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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024009937
(43)【公開日】2024-01-23
(54)【発明の名称】単一方向デュアルプローブプライマー伸長による標的濃縮
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6806 20180101AFI20240116BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20240116BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6806 Z
C12Q1/6869 Z
【審査請求】有
【請求項の数】12
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023176172
(22)【出願日】2023-10-11
(62)【分割の表示】P 2022092739の分割
【原出願日】2018-12-19
(31)【優先権主張番号】62/609,013
(32)【優先日】2017-12-21
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】591003013
【氏名又は名称】エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー
【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ
(71)【出願人】
【識別番号】511109814
【氏名又は名称】カパ バイオシステムズ， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(72)【発明者】
【氏名】バージェス，ダニエル
(72)【発明者】
【氏名】ゴドウィン，ブライアン・クリストファー
(72)【発明者】
【氏名】ラブジョイ，アレクサンダー
(72)【発明者】
【氏名】ミラー，ブロンウェン
(72)【発明者】
【氏名】プラッツァー，ジョセフ
(72)【発明者】
【氏名】ペンクラー，ジョー－アン・エリザベス
(57)【要約】 （修正有）
【課題】核酸のライブラリー中の少なくとも１つの標的核酸の濃縮のための方法を提供する。
【解決手段】第１のオリゴヌクレオチドは、第１及び第２のアダプターを有する核酸のライブラリー中の標的核酸にハイブリダイズされる。ハイブリダイズした第１のオリゴヌクレオチドは、第１のポリメラーゼで伸長され、それにより、標的核酸及び伸長された第１のオリゴヌクレオチドを含む第１のプライマー伸長複合体を生成する。第１のプライマー伸長複合体が捕捉され、核酸のライブラリーに対して濃縮され、第２のオリゴヌクレオチドが標的核酸にハイブリダイズする。ハイブリダイズした第２のオリゴヌクレオチドは第２のポリメラーゼで伸長され、それにより標的核酸及び伸長された第２のオリゴヌクレオチドを含む第２のプライマー伸長複合体を生成し、伸長された第１のオリゴヌクレオチドを第１のプライマー伸長複合体からさらに遊離させる。
【選択図】図１
【解決手段】第１のオリゴヌクレオチドは、第１及び第２のアダプターを有する核酸のライブラリー中の標的核酸にハイブリダイズされる。ハイブリダイズした第１のオリゴヌクレオチドは、第１のポリメラーゼで伸長され、それにより、標的核酸及び伸長された第１のオリゴヌクレオチドを含む第１のプライマー伸長複合体を生成する。第１のプライマー伸長複合体が捕捉され、核酸のライブラリーに対して濃縮され、第２のオリゴヌクレオチドが標的核酸にハイブリダイズする。ハイブリダイズした第２のオリゴヌクレオチドは第２のポリメラーゼで伸長され、それにより標的核酸及び伸長された第２のオリゴヌクレオチドを含む第２のプライマー伸長複合体を生成し、伸長された第１のオリゴヌクレオチドを第１のプライマー伸長複合体からさらに遊離させる。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
核酸のライブラリー中の少なくとも１つの標的核酸を濃縮するための方法であって、以下のステップ：
第１のオリゴヌクレオチドを、核酸のライブラリー中の標的核酸にハイブリダイズするステップであって、核酸のライブラリー中の各核酸が、第１のアダプターを含む第１の末端及び第２のアダプターを含む第２の末端を有するステップ；
ハイブリダイズした第１のオリゴヌクレオチドを第１のポリメラーゼで伸長し、それにより標的核酸及び伸長された第１のオリゴヌクレオチドを含む第１のプライマー伸長複合体を生成するステップ；
第１のプライマー伸長複合体を捕捉するステップ；
第１のプライマー伸長複合体を、核酸のライブラリーに対して濃縮するステップ；
第２のオリゴヌクレオチドを標的核酸にハイブリダイズするステップ；
ハイブリダイズした第２のオリゴヌクレオチドを第２のポリメラーゼで伸長し、それにより、標的核酸及び伸長された第２のオリゴヌクレオチドを含む第２のプライマー伸長複合体を生成し、それにより、伸長された第１のオリゴヌクレオチドを第１のプライマー伸長複合体から遊離させるステップ；並びに
標的核酸を第３のポリメラーゼ、第１の増幅プライマー、及び第２の増幅プライマーで増幅するステップであって、第１の増幅プライマーが、第１のアダプターに相補的な３’末端を持ち、第２の増幅プライマーが、第２のアダプターに相補的な３’末端を持つステップ
を含む方法。
第１のオリゴヌクレオチドを、核酸のライブラリー中の標的核酸にハイブリダイズするステップであって、核酸のライブラリー中の各核酸が、第１のアダプターを含む第１の末端及び第２のアダプターを含む第２の末端を有するステップ；
ハイブリダイズした第１のオリゴヌクレオチドを第１のポリメラーゼで伸長し、それにより標的核酸及び伸長された第１のオリゴヌクレオチドを含む第１のプライマー伸長複合体を生成するステップ；
第１のプライマー伸長複合体を捕捉するステップ；
第１のプライマー伸長複合体を、核酸のライブラリーに対して濃縮するステップ；
第２のオリゴヌクレオチドを標的核酸にハイブリダイズするステップ；
ハイブリダイズした第２のオリゴヌクレオチドを第２のポリメラーゼで伸長し、それにより、標的核酸及び伸長された第２のオリゴヌクレオチドを含む第２のプライマー伸長複合体を生成し、それにより、伸長された第１のオリゴヌクレオチドを第１のプライマー伸長複合体から遊離させるステップ；並びに
標的核酸を第３のポリメラーゼ、第１の増幅プライマー、及び第２の増幅プライマーで増幅するステップであって、第１の増幅プライマーが、第１のアダプターに相補的な３’末端を持ち、第２の増幅プライマーが、第２のアダプターに相補的な３’末端を持つステップ
を含む方法。
【請求項2】
増幅された標的核酸を、配列決定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
第１のオリゴヌクレオチドが、捕捉部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
第１のオリゴヌクレオチドが、第１のオリゴヌクレオチドを標的核酸にハイブリダイズする前に固体支持体に結合しており、並びに第１のオリゴヌクレオチドを標的核酸にハイブリダイズし、及びハイブリダイズした第１のオリゴヌクレオチドをポリメラーゼで伸長することが、それにより、固体支持体上の第１のプライマー伸長複合体を捕捉する、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを、第１のプライマー伸長複合体中の伸長された第１のオリゴヌクレオチド及び第２のプライマー伸長複合体中の伸長された第２のオリゴヌクレオチドの少なくとも１つに組み込むステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
第１のプライマー伸長複合体中の伸長された第１のオリゴヌクレオチドに少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを組み込むステップをさらに含み、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドは捕捉部分を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
第１のプライマー伸長複合体における伸長された第１のオリゴヌクレオチド、及び
第２のプライマー伸長複合体における伸長された第２のオリゴヌクレオチド
の少なくとも１つに、少なくとも１つのウラシルを組み込むステップをさらに含み、
それにより、ウラシル含有オリゴヌクレオチド産物を形成する、請求項１に記載の方法。
第２のプライマー伸長複合体における伸長された第２のオリゴヌクレオチド
の少なくとも１つに、少なくとも１つのウラシルを組み込むステップをさらに含み、
それにより、ウラシル含有オリゴヌクレオチド産物を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
核酸のライブラリーを、ブロッキングオリゴヌクレオチドと接触させるステップをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項9】
第１のアダプター及び第２のアダプターが、フォーク型アダプターである、請求項１に
記載の方法。
記載の方法。
【請求項10】
第１のアダプター及び第２のアダプターが、少なくとも１つのウラシルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
第２のオリゴヌクレオチドが、第１のオリゴヌクレオチドに対して５’位で標的核酸にハイブリダイズする、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
第１のアダプター、第２のアダプター、第１の増幅プライマー、及び第２の増幅プライマーのうちの少なくとも１つが、固有識別子（ＵＩＤ）配列、分子識別子（ＭＩＤ）配列のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
核酸のライブラリー中の少なくとも１つの標的核酸の濃縮のためのキットであって、前記キットが：
核酸のライブラリー中の標的核酸に相補的な第１のオリゴヌクレオチドであって、核酸のライブラリー中の各核酸が、第１のアダプターを含む第１の末端及び第２のアダプターを含む第２の末端を有する、第１のオリゴヌクレオチド；
標的核酸に相補的な第２のオリゴヌクレオチド；
第１の増幅プライマー；及び
第２の増幅プライマー
を含み、
ここで、第１のオリゴヌクレオチドが捕捉部分を含み、
ここで、第２のオリゴヌクレオチドが、第１のオリゴヌクレオチドに対して５’位で標的核酸にハイブリダイズし、
ここで、第１の増幅プライマーが、第１のアダプターに相補的な３’末端を有し、第２の増幅プライマーが、第２のアダプターに相補的な３’末端を有する、キット。
核酸のライブラリー中の標的核酸に相補的な第１のオリゴヌクレオチドであって、核酸のライブラリー中の各核酸が、第１のアダプターを含む第１の末端及び第２のアダプターを含む第２の末端を有する、第１のオリゴヌクレオチド；
標的核酸に相補的な第２のオリゴヌクレオチド；
第１の増幅プライマー；及び
第２の増幅プライマー
を含み、
ここで、第１のオリゴヌクレオチドが捕捉部分を含み、
ここで、第２のオリゴヌクレオチドが、第１のオリゴヌクレオチドに対して５’位で標的核酸にハイブリダイズし、
ここで、第１の増幅プライマーが、第１のアダプターに相補的な３’末端を有し、第２の増幅プライマーが、第２のアダプターに相補的な３’末端を有する、キット。
【請求項14】
核酸のライブラリー中の少なくとも１つの標的核酸の濃縮のためのキットであって、前記キットが：
核酸のライブラリー中の標的核酸に相補的な第１のオリゴヌクレオチドであって、核酸のライブラリー中の各核酸が、第１のアダプターを含む第１の末端及び第２のアダプターを含む第２の末端を有する、第１のオリゴヌクレオチド；
捕捉部分を有する修飾ヌクレオチド；
標的核酸に相補的な第２のオリゴヌクレオチド；
第１の増幅プライマー；及び
第２の増幅プライマー
を含み、
ここで、第２のオリゴヌクレオチドが、第１のオリゴヌクレオチドに対して５’位で標的核酸にハイブリダイズし、
ここで、第１の増幅プライマーが、第１のアダプターに相補的な３’末端を有し、第２の増幅プライマーが、第２のアダプターに相補的な３’末端を有する、キット。
核酸のライブラリー中の標的核酸に相補的な第１のオリゴヌクレオチドであって、核酸のライブラリー中の各核酸が、第１のアダプターを含む第１の末端及び第２のアダプターを含む第２の末端を有する、第１のオリゴヌクレオチド；
捕捉部分を有する修飾ヌクレオチド；
標的核酸に相補的な第２のオリゴヌクレオチド；
第１の増幅プライマー；及び
第２の増幅プライマー
を含み、
ここで、第２のオリゴヌクレオチドが、第１のオリゴヌクレオチドに対して５’位で標的核酸にハイブリダイズし、
ここで、第１の増幅プライマーが、第１のアダプターに相補的な３’末端を有し、第２の増幅プライマーが、第２のアダプターに相補的な３’末端を有する、キット。
【請求項15】
少なくとも１つの標的核酸を含む核酸のライブラリーであって、核酸のライブラリー中の各核酸が、第１のアダプターを含む第１の末端、第２のアダプターを含む第２の末端、及び第１のアダプター及び第２のアダプターの中間の目的領域を有する、核酸のライブラリー；
標的核酸の目的領域にハイブリダイズした伸長された第１のオリゴヌクレオチドであって、少なくとも１つの捕捉部分を含む伸長された第１のオリゴヌクレオチド；
少なくとも１つの捕捉部分に結合した固体支持体；
第１の伸長されたオリゴヌクレオチドに対して５’位で標的核酸にハイブリダイズした第
２のオリゴヌクレオチド；並びに
第２のオリゴヌクレオチドの３’末端に会合したポリメラーゼ
を含む組成物。
標的核酸の目的領域にハイブリダイズした伸長された第１のオリゴヌクレオチドであって、少なくとも１つの捕捉部分を含む伸長された第１のオリゴヌクレオチド；
少なくとも１つの捕捉部分に結合した固体支持体；
第１の伸長されたオリゴヌクレオチドに対して５’位で標的核酸にハイブリダイズした第
２のオリゴヌクレオチド；並びに
第２のオリゴヌクレオチドの３’末端に会合したポリメラーゼ
を含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
[0001]本開示は、一般に、サンプル中の核酸標的の濃縮に関し、より詳細には、ハイスループット配列決定を含む、核酸配列決定のための標的の濃縮に関する。
【背景技術】
【0002】
[0002]本発明は、配列決定される核酸内の目的領域にユーザーが焦点を絞ることを可能にする技術のクラスに属する。このことにより、配列決定反応とそれに続くデータ分析に付随するコストが低減される。現在、サンプルに存在する核酸内の目的領域を選択的に捕捉する３つの一般的なタイプの技術がある。第１の技術はハイブリダイゼーション捕捉で、捕捉表面に選択的に結合できるプローブのハイブリダイゼーションによって目的領域が捕捉される。非標的核酸の除去がこの捕捉により可能となり、その後、捕捉された標的分子の放出及び回収が続く。このタイプの技術は、エクソームサイズの領域や未知の構造多型を含む領域を捕捉する能力を含む利点を有する。短所には、完了するまでに８時間以上かかる傾向のある長く複雑なプロトコルが挙げられる。複雑さは主に、ハイブリダイゼーションの前にランダムにフラグメント化されたショットガンライブラリーを準備する必要があることにより発生する。ハイブリダイゼーションステップだけでも、完了するまでに最大３日かかることがある。このタイプの技術の例には、ＳＥＣＡＰ ＥＺ標的濃縮システム（ＲＯＣＨＥ）及びＳＵＲＥＳＥＬＥＣＴ標的濃縮システム（ＡＧＩＬＥＮＴ）が含まれる。
【0003】
[0003]標的濃縮の別の方法は、デュアル標的プライマーに基づく増幅である。この方法では、標的の境界にある２つのプローブを使用して目的領域を濃縮する。この方法は、８時間未満で完了する傾向があり、ハイブリダイゼーション捕捉法よりも簡単である。しかしながら、デュアルプライマーに基づく技術は、未知の構造多型を持つ配列を濃縮することができない。最も確立されたデュアルプライマーアプローチは、マルチプレックスポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。これは非常に簡単な単一ステップのプロセスであるが、反応チューブあたり数十の標的を増幅することしかできない。現在、単一の反応チューブ内で数百から数千の標的を増幅することができ、数回の処理ステップしか必要としない、ＴＲＵＳＥＱアンプリコン配列決定キット（ＩＬＬＵＭＩＮＡ）及びＩＯＮ ＴＯＲＲＥＮＴ ＡＭＰＬＩＳＥＱ配列決定キット（ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）製品を含む、他のより新しい技術が利用可能である。
【0004】
[0004]第３の技術は、単一標的プライマーに基づく増幅である。この方法では、単一標的プライマー及び末端ライゲーションユニバーサルプライマーによって定義される領域の増幅によって、標的が濃縮される。ハイブリダイゼーションに基づくアプローチと同様に；これらの技術では、標的オリゴヌクレオチドの選択的ハイブリダイゼーションの前に、ランダムにフラグメント化されたショットガンライブラリーを生成する必要がある。しかしながら、このオリゴヌクレオチドを、標的を捕捉し、非標的分子を洗い流すことに使用する代わりに、ランダムに生成された末端と標的特異的オリゴヌクレオチドとの間の領域を選択的に増幅する増幅ステップが採用される。この技術の利点は、デュアルプライマー技術とは異なり、未知の構造多型を持つ配列の検出が可能となることである。また、それはハイブリダイゼーションに基づく技術よりも迅速で簡単である。しかしながら、このタイプの技術は、デュアルプライマーに基づくアプローチよりも低速で複雑である。このタイプの技術の例は、ＡＲＣＨＥＲのアンカーマルチプレックスＰＣＲ（ＡＲＣＨＥＲ ＤＸ）及びＯＶＡＴＩＯＮ標的濃縮システム（ＮＵＧＥＮ）である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
[0005]標的配列における未知の構造多型にも対応する、標的濃縮の迅速かつ簡単な方法に対する満たされぬ必要性が依然として存在する。
【課題を解決するための手段】
