特開 2024-9914 抗アンジオポエチン２抗体およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024009914

(43)【公開日】2024-01-23

(54)【発明の名称】抗アンジオポエチン２抗体およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20240116BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240116BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20240116BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240116BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20240116BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240116BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240116BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240116BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240116BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240116BHJP

   A61P 27/02 20060101ALI20240116BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240116BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240116BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13 ZNA

C12N15/63 Z

C07K16/18

C12P21/08

C12P21/02 C

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

A61K39/395 N

A61K39/395 D

A61P27/02

A61P35/00

A61P35/02

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2023175308

(22)【出願日】2023-10-10

(62)【分割の表示】P 2020566520の分割

【原出願日】2019-02-19

(31)【優先権主張番号】62/633,038

(32)【優先日】2018-02-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】10-2019-0018769

(32)【優先日】2019-02-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】520312865

【氏名又は名称】インスティテュート・フォー・ベイシック・サイエンス

【氏名又は名称原語表記】ＩＮＳＴＩＴＵＴＥ ＦＯＲ ＢＡＳＩＣ ＳＣＩＥＮＣＥ

(71)【出願人】

【識別番号】596071752

【氏名又は名称】コリア アドバンスト インスティテュート オブ サイエンス アンド テクノロジー

(74)【代理人】

【識別番号】100145403

【弁理士】

【氏名又は名称】山尾 憲人

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100138911

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻井 陽子

(72)【発明者】

【氏名】コ・グヨン

(72)【発明者】

【氏名】ペ・チョミル

(72)【発明者】

【氏名】キム・ミジョン

(72)【発明者】

【氏名】パク・ジンソン

(72)【発明者】

【氏名】ソ・スジン

(72)【発明者】

【氏名】キム・ジェリョン

(72)【発明者】

【氏名】パク・チャンリョル

(72)【発明者】

【氏名】キム・ピハン

(72)【発明者】

【氏名】オ・ワンユル

(57)【要約】      （修正有）

【課題】ヒトアンジオポエチン２に特異的に結合しＴｉｅ２活性化を誘導する、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【解決手段】Ａｎｇ２を中和すると共にＴｉｅ２受容体を活性化するという、二重の機能を有する特定の配列を有する抗Ａｎｇ２抗体であって、異常な、および病的な血管を正常化する作用を示し、したがって異常な血管が関与するさまざまな疾患または障害に対する処置効果を示す抗体。血管新生抑制剤、ならびに異常なＡｎｇ２発現およびＴｉｅ２調節異常に関連する疾患を予防および治療するための、抗体を活性成分として含む組成物、およびＡｎｇ２抑制およびＴｉｅ２活性化に関連する疾患診断用の、抗体を含む組成物を提供する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ヒトアンジオポエチン２に特異的に結合しＴｉｅ２活性化を誘導する、抗体またはその抗原結合フラグメントであって、抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号１１５のアミノ酸、配列番号１１６のアミノ酸、または配列番号１１７のアミノ酸に結合する、抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項2】

抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号１１６のアミノ酸、または配列番号１１７のアミノ酸に結合する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項3】

抗体またはその抗原結合フラグメントが、配列番号１１５のアミノ酸に結合する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項4】

抗体またはその抗原結合フラグメントが、ヒトおよびマウスのＡｎｇ２に結合する、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項5】

抗体が、ポリクローナルまたはモノクローナルである、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項6】

抗原結合フラグメントが、ｓｃＦｖまたはＦａｂである、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項7】

抗体がヒト化されている、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。

【請求項8】

（ａ）配列番号３のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号４のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号５のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を有する重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）；および
（ｂ）配列番号６のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ
を含む、請求項１に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項9】

（ａ）配列番号１３のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１４のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号１５のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を有する重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）；および
（ｂ）配列番号１６のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１７のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号１８のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ
を含む、請求項１に記載の抗体または抗原結合フラグメントに関する。

【請求項10】

配列番号９、１９、４３、４７、５１、５５、５９、６３、６７、７１、７５、７９、８３、８７、９１、９５、９９、１０３、１０７または１１１からなる群から選択される重鎖可変領域；および
配列番号１１、２１、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６、８０、８４、８８、９２、９６、１００、１０４、１０８または１１２からなる群から選択される軽鎖可変領域
を含む、請求項１に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項11】

受託番号ＫＣＬＲＦ－ＢＰ－００４１７またはＫＣＬＲＦ－ＢＰ－００４１８で寄託された細胞株から産生される抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、請求項１に記載の抗体または抗原結合フラグメント。

【請求項12】

薬学的に有効な量の請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを、薬学的に許容しうる担体と共に含む医薬組成物。

【請求項13】

化学療法に用いられる低分子阻害剤をさらに含む、請求項１２に記載の医薬組成物。

【請求項14】

血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニストをさらに含む、請求項１２に記載の医薬組成物。

【請求項15】

ＶＥＧＦアンタゴニストが、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦ阻害融合タンパク質、または低分子キナーゼ阻害剤である、請求項１４に記載の医薬組成物。

【請求項16】

患者において腫瘍増殖を抑制する方法であって、請求項１２に記載の抗体または抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を患者に投与することを含む、方法。

【請求項17】

化学療法に用いられる低分子阻害剤、または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニストを投与することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

ＶＥＧＦアンタゴニストが、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦ阻害融合タンパク質、または低分子キナーゼ阻害剤である、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

眼疾患患者において、脈絡膜血管新生を抑制する、眼血管漏出を抑制する、または同時に脈絡膜毛細血管再生を誘導する方法であって、請求項１２に記載の医薬組成物を患者に投与することを含む、方法。

【請求項20】

化学療法に用いられる低分子阻害剤、または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニストを投与することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

ＶＥＧＦアンタゴニストが、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦ阻害融合タンパク質、または低分子キナーゼ阻害剤である、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

眼疾患が、滲出型加齢黄斑変性（ｗＡＭＤ）、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）、または糖尿病網膜症（ＤＲ）である、請求項１９に記載の方法。

【請求項23】

請求項１に記載の抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸。

【請求項24】

請求項２３に記載の核酸を含む発現ベクター。

【請求項25】

請求項２４に記載の発現ベクターが導入された宿主細胞。

【請求項26】

請求項２５に記載の宿主細胞を培養することを含む、抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合フラグメントを生産する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、血管形成および維持を調節するリガンドとして知られるアンジオポエチン２（Ａｎｇ２）に特異的に結合する、抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合フラグメント、それを含む医薬組成物、それをコードする核酸、核酸を含むベクター、ベクターを含む宿主細胞、ならびに抗体またはその抗原結合フラグメントを生産する方法を包含する。

【背景技術】

【0002】

生物の発達、成長、維持およびホメオスタシスにおいて、血管形成はさまざまな調節因子によってダイナミックに起こる。このプロセスにおいて新たに形成される血管は、周辺の細胞において、栄養物、酸素およびホルモンといったさまざまな生体材料の輸送チャネルとして機能する。機能的および構造的に異常な血管は、さまざまな疾患の発症および進行の、直接的または間接的な原因となる。腫瘍血管は、その機能的および構造的欠陥の故に低酸素を悪化させ、その結果、腫瘍の進行および他組織への転移を引き起こし、また、腫瘍塊中心部への抗癌剤デリバリーの低下をもたらす。血管の欠陥は、癌に加え、さまざまな他の疾患および状態においても見られる。その例としては、さまざまな、眼疾患（例えば、糖尿病黄斑浮腫、滲出型加齢黄斑変性）、ウイルス感染、および急性炎症反応、例えば敗血症が挙げられる。したがって、異常な血管を正常化することのできる処置剤が利用可能であれば、血管異常を有するさまざまな患者の処置に適用することができる。

