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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024098972
(43)【公開日】2024-07-24
(54)【発明の名称】ドーパミンＤ３／Ｄ２受容体調節化合物
(51)【国際特許分類】
C07D 295/135 20060101AFI20240717BHJP
A61K 31/495 20060101ALI20240717BHJP
A61P 25/18 20060101ALI20240717BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240717BHJP
【ＦＩ】
C07D295/135 CSP
A61K31/495
A61P25/18
A61P43/00 111
【審査請求】未請求
【請求項の数】13
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024001696
(22)【出願日】2024-01-10
(31)【優先権主張番号】63/479,530
(32)【優先日】2023-01-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】310008859
【氏名又は名称】リヒター ゲデオン ニュイルヴァーノシャン ミューコェデー レースヴェーニュタールシャシャーグ
【氏名又は名称原語表記】Ｒｉｃｈｔｅｒ Ｇｅｄｅｏｎ Ｎｙｒｔ．
(74)【代理人】
【識別番号】110001173
【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ボルザ，イシュトバーン
(72)【発明者】
【氏名】エーレシュ，ヤーノシュ
(72)【発明者】
【氏名】メンツィンガー，バーリント
(72)【発明者】
【氏名】ボッドナールネ・ディーク，シルビア
【テーマコード（参考）】
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086BC50
4C086GA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA18
4C086ZC41
(57)【要約】 （修正有）
【課題】統合失調症を含めた、疾患及び状態の治療における薬剤として有用である化合物を含む、医薬組成物を提供する。
【解決手段】式（Ｉ）：
（Ｒ１は、直鎖Ｃ１～Ｃ３アルキルである）の化合物、又は薬学的に許容されるその塩。
【選択図】なし
【解決手段】式（Ｉ）：
（Ｒ１は、直鎖Ｃ１～Ｃ３アルキルである）の化合物、又は薬学的に許容されるその塩。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
一般式（Ｉ）
（式中、
Ｒ１は、直鎖Ｃ１～Ｃ３アルキルである）の化合物、又は薬学的に許容されるその塩。
【化1】
Ｒ１は、直鎖Ｃ１～Ｃ３アルキルである）の化合物、又は薬学的に許容されるその塩。
【請求項2】
Ｒ１がＣＨ３である、請求項１に記載の化合物、又は薬学的に許容されるその塩。
【請求項3】
Ｒ１がＣＨ２ＣＨ３である、請求項１に記載の化合物、又は薬学的に許容されるその塩。
【請求項4】
Ｒ１がＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３である、請求項１に記載の化合物、又は薬学的に許容されるその塩。
【請求項5】
Ｎ’－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ－（エトキシメチル）－Ｎ－メチル尿素；
Ｎ’－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ－（メトキシメチル）－Ｎ－メチル尿素；及び
Ｎ’－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ－メチル－Ｎ－（プロポキシメチル）尿素からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物、又は薬学的に許容されるその塩。
Ｎ’－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ－（メトキシメチル）－Ｎ－メチル尿素；及び
Ｎ’－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ－メチル－Ｎ－（プロポキシメチル）尿素からなる群から選択される、請求項１に記載の化合物、又は薬学的に許容されるその塩。
【請求項6】
Ｎ’－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ－（エトキシメチル）－Ｎ－メチル尿素である、請求項１に記載の化合物、又は薬学的に許容されるその塩。
【請求項7】
Ｎ’－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ－（エトキシメチル）－Ｎ－メチル尿素である、請求項１に記載の化合物。
【請求項8】
Ｎ’－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ－（エトキシメチル）－Ｎ－メチル尿素の薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の化合物。
【請求項9】
薬学的に許容される担体と組み合わせて、治療有効量の請求項１に記載の化合物又は薬学的に許容されるその塩を含む、医薬組成物。
【請求項10】
統合失調症に罹患している対象において統合失調症を治療する方法であって、治療有効量の請求項１に記載の化合物又は薬学的に許容されるその塩を対象に投与するステップを含む、方法。
【請求項11】
医薬としての使用のための、請求項１に記載の化合物又は薬学的に許容されるその塩。
【請求項12】
統合失調症の治療における使用のための、請求項１に記載の化合物又は薬学的に許容されるその塩。
【請求項13】
統合失調症の治療用の医薬の製造のための、請求項１に記載の化合物又は薬学的に許容されるその塩の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０２３年１月１１日出願の米国特許仮出願第６３／４７９，５３０号の利益を主張し、その内容を参照によりその全体を本明細書に組み込む。
【0002】
本開示は、ドーパミンＤ２及びＤ３受容体の活性を調節する化合物、かかる化合物を製造する方法、それらの化合物を含有する組成物、及びそれらの化合物を用いる治療の方法に関係する。
【背景技術】
【0003】
ドーパミン神経伝達物質系の機能不全は、統合失調症及び情動性又は認知性の機能障害を含めた精神神経障害の病態において観察することができる（Ｓｏｋｏｌｏｆｆ、Ｐ．ら：Ｎａｔｕｒｅ、１９９０年、３４７．１４６；Ｓｃｈｗａｒｔｚ、Ｊ．－Ｃ．ら：Ｃｌｉｎ．Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．、１９９３年、１６巻、２９５頁）。ドーパミンの作用は、ドーパミンＤ１受容体ファミリー（すなわち、Ｄ１及びＤ５）又はＤ２受容体ファミリー（すなわち、Ｄ２、Ｄ３及びＤ４）に属する少なくとも５つの異なるドーパミン受容体によって媒介される。Ｄ３受容体は、中枢ドーパミン系（ｃｅｎｔｒａｌ ｄｏｐａｍｉｎｅｒｇｉｃ ｓｙｓｔｅｍ）に特徴的な分布を有する。ドーパミンＤ２受容体は、脳内に広範に分布し、多数の生理機能及び病理的状態に関与する。ドーパミンＤ２アンタゴニストは、例えば、統合失調症治療薬として用いられる。しかしながら、Ｄ２受容体の大量のアンタゴニズムによって、望まれない副作用、例えば、錐体外路の運動症状、精神運動の鎮静、認知機能の鈍麻などが生じる。Ｄ３受容体を優先的に標的とする統合失調症治療薬は、統合失調症の治療において治療介入に成果を挙げている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Ｓｏｋｏｌｏｆｆ、Ｐ．ら：Ｎａｔｕｒｅ、１９９０年、３４７．１４６
【非特許文献2】Ｓｃｈｗａｒｔｚ、Ｊ．－Ｃ．ら：Ｃｌｉｎ．Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ．、１９９３年、１６巻、２９５頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
当技術分野において、Ｄ３／Ｄ２受容体の選択性を有する改良された化合物が依然として必要である。
【課題を解決するための手段】
【0006】
（要旨）
いくつかの実施形態では、本発明は、式（Ｉ）
いくつかの実施形態では、本発明は、式（Ｉ）
【0007】
【化1】
Ｒ１は、Ｃ１～Ｃ３アルキルである）の化合物、又は薬学的に許容されるその塩を提供する。
【0008】
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｒ１がＣＨ３である、式（Ｉ）の化合物、又は薬学的に許容されるその塩を提供する。
【0009】
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｒ１がＣＨ２ＣＨ３である、式（Ｉ）の化合物、又は薬学的に許容されるその塩を提供する。
【0010】
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｒ１がＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３である、式（Ｉ）の化合物、又は薬学的に許容されるその塩を提供する。
【0011】
いくつかの実施形態では、本開示は、式（Ｉ）の化合物を提供し、本化合物は、
Ｎ’－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ－（エトキシメチル）－Ｎ－メチル尿素；
Ｎ’－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ－（メトキシメチル）－Ｎ－メチル尿素；及び
Ｎ’－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ－メチル－Ｎ－（プロポキシメチル）尿素；又は薬学的に許容されるその塩からなる群から選択される。
Ｎ’－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ－（エトキシメチル）－Ｎ－メチル尿素；
Ｎ’－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ－（メトキシメチル）－Ｎ－メチル尿素；及び
Ｎ’－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ－メチル－Ｎ－（プロポキシメチル）尿素；又は薬学的に許容されるその塩からなる群から選択される。
【0012】
いくつかの実施形態では、本開示は、式（Ｉ）の化合物を提供し、本化合物は、Ｎ’－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ－（エトキシメチル）－Ｎ－メチル尿素；又は薬学的に許容されるその塩である。
【0013】
いくつかの実施形態では、本開示は、式（Ｉ）の化合物を提供し、本化合物は、Ｎ’－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ－（エトキシメチル）－Ｎ－メチル尿素である。
【0014】
いくつかの実施形態では、本開示は、式（Ｉ）の化合物を提供し、本化合物は、薬学的に許容される塩Ｎ’－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ－（エトキシメチル）－Ｎ－メチル尿素である。
【0015】
いくつかの実施形態では、本開示は、薬学的に許容される担体と組み合わせて、治療有効量の式（Ｉ）の化合物、又は薬学的に許容されるその塩を含む、医薬組成物を提供する。
【0016】
いくつかの実施形態では、本開示は、統合失調症を治療するための方法を提供し、本方法は、治療有効量の式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容されるその塩を対象に投与する工程を含む。
【0017】
いくつかの実施形態では、本開示は、医薬としての使用のための、式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容されるその塩を提供する。
【0018】
いくつかの実施形態では、本開示は、統合失調症の治療における使用のための、式（Ｉ）の化合物、又は薬学的に許容されるその塩を提供する。
【0019】
いくつかの実施形態では、本開示は、統合失調症の治療用の医薬の製造のための、式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容されるその塩の使用を提供する。
【発明を実施するための形態】
【0020】
本開示は、ドーパミンＤ３受容体及びドーパミンＤ２受容体の活性を調節する化合物を記載している。
【0021】
本明細書に開示される化合物は、任意の置換基において又は本明細書の式中に２回以上存在する、１つ以上の変数を含むことができる。それぞれの存在における変数の定義は、別の存在におけるその定義と無関係である。さらに、置換基の組合せは、かかる組合せが安定化合物をもたらす場合にのみ、許容される。安定化合物は、反応混合物から単離することができる化合物である。
【0022】
定義
本明細書で使用される特定の用語は、以下に詳述する通り、次の定義を参照することを意図している。
本明細書で使用される特定の用語は、以下に詳述する通り、次の定義を参照することを意図している。
【0023】
本明細書及び所期の特許請求の範囲において使用される場合、別段文脈で明確に指示しない限り、単数形（「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」）は、複数の対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「化合物」への参照には、単一の化合物並びに１つ以上の同じ若しくは異なる化合物が含まれる。「薬学的に許容される担体」の参照は、単一の薬学的に許容される担体並びに１つ以上の薬学的に許容される担体などを意味する。
【0024】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、特段の指定がない限り、次の用語は、示した意味を有する。
【0025】
