(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024099081
(43)【公開日】2024-07-25
(54)【発明の名称】ＮＴ３発現増強用組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 31/352 20060101AFI20240718BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240718BHJP
【ＦＩ】
A61K31/352
A61P43/00 111
【審査請求】未請求
【請求項の数】2
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023002754
(22)【出願日】2023-01-12
(71)【出願人】
【識別番号】593106918
【氏名又は名称】株式会社ファンケル
(74)【代理人】
【識別番号】100162396
【弁理士】
【氏名又は名称】山田 泰之
(74)【代理人】
【識別番号】100194803
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 理弘
(72)【発明者】
【氏名】上野（坂井） 友美
【テーマコード（参考）】
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C086AA01
4C086AA02
4C086BA08
4C086MA02
4C086MA04
4C086NA05
4C086ZC02
(57)【要約】 （修正有）
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ガランギン、ケンフェロールのいずれか、または両方を有効成分として含有する、ＮＴ３の発現増強用組成物。
【請求項2】
ガランギン、ケンフェロールのいずれか、または両方が、植物抽出物由来である、請求項１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ＮＴ３の発現増強作用を有する組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ－３（ＮＴ３）は、ＮＧＦ（Ｎｅｒｖｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ）ファミリーに属する神経栄養因子の１つである。ＮＴ３は主として中枢神経や末梢神経、シナプスで発現し、Ｔｒｋレセプターを通したシグナル伝達を行う。海馬や小脳などでは、ＮＴ３が絶えず産生され、神経細胞及びグリア細胞の生存と成長、神経新生の促進に関与することが知られている。また、非特許文献１ではＮＴ３がシナプスの興奮を促し、神経伝達の促進に作用することが報告されており、非特許文献２では、加齢性難聴と内耳細胞におけるＮＴ３発現の関係が報告されるなど、神経系における役割が注目されている。
【0003】
一方、ＮＴ３は視覚機能における役割も報告されている。網膜に達した光は視細胞が受容して電気信号へと変換されるが、ＮＴ３は視細胞を光刺激などによるダメージから保護する作用があること、視細胞の分化や再生を促進する作用があることが非特許文献３に記載されている。また、ＮＴ３は網膜の支持細胞であるミュラー細胞に作用し、視細胞変性抑制作用が知られているｂＦＧＦの発現を増強する作用も報告されており、直接的にも間接的にも視細胞に保護的な作用をもたらす。網膜中でＮＴ３を産生する主要な細胞の１つにミュラー細胞がある。
これらの先行技術から、中枢神経系や末梢神経系において、神経栄養因子であるＮＴ３の役割の重要性が注目されており、例えば、本出願人は、特許文献１において、ケルセチンを有効成分として含有するＮＴ３の発現増強用組成物を提案している。
これらの先行技術から、中枢神経系や末梢神経系において、神経栄養因子であるＮＴ３の役割の重要性が注目されており、例えば、本出願人は、特許文献１において、ケルセチンを有効成分として含有するＮＴ３の発現増強用組成物を提案している。
【0004】
ガランギンは、ナンキョウ（Ａｌｐｉｎｉａ ｇａｌａｎｇａ）の地下茎等に含まれる天然フラボノールの一種である。ガランギンには、抗炎症効果、活性酸素消去酵素の発現促進効果（特許文献２）、肝虚血再灌流障害の緩和効果、アルツハイマーの原因であるβアミロイドタンパク質前躯体（ＡＰＰ）のＢＡＣＥ阻害剤としての用途（特許文献３）、ｂＦＧＦの発現増強作用（特許文献４）などが知られている。
ケンフェロールは、茶、キャベツ、ブロッコリー等に含まれる天然フラボノールの一種である。ケンフェロールには、Ｔｈ２サイトカイン発現抑制作用（特許文献５）、抗アレルギー作用（特許文献６）などが知られている。
しかし、ガランギンとケンフェロールについて、ＮＴ３の発現に関わる作用や用途は、これまで知られていない。
ケンフェロールは、茶、キャベツ、ブロッコリー等に含まれる天然フラボノールの一種である。ケンフェロールには、Ｔｈ２サイトカイン発現抑制作用（特許文献５）、抗アレルギー作用（特許文献６）などが知られている。