【0003】

アンジオポエチンファミリーは、血管の形成および維持において重要な役割を担い、４つのアンジオポエチン（Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、Ａｎｇ３およびＡｎｇ４）からなる。アンジオポエチン１（Ａｎｇ１）は、血管内皮細胞表面上に存在するＴｉｅ２受容体に結合して、Ｔｉｅ２受容体をリン酸化および活性化し、それによって血管を安定化する。一方、アンジオポエチン２（Ａｎｇ２）は、Ｔｉｅ２受容体に結合するが、アンタゴニストとして作用し、Ｔｉｅ２受容体の不活性化を誘導し、それによって血管の不安定化および血管の漏出をもたらす。癌患者、眼疾患、ウイルスおよび細菌感染ならびに炎症性疾患において血液中のＡｎｇ２の発現レベルが非常に高いことが報告されている（Saharinen P et al., 2017, Nature Review Drug Discovery）。しかしながら、Ａｎｇ２はまた、リンパのチューブ形成および維持を包含するいくつかのプロセスにおいて、Ｔｉｅ２受容体の活性化を誘導するアゴニストとして作用することが知られており、したがって、Ａｎｇ２は状況によってさまざまな機能を示すと考えられる。

【0004】

Ａｎｇ２結合抗体がいくつかの文献に報告されている（例えば米国特許第７６５８９２４号および米国特許第８９８７４２０号）。これまでに報告されたＡｎｇ２抗体の多くが、Ａｎｇ２のＴｉｅ２への結合を阻害し、したがって、そのようなＡｎｇ２中和効果によって新血管の形成を阻害することがわかっている。現在、さまざまなＡｎｇ２抗体がさまざまな癌患者に対する臨床試験に付されているが、その抗癌作用は不十分であることがわかっている。例えば、Amgenが実施した第３相臨床試験により、Ａｎｇ２抗体の卵巣癌患者における抗癌作用は有意ではないことが示された（Marth C et al., 2017, Eur. J. Cancer）。

【0005】

抗体に加え、Ｔｉｅ２受容体に直接結合してＴｉｅ２のリン酸化および活性化を誘導する組換えタンパク質も報告されている。その例には、COMP-Ang1（Cho et al., 2004, PNAS）、および５つのアンジオポエチン１タンパク質フラグメントからなるVasculotide（David S et al., 2011, Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol）ペプチドがある。しかしながら、これらのタンパク質は半減期が非常に短く、不安定な物理化学的性質を有すると考えられる。さらに、リン酸化されたＴｉｅ２からリン酸基を除去してＴｉｅ２を不活性化するＶＥ－ＰＴＰと称されるホスファターゼが存在し、ＶＥ－ＰＴＰ酵素の活性を阻害することによって間接的にＴｉｅ２活性を維持する低分子化合物（AKB-9778）の開発もなされている（Goel S, 2013, J Natl Cancer Inst）。しかしながら、この化合物は、Ｔｉｅ２に加え、他の受容体も活性化するという欠点を有する（Frye M, 2015, J Exp. Med, Hayashi M, 2013, Nature Communication, Mellberg S et al., 2009, FASEB J.）。

【発明の概要】

【0006】

本発明は、ヒトアンジオポエチン２に特異的に結合しＴｉｅ２活性化を誘導する、抗体またはその抗原結合フラグメントに関し、該抗体またはその抗原結合フラグメントは、水素／重水素交換法による決定で、配列番号１のアミノ酸２８９～２９９、配列番号１のアミノ酸３１６～３２２、または配列番号１のアミノ酸３３６～３５３に結合する。

【0007】

抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトおよびマウスのＡｎｇ２に結合しうる。抗体はポリクローナルまたはモノクローナルでありうる。抗原結合フラグメントはｓｃＦｖまたはＦａｂでありうる。抗体またはそのフラグメントはヒト化されうる。

【0008】

他の一態様において、本発明は、
（ａ）配列番号３のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号４のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号５のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を有する重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）；および
（ｂ）配列番号６のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号７のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号８のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ
を含む、抗体または抗原結合フラグメントに関する。

【0009】

他の一態様において、本発明は、
（ａ）配列番号１３のＨＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１４のＨＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号１５のＨＣＤＲ３アミノ酸配列を有する重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）；および
（ｂ）配列番号１６のＬＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１７のＬＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号１８のＬＣＤＲ３アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域のＣＤＲ
を含む、抗体または抗原結合フラグメントに関する。

【0010】

一態様において、本発明は、受託番号ＫＣＬＲＦ－ＢＰ－００４１７またはＫＣＬＲＦ－ＢＰ－００４１８で寄託された細胞株から産生される抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントに関する。

【0011】

他の一態様において、本発明は、薬学的に有効な量の前記抗体またはその抗原結合フラグメントを、薬学的に許容しうる担体と共に含む医薬組成物に関する。医薬組成物は、化学療法に用いられる低分子阻害剤、または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニストをさらに含みうる。一態様において、ＶＥＧＦアンタゴニストは、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦ阻害融合タンパク質、または低分子キナーゼ阻害剤でありうる。

【0012】

他の一態様において、本発明は、前記抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を患者に投与することを含む、患者において腫瘍増殖を抑制する方法に関する。該方法は、本発明の抗体またはそのフラグメントの投与と同時に、または前後して、化学療法に用いられる低分子阻害剤、または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニストを投与することをさらに含みうる。ＶＥＧＦアンタゴニストは、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦ阻害融合タンパク質、または低分子キナーゼ阻害剤でありうる。

【0013】

他の一態様において、本発明は、前記医薬組成物を眼疾患患者に投与することを含む、該患者において脈絡膜血管新生を抑制する、眼血管漏出を抑制する、または同時に脈絡膜毛細血管再生を促進する方法に関する。該方法は、本発明の抗体またはそのフラグメントの投与と同時に、または前後して、化学療法に用いられる低分子阻害剤、または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニストを投与することをさらに含みうる。ＶＥＧＦアンタゴニストは、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦ阻害融合タンパク質、または低分子キナーゼ阻害剤でありうる。眼疾患は、滲出型加齢黄斑変性（ｗＡＭＤ）、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）、または糖尿病網膜症（ＤＲ）である。