本明細書で使用される場合、用語「Ｃ１～Ｃ３アルキル」とは、別段規定がない限り、１、２又は３個の炭素原子を有する飽和の炭化水素鎖基を指す。「Ｃ１～３アルキル」の代表例には、メチル、エチル、及びｎ－プロピルが含まれる。
【0026】
ある場合には、ある部分の炭素原子数は、接頭辞「Ｃｘ～Ｃｙ」により示され、ｘは、最小値であり、ｙは、置換基中の炭素原子の最大数である。したがって、例えば、「Ｃ１～Ｃ６アルキル」は、１～６個の炭素原子を含むアルキル置換基を意味し、「Ｃ１～Ｃ３アルキル」は、１～３個の炭素原子を含むアルキル置換基を意味する。
【0027】
語句「医薬組成物」とは、医学的使用における投与に適した組成物を指す。
【0028】
語句「薬学的に許容される塩」とは、過度の毒性、刺激性、及びアレルギー性反応などがなく、妥当な利益／危険比に見合う、健全な医学的判断の範囲内で、ヒト及び下等動物の組織と接触して用いるのに適する、塩を指す。
【0029】
用語「安定した」とは、製造を可能にするのに十分な安定性を有する及び本明細書中で詳述される目的のために有用であるのに十分な期間、本化合物の完全性を維持する化合物を指す。
【0030】
語句「治療有効量」とは、ある特定の対象又は対象集団において治療用に投与された場合、治療されている状態若しくは障害の症状のうちの１つ以上の発生を予防する又は治療されている状態若しくは障害の症状のうちの１つ以上をある程度まで緩和するのに十分である、化合物、又は薬学的に許容されるその塩の量を指す。
【0031】
本明細書で使用される場合、用語「治療する」、「治療している」、及び「治療」は、疾患及び／又はそれらの付随する症状を緩和する又は抑止する方法を指す。
【0032】
化合物
本開示の化合物は、本明細書に記載された一般式（Ｉ）を有する。
本開示の化合物は、本明細書に記載された一般式（Ｉ）を有する。
【0033】
いくつかの実施形態では、本開示は、式（Ｉ）
【0034】
【化2】
Ｒ１は、Ｃ１～Ｃ３アルキルである）の化合物、又は薬学的に許容されるその塩を提供する。
【0035】
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｒ１がＣ１アルキルである、式（Ｉ）の化合物、又は薬学的に許容されるその塩を提供する。
【0036】
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｒ１がＣ２アルキルである、式（Ｉ）の化合物、又は薬学的に許容されるその塩を提供する。
【0037】
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｒ１がＣ３アルキルである、式（Ｉ）の化合物、又は薬学的に許容されるその塩を提供する。
【0038】
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｒ１が、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、及びＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３からなる群から選択される、式（Ｉ）の化合物、又は薬学的に許容されるその塩を提供する。
【0039】
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｒ１がＣＨ３である、式（Ｉ）の化合物、又は薬学的に許容されるその塩を提供する。
【0040】
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｒ１がＣＨ２ＣＨ３である、式（Ｉ）の化合物、又は薬学的に許容されるその塩を提供する。
【0041】
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｒ１がＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３である、式（Ｉ）の化合物、又は薬学的に許容されるその塩を提供する。
【0042】
いくつかの実施形態では、本開示は、Ｎ’－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ－（エトキシメチル）－Ｎ－メチル尿素である式（Ｉ）の化合物；又は薬学的に許容されるその塩を提供する。
【0043】
いくつかの実施形態では、本開示は、式（Ｉ）の化合物を提供し、本化合物は、Ｎ’－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ－（エトキシメチル）－Ｎ－メチル尿素である。
【0044】
いくつかの実施形態では、本開示は、式（Ｉ）の化合物を提供し、本化合物は、Ｎ’－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ－（エトキシメチル）－Ｎ－メチル尿素の薬学的に許容される塩である。
【0045】
いくつかの実施形態では、本開示は、式（Ｉ）の化合物；又は薬学的に許容されるその塩を提供し、本化合物は、Ｎ’－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ－（メトキシメチル）－Ｎ－メチル尿素である。
【0046】
いくつかの実施形態では、本開示は、式（Ｉ）の化合物を提供し、本化合物は、Ｎ’－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ－（メトキシメチル）－Ｎ－メチル尿素である。
【0047】
いくつかの実施形態では、本開示は、式（Ｉ）の化合物を提供し、本化合物は、Ｎ’－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ－（メトキシメチル）－Ｎ－メチル尿素の薬学的に許容される塩である。
【0048】
いくつかの実施形態では、本開示は、式（Ｉ）の化合物；又は薬学的に許容されるその塩を提供し、本化合物は、Ｎ’－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ－メチル－Ｎ－（プロポキシメチル）尿素である。
【0049】
いくつかの実施形態では、本開示は、式（Ｉ）の化合物を提供し、本化合物は、Ｎ’－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ－メチル－Ｎ－（プロポキシメチル）尿素である。
【0050】
いくつかの実施形態では、本開示は、式（Ｉ）の化合物を提供し、本化合物は、Ｎ’－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ－メチル－Ｎ－（プロポキシメチル）尿素の薬学的に許容される塩である。
【0051】
本開示の化合物及び中間体を、ＡＣＤ／Ｎａｍｅ ２０２１．１．３（ファイルバージョンＮ１５Ｅ４１、Ｂｕｉｌｄ １２３２３２、２０２１年７月７日）ソフトウェアプログラムを用いることによって及び／又はＣＨＥＭＤＲＡＷ（登録商標）Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ ｖ．２０．１．１．１２５の一部としてＳｔｒｕｃｔ＝Ｎａｍｅ命名アルゴリズムを用いることによって命名した。
【0052】
式（Ｉ）の模範的な化合物には、それだけには限らないが、以下の表１に示す化合物、及び薬学的に許容されるそれらの塩が含まれる。
【0053】
【表1】
【0054】
式（Ｉ）の化合物は、薬学的に許容される塩の形態で用いることができる。式（Ｉ）の化合物は、塩基性官能基又は酸性官能基のいずれか、又は両方を含むことができ、望まれる場合、適切な酸又は塩基を用いることにより、薬学的に許容される塩に変換することができる。
【0055】
模範的な化合物を作製する方法
本開示の化合物は、化合物を調製することができる手段を例証する次の合成スキーム及び方法に関連してより良く理解され得る。本開示の化合物は、様々な合成手順によって調製することができる。代表的な合成手順は、それだけに限らないが、スキーム１～２に示される。変数Ｒ１は、本明細書、例えば、要約に詳述される通り定義される。
スキーム
本開示の化合物は、化合物を調製することができる手段を例証する次の合成スキーム及び方法に関連してより良く理解され得る。本開示の化合物は、様々な合成手順によって調製することができる。代表的な合成手順は、それだけに限らないが、スキーム１～２に示される。変数Ｒ１は、本明細書、例えば、要約に詳述される通り定義される。
スキーム
【0056】
【化3】
【0057】
スキーム１に示す通り、Ｒ１が本明細書で定義する通りである、式（Ｉ）の化合物は、例えば、国際公開第２０１０／０７０３７０号などの当該技術分野で公知の方法に従って調製することができる式（１）の化合物から調製することができる。したがって、式（１）の化合物は、市販のパラホルムアルデヒド又はホルムアルデヒド（メタノール安定剤を含む飽和水溶液）、及びＲ１が本明細書に記載した通りである、式（２）の適切なアルコールで処理することができ、これらは、市販されている、又は当技術分野で公知の方法に従って周囲温度で還流して、調製することができる。反応は、通常、適当な溶媒、例えば、アルコール（２）又はテトラヒドロフランなどで１～１６８時間行って、式（Ｉ）の化合物が生成される。
【0058】
【化4】
【0059】
スキーム２に示す通り、式（Ｉ）の化合物は、式（１）の化合物から調製することができる。したがって、式（１）の化合物は、周囲温度で市販の１－ヒドロキシメチルイミダゾールで処理して、適当な溶媒、例えば、酢酸及びテトラヒドロフランの混合物中で１～２４時間還流して、式（３）の化合物を生成することができる。式（３）の化合物を、Ｒ１が本明細書に記載の通りである、式（２）の適切なアルコールを用いて、水酸化カリウムのような適切な塩基又は硫酸若しくはメタンスルホン酸のような適切な酸の存在下で処理して、式（Ｉ）の化合物を生成することができる。反応を、通常、周囲温度で行って、適当な溶媒、例えば、テトラヒドロフラン又はトルエン中で１～２４時間還流する。
【0060】
詳細な手順を、合成例のセクションにおいて示す。別段記載がない限り、出発材料及び試薬は、市販されている、又は化学文献に記載されている方法を用いて、市販の材料から当業者により調製することができる。
【0061】
医薬組成物
医薬品として使用される場合、本開示の化合物は、医薬組成物の形態で投与することができる。かかる組成物は、薬学的に許容される担体と一緒になって、治療有効量の式（Ｉ）の化合物、又は薬学的に許容されるその塩を含むことができる。
医薬品として使用される場合、本開示の化合物は、医薬組成物の形態で投与することができる。かかる組成物は、薬学的に許容される担体と一緒になって、治療有効量の式（Ｉ）の化合物、又は薬学的に許容されるその塩を含むことができる。
【0062】
いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体と組み合わせて、治療有効量の式（Ｉ）の化合物、又は薬学的に許容されるその塩を含む、医薬組成物が提供される。
【0063】
使用の方法
式（Ｉ）の化合物、又は薬学的に許容されるその塩、及び式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容されるその塩を含む医薬組成物は、統合失調症に罹患している対象に投与することができる。用語「投与」とは、化合物を対象と接触させる方法を指す。
式（Ｉ）の化合物、又は薬学的に許容されるその塩、及び式（Ｉ）の化合物又は薬学的に許容されるその塩を含む医薬組成物は、統合失調症に罹患している対象に投与することができる。用語「投与」とは、化合物を対象と接触させる方法を指す。
【0064】
いくつかの実施形態では、本開示は、医薬としての使用のための、式（Ｉ）の化合物、又は薬学的に許容されるその塩、及び式（Ｉ）の化合物、又は薬学的に許容されるその塩を含む医薬組成物を提供する。
【0065】
いくつかの実施形態では、本開示は、統合失調症の治療における使用のための、式（Ｉ）の化合物、又は薬学的に許容されるその塩、及び式（Ｉ）の化合物、又は薬学的に許容されるその塩を含む医薬組成物を提供する。
【0066】
いくつかの実施形態では、本開示は、統合失調症の治療用の医薬の製造のための、式（Ｉ）の化合物、又は薬学的に許容されるその塩、及び式（Ｉ）の化合物、又は薬学的に許容されるその塩を含む医薬組成物の使用を提供する。
【実施例0067】
次の実施例は、例示的な目的のために用いることができ、発明の範囲を限定するとみなすべきでない。
【0068】
すべての試薬は、市販グレードのもので、別段の記載がない限り、さらに精製せずにそのままを用いた。市販の無水溶媒を、不活性雰囲気下で行った反応のために用いた。別段規定がない限り、試薬グレードの溶媒を、他のすべての場合において用いた。１Ｈ ＮＭＲスペクトルの化学シフト（δ）を、テトラメチルシラン（δ０．００）又は内部参照として、適切な残留溶媒ピーク、すなわち、ＣＨＣｌ３（δ７．２７）に対する百万分率（ｐｐｍ）で報告した。
【0069】
次の略語は、別段規定がない限り、示されている意味を有する：
【0070】
【表2】
【0071】
合成例
［実施例１］
Ｎ’－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ－（エトキシメチル）－Ｎ－メチル尿素
Ｎ－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ’－メチル尿素５．０ｇ（１２．５ｍｍｏｌ）、エタノール２５０ｍＬ、酢酸２．５ｍＬ及びパラホルムアルデヒド３．７５ｇ（１２５ｍｍｏｌ）の混合物を７０℃で４０時間撹拌した。反応混合物を、真空中で濃縮した。残留物を、アセトンにより溶出するシリカゲルでのクロマトグラフィーにかけた。粗物質を、ジエチルエーテルと混合し、ろ過して、表題化合物を生成した。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.88-1.02 (m, 2H), 1.08 (t, J = 7.0 Hz, 3H), 1.14-1.28 (m, 3H), 1.31-1.40 (m, 2H), 1.69-1.81 (m, 4H), 2.31-2.39 (m, 2H), 2.42-2.61 (br m, 4H), 2.79 (s, 3H), 2.90-3.04 (br m, 4H), 3.35 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 3.31-3.44 (m, 1H), 4.63 (s, 2H), 6.03 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.10-7.18 (m, 1H), 7.25-7.34 (m, 2H); LC-MS (ESI) m/z 471.3 (M+H)+.
