特開 2024-99476 界面活性剤を分離するためのクロマトグラフィーカラム

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024099476

(43)【公開日】2024-07-25

(54)【発明の名称】界面活性剤を分離するためのクロマトグラフィーカラム

(51)【国際特許分類】

   B01J 20/283 20060101AFI20240718BHJP

   B01J 20/281 20060101ALI20240718BHJP

   G01N 30/88 20060101ALI20240718BHJP

   G01N 30/26 20060101ALI20240718BHJP

   G01N 30/34 20060101ALI20240718BHJP

【ＦＩ】

B01J20/283

B01J20/281 G

B01J20/281 Y

B01J20/281 X

G01N30/88 C

G01N30/26 A

G01N30/34 E

【審査請求】未請求

【請求項の数】32

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2023210465

(22)【出願日】2023-12-13

(31)【優先権主張番号】63/479,585

(32)【優先日】2023-01-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】18/503,722

(32)【優先日】2023-11-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＰＬＵＲＯＮＩＣ

２．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】399117121

【氏名又は名称】アジレント・テクノロジーズ・インク

【氏名又は名称原語表記】ＡＧＩＬＥＮＴ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】100099623

【弁理士】

【氏名又は名称】奥山 尚一

(74)【代理人】

【識別番号】100125380

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 綾子

(74)【代理人】

【識別番号】100142996

【弁理士】

【氏名又は名称】森本 聡二

(74)【代理人】

【識別番号】100166268

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 祐

(74)【代理人】

【識別番号】100180231

【弁理士】

【氏名又は名称】水島 亜希子

(72)【発明者】

【氏名】デイヴィッド・ロォン

(72)【発明者】

【氏名】チェンチェン・フゥー

(72)【発明者】

【氏名】サンディープ・コンダヴィーティ

(72)【発明者】

【氏名】タ・チェン・ウェイ

(72)【発明者】

【氏名】アマンダ・マックウェイ

(57)【要約】      （修正有）

【課題】界面活性剤の純度を特徴付けるためのクロマトグラフィー分離媒体及び分離カラムを提供する。
【解決手段】分離カラムは、ジイソプロピル側鎖基およびペンダントシアノ官能基を有する単官能性シランを有する粒状多孔質基材を有する分離媒体を備える。多孔質基材は、約５０Åから約５００Åの細孔径、および約１．０μｍから約１００μｍの平均粒径を有する。カラムは、約１．０から１００ｍｍ、例えば４．６ｍｍの内径、および約１０ｍｍから約２５０ｍｍの長さを有する。特徴付けられる界面活性剤が、ポリソルベート８０ＰＳ８０などの非イオン界面活性剤である。
【選択図】図５Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

界面活性剤の純度を特徴付けるためのクロマトグラフィー分離カラムであって、
ジイソプロピル側鎖基とペンダントシアノ官能基とを有する単官能性シランを有する粒状多孔質基材を含む分離媒体であって、前記多孔質基材が約５０Åから約５００Åの細孔径と約１．０μｍから約１００μｍの平均粒径とを有する分離媒体と、
前記分離媒体を保持するように構築および配置されているカラムであって、約１．０から１００ｍｍの内径と約１０ｍｍから約２５０ｍｍの長さを有するカラムと
を備えるクロマトグラフィー分離カラム。

【請求項2】

前記特徴付けられる界面活性剤が、非イオン界面活性剤を含む、請求項１に記載のカラム。

【請求項3】

前記非イオン界面活性剤が、ポリソルベート－８０を含む、請求項２に記載のカラム。

【請求項4】

前記多孔質基材が、水和金属酸化物、水和半金属酸化物または有機ポリマーを含む、請求項１に記載のカラム。

【請求項5】

前記多孔質基材が、シリカを含む、請求項４に記載のカラム。

【請求項6】

前記多孔質基材が、約３．５μｍの粒径を有する、請求項１に記載のカラム。

【請求項7】

前記多孔質基材が、約３００Åの細孔径を有する、請求項１に記載のカラム。

【請求項8】

前記カラムの内径が、２．１ｍｍである、請求項１に記載のカラム。

【請求項9】

前記長さが、約５０ｍｍから１５０ｍｍである、請求項１に記載のカラム。

【請求項10】

前記分離媒体が、１．０から８．０のｐＨ範囲における分解に耐えることができる、請求項１に記載のカラム。

【請求項11】

前記分離媒体が、約２０から８０℃の温度範囲で使用できる、請求項１に記載のカラム。

【請求項12】

前記カラムは、約４００ｂａｒまでの操作圧で使用できる、請求項１に記載のカラム。

【請求項13】

ポリソルベート８０の特徴付けを促す方法であって、
ポリソルベート８０、およびポリソルベート８０の１つまたは複数の反応生成物を含む試料を用意するステップと、
クロマトグラフィー分離カラムを用意するステップと
を含み、前記カラムが、
ジイソプロピル側鎖基とペンダントシアノ官能基とを有する単官能性シランを有する粒状多孔質基材を含む分離媒体であって、前記多孔質基材が約５０Åから約５００Åの細孔径と約１．０μｍから約１００μｍの平均粒径とを有する分離媒体と、
前記分離媒体を保持するように構築および配置されているカラムであって、約１．０から１００ｍｍの内径と約１０ｍｍから約２５０ｍｍの長さを有するカラムと
を備える、方法。

【請求項14】

用意された前記クロマトグラフィー分離カラムの前記多孔質基材が、シリカを含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

用意された前記クロマトグラフィー分離カラムの前記多孔質基材が、約３．５μｍの粒径を有する、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

用意された前記クロマトグラフィー分離カラムの前記多孔質基材が、約３００Åの細孔径を有する、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

用意された前記クロマトグラフィー分離カラム方法の前記内径が、２．１ｍｍである、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

用意された前記クロマトグラフィー分離カラムの前記長さが、約５０ｍｍから約１５０ｍｍである、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

前記ポリソルベート８０の１つまたは複数の反応生成物が、１つまたは複数の長鎖脂肪酸、短鎖脂肪酸、ポリオキシエチレン、ポリオキシエチレンソルビタン、アルデヒド、ケトン、ギ酸、酢酸および過酸化物を含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項20】

前記クロマトグラフィー分離カラムを、液体クロマトグラフィー機器に据え付けるステップをさらに含む、請求項１３から１９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項21】

移動相を用意して、前記ポリソルベート８０および前記ポリソルベート８０の１つまたは複数の反応生成物の分離を達成するステップをさらに含む、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記移動相が、酢酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム、アンモニア、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、メタノール、イソプロパノール、アセトニトリル、エタノールおよびアセトンの１つまたは複数を含む、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記移動相を使用した、グラジエントに基づく分離のための説明書を用意するステップをさらに含む、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

界面活性剤の前記特徴付けのためのクロマトグラフィー分離カラムであって、ジイソプロピル側鎖基およびペンダントシアノ官能基を有する単官能性シランを有する粒状多孔質基材を含む分離媒体、約３００Åの細孔径、および約３．５μｍの平均粒径を有する前記多孔質基材；ならびに前記分離媒体を保持するように構築および配置されているカラムを含み、前記カラムが、約２．１ｍｍの内径および約５０ｍｍから１５０ｍｍの長さを有する、クロマトグラフィー分離カラム。

【請求項25】

分離される前記界面活性剤が、非イオン界面活性剤を含む、請求項２４に記載のカラム。

【請求項26】

前記非イオン界面活性剤が、ポリソルベート８０を含む、請求項２５に記載のカラム。

【請求項27】

ポリソルベート８０を特徴付ける方法であって、
ポリソルベート８０、およびポリソルベート８０の１つまたは複数の反応生成物を含む試料を調製するステップと、
前記試料をクロマトグラフィー分離カラム中に注入するステップであって、前記カラムが、ジイソプロピル側鎖基とペンダントシアノ官能基とを有する単官能性シランを有する粒状多孔質基材を含む分離媒体であって、前記多孔質基材が約５０Åから約５００Åの細孔径と約１．０μｍから約１００μｍの平均粒径とを有する分離媒体と、前記分離媒体を保持するように構築および配置されているカラムであって、約１．０から１００ｍｍの内径と約１０ｍｍから約２５０ｍｍの長さを有するカラムとを備える、ステップと、
前記ポリソルベート８０および前記ポリソルベート８０の１つまたは複数の反応生成物が、少なくとも３の分解能で分解されるようなグラジエント移動相を使用して、前記ポリソルベート８０および前記ポリソルベート８０の１つまたは複数の反応生成物を溶出するステップと
を含む、方法。

【請求項28】

前記ポリソルベート８０および前記ポリソルベート８０の１つまたは複数の反応生成物が、少なくとも５の分解能で分解される、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記粒状多孔質基材が、約３００Åの細孔径、および約３．５μｍの平均粒径を有する、請求項２７に記載の方法。

【請求項30】

前記カラムが、約２．１ｍｍの内径および約５０ｍｍの長さを有する、請求項２７に記載の方法。

【請求項31】

前記グラジエント移動相が、酢酸アンモニウムおよびメタノールを含む、請求項２７に記載の方法。

【請求項32】

前記ポリソルベート８０および前記ポリソルベート８０の１つまたは複数の反応生成物の溶出が、１０分未満に発生する、請求項２８から３１のいずれか１項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

［関連出願のクロスリファレンス］
本出願は、２０２３年１月１２日に出願された米国特許出願第６３／４７９，５８５号に対する優先権を主張し、その全体の内容は、参照により本明細書の記載の一部をなすものとする。

【0002】

本明細書で開示されている態様および実施形態は、全般的に、医薬製品における界面活性剤、例えばポリソルベートを検出および分離するためのカラムに関連している。

【発明の概要】

【0003】

一態様によれば、界面活性剤の純度を特徴付けるためのクロマトグラフィー分離カラムが提供される。クロマトグラフィー分離カラムは、ジイソプロピル側鎖基とペンダントシアノ官能基とを有する単官能性シランを有する粒状多孔質基材を含む分離媒体を備え得る。多孔質基材は、約５０から約５００Åの細孔径、および約１．０μｍから約１００μｍの平均粒径を有し得る。クロマトグラフィー分離カラムは、分離媒体を保持するように構築および配置されているカラムも備え得る。このカラムは、約１．０から１００ｍｍの内径および約１０ｍｍから約２５０ｍｍの長さを有し得る。