【0014】

上記のおよび他の本発明の課題は、後述の本発明の説明、添付の図面および特許請求の範囲から、より明確に理解されうる。

【図面の簡単な説明】

【0015】

本発明は、後述の詳細な説明および添付の図面から、より明確に理解されうるが、それらは説明のためのものであるり、本発明を限定するものではない。

【図1】抗Ａｎｇ２抗体によって誘導されるＡｋｔリン酸化。ＨＵＶＥＣを６時間の血清飢餓に付し、ヒトＡｎｇ２（１μｇ／ｍｌ）の不存在下または存在下に、ＣＯＭＰ－Ａｎｇ１（ＣＡ１、０．５μｇ／ｍｌ）または抗Ａｎｇ２抗体（対照、２Ｃ８、４Ｂ９、２Ｆ１０および４Ｅ２のそれぞれ）と共に３０分間インキュベートした。細胞溶解物をＳＤＳ－ＰＡＧＥ／ウエスタンブロッティングに付し、ブロットを抗ホスホＡｋｔ（Ｓ４７３）または抗Ａｋｔ抗体でプローブした。

【図2】水素／重水素交換質量分析によって分析した抗Ａｎｇ２抗体のエピトープを示す図。組換えｈＡｎｇ２－ＲＢＤ単独、またはｈＡｎｇ２－ＲＢＤ／Ａｎｇ２抗体複合体を重水素で標識した。標識したタンパク質をペプシンカラムにおいて消化し、質量分析により分析した。ｈＡｎｇ２－ＲＢＤ単独およびｈＡｎｇ２－ＲＢＤ／Ａｎｇ２抗体複合体の重水素取り込みを分析し、重水素取り込みの差を比較した。重水素取り込みの質量差が０．５～１Ｄａを上回ったペプチドを、抗Ａｎｇ２抗体との結合を仲介する特異的エピトープであると決定した。PyMolソフトウェアを用いて作製したＡｎｇ２－ＲＢＤ結晶構造（ＰＤＢ：２ＧＹ７）の画像において、２Ｃ８エピトープ（赤）および４Ｂ９エピトープ（緑）を示した。

【図3】ヒト化抗Ａｎｇ２抗体４Ｂ９Ｈ１１および２Ｃ８Ｈ１１による用量依存的Ａｋｔリン酸化（ｐＡｋｔ）。血清飢餓ＨＵＶＥＣを、ヒトＡｎｇ２、抗Ａｎｇ２抗体、またはヒトＡｎｇ２とさまざまな濃度の抗Ａｎｇ２抗体との組み合わせと共に３０分間インキュベートした。細胞溶解物をＳＤＳ－ＰＡＧＥ／ウエスタンブロッティングに付した。

【図4】ヒト化抗Ａｎｇ２抗体４Ｂ９Ｈ１１および２Ｃ８Ｈ１１による用量依存的Ｔｉｅ２リン酸化（ｐＴｉｅ２）。４Ｂ９Ｈ１１抗体（図４Ａ）および２Ｃ８Ｈ１１抗体（図４Ｂ）のＴｉｅ２リン酸化誘導能力を、免疫沈降およびウエスタンブロッティングによって調べた。血清飢餓ＨＵＶＥＣを、ヒトＡｎｇ２、抗Ａｎｇ２抗体単独、またはヒトＡｎｇ２とさまざまな濃度の抗Ａｎｇ２抗体との組み合わせと共に３０分間インキュベートした。細胞溶解物を、抗Ｔｉｅ２抗体による免疫沈降、次いでＳＤＳ－ＰＡＧＥ／ウエスタンブロッティング分析に付した。

【図5】ヒト化Ａｎｇ２抗体によるＴｉｅ２受容体クラスター形成およびＦＯＸＯ１移行。ＨＵＶＥＣを６時間の血清飢餓に付し、ＣＯＭＰ－Ａｎｇ１（ＣＡ１）、Ａｎｇ２（Ａ２）、またはＡｎｇ２と抗Ａｎｇ２抗体（対照Ａｂ、２Ｃ８Ｈ１１、または４Ｂ９Ｈ１１）との組み合わせと共に３０分間インキュベートした。固定後、ＨＵＶＥＣを、ＤＡＰＩ（青）、抗Ｔｉｅ２抗体（緑）、抗ＦＯＸＯ１抗体（赤）および抗ヒトＦｃ（シアン）で染色して、細胞表面におけるＴｉｅ２クラスター形成、核からのＦＯＸＯ１移行、および細胞間結合域におけるヒト化Ａｎｇ２抗体の存在を調べた。矢尻は、細胞間接着においてクラスター形成したＴｉｅ２および共局在するＡｎｇ２抗体を示す。

【図6】２Ｃ８Ｈ１１により誘導されるＴｉｅ２受容体クラスター形成、ＦＯＸＯ１移行、およびＨＵＶＥＣの細胞間結合部におけるＡｎｇ２抗体局在の経時変化。血清飢餓ＨＵＶＥＣを、抗Ａｎｇ２抗体（対照Ａｂ、または２Ｃ８Ｈ１１）と共に、１０分～２４０分の間のさまざまな時間にわたりインキュベートした。細胞の固定後、細胞表面におけるクラスター形成したＴｉｅ２受容体、およびエンドサイトーシスを受けたＴｉｅ２受容体を、抗Ｔｉｅ２抗体での染色によって調べた。細胞表面およびサイトゾルにおけるヒト化抗Ａｎｇ２抗体を、抗ヒトＦｃ抗体でプローブした。矢尻は、細胞間接着においてクラスター形成したＴｉｅ２および共局在するＡｎｇ２抗体を示す。

【図7】ヒト化抗Ａｎｇ２抗体による血管透過性抑制。ＨＵＶＥＣをトランスウェルチャンバーに播種し、３日間培養した。１００％のコンフルエンシーで、ＨＵＶＥＣを、ＣＯＭＰ－Ａｎｇ１（ＣＡ１、０．５μｇ／ｍｌ）、Ａｎｇ２（Ａ２、１μｇ／ｍｌ）、Ａｎｇ２と対照Ａｂ（Ａ２＋対照Ａｂ、１μｇ／ｍｌ）、Ａｎｇ２と２Ｃ８Ｈ１１（Ａ２＋２Ｃ８Ｈ１１、１μｇ／ｍｌ）、またはＡｎｇ２と４Ｂ９Ｈ１１（Ａ２＋４Ｂ９Ｈ１１、１μｇ／ｍｌ）で３０分間処理し、その後、上部チャンバーへのＴＮＦ－ａ（１００ｎｇ／ｍｌ）で２２時間処理した。上部チャンバーにＦＩＴＣ－デキストランを加え、２０分間インキュベートした。ＦＩＴＣ－デキストランを上部チャンバーに２０分間加えた後の下部チャンバーにおけるＦＩＴＣ蛍光を測定することにより、血管透過性を評価した。値は平均±ＳＤである。一元ＡＮＯＶＡにより、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。

【図8】ＥＬＩＳＡによる、マウスＡｎｇ２に対する抗Ａｎｇ２抗体のＥＣ_５０値。マウスＡｎｇ２（ｍＡｎｇ２）に対するヒト化抗Ａｎｇ２抗体の結合親和性を、ＥＬＩＳＡによるＥＣ_５０の分析によって測定した。組換えｍＡｎｇ２をコートし、段階希釈した抗Ａｎｇ２抗体４Ｂ９Ｈ１１および２Ｃ８Ｈ１１と共にインキュベートした。次いで、プレートを、抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ）－ＨＲＰ二次抗体と反応させた。プレートをＴＭＢ溶液で処理し、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。PerkinElmerのWorkoOut 2.5プログラムを用いてＥＣ_５０値を分析した。