［実施例１］
Ｎ’－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ－（エトキシメチル）－Ｎ－メチル尿素
Ｎ－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ’－メチル尿素５．０ｇ（１２．５ｍｍｏｌ）、エタノール２５０ｍＬ、酢酸２．５ｍＬ及びパラホルムアルデヒド３．７５ｇ（１２５ｍｍｏｌ）の混合物を７０℃で４０時間撹拌した。反応混合物を、真空中で濃縮した。残留物を、アセトンにより溶出するシリカゲルでのクロマトグラフィーにかけた。粗物質を、ジエチルエーテルと混合し、ろ過して、表題化合物を生成した。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 0.88-1.02 (m, 2H), 1.08 (t, J = 7.0 Hz, 3H), 1.14-1.28 (m, 3H), 1.31-1.40 (m, 2H), 1.69-1.81 (m, 4H), 2.31-2.39 (m, 2H), 2.42-2.61 (br m, 4H), 2.79 (s, 3H), 2.90-3.04 (br m, 4H), 3.35 (q, J = 7.0 Hz, 2H), 3.31-3.44 (m, 1H), 4.63 (s, 2H), 6.03 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.10-7.18 (m, 1H), 7.25-7.34 (m, 2H); LC-MS (ESI) m/z 471.3 (M+H)+.
【0072】
［実施例２］
Ｎ’－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ－（メトキシメチル）－Ｎ－メチル尿素
Ｎ－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ’－メチル尿素１ｇ（２．４ｍｍｏｌ）、メタノール２０ｍＬ、酢酸０．５ｍＬ及び３７％ホルムアルデヒド溶液（およそ１０％メタノールを含む水溶液）２ｍＬ（２６．８ｍｍｏｌ）の混合物を８５℃で２０時間撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮した。残留物を、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｋｉｎｅｔｅｘ（登録商標）５μｍ Ｃ１８ １００Å ＡＸＩＡ Ｐａｃｋｅｄ ＬＣ Ｃｏｌｕｍｎ（１５０ｍｍ×２１．２ｍｍ）における分取ＨＰＬＣ；３分間にわたるイソクラティックの、水＋０，１％ジエチルアミン（Ａ）中の２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＨ４ＨＣＯ３；水＋０，１％ジエチルアミン（Ａ）及びメタノール（Ｂ）中の２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＨ４ＨＣＯ３（Ａ）の１６分間にわたる４０～５０％グラジエントにより４０℃で流速２１．２ｍＬ／分で精製して、表題化合物を生成した。1H NMR (400 MHz, ジメチルスルホキシド-d6) δppm 0.88-1.06 (m, 2H), 1.15-1.28 (m, 3H), 1.31-1.40 (m, 2H), 1.68-1.82 (m, 4H), 2.31-2.39 (m, 2H), 2.46-2.59 (br m, 4H), 2.79 (s, 3H), 2.90 -3.05 (br m, 4H), 3.12 (s, 3H), 3.25-3.45 (m, 1H), 4.59 (s, 2H), 6.05 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.11-7.17 (m, 1H), 7.27-7.34 (m, 2H); LC-MS (ESI) m/z 457.3 (M+H)+.
Ｎ’－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ－（メトキシメチル）－Ｎ－メチル尿素
Ｎ－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ’－メチル尿素１ｇ（２．４ｍｍｏｌ）、メタノール２０ｍＬ、酢酸０．５ｍＬ及び３７％ホルムアルデヒド溶液（およそ１０％メタノールを含む水溶液）２ｍＬ（２６．８ｍｍｏｌ）の混合物を８５℃で２０時間撹拌した。反応混合物を真空中で濃縮した。残留物を、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｋｉｎｅｔｅｘ（登録商標）５μｍ Ｃ１８ １００Å ＡＸＩＡ Ｐａｃｋｅｄ ＬＣ Ｃｏｌｕｍｎ（１５０ｍｍ×２１．２ｍｍ）における分取ＨＰＬＣ；３分間にわたるイソクラティックの、水＋０，１％ジエチルアミン（Ａ）中の２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＨ４ＨＣＯ３；水＋０，１％ジエチルアミン（Ａ）及びメタノール（Ｂ）中の２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮＨ４ＨＣＯ３（Ａ）の１６分間にわたる４０～５０％グラジエントにより４０℃で流速２１．２ｍＬ／分で精製して、表題化合物を生成した。1H NMR (400 MHz, ジメチルスルホキシド-d6) δppm 0.88-1.06 (m, 2H), 1.15-1.28 (m, 3H), 1.31-1.40 (m, 2H), 1.68-1.82 (m, 4H), 2.31-2.39 (m, 2H), 2.46-2.59 (br m, 4H), 2.79 (s, 3H), 2.90 -3.05 (br m, 4H), 3.12 (s, 3H), 3.25-3.45 (m, 1H), 4.59 (s, 2H), 6.05 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.11-7.17 (m, 1H), 7.27-7.34 (m, 2H); LC-MS (ESI) m/z 457.3 (M+H)+.
【0073】
［実施例３］
Ｎ’－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ－メチル－Ｎ－（プロポキシメチル）尿素
Ｎ’－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ－メチル－Ｎ－（プロポキシメチル）尿素
【0074】
［実施例３Ａ］
Ｎ’－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ－（１Ｈ－イミダゾル－１－イル）メチル］－Ｎ－メチル尿素
Ｎ－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ’－メチル尿素３．０ｇ（７．２５ｍｍｏｌ）、（１Ｈ－イミダゾル－１－イル）メタノール１．０７０ｇ（１０．９ｍｍｏｌ）、酢酸９ｍＬ（２００ｍｍｏｌ）及びテトラヒドロフラン７０ｍＬの混合物を８０℃で１８時間撹拌した。ジクロロメタン（１００ｍＬ）及び飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５０ｍＬ）を混合物に加えた。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過した。ろ液を、真空中で濃縮した。残留物を、ジエチルエーテル（２００ｍＬ）及びメタノール（５ｍＬ）の混合物と混合し、ろ過して、表題化合物を生成した。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ ４９３．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
Ｎ’－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ－（１Ｈ－イミダゾル－１－イル）メチル］－Ｎ－メチル尿素
Ｎ－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ’－メチル尿素３．０ｇ（７．２５ｍｍｏｌ）、（１Ｈ－イミダゾル－１－イル）メタノール１．０７０ｇ（１０．９ｍｍｏｌ）、酢酸９ｍＬ（２００ｍｍｏｌ）及びテトラヒドロフラン７０ｍＬの混合物を８０℃で１８時間撹拌した。ジクロロメタン（１００ｍＬ）及び飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５０ｍＬ）を混合物に加えた。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過した。ろ液を、真空中で濃縮した。残留物を、ジエチルエーテル（２００ｍＬ）及びメタノール（５ｍＬ）の混合物と混合し、ろ過して、表題化合物を生成した。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ ４９３．３（Ｍ＋Ｈ）＋。
【0075】
［実施例３Ｂ］
Ｎ’－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ－メチル－Ｎ－（プロポキシメチル）尿素
メタンスルホン酸８７ｍｇ（０．９ｍｍｏｌ）の１－プロパノール２７３ｍｇ（４．５５ｍｍｏｌ）中溶液に、トルエン２０ｍＬ及びＮ’－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ－［（１Ｈ－イミダゾル－１－イル）メチル］－Ｎ－メチル尿素４４３ｍｇ（１ｍｍｏｌ）を室温で加え、反応混合物を９０℃で２時間撹拌した。酢酸エチル（３０ｍＬ）及び飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（３０ｍＬ）を混合物に加えた。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過した。ろ液を、真空中で濃縮した。残留物を、ジクロロメタン／メタノール（９７：３）で溶出するシリカゲルのクロマトグラフィーにかけた。粗物質を、ｎ－ペンタンと混合し、ろ過して、表題化合物を生成した。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) d ppm 0.84 (t, J =7.2 Hz, 3H), 0.88-1.03 (m, 2H), 1.13-1.29 (m, 3H), 1.30-1.40 (m, 2H), 1.48 (sxt, J = 7.0 Hz, 2H), 1.69-1.81 (br m, 4H), 2.31-2.40 (m, 2H), 2.43-2.60 (br m, 4H), 2.79 (s, 3H), 2.90-3.05 (br m, 4H), 3.26 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.31-3.46 (m, 1H), 4.64 (s, 2H), 6.02 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.11-7.17 (m, 1H), 7.27-7.33 (m, 2H); LC-MS (ESI) m/z 485.3 (M+H)+.
Ｎ’－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ－メチル－Ｎ－（プロポキシメチル）尿素
メタンスルホン酸８７ｍｇ（０．９ｍｍｏｌ）の１－プロパノール２７３ｍｇ（４．５５ｍｍｏｌ）中溶液に、トルエン２０ｍＬ及びＮ’－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ－［（１Ｈ－イミダゾル－１－イル）メチル］－Ｎ－メチル尿素４４３ｍｇ（１ｍｍｏｌ）を室温で加え、反応混合物を９０℃で２時間撹拌した。酢酸エチル（３０ｍＬ）及び飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（３０ｍＬ）を混合物に加えた。有機層を分離し、硫酸ナトリウムで脱水し、ろ過した。ろ液を、真空中で濃縮した。残留物を、ジクロロメタン／メタノール（９７：３）で溶出するシリカゲルのクロマトグラフィーにかけた。粗物質を、ｎ－ペンタンと混合し、ろ過して、表題化合物を生成した。1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) d ppm 0.84 (t, J =7.2 Hz, 3H), 0.88-1.03 (m, 2H), 1.13-1.29 (m, 3H), 1.30-1.40 (m, 2H), 1.48 (sxt, J = 7.0 Hz, 2H), 1.69-1.81 (br m, 4H), 2.31-2.40 (m, 2H), 2.43-2.60 (br m, 4H), 2.79 (s, 3H), 2.90-3.05 (br m, 4H), 3.26 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.31-3.46 (m, 1H), 4.64 (s, 2H), 6.02 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.11-7.17 (m, 1H), 7.27-7.33 (m, 2H); LC-MS (ESI) m/z 485.3 (M+H)+.