【0004】

いくつかの実施形態では、特徴付けられる界面活性剤は、非イオン界面活性剤を含み得る。いくつかの実施形態では、非イオン界面活性剤は、ポリソルベートを含み得る。ある実施形態では、ポリソルベートは、ポリソルベート８０であり得る。

【0005】

いくつかの実施形態では、多孔質基材は、水和金属酸化物、水和半金属酸化物または有機ポリマーであり得る。具体的な実施形態では、多孔質基材は、シリカ、例えばシリカ粒子、例として、シラノール表面を有するシリカ粒子であり得る。

【0006】

いくつかの実施形態では、多孔質基材は、約３．５μｍの粒径を有し得る。いくつかの実施形態では、多孔質基材は、約３００Åの細孔径を有し得る。

【0007】

いくつかの実施形態では、カラムの内径は、２．１ｍｍであり得る。いくつかの実施形態では、カラムの長さは、約５０ｍｍであり得る。いくつかの実施形態では、カラムの長さは、約１００ｍｍであり得る。いくつかの実施形態では、カラムの長さは、約１５０ｍｍであり得る。

【0008】

いくつかの実施形態では、分離媒体は、１．０から８．０のｐＨ範囲における分解に耐えることができる。ある実施形態では、分離媒体は、約２０から８０℃の温度範囲で使用することができる。

【0009】

いくつかの実施形態では、カラムは、約４００ｂａｒまでの操作圧で使用することができる。

【0010】

一態様によれば、ポリソルベート８０の特徴付けを促す方法が提供される。この方法は、ポリソルベート８０、およびポリソルベート８０の１つまたは複数の反応生成物を含む試料を用意するステップを含み得る。この方法は、クロマトグラフィー分離カラムを用意するステップも含み得る。クロマトグラフィー分離カラムは、ジイソプロピル側鎖基とペンダントシアノ官能基とを有する単官能性シランを有する粒状多孔質基材を含む分離媒体を備え得る。多孔質基材は、約５０から約５００Åの細孔径、および約１．０μｍから約１００μｍの平均粒径を有し得る。クロマトグラフィー分離カラムは、分離媒体を保持するように構築および配置されているカラムも備え得る。このカラムは、約１．０から１００ｍｍの内径および約１０ｍｍから約２５０ｍｍの長さを有し得る。

【0011】

いくつかの実施形態では、用意されたクロマトグラフィー分離カラムの多孔質基材は、シリカを含み得る。いくつかの実施形態では、用意されたクロマトグラフィー分離カラムの多孔質基材は、約３．５μｍの粒径を有し得る。いくつかの実施形態では、用意されたクロマトグラフィー分離カラムの多孔質基材は、約３００Åの細孔径を有し得る。

【0012】

いくつかの実施形態では、用意されたクロマトグラフィー分離カラム方法の内径は、約２．１ｍｍであり得る。いくつかの実施形態では、用意されたクロマトグラフィー分離カラムの長さは、約５０ｍｍであり得る。いくつかの実施形態では、用意されたクロマトグラフィー分離カラムの長さは、約１００ｍｍであり得る。いくつかの実施形態では、用意されたクロマトグラフィー分離カラムの長さは、約１５０ｍｍであり得る。

【0013】

いくつかの実施形態では、試料におけるポリソルベート８０の１つまたは複数の反応生成物は、１つまたは複数の長鎖脂肪酸、短鎖脂肪酸、ポリオキシエチレン、ポリオキシエチレンソルビタン、アルデヒド、ケトン、ギ酸、酢酸および過酸化物を含み得る。

【0014】

さらなる実施形態では、この方法は、クロマトグラフィー分離カラムを、液体クロマトグラフィー機器に据え付けるステップを含み得る。

【0015】

さらなる実施形態では、この方法は、移動相を用意して、ポリソルベート８０およびポリソルベート８０の１つまたは複数の反応生成物の分離を達成するステップを含み得る。移動相は、酢酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム、アンモニア、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、メタノール、イソプロパノール、アセトニトリル、エタノールおよびアセトンの１つまたは複数を含み得る。例えば、具体的な実施形態では、移動相は、酢酸アンモニウム、例えば１０ｍＭ酢酸アンモニウム、およびメタノールの１つまたは両方を含み得る。さらなる実施形態では、移動相は、例えば、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、例として水中のＴＦＡ、例として水中の０．１％ＴＦＡ、およびメタノールの１つまたは両方を含み得る。

【0016】

さらなる実施形態では、この方法は、移動相を使用した、グラジエントに基づく分離のための説明（instructions）を用意するステップを含み得る。

【0017】

一態様によれば、界面活性剤、例えば、ポリソルベート８０の特徴付けのためのクロマトグラフィー分離カラムが提供される。クロマトグラフィー分離カラムは、ジイソプロピル側鎖基とペンダントシアノ官能基とを有する単官能性シランを有する粒状多孔質基材を含む分離媒体を備え得る。多孔質基材は、約３００Åの細孔径、および約３．５μｍの平均粒径を有し得る。クロマトグラフィー分離カラムは、分離媒体を保持するように構築および配置されているカラムも備え得る。このカラムは、約２．１ｍｍの内径および約５０ｍｍの長さを有し得る。いくつかの実施形態では、カラムは、約２．１ｍｍの内径および約１００ｍｍの長さを有し得る。いくつかの実施形態では、カラムは、約２．１ｍｍの内径および約１５０ｍｍの長さを有し得る。

【0018】

いくつかの実施形態では、特徴付けられる界面活性剤は、非イオン界面活性剤を含み得る。いくつかの実施形態では、非イオン界面活性剤は、ポリソルベートを含み得る。ある実施形態では、ポリソルベートは、ポリソルベート８０であり得る。

【0019】

一態様によれば、ポリソルベート８０を特徴付ける方法が提供される。この方法は、ポリソルベート８０、およびポリソルベート８０の１つまたは複数の反応生成物を含む試料を調製するステップを含み得る。この方法は、試料をクロマトグラフィー分離カラムに注入するステップを含み得る。クロマトグラフィー分離カラムは、ジイソプロピル側鎖基とペンダントシアノ官能基とを有する単官能性シランを有する粒状多孔質基材を含む分離媒体を備え得る。多孔質基材は、約５０Åから約５００Åの細孔径、および約１．０μｍから約１００μｍの平均粒径を有し得る。カラムは、約１．０ｍｍから約１００ｍｍの内径、および約１０ｍｍから約２５０ｍｍの長さを有し得る。この方法は、ポリソルベート８０、およびポリソルベート８０の１つまたは複数の反応生成物が、少なくとも３の分解能で分解されるようなグラジエント移動相を使用して、ポリソルベート８０、およびポリソルベート８０の１つまたは複数の反応生成物を溶出するステップをさらに含み得る。

【0020】

ある実施形態では、ポリソルベート８０、およびポリソルベート８０の１つまたは複数の反応生成物は、少なくとも５の分解能で分解される。

【0021】

いくつかの実施形態では、粒状多孔質基材は、約３００Åの細孔径、および約３．５μｍの平均粒径を有する。いくつかの実施形態では、カラムは、約２．１ｍｍの内径および約５０ｍｍの長さを有する。いくつかの実施形態では、カラムは、約２．１ｍｍの内径および約１００ｍｍの長さを有する。いくつかの実施形態では、カラムは、約２．１ｍｍの内径および約１５０ｍｍの長さを有する。

【0022】

いくつかの実施形態では、グラジエント移動相は、酢酸アンモニウム、例えば、１０ｍＭ酢酸アンモニウム、およびメタノールを含む。

【0023】

いくつかの実施形態では、ポリソルベート８０およびポリソルベート８０の１つまたは複数の反応生成物の溶出は、１０分未満で発生する。

【0024】

添付の図面は、スケール通りには描かれていない。図面では、様々な図で例示されている同一またはほぼ同一の各要素は、同じ符号により表される。明確性の目的のために、すべての要素が、すべての図面において標識されているとは限らない。

【図面の簡単な説明】

【0025】

【図1A】一実施形態に係る分離媒体の多孔質粒子形態を例示する図であり、完全多孔質粒子を例示する図である。図１Ｂは、固体コアおよび多孔質シェルを有する粒子を例示する図である。

【図1B】一実施形態に係る分離媒体の多孔質粒子形態を例示する図であり、固体コアおよび多孔質シェルを有する粒子を例示する図である。

【図2】一実施形態に係るクロマトグラフィー分離カラムを例示する図である。

【図3】ジイソプロピルシアノプロピルシランで官能基化した後の、１．８μｍ、３００Å媒体粒子の走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）画像を例示する図である。

【図4】ジイソプロピルシアノプロピルシランで官能基化した後の、２．７μｍ、１２０Åコアシェル媒体粒子のＳＥＭ画像を例示する図である。

【図5A】オレイン酸およびポリソルベート８０エステルを含有する試料の分離に対する、緩衝液選択の効果を示すクロマトグラムを例示する図であり、水中０．１％ＴＦＡ緩衝液でのクロマトグムを例示する図である。

【図5B】オレイン酸およびポリソルベート８０エステルを含有する試料の分離に対する、緩衝液選択の効果を示すクロマトグラムを例示する図であり、１０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液でのクロマトグラムを例示する図である。

【図6A】オレイン酸およびポリソルベート８０エステルを含有する試料の分離に対する、分離媒体の細孔径の効果を示すクロマトグラムを例示する図であり、８０Åの細孔を有する分離媒体でのクロマトグラムを例示する図である。

【図6B】オレイン酸およびポリソルベート８０エステルを含有する試料の分離に対する、分離媒体の細孔径の効果を示すクロマトグラムを例示する図であり、３００Åの細孔を有する分離媒体でのクロマトグラムを例示する図である。

【図7A】オレイン酸およびポリソルベート８０エステルを含有する試料の分離に対する、分離媒体の粒径の効果を示すクロマトグラムを例示する図であり、３．５μｍ直径粒子を有する分離媒体でのクロマトグラムを例示する図である。

【図7B】オレイン酸およびポリソルベート８０エステルを含有する試料の分離に対する、分離媒体の粒径の効果を示すクロマトグラムを例示する図であり、１．８μｍ直径粒子を有する分離媒体でのクロマトグラムを例示する図である。

