能性ＡＴＭタンパク質欠損への感受性についてスクリーニングする方法であって、該スクリーニングは、ヒトゲノムのｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基の存在を決定することを含み、ここで、ｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基の存在は、該被験者（又は被験者群）が機能性ＡＴＭタンパク質欠損を有するか又はそれに感受性であることを示す。

【0019】

[0019] ある態様では、本明細書に開示するのは、機能性ＡＴＭタンパク質欠損に感受性である被験者又は被験者の集団を治療又は予防するために選択する方法であって、該方
法は、ヒトゲノムのｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基の存在を決定し、ここで、ｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基の存在は、該被験者が機能性ＡＴＭタンパク質欠損を有するか又はそれに感受性であることを示し、そして、該被験者の機能性ＡＴＭレベルを増加させるように整えられた薬剤で治療するためにそのような被験者を選択することを含む。

【0020】

[0020] ある態様では、本明細書に開示するのは、被験者において機能性ＡＴＭタンパク質欠損を治療又は予防する方法であって、該方法は、ヒトゲノムのｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基の存在を同定し、ここで、ｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基の存在は、該被験者が機能性ＡＴＭタンパク質欠損を有するか又はそれに感受性であることを示し、そして、機能性ＡＴＭレベルを増加させるように整えられた薬剤を該被験者へ投与することを含む。いくつかの態様では、該方法は、ＣＧハプロタイプをＴＡへ改変することと組み合わされる。いくつかの態様では、該方法は、被験者においてＣＧハプロタイプを同定することと組み合わされ、場合により、先行する特許請求項に従って患者を治療するか又は治療のために選択する。

【0021】

[0021] ある態様では、本明細書に開示するのは、成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含の調節を改変する方法であり、該方法は、スプライソソーム成分についてＮＳＥと競合する、ＮＳＥの上流又は下流にある１以上のスプライシング調節モチーフを挿入又は欠失させることを含み、前記調節モチーフは、クリプティックスプライス部位又はシュードエクソンを含む。

【0022】

[0022] ある態様では、本明細書に開示するのは、タンパク質をコードする遺伝子の成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含によって調節される機能性タンパク質の発現の調節を改変する方法であり、該方法は、スプライソソーム成分についてＮＳＥと競合する、ＮＳＥの上流又は下流にある１以上のスプライシング調節モチーフを挿入又は欠失させることを含み、前記調節モチーフは、クリプティックスプライス部位又はシュードエクソンを含む。いくつかの態様では、１以上のスプライシング調節モチーフの挿入又は欠失は、ＡＴＭイントロン２８のゲノムＤＮＡ内である。いくつかの態様では、１以上のスプライシング調節モチーフの挿入は、成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含の低下を引き起こす。いくつかの態様では、１以上のスプライシング調節モチーフの欠失は、成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含の増加を引き起こす。いくつかの態様では、１以上のスプライシング調節モチーフの挿入又は欠失は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９のようなゲノム編集技術の使用を含む。

【0023】

[0023] ある態様では、本明細書に開示するのは、ｒｓ６０９２６１変異体及び／又はｒｓ４９８８０００変異体を同定するための１以上のオリゴヌクレオチドプローブを含むキットである。いくつかの態様では、１以上のオリゴヌクレオチドプローブは、ｒｓ６０９２６１及び／又はｒｓ４９８８０００を含む核酸の領域をＰＣＲ増幅する際に使用するためのプライマーである。

【0024】

[0024] ある態様では、本明細書に開示するのは、ＮＳＥアクチベーター剤及び／又はＮＳＥリプレッサー剤をコードする核酸を含むベクターである。
[0025] ある態様では、本明細書に開示するのは、遺伝子の発現の調節を改変することが可能な薬剤をスクリーニングする方法であり、該方法は：機能性の遺伝子発現を制限するナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構のスイッチエクソン（ＮＳＥ）を同定し；スプライソソーム成分についてＮＳＥと競合する、ＮＳＥの上流又は下流にある１以上のスプライシング調節モチーフを同定し、ここで、前記調節モチーフは、クリプティックスプライス部位又はシュードエクソンを含み；そのスプライシング調節モチーフへワトソン－クリック塩基対合を介してハイブリダイズするように整えられたアンチセンスポリ核酸で１以上
のスプライシング調節モチーフを標的とし；そして該遺伝子の成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含が増加するか又は減少するかを決定することを含む。

【0025】

[0026] ある態様では、本明細書に開示するのは、遺伝子の発現を調節する方法であり、該方法は、スプライソソーム成分についてナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構のスイッチエクソン（ＮＳＥ）と競合する、クリプティックスプライス部位又はシュードエクソンのようなスプライシング調節モチーフへ結合するように整えられた薬剤を提供することを含む。

【0026】

[0027] ある態様では、本明細書に開示するのは、スプライソソーム成分についてナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構のスイッチエクソン（ＮＳＥ）と競合する、クリプティックスプライス部位又はシュードエクソンのような遺伝子スプライシング調節モチーフへ結合するように整えられた薬剤であり、スプライシング調節モチーフは、該遺伝子の成熟ＲＮＡ転写産物内へのＮＳＥの包含を調節する。

【0027】

[0028] ある態様では、本明細書に開示するのは、実質的に本明細書に記載され、添付の図面を参照してもよい、方法、使用、組成物、ベクター、又は薬剤である。
援用
[0029] 本明細書において言及されるすべての刊行物、特許、及び特許出願は、それぞれ個別の刊行物、特許、又は特許出願が、具体的かつ個別的に援用されると示されるのと同じ程度で本明細書に援用される。
本願は以下の発明を包含する。
［項目１］ 機能性ＡＴＭタンパク質欠損への感受性に関して被験者をスクリーニングする方法であって、
ヒト被験者のゲノムのＮＳＥ（ＡＴＭイントロン２８内のクリプティックエクソン）の３’スプライス部位に対して－３位に位置する非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１の存在を決定することを含み、
非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１の存在は、該被験者が機能性ＡＴＭタンパク質欠損を有するか又はそれに感受性であることを示す、前記方法。
［項目２］ 機能性ＡＴＭタンパク質欠損に感受性の被験者を治療のために選択する方法であって、
ヒト被験者のゲノムのＮＳＥ（ＡＴＭイントロン２８内のクリプティックエクソン）の３’スプライス部位に対して－３位に位置する非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１の存在を決定し、ここで、非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１の存在は、該被験者が機能性ＡＴＭタンパク質欠損を有するか又はそれに感受性であることを示し、そして
該被験者を薬剤による治療のために選択し、それにより該被験者における機能性ＡＴＭレベルを増加させる、
ことを含む、前記方法。
［項目３］ 選択された被験者へ薬剤を投与し、それにより該被験者を治療することをさらに含む、項目２に記載の方法。
［項目４］ 薬剤がＮＳＥリプレッサー剤を含む、項目２又は３に記載の方法。
［項目５］ 被験者において機能性ＡＴＭタンパク質欠損を治療又は予防する方法であって、
ヒト被験者のゲノムのＮＳＥ（ＡＴＭイントロン２８内のクリプティックエクソン）の３’スプライス部位に対して－３位に位置する非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１の存在を同定し、ここで、非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１の存在は、該被験者が機能性ＡＴＭタンパク質欠損を有するか又はそれに感受性であることを示し、そして
該被験者へ機能性ＡＴＭレベルを増加させる薬剤を投与する、
ことを含む、前記方法。
［項目６］ 機能性ＡＴＭタンパク質欠損に関連した病態を治療又は予防する方法であっ
て、
ＮＳＥリプレッサー剤を被験者へ投与し、それにより機能性ＡＴＭタンパク質レベルを増加させることを含み、
該薬剤は、プレｍＲＮＡ転写産物のＡＴＭイントロン２８内のＮＳＥへ結合し、それによりプレｍＲＮＡ転写産物の成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含を減少させる、前記方法。
［項目７］ 成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含の減少が、機能性ＡＴＭタンパク質発現を増加させる、項目６に記載の方法。
［項目８］ 機能性ＡＴＭタンパク質欠損に関連した病態又は症状の治療又は予防のためである、項目５～７のいずれか１項に記載の方法。
［項目９］ 病態が、毛細血管拡張性運動失調症、がん、免疫不全、細胞の放射線感受性、又は染色体の不安定性である、項目８に記載の方法。
［項目１０］ ＮＳＥが、ｔｃｔａｃａｇｇｔｔｇｇｃｔｇｃａｔａｇａａｇａａａａａｇを含む配列を含む、項目１～９のいずれか１項に記載の方法。
［項目１１］ ＮＳＥリプレッサー剤が：
ａｇＴＣＴＡＣＡＧＧＴＴＧＧＣＴＧＣＡＴＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＧｇｔａｇａｇ；又は
ｔｃｔｔａｇＴＣＴＡＣＡＧＧＴＴＧＧＣＴＧＣＡＴＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＧｇｔａｇａｇ；又は
ｔｃｔｃａｇＴＣＴＡＣＡＧＧＴＴＧＧＣＴＧＣＡＴＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＧｇｔａｇａｇ、
を含む配列内でＮＳＥへ結合する、項目４～１０のいずれか１項に記載の方法。
［項目１２］ ＮＳＥリプレッサー剤が、ＮＳＥ又はＮＳＥのＡＴＭイントロン２８内の５’若しくは３’スプライス部位へ結合する、項目４～１０のいずれか１項に記載の方法。
［項目１３］ 被験者においてＡＴＭ発現の脱制御に関連した病態を治療又は予防する方法であって、
ＮＳＥアクチベーター剤を被験者へ投与することを含み、
ＮＳＥアクチベーター剤は、ＡＴＭイントロン２８内の調節モチーフへ結合することによって、又はＡＴＭプレｍＲＮＡ転写産物のＡＴＭイントロン２８内のＮＳＥの３’に位置するシュードエクソンの上流にあるＵ２ＡＦ６５結合部位へ結合することによって、ＡＴＭ成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含を増加させる、前記方法。
［項目１４］ 該被験者においてがんを治療又は予防する方法であって、
ＮＳＥアクチベーター剤を被験者へ投与し、ここで、ＮＳＥアクチベーター剤は、放射線療法のようなＤＮＡ傷害剤による細胞傷害性療法へのがん細胞の感受性を増加させ、そして、ＡＴＭイントロン２８内の調節モチーフへ結合することによって、又はＡＴＭプレｍＲＮＡ転写産物のＡＴＭイントロン２８内のＮＳＥの３’に位置するシュードエクソンの上流にあるＵ２ＡＦ６５結合部位へ結合することによって、ＡＴＭ成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含を増加させ、そして
放射線療法又は化学療法のような細胞傷害性療法で被験者を治療する、
ことを含む、前記方法。
［項目１５］ 放射線療法又は化学療法のようなＤＮＡ傷害剤による細胞傷害性療法への細胞の感受性を増加させる方法であって、
ＮＳＥアクチベーター剤を投与することによってＡＴＭタンパク質発現を低下させることを含み、
ＮＳＥアクチベーター剤は、ＡＴＭイントロン２８内のモチーフへ結合することによって、又はＡＴＭプレｍＲＮＡ転写産物のＡＴＭイントロン２８内のＮＳＥの３’に位置するシュードエクソンの上流にあるＵ２ＡＦ６５結合部位へ結合することによって、ＡＴＭ成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含を増加させる、前記方法。
［項目１６］ 成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含を増加させることが、機能性Ａ
ＴＭタンパク質発現の減少を提供する、項目１３～１５のいずれか１項に記載の方法。
［項目１７］ シュードエクソンが、配列ｔｃａｔｃｇａａｔａｃｔｔｔｔｇｇａａａｔａａｇを含む、項目１３～１６のいずれか１項に記載の方法。
［項目１８］ ＡＴＭイントロン２８内の調節モチーフが、スプライソソーム成分に対してＮＳＥと競合する、項目１３～１７のいずれか１項に記載の方法。
［項目１９］ ＡＴＭイントロン２８内の調節モチーフが、プレｍＲＮＡ転写産物のＡＴＭイントロン２８内のＮＳＥの３’に位置する２４ヌクレオチドのシュードエクソン（ＰＥ）を含む、項目１３～１８のいずれか１項に記載の方法。
［項目２０］ 被験者、細胞、又は組織において機能性ＡＴＭ発現を調整する方法であって、本明細書に記載のＮＳＥアクチベーター剤及び／又はＮＳＥリプレッサー剤を投与することを含む、前記方法。
［項目２１］ ＮＳＥリプレッサー剤及び／又はＮＳＥアクチベーター剤が、ポリ核酸ポリマーを含む、項目１～２０のいずれか１項に記載の方法。
［項目２２］ ＮＳＥリプレッサー剤及び／又はＮＳＥアクチベーター剤が、ＳＳＯ（スプライススイッチングオリゴヌクレオチド）である、項目１～２１のいずれか１項に記載の方法。
［項目２３］ ＮＳＥリプレッサー剤及び／又はＮＳＥアクチベーター剤が、ＮＳＥリプレッサー剤及び／又はＮＳＥアクチベーター剤を細胞へ送達するのに適した送達ビヒクルと結合している、項目１～２２のいずれか１項に記載の方法。
［項目２４］ ＮＳＥリプレッサー剤が：
配列ｃｕｕｃｕａｕｇｃａｇｃｃａａｃｃｕｇｕａｇａｃｕのＳＳＯ（ＳＳＯ－ＮＳＥ３）若しくはその核酸類似体；又は
配列ａｃｃｕｕｕｕｕｃｕｕｃｕａｕｇｃａｇｃｃａａｃのＳＳＯ（ＳＳＯ－ＮＳＥ５）若しくはその核酸類似体を含むか、及び／又は
ＮＳＥリプレッサー剤が：ａａｃａｕｕｕｃｕａｕｕｕａｇｕｕａａａａｇｃ（ＳＳＯ
Ａ１１）；ｕｕａｇｕａｕｕｃｃｕｕｇａｃｕｕｕａ（ＳＳＯ Ａ１７）；ｇａｃｕｇｇｕａａａｕａａｕａａａｃａｕａａｕｕｃ（ＳＳＯ Ｂ２）；ａｕａｕａｕｕａｇａｇａｕａｃａｕｃａｇｃｃ（ＳＳＯ Ｂ４）；及び、ｕｕａｇａｇａａｕｃａｕｕｕｕａａａｕａａｇａｃ（ＳＳＯ ＡＮ３）、若しくはこれらの組合せを含む群より選択されるいずれか１つのＳＳＯを含むか又はそれから成る、項目４～１２又は２０～２３のいずれか１項に記載の方法。
［項目２５］ ＮＳＥアクチベーター剤が、ＳＳＯ ＰＥｋｒ／ＰＥｄｅｌを含むか；及び／又は
ＮＳＥアクチベーター剤が：ａａｃｕｕａａａｇｇｕｕａｕａｕｃｕｃ（ＳＳＯ Ａ２）；ｕａｕａａａｕａｃｇａａｕａａａｕｃｇａ（ＳＳＯ Ａ４）；ｃａａｃａｃｇａｃａｕａａｃｃａａａ（ＳＳＯ Ａ９）；ｇｇｕａｕｇａｇａａｃｕａｕａｇｇａ（ＳＳＯ
Ａ２３）；ｇｇｕａａｕａａｇｕｇｕｃａｃａａａ（ＳＳＯ Ａ２５）；ｇｕａｕｃａｕａｃａｕｕａｇａａｇｇ（ＳＳＯ Ａ２６）；及び、ｕｇｕｇｇｇｇｕｇａｃｃａｃａｇｃｕｕ（ＳＳＯ Ｂ１１）、若しくはこれらの組合せを含む群より選択されるいずれか１つのＳＳＯを含むか又はそれから成る、項目１３～１９のいずれか１項に記載の方法。［項目２６］ ＡＴＭ脱制御に関連した病態の治療に対する被験者の応答を予測するための、ｒｓ６０９２６１及び／又はｒｓ４９８８０００遺伝子型決定の使用。
［項目２７］ 本明細書に記載のＮＳＥリプレッサー剤及び／又はＮＳＥアクチベーター剤を含む、組成物。
［項目２８］ 医薬的に許容される製剤である、項目２７に記載の組成物。
［項目２９］ 被験者において機能性ＡＴＭタンパク質欠損を治療又は予防する方法であって、
ヒト被験者のゲノムのＮＳＥ（ＡＴＭイントロン２８内のクリプティックエクソン）の３’スプライス部位に対して－３位に位置する非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１の存在を同定し、ここで、非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１の存在は、該被験者が機能性
ＡＴＭタンパク質欠損を有するか又はそれに感受性であることを示し、そして
非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１をチミン残基に置換する薬剤を該被験者へ投与する、
ことを含む、前記方法。
［項目３０］ 被験者において機能性ＡＴＭタンパク質欠損を治療又は予防する方法であって、ヒト被験者のゲノムのＮＳＥ（ＡＴＭイントロン２８内のクリプティックエクソン）の３’スプライス部位に対して－３位に位置する非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１をチミン残基に置換することを含む、前記方法。
［項目３１］ 非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１を置換することが、非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１をチミン残基に置換するように整えられた薬剤を被験者へ投与することを含む、項目２９又は３０に記載の方法。
［項目３２］ 非チミン残基を置換するための薬剤が、ゲノム編集分子である、項目２９～３１のいずれか１項に記載の方法。
［項目３３］ 非チミン残基を置換するための薬剤が、ｒｓ６０９２６１を標的とするＲＮＡ分子と一緒のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９又はその機能性同等物である、項目２９～３２のいずれか１項に記載の方法。
［項目３４］ 被験者において機能性ＡＴＭタンパク質欠損を治療又は予防する方法であって、
ヒト被験者のゲノムのｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基の存在を同定し、ここで、ｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基の存在は、該被験者が機能性ＡＴＭタンパク質欠損を有するか又はそれに感受性であることを示し、そして
ｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基をアデニンに置換する薬剤を該被験者へ投与する、
ことを含む、前記方法。
［項目３５］ 被験者において機能性ＡＴＭタンパク質欠損を治療又は予防する方法であって、
ヒト被験者のゲノムのｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基をアデニン残基に置換するか、又はｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基へＳＳＯを結合させることによってｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基を遮断する、
ことを含む、前記方法。
［項目３６］ ｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基を置換することが、ｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基をアデニン残基に置換するように整えられた薬剤を被験者へ投与することを含む、項目３４又は３５に記載の方法。
［項目３７］ グアニン残基を置換するための薬剤が、ゲノム編集分子である、項目３４～３６のいずれか１項に記載の方法。
［項目３８］ グアニン残基を置換するための薬剤が、ｒｓ４９８８０００を標的とするＲＮＡ分子と一緒のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９又はその機能性同等物である、項目３１～３４のいずれか１項に記載の方法。
［項目３９］ 被験者又は被験者の集団を機能性ＡＴＭタンパク質欠損への感受性についてスクリーニングする方法であって、
ヒト被験者のゲノムのｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基の存在を決定することを含み、
ｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基の存在は、該被験者（又は被験者群）が機能性ＡＴＭタンパク質欠損を有するか又はそれに感受性であることを示す、前記方法。
［項目４０］ 機能性ＡＴＭタンパク質欠損に感受性である被験者又は被験者の集団を治療又は予防のために選択する方法であって、
ヒト被験者のゲノムのｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基の存在を決定し、ここで、ｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基の存在は、該被験者が機能性ＡＴＭタンパク質欠損を有するか又はそれに感受性であることを示し、そして
該被験者の機能性ＡＴＭレベルを増加させる薬剤で治療するために被験者を選択する、
ことを含む、前記方法。
［項目４１］ 被験者において機能性ＡＴＭタンパク質欠損を治療又は予防する方法であって、
ヒト被験者のゲノムのｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基の存在を同定し、ここで、ｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基の存在は、該被験者が機能性ＡＴＭタンパク質欠損を有するか又はそれに感受性であることを示し、そして
機能性ＡＴＭレベルを増加させる薬剤を該被験者へ投与する、
ことを含む、前記方法。
［項目４２］ ＣＧハプロタイプをＴＡへ修飾することを組み合わせた、項目２９～３３及び３４～３８のいずれか１項に記載の方法。
［項目４３］ 被験者においてＣＧハプロタイプを同定すること、及び任意選択的に、項目１～４２に従って被験者を治療すること又は治療のために被験者を選択することと組み合わせた、項目１及び３６に記載の方法。
［項目４４］ 成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含の調節を改変する方法であって、
スプライソソーム成分に対してＮＳＥと競合する、ＮＳＥの上流又は下流にある１以上のスプライシング調節モチーフを挿入又は欠失させることを含み、
前記１以上のスプライシング調節モチーフは、クリプティックスプライス部位又はシュードエクソンを含む、前記方法。
［項目４５］ 機能性タンパク質をコードする遺伝子の成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含によって調節される機能性タンパク質の発現の調節を改変する方法であって、
スプライソソーム成分に対してＮＳＥと競合する、ＮＳＥの上流又は下流にある１以上のスプライシング調節モチーフを挿入又は欠失させることを含み、
前記１以上のスプライシング調節モチーフは、クリプティックスプライス部位又はシュードエクソンを含む、前記方法。
［項目４６］ １以上のスプライシング調節モチーフの挿入又は欠失が、ＡＴＭイントロン２８のゲノムＤＮＡ内である、項目４４又は４５に記載の方法。
［項目４７］ １以上のスプライシング調節モチーフの挿入が、成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含の低下を引き起こす、項目４４～４６のいずれか１項に記載の方法。
［項目４８］ １以上のスプライシング調節モチーフの欠失が、成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含の増加を引き起こす、項目４４～４６のいずれか１項に記載の方法。
［項目４９］ １以上のスプライシング調節モチーフの挿入又は欠失が、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９のようなゲノム編集技術の使用を含む、項目４４～４８のいずれか１項に記載の方法。
［項目５０］ ｒｓ６０９２６１変異体及び／又はｒｓ４９８８０００変異体を同定するための、１以上のオリゴヌクレオチドプローブを含むキット。
［項目５１］ １以上のオリゴヌクレオチドプローブが、ｒｓ６０９２６１変異体及び／又はｒｓ４９８８０００変異体を含む核酸の領域をＰＣＲ増幅する際に使用するためのプライマーである、項目５０に記載のキット。
［項目５２］ ＮＳＥアクチベーター剤及び／又はＮＳＥリプレッサー剤をコードする核酸を含むベクター。
［項目５３］ 遺伝子発現の調節を改変可能な薬剤をスクリーニングする方法であって：
機能性遺伝子の発現を制限するナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構のスイッチエクソン（ＮＳＥ）を同定し；
スプライソソーム成分に対してＮＳＥと競合する、ＮＳＥの上流又は下流にある１以上のスプライシング調節モチーフを同定し、前記１以上のスプライシング調節モチーフは、クリプティックスプライス部位又はシュードエクソンを含み；
該１以上のスプライシング調節モチーフの１つのスプライシング調節モチーフへワトソン－クリック塩基対合を介してハイブリダイズする配列を含むアンチセンスポリ核酸で、１以上のスプライシング調節モチーフを標的とし；そして
該遺伝子の成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含が増加するか又は減少するかを決定する、
ことを含む、前記方法。
［項目５４］ 遺伝子の発現を調節する方法であって、スプライソソーム成分に対してナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構のスイッチエクソン（ＮＳＥ）と競合する、クリプティックスプライス部位又はシュードエクソンのようなスプライシング調節モチーフへ結合する薬剤を提供することを含む、前記方法。
［項目５５］ スプライソソーム成分に対してナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構のスイッチエクソン（ＮＳＥ）と競合する、クリプティックスプライス部位又はシュードエクソンのような遺伝子スプライシング調節モチーフへ結合する薬剤であって、
遺伝子スプライシング調節モチーフは、該遺伝子の成熟ＲＮＡ転写産物内へのＮＳＥの包含を制御する、前記薬剤。
［項目５６］ 本明細書に実質的に記載され、添付の図面を参照してもよい、方法、使用、組成物、ベクター、又は薬剤。
［項目５７］ タンパク質発現を調節する方法であって：
ａ）単離ポリ核酸ポリマーを被験者の標的細胞へ接触させ；
ｂ）接触されたポリ核酸ポリマーを、予めプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物上の標的モチーフへハイブリダイズさせ、ここで、接触されたポリ核酸ポリマーの標的モチーフへのハイブリダイゼーションは、ナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構のスイッチエクソン（ＮＳＥ）の活性化を促進又は抑制し；
ｃ）予めプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物のｍＲＮＡ転写産物をプロセシングし、ここで、ＮＳＥは該ｍＲＮＡ転写産物内に存在するか又は存在せず；そして
ｄ）工程ｃ）のプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物を翻訳し、ここで、ＮＳＥの有無はタンパク質発現を調節する、
ことを含む、前記方法。
［項目５８］ タンパク質が、プロセシングされたｍＲＮＡ転写産物より発現される、項目５７に記載の方法。
［項目５９］ ＮＳＥの存在が、タンパク質発現を下方制御する、項目５７に記載の方法。
［項目６０］ ＮＳＥの不存在が、タンパク質発現を上方制御する、項目５７に記載の方法。
［項目６１］ ポリ核酸ポリマーが、ＡＴＭイントロン２８内のモチーフへハイブリダイズする、項目５７に記載の方法。
［項目６２］ モチーフが、スプライソソーム成分に対してＮＳＥと競合するスプライシング調節モチーフである、項目６１に記載の方法。
［項目６３］ スプライシング調節モチーフが、クリプティックスプライス部位又はシュードエクソンを含む、項目６２に記載の方法。
［項目６４］ シュードエクソンが、プレｍＲＮＡ転写産物のＡＴＭイントロン２８内のＮＳＥの３’に位置する２４ヌクレオチドのシュードエクソンである、項目６３に記載の方法。
［項目６５］ モチーフが、Ｕ２ＡＦ６５結合部位である、項目６２に記載の方法。
［項目６６］ モチーフが、転移因子の内部、転移因子の上流、又は転移因子の下流にあるモチーフである、項目６２に記載の方法。
［項目６７］ 転移因子が、Ａｌｕ又はＭＥＲ５１である、項目６６に記載の方法。
［項目６８］ 単離ポリ核酸ポリマーが、Ａｌｕ内の標的モチーフへハイブリダイズする、項目６７に記載の方法。
［項目６９］ 単離ポリ核酸ポリマーが、Ａｌｕの上流又は下流にある標的モチーフへハイブリダイズする、項目６７に記載の方法。
［項目７０］ 単離ポリ核酸ポリマーが、ＭＥＲ５１の下流にある標的モチーフへハイブリダイズする、項目６７に記載の方法。
［項目７１］ ポリ核酸ポリマーが、長さ約１０～約５０ヌクレオチドである、項目５７～７０のいずれか１項に記載の方法。
［項目７２］ 単離ポリ核酸ポリマーが、配列番号１８～５２から成る群より選択される配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性がある配列を含む、項目５７～７１のいずれか１項に記載の方法。
［項目７３］ タンパク質発現を調節する方法であって：
ａ）単離ポリ核酸ポリマーを被験者の標的細胞へ接触させ；
ｂ）接触されたポリ核酸ポリマーを、転移因子内の標的モチーフへハイブリダイズさせ、ここで、接触されたポリ核酸ポリマーの標的モチーフへのハイブリダイゼーションは、ナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構のスイッチエクソン（ＮＳＥ）の活性化を促進又は抑制し；
ｃ）予めプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物のｍＲＮＡ転写産物をプロセシングし、ここで、ＮＳＥは該ｍＲＮＡ転写産物内に存在するか又は存在せず；そして
ｄ）工程ｃ）のプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物を翻訳し、ここで、ＮＳＥの有無はタンパク質発現を調節する、
ことを含む、前記方法。
［項目７４］ タンパク質発現を調節する方法であって：
ａ）単離ポリ核酸ポリマーを被験者の標的細胞へ接触させ；
ｂ）接触されたポリ核酸ポリマーを、転移因子の上流又は下流にある標的モチーフへハイブリダイズさせ、ここで、接触されたポリ核酸ポリマーの標的モチーフへのハイブリダイゼーションは、ナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構のスイッチエクソン（ＮＳＥ）の活性化を促進又は抑制し；
ｃ）予めプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物のｍＲＮＡ転写産物をプロセシングし、ここで、ＮＳＥは、ｍＲＮＡ転写産物内に存在するか又は存在せず；そして
ｄ）工程ｃ）のプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物を翻訳し、ここで、ＮＳＥの有無は、タンパク質発現を調節する、
ことを含む、前記方法。
［項目７５］ タンパク質が、プロセシングされたｍＲＮＡ転写産物より発現される、項目７３又は７４に記載の方法。
［項目７６］ ＮＳＥの存在が、タンパク質発現を下方制御する、項目７３又は７４に記載の方法。
［項目７７］ ＮＳＥの不存在が、タンパク質発現を上方制御する、項目７３又は７４に記載の方法。
［項目７８］ 転移因子が、Ａｌｕ又はＭＥＲ５１である、項目７３又は７４に記載の方法。
［項目７９］ 単離ポリ核酸ポリマーが、配列番号１８～５２から成る群より選択される配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性がある配列を含む、項目７３又は７４に記載の方法。
［項目８０］ ポリ核酸ポリマーが、長さ約１０～約５０ヌクレオチドである、項目７３、７４、又は７９のいずれか１項に記載の方法。
［項目８１］ 単離ポリ核酸ポリマーが、Ａｌｕ内の標的モチーフへハイブリダイズする、項目７３に記載の方法。
［項目８２］ 単離ポリ核酸ポリマーが、Ａｌｕの上流又は下流にある標的モチーフへハイブリダイズする、項目７４に記載の方法。
［項目８３］ 単離ポリ核酸ポリマーが、ＭＥＲ５１の下流にある標的モチーフへハイブリダイズする、項目７４に記載の方法。
［項目８４］ ＮＳＥの活性化が、エクソンスキッピングをさらに誘導する、項目７３又は７４に記載の方法。
［項目８５］ ＮＳＥが、イントロン２８内に位置している、項目７３、７４、又は８４のいずれか１項に記載の方法。
［項目８６］ ＮＳＥが、ＡＴＭタンパク質発現を調節する、項目７３、７４、８４、又は８５のいずれか１項に記載の方法。
［項目８７］ それを必要とする被験者においてＡＴＭ発現の脱制御に関連した疾患又は病態を治療又は予防する方法であって：
（ｉ）予めプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物と相互作用して、プロセシングされたｍＲＮＡ転写産物内へのＮＳＥの包含を促進させる、ナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構のスイッチエクソン（ＮＳＥ）アクチベーター剤；及び
（ｉｉ）医薬的に許容される賦形剤及び／又は送達ビヒクル、
を含む医薬組成物を該被験者へ投与することを含み、
ＡＴＭ発現の脱制御に関連した疾患又は病態は、該ＮＳＥアクチベーター剤の投与によって該被験者において治療又は予防される、前記方法。
［項目８８］ それを必要とする被験者において機能性ＡＴＭタンパク質欠損に関連した疾患又は病態を治療又は予防する方法であって：
（ｉ）予めプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物と相互作用して、プロセシングされたｍＲＮＡ転写産物内のＮＳＥの排除を促進させる、ナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構のスイッチエクソン（ＮＳＥ）リプレッサー剤；及び
（ｉｉ）医薬的に許容される賦形剤及び／又は送達ビヒクル、
を含む医薬組成物を該被験者へ投与することを含み、
機能性ＡＴＭタンパク質欠損に関連した疾患又は病態は、該ＮＳＥリプレッサー剤の投与によって該被験者において治療又は予防される、前記方法。
［項目８９］ ＮＳＥアクチベーター剤が、単離ポリ核酸ポリマーである、項目８７に記載の方法。
［項目９０］ ＮＳＥリプレッサー剤が、単離ポリ核酸ポリマーである、項目８８に記載の方法。
［項目９１］ ポリ核酸ポリマーが、ＡＴＭイントロン２８内のモチーフへハイブリダイズする、項目８９又は９０に記載の方法。
［項目９２］ ポリ核酸ポリマーが、スプライソソーム成分に対してＮＳＥと競合するスプライシング調節モチーフへハイブリダイズする、項目８９に記載の方法。
［項目９３］ スプライシング調節モチーフが、クリプティックスプライス部位又はシュードエクソンを含む、項目９２に記載の方法。
［項目９４］ シュードエクソンが、プレｍＲＮＡ転写産物のＡＴＭイントロン２８内のＮＳＥの３’に位置する２４ヌクレオチドのシュードエクソンである、項目９３に記載の方法。
［項目９５］ ポリ核酸ポリマーが、Ｕ２ＡＦ６５結合部位へハイブリダイズする、項目８９に記載の方法。
［項目９６］ ポリ核酸ポリマーが、転移因子の内部、転移因子の上流、又は転移因子の下流にあるモチーフへハイブリダイズする、項目８９又は９０に記載の方法。
［項目９７］ 転移因子が、Ａｌｕ又はＭＥＲ５１である、項目９６に記載の方法。
［項目９８］ 単離ポリ核酸ポリマーが、Ａｌｕ内の標的モチーフへハイブリダイズする、項目９７に記載の方法。
［項目９９］ 単離ポリ核酸ポリマーが、Ａｌｕの上流又は下流にある標的モチーフへハイブリダイズする、項目９７に記載の方法。
［項目１００］ 単離ポリ核酸ポリマーが、ＭＥＲ５１の下流にある標的モチーフへハイブリダイズする、項目９７に記載の方法。
［項目１０１］
ポリ核酸ポリマーが、長さ約１０～約５０ヌクレオチドである、項目８９～１００のいずれか１項に記載の方法。
［項目１０２］ 単離ポリ核酸ポリマーが、配列番号１８～５２から成る群より選択される配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性がある配列を含む、項目８９～１０１のいずれか１項に記載の方法。
［項目１０３］ 疾患又は病態が、がんである、項目８７に記載の方法。
［項目１０４］ それを必要とする被験者において疾患又は病態を治療又は予防する方法であって：
（ｉ）予めプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物と相互作用して、プロセシングされたｍＲＮＡ転写産物内へのＮＳＥの包含を促進させる、ナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構のスイッチエクソン（ＮＳＥ）アクチベーター剤；及び
（ｉｉ）医薬的に許容される賦形剤及び／又は送達ビヒクル、
を含む医薬組成物を該被験者へ投与することを含み、
該疾患又は病態は、該ＮＳＥアクチベーター剤の投与によって該被験者において治療又は予防される、前記方法。
［項目１０５］ それを必要とする被験者において疾患又は病態を治療又は予防する方法であって：
（ｉ）予めプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物と相互作用して、プロセシングされたｍＲＮＡ転写産物内のＮＳＥの排除を促進させる、ナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構のスイッチエクソン（ＮＳＥ）リプレッサー剤；及び
（ｉｉ）医薬的に許容される賦形剤及び／又は送達ビヒクル、
を含む医薬組成物を該被験者へ投与することを含み、
該疾患又は病態は、該ＮＳＥリプレッサー剤の投与によって該被験者において治療又は予防される、前記方法。
［項目１０６］ ＮＳＥアクチベーター剤が、単離ポリ核酸ポリマーである、項目１０４に記載の方法。
［項目１０７］ ＮＳＥリプレッサー剤が、単離ポリ核酸ポリマーである、項目１０５に記載の方法。
［項目１０８］ ポリ核酸ポリマーが、ＡＴＭイントロン２８内のモチーフへハイブリダイズする、項目１０６又は１０７に記載の方法。
［項目１０９］
ポリ核酸ポリマーが、スプライソソーム成分に対してＮＳＥと競合するスプライシング調節モチーフへハイブリダイズする、項目１０６に記載の方法。
［項目１１０］ スプライシング調節モチーフが、クリプティックスプライス部位又はシュードエクソンを含む、項目１０９に記載の方法。
［項目１１１］ シュードエクソンが、プレｍＲＮＡ転写産物のＡＴＭイントロン２８内のＮＳＥの３’に位置する２４ヌクレオチドのシュードエクソンである、項目１１０に記載の方法。
［項目１１２］ ポリ核酸ポリマーが、Ｕ２ＡＦ６５結合部位へハイブリダイズする、項目１０８に記載の方法。
［項目１１３］ ポリ核酸ポリマーが、転移因子の内部、転移因子の上流、又は転移因子の下流にあるモチーフへハイブリダイズする、項目１０６又は１０７に記載の方法。
［項目１１４］ 転移因子が、Ａｌｕ又はＭＥＲ５１である、項目１１３に記載の方法。［項目１１５］ 単離ポリ核酸ポリマーが、Ａｌｕ内の標的モチーフへハイブリダイズする、項目１１４に記載の方法。
［項目１１６］ 単離ポリ核酸ポリマーが、Ａｌｕの上流又は下流にある標的モチーフへハイブリダイズする、項目１１４に記載の方法。
［項目１１７］ 単離ポリ核酸ポリマーが、ＭＥＲ５１の下流にある標的モチーフへハイブリダイズする、項目１１４に記載の方法。
［項目１１８］ ポリ核酸ポリマーが、長さ約１０～約５０ヌクレオチドである、項目１０４～１１７のいずれか１項に記載の方法。
［項目１１９］ 単離ポリ核酸ポリマーが、配列番号１８～５２から成る群より選択される配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性がある配列を含む、項目１０４～１１８のいずれか１項に記載の方法。
［項目１２０］ 疾患又は病態が、がんである、項目１０４に記載の方法。
［項目１２１］ 疾患又は病態が、ＡＴＭ発現の脱制御に関連した疾患又は病態である、項目１０４に記載の方法。
［項目１２２］ 疾患又は病態が、機能性ＡＴＭタンパク質欠損に関連した疾患又は病態である、項目１０５に記載の方法。
［項目１２３］ ポリ核酸ポリマーが、ヌクレオシド部分、リン酸エステル部分、５’末端、３’末端、又はこれらの組合せにおいて修飾されている、項目５７～１２２のいずれか１項に記載の方法。
［項目１２４］ ポリ核酸ポリマーが、人工ヌクレオチドを含む、項目５７～１２３のいずれか１項に記載の方法。
［項目１２５］ 人工ヌクレオチドが、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、Ｔ－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、Ｔ－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、１’，５’－アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、及び２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホロアミダイトから成る群より選択される、項目１２４に記載の方法。
［項目１２６］ 送達ビヒクルが、ナノ粒子ベースの送達ビヒクルを含む、項目８７、８８、１０４、又は１０５に記載の方法。
［項目１２７］ タンパク質発現を調節する方法であって：
ａ）単離ポリ核酸ポリマーを被験者の標的細胞へ接触させ；
ｂ）接触されたポリ核酸ポリマーを転移因子内の標的モチーフへハイブリダイズさせ、ここで、接触されたポリ核酸ポリマーの標的モチーフへのハイブリダイゼーションは、選択的スプライス部位の活性化を促進又は抑制し；
ｃ）予めプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物のｍＲＮＡ転写産物をプロセシングし、ここで、該選択的スプライス部位は、ｍＲＮＡ転写産物内に存在するか又は存在せず；そして
ｄ）工程ｃ）のプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物を翻訳し、ここで、該選択的スプライス部位の有無は、タンパク質発現を調節する、
ことを含む、前記方法。
［項目１２８］ タンパク質発現を調節する方法であって：
ａ）単離ポリ核酸ポリマーを被験者の標的細胞へ接触させ；
ｂ）接触されたポリ核酸ポリマーを転移因子の上流又は下流にある標的モチーフへハイブリダイズさせ、ここで、接触されたポリ核酸ポリマーの標的モチーフへのハイブリダイゼーションは、選択的スプライス部位の活性化を促進又は抑制し；
ｃ）予めプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物のｍＲＮＡ転写産物をプロセシングし、ここで、該選択的スプライス部位は、ｍＲＮＡ転写産物内に存在するか又は存在せず；そして
ｄ）工程ｃ）のプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物を翻訳し、ここで、該選択的スプライス部位の有無は、タンパク質発現を調節する、
ことを含む、前記方法。
［項目１２９］ トランスポゾン因子が、予めプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物上にある、項目１２７又は１２８に記載の方法。
［項目１３０］ タンパク質発現を調節する方法であって：
ａ）単離ポリ核酸ポリマーを被験者の標的細胞へ接触させ；
ｂ）接触されたポリ核酸ポリマーを予めプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物上の標的モチーフへハイブリダイズさせ、ここで、接触されたポリ核酸ポリマーの標的モチーフへのハイブリダイゼーションは、選択的スプライス部位の活性化を促進又は抑制し；
ｃ）予めプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物のｍＲＮＡ転写産物をプロセシングし、ここで、該選択的スプライス部位は、ｍＲＮＡ転写産物内に存在するか又は存在せず；そして
ｄ）工程ｃ）のプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物を翻訳し、ここで、該選択的スプライス部位の有無は、タンパク質発現を調節する、
ことを含む、前記方法。
［項目１３１］ タンパク質が、プロセシングされたｍＲＮＡ転写産物より発現される、項目１３０に記載の方法。
［項目１３２］ ＮＳＥの存在が、タンパク質発現を下方制御する、項目１３０に記載の方法。
［項目１３３］ ＮＳＥの不存在が、タンパク質発現を上方制御する、項目１３０に記載の方法。
［項目１３４］ ポリ核酸ポリマーが、ＡＴＭイントロン２８内のモチーフへハイブリダイズする、項目１３０に記載の方法。
［項目１３５］ モチーフが、スプライソソーム成分に対してＮＳＥと競合するスプライシング調節モチーフである、項目１３４に記載の方法。
［項目１３６］ スプライシング調節モチーフが、クリプティックスプライス部位又はシュードエクソンを含む、項目１３５に記載の方法。
［項目１３７］ シュードエクソンが、プレｍＲＮＡ転写産物のＡＴＭイントロン２８内のＮＳＥの３’に位置する２４ヌクレオチドのシュードエクソンである、項目１３６に記載の方法。
［項目１３８］ モチーフが、Ｕ２ＡＦ６５結合部位である、項目１３４に記載の方法。［項目１３９］ モチーフが、転移因子の内部、転移因子の上流、又は転移因子の下流にあるモチーフである、項目１３４に記載の方法。
［項目１４０］ 転移因子が、Ａｌｕ又はＭＥＲ５１である、項目１３９に記載の方法。［項目１４１］ 単離ポリ核酸ポリマーが、Ａｌｕ内の標的モチーフへハイブリダイズする、項目１４０に記載の方法。
［項目１４２］ 単離ポリ核酸ポリマーが、Ａｌｕの上流又は下流にある標的モチーフへハイブリダイズする、項目１４０に記載の方法。
［項目１４３］ 単離ポリ核酸ポリマーが、ＭＥＲ５１の下流にある標的モチーフへハイブリダイズする、項目１４０に記載の方法。
［項目１４４］ ポリ核酸ポリマーが、長さ約１０～約５０ヌクレオチドである、項目１３０～１４３のいずれか１項に記載の方法。
［項目１４５］ 単離ポリ核酸ポリマーが、配列番号１８～５２から成る群より選択される配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性がある配列を含む、項目１３０～１４４のいずれか１項に記載の方法。
［項目１４６］ ａ）予めプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物と相互作用して、プロセシングされたｍＲＮＡ転写産物内へのＮＳＥの包含を促進する、ナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構のスイッチエクソン（ＮＳＥ）アクチベーター剤、又は予めプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物と相互作用して、プロセシングされたｍＲＮＡ転写産物内のＮＳＥの排除を促進する、ナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構のスイッチエクソン（ＮＳＥ）リプレッサー剤；及び
ｂ）医薬的に許容される賦形剤及び／又は送達ビヒクル、
を含む医薬組成物。
［項目１４７］ ＮＳＥアクチベーター剤が、単離ポリ核酸ポリマーである、項目１４６に記載の医薬組成物。
［項目１４８］ ＮＳＥリプレッサー剤が、単離ポリ核酸ポリマーである、項目１４７に記載の医薬組成物。
［項目１４９］ ポリ核酸ポリマーが、ＡＴＭイントロン２８内のモチーフへハイブリダイズする、項目１４７又は１４８に記載の医薬組成物。
［項目１５０］ ポリ核酸ポリマーが、スプライソソーム成分に対してＮＳＥと競合するスプライシング調節モチーフへハイブリダイズする、項目１４７に記載の医薬組成物。
［項目１５１］ スプライシング調節モチーフが、クリプティックスプライス部位又はシュードエクソンを含む、項目１５０に記載の医薬組成物。
［項目１５２］ シュードエクソンが、プレｍＲＮＡ転写産物のＡＴＭイントロン２８内のＮＳＥの３’に位置する２４ヌクレオチドのシュードエクソンである、項目１５１に記載の医薬組成物。
［項目１５３］ ポリ核酸ポリマーが、Ｕ２ＡＦ６５結合部位へハイブリダイズする、項目１５０に記載の医薬組成物。
［項目１５４］ ポリ核酸ポリマーが、転移因子の内部、転移因子の上流、又は転移因子の下流にあるモチーフへハイブリダイズする、項目１４７又は１４８に記載の医薬組成物。
［項目１５５］ 転移因子が、Ａｌｕ又はＭＥＲ５１である、項目１５４に記載の医薬組成物。
［項目１５６］ 単離ポリ核酸ポリマーが、Ａｌｕ内の標的モチーフへハイブリダイズする、項目１５４に記載の医薬組成物。
［項目１５７］ 単離ポリ核酸ポリマーが、Ａｌｕの上流又は下流にある標的モチーフへハイブリダイズする、項目１５４に記載の医薬組成物。
［項目１５８］ 単離ポリ核酸ポリマーが、ＭＥＲ５１の下流にある標的モチーフへハイブリダイズする、項目１５４に記載の医薬組成物。
［項目１５９］ ポリ核酸ポリマーが、長さ約１０～約５０ヌクレオチドである、項目１４６～１５８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
［項目１６０］ 単離ポリ核酸ポリマーが、配列番号１８～５２から成る群より選択される配列に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の配列同一性がある配列を含む、項目１４６～１５９のいずれか１項に記載の医薬組成物。
［項目１６１］ 項目１４６～１６０のいずれか１項に記載の医薬組成物を含む細胞。