【0076】
【化5】
【0077】
参考例１
Ｎ’－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ－メチル－Ｎ－プロピル尿素
表題化合物を、国際公開第２００５０１２２６６号に記載されている通り調製した。
Ｎ’－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ－メチル－Ｎ－プロピル尿素
表題化合物を、国際公開第２００５０１２２６６号に記載されている通り調製した。
【0078】
【化6】
【0079】
参考例２
Ｎ’－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル尿素（ＣＡＲ）
表題化合物を、国際公開第２００５０１２２６６号に記載されている通り調製した。
Ｎ’－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル尿素（ＣＡＲ）
表題化合物を、国際公開第２００５０１２２６６号に記載されている通り調製した。
【0080】
【化7】
【0081】
参考例３
Ｎ－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ’－メチル尿素（ＤＣＡＲ）
表題化合物を、国際公開第２００５０１２２６６号に記載されている通り調製した。
Ｎ－［（１ｒ，４ｒ）－４－｛２－［４－（２，３－ジクロロフェニル）ピペラジン－１－イル］エチル｝シクロヘキシル］－Ｎ’－メチル尿素（ＤＣＡＲ）
表題化合物を、国際公開第２００５０１２２６６号に記載されている通り調製した。
【0082】
動的溶解度（Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）試験
【0083】
【表3】
【0084】
動的溶解度の決定のために、各化合物の１０ｍＭ（５ｍＭ、１ｍＭ）ＤＭＳＯ原液３ｍＬを、ＰＢＳ２９５ｍＬ（ｐＨ７．４）を含有する９６ウェルプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ（登録商標）ＨＴＳ－ＰＣＦ Ｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｔｅ、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）のウェルにピペットで移した。懸濁液を３００ｒｐｍのオービタルシェーカーで２時間振り混ぜた後、本懸濁液を、真空ろ過（Ｍｕｌｔｉｓｃｒｅｅｎ（登録商標）Ｖａｃｕｕｍ Ｍａｎｉｆｏｌｄ； ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）で清澄化した。ろ過ステップの直後、ろ液１６０ｍＬをアセトニトリル４０ｍＬに移して、飽和溶液からの化合物の沈殿を回避した。研究化合物の濃度を、研究化合物の同じバッチから作製された外部標準を用いることにより、ＨＰＬＣ－ＵＶ－（ＭＳ）検出によって決定した。結果を表２に示す。
【0085】
熱力学的溶解度試験（３７℃、４時間）
熱力学的溶解度を測定する場合：通常、本溶液２００～４００μＬを、固形試験物質（ｎ＝５）１～２ｍｇに加えた。得られた混合物／過飽和溶液を、３７℃で４時間（溶液平衡まで）振り混ぜ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅマルチスクリーンフィルタープレート（０．４５μｍ）でろ過する。ろ液の濃度を、５点校正に基づいてＬＣ／ＵＶ／ＭＳにより決定する。（固形材料が水性試験媒体に完全に溶解した場合、その結果は最小値と考えるべきである。）。結果を表２に示す。
熱力学的溶解度を測定する場合：通常、本溶液２００～４００μＬを、固形試験物質（ｎ＝５）１～２ｍｇに加えた。得られた混合物／過飽和溶液を、３７℃で４時間（溶液平衡まで）振り混ぜ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅマルチスクリーンフィルタープレート（０．４５μｍ）でろ過する。ろ液の濃度を、５点校正に基づいてＬＣ／ＵＶ／ＭＳにより決定する。（固形材料が水性試験媒体に完全に溶解した場合、その結果は最小値と考えるべきである。）。結果を表２に示す。
【0086】
熱力学的溶解度試験（ＲＴ、２４時間）
熱力学的溶解度を測定する場合：通常、本溶液２００～４００μＬを、固形試験物質（ｎ＝５）１～２ｍｇに加えた。得られた混合物を、室温（ＲＴ）で２４時間（溶液平衡まで）振り混ぜ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅマルチスクリーンフィルタープレート（０．４５μｍ）でろ過した。ろ液の濃度を、５点校正に基づいてＬＣ／ＵＶ／ＭＳにより決定した。（固形材料が水性試験媒体に完全に溶解した場合、その結果は最小値と考えるべきである。）。結果を表２に示す。
熱力学的溶解度を測定する場合：通常、本溶液２００～４００μＬを、固形試験物質（ｎ＝５）１～２ｍｇに加えた。得られた混合物を、室温（ＲＴ）で２４時間（溶液平衡まで）振り混ぜ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅマルチスクリーンフィルタープレート（０．４５μｍ）でろ過した。ろ液の濃度を、５点校正に基づいてＬＣ／ＵＶ／ＭＳにより決定した。（固形材料が水性試験媒体に完全に溶解した場合、その結果は最小値と考えるべきである。）。結果を表２に示す。
【0087】
【表4】
【0088】
本開示の実施例の速度論的及び熱力学的溶解度データによって、参照化合物の溶解度と比較して、それらの溶解度が予想外に改善されていることが示される。
【0089】
生物アッセイ
インビトロ生物学研究では、次の略語を一般的に用いた：ＢＳＡはウシ血清アルブミン、ｃＡＭＰは環状アデノシン一リン酸、ＤＭＥＭはダルベッコ改変イーグル培地、ＤＭＳＯはジメチルスルホキシド、ＥＤＴＡはエチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩、ＥＧＴＡはエチレングリコール－ビス（２－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸、ＦＢＳはウシ胎児血清、Ｇ４１８はジェネテシン、ＩＢＭＸは３－イソブチル－１－メチルキサンチン、Ｔｒｉｓはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンである。
インビトロ生物学研究では、次の略語を一般的に用いた：ＢＳＡはウシ血清アルブミン、ｃＡＭＰは環状アデノシン一リン酸、ＤＭＥＭはダルベッコ改変イーグル培地、ＤＭＳＯはジメチルスルホキシド、ＥＤＴＡはエチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩、ＥＧＴＡはエチレングリコール－ビス（２－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－四酢酸、ＦＢＳはウシ胎児血清、Ｇ４１８はジェネテシン、ＩＢＭＸは３－イソブチル－１－メチルキサンチン、Ｔｒｉｓはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンである。
【0090】
ヒトＤ２Ｌ受容体を用いた試験
競合的結合アッセイにおける［３Ｈ］ラクロプリドを用いたヒトＤ２Ｌ受容体の親和性の決定
組換えヒトＤ２Ｌ受容体を発現する培養ＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＤＲＤ２Ｌ ｃＡＭＰ Ｈｕｎｔｅｒ（商標）、Ｇｉ細胞株、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ社、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ、ＵＳＡ）を、４×（ｖ／ｖ）緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＧＴＡ、ｐＨ７．４、２５℃）中で、Ｄｏｕｎｃｅ組織グラインダーを用いてホモジナイズし、４０，０００×ｇで、４℃で１０分間遠心分離した。上澄みを除去し、ペレットを４×緩衝液（ｖ／ｖ）に再懸濁し、遠心分離した。得られたペレットを、上記緩衝液に体積１２．５ｍＬ／ｇ 原重量で再懸濁した。次いで、膜標本をアリコートし、－７０℃で保存した。
競合的結合アッセイにおける［３Ｈ］ラクロプリドを用いたヒトＤ２Ｌ受容体の親和性の決定
組換えヒトＤ２Ｌ受容体を発現する培養ＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＤＲＤ２Ｌ ｃＡＭＰ Ｈｕｎｔｅｒ（商標）、Ｇｉ細胞株、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ社、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ、ＵＳＡ）を、４×（ｖ／ｖ）緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＧＴＡ、ｐＨ７．４、２５℃）中で、Ｄｏｕｎｃｅ組織グラインダーを用いてホモジナイズし、４０，０００×ｇで、４℃で１０分間遠心分離した。上澄みを除去し、ペレットを４×緩衝液（ｖ／ｖ）に再懸濁し、遠心分離した。得られたペレットを、上記緩衝液に体積１２．５ｍＬ／ｇ 原重量で再懸濁した。次いで、膜標本をアリコートし、－７０℃で保存した。
【0091】
試験化合物を、ＤＭＳＯで連続的に希釈し、続いて、結合緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５ｍ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）中で５％ＤＭＳＯ（ｖ／ｗ）に希釈した。結合緩衝液（５０μＬ）中の５×濃縮化合物を、９６ウェルディープウェルプレート（ＢＲＡＮＤ、Ｗｅｒｔｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に移した。アリコートした膜標本を解凍し、結合緩衝液中で１回洗浄した。同じ緩衝液中で、ウェル当たりタンパク質１０μｇを、（試験化合物の結合阻害又は全結合をそれぞれ決定するために）試験化合物の存在下又は非存在下で、２５０μＬの体積で２５℃で１２０分間２ｎＭ［３Ｈ］ラクロプリド（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）でインキュベートした。非特異的結合（ＮＳＢ）を、Ｄ２受容体のアンタゴニストである１０μＭハロペリドールの存在下で決定した。インキュベーション後、サンプルを、Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ（商標）ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いてＵｎｉＦｉｌｔｅｒ（登録商標）ＧＦ／Ｂプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）でろ過し、氷冷結合緩衝液１ｍＬで４回洗浄した。プレートを４０℃で１時間乾燥させ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ（商標）－２０シンチレーションカクテル（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）４０μＬを各ウェルに加えた。放射能を、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ２（登録商標）マイクロプレートカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いて決定した。
【0092】
非特異的結合を差し引いて、特異的結合を得、これをビヒクル処理したサンプルに正規化し、置換％値に変換した。ＧｒａＦｉｔ ６．０（Ｅｒｉｔｈｒａｃｕｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、Ｈｏｒｌｅｙ、ＵＫ）をＩＣ５０値の決定及び曲線当てはめに用いた。ＩＣ５０値（すなわち、特異的結合を５０％抑制する化合物の濃度）を、シグモイダルフィッティング（ｓｉｇｍｏｉｄａｌ ｆｉｔｔｉｎｇ）による濃度－変位曲線から決定した。阻害定数（Ｋｉ）を、チェン－プルソフ方程式を用いて算出した：Ｋｉ＝ＩＣ５０／［１＋（［Ｌ］／ＫＤ）］（式中、［Ｌ］は、放射性リガンド濃度、ＫＤは、受容体に対する標識リガンドの親和性である）。ＫＤを、別個の飽和実験から決定した。ｐＫｉ値を、ｍｏｌ／リットルで表されるＫｉ値の負の対数を算出することによって導き出した。実験を３回行い、結果を表３に示す。これらの結果から、本開示の例は、ヒト組換えＤ２Ｌ受容体の高親和性リガンドであることが示される。
【0093】
【表5】
【0094】
［３Ｈ］スピペロンを用いた競合結合アッセイにおけるヒトＤ２Ｌ受容体の親和性の決定
ヒト組換えＤ２Ｌ受容体を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。細胞をプレートからすり落とし、１０００×ｇで遠心分離した。細胞を、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）ペッスルホモジナイザーを用いて、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ＝７．４、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を含有する緩衝液中で破砕した。得られた懸濁液を１０００×ｇで遠心分離した。上澄みを回収し、４１，０００×ｇで遠心分離した。上澄みを捨て、ペレットを上記の緩衝液に再懸濁した。次いで、膜標本をアリコートし、－７０℃で保存した。
ヒト組換えＤ２Ｌ受容体を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。細胞をプレートからすり落とし、１０００×ｇで遠心分離した。細胞を、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）ペッスルホモジナイザーを用いて、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ＝７．４、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）を含有する緩衝液中で破砕した。得られた懸濁液を１０００×ｇで遠心分離した。上澄みを回収し、４１，０００×ｇで遠心分離した。上澄みを捨て、ペレットを上記の緩衝液に再懸濁した。次いで、膜標本をアリコートし、－７０℃で保存した。
【0095】