【図8A】オレイン酸およびポリソルベート８０エステルを含有する試料の分離に対する、クロマトグラフィーカラムの長さの効果を示すクロマトグラムを例示する図であり、長さ５０ｍｍのクロマトグラフィーカラムでのクロマトグラムを例示する図である。

【図8B】オレイン酸およびポリソルベート８０エステルを含有する試料の分離に対する、クロマトグラフィーカラムの長さの効果を示すクロマトグラムを例示する図であり、長さ１５０ｍｍのクロマトグラフィーカラムでのクロマトグラムを例示する図である。

【図9A】オレイン酸およびポリソルベート８０エステルを含有する試料の分離に対する、分離媒体粒子タイプの効果を示すクロマトグラムを例示する図であり、２．７μｍ直径コアシェル粒子を有する分離媒体でのクロマトグラムを例示する図である。

【図9B】オレイン酸およびポリソルベート８０エステルを含有する試料の分離に対する、分離媒体粒子タイプの効果を示すクロマトグラムを例示する図であり、１．９μｍ直径コアシェル粒子を有する分離媒体でのクロマトグラムを例示する図である。

【発明を実施するための形態】

【0026】

ポリソルベートは、エトキシ化ソルビタンまたはイソソルビドに由来する、また、長鎖脂肪酸でエステル化した、食品およびバイオ医薬製品の両方に普通に使用される非イオン界面活性剤である。バイオ医薬製品では、ポリソルベートは、典型的にはタンパク質の表面への吸着、凝集および粒子形成を防止するために使用される。これらの化合物は、薬物の製造、運送または保存中に機械的応力を受けると、タンパク質分子の界面損傷を阻害することが公知である。医薬的適用のためのポリソルベートの普及は、主に、好都合な生体適合性、低い毒性、およびタンパク質の有効な安定化のためである。商用市場に使用される最も普通のポリソルベートであるポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ＰＳ８０）は、ポリエトキシ化ソルビタンおよびオレイン酸に由来する、粘性のある水溶性黄色液体であり、ここで親水基は、ポリオキシエチレン側鎖で構成される。市販のＰＳ８０は不均質であり、最も普通のプロセスに関連した亜種は、ポリオキシエチレン（ＰＯＥ）基、ＰＯＥイソソルビドモノエステル、ならびにＰＯＥソルビタン／イソソルビドジ－、トリ－およびテトラ－エステルである。

【0027】

市販のＰＳ８０およびＰＳ２０は、高度に複雑な化学物質混合物である。産業上の製造プロセスのため、市販のポリソルベートは、構造的に関連した分子の粗混合物で構成される。ＰＳ８０（ポリオキシエチレン（８０）ソルビタンモノオレエート）およびＰＳ２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）で予想される構造では、全体の材料のおよそ３０％しか明らかにならないことが多い。この極端な不均質性は、プロセスに関連した不純物、特定のベンダーからのロット間のばらつき、異なる合成経路および原料の利用、ならびに様々なレベルの副生成物の組合せから生じる。ポリソルベートは、固有の不均質性に加えて、複数の酸化および加水分解経路を通して分解することも公知であり、このため、複数の分解生成物の形成によりさらに複雑さが増す。ポリソルベートは、自己酸化機構を経由して、また、化学的または酵素的に促進された加水分解により分解することが公知である。

【0028】

ポリソルベートの酸化は、光、上昇温度または様々な遷移金属により加速し得、これによりＰＥＧエステル、ならびにアルカン、ケトン、アルデヒドおよび酸のような分解物が得られる。光への曝露中、ポリソルベート８０の水溶液は、ペンダントポリオキシエチレン鎖の自動酸化を受け、これにより、過酸化物誘導体の生成が引き起こされる。これらの過酸化物は、次いで製剤をなす任意のタンパク質分子に酸化損傷を誘導し、また、有効性を低下させることがある。ポリソルベートの加水分解は、極端なｐＨで発生し（塩基または酸で触媒される）、宿主細胞に由来する酵素によっても促進され得る。ポリソルベートの加水分解は、脂肪酸エステル結合の切断を引き起こし、遊離脂肪酸および親水性種、例えばＰＥＧ、ＰＥＧソルビタンおよびＰＥＧイソソルビドを生成する。長期間の保存中、ポリソルベートの加水分解では、最終的に薬物製剤における化合物の粒子として沈殿し、生成物の性能を阻害する遊離脂肪酸の蓄積も生じ得る。しかし、ポリソルベートの下流酸化分解生成物、例えば、長鎖脂肪酸、短鎖脂肪酸、ポリオキシエチレン、ポリオキシエチレンソルビタン、アルデヒド、ケトン、ギ酸、酢酸、過酸化物および他の反応性酸化種は、全体的な治療安定性および効き目に影響を与え得、非経口製剤に使用される場合、さらなる問題、例えば注入部位の刺激を引き起こし得ることが懸念される。この使用のため、広汎な使用を考慮して、ポリソルベート、具体的にはポリソルベート８０の完全性をモニターする分析法の開発に大きな関心が持たれている。

【0029】

ポリソルベート、例えばポリソルベート８０の特徴付けは、難易度が高かった。現在利用できるクロマトグラフィー分離方法は、異なる生成物の分解能（および後続の同定）を改善するために、典型的には長い実行時間を伴い、試料調製手順を複雑化している。既存のカラムの使用、より短いカラム、操作圧の増加、カラム固定相のより小さい粒径を通じてより速い流れを使用することにより分析時間を減少する試みは、他のエステルおよび分解物と共に２つの重要なポリソルベート８０種、ポリソルベート８０の主な加水分解生成物であるオレイン酸、およびモノ－エステル形態のポリソルベート８０の第一級エステルの分解能の損失をもたらした。したがって、医薬製品開発における重要な問題で、前記化学物質を用いる好適な分離化学物質および分析法の開発。また、したがって、改善した分離基材、ならびに、上で詳述されている欠乏に対応する、かつ／または、無傷のポリソルベートおよび／もしくは分解されたポリソルベート生成物を検出できる、ポリソルベートの検出方法を提供する必要性がある。

【0030】

一態様によれば、本開示は、分離媒体、すなわち、例えば、界面活性剤純度の測定のように、界面活性剤生成物の特徴付けを可能にする物理的および化学的性質の組合せを有する基材を含むクロマトグラフィーカラムを提供する。例えば、本明細書で開示されているクロマトグラフィー分離カラムは、複雑な非イオン界面活性剤、例えばポリソルベート８０の反応、例えば加水分解または酸化の生成物およびエステルを、既存の分離技術と比較して増進した分解能および速度で分離できる。分離媒体は、一般的に、シランのケイ素原子に付着した単一の立体保護基を含有する共有結合で付着した単官能性シランを有する基材を含む。基材は、粒状の水和金属酸化物、半金属酸化物、または固体有機ポリマー基材を含み得る。例えば、分離媒体は、米国特許第４８４７１５９号、米国特許第４８７４５１８号、米国特許第５０３２２６６号、および米国特許第５１０８５９５号に記載されている分離媒体であり得、それぞれの開示の全体は、いかなる目的でも参照により本明細書の記載の一部をなすものとする。

【0031】

本明細書で開示されているように、本発明の基材は、１つまたは複数の官能基化反応の支持体として使用するための固体材料である。ある実施形態では、これは、金属酸化物または半金属酸化物、例えば酸化ケイ素、酸化クロムおよび酸化スズであり得る。別法として、基材は、適用された一定の応力下で流れることとなる有機ポリマーまたはプラスチックであり得る。一般的に、基材は、ある範囲の温度、例えば約０から１５０℃にわたって安定である。いくつかの実施形態では、基材は、２００℃を超える温度にて安定である。基材は、粒状材料、例えば、マイクロ粒子またはナノ粒子であり得る。いくつかの実施形態では、基材は、複合材料であり得る。例えば、基材は、反応性を改善するためにさらに修飾できる金属－または半金属－酸化物フィルムによりコーティングされている、あるタイプの酸化物材料であり得る。非限定的な例として、チタニアは、シリカの薄膜でコーティングされていることがあり、これは次いで、本明細書で開示されているように加水分解および反応させることができる。

【0032】

分離媒体における粒子の大きさは、試料内における分離される分子（複数可）の物理的または化学的性質、例えば大きさ、極性などに基づいて調整され得る。いかなる特定の理論にも束縛されることを望まないが、分離媒体における粒子の大きさは、ある大きさの範囲の分子の分離を最適化するように、特定の試料タイプに対して分離媒体の表面積を調整するように、または、液体クロマトグラフィー機器に取り付けられる場合のある範囲の動作条件、すなわち溶媒流量および圧力を指定するように、選択され得る。より小さい粒子、例えば直径１００μｍ未満を有する粒子、例としての直径５μｍ未満を有する粒子、例として３．５μｍの直径を有する粒子は、検体のためにより短い拡散経路を備え得、ひいては分離効率および分解能の１つまたは両方を改善し得る。

【0033】

いくつかの実施形態では、基材のための粒子は、約１．０μｍから約１００μｍ、例えば、約１．０μｍから約１０μｍ、約１．２μｍから約１２μｍ、約１．４μｍから約１４μｍ、約１．６μｍから約１６μｍ、約１．８μｍから約１８μｍ、約２．０μｍから約２０μｍ、約２．２μｍから約２２μｍ、約２．４μｍから約２４μｍ、約２．６μｍから約２６μｍ、約２．８μｍから約２８μｍ、約３．０μｍから約３０μｍ、約３．２μｍから約３２μｍ、約３．４μｍから約３４μｍ、約３．６μｍから約３６μｍ、約３．８μｍから約３８μｍ、約４．０μｍから約４０μｍ、約５．２μｍから約５２μｍ、約５．４μｍから約５４μｍ、約５．６μｍから約５６μｍ、約５．８μｍから約５８μｍ、約６．０μｍから約６０μｍ、約６．２μｍから約６２μｍ、約６．４μｍから約６４μｍ、約６．６μｍから約６６μｍ、約６．８μｍから約６８μｍ、約７．０μｍから約７０μｍ、約７．２μｍから約７２μｍ、約７．４μｍから約７４μｍ、約７．６μｍから約７６μｍ、約７．８μｍから約７８μｍ、約８．０μｍから約８０μｍ、約８．２μｍから約８２μｍ、約８．４μｍから約８４μｍ、約８．６μｍから約８６μｍ、約８．８μｍから約８８μｍ、約９．０μｍから約９０μｍ、約９．２μｍから約９２μｍ、約９．４μｍから約９４μｍ、約９．６μｍから約９６μｍ、約９．８μｍから約９８μｍまたは約１０．０μｍから約１００μｍの直径を有し得る。