【図面の簡単な説明】

【0028】

【図1】[0030] 図１Ａ～図１Ｃは、ＡＴＭイントロン２８内のＵ２ＡＦ抑制クリプティックエクソンの同定を例証する。図１Ａは、このクリプティックエクソン（ここでは、ＮＭＤ－スイッチエクソンのことをＮＳＥと呼称する）活性化の概略を示す。ＮＳＥ配列（上パネル）を箱で囲み、星印はｒｓ６０９２６１を示して、黒色の矩形は、指定のアンチセンスオリゴヌクレオチドを示す。下パネルには、両方のＵ２ＡＦ３５アイソフォーム（ａｂ－）、Ｕ２ＡＦ３５ａ（ａ－）、Ｕ２ＡＦ３５ｂ（ｂ－）、及び対照（ｃ）のＲＮＡｉ－又はＳＳＯ－仲介欠失からのＲＮＡ－Ｓｅｑデータのゲノムブラウザビューを示す。Ｕ２ＡＦ１のエクソンＡｂとエクソン３の３’ｓｓを標的とするＳＳＯとＵ２ＡＦ３５ ｓｉＲＮＡについては、先に記載した通りである。Ｙ軸：表示密度。上にＮＳＥの包含／排除を点線によって概略的に示す。ＡＴＭエクソン（灰色のボックス）には、番号を付してある。この２９ヌクレオチド（ｎｔ）のＮＳＥは、ＡＴＭ ｍＲＮＡ内に終止コドンを導入した。図１Ｂは、独立した欠失におけるＲＴ－ＰＣＲ（上パネル）によるＮＳＥ活性化の検証を示す（下パネル）。パネルＡに、ＲＴ－ＰＣＲプライマー（ＡＴＭ－Ｆ、ＡＴＭ－Ｒ、図２０）を矢印で示す。スプライス産物を右方に示し、ＮＳＥ付き転写産物の百分率を上に示す。エラーバーは、２回のトランスフェクション実験のＳＤを示す（^＊＊＊，ｐ＜０．０００１，^＊＊，ｐ＜０．００１）。図１Ｃは、成熟転写産物におけるＮＳＥの包含が残留Ｕ２ＡＦと逆相関することを示す（ｒ＝ピアソン相関係数）。ヘテロ２量体レベルの推定値を決定した。

【図2-1】[0031] 図２Ａ～図２Ｃは、ｒｓ６０９２６１によって改変される、ＮＳＥ活性化とＡＴＭ発現を示す。指定の集団において、ｒｓ６０９２６１での対立遺伝子頻度を示す（図２Ａ）。図２Ｂは、例示のミニ遺伝子の概略を示す。ＮＳＥとエクソン２９を含有するＡＴＭのＸｈｏＩ／ＸｂａＩ断片をＵ２ＡＦ１のエクソン２とエクソン４の間でクローニングした（黒色のボックス）。外因性転写産物を増幅するためのＲＴ－ＰＣＲプライマー（ＰＬ３とＡＴＭ－Ｒ、図２０）を矢印によって示す。図２Ｃは、外因性プレｍＲＮＡにおけるｒｓ６０９２６１依存性のＮＳＥ活性化を示す。Ｕ２ＡＦ３５又はＵ２ＡＦ６５を欠失したＨＥＫ２９３細胞についてＴ（黒色）ミニ遺伝子とＣ（灰色）ミニ遺伝子で一過性トランスフェクションした。Ｕ２ＡＦ３５ ｓｉＲＮＡとＵ２ＡＦ６５ ｓｉＲＮＡの最終濃度は、それぞれ３０ｎＭと６０ｎＭであった。

【図2-2】[0031] 図２Ｄ～図２Ｉは、ｒｓ６０９２６１によって改変される、ＮＳＥ活性化とＡＴＭ発現を示す。図２Ｄは、ｒｓ６０９２６１（星印）でホモ接合性である細胞株の同定を例証する。ＮＳＥを箱で囲む。図２Ｅと図２Ｆは、内因性転写産物におけるＮＳＥの対立遺伝子特異的な活性化が用量依存的なやり方でＡＴＭ発現を制限することを示す。内因性転写産物の供給源を底部に示し、抗体を右方に示す。培養物中のｓｉＲＮＡの濃度は、３、１０、及び３０ｎＭであった（Ｃ１、Ｃ２、対照のｓｉＲＮＡ）。ＧＦＰ－プラスミドと蛍光顕微鏡法によってトランスフェクション効率をモニターした。図２Ｇは、ＵＰＦ１欠失がＮＳＥ活性化を増加させて（上パネル）、アイソフォームＵ２ＡＦ１ｃを上方制御した（下パネル）ことを示す。Ｕ２ＡＦ１ｃアイソフォームは、エクソンＡｂとエクソン３をともに含有して、ＮＭＤによって抑制される。ＵＰＦ１ ｓｉＲＮＡの最終濃度は、７、２０、及び６０ｎＭであった（ＳＣ＝スクランブル対照）。エラーバーは、独立したトランスフェクションのＳＤである。図２Ｈは、Ｕ２ＡＦ関連タンパク質と異種核内ＲＮＰのサブセットを欠失した細胞におけるＮＳＥの包含レベルを示す。エラーバーは、２回のトランスフェクションのＳＤを示す。免疫ブロットを右方に示す。Ｕ２ＡＦ３５ ｓｉＲＮＡの最終濃度は、２５ｎＭであって；残存するｓｉＲＮＡは、６０ｎＭであった（Ｃ＝対照）。図２Ｉは、ＰＵＦ６０の過剰発現がＮＳＥスキッピングを誘導したこと示す。免疫ブロットを下に、抗体を右方に示す。

【図3】[0032] 図３Ａ～図３Ｄは、ＮＳＥを標的とするＳＳＯによるＵ２ＡＦ抑制ＡＴＭ発現のレスキューを例証する。図３Ａと図３Ｂは、外因性（図３Ａ）及び内因性（図３Ｂ）のＡＴＭ転写産物における効率的なＳＳＯ仲介ＮＳＥ阻害を示す。右パネルには、２回のトランスフェクション実験の平均のＮＳＥ包含レベルを示す。図３Ｃは、ＮＳＥへのアクセスを遮断するＳＳＯによる、ＡＴＭタンパク質レベルの回復を示す。Ｕ２ＡＦ３５を欠く細胞と対照細胞を、ＮＳＥ ３’ｓｓを標的とするＳＳＯと対照ＳＳＯでトランスフェクトした（図１Ａと図２０）。４８時間後、この細胞をイオン化放射線（ＩＲ，１０Ｇｙ）へ曝露して、１時間後に採取した。グラジエントＳＤＳ－ＰＡＧＥを使用して、細胞溶解液を分離した。抗体を用いたウェスタンブロッティングを右方に示した。図３Ｄは、欠失細胞における、ＳＳＯ－ＮＳＥ３によるＡＴＭ発現の用量依存性の復元を示す。

【図4-1】[0033] 図４Ａ～図４Ｂは、イントロン性シスエレメントとＮＳＥ活性化を調節するＳＳＯの同定を示す。図４Ａは、ＡＴＭイントロン２８内の２つのシュードエクソンの概略を示す。カノニカル（canonical）エクソン（番号付け）を灰色のボックスとして、ＮＳＥを白色のボックスとして、そしてＰＥを格子状のボックスとして示す。星印は、Ａ－Ｔを引き起こす、ＩＶＳ２８－１５９のＡ＞Ｇ置換の位置を示す。このＡ－Ｔ事例では、ＮＳＥがヒトイントロンの最小サイズ未満でＰＥより離れているので、ＮＳＥとＰＥをともに介在配列と一緒にＡＴＭ ｍＲＮＡに含めた。カノニカル転写産物と異常な転写産物をそのプレｍＲＮＡの上と下に点線でそれぞれ示す。中央のパネルは、両方のＵ２ＡＦ３５アイソフォーム（ａｂ－）を、架橋結合及び免疫沈降によって同定されるＵ２ＡＦ６５タグ／高信頼性結合部位（水平線／矩形）と一緒に欠失した細胞におけるＮＳＥのＲＮＡ－Ｓｅｑ表示密度を示す。その一番下には、Ｐｈｙｌｏｐ（１００ ＶＣ）による１００塩基位置（basewise）の脊椎動物の保存を示す。より下のパネルは、Ｃミニ遺伝子において導入された突然変異（赤字で下線した）を示す。図４Ｂは、野生型Ｃミニ遺伝子と変異Ｃミニ遺伝子のスプライシングパターンを示す。突然変異をパネルＡに示し；ＲＮＡ産物を概略的に右方に示す。クローンＰＥｄｅｌＰＰＴ／ＡＧによって産生された最大の産物は、短縮されたシュードイントロン（４２ヌクレオチド）を含有する。

【図4-2】[0033] 図４Ｃ～図４Ｈは、イントロン性シスエレメントとＮＳＥ活性化を調節するＳＳＯの同定を示す。図４Ｃは、（モック）欠失ＨＥＫ２９３細胞においてＮＳＥ（レーン２、３、７、及び８）又はＰＥ（レーン４、５、９、及び１０）が変異したＣミニ遺伝子のスプライシングパターンを示す。突然変異が一番下にあって、ミニ遺伝子配列が図２１にある。スプライス産物を概略的に右方に示し；ＰＥ上のヘアピン記号は、ＭＩＲステムループ挿入を示す。図４Ｄと図４ＥはＳＳＯ誘導シュードエクソンスイッチングを例証する。トランスフェクトされたミニ遺伝子を上方に、スプライス産物を右方に、そしてＳＳＯを一番下に示す。ＳＳＯ配列は、図２０にある。パネルＤ～パネルＧに示すＳＳＯの最終濃度は、３、１０、及び３０ｎＭであった。図４Ｆは、ＰＥを標的とするＳＳＯがＮＳＥスキッピングを誘導したことを示す。図４Ｇは、欠失時にＮＳＥを活性化する配列を標的とするＳＳＯ（ＰＥｄｅｌＰＰＴ／ＡＧ；パネルＡとパネルＢ）がＰＥを阻害することを示す。図４Ｈは、ＮＳＥ活性化がハプロタイプ依存性であることを示す。指定の変異体でのミニ遺伝子ハプロタイプを一番下に示す。カラムは平均のＮＳＥ包含を表し、エラーバーはＳＤであって、星印は、図１Ｂと同様に、統計学的有意差を示す。

【図5-1】[0034] 図５Ａ～図５Ｂは、ＡＴＭシグナル伝達のエクソン中心性の制御を示す。図５Ａは、ＭＲＮ－ＡＴＭ－ＣＨＥＫ２－ＣＤＣ２５－ｃｄｃ２／サイクリンＢ経路における、Ｕ２ＡＦ制御された遺伝子及びエクソンレベルの発現変化を示す（左パネル）。括弧内にＬｏｇ２倍率変化値とｑ値を示す。ＣＨＥＫ２遺伝子とＣＤＣ２５Ａ遺伝子のエクソン利用をＲＮＡ－Ｓｅｑブラウザショットによって示し；ＰＣＲ検証ゲルを右パネルに示す。ＣＨＥＫ２エクソン９は、ＮＭＤスイッチエクソンであり；エクソン１１は、キナーゼドメインの一部をコードする。ＡＴＭシグナル伝達経路におけるＵ２ＡＦ仲介性の発現変化の全スペクトルを図９に示し；Ｕ２ＡＦ仲介性のスプライシング制御の例を図Ｓ３～図Ｓ６に示す。図５Ｂは、Ｕ２ＡＦ３５欠失細胞においてＩＲの後で損傷したＡＴＭシグナル伝達を示す。ＨＥＫ２９３細胞を、Ｕ２ＡＦ３５（モック）欠失させて、４８時間後にＩＲ（１０Ｇｙ）へ処した。指定の時点での免疫ブロッティングによって発現を検証した。抗体を右方に示す。ＣＨＥＫ２エクソン９スキッピングレベルを一番下に示す。

【図5-2】[0034] 図５Ｃ～図５Ｇは、ＡＴＭシグナル伝達のエクソン中心性の制御を示す。図５Ｂは、Ｕ２ＡＦ３５欠失細胞においてＩＲの後で損傷したＡＴＭシグナル伝達を示す。ＨＥＫ２９３細胞を、Ｕ２ＡＦ３５（モック）欠失させて、４８時間後にＩＲ（１０Ｇｙ）へ処した。指定の時点での免疫ブロッティングによって発現を検証した。対照細胞（Ｕ２ＡＦ３５＋）と欠失細胞（Ｕ２ＡＦ３５－）におけるその測定値をパネル図５Ｃに示す。図５Ｄは、ＵＰＦ１欠失細胞におけるＣＨＥＫ２エクソン９包含を示す。ＵＰＦ１ｓ ｉＲＮＡの最終濃度（図２０）は、１２．５、２５、５０、及び１００ｎＭであった。図５Ｅは、ＳＳＯによるＣＨＥＫ２エクソン９の抑制がＣＨＥＫ２レベルを低下させて、ＮＳＥの包含を促進したことを示す。ＣＨＥＫ２エクソン９を標的とするＳＳＯの最終濃度は、３、１０、及び３０ｎＭであった。図５Ｆは、ＨＥＫ２９３細胞を指定のＳＳＯでトランスフェクションした時のＣＨＥＫ２エクソン９の包含を示す。図５Ｇは、ＳＦ３Ｂ１の欠乏がＣＨＥＫ２エクソン９スキッピングを誘導したが、ＮＳＥ活性化は変化させなかったことを示す。ＳＦ３Ｂ１を標的とする各ｓｉＲＮＡの最終濃度は、２０ｎＭであった。

【図6】[0035] 図６は、Ｕ２ＡＦ３５におけるがん関連突然変異によるＮＳＥ抑制のレスキューを示す。Ｕ２ＡＦ３５における、Ｃミニ遺伝子のＵ２ＡＦ３５依存性ＮＳＥスプライシングのジンクフィンガー１及び２置換によるレスキュー（上パネル）。いずれの置換も、Ｕ２ＡＦ１ａ構築体（３５ａ）において行った。がん関連突然変異（下）を箱で囲み；スプライス産物を右方に示す。Ｕ２ＡＦ３５抗体とＧＦＰ抗体での免疫ブロットを下方のパネルに示す（ｅｘ＝外因性Ｕ２ＡＦ３５；ｅｎ＝内因性Ｕ２ＡＦ３５）。

【図7】[0036] 図７は、シュードエクソン標的化による、遺伝子発現のＳＳＯベースの調節を示す。カノニカルエクソンを灰色のボックスとして、ナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構（ＮＭＤ）のスイッチエクソンを黒色のボックスとして、シュードエクソンを白色のボックスとして示す。カノニカルスプライシングを点線によって示す。ＮＭＤエクソンと競合するシュードスプライス部位をＲＮＡ前駆体の下に示す。ＳＳＯアクチベーター／リプレッサーを水平の黒色／灰色のバーによってそれぞれ示す。成熟転写産物への包含のために、Ｕ２ＡＦ、異種核内リボ核タンパク質、又はセリン／アルギニンリッチタンパク質といったスプライソソーム成分についてＮＭＤスイッチエクソンと競合するスプライシング調節モチーフ又は２次構造は、簡略化のために示していない。それらは、以前に詳しく記載された計算法（例えば、Kralovicova, J. and Vorechovsky, I. (2007) Global control of aberrant splice site activation by auxiliary splicing sequences: evidence for a gradient in exon and intron definition［異常スプライス部位活性化の補助的スプライシング配列による全体制御；エクソン及びイントロンの明確性における勾配の証拠］Nucleic acids Res., 35, 6399-6413 とその中の参考文献）によって予測し得るか、又はＲＮＡ架橋結合及び免疫沈降、スプライシング基質の突然変異誘発、及びＲＮＡフォールディング試験が含まれる実験法によって決定し得る。

【図8】[0037] 図８Ａ～図８Ｃは、ＳＳＯ仲介性のＮＳＥ抑制がＡＴＭ発現を高めることを示す。図８Ａは、ＳＳＯ－ＮＳＥ３が全ＡＴＭと活性化ＡＴＭの発現を増加させたことを示す。ＨＥＫ２９３細胞を、Ｕ２Ａ Ｆ３５（モック）欠失させ、Ｘｐｒｅｓｓタグ付きＣＨＥＫ２とＳＳＯ ＮＳＥ３／対照（ＳＳＯ－Ｃ）で同時トランスフェクトし、イオン化放射線（ＩＲ）へ曝露して、３０分後に採取した。細胞溶解液を指定の抗体で免疫ブロットした。ｓｉＲＮＡとＳＳＯの最終濃度は、３０ｎＭであった。ＣＨＥＫ２を発現するプラスミドの量は、３０、９０、及び２７０ｎｇであって；エンプティ（empty）ベクター由来のＤＮＡを２７０ｎｇ／ｍＬの最終濃度まで加えた。Ｅｘ／ｅｎＣＨＥＫ２は、Ｄ９Ｃ６抗体によって検出される、外因性ＣＨＥＫ２と内因性ＣＨＥＫ２からのシグナルである。図８Ｂと図８Ｃは、ＮＭＤスイッチエクソン９を標的とするＳＳＯ（ＳＳＯ ＣＨＥＫ２）による、外因性ＣＨＥＫ２の増加した発現を示す。一定量のＳＳＯ ＣＨＥＫ２を増加量のＸｐｒｅｓｓ－ＣＨＥＫ２とトランスフェクション及びローディング対照としての一定量のＧＦＰプラスミドで同時トランスフェクトして（Ｂ）、その反対でも行った（Ｃ）。抗体は、右方にある。

【図9】[0038] 図９は、Ｕ２ＡＦ制御された機能性ＡＴＭ相互作用の例示マップを図解する。Ｕ２ＡＦ制御されたＡＴＭシグナル伝達ネットワークを赤色の矢印／桃色の背景によって強調する。Ｕ２ＡＦ３５欠失細胞において上方／下方制御される遺伝子を赤色／濃緑色でそれぞれ示す。有意に改変されたエクソン利用を明示する遺伝子を黄色で示す。このＡＴＭシグナル伝達マップは、ＡＴＭ相互作用性のタンパク質（紫色）／タンパク質複合体（淡緑色）を示す。矢印は活性化に対応し、Ｔ形状の刃形は阻害に対応して、白丸は未知の制御を示す。抑制（containment）リンクを緑色の刃形として示す。

【図10】[0039] 図１０Ａ～図１０Ｃは、Ｕ２ＡＦ３５欠失細胞内のＣＤＣ２５ＢとＣＤＣ２５Ｃにおけるエクソン利用を示す。対照（ｃｔｒ）細胞と欠失（ａｂ－）細胞におけるＲＮＡ－Ｓｅｑデータのゲノムブラウザビュー（図１０Ａと図１０Ｂの左パネル）。ＰＣＲプライマーを矢印によって示し、差示的に利用されるエクソンを黒色の矩形によって示す。ＲｅｆＳｅｑエクソンの注釈を一番下に示す。各Ｕ２ＡＦサブユニットとＵ２ＡＦ関連タンパク質を欠失した細胞より抽出したＲＮＡでのＲＴ－ＰＣＲを使用するＲＮＡ－Ｓｅｑデータの検証（図１０Ａと図１０Ｂの右パネル）。

【図11-1】[0040] 図１１Ａ～図１１Ｃは、ＴＴＫ、ＰＩＮ１、及びＣＤＫ１におけるＵ２ＡＦ制御エクソン利用を示す。対照（ｃｔｒ）細胞と欠失（ａｂ－）細胞におけるＲＮＡ－Ｓｅｑデータのゲノムブラウザビュー（図１１Ａ、図１１Ｂの左パネル、及び図１１Ｃ）。ＰＣＲプライマーを矢印によって示し、差示的に利用されるエクソンを黒色の矩形によって示す。ＲｅｆＳｅｑエクソンの注釈を一番下に示す。各Ｕ２ＡＦサブユニットとＵ２ＡＦ関連タンパク質を欠失した細胞より抽出したＲＮＡでのＲＴ－ＰＣＲを使用するＲＮＡ－Ｓｅｑデータの検証（図１１Ｂの右パネル）。

【図11-2】[0040] 図１１Ａ～図１１Ｃは、ＴＴＫ、ＰＩＮ１、及びＣＤＫ１におけるＵ２ＡＦ制御エクソン利用を示す。対照（ｃｔｒ）細胞と欠失（ａｂ－）細胞におけるＲＮＡ－Ｓｅｑデータのゲノムブラウザビュー（図１１Ａ、図１１Ｂの左パネル、及び図１１Ｃ）。

【図12】[0041] 図１２Ａ～図１２Ｄは、欠失細胞におけるＲＡＤ５０とＥＺＨ２のＲＮＡプロセシングを示す。対照（ｃｔｒ）細胞と欠失（ａｂ－）細胞におけるＲＮＡ－Ｓｅｑデータのゲノムブラウザビュー（図１２Ａ、図１２Ｂ、図１２Ｃ、及び図１２Ｄの左パネル）。ＰＣＲプライマーを矢印によって示し、差示的に利用されるエクソンを黒色の矩形によって示す。ＲｅｆＳｅｑエクソンの注釈を一番下に示す。各Ｕ２ＡＦサブユニットとＵ２ＡＦ関連タンパク質を欠失した細胞より抽出したＲＮＡでのＲＴ－ＰＣＲを使用するＲＮＡ－Ｓｅｑデータの検証（図１２Ａと図１１Ｂの右パネル）。

【図13】[0042] 図１３Ａ～図１３Ｂは、ぺプチジル－プロリルイソメラーゼＰＩＮ２とシェルタリン複合体の成分のＵ２ＡＦ３５制御されたエクソン利用を示す。

【図14-1】[0043] 図１４Ａ～図１４Ｂは、ＲＡＲＡ融合パートナーのＵ２ＡＦ制御を示す。

【図14-2】[0043] 図１４Ｃ～図１４Ｄは、ＲＡＲＡ融合パートナーのＵ２ＡＦ制御を示す。

【図15】[0044] 図１５Ａ～図１５Ｅは、正常組織細胞と白血病細胞におけるＮＳＥ活性化を示す。１９種のヒト組織（図１５Ａ）と１７種のＡＭＬ／ＣＭＭＬ骨髄試料（図１５Ｂ）においてプライマーのＡＴＭ－Ｆ及びＡＴＭ－Ｒを使用してＮＳＥの包含レベルを測定した（図１，図２０）。エクソン包含を定量した。平均値を対応なしｔ検定で比較した（図１５Ｃ）。図１５Ｄと図１５Ｅは、リンパ芽球様細胞株における、Ｕ２ＡＦ抑制（図１５Ｄ）及び活性化（図１５Ｅ）エクソンの包含レベルを示す（上）。細胞は、指定温度で低温ショックと熱ショックへ曝露した。ＥＳ，エクソンスキッピング；ＥＩ，エクソン包含。

【図16】[0045] 図１６Ａ～図１６Ｂは、ＮＳＥ活性化に影響を及ぼす、ＡＴＭイントロン２８内の転移因子の同定を示す。図１６Ａは、イントロン２８内の転移因子の位置とＮＳＥ活性化の概略を示す。カノニカルエクソンを灰色のボックスとして、ＮＳＥを白色のボックスとして、ＮＳＥに隣接するイントロンを実線として、そしてそれらのスプライシングを点線によって示す。転移因子を１次転写産物の下にある水平の白い矩形として示し；ＵＣは、識別可能なトランスポゾンを欠くユニーク配列である。それらの欠失を１～６と番号付けし、これは、パネルＢのレーン番号に対応する。ＲＴ－ＰＣＲプライマーを黒色の矢印によって示す。スケールが上部にある。より下のパネルでは、ＮＳＥ配列を箱で囲んでいる。センスＡｌｕ（Ａｌｕ＋）を欠く構築体は、反復的に連結／増殖し得なかったので、検査しなかった。図１６Ｂは、アンチセンスＡｌｕとＭＥＲ５１エレメントの欠失がＮＳＥ活性化を変化させることを示す。Ｕ２ＡＦ３５を（モック）欠失させたＨＥＫ２９３細胞内へ野生型（ＷＴ）構築体と変異構築体（１～６と指定）を一過的にトランスフェクトした。ＮＳＥ＋／－は、ＮＳＥを含む／含まないＲＮＡ産物である。カラムは、平均のＮＳＥの包含（％）を表し、エラーバーは、２回のトランスフェクション実験のＳＤを表す。星印は、両側のＰ値＜０．０１（ｔ検定）を示す。

【図17-1】[0046] 図１７Ａ～図１７Ｂは、ＮＳＥを活性化するか又は抑制するイントロン性ＳＳＯの同定を示す。図１７Ａは、イントロン２８において検討したＳＳＯの転移因子に対する位置を示す。凡例については、図１６Ａを参照のこと。図１７Ｂは、外因性転写産物においてＮＳＥ活性化を変化させるイントロン２８ ＳＳＯの同定を示す。例示のＳＳＯを表２に収載する。「ｘ」記号は多数の陰性対照を示し、点線は平均のＮＳＥ包含を示し、エラーバーは２回のトランスフェクション実験のＳＤを示す。カラムは平均の包含レベルを表し、星印は、有意なＰ値を示す。

【図17-2】[0046] 図１７Ｃは、ＮＳＥを活性化するか又は抑制するイントロン性ＳＳＯの同定を示す。１本鎖領域を標的とするＳＳＯに内因性ＮＳＥを抑制する傾向があったことを示す。ｒは、ピアソン相関係数である。Ｐ値を括弧内に示す。