９６ウェルプレート中、最終反応体積２２２μＬに１％ ＤＭＳＯで、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１．４ｍＭアスコルビン酸、０．００１％ ＢＳＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）を含有するインキュベーション緩衝液中で、試験化合物の存在下又は非存在下で０．１６ｎＭ［３Ｈ］スピペロン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いて２５℃で１２０分間、アリコートした膜標本をインキュベートした。非特異的結合（ＮＳＢ）を、１０μＭハロペリドール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）の存在下で決定した。インキュベーション後、サンプルをＵｎｉＦｉｌｔｅｒ（登録商標）ＧＦ／Ｃプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）でろ過し、洗浄し、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ（商標）－２０シンチレーションカクテルを加えた。放射能を、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ２（登録商標）マイクロプレートカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いて決定した。
【0096】
シンチレーション数から、ＮＳＢを差し引いて、特異的結合を得、これをビヒクル処理したサンプルに正規化し、置換％値に変換した。ＩＣ５０値を、ＭａｔｈＩＱ（商標）（ＩＤ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｌｔｄ．、Ｓｕｒｒｅｙ、ＵＫ）を用いた非線形最小二乗回帰分析により決定した。Ｋｉ値を、被検化合物の観察されたＩＣ５０、アッセイに使用した放射性リガンドの濃度、及びリガンドのＫＤの既存の値（ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ ｖａｌｕｅ）を用いたチェン－プルソフ式を用いて算出した。ｐＫｉ値を、ｍｏｌ／リットルで表されるＫｉ値の負の対数を算出することによって導き出し、表４に示す。これらの結果から、本開示の例は、［３Ｈ］スピペロンを放射性リガンドとして用いる場合、ヒト組換えＤ２Ｌ受容体の高親和性リガンドであることが示される。
【0097】
【表6】
【0098】
環状アデノシン一リン酸検出を用いたヒトＤ２Ｌ受容体のアゴニズムの特徴付け
ヒトＤ２Ｌ受容体におけるアゴニスト活性を、ｃＡＭＰ Ｇｉキット（Ｃｉｓｂｉｏ／ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いて、均一系時間分解蛍光法（ＨＴＲＦ（登録商標）：ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ ｔｉｍｅ－ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）により、ヒトＤ２Ｌ受容体（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ社、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ、ＵＳＡ）を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞においてｃＡＭＰレベルを測定することによりアッセイした。ヒトＤ２Ｌ受容体を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞を、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン抗マイコ溶液、及びＧ４１８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）８００μｇ／ｍＬを補充したＨａｍのＦ１２培地で培養し、ＣＯ２ ５．０％を含有する加湿雰囲気下で３７℃に維持した。ｃＡＭＰ測定のために、凍結保存した細胞を解凍し、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）ＡｓｓａｙＣｏｍｐｌｅｔｅ（商標）Ｃｅｌｌ Ｐｌａｔｉｎｇ ２（ＣＰ２）試薬（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ社）中で、半分の面積の白壁の９６ウェルプレートにウェル当たり１０，０００細胞で播種し、ＣＯ２ ５．０％を含む加湿雰囲気下で、３７℃で終夜インキュベートした。ｃＡＭＰ測定前に、ＣＰ２試薬を細胞から除去し、１００μＭ ＩＢＭＸを補充した、２０μＬの化合物又はビヒクル含有アッセイ緩衝液（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ２－［４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル］エタン－１－スルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、１０ｍＭグルコース、ｐＨ７．４）と置き換え、周囲温度で２０分間インキュベートした。０．５μＭフォルスコリン（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ社）により周囲温度でさらに３０分間インキュベートした後、細胞刺激を、溶解緩衝液で希釈した検出試薬（ｃＡＭＰ－ｄ２ ２０μＬ及び抗ｃＡＭＰクリプテート２０μＬ、Ｃｉｓｂｉｏ／ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を加えることにより停止した。周囲温度で６０分間インキュベートした後、レーザー励起が３３７ｎｍの標準ＨＴＲＦ（登録商標）設定を用いたＰＨＥＲＡｓｔａｒ ＦＳマルチモードリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ社、Ｏｒｔｅｎｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、時間分解蛍光シグナルを定量した。結果は、アクセプター蛍光シグナル（Ａ６６５ｎｍ）及びドナー蛍光シグナル（Ａ６２０ｎｍ）の比×１０４から算出し、次式を用いてΔＦ％値として表した：１００×（サンプル比－ネガティブコントロール比）／ネガティブコントロール比。実験では、すべての処理を複数のウェルで並行して測定し、平均ΔＦ％値をさらなる分析のために用いた。アゴニスト活性の値は、フォルスコリンにより刺激されたｃＡＭＰ蓄積の阻害のパーセンテージとして算出し、同じ実験で試験した最大有効濃度のドーパミンによって誘発された反応に対して正規化した。すべての算出を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（登録商標）（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社 、Ｒｅｄｍｏｎｄ、ＷＡ、ＵＳＡ）を用いて行った。表５に示すｐＥＣ５０値（フォルスコリンにより刺激されたｃＡＭＰ蓄積を５０％阻害するアゴニスト濃度の負の対数、ｍｏｌ／リットルで表される）を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ社、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、下方漸近線をゼロに制限し、４パラメーターのシグモイド曲線を濃度－効果データに当てはめることにより得た。これらの結果から、本開示の例が、ヒト組換えＤ２Ｌ受容体のＧタンパク質共役シグナル伝達経路の強力なアゴニストであることが示される。
ヒトＤ２Ｌ受容体におけるアゴニスト活性を、ｃＡＭＰ Ｇｉキット（Ｃｉｓｂｉｏ／ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いて、均一系時間分解蛍光法（ＨＴＲＦ（登録商標）：ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ ｔｉｍｅ－ｒｅｓｏｌｖｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）により、ヒトＤ２Ｌ受容体（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ社、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ、ＵＳＡ）を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞においてｃＡＭＰレベルを測定することによりアッセイした。ヒトＤ２Ｌ受容体を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞を、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン抗マイコ溶液、及びＧ４１８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）８００μｇ／ｍＬを補充したＨａｍのＦ１２培地で培養し、ＣＯ２ ５．０％を含有する加湿雰囲気下で３７℃に維持した。ｃＡＭＰ測定のために、凍結保存した細胞を解凍し、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）ＡｓｓａｙＣｏｍｐｌｅｔｅ（商標）Ｃｅｌｌ Ｐｌａｔｉｎｇ ２（ＣＰ２）試薬（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ社）中で、半分の面積の白壁の９６ウェルプレートにウェル当たり１０，０００細胞で播種し、ＣＯ２ ５．０％を含む加湿雰囲気下で、３７℃で終夜インキュベートした。ｃＡＭＰ測定前に、ＣＰ２試薬を細胞から除去し、１００μＭ ＩＢＭＸを補充した、２０μＬの化合物又はビヒクル含有アッセイ緩衝液（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ２－［４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル］エタン－１－スルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、１０ｍＭグルコース、ｐＨ７．４）と置き換え、周囲温度で２０分間インキュベートした。０．５μＭフォルスコリン（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ社）により周囲温度でさらに３０分間インキュベートした後、細胞刺激を、溶解緩衝液で希釈した検出試薬（ｃＡＭＰ－ｄ２ ２０μＬ及び抗ｃＡＭＰクリプテート２０μＬ、Ｃｉｓｂｉｏ／ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を加えることにより停止した。周囲温度で６０分間インキュベートした後、レーザー励起が３３７ｎｍの標準ＨＴＲＦ（登録商標）設定を用いたＰＨＥＲＡｓｔａｒ ＦＳマルチモードリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ社、Ｏｒｔｅｎｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、時間分解蛍光シグナルを定量した。結果は、アクセプター蛍光シグナル（Ａ６６５ｎｍ）及びドナー蛍光シグナル（Ａ６２０ｎｍ）の比×１０４から算出し、次式を用いてΔＦ％値として表した：１００×（サンプル比－ネガティブコントロール比）／ネガティブコントロール比。実験では、すべての処理を複数のウェルで並行して測定し、平均ΔＦ％値をさらなる分析のために用いた。アゴニスト活性の値は、フォルスコリンにより刺激されたｃＡＭＰ蓄積の阻害のパーセンテージとして算出し、同じ実験で試験した最大有効濃度のドーパミンによって誘発された反応に対して正規化した。すべての算出を、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（登録商標）（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社 、Ｒｅｄｍｏｎｄ、ＷＡ、ＵＳＡ）を用いて行った。表５に示すｐＥＣ５０値（フォルスコリンにより刺激されたｃＡＭＰ蓄積を５０％阻害するアゴニスト濃度の負の対数、ｍｏｌ／リットルで表される）を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ社、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、下方漸近線をゼロに制限し、４パラメーターのシグモイド曲線を濃度－効果データに当てはめることにより得た。これらの結果から、本開示の例が、ヒト組換えＤ２Ｌ受容体のＧタンパク質共役シグナル伝達経路の強力なアゴニストであることが示される。
【0099】
【表7】
【0100】
ヒトドーパミンＤ２Ｌ受容体に対するβ－アレスチンリクルートの測定
タグ化ヒトＤ２Ｌ受容体及びタグ化β－アレスチン－２（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ社、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ、ＵＳＡ）を発現するＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）ＣＨＯ－Ｋ１細胞を、壁面が白く底が透明な９６ウェル組織培養プレートに、細胞当たり９０μＬのＡｓｓａｙＣｏｍｐｌｅｔｅ（商標）Ｃｅｌｌ Ｐｌａｔｉｎｇ ２（ＣＰ２）試薬（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ社）中に、ウェル当たり２０，０００細胞の密度で播種した。プレートを、３７℃でＣＯ２ ５％を含む加湿雰囲気下で終夜インキュベートした。２０～２４時間後、ＣＰ２試薬中の及び２．２％ＤＭＳＯ含有する試験化合物又はビヒクル２０μＬを、細胞に加え、それらを３７℃で９０分間インキュベートした。次いで、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）検出試薬（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ社）をウェル当たり５５μＬ加え、プレートを２５℃で６０分間インキュベートし、その後、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ（登録商標）ＦＳマルチモードプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ社、Ｏｒｔｅｎｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて発光を検出した。生データを、基底値を上回る刺激パーセントに変換した。値を、３０μＭドーパミンによるβ－アレスチンリクルートの最大刺激パーセントにさらに変換した。ＥＣ５０値を、Ｏｒｉｇｉｎ（登録商標）７．５ソフトウェア（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて、シグモイダルフィッティングにより２連で実行した、少なくとも６種の濃度の濃度－反応曲線から算出し、刺激が最大半減であるアゴニストの濃度として定義した。ｐＥＣ５０値を、ｍｏｌ／リットルで表した、ＥＣ５０値の負の対数として算出し、表６に示す。この結果から、本開示の例が、ヒト組換えＤ２Ｌ受容体のＧタンパク質非依存性シグナル伝達経路の強力なアゴニストであることが示される。