【0006】
[0006]一実施形態によれば、本開示は、核酸のライブラリーにおける少なくとも１つの標的核酸の濃縮のための方法を提供する。この方法は、第１のオリゴヌクレオチドを、核酸のライブラリー中の標的核酸にハイブリダイズさせることを含む。核酸のライブラリー中の各核酸は、第１のアダプターを含む第１の末端及び第２のアダプターを含む第２の末端を有する。この方法はさらに、ハイブリダイズした第１のオリゴヌクレオチドを第１のポリメラーゼで伸長し、それにより標的核酸及び伸長された第１のオリゴヌクレオチドを含む第１のプライマー伸長複合体を生成することを含む。この方法はさらに、第１のプライマー伸長複合体を捕捉し、核酸のライブラリーに対して第１のプライマー伸長複合体を濃縮し、第２のオリゴヌクレオチドを標的核酸にハイブリダイズし、ハイブリダイズした第２のオリゴヌクレオチドを第２のポリメラーゼで伸長し、それにより、標的核酸及び伸長された第２のオリゴヌクレオチドを含む第２のプライマー伸長複合体を生成し、それにより、伸長された第１のオリゴヌクレオチドを第１のプライマー伸長複合体から遊離させることを含む。この方法はさらに、第３のポリメラーゼ、第１の増幅プライマー、及び第２の増幅プライマーで標的核酸を増幅することを含み、第１の増幅プライマーは第１のアダプターに相補的な３’末端を有し、第２の増幅プライマーは第２のアダプターに相補的な３’末端を有する。
【0007】
[0007]一態様では、方法は、増幅された標的核酸を配列決定することをさらに含む。
[0008]別の態様では、第１のオリゴヌクレオチドは、捕捉部分を含む。
[0009]別の態様では、第１のプライマー伸長複合体を捕捉することは、固体支持体上に捕捉部分を捕捉することを含む。
[0008]別の態様では、第１のオリゴヌクレオチドは、捕捉部分を含む。
[0009]別の態様では、第１のプライマー伸長複合体を捕捉することは、固体支持体上に捕捉部分を捕捉することを含む。
【0008】
[0010]別の態様では、捕捉部分はビオチンであり、固体支持体はストレプトアビジンを含む。
[0011]別の態様では、第１のオリゴヌクレオチドは標的核酸にハイブリダイズする前に、第１のオリゴヌクレオチドを固体支持体に結合しており、第１のオリゴヌクレオチドを標的核酸にハイブリダイズし、ハイブリダイズした第１のオリゴヌクレオチドをポリメラーゼで伸長することが、それにより、固体支持体上の第１のプライマー伸長複合体を捕捉する。
[0011]別の態様では、第１のオリゴヌクレオチドは標的核酸にハイブリダイズする前に、第１のオリゴヌクレオチドを固体支持体に結合しており、第１のオリゴヌクレオチドを標的核酸にハイブリダイズし、ハイブリダイズした第１のオリゴヌクレオチドをポリメラーゼで伸長することが、それにより、固体支持体上の第１のプライマー伸長複合体を捕捉する。
【0009】
[0012]別の態様では、第１のプライマー伸長複合体の捕捉は、ハイブリダイズした第１のオリゴヌクレオチドを伸長した後に行われる。
[0013]別の態様では、本方法は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを、第１のプライマー伸長複合体中の伸長された第１のオリゴヌクレオチド及び第２のプライマー伸長複合体中の伸長された第２のオリゴヌクレオチドの少なくとも１つに組み込むことをさらに含む。
[0013]別の態様では、本方法は、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを、第１のプライマー伸長複合体中の伸長された第１のオリゴヌクレオチド及び第２のプライマー伸長複合体中の伸長された第２のオリゴヌクレオチドの少なくとも１つに組み込むことをさらに含む。
【0010】
[0014]別の態様では、修飾ヌクレオチドは、ｄＵＴＰ及び捕捉部分を有するヌクレオチドから選択される。
[0015]別の態様では、本方法は、第１のプライマー伸長複合体中の伸長された第１のオリゴヌクレオチドに少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを組み込むことをさらに含み、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドは捕捉部分を有する。
[0015]別の態様では、本方法は、第１のプライマー伸長複合体中の伸長された第１のオリゴヌクレオチドに少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを組み込むことをさらに含み、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドは捕捉部分を有する。
【0011】
[0016]別の態様では、第１のプライマー伸長複合体を捕捉することは、固体支持体上に捕捉部分を捕捉することを含む。
[0017]別の態様では、本方法は、少なくとも１つのウラシルを第１のプライマー伸長複合体の伸長された第１のオリゴヌクレオチド及び第２のプライマー伸長複合体の伸長された第２のオリゴヌクレオチドの少なくとも１つに組み込むこと、それによりウラシル含有オリゴヌクレオチド産物を形成することをさらに含む。
[0017]別の態様では、本方法は、少なくとも１つのウラシルを第１のプライマー伸長複合体の伸長された第１のオリゴヌクレオチド及び第２のプライマー伸長複合体の伸長された第２のオリゴヌクレオチドの少なくとも１つに組み込むこと、それによりウラシル含有オリゴヌクレオチド産物を形成することをさらに含む。
【0012】
[0018]別の態様では、本方法は、ウラシル含有オリゴヌクレオチド産物を消化することをさらに含む。
[0019]別の態様では、ウラシル含有オリゴヌクレオチド産物の消化は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ及びＤＮＡグリコシラーゼリアーゼのうちの少なくとも１つを用いて達成される。
[0019]別の態様では、ウラシル含有オリゴヌクレオチド産物の消化は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ及びＤＮＡグリコシラーゼリアーゼのうちの少なくとも１つを用いて達成される。
【0013】
[0020]別の態様では、ＤＮＡグリコシラーゼリアーゼは、エンドヌクレアーゼＩＶ及びエンドヌクレアーゼＶＩＩＩから選択される。
[0021]別の態様では、本方法は、核酸のライブラリーをブロッキングオリゴヌクレオチドと接触させることをさらに含む。
[0021]別の態様では、本方法は、核酸のライブラリーをブロッキングオリゴヌクレオチドと接触させることをさらに含む。
【0014】
[0022]別の態様では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、第１のアダプター及び第２のアダプターの少なくとも１つに少なくとも部分的に相補的である。
[0023]別の態様では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ユニバーサルブロッキングオリゴヌクレオチドである。
[0023]別の態様では、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ユニバーサルブロッキングオリゴヌクレオチドである。
【0015】
[0024]別の態様では、第１のアダプター及び第２のアダプターは、同じ核酸配列を有する。
[0025]別の態様では、第１のアダプター及び第２のアダプターは、異なる核酸配列を有する。
[0025]別の態様では、第１のアダプター及び第２のアダプターは、異なる核酸配列を有する。
【0016】
[0026]別の態様では、第１のアダプター及び第２のアダプターは、フォーク型アダプターである。
[0027]別の態様では、第１のアダプター及び第２のアダプターは、少なくとも１つのウラシルを含む。
[0027]別の態様では、第１のアダプター及び第２のアダプターは、少なくとも１つのウラシルを含む。
【0017】
[0028]別の態様では、第１のポリメラーゼ及び第２のポリメラーゼの少なくとも１つは、ウラシル不適合性ポリメラーゼである。
[0029]別の態様では、第３のポリメラーゼは、ウラシル適合性ポリメラーゼである。
[0029]別の態様では、第３のポリメラーゼは、ウラシル適合性ポリメラーゼである。
【0018】
[0030]別の態様では、第２のオリゴヌクレオチドは、標的核酸に第１のオリゴヌクレオチドに対して５’位でハイブリダイズする。
[0031]別の態様では、第３のポリメラーゼは、ウラシル不適合性ポリメラーゼである。
[0031]別の態様では、第３のポリメラーゼは、ウラシル不適合性ポリメラーゼである。
【0019】
[0032]別の態様では、第１のアダプター、第２のアダプター、第１の増幅プライマー、及び第２の増幅プライマーの少なくとも１つは、固有識別子（ｕｎｉｑｕｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ；ＵＩＤ）配列、分子識別子（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ；ＭＩＤ）配列の少なくとも１つを含む。
【0020】
[0033]別の実施形態によれば、本開示は、核酸のライブラリー中の少なくとも１つの標的核酸を濃縮するためのキットを提供する。キットは、核酸のライブラリー中の標的核酸に相補的な第１のオリゴヌクレオチドを含み、核酸のライブラリー中の各核酸は、第１のアダプターを含む第１の末端及び第２のアダプターを含む第２の末端を有する。キットは、標的核酸に相補的な第２のオリゴヌクレオチド、第１の増幅プライマー、及び第２の増幅プライマーをさらに含む。第１のオリゴヌクレオチドは捕捉部分を含み、第２のオリゴヌクレオチドは第１のオリゴヌクレオチドに対して５’位で標的核酸にハイブリダイズし、第１の増幅プライマーは第１のアダプターに相補的な３’末端を持ち、第２の増幅プライマーは第２のアダプターに相補的な３’末端を持つ。
【0021】
[0034]別の実施形態によれば、本開示は、核酸のライブラリー中の少なくとも１つの標的核酸を濃縮するためのキットを提供する。キットは、核酸のライブラリー中の標的核酸に相補的な第１のオリゴヌクレオチドを含み、核酸のライブラリー中の各核酸は、第１のアダプターを含む第１の末端及び第２のアダプターを含む第２の末端を有する。キットは、捕捉部分を有する修飾ヌクレオチド、標的核酸に相補的な第２のオリゴヌクレオチド、第１の増幅プライマー、及び第２の増幅プライマーをさらに含む。第２のオリゴヌクレオチドは第１のオリゴヌクレオチドに対して５’位で標的核酸にハイブリダイズし、第１の増幅プライマーは第１のアダプターに相補的な３’末端を持ち、第２の増幅プライマーは第２のアダプターに相補的な３’末端を持つ。
【0022】
[0035]一態様では、キットは、ウラシルヌクレオチド、ウラシル適合性ポリメラーゼ、ウラシル不適合性ポリメラーゼ、及びブロッキングオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つをさらに含む。
【0023】
[0036]別の実施形態によれば、本開示は、少なくとも１つの標的核酸を含む核酸のライブラリーを含む組成物を提供する。核酸のライブラリー中の各核酸は、第１のアダプターを含む第１の末端、第２のアダプターを含む第２の末端、並びに第１のアダプター及び第２のアダプターの中間の目的領域を有する。組成物は、標的核酸の目的領域にハイブリダイズした伸長された第１のオリゴヌクレオチドをさらに含む。伸長された第１のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの捕捉部分を含む。組成物は、少なくとも１つの捕捉部分に結合した固体支持体、第１の伸長されたオリゴヌクレオチドに対して５’位で標的核酸にハイブリダイズした第２のオリゴヌクレオチド、及び第２のオリゴヌクレオチドの３’末端に会合したポリメラーゼをさらに含む。
【0024】
[0037]一態様では、組成物は、第１のアダプター及び第２のアダプターのそれぞれとハイブリダイズしたブロッキングオリゴをさらに含む。
[0038]別の態様では、少なくとも１つの捕捉部分は、伸長された第１のオリゴヌクレオチドの５’末端に位置する。
[0038]別の態様では、少なくとも１つの捕捉部分は、伸長された第１のオリゴヌクレオチドの５’末端に位置する。
【0025】
[0039]別の態様では、少なくとも１つの捕捉部分は、伸長された第１のオリゴヌクレオチドの伸長部分に組み込まれる。
[0040]別の態様では、伸長された第１のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのウラシル及び少なくとも１つのチミンをさらに含む。
[0040]別の態様では、伸長された第１のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのウラシル及び少なくとも１つのチミンをさらに含む。
【0026】
[0041]別の態様では、ポリメラーゼは、ウラシル不適合性ポリメラーゼである。
[0042]別の態様では、第１のアダプター及び第２のアダプターの少なくとも１つは、少なくとも１つのウラシル及び少なくとも１つのチミンを含む。
[0042]別の態様では、第１のアダプター及び第２のアダプターの少なくとも１つは、少なくとも１つのウラシル及び少なくとも１つのチミンを含む。
【0027】
[0043]別の態様では、第１のプライマー伸長複合体から伸長された第１のオリゴヌクレオチドを遊離させることは、鎖置換活性、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性、及びフラップエンドヌクレアーゼ活性から選択される活性を有する酵素を用いて達成される。
【0028】
[0044]本発明の前述の及び他の態様及び利点は、以下の説明から明らかになるであろう。説明においては、本明細書の一部を形成し、本発明の好ましい実施形態を例として示す添付図面を参照する。しかしながら、そのような実施形態は、必ずしも本発明の全ての範囲を表すものでは無く、したがって、本発明の範囲を解釈するために特許請求の範囲及び本明細書を参照する。
【図面の簡単な説明】
【0029】
【図1】[0045]本開示による、核酸のライブラリー中の少なくとも１つの標的核酸を濃縮するための方法の実施形態を例示する概略フローダイアグラムを示す図である。
【図2】[0046]本開示による、核酸のライブラリー中の少なくとも１つの標的核酸を濃縮するための方法の第１の実施形態の概略表示を示す図である。例示された実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドは、標的核酸の液相捕捉のための捕捉部分を含む。
【図3】[0047]本開示による核酸のライブラリー中の少なくとも１つの標的核酸を濃縮するための方法のさらなる第２の実施形態の概略表示を示す図である。例示された実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドは、標的核酸のインサイツの捕捉のために固体支持体に結合している。
【図4】[0048]本開示による核酸のライブラリー中の少なくとも１つの標的核酸の濃縮のための方法のさらなる第３の実施形態の概略表示を示す図である。例示された実施形態では、標的核酸にハイブリダイズした第１のオリゴヌクレオチドの伸長中に１つ又は複数の捕捉部分が組み込まれ、それにより固体支持体上の標的核酸及び伸長された第１のオリゴヌクレオチドを含む複合体の捕捉が可能になる。
【図5】[0049]分子間アダプター－アダプターハイブリダイゼーションを示すライブラリー分子中の複数の核酸の概略例示を示す図である。
【図6】[0050]図６Ａは、市販のライブラリー調製キットを使用して一般的なアダプター末端配列に適合させた、ヒトゲノムＤＮＡ由来の核酸のライブラリーの電気泳動ＤＮＡ解析機からの蛍光出力トレースを示す図である。１０ｎｇのライブラリー１μＬ及び１００ｎｇのライブラリー１μＬの、それぞれ５サイクルと１２サイクルでの標準ＰＣＲ増幅に続けて、データを収集した。本開示に従って、核酸のライブラリーをサンプルとし、標的核酸について濃縮した。 [0051]図６Ｂは、本開示によるプライマー伸長標的濃縮及び増幅後の図６Ａの核酸のライブラリーの蛍光に基づくサイズ分析を示す図である。
【図7】[0052]図７は、図６Ｂの濃縮された核酸のライブラリーの高レベル配列決定メトリックを示す棒グラフを示す図である。配列決定リードの９９％以上が、ライブラリーに存在することが知られている配列にマップされ、及び配列決定リードの約半分が、濃縮された標的核酸にマップされた。ライブラリーのフォールド８０塩基ペナルティは、６０℃及び６５℃の第１のオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング温度について、それぞれ１．４及び１．５であった。３つのバーの各クラスター内で、マップされたトリミングされたリード割合（左）、パディングされた標的核酸の塩基割合（中央）、及びオンターゲットのマップされた重複していないリード割合（右）についてのデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【0030】
Ｉ．定義
[0053]本出願では、文脈からそうでないことが明らかでない限り、（ｉ）「ａ」という用語は、「少なくとも１つ」を意味すると理解され得る；（ｉｉ）「又は」という用語は、「及び／又は」を意味すると理解され得る；（ｉｉｉ）「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、それ自体で提示されるか、１つ又は複数の追加の成分又はステップと一緒に提示されるかにかかわらず、項目化された成分又はステップを包含すると理解され得る；並びに（ｉｖ）「約」及び「およそ」という用語は、当業者によって理解される標準的な変動を許容するものと理解され得る；及び（ｖ）範囲が指定されている場合、エンドポイントが含まれる。
[0053]本出願では、文脈からそうでないことが明らかでない限り、（ｉ）「ａ」という用語は、「少なくとも１つ」を意味すると理解され得る；（ｉｉ）「又は」という用語は、「及び／又は」を意味すると理解され得る；（ｉｉｉ）「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、それ自体で提示されるか、１つ又は複数の追加の成分又はステップと一緒に提示されるかにかかわらず、項目化された成分又はステップを包含すると理解され得る；並びに（ｉｖ）「約」及び「およそ」という用語は、当業者によって理解される標準的な変動を許容するものと理解され得る；及び（ｖ）範囲が指定されている場合、エンドポイントが含まれる。