【0034】

いくつかの実施形態では、基材のための粒子は、約１．０μｍ、約１．２μｍ、約１．４μｍ、約１．６μｍ、約１．８μｍ、約２．０μｍ、約２．２μｍ、約２．４μｍ、約２．６μｍ、約２．８μｍ、３．０μｍ、約３．２μｍ、約３．４μｍ、約３．６μｍ、約３．８μｍ、約４．０μｍ、約４．２μｍ、約４．４μｍ、約４．６μｍ、約４．８μｍ、約５．０μｍ、約５．２μｍ、約５．４μｍ、約５．６μｍ、約５．８μｍ、約６．０μｍ、約６．２μｍ、約６．４μｍ、約６．６μｍ、約６．８μｍ、約７．０μｍ、約７．２μｍ、約７．４μｍ、約７．６μｍ、約７．８μｍ、約８．０μｍ、約８．２μｍ、約８．４μｍ、約８．６μｍ、約８．８μｍ、約９．０μｍ、約９．２μｍ、約９．４μｍ、約９．６μｍ、約９．８μｍ、約１０μｍ、約１２μｍ、約１４μｍ、約１６μｍ、約１８μｍ、約２０μｍ、約２２μｍ、約２４μｍ、約２６μｍ、約２８μｍ、３０μｍ、約３２μｍ、約３４μｍ、約３６μｍ、約３８μｍ、約４０μｍ、約４２μｍ、約４４μｍ、約４６μｍ、約４８μｍ、約５０μｍ、約５２μｍ、約５４μｍ、約５６μｍ、約５８μｍ、約６０μｍ、約６２μｍ、約６４μｍ、約６６μｍ、約６８μｍ、約７０μｍ、約７２μｍ、約７４μｍ、約７６μｍ、約７８μｍ、約８０μｍ、約８２μｍ、約８４μｍ、約８６μｍ、約８８μｍ、約９０μｍ、約９２μｍ、約９４μｍ、約９６μｍ、約９８μｍまたは約１００μｍの直径を有し得る。具体的な実施形態では、基材の粒径は、１．８μｍである。具体的な実施形態では、基材の粒径は、３．５μｍである。分離媒体の粒径が小さい、例えば３．５μｍまたは１．８μｍ、ほど、分離媒体の表面積は増加し、分離、すなわち界面活性剤、例えば非イオン界面活性剤、例としてポリソルベート８０における１つまたは複数の分解生成物の分解能が改善することが判定された。

【0035】

ポリソルベート８０の特徴付けおよび分析に好適なクロマトグラフィーカラム、例えば１．８または３．５μｍ粒子を有するカラムは、必ずしもポリソルベート８０にしか使用されないわけではない。他の界面活性剤、例えばポロキサマー１８８、すなわち、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ－６８、他のポリソルベート、例えばポリソルベート２０、およびＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００も、本明細書で開示されている物理的および化学的特性を有するカラムを使用して分離され得る。さらに、本明細書で開示されている物理的および化学的特性を有するカラムは、生物学的に関連性がある試料、例えば脂質ナノ粒子、例としてコレステロール、１，２－ジミリストイル－ｒａｃ－グリセロ－３－メトキシポリエチレングリコール－２０００（ＤＭＰ－ＰＥＧ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＧ）および１，２－ジオレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）、ウイルス－様粒子、例えば組換えヒトパピローマウイルス型１６ Ｌ１タンパク質およびウイルスベクター、例としてアデノ随伴ウイルスセロタイプ１（ＡＡＶ１）の分離に使用され得る。

【0036】

本明細書で開示されている分離媒体に使用される多孔質粒子は、完全多孔質粒子またはコアシェル形態のものであり得る。例えば、図１Ａに例示したように、直径２μｍ未満、例えば１．８μｍの粒子は、粒子の全体が多孔質の完全多孔質であり得る。別法として、図１Ｂに例示したように、大きい、すなわち５μｍ以上の粒子は、粒子が内部固体、すなわち無孔の核および多孔質シェルを有し、これにより、液体がシェルを通って流れることが可能となるコアシェル形態のものであり得る。分離媒体における多孔質粒子での細孔のサイズは、試料内における分離される分子（複数可）の物理的または化学的性質、例えば大きさ、極性などに基づいて選択され得る。いかなる特定の理論に束縛されることも望まないが、分離媒体における多孔質粒子での細孔のサイズは、分離される、試料内における分子（複数可）の大きさと直線的に相関している、すなわち、多孔質粒子がより大きいと、試料におけるより大きい分子の分離が改善できる。いくつかの実施形態では、基材は、約５０Åから約５００Å、例えば、約５０Åから約１５０Å、約１００Åから約２００Å、約１５０Åから約２５０Å、約２００Åから約３００Å、約２５０Åから約３５０Å、約３００Åから約４００Å、約３５０Åから約４５０Å、または約４００Åから約５００Å、例えば、約５０Å、約６０Å、約７０Å、約８０Å、約９０Å、約１００Å、約１１０Å、約１２０Å、約１３０Å、約１４０Å、約１５０Å、約１６０Å、約１７０Å、約１８０Å、約１９０Å、約２００Å、約２１０Å、約２２０Å、約２３０Å、約２４０Å、約２５０Å、約２６０Å、約２７０Å、約２８０Å、約２９０Å、約３００Å、約３１０Å、約３２０Å、約３３０Å、約３４０Å、約３５０Å、約３６０Å、約３７０Å、約３８０Å、約３９０Å、約４００Å、約４１０Å、約４２０Å、約４３０Å、約４４０Å、約４５０Å、約４６０Å、約４７０Å、約４８０Å、約４９０Åまたは約５００Åの細孔径を備える。具体的な実施形態では、基材の細孔径は、３００Åである。

【0037】

本明細書で開示されているように、基材は、１つまたは複数の官能基化化学物質、例えばシラン試薬と反応することとなる表面を有し得る。例えば、無機固体、例として酸化ケイ素、酸化クロムおよび酸化スズは、一般的に加水分解され、その結果、表面のヒドロキシル、すなわちＯＨ基は、官能基化に利用できるようになる。別法として、これらの材料の表面は、さらなる官能基化を可能にする他の適切な官能基で修飾され得る。例えば、乾燥させた酸化ケイ素粒子の表面は、四塩化ケイ素または塩化チオニルで塩素化され得る。この塩素化された表面は、次いで、反応性Ｓｉ－ＨまたはＳｉ－ＯＨ基を含有するシラン官能基化試薬と反応させて、より大きい官能基を調整する追加の反応のために、基材を調製することができる。

【0038】

本明細書で開示されているように、基材は、様々な検体に選択性を付与する官能基を調整する、１つまたは複数の異なる化学物質で官能基化され得る。官能基化化学物質のある分類は、基材表面と非反応性シランの反応による。基材を調製するために使用されるシランは、典型的には単官能性であり、シランのケイ素原子に付着している少なくとも１つの立体的保護部分を含む。したがって、本発明で具体化されるシランは、以下の構造

【0039】

【化1】

（式中、Ｘ＝反応基、例えば塩素、臭素、ヨウ素、アミノ、ヒドロキシル、アルコキシ、水素、－－Ｃ－Ｃ－－を含有する基などであり；Ｒ、Ｒ_１およびＲ_２は、独立して、アルカン、置換アルカン、アルケン、置換アルケン、アリールまたは置換アリールであるが、Ｒ＝Ｒ_１＝Ｒ_２＝Ｈ、Ｒ＝Ｒ_１＝Ｒ_２＝ＣＨ_３、Ｒ_１＝Ｒ_２＝ＨおよびＲ＝ＣＨ_３、Ｒ_１＝Ｒ_２＝ＣＨ_３およびＲ＝Ｈである構造は特に排除される）を有し得る。便宜のため、これらのシランは、立体的保護シランという。本開示に有用なシランは、シランのケイ素原子に付着している、少なくとも１つのジメチルで置換されている第三級炭素部分を含有する。この部分に関連するＲ基は、メチル（単純なｔブチル基）であり得るが、このケースでは、シランのＲ_１基が、メチルであってもならず；ＲおよびＲ_１が両方とも水素である構造も特に排除される。Ｒ＝メチルを有する構造は、一般的に好ましいが、但し、Ｒ_１がメチルではないことも条件とする。単純なｔブチル基を含有するそのような構造は、容易に合成され、シランを基材に付着させるＳｉ－Ｏ－結合の立体的保護に一般的に有効である。Ｒ基は、より大きい官能基、例えばエチルまたはイソプロピル、例としてジイソプロピルからもなり得る。例えば、基材は、ジイソプロピルシアノプロピルシラン化合物で官能基化され得る。

【0040】

いくつかの実施形態では、本開示のシランは、結合したシランを加水分解から保護することを可能にする立体的性質を有する官能基を含有する。シランにおけるＲおよびＲ_１基は、同一の官能基であってもなくてもよい。特定の実施形態では、ＲおよびＲ_１は、立体因子のため、シランが基材の表面に配置して、その結果相互反応する目的の化学種への到達を増加させるように異なる大きさであり得る。非限定的な例として、Ｒ＝メチルまたはイソプロピルは、加水分解に対するシランの安定化を助け、Ｒ_１＝Ｃ_８は、逆相クロマトグラフィーのための強い疎水性の特徴を固定相に付与する。ＲおよびＲ_１基の適切な操作により、固定相が変性する、すなわち、立体配座の変化を生物学的分子、例えばタンパク質に引き起こす傾向を最小化する材料を調製することが実現可能である。さらに、Ｒ基により示される立体障害は、シロキサン結合、例えば、シリカ粒子と単官能性シランとの間における結合を、ある範囲の溶媒／溶液ｐＨ値にわたり加水分解作用から保護する。いくつかの実施形態では、本明細書で開示されている分離媒体は、ｐＨ範囲１．０から８．０、例えば、ｐＨ１．０からｐＨ３．０、ｐＨ２．０からｐＨ４．０、ｐＨ３．０からｐＨ５．０、ｐＨ４．０からｐＨ６．０、ｐＨ５．０からｐＨ７．０、またはｐＨ６．０からｐＨ８．０、例えば、ｐＨ１．０から、ｐＨ１．５、ｐＨ２．０、ｐＨ２．５、ｐＨ３．０、ｐＨ３．５、ｐＨ４．０、ｐＨ４．５、ｐＨ５．０、ｐＨ５．５、ｐＨ６．０、ｐＨ６．５、ｐＨ７．０、ｐＨ７．５、またはｐＨ８．０にわたり分解に耐えることができる。