【図18】[0047] 図１８Ａ～図１８Ｂは、ＳＳＯ－ＮＳＥ３のヒト細胞株へのＴＭＣ－ＳＡ支援送達がＮＳＥ抑制をもたらすことを示す。図１８Ａは、ＨＥＫ２９３細胞におけるＮＳＥの包含がＳＳＯ－ＮＳＥ３／ＴＭＣ－ＳＡナノ複合体の曝露時に阻害されることを示す。Ｎ／Ｐ比は、２０、４０、及び８０であった（Ｓｃ＝同じ修飾のあるスクランブル対照、Ｍ＝サイズマーカー）。エラーバーは、２回のトランスフェクション実験のＳＤを示す。指定の比較についてのＰ値を上方に示す。図１８Ｂは、ＳＳＯ－ＮＳＥ３／ＴＭＣ－ＳＡ複合体へ曝露されたＶＡＶＹ細胞におけるＮＳＥ抑制を示す。

【図19】[0048] 図１９は、ＡＴＭイントロン２８のあるＭＥＲ５１コンセンサス配列における逆方向反復を示す（ｖ，トランスバージョン；ｉ，トランジション）。ＡＴＭ ＭＥＲ５１Ａ内のほとんどの安定した逆方向反復に下線を施して強調する；プリンリッチの１本鎖領域を赤色で示し；ＭＥＲ５１ファミリーについて最初に記載した長い末端反復相同性をイタリック体で示す。並置した断片は、図１６ａに示した欠失４に対応する。ＭＥＲ５１Ａコンセンサス配列は、アンチセンス配向にある。

【図20】[0049] 図２０は、例示の合成ＤＮＡ及びＲＮＡの配列を例解する。

【図21】[0050] 図２１は、ＮＳＥとＰＥにおいて変異したスプライシングレポーター構築体の例示配列を示す。

【図22】[0051] 図２２は、ＮＳＥとＰＥにおける補助スプライシングエレメントを示す。

【図23】[0052] 図２３は、ＮＭＤに関与するＵ２ＡＦ３５制御転写産物の概要を示す。

【発明を実施するための形態】

【0029】

[0053] 介在配列又はイントロンは、１次転写産物、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、及び多数のタンパク質の間の複雑な相互作用を統合する、スプライソソームと呼ばれる大きくて高度に動的なＲＮＡ－タンパク質複合体によって除去される。スプライソソームは、各イントロン上で特定の目的のために秩序だったやり方で組み立てられ、Ｕ１ ｓｎＲＮＡによる５’スプライス部位（５’ｓｓ）の認識、又はＵ２経路（Ｕ２補助因子（Ｕ２ＡＦ）が３’ｓｓ領域へ結合して、分岐点配列（ＢＰＳ）へのＵ２結合を促進することを含む）による３’ｓｓの認識から始まる。Ｕ２ＡＦは、Ｕ２ＡＦ２コード化６５ｋＤサブユニット（Ｕ２ＡＦ６５）［ポリピリミジントラクト（ＰＰＴ）と結合する］とＵ２ＡＦ１コード化３５ｋＤサブユニット（Ｕ２ＡＦ３５）［高度に保存されたＡＧジヌクレオチドと３’ｓｓで相互作用してＵ２ＡＦ６５結合を安定にする］から構成される安定したヘテロ２量体である。ＢＰＳ／ＰＰＴユニットと３’ｓｓ／５’ｓｓに加えて、正確なスプライシングには、イントロン性又はエクソン性のスプライシングエンハンサー又はサイレンサーとして知られる、スプライス部位認識を活性化するか又は抑制する補助的な配列又は構造が必要とされる。これらのエレメントは、高等真核生物のゲノム内にある（同じ配列を有するが、正統の部位より１桁分の数で優る）大過剰のクリプティック部位又はシュード部位の中で真のスプライス部位が認識されることを可能にする。それらは、制御機能をしばしば有するが、それらの活性化又は抑制の正確な機序は、ほとんど理解されていない。

【0030】

[0054] エクソーム配列決定研究は、がん細胞、最も著名には骨髄異形成症候群には、Ｕ２ＡＦ１／Ｕ２ＡＦ２と３’ｓｓ認識に関与する他の遺伝子（ＳＦ３Ｂ１，ＺＲＳＲ２、ＳＦ１、ＳＦ３Ａ１、ＰＲＰＦ４０Ｂ、及びＳＲＳＦ２）において体細胞突然変異のきわめて限定されたパターンがあることを明らかにしてきた。これらの遺伝子は、スプライソソームアセンブリーの間にしばしば相互作用する産物をコードするので、発がんにおける共通の経路の存在を示唆し、このことは、がん関連突然変異の高度の相互排除性によってさらに支持されている。これらの突然変異を担う白血病試料におけるゲノム全体のトランスクリプトームプロファイリングでは、ｍＲＮＡ前駆体のスプライシングに数多くの改変が検出されたが、特定のＲＮＡプロセシング障害とがんの発生又は進行との間の重要な関連については、これらの標的が治療上の調節にきわめて有望であるにもかかわらず、不明なままである。これらのＲＮＡ結合タンパク質とＤＮＡ傷害応答（ＤＤＲ）経路の間の相互関連性も依然として十分特徴づけられているわけではない。

【0031】

[0055] 従来のスプライシングモチーフ（ＢＰＳ／ＰＰＴ／３’ｓｓ／５’ｓｓ）と補助的なスプライシングモチーフにおける突然変異は、エクソンスキッピング、又はクリプティックエクソン若しくはスプライス部位の活性化といった異常なスプライシングをしばしば引き起こして、ヒトの罹病及び死亡へ有意に寄与する。異常なスプライシングパターンも選択的スプライシングパターンもエクソンとイントロンにおける天然のＤＮＡ変異体によって影響を受ける可能性があり、このことは、メンデル形質と複合形質の両方の遺伝率において重要な役割を担う。しかしながら、対立遺伝子又はハプロタイプ特異的なＲＮＡ発現を表現型の変動性へ翻案する分子機序についても、イントロン性及びエクソン性の変異対立遺伝子とトランス作用因子の間の相互作用についても、ほとんどわかっていない。

【0032】

[0056] アンチセンス技術は、今や重要な臨床応用に達している。例えば、ＡＴＭ遺伝子を標的とするアンチセンススプライススイッチングオリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）は、毛細血管拡張性運動失調症（Ａ－Ｔ）におけるスプライシング突然変異を修復するのに使用されたことがあって、ＡＴＭタンパク質レベルを正常化するのに成功した（Du et al.,
2011; Du et al.,2007）。

【0033】

[0057] 白血病と固形腫瘍の両方の大部分で、ＡＴＭ発現の脱制御が示されている（例えば、Stankovic et al., 1999; Starczynski et al., 2003）。ＡＴＭの化学阻害剤（ウォルトマンニン、ＣＰ－４６６７２２、ＫＵ－５５９３３、及びＫＵ６００１９）は、主として非特異的な効果及び／又は高い毒性の故に臨床試験に到達していないが、ＫＵ－５５９４０３については、良好なバイオアベイラビリティと信頼し得るほどに付与される放射線感受性が示されている。

【0034】

[0058] いくつかの事例では、遺伝子発現を配列特異的なやり方で上方又は下方制御する能力は、望ましい。
[0059] ある態様では、本発明で提供するのは、被験者又は被験者の集団について機能性ＡＴＭタンパク質欠損への感受性をスクリーニングする方法であって、ここで該スクリーニングは、そのヒトゲノムのＮＳＥ（ＡＴＭイントロン２８内のクリプティック又はナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構のスイッチエクソン）の３’スプライス部位に対して－３位に位置する非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１の存在を決定することを含み、ここで非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１の存在は、該被験者（又は被験者群）が機能性ＡＴＭタンパク質欠損を有するか又はそれに感受性であることを示す。

【0035】

[0060] 「機能性ＡＴＭタンパク質欠損」という用語は、ある被験者、細胞、又は組織において機能的であるＡＴＭタンパク質の存在／発現の低下を意味する。機能性ＡＴＭ欠乏症は、ＡＴＭ前駆体メッセンジャーＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）のＲＮＡプロセシングを改変する、ＡＴＭイントロン２８内の機能性変異体ｒｓ６０９２６１の所産である。ｒｓ６０９２６１でのシトシン対立遺伝子は、この位置でのチミン対立遺伝子より、ＡＴＭ ｍＲＮＡにおけるナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構のスイッチエクソン（本明細書ではＮＳＥと呼称する）のより高次の包含を生じて、チミン対立遺伝子より効率的にＡＴＭタンパク質の発現を制限する。この制限は、同じイントロン内のＮＳＥ又はＮＳＥ制御配列へのアクセスを遮断する新規ＳＳＯによって除去するか又は調節することが可能であって、ＡＴＭタンパク質の脱抑制又は阻害をそれぞれもたらす。

【0036】

[0061] いくつかの態様では、本発明で提供するのは、機能性ＡＴＭタンパク質欠損に感受性である被験者又は被験者の集団を治療又は予防のために選択する方法であって、該
方法は、そのヒトゲノムのＮＳＥ（ＡＴＭイントロン２８内のクリプティックエクソン）の３’スプライス部位に対して－３位に位置する非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１の存在を決定すること（ここで非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１の存在は、該被験者が機能性ＡＴＭタンパク質欠損を有するか又はそれに感受性であることを示す）と、該被験者の機能性ＡＴＭレベルを増加させるように整えられた薬剤での治療のためにそのような被験者を選択することを含む。

【0037】

[0062] 本発明の別の側面によれば、機能性ＡＴＭタンパク質欠損の被験者における治療又は予防の方法が提供され、該方法は、そのヒトゲノムのＮＳＥの３’スプライス部位に対して－３位に位置する非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１の存在を同定すること（ここで非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１の存在は、該被験者が機能性ＡＴＭタンパク質欠損を有するか又はそれに感受性であることを示す）と、機能性ＡＴＭレベルを増加させるように整えられた薬剤の該被験者への投与を含む。

【0038】

[0063] 本発明の別の側面によれば、機能性ＡＴＭタンパク質のレベルを増加させるように整えられたＮＳＥリプレッサー剤の投与を含む、機能性ＡＴＭタンパク質欠損に関連した病態の治療又は予防の方法が提供され、ここで該薬剤は、プレｍＲＮＡ転写産物のＡＴＭイントロン２８内のＮＳＥへ、又は同じイントロン内のＮＳＥ活性化制御配列へ結合して、成熟転写産物におけるＮＳＥの包含を減少させるように整えられる。

【0039】

[0064] 本発明の別の側面によれば、ＮＳＥアクチベーター剤の投与を含む、ＡＴＭ発現の脱制御に関連した病態の被験者における治療又は予防の方法が提供され、ここでＮＳＥアクチベーター剤は、ＡＴＭイントロン２８内のＮＳＥ阻害性調節モチーフへ結合することによって、ＡＴＭ成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含を増加させるように整えられる。

【0040】

[0065] ＡＴＭイントロン２８内のＮＳＥ阻害性調節モチーフは、プレｍＲＮＡ転写産物のＡＴＭイントロン２８内のＮＳＥの３’に位置する２４ヌクレオチドのシュードエクソン（ＰＥ）、又は該シュードエクソンの上流にあるＵ２ＡＦ６５結合部位といった、スプライソソーム成分についてＮＳＥと競合する配列を含み得る。

【0041】

[0066] 本発明の別の側面によれば、放射線療法のような、２本鎖ＤＮＡの切断を誘導するＤＮＡ傷害剤へのがん細胞の感受性を増加させるように整えられたＮＳＥアクチベーター剤の投与（ここでＮＳＥアクチベーター剤は、ＡＴＭイントロン２８内のＮＳＥ調節モチーフへ結合することによってＡＴＭ成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含を増加させるように整えられる）と、放射線療法又は化学療法のような、２本鎖切断を引き起こすＤＮＡ傷害剤で被験者を治療することを含む、該被験者におけるがんの治療又は予防の方法が提供される。

【0042】

[0067] 本発明の別の側面によれば、ＡＴＭイントロン２８内の調節モチーフへ結合することによってＡＴＭ成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含を増加させるように整えられたＮＳＥアクチベーター剤の投与によるＡＴＭタンパク質発現の低下を含む、放射線療法での治療のような細胞傷害性療法への細胞の感受性を増加させる方法が提供される。

【0043】

[0068] ＡＴＭイントロン２８内の調節モチーフは、スプライソソーム成分についてＮＳＥと競合し得て、ここでそのようなモチーフは、プレｍＲＮＡ転写産物のＡＴＭイントロン２８内のＮＳＥの３’に位置する２４ヌクレオチドのシュードエクソン（ＰＥ）、又は該シュードエクソンの上流にあるＵ２ＡＦ６５結合部位を含み得る。

【0044】

[0069] 本発明の別の側面によれば、本明細書に記載のＮＳＥアクチベーター剤及び／
又はＮＳＥリプレッサー剤の投与を含む、被験者、細胞、又は組織において機能性ＡＴＭ発現を増減させる方法が提供される。

【0045】

[0070] 本発明の別の側面によれば、ＡＴＭ脱制御に関連した病態への治療に対する被験者の応答を予測することへのｒｓ６０９２６１遺伝子型決定の使用が提供される。
[0071] 本発明の別の側面によれば、本発明のＮＳＥリプレッサー剤を含む組成物が提供される。

【0046】

[0072] 本発明の別の側面によれば、本発明のＮＳＥアクチベーター剤を含む組成物が提供される。
[0073] 本発明の別の側面によれば、機能性ＡＴＭタンパク質欠損の被験者における治療又は予防のための方法が提供され、該方法は、そのヒトゲノムのＮＳＥ（ＡＴＭイントロン２８内のクリプティックエクソン）の３’スプライス部位に対して－３位に位置する非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１の存在を同定すること（ここで非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１の存在は、該被験者が機能性ＡＴＭタンパク質欠損を有するか又はそれに感受性であることを示す）と、非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１をチミン残基に置換するように整えられた薬剤の該被験者への投与を含む。

【0047】

[0074] 本発明の別の側面によれば、機能性ＡＴＭタンパク質欠損の被験者における治療又は予防の方法が提供され、該方法は、そのヒトゲノムのＮＳＥ（ＡＴＭイントロン２８内のクリプティックエクソン）の３’スプライス部位に対して－３位に位置する非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１をチミン残基に置換することを含む。

【0048】

[0075] 本発明の別の側面によれば、本発明のポリ核酸ポリマーを含むベクターが提供される。
[0076] 本発明の別の側面によれば、機能性ＡＴＭタンパク質欠損の被験者における治療又は予防の方法が提供され、該方法は、そのヒトゲノムのｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基の存在を同定すること（ここでｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基の存在は、該被験者が機能性ＡＴＭタンパク質欠損を有するか又はそれに感受性であることを示す）と、ｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基をアデニンに置換するように整えられた薬剤の該被験者への投与を含む。

【0049】

[0077] 本発明の別の側面によれば、機能性ＡＴＭタンパク質欠損の被験者における治療又は予防の方法が提供され、該方法は、そのヒトゲノムのｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基をアデニン残基に置換することを含む。

【0050】

[0078] 本発明の第１の側面によれば、被験者又は被験者の集団について機能性ＡＴＭタンパク質欠損への感受性をスクリーニングする方法が提供され、ここで該スクリーニングは、そのヒトゲノムのｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基の存在を決定することを含み、ここでｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基の存在は、該被験者（又は被験者群）が機能性ＡＴＭタンパク質欠損を有するか又はそれに感受性であることを示す。

【0051】

[0079] 本発明の別の側面によれば、機能性ＡＴＭタンパク質欠損に感受性である被験者又は被験者の集団を治療又は予防のために選択する方法が提供され、該方法は、そのヒトゲノムのｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基の存在を決定すること（ここでｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基の存在は、該被験者が機能性ＡＴＭタンパク質欠損を有するか又はそれに感受性であることを示す）と、該被験者の機能性ＡＴＭレベルを増加させるように整えられた薬剤での治療のためにそのような被験者を選択することを含む。

【0052】

[0080] 本発明の別の側面によれば、機能性ＡＴＭタンパク質欠損の被験者における治療又は予防の方法が提供され、該方法は、そのヒトゲノムのｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基の存在を同定すること（ここでｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基の存在は、該被験者が機能性ＡＴＭタンパク質欠損を有するか又はそれに感受性であることを示す）と、機能性ＡＴＭレベルを増加させるように整えられた薬剤の該被験者への投与を含む。

【0053】

[0081] 本発明の別の側面によれば、遺伝子の発現の制御を改変することが可能な薬剤又は薬剤の組合せをスクリーニングする方法（図７）が提供され、該方法は、機能性の遺伝子発現を制限するナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構のスイッチエクソン（ＮＳＥ）を同定すること；スプライソソーム成分についてＮＳＥと競合する、ＮＳＥの上流又は下流にある１以上のスプライシング調節モチーフを同定すること（前記調節モチーフは、クリプティックスプライス部位又はシュードエクソンを含む）；そのスプライシング調節モチーフへワトソン－クリック塩基対合を介してハイブリダイズするように整えられたアンチセンスポリ核酸でその１以上のスプライシング調節モチーフを標的とすること；及び該遺伝子の成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含が増加又は減少するかを決定することを含む。

【0054】

[0082] 本発明の別の側面によれば、ＮＳＥスプライシング調節モチーフへ結合するように整えられた薬剤を提供することを含む、遺伝子の発現を調節する方法が提供される。
[0083] 本発明の別の側面によれば、ＮＳＥの遺伝子スプライシング調節モチーフへ結合するように整えられた薬剤が提供され、ここでスプライシング調節モチーフは、該遺伝子の成熟ＲＮＡ転写産物内へのＮＳＥの包含を制御する。

【0055】

[0084] 本発明の別の側面によれば、本発明で提供するのは、ｍＲＮＡ遺伝子転写産物におけるＮＳＥの包含によって引き起こされる疾患病理の治療又は予防の方法であって、該方法は、その遺伝子の成熟ＲＮＡ転写産物へのＮＳＥの包含を制御する遺伝子ＮＳＥスプライシング調節モチーフへ結合するように整えられた薬剤を提供することを含む。

【0056】

[0085] 本発明の好ましい態様について、本明細書に示して記載してきたが、当業者には、そのような態様が例示としてのみ提供されることが明らかであろう。今や、当業者には、本発明から逸脱することなく、多数の変形、変更、及び代用が発想されよう。本発明を実施する場合には、本明細書に記載した本発明の態様に対する様々な代替態様を利用し得ると理解されたい。以下の特許請求項は、本発明の範囲を明確化して、これらの特許請求項の範囲内の方法及び構造とそれらの均等物がそれによって含まれると企図される。

【0057】

[0086] 種々の決定には、当業者に利用可能などの好適なアッセイ又は遺伝子解析も使用し得る。いくつかの事例では、in situ ハイブリダイゼーション及びＲＴ－ＰＣＲのような核酸ベースの技術を用いて核酸レベルで検出がなされる。配列決定技術には、Helicos True Single Molecule Sequencing（ｔＳＭＳ）（Harris T.D. et al. (2008) Science 320:106-109)；４５４配列決定法（ロシュ）（Margulies, M. et al. 2005, Nature, 437, 376-380）；ＳＯＬｉＤ技術（アプライド・バイオシステムズ）；ＳＯＬＥＸＡ配列決定法（Illumina）；Pacific Biosciences の単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ^ＴＭ）技術；ナノポア（nanopore）配列決定法（Soni GV and Meller A. (2007) Clin Chem 53: 1996-2001）；半導体配列決定法（Ion Torrent；Personal Genome Machine）；ＤＮＡナノボール（nanoball）配列決定法；Dover Systems（Polonator）由来の技術を使用する配列決定法、及びナノポアベースの戦略（例、Oxford Nanopore、Genia Technologies、及び Nabsys）のような、配列決定に先立って増幅を必要としないし他のやり方でネイティブＤＮＡを形質転換することもない技術（例、Pacific Biosciences 及び Helicos）といった次世代の配列決定技術を含めることができる。配列決定技術には、サンガー配列決定法、マキサム・ギルバート配列決定法、ショットガン配列決定法、ブリッジＰＣＲ、質量分析法ベースの配列決定法、微小流路（microfluidic）ベースのサンガー配列決定法、顕微鏡法ベースの配列決定法、ＲＮＡＰ配列決定法、又はハイブリダイゼーションベースの配列決定法も含めることができる。

【0058】

[0087] 目的の遺伝子転写産物の配列決定法には、増幅工程も含めてよい。例示の増幅法には、限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、自立配列複製（３ＳＲ）、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、全ゲノム増幅、多重置換増幅、鎖置換増幅、ヘリカーゼ依存性増幅、ニッキング（nicking）酵素増幅反応、組換えポリメラーゼ増幅、逆転写ＰＣＲ、ライゲーション媒介ＰＣＲ、又はメチル化特異的ＰＣＲが含まれる。

【0059】

[0088] 核酸配列を入手するために使用し得る追加の方法には、例えば、全ゲノムＲＮＡ発現アレイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ゲノム配列決定法、de novo 配列決定法、Pacific Biosciences ＳＭＲＴ配列決定法、免疫組織化学（ＩＨＣ）、免疫細胞化学（ＩＣＣ）、質量分析法、タンデム質量分析法、マトリックス支援レーザー脱離イオン化－飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ）、in-situ ハイブリダイゼーション、蛍光 in-situ ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、色素 in-situ ハイブリダイゼーション（ＣＩＳＨ）、銀 in situ ハイブリダイゼーション（ＳＩＳＨ）、デ
ジタルＰＣＲ（ｄＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ、定量ＰＣＲ（Ｑ－ＰＣＲ）、単一マーカーｑＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、nCounter Analysis（Nanostring technology）、ウェスタンブロッティング、サザンブロッティング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ゲル電気泳動法、及びノーザンブロッティングが含まれる。

【0060】

[0089] 本発明の別の側面によれば、機能性ＡＴＭタンパク質欠損の被験者における治療又は予防の方法が提供され、該方法は、そのヒトゲノムのＮＳＥ（ＡＴＭイントロン２８内のクリプティックエクソン）の３’スプライス部位に対して－３位に位置する非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１の存在を同定すること（ここで非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１の存在は、該被験者が機能性ＡＴＭタンパク質欠損を有するか又はそれに感受性であることを示す）と、機能性ＡＴＭレベルを増加させるように整えられた薬剤の該被験者への投与を含む。

【0061】

[0090] 本発明の別の側面によれば、機能性ＡＴＭタンパク質レベルを増加させるように整えられたＮＳＥリプレッサー剤の投与を含む、機能性ＡＴＭタンパク質欠損に関連した病態の治療又は予防の方法が提供され、ここで該薬剤は、プレｍＲＮＡ転写産物のＡＴＭイントロン２８内のＮＳＥへ結合して、この成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含を減少させるように整えられる。

【0062】

[0091] 成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含を減少させることは、機能性ＡＴＭタンパク質発現の増加を提供する場合がある。
[0092] 機能性ＡＴＭタンパク質欠損の被験者又はリスク病態の被験者集団における治療又は予防の方法は、機能性ＡＴＭタンパク質欠損に関連した病態の治療又は予防の方法であり得る。該病態は、毛細血管拡張性運動失調症；小脳性運動失調症；眼皮膚血管拡張症；がん；免疫不全；細胞の放射線感受性；又は染色体の不安定性のいずれの症状でもよい。がんは、リンパ芽球様白血病、又はリンパ腫を含み得る。１つの態様では、該病態は、毛細血管拡張性運動失調症である。別の態様では、該病態は、がんである。そのがんは、非ホジキンリンパ腫又はホジキンリンパ腫を含み得る。

【0063】

[0093] １つの態様では、ＮＳＥは、配列ｔｃｔａｃａｇｇｔｔｇｇｃｔｇｃａｔａｇ
ａａｇａａａａａｇ（配列番号５７）を含む。ＮＳＥリプレッサー剤は、配列；ａｇＴＣＴＡＣＡＧＧＴＴＧＧＣＴＧＣＡＴＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＧｇｔａｇａｇ（配列番号５８）（隣接する介在配列のそれぞれの３’及び５’スプライス部位ジヌクレオチドに下線を施す）内のＮＳＥへ結合するように整えられ得る。ＮＳＥリプレッサー剤は、ＡＴＭイントロン２８内のＮＳＥの５’又は３’スプライス部位へ結合するように整えられ得る。別の態様では、ＮＳＥリプレッサー剤は、ＡＴＭイントロン２８内のＮＳＥの３’スプライス部位へ結合するように整えられる。別の態様では、ＮＳＥリプレッサー剤は、配列ｔｃｔｔａｇＴＣＴＡＣＡＧＧＴＴＧＧＣＴＧＣＡＴＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＧｇｔａｇａｇ（配列番号５９）（隣接する介在配列のそれぞれの３’及び５’スプライス部位ジヌクレオチドに下線を施す）内のＮＳＥへ結合するように整えられ得る。別の態様では、ＮＳＥリプレッサー剤は、配列ｔｃｔｃａｇＴＣＴＡＣＡＧＧＴＴＧＧＣＴＧＣＡＴＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＧｇｔａｇａｇ（配列番号６０）（隣接する介在配列のそれぞれの３’及び５’スプライス部位ジヌクレオチドに下線を施す）内のＮＳＥへ結合するように整えられ得る。

【0064】

[0094] 本発明の別の側面によれば、ＮＳＥアクチベーター剤の投与を含む、ＡＴＭ発現の脱制御に関連した病態の被験者における治療又は予防の方法が提供され、ここでＮＳＥアクチベーター剤は、ＡＴＭイントロン２８内のスプライシング調節モチーフへ結合することによってＡＴＭ成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含を増加させるように整えられる。

【0065】

[0095] 成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含を増加させることは、機能性ＡＴＭタンパク質発現の減少を提供する場合がある。
[0096] 本発明の別の側面によれば、放射線療法のようなＤＮＡ傷害剤での細胞傷害性療法へのがん細胞の感受性を増加させるように整えられたＮＳＥアクチベーター剤の投与（ここでＮＳＥアクチベーター剤は、ＡＴＭイントロン２８内のスプライシング調節モチーフへ結合することによって、ＡＴＭ成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含を増加させるように整えられる）と、放射線療法又は化学療法のような細胞傷害性療法で被験者を治療することを含む、被験者におけるがんの治療又は予防の方法が提供される。

【0066】

[0097] 化学療法は、２本鎖ＤＮＡ切断を誘発する治療薬剤を含み得る。当業者は、２本鎖ＤＮＡ切断を誘発することが可能である数種の化学療法剤／治療薬剤があることを理解されよう。１つの態様では、化学療法剤は、ブレオマイシンを含み得る。

【0067】

[0098] 成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含を増加させることは、機能性ＡＴＭタンパク質発現の減少を提供する場合がある。
[0099] 放射線療法又は化学療法は、該薬剤の投与後であってよい。放射線療法又は化学療法は、該薬剤の投与から１日以上後であってよい。放射線療法又は化学療法は、該薬剤の投与から１週以上後であってよい。

【0068】

[0100] １つの態様では、シュードエクソンは、配列ｔｃａｔｃｇａａｔａｃｔｔｔｔｇｇａａａｔａａｇを含む。
[0101] 本発明の別の側面によれば、放射線療法のようなＤＮＡ傷害剤による細胞傷害性療法への細胞の感受性を増加させる方法が提供され、該方法は、ＡＴＭイントロン２８内のＮＳＥ調節モチーフへ結合することによってＡＴＭ成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含を増加させるように整えられたＮＳＥアクチベーター剤の投与により、ＡＴＭタンパク質発現を低下させることを含む。

【0069】

[0102] １つの態様では、該細胞はがん性細胞である。別の態様では、該細胞は前がん性細胞である。
[0103] 本発明の別の側面によれば、被験者、細胞、又は組織において機能性ＡＴＭ発現を増減させる方法が提供され、該方法は、本明細書に記載のＮＳＥアクチベーター剤及び／又はＮＳＥリプレッサー剤を投与することを含む。

【0070】

ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構
[0104] ナンセンス変異依存ｍＲＮＡ分解機構（ＮＭＤ）は、すべての真核生物に存在する監視経路である。その主たる機能は、未熟な終止コドンを含有するｍＲＮＡ転写産物を消失させることによって遺伝子発現におけるエラーを抑えることである。ＮＭＤは、未熟な終止コドンのある転写産物だけでなく、多くの内因性遺伝子より発現される広範囲のｍＲＮＡアイソフォームを標的とするので、ＮＭＤが細胞内の定常状態のＲＮＡレベルの微調整と粗調整をともに推進する主要制御因子であることを示唆する。

【0071】

[0105] ナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構のスイッチエクソン（ＮＳＥ）は、成熟ＲＮＡ転写産物に含まれる場合にＮＭＤ経路を活性化するエクソン又はシュードエクソンである。成熟転写産物におけるＮＳＥの包含は、遺伝子発現を下方制御する。

【0072】

[0106] クリプティック（又はシュード－スプライス部位）は、真のスプライス部位と同じスプライシング認識配列を有するが、スプライシング反応では使用されない。それらは、ヒトゲノム内の真のスプライス部位より１桁分の数で優るが、通常は、これまでほとんど理解されていない分子機序によって抑制されている。クリプティック５’スプライス部位は、コンセンサスＮＮＮ／ＧＵＮＮＮＮ又はＮＮＮ／ＧＣＮＮＮＮ（ここでＮは、任意のヌクレオチドであって、／は、エクソン－イントロンの境界である）を有する。クリプティック３’スプライス部位は、コンセンサスＮＡＧ／Ｎを有する。それらの活性化は、正統のスプライス部位の最適なコンセンサス（即ち、それぞれ、ＭＡＧ／ＧＵＲＡＧＵとＹＡＧ／Ｇ［ここでＭはＣ又はＡであり、ＲはＧ又はＡであり、そしてＹはＣ又はＵである］）へそれらをより似せる周囲のヌクレオチドによって明確に影響を受ける。

【0073】

[0107] クリプティック（又はシュード）エクソンは、真のエクソンと同じスプライシング認識配列を有するが、スプライシング反応では使用されない。それらは、真のエクソンより１桁分の数で優るが、通常は、これまでほとんど理解されていない分子機序によって抑制されている。

【0074】

[0108] スプライス部位とそれらの制御配列は、例えば、Kralovicova, J. and Vorechovsky, I. (2007) Global control of aberrant splice site activation by auxiliary splicing sequences: evidence for a gradient in exon and intron definition［異常スプライス部位活性化の補助的スプライシング配列による全体制御；エクソン及びイントロンの明確性に勾配があることの証拠］Nucleic acids Res., 35, 6399-6413,（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2095810/pdf/gkm680.pdf) に収載された、公的に利用可能な好適なアルゴリズムを使用して、当業者によって容易に同定することができる。

【0075】

[0109] クリプティックスプライス部位又はスプライシング制御配列は、Ｕ２ＡＦのようなＲＮＡ結合タンパク質について、ＮＳＥのスプライス部位と競合する場合がある。１つの態様では、該薬剤は、クリプティックスプライス部位又はスプライシング制御配列へ結合してＲＮＡ結合タンパク質の結合を妨げて、それによってＮＳＥスプライス部位の利用を有利にする場合がある。

【0076】

[0110] １つの態様では、クリプティックスプライス部位は、ＮＳＥの５’又は３’スプライス部位を含まなくてもよい。クリプティックスプライス部位は、ＮＳＥの５’スプライス部位の少なくとも１０ヌクレオチド上流にあり得る。クリプティックスプライス部
位は、ＮＳＥの５’スプライス部位の少なくとも２０ヌクレオチド上流にあり得る。クリプティックスプライス部位は、ＮＳＥの５’スプライス部位の少なくとも５０ヌクレオチド上流にあり得る。クリプティックスプライス部位は、ＮＳＥの５’スプライス部位の少なくとも１００ヌクレオチド上流にあり得る。クリプティックスプライス部位は、ＮＳＥの５’スプライス部位の少なくとも２００ヌクレオチド上流にあり得る。

【0077】

[0111] クリプティックスプライス部位は、ＮＳＥの３’スプライス部位の少なくとも１０ヌクレオチド下流にあり得る。クリプティックスプライス部位は、ＮＳＥの３’スプライス部位の少なくとも２０ヌクレオチド下流にあり得る。クリプティックスプライス部位は、ＮＳＥの３’スプライス部位の少なくとも５０ヌクレオチド下流にあり得る。クリプティックスプライス部位は、ＮＳＥの３’スプライス部位の少なくとも１００ヌクレオチド下流にあり得る。クリプティックスプライス部位は、ＮＳＥの３’スプライス部位の少なくとも２００ヌクレオチド下流にあり得る。

【0078】

ＮＳＥリプレッサー剤とＮＳＥアクチベーター剤
[0112] ＮＳＥリプレッサー剤及び／又はＮＳＥアクチベーター剤は、ポリ核酸ポリマーを含み得る。１つの態様では、ＮＳＥリプレッサー剤及び／又はＮＳＥアクチベーター剤は、ＳＳＯ（スプライススイッチングオリゴヌクレオチド）である。

【0079】

[0113] ＮＳＥリプレッサー剤及び／又はＮＳＥアクチベーター剤がポリ核酸ポリマーを含む態様では、他に示さなければ、以下の陳述がＮＳＥリプレッサー剤及びＮＳＥアクチベーター剤へ等しく適用され得る。ポリ核酸ポリマーは、約５０ヌクレオチドの長さであり得る。ポリ核酸ポリマーは、約４５ヌクレオチドの長さであり得る。ポリ核酸ポリマーは、約４０ヌクレオチドの長さであり得る。ポリ核酸ポリマーは、約３５ヌクレオチドの長さであり得る。ポリ核酸ポリマーは、約３０ヌクレオチドの長さであり得る。ポリ核酸ポリマーは、約２４ヌクレオチドの長さであり得る。ポリ核酸ポリマーは、約２５ヌクレオチドの長さであり得る。ポリ核酸ポリマーは、約２０ヌクレオチドの長さであり得る。ポリ核酸ポリマーは、約１９ヌクレオチドの長さであり得る。ポリ核酸ポリマーは、約１８ヌクレオチドの長さであり得る。ポリ核酸ポリマーは、約１７ヌクレオチドの長さであり得る。ポリ核酸ポリマーは、約１６ヌクレオチドの長さであり得る。ポリ核酸ポリマーは、約１５ヌクレオチドの長さであり得る。ポリ核酸ポリマーは、約１４ヌクレオチドの長さであり得る。ポリ核酸ポリマーは、約１３ヌクレオチドの長さであり得る。ポリ核酸ポリマーは、約１２ヌクレオチドの長さであり得る。ポリ核酸ポリマーは、約１１ヌクレオチドの長さであり得る。ポリ核酸ポリマーは、約１０ヌクレオチドの長さであり得る。ポリ核酸ポリマーは、約１０～約５０のヌクレオチドの長さであり得る。ポリ核酸ポリマーは、約１０～約４５のヌクレオチドの長さであり得る。ポリ核酸ポリマーは、約１０～約４０のヌクレオチドの長さであり得る。ポリ核酸ポリマーは、約１０～約３５のヌクレオチドの長さであり得る。ポリ核酸ポリマーは、約１０～約３０のヌクレオチドの長さであり得る。ポリ核酸ポリマーは、約１０～約２５のヌクレオチドの長さであり得る。ポリ核酸ポリマーは、約１０～約２０のヌクレオチドの長さであり得る。ポリ核酸ポリマーは、約１５～約２５のヌクレオチドの長さであり得る。ポリ核酸ポリマーは、約１５～約３０のヌクレオチドの長さであり得る。ポリ核酸ポリマーは、約１２～約３０のヌクレオチドの長さであり得る。

【0080】

[0114] ポリ核酸ポリマーの配列は、部分的にプロセシングされたｍＲＮＡ転写産物の標的配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％相補的であり得る。ポリ核酸ポリマーの配列は、そのプレｍＲＮＡ転写産物の標的配列に対して１００％相補的であり得る。