【0031】
[0054]アダプター：本明細書で使用する場合、「アダプター」とは、別の配列に追加の特性を移入するために別の配列に追加することができるヌクレオチド配列を意味する。アダプターは一本鎖又は二本鎖であり得、又は一本鎖部分及び二本鎖部分の両方を有し得る。
【0032】
[0055]およそ：本明細書で使用される場合、「およそ」又は「約」という用語は、１つ又は複数の目的値に適用される場合、言及された参照値と同様の値を指す。ある実施形態では、「およそ」又は「約」という用語は、そうでないことが言及されていないか、又は文脈から明白でない限り、言及された参照値のいずれかの方向（より大きいか又はより小さい）に、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、又はそれ以下の内にある値の範囲を指す（そのような数が可能な値の１００％を超える場合を除く）。
【0033】
[0056]付随する（Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ）：一つの存在、レベル、及び／又は形態が他のものと相関している場合、その用語が本明細書で使用されるように、２つの事象又は実体は互いに「付随する」。例えば、その存在、レベル及び／又は形態が、疾患、障害、又は状態の発生頻度及び／又は感受性と相関する場合（例えば、関連する集団にわたって）、特定の実体（例えば、ポリペプチド、遺伝子シグネチャー、代謝物など）は、特定の疾患、障害、又は状態に付随すると見なされる。いくつかの実施形態では、それらが互いに物理的に近接しているか、及び／又は物理的に近接したままであるかのように、それらが直接的又は間接的に相互作用する場合、２つ以上の実体は、互いに物理的に「会合している（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）」。いくつかの実施形態では、互いに物理的に会合している２つ以上の実体は、互いに共有結合されている；いくつかの実施形態では、互いに物理的に会合している２つ以上の実体は、互いに共有結合されていないが、例えば、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水性相互作用、磁性、及びそれらの組み合わせによって、非共有結合的に会合している。
【0034】
[0057]バーコード：本明細書中で使用される場合、「バーコード」は、分子に同一性を付与するヌクレオチド配列を意味する。バーコードは、個々の分子（及びそのコピー）にユニークな同一性を付与し得る。そのようなバーコードは、ユニークなＩＤ（ｕｎｉｑｕｅ ＩＤ；ＵＩＤ）である。バーコードは、同一源（例えば、患者）からの分子（及びそのコピー）の集団全体に同一性を付与し得る。そのようなバーコードは、マルチプレックスＩＤ（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＩＤ；ＭＩＤ）である。
【0035】
[0058]生物学的サンプル：本明細書で使用される場合、「生物学的サンプル」という用語は、本明細書に記載されるように、目的の生物学的供給源（例えば、組織又は生物又は細胞培養物）から得られるか又は由来するサンプルを典型的に指す。いくつかの実施形態では、目的の供給源は、動物又はヒトなどの生物を含むか、又はからなる。いくつかの実施形態では、生物学的サンプルは、生体組織又は体液を含むか、又はからなる。いくつかの実施形態では、生物学的サンプルは、骨髄；血液；血液細胞；腹水；組織若しくは細針生検サンプル；細胞含有体液；遊離浮遊核酸；喀痰；唾液；尿；脳脊髄液、腹水；胸水；糞便；リンパ；婦人科体液；皮膚スワブ；膣スワブ；口腔スワブ；鼻腔スワブ；管洗浄液又は気管支肺胞洗浄液などの洗液又は洗浄液；吸引；スクレーピング；骨髄標本；組織生検標本；外科標本；他の体液、分泌物、及び／若しくは排泄物；並びに／又はそれらからの細胞などであり得るか、又は含み得る。いくつかの実施形態では、生物学的サンプルは、個体から得られた細胞を含むか、又はからなる。いくつかの実施形態では、得られた細胞は、サンプルが得られた個体からの細胞であるか、又はその細胞を含む。いくつかの実施形態では、サンプルは、目的の供給源から任意の適切な手段によって直接得られた「一次サンプル」である。例えば、いくつかの実施形態では、一次生物学的サンプルは、生検（例えば、細針吸引又は組織生検）、手術、体液の収集（例えば、血液、リンパ液、糞便など）などからなる群から選択される方法によって得られる。いくつかの実施形態では、文脈から明らかとなるように、「サンプル」という用語は、一次サンプルの処理によって（例えば、１つ又は複数の成分を除去することによって、及び／又は１つ又は複数の薬剤を加えることによって）得られる調製物を指す。例えば、半透膜を使用したろ過。そのような「処理されたサンプル」は、例えば、サンプルから抽出されるか、又は一次サンプルをｍＲＮＡの増幅又は逆転写、特定の成分の単離及び／又は精製などの技術に供することによって得られる核酸又はタンパク質を含み得る。
【0036】
[0059]ブロッキングオリゴヌクレオチド：反応混合物中に存在する別の核酸に相補的であり、そのような核酸にハイブリダイズして、そのような核酸の望ましくないハイブリダイゼーションを防ぐことができるオリゴヌクレオチド。そのような別の核酸は、合成核酸、例えば、プライマー又はアダプターであり得る。プライマー又はアダプターがライブラリー核酸分子に組み込まれると、防ぐべき望ましくないハイブリダイゼーションが起き得る。ブロッキングオリゴヌクレオチドは、望ましくないハイブリダイゼーションから保護される核酸に完全に相補的である必要はないが、望ましくない事象が起きることを防ぐために十分に安定なハイブリッドを形成しなければならない。その目的のために、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、ユニバーサル塩基又はＴｍ修飾塩基を含み得る。
【0037】
[0060]含む：１つ又は複数の指定された要素又はステップを「含む」として本明細書に記載されている組成物又は方法は、オープンエンドであり、指定された要素又はステップが必須であることを意味するが、他の要素又はステップが、組成物又は方法の範囲内で追加されてもよい。１つ又は複数の指定された要素又はステップを「含む」（又は「含まれる」）と記載された組成物又は方法は、同一に指定された要素又はステップに「本質的にからなる」（又は「本質的に～からなる」）対応したより限定された組成物又は方法も記述され、これは、組成物又は方法に、指定された必須の要素又はステップが含まれ、さらに、組成物又は方法の基本的かつ新規の特質に実質的に影響しない追加の要素又はステップもまた含まれ得ることを意味することを理解されたい。１つ又は複数の指定された要素又はステップ「を含む」又は「から本質的になる」として本明細書に記載される任意の組成物又は方法もまた、他の指定されていない要素又はステップを除外した、指定された要素又はステップ「からなる」（又は「から成る」）対応した、より限定された、クローズドエンドの組成物又は方法を記載することも理解される。本明細書に開示される任意の組成物又は方法では、任意の指定された必須要素又はステップの公知の又は開示された同等物が、その要素又はステップの代替となり得る。
【0038】
[0061]設計された：本明細書で使用される場合、「設計された」という用語は、（ｉ）その構造が人間の手によって選択されるか、又は選択された因子；（ｉｉ）人間の手を必要とするプロセスによって生成される因子；及び／又は（ｉｉｉ）天然物質及び他の公知の因子とは異なる因子を指す。
【0039】
[0062]決定：本明細書を読んだ当業者は、「決定する」ことが、例えば本明細書に明示的に引用された特定の技術を含む、当業者に利用可能な様々な技術のいずれかを使用することによって利用又は達成できることを認識するであろう。いくつかの実施形態では、決定は、物理的サンプルの操作を含む。いくつかの実施形態では、決定には、例えば、関連する分析を実行するように適合されたコンピュータ又は他の処理ユニットを利用する、データ又は情報の考察及び／又は操作が含まれる。いくつかの実施形態では、決定には、関連する情報及び／又は資料を供給源から受け取ることが含まれる。いくつかの実施形態では、決定は、サンプル又は実体の１つ又は複数の特徴を比較可能な参照と比較することを含む。
【0040】
[0063]同一性：本明細書で使用される場合、「同一性」という用語は、ポリマー分子間、例えば、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／又はＲＮＡ分子）間及び／又はポリペプチド分子間の全体的な関連性を指す。いくつかの実施形態では、ポリマー分子は、それらの配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％同一である場合、互いに「実質的に同一」であると見なされる。２つの核酸又はポリペプチド配列の同一性割合の計算は、例えば、２つの配列を最適な比較目的のために整列させることによって実行できる（例えば、最適な整列のために、第１及び第２の配列の一方又は両方にギャップを導入でき、同一でない配列は比較目的からは無視され得る）。特定の実施形態では、比較目的で整列された配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は実質的に１００％である。対応する位置にあるヌクレオチドが次に比較される。第１の配列の位置が第２の配列の対応する位置と同じ残基（例えば、ヌクレオチド又はアミノ酸）で占められている場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性割合は、２つの配列の最適な整列のために導入する必要があるギャップの数と、各ギャップの長さを考慮した、配列によって共有される同一位置の数の関数である。配列の比較と２つの配列間の同一性割合の決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成できる。例えば、２つのヌクレオチド配列間の同一性割合は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＭｅｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ、１９８９、４：１１～１７頁）のアルゴリズムを使用して決定できる。いくつかの例示的な実施形態では、ＡＬＩＧＮプログラムで行われた核酸配列比較は、ＰＡＭ１２０重量残基表、１２のギャップ長ペナルティ及び４のギャップペナルティを使用する。２つのヌクレオチド配列間の同一性割合は、或いは、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスを使用するＧＣＧソフトウェアパッケージ内のＧＡＰプログラムを使用して決定できる。
【0041】
[0064]ライゲーション部位：本明細書で使用される場合、「ライゲーション部位」は、ライゲーションを促進させる（二本鎖分子の平滑末端以外の）核酸分子の一部である。２つの分子に存在する「互換性のあるライゲーション部位」は、２つの分子の互いの優先的なライゲーションを可能にする。
【0042】
[0065]サンプル：本明細書で使用される場合、「サンプル」という用語は、定性的及び／又は定量的評価のための目的の組成物であるか、又はそれを含む物質を指す。いくつかの実施形態において、サンプルは、生物学的サンプルである（すなわち、生体（例えば、細胞又は生物）から来る）。いくつかの実施形態において、サンプルは、地質学的、水生学的、天文学的、又は農学的供給源に由来する。いくつかの実施形態では、目的の供給源は、動物又はヒトなどの生物を含むか、又はからなる。いくつかの実施形態では、法医学分析用のサンプルは、生物学的組織、生体体液、例えば衣服、汚れ、プラスチック、水などの有機物又は非有機物であるか、又はそれらを含む。いくつかの実施形態では、農学的サンプルは、葉、花弁、樹皮、木材、種子、植物、果物などの有機物を含むか、又はからなる。
【0043】
[0066]一本鎖ライゲーション：本明細書で使用される場合、「一本鎖ライゲーション」は、少なくとも１つの一本鎖基質で始まり、典型的には１つ又は複数の二本鎖又は部分的な二本鎖アダプターを含むライゲーション手順である。
【0044】
[0067]固体支持体：本明細書で使用される場合、「固体支持体」は、捕捉部分と相互作用することができる任意の固体材料を指す。固体支持体は、溶液中に懸濁することができる溶液相支持体（例えば、ガラスビーズ、磁気ビーズ、又は別の類似の粒子）、又は固相支持体（例えば、シリコンウエハー、ガラススライド、など）であり得る。溶液相支持体の例には、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮからのＤＹＮＡＢＥＡＤＳ磁気ビーズなどの超常磁性球状ポリマー粒子、又は米国特許第６５６５６８、６２７４３８６、７３７１８３０、６８７００４７、６２５５４７７、６７４６８７４及び６２５８５３１に記載されているような磁性ガラス粒子が含まれる。
【0045】
[0068]実質的に：本明細書で使用する場合、「実質的に」という用語は、目的の特質若しくは特性の全体若しくはほぼ全体の規模又は程度を示す定性的状態を指す。生物学の当業者は、生物学的及び化学的現象が完了に至る、及び／又は完全に進む、又は絶対的な結果を達成する若しくは回避することは稀にしかないことを理解するであろう。したがって、本明細書において「実質的に」という用語は、多くの生物学的及び化学的現象に固有の完全性の潜在的な欠如を捕捉するために使用される。
【0046】
[0069]合成：本明細書で使用される場合、「合成」という用語は、自然には存在しない構造を持っているため、又は自然に付随しない１つ又は複数の他の成分に付随するか、若しくは自然に付随する１つ又は複数の他の成分に付随しないため、人間の手によって、したがって、自然には存在しない形態で生成されることを意味する。
【0047】
[0070]ユニバーサルプライマー：本明細書中で使用される場合、「ユニバーサルプライマー」及び「ユニバーサルプライミング部位」は、標的配列中の天然に存在しないプライマー及びプライミング部位を指す。典型的には、ユニバーサルプライミング部位は、アダプター又は標的特異的プライマーに存在する。ユニバーサルプライマーは、ユニバーサルプライミング部位に結合し、そこからプライマー伸長を誘導できる。
【0048】
[0071]変異：本明細書で使用する場合、「変異」という用語は、参照実体と有意な構造的同一性を示すが、参照実体と比較した場合、１つ又は複数の化学部分の存在又はレベルが参照実体と構造的に異なる実体を指す。多くの実施形態では、変異はまた、その参照実体と機能的に異なる。一般に、特定の実体が参照実体の「変異」であると適切に見なされるかどうかは、参照実体との構造的同一性の程度に基づいている。当業者によって認識されるように、任意の生物学的又は化学的参照実体は、特定の特徴的な構造要素を有する。変異は、定義により、１つ又は複数のそのような特徴的な構造要素を共有する別個の化学的な実体である。いくつかの例を挙げるならば、小分子は、特徴的なコア構造要素（例えば、大員環コア）及び／又は１つ又は複数の特徴的なペンダント部分を有し、その結果、小分子の変異は、コア構造要素及び特徴的なペンダント部分を共有するが、コア内の他のペンダント部分及び／又は存在する結合のタイプ（単結合対二重結合、Ｅ対Ｚなど）が異なり、ポリペプチドは、線形又は三次元空間において、互いに対して指定された位置を有し、及び／又は特定の生物学的機能に寄与する複数のアミノ酸から構成される特徴的な配列要素を有してもよく、核酸は、線形又は三次元空間において、他に対して指定された位置を有する複数のヌクレオチド残基から構成される特徴的な配列要素を有してもよい。例えば、変異ポリペプチドは、アミノ酸配列の１つ又は複数の差異及び／又はポリペプチド骨格に共有結合された化学的部分（例えば、炭水化物、脂質など）の１つ又は複数の差異の結果として、参照ポリペプチドと異なり得る。いくつかの実施形態では、変異ポリペプチドは、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、又は９９％である、参照ポリペプチドと全体的な配列同一性を示す。或いは、又はさらに、いくつかの実施形態では、変異ポリペプチドは、参照ポリペプチドと少なくとも１つの特徴的な配列要素を共有しない。いくつかの実施形態では、参照ポリペプチドは、１つ又は複数の生物学的活性を有する。いくつかの実施形態では、変異ポリペプチドは、参照ポリペプチドの１つ又は複数の生物学的活性を共有する。いくつかの実施形態では、変異ポリペプチドは、参照ポリペプチドの１つ又は複数の生物学的活性を欠く。いくつかの実施形態では、変異ポリペプチドは、参照ポリペプチドと比較して、低減したレベルの１つ又は複数の生物学的活性を示す。多くの実施形態では、目的のポリペプチドが特定の位置で少数の配列変化がある以外は親のアミノ酸配列と同一である場合、目的のポリペプチドは親又は参照ポリペプチドの「変異体」であると見なされる。典型的には、親と比較して、変異体における残基の２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満が置換される。いくつかの実施形態では、変異体は、親と比較して、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１つの置換残基を有する。しばしば、変異体は非常に少数（例えば、５、４、３、２、又は１未満）の数の置換された機能的残基（すなわち、特定の生物学的活性に関与する残基）を有する。さらに、変異は、典型的には、親と比較して、５、４、３、２、又は１以下の追加又は削除があるが、追加又は削除がないこともしばしばある。さらに、任意の追加又は削除は通常、約２５、約２０、約１９、約１８、約１７、約１６、約１５、約１４、約１３、約１０、約９、約８、約７、約６残基未満であり、一般に、約５、約４、約３、又は約２残基未満である。いくつかの実施形態では、変異はまた、１つ又は複数の機能的欠陥も有する場合があり、及び／又はそうでなければ「突然変異体」と見なされ得る。いくつかの実施形態では、親ポリペプチド又は参照ポリペプチドは、自然界に見られるものである。当業者によって理解されるであろうが、特に、ある特定の目的ポリペプチドが感染性因子のポリペプチドである場合、目的ポリペプチドの複数の変異は自然界で一般に見られ得る。
