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特開2024-99482分子導入方法、分子導入効率改善剤、使用、分子導入細胞、分子導入細胞の製造方法、及び分子導入装置
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024099482
(43)【公開日】2024-07-25
(54)【発明の名称】分子導入方法、分子導入効率改善剤、使用、分子導入細胞、分子導入細胞の製造方法、及び分子導入装置
(51)【国際特許分類】
C12N 5/071 20100101AFI20240718BHJP
C12M 1/42 20060101ALI20240718BHJP
C07K 14/55 20060101ALI20240718BHJP
C07K 14/52 20060101ALI20240718BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20240718BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240718BHJP
【ＦＩ】
C12N5/071
C12M1/42 ZNA
C07K14/55
C07K14/52
C12M1/00 Z
C12N15/12
【審査請求】未請求
【請求項の数】24
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023216603
(22)【出願日】2023-12-22
(31)【優先権主張番号】P 2023003017
(32)【優先日】2023-01-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
(71)【出願人】
【識別番号】000002174
【氏名又は名称】積水化学工業株式会社
(74)【代理人】
【識別番号】100161207
【弁理士】
【氏名又は名称】西澤 和純
(74)【代理人】
【識別番号】100152272
【弁理士】
【氏名又は名称】川越 雄一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100147267
【弁理士】
【氏名又は名称】大槻 真紀子
(74)【代理人】
【識別番号】100188592
【弁理士】
【氏名又は名称】山口 洋
(72)【発明者】
【氏名】朴 起里
(72)【発明者】
【氏名】井上 仁志
【テーマコード（参考）】
4B029
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B029AA27
4B029BB11
4B029DG10
4B065AA90X
4B065AC14
4B065BA30
4B065BD39
4B065BD50
4B065CA44
4B065CA46
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA09
4H045CA40
4H045DA04
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】
【課題】汎用性に優れるとともに、簡便でかつ効率的な、分子導入方法を提供する。
【解決手段】分子を含む液体と標的細胞を接触させる導入工程、及び前記標的細胞の前記分子の導入効率を改善する分子導入効率改善剤を含む液体と前記標的細胞を接触させる活性化工程を含み、前記導入工程の前及び後のいずれか一方又は両方に前記活性化工程を行う、分子導入方法。前記導入工程において、前記標的細胞にプラズマを照射することができる。
【選択図】なし
【解決手段】分子を含む液体と標的細胞を接触させる導入工程、及び前記標的細胞の前記分子の導入効率を改善する分子導入効率改善剤を含む液体と前記標的細胞を接触させる活性化工程を含み、前記導入工程の前及び後のいずれか一方又は両方に前記活性化工程を行う、分子導入方法。前記導入工程において、前記標的細胞にプラズマを照射することができる。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
分子を含む液体と標的細胞を接触させる導入工程、及び
前記標的細胞の前記分子の導入効率を改善する分子導入効率改善剤を含む液体と前記標的細胞とを接触させる活性化工程
を含み、
前記導入工程の前及び後のいずれか一方又は両方に前記活性化工程を行う、分子導入方法。
前記標的細胞の前記分子の導入効率を改善する分子導入効率改善剤を含む液体と前記標的細胞とを接触させる活性化工程
を含み、
前記導入工程の前及び後のいずれか一方又は両方に前記活性化工程を行う、分子導入方法。
【請求項2】
前記導入工程の前に前記活性化工程を行う、請求項１に記載の分子導入方法。
【請求項3】
前記導入工程と前記活性化工程との間に２４～５４時間の間隔を設定する、請求項１又は２に記載の分子導入方法。
【請求項4】
前記導入工程において前記標的細胞にプラズマを照射する、請求項１又は２に記載の分子導入方法。
【請求項5】
前記分子導入効率改善剤は、サイトカイン及びその組換え体からなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とする、請求項１又は２に記載の分子導入方法。
【請求項6】
前記分子導入効率改善剤は、細胞が分泌するタンパク質のうち獲得免疫反応に関わる物質及びその組換え体からなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とする、請求項１又は２に記載の分子導入方法。
【請求項7】
前記細胞が分泌するタンパク質のうち獲得免疫反応に関わる物質がサイトカインである、請求項６に記載の分子導入方法。
【請求項8】
前記サイトカインがインターロイキンである、請求項５に記載の分子導入方法。
【請求項9】
前記サイトカインがインターロイキンである、請求項７に記載の分子導入方法。
【請求項10】
前記サイトカインがＴ細胞及びＢ細胞からなる群から選択される少なくとも１種によって産生されるインターロイキンである、請求項５に記載の分子導入方法。
【請求項11】
前記サイトカインがＴ細胞及びＢ細胞からなる群から選択される少なくとも１種によって産生されるインターロイキンである、請求項７に記載の分子導入方法。
【請求項12】
前記サイトカインがインターロイキン－２である、請求項５に記載の分子導入方法。
【請求項13】
前記サイトカインがインターロイキン－２である、請求項７に記載の分子導入方法。
【請求項14】
前記分子導入効率改善剤は、２つのドメインを有し、ヘリックス４つのＣ鎖とヘリックス４つのＤ鎖又はヘリックス８つと２カ所のジスルフィド結合で構成された、分子量が１５．５～１６ｋＤａのタンパク質を有効成分とする、請求項１又は２に記載の分子導入方法。
【請求項15】
前記分子導入効率改善剤は、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列と９５％以上配列一致するアミノ酸配列からなるタンパク質を有効成分とする、請求項１又は２に記載の分子導入方法。
【請求項16】
サイトカイン及びその組換え体からなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とする、標的細胞への分子の導入効率を改善するための分子導入効率改善剤。
【請求項17】
細胞が分泌するタンパク質のうち獲得免疫反応に関わる物質及びその組換え体からなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とする、標的細胞への分子の導入効率を改善するための分子導入効率改善剤。
【請求項18】
前記細胞が分泌するタンパク質のうち獲得免疫反応に関わる物質がサイトカインである、請求項１７に記載の分子導入効率改善剤。
【請求項19】
サイトカイン及びその組換え体からなる群から選択される少なくとも１種の標的細胞への分子の導入効率を改善するための使用。
【請求項20】
細胞が分泌するタンパク質のうち獲得免疫反応に関わる物質及びその組換え体からなる群から選択される少なくとも１種の標的細胞への分子の導入効率を改善するための使用。
【請求項21】
前記細胞が分泌するタンパク質のうち獲得免疫反応に関わる物質がサイトカインである、請求項２０に記載の使用。
【請求項22】
請求項１又は２に記載の分子導入方法を用いる、分子導入細胞の製造方法。
【請求項23】
標的細胞に分子が導入されてなる分子導入細胞であって、
前記分子導入細胞の細胞内又は細胞膜に分子導入効率改善剤を含む、分子導入細胞。
前記分子導入細胞の細胞内又は細胞膜に分子導入効率改善剤を含む、分子導入細胞。
【請求項24】
第一電極と、
前記第一電極と離間し、前記第一電極の先端が向く方向に位置する第二電極と、
前記第一電極と前記第二電極との間に、前記第一電極の先端から離間して位置する照射場と、
前記第一電極と前記第二電極との間に電圧を印加する給電部と、
前記照射場に配置した、標的細胞を収容した容器に分子導入効率改善剤を含む液体を添加する液体添加部と、
前記給電部及び前記液体添加部をコンピュータにより制御する制御部と
を備える分子導入装置であって、
前記制御部は、前記液体添加部に前記容器への前記分子導入効率改善剤を含む液体の注入を行わせる液体注入ステップ、前記給電部に前記第一電極と前記第二電極との間に電圧を印加させる電圧印加ステップ、並びに前記液体注入ステップ及び前記電圧印加ステップの実行タイミングを制御する、分子導入装置。
前記第一電極と離間し、前記第一電極の先端が向く方向に位置する第二電極と、
前記第一電極と前記第二電極との間に、前記第一電極の先端から離間して位置する照射場と、
前記第一電極と前記第二電極との間に電圧を印加する給電部と、
前記照射場に配置した、標的細胞を収容した容器に分子導入効率改善剤を含む液体を添加する液体添加部と、
前記給電部及び前記液体添加部をコンピュータにより制御する制御部と
を備える分子導入装置であって、
前記制御部は、前記液体添加部に前記容器への前記分子導入効率改善剤を含む液体の注入を行わせる液体注入ステップ、前記給電部に前記第一電極と前記第二電極との間に電圧を印加させる電圧印加ステップ、並びに前記液体注入ステップ及び前記電圧印加ステップの実行タイミングを制御する、分子導入装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、分子導入方法、分子導入効率改善剤、使用、分子導入細胞、分子導入細胞の製造方法、及び分子導入装置に関する。
【背景技術】
【0002】
ヒトゲノム及びマウスゲノムの解読がなされ、医学又は薬学等の分野において、分子生物学関連の研究開発又は医薬品開発を行なう際に、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ等のポリヌクレオチド又はその誘導体、シグナル伝達タンパク質若しくは転写調節因子等のタンパク質又はその誘導体等の高分子化合物、低分子生理活性物質、又は薬剤候補品等の分子を標的細胞内に導入し、標的細胞内での遺伝子の機能又は生理活性分子の生理的な活性を試験する必要が増している。
【0003】
標的細胞に分子を導入する方法は、化学的手法、物理的手法、及び生物学的手法の大きく３つの手法がある。化学的手法は、カチオンポリマー、カチオン脂質、又はリン酸カルシウム等のトランスフェクション試薬を用いて、エンドサイトーシスにより分子を標的細胞に取り込ませる手法である。物理的手法は、マイクロインジェクション、ソノポレーション、レーザー照射、又はエレクトロポレーション等の物理的操作により分子を標的細胞に直接導入する手法である。生物学的手法は、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、又はアデノウイルス等のウイルスベクターを用い、ウイルスの感染能力によりウイルス粒子内の核酸を標的細胞内に移行させる手法である。
【0004】
非特許文献１には、レトロウイルスベクターを用いて造血幹細胞へ遺伝子導入する際、フィブロネクチンを添加すると導入効率が向上することが記載されている。
【0005】
非特許文献２には、レトロウイルスベクターを用いて血球細胞へ遺伝子導入する際、ヒトフィブロネクチンの細胞接着ドメイン（Ｃ－ｄｏｍａｉｎ）、ヘパリン結合ドメイン（Ｈ－ｄｏｍａｉｎ）及びＣＳ－１部位の３種類の機能性ドメインを含む組換えタンパク質（レトロネクチン（登録商標）、リコンビナントヒトフィブロネクチンＣＨ－２９６）を添加すると導入効率が向上することが記載されている。
【0006】
特許文献１には、（ａ）フィブロネクチン又はフィブロネクチンフラグメントＣＨ－２９６〔ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ〕等のレトロウイルス結合性物質が固定化された培養容器に、外来遺伝子が搭載されたレトロウイルスベクターを含有する液体を入れた後、２５℃未満の温度で４時間以上インキュベートし、レトロウイルスベクターが結合された培養容器を得る工程と、（ｂ）工程（ａ）により得られた培養容器に標的細胞を入れ、インキュベートする工程とを含む、レトロウイルスベクターによる標的細胞への外来遺伝子の導入方法が記載されている。
【0007】
特許文献２には、（１）フィブロネクチン又はそのフラグメント及びＣＤ３リガンドを含む容器内でＴ細胞及び／又はＴ細胞の前駆細胞を含有する細胞集団を培養する工程と、（２）所望の遺伝子を保持するベクターを工程（１）の容器に添加する工程とを含む、所望の遺伝子が導入された細胞集団の製造方法が記載されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0008】
【特許文献1】国際公開第２０１２／００２４５２号
【特許文献2】国際公開第２００９／１１９７９３号
【非特許文献】
【0009】
【非特許文献1】Ｍｏｒｉｔｚ，Ｔ．外６名、“Fibronectin Improves Transduction of Reconstituting Hematopoietic Stem Cells by Retroviral Vectors: Evidence of Direct Viral Binding to Chymotryptic Carboxy-Terminal Fragments”、Ｂｌｏｏｄ、１９９６年８月１日、第８８巻、第３号、ｐ．８５５－８６２
【非特許文献2】Ｈａｎｅｎｂｅｒｇ，Ｈ．外５名、“Colocalization of retrovirus and target cells on specific fibronectin fragments increases genetic transduction of mammalian cells”、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９９６年８月、第２巻、第８号、ｐ．８７６－８８２
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0010】
先行技術文献に開示された標的細胞への分子導入方法は、標的細胞が造血幹細胞又は血球系細胞に限定され、さらに分子の導入にウイルスベクターを用いることが必要であることから、より汎用性に優れた分子導入方法が求められている。
【0011】
本発明は、汎用性に優れるとともに、簡便でかつ効率的な、分子導入方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明は以下の態様を含む。
［１］ 分子を含む液体と標的細胞を接触させる導入工程、及び
前記標的細胞の前記分子の導入効率を改善する分子導入効率改善剤を含む液体と前記標的細胞とを接触させる活性化工程
を含み、
前記導入工程の前及び後のいずれか一方又は両方に前記活性化工程を行う、分子導入方法。
［２］ 前記導入工程の前に前記活性化工程を行う、［１］に記載の分子導入方法。
［３］ 前記導入工程と前記活性化工程との間に２４～５４時間の間隔を設定する、［１］又は［２］に記載の分子導入方法。
［４］ 前記導入工程において前記標的細胞にプラズマを照射する、［１］～［３］のいずれかに記載の分子導入方法。
［５］ 前記分子導入効率改善剤は、サイトカイン及びその組換え体からなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とする、［１］～［４］のいずれかに記載の分子導入方法。
［６］ 前記分子導入効率改善剤は、細胞が分泌するタンパク質のうち獲得免疫反応に関わる物質及びその組換え体からなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とする、［１］～［４］のいずれかに記載の分子導入方法。
［７］ 前記細胞が分泌するタンパク質のうち獲得免疫反応に関わる物質がサイトカインである、［６］に記載の分子導入方法。
［８］ 前記サイトカインがインターロイキンである、［５］に記載の分子導入方法。
［９］ 前記サイトカインがインターロイキンである、［７］に記載の分子導入方法。
［１０］ 前記サイトカインがＴ細胞及びＢ細胞からなる群から選択される少なくとも１種によって産生されるインターロイキンである、［５］又は［８］に記載の分子導入方法。
［１１］ 前記サイトカインがＴ細胞及びＢ細胞からなる群から選択される少なくとも１種によって産生されるインターロイキンである、［７］又は［９］に記載の分子導入方法。
［１２］ 前記サイトカインがインターロイキン－２である、［５］、［８］、又は［１０］に記載の分子導入方法。
［１３］ 前記サイトカインがインターロイキン－２である、［７］、［９］、又は［１１］に記載の分子導入方法。
［１４］ 前記分子導入効率改善剤は、２つのドメインを有し、ヘリックス４つのＣ鎖とヘリックス４つのＤ鎖又はヘリックス８つと２カ所のジスルフィド結合で構成された、分子量が１５．５～１６ｋＤａのタンパク質を有効成分とする、［１］～［１３］のいずれかに記載の分子導入方法。
［１５］ 前記分子導入効率改善剤は、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列と９５％以上配列一致するアミノ酸配列からなるタンパク質を有効成分とする、［１］～［１４］のいずれかに記載の分子導入方法。
［１６］ サイトカイン及びその組換え体からなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とする、標的細胞への分子の導入効率を改善するための分子導入効率改善剤。