タグ化ヒトＤ２Ｌ受容体及びタグ化β－アレスチン－２（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ社、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ、ＵＳＡ）を発現するＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）ＣＨＯ－Ｋ１細胞を、壁面が白く底が透明な９６ウェル組織培養プレートに、細胞当たり９０μＬのＡｓｓａｙＣｏｍｐｌｅｔｅ（商標）Ｃｅｌｌ Ｐｌａｔｉｎｇ ２（ＣＰ２）試薬（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ社）中に、ウェル当たり２０，０００細胞の密度で播種した。プレートを、３７℃でＣＯ２ ５％を含む加湿雰囲気下で終夜インキュベートした。２０～２４時間後、ＣＰ２試薬中の及び２．２％ＤＭＳＯ含有する試験化合物又はビヒクル２０μＬを、細胞に加え、それらを３７℃で９０分間インキュベートした。次いで、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）検出試薬（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ社）をウェル当たり５５μＬ加え、プレートを２５℃で６０分間インキュベートし、その後、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ（登録商標）ＦＳマルチモードプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ社、Ｏｒｔｅｎｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて発光を検出した。生データを、基底値を上回る刺激パーセントに変換した。値を、３０μＭドーパミンによるβ－アレスチンリクルートの最大刺激パーセントにさらに変換した。ＥＣ５０値を、Ｏｒｉｇｉｎ（登録商標）７．５ソフトウェア（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて、シグモイダルフィッティングにより２連で実行した、少なくとも６種の濃度の濃度－反応曲線から算出し、刺激が最大半減であるアゴニストの濃度として定義した。ｐＥＣ５０値を、ｍｏｌ／リットルで表した、ＥＣ５０値の負の対数として算出し、表６に示す。この結果から、本開示の例が、ヒト組換えＤ２Ｌ受容体のＧタンパク質非依存性シグナル伝達経路の強力なアゴニストであることが示される。
【0101】
【表8】
【0102】
ヒトＤ３受容体を用いた試験
［３Ｈ］ラクロプリドを用いた競合的結合アッセイにおけるヒトＤ３受容体の親和性の決定
組換えヒトＤ３受容体（ＤＲＤ３、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ Ｕ３２４９９、Ｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ Ｆａｓｔ社、Ｂｒｕｓｓｅｌｓ、ＢＥから購入）を発現する細胞培養（ＣＨＯ－Ｋ１）を、４×緩衝（ｖ／ｖ）溶液（１５ｍＭ Ｔｒｉｓ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．３ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、ｐＨ７．４、２５℃）中でＤｏｕｎｃｅ組織粉砕機を用いてホモジナイズし、４℃で２５分間４０，０００×ｇで遠心分離した。上澄みを除去し、ペレットを４×（ｖ／ｖ）緩衝液に再懸濁し、遠心分離した。本プロセスを、２回繰り返し、ペレットを保存緩衝液（７５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．３ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、２５０ｍＭスクロース、ｐＨ７．４、２５℃）に１２．５ｍＬ／ｇ 元の細胞重量で再懸濁した。次いで、膜標本をアリコートし、－７０℃で保存した。
［３Ｈ］ラクロプリドを用いた競合的結合アッセイにおけるヒトＤ３受容体の親和性の決定
組換えヒトＤ３受容体（ＤＲＤ３、ＧｅｎＢａｎｋ ＩＤ Ｕ３２４９９、Ｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ Ｆａｓｔ社、Ｂｒｕｓｓｅｌｓ、ＢＥから購入）を発現する細胞培養（ＣＨＯ－Ｋ１）を、４×緩衝（ｖ／ｖ）溶液（１５ｍＭ Ｔｒｉｓ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．３ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、ｐＨ７．４、２５℃）中でＤｏｕｎｃｅ組織粉砕機を用いてホモジナイズし、４℃で２５分間４０，０００×ｇで遠心分離した。上澄みを除去し、ペレットを４×（ｖ／ｖ）緩衝液に再懸濁し、遠心分離した。本プロセスを、２回繰り返し、ペレットを保存緩衝液（７５ｍＭ Ｔｒｉｓ、１２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．３ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、２５０ｍＭスクロース、ｐＨ７．４、２５℃）に１２．５ｍＬ／ｇ 元の細胞重量で再懸濁した。次いで、膜標本をアリコートし、－７０℃で保存した。
【0103】
化合物を、ＤＭＳＯ及び結合緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡを含有する）に希釈し、各溶液５０μＬを、５％ＤＭＳＯ－緩衝液中で最終濃度５倍でディープウェルプレート（ＢＲＡＮＤ）に移した。アリコートした膜標本を解凍し、結合緩衝液中で１回洗浄した。同じ緩衝液中で、アッセイ当たりタンパク質３．３μｇを、試験化合物の存在下又は非存在下で、９６ウェルディープウェルプレート（ＢＲＡＮＤ）中に約２．７ｎＭ［３Ｈ］ラクロプリド（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いて、２５０μＬの体積で、２５℃で１２０分間インキュベートした。非特異的結合（ＮＳＢ）を、１０μＭハロペリドールの存在下で決定した。ＤＭＳＯの最終濃度は、すべての反応において１％（ｖ／ｖ）であった。インキュベーション後、サンプルを、Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ（商標）ｈａｒｖｅｓｔｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いてＵｎｉＦｉｌｔｅｒ（登録商標）ＧＦ／Ｂプレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）でろ過し、氷冷結合緩衝液４×１ｍＬで洗浄した。プレートを４０℃で１時間乾燥させ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ（商標）－２０シンチレーションカクテル（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）４０μＬを各ウェルに加えた。放射能を、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ２（登録商標）マイクロプレートカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いて決定した。
【0104】
生シンチレーション数を用いて、ＮＳＢを差し引いて、特異的結合を得、これをビヒクル処理したサンプルに正規化し、置換パーセント値に変換した。ＧｒａＦｉｔ ６．０（Ｅｒｉｔｈｒａｃｕｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、Ｈｏｒｌｅｙ、ＵＫ）を曲線フィッティング及び算出のために用いた。ＩＣ５０値（すなわち、特異的結合を５０％抑制する化合物の濃度）を、シグモイダルフィッティングによる濃度－変位曲線から決定した。阻害定数（Ｋｉ）を、チェン－プルソフ方程式を用いて算出した：Ｋｉ＝ＩＣ５０／［１＋（［Ｌ］／ＫＤ）］（式中、［Ｌ］は、放射性リガンド濃度、ＫＤは、受容体に対する標識リガンドの親和性である）。ＫＤを、別個の飽和実験から決定した。表７に示したｐＫｉ値を、ｍｏｌ／リットルで表されるＫｉ値の負の対数を算出することによって導き出した。すべての実験において、サンプルを３連で実行した。これらの結果から、本開示の例は、ヒト組換えＤ３受容体の高親和性リガンドであることが示される。
【0105】
【表9】
【0106】
［３Ｈ］スピペロンを用いた競合的結合アッセイにおけるヒトＤ３受容体の親和性の決定
ヒト組換えＤ３受容体を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞をＰＢＳで洗浄した。細胞をプレートからすり落とし、１０００×ｇで遠心分離した。細胞を、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）ペッスルホモジナイザーを用いて、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ＝７．４）、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＰＭＳＦを含有する緩衝液中で破砕した。懸濁液を１０００×ｇで遠心分離した。上澄みを回収し、４１，０００×ｇで遠心分離した。上澄みを捨て、ペレットを上記の緩衝液に再懸濁した。膜標本をアリコートし、－７０℃で保存した。
ヒト組換えＤ３受容体を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞をＰＢＳで洗浄した。細胞をプレートからすり落とし、１０００×ｇで遠心分離した。細胞を、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）ペッスルホモジナイザーを用いて、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ＝７．４）、６ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＰＭＳＦを含有する緩衝液中で破砕した。懸濁液を１０００×ｇで遠心分離した。上澄みを回収し、４１，０００×ｇで遠心分離した。上澄みを捨て、ペレットを上記の緩衝液に再懸濁した。膜標本をアリコートし、－７０℃で保存した。
【0107】
９６ウェルプレート中、最終反応体積２２２μＬに１％ＤＭＳＯで、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１．４ｍＭアスコルビン酸、０．００１％ウシ血清アルブミン、及び１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）を含有するインキュベーション緩衝液中で、試験化合物の存在下又は非存在下で０．７ｎＭ［３Ｈ］スピペロン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いて３７℃で１２０分間、アリコートした膜標本をインキュベートした。非特異的結合（ＮＳＢ）を、２５μＭ（Ｓ）－（－）－スルピリド（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社）の存在下で決定した。インキュベーション後、サンプルをＧＦ／Ｃフィルタープレート（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）でろ過し、洗浄し、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ（商標）－２０シンチレーションカクテルを加えた。放射能を、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ２（登録商標）マイクロプレートカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）において決定した。
【0108】
生シンチレーション数から、ＮＳＢを差し引いて、特異的結合を得、これをビヒクル処理したサンプルに正規化し、置換％値に変換した。ＩＣ５０値を、ＭａｔｈＩＱ（商標）（ＩＤ Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｌｔｄ．、Ｓｕｒｒｅｙ、ＵＫ）を用いた非線形最小二乗回帰分析により決定した。Ｋｉ値を、被検化合物の観察されたＩＣ５０、アッセイに使用した放射性リガンドの濃度、及びリガンドのＫＤの既存の値（ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ ｖａｌｕｅ）を用いたチェン－プルソフ式を用いて算出した。表８に示したｐＫｉ値を、ｍｏｌ／リットルで表されるＫｉ値の負の対数を算出することによって導き出した。これらの結果から、本開示の例は、［３Ｈ］スピペロンを放射性リガンドとして用いる場合、ヒト組換えＤ３受容体の高親和性リガンドであることが示される。
【0109】
【表10】
【0110】
環状アデノシン一リン酸検出を用いたヒトＤ３受容体のアゴニズムの特徴付け
ヒトＤ３受容体におけるアゴニスト活性を、ｃＡＭＰ Ｇｉキット（Ｃｉｓｂｉｏ／ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いた均一時間分解蛍光法（ＨＴＲＦ）により、アデニルシクラーゼＶ（ＡＣＶ）を安定的に共発現させている組換えヒトＤ３受容体（ＢｉｏＸｔａｌ、Ｓａｉｎｔ－Ｆｅｌｉｘ、Ｆｒａｎｃｅ）を発現するＨＥＫ２９３細胞（Ｇｅｄｅｏｎ Ｒｉｃｈｔｅｒにより開発された細胞株）においてｃＡＭＰレベルによりアッセイした。組換えヒトＤ３受容体及びＡＣＶを発現しているＨＥＫ２９３細胞を、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン抗マイコ溶液、１％ピルベート、１００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、及び６０μｇ／ｍＬハイグロマイシンＢを補充したＤＭＥＭ中で培養し、ＣＯ２ ５％を含有する加湿雰囲気下で３７℃に維持した。ｃＡＭＰを測定する前に、細胞を、Ｖｅｒｓｅｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で剥離し、壁面が白く半分の面積の９６ウェルマイクロプレートに、アッセイ緩衝液（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ２－［４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル］エタン－１－スルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、１０ｍＭグルコース、ｐＨ７．４）にウェル当たり１５，０００細胞の密度で２０μＬの体積で懸濁した。アッセイ緩衝液を、１００μＭ ＩＢＭＸ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）で補充した。ウェル当たり１０μＬで試験化合物（４×濃縮した）又はビヒクル（ＤＭＳＯ）を加えた後、細胞をアッセイ緩衝液又は様々な濃度の試験化合物で２０分間インキュベートした。１．５μＭフォルスコリン（ＤＭＳＯ最終濃度は、０．３％であった。）により周囲温度でさらに３０分間インキュベートした後、細胞刺激を、溶解緩衝液（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）に希釈した検出試薬（ｃＡＭＰ－ｄ２ ２０μＬ及び抗ｃＡＭＰクリプテート２０μＬ）を加えることにより停止した。周囲温度で６０分間インキュベートした後、レーザー励起が３３７ｎｍの標準ＨＴＲＦ設定を用いたＰＨＥＲＡｓｔａｒ ＦＳマルチモードリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ社、Ｏｒｔｅｎｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、時間分解蛍光シグナル（ＴＲＦ）を定量した。