【0049】
ＩＩ．特定の実施形態の詳細な説明
[0072]多くの核酸濃縮技術において、最初に核酸のショットガンライブラリーを提供することは有用であり得、それにより、サンプルに由来するより長い核酸配列が、短いリード配列決定技術と互換性のあるより小さいフラグメントに細分される（すなわち、約５０～５００ヌクレオチド）。ショットガンライブラリーを準備するために、高分子量の核酸鎖（典型的には、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）は、ランダムなフラグメントに剪断され、場合により、共通の末端配列（すなわちアダプター）のライゲーションによって修飾され、下流の処理及び分析のためにサイズ選択される。例えば、ショットガンライブラリーの核酸のサブセットを選択的に捕捉することは有用であり得る。
[0072]多くの核酸濃縮技術において、最初に核酸のショットガンライブラリーを提供することは有用であり得、それにより、サンプルに由来するより長い核酸配列が、短いリード配列決定技術と互換性のあるより小さいフラグメントに細分される（すなわち、約５０～５００ヌクレオチド）。ショットガンライブラリーを準備するために、高分子量の核酸鎖（典型的には、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）は、ランダムなフラグメントに剪断され、場合により、共通の末端配列（すなわちアダプター）のライゲーションによって修飾され、下流の処理及び分析のためにサイズ選択される。例えば、ショットガンライブラリーの核酸のサブセットを選択的に捕捉することは有用であり得る。
【0050】
[0073]現在、２つの一般的なカテゴリーの捕捉技術が存在する：ハイブリダイゼーションに基づく捕捉及び増幅に基づく捕捉である。ハイブリダイゼーションに基づく捕捉方法には、元のライブラリーフラグメントのサブセットのみを複製して回収するのではなく、元のショットガンライブラリーフラグメント全体を回収できるという利点がある。しかしながら、ハイブリダイゼーションに基づく捕捉に付随するオンターゲット率は、増幅に基づく方法と比較して一般的に低い。特に、オンターゲット率が低いと、オフターゲット捕捉産物を配列決定する必要があるため、配列決定能力が無駄になる。さらに、ハイブリダイゼーションに基づく捕捉方法に付随するワークフローは、増幅に基づくアプローチと比較して、長い所要時間で複雑になる可能性がある。対照的に、アンカーマルチプレックスＰＣＲ法（ａｎｃｈｏｒｅｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ）などの増幅に基づくアプローチは、ハイブリダイゼーションに基づく方法と比べて、単純なワークフロー、より短い所要時間、オンターゲット率がより高いという利点があるが、いくつかの短所がある。例えば、増幅後のライブラリーフラグメントに組み込まれた標的特異的プライマー配列のため、配列決定能力が無駄になる。さらに、鋳型が標的特異的プライマー結合部位で必ずトランケートされるため、ライブラリーフラグメントは必ずしも元のショットガンライブラリーを代表していない。したがって、標的配列における未知の構造多型にも対応する、標的濃縮の迅速かつ単純な方法に対する要求は満たされていないままである。
【0051】
[0074]これら及び他の課題は、本開示による一方向性デュアルプローブプライマー伸長による標的濃縮のための方法で克服され得る。一態様では、本開示は一方向デュアルプローブプライマー伸長に基づく濃縮のための一般的アプローチ並びにそのための改善の両方を記載する。この目的のために、本開示は、標的核酸のライブラリーからの１つ又は複数の標的核酸の濃縮のための、プライマー伸長及び固体支持体上へのハイブリダイゼーションに基づく捕捉の組み合わせを提供する。本開示はさらに、アンカーマルチプレックス増幅に基づく濃縮方法及びハイブリダイゼーション捕捉方法の前述の利点の多くを有するが、前述の短所の多くを伴わない、全体的なワークフローを提供する。多くの既存のハイブリダイゼーションに基づく捕捉方法及びアンカーマルチプレックス増幅に基づく捕捉方法と比較した、本開示のキット、組成物及び方法の利点には、ショットガン分子全体に由来するライブラリー分子の回収、単純なワークフロー（例えば、全ステップ数の減少及び実践時間の短縮）、所要時間の短縮、より高いオンターゲット率、及びより低い全体的な材料コストが含まれる。
【0052】
[0075]一実施形態では、本発明は、核酸のライブラリー中の少なくとも１つの標的核酸の濃縮のための方法である。本方法は、核酸のライブラリー中の標的核酸に第１のオリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせることを含むことができる。核酸のライブラリー中の各核酸は、第１のアダプターを含む第１の末端及び第２のアダプターを含む第２の末端を備えることができる。本方法は、ハイブリダイズした第１のオリゴヌクレオチドを第１のポリメラーゼで伸長し、そのことにより標的核酸及び伸長された第１のオリゴヌクレオチドを含む第１のプライマー伸長複合体を生成することをさらに含む。
【0053】
[0076]一態様では、本方法は、第１のプライマー伸長複合体を捕捉すること、及び核酸のライブラリーに対して第１のプライマー伸長複合体を濃縮することをさらに含むことができる。別の態様では、本方法は、第２のオリゴヌクレオチドを標的核酸にハイブリダイズし、ハイブリダイズした第２のオリゴヌクレオチドを第２のポリメラーゼで伸長し、それにより標的核酸及び伸長された第２のオリゴヌクレオチドを含む第２のプライマー伸長複合体を生成し、それにより、伸長された第１のオリゴヌクレオチドを第１のプライマー伸長複合体から遊離させることを含むことができる。本方法は、第３のポリメラーゼ、第１の増幅プライマー、及び第２の増幅プライマーを用いて、標的核酸を増幅することをさらに含むことができる。第１のアダプターに相補的な３’末端を有する第１の増幅プライマー及び第２のアダプターに相補的な３’末端を有する第２の増幅プライマー。
【0054】
[0077]第１、第２、及び第３のポリメラーゼは、任意の適切なポリメラーゼであってもよい。ポリメラーゼの一例は、Ｔａｑ又はＴａｑ由来ポリメラーゼ（例えば、ＫＡＰＡ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳのＫＡＰＡ ２Ｇポリメラーゼ）である。別の例のポリメラーゼは、ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＫＡＰＡ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳからのＫＡＰＡ ＨＩＦＩポリメラーゼ）である。
【0055】
[0078]別の実施形態では、本開示は、核酸のライブラリー中の少なくとも１つの標的核酸の濃縮のためのキットを提供する。キットは、核酸のライブラリー中の標的核酸に相補的な第１のオリゴヌクレオチドを含むことができる。核酸のライブラリー中の各核酸は、第１のアダプターを含む第１の端部及び第２のアダプターを含む第２の端部を有する。キットはさらに、標的核酸に相補的な第２のオリゴヌクレオチド、第１の増幅プライマー、及び第２の増幅プライマーを含むことができる。第１のオリゴヌクレオチドは、捕捉部分を含み得る。第２のオリゴヌクレオチドは、標的核酸に第１のオリゴヌクレオチドに対して５’位でハイブリダイズできる。第１の増幅プライマーは、第１のアダプターに相補的な３’末端を有し、第２の増幅プライマーは、第２のアダプターに相補的な３’末端を有する。
【0056】
[0079]別の実施形態では、本開示は、核酸のライブラリー中の少なくとも１つの標的核酸を濃縮するためのキットを提供する。キットは、核酸のライブラリー中の標的核酸に相補的な第１のオリゴヌクレオチドを含むことができる。核酸のライブラリー中の各核酸は、第１のアダプターを含む第１の末端及び第２のアダプターを含む第２の末端を有することができる。キットはさらに、捕捉部分を有する修飾ヌクレオチド、標的核酸に相補的な第２のオリゴヌクレオチド、第１の増幅プライマー、及び第２の増幅プライマーを含むことができる。第２のオリゴヌクレオチドは第１のオリゴヌクレオチドに対して５’位で標的核酸にハイブリダイズし、第１の増幅プライマーは第１のアダプターに相補的な３’末端を有し、第２の増幅プライマーは第２のアダプターに相補的な３’末端を有する。
【0057】
[0080]さらに別の実施形態では、本開示は、少なくとも１つの標的核酸を含む核酸のライブラリーを含む組成物を提供する。核酸のライブラリー中の各核酸は、第１のアダプターを含む第１の末端、第２のアダプターを含む第２の末端、及び第１のアダプターと第２のアダプターの中間の目的領域を有する。組成物は、標的核酸の目的領域にハイブリダイズした伸長された第１のオリゴヌクレオチドをさらに含む。伸長された第１のオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの捕捉部分を含む。組成物は、少なくとも１つの捕捉部分に結合した固体支持体、第１の伸長されたオリゴヌクレオチドに対して５’位で標的核酸にハイブリダイズした第２のオリゴヌクレオチド、及び第２のオリゴヌクレオチドの３’末端に会合したポリメラーゼをさらに含む。
【0058】
[0081]本発明の方法は、ハイスループット単一分子配列決定プロトコルを含む、配列決定プロトコルの一部として使用することができる。本発明の方法は、配列決定される標的核酸のライブラリーを生成する。ライブラリー中の標的核酸には、分子同定及びサンプル同定のためのバーコードが組み込まれていてもよい。
【0059】
[0082]本発明は、標的特異的プライマーを用いた少なくとも１つの線形プライマー伸長ステップを含む。線形伸長ステップには、当技術分野で行われている指数関数的増幅を超えるいくつかの利点がある。各標的核酸は、標的特異的プライマーのアニーリングの速度及びポリメラーゼが特定の標的配列を読み通すことができる速度に依存するユニークな合成速度によって特徴付けられる。伸長速度及び合成速度の違いにより、単一ラウンドの合成でわずかな違いをもたらし得るバイアスが生じる。しかしながら、そのわずかな違いがＰＣＲ中に指数関数的に増幅されるようになる。結果として生じるギャップは、ＰＣＲバイアスと呼ばれる。バイアスにより、サンプル中の各配列の初期量に何らかの違いがあったとしてもそれが不明瞭になり、いかなる定量的な分析も妨げられる場合がある。
【0060】
[0083]本発明は、標的特異的プライマー（偶然にもゲノム内の結合部位に特異的である遺伝子特異的プライマー及び縮重プライマーを含む）の伸長を単一ステップに限定する。指数関数的増幅は全て、鋳型依存バイアスを受けないか、又は標的特異的プライマーよりもバイアスを受けないユニバーサルプライマーを使用して行われる。
【0061】
[0084]ここで図１を参照すると、一方向性デュアルプローブプライマー伸長による標的濃縮のための方法１００には、核酸ライブラリーフラグメントを調製するステップ１０２が含まれる。一態様では、核酸ライブラリーフラグメントは、１つ又は複数の標的核酸を含む任意の核酸源から調製することができる。一般に、標的核酸には目的領域又は配列が含まれ、それらの目的領域又は配列の下流の検出及び分析のための、核酸ライブラリー中の１つ又は複数の標的核酸の非標的核酸に対する優先的な濃縮が、方法１００により可能となる。
【0062】
[0085]続いてステップ１０２を参照すると、核酸は任意選択でフラグメント化され、アダプターは核酸の各末端にライゲーションされる。本開示とともに使用するための核酸フラグメントのライブラリーを調製するための例示的な方法には、トランスポゾン媒介フラグメント化及び標識化、機械的剪断、酵素消化、オーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）（例えば、Ｔ／Ａ）又は平滑末端ライゲーション、鋳型スイッチング媒介アダプターライゲーションなど並びにその組み合わせが含まれる。最終的に、核酸ライブラリーフラグメントを調製するステップ１０２の産物は、核酸のライブラリーをもたらすことができ、ここで、核酸のライブラリー中の各核酸は、第１のアダプターを含む第１の末端及び第２のアダプターを含む第２の末端を有する。特に、第１及び第２のアダプターは同一でも異なっていてもよく、さらに、相補部分及び非相補部分を持つフォーク型又はＹ字型アダプター、ブラントエンドアダプター、オーバーハングアダプター、ヘアピンアダプターなど、並びにそれらの組み合わせを含むがそれらに限定されない、さまざまな形態をとることができる。一般に、前述のアダプターの少なくとも一部は二本鎖である；しかしながら、他のアダプター構成もまた、本開示による核酸フラグメントのライブラリーを調製する際に使用され得る。さらに、ヘアピンアダプターの場合、自己プライミング事象を防ぐために、ブロッキング要素（例えば、３’ジデオキシヌクレオチド又はリン酸基）を含めると有用な場合がある。
【0063】
[0086]方法１００の次のステップ１０４は、核酸のライブラリー中に存在する標的核酸への第１のオリゴヌクレオチドプライマーのハイブリダイゼーションを含むことができ、それにより、未伸長の第１のプライマー－標的複合体を形成する。一実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、標的核酸の配列に相補的である規定された配列を有する標的特異的プライマーである。標的特異的プライマーの一例は、目的遺伝子（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ）、又はその近くに（例えば、その上流又は５’に）ハイブリダイズするように設計された遺伝子特異的プライマーである。標的核酸は、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又はそれらの組み合わせであり得る。第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、リボ核酸、デオキシリボ核酸、修飾された核酸（例えば、ビオチン化、ロックド核酸、イノシン、シーラ塩基など）、又は当技術分野で公知の他の核酸アナログから構成されるオリゴヌクレオチドプライマーであり得る。
【0064】
[0087]本開示の様々な実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、１つ又は複数の修飾された塩基、捕捉部分又はそれらの組み合わせを含み得る。第１のオリゴヌクレオチドプライマーが捕捉部分を含む場合、第１のオリゴヌクレオチドプライマーを標的核酸にハイブリダイズするステップ１０４の前に、第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、固体支持体に付着していても、溶液中に遊離（すなわち、固体支持体に結合していないか、又は代わりに付着していない）していてもよい。捕捉部分を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマーが、捕捉部分を介して固体支持体に付着していない実施形態では、ステップ１０４は溶液中で実行することができる。捕捉部分を含む第１のオリゴヌクレオチドプライマーが、捕捉部分を介して固体支持体に付着している実施形態では、ステップ１０４はインサイツで実行することができる。特に、インサイツでの反応の場合、得られた未伸長のプライマー－標的複合体は、固体支持体に付着する。プライマー－標的複合体が結合している固体支持体から溶液を分離することにより、溶液中に残っている非標的核酸又は第１のオリゴヌクレオチドプライマーにアニーリングされていない標的核酸を全て除去することができる。
【0065】
[0088]方法１００の次のステップ１０６は、第１のプライマー伸長反応を行うことを含む。一態様では、ステップ１０６は、ハイブリダイズした第１のオリゴヌクレオチドプライマーの第１のポリメラーゼを用いた伸長を含む。ステップ１０４での標的核酸鋳型への第１のオリゴヌクレオチドプライマーのハイブリダイゼーションに続いて、第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、第１のポリメラーゼによって伸長され、それにより、少なくとも一部の標的核酸鋳型の逆相補体を含む伸長された第１のオリゴヌクレオチドプライマーの３’領域を含む第１のプライマー伸長産物又は複合体を生成する。本明細書に記載されるように、ハイブリダイゼーション及び伸長反応は任意選択で同時に行われるが、他の実施形態では、ハイブリダイゼーション及び伸長反応は別々に（例えば、順次に）行われ、アニールしていなくて捕捉されていない標的核酸を反応混合物から除去する洗浄ステップによって分離されてもよい。さらに、ステップ１０４は、伸長された第１のオリゴヌクレオチドプライマーの長さを制御するために、プライマー伸長反応を停止することをさらに含み得る。特に、伸長された第１のオリゴヌクレオチドプライマー産物の長さは、ステップ１０４で追加したポリメラーゼを不活性化するなどの手法により能動的に制御するか、又は、限定された量の反応物の消費を介することなどで反応を完結させることや、方法１００のステップ１０２において、核酸のライブラリー中の核酸のフラグメントのサイズを制御／選択することにより受動的に制御することができる。
【0066】
[0089]方法１００は、第１のプライマー伸長複合体を捕捉するステップ１０８をさらに含む。第１のプライマー伸長複合体の捕捉は、本明細書に開示される様々な方法で達成することができ、方法１００のステップ１０４及びステップ１０６のいずれかの前、同時又は後に達成することができる。上に記載のように、第１のオリゴヌクレオチドは、方法１００のステップ１０４又はステップ１０６の前、間、又は後に第１のオリゴヌクレオチドプライマーを固体支持体上に捕捉するために使用できる捕捉部分を含むことができる。別の例では、標的核酸へのハイブリダイゼーションに続く第１のオリゴヌクレオチドプライマーの伸長は、１つ又は複数の修飾ヌクレオチドの取り込みを含む。修飾ヌクレオチドは、捕捉部分を含むことができるか、又は修飾ヌクレオチドの下流修飾が、捕捉部分を第１のプライマー伸長複合体の伸長された部分に付着又はそうでなければ組み込むことを可能にするように構成することができる。したがって、第１のプライマー伸長複合体を、１つ又は複数の修飾ヌクレオチドに付随する捕捉部分によって、ステップ１０６の間又はその後に捕捉することができる。標的核酸、アニールされたプライマー－標的複合体、又は標的伸長プライマー複合体が捕捉されるかどうかの選択は、方法のステップ１０４及びステップ１０６が溶液又はインサイツで行われるかどうかをさらに決定する。