しかし、ガランギンとケンフェロールについて、ＮＴ３の発現に関わる作用や用途は、これまで知られていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】特開２０２１－４８８１８号公報
【特許文献2】特開２００７－３２６７９９号公報
【特許文献3】国際公開第２０１３／１４２３７０号
【特許文献4】特開２０２０－１４７５１７号公報
【特許文献5】特開２００１－１１４６８６号公報
【特許文献6】国際公開第２００６／０９３１９４号
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Ｎａｔｕｒｅ． １９９３ Ｍａｙ ２７；３６３（６４２７）：３５０－３．
【非特許文献2】Ｅｌｉｆｅ． ２０１４ Ｏｃｔ ２０；３．
【非特許文献3】Ｎｅｕｒｏｎ． ２０００ Ｍａｙ；２６（２）：５３３－４１．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、新規なＮＴ３の発現を増強する組成物を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明の課題を解決するための手段は、以下の通りである。
（１）ガランギン、ケンフェロールのいずれか、または両方を有効成分として含有する、ＮＴ３の発現増強用組成物。
（２）ガランギン、ケンフェロールのいずれか、または両方が、植物抽出物由来である、（１）に記載の組成物。
（１）ガランギン、ケンフェロールのいずれか、または両方を有効成分として含有する、ＮＴ３の発現増強用組成物。
（２）ガランギン、ケンフェロールのいずれか、または両方が、植物抽出物由来である、（１）に記載の組成物。
【発明の効果】
【0009】
本発明により、ガランギン、ケンフェロールのいずれか、または両方を有効成分とする、新規なＮＴ３の発現を増強する作用を有する組成物が提供される。本発明の組成物により、中枢神経系や末梢神経系の生成、機能維持、保護作用が期待できる。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【発明を実施するための形態】
【0011】
本発明について具体的に説明する。
本発明でいう「組成物」とは、ガランギン、ケンフェロールのいずれか、または両方を含有し、ＮＴ３の発現を増強するものをいう。本発明の組成物は、ガランギン、ケンフェロールのいずれか、または両方を含有すること以外は特に制限されず、飲食品、医薬品、健康食品、動物用飼料等を包含する。
本発明でいう「組成物」とは、ガランギン、ケンフェロールのいずれか、または両方を含有し、ＮＴ３の発現を増強するものをいう。本発明の組成物は、ガランギン、ケンフェロールのいずれか、または両方を含有すること以外は特に制限されず、飲食品、医薬品、健康食品、動物用飼料等を包含する。
【0012】
本発明に用いるガランギン、ケンフェロールとしては、その由来を特に限定されるものではない。しかし安全性の観点から、植物由来のものが好ましい。
ガランギン（ｇａｌａｎｇｉｎ、Ｃ１５Ｈ１０Ｏ５）、ケンフェロール（ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ、Ｃ１５Ｈ１０Ｏ６）を植物から抽出する場合、抽出方法は、特に制限されないが、熱水抽出法、二相溶媒分配法、分配高速クロマトグラフィー法等を用いることができる。
ガランギン（ｇａｌａｎｇｉｎ、Ｃ１５Ｈ１０Ｏ５）、ケンフェロール（ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ、Ｃ１５Ｈ１０Ｏ６）を植物から抽出する場合、抽出方法は、特に制限されないが、熱水抽出法、二相溶媒分配法、分配高速クロマトグラフィー法等を用いることができる。
【0013】
抽出溶媒としては、水、メタノール、エタノール、プロパノール等のアルコール類、アセトンやメチルエチルケトン等のケトン類、アセトニトリル等のニトリル類、テトラヒドロフランやジエチルエーテルなどのエーテル類、ジクロロメタンやクロロホルム等のハロゲン化炭化水素類、酢酸エチルや蟻酸エチルなどのエステル類、ヘキサン等の１種または２種以上を使用することができ、これらの中で、水、アルコール類、水とアルコール類の混合溶媒が好ましく、また、アルコール類としてはエタノールが好ましい。抽出温度は、通常、０～１００℃の範囲内であり、５～５０℃であることが好ましい。抽出溶媒量は、被抽出物に対して１～１００倍、好ましくは５～１０倍である。また、ガランギン、ケンフェロールのいずれか、または両方を含有する市販品の抽出物を用いることもできる。 ガランギン、ケンフェロールが植物抽出物由来である場合、得られたままの抽出液、精製や濃縮をした抽出エキス、あるいは、減圧濃縮、スプレ－ドライまたは凍結乾燥等の方法で粉末化したものを使用することができる。
【0014】
ガランギン、ケンフェロールをヒトに投与する場合は、経口投与が好ましく、具体的には、飲食品、医薬品、サプリメント等の健康食品として使用可能である。