【0081】

[0115] ポリ核酸ポリマーの配列は、プレｍＲＮＡ転写産物の標的配列に対して４以下のミスマッチを有し得る。ポリ核酸ポリマーの配列は、プレｍＲＮＡ転写産物の標的配列に対して３以下のミスマッチを有し得る。ポリ核酸ポリマーの配列は、プレｍＲＮＡ転写産物の標的配列に対して２以下のミスマッチを有し得る。ポリ核酸ポリマーの配列は、プレｍＲＮＡ転写産物の標的配列に対して１以下のミスマッチを有し得る。

【0082】

[0116] ポリ核酸ポリマーは、プレｍＲＮＡ転写産物の標的配列へ特異的にハイブリダイズし得る。その特異性は、プレｍＲＮＡ転写産物の標的配列に対するポリ核酸ポリマーの少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は１００％の配列相補性であり得る。ハイブリダイゼーションは、高ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下であり得る。

【0083】

[0117] ポリ核酸ポリマーは、表２又は図２０に例解される配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％の配列同一性がある配列を有し得る。ポリ核酸ポリマーは、表２又は図２０に例解される配列に対して１００％の配列同一性がある配列を有し得る。いくつかの事例では、ポリ核酸ポリマーは、表２に例解される配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％の配列同一性がある配列を有し得る。いくつかの事例では、ポリ核酸ポリマーは、表２に例解される配列に対して１００％の配列同一性がある配列を有し得る。

【0084】

[0118] いくつかの事例では、ポリ核酸ポリマーは、配列番号１８～５２より選択される配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％の配列同一性がある配列を有する。いくつかの事例では、ポリ核酸ポリマーは、配列番号１８～５２より選択される配列に対して少なくとも５０％の配列同一性がある配列を有する。いくつかの事例では、ポリ核酸ポリマーは、配列番号１８～５２より選択される配列に対して少なくとも６０％の配列同一性がある配列を有する。いくつかの事例では、ポリ核酸ポリマーは、配列番号１８～５２より選択される配列に対して少なくとも７０％の配列同一性がある配列を有する。いくつかの事例では、ポリ核酸ポリマーは、配列番号１８～５２より選択される配列に対して少なくとも８０％の配列同一性がある配列を有する。いくつかの事例では、ポリ核酸ポリマーは、配列番号１８～５２より選択される配列に対して少なくとも８５％の配列同一性がある配列を有する。いくつかの事例では、ポリ核酸ポリマーは、配列番号１８～５２より選択される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性がある配列を有する。いくつかの事例では、ポリ核酸ポリマーは、配列番号１８～５２より選択される配列に対して少なくとも９１％の配列同一性がある配列を有する。いくつかの事例では、ポリ核酸ポリマーは、配列番号１８～５２より選択される配列に対して少なくとも９２％の配列同一性がある配列を有する。いくつかの事例では、ポリ核酸ポリマーは、配列番号１８～５２より選択される配列に対して少なくとも９３％の配列同一性がある配列を有する。いくつかの事例では、ポリ核酸ポリマーは、配列番号１８～５２より選択される配列に対して少なくとも９４％の配列同一性がある配列を有する。いくつかの事例では、ポリ核酸ポリマーは、配列番号１８～５２より選択される配列に対して少なくとも９５％の配列同一性がある配列を有する。いくつかの事例では、ポリ核酸ポリマーは、配列番号１８～５２より選択される配列に対して少なくとも９６％の配列同一性がある配列を有する。いくつかの事例では、ポリ核酸ポリマーは、配列番号１８～５２より選択される配列に対して少なくとも９７％の配列同一性がある配列を有する。いくつかの事例では、ポリ核酸ポリマーは、配列番号１８～５２より選択される配列に対して少なくとも９８％の配列同一性がある配列を有する。いくつかの事例では、ポリ核酸ポリマーは、配列番号１８～５２より選択される配列に対して少なくとも９９％の配列同一性がある配列を有する。いくつかの事例では、ポリ核酸ポリマーは、配列番号１８～５２より選択される配列に対して少なくとも９９．５％の配列同一性がある配列を有する。いくつかの事例では、ポリ核酸ポリマーは、配列番号１８～５２より選択される配列に対して１００％の配列同一性がある配列を有する。

【0085】

[0119] いくつかの態様では、ポリ核酸ポリマーが転移因子の内部、転移因子の上流、又は転移因子の下流にあるモチーフへハイブリダイズする。いくつかの事例では、転移因子は、Ａｌｕ、ＭＥＲ５１、ＵＣ、又はＬ４Ｃである。いくつかの事例では、転移因子は、Ａｌｕ（例えばＡｌｕ－又はＡｌｕ＋）又はＭＥＲ５１である。いくつかの事例では、転移因子は、Ａｌｕ（例えばＡｌｕ－又はＡｌｕ＋）である。他の事例では、転移因子は、ＭＥＲ５１である。いくつかの事例では、ポリ核酸ポリマーは、Ａｌｕ（例えばＡｌｕ－又はＡｌｕ＋）内部の標的モチーフへハイブリダイズする。他の事例では、ポリ核酸ポリマーは、ＭＥＲ５１の下流にある標的モチーフへハイブリダイズする。いくつかの事例では、ポリ核酸ポリマーは、配列番号１８～５２より選択される配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％の配列同一性がある配列を有する。

【0086】

[0120] いくつかの態様では、ポリ核酸ポリマーは、Ａｌｕ（例えばＡｌｕ－又はＡｌｕ＋）の上流又は下流にある標的モチーフへハイブリダイズする。いくつかの事例では、ポリ核酸ポリマーは、Ａｌｕの上流にある標的モチーフへハイブリダイズする。いくつかの事例では、標的モチーフは、Ａｌｕの約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００塩基、又はそれ以上の塩基上流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、Ａｌｕの約５以上の塩基上流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、Ａｌｕの約１０以上の塩基上流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、Ａｌｕの約２０以上の塩基上流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、Ａｌｕの約３０以上の塩基上流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、Ａｌｕの約４０以上の塩基上流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、Ａｌｕの約５０以上の塩基上流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、Ａｌｕの約８０以上の塩基上流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、Ａｌｕの約１００以上の塩基上流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、Ａｌｕの約１５０以上の塩基上流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、Ａｌｕの約２００以上の塩基上流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、Ａｌｕの約３００以上の塩基上流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、Ａｌｕの約５００以上の塩基上流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、Ａｌｕの約８００以上の塩基上流にある。いくつかの事例では、ポリ核酸ポリマーは、配列番号１８～５２より選択される配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％の配列同一性がある配列を有する。

【0087】

[0121] いくつかの態様では、ポリ核酸ポリマーは、Ａｌｕ（例えばＡｌｕ－又はＡｌｕ＋）の下流にある標的モチーフへハイブリダイズする。いくつかの事例では、標的モチーフは、Ａｌｕの約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００塩基、又はそれ以上の塩基下流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、Ａｌｕの約５以上の塩基下流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、Ａｌｕの約１０以上
の塩基下流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、Ａｌｕの約２０以上の塩基下流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、Ａｌｕの約３０以上の塩基下流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、Ａｌｕの約４０以上の塩基下流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、Ａｌｕの約５０以上の塩基下流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、Ａｌｕの約８０以上の塩基下流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、Ａｌｕの約１００以上の塩基下流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、Ａｌｕの約１５０以上の塩基下流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、Ａｌｕの約２００以上の塩基下流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、Ａｌｕの約３００以上の塩基下流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、Ａｌｕの約５００以上の塩基下流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、Ａｌｕの約８００以上の塩基下流にある。いくつかの事例では、ポリ核酸ポリマーは、配列番号１８～５２より選択される配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％の配列同一性がある配列を有する。

【0088】

[0122] いくつかの態様では、ポリ核酸ポリマーは、ＭＥＲ５１の上流又は下流にある標的モチーフへハイブリダイズする。いくつかの事例では、ポリ核酸ポリマーは、ＭＥＲ５１の上流にある標的モチーフへハイブリダイズする。いくつかの事例では、標的モチーフは、ＭＥＲ５１の約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００塩基、又はそれ以上の塩基上流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、ＭＥＲ５１の約５以上の塩基上流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、ＭＥＲ５１の約１０以上の塩基上流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、ＭＥＲ５１の約２０以上の塩基上流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、ＭＥＲ５１の約３０以上の塩基上流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、ＭＥＲ５１の約４０以上の塩基上流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、ＭＥＲ５１の約５０以上の塩基上流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、ＭＥＲ５１の約８０以上の塩基上流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、ＭＥＲ５１の約１００以上の塩基上流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、ＭＥＲ５１の約１５０以上の塩基上流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、ＭＥＲ５１の約２００以上の塩基上流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、ＭＥＲ５１の約３００以上の塩基上流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、ＭＥＲ５１の約５００以上の塩基上流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、ＭＥＲ５１の約８００以上の塩基上流にある。いくつかの事例では、ポリ核酸ポリマーは、配列番号１８～５２より選択される配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％の配列同一性がある配列を有する。

【0089】

いくつかの事例では、ポリ核酸ポリマーは、ＭＥＲ５１の下流にある標的モチーフへハイブリダイズする。いくつかの事例では、標的モチーフは、ＭＥＲ５１の約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００塩基、又はそれ以上の塩基下流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、ＭＥＲ５１の約５以上の塩基下流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、ＭＥＲ５１の約１０以上の塩基下流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、ＭＥＲ５１の約２０以上の塩基下流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、ＭＥＲ５１の約３０以上の塩基下流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、ＭＥＲ５１の約４０以上の塩基下流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、ＭＥＲ５１の約５０以上の塩基下流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、ＭＥＲ５１の約８０以上の塩基下流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、ＭＥＲ５１の約１００以上の塩基下流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、ＭＥＲ５１の約１５０以上の塩基下流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、ＭＥＲ５１の約２００以上の塩基下流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、ＭＥＲ５１の約３００以上の塩基下流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、ＭＥＲ５１の約５００以上の塩基下流にある。いくつかの事例では、標的モチーフは、ＭＥＲ５１の約８００以上の塩基下流にある。いくつかの事例では、ポリ核酸ポリマーは、配列番号１８～５２より選択される配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９．５％の配列同一性がある配列を有する。

【0090】

[0123] ポリ核酸ポリマー配列への言及がなされる場合、当業者は、標的配列へハイブリダイズする能力が維持されるならば、あるいは（その置換が標的配列内である場合は）標的配列として認識される能力が維持されるならば、その配列において、１以上の置換が許容され得て、２つの置換が許容されてもよいことが理解されよう。配列同一性への参照は、標準／デフォルト変数を使用する、ＢＬＡＳＴ配列アライメント（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）によって決定され得る。例えば、配列は、９９％の同一性を有して、それでも本発明に従って機能する場合がある。他の態様では、配列は、９８％の同一性を有して、それでも本発明に従って機能する場合がある。別の態様では、配列は、９５％の同一性を有して、それでも本発明に従って機能する場合がある。

【0091】

[0124] ＳＳＯのようなポリ核酸ポリマーは、ＲＮＡ又はＤＮＡを含み得る。ＳＳＯのようなポリ核酸ポリマーは、ＲＮＡを含み得る。ＳＳＯのようなポリ核酸ポリマーは、ＤＮＡ又はＲＮＡと同等の相補性を有する、天然又は合成又は人工のヌクレオチド類似体又は塩基を含み得る。ＳＳＯのようなポリ核酸ポリマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／又はヌクレオチド類似体の組合せを含み得る。ヌクレオチド類似体は、ＰＮＡ又はＬＮＡを含み得る。別の態様では、ＳＳＯのような核酸は、ＰＭＯを含み得るか又はそれからなり得る。

【0092】

[0125] いくつかの事例では、合成又は人工のヌクレオチド類似体又は塩基は、リボース部分、リン酸エステル部分、ヌクレオシド部分、又はこれらの組合せの１以上における修飾を含むことができる。例えば、ヌクレオチド塩基は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、及びウラシルのような、どの天然に存在する非修飾ヌクレオチド塩基であっても、標的プレｍＲＮＡ状に存在する塩基と水素結合することが可能であるように非修飾ヌクレオチド塩基に十分類似している、どの合成又は修飾塩基でもよい。修飾ヌクレオチド塩基の例には、限定されるものではないが、ヒポキサンチン、キサンチン、７－メチルグアニン、５，６－ジヒドロウラシル、５－メチルシトシン、及び５－ヒドロキシメトイルシトシンが含まれる。

【0093】

[0126] 時には、本明細書に記載されるポリ核酸ポリマーは、オリゴマーの諸成分を連結させる骨格構造も含み得る。「骨格構造」及び「オリゴマー連結」という用語は、互換的に使用し得て、ポリ核酸ポリマーのモノマー間の連結を意味する。天然に存在するオリゴヌクレオチドにおいて、骨格は、オリゴマーの糖部分を連結する３’－５’ホスホジエステル結合を含む。本明細書に記載されるポリ核酸ポリマーの骨格構造又はオリゴマー連結には、（限定されるものではないが）ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニラデート、ホスホロアミデート、等が含まれ得る。例えば、LaPlanche et al., Nucleic acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al., J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984), Stein et al., Nucleic acids Res. 16:3209 (1988), Zon et al., Anti Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al., Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach [オリゴヌクレオチドと類似体：実践アプローチ] pp.87-108 (F.Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al., 米国特許第５，１５１，５１０号；Uhlmann an Peyman, Chemical Reviews 90:543 (1990) を参照のこと。

【0094】

[0127] 複数の態様では、ポリ核酸ポリマー骨格のリン－ヌクレオチド間連結のそれぞれでの立体化学は、ランダムである。複数の態様では、ポリ核酸ポリマー骨格のリン－ヌクレオチド間連結のそれぞれでの立体化学は、制御されていて、ランダムではない。例えば、参照によって本明細書に取り込まれる、米国特許出願公開公報番号：２０１４／０１９４６１０「Methods for the Synthesis of Functionalized Nucleic Acids（機能化核酸の合成法）」は、核酸オリゴマー内の各リン原子でのキラリティーの掌性を独立的に選択するための方法について記載する。複数の態様では、本明細書に記載されるポリ核酸ポリマーが、ランダムではないリン－ヌクレオチド間連結を有するポリ核酸ポリマーを含む。複数の態様では、本発明の方法に使用される組成物が、純粋なジアステレオ異性のポリ核酸ポリマーを含む。複数の態様では、本発明の方法に使用される組成物が、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、約１００％、約９０％～約１００％、約９１％～約１００％、約９２％～約１００％、約９３％～約１００％、約９４％～約１００％、約９５％～約１００％、約９６％～約１００％、約９７％～約１００％、約９８％～約１００％、又は約９９％～約１００％のジアステレオマー純度を有するポリ核酸ポリマーを含む。

【0095】

[0128] 複数の態様では、ポリ核酸ポリマーは、そのリン－ヌクレオチド間連結でのＲｐ及びＳｐ配置のノンランダム混合物を有する。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドでは、良好な活性とヌクレアーゼ安定性の間で均衡を達成するために、ＲｐとＳｐの混合が求められる場合がある（参照により本明細書に組み込まれる、Wan, et al., 2014「Synthesis, biophysical properties and biological activity of second generation antisense oligonucleotides containing chiral phosphorothioate linkages（キラルホスホロチオエート連結を含有する第２世代アンチセンスオリゴヌクレオチドの合成、生物物理学特性、及び生体活性）」 Nucleic Acids Research 42(22): 13456-13468）。複数の態様では、本明細書に記載されるポリ核酸ポリマーは、約５～１００％のＲｐ、少なくとも約５％のＲｐ、少なくとも約１０％のＲｐ、少なくとも約１５％のＲｐ、少なくとも約２０％のＲｐ、少なくとも約２５％のＲｐ、少なくとも約３０％のＲｐ、少なくとも約３５％のＲｐ、少なくとも約４０％のＲｐ、少なくとも約４５％のＲｐ、少なくとも約５０％のＲｐ、少なくとも約５５％のＲｐ、少なくとも約６０％のＲｐ、少なくとも約６５％のＲｐ、少なくとも約７０％のＲｐ、少なくとも約７５％のＲｐ、少なくとも約８０％のＲｐ、少なくとも約８５％のＲｐ、少なくとも約９０％のＲｐ、又は少なくとも約９５％のＲｐを、残るＳｐとともに含むか、又は約１００％のＲｐを含む。複数の態様では、本明細書に記載されるポリ核酸ポリマーは、約１０％～約１００％のＲｐ、約１５％～約１００％のＲｐ、約２０％～約１００％のＲｐ、約２５％～約１００％のＲｐ、約３０％～約１００％のＲｐ、約３５％～約１００％のＲｐ、約４０％～約１００％のＲｐ、約４５％～約１００％のＲｐ、約５０％～約１００％のＲｐ、約５５％～約１００％のＲｐ、約６０％～約１００％のＲｐ、約６５％～約１００％のＲｐ、約７０％～約１００％のＲｐ、約７５％～約１００％のＲｐ、約８０％～約１００％のＲｐ、約８５％～約１００％のＲｐ、約９０％～約１００％のＲｐ、又は約９５％～約１００％のＲｐ、約２０％～約８０％のＲｐ、約２５％～約７５％のＲｐ、約３０％～約７０％のＲｐ、約４０％～約６０％のＲｐ、又は約４５％～約５５％のＲｐを、残るＳｐとともに含む。

【0096】

[0129] 複数の態様では、本明細書に記載されるポリ核酸ポリマーは、約５～１００％のＳｐ、少なくとも約５％のＳｐ、少なくとも約１０％のＳｐ、少なくとも約１５％のＳ
ｐ、少なくとも約２０％のＳｐ、少なくとも約２５％のＳｐ、少なくとも約３０％のＳｐ、少なくとも約３５％のＳｐ、少なくとも約４０％のＳｐ、少なくとも約４５％のＳｐ、少なくとも約５０％のＳｐ、少なくとも約５５％のＳｐ、少なくとも約６０％のＳｐ、少なくとも約６５％のＳｐ、少なくとも約７０％のＳｐ、少なくとも約７５％のＳｐ、少なくとも約８０％のＳｐ、少なくとも約８５％のＳｐ、少なくとも約９０％のＳｐ、又は少なくとも約９５％のＳｐを、残るＲｐとともに含むか、又は約１００％のＳｐを含む。複数の態様では、本明細書に記載されるポリ核酸ポリマーは、約１０％～約１００％のＳｐ、約１５％～約１００％のＳｐ、約２０％～約１００％のＳｐ、約２５％～約１００％のＳｐ、約３０％～約１００％のＳｐ、約３５％～約１００％のＳｐ、約４０％～約１００％のＳｐ、約４５％～約１００％のＳｐ、約５０％～約１００％のＳｐ、約５５％～約１００％のＳｐ、約６０％～約１００％のＳｐ、約６５％～約１００％のＳｐ、約７０％～約１００％のＳｐ、約７５％～約１００％のＳｐ、約８０％～約１００％のＳｐ、約８５％～約１００％のＳｐ、約９０％～約１００％のＳｐ、又は約９５％～約１００％のＳｐ、約２０％～約８０％のＳｐ、約２５％～約７５％のＳｐ、約３０％～約７０％のＳｐ、約４０％～約６０％のＳｐ、又は約４５％～約５５％のＳｐを、残るＲｐとともに含む。

【0097】

[0130] ヌクレオチド類似体又は人工ヌクレオチド塩基は、リボース部分の２’ヒドロキシル基に修飾がある核酸を含み得る。この修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾又は２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）修飾であり得る。２’－Ｏ－メチル修飾は、リボース部分の２’ヒドロキシル基へメチル基を付加し得て、一方２’Ｏ－メトキシエチル修飾は、リボース部分の２’ヒドロキシル基へメトキシエチル基を付加し得る。アデノシン分子の２’－Ｏ－メチル修飾とウリジンの２’Ｏ－メトキシエチル修飾の例示の化学構造を下記に図示する。

【0098】

【化1】

【0099】

[0131] ２’ヒドロキシル基での追加の修飾には、２’－Ｏ－アミノプロピル糖コンホメーションを含めることができて、これは、アミン基を２’酸素へ結合するプロピルリンカーを含む、延長アミン基を含むことができる。この修飾は、糖１つに付きこのアミン基からの１つの陽電荷を導入することによって、リン酸エステルに由来するオリゴヌクレオチド分子全体の陰電荷を中和することができて、それによってその双性イオン特性による細胞取込み特性を改善することができる。２’－Ｏ－アミノプロピルヌクレオシドホスホロアミダイトの例示の化学構造を下記に図示する。

【0100】

【化2】

【0101】

[0132] ２’ヒドロキシル基での別の修飾には、４’リボース位も含め得る、ロックされた（locked）か又は架橋されたリボースコンホメーション（例、ロック核酸又はＬＮＡ）を含めることができる。この修飾において、２’炭素で結合した酸素分子は、メチレン基によって４’炭素へ連結して、それによって２’－Ｃ，４’－Ｃ－オキシ－メチレン連結性の２環式リボヌクレオチドモノマーを形成することができる。ＬＮＡの化学構造の例示の描図を下記に図示する。左方に示した描図は、ＬＮＡモノマーの化学連結性を強調する。右方に示した描図では、ＬＮＡモノマーのフラノース環のロックされた３’－エンド（^３Ｅ）コンホメーションを強調する。

【0102】

【化3】

【0103】

[0133] ２’ヒドロキシル基でのさらなる修飾は、糖コンホメーションをＣ３’－エンド糖パッカリング（puckering）コンホメーションの中へロックする、例えば２’－４’
－エチレン－架橋型核酸のようなエチレン核酸（ＥＮＡ）を含み得る。ＥＮＡは、ＬＮＡも含む、修飾された核酸の架橋型核酸群の一部である。ＥＮＡと架橋型核酸の例示の化学構造を下記に図示する。

【0104】

【化4】

【0105】

[0134] ２’ヒドロキシル基でのなお他の修飾には、２’－デオキシ、Ｔ－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、Ｔ－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、又は２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）を含めることができる。

【0106】

[0135] ヌクレオチド類似体は、モルホリノ類、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホロアミダイト、１’，５’－アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、又はこれらの組合せをさらに含み得る。モルホリノ又はホスホロジアミデートモルホリノオリゴ（ＰＭＯ）は、その構造が、通常の糖及びリン酸エステルの構造からの逸脱によって天然の核酸構造を模倣する合成分子を含む。また、５員リボース環は、４個の炭素、１個の窒素、及び１個の酸素を含有する６員モルホリノ環で置換し得る。リボースモノマーは、リン酸エステル基の代わりにホスホロジアミデート基によって連結することができる。これらの骨格改変は、すべての陽電荷と陰電荷を除去して、モルホリノ類を、荷電性オリゴヌクレオチドによって使用されるような細胞送達剤の手助け無しに細胞膜を横断することができる中性分子にすることを可能にする。

【0107】

【化5】

【0108】

[0136] ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、糖環もリン酸エステル連結も含有しない。その代わり、塩基は、オリゴグリシン様分子に付いて、それによって適切に整えられるので、骨格電荷を消失させることができる。

【0109】

【化6】

【0110】

[0137] リン酸エステル骨格の修飾は、メチルホスホネートヌクレオチドのようなメチル又はチオール修飾も含み得る。例示のチオールホスホネートヌクレオチド（左）とチルホスホネートヌクレオチド（右）を下記に図示する。

【0111】

【化7】

【0112】

[0138] さらに、例示の２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホロアミダイトを下記のように図示する：

【0113】

【化8】

【0114】

[0139] さらに、例示のヘキシトール核酸（又は１’，５’－アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ））を下記のように図示する：

【0115】

【化9】

【0116】

[0140] リボース部分、リン酸エステル骨格、及びヌクレオシドの修飾に加えて、ヌクレオチド類似体は、例えば、３’又は５’末端でも修飾することができる。例えば、３’末端には、３’カチオン基を含めることができる、又は３’末端のヌクレオシドを３’－３’連結で逆にすることができる。別の代替態様では、３’末端は、アミノアルキル基（例、３’Ｃ５－アミノアルキルｄＴ）でブロックすることができる。５’末端は、アミノアルキル基（例、５’－Ｏ－アルキルアミノ置換基）でブロックすることができる。他の５’コンジュゲートは、５’－３’エクソヌクレアーゼによる切断を阻害することができる。他の３’コンジュゲートは、３’－５’エクソヌクレアーゼによる切断を阻害することができる。

【0117】

[0141] 他に断らなければ、１本鎖核酸（例、プレｍＲＮＡ転写産物、オリゴヌクレオチド、ＳＳＯ、等）配列の左端は、５’端であって、１本鎖又は２本鎖の核酸配列の左手方向は、５’方向と呼ばれる。同様に、核酸配列（１本鎖又は２本鎖）の右手端又は方向は、３’端又は３’方向である。一般に、核酸内の基準点に対して５’にある領域又は配列は、「上流」と言及されて、核酸内の基準点に対して５’にある領域又は配列は、「下流」と言及される。一般に、ｍＲＮＡの５’方向又は５’端は、開始又は出発コドンが位置する所であって、一方３’端又は３’方向は、終止コドンが位置する所である。いくつかの側面では、核酸内の基準点の上流にあるヌクレオチドが負数で指定される場合がある一方、一方核酸内の基準点の下流にあるヌクレオチドが正数で指定される場合がある。例えば、基準点（例、ｍＲＮＡ内のエクソン－エクソン連結部）が「ゼロ」位と指定される場合があると、その基準点のすぐ隣で上流にあるヌクレオチドは、「マイナス１」例えば「－１」と指定され、その基準点のすぐ隣で下流にあるヌクレオチドは、「プラス１」例えば「＋１」と指定される。

【0118】

[0142] いくつかの事例では、本明細書に記載される人工ヌクレオチド類似体の１以上が、天然のポリ核酸ポリマーと比べた場合、例えば、ＲＮアーゼＨのようなリボヌクレアーゼ、ＤＮアーゼのようなデオキシリボヌクレアーゼ、又は５’－３’エクソヌクレアーゼ及び３’－５’エクソヌクレアーゼのようなエクソヌクレアーゼといったヌクレアーゼに対して抵抗性である。いくつかの事例では、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、Ｔ－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、Ｔ－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、又は２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）修飾された、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホロアミダイト、又はこれらの組合せを含む人工ヌクレオチド類似体が、例えば、ＲＮアーゼＨのようなリボヌクレアーゼ、ＤＮアーゼのようなデオキシリボヌクレアーゼ、又は５’－３’エクソヌクレアーゼ及び３’－５’エクソヌクレアーゼのようなエクソヌクレアーゼといったヌクレアーゼに対して抵抗性である。２’－Ｏ－メチル修飾されたポリ核酸ポリマーは、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮアーゼＨ、ＤＮアーゼ、５’－３’エクソヌクレアーゼ又は３’－５’エクソヌクレアーゼ抵抗性）であり得る。２’Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）修飾されたポリ核酸ポリマーは、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮアーゼＨ、ＤＮアーゼ、５’－３’エクソヌクレアーゼ又は３’－５’エクソヌクレアーゼ抵抗性）であり得る。２’－Ｏ－アミノプロピル修飾されたポリ核酸ポリマーは、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮアーゼＨ、ＤＮアーゼ、５’－３’エクソヌクレアーゼ又は３’－５’エクソヌクレアーゼ抵抗性）であり得る。２’－デオキシ修飾されたポリ核酸ポリマーは、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮアーゼＨ、ＤＮアーゼ、５’－３’エクソヌクレアーゼ又は３’－５’エクソヌクレアーゼ抵抗性）であり得る。Ｔ－デオキシ－２’－フルオロ修飾されたポリ核酸ポリマーは、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮアーゼＨ、ＤＮアーゼ、５’－３’エクソヌクレアーゼ又は３’－５’エクソヌクレアーゼ抵抗性）であり得る。２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）修飾されたポリ核酸ポリマーは、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮアーゼＨ、ＤＮアーゼ、５’－３’エクソヌクレアーゼ又は３’－５’エクソヌクレアーゼ抵抗性）であり得る。２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）修飾されたポリ核酸ポリマーは、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮアーゼＨ、ＤＮアーゼ、５’－３’エクソヌクレアーゼ又は３’－５’エクソヌクレアーゼ抵抗性）であり得る。２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）修飾されたポリ核酸ポリマーは、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮアーゼＨ、ＤＮアーゼ、５’－３’エクソヌクレアーゼ又は３’－５’エクソヌクレアーゼ抵抗性）であり得る。Ｔ－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）修飾されたポリ核酸ポリマーは、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮアーゼＨ、ＤＮアーゼ、５’－３’エクソヌクレアーゼ又は３’－５’エクソヌクレアーゼ抵抗性）であり得る。２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）修飾されたポリ核酸ポリマーは、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮアーゼＨ、ＤＮアーゼ、５’－３’エクソヌクレアーゼ又は３’－５’エクソヌクレアーゼ抵抗性）であり得る。ＬＮＡ修飾されたポリ核酸ポリマーは、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮアーゼＨ、ＤＮアーゼ、５’－３’エクソヌクレアーゼ又は３’－５’エクソヌクレアーゼ抵抗性）であり得る。ＥＮＡ修飾されたポリ核酸ポリマーは、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮアーゼＨ、ＤＮアーゼ、５’－３’エクソヌクレアーゼ又は３’－５’エクソヌクレアーゼ抵抗性）であり得る。ＨＮＡ修飾されたポリ核酸ポリマーは、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮアーゼＨ、ＤＮアーゼ、５’－３’エクソヌクレアーゼ又は３’－５’エクソヌクレアーゼ抵抗性）であり得る。モルホリノ類は、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮアーゼＨ、ＤＮアーゼ、５’－３’エクソヌクレアーゼ又は３’－５’エクソヌクレアーゼ抵抗性）であり得る。ＰＮＡは、ヌクレアーゼに対して抵抗し得る（例えば、ＲＮアーゼＨ、ＤＮアーゼ、５’－３’エクソヌクレアーゼ又は３’－５’エクソヌクレアーゼ抵抗性）。メチルホスホネートヌクレオチド修飾されたポリ核酸ポリマーは、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮアーゼＨ、ＤＮアーゼ、５’－３’エクソヌクレアーゼ又は３’－５’エクソヌクレアーゼ抵抗性）であり得る。チオールホスホネートヌクレオチド修飾されたポリ核酸ポリマーは、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮアーゼＨ、ＤＮアーゼ、５’－３’エクソヌクレアーゼ又は３’－５’エクソヌクレアーゼ抵抗性）であり得る。２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホロアミダイトを含むポリ核酸ポリマーは、ヌクレアーゼ抵抗性（例えば、ＲＮアーゼＨ、ＤＮアーゼ、５’－３’エクソヌクレアーゼ又は３’－５’エクソヌクレアーゼ抵抗性）であり得る。

【0119】

[0143] いくつかの事例では、本明細書に記載される人工ヌクレオチド類似体の１以上が、同等の天然ポリ核酸ポリマーに比して、そのｍＲＮＡ標的に対して増加した結合親和性を有する。２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、Ｔ－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、Ｔ－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、又は２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）修飾された、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ＰＮＡ、ＨＮＡ、モルホリノ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、又は２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホロアミダイトを含む人工ヌクレオチド類似体の１以上は、同等の天然ポリ核酸ポリマーに比して、そのｍＲＮＡ標的に対して増加した結合親和性を有する可能性がある。２’－Ｏ－メチル修飾されたポリ核酸ポリマーは、同等の天然ポリ核酸ポリマーに比して、そのｍＲＮＡ標的に対して増加した結合親和性を有する可能性がある。２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）修飾されたポリ核酸ポリマーは、同等の天然ポリ核酸ポリマーに比して、そのｍＲＮＡ標的に対して増加した結合親和性を有する可能性がある。２’－Ｏ－アミノプロピル修飾されたポリ核酸ポリマーは、同等の天然ポリ核酸ポリマーに比して、そのｍＲＮＡ標的に対して増加した結合親和性を有する可能性がある。２’－デオキシ修飾されたポリ核酸ポリマーは、同等の天然ポリ核酸ポリマーに比して、そのｍＲＮＡ標的に対して増加した結合親和性を有する可能性がある。Ｔ－デオキシ－２’－フルオロ修飾されたポリ核酸ポリマーは、同等の天然ポリ核酸ポリマーに比して、そのｍＲＮＡ標的に対して増加した結合親和性を有する可能性がある。２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）修飾されたポリ核酸ポリマーは、同等の天然ポリ核酸ポリマーに比して、そのｍＲＮＡ標的に対して増加した結合親和性を有する可能性がある。２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）修飾されたポリ核酸ポリマーは、同等の天然ポリ核酸ポリマーに比して、そのｍＲＮＡ標的に対して増加した結合親和性を有する可能性がある。２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）修飾されたポリ核酸ポリマーは、同等の天然ポリ核酸ポリマーに比して、そのｍＲＮＡ標的に対して増加した結合親和性を有する可能性がある。Ｔ－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）修飾されたポリ核酸ポリマーは、同等の天然ポリ核酸ポリマーに比して、そのｍＲＮＡ標的に対して増加した結合親和性を有する可能性がある。２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）修飾されたポリ核酸ポリマーは、同等の天然ポリ核酸ポリマーに比して、そのｍＲＮＡ標的に対して増加した結合親和性を有する可能性がある。ＬＮＡ修飾されたポリ核酸ポリマーは、同等の天然ポリ核酸ポリマーに比して、そのｍＲＮＡ標的に対して増加した結合親和性を有する可能性がある。ＥＮＡ修飾されたポリ核酸ポリマーは、同等の天然ポリ核酸ポリマーに比して、そのｍＲＮＡ標的に対して増加した結合親和性を有する可能性がある。ＰＮＡ修飾されたポリ核酸ポリマーは、同等の天然ポリ核酸ポリマーに比して、そのｍＲＮＡ標的に対して増加した結合親和性を有する可能性がある。ＨＮＡ修飾されたポリ核酸ポリマーは、同等の天然ポリ核酸ポリマーに比して、そのｍＲＮＡ標的に対して増加した結合親和性を有する可能性がある。モルホリノ修飾されたポリ核酸ポリマーは、同等の天然ポリ核酸ポリマーに比して、そのｍＲＮＡ標的に対して増加した結合親和性を有する可能性がある。メチルホスホネートヌクレオチド修飾されたポリ核酸ポリマーは、同等の天然ポリ核酸ポリマーに比して、そのｍＲＮＡ標的に対して増加した結合親和性を有する可能性がある。チオールホスホネートヌクレオチド修飾されたポリ核酸ポリマーは、同等の天然ポリ核酸ポリマーに比して、そのｍＲＮＡ標的に対して増加した結合親和性を有する可能性がある。２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホロアミダイトを含むポリ核酸ポリマーは、同等の天然ポリ核酸ポリマーに比して、そのｍＲＮＡ標的に対して増加した結合親和性を有する可能性がある。増加した親和性は、より低いＫｄ、より高い融点（Ｔｍ）、又はこれらの組合せで例証することができる。

【0120】

[0144] 追加の事例では、本明細書に記載されるポリ核酸ポリマーを修飾して、その安定性を高めてよい。ポリ核酸ポリマーがＲＮＡである態様では、ポリ核酸ポリマーは、その安定性を高めるように修飾し得る。ポリ核酸ポリマーは、上記に記載した修飾の１以上によって、その安定性を高めるように修飾し得る。ポリ核酸ポリマーは、２’ヒドロキシル位で、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ
－アミノプロピル、２’－デオキシ、Ｔ－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、Ｔ－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、又は２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）修飾によるか又はロックされたか又は架橋型のリボースコンホメーション（例、ＬＮＡ又はＥＮＡ）によるように修飾し得る。ポリ核酸ポリマーは、２’－Ｏ－メチル及び／又は２’－Ｏ－メトキシエチルリボースによって修飾し得る。ポリ核酸ポリマーは、その安定性を高めるために、モルホリノ類、ＰＮＡ、ＨＮＡ、メチルホスホネートヌクレオチド、チオールホスホネートヌクレオチド、又は２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホロアミダイトも含めてよい。当業者には、送達のために安定性を高めるのに適したＲＮＡへの修飾が明らかであろう。