【図9】ＬＬＣ腫瘍モデルにおけるヒト化２Ｃ８Ｈ１１抗体およびシスプラチン（Ｃｐｔ）による腫瘍増殖抑制。腫瘍移植後７日目に開始して、示されるように処置されたマウスにおけるＬＬＣ腫瘍増殖を比較した。黒の矢印は抗体の注射を示し、赤の矢印はＣｐｔの単回注射を示す。各群において、ｎ＝７～９。値は平均±ＳＤ。＊Ｆｃに対してｐ＜０．０５；＃Ｆｃ＋Ｃｐｔに対してｐ＜０．０５。

【図10】ヒト化２Ｃ８Ｈ１１抗体の腫瘍血管正常化作用。ＬＬＣ皮下腫瘍モデルにおいて、腫瘍におけるＰＤＧＦＲβ^＋ペリサイト域、および腫瘍間領域におけるＣＤ３１^＋ＢＶを比較した。スケールバー：１００μｍ。各群において、ｎ＝５。値は平均±ＳＤ。＊Ｆｃに対してｐ＜０．０５；＃Ｆｃ＋Ｃｐｔに対してｐ＜０．０５。

【図11】ヒト化２Ｃ８Ｈ１１抗体による低酸素の軽減および腫瘍血管の灌流増加。ＬＬＣ腫瘍において、レクチンの腫瘍血管灌流、およびHypoxyprobe^＋低酸素面積を分析し比較した。Hypoxyprobe^＋面積は、総断面積に対するパーセンテージとして示した。スケールバー：１００μｍ。各群において、ｎ＝５。値は平均±ＳＤ。＊Ｆｃに対してｐ＜０．０５；＃Ｆｃ＋Ｃｐｔに対してｐ＜０．０５。

【図12】ヒト化２Ｃ８Ｈ１１抗体による腫瘍内部へのＣｐｔドラッグデリバリーの増加。抗Ｃｐｔ修飾ＤＮＡ抗体を用いて、２１日目に採取した腫瘍におけるＣｐｔ^＋領域を画像化した。Ｃｐｔ^＋面積を、総断面積に対するパーセンテージとして測定した。スケールバー：１００μｍ。各群において、ｎ＝５。値は平均±ＳＤ。＃Ｆｃ＋Ｃｐｔに対してｐ＜０．０５。

【図13】レーザー誘発ＣＮＶモデルにおける２Ｃ８Ｈ１１抗体の硝子体内注射によるＣＮＶ低減および血管漏出抑制。レーザー光凝固後７日目に、抗体の硝子体内投与を行った。レーザー光凝固後６日目および／または１４日目に、ＣＤ３１^＋ＣＮＶ体積を測定し、ＣＮＶ周囲の漏出面積を、ＦＡ画像において測定された高蛍光の総面積を、ＩＣＧＡ画像において測定された総ＣＮＶ面積で除したものとして、計算した。スケールバー：１００μｍ。各群において、ｎ＝１１。値は平均±ＳＤ。＊＊＊一元ＡＮＯＶＡ、次いでスチューデント－ニューマン－ケウルスのポスト検定によりｐ＜０．００１；＃＃＃対応のあるスチューデントのｔ検定によりｐ＜０．００１。

【図14】２Ｃ８Ｈ１１抗体の硝子体内注射によるＣＮＶ低減および脈絡膜毛細血管再生。レーザー光凝固後７日目に、抗体の硝子体内投与を行った。レーザー光凝固後、６、１４、２１および３５日目に、眼のＯＣＴＡ画像によって、ＣＮＶ体積（白色の点線の境界線で区切られた部分）、およびＣＮＶの周囲の無血管スペース（黄色の点線の境界線で区切られた部分）を測定した。各群において、ｎ＝１１。値は平均±ＳＤ。一元ＡＮＯＶＡ、次いでスチューデント－ニューマン－ケウルスのポスト検定により、Ｆｃに対して、＊ｐ＜０．００５、＊＊ｐ＜０．００５。

【図15】ＣＮＶの内皮細胞における２Ｃ８Ｈ１１抗体およびＣＤ３１の共局在。レーザー光凝固後１日目に、２Ｃ８Ｈ１１抗体の皮下投与を行った。レーザー光凝固後２、４および８日目に、ＣＮＶの内皮細胞における２Ｃ８Ｈ１１抗体およびＣＤ３１共局在を、抗ヒトＩｇＧ抗体で直接に検出した。

【図16】皮下注射２Ｃ８Ｈ１１抗体のＣＮＶ抑制効果。レーザー光凝固後１日目に、２Ｃ８Ｈ１１抗体の皮下投与を行った。レーザー光凝固後８日目に、ＣＤ３１^＋ＣＮＶの体積を測定した。スケールバー：１００μｍ。各群において、ｎ＝１０。値は平均±ＳＤ。＊＊＊対応のないスチューデントのｔ検定によりｐ＜０．００１。

【発明を実施するための形態】

【0016】

別の定義をしない限り、本書に使用する技術用語および科学用語はいずれも、本発明が属する技術分野の専門家に理解されるのと同じ意味を有する。全般に、本書に使用する命名法は当分野において知られ、普通に使用されるものである。

【0017】

本願において、単数形の記載は、対象が単数である場合および複数である場合の両方を意味する。

【0018】

一態様において、本発明は、ヒトアンジオポエチン２に特異的に結合し、Ｔｉｅ２活性化を誘導する、抗体またはその抗原結合フラグメントに関し、ここで、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１１５のアミノ酸、配列番号１１６のアミノ酸、または配列番号１１７のアミノ酸に結合する。

【0019】

配列番号１１５のアミノ酸は、配列番号１のアミノ酸３３６～３５３に対応し、配列番号１１６のアミノ酸は、配列番号１のアミノ酸２８９～２９９に対応し、配列番号１１７のアミノ酸配は、配列番号１のアミノ酸３１６～３２２に対応する。

【0020】

本書において、用語「Ａｎｇ２に特異的に結合する抗体」は、Ａｎｇ２に結合し、その結果Ａｎｇ２の生物学的活性を阻害する抗体をさし、「抗Ａｎｇ２抗体」、「Ａｎｇ２結合抗体」と互換的に使用される。

【0021】

本書において「抗体」は、特定の抗原に対し免疫学的に反応性の免疫グロブリン分子であり、抗原を特異的に認識する受容体としてはたらくタンパク質分子を意味し、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（単クローン抗体）、全抗体、および抗体フラグメントのいずれをも包含しうる。さらに、抗体は、キメラ抗体（例えばヒト化マウス抗体）および二価または二重特異性分子（例えば二重特異性抗体）、ディアボディ、トリアボディおよびテトラボディを包含しうる。

【0022】

全抗体は、２つの完全長軽鎖および２つの完全長重鎖を有し、各軽鎖が重鎖にジスルフィド結合により連結されうるという構造を有する。全抗体はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭおよびＩｇＧを包含し、ＩｇＧはサブタイプであり、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を包含する。

【0023】

本開示において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒトおよびマウスのＡｎｇ２に結合しうる。

【0024】

抗体フラグメントとは、抗原結合機能を維持するフラグメントを意味し、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、ｓｃＦｖ、およびＦｖ等を包含する。