［１７］ 細胞が分泌するタンパク質のうち獲得免疫反応に関わる物質及びその組換え体からなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とする、標的細胞への分子の導入効率を改善するための分子導入効率改善剤。
［１８］ 前記細胞が分泌するタンパク質のうち獲得免疫反応に関わる物質がサイトカインである、［１７］に記載の分子導入効率改善剤。
［１９］ サイトカイン及びその組換え体からなる群から選択される少なくとも１種の標的細胞への分子の導入効率を改善するための使用。
［２０］ 細胞が分泌するタンパク質のうち獲得免疫反応に関わる物質及びその組換え体からなる群から選択される少なくとも１種の標的細胞への分子の導入効率を改善するための使用。
［２１］ 前記細胞が分泌するタンパク質のうち獲得免疫反応に関わる物質がサイトカインである、［２０］に記載の使用。
［２２］ ［１］～［１５］のいずれかに記載の分子導入方法を用いる、分子導入細胞の製造方法。
［２３］ 標的細胞に分子が導入されてなる分子導入細胞であって、
前記分子導入細胞の細胞内又は細胞膜に分子導入効率改善剤を含む、分子導入細胞。
［２４］ 第一電極と、
前記第一電極と離間し、前記第一電極の先端が向く方向に位置する第二電極と、
前記第一電極と前記第二電極との間に、前記第一電極の先端から離間して位置する照射場と、
前記第一電極と前記第二電極との間に電圧を印加する給電部と、
前記照射場に配置した、標的細胞を収容した容器に分子導入効率改善剤を含む液体を添加する液体添加部と、
前記給電部及び前記液体添加部をコンピュータにより制御する制御部と
を備える分子導入装置であって、
前記制御部は、前記液体添加部に前記容器への前記分子導入効率改善剤を含む液体の注入を行わせる液体注入ステップ、前記給電部に前記第一電極と前記第二電極との間に電圧を印加させる電圧印加ステップ、並びに前記液体注入ステップ及び前記電圧印加ステップの実行タイミングを制御する、分子導入装置。
［１］ 分子を含む液体と標的細胞を接触させる導入工程、及び
前記標的細胞の前記分子の導入効率を改善する分子導入効率改善剤を含む液体と前記標的細胞とを接触させる活性化工程
を含み、
前記導入工程の前及び後のいずれか一方又は両方に前記活性化工程を行う、分子導入方法。
［２］ 前記導入工程の前に前記活性化工程を行う、［１］に記載の分子導入方法。
［３］ 前記導入工程と前記活性化工程との間に２４～５４時間の間隔を設定する、［１］又は［２］に記載の分子導入方法。
［４］ 前記導入工程において前記標的細胞にプラズマを照射する、［１］～［３］のいずれかに記載の分子導入方法。
［５］ 前記分子導入効率改善剤は、サイトカイン及びその組換え体からなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とする、［１］～［４］のいずれかに記載の分子導入方法。
［６］ 前記分子導入効率改善剤は、細胞が分泌するタンパク質のうち獲得免疫反応に関わる物質及びその組換え体からなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とする、［１］～［４］のいずれかに記載の分子導入方法。
［７］ 前記細胞が分泌するタンパク質のうち獲得免疫反応に関わる物質がサイトカインである、［６］に記載の分子導入方法。
［８］ 前記サイトカインがインターロイキンである、［５］に記載の分子導入方法。
［９］ 前記サイトカインがインターロイキンである、［７］に記載の分子導入方法。
［１０］ 前記サイトカインがＴ細胞及びＢ細胞からなる群から選択される少なくとも１種によって産生されるインターロイキンである、［５］又は［８］に記載の分子導入方法。
［１１］ 前記サイトカインがＴ細胞及びＢ細胞からなる群から選択される少なくとも１種によって産生されるインターロイキンである、［７］又は［９］に記載の分子導入方法。
［１２］ 前記サイトカインがインターロイキン－２である、［５］、［８］、又は［１０］に記載の分子導入方法。
［１３］ 前記サイトカインがインターロイキン－２である、［７］、［９］、又は［１１］に記載の分子導入方法。
［１４］ 前記分子導入効率改善剤は、２つのドメインを有し、ヘリックス４つのＣ鎖とヘリックス４つのＤ鎖又はヘリックス８つと２カ所のジスルフィド結合で構成された、分子量が１５．５～１６ｋＤａのタンパク質を有効成分とする、［１］～［１３］のいずれかに記載の分子導入方法。
［１５］ 前記分子導入効率改善剤は、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列と９５％以上配列一致するアミノ酸配列からなるタンパク質を有効成分とする、［１］～［１４］のいずれかに記載の分子導入方法。
［１６］ サイトカイン及びその組換え体からなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とする、標的細胞への分子の導入効率を改善するための分子導入効率改善剤。
［１７］ 細胞が分泌するタンパク質のうち獲得免疫反応に関わる物質及びその組換え体からなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とする、標的細胞への分子の導入効率を改善するための分子導入効率改善剤。
［１８］ 前記細胞が分泌するタンパク質のうち獲得免疫反応に関わる物質がサイトカインである、［１７］に記載の分子導入効率改善剤。
［１９］ サイトカイン及びその組換え体からなる群から選択される少なくとも１種の標的細胞への分子の導入効率を改善するための使用。
［２０］ 細胞が分泌するタンパク質のうち獲得免疫反応に関わる物質及びその組換え体からなる群から選択される少なくとも１種の標的細胞への分子の導入効率を改善するための使用。
［２１］ 前記細胞が分泌するタンパク質のうち獲得免疫反応に関わる物質がサイトカインである、［２０］に記載の使用。
［２２］ ［１］～［１５］のいずれかに記載の分子導入方法を用いる、分子導入細胞の製造方法。
［２３］ 標的細胞に分子が導入されてなる分子導入細胞であって、
前記分子導入細胞の細胞内又は細胞膜に分子導入効率改善剤を含む、分子導入細胞。
［２４］ 第一電極と、
前記第一電極と離間し、前記第一電極の先端が向く方向に位置する第二電極と、
前記第一電極と前記第二電極との間に、前記第一電極の先端から離間して位置する照射場と、
前記第一電極と前記第二電極との間に電圧を印加する給電部と、
前記照射場に配置した、標的細胞を収容した容器に分子導入効率改善剤を含む液体を添加する液体添加部と、
前記給電部及び前記液体添加部をコンピュータにより制御する制御部と
を備える分子導入装置であって、
前記制御部は、前記液体添加部に前記容器への前記分子導入効率改善剤を含む液体の注入を行わせる液体注入ステップ、前記給電部に前記第一電極と前記第二電極との間に電圧を印加させる電圧印加ステップ、並びに前記液体注入ステップ及び前記電圧印加ステップの実行タイミングを制御する、分子導入装置。
【発明の効果】
【0013】
本発明は、汎用性に優れるとともに、簡便でかつ効率的な、分子導入方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】本発明の一実施形態に係る分子導入装置の断面図である。
【図3】実験例１の結果を示すグラフである。
【図4】実験例２の結果を示すグラフである。
【図5】実験例３の結果を示すグラフである。
【図6】実験例４の結果を示すグラフである。
【図7】実験例５の結果を示すグラフである。
【図8】実験例６の結果を示すグラフである。
【図9】実験例７の結果を示すグラフである。
【図10】実験例８の結果を示すグラフである。
【図11】実験例９の結果を示すグラフである。
【図12】実験例１０の結果を示すグラフである。
【図13】実験例１１の結果を示すグラフである。
【図14】実験例１２の結果を示すグラフである。
【図15】実験例１３の結果を示すグラフである。
【図16】実験例１４の結果を示すグラフである。
【図17】実験例１５の結果を示すグラフである。
【図18】実験例１６の結果を示すグラフである。
【図19】実験例１７の結果を示すグラフである。
【図20】実験例１８の結果を示すグラフである。
【図21】実験例１９の結果を示すグラフである。
【図22】実験例２０の結果を示すグラフである。
【図23】実験例２１の結果を示すグラフである。
【図24】実験例２２の結果を示すグラフである。
【図25】実験例２３の結果を示すグラフである。
【図26】実験例２４の結果を示すグラフである。
【図27】実験例２５の結果を示すグラフである。
【図28】実験例２６の結果を示すグラフである。
【図29】実験例２７の結果を示すグラフである。
【図30】実験例２８の結果を示すグラフである。
【図31】実験例２９の結果を示すグラフである。
【図32】実験例３０の結果を示すグラフである。
【図33】実験例３１の結果を示すグラフである。
【図34】実験例３２の結果を示すグラフである。
【図35】実験例３３の結果を示すグラフである。
【図36】実験例３４の結果を示すグラフである。
【図37】実験例３５の結果を示すグラフである。
【図38】実験例３６の結果を示すグラフである。
【図39】実験例３７の結果を示すグラフである。
【図40】実験例３８の結果を示すグラフである。
【図41】実験例３９の結果を示すグラフである。
【図42】実験例４０の結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【0015】
本発明において、数値範囲を示す「～」は、その前後に記載した数値を下限値及び上限値として含むことを意味する。
本発明において、アミノ酸の名称及び略号は、ＩＵＰＡＣ（国際純正・応用化学連合、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｐｕｒｅ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）又はＩＵＢ（国際生化学連合、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）の命名に従う。
本発明において、アミノ酸の名称及び略号は、ＩＵＰＡＣ（国際純正・応用化学連合、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｐｕｒｅ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）又はＩＵＢ（国際生化学連合、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）の命名に従う。
【0016】
［分子導入方法］
本発明の分子導入方法は、導入工程及び活性化工程を含む。
本発明の分子導入方法は、導入工程及び活性化工程を含む。
【0017】
導入工程は、分子を含む液体と標的細胞を接触させる工程である。
【0018】
本実施形態において、前記分子は、標的細胞に導入するために選定した分子のことを示し、特に特定の種類の分子に限定されるものではない。このような分子の具体例としては、ＤＮＡ、ＲＮＡなどのポリヌクレオチド又はその誘導体、シグナル伝達タンパク質や転写調節因子などのタンパク質やペプチドとその誘導体などの高分子化合物があげられる。 また、上述したポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドの誘導体には、ベクター、アンチセンスポリヌクレオチド、デコイポリヌクレオチド、リボザイム、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡなどが含まれる。ポリヌクレオチドの分子量は特に限定されない。
さらに、上述したタンパク質分子及びタンパク質分子誘導体には、シグナル伝達因子、転写調節因子、各種酵素、各種受容体、抗体及び抗体のＦａｂ部分などが含まれる。
他の分子としては、低分子生理活性物質、薬剤候補品などが挙げられ、これらの中でも医薬品などの生理活性な低分子化合物であって、他の導入方法では組織内又は細胞内に導入されにくい低分子化合物が好ましい。他の導入方法では組織内又は細胞内に導入されにくい低分子化合物とは、分子量が１０００Ｄａ以上の低分子、膜透過性の低い分子、などである。
なお、上述の各種分子は、単一の種類を用いてもよいし、二種以上を混合して用いてもよい。
さらに、上述したタンパク質分子及びタンパク質分子誘導体には、シグナル伝達因子、転写調節因子、各種酵素、各種受容体、抗体及び抗体のＦａｂ部分などが含まれる。
他の分子としては、低分子生理活性物質、薬剤候補品などが挙げられ、これらの中でも医薬品などの生理活性な低分子化合物であって、他の導入方法では組織内又は細胞内に導入されにくい低分子化合物が好ましい。他の導入方法では組織内又は細胞内に導入されにくい低分子化合物とは、分子量が１０００Ｄａ以上の低分子、膜透過性の低い分子、などである。
なお、上述の各種分子は、単一の種類を用いてもよいし、二種以上を混合して用いてもよい。
【0019】
分子を含む液体は、上述した分子を含む溶液又は分散液であれば特に限定されない。例えば分子を緩衝液に溶解又は分散したものが挙げられる。前記緩衝液は、特に限定されないが、標的細胞への分子導入効率に対する影響が無いか低いものであり、かつ、標的細胞に対する細胞毒性が無いか低いものが好ましい。
【0020】
標的細胞とは、分子を導入する標的となる細胞のことを示し、特に特定の種類の細胞に限定されるものではない。このような標的細胞の具体例としては、ヒトを含む動物細胞、ヒト以外の動物個体、ヒトの個体から採取された細胞、ヒトの個体内の細胞、ヒトの個体、植物細胞、微生物細胞などが挙げられる。これらの標的細胞は、単一の種類を用いてもよいし、二種以上を混合して用いてもよい。
なお、上述したヒトの個体から採取された細胞には、医薬品の研究開発などに用いられるヒトの個体に戻すことを前提としない細胞と、再生医療などに用いられるヒトの個体に戻すことを前提とする細胞とが含まれる。また、上述したヒトの個体から採取された細胞には、ヒトの個体から採取された細胞から培養された細胞も含まれる。
さらに、上述したヒト以外の動物細胞及び植物細胞には、個体内に存在する細胞と、組織内に存在する細胞と、個体や組織から採取された細胞と、個体や組織から採取された細胞から培養された細胞と、が含まれる。
ここで、別の側面から捉えれば、本発明に用いる標的細胞には、大腸菌、放線菌、枯草菌などの原核細胞や、酵母、ヒト以外の動物細胞、ヒトの個体から採取された細胞、ヒトの個体に含まれる細胞、植物細胞などの真核細胞が含まれる。
さらに、本発明に用いる標的細胞には、赤血球ゴーストやリポソームなどの脂質二重膜構造をもつものも含まれる。
また、本発明に用いる標的細胞は、特に処理を施されていないものであってもよいが、分子の導入効率を向上するためには、遺伝子導入の際に一般的に用いられる、コンピータント細胞としての処理を施されたものであってもよい。具体例としては、塩化カルシウムで処理され、細胞膜の構造が変化してＤＮＡ分子を透析しやすくなった大腸菌のコンピータント細胞などが挙げられる。
なお、本発明においては、複数の標的細胞に同時に分子の導入を行うこともできる。この場合、複数の標的細胞は、同種の細胞であってもよく、異種の細胞であってもよい。又は、この複数の標的細胞は、異種の細胞を含むことも好ましい。また、この標的細胞は、ヒト以外の動物細胞、ヒト以外の動物個体、ヒトの個体から採取された細胞、ヒトの個体内の細胞、ヒトの個体、植物細胞、微生物細胞からなる群より選ばれる１種以上であることが望ましい。
なお、上述したヒトの個体から採取された細胞には、医薬品の研究開発などに用いられるヒトの個体に戻すことを前提としない細胞と、再生医療などに用いられるヒトの個体に戻すことを前提とする細胞とが含まれる。また、上述したヒトの個体から採取された細胞には、ヒトの個体から採取された細胞から培養された細胞も含まれる。
さらに、上述したヒト以外の動物細胞及び植物細胞には、個体内に存在する細胞と、組織内に存在する細胞と、個体や組織から採取された細胞と、個体や組織から採取された細胞から培養された細胞と、が含まれる。
ここで、別の側面から捉えれば、本発明に用いる標的細胞には、大腸菌、放線菌、枯草菌などの原核細胞や、酵母、ヒト以外の動物細胞、ヒトの個体から採取された細胞、ヒトの個体に含まれる細胞、植物細胞などの真核細胞が含まれる。
さらに、本発明に用いる標的細胞には、赤血球ゴーストやリポソームなどの脂質二重膜構造をもつものも含まれる。
また、本発明に用いる標的細胞は、特に処理を施されていないものであってもよいが、分子の導入効率を向上するためには、遺伝子導入の際に一般的に用いられる、コンピータント細胞としての処理を施されたものであってもよい。具体例としては、塩化カルシウムで処理され、細胞膜の構造が変化してＤＮＡ分子を透析しやすくなった大腸菌のコンピータント細胞などが挙げられる。
なお、本発明においては、複数の標的細胞に同時に分子の導入を行うこともできる。この場合、複数の標的細胞は、同種の細胞であってもよく、異種の細胞であってもよい。又は、この複数の標的細胞は、異種の細胞を含むことも好ましい。また、この標的細胞は、ヒト以外の動物細胞、ヒト以外の動物個体、ヒトの個体から採取された細胞、ヒトの個体内の細胞、ヒトの個体、植物細胞、微生物細胞からなる群より選ばれる１種以上であることが望ましい。
【0021】
前記標的細胞は、組織に含まれていてもよい。標的細胞を含む組織を、本発明では標的組織ということがある。標的組織は特に特定の種類の組織に限定されるものではない。このような標的組織の具体例としては、移植に用いられるドナーからの臓器、再生医療の方法を用いて再構成された皮膚や歯根などの組織、カルス培養で構築された植物に分化前の組織、などが挙げられる。これらの標的組織は、単一の種類を用いてもよいし、二種以上を混合して用いてもよい。
【0022】
導入工程において標的細胞に分子を導入する方法は、特に限定されないが、カチオンポリマー、カチオン脂質、又はリン酸カルシウム等のトランスフェクション試薬を用いて、エンドサイトーシスにより分子を標的細胞に取り込ませる化学的手法、マイクロインジェクション、ソノポレーション、レーザー照射、又はエレクトロポレーション等の物理的操作により分子を標的細胞に直接導入する物理的手法、及びレトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、又はアデノウイルス等のウイルスベクターを用い、ウイルスの感染能力によりウイルス粒子内の核酸を標的細胞内に移行させる生物学的手法のいずれも使用できる。また、標的細胞にプラズマを照射して標的細胞の働きを活性化し、分子を標的細胞の中に導入するプラズマ導入法を使用することもできる。プラズマ導入法は、放電プラズマを標的細胞に照射して分子を標的細胞に導入する比較的新しい手法である。この手法は、ウイルスを使わないため発がんのリスクは無く、化学薬品を使わないため細胞の機能障害のリスクも無いという利点を有する。そして、直接細胞に電流を流さないために細胞へのダメージも少なく、分子を導入した細胞の生存率も高い。また、リポソームと呼ばれるリン脂質二重膜の小胞の内部に分子を封入して細胞膜を通過させるリポフェクション（リポソームトランスフェクションともいう。）を用いることもできる。