【0041】

本明細書で開示されている分離媒体を調製するために利用されるシランは、意図される用途に合う多彩な官能基を含み得る。官能基は、シラン構造のＲ_１基に組み込まれる。例えば、分離媒体が、逆相クロマトグラフィーにおける使用を意図される場合、シランのＲ_１は、アルキルまたはアリール基、例えばＣ_３、Ｃ_４、ｎ－Ｃ_８およびｎ－Ｃ_１８を含んで、保持に望ましい疎水性相互反応が発生することを可能にし得る。分離媒体が、イオン交換クロマトグラフィーにおける使用を意図される場合、Ｒ_１基は、イオン交換能力を有する官能基、例えば、アニオン交換体としての（ＣＨ_２）_３Ｎ^＋（ＣＨ_３）_３、およびカチオン交換体としての－（ＣＨ_２）_３－Ｃ_６Ｈ_４－ＳＯ_３Ｈを含み得る。特に高度に極性の水溶性生体高分子、例えばタンパク質の分離のためのサイズ排除クロマトグラフィーでは、基材の表面が、高度に極性のＲ_１基、例えば－（ＣＨ_２）_３－Ｏ－ＣＨ（ＯＨ）－ＣＨＯＨ、いわゆる「ジオール」官能基で修飾され得る。疎水性相互反応クロマトグラフィーでは、基材に対して弱疎水性固定相が望ましい。例えば、Ｒ_１＝メチル、エチル、ｎ－プロピルまたはイソプロピルは、この様式のクロマトグラフィーの保持では、穏当な疎水性相互反応を備える。順相クロマトグラフィーのケースでは、極性官能基がシランにＲ_１基、例えば－（ＣＨ_２）_３－ＮＨ_２および－（ＣＨ_２）_３－ＣＮとして組み込まれる。

【0042】

アフィニティークロマトグラフィー支持構造では、基材は最初に、反応性Ｒ_１－基、例えば－（ＣＨ_２）_３－ＮＨ_２を含有する単官能性シランと反応し得る。これらの基は、次いで特定の生物学的活性のリガンドとさらに反応させて、適切に反応性のＲ_１－基、例えば－（ＣＨ_２）_３ＮＨ_２の望ましいシングを行うのに必要なアフィニティー支持構造を生成することができる。これらの基は、次いで特定の生物学的活性のリガンドとさらに反応させて、適切に反応性のＲ_１基、例えば－（ＣＨ_２）_３－ＮＨ_２の望ましいシングを行うのに必要なアフィニティー支持構造を生成することができる。これらの基は、次いで特定の生物学的活性のリガンドとさらに反応させて、適切に反応性のＲ_１基、例えば－（ＣＨ_２）_３－ＮＨ_２の望ましいシングを行うのに必要なアフィニティー支持構造を生成することができる。これらの基は、次いで特定の生物学的活性のリガンドとさらに反応させて、望ましい分離を行うのに必要なアフィニティー支持構造を生成することができる。Ｒ_１が、エポキシド基を含有する場合、タンパク質またはペプチドのアミノ末端、すなわちＲＮＨ_２は、直接的反応により連結して、タイプ：－ＣＨ（－ＯＨ）－ＣＨ_２－ＮＨＲの構造を形成し得る。エポキシドも最初に加水分解させて、「ジオール」基を形成し、次いで多彩な他の試薬で活性化することができる。

【0043】

立体的保護単官能性シラン試薬も、液相反応用の触媒としての用途を有する基材を調製するために使用される。酸性または塩基性触媒としての使用では、強酸性のスルホン酸基または強塩基性の四級化アミン基がそれぞれ、上のイオン交換クロマトグラフィー充填について記載されているものと同一の手法で、シラン構造に組み込まれ得る。金属、例えば白金およびパラジウムをイオンとして、または有機金属錯体で含有するリガンドは、酸化または還元による選択的触媒のために本発明の基材に組み入れられ得る。

【0044】

一実施形態では、基材は、ジイソプロピル側鎖基およびペンダントシアノ官能基を有する単官能性シランを含み、例えば、逆相クロマトグラフィーカラムは、固定相に固定化されたシアノ基を含む。シアノ基は、－ＣＮ基を含有する任意の化合物を含む。本明細書で開示されているように、任意の好適なシアノ基は、－ＣＮを基材の表面に添加する官能基化反応の一部として使用され得る。ＣＮ基を含むカラムは、Ａｇｉｌｅｎｔ ＺＯＲＢＡＸ（登録商標）ＳＢ３００－ＣＮまたはＡｇｉｌｅｎｔ ＩｎｆｉｎｉｔｙＬａｂ ＰＯＲＯＳＨＥＬＬ（登録商標）１２０ ＳＢ－ＣＮを含む。

【0045】

ある実施形態では、カラムは、例えば約５０Åから約５００Å、例として約８０Å以上の細孔径を有するシリカ粒子カラムであり得る。ある実施形態では、細孔径は、大きさ約１２０Åから約３００Åの間である。例えば、約３００Åの細孔径が使用され得る。好適なシリカカラムの例は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＺＯＲＢＡＸ（登録商標）ＳＢ３００－ＣＮまたはＡｇｉｌｅｎｔ ＩｎｆｉｎｉｔｙＬａｂ ＰＯＲＯＳＨＥＬＬ（登録商標）１２０ ＳＢ－ＣＮを含むが、それらに限定されない。カラムは加熱され得、例えば、カラムの温度は、約２０℃から約８０℃の間、または約４０℃から約６０℃、または約５０℃であり得る。

【0046】

分離媒体、例えばシリカ粒子を収容または含有するのに使用されるカラムは、適切な直径、長さおよび材料の任意の好適なカラムであり得る。例えば、カラムは、金属材料、例えばステンレス鋼、またはクロマトグラフィー分離に適切な物理的性質、例えば溶媒耐性、圧力耐性を有する別の合金から作られていることがある。他のクロマトグラフィーカラムに好適な材料は、当業界で公知である。

【0047】

カラムの寸法、すなわち内径および長さは、異なる分離特性、および液体クロマトグラフィー機器の操作パラメーターを達成するように選択され得る。一般に、カラムの長さがより短いと、分離実験の実行時間を短縮し、試料における特定の検体の保持時間を短縮する。対照的に、カラムがより長いと、一般的に滞留時間が延長し、これにより、所定の試料に対するクロマトグラムピークの分解能が増進する。クロマトグラフィーカラムの内径は、一般的にピーク高さ応答を増大させ、検出の限界および定量する能力を改善できる。カラムの直径がより大きいと、より大きい試料の装填、およびパーセンテージの低い検体、例えば化学的分解生成物の分析が可能になる。直径カラムがより小さいと、より小さい試料体積の検出感受性を改善できる。これらの変量は、典型的には、バランス要因のうち、溶媒流量、操作圧および試料装填体積によりバランスが取られる。

【0048】

いくつかの実施形態では、カラムは、内径約１．０ｍｍから約１００ｍｍ、例えば、約１．０ｍｍから約１０ｍｍ、約１．２ｍｍから約１２ｍｍ、約１．４ｍｍから約１４ｍｍ、約１．６ｍｍから約１６ｍｍ、約１．８ｍｍから約１８ｍｍ、約２．０ｍｍから約２０ｍｍ、約２．２ｍｍから約２２ｍｍ、約２．４ｍｍから約２４ｍｍ、約２．６ｍｍから約２６ｍｍ、約２．８ｍｍから約２８ｍｍ、約３．０ｍｍから約３０ｍｍ、約３．２ｍｍから約３２ｍｍ、約３．４ｍｍから約３４ｍｍ、約３．６ｍｍから約３６ｍｍ、約３．８ｍｍから約３８ｍｍ、約４．０ｍｍから約４０ｍｍ、約５．２ｍｍから約５２ｍｍ、約５．４ｍｍから約５４ｍｍ、約５．６ｍｍから約５６ｍｍ、約５．８ｍｍから約５８ｍｍ、約６．０ｍｍから約６０ｍｍ、約６．２ｍｍから約６２ｍｍ、約６．４ｍｍから約６４ｍｍ、約６．６ｍｍから約６６ｍｍ、約６．８ｍｍから約６８ｍｍ、約７．０ｍｍから約７０ｍｍ、約７．２ｍｍから約７２ｍｍ、約７．４ｍｍから約７４ｍｍ、約７．６ｍｍから約７６ｍｍ、約７．８ｍｍから約７８ｍｍ、約８．０ｍｍから約８０ｍｍ、約８．２ｍｍから約８２ｍｍ、約８．４ｍｍから約８４ｍｍ、約８．６ｍｍから約８６ｍｍ、約８．８ｍｍから約８８ｍｍ、約９．０ｍｍから約９０ｍｍ、約９．２ｍｍから約９２ｍｍ、約９．４ｍｍから約９４ｍｍ、約９．６ｍｍから約９６ｍｍ、約９．８ｍｍから約９８ｍｍまたは約１０．０ｍｍから約１００ｍｍを有し得る。