【0025】

Ｆａｂは、軽鎖および重鎖の可変領域、ならびに軽鎖定常領域および重鎖第１定常領域（ＣＨ１ドメイン）の構造を有し、１つの抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインＣ末端に１つまたはそれ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域を有する点で、Ｆａｂと異なる。Ｆ（ａｂ’）_２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合することによって形成される。

【0026】

Ｆｖ（可変フラグメント）とは、重鎖可変領域および軽鎖可変領域のみを有する最小の抗体フラグメントをいう。二本鎖Ｆｖ（ｄｓＦｖ）においては、重鎖可変領域および軽鎖可変領域がジスルフィド結合によって連結される。一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）においては、重鎖可変領域および軽鎖可変領域が、一般に、ペプチドリンカーを用いる共有結合によって連結される。これら抗体フラグメントは、タンパク質分解酵素を用いて得ることができ（例えば、Ｆａｂは、全抗体をパパインで限定切断することによって得ることができ、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントはペプシンによる切断によって得ることができる）、また、組換えＤＮＡ技術によって作製することができる（例えば、抗体重鎖またはその可変領域をコードするＤＮＡおよび軽鎖またはその可変領域をコードするＤＮＡを鋳型として用い、プライマー対を用いる、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）法による増幅、および、両端に重鎖またはその可変領域および軽鎖またはその可変領域をそれぞれ連結させるように、プライマー対のペプチドリンカーをコードするＤＮＡを組み合わせての増幅）。

【0027】

本開示において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト化されうる。好ましくは、本発明の抗Ａｎｇ２抗体は、ヒト抗体ライブラリーから選択される完全ヒト抗体でありうるが、それに限定されない。

【0028】

本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；および配列番号６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、配列番号８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むことによって特徴付けられる。

【0029】

本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１３のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１、配列番号１４のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２、配列番号１５のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；および配列番号１６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１７のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２、配列番号１８のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むことによって特徴付けられる。

【0030】

本発明において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号９、１９、４３、４７、５１、５５、５９、６３、６７、７１、７５、７９、８３、８７、９１、９５、９９、１０３、１０７または１１１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；および配列番号１１、２１、４４、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６、８０、８４、８８、９２、９６、１００、１０４、１０８または１１２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含むことによって特徴付けられるが、それに限定されない。

【0031】

抗体のアミノ酸配列は、保存的置換によって置換されうる。「保存的置換」とは、少なくとも１つのアミノ酸の、同様の生化学的性質を有するアミノ酸による置換を含む、ポリペプチドの対応するポリペプチドへの、生物学的または生化学的機能の低下を伴わない改変をいう。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置換される置換をいう。同様の側鎖を有するアミノ酸残基の群は、当分野において定義されている。そのような群は、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、荷電していない極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を包含する。本発明の抗体は、保存的アミノ酸置換がなされても活性を維持することができると考えられる。

【0032】

本発明において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、受託番号ＫＣＬＲＦ－ＢＰ－００４１７またはＫＣＬＲＦ－ＢＰ－００４１８で寄託された細胞株から産生される抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むことによって特徴付けられる。

【0033】

本発明の抗Ａｎｇ２抗体の配列は、本願において提示される配列とは異なっていてよい。例えば、アミノ酸配列は、上記に示したアミノ酸配列とは次のように異なりうる：（ａ）軽鎖の定常ドメインから可変領域が切り離されうる；（ｂ）アミノ酸が上記に示したものと、該残基の化学的性質への著しい影響はないが異なりうる（いわゆる保存的置換）；（ｃ）アミノ酸が上記に示したものと、あるパーセンテージ、例えば８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性で異なりうる。あるいは、抗体をコードする核酸は、（ａ）軽鎖の定常ドメインから切り離されうる；（ｂ）上記に示したものと、コードする残基を変更することなく異なりうる；または（ｃ）上記に示したものと、あるパーセンテージ、例えば７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性で異なりうる。

【0034】

アミノ酸配列において保存的変異を導入する際、アミノ酸のハイドロパシーインデックスを考慮しうる。タンパク質に生物学的相互作用機能を付与する際のアミノ酸ハイドロパシーインデックスの重要性は、当分野で一般に理解されている。アミノ酸の相対的なハイドロパシーは、得られるタンパク質の二次構造に影響し、それがタンパク質と他の分子、例えば酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原等との相互作用を決定付けると認識されている。

【0035】

また、同様のアミノ酸による置換は、親水性に基づいて効果的になされうることが当分野で理解されている。例えば、隣接するアミノ酸の親水性によって決まる、タンパク質の最大の局部的平均親水性が、タンパク質の生物学的性質に影響する。アミノ酸が、同様の親水性を有する他のアミノ酸で置換され、生物学的または免疫学的に改変されたタンパク質をもたらしうることが理解される。そのような変異において、親水性値が±２以内のアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが特に好ましく、±０．５のものがより一層好ましい。

【0036】

上述のように、アミノ酸置換は一般に、アミノ酸側鎖置換基、例えばその疎水性、親水性、荷電性、大きさ等の相対的類似性に基づく。前記のさまざまな性質を考慮した置換の例は当業者に知られており、以下のものを包含する：アルギニンおよびリジン：グルタメートおよびアスパルテート；セリンおよびスレオニン：グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシン。

【0037】

他の一態様において、本発明は、抗体またはその抗原結合フラグメントを有効成分として含む医薬組成物に関する。

【0038】

医薬組成物は、薬学的に有効な量の本発明の抗体またはその抗原結合フラグメント、および薬学的に許容しうる担体を含むことによって特徴付けられる。

【0039】

医薬組成物は、化学療法に用いられる低分子阻害剤、または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニストをさらに含みうる。一態様において、ＶＥＧＦアンタゴニストは、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦ阻害融合タンパク質、または低分子キナーゼ阻害剤でありうる。

【0040】

他の一態様において、本発明は、抗体またはその抗原結合フラグメントを有効成分として含む、眼疾患を予防または治療するための医薬組成物に関する。

【0041】

他の一態様において、本発明は、前記医薬組成物を眼疾患患者に投与することを含む、該患者において脈絡膜血管新生を抑制する、眼血管漏出を抑制する、または同時に脈絡膜毛細血管再生を促進する方法に関する。

【0042】

眼疾患を予防または治療するための医薬組成物は、化学療法に用いられる低分子阻害剤、または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニストをさらに含みうる。ＶＥＧＦアンタゴニストは、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦ阻害融合タンパク質、または低分子キナーゼ阻害剤でありうる。

【0043】

前記方法は、本発明の抗体またはそのフラグメントの投与と同時に、または前後して、化学療法に用いられる低分子阻害剤、または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニストを投与することをさらに含みうる。ＶＥＧＦアンタゴニストは、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦ阻害融合タンパク質、または低分子キナーゼ阻害剤でありうる。

【0044】

抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ａｎｇ２の機能を阻害することによって異常な血管形成を抑制する機能を有し、したがって、血管異常が関与する眼疾患を予防または治療する作用を有する。

【0045】

本書において、用語「予防する」とは、本発明の組成物の投与による、眼疾患を防ぐ、またはその進行を遅延する任意の作用をいい、用語「治療する」、「処置する」とは、眼疾患を防ぐ、軽減する、またはその発現を抑制することをいう。