【0023】
活性化工程は、分子導入効率改善剤を含む液体と標的細胞とを接触させる工程である。
【0024】
分子導入効率改善剤とは、前記標的細胞への前記分子の導入効率を改善するための薬剤である。
前記分子導入効率改善剤の有効成分としては、サイトカイン及びその組換え体からなる群から選択される少なくとも１種が好ましい。
前記サイトカインは、例えばインターロイキン（以下「ＩＬ」とも記す。）、インターフェロン（以下「ＩＦＮ」とも記す。）、ケモカイン、コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子（以下「ＴＮＦ」とも記す。）、及び増殖因子であり、インターロイキンがより好ましく、活性化Ｔ細胞によって産生されるインターロイキンがさらに好ましく、インターロイキン－２、インターロイキン－３、インターロイキン－５、インターロイキン－７、及びインターロイキン－１５からなる群から選択される少なくとも１種がいっそう好ましく、インターロイキン－２（以下「ＩＬ２」とも記す。）がよりいっそう好ましい。
なお、本明細書及び特許請求の範囲において、「インターロイキン－Ｘ」（Ｘはアラビア数字）を、ハイフンを省略して、「インターロイキンＸ」と記載する場合がある。
前記分子導入効率改善剤の有効成分としては、サイトカイン及びその組換え体からなる群から選択される少なくとも１種が好ましい。
前記サイトカインは、例えばインターロイキン（以下「ＩＬ」とも記す。）、インターフェロン（以下「ＩＦＮ」とも記す。）、ケモカイン、コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子（以下「ＴＮＦ」とも記す。）、及び増殖因子であり、インターロイキンがより好ましく、活性化Ｔ細胞によって産生されるインターロイキンがさらに好ましく、インターロイキン－２、インターロイキン－３、インターロイキン－５、インターロイキン－７、及びインターロイキン－１５からなる群から選択される少なくとも１種がいっそう好ましく、インターロイキン－２（以下「ＩＬ２」とも記す。）がよりいっそう好ましい。
なお、本明細書及び特許請求の範囲において、「インターロイキン－Ｘ」（Ｘはアラビア数字）を、ハイフンを省略して、「インターロイキンＸ」と記載する場合がある。
【0025】
また、前記分子導入効率改善剤の有効成分としては、２つのドメインを有し、ヘリックス４つのＣ鎖とヘリックス４つのＤ鎖又はヘリックス８つと２カ所のジスルフィド結合で構成された、分子量が１５．５～１６ｋＤａのタンパク質も好ましい。
【0026】
さらに、前記分子導入効率改善剤の有効成分としては、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列と９５％以上配列一致するアミノ酸配列からなるタンパク質も好ましい。ここで、２つのアミノ酸配列の配列一致は、２つのアミノ酸配列のペアワイズアラインメントを作成し、比較可能な全ポジション中の同一アミノ酸ポジションのパーセンテージとする。
【0027】
分子導入効率改善剤を含む液体は、上述した導入効率改善剤を含む溶液又は分散液であれば特に限定されない。例えば導入効率改善剤を緩衝液に溶解又は分散したものが挙げられる。前記緩衝液は、特に限定されないが、標的細胞への分子導入効率に対する影響が無いか低いものであり、かつ、標的細胞に対する細胞毒性が無いか低いものが好ましい。
【0028】
分子導入効率改善剤を含む液体中の分子導入効率改善剤の濃度は特に限定されないが、ＩＬ２の場合で、１～３０ＩＵ／ｍＬが好ましい。ただし、ＩＵは国際単位（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｔ）を意味する。
【0029】
本発明の分子導入方法では、前記導入工程の前及び後のいずれか一方又は両方に前記活性化工程を行うが、少なくとも前記導入工程の前に前記活性化工程を行うことが好ましく、前記導入工程の前及び後の両方に前記活性化工程を行うことがより好ましい。
【0030】
前記活性化工程から前記導入工程への移行は、例えば前記活性化工程終了からの経過時間をトリガーとして行ってもよく、前記導入工程から前記活性化工程への移行は、例えば前記導入工程終了からの経過時間をトリガーとして行ってもよい。
また、前記導入工程から前記活性化工程への移行は、例えば前記導入工程終了時の前記標的細胞の画像を取得して画像解析の結果に基づいて行ってもよい。
また、前記導入工程から前記活性化工程への移行は、例えば前記導入工程終了時の前記標的細胞の画像を取得して画像解析の結果に基づいて行ってもよい。
【0031】
前記導入工程と前記活性化工程との間には、間隔（インターバル）を設定することが好ましく、このインターバルとしては、６～７２時間が好ましく、２４～５４時間がより好ましい。
このインターバルの間に、標的細胞の培養が行われてもよく、例えばヒト由来の動物細胞の場合、１～１０体積％のＣＯ２を含む大気中で３５～３９℃の温度で培養することが好ましい。
このインターバルの間に、標的細胞の培養が行われてもよく、例えばヒト由来の動物細胞の場合、１～１０体積％のＣＯ２を含む大気中で３５～３９℃の温度で培養することが好ましい。
【0032】
［分子導入効率改善剤］
本発明の分子導入効率改善剤は、サイトカイン及びその組換え体からなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とすることが好ましい。
前記サイトカインは、例えばインターロイキン、インターフェロン、ケモカイン、コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子、及び増殖因子であり、インターロイキンがより好ましく、活性化Ｔ細胞によって産生されるインターロイキンがさらに好ましく、インターロイキン－２（以下「ＩＬ２」とも記す。）がいっそう好ましい。
本発明の分子導入効率改善剤は、サイトカイン及びその組換え体からなる群から選択される少なくとも１種を有効成分とすることが好ましい。
前記サイトカインは、例えばインターロイキン、インターフェロン、ケモカイン、コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子、及び増殖因子であり、インターロイキンがより好ましく、活性化Ｔ細胞によって産生されるインターロイキンがさらに好ましく、インターロイキン－２（以下「ＩＬ２」とも記す。）がいっそう好ましい。
【0033】
本発明の分子導入効率改善剤は、また、２つのドメインを有し、ヘリックス４つのＣ鎖とヘリックス４つのＤ鎖又はヘリックス８つと２カ所のジスルフィド結合で構成された、分子量が１５．５～１６ｋＤａのタンパク質を有効成分とすることも好ましい。
【0034】
本発明の分子導入効率改善剤は、また、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列と９５％以上配列一致するアミノ酸配列からなるタンパク質を有効成分とすることも好ましい。ここで、２つのアミノ酸配列の配列一致は、２つのアミノ酸配列のペアワイズアラインメントを作成し、比較可能な全ポジション中の同一アミノ酸ポジションのパーセンテージとする。
【0035】
［標的細胞への分子の導入効率を改善するための分子導入効率改善剤の使用］
本発明は、標的細胞への分子の導入効率を改善するための分子導入効率改善剤の使用も提供する。
前記分子導入効率改善剤は上述したとおりである。
本発明は、標的細胞への分子の導入効率を改善するための分子導入効率改善剤の使用も提供する。
前記分子導入効率改善剤は上述したとおりである。
【0036】
［分子導入細胞の製造方法］
本発明は、上述した分子導入方法を用いる分子導入細胞の製造方法を提供する。
本発明は、上述した分子導入方法を用いる分子導入細胞の製造方法を提供する。
【0037】
［分子導入細胞］
本発明は、標的細胞に分子が導入されてなる分子導入細胞を提供する。
本発明の分子導入細胞は、前記分子導入細胞の細胞内又は細胞膜に分子導入効率改善剤を含む。
前記分子導入効率改善剤は上述したとおりである。
本発明は、標的細胞に分子が導入されてなる分子導入細胞を提供する。
本発明の分子導入細胞は、前記分子導入細胞の細胞内又は細胞膜に分子導入効率改善剤を含む。
前記分子導入効率改善剤は上述したとおりである。
【0038】
［分子導入装置］
以下、本発明の分子導入方法に好適に用いることができる分子導入装置について、一実施形態を挙げて説明する。
本実施形態の分子導入装置は、第一電極と、第二電極と、第一電極と第二電極との間に位置する照射場とを有する。
分子導入装置は、標的細胞に分子を導入する。分子導入装置は、第一電極からプラズマを生じ、標的細胞と分子とが共存する照射対象に照射し、標的細胞に分子を導入する。
以下、本発明の分子導入方法に好適に用いることができる分子導入装置について、一実施形態を挙げて説明する。
本実施形態の分子導入装置は、第一電極と、第二電極と、第一電極と第二電極との間に位置する照射場とを有する。
分子導入装置は、標的細胞に分子を導入する。分子導入装置は、第一電極からプラズマを生じ、標的細胞と分子とが共存する照射対象に照射し、標的細胞に分子を導入する。
【0039】
図１の分子導入装置１は、第一電極１０と、第二電極２０と、給電部３０と、容器４０とを有する。
【0040】
第二電極２０は、第一電極１０と離間し、第一電極１０の下端（先端）の下方に位置している。即ち、第二電極２０は、第一電極１０の先端の先方に位置し、第一電極１０と第二電極２０とは対向している。
給電部３０は、第一電極１０と第二電極２０とに接続されている。
容器４０は、第一電極１０と第二電極２０との間に位置している。容器４０は、第二電極２０上に対置され、かつ第一電極１０と離間している。
給電部３０は、第一電極１０と第二電極２０とに接続されている。
容器４０は、第一電極１０と第二電極２０との間に位置している。容器４０は、第二電極２０上に対置され、かつ第一電極１０と離間している。
【0041】
第一電極１０は、電極本体１２と、電極本体１２の先端に設けられた照射体１４とを有する。なお、本発明において、第一電極１０は、照射体１４のみで構成されていてもよい。
本実施形態において、第一電極１０は、高圧電極である。
本実施形態において、第一電極１０は、高圧電極である。
【0042】
電極本体１２は、一方向に延びる棒状体である。
電極本体１２は、円筒状、多角筒状等の中空構造でもよいし、円柱状、多角柱状等の中実構造でもよい。中でも、電極本体１２は、中実構造であると、耐久性を高め、かつ製造が容易である。
電極本体１２の材料としては、ステンレス、銅、タングステン等の金属、カーボン等を例示できる。
電極本体１２は、円筒状、多角筒状等の中空構造でもよいし、円柱状、多角柱状等の中実構造でもよい。中でも、電極本体１２は、中実構造であると、耐久性を高め、かつ製造が容易である。
電極本体１２の材料としては、ステンレス、銅、タングステン等の金属、カーボン等を例示できる。
【0043】
電極本体１２の太さ（外径）Ｒ１２は、例えば１～５０ｍｍとされる。電極本体１２が多角筒状又は多角柱状である場合、外径Ｒ１２は電極本体１２の横断面の外接円の直径である。
【0044】
照射体１４は、平板状の基板部１５と、基板部１５の周縁から垂下する壁部１６とを有する。基板部１５と壁部１６とは接続している。図２は、第一電極１０を下端（即ち、第二電極２０の方向）から見た照射体１４の端面である。図２に示すように、壁部１６は、内部が中空で、下端（先端）に開口した円筒状である。壁部１６は、第一電極１０から第二電極２０に向かう方向を管軸Ｏ１とした、一重の円筒である。なお、壁部１６は、円筒状に限られず、多角筒状でもよい。
【0045】
基板部１５の材料としては、ステンレス、銅、タングステン等の金属、カーボン等を例示できる。
壁部１６の材料としては、ステンレス、銅、タングステン等の金属、カーボン等を例示できる。
基板部１５と壁部１６とは、一体成形物でもよいし、個々に成形されて接合されたものでもよい。
壁部１６の材料としては、ステンレス、銅、タングステン等の金属、カーボン等を例示できる。
基板部１５と壁部１６とは、一体成形物でもよいし、個々に成形されて接合されたものでもよい。
【0046】
電極本体１２が中空構造である場合、基板部１５には電極本体１２の内部と壁部１６の内部とを連通する貫通孔を有してもよく、有しなくてもよい。
【0047】
壁部１６の太さ（外径）Ｒ１６は、容器４０の大きさ等を勘案して適宜決定できる。外径Ｒ１６は、例えば１ｍｍ超が好ましく、３～５０ｍｍがより好ましく、５～１０ｍｍがさらに好ましい。外径Ｒ１６が上記下限値以上であると、プラズマをより広範囲に照射して、標的細胞への分子の導入効率（以下、単に「導入効率」ということがある）をさらに高められる。外径Ｒ１６が上記上限値以下であると、安定した放電を生成しやすくなる。 また、外径Ｒ１６は、外径Ｒ１２よりも大きいことが好ましい。外径Ｒ１６が大きいと、より広範囲にプラズマを照射して、導入効率をさらに高められる。
壁部１６が多角筒状である場合、外径Ｒ１６は壁部１６の横断面の外接円の直径である。
照射体１４が２以上の壁部１６を有する場合、壁部１６の外径Ｒ１６は、最も外側に位置する壁部１６の外径である。
壁部１６が多角筒状である場合、外径Ｒ１６は壁部１６の横断面の外接円の直径である。
照射体１４が２以上の壁部１６を有する場合、壁部１６の外径Ｒ１６は、最も外側に位置する壁部１６の外径である。
【0048】
壁部１６の内径ｒ１６は、例えば０．１ｍｍ以上が好ましい。
壁部１６が多角筒状である場合、内径ｒ１６は壁部１６の横断面の内接円の直径である。
照射体１４が２以上の壁部１６を有する場合、壁部１６の内径ｒ１６は、最も内側に位置する壁部１６の内径である。
壁部１６が多角筒状である場合、内径ｒ１６は壁部１６の横断面の内接円の直径である。
照射体１４が２以上の壁部１６を有する場合、壁部１６の内径ｒ１６は、最も内側に位置する壁部１６の内径である。
【0049】
壁部１６の下端面と壁部１６の外面とのなす角度θ１は、例えば６０°以下が好ましく、３０°以下がより好ましく、１０℃以下がさらに好ましい。壁部１６の下端面と壁部１６の外面との交点は、いわゆるエッジである。角度θ１が上記上限値以下であると、エッジに電界が集中して、電極間にプラズマをより容易に生じさせられる。
壁部１６の下端面と壁部１６の内面とのなす角度は、角度θ１と同様である。壁部１６の下端面と壁部１６の内面とのなす角度は、角度θ１と同じでもよいし、異なってもよい。
壁部１６の下端面と壁部１６の内面とのなす角度は、角度θ１と同様である。壁部１６の下端面と壁部１６の内面とのなす角度は、角度θ１と同じでもよいし、異なってもよい。
【0050】
壁部１６の厚さｔ１６は、例えば１ｍｍ以下が好ましく、０．１ｍｍ以下がより好ましい。厚さｔ１６が上記上限値以下であると、端部の電界の強さをより高められる。
【0051】
壁部１６の高さｈ１６は、特に限定されず、例えば１～１０ｍｍが好ましい。
【0052】
第二電極２０は、設置電極として機能するものであればよく、例えば平板状の電極が挙げられる。
第二電極２０の材料としては、ステンレス、銅、タングステン等の金属、カーボン等を例示できる。
第二電極２０の材料としては、ステンレス、銅、タングステン等の金属、カーボン等を例示できる。
【0053】
平面視において、第二電極２０の面積は、第一電極１０の面積よりも大きい。第二電極２０の面積が大きいと、第一電極１０から照射対象に対して、より広範囲にプラズマを照射できる。
【0054】
給電部３０は、第一電極１０と第二電極との間に電圧を印加し、両電極間にプラズマを生じることができればよい。給電部３０は、電極への電気の供給の開始又は停止を切り替える。また、給電部３０は、電極に印加する電圧及び周波数を調整する。給電部３０としては、例えば外部の電源と接続し、インバータを含む回路等を例示できる。また、給電部３０としては、二次電池を例示できる。
【0055】
本実施形態において、容器４０は、照射場として機能する。照射場は、後述する分子の導入方法において、照射対象を位置させる場所であればよい。このため、容器４０を分子導入装置１の構成の一部としない場合、容器４０を載置する第二電極２０を照射場としてもよい。
容器４０は、照射対象を収容できればよく、例えばマイクロプレートの各ウェル等を例示できる。
容器４０の内底面は、第一電極１０の先端（即ち、照射体１４）から離間している。
容器４０は、照射対象を収容できればよく、例えばマイクロプレートの各ウェル等を例示できる。
容器４０の内底面は、第一電極１０の先端（即ち、照射体１４）から離間している。
【0056】
容器４０の材料は、導電性材料でもよいし、絶縁性材料でもよい。但し、高電圧により局所的な放電が発生することを防ぐ観点から、絶縁性材料が好ましい。絶縁性材料としては、樹脂、セラミックス、ガラス等を例示できる。樹脂としては、ポリスチレン、ポリオレフィン、ポリエステル等を例示できる。
【0057】
制御部５０は、給電部３０及び液体添加部６０をコンピュータにより制御する。制御部５０のコンピュータは、演算ユニット（ＣＰＵ）、主記憶（メモリ）、記憶領域（ストレージ）、及び入出力（Ｉ／Ｏ）回路を備え、ストレージに記録されたプログラムを読み出し、メモリを作業領域として用いて、ＣＰＵによる処理を行う。
制御部５０は、液体添加部６０に容器４０への分子導入効率改善剤を含む液体の注入を行わせる液体注入ステップ、給電部３０に第一電極１０と第二電極２０との間に電圧を印加させる電圧印加ステップ、並びに前記液体注入ステップ及び前記電圧印加ステップの実行タイミングを制御する。
制御部５０は、液体添加部６０に容器４０への分子導入効率改善剤を含む液体の注入を行わせる液体注入ステップ、給電部３０に第一電極１０と第二電極２０との間に電圧を印加させる電圧印加ステップ、並びに前記液体注入ステップ及び前記電圧印加ステップの実行タイミングを制御する。
【0058】
液体添加部６０は、制御部５０からの指令により、容器４０への分子導入効率改善剤を含む液体の注入を行う。