【0049】

いくつかの実施形態では、カラムは、約１．０ｍｍ、約１．２ｍｍ、約１．４ｍｍ、約１．６ｍｍ、約１．８ｍｍ、約２．０ｍｍ、約２．２ｍｍ、約２．４ｍｍ、約２．６ｍｍ、約２．８ｍｍ、３．０ｍｍ、約３．２ｍｍ、約３．４ｍｍ、約３．６ｍｍ、約３．８ｍｍ、約４．０ｍｍ、約４．２ｍｍ、約４．４ｍｍ、約４．６ｍｍ、約４．８ｍｍ、約５．０ｍｍ、約５．２ｍｍ、約５．４ｍｍ、約５．６ｍｍ、約５．８ｍｍ、約６．０ｍｍ、約６．２ｍｍ、約６．４ｍｍ、約６．６ｍｍ、約６．８ｍｍ、約７．０ｍｍ、約７．２ｍｍ、約７．４ｍｍ、約７．６ｍｍ、約７．８ｍｍ、約８．０ｍｍ、約８．２ｍｍ、約８．４ｍｍ、約８．６ｍｍ、約８．８ｍｍ、約９．０ｍｍ、約９．２ｍｍ、約９．４ｍｍ、約９．６ｍｍ、約９．８ｍｍ、約１０ｍｍ、約１２ｍｍ、約１４ｍｍ、約１６ｍｍ、約１８ｍｍ、約２０ｍｍ、約２２ｍｍ、約２４ｍｍ、約２６ｍｍ、約２８ｍｍ、３０ｍｍ、約３２ｍｍ、約３４ｍｍ、約３６ｍｍ、約３８ｍｍ、約４０ｍｍ、約４２ｍｍ、約４４ｍｍ、約４６ｍｍ、約４８ｍｍ、約５０ｍｍ、約５２ｍｍ、約５４ｍｍ、約５６ｍｍ、約５８ｍｍ、約６０ｍｍ、約６２ｍｍ、約６４ｍｍ、約６６ｍｍ、約６８ｍｍ、約７０ｍｍ、約７２ｍｍ、約７４ｍｍ、約７６ｍｍ、約７８ｍｍ、約８０ｍｍ、約８２ｍｍ、約８４ｍｍ、約８６ｍｍ、約８８ｍｍ、約９０ｍｍ、約９２ｍｍ、約９４ｍｍ、約９６ｍｍ、約９８ｍｍまたは約１００ｍｍの内径を有し得る。具体的な実施形態では、カラムは、約４．６ｍｍの内径を有する。ある実施形態では、カラムは、約２．１ｍｍの内径を有する。

【0050】

いくつかの実施形態では、カラムは、長さ約１０ｍｍから約２５０ｍｍ、例えば、約１０ｍｍから約２５ｍｍ、約１５ｍｍから約４０ｍｍ、約２０ｍｍから約５０ｍｍ、約２５ｍｍから約５５ｍｍ、約３０ｍｍから約６０ｍｍ、約３５ｍｍから約７０ｍｍ、約４０ｍｍから約７５ｍｍ、約５０ｍｍから約８５ｍｍ、約６０ｍｍから約１００ｍｍ、約７５ｍｍから約１１５ｍｍ、約８５ｍｍから約１２５ｍｍ、約１００ｍｍから約１５０ｍｍ、約１２５ｍｍから約１７５ｍｍ、約１４０ｍｍから約１９０ｍｍ、約１５０ｍｍから約２００ｍｍ、約１７５ｍｍから約２２５ｍｍ、約１９０ｍｍから約２３０ｍｍまたは約２００ｍｍから約２５０ｍｍを有し得る。

【0051】

いくつかの実施形態では、カラムは、約１０ｍｍ、約１５ｍｍ、約２０ｍｍ、約２５ｍｍ、約３０ｍｍ、約３５ｍｍ、約４０ｍｍ、約４５ｍｍ、約５０ｍｍ、約５５ｍｍ、約６０ｍｍ、約６５ｍｍ、約７０ｍｍ、約７５ｍｍ、約８０ｍｍ、約８５ｍｍ、約９０ｍｍ、約９５ｍｍ、約１００ｍｍ、約１１０ｍｍ、約１１５ｍｍ、約１２０ｍｍ、約１２５ｍｍ、約１３０ｍｍ、約１３５ｍｍ、約１４０ｍｍ、約１４５ｍｍ、約１５０ｍｍ、約１５５ｍｍ、約１６０ｍｍ、約１６５ｍｍ、約１７０ｍｍ、約１７５ｍｍ、約１８０ｍｍ、約１８５ｍｍ、約１９０ｍｍ、約１９５ｍｍ、約２００ｍｍ、約２１０ｍｍ、約２１５ｍｍ、約２２０ｍｍ、約２２５ｍｍ、約２３０ｍｍ、約２３５ｍｍ、約２４０ｍｍ、約２４５ｍｍまたは約２５０ｍｍの長さを有し得る。具体的な実施形態では、カラムは、約５０ｍｍの長さを有する。具体的な実施形態では、カラムは、約１００ｍｍの長さを有する。ある実施形態では、カラムは、約１５０ｍｍの長さを有する。

【0052】

クロマトグラフィー分離カラムの実施形態は、図２で例示されている。例示されているように、クロマトグラフィー分離カラム１００は、カラム１１２内に配置されている分離媒体１０２を含む。分離媒体１０２は、官能基化された表面を得るように修飾されている粒状多孔質基材１０４、例えば多孔質シリカ粒子を含む。粒状多孔質基材１０４の官能基化された表面は、ジイソプロピル側鎖基１０８およびペンダントシアノ官能基１１０を含む単官能性シラン１０６を含む。多孔質基材１０４は、約５０Åから約５００Åの細孔径、および約１．０μｍから約１００μｍの平均粒径を有する。具体的な実施形態では、多孔質基材１０４は、３００Åの細孔径および３．５μｍの粒径を有する。化学的に安定な、緻密にカバーされた立体的保護ジイソプロピルシアノプロピルシラン固定相の１．８μｍ、３００Å細孔径粒子および２．７μｍ、１２０Å細孔径粒子のＳＥＭ画像は、図３および４で例示されている。カラム１１２は、約１．０から１００ｍｍの内径、および長さ約１０ｍｍから約２５０ｍｍを有する。具体的な実施形態では、カラムは、約５０ｍｍの長さを有する。具体的な実施形態では、カラムは、約１００ｍｍの長さを有する。ある実施形態では、カラムは、約１５０ｍｍの長さを有する。操作では、クロマトグラフィー分離カラム１００は、クロマトグラフィー機器に取り付けられ得、界面活性剤、例えばポリソルベート８０、例としてポリソルベート８０モノ－、ジ－、トリ－およびテトラ－エステル、ならびに１つまたは複数の反応生成物を含む試料は、試料の１つまたは複数の成分を分離するために、クロマトグラフィー分離カラム１００に向けられ得る。

【0053】

界面活性剤試料における様々な成分は、アイソクラティックまたはグラジエントの溶出条件下で、任意の好適な溶出溶媒または溶媒を使用して分離できる。非限定的な例として、ポリソルベート８０、例えばポリソルベート８０モノ－、ジ－、トリ－およびテトラ－エステル、ならびに長鎖脂肪酸、短鎖脂肪酸、ポリオキシエチレン、ポリオキシエチレンソルビタン、アルデヒド、ケトン、ギ酸、酢酸または過酸化物を含むが、それらに限定されないポリソルベート８０の１つまたは複数の反応生成物のミックスを含むポリソルベート８０試料では、分離は、グラジエント分離移動相を使用して行われ得る。移動相は、酢酸アンモニウム、ギ酸アンモニウム、アンモニア、ギ酸、酢酸、トリフルオロ酢酸、メタノール、イソプロパノール、アセトニトリル、エタノールおよびアセトンの１つまたは複数を含み得る。移動相での溶媒は、ポリソルベート８０、例えばポリソルベート８０モノ－、ジ－、トリ－およびテトラ－エステル、ならびにポリソルベート８０の１つまたは複数の反応生成物を含む試料の１つまたは複数の成分の分離を最適化するように選択され得る。非限定的な一実施形態では、１つの相が、水中酸または酢酸アンモニウム０．１％から約１０％の混合物であるグラジエント分離移動相。酸は、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ギ酸、酢酸またはジフルオロ酢酸から選択され得る。他の相は、メタノール、イソプロパノールまたはアセトニトリルの１つまたは複数を含む溶媒であり得る。別の非限定的な実施形態では、グラジエント分離移動相は、１０ｍＭ酢酸アンモニウムおよびメタノールの混合物であり得る。別の非限定的な実施形態では、グラジエント分離移動相は、水およびメタノール中０．１％ＴＦＡの混合物であり得る。他の溶媒グラジエントは、本開示の範囲内であり、本開示は、溶媒の選択に決して限定されないし、アイソクラティックまたはグラジエント分離条件下で分離が行われる場合にも決して限定されない。

【0054】

一態様によれば、ポリソルベート８０を特徴付ける方法が提供される。方法は、ポリソルベート８０、およびポリソルベート８０の１つまたは複数の反応生成物を含む試料を調製するステップを含む。方法は、試料をクロマトグラフィー分離カラム上に注入するステップを含む。クロマトグラフィー分離カラムは、ジイソプロピル側鎖基およびペンダントシアノ官能基を有する単官能性シランを有する粒状多孔質基材を含む分離媒体を含む。多孔質基材は、約５０Åから約５００Åの細孔径、および約１．０μｍから約１００μｍの平均粒径を有する。カラムは、約１．０ｍｍから約１００ｍｍの内径、および長さ約１０ｍｍから約２５０ｍｍを有する。方法は、ポリソルベート８０、およびポリソルベート８０の１つまたは複数の反応生成物が、少なくとも３の分解能で分解されるようなグラジエント移動相を使用して、ポリソルベート８０、およびポリソルベート８０の１つまたは複数の反応生成物を溶出するステップをさらに含む。

【0055】

ある実施形態では、ポリソルベート８０、およびポリソルベート８０の１つまたは複数の反応生成物が、少なくとも５の分解能で分解される。

【0056】

いくつかの実施形態では、粒状多孔質基材は、約３００Åの細孔径、および約３．５μｍの平均粒径を有する。いくつかの実施形態では、カラムは、約２．１ｍｍの内径および約５０ｍｍの長さを有する。いくつかの実施形態では、カラムは、約２．１ｍｍの内径および約１００ｍｍの長さを有する。いくつかの実施形態では、カラムは、約２．１ｍｍの内径および約１５０ｍｍの長さを有する。

【0057】

さらなる実施形態では、カラムは、約４．６ｍｍの内径および約５０ｍｍの長さを有する。

【0058】

いくつかの実施形態では、グラジエント移動相は、酢酸アンモニウム、例えば、１０ｍＭ酢酸アンモニウム、およびメタノールを含む。

【0059】

いくつかの実施形態では、ポリソルベート８０、およびポリソルベート８０の１つまたは複数の反応生成物の溶出は、１０分未満、例えば１０分未満、９．５分未満、９分未満、８．５分、８分未満、７．５分、７分未満、６．５分、６分未満、５．５分、５分未満、４．５分、４分未満、３．５分、３分未満、２．５分、２分未満、１．５分または１分未満で発生する。