【0046】

本発明において、眼疾患は、滲出型加齢黄斑変性（ｗＡＭＤ）、糖尿病黄斑浮腫（ＤＭＥ）、または糖尿病網膜症（ＤＲ）であるが、それに限定されない。

【0047】

本書において、用語「黄斑変性」とは、血管新生が異常に増加し、それによって黄斑に損傷が起こり視力が損なわれる状態をさす。黄斑変性は主に５０歳を超える年齢で起こり、非滲出型（ドライ型）または滲出型（ウェット型）に分けられる。特に滲出型のＡＭＤの場合、失明に至りうる。ＡＭＤの原因は未だ解明されていないが、年齢；および喫煙、高血圧、肥満、遺伝的素因、過度のＵＶ暴露、低い血清抗酸化物質濃度等を包含する環境的要因がリスク因子であることがわかっている。

【0048】

本書において、用語「黄斑浮腫」とは、網膜の黄斑の腫脹をさし、これは網膜血管からの液体漏出によって起こる。弱い血管壁からの漏出血液が、色覚に係る神経の終末であり網膜錐体が豊富な網膜黄斑の限局域に入る。そして、中心窩右または中心窩中央への像が不鮮明となる。視力が何箇月かにわたって徐々に低下する。本書において、用語「糖尿病網膜症」とは、糖尿病により引き起こされる末梢循環障害による網膜微小循環の障害によって視力が低下する、眼の合併症をいう。初期には視力障害は軽度であるが、最終的に失明に至りうる。糖尿病網膜症は１型糖尿病または２型糖尿病のいずれの患者にも起こりうる。

【0049】

本発明は、処置有効量の抗Ａｎｇ２抗体、および薬学的に許容しうる担体を含む医薬組成物を提供する。「薬学的に許容しうる担体」とは、製剤の調製または安定化を促進するために活性成分に添加することができ、患者に顕著な有害毒性作用をもたらさない材料である。

【0050】

担体とは、患者に刺激を与えず、投与される化合物の生物学的活性および特性を阻害しない担体または希釈剤をさす。液体溶液として調製される組成物における薬学的に許容しうる担体は、無菌であり、生体に対して適当なものである。食塩液、無菌水、リンガー液、緩衝食塩液、アルブミン注射用溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールを担体として使用し得るか、またはその少なくとも１つの成分を混合して使用し得、他の通常の添加剤、例えば抗酸化剤、緩衝剤、殺菌剤等を必要に応じて添加し得る。さらに、組成物は、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および滑沢剤のさらなる添加によって、注射用製剤、例えば水溶液、懸濁液、エマルジョン等、丸薬、カプセル剤、顆粒剤または錠剤に調製し得る。他の担体は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences (E. W. Martin) に記載されている。組成物は、少なくとも１つの抗Ａｎｇ２抗体を処置有効量で含み得る。

【0051】

薬学的に許容しうる担体は、無菌水溶液または分散液、および無菌注射用溶液または分散液の用時調製用の無菌粉末を包含する。医薬活性物質にそのような媒体および物質を使用することは、当分野で知られている。組成物は好ましくは、非経口注射用に調製される。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、リポソーム、または高薬物濃度に適当な他の処方構造物として調製されうる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）およびその適当な混合物を含む溶媒または分散媒でありうる。いくつかの態様において、組成物は、等張化剤、例えば糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを含みうる。無菌注射用溶液は、必要量の活性化合物を、前記成分の１つまたはその組み合わせと共に適当な溶媒中に組み合わせ、その後必要に応じて滅菌マイクロ濾過することによって調製しうる。一般に、分散液は、ベースの分散媒体および前記成分から選択される他の必要成分を含む無菌ビヒクル中に活性化合物を組み合わせることによって調製される。無菌注射用溶液の調製用の無菌粉末は、活性成分粉末および任意の所望の追加成分の粉末を、予め滅菌濾過した溶液から減圧乾燥および凍結乾燥することによって得られる。

【0052】

医薬組成物は、患者の重篤度によって異なりうる用量および頻度で、経口的または非経口的に投与しうる。組成物は、必要に応じて、ボーラスとして、または連続注入によって、患者に投与しうる。例えば、Ｆａｂフラグメントとして供される本発明の抗体のボーラス投与は、０．００２５～１００ｍｇ／ｋｇ体重、０．０２５～０．２５ｍｇ／ｋｇ、０．０１０～０．１０ｍｇ／ｋｇ、または０．１０～０．５０ｍｇ／ｋｇの量でありうる。連続注入のためには、Ｆａｂフラグメントとして供される本発明の抗体は、０．００１～１００ｍｇ／ｋｇ／分、０．０１２５～１．２５ｍｇ／ｋｇ／分、０．０１０～０．７５ｍｇ／ｋｇ／分、０．０１０～１．０ｍｇ／ｋｇ／分、または０．１０～０．５０ｍｇ／ｋｇ／分で、１～２４時間、１～１２時間、２～１２時間、６～１２時間、２～８時間、または１～２時間にわたって投与されうる。完全な定常領域を有する全長抗体として供される本発明の抗体が投与される場合、投与量は、およそ１～１０ｍｇ／ｋｇ体重、２～８ｍｇ／ｋｇ、または５～６ｍｇ／ｋｇでありうる。全長抗体は典型的には、３０分間～３５分間にわたる注入によって投与される。投与頻度は、状態の重篤度による。投与頻度は、毎週３回ないし１週間または２週間に１回でありうる。

【0053】

さらに、組成物は、皮下注射によって患者に投与されうる。例えば、投与量１０～１００ｍｇの抗Ａｎｇ２抗体が、１週間、２週間または１箇月毎に、患者に皮下注射により投与されうる。

【0054】

本書において、「処置有効量」とは、医学的処置に適用可能な妥当なベネフィット／リスク比で疾患を処置するのに十分な量、および抗Ａｎｇ２抗体の組み合わせの量を意味する。正確な量は、処置用組成物の成分および物理的性質、意図される患者集団、個々の患者について考慮すべき条件等を包含するがそれに限定されない多くの因子によって異なり得、当業者によって容易に決定され得る。それら因子をすべて考慮するとき、副作用を伴わずに最大の効果を得るのに十分な最小量を投与することが重要であり、該用量は当業者によって容易に決定され得る。

【0055】

本発明の医薬組成物の用量は、特に限定されず、患者の健康状態および体重、疾患重篤度、薬物の種類、投与経路ならびに投与時間を包含するさまざまな因子に応じて変更される。組成物は、ラット、マウス、ウシ、ヒト等を包含する哺乳動物において通常許容される経路で、例えば経口、直腸、静脈内、皮下、子宮内または脳血管内に、単回投与または１日当たりの多回投与として投与され得る。

【0056】

他の一態様において、本発明は、抗体またはその抗原結合フラグメントを活性成分として含む、癌を予防または治療するための医薬組成物に関する。

【0057】

他の一態様において、本発明は、前記の抗体または抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を患者に投与することを含む、患者における腫瘍増殖抑制および癌処置のための方法に関する。該方法は、本発明の抗体またはそのフラグメントの投与と同時に、または前後して、化学療法に用いられる低分子阻害剤、または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニストを投与することをさらに含みうる。ＶＥＧＦアンタゴニストは、抗ＶＥＧＦ抗体、ＶＥＧＦ阻害融合タンパク質、または低分子キナーゼ阻害剤でありうる。