【0067】
[0090]方法１００の次のステップ１１０は、第１のプライマー伸長複合体の濃縮を含み得る。一態様では、ステップ１１０は、ライブラリー中の非標的核酸及び未使用の反応成分（例えば、ヌクレオチド、プライマー分子、ＡＴＰなど）、酵素、緩衝液などの他の分子からの第１のプライマー伸長複合体の回収のための１つ又は複数の精製及び濃縮ステップを含む。いくつかの実施形態では、ステップ１１０は、酵素消化、サイズ排除に基づく精製、親和性に基づく精製など、又はそれらの組み合わせを含む。特に、第１のプライマー伸長産物の濃縮は、核酸のライブラリーの全体に対する濃縮として測定することができる。一態様では、濃縮は、標的核酸ではない核酸のライブラリーの他のメンバーの枯渇（すなわち、除去）を介して標的核酸の濃度を増加させることを含む。
【0068】
[0091]方法１００の次のステップ１１２は、核酸のライブラリーに存在する標的核酸への第２のオリゴヌクレオチドプライマーのハイブリダイゼーションを含むことができる。一態様では、第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、（第１のアダプター及び第２のアダプターの一方又は両方とハイブリダイズ又は相補的であるのではなく）標的核酸内の目的領域に結合する標的特異的プライマーである。別の態様では、標的核酸は、ステップ１１２の間の第１のプライマー伸長複合体の一部である。例えば、第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、第１のプライマー伸長複合体中の伸長された第１のオリゴヌクレオチドプライマーに対して５’位（すなわち、上流）で標的核酸にハイブリダイズすることができる。この場合に、生じた未伸長の第２のプライマー－標的複合体には、第１の伸長されたオリゴヌクレオチドプライマー、第１の伸長されたオリゴヌクレオチドプライマーにハイブリダイズした標的核酸、及び第２の（未伸長）オリゴヌクレオチドプライマーが含まれる。ステップ１１２の間に第１のプライマー伸長産物が固体支持体に付着する場合、未伸長の第２のプライマー－標的複合体は、同様に固体支持体に付着する。他の実施形態では（例えば、反応混合物から非標的核酸を除去した後）、第１のプライマー伸長産物は、固体支持体から遊離されて溶液中にあり、ステップ１１２で第２のオリゴヌクレオチドプライマーの溶液中ハイブリダイゼーションが可能になる。
【0069】
[0092]方法１００の次のステップ１１４は、第２のプライマー伸長反応を行うことを含む。ステップ１１２における第２のオリゴヌクレオチドプライマーの標的核酸鋳型へのハイブリダイゼーションに続いて、第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、第２のポリメ
ラーゼによって伸長され、それにより、標的核酸を含む第２のプライマー伸長産物又は複合体を生成する。伸長された第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、標的核酸鋳型の少なくとも一部の逆相補体を含む３’領域を含む。一態様では、第２のポリメラーゼでの第２のオリゴヌクレオチドプライマーの伸長は、伸長された第１のオリゴヌクレオチドプライマーを標的核酸との複合体から遊離させる。第１のプライマー伸長複合体から伸長された第１のオリゴヌクレオチドを遊離させることは、１つ又は複数の鎖置換（例えば、ポリメラーゼによる）、又は消化（例えば、ヌクレアーゼによる）を含み得る。例えば、伸長された第１のオリゴヌクレオチドの遊離は、鎖置換活性、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性、及びフラップエンドヌクレアーゼ活性の少なくとも１つを有する酵素で達成することができる。
ラーゼによって伸長され、それにより、標的核酸を含む第２のプライマー伸長産物又は複合体を生成する。伸長された第２のオリゴヌクレオチドプライマーは、標的核酸鋳型の少なくとも一部の逆相補体を含む３’領域を含む。一態様では、第２のポリメラーゼでの第２のオリゴヌクレオチドプライマーの伸長は、伸長された第１のオリゴヌクレオチドプライマーを標的核酸との複合体から遊離させる。第１のプライマー伸長複合体から伸長された第１のオリゴヌクレオチドを遊離させることは、１つ又は複数の鎖置換（例えば、ポリメラーゼによる）、又は消化（例えば、ヌクレアーゼによる）を含み得る。例えば、伸長された第１のオリゴヌクレオチドの遊離は、鎖置換活性、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性、及びフラップエンドヌクレアーゼ活性の少なくとも１つを有する酵素で達成することができる。
【0070】
[0093]本明細書に記載されるように、ステップ１１２及びステップ１１４は任意選択で同時に行われるが、他の実施形態では、ステップ１１２及びステップ１１４は別々に（例えば、順次に）行われる。さらに、ステップ１１４は、伸長された第２のオリゴヌクレオチドプライマーの長さを制御するために、プライマー伸長反応の停止をさらに含むことができる。特に、伸長された第２のオリゴヌクレオチドプライマー産物の長さは、ステップ１１４で追加したポリメラーゼを不活性化するなどの手法により能動的に制御するか、又は、限定された量の反応物の消費を介することなどで反応を完結させることや、核酸のライブラリー中の核酸のフラグメントのサイズを制御／選択することにより受動的に制御することができる。
【0071】
[0094]伸長された第１のプライマーが固体支持体に付着した１つ又は複数の捕捉部分を含む場合、ステップ１１４における伸長された第１のオリゴヌクレオチドの遊離は、固体支持体に付着するのではなく溶液中で遊離した、第２のプライマー伸長複合体をもたらす。したがって、方法１００のステップ１１０に記載されるように、ステップ１１４に続いて、支持体に付着した第１の伸長されたオリゴヌクレオチドプライマー、第２のポリメラーゼ、他の反応成分など、及びそれらの組み合わせから、未結合の第２の伸長産物又は標的核酸を含む複合体を回収するために、１つ又は複数の精製技術を実現することができる。
【0072】
[0095]方法１００は、増幅のステップ１１６をさらに含む。ステップ１１６は、線形又は指数関数的増幅（例えば、ＰＣＲ）を含むことができる。一般に、ステップ１１６は、第３のポリメラーゼ、第１の増幅プライマー、及び第２の増幅プライマーを用いて標的核酸を増幅することを含む。一態様では、第１及び第２の増幅プライマーは、ステップ１０２で核酸のライブラリー中の標的核酸に組み込まれたアダプターの配列に相補的であるように設計される。例えば、第１の増幅プライマーは、第１のアダプターに相補的な３’末端を有することができ、第２の増幅プライマーは、第２のアダプターに相補的な３’末端を有することができる。しかしながら、増幅のためのプライマーは、増幅される標的核酸内に存在する任意の配列を含むことができ（例えば、遺伝子／標的特異的プライマー、ユニバーサルプライマーなど）、一方又は両方の鎖（すなわち、増幅反応の鋳型に対応する二本鎖核酸の上方及び下方の両方の鎖）の合成を支援することができる。
【0073】
[0096]いくつかの実施形態では、ステップ１１６は、標的核酸に由来する第１又は第２の伸長されたオリゴヌクレオチドプライマーのいずれかの増幅するのではなく、核酸のライブラリーからの標的核酸の選択的増幅を可能にする。一例において、ウラシル適合性ポリメラーゼ及びｄＵＴＰは、ステップ１０６及びステップ１１４で実行される伸長反応の一方又は両方に含まれる。反応から生じる伸長されたオリゴヌクレオチドプライマーは、少なくとも１つのウラシルヌクレオチドを含むが、標的核酸鋳型は、ウラシルヌクレオチドを有さないＤＮＡ鋳型であり得る。その後、標的核酸の増幅のために、ウラシル不適合性ポリメラーゼがステップ１１６に含まれる。ウラシル不適合性ポリメラーゼは、ウラシ
ルヌクレオチドを有さない標的核酸を増幅できる；しかしながら、ウラシル不適合性ポリメラーゼは、ウラシルを含む伸長されたオリゴヌクレオチドプライマーの複製が不可能であろう。或いは、又はさらに、ウラシルを含む産物は、選択的に消化されるか、さもなければ分解され得、それによって、核酸のライブラリーからの元の分子のみが残る。
ルヌクレオチドを有さない標的核酸を増幅できる；しかしながら、ウラシル不適合性ポリメラーゼは、ウラシルを含む伸長されたオリゴヌクレオチドプライマーの複製が不可能であろう。或いは、又はさらに、ウラシルを含む産物は、選択的に消化されるか、さもなければ分解され得、それによって、核酸のライブラリーからの元の分子のみが残る。
【0074】
[0097]増幅のステップ１１６の後、方法１００は、増幅された標的核酸を分析するステップ１１８を含むことができる。ステップ１１６は、方法１００の１つ又は複数の産物の核酸配列を決定するための、任意の方法を含むことができる。ステップ１１６は、配列アラインメント、配列変動の同定、ユニークなプライマー伸長産物の計測など、又はそれらの組み合わせをさらに含み得る。
【0075】
[0098]方法１００で概説される本開示の要素に加えて、本明細書に記載されるキット、組成物、及び方法を実現する場合、いくつかの追加の検討事項を考慮することが有用であり得る。一態様では、プライマーハイブリダイゼーションステップは、プライマーの標的特異的領域によって仲介される。いくつかの実施形態では、標的特異的領域は、エクソン、イントロン、若しくは遺伝子の非翻訳部分、又は遺伝子の非転写部分（例えば、プロモーター又はエンハンサー）に位置する遺伝子の領域にハイブリダイズすることができる。一部の実施形態では、遺伝子はタンパク質コード遺伝子であるが、他の実施形態では、遺伝子は、ＲＮＡコード遺伝子又は偽遺伝子などの、タンパク質コード遺伝子ではない。さらに他の実施形態では、標的特異的領域は遺伝子間領域に位置する。ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ標的については、プライマーはオリゴｄＴ配列を含んでもよい。
【0076】
[0099]予め設計された標的特異的領域の代わりに、プライマーは、縮重配列（すなわち、無作為に組み込まれたヌクレオチドのストリング）を含んでもよい。そのようなプライマーもまた、ゲノム内の結合部位を見いだし、その結合部位の標的特異的プライマーとして作用し得る。特に、各ヌクレオチド位置が縮重している完全縮重プライマーは、標的化された濃縮に有用ではない可能性がある。しかしながら、ヌクレオチド位置の一部のみが縮重している部分的な縮重プライマーは、本開示による使用に有用であり得る。例えば、単一ヌクレオチド位置に部分的な縮重を有するプライマーは、１つ又は複数の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含む標的配列の捕捉に有用であり得る。
【0077】
[0100]標的特異的領域に加えて、プライマーは追加の配列を含んでもよい。一部の実施形態では、これらの配列は、標的特異的領域の５’末端に位置する。他の実施形態では、標的特異的領域が下に記載のように標的にハイブリダイズしてプライマー伸長反応を推進することができる限り、これらの配列をプライマー内の他の場所に含めることが可能であり得る。プライマー内の追加の配列は、ユニークな分子識別配列（ｕｎｉｑｕｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ；ＵＩＤ）又はマルチプレックスサンプル識別配列（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｓａｍｐｌｅ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ；ＭＩＤ）などの１つ又は複数のバーコード配列を含んでもよい。バーコード配列は、単一の配列として、又は２つ以上の配列として存在し得る。
【0078】
[0101]いくつかの実施形態では、追加の配列は、プライマーの５’末端へのライゲーションを促進する配列を含む。プライマーには、次のセクションに記載するように、アダプターのライゲーションを可能にするユニバーサルライゲーション配列を含んでもよい。
【0079】
[0102]いくつかの実施形態では、追加の配列は、１つ又は複数のユニバーサル増幅プライマーのための１つ又は複数の結合部位を含む。
[0103]プライマー伸長ステップは、核酸ポリメラーゼによって行われる。分析される核酸の種類に依存して、ポリメラーゼはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（「ＤＮＡポリメラーゼ」）又はＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（「逆転写酵素」）であってもよい。
[0103]プライマー伸長ステップは、核酸ポリメラーゼによって行われる。分析される核酸の種類に依存して、ポリメラーゼはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（「ＤＮＡポリメラーゼ」）又はＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（「逆転写酵素」）であってもよい。
【0080】
[0104]いくつかの実施形態では、プライマー伸長反応で合成される核酸鎖の長さを制御することが望ましい。以下で説明されるように、この鎖の長さは、方法の後続のステップ及び任意の下流の応用に供される核酸の長さを決定する。伸長反応は、当技術分野で公知の任意の方法によって停止することができる。例えば、温度シフト又はポリメラーゼ阻害剤の添加により、反応を物理的に停止させてもよい。いくつかの実施形態では、反応は氷上に反応物を置くことにより停止される。他の実施形態において、反応は、温度を上昇させて非耐熱性ポリメラーゼを不活性化することによって停止される。さらに他の実施形態において、反応は、酵素の重要な補因子を隔絶することができるＥＤＴＡなどのキレート剤の添加、又は酵素を可逆的若しくは不可逆的に不活性化することができる別の化学的若しくは生物学的な物質化合物によって停止される。
【0081】
[0105]プライマー伸長産物の長さを制御する別の方法は、伸長長さを直接限定するために重要な成分（例えば、ｄＮＴＰ）を限定するか、又は伸長速度を遅くして伸長停止ポイントを制御する能力を改善するためにＭｇ２＋を限定して、伸長反応を欠乏させることである。当業者は、限定されたプライマー伸長が主に所望の長さの産物を生じることを可能にする重要な成分の適切な量を実験的又は理論的に決定することができる。
【0082】
[0106]プライマー伸長産物の長さを制御する別の方法は、可逆的ターミネーターヌクレオチドを含む、ターミネーターヌクレオチドの付加である。当業者は、限定されたプライマー伸長が主に所望の長さの産物を生じることを可能にするターミネーター及び非ターミネーターヌクレオチドの適切な比率を実験的又は理論的に決定することができる。ターミネーターヌクレオチドの例には、ジデオキシヌクレオチド、Ｇｅｌｆａｎｄらの米国特許第８，１６３，４８７号に記載されるように２’－リン酸ヌクレオチド、３’－Ｏ－ブロック化可逆ターミネーター、並びに例えば、Ｚｈｕｏらの米国特許出願公開第２０１４／０２４２５７９号及びＧｕｏ、Ｊ．ら、Ｆｏｕｒ－ｃｏｌｏｒ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｗｉｔｈ ３’－Ｏ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒｓ ａｎｄ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｃｌｅａｖａｂｌｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｉｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ． ２００８年 １０５（２７）９１４５～９１５０頁に記載されるように３’非ブロック化可逆ターミネーターが含まれる。プライマー伸長産物の長さを制御するさらなる別の方法は、プライマー伸長反応への限定量のウラシル（ｄＵＴＰ）の添加である。その後、ウラシル含有ＤＮＡをウラシルＮ－ＤＮＡグリコシラーゼで処理して、脱塩基部位を生成する。脱塩基部位を有するＤＮＡは、Ｇｕｐｔａらの米国特許第８，６６９，０６１号に記載されるように、分解の効率を改善するためにアルカリを任意選択で添加して熱処理することにより分解することができる。当業者は、エンドヌクレアーゼ処理時に所望の長さの産物を主に生じさせるためにｄＵＴＰを限定的に含める伸長反応において、ｄＵＴＰ対ｄＴＴＰの適切な比率を実験的又は理論的に決定することができる。
【0083】
[0107]いくつかの実施形態では、伸長産物の長さは、入力核酸の長さによって本質的に限定される。例えば、母体血漿に存在する無細胞ＤＮＡは２００ｂｐ未満の長さであり、大部分は１６６ｂｐの長さである。Ｙｕ，Ｓ．Ｃ．Ｙ．ら、Ｓｉｚｅ－ｂａｓｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ｕｓｉｎｇ ｐｌａｓｍａ ＤＮＡ ｆｏｒ
ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ ｐｒｅｎａｔａｌ ｔｅｓｔｉｎｇ、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ２０１４年；１１１（２３）：８５８３～８頁。健常者や癌患者の血漿中で見られる無細胞ＤＮＡの長さの中央値は、約１８５～２００ｂｐである。Ｇｉａｃｏｎａ，Ｍ．Ｂ．ら、Ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ ｐｌａｓｍａ：ｌｅｎｇｔｈ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｈｅａｌｔｈｙ ｃｏｎｔｒｏｌｓ、Ｐａｎｃｒｅａｓ １９９８年；１７（１）：８９～９７頁。保存が不十分であるか又は化学的に処理されたサンプルは、化学的又は物理的に分解された核酸を含む場合がある。例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥＴ）は、典型的には、平均１５０ｂｐの長さの核酸を生成する。
ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ ｐｒｅｎａｔａｌ ｔｅｓｔｉｎｇ、ＰＮＡＳ ＵＳＡ ２０１４年；１１１（２３）：８５８３～８頁。健常者や癌患者の血漿中で見られる無細胞ＤＮＡの長さの中央値は、約１８５～２００ｂｐである。Ｇｉａｃｏｎａ，Ｍ．Ｂ．ら、Ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｌｏｏｄ ｐｌａｓｍａ：ｌｅｎｇｔｈ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｈｅａｌｔｈｙ ｃｏｎｔｒｏｌｓ、Ｐａｎｃｒｅａｓ １９９８年；１７（１）：８９～９７頁。保存が不十分であるか又は化学的に処理されたサンプルは、化学的又は物理的に分解された核酸を含む場合がある。例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥＴ）は、典型的には、平均１５０ｂｐの長さの核酸を生成する。
【0084】
[0108]いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素によるプライマー伸長後に、１つ又は複数の精製ステップを含む。精製により、未使用のプライマー分子及びプライマー伸長産物の作成に使用された鋳型分子が除去される。いくつかの実施形態では、鋳型核酸及び伸長されたプライマー以外のすべての核酸フラグメントは、エキソヌクレアーゼ消化によって除去される。その実施形態では、プライマー伸長において使用されるプライマーは、プライマー及び任意の伸長産物をエキソヌクレアーゼ消化耐性にする５’末端修飾を有してもよい。そのような修飾の例には、ホスホロチオエート結合が含まれる。他の実施形態では、ＲＮＡ鋳型は、ＲＮａｓｅＨ消化を含むＲＮａｓｅ消化などの、ＤＮＡを残す酵素処理によって除去することができる。さらなる他の実施形態では、プライマー及び大型鋳型ＤＮＡは、サイズ排除法、例えば、ゲル電気泳動、クロマトグラフィー又は等速電気泳動又はエピタコフォレシス（ｅｐｉｔａｃｈｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）によって伸長産物から分離される。
【0085】
[0109]いくつかの実施形態では、精製は、親和性結合による。この実施形態の変形では、親和性は、特定の標的配列に対するものである（配列捕捉）。他の実施形態では、プライマーは、親和性タグを含む。当技術分野で公知の任意の親和性タグ、例えばビオチン又は抗体又は特定の抗体が存在する抗原を使用することができる。親和性タグの親和性パートナーは、溶液中に、例えば、懸濁粒子又はビーズなどの溶液相固体支持体上に存在するか、又は固相支持体に結合することができる。親和性精製の過程で、反応混合物の未結合成分が洗い流される。いくつかの実施形態では、未使用のプライマーを除去するために追加のステップが取られる。いくつかの実施形態では、親和性捕捉は、プライマー伸長産物の電荷を変化させる。例えば、１つ又は複数のビオチン化ヌクレオチドの含めること及びストレプトアビジンをそれに結合させることにより、新生した核酸鎖において電荷に変化が生じる。変化した電荷は、等速電気泳動又はエピタコフォレシスにより、新生した鎖（プライマー伸長産物）の分離に利用できる。
【0086】
[0110]特に、本開示の方法は、ライゲーションステップを必要としない（例えば、共通配列を伸長された第１又は第２のオリゴヌクレオチドプライマーに追加すること）。しかしながら、いくつかの実施形態では、本発明は、ライゲーションステップを含む。例えば、ホモポリマーテールを核酸の３’末端に追加することができる。この実施形態では、ホモポリマーは、逆補体ホモポリマーの結合部位として機能し得る（ｍＲＮＡのためのポリＴプライマーを用いるポリＡテールと同様に）。ライゲーションにより、１つ又は複数のアダプター配列が、前のステップで生成されたプライマー伸長産物に追加される。アダプター配列は、１つ又は複数のユニバーサルプライミング部位（増幅又は配列決定のための）及び任意選択で、１つ又は複数のバーコードを提供する。アダプターをライゲーションする正確なモードは、アダプターがプライマー伸長産物に付随し、以下で説明する後続ステップが可能な限り、重要ではない。
【0087】
[0111]上に記載するいくつかの実施形態では、本方法は、ユニバーサルプライミング配列（「プライミング部位」）を含み、単一のプライミング部位を用いたプライマー伸長産物を生じる標的特異的プライマーを含む。そのような実施形態では、指数関数的増幅を可能にするために、１つだけの追加のプライミング配列（「プライミング部位」）を提供する必要がある。他の実施形態では、標的特異的プライマーは、ユニバーサルプライミング部位を含まない。そのような実施形態では、指数関数的増幅を可能にするために、２つのプライミング部位が提供される必要がある。ユニバーサルプライミング部位を有するアダプターは、当技術分野で利用可能な任意の一本鎖ライゲーション法によって追加されても
よい。
よい。
【0088】
[0112]一本鎖ライゲーション法の一例は、伸長プライマーが、ユニバーサルライゲーション部位を含む実施形態で使用することができる。そのような実施形態では、プライマーのユニバーサルライゲーション部位に相補的な二本鎖領域及び一本鎖オーバーハングを有するアダプターを、アニール及びライゲートすることができる。アダプターの一本鎖３’オーバーハングをプライマーの５’末端のユニバーサルライゲーション部位にアニーリングすると、プライマー伸長産物を含む鎖にニックのある二本鎖領域が生成される。ＤＮＡリガーゼ若しくは別の酵素、又はプライマー伸長産物の５’－リン酸とアダプターの３’－ＯＨの間の反応を触媒することができる非酵素試薬によって、２本の鎖をニックでライゲートできる。アダプターをつなげることにより、ライゲーションは、プライマー伸長産物の一端にユニバーサルプライミング部位を提供する。
【0089】
[0113]一本鎖ライゲーション法の別の例を、ユニバーサルプライミング部位をプライマー伸長産物の反対側末端に（又は、伸長プライマーがユニバーサルライゲーション部位を含まない実施形態では、伸長産物の両側に）追加することに使用できる。この実施形態では、ライゲーションされるプライマー伸長産物の一端又は両端は、ユニバーサルライゲーション部位を持たない。さらに、いくつかの実施形態では、ライゲーションされるプライマー伸長産物の少なくとも１つの末端は、（例えば、無作為的な終結事象又は未知の配列変動のために）未知の配列を有する。そのような実施形態では、配列に依存しない一本鎖ライゲーション法が用いられる。例示的な方法は、米国特許出願公開第２０１４０１９３８６０号に記載されている。基本的に、本方法では、一本鎖３’末端オーバーハングが、ユニバーサルライゲーション部位を持つ代わりに、無作為配列、例えば、無作為ヘキサマー配列を持つアダプターの母集団を使用する。その方法のいくつかの実施形態では、アダプターはヘアピン構造も持つ。別の例は、ＡＣＣＥＬ－ＮＧＳ １Ｓ ＤＮＡライブラリーキット（Ｓｗｉｆｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈ．）によって可能となる方法である。
【0090】
[0114]本方法のライゲーションステップは、リガーゼ若しくは同様の活性を持つ別酵素又は非酵素試薬を利用する。リガーゼは、例えば、Ｔ４若しくはＥ．ｃｏｌｉリガーゼなどのウイルス若しくは細菌起源のＤＮＡ若しくはＲＮＡリガーゼ、又は熱安定性リガーゼＡｆｕ、Ｔａｑ、Ｔｆｌ若しくはＴｔｈであり得る。一部の実施形態では、代替酵素、例えばトポイソメラーゼを使用することができる。さらに、非酵素試薬を使用して、Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａらの米国特許出願公開第２０１４／０１９３８６０号に記載及び参照されているように、プライマー伸長産物の５’－リン酸とアダプターの３’－ＯＨとの間にリン酸－ジエステル結合を形成することができる。
【0091】
[0115]本方法のいくつかの実施形態では、アダプターの第１のライゲーションの後に、任意選択のプライマー伸長が続く。ライゲーションされたアダプターは、伸長して二本鎖核酸を生成できる遊離の３’末端を持つ。その後、アダプターの反対端は、別のアダプターの平滑末端ライゲーションに適するようになる。一本鎖ライゲーション手順の必要を避け、分子のこの二本鎖末端を、任意のリガーゼ又は別の酵素的又は非酵素的手段によって、二本鎖アダプターにライゲーションすることができる。二本鎖アダプター配列は、１つ又は複数のユニバーサルプライミング部位（増幅又は配列決定のための）及び、任意選択で１つ又は複数のバーコードを提供する。
【0092】
[0116]いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ライゲーションステップの後に１つ又は複数の精製ステップを含む。精製により、未使用のアダプター分子が除去される。アダプター及び大きなサイズのライゲーション産物は、サイズ排除法、例えばゲル電気泳動、クロマトグラフィー、又は等速電気泳動によって伸長産物から分離される。
【0093】
[0117]いくつかの実施形態では、精製は親和性結合による。この実施形態の変形では、親和性は特定の標的配列に対するものである（配列捕捉）。他の実施形態では、アダプターは親和性タグを含む。当該分野で公知の任意の親和性タグを使用することができる（例えば、ビオチン又は抗体又は特定の抗体が存在する抗原）。親和性タグの親和性パートナーは、溶液相支持体（例えば、懸濁粒子上又はビーズ上）に会合していても、又は固体支持体に結合していてもよい。親和性精製の過程で、反応混合物の未結合成分が洗い流される。一部の実施形態では、未使用のアダプターを除去するために追加のステップが取られる。
【0094】
[0118]いくつかの実施形態において、本発明は、増幅ステップを含む。このステップには、線形又は指数関数的増幅（例えば、ＰＣＲ）が含まれる。増幅用のプライマーは、増幅される核酸内に存在する任意の配列を含むことができ、一方又は両方の鎖の合成を支援することができる。増幅は、等温であってもよいし、熱サイクルを伴っていてもよい。
【0095】
[0119]いくつかの実施形態では、増幅は指数関数的であり、ＰＣＲを伴う。ＰＣＲ増幅バイアスを低減することが望まれる。バイアスを低減するために１つ又は複数の遺伝子特異的プライマーが使用される場合、限定された数の増幅サイクル（例えば、約１０以下のサイクル）が方法に伴う。これらの実施形態の他の変形では、ユニバーサルプライマーを使用して両方の鎖を合成する。ユニバーサルプライマー配列は、ライゲーションされたアダプターの一方又は両方の元来の伸長プライマーの一部であってもよい。１つ又は２つのユニバーサルプライマーが使用できる。上に記載の伸長プライマー及び一方又は両方のアダプターは、同じプライマー結合部位を有するように操作することができる。その実施形態では、単一のユニバーサルプライマーを使用して、両方の鎖を合成することができる。他の実施形態では、増幅される分子の一方の側の伸長プライマー（又はアダプター）及びもう一方の側のアダプターは、異なるユニバーサルプライマー結合部位を含む。ユニバーサルプライマーは、（同じ又は異なる配列の）別のユニバーサルプライマーと対になってもよい。他の実施形態では、ユニバーサルプライマーは、遺伝子特異的プライマーと対になってもよい。ユニバーサルプライマーを用いたＰＣＲでは配列バイアスが低減するため、増幅サイクルの数を、遺伝子特異的プライマーを用いたＰＣＲにおける場合と同じ程度に限定する必要はない。ユニバーサルプライマーが使用される場合の増幅サイクルの数は、低くてもよいが、約２０、３０又はそれ以上に高くてもよい。
【0096】
[0120]本発明は、分子バーコードの使用を含む。バーコードは、典型的には、４～３６ヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、バーコードは、互いに１０℃以下の融解温度を有するように設計される。バーコードは、最小限のクロスハイブリダイズセット、つまり、所望の反応条件下で互いにできるだけ少ない安定なハイブリッドを形成する配列の組み合わせを形成するように設計できる。配列の同定及び計測のためのバーコードの設計、配置及び使用は、当技術分野で知られている。例えば、米国特許第７，３９３，６６５号、第８，１６８，３８５号、第８，４８１，２９２号、第８，６８５，６７８号、及び第８，７２２，３６８号を参照されたい。
【0097】
[0121]バーコードを使用して、サンプル及びその子孫（すなわち、元の核酸分子を使用して産生される核酸分子のセット）中の各核酸分子を同定することができる。そのようなバーコードは「ユニークＩＤ」（ｕｎｉｑｕｅ ＩＤｓ；ＵＩＤ）である。
【0098】
[0122]バーコードはまた、分析される核酸分子が由来するサンプルを同定するために使用できる。そのようなバーコードは「マルチプレックスサンプルＩＤ」（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｓａｍｐｌｅ ＩＤ；「ＭＩＤ」）である。同じサンプルに由来するすべての分子は、同じＭＩＤを共有する。
【0099】
[0123]バーコードには、各バーコードに特徴的なヌクレオチドのユニークな配列が含まれる。いくつかの実施形態では、バーコードの配列は事前に設計されている。他の実施形態では、バーコード配列は無作為的である。バーコード内の全て又は一部のヌクレオチドは無作為的にできる。既知の配列内の無作為配列及び無作為ヌクレオチド塩基は、それぞれ「縮重配列」及び「縮重塩基」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、分子は２つ以上のバーコードを含む：１つは分子識別（ＵＩＤ）用であり、１つはサンプル識別（ＭＩＤ）用である。ときおり、ＵＩＤ又はＭＩＤが各々いくつかのバーコードを含み、それらを一緒にすると、分子又はサンプルの識別が可能になる。
【0100】
[0124]いくつかの実施形態では、反応におけるＵＩＤの数は、標識される分子の数を超えることができる。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のバーコードを使用して、配列をグループ化又はビン化する。例えば、いくつかの実施形態では、１つ又は複数のＵＩＤを使用して配列をグループ化又はビン化し、各ビン内の配列は同じＵＩＤを含む、すなわち、単一の標的分子に由来するアンプリコンである。いくつかの実施形態では、配列を整列させるためにＵＩＤが使用される。他の実施形態では、標的特異的領域は、配列を整列させるために使用される。本発明のいくつかの実施形態では、ＵＩＤが初期プライマー伸長事象に導入される一方で、サンプルのバーコード（ＭＩＤ）がライゲーションされたアダプターに導入される。
【0101】
[0125]ライゲーションを行った後、核酸産物を配列決定することができる。配列決定は、当技術分野で公知の任意の方法によって行うことができる。ハイスループットの単一分子配列決定が特に有利である。そのような技術の例には、４５４ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳ ＧＳ ＦＬＸプラットフォーム（４５４ ＬＩＦＥ ＳＣＩＥＮＣＥＳ）ＩＬＬＵＭＩＮＡ ＨＩＳＥＱプラットフォーム（ＩＬＬＵＭＩＮＡ）、ＩＯＮ ＴＯＲＲＥＮＴプラットフォーム（ＬＩＦＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）、ＳＭＲＴ配列決定技術を利用したＰＡＣＩＦＩＣ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳプラットフォーム（ＰＡＣＩＦＩＣ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ）、及び合成による配列決定を伴うか、又は伴わない任意の他の現在存在するか又は将来の単一分子配列決定技術が含まれる。これらの実施形態の変形では、配列決定は、一方又は両方のアダプター配列又は一方又は両方のプライマー配列に存在するユニバーサルプライマー部位を利用する。これらの実施形態のさらなる他の変形では、遺伝子特異的プライマーが配列決定に使用される。しかしながら、ユニバーサルプライマーは、遺伝子特異的プライマーと比較して、配列決定バイアスの減少が付随することに留意されたい。
【0102】
[0126]いくつかの実施形態では、配列決定ステップは、配列整列を含む。いくつかの実施形態では、整列を使用して、複数の配列、例えば、同じユニーク分子ＩＤ（ＵＩＤ）を有する複数からコンセンサス配列を決定する。いくつかの実施形態では、整列は、単一ヌクレオチド変動（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｖａｒｉａｔｉｏｎ；ＳＮＶ）などの配列変動を同定するために使用される。いくつかの実施形態では、コンセンサス配列は、すべてが同一のＵＩＤを有する複数の配列から決定される。他の実施形態では、ＵＩＤは、アーティファクト、すなわち、（特定のＵＩＤによって特徴付けられる）単一分子の子孫に存在する変動、を排除するために使用される。ＰＣＲエラー又は配列決定エラーから生じるそのようなアーティファクトは、ＵＩＤを使用して排除できる。
【0103】
[0127]いくつかの実施形態では、サンプル中の各配列の数は、同じマルチプレックスサンプルＩＤ（ＭＩＤ）を持つ集団の間で、各ＵＩＤを持つ配列の相対数を定量化することによって定量化することができる。各ＵＩＤは元のサンプルの単一分子を表し、各配列変異体に付随する異なるＵＩＤを計数すると、すべての分子が同じＭＩＤを共有する、元のサンプルの各配列変異体の割合を決定することができる。当業者は、コンセンサス配列を
決定するために必要な配列読み取りの数を決定することができるであろう。一部の実施形態では、関連する数は、正確な定量的結果のために必要であるＵＩＤ（「配列深度」）あたりの読み取りである。一部の実施形態では、所望の深さは、ＵＩＤあたり５～５０回の読み取りである。