【0060】

一態様によれば、ポリソルベート８０の特徴付けを促す方法が提供される。方法は、ポリソルベート８０、例えば、ポリソルベート８０モノ－、ジ－、トリ－およびテトラ－エステル、ならびにポリソルベート８０の１つまたは複数の反応生成物を含む試料を用意するステップを含む。方法は、クロマトグラフィー分離カラムを用意するステップも含む。クロマトグラフィー分離カラムは、ジイソプロピル側鎖基およびペンダントシアノ官能基を有する単官能性シランを有する粒状多孔質基材を含む分離媒体を含み得る。多孔質基材は、約５０から約５００Åの細孔径、および約１．０μｍから約１００μｍの平均粒径を有する。クロマトグラフィー分離カラムは、分離媒体を保持するように構築および配置されているカラムも含む。カラムは、約１．０から１００ｍｍの内径、および長さ約１０ｍｍから約２５０ｍｍを有する。

【0061】

いくつかの実施形態では、用意されたクロマトグラフィー分離カラムの多孔質基材は、シリカを含む。いくつかの実施形態では、用意されたクロマトグラフィー分離カラムの多孔質基材は、約３．５μｍの粒径を有する。いくつかの実施形態では、用意されたクロマトグラフィー分離カラムの多孔質基材は、約３００Åの細孔径を有する。

【0062】

いくつかの実施形態では、用意されたクロマトグラフィー分離カラム方法の内径は、約２．１ｍｍである。いくつかの実施形態では、用意されたクロマトグラフィー分離カラムの長さは、約５０ｍｍである。いくつかの実施形態では、用意されたクロマトグラフィー分離カラムの長さは、約１００ｍｍである。いくつかの実施形態では、用意されたクロマトグラフィー分離カラムの長さは、約１５０ｍｍである。

【0063】

いくつかの実施形態では、用意された試料は、ポリソルベート８０、例えば、ポリソルベート８０モノ－、ジ－、トリ－およびテトラ－エステル、１つまたは複数の長鎖脂肪酸、短鎖脂肪酸、ポリオキシエチレン、ポリオキシエチレンソルビタン、アルデヒド、ケトン、ギ酸、酢酸および過酸化物を含み得る。

【0064】

さらなる実施形態では、方法は、クロマトグラフィー分離カラムを液体クロマトグラフィー機器に据え付けるステップを含む。

【0065】

さらなる実施形態では、方法は、移動相を付与して、ポリソルベート、例えばポリソルベート８０モノ－、ジ－、トリ－およびテトラ－エステル、ならびにポリソルベート８０の１つまたは複数の反応生成物の分離を達成するステップを含む。移動相は、例えば酢酸アンモニウム、例として１０ｍＭ酢酸アンモニウムおよびメタノールの１つまたは両方を含み得る。

【0066】

さらなる実施形態では、方法は、移動相を使用した、グラジエントに基づく分離のための説明書を用意するステップを含む。

【実施例0067】

これらのおよび他の実施形態の機能および利点は、以下の実施例からより良好に理解され得る。これらの実施例は、本質的に例示であることが意図され、本発明の範囲を限定するとは決して考えるべきではない。

【0068】

［実施例１］
緩衝液化学物質の効果
この実施例では、オレイン酸およびポリソルベート８０の混合物を分離するためのＨＰＬＣを使用して、分解能、ピーク幅、およびピーク高さに対する、異なる緩衝液の効果を調査した。

【0069】

この実施例で使用される計器装備は、１２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＨＰＬＣ系であった。ＨＰＬＣオートサンプラーを室温（２３℃）にて保持した。ＥＬＳＤでは、エバポレーター温度は５０℃であり、ネブライザー温度５０℃、ガス流量は、１分当たり１標準リットル（ＳＬＭ）であった。出力データ速度は８０Ｈｚであり、データ平滑化は３．０秒であった。試料は、混合し、９０：１０水：メタノール（ｖ／ｖ）の溶液に溶解した５ｐｐｍオレイン酸および２０ｐｐｍポリソルベート８０であった。

【0070】

移動相は、２つの成分であり、移動相Ａは、水中０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、または水中１０ｍＭ酢酸アンモニウムであり、移動相Ｂは、メタノールであり、グラジエントは試料の流動中に使用された。全体の試料の流動は１０分の長さであり、時間に応じた移動相グラジエント組成は、表１で指定されている。流量は、０．２５ｍＬ／分および２０μＬの試料注入体積に設定した。カラムの温度は、５０℃であった。この実施例に使用されるカラムは、Ａｇｉｌｅｎｔ ＺＯＲＢＡＸ（登録商標）ＳＢ－ＣＮ、２．１ｍｍ×５０ｍｍ、３．５μｍ粒径、３００Åの細孔を含んでいた。カラム圧力は、２０１ｂａｒであった。

【0071】

【表1】

【0072】

０．１％ＴＦＡおよび１０ｍＭ酢酸アンモニウムを使用した、５ｐｐｍオレイン酸および２０ｐｐｍポリソルベート８０混合物を分離するための個々のクロマトグラフィートレースは、図５Ａおよび５Ｂでそれぞれ例示されている。例示されているように、緩衝液を０．１％ＴＦＡ（図５Ａ）から１０ｍＭ酢酸アンモニウム（図５Ｂ）へと切り替えると、２つの主なモノマーピーク、すなわちオレエートとＰＳ８０モノエステルとの間における分解能が著しく増進する。

【0073】

［実施例２］
粒子細孔径の効果
この実施例では、オレイン酸およびポリソルベート８０の混合物を分離するためのＨＰＬＣを使用して、分離媒体細孔径の分解能、ピーク幅およびピーク高さに対する効果を調査した。

【0074】

この実施例で使用される計器装備は、１２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＨＰＬＣ系であった。ＨＰＬＣオートサンプラーを室温（２３℃）にて保持した。ＥＬＳＤでは、エバポレーター温度は５０℃であり、ネブライザー温度５０℃、ガス流量は、１分当たり１標準リットル（ＳＬＭ）であった。出力データ速度は８０Ｈｚであり、データ平滑化は３．０秒であった。試料は、混合した５ｐｐｍオレイン酸および２０ｐｐｍポリソルベート８０であり、９０：１０水：メタノール（ｖ／ｖ）の溶液に溶解した。

【0075】

移動相は、２つの成分であり、移動相Ａは、水中１０ｍＭ酢酸アンモニウムであり、移動相Ｂはメタノールであり、グラジエントは試料の流動中に使用された。全体の試料の流動は１０分の長さであり、時間に応じた移動相グラジエント組成は、実施例１の表１で指定されている通りであった。流量は、０．６０ｍＬ／分および２０μＬの試料注入体積に設定した。カラムの温度は、５０℃であった。この実施例に使用されるカラムは、Ａｇｉｌｅｎｔ ＺＯＲＢＡＸ（登録商標）ＳＢ－ＣＮ、４．６ｍｍ×５０ｍｍ、３．５μｍ粒径、８０Åの細孔、および、Ａｇｉｌｅｎｔ ＺＯＲＢＡＸ（登録商標）ＳＢ－ＣＮ、４．６ｍｍ×５０ｍｍ、３．５μｍ粒径、３００Åの細孔を含んでいた。各カラムにおける圧力は、それぞれ９５ｂａｒおよび１０４ｂａｒであった。

【0076】

８０Åの細孔および３００Åの細孔を有する粒子を用いたＺＯＲＢＡＸ（登録商標）ＳＢ－ＣＮカラムを使用した、５ｐｐｍオレイン酸および２０ｐｐｍポリソルベート８０混合物を分離するための個々のクロマトグラフィートレースは、図６Ａおよび６Ｂでそれぞれ例示されている。例示されているように、より小さい８０Å細孔径（図６Ａ）と比較してより大きい３００Å細孔径（図６Ｂ）を有するカラムは、２つの化学種間における改善したピーク形状、より少ないベースラインノイズ、およびより高い分解能（３．０８ｖｓ５．０３）により証拠立てられるように、２つの主なモノマーピーク、すなわちオレエートおよびＰＳ８０モノエステルの分離について、より良好に作用した。

【0077】

［実施例３］
粒径の効果
この実施例では、オレイン酸およびポリソルベート８０の混合物を分離するための、２つの異なる粒径を有するＨＰＬＣカラムを使用して、粒径の分解能、ピーク幅およびピーク高さに対する効果を調査した。

【0078】

この実施例で使用される計器装備は、１２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＨＰＬＣ系であった。ＨＰＬＣオートサンプラーを、室温（２３℃）にて保持した。ＥＬＳＤでは、エバポレーター温度は５０℃であり、ネブライザー温度５０℃、ガス流量は、１分当たり１標準リットル（ＳＬＭ）であった。出力データ速度は８０Ｈｚであり、データ平滑化は３．０秒であった。試料は、混合した５ｐｐｍオレイン酸および２０ｐｐｍポリソルベート８０であり、９０：１０水：メタノール（ｖ／ｖ）の溶液に溶解した。

【0079】

移動相は、２つの成分であり、移動相Ａは、水中１０ｍＭ酢酸アンモニウムであり、移動相Ｂはメタノールであり、グラジエントは試料の流動中に使用された。全体の試料の流動は１０分の長さであり、時間に応じた移動相グラジエント組成は、実施例１の表１で指定されている通りであった。流量は、０．２５ｍＬ／分および２０μＬの試料注入体積に設定した。カラムの温度は、５０℃であった。この実施例に使用されるカラムは、Ａｇｉｌｅｎｔ ＺＯＲＢＡＸ（登録商標）ＳＢ－ＣＮ、２．１ｍｍ×５０ｍｍ、３．５μｍ粒径、３００Åの細孔、および、Ａｇｉｌｅｎｔ ＺＯＲＢＡＸ（登録商標）ＳＢ－ＣＮ、２．１ｍｍ×５０ｍｍ、１．８μｍ粒径、３００Åの細孔を含んでいた。各カラムにおける圧力は、それぞれ７５ｂａｒおよび２０１ｂａｒであった。