【0121】

[0145] 本明細書に記載されるポリ核酸ポリマーは、当該技術分野で知られた手順を使用する、化学合成及び／又は酵素ライゲーション反応を使用して、構築することができる。例えば、天然に存在するヌクレオチド、又は分子の生物学的安定性を高めるか又はポリ核酸ポリマーと標的核酸の間で形成される２重鎖の物理学的安定性を高めるように設計された、様々に修飾されたヌクレオチドを使用して、ポリ核酸ポリマーを化学的に合成することができる。例示の方法には、ＵＳ５，１４２，０４７；ＵＳ５，１８５，４４４；ＷＯ２００９０９９９４２；又はＥＰ１５７９０１５に記載されるものを含めることができる。追加の例示の方法には、Griffey et al.,「2^’-O-aminopropyl ribonucleotides: a zwitterionic modification that enhances the exonuclease resistance and biological activity of antisense oligonucleotides（２’－Ｏ－アミノプロピルリボヌクレオチド：アンチセンスオリゴヌクレオチドのエクソヌクレアーゼ抵抗性と生物学的活性を高める双性イオン修飾）」J. Med. Chem. 39(26): 5100-5109 (1997))；Obika, et al.「Synthesis of 2^’-O, 4^’-C-methyleneuridine and -cytidine. Novel bicyclic nucleosides
having affixed C3, -endo suger puckering（２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレンウリジン
及びシチジンの合成。固定されたＣ３，エンド糖パッカリングを有する新規２環式ヌクレオシド）」Tetrahedron Letters 38(50): 8735 (1997)；Koizumi, M.「ENA oligonucleotides as therapeutics（治療薬としてのＥＮＡオリゴヌクレオチド）」Current opinion in molecular therapeutics 8(2): 144-149 (2006)；及び Abramova et al.,「Novel oligonucleotide analogues based on morpholino nucleoside subunits-antisense technologies: new chemical possibilities（モルホリノヌクレオシドサブユニット－アンチセ
ンス技術に基づく新規オリゴヌクレオチド類似体：新しい化学の可能性）」Indian Journal of Chemistry 48B: 1721-1726 (2009) に記載されるものを含めることができる。あるいは、ポリ核酸ポリマーは、あるポリ核酸ポリマーがアンチセンス配向でその中へサブクローン化された（即ち、挿入されたポリ核酸ポリマーから転写されるＲＮＡが目的の標的ポリ核酸ポリマーに対してアンチセンス配向になる）発現ベクターを使用して生物学的に産生することができる。

【0122】

[0146] ポリ核酸ポリマーは、別のアンチセンス分子のようなどの核酸分子へも、ペプチドへも、又はポリ核酸ポリマーの送達を促進する、及び／又は該核酸を特定の組織、細胞種、又は細胞の発生期へ標的指向させる他の化学品へも結合し得る。ポリ核酸ポリマーは、タンパク質又はＲＮＡへ結合し得る。ポリ核酸ポリマーへ繋がったタンパク質は、スプライシングとイントロン除去を増強する、阻害する、又は調節するスプライシング因子を含み得る。ポリ核酸ポリマーへ繋がったＲＮＡは、スプライシングとイントロン除去を増強する、阻害する、又は調節する、アプタマー又はあらゆる構造を含み得る。ポリ核酸ポリマーは、単離された核酸であり得る。

【0123】

[0147] ポリ核酸ポリマーは、該ポリ核酸ポリマーを細胞へ送達するのに適した送達ビヒクルへコンジュゲートさせても、それによって結合してもよい。該細胞は、特定の細胞
種、又は特定の発生期であり得る。送達ビヒクルは、部位特異的、組織特異的、細胞特異的、又は発生期特異的な送達が可能であり得る。例えば、送達ビヒクルは、細胞特異的なウイルス粒子又はその成分であっても、あるいは、送達ビヒクルは、細胞特異的な抗体粒子又はその成分であってもよい。ポリ核酸ポリマーは、膵臓中のβ細胞への送達に標的指向され得る。ポリ核酸ポリマーは、胸腺細胞への送達に標的指向され得る。ポリ核酸ポリマーは、悪性細胞への送達に標的指向され得る。ポリ核酸ポリマーは、前悪性細胞（近未来のうちに、プレ白血病や骨髄異形成症候群のような明らかに悪性の表現型、又は組織病理学的に定義される前がん病変又は病態へ発達することが知られている）への送達に標的指向され得る。

【0124】

[0148] ポリ核酸ポリマーは、ナノ粒子ベースの送達ビヒクルへコンジュゲートさせても、それによって結合してもよい。ナノ粒子は、金属ナノ粒子、例えば、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、鉄、コバルト、ニッケル、銅、亜鉛、イットリウム、ジルコニウム、ニオビウム、モリブデン、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、銀、カドミウム、ハフニウム、タンタル、タングステン、レニウム、オスミウム、イリジウム、白金、金、ガドリニウム、アルミニウム、ガリウム、インジウム、スズ、タリウム、鉛、ビスマス、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウム、リチウム、ナトリウム、カリウム、ホウ素、ケイ素、リン、ゲルマニウム、ヒ素、アンチモン、及びこれらの組合せ、合金、又は酸化物のナノ粒子であり得る。ナノ粒子は、ポリマー材料より製造される場合もある。例示のポリマー材料には、限定されるものではないが、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）、ポリ（アルキルシアノアクリレート）、ポリ（アミドアミン）デンドリマー（ＰＡＭＡＭ）、ポリ（ε－カプロラクトン）（ＰＣＬ）、乳酸－グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、又はポリエステル（ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）が含まれる。ナノ粒子は、機能性エレメントの付着用の分子でさらにコートされる場合もある。いくつかの事例では、コーティング剤は、コンドロイチン硫酸、硫酸デキストラン、カルボキシメチルデキストラン、アルギン酸、ペクチン、カラゲナン、フコイダン、アガロペクチン、ポルフィラン、カラヤゴム、ゲランゴム、キサンタンゴム、ヒアルロン酸、グルコサミン、ガラクトサミン、キチン（又はキトサン）、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、リゾチーム、シトクロムＣ、リボヌクレアーゼ、トリプシノゲン、キモトリプシノゲン、α－キモトリプシン、ポリリジン、ポリアルギニン、ヒストン、プロタミン、グラフェン、オバルブミン、又はデキストリン若しくはシクロデキストリンを含む。ナノ粒子には、コア－シェルナノ粒子にあるように、コア、又はコア及びシェルが含まれる場合がある。ナノ粒子は、約５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２００ｎｍ、又は１００ｎｍ未満の少なくとも１つの寸法を有することもできる。

【0125】

[0149] いくつかの態様では、ポリ核酸ポリマーが、目的の部位（例えば、悪性組織部位、又はタンパク質発現が脱制御されている細胞）への送達のために、ナノ粒子ベースの送達ビヒクルとともに製剤化され得る。いくつかの事例では、ポリ核酸ポリマーが、血液－脳関門（ＢＢＢ）を通過する輸送を促進し、及び／又は可能にするために、ナノ粒子ベースの送達ビヒクルとともに製剤化され得る。

【0126】

[0150] 脳－血液関門を通過する浸透又は輸送を促進することが当該技術分野で知られている物質（例えばトランスフェリン受容体に対する抗体）へポリ核酸ポリマーを結合させる場合もある。いくつかの態様では、ポリ核酸ポリマーは、例えば、該化合物をより有効にするか又は脳－血液関門を通過する輸送を高めるために、ウイルスベクターと連結される。いくつかの態様では、糖（例えば、メソエリスリトール、キシリトール、Ｄ（＋）ガラクトース、Ｄ（＋）ラクトース、Ｄ（＋）キシロース、ズルシトール、ミオイノシトール、Ｌ（－）フルクトース、Ｄ（－）マンニトール、Ｄ（＋）グルコース、Ｄ（＋）アラビノース、Ｄ（－）アラビノース、セロビオース、Ｄ（＋）マルトース、Ｄ（＋）ラフィノース、Ｌ（＋）ラムノース、Ｄ（＋）メリビオース、Ｄ（－）リボース、アドニトール、Ｄ（＋）アラビトール、Ｌ（－）アラビトール、Ｄ（＋）フコース、Ｌ（－）フコース、Ｄ（－）リキソース、Ｌ（＋）リキソース、及びＬ（－）リキソース）又はアミノ酸（例えば、グルタミン、リジン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、チロシン、バリン、及びタウリン）の注入によって浸透性の血液－脳関門破壊が支援される。血液－脳関門浸透を高めるための方法及び材料については、米国特許第４，８６６，０４２号、米国特許第６，２９４，５２０号、及び米国特許第６，９３６，５８９号に記載されており、それぞれ本明細書に援用される。

【0127】

[0151] １つの態様では、ポリ核酸ポリマーは、薬物のような化学分子（例えば非ペプチド又は核酸ベースの分子）へ結合し得る。該薬物は、低分子（例えば９００Ｄａ未満の分子量を有する）であり得る。

【0128】

[0152] 本発明の１つの態様では、送達ビヒクルは、細胞浸透ペプチド（ＣＰＰ）を含み得る。例えば、ポリ核酸ポリマーは、ＣＰＰと結合又は複合化し得る。当業者は、いかなる好適なＣＰＰもポリ核酸ポリマーとコンジュゲートして、該ポリ核酸ポリマーの細胞への及び／又は細胞内への送達に役立ち得ることを理解されよう。このようなＣＰＰは、本明細書に援用される、Boisguerin et al., Advanced Drug Delivery Reviews, (2015）によって記載される、いかなる好適なＣＰＰ技術でもよい。ポリ核酸ポリマーへのコンジュゲーションに適した送達ビヒクルについては、本明細書に援用される、Lochmann et al (European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 58(2004), 237-251) にも記載されている。

【0129】

[0153] ＣＰＰは、例えば、該ペプチド内の残基の大多数がリジン又はアルギニンである場合、アルギニン及び／又はリジンリッチのペプチドであり得る。ＣＰＰは、ポリ－Ｌ－リジン（ＰＬＬ）を含み得る。あるいは、ＣＰＰは、ポリアルギニンを含み得る。好適なＣＰＰは、ペネトラチン（Penetratin）；Ｒ６－ペネトラチン；トランスポータン（Transportan）；オリゴ－アルギニン；Ｆ－３；Ｂ－ペプチド；Ｂ－ＭＳＰ；Ｐｉｐ１、Ｐｉｐ２ａ、Ｐｉｐ２ｂ、Ｐｉｐ５ｅ、Ｐｉｐ５ｆ、Ｐｉｐ５ｈ、Ｐｉｐ５ｊ；Ｐｉｐ５ｋ、Ｐｉｐ５ｌ、Ｐｉｐ５ｍ、Ｐｉｐ５ｎ、Ｐｉｐ５ｏ、Ｐｉｐ６ａ、Ｐｉｐ６ｂ、Ｐｉｐ６ｃ、Ｐｉｐ６ｄ、Ｐｉｐ６ｅ、Ｐｉｐ６ｆ、Ｐｉｐ６ｇ、又はＰｉｐ６ｈのようなＰｉｐペプチド；配列ＰＫＫＫＲＫＶのペプチド；ペナトラチン（Penatratin）；Ｌｙｓ４；ＳＰＡＣＥ；Ｔａｔ；Ｔａｔ－ＤＲＢＤ（ｄｓＲＮＡ結合ドメイン）；（ＲＸＲ）４；（ＲＦＦ）３ＲＸＢ；（ＫＦＦ）３Ｋ；ＲｇＦ２；Ｔ細胞由来ＣＰＰ；Ｐｅｐ－３；ＰＥＧｐｅｐ－３；ＭＰＧ－８；ＭＰＧ－８－Ｃｈｏｌ；ＰｅｐＦｅｃｔ６；Ｐ５ＲＨＨ；Ｒ１５；及びＣｈｏｌ－Ｒ９；又はこれらの機能性変異体（例えば、Boisguerin et al. Advanced Drug Delivery Reviews (2015) を参照のこと）を含む群より選択され得る。

【0130】

[0154] １つの態様では、ＣＰＰは、Ｐｉｐペプチドを含むか又はそれから成る。Ｐｉｐペプチドは、Ｐｉｐ１、Ｐｉｐ２ａ、Ｐｉｐ２ｂ、Ｐｉｐ５ｅ、Ｐｉｐ５ｆ、Ｐｉｐ５ｈ、Ｐｉｐ５ｊ；Ｐｉｐ５ｋ、Ｐｉｐ５ｌ、Ｐｉｐ５ｍ、Ｐｉｐ５ｎ、Ｐｉｐ５ｏ、Ｐｉｐ６ａ、Ｐｉｐ６ｂ、Ｐｉｐ６ｃ、Ｐｉｐ６ｄ、Ｐｉｐ６ｅ、Ｐｉｐ６ｆ、Ｐｉｐ６ｇ、及びＰｉｐ６ｈを含む群より選択され得る。

【0131】

[0155] 本発明の１つの態様では、送達ビヒクルは、ペプチドベースのナノ粒子（ＰＢＮ）を含むことができ、複数のＣＰＰ（例えば、本明細書で考察した１以上の好適なＣＰＰ）が電荷相互作用を介してポリ核酸ポリマーと複合体を形成する。このようなナノ粒子は、約５０ｎｍ～２５０ｎｍの大きさであり得る。１つの態様では、ナノ粒子は、約７０～２００ｎｍの大きさであり得る。別の態様では、ナノ粒子は、約７０～１００ｎｍの大きさ又は１２５～２００ｎｍの大きさであり得る。

【0132】

[0156] １つの態様では、ポリ核酸ポリマーは、送達ビヒクルと、例えばイオン結合によって複合化し得る。あるいは、ポリ核酸ポリマーは、送達ビヒクルへ共有結合し得る。コンジュゲーション／結合の方法については、本明細書に援用される、Lochmannら（European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 58(2004), 237-251）に記載されている。例えば、コンジュゲーション法は、反応基（例えば－ＮＨ_２又は－ＳＨ_２）を含有する好適なテザー（tether）をポリ核酸ポリマーへ導入して、合成後に活性中間体としてペプチドのような送達ビヒクルへ付加し、続いて水系媒体においてカップリング反応を行うことを含み得る。代替方法は、単一の固相支持体上でコンジュゲーションを線形モードで行うことを含み得る。

【0133】

[0157] 送達ビヒクルとポリ核酸ポリマーは、チオール－マレイミド連結のように、チオール及び／又はマレイミドで連結し得る。ポリ核酸ポリマーと送達ビヒクルのコンジュゲーションは、コンジュゲートされる各分子上のアジド又は２’－Ｏ－プロパルジル官能基とアルキン基の反応のような、クリックケミストリー（click-chemistry）によってよ
い。１つの態様では、送達ビヒクルとポリ核酸ポリマーは、チオエーテル架橋によって連結し得る。別の態様では、送達ビヒクルとポリ核酸ポリマーは、ジスルフィド架橋によって連結し得る。当業者は、ポリ核酸ポリマーと送達ビヒクル（ペプチドのような）のコンジュゲーションに適した連結基又は反応を容易に確認されよう。

【0134】

[0158] １つの態様では、ＮＳＥリプレッサー剤は、配列ｃｕｕｃｕａｕｇｃａｇｃｃａａｃｃｕｇｕａｇａｃｕ（ＳＳＯ－ＮＳＥ３）（配列番号５３）のＳＳＯ又はその核酸類似体を含み得る。１つの態様では、ＮＳＥリプレッサー剤は、配列ａｃｃｕｕｕｕｕｃｕｕｃｕａｕｇｃａｇｃｃａａｃ（ＳＳＯ－ＮＳＥ５）（配列番号５４）のＳＳＯ又はその核酸類似体を含み得る。当業者は、ＮＳＥ３（ｃｕｕｃｕａｕｇｃａｇｃｃａａｃｃｕｇｕａｇａｃｕ）（配列番号５３）とＮＳＥ５（ａｃｃｕｕｕｕｕｃｕｕｃｕａｕｇｃａｇｃｃａａｃ）（配列番号５４）が配列において重複することに注目されよう。１つの態様では、ＮＳＥリプレッサー剤は、この重複配列（即ち、ａｃｃｕｕｕｕｕｃｕｕｃｕａｕｇｃａｇｃｃａａｃｃｕｇｕａｇａｃｕ）（配列番号５５）の配列又はその内部にある配列を有するＳＳＯを含み得る。

【0135】

[0159] １つの態様では、ＮＳＥリプレッサー又はＮＳＥアクチベーター剤は、以下を含む群より選択されるいずれか１つのＳＳＯを含むか又はそれから成る：
ａａｃｕｕａａａｇｇｕｕａｕａｕｃｕｃ（ＳＳＯ Ａ２）（配列番号１８）；
ｕａｕａａａｕａｃｇａａｕａａａｕｃｇａ（ＳＳＯ Ａ４）（配列番号１９）；
ｃａａｃａｃｇａｃａｕａａｃｃａａａ（ＳＳＯ Ａ９）（配列番号２１）；
ａａｃａｕｕｕｃｕａｕｕｕａｇｕｕａａａａｇｃ（ＳＳＯ Ａ１１）（配列番号２３）；
ｕｕａｇｕａｕｕｃｃｕｕｇａｃｕｕｕａ（ＳＳＯ Ａ１７）（配列番号２６）；
ｇｇｕａｕｇａｇａａｃｕａｕａｇｇａ（ＳＳＯ Ａ２３）（配列番号３２）；
ｇｇｕａａｕａａｇｕｇｕｃａｃａａａ（ＳＳＯ Ａ２５）（配列番号３４）；
ｇｕａｕｃａｕａｃａｕｕａｇａａｇｇ（ＳＳＯ Ａ２６）；
ｇａｃｕｇｇｕａａａｕａａｕａａａｃａｕａａｕｕｃ（ＳＳＯ Ｂ２）；
ａｕａｕａｕｕａｇａｇａｕａｃａｕｃａｇｃｃ（ＳＳＯ Ｂ４）；
ｕｇｕｇｇｇｇｕｇａｃｃａｃａｇｃｕｕ（ＳＳＯ Ｂ１１）；
ｕｕａｇａｇａａｕｃａｕｕｕｕａａａｕａａｇａｃ（ＳＳＯ ＡＮ３）；及び
ｃｕｇｕａａａａｇａａａａｕａｇａ（ＰＥｋｒ）、又はこれらの組合せ。

【0136】

[0160] 別の態様では、ＮＳＥアクチベーター剤は、以下を含む群より選択されるいずれか１つのＳＳＯを含むか又はそれから成る：
ａａｃｕｕａａａｇｇｕｕａｕａｕｃｕｃ（ＳＳＯ Ａ２）（配列番号１８）；
ｕａｕａａａｕａｃｇａａｕａａａｕｃｇａ（ＳＳＯ Ａ４）（配列番号１９）；
ｃａａｃａｃｇａｃａｕａａｃｃａａａ（ＳＳＯ Ａ９）（配列番号２１）；
ｇｇｕａｕｇａｇａａｃｕａｕａｇｇａ（ＳＳＯ Ａ２３）（配列番号３２）；
ｇｇｕａａｕａａｇｕｇｕｃａｃａａａ（ＳＳＯ Ａ２５）（配列番号３４）；
ｇｕａｕｃａｕａｃａｕｕａｇａａｇｇ（ＳＳＯ Ａ２６）（配列番号３５）；
ｕｇｕｇｇｇｇｕｇａｃｃａｃａｇｃｕｕ（ＳＳＯ Ｂ１１）（配列番号４５）；及び
ｃｕｇｕａａａａｇａａａａｕａｇａ（ＰＥｋｒ）（配列番号５６）、又はこれらの組合せ。

【0137】

[0161] ＮＳＥアクチベーター剤は、配列ａａｃｕｕａａａｇｇｕｕａｕａｕｃｕｃ（ＳＳＯ Ａ２）（配列番号１８）のＳＳＯを含むか又はそれから成る場合がある。ＮＳＥアクチベーター剤は、配列ｕａｕａａａｕａｃｇａａｕａａａｕｃｇａ（ＳＳＯ Ａ４）（配列番号１９）のＳＳＯを含むか又はそれから成る場合がある。ＮＳＥアクチベーター剤は、配列ｃａａｃａｃｇａｃａｕａａｃｃａａａ（ＳＳＯ Ａ９）（配列番号２１）のＳＳＯを含むか又はそれから成る場合がある。ＮＳＥアクチベーター剤は、配列ｇｇｕａｕｇａｇａａｃｕａｕａｇｇａ（ＳＳＯ Ａ２３）（配列番号３２）のＳＳＯを含むか又はそれから成る場合がある。ＮＳＥアクチベーター剤は、配列ｇｇｕａａｕａａｇｕｇｕｃａｃａａａ（ＳＳＯ Ａ２５）（配列番号３４）のＳＳＯを含むか又はそれから成る場合がある。ＮＳＥアクチベーター剤は、配列ｇｕａｕｃａｕａｃａｕｕａｇａａｇｇ（ＳＳＯ Ａ２６）（配列番号３５）のＳＳＯを含むか又はそれから成る場合がある。ＮＳＥアクチベーター剤は、配列ｕｇｕｇｇｇｇｕｇａｃｃａｃａｇｃｕｕ（ＳＳＯ Ｂ１１）（配列番号４５）のＳＳＯを含むか又はそれから成る場合がある。

【0138】

[0162] １つの態様では、ＮＳＥアクチベーター剤は、本明細書に記載されるＳＳＯ ＰＥｋｒを含み得る。１つの態様では、ＮＳＥアクチベーター剤は、配列ＣＵＧＵＡＡＡＡＧＡＡＡＡＵＡＧＡ（ＰＥｋｒ）（配列番号５６）のＳＳＯを含み得る。ＰＥｋｒは、ＰＥｄｅｌとして言及される場合もあって、これらの用語は交換可能であると理解される。

【0139】

[0163] １つの態様では、ＮＳＥリプレッサー剤は、以下を含む群より選択されるいずれか１つのＳＳＯを含むか又はそれから成る：
ｃｕｕｃｕａｕｇｃａｇｃｃａａｃｃｕｇｕａｇａｃｕ（ＳＳＯ－ＮＳＥ３）（配列番号５３）；
ａｃｃｕｕｕｕｕｃｕｕｃｕａｕｇｃａｇｃｃａａｃ（ＳＳＯ－ＮＳＥ５）（配列番号５４）；
ａａｃａｕｕｕｃｕａｕｕｕａｇｕｕａａａａｇｃ（ＳＳＯ Ａ１１）（配列番号２３）；
ｕｕａｇｕａｕｕｃｃｕｕｇａｃｕｕｕａ（ＳＳＯ Ａ１７）（配列番号２６）；
ｇａｃｕｇｇｕａａａｕａａｕａａａｃａｕａａｕｕｃ（ＳＳＯ Ｂ２）（配列番号３７）；
ａｕａｕａｕｕａｇａｇａｕａｃａｕｃａｇｃｃ（ＳＳＯ Ｂ４）（配列番号３９）；及び
ｕｕａｇａｇａａｕｃａｕｕｕｕａａａｕａａｇａｃ（ＳＳＯ ＡＮ３）（配列番号５１）、又はこれらの組合せ。

【0140】

[0164] ＮＳＥリプレッサー剤は、配列ｃｕｕｃｕａｕｇｃａｇｃｃａａｃｃｕｇｕａｇａｃｕ（ＳＳＯ－ＮＳＥ３）（配列番号５３）のＳＳＯを含むか又はそれから成る場合がある。ＮＳＥリプレッサー剤は、配列ａｃｃｕｕｕｕｕｃｕｕｃｕａｕｇｃａｇｃｃａａｃ（ＳＳＯ－ＮＳＥ５）（配列番号５４）のＳＳＯを含むか又はそれから成る場合があ
る。ＮＳＥリプレッサー剤は、配列ａａｃａｕｕｕｃｕａｕｕｕａｇｕｕａａａａｇｃ（ＳＳＯ Ａ１１）（配列番号２３）のＳＳＯを含むか又はそれから成る場合がある。ＮＳＥリプレッサー剤は、配列ｕｕａｇｕａｕｕｃｃｕｕｇａｃｕｕｕａ（ＳＳＯ Ａ１７）（配列番号２６）のＳＳＯを含むか又はそれから成る場合がある。ＮＳＥリプレッサー剤は、配列ｇａｃｕｇｇｕａａａｕａａｕａａａｃａｕａａｕｕｃ（ＳＳＯ Ｂ２）（配列番号３７）のＳＳＯを含むか又はそれから成る場合がある。ＮＳＥリプレッサー剤は、配列ａｕａｕａｕｕａｇａｇａｕａｃａｕｃａｇｃｃ（ＳＳＯ Ｂ４）（配列番号３９）のＳＳＯを含むか又はそれから成る場合がある。ＮＳＥリプレッサー剤は、配列ｕｕａｇａｇａａｕｃａｕｕｕｕａａａｕａａｇａｃ（ＳＳＯ ＡＮ３）（配列番号５１）のＳＳＯを含むか又はそれから成る場合がある。

【0141】

[0165] １つの態様では、ＳＳＯのようなＮＳＥリプレッサー剤は、ｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基へ結合するように整えられ得る。
[0166] 当業者は、本明細書に記載される２種以上のＳＳＯの組合せを、治療のために提供及び／又は使用してよいことを理解されよう。例えば、２、３、４、５種以上のＮＳＥリプレッサー剤の組合せを提供しても、２、３、４、５種以上のＮＳＥアクチベーター剤の組合せを提供してもよい。

【0142】

[0167] 成熟ＲＮＡにおけるＮＳＥの包含を低下することへ言及がなされる場合、その抑制は、完全（例えば１００％）であっても、一部であってもよい。この低下は、臨床的に有意であり得る。この低下／是正は、治療無しの被験者におけるＮＳＥの包含のレベルに対するものであっても、同様の被験者の集団におけるＮＳＥの包含の量に対するものであってもよい。この抑制／是正は、平均的な被験者、又は治療前の被験者に対して少なくとも１０％少ないＮＳＥの包含であってよい。この低下は、平均的な被験者、又は治療前の被験者に対して少なくとも２０％少ないＮＳＥの包含であってよい。この低下は、平均的な被験者、又は治療前の被験者に対して少なくとも４０％少ないＮＳＥの包含であってよい。この低下は、平均的な被験者、又は治療前の被験者に対して少なくとも５０％少ないＮＳＥの包含であってよい。この低下は、平均的な被験者、又は治療前の被験者に対して少なくとも６０％少ないＮＳＥの包含であってよい。この低下は、平均的な被験者、又は治療前の被験者に対して少なくとも８０％少ないＮＳＥの包含であってよい。この低下は、平均的な被験者、又は治療前の被験者に対して少なくとも９０％少ないＮＳＥの包含であってよい。

【0143】

[0168] 活性ＡＴＭタンパク質レベルを増加させることへの言及がなされる場合、この増加は、臨床的に有意であり得る。この増加は、治療無しの被験者における活性ＡＴＭタンパク質のレベルに対するものであっても、同様の被験者の集団における活性ＡＴＭタンパク質の量に対するものであってもよい。この増加は、平均的な被験者、又は治療前の被験者に対して少なくとも１０％以上の活性ＡＴＭタンパク質であってよい。この増加は、平均的な被験者、又は治療前の被験者に対して少なくとも２０％以上の活性ＡＴＭタンパク質であってよい。この増加は、平均的な被験者、又は治療前の被験者に対して少なくとも４０％以上の活性ＡＴＭタンパク質であってよい。この増加は、平均的な被験者、又は治療前の被験者に対して少なくとも５０％以上の活性ＡＴＭタンパク質であってよい。この増加は、平均的な被験者、又は治療前の被験者に対して少なくとも８０％以上の活性ＡＴＭタンパク質であってよい。この増加は、平均的な被験者、又は治療前の被験者に対して少なくとも１００％以上の活性ＡＴＭタンパク質であってよい。この増加は、平均的な被験者、又は治療前の被験者に対して少なくとも２００％以上の活性ＡＴＭタンパク質であってよい。この増加は、平均的な被験者、又は治療前の被験者に対して少なくとも５００％以上の活性ＡＴＭタンパク質であってよい。

【0144】

[0169] 活性ＡＴＭ及び機能性ＡＴＭという用語は、本明細書において互換的に使用し
得る。
[0170] 本発明の別の側面によれば、ＡＴＭ脱制御に関連した病態の治療に対する被験者の応答を予測するための、ｒｓ６０９２６１遺伝子型決定の使用が提供される。

【0145】

[0171] ＡＴＭ脱制御に関連した病態は、Ａ－Ｔ又はがんを含むことができる。
[0172] １つの態様では、ｒｓ６０９２６１シトシン残基の存在は、同じ位置での非シトシン残基に比べて、より高いＮＳＥ活性化、ＤＮＡ２本鎖切断シグナル伝達に対するＡＴＭのより非効率な応答、より高いがんリスク、及びより低い生存率に関連する。

【0146】

[0173] 本発明の別の側面によれば、本発明のＮＳＥリプレッサー剤を含む組成物が提供される。
[0174] 本発明の別の側面によれば、本発明のＮＳＥアクチベーター剤を含む組成物が提供される。

【0147】

[0175] １つの態様では、組成物は、医薬的に許容される製剤である。
[0176] 該組成物は、ポリ核酸ポリマーに加えて、少なくとも１つの他の生理活性分子を含み得る。この生理活性分子は、薬物又はプロドラッグであり得る。この生理活性分子は、核酸又はアミノ酸を含み得る。この生理活性分子は、低分子（例えば９００ダルトン未満の分子）を含み得る。

【0148】

[0177] いくつかの態様では、本明細書に記載される医薬製剤は、経腸投与経路、非経口投与経路、又は局所投与経路によって被験者へ投与される。いくつかの事例では、本明細書に記載される医薬製剤は、経腸投与経路によって被験者へ投与される。他の事例では、本明細書に記載される医薬製剤は、非経口投与経路によって被験者へ投与される。追加の事例では、本明細書に記載される医薬製剤は、局所投与経路によって被験者へ投与される。

【0149】

[0178] 例示の投与経路には、限定されるものではないが、非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、動脈内、頭蓋内、脳内、脳室内、髄腔内、又は硝子体内）、経口、鼻腔内、頬内、局所、直腸、経粘膜、又は経皮の投与経路が含まれる。いくつかの事例では、本明細書に記載される医薬組成物は、非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、動脈内、頭蓋内、脳内、脳室内、髄腔内、又は硝子体内）投与用に製剤化される。他の事例では、本明細書に記載される医薬組成物は、経口投与用に製剤化される。さらに他の事例では、本明細書に記載される医薬組成物は、鼻腔内投与用に製剤化される。

【0150】

[0179] 本明細書に記載される医薬製剤には、限定されるものではないが、水性液体分散液剤、自己乳化型分散液剤、固体溶液剤、リポソーム分散液剤、エアゾール剤、固体剤形、散剤、即時放出型製剤、制御放出型製剤、速溶解型製剤、錠剤、カプセル剤、丸剤、遅延放出型製剤、延長放出型製剤、パルス放出型製剤、多微粒子製剤、並びに即時及び制御複合放出型製剤が含まれ得る。

【0151】

[0180] 医薬製剤には、医薬品において一般的に使用される賦形剤を含むことができ、本明細書に開示される組成物との適合性と、所望される剤形の放出プロフィール特性に基づいて選択されるべきである、担体又は担体材料が含まれ得る。例示の担体材料には、例えば、結合剤、懸濁剤、崩壊剤、充填剤、界面活性剤、可溶化剤、安定化剤、滑沢剤、湿潤剤、希釈剤、等が含まれる。医薬的に適合可能な担体材料には、限定されるものではないが、アカシア、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、マルトデキストリン、グリセリン、ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、コレステロール、コレステロールエステル類、カゼイン酸ナトリウム、大豆レシチン、タウロコール酸、ホスファチジルコリン、塩化ナトリウム、リン酸三カル
シウム、リン酸二カリウム、セルロースとセルロースコンジュゲート、糖類、ステアロイルラクチル酸ナトリウム、カラゲナン、モノグリセリド、ジグリセリド、プレゼラチン化デンプン、等が含まれ得る。リポソーム剤には、立体的に安定したリポソーム剤（例えば、１種以上の特殊化脂質を含むリポソーム剤）が含まれ得る。これらの特殊化脂質は、循環存続時間が亢進したリポソーム剤をもたらすことができる。立体的に安定したリポソーム剤は、１種以上の糖脂質を含み得るか、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分のような１種以上の親水性ポリマーで誘導体化される場合もある。例えば、「Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed（レミントン：調剤の科学と実践、第19版）」(ペンシルヴェニア州イーストン：Mack Publishing Company, 1995)；Hoover, John E.「Remington^’s Pharmaceutical Sciences（レミントン製剤科学）」（Mack Publishing Co., ペンシルヴェニア州イーストン、1975）；Liberman, H. A. and Lachman, L.（監修）「Pharmaceutical Dosage Forms（医薬剤形）」Marcel Decker, ニューヨーク州ニューヨーク、1980；及び「Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems（医薬剤形と薬物送達システム）」第7版（Lippincott Williams & Wilkins, 1999)
を参照のこと。

【0152】

[0181] 本発明の別の側面によれば、被験者において機能性ＡＴＭタンパク質欠損を治療又は予防する方法が提供され、該方法は、ヒトゲノムのＮＳＥ（ＡＴＭイントロン２８内のクリプティックエクソン）の３’スプライス部位に対して－３位に位置する非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１の存在を同定し、ここで、非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１の存在は、該被験者が機能性ＡＴＭタンパク質欠損を有するか又はそれに感受性であることを示し、そして、非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１をチミン残基に置換するように整えられた薬剤を該被験者へ投与する、ことを含む。

【0153】

[0182] 本発明の別の側面によれば、被験者において機能性ＡＴＭタンパク質欠損を治療又は予防する方法が提供され、該方法は、ヒトゲノムのＮＳＥ（ＡＴＭイントロン２８内のクリプティックエクソン）の３’スプライス部位に対して－３位に位置する非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１をチミン残基に置換する、ことを含む。

【0154】

[0183] １つの態様では、非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１を置換することは、非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１をチミン残基に置換するように整えられた薬剤を被験者へ投与する、ことを含み得る。

【0155】

[0184] 非チミン残基を置換するための薬剤は、ｒｓ６０９２６１を標的とするように整えられた適正なＲＮＡ分子と一緒の、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９のようなゲノム編集分子又はその機能性同等物であり得る。

【0156】

[0185] 本発明の別の側面によれば、被験者において機能性ＡＴＭタンパク質欠損を治療又は予防する方法が提供され、該方法は、そのヒトゲノムのｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基の存在を同定し、ここで、ｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基の存在は、該被験者が機能性ＡＴＭタンパク質欠損を有するか又はそれに感受性であることを示し、そして、ｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基をアデニンに置換するように整えられた薬剤を該被験者へ投与する、ことを含む。

【0157】

[0186] 本発明の別の側面によれば、被験者において機能性ＡＴＭタンパク質欠損を治療又は予防する方法が提供され、該方法は、そのヒトゲノムのｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基をアデニン残基に置換する、ことを含む。

【0158】

[0187] １つの態様では、ｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基を置換することは、ｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基をアデニン残基に置換するように整えら
れた薬剤を該被験者へ投与することを含み得る。

【0159】

[0188] グアニン残基を置換するための薬剤は、ｒｓ４９８８０００を標的とするように整えられた適正なＲＮＡ分子と一緒の、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９のようなゲノム編集分子又はその機能性同等物であり得る。