決定するために必要な配列読み取りの数を決定することができるであろう。一部の実施形態では、関連する数は、正確な定量的結果のために必要であるＵＩＤ（「配列深度」）あたりの読み取りである。一部の実施形態では、所望の深さは、ＵＩＤあたり５～５０回の読み取りである。
【0104】
[0128]本発明の方法において使用されるサンプルは、核酸を含む任意の個体（例えば、ヒト、患者）又は環境サンプルを含む。ポリヌクレオチドはサンプルから抽出することができるか、又はサンプルは本発明の方法に直接供することができる。開始サンプルはまた、抽出されるか又は単離された核酸、ＤＮＡ又はＲＮＡであり得る。サンプルは、生物から得られた任意の組織又は体液を構成することができる。例えば、サンプルは、腫瘍生検又は血液又は血漿サンプルであり得る。一部の実施形態では、サンプルは、ホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）サンプルである。サンプルは、１つ又は複数の供給源、例えば１人又は複数の患者からの核酸を含み得る。いくつかの実施形態では、組織は病原体に感染する可能性があり、したがって宿主及び病原体の核酸を含み得る。
【0105】
[0129]ＤＮＡ抽出の方法は、当技術分野でよく知られている。Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋら、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，”１９８９年、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．を参照されたい。生体サンプルから核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）を抽出するためのさまざまなキットが市販されている（例えば、ＢＤ ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ ＣＬＯＮＴＥＣＨ （Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、Ｃａｌ．）、ＥＰＩＣＥＮＴＲＥ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ （Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃ．）；ＧＥＮＴＲＡ ＳＹＳＴＥＭＳ、ＩＮＣ．（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎ．）；ａｎｄ ＱＩＡＧＥＮ、ＩＮＣ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ、Ｃａｌ．）、ＡＭＢＩＯＮ、ＩＮＣ．（Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘ．）；ＢＩＯＲＡＤ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌ．）；など）。
【0106】
[0130]いくつかの実施形態では、本発明の方法で使用される開始サンプルは、ライブラリー、例えば、複数のポリヌクレオチドを含むゲノムライブラリー又は発現ライブラリーである。他の実施形態では、ライブラリーは、本発明の方法によって作成される。出発材料が生物学的サンプルである場合、本方法は、増幅ライブラリー、又は多様性又は配列を代表するアンプリコンのコレクションを作成する。ライブラリーは、ライブラリー内の核酸のさらなる増幅又は配列決定のために複数回保存及び使用することができる。
【0107】
[0131]本開示の一実施形態によれば、プライマー伸長標的濃縮のための方法は、標的核酸の溶液中プライマー媒介捕捉を含むことができる。ここで図２Ａ～２Ｅを見ると、核酸のライブラリーには、目的領域（ＲＯＩ）２０２を含む標的核酸２００が含まれる（図２Ａ）。標的核酸２００は、第１のアダプター２０４を含む第１の末端及び第２のアダプター２０６を含む第２の末端をさらに含む。図２Ａ～２Ｅでは、標的核酸２００は、標的核酸２００の３’末端（すなわち、第１の末端）に位置する第１のアダプター２０４及び標的核酸２００の５’末端（すなわち、第２の末端）に位置する第２のアダプター２０６を有する一本鎖核酸として示される。第１のオリゴヌクレオチド２０８は、核酸のライブラリー中の標的核酸２００にハイブリダイズする。第１のオリゴヌクレオチド２０８は、標的核酸に相補的な３’標的特異的領域２１０及び捕捉部分２１２を含む。図示の実施形態では、標的特異的領域２１０は、ＲＯＩ ２０２に相補的である。
【0108】
[0132]図２Ｂに示すように、ハイブリダイズされた第１のオリゴヌクレオチド２０８は、第１のポリメラーゼ（図示せず）で伸長され、それにより、標的核酸２００及び伸長された第１のオリゴヌクレオチド２１６を含む第１のプライマー伸長複合体２１４を生成する（伸長された第１のオリゴヌクレオチド２１６の伸長された部分を破線で示す）。第１のプライマー伸長複合体２１４は、固体支持体２１８上に捕捉される。固体支持体は、溶液相支持体（例えば、ビーズ又は別の類似の粒子）、又は固相支持体（例えば、シリコンウエハー、ガラススライドなど）であり得る。例えば、米国特許第６５６５６８号、第６２７４３８６号、第７３７１８３０号、第６８７００４７号、第６２５５４７７号、第６７４６８７４号及び第６２５８５３１号に記載される磁性ガラス粒子及びそれを使用するデバイスを使用することができる。図２Ｂに図示される実施形態では、第１のプライマー伸長複合体２１４は、捕捉部分２１２を介して固体支持体上に捕捉される。捕捉に続いて、第１のプライマー伸長複合体２１４は、核酸のライブラリーに対して濃縮される。
【0109】
[0133]図２Ｃを見ると、第２のオリゴヌクレオチド２２０は、標的核酸２００にハイブリダイズされる。第２のオリゴヌクレオチド２２０は、標的核酸２００に相補的であり、第１のオリゴヌクレオチド２０８の標的特異的領域２１０に対して５’位で標的核酸２００にハイブリダイズする。図示される実施形態では、第２のオリゴヌクレオチド２２０は、ＲＯＩ ２０２のすぐ外側の位置で標的核酸２００に相補的であり、ハイブリダイズされる。しかしながら、第１のオリゴヌクレオチド２０８及び第２のオリゴヌクレオチド２２０は、第２のオリゴヌクレオチド２２０が第１のオリゴヌクレオチド２０８の標的特異的領域２１０に対して５’位で標的核酸２００にハイブリダイズするように、標的核酸２００の長さに沿った任意の定義された位置でハイブリダイズするように設計できることが認識される。図２Ｃから、第１の伸長されたオリゴヌクレオチド２１６（固体支持体２１８に付着している）及び第２のオリゴヌクレオチド２２０の両方が標的核酸２００にハイブリダイズされることが分かる。
【0110】
[0134]図２Ｄを参照すると、ハイブリダイズされた第２のオリゴヌクレオチド２２０は、第２のポリメラーゼ（図示せず）で伸長され、それにより、標的核酸２００及び伸長された第２のオリゴヌクレオチド２２４（伸長された第２のオリゴヌクレオチド２２４の伸長部分を破線で示す）を含む第２のプライマー伸長複合体２２２を生成する。一態様では、ハイブリダイズされた第２のオリゴヌクレオチド２２０の伸長により、第１のプライマー伸長複合体２１４から伸長された第１のオリゴヌクレオチド２１６が遊離する。別の態様では、伸長された第１のオリゴヌクレオチド２１６（第１のオリゴヌクレオチドプライマー２０８を含む）は、固体支持体２１８に付着したままである。
【0111】
[0135]図２Ｅに図示するように、標的核酸２００は、第３のポリメラーゼ（図示せず）、第１の増幅プライマー２２６、及び第２の増幅プライマー２２８で増幅される。第１の増幅プライマー２２６は、第１のアダプター２０４に相補的な３’末端を含み、第２の増幅プライマー２２８は、第２のアダプター２０６に相補的な３’末端を含む。
【0112】
[0136]本開示の別の実施形態によれば、プライマー伸長標的濃縮のための方法は、標的核酸のインサイツプライマー媒介捕捉を含むことができる。図３Ａ及び３Ｂを参照すると、核酸のライブラリーは、目的領域（ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｅｓｔ；ＲＯＩ）３０２（図３Ａ）を含む標的核酸３００を含む。標的核酸３００は、第１のアダプター３０４を含む第１の末端及び第２のアダプター３０６を含む第２の末端をさらに含む。図３Ａ及び３Ｂでは、標的核酸３００は、第１のアダプター３０４が標的核酸３００の３’末端（すなわち、第１の末端）に位置し、第２のアダプター３０６が標的核酸３００の５’末端（すなわち、第２の末端）に位置する一本鎖核酸として図示される。第１のオリゴヌクレオチド３０８は、核酸のライブラリー中の標的核酸３００にハイブリダイズされる。第１のオリゴヌクレオチド３０８は、標的核酸３００に相補的である３’標的特異的領域３１０及び捕捉部分３１２を含む。図示の実施形態では、標的特異的領域３１０は、ＲＯＩ ３０２に相補的である。
【0113】
[0137]図２Ａ～２Ｅに示される実施形態と比較して、第１のオリゴヌクレオチド３０８
は、第１のオリゴヌクレオチド３０８の標的核酸３００へのハイブリダイゼーションの前又は同時に、固体支持体３１８上に捕捉される。固体支持体３１８は、溶液相支持体（例えば、ビーズ又は他の類似の粒子）、又は固相支持体（例えば、シリコンウエハー、ガラススライドなど）であってもよい。図３Ａに示される実施形態では、第１のオリゴヌクレオチド３０８は、捕捉部分３１２を介して固体支持体３１８上に捕捉される。図２Ｂを見ると、ハイブリダイズされた第１のオリゴヌクレオチド３０８は、第１のポリメラーゼ（図示せず）で伸長され、それにより、標的核酸３００及び伸長された第１のオリゴヌクレオチド３１６を含む第１のプライマー伸長複合体３１４を生成する（伸長された第１のオリゴヌクレオチド３１６の伸長された部分を破線で示す）。特に、第１のプライマー伸長複合体３１４は、固体支持体３１８上に捕捉され、核酸のライブラリーに対する標的核酸３００の濃縮を可能にする。その後、第２のプライマーハイブリダイゼーション及び伸長反応は、図２Ｃ及び２Ｄに図示されるように実行することができ、その後、図２Ｅに図示されるような増幅ステップが続く。
は、第１のオリゴヌクレオチド３０８の標的核酸３００へのハイブリダイゼーションの前又は同時に、固体支持体３１８上に捕捉される。固体支持体３１８は、溶液相支持体（例えば、ビーズ又は他の類似の粒子）、又は固相支持体（例えば、シリコンウエハー、ガラススライドなど）であってもよい。図３Ａに示される実施形態では、第１のオリゴヌクレオチド３０８は、捕捉部分３１２を介して固体支持体３１８上に捕捉される。図２Ｂを見ると、ハイブリダイズされた第１のオリゴヌクレオチド３０８は、第１のポリメラーゼ（図示せず）で伸長され、それにより、標的核酸３００及び伸長された第１のオリゴヌクレオチド３１６を含む第１のプライマー伸長複合体３１４を生成する（伸長された第１のオリゴヌクレオチド３１６の伸長された部分を破線で示す）。特に、第１のプライマー伸長複合体３１４は、固体支持体３１８上に捕捉され、核酸のライブラリーに対する標的核酸３００の濃縮を可能にする。その後、第２のプライマーハイブリダイゼーション及び伸長反応は、図２Ｃ及び２Ｄに図示されるように実行することができ、その後、図２Ｅに図示されるような増幅ステップが続く。
【0114】
[0138]本開示のさらなる別の実施形態によれば、プライマー伸長標的濃縮のための方法は、標的核酸の伸長媒介捕捉を含んでもよい。図４Ａ～４Ｄを参照すると、核酸のライブラリーは、目的領域（ＲＯＩ）４０２を含む標的核酸４００を含む（図４Ａ）。標的核酸４００はさらに、第１のアダプター４０４を含む第１の末端及び第２のアダプター４０６を含む第２の末端を含む。図４Ａ～４Ｄでは、標的核酸４００は、第１のアダプター４０４が標的核酸４００の３’末端（すなわち、第１の末端）に位置し、第２のアダプター４０６が標的核酸４００の５’末端（すなわち、第２の末端）に位置する一本鎖核酸として図示される。第１のオリゴヌクレオチド４０８は、核酸のライブラリー中の標的核酸４００にハイブリダイズされる。第１のオリゴヌクレオチド４０８は、標的核酸４００に相補的である。特に、第１のオリゴヌクレオチド４０８は、図２Ａの捕捉部分２１２を含む第１のオリゴヌクレオチド２０８と比較して、必ずしも捕捉部分を含まない。図４Ａに示される実施形態では、第１のオリゴヌクレオチド４０８は、ＲＯＩ ４０２の一部に相補的である。
【0115】
[0139]図４Ｂに示されるように、ハイブリダイズされた第１のオリゴヌクレオチド４０８は、第１のポリメラーゼ（図示せず）で伸長され、それにより、標的核酸４００及び伸長された第１のオリゴヌクレオチド４１６を含む第１のプライマー伸長複合体４１４を生成する（伸長された第１のオリゴヌクレオチド４１６の伸長された部分を破線で示す）。図４Ａ～４Ｄに図示される実施形態によれば、第１のオリゴヌクレオチド４０８の伸長は、１つ又は複数の修飾核酸４１２の存在下で行われる。各修飾核酸は、捕捉部分４１２ａを含むか、又は、第１のオリゴヌクレオチド４１６の伸長と同時に又はその後に、修飾を受けて捕捉部分４１２ａを追加することができる。捕捉部分４１２ａを含む１つ又は複数の修飾核酸４１２を組み込むことにより、固体支持体４１８上での標的核酸４００の伸長を介した捕捉が可能になる。固体支持体４１８は、溶液相支持体（例えば、ビーズ又は他の類似の粒子）、又は固相支持体（例えば、シリコンウエハー、ガラススライドなど）であり得る。図４Ｂに図示される実施形態では、第１のプライマー伸長複合体４１４は、捕捉部分４１２ａを含む修飾された核酸４１２を介して固体支持体４１８上に捕捉される。捕捉に続いて、第１のプライマー伸長複合体４１４は、核酸のライブラリーに対して濃縮される。
【0116】
[0140]図４Ｃを見ると、第２のオリゴヌクレオチド４２０は、標的核酸４００にハイブリダイズされる。第２のオリゴヌクレオチド４２０は、標的核酸４００に相補的であり、第１のオリゴヌクレオチド４０８に対して５’位で標的核酸４００にハイブリダイズする。図示の実施形態では、第２のオリゴヌクレオチド４２０は、ＲＯＩ ４０２のすぐ内側の位置で標的核酸４００に相補的であり、ハイブリダイズする。しかしながら、第１のオリゴヌクレオチド４０８及び第２のオリゴヌクレオチド４２０は、第２のオリゴヌクレオチド４２０が第１のオリゴヌクレオチド４０８の標的特異的領域４１０に対して５’位で標的核酸４００にハイブリダイズするように、標的核酸４００の長さに沿った任意の定義された位置でハイブリダイズするように設計できることが認識される。
【0117】
[0141]図４Ｃを引き続き参照すると、ハイブリダイズされた第２のオリゴヌクレオチド４２０は、第２のポリメラーゼ（図示せず）で伸長され、それにより、標的核酸４００及び伸長された第２のオリゴヌクレオチド４２４（伸長された第２のオリゴヌクレオチド４２４の伸長部分を破線で示す）を含む第２のプライマー伸長複合体４２２を生成する。第２のポリメラーゼでの第２のオリゴヌクレオチド４２０の伸長の前に、第１の伸長されたオリゴヌクレオチド４１６（固体支持体４１８に付着している）及び第２のオリゴヌクレオチド４２０はそれぞれ標的核酸４００にハイブリダイズされている。ハイブリダイズされた第２のオリゴヌクレオチド４２０の伸長により、第１のプライマー伸長複合体４１４から、伸長された第１のオリゴヌクレオチド４１６が遊離する。別の態様では、伸長された第１のオリゴヌクレオチド４１６（第１のオリゴヌクレオチドプライマー４０８及び修飾された核酸４１２を含む）は、固体支持体４１８に付着したままである。
【0118】
[0142]図４Ｄに図示されるように、標的核酸４００は、第３のポリメラーゼ（図示せず）、第１の増幅プライマー４２６、及び第２の増幅プライマー４２８で増幅される。第１の増幅プライマー４２６は、第１のアダプター４０４に相補的な３’末端を含み、第２の増幅プライマー４２８は、第２のアダプター４０６に相補的な３’末端を含む。
【0119】
[0143]一態様では、核酸のライブラリー中の標的及び非標的核酸は、デイジーチェーン構造をもたらす分子間相互作用を示し得る。図５に示されるように、標的核酸２００（図２Ａも参照）は、ＲＯＩ、第１のアダプター２０４及び第２のアダプター２０６を含む。第１のオリゴヌクレオチド２０８は、標的核酸２００にハイブリダイズされる。第１のオリゴヌクレオチド２０８は、３’標的特異的領域２１０及び捕捉部分２１２を含む。核酸のライブラリーは、第１の非標的核酸５００及び第２の非標的核酸５００’を含む１つ又は複数の非標的核酸をさらに含み得る。標的核酸２００と同様に、第１の非標的核酸５００及び第２の非標的核酸５００’は各々、第１のアダプター５０４及び５０４’をそれぞれ含む第１の末端、並びに第２のアダプター５０６及び５０６’をそれぞれ含む第２の末端を含む。一態様では、第１のアダプター２０４は、第１のアダプター５０４に少なくとも部分的に相補的であり、第２のアダプター５０６は、第２のアダプター５０６’に少なくとも部分的に相補的である。したがって、図５に図示されるように、標的核酸２００は、非標的核酸５００及び非標的核酸５００’とデイジーチェーンを形成することができる。
【0120】
[0144]様々な状況において、デイジーチェーン構造の形成を最小化又は排除することは有用であり得る。例えば、第１のオリゴヌクレオチド２０８のハイブリダイゼーション及び伸長による標的核酸２００の捕捉は、非標的核酸５００及び非標的核酸５００を、会合を介して捕捉してしまう可能性があり、それにより、捕捉及び濃縮法の特異性の低減をもたらし得る。核酸のライブラリー中の標的核酸と非標的核酸のアダプター末端間の分子間相互作用を低減するために、ブロッキングオリゴヌクレオチドをアダプター末端配列にハイブリダイズさせることができる。
【0121】
[0145]オフターゲットハイブリダイゼーションの低減を促進するために、ブロッキングオリゴヌクレオチドは、アダプター（例えば、第１のアダプター２０４及び第２のアダプター２０６）に相補的な配列を有し、これらのアダプター配列に優先的にハイブリダイズする。ブロッキングオリゴは、シングルプレックス（ｓｉｎｇｌｅ－ｐｌｅｘ）とマルチプレックス（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）の両方のフォーマットで使用できる。マルチプレックスが望ましい場合は、さまざまなサンプルインデックス配列をアダプターに組み込むこと