ガランギン、ケンフェロールを食品・飲料として使用する場合、例えば、果汁飲料、炭酸飲料、茶系飲料、乳飲料、アルコール飲料、清涼飲料等の飲料、ゼリー状食品や各種スナック類、焼き菓子、ケーキ類、チョコレート、ガム、飴、スープ類等、あらゆる食品・飲料形態とすることができる。
ガランギン、ケンフェロールを食品・飲料として使用する場合、例えば、果汁飲料、炭酸飲料、茶系飲料、乳飲料、アルコール飲料、清涼飲料等の飲料、ゼリー状食品や各種スナック類、焼き菓子、ケーキ類、チョコレート、ガム、飴、スープ類等、あらゆる食品・飲料形態とすることができる。
【0015】
また、ガランギン、ケンフェロールのいずれか、または両方をサプリメントや医薬品として使用する場合、例えば、錠剤、顆粒剤等の経口用固形成形剤、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤として利用することができる。
【0016】
ガランギン、ケンフェロールのいずれか、または両方を医薬品やサプリメントの製剤とする場合は、ガランギン、ケンフェロールのいずれか、または両方を一般的な製造法により、直接又は製剤上許容し得る担体とともに混合、分散した後、所望の形態に加工することによって、容易に得ることができる。この場合、本発明に用いられる抽出物の他に、かかる形態に一般的に用いられる植物油、動物油等の油性分、ビタミン類、ｐＨ調整剤、防腐剤、増粘剤、色素、香料等を本発明の効果を妨害しない範囲で適宜配合することができる。
【0017】
本発明のガランギン、ケンフェロールのいずれか、または両方を含有する組成物は、特に限定されるものではないが、好ましくは、ガランギンとケンフェロールを合計で、全組成の０．００００１～９９．５質量％の範囲で含有される組成物とする。
【実施例0018】
実施例を示し、本発明についてさらに説明する。
【0019】
（１）初代ミュラー細胞の調製
初代ミュラー細胞は次の方法で調製した。７日齢のＳＤラット１０匹から網膜を単離した。単離した網膜は、ＰＢＳ（－）で５倍希釈したトリプシン－ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ Ｔ３９２４）にＤＮａｃｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）を終濃度１００ｎｇ／ｍｌで添加した溶液１０ｍＬ中で、３７℃で３０分間静置した。ピペッティング操作により網膜組織を分散させ、２，４００ｒｐｍ、室温で５分間遠心した。上清を吸引除去した後、１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｓｅｒａ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）を含むＤＭＥＭ－Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）２５ｍＬに縣濁した。懸濁液を７０μＭのセルストレーナー（ＦＡＬＣＯＮ）に通した後、細胞数を計測し、４．２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度になるよう希釈した。Ｔ－７５細胞培養用フラスコ（住友ベークライト）に１０ｍＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した（培養０日目）。培養３日目に、培地を吸引除去し、新しい培地２０ｍＬに交換し、再び３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。培養７日目に、Ｗｅｉ－Ｔａｏ Ｓｏｎｇらの方法（Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２０１３；６（６）：７７８－７８４）に準じて、ミュラー細胞を純化した。培養８日目に、ミュラー細胞を剥がし、４×１０５ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度になるよう縣濁し、９６ｗｅｌｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ（ＦＡＬＣＯＮ）に１００μＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。
初代ミュラー細胞は次の方法で調製した。７日齢のＳＤラット１０匹から網膜を単離した。単離した網膜は、ＰＢＳ（－）で５倍希釈したトリプシン－ＥＤＴＡ（Ｓｉｇｍａ Ｔ３９２４）にＤＮａｃｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）を終濃度１００ｎｇ／ｍｌで添加した溶液１０ｍＬ中で、３７℃で３０分間静置した。ピペッティング操作により網膜組織を分散させ、２，４００ｒｐｍ、室温で５分間遠心した。上清を吸引除去した後、１０％ＦＢＳ（Ｂｉｏｓｅｒａ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）を含むＤＭＥＭ－Ｆ１２培地（Ｇｉｂｃｏ）２５ｍＬに縣濁した。