【0059】
本実施形態の分子導入装置１は、さらに、容器４０内の標的細胞の画像を取得する画像取得部（図示せず）を備えていてもよい。
この場合、制御部５０は、前記画像取得部からの画像データを解析して、液体添加部６０に容器４０への前記分子導入効率改善剤を含む液体の注入を行わせる液体注入ステップ、給電部３０に第一電極１０と第二電極２０との間に電圧を印加させる電圧印加ステップ、並びに前記液体注入ステップ及び前記電圧印加ステップの実行タイミングを制御する。
この場合、制御部５０は、前記画像取得部からの画像データを解析して、液体添加部６０に容器４０への前記分子導入効率改善剤を含む液体の注入を行わせる液体注入ステップ、給電部３０に第一電極１０と第二電極２０との間に電圧を印加させる電圧印加ステップ、並びに前記液体注入ステップ及び前記電圧印加ステップの実行タイミングを制御する。
【0060】
［作用効果］
本発明の分子導入方法では、分子を標的細胞にトランスフェクションする際にＩＬ２等の分子導入効率改善剤を共存させることで、標的細胞が活性化されて、分子の導入効率が向上するものと考えられる。
ただし、ＩＬ２等の分子導入効率改善剤の作用効果は上記したものに限定されない。
本発明の分子導入方法では、分子を標的細胞にトランスフェクションする際にＩＬ２等の分子導入効率改善剤を共存させることで、標的細胞が活性化されて、分子の導入効率が向上するものと考えられる。
ただし、ＩＬ２等の分子導入効率改善剤の作用効果は上記したものに限定されない。
【実施例0061】
以下では実験例によって本発明をより具体的に説明する。ただし、後述する実施例は本発明を限定するものではない。
【0062】
［実験例１］
〈分子導入装置〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
第一電極：φ３の中空パイプ状の電極
電源周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶｐ－ｐ
放電時間：２０ｍｓ又は４０ｍｓ
１ウェルあたりの放電箇所：８箇所
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１４ｍｍ
電極端部と容器上面の離間距離：０．５ｍｍ
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
〈分子導入装置〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
第一電極：φ３の中空パイプ状の電極
電源周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶｐ－ｐ
放電時間：２０ｍｓ又は４０ｍｓ
１ウェルあたりの放電箇所：８箇所
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１４ｍｍ
電極端部と容器上面の離間距離：０．５ｍｍ
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
【0063】
〈実験手順〉
６ウェルプレートの各ウェルにＪｕｒｋａｔ細胞（ＥＣＡＣＣ（ＴｈｅＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）製）２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬを播種し、ＩＬ２濃度を０ＩＵ／ｍＬ又は２０ＩＵ／ｍＬになるように添加した。
ＣＯ２インキュベーターにてプラズマ照射まで２４～３０時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
プラズマ照射の前に培地／上澄みを排除し、ＥＧＦＰプラスミド（ｐＣＭＶ－ＥＧＦＰ）を規定量添加した。
プラズマ照射処理を行い（放電時間２０ｍｓ又は４０ｍｓ）、既定のＩＬ２濃度の回復培地を５ｍＬ添加した。
ＣＯ２インキュベーターにて４８時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
フローサイトメーターによりＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数を測定し、ＩＬ２非添加群の細胞数を１００として指数で表した。
６ウェルプレートの各ウェルにＪｕｒｋａｔ細胞（ＥＣＡＣＣ（ＴｈｅＥｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）製）２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬを播種し、ＩＬ２濃度を０ＩＵ／ｍＬ又は２０ＩＵ／ｍＬになるように添加した。
ＣＯ２インキュベーターにてプラズマ照射まで２４～３０時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
プラズマ照射の前に培地／上澄みを排除し、ＥＧＦＰプラスミド（ｐＣＭＶ－ＥＧＦＰ）を規定量添加した。
プラズマ照射処理を行い（放電時間２０ｍｓ又は４０ｍｓ）、既定のＩＬ２濃度の回復培地を５ｍＬ添加した。
ＣＯ２インキュベーターにて４８時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
フローサイトメーターによりＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数を測定し、ＩＬ２非添加群の細胞数を１００として指数で表した。
【0064】
〈実験結果〉
結果を表１及び図３に示す。
結果を表１及び図３に示す。
【0065】
【表1】
【0066】
ＩＬ２を添加した実施例１－１及び実施例１－２では、ＩＬ２を添加していない比較例１と比べて、ＧＦＰ導入効率が優れていた。
【0067】
［実験例２］
〈分子導入装置〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
第一電極：φ３の中空パイプ状の電極
電源周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶｐ－ｐ
放電時間：４０ｍｓ又は６０ｍｓ
１ウェルあたりの放電箇所：８箇所
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１４ｍｍ
電極端部と容器上面の離間距離：１．０ｍｍ
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
〈分子導入装置〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
第一電極：φ３の中空パイプ状の電極
電源周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶｐ－ｐ
放電時間：４０ｍｓ又は６０ｍｓ
１ウェルあたりの放電箇所：８箇所
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１４ｍｍ
電極端部と容器上面の離間距離：１．０ｍｍ
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
【0068】
〈実験手順〉
６ウェルプレートの各ウェルにＪｕｒｋａｔ細胞（ＥＣＡＣＣ製）２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬを播種し、ＩＬ２濃度を０ＩＵ／ｍＬ又は２０ＩＵ／ｍＬになるように添加した。
ＣＯ２インキュベーターにてプラズマ照射まで２４～３０時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
プラズマ照射の前に培地／上澄みを排除し、ＥＧＦＰプラスミド（ｐＣＭＶ－ＥＧＦＰ）を規定量添加した。
プラズマ照射処理を行い（放電時間４０ｍｓ又は６０ｍｓ）、既定のＩＬ２濃度の回復培地を５ｍＬ添加した。
ＣＯ２インキュベーターにて４８時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
フローサイトメーターによりＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数を測定し、ＩＬ２非添加群の細胞数を１００として指数で表した。
６ウェルプレートの各ウェルにＪｕｒｋａｔ細胞（ＥＣＡＣＣ製）２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬを播種し、ＩＬ２濃度を０ＩＵ／ｍＬ又は２０ＩＵ／ｍＬになるように添加した。
ＣＯ２インキュベーターにてプラズマ照射まで２４～３０時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
プラズマ照射の前に培地／上澄みを排除し、ＥＧＦＰプラスミド（ｐＣＭＶ－ＥＧＦＰ）を規定量添加した。
プラズマ照射処理を行い（放電時間４０ｍｓ又は６０ｍｓ）、既定のＩＬ２濃度の回復培地を５ｍＬ添加した。
ＣＯ２インキュベーターにて４８時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
フローサイトメーターによりＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数を測定し、ＩＬ２非添加群の細胞数を１００として指数で表した。
【0069】
〈実験結果〉
結果を表２及び図４に示す。
結果を表２及び図４に示す。
【0070】
【表2】
【0071】
ＩＬ２を添加した実施例２－１及び実施例２－２では、ＩＬ２を添加していない比較例２と比べて、ＧＦＰ導入効率が優れていた。
【0072】
［実験例３］
〈分子導入装置〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
第一電極：φ３の中空パイプ状の電極
電源周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶｐ－ｐ
放電時間：４０ｍｓ
１ウェルあたりの放電箇所：８箇所
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１４ｍｍ
電極端部と容器上面の離間距離：１．０ｍｍ
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
〈分子導入装置〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
第一電極：φ３の中空パイプ状の電極
電源周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶｐ－ｐ
放電時間：４０ｍｓ
１ウェルあたりの放電箇所：８箇所
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１４ｍｍ
電極端部と容器上面の離間距離：１．０ｍｍ
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
【0073】
〈実験手順〉
６ウェルプレートの各ウェルにＪｕｒｋａｔ細胞（ＥＣＡＣＣ製）２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬを播種し、ＩＬ２濃度を０ＩＵ／ｍＬ又は２０ＩＵ／ｍＬになるように添加した。
ＣＯ２インキュベーターにてプラズマ照射まで２４～３０時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
プラズマ照射の前に培地／上澄みを排除し、ＥＧＦＰプラスミド（ｐＣＭＶ－ＥＧＦＰ）を規定量添加した。
プラズマ照射処理を行い（放電時間４０ｍｓ）、既定のＩＬ２濃度の回復培地を５ｍＬ添加した。
ＣＯ２インキュベーターにて４８時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
フローサイトメーターによりＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数を測定し、ＩＬ２非添加群の細胞数を１００として指数で表した。
６ウェルプレートの各ウェルにＪｕｒｋａｔ細胞（ＥＣＡＣＣ製）２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬを播種し、ＩＬ２濃度を０ＩＵ／ｍＬ又は２０ＩＵ／ｍＬになるように添加した。
ＣＯ２インキュベーターにてプラズマ照射まで２４～３０時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
プラズマ照射の前に培地／上澄みを排除し、ＥＧＦＰプラスミド（ｐＣＭＶ－ＥＧＦＰ）を規定量添加した。
プラズマ照射処理を行い（放電時間４０ｍｓ）、既定のＩＬ２濃度の回復培地を５ｍＬ添加した。
ＣＯ２インキュベーターにて４８時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
フローサイトメーターによりＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数を測定し、ＩＬ２非添加群の細胞数を１００として指数で表した。
【0074】
〈実験結果〉
結果を表３及び図５に示す。
結果を表３及び図５に示す。
【0075】
【表3】
【0076】
ＩＬ２を添加した実施例３では、ＩＬ２を添加していない比較例３と比べて、ＧＦＰ導入効率が優れていた。
【0077】
［実験例４］
〈分子導入装置〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
第一電極：φ３の中空パイプ状の電極
電源周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶｐ－ｐ
放電時間：４０ｍｓ
１ウェルあたりの放電箇所：８箇所
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１４ｍｍ
電極端部と容器上面の離間距離：１．０ｍｍ
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
〈分子導入装置〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
第一電極：φ３の中空パイプ状の電極
電源周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶｐ－ｐ
放電時間：４０ｍｓ
１ウェルあたりの放電箇所：８箇所
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１４ｍｍ
電極端部と容器上面の離間距離：１．０ｍｍ
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
【0078】
〈実験手順〉
６ウェルプレートの各ウェルにＴＨＰ－１細胞（ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）製）２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬを播種し、ＩＬ２濃度を０ＩＵ／ｍＬ又は２０ＩＵ／ｍＬになるように添加した。
ＣＯ２インキュベーターにてプラズマ照射まで２４～３０時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
プラズマ照射の前に培地／上澄みを排除し、ＥＧＦＰプラスミド（ｐＣＭＶ－ＥＧＦＰ）を規定量添加した。
プラズマ照射処理を行い（放電時間４０ｍｓ）、既定のＩＬ２濃度の回復培地を５ｍＬ添加した。
ＣＯ２インキュベーターにて４８時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
フローサイトメーターによりＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数を測定し、ＩＬ２非添加群の細胞数を１００として指数で表した。
６ウェルプレートの各ウェルにＴＨＰ－１細胞（ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）製）２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬを播種し、ＩＬ２濃度を０ＩＵ／ｍＬ又は２０ＩＵ／ｍＬになるように添加した。
ＣＯ２インキュベーターにてプラズマ照射まで２４～３０時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
プラズマ照射の前に培地／上澄みを排除し、ＥＧＦＰプラスミド（ｐＣＭＶ－ＥＧＦＰ）を規定量添加した。
プラズマ照射処理を行い（放電時間４０ｍｓ）、既定のＩＬ２濃度の回復培地を５ｍＬ添加した。
ＣＯ２インキュベーターにて４８時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
フローサイトメーターによりＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数を測定し、ＩＬ２非添加群の細胞数を１００として指数で表した。
【0079】
〈実験結果〉
結果を表４及び図６に示す。
結果を表４及び図６に示す。
【0080】
【表4】
【0081】
ＩＬ２を添加した実施例４では、ＩＬ２を添加していない比較例４と比べて、ＧＦＰ導入効率が優れていた。
【0082】
［実験例５］
〈分子導入装置〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
第一電極：φ３の中空パイプ状の電極
電源周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶｐ－ｐ
放電時間：６０ｍｓ
１ウェルあたりの放電箇所：８箇所
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１２ｍｍ
電極端部と容器上面の離間距離：３．０ｍｍ
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
〈分子導入装置〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
第一電極：φ３の中空パイプ状の電極
電源周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶｐ－ｐ