ができる。しかしながら、これには、マッチングするブロッキングオリゴヌクレオチドの使用が必要である。多数のサンプルインデックス（例えば、２４、９６など）を使用する場合、１つの「ユニバーサル」ブロッキングオリゴヌクレオチドを使用することは１つの可能性である。ユニバーサルブロッキングオリゴヌクレオチドは、多数の異なるサンプルインデックス配列に結合できる非天然ヌクレオチドを含むユニーク配列を持っている。その結果、単一のブロッキングオリゴヌクレオチドのみが核酸サンプルに追加される。或いは（又はさらに）、単一のユニバーサルブロッキングオリゴヌクレオチドは、ユニバーサルブロッキングオリゴヌクレオチド組成物を集合的に構成するオリゴヌクレオチドの混合物であり得る。
ができる。しかしながら、これには、マッチングするブロッキングオリゴヌクレオチドの使用が必要である。多数のサンプルインデックス（例えば、２４、９６など）を使用する場合、１つの「ユニバーサル」ブロッキングオリゴヌクレオチドを使用することは１つの可能性である。ユニバーサルブロッキングオリゴヌクレオチドは、多数の異なるサンプルインデックス配列に結合できる非天然ヌクレオチドを含むユニーク配列を持っている。その結果、単一のブロッキングオリゴヌクレオチドのみが核酸サンプルに追加される。或いは（又はさらに）、単一のユニバーサルブロッキングオリゴヌクレオチドは、ユニバーサルブロッキングオリゴヌクレオチド組成物を集合的に構成するオリゴヌクレオチドの混合物であり得る。
【0122】
[0146]一態様では、ユニバーサルブロッキングオリゴヌクレオチドは、第１及び第２の特異的領域に隣接する非特異的領域を含む。非特異的領域は、例えば、ユニバーサルブロッキングオリゴヌクレオチドが標的アダプター配列にハイブリダイズしたときにサンプルインデックス配列と整列する一連のイノシンを含む。ユニバーサルブロッキングオリゴヌクレオチドの特定領域は、アダプター配列の不変部分に相補的であり、ブロッキングオリゴヌクレオチドアダプター二重鎖のＴｍを増加させるために１つ又は複数の融解温度（Ｔｍ）修飾塩基を含む。Ｔｍ修飾塩基置換の例を表１に示す。
【0123】
[0147]
【0124】
【表1】
【0125】
[0148]別の態様では、２つの異なるアダプター配列で調製された非増幅核酸ライブラリーは、アダプター末端が互いにハイブリダイズしないならば、ブロッキングオリゴヌクレオチド無しで処理することもあり得る。このアプローチに適したアダプタータイプには、フォーク型及びＹ型アダプターが含まれる。
【実施例0126】
実施例１
溶液中プライマー媒介捕捉（ＰＥＴＥ－Ｃａｐ）によるプライマー伸長標的濃縮
[0149]溶液中プライマー媒介捕捉によるプライマー伸長標的濃縮は、以下のプロトコルに従って行われた。製造業者の取扱説明書に従って、ＫＡＰＡ ＨＹＰＥＲＰＬＵＳライブラリー調製キットを使用して、最大０．８Ｘのライゲーション後クリーンアップステップを含む、１０ｎｇ及び１００ｎｇのＮＡ１２８７８ヒトゲノムＤＮＡ（ＣＯＲＩＥＬＬ）から、核酸の重複ライブラリーを調製した（図６Ａ）。その後、核酸のライブラリー中の標的核酸は、図２に図示されている実施形態に従って、溶液中プライマー媒介捕捉を含むプライマー伸長標的濃縮によって濃縮された。標的核酸のプラス又はマイナス鎖に相補的なプライマーは、各目的遺伝子（すなわち、標的）の同じエクソン用に設計されている。第１の（内側）オリゴヌクレオチドプライマーは２０～２５ヌクレオチド長で、第２の（外側）オリゴヌクレオチドプライマーは５０～６０ヌクレオチド長であった。第２のオリゴヌクレオチドプライマーに付随する追加の長さ（第１のオリゴヌクレオチドプライマーと比較した）は、５’非相補的テール配列が含まれていたためであった。特に、５’非相補的テール配列を省略することで、第２のオリゴヌクレオチドプライマーの全長を低減することができる。
溶液中プライマー媒介捕捉（ＰＥＴＥ－Ｃａｐ）によるプライマー伸長標的濃縮
[0149]溶液中プライマー媒介捕捉によるプライマー伸長標的濃縮は、以下のプロトコルに従って行われた。製造業者の取扱説明書に従って、ＫＡＰＡ ＨＹＰＥＲＰＬＵＳライブラリー調製キットを使用して、最大０．８Ｘのライゲーション後クリーンアップステップを含む、１０ｎｇ及び１００ｎｇのＮＡ１２８７８ヒトゲノムＤＮＡ（ＣＯＲＩＥＬＬ）から、核酸の重複ライブラリーを調製した（図６Ａ）。その後、核酸のライブラリー中の標的核酸は、図２に図示されている実施形態に従って、溶液中プライマー媒介捕捉を含むプライマー伸長標的濃縮によって濃縮された。標的核酸のプラス又はマイナス鎖に相補的なプライマーは、各目的遺伝子（すなわち、標的）の同じエクソン用に設計されている。第１の（内側）オリゴヌクレオチドプライマーは２０～２５ヌクレオチド長で、第２の（外側）オリゴヌクレオチドプライマーは５０～６０ヌクレオチド長であった。第２のオリゴヌクレオチドプライマーに付随する追加の長さ（第１のオリゴヌクレオチドプライマーと比較した）は、５’非相補的テール配列が含まれていたためであった。特に、５’非相補的テール配列を省略することで、第２のオリゴヌクレオチドプライマーの全長を低減することができる。
【0127】
[0150]第１のオリゴヌクレオチド（内部）プライマーハイブリダイゼーション及び伸長反応を表２に従って設定した。核酸のライブラリーは、上記のＫＡＰＡ ＨＹＰＥＲＰＬＵＳライブラリー調製キットで調製された未増幅産物から構成された。０．８Ｘのライゲーション後クリーンアップステップが反応に含まれた後、溶出後に回収された核酸のライブラリーの総量；核酸のライブラリーの最終濃度は決定されていない（ｎ．ｄ．）。マスターミックス（Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ）は、カスタムＫＡＰＡ ２ＧポリメラーゼＰＣＲマスターミックスで構成された。プライマー混合物は、等モル濃度で存在する３７７個の第１のオリゴヌクレオチド標的特異的内部プライマーのセットで構成された。特に、各々の第１のオリゴヌクレオチド標的固有の内部プライマーには、５’ビオチン捕捉部分が含まれていた。
【0128】
[0151]
【0129】
【表2】
【0130】
[0152]第１のオリゴヌクレオチドプライマーは、核酸のライブラリー中の標的核酸にハイブリダイズされ、表３の熱プロファイルに従い合計約１時間、ポリメラーゼで伸長された。特に、表３のプロトコルでは熱サイクルの使用が省略されている。
【0131】
[0153]
【0132】
【表3】
【0133】
[0154]ビオチン化された第１のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたハイブリダイゼーション及び伸長に続いて、サンプルは、１：１の比率でＤＹＮＡＢＥＡＤＳ ＭＹＯＮＥストレプトアビジンＴ１捕捉ビーズ（ＴＨＥＲＭＯ ＦＩＳＨＥＲ ＳＣＩＥＮＴＩＦ
ＩＣ）と混合された。捕捉ビーズは、ＤＮＡサンプルに添加する前に、１Ｘ結合及び洗浄緩衝液で２回洗浄し、２Ｘ結合及び洗浄緩衝液で再懸濁することにより調製した。結合及び洗浄緩衝液の組成は、表４に列挙される。
ＩＣ）と混合された。捕捉ビーズは、ＤＮＡサンプルに添加する前に、１Ｘ結合及び洗浄緩衝液で２回洗浄し、２Ｘ結合及び洗浄緩衝液で再懸濁することにより調製した。結合及び洗浄緩衝液の組成は、表４に列挙される。
【0134】
[0155]
【0135】
【表4】
【0136】
[0156]サンプルは、５０μＬのＭＹＯＮＥ捕捉ビーズと共に、自動サンプル回転機の上で、室温で１０分間、インキュベートされた。ビオチン化ＤＮＡがビーズに結合したら、サンプルを磁石上に３分間置いてビーズを捕捉し、上清を除去して廃棄した。ビーズを２回、表３に記載されている１Ｘ結合及び洗浄緩衝液で１回、ｐＨ８．０の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌで１回、洗浄し、非ビオチン化ＤＮＡを除去した。次に、ビーズを２０μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ８．０に再懸濁した。
【0137】
[0157]表５に従って、再懸濁したビーズを、第２のオリゴヌクレオチド（外側）プライマーハイブリダイゼーション反応混合物に加えた。
[0158]
[0158]
【0138】
【表5】
【0139】
[0159]表５に列挙した反応混合物を５５℃で１６５分間インキュベートして、標的捕捉の特異性を高めて、第２のオリゴヌクレオチドプライマーが核酸のライブラリー中の標的核酸にハイブリダイズできるようにした。
【0140】
[0160]次に、以前に記載されたようにサンプルを洗浄し、溶出した（すなわち、１×結合及び洗浄緩衝液での単回の洗浄及び１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌでの単回の洗浄、続いて２０μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ中での再懸濁）。
【0141】
[0161]再懸濁したビーズを第２の伸長反応に加え、第２のオリゴヌクレオチドプライマーの伸長及び標的核酸分子の溶液への遊離をもたらした。第２の伸長反応の組成が、表６に列挙される。
【0142】
[0162]
【0143】
【表6】
【0144】
[0163]第２の伸長反応に続いて、サンプルを５０℃で２分間インキュベートし、次に氷上で１分間、磁石の上に直接置いた。上澄みを（ビーズを乱すことなく）サンプルから除去し、等量のＫＡＰＡ ＰＵＲＥ ＢＥＡＤＳ捕捉ビーズ（ＫＡＰＡ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ）に加えた。１Ｘのクリーンアップを行い、サンプルを１５μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ８．０で溶出した。
【0145】
[0164]標的濃縮プロトコルの次のステップは、ＫＡＰＡ ＨＹＰＥＲＰＬＵＳライブラリー調製キットの製造業者の取扱説明書に従った、増幅反応及びＫＡＰＡ ＰＵＲＥ ＢＥＡＤ捕捉ビーズ（ＫＡＰＡ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ）クリーンアップであった。最終産物を２５μＬのＴｒｉｓ－ＨＣｌで溶出した。次に、濃縮された標的核酸を増幅し、ＫＡＰＡ ＨＹＰＥＲＰＬＵＳライブラリー調製キット（ＫＡＰＡ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ）を製造業者の取扱説明書に従って使用して、精製した（図６Ｂ）。濃縮され、増幅されたライブラリーは、ＭＩＮＩＳＥＱ ＤＮＡシーケンサー（ＩＬＬＵＭＩＮＡ）上、２ｘ１５０ｂｐの読み取り、１．６ｐＭのローディング濃度、及び１％のＰｈｉＸ ＤＮＡでｍｉｄ－ｏｕｔｐｕｔキットを使用し、配列決定された。得られた配列決定データは、標的濃縮の程度を評価するために、ＳＥＱＣＡＰ ＥＺ標的濃縮システム（ＲＯＣＨＥ）データの分析用に開発されたパイプラインを使用して処理された（図７）。
【0146】
[0165]本発明の記載された特徴、構造、又は特質は、１つ又は複数の実施形態において、任意の適切な方法で組み合わせることができる。以下の記載では、システムの実施形態の完全な理解を提供するために、数多くの特定の詳細が列挙される。しかしながら、当業者は、１つ又は複数の特定の詳細を省いて、又は他の方法、構成要素、材料などを用いて、システム及び方法の両方が実行され得ることを認識するであろう。他の例では、周知の構造、材料、又は操作は、本発明の態様を不明瞭にすることを避けるために、詳細に示されていないか、又は記載されていない。したがって、前述の記載は例示を意図したものであって、本発明の概念の範囲を限定するものではない。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【手続補正書】
【提出日】2023-10-11
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
核酸のライブラリー中の少なくとも１つの標的核酸を濃縮するための方法であって、以下のステップ：
第１のオリゴヌクレオチドを、核酸のライブラリー中の標的核酸にハイブリダイズするステップであって、核酸のライブラリー中の各核酸が、第１のアダプターを含む第１の末端及び第２のアダプターを含む第２の末端を有するステップ；
ハイブリダイズした第１のオリゴヌクレオチドを第１のポリメラーゼで伸長し、それにより標的核酸及び伸長された第１のオリゴヌクレオチドを含む第１のプライマー伸長複合体を生成するステップ；
第１のプライマー伸長複合体を捕捉するステップ；
第１のプライマー伸長複合体を、核酸のライブラリーに対して濃縮するステップ；
第２のオリゴヌクレオチドを標的核酸にハイブリダイズするステップ；
ハイブリダイズした第２のオリゴヌクレオチドを第２のポリメラーゼで伸長し、それにより、標的核酸及び伸長された第２のオリゴヌクレオチドを含む第２のプライマー伸長複合体を生成し、それにより、伸長された第１のオリゴヌクレオチドを第１のプライマー伸長複合体から遊離させるステップ；並びに
標的核酸を第３のポリメラーゼ、第１の増幅プライマー、及び第２の増幅プライマーで増幅するステップであって、第１の増幅プライマーが、第１のアダプターに相補的な３’末端を持ち、第２の増幅プライマーが、第２のアダプターに相補的な３’末端を持ち、
ここで、標的核酸を増幅するステップは、標的核酸のコピーを産生し、ここで、標的核酸のコピーは、標的核酸の全配列を含み、そして、前記標的核酸のコピーは、伸長された第１のオリゴヌクレオチドおよび伸長された第２のオリゴヌクレオチドよりも長い、ステップ；
を含む方法。
第１のオリゴヌクレオチドを、核酸のライブラリー中の標的核酸にハイブリダイズするステップであって、核酸のライブラリー中の各核酸が、第１のアダプターを含む第１の末端及び第２のアダプターを含む第２の末端を有するステップ；
ハイブリダイズした第１のオリゴヌクレオチドを第１のポリメラーゼで伸長し、それにより標的核酸及び伸長された第１のオリゴヌクレオチドを含む第１のプライマー伸長複合体を生成するステップ；
第１のプライマー伸長複合体を捕捉するステップ；
第１のプライマー伸長複合体を、核酸のライブラリーに対して濃縮するステップ；
第２のオリゴヌクレオチドを標的核酸にハイブリダイズするステップ；
ハイブリダイズした第２のオリゴヌクレオチドを第２のポリメラーゼで伸長し、それにより、標的核酸及び伸長された第２のオリゴヌクレオチドを含む第２のプライマー伸長複合体を生成し、それにより、伸長された第１のオリゴヌクレオチドを第１のプライマー伸長複合体から遊離させるステップ；並びに
標的核酸を第３のポリメラーゼ、第１の増幅プライマー、及び第２の増幅プライマーで増幅するステップであって、第１の増幅プライマーが、第１のアダプターに相補的な３’末端を持ち、第２の増幅プライマーが、第２のアダプターに相補的な３’末端を持ち、
ここで、標的核酸を増幅するステップは、標的核酸のコピーを産生し、ここで、標的核酸のコピーは、標的核酸の全配列を含み、そして、前記標的核酸のコピーは、伸長された第１のオリゴヌクレオチドおよび伸長された第２のオリゴヌクレオチドよりも長い、ステップ；
を含む方法。
【請求項2】
増幅された標的核酸を、配列決定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
第１のオリゴヌクレオチドが、捕捉部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
第１のオリゴヌクレオチドが、第１のオリゴヌクレオチドを標的核酸にハイブリダイズする前に固体支持体に結合しており、並びに第１のオリゴヌクレオチドを標的核酸にハイブリダイズし、及びハイブリダイズした第１のオリゴヌクレオチドをポリメラーゼで伸長することが、それにより、固体支持体上の第１のプライマー伸長複合体を捕捉する、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを、第１のプライマー伸長複合体中の伸長された第１のオリゴヌクレオチド及び第２のプライマー伸長複合体中の伸長された第２のオリゴヌクレオチドの少なくとも１つに組み込むステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
第１のプライマー伸長複合体中の伸長された第１のオリゴヌクレオチドに少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを組み込むステップをさらに含み、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドは捕捉部分を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
第１のプライマー伸長複合体における伸長された第１のオリゴヌクレオチド、及び
第２のプライマー伸長複合体における伸長された第２のオリゴヌクレオチド
の少なくとも１つに、少なくとも１つのウラシルを組み込むステップをさらに含み、
それにより、ウラシル含有オリゴヌクレオチド産物を形成する、請求項１に記載の方法。
第２のプライマー伸長複合体における伸長された第２のオリゴヌクレオチド
の少なくとも１つに、少なくとも１つのウラシルを組み込むステップをさらに含み、
それにより、ウラシル含有オリゴヌクレオチド産物を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
核酸のライブラリーを、ブロッキングオリゴヌクレオチドと接触させるステップをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項9】
第１のアダプター及び第２のアダプターが、フォーク型アダプターである、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
第１のアダプター及び第２のアダプターが、少なくとも１つのウラシルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
第２のオリゴヌクレオチドが、第１のオリゴヌクレオチドに対して５’位で標的核酸にハイブリダイズする、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
第１のアダプター、第２のアダプター、第１の増幅プライマー、及び第２の増幅プライマーのうちの少なくとも１つが、固有識別子（ＵＩＤ）配列、分子識別子（ＭＩＤ）配列のうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。