懸濁液を７０μＭのセルストレーナー（ＦＡＬＣＯＮ）に通した後、細胞数を計測し、４．２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬの濃度になるよう希釈した。Ｔ－７５細胞培養用フラスコ（住友ベークライト）に１０ｍＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した（培養０日目）。培養３日目に、培地を吸引除去し、新しい培地２０ｍＬに交換し、再び３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。培養７日目に、Ｗｅｉ－Ｔａｏ Ｓｏｎｇらの方法（Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ ２０１３；６（６）：７７８－７８４）に準じて、ミュラー細胞を純化した。培養８日目に、ミュラー細胞を剥がし、４×１０５ｃｅｌｌ／ｍｌの濃度になるよう縣濁し、９６ｗｅｌｌ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅ（ＦＡＬＣＯＮ）に１００μＬずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。
【0020】
＜ＮＴ３の発現増強作用＞
ケルセチンと分子構造が類似している、ガランギン、ケンフェロール、クリシン（ｃｈｒｙｓｉｎ、Ｃ１５Ｈ１０Ｏ４）、ミリセチン（ｍｙｒｉｃｅｔｉｎ、Ｃ１５Ｈ１０Ｏ８）について、ＮＴ３発現増強作用を以下の方法で試験した。各化合物の構造を、ケルセチンとともに示す。
ケルセチンと分子構造が類似している、ガランギン、ケンフェロール、クリシン（ｃｈｒｙｓｉｎ、Ｃ１５Ｈ１０Ｏ４）、ミリセチン（ｍｙｒｉｃｅｔｉｎ、Ｃ１５Ｈ１０Ｏ８）について、ＮＴ３発現増強作用を以下の方法で試験した。各化合物の構造を、ケルセチンとともに示す。
【化1】
【0021】
（１）試験方法
１）試験試料
ガランギン（Ｇａｌａｎｇｉｎ）はＣＡＹＭＡＮ社（製品番号：１５９４８）より入手し、ＤＭＳＯで溶解し使用した。ケンフェロール（Ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ）はＳＩＧＭＡ社（製品番号：Ｋ０１３３）より入手し、ＤＭＳＯで溶解し使用した。クリシンはＬＫＴ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（製品番号：Ｃ２９６８）より入手し、ＤＭＳＯで溶解し使用した。ミリセチンは東京化成（製品番号：Ｍ２１３１）より入手し、ＤＭＳＯで溶解して使用した。
１）試験試料
ガランギン（Ｇａｌａｎｇｉｎ）はＣＡＹＭＡＮ社（製品番号：１５９４８）より入手し、ＤＭＳＯで溶解し使用した。ケンフェロール（Ｋａｅｍｐｆｅｒｏｌ）はＳＩＧＭＡ社（製品番号：Ｋ０１３３）より入手し、ＤＭＳＯで溶解し使用した。クリシンはＬＫＴ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（製品番号：Ｃ２９６８）より入手し、ＤＭＳＯで溶解し使用した。ミリセチンは東京化成（製品番号：Ｍ２１３１）より入手し、ＤＭＳＯで溶解して使用した。
【0022】
２）ＮＴ３発現増強
ラット初代ミュラー細胞でのＮＴ３遺伝子発現に対する各試験物質の作用について、以下の方法で検討した。
培養９日目の初代ミュラー細胞の培地を全量除去し、１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ－Ｆ１２培地１００μＬに交換し、３７℃、５％ＣＯ２で９０分間培養することで血清飢餓状態に置いた。ガランギン、ケンフェロールをそれぞれ図１に表示した濃度になるように、また、クリシン、ミリセチンをそれぞれ図２に表示した濃度になるように添加し、９０分間培養後に上清を除去し、ＲＮｅａｓｙ９６ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い添付の説明書に従ってＲＮＡを調製した。ＲＮＡ調製の際、ＤＮａｓｅ Ｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、ゲノムＤＮＡの除去を行った。調製した適正量のＲＮＡを、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて添付の説明書に従いｃＤＮＡを作製した。
ラット初代ミュラー細胞でのＮＴ３遺伝子発現に対する各試験物質の作用について、以下の方法で検討した。
培養９日目の初代ミュラー細胞の培地を全量除去し、１％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ－Ｆ１２培地１００μＬに交換し、３７℃、５％ＣＯ２で９０分間培養することで血清飢餓状態に置いた。ガランギン、ケンフェロールをそれぞれ図１に表示した濃度になるように、また、クリシン、ミリセチンをそれぞれ図２に表示した濃度になるように添加し、９０分間培養後に上清を除去し、ＲＮｅａｓｙ９６ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い添付の説明書に従ってＲＮＡを調製した。ＲＮＡ調製の際、ＤＮａｓｅ Ｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、ゲノムＤＮＡの除去を行った。調製した適正量のＲＮＡを、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて添付の説明書に従いｃＤＮＡを作製した。