【0160】

[0189] 本発明の第１の側面によれば、被験者又は被験者の集団を機能性ＡＴＭタンパク質欠損への感受性についてスクリーニングする方法が提供され、該スクリーニングは、ヒトゲノムのｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基の存在を決定することを含み、ｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基の存在は、該被験者（又は被験者群）が機能性ＡＴＭタンパク質欠損を有するか又はそれに感受性である、ことを示す。

【0161】

[0190] 本発明の別の側面によれば、機能性ＡＴＭタンパク質欠損に感受性である被験者又は被験者の集団を治療又は予防のために選択する方法が提供され、該方法は、ヒトゲノムのｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基の存在を決定し、ここで、ｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基の存在は、該被験者が機能性ＡＴＭタンパク質欠損を有するか又はそれに感受性であることを示し、そして、該被験者の機能性ＡＴＭレベルを増加させるように整えられた薬剤で治療するためにそのような被験者を選択する、ことを含む。

【0162】

[0191] 本発明の別の側面によれば、被験者において機能性ＡＴＭタンパク質欠損を治療又は予防する方法が提供され、該方法は、ヒトゲノムのｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基の存在を決定し、ここで、ｒｓ４９８８０００でのグアニン変異体残基の存在は、該被験者が機能性ＡＴＭタンパク質欠損を有するか又はそれに感受性であることを示し、そして、機能性ＡＴＭレベルを増加させるように整えられた薬剤を該被験者へ投与する、ことを含む。

【0163】

[0192] 本発明の方法は、例えばＳＳＯを使用して、グアニン変異体残基をｒｓ４９８８０００で遮断することを含み得る。
[0193] ＰＥは、天然のＤＮＡ変異体ｒｓ４９８８０００（Ｇ／Ａ）を含有し、これもＮＳＥ認識に影響を及ぼす（図４Ｈ）。ｒｓ４９８８０００で系統的に変異させたＣ及びＴミニ遺伝子のトランスフェクションは、Ｕ２ＡＦ３５欠失細胞及びモック欠失細胞で、稀なＡ対立遺伝子がそれぞれのプレｍＲＮＡでのＮＳＥの包含を減少させることを明らかにした。したがって、グアニン残基をアデニンで置換すると、ＮＳＥの包含を減少させ、機能性ＡＴＭタンパク質のレベルを増加させるだろう。

【0164】

[0194] 最も高いＮＳＥの包含がもたらされるのは、白色人種において最も頻度が高いハプロタイプ（ＣＧ）であって、ハプロタイプ：ＣＡ＞ＴＧ＞ＴＡ（それぞれｒｓ６０９２６１とｒｓ４９８８０００と呼ばれる）がそれに続く。故に、本発明の方法及び組成物は、ＣＧハプロタイプをＣＡ、ＴＧ、又はＴＡへ改変するために組み合わせて（同時的又は連続的に）使用し得る。１つの態様では、本発明の方法及び組成物は、ＣＧハプロタイプをＴＡへ改変するために使用し得る。１つの態様では、本発明の方法及び組成物は、ＣＡハプロタイプをＴＧ又はＴＡへ改変するために使用し得る。１つの態様では、本発明の方法及び組成物は、ＣＡハプロタイプをＴＡへ改変するために使用し得る。１つの態様では、本発明の方法及び組成物は、ＴＧハプロタイプをＴＡへ改変するために使用し得る。

【0165】

[0195] 本発明の方法及び組成物はまた、被験者においてＣＧハプロタイプを同定することと、任意選択的に、本発明に従って該患者を治療するか又は選択するために、組み合わせて（同時的又は連続的に）使用し得る。本発明の方法及び組成物はまた、被験者においてＣＡハプロタイプを同定することと、任意選択的に、本発明に従って該患者を治療す
るか又は選択するために、組み合わせて（同時的又は連続的に）使用し得る。本発明の方法及び組成物はまた、被験者においてＴＧハプロタイプを同定することと、任意選択的に、本発明に従って該患者を治療するか又は選択するために、組み合わせて（同時的又は連続的に）使用し得る。

【0166】

[0196] 本発明の別の側面によれば、成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含の調節を改変する方法が提供され、該方法は、スプライソソーム成分についてＮＳＥと競合する、ＮＳＥの上流又は下流にある１以上のスプライシング調節モチーフを挿入又は欠失させることを含み、前記調節モチーフは、クリプティックスプライス部位又はシュードエクソンを含む。

【0167】

[0197] 本発明の別の側面によれば、タンパク質をコードする遺伝子の成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含によって調節される機能性タンパク質発現の調節を改変する方法が提供され、該方法は、スプライソソーム成分についてＮＳＥと競合する、ＮＳＥの上流又は下流にある１以上のスプライシング調節モチーフを挿入又は欠失させることを含み、前記調節モチーフは、クリプティックスプライス部位又はシュードエクソンを含む。

【0168】

[0198] １つの態様では、１以上のスプライシング調節モチーフの挿入又は欠失は、ＡＴＭイントロン２８のゲノムＤＮＡ内である。
[0199] １以上のスプライシング調節モチーフの挿入は、成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含の低下を引き起こす場合がある。１以上のスプライシング調節モチーフの欠失は、成熟ＲＮＡ転写産物におけるＮＳＥの包含の増加を引き起こす場合がある。

【0169】

[0200] １以上のスプライシング調節モチーフの挿入又は欠失は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９のようなゲノム編集技術の使用を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９は、適正な標的化ＲＮＡ分子とともに提供され得る。

【0170】

[0201] 本発明に従って治療又はスクリーニングされる被験者又は細胞は、哺乳動物であり得る。１つの態様では、被験者はヒトである。１つの態様では、細胞はヒト細胞である。

【0171】

[0202] 本発明では、本明細書に記載される１以上の方法において使用するためのキット及び製造品が提供される。該キットは、本明細書に記載されるポリ核酸ポリマーの１以上を含有することができる。

【0172】

[0203] 本発明の別の側面によれば、ｒｓ６０９２６１変異体及び／又はｒｓ４９８８０００変異体を同定するための、１以上のオリゴヌクレオチドプローブを含むキットが提供される。

【0173】

[0204] 当業者は、特徴的な遺伝子配列の有無をプローブするための技術に馴染みがあろう。例えば、オリゴヌクレオチドプローブは、ｒｓ６０９２６１及び／又はｒｓ４９８８０００を含む核酸の領域をＰＣＲ増幅する際に使用するためのプライマーを含み得る。別の態様では、オリゴヌクレオチドプローブは、ｒｓ６０９２６１又はｒｓ４９８８０００へ直接結合することができ、その結合は検出可能であり得る。該プローブの結合は、例えばＳＥＲＳ又はＳＥＲＲＳ技術を使用して、検出可能であり得る。

【0174】

[0205] 該キットには、バイアル、チューブ、等のような１以上の容器を受容するように仕切られた、担体、パッケージ、又は容器を含めることもでき、その容器それぞれは、本明細書に記載の方法において使用される、ポリ核酸ポリマーと試薬といった、別々の構成要素の１つを含む。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、及び試験
管が含まれる。容器は、ガラス又はプラスチックのような多様な材料から成型され得る。

【0175】

[0206] 本発明で提供される製造品は、包装材料を含有する。医薬包装材料の例には、限定されるものではないが、ボトル、チューブ、バッグ、容器、ボトル、及び選択される製剤と企図される投与及び治療の形式に適したあらゆる包装材料が含まれる。

【0176】

[0207] キットには、典型的には、内容物を収載するラベル、及び／又は使用説明書、並びに使用説明書付きの添付文書が含まれる。典型的には、説明書のセットも含まれるものである。

【0177】

[0208] 本発明の別の側面によれば、本発明のポリ核酸ポリマーを含むベクターが提供される。
[0209] 該ベクターは、ウイルスベクターを含み得る。ウイルスベクターは、アデノ関連ウイルスベクターを含み得る。該ベクターは、ポリ核酸ポリマーを悪性細胞又は特定の細胞種へ標的指向させるウイルスも含み得る。

【0178】

適応症
[0210] いくつかの事例では、本明細書に記載される組成物及び方法を使用して、遺伝病のような遺伝子疾患又は病態を治療する。本明細書に記載される組成物及び方法を使用して、タンパク質の産生不全を特徴とする遺伝病のような遺伝子疾患又は病態を治療することができる。本明細書に記載される組成物及び方法を使用して、不完全なスプライシングを特徴とする遺伝病のような遺伝子疾患又は病態を治療することができる。

【0179】

[0211] 本明細書に記載される組成物及び方法は、常染色体優性疾患、常染色体劣性疾患、Ｘ連鎖優性疾患、Ｘ連鎖劣性疾患、Ｙ連鎖疾患、ミトコンドリア病、又は多因子若しくは多遺伝子疾患のような遺伝子疾患又は病態を治療するために使用することもできる。本明細書に記載される組成物及び方法を使用して、常染色体優性疾患、常染色体劣性疾患、Ｘ連鎖優性疾患、Ｘ連鎖劣性疾患、Ｙ連鎖疾患、ミトコンドリア病、又は多因子若しくは多遺伝子疾患を治療することができ、この疾患又は病態は、タンパク質の産生不全を特徴とする。本明細書に記載される組成物及び方法は、常染色体優性疾患、常染色体劣性疾患、Ｘ連鎖優性疾患、Ｘ連鎖劣性疾患、Ｙ連鎖疾患、ミトコンドリア病、又は多因子若しくは多遺伝子疾患を治療するために使用することもでき、この疾患又は病態は、不完全なスプライシングを特徴とする。

【0180】

[0212] ＡＴＭ発現の脱制御に関連した病態は、がんを含み得る。本明細書に記載される組成物及び方法は、がんを治療するために使用することができる。１つの態様では、がんは、乳癌を含む。がんは、固形腫瘍又は血液系腫瘍であり得る。固形腫瘍は、肉腫又は癌腫であり得る。肉腫は、骨、軟骨、脂肪筋、血管又は造血組織のがんであり得る。例示の肉腫には、胞巣状横紋筋肉腫、胞巣状軟部肉腫、エナメル上皮腫、血管肉腫、軟骨肉腫、脊索腫、軟部組織の淡明細胞肉腫、脱分化型脂肪肉腫、デスモイド、線維形成性小円形細胞腫瘍、胎児性横紋筋肉腫、類上皮線維肉腫、類上皮血管内皮腫、類上皮肉腫、鼻腔神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、腎外性ラブドイド腫瘍、骨外性粘液型軟骨肉腫、骨外性骨肉腫、線維肉腫、巨細胞腫瘍、血管外皮腫、乳児型線維肉腫、炎症性筋線維芽細胞腫瘍、カポシ肉腫、骨平滑筋肉腫、脂肪肉腫、骨脂肪肉腫、悪性線維性組織球腫（ＭＦＨ）、骨悪性線維性組織球腫（ＭＦＨ）、悪性間葉腫、悪性末梢神経鞘腫瘍、間葉性軟骨肉腫、粘液線維肉腫、粘液型脂肪肉腫、粘液炎症性線維芽細胞肉腫、血管周囲類上皮細胞分化を伴う新生物、骨肉腫、傍骨性骨肉腫、血管周囲類上皮細胞分化を伴う新生物、骨膜性骨肉腫、多形型脂肪肉腫、多形型横紋筋肉腫、ＰＮＥＴ／骨外性ユーイング腫瘍、横紋筋肉腫、円形細胞型脂肪肉腫、小細胞型骨肉腫、孤在線維性腫瘍、滑膜肉腫、血管拡張型骨肉腫を含めることができる。

【0181】

[0213] 癌腫は、上皮細胞より発生する癌であり得る。例示の癌腫には、腺癌、扁平細胞癌、腺扁平上皮癌、退形成癌、大細胞癌、小細胞癌、肛門癌、盲腸癌、胆管癌（即ち、胆管細胞癌）、膀胱癌、脳腫瘍、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、原発不明癌（ＣＵＰ）、食道癌、眼癌、卵管癌、消化器系癌、腎癌、肝癌、肺癌、髄芽腫、黒色腫、口腔癌、卵巣癌、膵臓癌、副甲状腺疾患、陰茎癌、下垂体腫瘍、前立腺癌、直腸癌、皮膚癌、胃癌、精巣癌、咽頭癌、甲状腺癌、子宮癌、膣癌、又は外陰癌を含めることができる。血液系腫瘍は、血管系の悪性腫瘍であって、Ｔ細胞ベースの悪性腫瘍とＢ細胞ベースの悪性腫瘍を含めることができる。例示の血液系腫瘍には、骨髄性白血病、骨髄増殖性腫瘍、非特定型末梢Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ－ＮＯＳ）、未分化大細胞型リンパ腫、血管免疫芽球性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬＬ）、芽球型ＮＫ細胞リンパ腫、腸管症型Ｔ細胞リンパ腫、肝脾ガンマ・デルタＴ細胞リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、鼻性ＮＫ／Ｔ細胞リンパ腫、治療関連Ｔ細胞リンパ腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、高リスクＣＬＬ、非ＣＬＬ／ＳＬＬリンパ腫、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、ワルデンストレームマクログロブリン血症、多発性骨髄腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、非バーキット高悪性度Ｂ細胞リンパ腫、縦隔原発Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）、免疫芽球性大細胞リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性白血病、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾辺縁帯リンパ腫、形質細胞骨髄腫、形質細胞腫、縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、又はリンパ腫様肉芽腫症を含めることができる。

【0182】

[0214] 本発明の別の側面によれば、プレｍＲＮＡ遺伝子転写産物におけるＮＳＥの包含によって引き起こされる疾患病理を治療又は予防する方法が提供され、該方法は、プレｍＲＮＡ遺伝子転写産物上に存在するシュードエクソンのクリプティックスプライス部位へ結合するように整えられた薬剤を提供することを含み、クリプティック部位は、該遺伝子の成熟ＲＮＡ転写産物へのナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構のスイッチエクソン（ＮＳＥ）の包含を調節することが可能である。

【0183】

[0215] ここで、プレｍＲＮＡ遺伝子転写産物上に存在するシュードエクソンのクリプティックスプライス部位への薬剤の結合は、ＮＳＥの包含を低下させる。
[0216] 該方法は、ある疾患病理が、遺伝子転写産物におけるＮＳＥの包含によって引き起こされるかどうかを治療に先立って決定することを含み得る。

【0184】

[0217] 当業者は、本発明の１つの態様又は側面の任意選択の特徴が、本発明の他の態様又は側面に対して、適宜適用可能であり得ることを理解されよう。

【実施例0185】

[0218] 本発明の態様を、添付の図面を参照して、例としてのみ挙げて以下により詳細に記載する。これらの実施例は、例示の目的のためにのみ提供するのであって、本明細書で提供される特許請求の範囲を制限するものではない。

【0186】

[0219] 略語
ＮＳＥ： ＡＴＭイントロン２８内のナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構のスイッチエクソン
ＰＥ： ＡＴＭイントロン２８内のＮＳＥの３’に位置する２４ヌクレオチドのシュードエクソン
ＮＭＤ： ナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構
Ａ－Ｔ： 毛細血管拡張性運動失調症
ＡＴＭ： 毛細血管拡張性運動失調症における欠損遺伝子
ＳＳＯ： スプライススイッチングオリゴヌクレオチド
ＤＳＢ： ２本鎖ＤＮＡの切断
ＤＤＲ： ＤＮＡの傷害応答
ＭＩＲ： 哺乳動物散在反復
ＢＰＳ： 分岐点配列
ＰＰＴ： ポリピリミジントラクト
ＩＲ： イオン化放射線
Ｕ２ＡＦ： Ｕ２核内低分子リボ核タンパク質の補助因子
Ｕ２ＡＦ３５： Ｕ２ＡＦ１によってコードされる、Ｕ２ＡＦの３５ｋＤサブユニット
Ｕ２ＡＦ６５： Ｕ２ＡＦ２によってコードされる、Ｕ２ＡＦの６５ｋＤサブユニット
ｓｎＲＮＡ 核内低分子ＲＮＡ
実施例１
概要
[0220] 表現型の多様性と遺伝子疾患への感受性は、天然のイントロン性変異体によって影響を受けるが、ＲＮＡ結合タンパク質とそれらの相互作用については、ほとんど不明である。今回、拘束された（detained）ＡＴＭイントロン内の１塩基多型がＵ２核内低分子リボ核タンパク質（Ｕ２ＡＦ）の補助因子を欠く細胞において機能性を獲得することを示した。ＡＴＭイントロン２８におけるナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構のスイッチエクソン（ＮＳＥ）の抑制には、それぞれのＵ２ＡＦサブユニットが必要とされた。ＮＳＥは、ＮＳＥ３’スプライス部位に対して－３位に位置するｒｓ６０９２６１でのチミンよりもシトシンの存在時により大きな度合いで活性化された。このシトシン対立遺伝子は、白色人種において優性であるが、アジア人の集団において主要な対立遺伝子であるチミンよりも、ＡＴＭ発現のより効率的なＮＳＥ仲介性の阻害をもたらした。ＮＳＥ活性化は、白血病細胞において脱制御病態にあって、Ｕ２ＡＦ３５残基３４でのアミノ酸同一性によって影響を受けた。ＮＳＥと下流シュードエクソンの間の競合を利用して、ＮＳＥを抑制するか又は活性化してＡＴＭ発現を調節するスプライススイッチングオリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）を同定した。ＲＮＡ－Ｓｅｑを使用して、ＡＴＭシグナル伝達経路におけるＵ２ＡＦ制御されるエクソン利用がＭＲＮ／ＡＴＭ－ＣＨＥＫ２－ＣＤＣ２５－ｃｄｃ２／サイクリンＢ軸に集中して、Ｕ２ＡＦががん関連融合や染色体転座に関与する転写産物のＲＮＡプロセシングを選好的に制御することを示した。これらの結果は、３’スプライス部位制御と２本鎖ＤＮＡ切断に対するＡＴＭ依存性応答の間の重要な連関を明らかにし、ＲＮＡ結合因子への応答におけるイントロン性変異体の機能的柔軟性を例証し、イントロン内のシュードスプライス部位を標的とすることによって遺伝子発現を改変するＳＳＯの多用途性を実証して、がんのリスク及び生存率における人種差を説明する可能性がある。

【0187】

序論
[0221] 今回、ＡＴＭ遺伝子（毛細血管拡張性運動失調症、Ａ－Ｔ、突然変異型）におけるナンセンス変異依存分解機構（ＮＭＤ）のスイッチエクソン（ＮＳＥ）をＵ２ＡＦが抑制することを示し、成熟転写産物におけるＮＳＥの包含を制御する３’ｓｓ認識に関与する他のタンパク質を同定した。この事象がＡＴＭ発現を制限する程度は、イントロン２８の深部にあるＮＳＥ ３’ｓｓコンセンサス内に位置する一般的なＣ／Ｔ変異体ｒｓ６０９２６１に依存する。また同定されるのは、成熟転写産物におけるＮＳＥの包含を制御するイントロン性シスエレメントと、同じイントロン内の競合シュードエクソンを標的とすることによってＮＳＥ活性化を調節するスプライススイッチングオリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）である。ＲＮＡ－Ｓｅｑを使用して、ＤＮＡ傷害応答（ＤＤＲ）経路のＵ２ＡＦ仲介性の制御がＡＴＭ－ＣＨＥＫ２－ＣＤＣ２５－ｃｄｃ２／サイクリンＢ軸に集中していることを次に示して、それが２本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）に対する細胞性応答とともに共進化してきたことを示唆した。最後に、がん関連の遺伝子融合と染色体転座における、Ｕ２ＡＦ制御転写産物の選好的な関与を実証する。

【0188】

結果
ＡＴＭにおけるＵ２ＡＦ抑制クリプティックエクソンの同定
[0222] 最近になって、各Ｕ２ＡＦサブユニットの欠失が主として選択的にスプライスされる多数のエクソンの下方及び上方制御をもたらすことが示されてきた。Ｕ２ＡＦ３５が欠失した細胞において全体のＲＮＡプロセシング変化を精査したところ、ＲｅｆＳｅｑによって注目されないクリプティックな２９ヌクレオチドのＡＴＭエクソン（ＮＳＥと呼称する、図１Ａ）の予期せぬ強い活性化が見出された。このＮＳＥ活性化は、各Ｕ２ＡＦ３５アイソフォームを、アイソフォーム特異的な低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）で、そして選択的にスプライスされるＵ２ＡＦ１エクソンＡｂ及び３（それぞれ、アイソフォームのＵ２ＡＦ３５ｂとＵ２ＡＦ３５ａをコードする）の３’ｓｓを標的とするＳＳＯで個別に欠失させた細胞でも観測された（図１Ａ）。ＲＴ－ＰＣＲを使用するＲＮＡ－Ｓｅｑデータの検証は、リンパ芽球様細胞株において観測されるレベルに類似して、未処理ＨＥＫ２９３細胞内のポリアデニル化転写産物の約１０～２０％にＮＳＥが存在していることを示した。このＮＳＥの包含レベルは、約９０％のＵ２ＡＦ３５が欠失した培養物では約７５％まで増加して、約７５％のＵ２ＡＦ６５が欠失した細胞では約５０％まで増加し（図１Ｂ）、ｓｉＲＮＡ用量依存性であって、利用可能なＵ２ＡＦヘテロ２量体の量と逆相関し（図１Ｃ）、ＮＳＥ抑制への各Ｕ２ＡＦサブユニットの必要性と一致した。ＲＮＡ－Ｓｅｑデータの精査は、ＮＳＥの周囲にあるイントロン配列の保持を明らかにし（図１Ａ）、イントロン２８が「拘束」されて、転写後にスプライスされる可能性があることを示唆した。イントロン２８の保持レベルは、Ｕ２ＡＦ３５のＳＳＯ仲介の欠失にもｓｉＲＮＡ仲介性の欠失にも影響されず（図１Ａ）、この遺伝子内の他のクリプティックエクソンでＮＳＥと同じ程度まで活性化されるものはなかった。従って、ＮＳＥは、ＡＴＭ発現のＵ２ＡＦによるエクソン中心性の制御において重要な役割を担うものである。

【0189】

ＮＳＥ活性化とＡＴＭ発現は、ｒｓ６０９２６１によって改変される。
[0223] ＮＳＥの周囲にあるゲノム配列の検証は、ＮＳＥ３’ｓｓに対して－３の位置が多型性である（ｒｓ６０９２６１，図２Ａ）ことを明らかにし、ここではアフリカ人種とアジア人種でチミン（Ｔ）が優勢であるのに対し、白色人種ではシトシン（Ｃ）が優勢である（図２Ａ）。この位置での塩基同一性は、普遍的なエクソン認識に重要であって、エクソン包含レベルのＣＡＧ＞ＴＡＧ＞ＡＡＧ＞ＧＡＧ階層が正統の３’ｓｓとＵ２ＡＦ３５依存性の３’ｓｓの両方にある。ＮＳＥ利用が対立遺伝子特異的であることを確認するために、この位置にＣ又はＴを含有する２つのレポーター構築体のスプライシングを、ヒト胚性腎（ＨＥＫ）２９３細胞への一過性トランスフェクションに続いて検証した（図２Ｂ）。未処理細胞と各Ｕ２ＡＦサブユニットを個別に欠失させた細胞の両方で、Ｔ構築体は、Ｃレポーターより低いＮＳＥの包含を生じた（図２Ｃ）。

【0190】

[0224] Ｕ２ＡＦ３５を欠く細胞において、対立遺伝子特異的なＮＳＥ利用が差示的なタンパク質発現を生じるかどうかを検証するために、初めに利用可能な細胞株よりｒｓ６０９２６１を挟んだＤＮＡの配列を決定して、それぞれの対立遺伝子について同型接合であるトランスフェクト可能な細胞を入手した。ＨＥＫ２９３細胞は、Ｃ対立遺伝子について同型接合であることがわかって、ＨｅＬａ細胞は、Ｔ対立遺伝子について同型接合であった（図２Ｄ）。Ｕ２ＡＦ３５欠失細胞と未処理対照からの免疫ブロットより、各細胞株における効率的な欠失と、Ｔ対立遺伝子よりもＣ対立遺伝子の存在下でのＡＴＭ発現のより大きなＵ２ＡＦ仲介性の低下が確認された（図２Ｅ，Ｆ）。ＮＭＤ経路の主要因子であるＵＰＦ１の欠失は、ＡＴＭ成熟ＲＮＡにおけるＮＳＥの包含の用量依存性の増加を明らかにした（図２Ｇ）。欠失細胞からの免疫ブロットには、推定される短鎖型シグナルを検出しなかった。

【0191】

[0225] Ｕ２ＡＦ抑制エクソンとＵ２ＡＦ活性化エクソンがＵ２ＡＦ関連タンパク質に
対する選好的な応答を示すので、ＰＵＦ６０とＣＡＰＥＲａ、並びにｈｎＲＮＰ Ａ１を含めていくつかの異種核内ＲＮＰをＨＥＫ２９３細胞より欠失させた。ＰＵＦ６０は、ウリジンリッチモチーフと３’ｓｓで相互作用して、ｈｎＲＮＰ Ａ１は、ＡＧ含有ＵリッチＲＮＡ上でＵ２ＡＦヘテロ２量体とともに３元複合体を形成する。ＰＵＦ６０又はｈｎＲＮＰ Ａ１のいずれかの欠失がＮＳＥの包含を増加させた（図２Ｈ）一方で、ＰＵＦ６０の過剰発現は、ＮＳＥスキッピングをもたらした（図２Ｉ）。従って、ＡＴＭイントロン２８深部のｒｓ６０９２６１及び集団依存性のＮＳＥ活性化は、Ｕ２ＡＦ、ＰＵＦ６０、及びｈｎ ＲＮＰＡ１によって制御されて、一般的なイントロン多型の機能性が３’ｓｓ認識を容易にするＲＮＡ結合タンパク質の細胞レベルに伴っていかに変動するかを実証する。

【0192】

ＳＳＯによるＮＳＥ阻害は、ＡＴＭ発現を促進する
[0226] Ｕ２ＡＦを欠く細胞におけるＮＳＥ活性化を抑制してＡＴＭ発現を回復させることが可能であるかを検証するために、Ｃ対立遺伝子レポーター構築体を、それぞれのＮＳＥスプライス部位を標的とするＳＳＯとともに同時トランスフェクトした（図１Ａ）。ＳＳＯをそれぞれのホスホロチオエート連結と２’－Ｏ－メチルリボースで修飾して、ＮＳＥのＰＰＴ、安定したＭフォールド予測ステム、及びｒｓ６０９２６１を回避するように設計した。外因性転写産物（図３Ａ）と内因性転写産物（図３Ｂ）の両方において、各ＳＳＯは、ＮＳＥの包含を用量依存的なやり方で減少させて、ＮＳＥ ３’ｓｓを標的とするＳＳＯは、その５’ｓｓを架橋するＳＳＯよりも同じ濃度でより効率的であった。

【0193】

[0227] 次に、イオン化放射線（ＩＲ）へ曝露した細胞において、ＮＳＥ ３’ｓｓ ＳＳＯがＡＴＭタンパク質の発現及び活性化を増加させることが可能であるかどうかを検証した。非曝露細胞とＩＲ曝露細胞の両方で、Ｕ２ＡＦ３５を欠く細胞における低いＡＴＭ発現がこのＳＳＯによって一部レスキューされて（レーン１対２とレーン５対６、図３Ｃ、レーン５～８対レーン９～１２、図８Ａ）、その増加は、用量依存性であった（図４Ｄ）。ＩＲに続いて、Ｓ１９８１で自己リン酸化した活性化ＡＴＭは、未処理細胞と比較して、欠失細胞において低下したシグナルを示した（レーン６対８、図３Ｃと、レーン１～４対レーン５～８、図８Ａ）。ＮＳＥ ３’ｓｓ ＳＳＯへの曝露は、活性化ＡＴＭもやや増加させた（レーン５～８対レーン９～１２、図８Ａ、レーン５対６、図３Ｃ）。ＡＴＭシグナル伝達に対するＳＳＯ仲介ＮＳＥ抑制の推定効果を探究し始めると、Ｕ２ＡＦを（モック）欠失した（モック）照射細胞では、野生型ＣＨＥＫ２も過剰発現されていた（図８Ａ）。ＣＨＥＫ２は、ＤＮＡ２本鎖切断（ＤＳＢ）に応答してＴ６８でＡＴＭによってリン酸化されるセリン／スレオニンキナーゼである。しかしながら、Ｕ２ＡＦを欠く細胞は、対照に比較して、著しく低いレベルの内因性ＣＨＥＫ２を有して、これは、ＮＳＥ ３’ｓｓ ＳＳＯによって変化されるように見えなかった（レーン１～４対レーン５～８対レーン９～１２）。一方、外因性ＣＨＥＫ２は、ＩＲ曝露細胞と非曝露細胞の両方で欠失細胞において増加していた（レーン１～４対レーン５～８、図５と、さらに下の図８Ｂ，Ｃも参照のこと）。

【0194】

[0228] まとめると、ＮＳＥ活性化は、ＮＳＥスプライス部位へのアクセスを遮断するがＲＮアーゼＨ切断は支持しないＳＳＯによって効率的に阻害された。より効率的なＳＳＯは、ＡＴＭのＮＳＥ仲介性の阻害を一部レスキューした。

【0195】

ＮＭＤスイッチエクソンの活性化は、下流シュードエクソンによって影響を受ける。
[0229] 成熟転写産物におけるＮＳＥの包含を制御するイントロン性の制御シスエレメントを同定するために、以前に報告したＡ－Ｔ突然変異ＩＶＳ２８－１５９Ａ＞Ｇを利用した。この突然変異は、ＮＳＥ ３’ｓｓを活性化する一方で、その５’ｓｓを抑制して代わりに下流の５’ｓｓを促進して、このｍＲＮＡに１１２ヌクレオチドのクリプティックエクソンを導入することが観測された。このエクソンの内部に観測される最適のＢＰＳ
／ＰＰＴモチーフに先行される強い３’ｓｓコンセンサスがあって、これは、Ｕ２ＡＦへ結合して、より小さな２４ヌクレオチドのシュードエクソン（ＰＥと呼称される；図４Ａ）を活性化する場合がある。ＡＴＭにおける公知のＲＮＡ架橋連結／免疫沈降データの検証は、Ｕ２ＡＦ６５がＮＳＥの上流及び下流とＰＥの上流で結合することを示して、ＮＳＥ活性化がＰＥ ３’ｓｓとＮＳＥ ３’ｓｓで組み立てられる、一部生産的なスプライソソーム間での競合によって制御され得ることを示唆した。この２つの３’ｓｓは、哺乳動物において保存されているが、ヒトイントロンの最小サイズより小さな距離で分離していて、ＮＳＥとＰＥの同時認識を立体的に妨げる（図４Ａ）。この仮説に一致して、Ｃミニ遺伝子において導入されるＰＥ ＰＰＴ／３’ｓｓの欠失は、Ｕ２ＡＦのＰＥへの結合の減少を介してＮＳＥ抑制を緩和するはずなので、ＮＳＥの包含を増加させた（図４Ｂ）。この欠失は、ＮＳＥとＰＥを分離するイントロンの保持ももたらして、Ａ－Ｔ突然変異ＩＶＳ２８－１５９Ａ＞Ｇのスプライシングパターンを模倣した。そのイントロンの長さを５９ヌクレオチドから７９ヌクレオチドへ増加させて、それによってこの２つのシュード３’ｓｓ間の不十分な距離によって課せられる立体障害を克服することも、ＮＳＥの包含を改善して、イントロン保持を減少させた（図４Ｂ）。

【0196】

[0230] ＮＳＥ不活性化がｍＲＮＡにおけるＰＥの包含に影響を及ぼし得るかを検証するために、初めにＮＳＥ ３’ｓｓを消失させた。この突然変異は、正統のＮＳＥ ３’ｓｓの７ヌクレオチド下流にあるクリプティック３’ｓｓを活性化した（レーン１、２とレーン６、７、図４Ｃ，図２１）。このクリプティック３’ｓｓは、Ｕ２ＡＦへの減少した要求性を示した。この背景でＮＳＥとＰＥの間のイントロン長さを広げてもＰＥを活性化することができず（図４Ｃ，レーン３とレーン８）、ＰＥはエクソン性スプライシングエンハンサーを欠いて、最適以下のＢＰＳを有する（図２２）ので、哺乳動物ワイド散在反復（ＭＩＲ）に由来する２４ヌクレオチドのステムループをＰＥの中央に挿入した。このＭＩＲヘアピンは、末端ＲＮＡトリループにおいて曝露されるスプライシングエンハンサーを介して、ほぼ普遍的なエクソン定義モジュールとして作用する。この拡大されたＰＥは、モック欠失細胞において強く活性化されたが、Ｕ２ＡＦ３５を欠く細胞ではＮＳＥによって打ち負かされて（レーン４とレーン９）、ＮＳＥの包含がＰＥよりＵ２ＡＦ３５に依存していることを示した。ＰＥ内のＭＩＲ挿入と拡大イントロンをともに含有する構築体は、最終的に、ＮＳＥとＰＥをともに含有するｍＲＮＡを産生した（レーン５とレーン１０）。

【0197】

競合するシュードエクソンを標的とするイントロン性ＳＳＯによる遺伝子発現の調節
[0231] 次に、ＭＩＲレポーターを利用して、ＮＳＥ ＳＳＯとＰＥ ＳＳＯのエクソン利用とＡＴＭ発現に対する影響を検証した。図４Ｄは、ＮＳＥ ３’ｓｓ ＳＳＯが、ＮＳＥを含有する転写産物を抑制して、ＰＥのあるそれを上方制御したのに対して、ＰＥ内のＭＩＲエンハンサーループを標的とするＳＳＯでは、反対の効果が見出されたことを示す。ＮＳＥとＰＥがｍＲＮＡにおけるそれらの同時包含には不十分な距離で分離したレポーターでは、同じパターンが観測された（図４Ｅ）。これらの結果は、ＰＥ及び／又はＰＥの上流にあるＵ２ＡＦ６５結合部位を標的とするＳＳＯには、潜在的にＮＳＥの包含を促進してＡＴＭ発現を低下させる可能性がある一方で、ＮＳＥ ＳＳＯは反対の効果を有するはずであることを示唆した。このアプローチは、その一方が遺伝子制御にとって決定的である、競合するシュードエクソンのアンチセンスベースの標的化によって、遺伝子発現をいずかの方向で調節する広汎な戦略を提供するだろう。この概念を検証するために、ＰＥ ３’ｓｓとＰＥ ５’ｓｓを標的とするＳＳＯについて試験した。それぞれのＰＥ ＳＳＯは、外因性転写産物と内因性転写産物の両方でＮＳＥスキッピングを誘導した（図４Ｆ）が、ＰＥのわずか上流にあるＵ２ＡＦ６５結合部位（即ち、ＮＳＥ抑制配列（構築体：ｄｅｌＰＰＴ／ＡＧ，図４Ｂ））を標的とするＳＳＯ（図４Ａ）がＰＥの包含を低下させて、ＭＩＲレポーターにおいてＮＳＥをわずかに増加させた（図４Ｇ）。対照的に、５’方向に延長されたより長いオリゴ（ＳＳＯ－ＰＥＢＰ，図２０）は、何の効果も示さなかった。

【0198】

[0232] ＰＥは、天然のＤＮＡ変異体ｒｓ４９８８０００（Ｇ／Ａ）を含有し、これもＮＳＥ認識に影響を及ぼす場合がある（図４Ｈ）。ｒｓ４９８８０００で系統的に変異させたＣ及びＴミニ遺伝子のトランスフェクションは、Ｕ２ＡＦ３５欠失細胞とモック欠失細胞の両方で、稀なＡ対立遺伝子がそれぞれのプレｍＲＮＡでのＮＳＥの包含を減少させることを明らかにした。従って、白色人種において最も頻度が高いハプロタイプ（ＣＧ）によって、最も高いＮＳＥの包含が生じて、ハプロタイプ：ＣＡ＞ＴＧ＞ＴＡがそれに続いた。