【0058】

本書において、用語「癌」または「腫瘍」は典型的には、制御されない細胞成長／増殖によって特徴付けられる哺乳動物の生理学的状態をいう。

【0059】

本発明の組成物で処置することのできる癌は、特に限定されず、固形癌および血液癌の両方を包含する。そのような癌の例は、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、皮膚癌、皮膚または眼のメラノーマ、直腸癌、肛門癌、食道癌、小腸癌、内分泌癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、尿道癌、慢性または急性白血病、リンパ腫、肝細胞癌、消化器癌、膵臓癌、神経膠腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝腫瘍、乳癌、結腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、頭頸部癌、脳腫瘍、骨肉腫等を包含するが、それに限定されない。

【0060】

癌を予防または治療するための組成物は抗Ａｎｇ２抗体を含み、その構成は、眼疾患を予防または治療するための組成物に含まれる組成と同様であり、したがってその各構成の記述は、癌を予防または治療するための組成物にも同様に適用される。

【0061】

本願は、本書に記載される抗Ａｎｇ２抗体を、化学療法もしくは放射性療法の介入または他の処置と組み合わせて使用することをも意図する。特に、抗Ａｎｇ２抗体を、Ａｎｇ２の機能の異なる側面を標的とする他の処置と組み合わせることも有効であることが示され得る。

【0062】

他の一態様において、本発明の抗体は、診断または処置剤としての抗体分子の効果を高めるために、少なくとも１つの物質と連結されて抗体コンジュゲートを形成しうる。

【0063】

本発明の他の一態様において、本発明は抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸に関する。

【0064】

本書において、核酸は、細胞、細胞溶解物中に存在するものであり得、または部分的に精製された形態もしくは実質的に純粋な形態で存在するものであり得る。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動および当分野で知られる他の技術を包含する標準的な方法で、他の細胞成分または他の汚染物、例えば他の細胞核酸またはタンパク質から精製されているとき、「単離されている」または「実質的に純粋である」。本発明の核酸は、例えばＤＮＡまたはＲＮＡであり得、イントロン配列を含むかまたはイントロン配列を含まないものであり得る。

【0065】

本発明の他の一態様において、本発明は、核酸を含む組換え発現ベクターに関する。

【0066】

抗体またはそのフラグメントの発現のために、標準的な分子生物学的技術（例えば、ＰＣＲ増幅、または標的抗体を発現するハイブリドーマを用いるｃＤＮＡクローニング）によって、部分長または完全長を有する軽鎖および重鎖をコードするＤＮＡを得ることができ、ＤＮＡを、発現ベクターに挿入されるように、転写および翻訳調節配列に「作動可能に結合」することができる。

【0067】

本書において、用語「作動可能に結合」するとは、抗体遺伝子がベクター中に、ベクター中の転写および翻訳調節配列が抗体遺伝子の転写および翻訳を調節する意図される機能を持つようにライゲートされることをさしうる。発現ベクターおよび発現調節配列は、使用する発現用宿主細胞との適合性を持つように選択される。抗体の軽鎖遺伝子および抗体の重鎖遺伝子は、別個のベクターに挿入されるか、または同じ発現ベクターに挿入される。抗体は、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子フラグメントおよびベクター上の相補的制限酵素部位のライゲーション、または制限酵素部位が全く存在しない場合は、平滑末端ライゲーション）によって発現ベクターに挿入される。いくつかの態様において、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードしうる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にフレームにしたがって結合するように、ベクター中にクローン化されうる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち免疫グロブリン以外のタンパク質に由来するシグナルペプチド）でありうる。さらに、組換え発現ベクターは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を有する。「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、および抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御する他の発現調節エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を包含しうる。当業者は、発現ベクターのデザインは、形質転換する宿主細胞の種類、タンパク質の発現レベル等といった因子に応じた調節配列の変更によって変わりうることを認識することができる。

【0068】

他の一態様において、本発明は、組換え発現ベクターが導入された細胞に関する。

【0069】

本開示の抗体を生産するために使用する細胞は、原核生物、酵母、またはより高等な真核生物の細胞でありうるが、それに限定されない。

【0070】

特に、バチルス属の株、例えば大腸菌、枯草菌およびバチルス・チューリンゲンシス（Bacillus tuligensis）、ストレプトミセス属の株、シュードモナス属の株（例えばシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida））、ならびに原核生物宿主細胞株、例えばプロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）、およびスタフィロコッカス属の株（例えばスタフィロコッカス・カルノーサス（Staphylococcus carnosus））を使用することができる。

【0071】

動物細胞の関心が最も高く、有用な宿主細胞株の例は、以下のものを包含するが、それに限定されない：ＣＯＳ－７、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＨＯＫ１、ＤＸＢ－１１、ＤＧ－４４、ＣＨＯ／－ＤＨＦＲ、ＣＶ１、ＣＯＳ－７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＴＭ４、ＶＥＲＯ、ＨＥＬＡ、ＭＤＣＫ、ＢＲＬ ３Ａ、Ｗ１３８、Ｈｅｐ Ｇ２、ＳＫ－Ｈｅｐ、ＭＭＴ、ＴＲＩ、ＭＲＣ ５、ＦＳ４、３Ｔ３、ＲＩＮ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、Ｕ２０Ｓ、またはＨＴ１０８０。

【0072】

核酸またはベクターは、宿主細胞にトランスフェクトされる。「トランスフェクション」のために、原核生物宿主細胞または真核生物宿主細胞に外来核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を導入する、一般に用いられるさまざまな種類の技術、例えば電気泳動、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ－デキストラントランスフェクション、リポフェクション等を用いうる。本発明の抗体は、哺乳動物細胞への適用可能性を考慮して、真核生物細胞において、好ましくは、哺乳動物宿主細胞において発現されうる。抗体の発現に適当な哺乳動物宿主細胞は、例えばチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、ＤＨＦＲ選択マーカーと共に用いられるｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞を包含する）、ＮＳＯミエローマ細胞、ＣＯＳ細胞またはＳＰ２細胞等を包含しうる。

【0073】

他の一態様において、本発明は、抗Ａｎｇ２抗体またはその抗原結合フラグメントを生産する方法であって、宿主細胞を培養し、抗体またはその抗原結合フラグメントを発現させることを含む方法に関する。

【0074】

抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞に導入する場合、宿主細胞を、抗体が宿主細胞中で発現されるのに十分な時間培養することによって、より好ましくは、抗体が宿主細胞が培養される培養培地中に分泌されるのに十分な時間培養することによって、抗体を生産しうる。

【0075】

いくつかの態様において、発現された抗体は、宿主細胞から分離され、均一に精製されうる。抗体の分離または精製は、タンパク質に一般に用いられる分離方法、精製方法、例えばクロマトグラフィーによって実施されうる。クロマトグラフィーは、例えば、プロテインＡカラムおよびプロテインＧカラムを含む、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、または疎水性クロマトグラフィーを包含しうる。クロマトグラフィーに加えて、濾過、限外濾過、塩析、透析等をさらに組み合わせて、抗体を分離および精製しうる。