放電時間：６０ｍｓ
１ウェルあたりの放電箇所：８箇所
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１２ｍｍ
電極端部と容器上面の離間距離：３．０ｍｍ
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
【0083】
〈実験手順〉
６ウェルプレートの各ウェルにＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）０．８６×１０６個／ウェル／３ｍＬを播種し、ＩＬ２濃度を０ＩＵ／ｍＬ、２０ＩＵ／ｍＬ、又は３０ＩＵ／ｍＬになるように添加した。
ＣＯ２インキュベーターにてプラズマ照射まで４８～５４時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
プラズマ照射の前に培地／上澄みを排除し、ＥＧＦＰプラスミド（ｐＣＭＶ－ＥＧＦＰ）を規定量添加した。
プラズマ照射処理を行い（放電時間６０ｍｓ）、既定のＩＬ２濃度の回復培地を３ｍＬ添加した。
ＣＯ２インキュベーターにて４８時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
フローサイトメーターによりＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数を測定し、ＩＬ２非添加群の細胞数を１００として指数で表した。
６ウェルプレートの各ウェルにＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）０．８６×１０６個／ウェル／３ｍＬを播種し、ＩＬ２濃度を０ＩＵ／ｍＬ、２０ＩＵ／ｍＬ、又は３０ＩＵ／ｍＬになるように添加した。
ＣＯ２インキュベーターにてプラズマ照射まで４８～５４時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
プラズマ照射の前に培地／上澄みを排除し、ＥＧＦＰプラスミド（ｐＣＭＶ－ＥＧＦＰ）を規定量添加した。
プラズマ照射処理を行い（放電時間６０ｍｓ）、既定のＩＬ２濃度の回復培地を３ｍＬ添加した。
ＣＯ２インキュベーターにて４８時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
フローサイトメーターによりＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数を測定し、ＩＬ２非添加群の細胞数を１００として指数で表した。
【0084】
〈実験結果〉
結果を表５及び図７に示す。
結果を表５及び図７に示す。
【0085】
【表5】
【0086】
ＩＬ２を添加した実施例５－１及び実施例５－２では、ＩＬ２を添加していない比較例５と比べて、ＧＦＰ導入効率が優れていた。
【0087】
［実験例６］
〈分子導入装置〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
第一電極：φ３の中空パイプ状の電極
電源周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶｐ－ｐ
放電時間：４０ｍｓ
１ウェルあたりの放電箇所：８箇所
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１２ｍｍ
電極端部と容器上面の離間距離：３．０ｍｍ
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
〈分子導入装置〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
第一電極：φ３の中空パイプ状の電極
電源周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶｐ－ｐ
放電時間：４０ｍｓ
１ウェルあたりの放電箇所：８箇所
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１２ｍｍ
電極端部と容器上面の離間距離：３．０ｍｍ
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
【0088】
〈実験手順〉
６ウェルプレートの各ウェルにＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）０．８６×１０６個／ウェル／３ｍＬを播種し、ＩＬ２濃度を０ＩＵ／ｍＬ、２０ＩＵ／ｍＬ、又は３０ＩＵ／ｍＬになるように添加した。
ＣＯ２インキュベーターにてプラズマ照射まで２４～３０時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
プラズマ照射の前に培地／上澄みを排除し、ＥＧＦＰプラスミド（ｐＣＭＶ－ＥＧＦＰ）を規定量添加した。
プラズマ照射処理を行い（放電時間４０ｍｓ）、既定のＩＬ２濃度の回復培地を３ｍＬ添加した。
ＣＯ２インキュベーターにて４８時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
フローサイトメーターによりＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数を測定し、ＩＬ２非添加群の細胞数を１００として指数で表した。
６ウェルプレートの各ウェルにＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）０．８６×１０６個／ウェル／３ｍＬを播種し、ＩＬ２濃度を０ＩＵ／ｍＬ、２０ＩＵ／ｍＬ、又は３０ＩＵ／ｍＬになるように添加した。
ＣＯ２インキュベーターにてプラズマ照射まで２４～３０時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
プラズマ照射の前に培地／上澄みを排除し、ＥＧＦＰプラスミド（ｐＣＭＶ－ＥＧＦＰ）を規定量添加した。
プラズマ照射処理を行い（放電時間４０ｍｓ）、既定のＩＬ２濃度の回復培地を３ｍＬ添加した。
ＣＯ２インキュベーターにて４８時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
フローサイトメーターによりＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数を測定し、ＩＬ２非添加群の細胞数を１００として指数で表した。
【0089】
〈実験結果〉
結果を表６及び図８に示す。
結果を表６及び図８に示す。
【0090】
【表6】
【0091】
ＩＬ２を添加した実施例６では、ＩＬ２を添加していない比較例６と比べて、ＧＦＰ導入効率が優れていた。
【0092】
［実験例７］
〈分子導入装置〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
第一電極：φ３の中空パイプ状の電極
電源周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶｐ－ｐ
放電時間：４０ｍｓ
１ウェルあたりの放電箇所：８箇所
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１２ｍｍ
電極端部と容器上面の離間距離：３．０ｍｍ
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
〈分子導入装置〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
第一電極：φ３の中空パイプ状の電極
電源周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶｐ－ｐ
放電時間：４０ｍｓ
１ウェルあたりの放電箇所：８箇所
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１２ｍｍ
電極端部と容器上面の離間距離：３．０ｍｍ
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
【0093】
〈実験手順〉
６ウェルプレートの各ウェルにＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）０．８６×１０６個／ウェル／３ｍＬを播種し、ＩＬ２濃度を０ＩＵ／ｍＬ、２０ＩＵ／ｍＬ、又は３０ＩＵ／ｍＬになるように添加した。
ＣＯ２インキュベーターにてプラズマ照射まで４８～５４時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
プラズマ照射の前に培地／上澄みを排除し、ＥＧＦＰプラスミド（ｐＣＭＶ－ＥＧＦＰ）を規定量添加した。
プラズマ照射処理を行い（放電時間４０ｍｓ）、既定のＩＬ２濃度の回復培地を３ｍＬ添加した。
ＣＯ２インキュベーターにて４８時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
フローサイトメーターによりＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数を測定し、ＩＬ２非添加群の細胞数を１００として指数で表した。
６ウェルプレートの各ウェルにＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）０．８６×１０６個／ウェル／３ｍＬを播種し、ＩＬ２濃度を０ＩＵ／ｍＬ、２０ＩＵ／ｍＬ、又は３０ＩＵ／ｍＬになるように添加した。
ＣＯ２インキュベーターにてプラズマ照射まで４８～５４時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
プラズマ照射の前に培地／上澄みを排除し、ＥＧＦＰプラスミド（ｐＣＭＶ－ＥＧＦＰ）を規定量添加した。
プラズマ照射処理を行い（放電時間４０ｍｓ）、既定のＩＬ２濃度の回復培地を３ｍＬ添加した。
ＣＯ２インキュベーターにて４８時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
フローサイトメーターによりＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数を測定し、ＩＬ２非添加群の細胞数を１００として指数で表した。
【0094】
〈実験結果〉
結果を表７及び図９に示す。
結果を表７及び図９に示す。
【0095】
【表7】
【0096】
ＩＬ２を添加した実施例７では、ＩＬ２を添加していない比較例７と比べて、ＧＦＰ導入効率が優れていた。
【0097】
［実験例８］
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
第一電極：φ３の中空パイプ状の電極
電源周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶｐ－ｐ
放電時間：４０ｍｓ
１ウェルあたりの放電箇所：８箇所
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１４ｍｍ
電極端部と容器上面の離間距離：１．０ｍｍ
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
第一電極：φ３の中空パイプ状の電極
電源周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶｐ－ｐ
放電時間：４０ｍｓ
１ウェルあたりの放電箇所：８箇所
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１４ｍｍ
電極端部と容器上面の離間距離：１．０ｍｍ
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
【0098】
〈実験手順〉
６ウェルプレートの各ウェルにＪｕｒｋａｔ細胞（ＥＣＡＣＣ製）２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬを播種し、ＩＬ２濃度を０ＩＵ／ｍＬ又は２０ＩＵ／ｍＬになるように添加した。
ＣＯ２インキュベーターにてプラズマ照射まで２４～３０時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
プラズマ照射の前に培地／上澄みを排除し、ＥＧＦＰプラスミド（ｐＣＭＶ－ＥＧＦＰ）を規定量添加した。
プラズマ照射処理を行い（放電時間４０ｍｓ）、ＩＬ２を含まない回復培地を５ｍＬ添加した。
ＣＯ２インキュベーターにて４８時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
フローサイトメーターによりＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数を測定し、ＩＬ２非添加群の細胞数を１００として指数で表した。
６ウェルプレートの各ウェルにＪｕｒｋａｔ細胞（ＥＣＡＣＣ製）２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬを播種し、ＩＬ２濃度を０ＩＵ／ｍＬ又は２０ＩＵ／ｍＬになるように添加した。
ＣＯ２インキュベーターにてプラズマ照射まで２４～３０時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
プラズマ照射の前に培地／上澄みを排除し、ＥＧＦＰプラスミド（ｐＣＭＶ－ＥＧＦＰ）を規定量添加した。
プラズマ照射処理を行い（放電時間４０ｍｓ）、ＩＬ２を含まない回復培地を５ｍＬ添加した。
ＣＯ２インキュベーターにて４８時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
フローサイトメーターによりＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数を測定し、ＩＬ２非添加群の細胞数を１００として指数で表した。
【0099】
〈実験結果〉
結果を表８及び図１０に示す。
結果を表８及び図１０に示す。
【0100】
【表8】
【0101】
ＩＬ２を添加した実施例８では、ＩＬ２を添加していない比較例８と比べて、ＧＦＰ導入効率が優れていた。
【0102】
［実験例９］
〈分子導入装置〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
第一電極：φ３の中空パイプ状の電極
電源周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶｐ－ｐ
放電時間：４０ｍｓ
１ウェルあたりの放電箇所：８箇所
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１４ｍｍ
電極端部と容器上面の離間距離：１．０ｍｍ
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
〈分子導入装置〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
第一電極：φ３の中空パイプ状の電極
電源周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶｐ－ｐ
放電時間：４０ｍｓ
１ウェルあたりの放電箇所：８箇所
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１４ｍｍ
電極端部と容器上面の離間距離：１．０ｍｍ
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
【0103】
〈実験手順〉
６ウェルプレートの各ウェルにＴＨＰ－１細胞（ＡＴＣＣ製）２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬを播種し、ＩＬ２濃度を０ＩＵ／ｍＬ又は２０ＩＵ／ｍＬになるように添加した。
ＣＯ２インキュベーターにてプラズマ照射まで２４～３０時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
プラズマ照射の前に培地／上澄みを排除し、ＥＧＦＰプラスミド（ｐＣＭＶ－ＥＧＦＰ）を規定量添加した。
プラズマ照射処理を行い（放電時間４０ｍｓ）、ＩＬ２を含まない回復培地を５ｍＬ添加した。
ＣＯ２インキュベーターにて４８時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
フローサイトメーターによりＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数を測定し、ＩＬ２非添加群の細胞数を１００として指数で表した。
６ウェルプレートの各ウェルにＴＨＰ－１細胞（ＡＴＣＣ製）２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬを播種し、ＩＬ２濃度を０ＩＵ／ｍＬ又は２０ＩＵ／ｍＬになるように添加した。
ＣＯ２インキュベーターにてプラズマ照射まで２４～３０時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
プラズマ照射の前に培地／上澄みを排除し、ＥＧＦＰプラスミド（ｐＣＭＶ－ＥＧＦＰ）を規定量添加した。
プラズマ照射処理を行い（放電時間４０ｍｓ）、ＩＬ２を含まない回復培地を５ｍＬ添加した。
ＣＯ２インキュベーターにて４８時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
フローサイトメーターによりＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数を測定し、ＩＬ２非添加群の細胞数を１００として指数で表した。
【0104】
〈実験結果〉
結果を表９及び図１１に示す。
結果を表９及び図１１に示す。
【0105】
【表9】
【0106】
ＩＬ２を添加した実施例９では、ＩＬ２を添加していない比較例９と比べて、ＧＦＰ導入効率が優れていた。
【0107】
［実験例１０］
〈分子導入装置〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
第一電極：φ３の中空パイプ状の電極
電源周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶｐ－ｐ
放電時間：４０ｍｓ
１ウェルあたりの放電箇所：８箇所
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１２ｍｍ
電極端部と容器上面の離間距離：３．０ｍｍ