【0023】
ＮＴ３の遺伝子発現量はＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＴａｑＭａｎ Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｓｓａｙを用いて、次の方法で定量した。
１μＬのｃＤＮＡとラットＮＴ３転写産物のＴａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅ、Ｔａｑｍａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを所定の割合で混合し、計１０μＬとなるようにＰＣＲ ｇｒａｄｅ ｗａｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し混合したものを反応液とした。
調製した反応液は、Ｑｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ５（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、［（９５℃、２０秒）→（９５℃、１秒）→（６０℃、２０秒）］×４０サイクルの反応条件で測定を行った。
内在性コントロールにはラットＧａｐＤＨ Ｔａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅを用い、上記と同様の反応条件で測定を行った。測定により得られたＣｔ値からＧａｐＤＨを内部標準としてΔΔＣｔ法により、各サンプルの相対的遺伝子発現量を求めた。
使用したＴａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅの製品情報、仕様は以下のとおりである。
ＧａｐＤＨ：Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ａｓｓａｙ ＩＤ：Ｒｎ０１４６２６６２＿ｇ１
ＮＴ３：Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ａｓｓａｙ ＩＤ：Ｒｎ００５７９２８０＿ｍ１
１μＬのｃＤＮＡとラットＮＴ３転写産物のＴａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅ、Ｔａｑｍａｎ Ｆａｓｔ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘを所定の割合で混合し、計１０μＬとなるようにＰＣＲ ｇｒａｄｅ ｗａｔｅｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加し混合したものを反応液とした。
調製した反応液は、Ｑｕａｎｔ Ｓｔｕｄｉｏ５（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、［（９５℃、２０秒）→（９５℃、１秒）→（６０℃、２０秒）］×４０サイクルの反応条件で測定を行った。
内在性コントロールにはラットＧａｐＤＨ Ｔａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅを用い、上記と同様の反応条件で測定を行った。測定により得られたＣｔ値からＧａｐＤＨを内部標準としてΔΔＣｔ法により、各サンプルの相対的遺伝子発現量を求めた。
使用したＴａｑｍａｎ ｐｒｏｂｅの製品情報、仕様は以下のとおりである。
ＧａｐＤＨ：Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ａｓｓａｙ ＩＤ：Ｒｎ０１４６２６６２＿ｇ１
ＮＴ３：Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ａｓｓａｙ ＩＤ：Ｒｎ００５７９２８０＿ｍ１
【0024】
（２）結果
測定結果を図１、２に示す。
ラット初代ミュラー細胞において、ガランギン、ケンフェロールの添加により、ＮＴ３の遺伝子発現増強作用が認められた。
一方、類似骨格を有する化合物であっても、クリシン、ミリセチンは、ＮＴ３の遺伝子発現を増強しなかった。以上より、ガランギンとケンフェロールにＮＴ３の発現増強作用があることが確かめられた。
測定結果を図１、２に示す。
ラット初代ミュラー細胞において、ガランギン、ケンフェロールの添加により、ＮＴ３の遺伝子発現増強作用が認められた。
一方、類似骨格を有する化合物であっても、クリシン、ミリセチンは、ＮＴ３の遺伝子発現を増強しなかった。以上より、ガランギンとケンフェロールにＮＴ３の発現増強作用があることが確かめられた。
【図1】
【図2】