ヒトＤ３受容体におけるアゴニスト活性を、ｃＡＭＰ Ｇｉキット（Ｃｉｓｂｉｏ／ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いた均一時間分解蛍光法（ＨＴＲＦ）により、アデニルシクラーゼＶ（ＡＣＶ）を安定的に共発現させている組換えヒトＤ３受容体（ＢｉｏＸｔａｌ、Ｓａｉｎｔ－Ｆｅｌｉｘ、Ｆｒａｎｃｅ）を発現するＨＥＫ２９３細胞（Ｇｅｄｅｏｎ Ｒｉｃｈｔｅｒにより開発された細胞株）においてｃＡＭＰレベルによりアッセイした。組換えヒトＤ３受容体及びＡＣＶを発現しているＨＥＫ２９３細胞を、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン－ストレプトマイシン抗マイコ溶液、１％ピルベート、１００μｇ／ｍＬ Ｇ４１８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）、及び６０μｇ／ｍＬハイグロマイシンＢを補充したＤＭＥＭ中で培養し、ＣＯ２ ５％を含有する加湿雰囲気下で３７℃に維持した。ｃＡＭＰを測定する前に、細胞を、Ｖｅｒｓｅｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）で剥離し、壁面が白く半分の面積の９６ウェルマイクロプレートに、アッセイ緩衝液（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ２－［４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル］エタン－１－スルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、１０ｍＭグルコース、ｐＨ７．４）にウェル当たり１５，０００細胞の密度で２０μＬの体積で懸濁した。アッセイ緩衝液を、１００μＭ ＩＢＭＸ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ社、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）で補充した。ウェル当たり１０μＬで試験化合物（４×濃縮した）又はビヒクル（ＤＭＳＯ）を加えた後、細胞をアッセイ緩衝液又は様々な濃度の試験化合物で２０分間インキュベートした。１．５μＭフォルスコリン（ＤＭＳＯ最終濃度は、０．３％であった。）により周囲温度でさらに３０分間インキュベートした後、細胞刺激を、溶解緩衝液（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）に希釈した検出試薬（ｃＡＭＰ－ｄ２ ２０μＬ及び抗ｃＡＭＰクリプテート２０μＬ）を加えることにより停止した。周囲温度で６０分間インキュベートした後、レーザー励起が３３７ｎｍの標準ＨＴＲＦ設定を用いたＰＨＥＲＡｓｔａｒ ＦＳマルチモードリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ社、Ｏｒｔｅｎｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、時間分解蛍光シグナル（ＴＲＦ）を定量した。
【0111】
結果を、アクセプター蛍光シグナル（Ａ６６５ｎｍ）及びドナー蛍光シグナル（Ａ６２０ｎｍ）×１０４の比から算出し、次式を用いてΔＦ％値として表した：１００×（サンプル比－ネガティブコントロール比）／ネガティブコントロール比。すべての実験において、複数のウェルを並行して測定し、平均ΔＦ％値をさらなる分析に用いた。アゴニスト活性の値は、フォルスコリンにより刺激されたｃＡＭＰ蓄積の阻害のパーセンテージとして算出し、同じ実験で試験した最大有効濃度のドーパミンによって誘発された反応に対して正規化した。すべての算出を、Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ社、Ｒｅｄｍｏｎｄ、ＷＡ、ＵＳＡ）を用いて行った。ｐＥＣ５０値（ｍｏｌ／リットルで表される、フォルスコリンにより刺激されたｃＡＭＰ蓄積を５０％阻害するアゴニスト濃度の負の対数）を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、下方漸近線をゼロに制限し、４パラメーターのシグモイド曲線を濃度－効果データに当てはめることにより得て、表９に示した。この結果から、本開示の例が、ヒト組換えＤ３受容体のＧタンパク質依存性シグナル伝達経路の強力なアゴニストであることが示される。
【0112】
【表11】
【0113】
ヒトドーパミンＤ３受容体に対するβ－アレスチンリクルートの測定
タグ化ヒトＤ３受容体及びタグ化β－アレスチン－２（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ社、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ、ＵＳＡ）を発現するＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）ＣＨＯ－Ｋ１細胞を、壁面が白く底が透明な９６ウェル組織培養プレートに、９０μＬのＡｓｓａｙＣｏｍｐｌｅｔｅ（商標）Ｃｅｌｌ Ｐｌａｔｉｎｇ ２（ＣＰ２）試薬（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ社）中に、ウェル当たり２５，０００細胞の密度で播種し、３７℃でＣＯ２ ５％で加湿雰囲気下で終夜インキュベートした。２０～２４時間後、２．２％ＤＭＳＯ含有するＣＰ２試薬中の試験化合物又はビヒクル２０μＬを、細胞に加え、細胞を３７℃で９０分間インキュベートした。インキュベーション後、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）検出試薬（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ社）をウェル当たり５５μＬ加え、プレートを２５℃で６０分間インキュベートし、その後、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ（登録商標）ＦＳマルチモードプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ社、Ｏｒｔｅｎｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて発光を検出した。
タグ化ヒトＤ３受容体及びタグ化β－アレスチン－２（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ社、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ、ＵＳＡ）を発現するＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）ＣＨＯ－Ｋ１細胞を、壁面が白く底が透明な９６ウェル組織培養プレートに、９０μＬのＡｓｓａｙＣｏｍｐｌｅｔｅ（商標）Ｃｅｌｌ Ｐｌａｔｉｎｇ ２（ＣＰ２）試薬（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ社）中に、ウェル当たり２５，０００細胞の密度で播種し、３７℃でＣＯ２ ５％で加湿雰囲気下で終夜インキュベートした。２０～２４時間後、２．２％ＤＭＳＯ含有するＣＰ２試薬中の試験化合物又はビヒクル２０μＬを、細胞に加え、細胞を３７℃で９０分間インキュベートした。インキュベーション後、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）検出試薬（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ社）をウェル当たり５５μＬ加え、プレートを２５℃で６０分間インキュベートし、その後、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ（登録商標）ＦＳマルチモードプレートリーダー（ＢＭＧ Ｌａｂｔｅｃｈ社、Ｏｒｔｅｎｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて発光を検出した。
【0114】
生データを最初に、基底値を上回る刺激％に変換した。基底値を上回る刺激％を、１μＭドーパミンによるβ－アレスチンリクルートの最大刺激％にさらに変換した。ＥＣ５０値を、Ｏｒｉｇｉｎ（登録商標）７．５ソフトウェア（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いて、シグモイダルフィッティングにより２連の、少なくとも６種の濃度の濃度－反応曲線から算出し、刺激が最大半減であるアゴニストの濃度として定義した。表１０に示すｐＥＣ５０値を、ｍｏｌ／リットルで表した、ＥＣ５０値の負の対数として算出した。この結果から、本開示の例が、ヒト組換えＤ３受容体のＧタンパク質非依存性シグナル伝達経路の非常に強力なアゴニストであることが示される。
【0115】
【表12】
【0116】
５－ＨＴ２Ａ受容体アッセイ
競合的結合アッセイにおけるヒト５－ＨＴ２Ａ受容体に対する親和性の決定
受容体膜を、ヒト５－ＨＴ２Ａ受容体を安定的に発現しているＣＨＯ－Ｋ１組換えＡｅｑｕｏＳｃｒｅｅｎ（登録商標）細胞株（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）から調製した。細胞を、緩衝液Ａ（１５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．３ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ）に４×体積で懸濁し（細胞１ｇ － 緩衝液４ｍＬ）、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーでホモジナイズした。粗膜画分を、緩衝液Ａでの洗浄工程によって４０，０００×ｇ、２５分間の連続した２回の遠心分離により分離した後に、回収した。最終ペレットを、緩衝液Ｂ（７５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．３ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、２５０ｍＭスクロース）に０．５ｍＬ緩衝液中で湿潤細胞重量８０ｍｇの濃度で再懸濁し、分注し、ドライアイス上で瞬間凍結した。タンパク質含量を、標準としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む、スルフヒドリル試薬存在下でビシンコニン酸アッセイを用いて決定した。
競合的結合アッセイにおけるヒト５－ＨＴ２Ａ受容体に対する親和性の決定
受容体膜を、ヒト５－ＨＴ２Ａ受容体を安定的に発現しているＣＨＯ－Ｋ１組換えＡｅｑｕｏＳｃｒｅｅｎ（登録商標）細胞株（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）から調製した。細胞を、緩衝液Ａ（１５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．３ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ）に４×体積で懸濁し（細胞１ｇ － 緩衝液４ｍＬ）、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーでホモジナイズした。粗膜画分を、緩衝液Ａでの洗浄工程によって４０，０００×ｇ、２５分間の連続した２回の遠心分離により分離した後に、回収した。最終ペレットを、緩衝液Ｂ（７５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１２．５ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．３ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、２５０ｍＭスクロース）に０．５ｍＬ緩衝液中で湿潤細胞重量８０ｍｇの濃度で再懸濁し、分注し、ドライアイス上で瞬間凍結した。タンパク質含量を、標準としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む、スルフヒドリル試薬存在下でビシンコニン酸アッセイを用いて決定した。
【0117】
結合実験では、ウェル当たりの膜標本のタンパク質１５μｇ及び放射性リガンドとして１ｎＭ塩酸ケタンセリン、［エチレン－３Ｈ］（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を、インキュベーション緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．３％ＢＳＡ、ｐＨ７．４）中で、化合物又はビヒクル（ＤＭＳＯ、最終濃度１％（ｖ／ｖ））でインキュベートした。非特異的結合（ＮＳＢ）を、１μＭ ミアンセリン塩酸塩（Ｔｏｃｒｉｓ社、Ｂｒｉｓｔｏｌ、ＵＫ）の存在下で決定した。サンプルを、最終体積２５０μＬで２５℃で１５分間インキュベートした。結合反応を、０．５％（ｖ／ｖ）のポリエチレンイミン（ＰＥＩ、蒸留水に溶解）に少なくとも１時間予め浸漬したＵｎｉＦｉｌｔｅｒ（登録商標）ＧＦ／Ｃプレートを用いて、Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ（商標）ハーベスター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を通して急速ろ過することにより終了させた。フィルタープレートを、氷冷洗浄緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４）０．５ｍＬで３回洗浄した。洗浄したフィルタープレートを、４０℃で６０分間乾燥させ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｎｔ（商標）－２０シンチレーションカクテル（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）４０μＬを各ウェルに加えた。放射能を、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ２（登録商標）マイクロプレートカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を用いて決定した。
【0118】