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
〈分子導入装置〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
第一電極：φ３の中空パイプ状の電極
電源周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶｐ－ｐ
放電時間：４０ｍｓ
１ウェルあたりの放電箇所：８箇所
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１２ｍｍ
電極端部と容器上面の離間距離：３．０ｍｍ
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
【0108】
〈実験手順〉
６ウェルプレートの各ウェルにＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）０．８６×１０６個／ウェル／３ｍＬを播種し、ＩＬ２濃度を０ＩＵ／ｍＬ、２０ＩＵ／ｍＬ、又は３０ＩＵ／ｍＬになるように添加した。
ＣＯ２インキュベーターにてプラズマ照射まで２４～３０時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
プラズマ照射の前に培地／上澄みを排除し、ＥＧＦＰプラスミド（ｐＣＭＶ－ＥＧＦＰ）を規定量添加した。
プラズマ照射処理を行い（放電時間４０ｍｓ）、ＩＬ２を含まない回復培地を３ｍＬ添加した。
ＣＯ２インキュベーターにて４８時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
フローサイトメーターによりＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数を測定し、ＩＬ２非添加群の細胞数を１００として指数で表した。
６ウェルプレートの各ウェルにＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）０．８６×１０６個／ウェル／３ｍＬを播種し、ＩＬ２濃度を０ＩＵ／ｍＬ、２０ＩＵ／ｍＬ、又は３０ＩＵ／ｍＬになるように添加した。
ＣＯ２インキュベーターにてプラズマ照射まで２４～３０時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
プラズマ照射の前に培地／上澄みを排除し、ＥＧＦＰプラスミド（ｐＣＭＶ－ＥＧＦＰ）を規定量添加した。
プラズマ照射処理を行い（放電時間４０ｍｓ）、ＩＬ２を含まない回復培地を３ｍＬ添加した。
ＣＯ２インキュベーターにて４８時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
フローサイトメーターによりＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数を測定し、ＩＬ２非添加群の細胞数を１００として指数で表した。
【0109】
〈実験結果〉
結果を表１０及び図１２に示す。
結果を表１０及び図１２に示す。
【0110】
【表10】
【0111】
ＩＬ２を添加した実施例１０では、ＩＬ２を添加していない比較例１０と比べて、ＧＦＰ導入効率が優れていた。
【0112】
［実験例１１］
〈分子導入装置〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
第一電極：φ３の中空パイプ状の電極
電源周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶｐ－ｐ
放電時間：４０ｍｓ
１ウェルあたりの放電箇所：８箇所
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１２ｍｍ
電極端部と容器上面の離間距離：３．０ｍｍ
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
〈分子導入装置〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
第一電極：φ３の中空パイプ状の電極
電源周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶｐ－ｐ
放電時間：４０ｍｓ
１ウェルあたりの放電箇所：８箇所
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１２ｍｍ
電極端部と容器上面の離間距離：３．０ｍｍ
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
【0113】
〈実験手順〉
６ウェルプレートの各ウェルにＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）０．８６×１０６個／ウェル／３ｍＬを播種し、ＩＬ２濃度を０ＩＵ／ｍＬ、２０ＩＵ／ｍＬ、又は３０ＩＵ／ｍＬになるように添加した。
ＣＯ２インキュベーターにてプラズマ照射まで４８～５４時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
プラズマ照射の前に培地／上澄みを排除し、ＥＧＦＰプラスミド（ｐＣＭＶ－ＥＧＦＰ）を規定量添加した。
プラズマ照射処理を行い（放電時間４０ｍｓ）、ＩＬ２を含まない回復培地を３ｍＬ添加した。
ＣＯ２インキュベーターにて４８時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
フローサイトメーターによりＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数を測定し、ＩＬ２非添加群の細胞数を１００として指数で表した。
６ウェルプレートの各ウェルにＨＥＫ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）０．８６×１０６個／ウェル／３ｍＬを播種し、ＩＬ２濃度を０ＩＵ／ｍＬ、２０ＩＵ／ｍＬ、又は３０ＩＵ／ｍＬになるように添加した。
ＣＯ２インキュベーターにてプラズマ照射まで４８～５４時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
プラズマ照射の前に培地／上澄みを排除し、ＥＧＦＰプラスミド（ｐＣＭＶ－ＥＧＦＰ）を規定量添加した。
プラズマ照射処理を行い（放電時間４０ｍｓ）、ＩＬ２を含まない回復培地を３ｍＬ添加した。
ＣＯ２インキュベーターにて４８時間培養した（３７℃、５体積％ＣＯ２濃度）。
フローサイトメーターによりＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数を測定し、ＩＬ２非添加群の細胞数を１００として指数で表した。
【0114】
〈実験結果〉
結果を表１１及び図１３に示す。
結果を表１１及び図１３に示す。
【0115】
【表11】
【0116】
ＩＬ２を添加した実施例１１では、ＩＬ２を添加していない比較例１１と比べて、ＧＦＰ導入効率が優れていた。
【0117】
［実験例１２］
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＨＥＫ２９３Ｆ
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：０．８６×１０６個／ウェル／３ｍＬ
プラズマ照射の２４～４８時間前に播種
ＩＬ２添加量：３．４ＩＵ／ｍＬ又は５．１ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：６０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１２ｍｍ
離間距離：３．０ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＨＥＫ２９３Ｆ
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：０．８６×１０６個／ウェル／３ｍＬ
プラズマ照射の２４～４８時間前に播種
ＩＬ２添加量：３．４ＩＵ／ｍＬ又は５．１ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：６０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１２ｍｍ
離間距離：３．０ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
【0118】
〈実験手順〉
（１）６ウェルプレートの各ウェルに細胞を上記個数播種し、ＩＬ２を上記濃度となるように添加した。
（２）ＣＯ２インキュベーターにてプラズマ照射まで培養した。
（３）プラズマ照射の前に培地／上澄みを排除し、１μｇ／μＬに調整したＤＮＡを規定量添加し、３分間静置した。
（４）プラズマ照射処理を行い、３分間静置した。
（５－１）前処理のみの場合、静置後、ＩＬ２を含まない回復培地を添加した。
（５－２）前後処理の場合、静置後、規定のＩＬ２濃度の回復培地を添加した。
（６）ＣＯ２インキュベーターにて４８時間培養した。
（７）フローサイトメーターによりＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数を測定し、ＩＬ２非添加群の結果で標準化した。
（１）６ウェルプレートの各ウェルに細胞を上記個数播種し、ＩＬ２を上記濃度となるように添加した。
（２）ＣＯ２インキュベーターにてプラズマ照射まで培養した。
（３）プラズマ照射の前に培地／上澄みを排除し、１μｇ／μＬに調整したＤＮＡを規定量添加し、３分間静置した。
（４）プラズマ照射処理を行い、３分間静置した。
（５－１）前処理のみの場合、静置後、ＩＬ２を含まない回復培地を添加した。
（５－２）前後処理の場合、静置後、規定のＩＬ２濃度の回復培地を添加した。
（６）ＣＯ２インキュベーターにて４８時間培養した。
（７）フローサイトメーターによりＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数を測定し、ＩＬ２非添加群の結果で標準化した。
【0119】
〈実験結果〉
結果を表１２及び図１４に示す。
結果を表１２及び図１４に示す。
【0120】
【表12】
【0121】
ＩＬ２を添加した実施例１２－１及び実施例１２－２では、ＩＬ２を添加していない比較例１２と比べて、ＧＦＰ導入効率が優れていた。
【0122】
［実験例１３］
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＨＥＫ２９３Ｆ
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：０．８６×１０６個／ウェル／３ｍＬ
プラズマ照射の２４～４８時間前に播種
ＩＬ２添加量：３．４ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：４０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１２ｍｍ
離間距離：３．０ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＨＥＫ２９３Ｆ
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：０．８６×１０６個／ウェル／３ｍＬ
プラズマ照射の２４～４８時間前に播種
ＩＬ２添加量：３．４ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：４０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１２ｍｍ
離間距離：３．０ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
【0123】
〈実験手順〉
条件を上記のとおり変更した他は実験例１２と同様にして実験を行った。
条件を上記のとおり変更した他は実験例１２と同様にして実験を行った。
【0124】
〈実験結果〉
結果を表１３及び図１５に示す。
結果を表１３及び図１５に示す。
【0125】
【表13】
【0126】
ＩＬ２を添加した実施例１３では、ＩＬ２を添加していない比較例１３と比べて、ＧＦＰ導入効率が優れていた。
【0127】
［実験例１４］
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＨＥＫ２９３Ｆ
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：０．８６×１０６個／ウェル／３ｍＬ
プラズマ照射の４８～５４時間前に播種
ＩＬ２添加量：３．４ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：４０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１２ｍｍ
離間距離：３ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＨＥＫ２９３Ｆ
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：０．８６×１０６個／ウェル／３ｍＬ
プラズマ照射の４８～５４時間前に播種
ＩＬ２添加量：３．４ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：４０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１２ｍｍ
離間距離：３ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
【0128】
〈実験手順〉
条件を上記のとおり変更した他は実験例１２と同様にして実験を行った。
条件を上記のとおり変更した他は実験例１２と同様にして実験を行った。
【0129】
〈実験結果〉
結果を表１４及び図１６に示す。
結果を表１４及び図１６に示す。
【0130】
【表14】
【0131】
ＩＬ２を添加した実施例１４では、ＩＬ２を添加していない比較例１４と比べて、ＧＦＰ導入効率が優れていた。
【0132】
［実験例１５］
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＨＥＫ２９３Ｆ
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：０．８６×１０６個／ウェル／３ｍＬ
プラズマ照射の２４～３０時間前に播種
ＩＬ４添加量：０．５ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：４０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１２ｍｍ
離間距離：３．０ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＨＥＫ２９３Ｆ
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：０．８６×１０６個／ウェル／３ｍＬ
プラズマ照射の２４～３０時間前に播種
ＩＬ４添加量：０．５ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：４０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１２ｍｍ
離間距離：３．０ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
【0133】
〈実験手順〉
条件を上記のとおり変更した他は実験例１２と同様にして実験を行った。
条件を上記のとおり変更した他は実験例１２と同様にして実験を行った。
【0134】
〈実験結果〉
結果を表１５及び図１７に示す。
結果を表１５及び図１７に示す。
【0135】
【表15】
【0136】
ＩＬ４を添加した実施例１５では、ＩＬ４を添加していない比較例１５と比べて、ＧＦＰ導入効率が優れていた。
【0137】
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＨＥＫ２９３Ｆ
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：０．８６×１０６個／ウェル／３ｍＬ
プラズマ照射の２４～３０時間前に播種
ＩＬ７添加量：０．４ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：４０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１２ｍｍ
離間距離：３．０ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＨＥＫ２９３Ｆ
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：０．８６×１０６個／ウェル／３ｍＬ
プラズマ照射の２４～３０時間前に播種
ＩＬ７添加量：０．４ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：４０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１２ｍｍ
離間距離：３．０ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
【0138】
〈実験手順〉
条件を上記のとおり変更した他は実験例１２と同様にして実験を行った。
条件を上記のとおり変更した他は実験例１２と同様にして実験を行った。
【0139】
〈実験結果〉
結果を表１６及び図１８に示す。
結果を表１６及び図１８に示す。
【0140】
【表16】
【0141】
ＩＬ７を添加した実施例１６では、ＩＬ４を添加していない比較例１６と比べて、ＧＦＰ導入効率が優れていた。
【0142】
［実験例１７］
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＨＥＫ２９３Ｆ
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：０．８６×１０６個／ウェル／３ｍＬ
プラズマ照射の２４～３０時間前に播種
ＩＬ２添加量：３．４ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：４０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１２ｍｍ