【0080】

３．５μｍ粒子および１．８μｍ粒子を用いたＺＯＲＢＡＸ（登録商標）ＳＢ－ＣＮカラムを使用した、５ｐｐｍオレイン酸および２０ｐｐｍポリソルベート８０混合物を分離するための個々のクロマトグラフィートレースは、図７Ａおよび７Ｂでそれぞれ例示されている。例示されているように、両方のカラムは、２つの化学種間における実質的に同様のピーク形状、ベースラインノイズ、および分解能（５．１３ｖｓ５．０８）により証拠立てられるように、２つの主なモノマーピーク、すなわちオレエートおよびＰＳ８０モノエステルを分離するために同等に作用させ、より小さい粒子が、わずかにより良好な性能を呈した。これは、２つの粒径に対しての保持時間、ピーク幅およびピーク面積について、表２および３で提示されているデータによりさらに証拠立てられる。表２および３で見られるように、両方の粒径を全体的に同等に作用させたが、１．８μｍ、３００Å粒子では、３．５μｍ、３００Å粒子よりわずかに狭いピーク、およびわずかに良好な感受性が得られた。これらの結果から、シアノシラン残基に結合した１．８μｍ粒子が、主なポリソルベート亜種および個々の分解物生成物すべてを完全に分離する、詳細には、短い５０ｍｍカラムを使用して、１０分以下のクロマトグラフィーの流動によりオレイン酸からのポリソルベート８０を明らかに分離する能力が確認された。

【0081】

【表2】

【0082】

【表3】

【0083】

［実施例４］
カラムの長さの効果
この実施例では、オレイン酸およびポリソルベート８０の混合物を分離するための、分解能、ピーク幅およびピーク高さに対する、カラムの長さの効果を調査した。

【0084】

この実施例で使用される計器装備は、１２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＨＰＬＣ系であった。ＨＰＬＣオートサンプラーを室温（２３℃）にて保持した。ＥＬＳＤでは、エバポレーター温度は５０℃であり、ネブライザー温度５０℃、ガス流量は、１分当たり１標準リットル（ＳＬＭ）であった。出力データ速度は８０Ｈｚであり、データ平滑化は３．０秒であった。試料は、混合した５ｐｐｍオレイン酸および２０ｐｐｍポリソルベート８０であり、９０：１０水：メタノール（ｖ／ｖ）の溶液に溶解した。

【0085】

移動相は、２つの成分であり、移動相Ａは、水中１０ｍＭ酢酸アンモニウムであり、移動相Ｂはメタノールであり、グラジエントは試料の流動中に使用された。この実施例に使用されるカラムは、Ａｇｉｌｅｎｔ ＺＯＲＢＡＸ（登録商標）ＳＢ－ＣＮ、２．１ｍｍ×５０ｍｍ、３．５μｍ粒径、３００Åの細孔、および、Ａｇｉｌｅｎｔ ＺＯＲＢＡＸ（登録商標）ＳＢ－ＣＮ、２．１ｍｍ×１５０ｍｍ、３．５μｍ粒径、３００Åの細孔を含んでいた。各カラムにおける圧力は、それぞれ７５ｂａｒおよび１６３ｂａｒであった。カラムの長さにおける差のため、全体の実行時間および移動相グラジエントは、各カラムで異なっていた。長さ５０ｍｍのカラムでは、実行時間は１０分であり、時間に応じた移動相グラジエント組成は、実施例１の表１で指定されている通りである。長さ１５０ｍｍのカラムでは、実行時間は１５分であり、時間に応じた移動相グラジエント組成は、表４で示されている。両方のカラムで、流量は、０．２５ｍＬ／分および２０μＬの試料注入体積に設定した。カラムの温度は、５０℃であった。

【0086】

【表4】

【0087】

長さが５０ｍｍおよび１５０ｍｍのＺＯＲＢＡＸ（登録商標）ＳＢ－ＣＮカラムを使用して、５ｐｐｍオレイン酸および２０ｐｐｍポリソルベート８０混合物を分離するための個々のクロマトグラフィートレースは、図８Ａおよび８Ｂでそれぞれ例示されている。例示されているように、より長い１５０ｍｍカラム（図８Ｂ）は、より短い５０ｍｍカラム（図８Ａ）より良好に作用し、２つの化学種でより良好なピーク分解能（７．１８ｖｓ５．１３）を呈示した。

【0088】

［実施例５］
粒子タイプおよび大きさの効果
この実施例では、分解能、ピーク幅およびピーク高さに対する粒径の効果は、オレイン酸およびポリソルベート８０の混合物を分離するための、２つの異なる大きさの表面多孔質粒子を有するＨＰＬＣカラムを使用して調査した。表面多孔質粒子は、全体の粒子にわたって多孔質ではなく、薄い多孔質シェルに囲まれている固体コアを有する。これらのタイプの粒子は、一般的に、粒子を通した材料の拡散が限定され、より高い圧力で装填できるので、改善した分離速度を呈する。

【0089】

この実施に使用される計器装備は、１２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ蒸発光散乱検出器（ＥＬＳＤ）を備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ ＨＰＬＣ系であった。ＨＰＬＣオートサンプラーを室温（２３℃）にて保持した。ＥＬＳＤでは、エバポレーター温度は５０℃であり、ネブライザー温度は５０℃、ガス流量は、１分当たり１標準リットル（ＳＬＭ）であった。出力データ速度は８０Ｈｚであり、データ平滑化は３．０秒であった。試料は、混合した５ｐｐｍオレイン酸および２０ｐｐｍポリソルベート８０であり、９０：１０水：メタノール（ｖ／ｖ）の溶液に溶解した。

【0090】

移動相は、２つの成分であり、移動相Ａは、水中１０ｍＭ酢酸アンモニウムであり、移動相Ｂはメタノールであり、グラジエントは試料の流動中に使用された。全体の試料の流動は１０分の長さであり、実施例１の表１で指定されている時間に応じた移動相グラジエント組成。流量は、０．２５ｍＬ／分および２０μＬの試料注入体積に設定した。カラムの温度は、５０℃であった。この実施例に使用されるカラムは、Ａｇｉｌｅｎｔ ＰＯＲＯＳＨＥＬＬ（登録商標）ＳＢ－ＣＮ、２．１ｍｍ×５０ｍｍ、２．７μｍ粒径、１２０Åの細孔、および、Ａｇｉｌｅｎｔ ＰＯＲＯＳＨＥＬＬ（登録商標）ＳＢ－ＣＮ、２．１ｍｍ×５０ｍｍ、１．９μｍ粒径、１２０Åの細孔を含んでいた。各カラムにおける圧力は、それぞれ１７７ｂａｒおよび２０１ｂａｒであった。

【0091】

２．７μｍ粒子および１．９μｍ粒子を用いたＰＯＲＯＳＨＥＬＬ（登録商標）ＳＢ－ＣＮカラムを使用した、５ｐｐｍオレイン酸および２０ｐｐｍポリソルベート８０混合物を分離するための個々のクロマトグラフィートレースは、図９Ａおよび９Ｂでそれぞれ例示されている。例示されているように、２つの化学種間における実質的に同様のピーク形状、ベースラインノイズおよび分解能（５．５０ｖｓ４．９３）により証拠立てられるように、２つの主なモノマーピーク、すなわちオレエートおよびＰＳ８０モノエステルの分離について互いと比較して、両方のカラムで同等に作用させ、より小さい粒子は、わずかにより良好な性能を呈した。さらに、両方の大きさのＰＯＲＯＳＨＥＬＬ（登録商標）粒子は、図５Ａおよび５Ｂに例示したように、同等に作用させて、ＺＯＲＢＡＸ（登録商標）粒子と同様の大きさにした。これは、２つの粒子サイズドで保持時間、ピーク幅およびピーク面積について表５および６で提示されているデータによりさらに証拠立てられた。表５および６で見られるように、両方の粒径を全体的に同等に作用させたが、１．９μｍ、１２０Å ＰＯＲＯＳＨＥＬＬ（登録商標）粒子では、２．７μｍ、１２０Å ＰＯＲＯＳＨＥＬＬ（登録商標）粒子よりわずかに狭いピークが、後で溶出する化合物で得られた。これらの結果から、ＰＯＲＯＳＨＥＬＬ（登録商標）粒子は、特定の状況において、例えばより高い充填圧力が有利になり得る場合、ＺＯＲＢＡＸ（登録商標）粒子の代替粒子として使用できることが示唆された。

【0092】

【表5】

【0093】

【表6】

【0094】

本明細書で使用される表現および専門用語は、説明を目的とするものであり、限定と解釈すべきではない。本明細書で使用されている、「複数」という用語は、２つ以上の項目または要素を指す。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「保有する」、「有する」、「含有する」および「伴う」という用語は、明細書または特許請求の範囲を問わず、非限定的用語であり、すなわち「含むが、それらに限定されない」を意味することになる。したがって、そのような用語の使用は、その後に列挙されている項目、およびそれらの等価物、ならびに追加の項目を包含することを意味する。「からなる」および「本質的に～からなる」という移行句のみが、それぞれ、特許請求の範囲に関する限定的または半限定的な移行句である。序数に関する用語、例えば特許請求の範囲において、特許請求の範囲の要素を修飾する「第１の」、「第２の」、「第３の」などの使用は、それ自体が、ある特許請求の範囲の要素の、別の特許請求の範囲に対するいかなる優先、優位性、または順序、もしくは方法の動作が行われる時間的順序も含意しないが、ある名称を有する、ある特許請求の範囲の要素を、特許請求の範囲の要素を区別するために、同一の名称（序数に関する用語の使用を除いて）を有する別の要素と区別する標識としてのみ使用される。

【0095】

少なくとも１つの実施形態のいくつかの態様はこのように説明したが、当業者は、様々な変化、修飾および改善が容易に発生するであろうと認識すべきである。いずれかの実施形態に記載されているいずれかの特徴は、他のいずれかの実施形態のいずれかの特徴に含まれ得る、またはそれで置き換えられ得る。そのような変化、修飾および改善は、本開示の一部であることが意図され、また、本発明の範囲内にあることが意図される。したがって、先述の説明および図面は、単なる例である。

【0096】

当業者は、本明細書に記載されているパラメーターおよび構成は模範であること、また、実際のパラメーターおよび／または構成は、開示されている方法および材料が使用される具体的な用途によって決まることとなることを認識すべきである。当業者は、単なる日常的実験法を使用して、開示されている具体的な実施形態の等価物を把握する、または確かめることもできるはずである。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図7A】

【図7B】

【図8A】

【図8B】

【図9A】

【図9B】

【外国語明細書】