非特異的結合を生のシンチレーションカウントから差し引いて、特異的結合を生成し、これをビヒクル処理したサンプルに正規化し、置換％値に変換した。ＩＣ５０値（すなわち、特異的に結合した放射性リガンドの５０％を変位する化合物の濃度）を、Ｏｒｉｇｉｎ（登録商標）７．５．ソフトウェア（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ（登録商標）Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）を用いたシグモイダルフィッティングにより、濃度－変位曲線から決定した。表１１に示すＫｉ値（すなわち、阻害定数）を、チェン－プルソフ式を用いて算出した：Ｋｉ＝ＩＣ５０／［１＋（［Ｌ］／ＫＤ）］（式中、［Ｌ］は、用いた放射性リガンド濃度であり、シンチレーションカウントにより決定され、ＫＤは、別の実験において決定された標識リガンドの受容体に対する親和性である）。競合的結合アッセイは、２つの独立した実験において、最低６種の濃度で行い、各濃度を３回繰り返した。表１１に示したｐＫｉ値を、ｍｏｌ／リットルで表されるＫｉ値の負の対数を算出することによって導き出した。これらの結果から、本開示の例は、ヒト組換え５－ＨＴ２Ａ受容体のリガンドであることが示される。
【0119】
【表13】
【0120】
蛍光Ｃａ２＋検出を用いたヒト５－ＨＴ２Ａ受容体におけるアンタゴニズムの特徴付け
培養下でヒト組換え５－ＨＴ２Ａ受容体及びＧα１６（Ｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ Ｆａｓｔ社、Ｂｒｕｓｓｅｌｓ、ＢＥより購入）を発現しているＣＨＯ－Ｋ１細胞を、培地として９０％ＦＢＳ／１０％ＤＭＳＯを用いて、確立されたプロトコールに従って凍結保存した。実験前に、細胞を解凍し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン抗マイコ溶液、及び１％ピルベートを補充したＰｏｗｅｒＣＨＯ（商標）２培地（Ｌｏｎｚａ社、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に再懸濁した。細胞を、９６ウェルマイクロプレートにウェル当たり４０，０００細胞の密度で播種し、ＣＯ２ ５．０％を含有する加湿雰囲気下で、３７℃で終夜インキュベートした。実験当日、プレートを、プレート洗浄器（Ｅｌｘ４０５ＵＣＷＳ、Ｂｉｏｔｅｋ社、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ、ＵＳＡ）を用いて、アッセイ緩衝液（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ２－［４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル］エタン－１－スルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、１０ｍＭグルコース、２ｍＭプロベネシド、ｐＨ７．４）で洗浄し、次いで、アッセイ緩衝液中の４μＭ Ｆｌｕｏ－４ ＡＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）をウェル当たり５０μＬ加えた。色素を負荷した後（６０分、３７℃、暗所）、プレートを、プレート洗浄器を用い、アッセイ緩衝液で洗浄しウェル当たり５０μＬの体積を残したままにし、次いで、ビヒクル（アッセイ緩衝液中３％ＤＭＳＯ）又は試験化合物（最終濃度の３×）を含有する、ウェル当たり５０μＬのアッセイ緩衝液を加え、細胞を３７℃でさらに１０分間インキュベートした。
培養下でヒト組換え５－ＨＴ２Ａ受容体及びＧα１６（Ｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ Ｆａｓｔ社、Ｂｒｕｓｓｅｌｓ、ＢＥより購入）を発現しているＣＨＯ－Ｋ１細胞を、培地として９０％ＦＢＳ／１０％ＤＭＳＯを用いて、確立されたプロトコールに従って凍結保存した。実験前に、細胞を解凍し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン抗マイコ溶液、及び１％ピルベートを補充したＰｏｗｅｒＣＨＯ（商標）２培地（Ｌｏｎｚａ社、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に再懸濁した。細胞を、９６ウェルマイクロプレートにウェル当たり４０，０００細胞の密度で播種し、ＣＯ２ ５．０％を含有する加湿雰囲気下で、３７℃で終夜インキュベートした。実験当日、プレートを、プレート洗浄器（Ｅｌｘ４０５ＵＣＷＳ、Ｂｉｏｔｅｋ社、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ、ＵＳＡ）を用いて、アッセイ緩衝液（１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ２－［４－（２－ヒドロキシエチル）ピペラジン－１－イル］エタン－１－スルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、１０ｍＭグルコース、２ｍＭプロベネシド、ｐＨ７．４）で洗浄し、次いで、アッセイ緩衝液中の４μＭ Ｆｌｕｏ－４ ＡＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）をウェル当たり５０μＬ加えた。色素を負荷した後（６０分、３７℃、暗所）、プレートを、プレート洗浄器を用い、アッセイ緩衝液で洗浄しウェル当たり５０μＬの体積を残したままにし、次いで、ビヒクル（アッセイ緩衝液中３％ＤＭＳＯ）又は試験化合物（最終濃度の３×）を含有する、ウェル当たり５０μＬのアッセイ緩衝液を加え、細胞を３７℃でさらに１０分間インキュベートした。
【0121】
最終的なＤＭＳＯ濃度は、すべての処理について１％（ｖ／ｖ）であった。これを達成するために、一連のＤＭＳＯ原液を、すべての試験化合物から調製した。原液を、－２０℃で保存し、アッセイ緩衝液にさらに希釈して、測定直前に所望の最終濃度を得た。５－ＨＴを脱イオン限外ろ過水に溶解することにより、５－ＨＴの原液（１０ｍＭ）を調製した。
【0122】
ベースライン及びアゴニスト誘発［Ｃａ２＋］ｉ（細胞内Ｃａ２＋）の変化を、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ（登録商標）ＩＩ ９６ウェルプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてモニターした。ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ（登録商標）ＩＩについての設定は、蛍光イメージングの場合次の通りであった：励起４８５ｎｍ、発光５２５ｎｍ、カットオフフィルター５１５ｎｍ。蛍光測定を、３７℃で行い、ランタイムは４０秒、サンプリング間隔は１．３６秒であった。励起及び検出を、プレートの底を通して行った。ベースラインを、２０秒間記録し、その後、５０μＬの３×濃縮アゴニスト（ＥＣ８０の５－ＨＴ）溶液又はアッセイ緩衝液／ビヒクルを、取り付けられたピペッターを用いて、１５５μＬに対応する高さで７５μＬ／秒ですべてのウェルに加えたとき、アゴニスト刺激を行った。蛍光を、さらに２０秒間モニターした。
【0123】
化合物を、測定ソフトウェア（ＳｏｆｔＭａｘ（登録商標）Ｐｒｏ ５．２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）の一体型曲線フィッティングモジュールで各プレートで決定された通り、ＥＣ８０ ５－ＨＴ濃度に対して評価した。
【0124】
結果を、ΔＦ／Ｆ値として表し、Ｆはアゴニスト投与前及び／又は投与直後の平均蛍光として定義されるベースライン蛍光であり、ΔＦは、アゴニスト投与後の蛍光の増加であり；ΔＦ＝Ｆｍａｘ－Ｆとして算出し、Ｆｍａｘは、リード間の最大蛍光１７～２９であり、Ｆは、蛍光リードの平均２～１３であった。すべての実験では、すべての処理を、複数のウェルで並行して測定し、平均ΔＦ／Ｆを、さらなる分析のために用いた。平均ΔＦ／Ｆ値を、次の式を用いて阻害％（Ｉ％）値に変換した：Ｉ％＝１００×［１－（（ΔＦ／Ｆｃｏｍｐｏｕｎｄ－ΔＦ／Ｆｖｅｈｉｃｌｅ）／（ΔＦ／Ｆｃｏｎｔｒｏｌ－ΔＦ／Ｆｖｅｈｉｃｌｅ））］。試験化合物のＩＣ５０値を、ＳｏｆｔＭａｘ（登録商標）Ｐｒｏソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ社）を用いて、阻害％データにフィットさせた４－パラメーターＳ字濃度効果曲線から決定した。表１２に示したｐＩＣ５０値のさらなる算出を、上記のソフトウェアによってｍｏｌ／リットルとして表されるＩＣ５０値の負の対数を算出することによって導き出した。これらの結果から、本開示の例は、ヒト組換え５－ＨＴ２Ａ受容体のアンタゴニストであることが示される。
【0125】
【表14】
【0126】
ラットにおけるフェンシクリジン誘発性運動過剰
自発運動活性（Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｌｏｃｏｍｏｔｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｔｒｉａ Ｌｔｄ．（Ｂｕｄａｐｅｓｔ、ＨＵ）により製造された６－チャンネル活動モニターを用いて測定した。装置は、水平歩行行動を検出するために、ケージの底に近い、壁面に３０対の光電管を２倍装備したアクリル製ケージ（４８．５ｃｍ×４８．５ｃｍ×４０ｃｍ）で構成された。飼育反応を検出するために、ケージの反対側の側面に沿って、異なる高さ（６．５ｃｍ、１２ｃｍ、１８ｃｍ及び２３ｃｍ）で追加の光電管アレイ（３０対）を設置した。光電管のビームが切れたことにより引き起こされる信号を、運動解析ソフトウェア（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｔｒｉａ社）により処理し、１Ｈｚのサンプリング周波数で動物の空間位置を決定し、ラットが歩行するのに費やした時間をコンピュータで算出した。
自発運動活性（Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ ｌｏｃｏｍｏｔｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ）を、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｔｒｉａ Ｌｔｄ．（Ｂｕｄａｐｅｓｔ、ＨＵ）により製造された６－チャンネル活動モニターを用いて測定した。装置は、水平歩行行動を検出するために、ケージの底に近い、壁面に３０対の光電管を２倍装備したアクリル製ケージ（４８．５ｃｍ×４８．５ｃｍ×４０ｃｍ）で構成された。飼育反応を検出するために、ケージの反対側の側面に沿って、異なる高さ（６．５ｃｍ、１２ｃｍ、１８ｃｍ及び２３ｃｍ）で追加の光電管アレイ（３０対）を設置した。光電管のビームが切れたことにより引き起こされる信号を、運動解析ソフトウェア（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｔｒｉａ社）により処理し、１Ｈｚのサンプリング周波数で動物の空間位置を決定し、ラットが歩行するのに費やした時間をコンピュータで算出した。
【0127】
試験化合物を、治療群当たり動物１０匹で、試験動物に経口又は皮下で投与した。これらの研究では、体重１９０～２１０グラムの雄のハーラン－ウィスターラット（Ｔｏｘｉ－Ｃｏｏｐ社、Ｂｕｄａｐｅｓｔ、ＨＵ）を用いた。試験化合物又はビヒクルを経口投与した後、動物を、個別に３０分間活動モニターに慣らした。試験化合物を皮下投与した場合では、ラットを、最初に活動モニターに１５分間慣れさせ、次いで、試験化合物又はビヒクルで処置し、その後、さらに１５分間慣れさせるために活動モニターに戻した。慣れさせた後、ラットを、皮下にフェンシクリジン塩酸塩（ＰＣＰ）で処置し、測定時間（１時間）中直ちに実験装置に戻した。
【0128】
データを、ＧｒａｐｈＰａｄ（登録商標）Ｐｒｉｓｍ（登録商標）９ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ社、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて解析した。統計評価を、活動（歩行に費やした時間）の１時間後に行った。薬効を、分散分析（ＡＮＯＶＡ、又は適切な場合、ＷｅｌｃｈのＡＮＯＶＡ）を用い、その後、Ｄｕｎｎｅｔｔの多重比較検定を用いて評価した。適切な場合、ＥＤ５０値を、線形回帰分析から得られた阻害パーセントのデータから決定した。ＥＤ５０値を、表１３に示す。
【0129】
【表15】
【0130】
上記のデータ（表１３）によって、本開示の実施例の化合物が、ラットにおけるフェンシクリジン誘発性運動過剰での良好かつ強力な薬力学的効果／活性を示したことが示され、それらが、実質的な統合失調症治療薬の有効性を有し得るということが示される。
【0131】
マウスにおけるアポモルフィンによって誘発された登はん（ｃｌｉｍｂｉｎｇ）及び嗅ぐ動作
体重２４～２９ｇの雄性ＣＤ１（登録商標）マウス（Ｅｎｖｉｇｏ社、Ｈｏｒｓｔ、ＮＬ）を実験に用いた（処置群当たりｎ＝１２）。登はん及び嗅ぐ動作を、円筒形のケージ内での目視観察によって測定した。ケージは、高さ１５ｃｍ、直径１２ｃｍであり、直径２ｍｍ及び１ｃｍ間隔の垂直の金属棒の壁が、平滑なプラスチックの表面にはめ込まれていた。
体重２４～２９ｇの雄性ＣＤ１（登録商標）マウス（Ｅｎｖｉｇｏ社、Ｈｏｒｓｔ、ＮＬ）を実験に用いた（処置群当たりｎ＝１２）。登はん及び嗅ぐ動作を、円筒形のケージ内での目視観察によって測定した。ケージは、高さ１５ｃｍ、直径１２ｃｍであり、直径２ｍｍ及び１ｃｍ間隔の垂直の金属棒の壁が、平滑なプラスチックの表面にはめ込まれていた。
【0132】
ビヒクル又は被験化合物の皮下投与直後、動物をケージに入れて１０分間慣らした。１０分間の習慣化期間終了時、アポモルフィン塩酸塩１．５ｍｇ／ｋｇを皮下投与した。処理後、動物を円筒形のケージに戻した。登はん及び嗅ぐ挙動の測定は、アポモルフィン処置の１０分後（その処置から１１分）に開始し、１６分間続いた。全行程、登はん挙動を次の通りスコア化した：足４本が床に四つん這いである（０点）、前足が鉄棒に接触している（１点）、足４本が鉄棒をつかんでいる（２点）。動物はまた、次の動作に従って、常同症の尺度として、反復的な嗅ぐ動作を評定した：嗅ぐ動作（０点）、中程度の嗅ぐ動作でケージの壁又は床にほとんど鼻を接触させない（１点）、一定の嗅ぐ動作で、絶え間なく鼻を接触させる（２点）。
【0133】
データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ社）を用いて分析した。両挙動のスコアを、個体毎に集計し（あり得る最高スコア３２点）、群平均を算出した。薬効を、アポモルフィンによって誘発された挙動の抑制パーセントとして算出した。抑制パーセンテージのデータから、用量反応曲線をプロットし、ＥＤ５０を単純線形回帰によってＥＤ５０値をコンピュータで算出した。
【0134】
【表16】
【0135】
上記のデータ（表１４）によって、本開示の例の化合物が、マウスにおけるアポモルフィンによって誘発された登はん及び嗅ぐ動作において良好かつ強力な薬力学的効果／活性を示すことが示され、それらは、実質的な統合失調症治療薬の有効性を有し得るということが示されている。
【0136】
前述の詳細な説明及び添付の例が、単に例示的なものであり、添付の特許請求の範囲及びそれらの均等物により単独で定義される、本開示の範囲において限定されるものと解釈するべきではないということが理解される。開示された実施形態への様々な変更及び修正は、当業者には明らかである。それだけに限らないが、本開示の化学構造、置換基、誘導体、中間体、合成、配合物及び／又は使用の方法に関するものを含めた、かかる変更及び修正は、その精神及び範囲から逸脱することなくなされ得る。本明細書中で引用したすべての刊行物、特許、及び特許出願は、あらゆる目的のために参照によりその全体を本明細書に組み込む。
【外国語明細書】