【0199】

[0233] まとめると、Ｕ２ＡＦ抑制ＮＳＥのハプロタイプ依存性の活性化は、競合するシュード３’ｓｓの上流にあるＵ２ＡＦ６５イントロン性結合部位を標的とするＳＳＯによって改変することが可能であって、ＮＭＤスイッチエクソンとイントロン内のそれらの調節モチーフへのアンチセンスベースの標的化によってエクソン中心性の遺伝子発現を操作するための一般的な方法を提供する可能性がある。

【0200】

ＡＴＭシグナル伝達のＵ２ＡＦによる制御：焦点でのＤＳＢ
[0234] ＡＴＭがＤＤＲ経路における主要な上位（apical）キナーゼであって、ＮＭＤスイッチエクソンがタンパク質相互作用パートナーをコードする遺伝子をしばしば制御するので、現在知られているＡＴＭ基質とＡＴＭシグナル伝達ネットワークの他の構成要素のＵ２ＡＦ３５誘導性のＲＮＡプロセシング変化を系統的に特徴付けた。興味深いことに、ＤＤＲと細胞周期制御に関与してＵ２ＡＦ３５依存性のエクソンを含有する遺伝子がほとんど増えなかった（ＦＤＲ＝０．０８）ものの、ＡＴＭ－ＣＨＥＫ２－ＣＤＣ２５－ＣＤＣ２／サイクリンＢ軸の各成分は、ＲＮＡプロセシング改変を示した（図５Ａ，図９）。この経路は、ＤＳＢのＡＴＭシグナル伝達にとって決定的である。

【0201】

[0235] 初めに、Ｕ２ＡＦを欠く細胞におけるＡＴＭ発現の低下（図８）は、ＣＨＥＫ２ ｍＲＮＡの減少、ＣＨＥＫ２イントロン１０の保持の増加、及びエクソン９とエクソン１１のスキッピングに関連していた（図５Ａ）。既知のＣＨＥＫ２基質のＲＮＡプロセシング改変は、細胞周期を制御する遺伝子（ＣＤＣ２５Ａ、ＣＤＣ２５Ｂ、ＣＤＣ２５Ｃ、及びＴＴＫ；図５Ａ，Ｓ３Ａ－Ｂ，１１Ａ）に限られて、ＤＮＡ修復に関与する遺伝子（ＢＲＣＡ１／２，ＸＲＣＣ１，ＦＯＸＭ１，ＴＲＩＭ２８）又はｐ５３シグナル伝達に関与する遺伝子（ＴＰ５３，ＭＤＭ４，ＣＡＢＩＮ１，ＳＴＲＡＰ，ＡＡＴＦ）では、明らかでなかった。ＣＨＥＫ２エクソン９スキッピングは、ＮＭＤを活性化すると予測されたが、ＩＲ後２４時間でもほとんど増加せず、ＩＲ後早くも３０分に観測される全ＣＨＥＫ２の低落に寄与しなかった（図５Ｂと図５Ｃ）。ＣＨＥＫ２エクソン９の包含が増加したのは、最高濃度のＵＰＦ１ ｓｉＲＮＡの場合だけであった（図５Ｄ）ので、その３’ｓｓを標的とするＳＳＯでＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクトした。この処理は、エクソン９スキッピングを誘導して、ＣＨＥＫ２タンパク質の発現を低下させたが、それはＮＳＥ活性化も増加させた（図５Ｅ）。対照的に、ＮＳＥ又はＰＥを標的とするＳＳＯは、ＣＨＥＫ２エクソン９の包含にいかなる影響も及ぼさなかった（図５Ｆ）。ＳＦ３Ｂ１を欠く細胞では、ＮＳＥではなく、エクソン９スキッピングも劇的に増加した（図５Ｇ）。Ｕ２ＡＦ３５を欠く細胞において対照と比較してＣＨＥＫ２の外因性発現が増加した（図８Ａ）理由に対処するために、ＣＨＥＫ２抑制性ＳＳＯとＣＨＥＫ２発現性プラスミドでＨＥＫ２９３細胞を同時トランスフェクトした（図８Ｂと図８Ｃ）。Ｕ２ＡＦ機能性（proficient）細胞でも、内因性ＣＨＥＫ２の低下が外因性ＣＨＥＫ２の有意な増加に関連していて、細胞内のＣＨＥＫ２タンパク質全体の厳格な恒常性の制御を示した。

【0202】

[0236] 次に、ＣＨＥＫ２とＣＨＥＫ１によってリン酸化されて１４－３－３の結合を促進する残基（Ｓ１７８）をコードする、ＣＤＣ２５Ａエクソン６の完全活性化にＵ２Ａ
Ｆが必要とされた（図５Ａ）。Ｕ２ＡＦ３５は、ＣＤＣ２５ＢとＣＤＣ２５Ｃのエクソン３の包含にも必要とされて（図１０Ａと図１０Ｂ）、これまでのマイクロアレイデータを裏付けた。ＣＤＣ２５Ｂエクソン３は、Ｂドメイン残基Ｓ１６９（ＭＡＰＫＡＰキナーゼ２とｐＥｇ３によってリン酸化される）を含めて、多数のリン酸化残基をコードする。このアイソフォームは、中心体に局在化して、有糸分裂の間に蓄積する。ＣＤＣ２５Ｃエクソン３は、自己増殖ループの一部としてｃｄｃ２／サイクリンＢによってリン酸化されるＴ６７をコードする。ＣＤＣ２５Ｃにおいてリン酸化されるＴ６７は、ＰＩＮ１のＷＷドメインによって認識される結合部位を創出して、それがＵ２ＡＦ抑制ＮＭＤスイッチエクソンの活性化を持続して（図１１Ｂ）、おそらくはこの豊富なぺプチジル－プロリルイソメラーゼの触媒活性を改変する。最後に、Ｕ２ＡＦ３５を欠く細胞では、サイクリンＢ１－相互作用タンパク質（ＣＣＮＢ１ＩＰ１，ＨＥＩ１０としても知られる）と同様に、サイクリンＢ１及びＢ２のｍＲＮＡが上方制御されたが、それらのＲＮＡプロセシングパターンは、改変されたように見えなかった（図５Ａ）。サイクリンＢの上方制御は、（転写後にスプライスされ得る）拘束されたＣＤＫ１イントロンに関連していた（図１１Ｃ）。

【0203】

[0237] ＤＳＢへのＡＴＭ動員は、ＭＲＥ１１、ＲＡＤ５０、及びＮＢＮから成るＭＲＮ複合体によって促進される。Ｕ２ＡＦ３５を欠く細胞において、ＮＢＮは、明瞭なＲＮＡプロセシング変化を示さなかったが、おそらくはＮＭＤスイッチエクソンの活性化及び／又は追加のスプライシング改変を介して、ＲＡＤ５０ ｍＲＮＡが下方制御された（図１２Ａ～Ｃと図９）。最後のＭＲＥ１１Ａエクソンは、Ｂ細胞を除いてほとんどの細胞型に存在する、欠失細胞内の遠位選択的ポリアデニル化部位の促進の結果として、上方制御された。ＤＥＸＳｅｑ分析では、セリン／スレオニンタンパク質キナーゼ（ＡＴＲとＰＲＫＤＣ）のホスファチジルイノシトール３－キナーゼ様ファミリーの他のメンバーをコードする転写産物においても、ＢＲＣＡ１／２、ＲＮＦ１６８、及びＡＴＭインタラクタ（ＡＴＭＩＮ）をコードする転写産物においても、有意なＲＮＡプロセシング変化を検出しなかった。エクソン又は遺伝子発現が改変した追加のＡＴＭ相互作用パートナーには、ＲＰＳ６、ＳＲＳＦ１、及び他のＳＲタンパク質、ＥＰ３００、ＲＰＡ２、ＢＬＭ、ＦＡＮＣＤ２及びＦＡＮＣＩ、ＰＰＰ２Ｒ５Ｃ及びＰＰＰ２Ｒ５Ｄ、及びＳＭＣ３、コヒーシン複合体の中心成分が含まれた（図９）。

【0204】

[0238] Ｕ２ＡＦ３５の欠失は、ＡＴＭシグナル伝達への数多くの機能的連関を有する、クロマチン修飾に関与する遺伝子／エクソンの選好的な改変に関連した（図９）。例えば、ＩＮＯ８０クロマチン再構成複合体は、ＡＴＭによってリン酸化されて、ＣＨＥＫ２が含まれるチェックポイントレギュレーターへ機能的に関連する。Ｕ２ＡＦは、酵母Ｉｅｓ６相同体に存在しないペプチドをコードする５４ヌクレオチドのエクソンを含有するＩＮＯ８０Ｃアイソフォームを阻害したが、このことは生体内でのＩＮＯ８０機能にとって決定的で、ＡＣＴＲ５とのヘテロ２量体形成やヌクレオソーム結合を変化させる可能性がある。欠失細胞では、ＡＣＴＲ５、ＡＣＴＬ６Ａ、及びＲＵＶＬ２Ｂが含まれる、ＩＮＯ８０複合体の多数の成分の発現が変化していた。多くのＩＮＯ８０サブユニットは、選好的にテロメアに局在化して、それらの突然変異は、テロメア延長をもたらす。Ｕ２ＡＦは、ｍＲＮＡにおけるＴＥＲＦ１エクソン７の完全な包含に必要とされ（図１３Ａ）、シェルテリン複合体の重要成分である、ＴＲＦ１（エクソン７＋）／ＰＩＮ２（エクソン７－）アイソフォームの量を制御する。エクソン７は、多数のリン酸化セリン残基をコードして、いずれのアイソフォームも、この２量体化ドメインを介してヘテロ２量体化することができる。テロメアへのＴＲＦ１結合がＡＴＭ阻害によって促進される一方で、ＡＴＭ仲介性のリン酸化は、テロメアＤＮＡとのＴＲＦ１相互作用を妨害する。テロメアとのＴＲＦ１会合は、ＲＡＤ５０によっても負に制御される。ＴＲＦ１相互作用性のＴＩＦ２は、核内マトリックスに局在化してＴＩＮＦ２によってコードされる、別のシェルテリンタンパク質である。ＴＩＦ２は、ＴＩＮ２Ｓ及びＴＩＮ２Ｌと呼ばれる、選択的スプライシングによって産生される少なくとも２つのアイソフォームで存在する。ＴＩＮ２Ｌは、余分のＮＭ結合ドメインを含有して、ＴＩＦ２Ｓ（これは、長い３’非翻訳領域を形成する３’イントロンが保持された転写産物によってコードされる）より強く核内マトリックスと会合する。このｍＲＮＡアイソフォームは、Ｕ２ＡＦによって抑制された（図１３Ｂ）。

【0205】

[0239] まとめると、上記の結果は、Ｕ２ＡＦ制御がクロマチン修飾やテロメア長さ制御に関与する追加のＡＴＭ基質まで拡張されるものの、ＤＤＲのＵ２ＡＦ３５仲介性の制御の中心には、ＭＲＮ／ＡＴＭ－ＣＨＥＫ２－ＣＤＣ２５－ｃｄｃ２／サイクリンＢ軸があることを示す。

【0206】

Ｕ２ＡＦは、白血病関連融合に関与する転写産物のＲＮＡプロセシングを選好的に制御する。
[0240] ＣＨＥＫ２は、ＰＭＬ（前骨髄球性白血病）をリン酸化して、後続の自己リン酸化のためにＰＭＬを必要とするらしい。Ｕ２ＡＦ３５の欠失は、ＰＭＬの近位の選択的ポリアデニル化部位の使用を促進して、核内輸送シグナルをコードする最終エクソンを欠く、最も短いＰＭＬアイソフォームの上方制御をもたらした（図１４Ａ）。この長いＰＭＬアイソフォームと短いＰＭＬアイソフォームは、異なる機能を有し；例えば、核内ＰＭＬアイソフォームは、細胞質のアイソフォームと異なって、ＩＦＮγシグナル伝達の正のレギュレーターである。最長のＰＭＬアイソフォームのＣ末端は、ＡＭＬ１と特異的に相互作用して、ＡＭＬ１仲介性の転写を高め、Ｕ２ＡＦの不足がＰＭＬ－ＡＭＬ１相互作用を妨げる可能性があることを示唆する。ＰＭＬはまたＰＩＮ１と結合して、この相互作用は、ＰＭＬ分解をリン酸化依存的なやり方で促進する。Ｕ２ＡＦ欠失は、ＰＩＮ１ ＮＭＤエクソンを増加させ（図１１Ｂ）、このきわめて豊富なぺプチジル－プロリルイソメラーゼ（これは、リン酸化ＣＤＣ２５が含まれる、多くのリンタンパク質と相互作用して、有糸分裂を制御する）の発現を潜在的に制限する。

【0207】

[0241] ＰＭＬとは別に、Ｕ２ＡＦ３５の欠失は、ＮＰＭ１が含まれる他のＲＡＲＡパートナーを上方制御した（図１４Ｂ）。この事象は、近位ポリアデニル化部位の昇格に関連して、それによって、より短い、おそらくはより安定な転写産物の量を増加させた。選択的にスプライスされるＢＣＯＲのエクソンであるＢＣＬ６コリプレッサー（ＢＣＯＲ－ＲＡＲＡ融合を形成していくつかのヒストンデアセチラーゼと相互作用して、ＢＣＬ６の転写抑制を増加させる）も、下方制御されていた（図１４Ｃ）。

【0208】

[0242] 興味深いことに、Ｕ２ＡＦ３５感受性遺伝子／エクソンとがん関連遺伝子融合に関与する１，１８７個の遺伝子並びに再発性の染色体転座に関与する３００個の遺伝子の間の重複は、予測より大きくて、差示的に使用されるエクソンがある遺伝子では、転写産物レベルで Cufflinks によって示唆される遺伝子より有意なＰ値が観測された（表１
）。同様に、骨髄異形成症候群において頻繁に変異する遺伝子とＵ２ＡＦ３５欠失時に差示的に発現される遺伝子の共用は、予測より有意に高かった（Ｐ＜０．０１，超幾何分布検定）。従って、がん関連遺伝子融合や染色体転座に関与する転写産物のＲＮＡプロセシングは、Ｕ２ＡＦによって選好的に制御される。

【0209】

[0243] がん関連Ｕ２ＡＦ１突然変異のＮＳＥスプライシングにおける機能を検証す
るために、Ｕ２ＡＦ３５を（モック）欠失させた細胞へＣミニ遺伝子とともに同時トランスフェクトされる、野生型と変異型のＵ２ＡＦ３５構築体を用いた再構成実験を実施した（図６）。ＮＳＥ活性化は、いずれのＵ２ＡＦ３５アイソフォームによっても、並びにジンクフィンガー１ドメイン内のＳ３４（がんにおいて最も頻繁に変異するＵ２ＡＦ３５残基）の置換を含有するＵ２ＡＦ３５ａによっても、ある程度まで抑制された。対照的に、これらの突然変異がさほど頻繁でない第２のジンクフィンガードメイン内のＱ１５７の置換では、部分的なレスキューしか達成されなかった。Ｓ３４Ｔと小さなアミノ酸での置換を含めて、他のＳ３４突然変異ではこの欠損を完全に再構成することができなかったが、
この位置での大きな残基（Ｓ３４Ｒ）は、効率的であった。従って、ＮＳＥ認識には、Ｕ２ＡＦ３５の３４位にある残基の独自性（identity）が重要である。

【0210】

[0244] 最後に、多様なヒト組織では、ヘキサマーでプライミングされた試料とポリアデニル化転写産物の両方で、低い度合いのＮＳＥ活性化を検出した（図１５Ａ）。ＮＳＥ含有ＲＮＡの比率は、平均して、正常細胞より白血病細胞において高くて、正常組織では観測されないきわめて高いレベルを明示する試料もあって（図１５Ｂと図１５Ｃ）、これは、これまでに白血病と固形腫瘍のいずれでも観測されたＡＴＭ発現の低下に寄与する可能性がある。溶解に先立って指定温度での低温ショックと熱ショックへ曝露したリンパ芽球様細胞株のパネルより抽出したポリアデニル化ＲＮＡにおいても、ＮＳＥの包含を試験した（図１５Ｄと図１５Ｅ）。興味深いことに、ＮＳＥは、細胞を４２℃へ（しかし準生理学的な温度ではなくて）曝露することによって、わずかな程度活性化されるように見えた（図１５）ので、悪性細胞において著しく高いＮＳＥの包含レベルが患者の試料の保存の間に遭遇する冷温ショックによって説明される可能性は低いことを示唆した。４３℃での熱ストレスへ曝露したＪｕｒｋａｔ細胞のプロテオミクスプロファイリングでは、Ｕ２ＡＦ３５ａが含まれるいくつかのタンパク質の発現減少が明らかにされたので、これらの結果は、特定のＮＳＥリプレッサーとしてのＵ２ＡＦ３５をさらに裏付ける。

【0211】

考察
[0245] 本明細書に記載される研究は、ＲＮＡプロセシングとＤＤＲ経路の間で現在知られている関連を有意に拡張する（図５と図９）。ＡＴＭ発現に決定的な選択的スプライシングに共役したＮＭＤスイッチエクソンを同定して（図１と図３）、がんリスクにおけるその重要性を検討した（図２、図６、及び図１５）。このエクソンの成熟転写産物における包含にイントロン性ハプロタイプがいかに影響を及ぼすかということと、３’ｓｓ選択に関与するＲＮＡ結合タンパク質の細胞レベルに対するそれらの機能依存性についても示した（図２と図４Ｈ）。最後に、その制御配列を標的とすることによってこのエクソンの活性化を調節するＳＳＯを同定して、遺伝子発現を改変するための新規なアンチセンス戦略を提唱した。

【0212】

[0246] Ｕ２ＡＦは、重要な３’ｓｓ認識複合体であって、選択的スプライシングの決定的なレギュレーターである。タンパク質－タンパク質相互作用を拡大することに加えて、選択的スプライシングは、定量的な遺伝子発現をＮＭＤにより微調整するように進化してきた（この因子を欠く細胞では多くのＮＭＤエクソンの改変があることに一致している）（図１、図５、及び図１３）。選択的にスプライスされるエクソンによってコードされるペプチドが無秩序領域や翻訳後修飾（ＰＴＭ）部位に濃縮されて、２以上のアイソフォーム間の動的で可逆的なスイッチングに必要とされる。逆に、ＰＴＭは、ＮＳＥ制御に関与するタンパク質を含めて、数多くのスプライシング因子を制御する。この複雑性は、明瞭な課題が前途にあることを表して、ＣＨＥＫ２エクソン９を標的とするときに観測されるＮＳＥ活性化によって例示することができる（図５Ｅ）。ＣＨＥＫ２発現の低下は、ＣＤＫ１１（これは、ＣＨＥＫ２依存的なやり方でＳ７３７で恒常的にリン酸化されて、Ｕ２ＡＦ６５とＰＵＦ６０と相互作用し、ＮＳＥレベルを制御する調節ループを創出する）のような他のキナーゼとの相互作用を改変する可能性がある（図２Ｈ，Ｉ）。

【0213】

[0247] これらの結果は、Ｕ２ＡＦがＤＤＲ制御の統合的な部分であって、そのＰＴＭネットワークの微調整に貢献して、ＰＴＭそれ自体に従属することを示唆する。Ｕ２ＡＦ３５は、ＤＮＡ傷害時にＳ５９での増加したリン酸化を示すタンパク質の中で見出された。このセリン残基は、Ｕ２ＡＦ３５ａにのみ存在して、Ｕ２ＡＦ３５ｂではアラニンに置き換わっている。Ｕ２ＡＦ３５ｂの外因性発現がＵ２ＡＦ３５ａより高くて、Ｕ２ＡＦ３５ｂの相対量がＵ２ＡＦ６５の欠失時に増加したことは、この２つのＵ２ＡＦ３５アイソフォームがＵ２ＡＦ６５と差示的に相互作用する可能性があって、ＤＤＲにおいて同等の役割を有さない可能性があることを示唆した。しかしながら、Ｕ２ＡＦ３５制御エクソンとＵ２ＡＦ６５制御エクソンは多大に重複しているので、Ｕ２ＡＦ３５欠失細胞において見出される、全てではないとしてもほとんどのＲＮＡプロセシング変化は、ＮＳＥ活性化を含めて、Ｕ２ＡＦヘテロ２量体の不足に帰せられるものである（図１Ｃ）。

【0214】

[0248] Ｕ２ＡＦ抑制エクソンは、Ｕ２ＡＦ活性化エクソンと比較して、独自の３’ｓｓ組織化とＵ２ＡＦ関連タンパク質への応答を有し、このエクソン抑制が直接的なＲＮＡ結合に関与することを示唆する。このことは、ＮＭＤを受けない外因性転写産物に対してＮＳＥ活性化が観測されることと、ＳＳＯ誘導性のＮＳＥ遮断によって裏付けられる（図２と図４）。ＮＳＥは、予測されるＢＰＳと３’ｓｓの間にＡＧジヌクレオチドを欠いて、そのＡＧ排除ゾーンは、平均より長くて、５つの保存グアニンの珍しいストレッチをＢＰＳの上流に有し、これが抑制のために必要とされ得る、３’ｓｓ域の安定した２次構造に貢献するのかもしれない。ＮＳＥとＰＥの両方のアデニンリッチな３’部分は、その５’部分よりも進化において多く保存されていて（図４Ａ）、構造化されたＲＮＡ内の非対合位置を占有するアデニンの傾向を考慮すると、重要なリガンド相互作用を提供する可能性がある。興味深いことに、霊長類のＮＳＥは、－３位にウリジンを有して、その位置にシトシンを有する下等哺乳類より長いＰＰＴを有する。Ｕ２ＡＦによるエクソン抑制への最も単純な説明となるのは、直接的なＲＮＡ結合であるように見あるが、Ｕ２ＡＦ３５欠失は、ＮＭＤに関与するいくつかのタンパク質の下方制御をもたらし（表Ｓ４）、このことが内因性転写産物に対するＮＳＥ活性化に貢献するのかもしれない。加えて、ＮＳＥ制御には、Ｕ２ＡＦ６５とＴＲＦ１のＣ末端又はＡＴＭシグナル伝達ネットワークの他の成分の間の物理的な相互作用も参画するのかもしれない。

【0215】

[0249] Ｕ２ＡＦ１／Ｕ２ＡＦ２とは別に、３’ｓｓ選択に関与する追加の遺伝子もがんでは変異していることがわかった。興味深いことに、ＳＦ３Ｂ１突然変異のある慢性リンパ球性白血病は、ＡＴＭ末端切断をもたらす、ＡＴＭエクソン４６のクリプティック３’ｓｓ活性化に関連していた。最近、がん関連ＳＲＳＦ２突然変異の結果としてのＥＺＨ２エクソンのスプライシングが造血分化障害に関与している可能性があるとされ、同じＮＭＤエクソンは、Ｕ２ＡＦ３５欠失時にも上方制御された（図１２Ｄ）。これらのエクソンが白血病発生の根底にある共通の３’ｓｓ認識経路の標的であるかどうかは、依然として確定していない。対照的に、ＳＦ３Ｂ１の欠失した細胞では、ＣＨＥＫ２エクソン９のほとんど完全なスキッピングがもたらされ、ＮＳＥの包含が変化するように見えなかった（図５Ｇ）。

【0216】

[0250] ＮＳＥ活性化が正常細胞とがん細胞のいずれにおいてもＡＴＭ発現を束縛する可能性があって（図１、図２、及び図１５）、ＡＴＭがＤＤＲ経路における制限因子であるので、ｒｓ６０９２６１でのシトシンは、（前）悪性細胞においてだけでなく生殖細胞株においても相対的なＡＴＭ不足を付与する可能性がある。ＡＴＭキナーゼ活性は、Ａ－Ｔ重症度の良好な予測因子であるように見えるが、Ａ－Ｔ対立遺伝子の多様性は、臨床症状のスペクトルを完全には説明しない。Ａ－Ｔ患者の臨床的多様性には、ＮＳＥ活性化に関与する遺伝子（図１，図２）、特に「漏出（leaky）」突然変異のある遺伝子が貢献す
る可能性がある。ＮＳＥの包含を改変する天然の変異体（図２Ｃ～図Ｆと図４Ｈ）も、ＡＴＭシグナル伝達ネットワーク内のＵ２ＡＦ制御エクソン利用の核心（central focus）
と一致して、明白な臨床的特徴を欠くが、放射線感受性やがんリスクの増加を示す場合があるＡ－ＴさらにはＡ－Ｔ異型接合体の表現型の複雑性に貢献する場合がある（図９）。

【0217】

[0251] これらの結果は、ＮＳＥ活性化が、白色人種において、アジア人の集団よりも、ｒｓ６０９２６１でのＣ対立遺伝子が前者においてより高頻度であることの結果として、平均してより効率的であることを予測させる（図２Ａ）。アジア系アメリカ人は、長期間にわたって存続する一般的な悪性腫瘍での死亡率が白色人種より低い。造血系腫瘍のリ
スクも人種群で大きく変動して、その発生率は、Ａ－Ｔと関連する非ホジキンリンパ腫とホジキンリンパ腫を含めて、白人集団において最も高い。この傾向は、移民でも存続して、後続の世代でも続く。リンパ芽球様白血病、リンパ腫、及び他の癌種は、アジア人集団と白色人種集団の間で異なる発生率を示すが、Ａ－Ｔにおいてより優勢であるように見えない骨髄性白血病では、リンパ系腫瘍や他のがんとは異なって、年齢標準化発生率に有意な人種差を見出さなかった。アジア人のがん患者は、細胞傷害性療法に対して、白色人種患者よりも好ましく応答して、平均して、より長いメジアン生存率を有する。アジア人のがん患者はまた、いくつかの遺伝子融合の発生率が白色人種より低いと報告されて、ＤＳＢへ応答する彼らの能力を反映する可能性がある。ｒｓ６０９２６１は、神経膠種との関連についてのコクラン＝アーミテージ（Cochrane-Armitage）検定において、ＡＴＭ変異体の最低のｐ値を示した。最小組換え領域内のｒｓ６０９２６１のわずかに約３５ｋｂ上流に位置する、ｒｓ２２３５００６（ＡＴＭ対立遺伝子、Ｆ５８２Ｌ）は、慢性リンパ球性白血病の高いリスク（ＯＲ１１．２）と関連していた。この研究では、８６５の候補遺伝子内の１４６７のコーディング非同義ＳＮＰについて遺伝子型決定をして、ＡＴＭ－ＢＲＣＡ２－ＣＨＥＫ２ ＤＤＲ軸をコードする遺伝子における変異体が、最も重大なリスク経路と関連があると示唆された。９０歳代／１００歳以上と対照若年者との対立遺伝子関連研究でも、ＡＴＭと寿命の間の関連性が示唆された。最後に、血液系腫瘍において頻繁に改変される遺伝子における突然変異率についても人種差に注目した；例えば、慢性リンパ球性白血病におけるＳＦ３Ｂ１突然変異は、中国人の集団において、ヨーロッパ人の集団より頻繁でなかった。

【0218】

[0252] 上記の考察は、まとめると、がんのリスク及び生存率におけるｒｓ６０９２６１依存性ＮＳＥ活性化の重要性を支持するが、ＮＳＥの包含のＵ２ＡＦ依存性やｈｎＲＮＰ Ａ１依存性（図２Ｈ，Ｓ８Ｂ）は、それが決して固定されてないことを明証する。これらのタンパク質の悪性腫瘍ごとに変化する発現パターンは、この変異体の「気まぐれな機能性（capricious functionality）」を含意するものであろう。この属性を有するより多くの多型部位が今後確定される見込みがあって、「有毒（poison）」クリプティックエクソンの制限的な能力による遺伝子発現の個体間変動性に対してだけでなく、潜在的には、複雑形質の「消えた遺伝力」や、特にがん分野でのゲノムワイド関連研究の失敗例に貢献するだろう。

【0219】

[0253] ＲＮＡ－Ｓｅｑは、ＤＮＡ傷害に応答するトランスクリプトーム全体について検証する有力なツールであるが、ＲＮＡプロセシングにおいて観測される改変の生物学的及び統計学的意義を正確に評価する厳密な標準手法は、まだ実施されていない。ＤＥＸＳｅｑアルゴリズムの高ストリンジェンシーを仮定すれば、Ｕ２ＡＦへ応答する追加の生物学的に重要なＲＮＡプロセシング事象の存在は、排除することができない。例えば、ＣＬＡＳＰ１内の２４ヌクレオチドエクソンと２７ヌクレオチドエクソンの上方制御と共役していた、ＣＨＥＫ１における近位ポリアデニル化部位の上方制御は、ＡＴＭアポトーシス経路との関係を示唆するだろう。これらの事象は、ＤＥＸＳｅｑによって検出されなかったが、ゲノムブラウザでは見えて、確認が必要とされた。アポトーシス経路が特に興味深いのは、プログラムされた細胞死に対する骨髄系前駆細胞の感受性が示されて、初期の臨床段階ではなくて、より進行した段階においてＡＴＭシグナル伝達に関与する遺伝子の脱制御が見出された、骨髄異形成症候群においてである。興味深いことに、Ｕ２ＡＦ１突然変異は、進行期でもより頻繁であることが見出され、短い生存と関連付けられた。この研究はまた、現行の不完全な転写産物注釈の限界とクリプティックエクソンをＲＮＡ－Ｓｅｑデータにおいて検証することの重要性も強調している。故に、将来のＲＮＡ－Ｓｅｑ研究では、終止コドン含有転写産物の不安定性によって妨げられてきた、選択的スプライシングに関連するＮＭＤ事象の全体的な検出を試みるべきである。

【0220】

[0254] 最後に、本研究は、ＡＴＭタンパク質レベルも増加させたＳＳＯによる、ＡＴ
Ｍ内の主要なＮＭＤスイッチエクソンの効率的な抑制を実証する（図３Ａ～Ｄ，図８）。それはまた、遺伝子発現のＳＳＯ仲介調節の標的として利用し得る（図４Ｄ～Ｇ）、同じイントロンにおいて競合するＮＳＥの調節モチーフを明らかにする（図４Ａ～Ｃ，図Ｈ）。このアプローチをＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９のようなゲノム編集と組み合わせて、ミニ遺伝子研究（図４Ｃ）において示唆されたスプライシング調節モチーフ又はタンパク質結合部位を欠失又は導入することが可能であって、ＲＮＡプロセシングについて所望される結果をもたらす効率的なイントロン性ＳＳＯを我々が見出すのに役立つはずである。そのようなＳＳＯの探索は、ヒトエクソンを標的とするＳＳＯへの探索より挑戦的である。例えば、ＳＭＮ２エクソン７を系統的にカバーするほとんどのＳＳＯは、エクソンスキッピング（脊髄性筋萎縮症の治療に利用される事象）を刺激したが、その約２０％は、エクソンの包含を誘導したのである。類推によって、イントロンスプライシングの所望される刺激が見出されたのは、ＩＮＳ イントロン１を標的とするＳＳＯの１０％でしかなくて、大多数は、この効果を示すのに失敗した。提起される戦略は、ヒトの補助スプライシング配列についての下等動物に比較してずっと高次の情報内容を利用して、将来の全世界的なプレｍＲＮＡフォールディング研究によって大いに促進されるはずである。例えば、ＮＳＥ ３’ｓｓを効率的に遮断したＳＳＯ（ＳＳＯ－ＮＳＥ３，図３Ａ，Ｂ）とは違って、ＮＳＥ内へ７ヌクレオチドだけ伸びている一部重複性のモルホリノは、Ｕ２ＡＦ結合部位を標的としたにもかかわらず、同じ３’ｓｓを抑制して突然変異：ＩＶＳ２８－１５９Ａ＞Ｇのスプライシングをレスキューすることに失敗した（図４Ａ）。このことは、このモルホリノオリゴが、上記の知見に一致して、エクソン活性化の責任はないがエクソン抑制には責任がある構造又はモチーフへのアクセスを遮断した可能性があることを示唆する（図１Ａ～Ｃ）。イントロン内のスプライシング因子の結合部位を標的とするか又はそれを回避するアンチセンスベースのＲＮＡプロセシングアクチベーター又は阻害剤の投与は、がん細胞におけるＮＭＤの有益又は有害な帰結を形成するために療法的に利用することができよう。このアプローチは、ＮＭＤが広範囲の転写産物に及ぶ制御機能として主に役立って、短鎖型ポリペプチドを産生するＮＭＤ基質の翻訳も促進する可能性がある（このことは、抗腫瘍免疫を刺激する場合がある）という広汎な認識によって支持されている。

【0221】

材料及び方法
プラスミド構築体
[0255] 約０．９ｋｂのアンプリコンをＵ２ＡＦ１構築体のＸｈｏＩ／ＸｂａＩ部位へクローニングすることによって、ＡＴＭミニ遺伝子を製造した。クローニングプライマーを表Ｓ１に示す。企図した変化の同一性を確認して、望まれない突然変異を排除するために、全挿入物について配列決定した。ＰＵＦ６０発現ベクターも使用した。ｈｎＲＮＰ Ａ１構築体は、Gideon Dreyfuss（ペンシルヴェニア大学）の寛大な贈り物であった。

【0222】

細胞培養とトランスフェクション
[0256] １０％（ｖ／ｖウシ胎仔血清（Life Technologies）を補充したＤＭＥＭにお
いて、標準条件で細胞培養を維持した。低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）とスプライススイッチングオリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）でのＵ２ＡＦサブユニットとＵ２ＡＦ３５アイソフォームの欠失は、各アイソフォームの欠失レベルを確定する、経時変化実験に従って行った。オリゴ（リボ）ヌクレオチドとｓｉＲＮＡを表Ｓ１に収載する。トランスフェクションは、jetPRIME（Polyplus）を製造業者の推奨法に従って使用して、６ウェルプレート又は１２ウェルプレートにおいて行った。細胞は、ＩＲへ曝露して単一ヒットを受けたもの以外は、セカンドヒットから４８時間後に採取した。ＳＦ３Ｂ１欠失のためには、ＨＥＫ２９３細胞をｓｉＲＮＡ混合物（Ｓ２３８５０、Ｓ２３８５２、及びＳ２２３５９８（Life Technologies））へ曝露して、４８時間後に採取した。

【0223】

ＲＮＡ‐Ｓｅｑ
[0257] ＤＥＸＳｅｑ（ｖ．１．１２．１）を使用して、０．０５未満のｑ値に基づい
て、差示的なエクソン利用の解析を実施した。試料セット間の差示的な遺伝子とアイソフォーム発現について、Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ（ｖ．２．１．１）（百万の読取り測定値につきキロベースのエクソンモデルあたりの断片を使用して読取り値を正規化する）で解析した。ＦＤＲ補正Ｐ値（ｑ＜０．０５）に基づいて、有意に差示的に発現される遺伝子の選択を行った。

【0224】

ヒトの組織及び細胞株におけるＮＳＥ発現
[0258] １９の異なる組織由来の全ＲＮＡ試料を含有する FirstChoice ヒト全ＲＮＡ
サーベイパネルは、Life Technologies より購入した。それぞれの組織試料は、異なるドナーに由来するＲＮＡのプールを含有した。リンパ芽球様細胞株を低温ショックと熱ショックへ曝露した。全ＲＮＡ試料をモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（プロメガ）とランダムヘキサマー又はオリゴ－ｄ（Ｔ）プライマーで逆転写した。図２０に示すプライマーを使用して、ｃＤＮＡ試料を増幅した。急性骨髄性白血病又は慢性骨髄単球性白血病の無作為選択患者の骨髄試料由来の白血球より抽出した全ＲＮＡをランダムヘキサマープライマーで逆転写した。本研究は、国立研究倫理委員会（英国、サウスウェスト）［National Research Ethics Service (UK) Committee South West］によって承認された。