【実施例0076】

以下、下記実施例を参照して本発明をより詳細に説明する。しかしながら、下記実施例は単に本発明を説明するためのものであり、当業者には、本発明の範囲が実施例に限定されると解釈されるものでないことは明らかであろう。

【実施例0077】

マウスモノクローナル抗Ａｎｇ２抗体の調製
１－１：ヒトＡｎｇ２によるマウスの免疫
抗原としての使用のために、ヒトＡｎｇ２（ｈＡｎｇ２、配列番号２）の受容体結合ドメイン（ＲＢＤ）を、ＣＭＶプロモーターを含むベクター中にクローン化し、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞株へのトランスフェクションによって一過性に発現させた。５日間のインキュベーション後、発現された組換えヒトＡｎｇ２－ＲＢＤをアフィニティーカラムによって精製した。精製したヒトＡｎｇ２－ＲＢＤ（１００μｇ／注射）をアジュバントと混合したものによって、５週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスを１週間に２回、６週間にわたり免疫した。免疫したマウスの血清における抗Ａｎｇ２抗体価を、ｈＡｎｇ２ ＥＬＩＳＡによって調べた。抗体価（１：５０００希釈）が適度に上昇したら（ＯＤ＞１．０）、免疫マウスから脾臓を摘出し、そこからＢリンパ球を単離し、培養したミエローマ細胞（ＳＰ２／０）と融合した。融合細胞を、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含むＨＡＴ培地中で培養し、そこから、ミエローマ細胞とＢリンパ球の融合物のみからなるハイブリドーマ細胞を選択し、培養した。生き延びたハイブリドーマ細胞を９６ウェルプレートに播種し、培養上清をｈＡｎｇ２ ＥＬＩＳＡによって試験した。陽性シグナルを示したハイブリドーマのプールを、限界希釈によるクローン選別のために選択した。最終的に、約５０のモノクローナルハイブリドーマ株を確立した。そのなかで、いくつかのＡｎｇ２結合性抗体がＴｉｅ２活性化活性を示した。Ｔｉｅ２活性化レベルおよびヒトＡｎｇ２に対する高親和性に基づいて候補抗体を選択し、後でヒト化のために処理した。

【0078】

【表1】

【0079】

１－２：マウスモノクローナル抗Ａｎｇ２抗体の生産および精製
ＥＬＩＳＡ陽性反応に基づいて選択した抗Ａｎｇ２抗体を生産するために、ハイブリドーマ細胞を、Ｔ７５フラスコ（面積７５ｃｍ^２）において１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）中で培養した。細胞コンフルエンシーが約９０％に達したら、細胞をＰＢＳで洗い、５０ｍｌの無血清培地（ＳＦＭ、Gibco）と共にインキュベートし３７℃で３日間培養した。その後、各モノクローナルハイブリドーマから抗体が分泌された培養培地を収集し、遠心分離によって細胞を除去し、培養上清を収集し、濾過した。次いで、抗体を、プロテインＧアフィニティーカラム（GE Healthcare）を備えるAKTA精製デバイス（GE Healthcare）を用いて精製した。遠心フィルターユニット（Amicon）を用いて上清をＰＢＳで置換することにより、精製した抗体を濃縮した。

【0080】

１－３：Ｔｉｅ２受容体活性化 抗Ａｎｇ２抗体の同定およびスクリーニング
マウス抗Ａｎｇ２抗体が内皮細胞においてＴｉｅ２受容体の下流シグナル伝達を誘導するかを調べるために、ＨＵＶＥＣ（Lonza）をｈＡｎｇ２タンパク質と抗Ａｎｇ２抗体の組み合わせで処理し、Ｔｉｅ２受容体の主要な下流シグナル伝達タンパク質であるＡｋｔのリン酸化レベルを、免疫ブロッティングにより分析した。陰性対照群として、全長ｈＡｎｇ２（R&D systems）単独で細胞を処理した。

【0081】

具体的には、ＨＵＶＥＣ（１×１０^５細胞／ｍｌ）を、６０ｍｍ培養皿においてＥＧＭ－２培地（Lonza）中で３７℃で培養した。細胞（９０％のコンフルエンシー）を、血清飢餓のために、無血清ＥＢＭ－２培地と共に４時間インキュベートした。血清飢餓ＨＵＶＥＣを抗Ａｎｇ２抗体とｈＡｎｇ２タンパク質（１μｇ／ｍｌ、R&D system）の混合物で処理し、さらに３０分間インキュベートした。細胞を冷ＰＢＳで洗い、溶解バッファーで処理し、４℃で２０分間溶解した。次いで、１３０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離により、細胞溶解物を調製した。細胞溶解物に５×ＳＤＳサンプルバッファーを加え、細胞溶解物を９５℃で５分間沸騰させた。その後、細胞溶解物をＳＤＳ ＰＡＧＥに付し、タンパク質をニトロセルロース膜（GE）に転写した。

【0082】

Ａｋｔリン酸化を調べるために、ブロットを５％スキムミルク含有ＴＢＳ－Ｔで室温（ＲＴ）で１時間ブロックし、抗ホスホＡｋｔ抗体（Ｓ４７３）と共に４℃で約８時間インキュベートした。増強化学発光（ＥＣＬ）により、ホスホＡｋｔの量を可視化した。その後、膜をストリッピングバッファー（Thermo）中で１５分間インキュベートし、次いで抗Ａｋｔ抗体でリプローブして、全Ａｋｔ量を決定した。

【0083】

ＡｋｔのＳ４７３におけるリン酸化が、ｈＡｎｇ２と抗Ａｎｇ２抗体、例えば２Ｃ８、４Ｂ９、２Ｆ１０および４Ｅ２のそれぞれとの組み合わせで処理したいくつかの群において、強く誘導された（図１）。

【0084】

１－４：Octet分析による、ｈＡｎｇ２に対する抗Ａｎｇ２抗体の親和性測定
ｈＡｎｇ２に対するマウスモノクローナ抗体の親和性を、Octetシステム（ForteBio）を用いて測定した。具体的には、バッファーおよびサンプルを、ブラック９６ウェルプレート（９６ウェルＦ型ブラックプレート、Greiner）を用いて、全量２００μｌ／ウェルで測定した。親和性測定用のバイオセンサーは、ＡＲ２Ｇチップ（ForteBio Octet）を用いる測定前に１０分間水和した。水和後、ｈＡｎｇ２を１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ６．０バッファー中に１０μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、ＡＲ２Ｇバイオセンサー上に固定し、１Ｍエタノールアミンでブロックした。マウスモノクローナル抗Ａｎｇ２抗体を１×カイネティックバッファーで５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５および０ｎＭに希釈し、結合に３００秒間、解離に９００秒間付した。親和性測定（Ｋ_Ｄ）のために、結合速度（Ｋ－ｏｎ）および解離速度（Ｋ－ｏｆｆ）を結合曲線によって分析し（グローバル）、Octetデータ分析v9.0.0.10プログラムを用いて１：１結合モデルにフィットさせた。ＫＤ値を下記の表２に示す。ｈＡｎｇ２に対するマウス抗Ａｎｇ２抗体の親和性を表２に示す。

【0085】

【表2】