【0225】

スプライススイッチングオリゴヌクレオチド
[0259] １本鎖領域との相互作用を最大化して、Ｍフォールドによって予測される２次構造を回避するようにＳＳＯを設計した。すべてのＳＳＯを Eurofins より購入し、水に希釈して、それらのアリコートを－８０℃で保存した。いずれのトランスフェクションも、jetPRIME（Polyplus）を製造業者の推奨法に従って使用して行った。

【0226】

細胞培養物のイオン化放射線への曝露
[0260] Gulmay Medical（X-Strahl）Ｄ３２２５常用電圧Ｘ線システムを室温で０．６３Ｇｙ／分の線量率で使用して、第１ヒット後４８時間、（モック）欠失ＨＥＫ２９３細胞をＩＲへ曝露した。実線量率は、不変メーターによってモニターした。図面の註に示したように、細胞を採取した。

【0227】

免疫ブロッティング
[0261] ＡＴＭに対する抗体（Ｄ２Ｅ２）、ＡＴＭ－ｐＳ１９８１に対する抗体（Ｄ６Ｈ９）、ＣＨＥＫ２に対する抗体（Ｄ９Ｃ６）、及びＣＨＥＫ２ｐＴｈｒ６８に対する抗体（Ｃ１３Ｃ１）を Cell Signaling Technology 社より購入した。ＲＢＭ３９抗体を Thermo Fisher Scientific（ＰＡ５－３１１０３）より購入した。Ｘ－プレスタグ、Ｕ２ＡＦ３５、Ｕ２ＡＦ６５、及びチューブリンを検出する抗体を使用した。ＳＦ３Ｂ１免疫ブロッティングは、マウスモノクローナル抗ＳＡＰ１５５抗体（Ｄ１３８－３，ＭＢＬ）で実施した。細胞溶解液の調製と免疫ブロッティングを行った。

【0228】

【表1】

【0229】

実施例２ ＡＴＭ遺伝子において制御されるナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構のスイッチエクソンを標的とするアンチセンスマクロウォーク
概要
[0262] ＡＴＭは、ＤＮＡ傷害応答（ＤＤＲ）経路の決定的なキナーゼをコードする、重要ながん感受性遺伝子である。ＡＴＭの不足は、リンパ系腫瘍への高い感受性を明示する稀な遺伝的症候群である、毛細血管拡張性運動失調症（Ａ－Ｔ）をもたらす。ＡＴＭ発現は、スプライソソームによってしっかり制御される、イントロン２８内に位置するナンセンス変異依存ＲＮＡ分解機構（ＮＭＤ）のスイッチエクソン（ＮＳＥと呼称される）によって制限される。成熟転写産物におけるＮＳＥの包含をスプライススイッチングオリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）によって調節することが可能であるが、そのイントロンにおけるそれらの最適な標的は不明であって、リンパ系細胞へのそれらの送達についても検証されていない。今回、ＮＳＥのアクチベーター及び阻害剤を同定するためにイントロン２８を標的とする効率的なＳＳＯへの体系的な探索を利用した。イントロン性転移因子の断片欠失解析によってこれらのアンチセンス化合物の発見を支援して、離れたアンチセンスＡｌｕの除去時のＮＳＥ抑制と、長鎖末端リピートトランスポゾン、ＭＥＲ５１Ａの消失時のＮＳＥ活性化を明らかにした。キトサンベースのナノ粒子での胚性細胞とリンパ芽球様細胞へのＳＳＯ送達時の効率的なＮＳＥ抑制も実証して、がんやＡ－ＴにおけるＡＴＭ発現のＮＳＥ仲介性の調節への可能性を開いた。まとめると、これらの結果は、ＮＭＤスイッチエクソンを制御することにおける転移因子の重要な役割と遺伝子発現を改変するイントロン性ＳＳＯの能力を強調する。

【0230】

序論
[0263] 真核生物の遺伝子は、正確なタンパク質合成を確実にするために、スプライソソームと呼ばれる、大きくて高度に動的なＲＮＡタンパク質複合体によって除去される必要がある介在配列又はイントロンを含有する。該細胞は、ヒトゲノムの少なくとも４分の１に由来する、前駆体メッセンジャーＲＮＡ（プレｍＲＮＡ）を含有するイントロンの転写を完了するのに過度のエネルギー及び時間を必要として、この課題を達成するには、ノンコーディングＲＮＡと２００より多い様々なスプライソソームタンパク質を合成する必要もある。かつては、「利己的（selfish）」又は「ジャンク（junk）」ＤＮＡとみなさ
れたが、イントロンは、今日では、遺伝子発現を高め、選択的ＲＮＡプロセシング、ｍＲＮＡ輸送、及びＲＮＡ監視を制御する、真核生物遺伝子の決定的な機能的成分と認められ
ている。それらは、新たな遺伝子コーディング配列や制御配列とノンコーディングＲＮＡ（マイクロＲＮＡと環状ＲＮＡが含まれる）の重要な供給源でもある。それらの除去プロセスは、転写、ｍＲＮＡ輸送、及び翻訳と緊密に共役して、ほとんどのヒトイントロンは、プレｍＲＮＡより同時転写的に消失されるが、核酸療法への標的としてのそれらの潜在可能性については、解明の端緒に付いたばかりである。

【0231】

[0264] スプライソソームは、各イントロン上に、秩序だったやり方で、特定の目的のために（ad hoc）組み立てられ、Ｕ１核内低分子ＲＮＰによる５’スプライス部位（５’ｓｓ）の認識又はＵ２経路による３’ｓｓの認識から始まる。正確なスプライシングには、従来のスプライス部位認識配列（５’ｓｓ、分岐点、ポリピリミジントラクト、及び３’ｓｓ）に加えて、イントロン性又はエクソン性のスプライシングエンハンサー又はサイレンサーとして知られる、スプライス部位を活性化するか又は抑制する補助的な配列又は構造が必要とされる。これらのエレメントは、真核生物ゲノムにある大過剰のクリプティック又はシュード部位（類似の配列を有するが、正統の部位より１桁分の数で優る）の中で真のスプライス部位が認識されることを可能にする。クリプティックスプライス部位の活性化は、未熟な終止コドン（ＰＴＣ）を翻訳読取りフレームに導入する可能性があって、それが遺伝性疾患をもたらす場合がある。そのような転写産物は、通常はＮＭＤ経路によって認識されて、下方制御されている。しかしながら、クリプティックエクソンとＮＭＤは、天然に存在する転写産物の発現を制御する上で、そして造血作用の最終段階によって例示されるような、分化段階特異的なスプライシングスイッチにも重要な役割を担っている。加えて、クリプティックスプライス部位は、天然のスプライス部位と競合し得る、非生産的又は部分的なスプライソソームアセンブリーを許容する場合があって、単一ヌクレオチド解像度でのそれらの正確な選択を促進する。従って、遺伝子発現を制限してｍＲＮＡアイソフォームのプールを制御する、そのような「シュードエクソン」（「有毒」エクソン又は「ＮＭＤスイッチ」エクソンとしても知られる）を活性化するクリプティックスプライス部位は、核酸治療剤の興味深い標的を提供する可能性があるが、そのようなアプローチの利用は、その揺籃期にある。

【0232】

[0265] スプライススイッチングオリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）は、スプライス部位認識又は制御配列へ結合してそれらの標的についてシス及びトランス作用因子と競合することによってイントロンスプライシングを調節するアンチセンス試薬である。それらは、異常なＲＮＡプロセシングを回復させ、既存のｍＲＮＡアイソフォームの相対量を改変するか又は通常は該細胞によって発現されない新規のスプライス変異体を産生することが示されてきた。前臨床開発と臨床開発において利用されたほとんどのＳＳＯは、エクソン配列を標的としてきた。機能的なイントロン性ＳＳＯは、疾患起因性の突然変異によって活性化されるイントロン性クリプティックスプライス部位へのアクセスをＳＳＯが遮断しなければ、同定することがより困難である。第１に、大部分のイントロン配列は、ヒトゲノム内にイントロン性の補助スプライシングモチーフが多量にあるにもかかわらず、ＲＮＡプロセシングに影響を及ぼさないかもしれない。加えて、それらの同定は、長いイントロンでは、コストがかかって非効率的である。エクソンスキッピングを導入するように設計されたほとんどのエクソン性ＳＳＯは、通常は、所望される効果を有する。例えば、ＳＭＮ２エクソン７を系統的に網羅するほとんどのＳＳＯは、脊髄性筋萎縮症へのアンチセンス療法の前提条件であるエクソンスキッピングを刺激したが、エクソンの包含を増加させたのは、約２０％であった。対照的に、イントロンスプライシングの刺激が見出されたのは、ＩＮＳイントロン１を標的とするＳＳＯの約１０％にすぎず、その一方で、大多数はこの効果を示すことができなかった。有効なＳＳＯの同定は、スプライソソーム又はエクソン接合複合体の成分についての結合部位を同定する、プレｍＲＮＡフォールディング及び紫外線架橋連結及び免疫沈降の全体研究によって促進される可能性がある。しかしながら、これらの結合部位は、最適のアンチセンス標的を反映しないかもしれないし、それらの解像度は十分でないかもしれない。このように、ＲＮＡプロセシングに対して所望される効果があるイントロン性ＳＳＯの探索は、依然として難題なのである。

【0233】

[0266] 最近、ＲＮＡ－Ｓｅｑ研究は、Ｕ２核内低分子ＲＮＰ（Ｕ２ＡＦ）の補助因子の各サブユニットを欠失した細胞内のＡＴＭイントロン２８深部にあるＮＭＤスイッチエクソン（ＮＳＥと呼ばれる）の活性化を明らかにした。Ｕ２ＡＦは、イントロン末端にある高度に保存された３’ｓｓ ＡＧジヌクレオチドと共役してポリピリミジントラクトへ結合して、この結合が分岐部位へのＵ２動員とラリアット（lariat）イントロンの形成を促進する。しかしながら、各Ｕ２ＡＦサブユニット（Ｕ２ＡＦ３５とＵ２ＡＦ６５）を欠失した細胞において活性化されて特徴的な３’ｓｓ組織化を明示した多数のエクソンの最近の同定では、ますます増えつつあるＲＮＡ結合タンパク質で見出される、エクソン抑制性や活性化の活性に類似して、カノニカルスイッチエクソンとＮＭＤスイッチエクソンの両方のサブセットがＵ２ＡＦによって抑制されることが示唆された。このＮＳＥレベルは、３’ｓｓ認識に関与する追加のスプライシング因子のノックダウンに即応して、ＮＳＥそれ自体とその３’ｓｓにそれぞれ位置する、２つの天然ＤＮＡ変異体（ｒｓ４９８８０００とｒｓ６０９２６１）によって影響を受けた。ＮＳＥと同じイントロン内のその競合性シュードエクソンを標的とすることによってＡＴＭ ｍＲＮＡにおけるＮＳＥの包含レベルを調節するＳＳＯも同定されてきた。このＡＴＭ ＮＳＥは、いくつかの理由で、抗がん療法への興味深くて有望な標的を提供する：（ｉ）ＡＴＭキナーゼは、２本鎖切断に応答して活性化され、広範囲の標的がある広汎なシグナル伝達ネットワークを可動化して、ＤＮＡ傷害剤に対する細胞感受性に影響を及ぼす；（ｉｉ）ＡＴＭシグナル伝達経路におけるＵ２ＡＦ制御されたエクソン利用は、ＭＲＮ／ＡＴＭ－ＣＨＥＫ２－ＣＤＣ２５軸に集中して、選好的に関与する転写産物では、がん関連遺伝子融合と染色体転座との関連が示唆された；そして（ｉｉｉ）ＡＴＭ ＮＳＥ活性化は、各Ｕ２ＡＦサブユニットを欠いている細胞においてＡＴＭ発現を制限する。しかしながら、最適のＮＳＥ ＳＳＯについては知られておらず、リンパ系細胞へのそれらの送達については、検証されていない。

【0234】

[0267] 今回の研究では、イントロン２８全体を網羅するＳＳＯについて系統的にスクリーニングして、ＮＳＥを活性化するか又は抑制して推定のＮＳＥベースのＡＴＭ阻害剤及びアクチベーターとして治療戦略に利用し得る、追加のＳＳＯを同定した。ＮＳＥの包含に影響を及ぼす同じイントロン内の遠れた転移因子も同定した。最後に、キトサンベースのナノ粒子を使用する胚性及びリンパ芽球様細胞株へのＳＳＯ送達時の効率的なＮＳＥ抑制についても示した。

【0235】

材料及び方法
プラスミド構築体
[0268] ＡＴＭイントロン２８全体と隣接するエクソンを含有するレポーター構築体を、増殖プライマーのＡＴＭ２６及びＡＴＭ２７（表２）を使用して、ｐＣＲ３．１（インビトロジェン）のＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ部位においてクローニングした。欠失構築体（図１６）は、突然変異誘発プライマーでの重複伸長ＰＣＲによって入手した（表２）。ＮＳＥとエクソン２９を含有する約０．９ｋｂのアンプリコンをＵ２ＡＦ１構築体のＸｈｏＩ／ＸｂａＩ部位へクローニングすることによって、ハイブリッドＡＴＭミニ遺伝子を作製した。プラスミドを大腸菌（ＤＨ５α）内で増殖させて、Gene JET Plasmid Miniprep キット（Thermo Scientific）でプラスミドＤＮＡを抽出した。挿入物全体について配列決定して、企図された変化の独自性を確認して、望まれない突然変異を排除した。

【0236】

スプライススイッチングオリゴヌクレオチド（ＳＳＯ）
[0269] 内因性プレｍＲＮＡと外因性プレｍＲＮＡの両方でＳＳＯを検証するために、イントロン２８において転移因子を回避するようにＳＳＯを設計した。RepeatMasker を
使用して、この構築体の配列内にトランスポゾンを確認した。このＳＳＯのＧＣ含量は、少なくとも２４％（平均３１％）であって、それらの平均長は、約２０ヌクレオチドであ
った。ＳＳＯは、ＡＴＭイントロン２８内の３つのユニーク領域（Ａ、Ｂ、及びＡＮと呼ばれる、図１７）を包括的に網羅して、ホモポリマートラクトだけを回避した。体外（ex
vivo）スクリーニングに十分な安定性を確保するために、ＳＳＯ（Eurofins）を各リボ
ースで２’－Ｏ－メチルによって、そして各末端連結部ではホスホロチオエートによって修飾した。ＳＳＯを２重蒸留水で希釈して、Nanodrop（ThermoScientific）を使用して定量した。それらの正規化アリコートを－８０℃で保存した。

【0237】

ＰＵ値の決定
[0270] ＰＵ（無対応確率）値は、短い配列のすべての可能なＲＮＡ構造を考慮し、各ヌクレオチド位置でのそれらの比較を可能にすることによって平衡分配関数を使用して、ＲＮＡ１本鎖性を評価する。ＰＵ値が高いほど、ＲＮＡモチーフの１本鎖性が高いことを示す。ＰＵ値は、先の３つのイントロン領域とそれらの３０ヌクレオチドの隣接配列をインプットとして使用して、記載のように計算した。ＳＳＯ標的の各位置でのＰＵ値を平均して、ＳＳＯ誘導性のＮＳＥ包含レベルと相関付けた。

【0238】

ステアリル化トリメチルキトサンの製造
[0271] 元は Agaricus bisporus より入手した超純粋キトサンに由来するトリメチル
キトサンキトサンは、KitoZyme（ベルギー）より提供された。

【0239】

[0272] 精製産物は、０．３３Ｍ ＮａＣＨ_３ＣＯＯＨ／０．２８Ｍ ＣＨ_３ＣＯＯＨ溶出液における１ｍＬ／分の流速でのゲル浸透クロマトグラフィーによって定量されるように、４３．３±５．５ｋＤの数平均分子量（Ｍｎ）と２．４±０．３の多分散指数（Ｍｗ／Ｍｎ）を有した。アセチル化の度合いと４級化の度合いは、フーリエ変換赤外分光法と１Ｈ－核磁気共鳴分光法（^１Ｈ ＮＭＲ）によってそれぞれ決定して、１１．１±０．９％と３０．１±４．６％であった。トリメチルキトサンをＮ－スクシンイミジルステアレート（Santa Cruz BioTechnologies）で官能化して、１Ｈ ＮＭＲによって決定したように、２．１±０．６％（モル％）の最終置換度を達成した。

【0240】

ナノ複合体の形成
[0273] 等量（３０μＬ）のＳＳＯとポリマー溶液を混合することによって、ナノ複合体を製造した。簡潔に言えば、ＳＳＯを緩衝液Ａ（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．３，５％（ｗ／ｖ）グルコース）に希釈して１Ｍ Ｎａ_２ＳＯ_４を補充して、５０ｍＭの最終濃度とした。ポリマー溶液とＳＳＯ溶液をともに６０℃で５分間加熱した後で、ボルテックスを用いて１，０００ｒｐｍで１５秒間混合した。この被検複合体は、先に最適化したように、４級化アミン（Ｎ）のリン酸基（Ｐ）に対するモル比が２０、４０、及び８０であるように製造されて、２０～８０のＮ／Ｐ比に対して１１０～１３０ｎｍの流体力学的径を有した。この複合体を室温で３０分間安定化させた後で、血清も抗生物質もない２４０μＬの培養基（ＤＭＥＭ）へ加えた。キトサン含有培養物中のＳＳＯの最終濃度は、３００ｎＭであった。トランスフェクションから２４時間後、３００μＬの血清／抗生物質入り培養基を加えた。この細胞を２４時間後に採取した。

【0241】

[0274] 細胞培養とトランスフェクション。ＨＥＫ２９３細胞とリンパ芽球様ＶＡＶＹ細胞を１０％（ｖ／ｖ）胎仔ウシ血清を補充したＤＭＥＭにおいて標準培養条件で維持した。トランスフェクションに先立つ２４時間前に細胞を７０％集密度で播種した。jetPRIME（Polyplus）を製造業者の推奨法に従って使用して、１２又は２４ウェルプレートにおいて、野生型構築体と欠失構築体のトランスフェクションを行った。全ＲＮＡ抽出のためにこの細胞を２４時間後に採取した。各ＳＳＯを全長ＡＴＭ構築体（５０ｎＭ）の有り無しでトランスフェクトして、ＲＮＡ抽出のために４８時間後に細胞を採取した。

【0242】

[0275] スプライス（された）産物の分析。ＴＲＩ試薬（Ambion）を使用してＲＮＡ試
料を単離した。キトサン実験からの全ＲＮＡ試料をＲＮｅａｓｙキット（キアゲン）で抽出した。ＲＮＡを定量して、１μｇの全ＲＮＡをモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（プロメガ）とランダムヘキサマー又はオリゴ－ｄ（Ｔ）プライマーで逆転写した。外因性ｃＤＮＡ試料は、プライマーのＰＬ４とＡＴＭ－Ｆを使用して増幅して、内因性産物は、プライマーのＡＴＭ－ＦとＡＴＭ－Ｒを使用して増幅した（表２）。スプライス産物をアガロースゲルとポリアクリルアミドゲルで分離して、それらのシグナル強度を測定した。統計解析は、Ｓｔａｔ２００（BioSoft，イギリス）で行った。

【0243】

【表2】

【0244】

結果
[0276] ＮＳＥの３’ｓｓ又は５’ｓｓのいずれかを標的とするＳＳＯは、このエクソンをハプロタイプ依存的なやり方で効率的に抑制する。ＮＳＥを活性化する最適なイントロン性ＳＳＯの同定を容易にするために、ＡＴＭイントロン２８全体を含むスプライシングレポーター構築体（図１６Ａ）を初めに作製した。この構築体は、ＨＥＫ２９３ ＤＮＡを鋳型として使用するＰＣＲによって入手した。イントロン２８の参照配列（ｈｇ１９）は、約３，１００ヌクレオチドの長さで、平均的なヒトイントロンに類似している。イントロン２８の約６４％を転移因子が占有し、このイントロンの５’半分の約３５０ヌクレオチド領域とエクソン性隣接配列を除いて、その中央部分を完全に充たしている（図１６Ａ）。プラスミドＤＮＡの配列決定は、追加のトランスポゾンコピーのない、転移因子の同じ組織を明らかにした。それはまた、ｒｓ４９８８０００とｒｓ６０９２６１でのＣ対立遺伝子とＧ対立遺伝子をそれぞれ示し、この構築体がＡＴＭ ｍＲＮＡにおけるＮＳＥの包含に最も許容的なハプロタイプを含有することを示した。ＨＥＫ２９３細胞へのトランスフェクションの後で全ＲＮＡを抽出して、ベクタープライマーＰＬ４（表２）とエクソンプライマーでの増幅に先立って逆転写した（図１６Ａ）。スプライス産物の検証は、ほとんどの転写産物がイントロン配列を完全に欠いた（ＮＳＥ－）のに対し、約３６％のｍＲＮＡがＮＳＥを含有する（図１６Ｂ，レーン１）ことを示し、この割合は、先に報告されたハイブリッドレポーターの場合よりやや高かった。

【0245】

[0277] 転移因子のＮＳＥの包含への重要性を決定するために、重複伸長ＰＣＲを使用して、イントロン２８由来の各トランスポゾンを個別に欠失させた（欠失１～欠失５、図１６Ａ）。このイントロンの大きな中央部分もすべてのトランスポゾンと共に欠失させて、ＮＳＥとその上流配列をインタクトなままにした（このイントロンの約７５％、欠失６）。実証済みの変異構築体（いずれも、ｒｓ４９８８０００とｒｓ６０９２６１で野生型構築体と同一の遺伝子型を有する）のトランスフェクションは、その大きな欠失がＮＳＥ含有転写産物を増進することを明らかにした（欠失６、図１６Ｂ）。ＭＥＲ５１エレメントの欠失は、ＮＳＥの包含をより小さな程度で増加させた。対照的に、アンチセンスＡｌｕの欠失がＮＳＥを阻害する一方で、長い散在反復の欠失（欠失３と欠失５）又はユニークなイントロン性断片の欠失（欠失２）は、ＮＳＥ活性化に何の影響も及ぼさなかった。ＮＳＥ包含レベルの変動性は、Ｕ２ＡＦ３５の２ヒットノックダウンの後でずっとより高くて、欠失６でのみＮＳＥレベルの有意な増加が維持され（図１６Ｂ）、ＮＳＥ応答の主要なストレス成分に一致していた。次いで、そのゲノム内にユニーク配列を有する３つのイントロン領域（Ａ、Ｂ、及びＡＮと呼ばれる）を標的とする一方でＮＳＥの上流にある予測分岐部位を回避するＳＳＯの系列を設計した（図１７Ａ，表２）。各ＳＳＯをそれぞれのリボースにて２’－Ｏ－メチルで、そしてそれぞれの末端連結部にてホスホロチオエートで修飾して、一過性トランスフェクションにおけるそれらのＲＮアーゼＨ抵抗性と十分な安定性を確保した。陽性対照と陰性対照として、ＮＳＥ ３’ｓｓを遮断するのにきわめて効率的であるＳＳＯ－ＮＳＥ３と、スクランブルＳＳＯの系列と、ＲＮＡ－Ｓｅｑによって確認されるようにＨＥＫ２９３細胞において発現されない他の遺伝子（ＩＮＳとＢＴＫが含まれる）を標的とするＳＳＯの系列を使用した。それぞれのＳＳＯを野生型ＡＴＭ構築体の有り無しで個別にトランスフェクトした。

【0246】

[0278] スプライス産物の測定は、ＳＳＯ－ＮＳＥ３により最も効率的なＮＳＥ抑制が生じることを明らかにした（図１７Ｂ）。試験したＳＳＯの約半数が対照と比較してＮＳＥの包含レベルを改変し、リプレッサーＳＳＯとアクチベーターＳＳＯがほぼ同数であった。反復トランスフェクション間のピアソン相関係数は、きわめて有意で０．８８（Ｐ＜１０～８）に達した；しかしながら、外因性ＮＳＥレベルと内因性ＮＳＥレベルの間の全体相関性は、０．３５（Ｐ＜０．０１）にすぎなかった。

【0247】

[0279] 図１６の実験は、ＮＳＥの包含がトランスポゾンの内側と外側にある遠位スプライシング制御配列によって制御されることを示した。その天然のプレｍＲＮＡコンテクストにおいて実験的に決定されたスプライシングエンハンサー及びサイレンサーのモチーフは、１本鎖領域において選好的に生じ、それらがＲＮＡ結合タンパク質やエクソン選択を制御する他のリガンドへよりアクセスし易いことを示唆した。従って、ＳＳＯの不対合領域への選好的な標的化をすれば、イントロン性ＳＳＯの探索が改善される可能性がある。この仮説を検証するために、各ＳＳＯによって誘導されるＮＳＥ包含のレベルをそれらの平均ＰＵ値と相関させた（図１７Ｃ）。これらの数値は、平衡分配関数を使用して、それらのＲＮＡ標的の１本鎖性を評価するものであって、数値が高いほど、１本鎖コンホメーションの確率が高いことを知らせる。興味深いことに、平均ＰＵ値がより高いＳＳＯ標的は、エクソンスキッピングを誘導する傾向があって、該エクソンより２ｋｂほど離れた所での不対合相互作用の効率的な遮断がその活性化を妨げる可能性があることを示唆した。

【0248】

[0280] 上記に記載した実験では、成熟した外因性転写産物及び内因性転写産物においてＮＳＥの包含を活性化するイントロン性ＳＳＯの小セットを同定した。ＮＳＥがＡＴＭ発現をＮＭＤにより制限し得るので、アクチベーターＳＳＯとリプレッサーＳＳＯは、調整可能な遺伝子特異的阻害剤として役立つ可能性がある。ＮＳＥ活性化ＳＳＯによる一過性のＡＴＭ抑制は、２本鎖切断シグナル伝達経路や放射線増感作用を阻害することによるがん治療に有利であり得る。

【0249】

[0281] ＨＥＫ２９３細胞よりずっと低いトランスフェクション効率を有する細胞へＡＴＭ ＳＳＯを送達することができるかどうかを検証するために、ステアリル化トリメチル化キトサン（ＴＭＣ－ＳＡ）を利用した。キトサンは、生体適合性、生分解性、及び低い毒性及び免疫原性で知られている、Ｄ－グルコサミンとＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミンの天然の共重合体である。トリメチル化されると、キトサンは、中性ｐＨでのその溶解性を改善する永続的な陽電荷を獲得する。ステアリル化は、ＳＳＯとの安定したナノ複合体の形成と、ＨｅＬａ／ｐＬｕｃ７０５系（変異ＨＢＢ１イントロンによって中断されたルシフェラーゼ遺伝子を利用する）におけるそのトランスフェクション活性に必要であることがわかった。

【0250】

[0282] ＴＭＣ－ＳＡがＳＳＯ－ＮＳＥ３のＨＥＫ２９３細胞内への送達を促進することができるかどうかを最初に検討した。図１８Ａは、ＳＳＯ－ＮＳＥ３－ＴＭＣナノ粒子への曝露に続くＮＳＥレベルの低下をスクランブルＳＳＯと比較して示す。この低落は、２０及び４０のＴＭＣ－ＳＡ／ＳＳＯ－ＮＳＥ３（Ｎ／Ｐ）比で有意であった。このＮＳＥ低落は、非複合ＳＳＯ－ＮＳＥ３へ曝露した細胞におけるＮＳＥの包含と比較する場合にも明らかであって、このきわめてトランスフェクト可能な細胞株によるそれらの有意な取込みと一致していた。しかしながら、ＮＳＥレベルの抑制は、ＴＭＣ－ＳＡ／ＳＳＯ－ＮＳＥ３では、jetPrime で同じ細胞株へより低い最終濃度でトランスフェクトされた同
じオリゴほどは効率的でなかった。ＴＭＣ－ＳＡ／ＳＳＯ－ＮＳＥ３ナノ複合体への曝露時の有意なＮＳＥ抑制は、非複合ＳＳＯ－ＮＳＥ３がＮＳＥを抑制し得なかったリンパ芽球様細胞株でも観測された（図１８Ｂ）。まとめると、これらの結果は、イントロン性ＳＳＯのキトサンベースの送達系がヒト細胞においてＮＭＤスイッチエクソンを抑制することが可能であるという初めての原理証明を提供するものである。

【0251】

考察
[0283] 本研究は、ＮＭＤスイッチエクソンの活性化を促進及び抑制する転移因子の初めての例を示す（図１６）。Ａｌｕ配列それ自体に３’ｓｓ又は５’ｓｓ活性化又は補助スプライシングモチーフを介してエクソン化する傾向があって、そのことがヒトの病的病態に有意に寄与する。それらはまた、離れた欠失によってエクソン化されて遺伝性疾患を引き起こす可能性があり、それらが遠位イントロン配列の成熟転写産物における包含を促進し得ることを示唆する。このことは、選択的にスプライスされるエクソンに隣接するＡｌｕの割合が恒常的にスプライスされるものより高いことによってさらに裏付けられる。これらの離れた効果の正確な機序については理解されていないが、これらのＧＣリッチ転写産物の２次構造が重要な役割を担う可能性がある。

【0252】

[0284] 突然変異誘発性のエクソン化は、哺乳動物の散在反復配列と呼ばれる、より昔からの短鎖散在エレメントが含まれる、他のすべての転移因子群でも示されてきた。今回の研究では、ＭＥＲ５１Ａ（中位反復頻度リピート［Medium Reiterated frequency repe
at］ファミリー５１）に対して最も類似しているイントロン性転移因子がＮＳＥを抑制し、Ａｌｕ仲介性のＮＳＥ活性化に対抗する緩衝剤として作用した（図１６Ａと図１６Ｂ）。ＡＴＭ ＭＥＲ５１は、相対的にＧＣリッチ（約４４％）であって、同時転写フォールディングの間にＧＣリッチＡｌｕとの分子内相互作用を促進するのかもしれない。このエレメントは、いくつかの逆位反復を含有し、おそらくは、ＮＳＥの包含を制御し得る、曝露されたプリンリッチループを含有する安定したヘアピンを形成する（図１９）。ヒトゲノムには、識別可能なＭＥＲ配列の約２５０，０００コピーが存在すると推定され、その多くがタンパク質コーディング遺伝子の成熟転写産物に見出され、タンパク質相互作用の多様性に貢献している。突然変異誘発性ＭＥＲエクソン化の事象は、ギテルマン（Gitelman）症候群を引き起こすことも示された。ＭＥＲ５１の３’部分は、疾患起因性エクソン化の約１５％を占める、レトロウイルスの長い末端反復に類似している（図１９）。ほとんどのＭＥＲの起源は、哺乳動物の拡張と同時進行した、Ａｌｕ拡散以前の哺乳動物散在反復の低落の後と位置付けられて、ＭＥＲが早期の哺乳動物放散への洞察をもたらす可能性があることを示唆した。しかしながら、ＭＥＲ仲介性のエクソン活性化の根底にある分子機序についてはわかってないので、さらなる研究が求められよう。まとめると、これらの結果は、長いイントロンにおける転移因子の相互作用が多くのＮＭＤスイッチエクソンの包含レベルに影響を及ぼして、遺伝子発現を微調整する可能性を示唆する。

【0253】

[0285] 本研究では、ＡＴＭ発現に決定的な制御ＮＭＤスイッチエクソンを促進することによって作用する候補配列特異的なＡＴＭ阻害剤も同定した（図１７）。ＡＴＭ阻害剤は、多くの癌種の治療計画に不可欠な部分である、２本鎖切断を誘導する細胞傷害性療法（局所放射線療法が含まれる）に対してがん細胞を増感させる。化学的なＡＴＭ阻害剤は、がん放射線療法への多大な期待を示したが、それらの望まれない薬物動態プロフィール、高い毒性、又は乏しい効果は、臨床現場へのそれらの進展を阻んできた。対照的に、新たに同定されたＳＳＯは、ヒトゲノム内のユニーク配列を標的とし、それらの作用機序は十分明確であって、それらは、天然の生分解性化合物を使用して細胞へ送達することができる（図１８）。加えて、ＮＳＥを活性化するＳＳＯとそれを抑制するＳＳＯのアベイラビリティは、化学阻害剤より正確に遺伝子発現を増減させる機会を提供する。本明細書に記載されるアプローチは、ＮＭＤを活性化するクリプティックエクソンのＳＳＯ仲介性調節を利用する。これらのエクソンは、通常は、天然の転写産物においてごく低いレベルで存在しているが、それらの包含レベルは、様々な刺激に応答して効率的に上方制御することができる。最近、ＮＭＤの遺伝子特異的なアンチセンス阻害では、エクソン接合部の複合沈着部位を標的とするＳＳＯを利用して、それによってＰＴＣ含有エクソンのスキッピングに頼らないＮＭＤ抑制を可能にした。イントロン配列に依拠する前者のアプローチとエクソン標的に依拠する後者のアプローチという２つのアプローチには、今後互いに補完して、ＮＭＤを阻害するアンチセンス戦略のレパートリーを広げる可能性があろう。

【0254】

[0286] 今回のスクリーニングにおいて利用したＳＳＯの平均的な長さは、ユニークな標的への最小値に近かった（表２）。この短いＳＳＯは、より長いＳＳＯより多くのオフターゲット（off-target）効果を誘導して、内因性ＮＳＥ転写産物と外因性ＮＳＥ転写産物の包含レベル間の低い相関性に寄与する可能性がある。このあり得る最適以下の標的特異性とは別に、イントロン２８スプライシングとＮＳＥの包含は、外因性転写産物に存在しなかった隣接イントロンによって影響を受ける可能性がある。加えて、イントロン２８スプライシングは、完全に同時転写的でない場合もあって、異なるプロモーターより転写されるＲＮＡのフォールディングとフォールディング速度論が別個になって、その低い相関性に寄与する可能性がある。それでもやはり、今回の研究は、下等動物（選択的スプライシングへの制御可能性がより低い、より小さなイントロンを有する）と比較した場合のイントロン性補助スプライシング配列のより高次の情報量に一致して、ＳＳＯの候補イントロン性標的部位がヒトゲノムに豊富にあることを明確に実証する。ＳＳＯ－ＮＳＥ３と他のＳＳＯは、内因性ＮＳＥ含有ｍＲＮＡを抑制することが可能であり（図１７Ｂと図１
７Ｃ）、比存在度が約１％ほどの低さであるＮＭＤ転写産物がｍＲＮＡ消費に寄与することが可能であっても、それらの低下が正常細胞においてＡＴＭタンパク質レベルの持続的な増加をもたらし得るかは検証されていない。今回のアプローチには、特に（ＮＳＥの３’ｓｓ認識を容易にする）Ｃ対立遺伝子をｒｓ６０９２６１に担う同型接合Ａ－Ｔ患者において、漏出Ａ－Ｔ対立遺伝子の表現型の結果を突然変異非依存的なやり方で緩和する可能性があるかもしれない。最後に、キトサンベースのナノ粒子が血液脳関門を貫通して組織形態学に悪影響を及ぼすことなく小脳に蓄積することが示され、ＮＳＥリプレッサーと推定ＡＴＭアクチベーターを神経細胞へ送達してＡＴの小脳症状を改善する可能性を開いた。

【図1】

【図2-1】

【図2-2】

【図3】

【図4-1】

【図4-2】

【図5-1】

【図5-2】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11-1】

【図11-2】

【図12】

【図13】

【図14-1】

【図14-2】

【図15】

【図16】

【図17-1】

【図17-2】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【配列表】

2024009853000001.app

【手続補正書】

【提出日】2023-11-01

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項1】

機能性ＡＴＭタンパク質欠損への感受性に関して被験者をスクリーニングする方法であって、
ヒト被験者のゲノムのＮＳＥ（ＡＴＭイントロン２８内のクリプティックエクソン）の３’スプライス部位に対して－３位に位置する非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１の存在を決定することを含み、
非チミン変異体残基ｒｓ６０９２６１の存在は、該被験者が機能性ＡＴＭタンパク質欠損を有するか又はそれに感受性であることを示す、前記方法。