離間距離：３．０ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＨＥＫ２９３Ｆ
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：０．８６×１０６個／ウェル／３ｍＬ
プラズマ照射の２４～３０時間前に播種
ＩＬ２添加量：３．４ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：４０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１２ｍｍ
離間距離：３．０ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
【0143】
〈実験手順〉
条件を上記のとおり変更した他は実験例１２と同様にして実験を行った。
条件を上記のとおり変更した他は実験例１２と同様にして実験を行った。
【0144】
〈実験結果〉
結果を表１７及び図１９に示す。
結果を表１７及び図１９に示す。
【0145】
【表17】
【0146】
ＩＬ２を添加した実施例１７では、ＩＬ２を添加していない比較例１７と比べて、ＧＦＰ導入効率が優れていた。
【0147】
［実験例１８］
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＨＥＫ２９３Ｆ
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：０．８６×１０６個／ウェル／３ｍＬ
プラズマ照射の４８～５４時間前に播種
ＩＬ２添加量：３．４ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：４０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１２ｍｍ
離間距離：３．０ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＨＥＫ２９３Ｆ
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：０．８６×１０６個／ウェル／３ｍＬ
プラズマ照射の４８～５４時間前に播種
ＩＬ２添加量：３．４ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：４０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１２ｍｍ
離間距離：３．０ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
【0148】
〈実験手順〉
条件を上記のとおり変更した他は実験例１２と同様にして実験を行った。
条件を上記のとおり変更した他は実験例１２と同様にして実験を行った。
【0149】
〈実験結果〉
結果を表１８及び図２０に示す。
結果を表１８及び図２０に示す。
【0150】
【表18】
【0151】
ＩＬ２を添加した実施例１８では、ＩＬ２を添加していない比較例１８と比べて、ＧＦＰ導入効率が優れていた。
【0152】
［実験例１９］
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＨＥＫ２９３Ｆ
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：０．８６×１０６個／ウェル／３ｍＬ
プラズマ照射の２４～３０時間前に播種
ＩＬ３添加量：２．０ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：４０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１２ｍｍ
離間距離：３．０ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＨＥＫ２９３Ｆ
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：０．８６×１０６個／ウェル／３ｍＬ
プラズマ照射の２４～３０時間前に播種
ＩＬ３添加量：２．０ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：４０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１２ｍｍ
離間距離：３．０ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
【0153】
〈実験手順〉
条件を上記のとおり変更した他は実験例１２と同様にして実験を行った。
条件を上記のとおり変更した他は実験例１２と同様にして実験を行った。
【0154】
〈実験結果〉
結果を表１９及び図２１に示す。
結果を表１９及び図２１に示す。
【0155】
【表19】
【0156】
ＩＬ３を添加した実施例１９では、ＩＬ３を添加していない比較例１９と比べて、ＧＦＰ導入効率が優れていた。
【0157】
［実験例２０］
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＨＥＫ２９３Ｆ
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：０．８６×１０６個／ウェル／３ｍＬ
プラズマ照射の２４～３０時間前に播種
ＩＬ４添加量：０．５ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：４０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１２ｍｍ
離間距離：３．０ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＨＥＫ２９３Ｆ
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：０．８６×１０６個／ウェル／３ｍＬ
プラズマ照射の２４～３０時間前に播種
ＩＬ４添加量：０．５ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：４０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１２ｍｍ
離間距離：３．０ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
【0158】
〈実験手順〉
条件を上記のとおり変更した他は実験例１２と同様にして実験を行った。
条件を上記のとおり変更した他は実験例１２と同様にして実験を行った。
【0159】
〈実験結果〉
結果を表２０及び図２２に示す。
結果を表２０及び図２２に示す。
【0160】
【表20】
【0161】
ＩＬ４を添加した実施例２０では、ＩＬ２を添加していない比較例２０と比べて、ＧＦＰ導入効率が優れていた。
【0162】
［実験例２１］
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＨｕＴ－７８
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬ
プラズマ照射の２４～３０時間前に播種
ＩＬ２添加量：１．７ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：４０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１２ｍｍ
離間距離：１．０ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＨｕＴ－７８
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬ
プラズマ照射の２４～３０時間前に播種
ＩＬ２添加量：１．７ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：４０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１２ｍｍ
離間距離：１．０ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
【0163】
〈実験手順〉
（１）６ウェルプレートの各ウェルに細胞を上記個数播種し、ＩＬ２を上記濃度となるように添加した。
（２）ＣＯ２インキュベーターにてプラズマ照射まで培養した。
（３）プラズマ照射の前に培地／上澄みを排除し、１μｇ／μＬに調整したＤＮＡを規定量添加し、３分間静置した。
（４）プラズマ照射処理を行い、３分間静置した。
（５－１）前処理のみの場合、静置後、ＩＬ２を含まない回復培地を添加した。
（５－２）前後処理の場合、静置後、規定のＩＬ２濃度の回復培地を添加した。
（６）ＣＯ２インキュベーターにて４８時間培養した。
（７）フローサイトメーターによりＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数を測定し、ＩＬ２非添加群の結果で標準化した。
（１）６ウェルプレートの各ウェルに細胞を上記個数播種し、ＩＬ２を上記濃度となるように添加した。
（２）ＣＯ２インキュベーターにてプラズマ照射まで培養した。
（３）プラズマ照射の前に培地／上澄みを排除し、１μｇ／μＬに調整したＤＮＡを規定量添加し、３分間静置した。
（４）プラズマ照射処理を行い、３分間静置した。
（５－１）前処理のみの場合、静置後、ＩＬ２を含まない回復培地を添加した。
（５－２）前後処理の場合、静置後、規定のＩＬ２濃度の回復培地を添加した。
（６）ＣＯ２インキュベーターにて４８時間培養した。
（７）フローサイトメーターによりＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数を測定し、ＩＬ２非添加群の結果で標準化した。
【0164】
〈実験結果〉
結果を表２１及び図２３に示す。
結果を表２１及び図２３に示す。
【0165】
【表21】
【0166】
ＩＬ２を添加した実施例２１では、ＩＬ２を添加していない比較例２１と比べて、ＧＦＰ導入効率が優れていた。
【0167】
［実験例２２］
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＨｕＴ－７８
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬ
プラズマ照射の２４～３０時間前に播種
ＩＬ５添加量：１．３ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：４０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１２ｍｍ
離間距離：１．０ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＨｕＴ－７８
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬ
プラズマ照射の２４～３０時間前に播種
ＩＬ５添加量：１．３ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：４０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１２ｍｍ
離間距離：１．０ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
【0168】
〈実験手順〉
条件を上記のとおり変更した他は実験例２１と同様にして実験を行った。
条件を上記のとおり変更した他は実験例２１と同様にして実験を行った。
【0169】
〈実験結果〉
結果を表２２及び図２４に示す。
結果を表２２及び図２４に示す。
【0170】
【表22】
【0171】
ＩＬ５を添加した実施例２２では、ＩＬ５を添加していない比較例２２と比べて、ＧＦＰ導入効率が優れていた。
【0172】
［実験例２３］
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＨｕＴ－７８
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬ
プラズマ照射の２４～３０時間前に播種
ＩＬ７添加量：０．２ＩＵ／ｍＬ又は０．４ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：４０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１２ｍｍ
離間距離：１．０ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＨｕＴ－７８
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬ
プラズマ照射の２４～３０時間前に播種
ＩＬ７添加量：０．２ＩＵ／ｍＬ又は０．４ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：４０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１２ｍｍ
離間距離：１．０ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
【0173】
〈実験手順〉
条件を上記のとおり変更した他は実験例２１と同様にして実験を行った。
条件を上記のとおり変更した他は実験例２１と同様にして実験を行った。
【0174】
〈実験結果〉
結果を表２３及び図２５に示す。
結果を表２３及び図２５に示す。
【0175】
【表23】
【0176】
ＩＬ７を添加した実施例２３－１及び実施例２３－２では、ＩＬ７を添加していない比較例２３と比べて、ＧＦＰ導入効率が優れていた。
【0177】
［実験例２４］
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＨｕＴ－７８
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬ
プラズマ照射の２４～３０時間前に播種
ＩＬ１５添加量：０．２ＩＵ／ｍＬ又は０．４ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：４０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１２ｍｍ
離間距離：１．０ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＨｕＴ－７８
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬ
プラズマ照射の２４～３０時間前に播種
ＩＬ１５添加量：０．２ＩＵ／ｍＬ又は０．４ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：４０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１２ｍｍ
離間距離：１．０ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
【0178】
〈実験手順〉
条件を上記のとおり変更した他は実験例２１と同様にして実験を行った。
条件を上記のとおり変更した他は実験例２１と同様にして実験を行った。
【0179】
〈実験結果〉
結果を表２４及び図２６に示す。
結果を表２４及び図２６に示す。
【0180】
【表24】
【0181】
ＩＬ５を添加した実施例２４－１及び実施例２４－２では、ＩＬ５を添加していない比較例２４と比べて、ＧＦＰ導入効率が優れていた。
【0182】
［実験例２５］
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＨｕＴ－７８
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬ
プラズマ照射の２４～３０時間前に播種
ＩＬ５添加量：２ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：４０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１２ｍｍ
離間距離：１．０ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＨｕＴ－７８
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬ
プラズマ照射の２４～３０時間前に播種
ＩＬ５添加量：２ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：４０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１２ｍｍ
離間距離：１．０ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
【0183】
〈実験手順〉
条件を上記のとおり変更した他は実験例２１と同様にして実験を行った。
条件を上記のとおり変更した他は実験例２１と同様にして実験を行った。
【0184】
〈実験結果〉
結果を表２５及び図２７に示す。
結果を表２５及び図２７に示す。
【0185】
【表25】
【0186】
ＩＬ３を添加した実施例２５では、ＩＬ３を添加していない比較例２５と比べて、ＧＦＰ導入効率が優れていた。
【0187】
［実験例２６］
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＨｕＴ－７８
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬ
プラズマ照射の２４～３０時間前に播種
ＩＬ５添加量：０．６６Ｕ／ｍＬ又は１．３ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：４０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１２ｍｍ
離間距離：１．０ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＨｕＴ－７８
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬ
プラズマ照射の２４～３０時間前に播種
ＩＬ５添加量：０．６６Ｕ／ｍＬ又は１．３ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：４０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１２ｍｍ
離間距離：１．０ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
【0188】
〈実験手順〉
条件を上記のとおり変更した他は実験例２１と同様にして実験を行った。
条件を上記のとおり変更した他は実験例２１と同様にして実験を行った。
【0189】
〈実験結果〉
結果を表２６及び図２８に示す。
結果を表２６及び図２８に示す。
【0190】
【表26】
【0191】
ＩＬ５を添加した実施例２６－１及び実施例２６－２では、ＩＬ５を添加していない比較例２６と比べて、ＧＦＰ導入効率が優れていた。
【0192】
［実験例２７］
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＨｕＴ－７８
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬ
プラズマ照射の２４～３０時間前に播種
ＩＬ５添加量：０．２ＩＵ／ｍＬ又は０．４ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：４０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１２ｍｍ
離間距離：１．０ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＨｕＴ－７８
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬ
プラズマ照射の２４～３０時間前に播種
ＩＬ５添加量：０．２ＩＵ／ｍＬ又は０．４ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：４０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１２ｍｍ
離間距離：１．０ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
【0193】
〈実験手順〉
条件を上記のとおり変更した他は実験例２１と同様にして実験を行った。
条件を上記のとおり変更した他は実験例２１と同様にして実験を行った。
【0194】
〈実験結果〉
結果を表２７及び図２９に示す。
結果を表２７及び図２９に示す。
【0195】
【表27】
【0196】
ＩＬ７を添加した実施例２７－１及び実施例２７－２では、ＩＬ７を添加していない比較例２７と比べて、ＧＦＰ導入効率が優れていた。
【0197】
［実験例２８］
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＨｕＴ－７８
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬ
プラズマ照射の２４～３０時間前に播種
ＩＬ１５添加量：０．２ＩＵ／ｍＬ又は０．４ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：４０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１２ｍｍ
離間距離：１．０ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＨｕＴ－７８
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬ
プラズマ照射の２４～３０時間前に播種
ＩＬ１５添加量：０．２ＩＵ／ｍＬ又は０．４ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：４０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１２ｍｍ
離間距離：１．０ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
【0198】
〈実験手順〉
条件を上記のとおり変更した他は実験例２１と同様にして実験を行った。
条件を上記のとおり変更した他は実験例２１と同様にして実験を行った。
【0199】
〈実験結果〉
結果を表２８及び図３０に示す。
結果を表２８及び図３０に示す。
【0200】
【表28】
【0201】
ＩＬ１５を添加した実施例２８－１及び実施例２８－２では、ＩＬ１５を添加していない比較例２８と比べて、ＧＦＰ導入効率が優れていた。
【0202】
［実験例２９］
【0203】
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：Ｊｕｒｋａｔ
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬ
プラズマ照射の２４～３０時間前に播種
ＩＬ２添加量：３．４ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：２０ｍｓ又は４０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１４ｍｍ
離間距離：０．５ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：Ｊｕｒｋａｔ
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬ
プラズマ照射の２４～３０時間前に播種
ＩＬ２添加量：３．４ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：２０ｍｓ又は４０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１４ｍｍ
離間距離：０．５ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
【0204】
〈実験手順〉
（１）６ウェルプレートの各ウェルに細胞を上記個数播種し、ＩＬ２を上記濃度となるように添加した。
（２）ＣＯ２インキュベーターにてプラズマ照射まで培養した。
（３）プラズマ照射の前に培地／上澄みを排除し、１μｇ／μＬに調整したＤＮＡを規定量添加し、３分間静置した。
（４）プラズマ照射処理を行い、３分間静置した。
（５－１）前処理のみの場合、静置後、ＩＬ２を含まない回復培地を添加した。
（５－２）前後処理の場合、静置後、規定のＩＬ２濃度の回復培地を添加した。
（６）ＣＯ２インキュベーターにて４８時間培養した。
（７）フローサイトメーターによりＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数を測定し、ＩＬ２非添加群の結果で標準化した。
（１）６ウェルプレートの各ウェルに細胞を上記個数播種し、ＩＬ２を上記濃度となるように添加した。
（２）ＣＯ２インキュベーターにてプラズマ照射まで培養した。
（３）プラズマ照射の前に培地／上澄みを排除し、１μｇ／μＬに調整したＤＮＡを規定量添加し、３分間静置した。
（４）プラズマ照射処理を行い、３分間静置した。
（５－１）前処理のみの場合、静置後、ＩＬ２を含まない回復培地を添加した。
（５－２）前後処理の場合、静置後、規定のＩＬ２濃度の回復培地を添加した。
（６）ＣＯ２インキュベーターにて４８時間培養した。
（７）フローサイトメーターによりＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数を測定し、ＩＬ２非添加群の結果で標準化した。
【0205】
〈実験結果〉
結果を表２９及び図３１に示す。
結果を表２９及び図３１に示す。
【0206】
【表29】
【0207】
ＩＬ２を添加した実施例２９－１及び実施例２９－２では、ＩＬ２を添加していない比較例２９と比べて、ＧＦＰ導入効率が優れていた。
【0208】
［実験例３０］
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：Ｊｕｒｋａｔ
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬ
プラズマ照射の２４～３０時間前に播種
ＩＬ２添加量：３．４ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：４０ｍｓ又は６０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１４ｍｍ
離間距離：１．０ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：Ｊｕｒｋａｔ
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬ
プラズマ照射の２４～３０時間前に播種
ＩＬ２添加量：３．４ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：４０ｍｓ又は６０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１４ｍｍ
離間距離：１．０ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
【0209】
〈実験手順〉
条件を上記のとおり変更した他は実験例２９と同様にして実験を行った。
条件を上記のとおり変更した他は実験例２９と同様にして実験を行った。
【0210】
〈実験結果〉
結果を表３０及び図３２に示す。
結果を表３０及び図３２に示す。
【0211】
【表30】
【0212】
ＩＬ２を添加した実施例３０－１及び実施例３０－２では、ＩＬ２を添加していない比較例３０と比べて、ＧＦＰ導入効率が優れていた。
【0213】
［実験例３１］
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：Ｊｕｒｋａｔ
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬ
プラズマ照射の２４～３０時間前に播種
ＩＬ２添加量：３．４ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：４０ｍｓ又は６０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１４ｍｍ
離間距離：１．０ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：Ｊｕｒｋａｔ
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬ
プラズマ照射の２４～３０時間前に播種
ＩＬ２添加量：３．４ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：４０ｍｓ又は６０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１４ｍｍ
離間距離：１．０ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
【0214】
〈実験手順〉
条件を上記のとおり変更した他は実験例２９と同様にして実験を行った。
条件を上記のとおり変更した他は実験例２９と同様にして実験を行った。
【0215】
〈実験結果〉
結果を表３１及び図３３に示す。
結果を表３１及び図３３に示す。
【0216】
【表31】
【0217】
ＩＬ２を添加した実施例３１では、ＩＬ２を添加していない比較例３１と比べて、ＧＦＰ導入効率が優れていた。
【0218】
［実験例３２］
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：Ｊｕｒｋａｔ
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬ
プラズマ照射の２４～３０時間前に播種
ＩＬ２添加量：３．４ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：４０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１４ｍｍ
離間距離：１．０ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：Ｊｕｒｋａｔ
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬ
プラズマ照射の２４～３０時間前に播種
ＩＬ２添加量：３．４ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：４０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１４ｍｍ
離間距離：１．０ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
【0219】
〈実験手順〉
条件を上記のとおり変更した他は実験例２９と同様にして実験を行った。
条件を上記のとおり変更した他は実験例２９と同様にして実験を行った。
【0220】
〈実験結果〉
結果を表３２及び図３４に示す。
結果を表３２及び図３４に示す。
【0221】
【表32】
【0222】
ＩＬ２を添加した実施例３２では、ＩＬ２を添加していない比較例３２と比べて、ＧＦＰ導入効率が優れていた。
【0223】
［実験例３３］
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＳＵＰ－Ｔ１
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬ
プラズマ照射の２４～３０時間前に播種
ＩＬ２添加量：３．４ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：４０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１４ｍｍ
離間距離：１．０ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＳＵＰ－Ｔ１
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬ
プラズマ照射の２４～３０時間前に播種
ＩＬ２添加量：３．４ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：４０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１４ｍｍ
離間距離：１．０ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
【0224】
〈実験手順〉
（１）６ウェルプレートの各ウェルに細胞を上記個数播種し、ＩＬ２を上記濃度となるように添加した。
（２）ＣＯ２インキュベーターにてプラズマ照射まで培養した。
（３）プラズマ照射の前に培地／上澄みを排除し、１μｇ／μＬに調整したＤＮＡを規定量添加し、３分間静置した。
（４）プラズマ照射処理を行い、３分間静置した。
（５－１）前処理のみの場合、静置後、ＩＬ２を含まない回復培地を添加した。
（５－２）前後処理の場合、静置後、規定のＩＬ２濃度の回復培地を添加した。
（６）ＣＯ２インキュベーターにて４８時間培養した。
（７）フローサイトメーターによりＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数を測定し、ＩＬ２非添加群の結果で標準化した。
（１）６ウェルプレートの各ウェルに細胞を上記個数播種し、ＩＬ２を上記濃度となるように添加した。
（２）ＣＯ２インキュベーターにてプラズマ照射まで培養した。
（３）プラズマ照射の前に培地／上澄みを排除し、１μｇ／μＬに調整したＤＮＡを規定量添加し、３分間静置した。
（４）プラズマ照射処理を行い、３分間静置した。
（５－１）前処理のみの場合、静置後、ＩＬ２を含まない回復培地を添加した。
（５－２）前後処理の場合、静置後、規定のＩＬ２濃度の回復培地を添加した。
（６）ＣＯ２インキュベーターにて４８時間培養した。
（７）フローサイトメーターによりＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数を測定し、ＩＬ２非添加群の結果で標準化した。
【0225】
〈実験結果〉
結果を表３３及び図３５に示す。
結果を表３３及び図３５に示す。
【0226】
【表33】
【0227】
ＩＬ２を添加した実施例３３では、ＩＬ２を添加していない比較例３３と比べて、ＧＦＰ導入効率が優れていた。
【0228】
［実験例３４］
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＴＨＰ－１
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬ
プラズマ照射の２４～３０時間前に播種
ＩＬ２添加量：３．４ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：４０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１４ｍｍ
離間距離：１．０ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＴＨＰ－１
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬ
プラズマ照射の２４～３０時間前に播種
ＩＬ２添加量：３．４ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：４０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１４ｍｍ
離間距離：１．０ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
【0229】
〈実験手順〉
（１）６ウェルプレートの各ウェルに細胞を上記個数播種し、ＩＬ２を上記濃度となるように添加した。
（２）ＣＯ２インキュベーターにてプラズマ照射まで培養した。
（３）プラズマ照射の前に培地／上澄みを排除し、１μｇ／μＬに調整したＤＮＡを規定量添加し、３分間静置した。
（４）プラズマ照射処理を行い、３分間静置した。
（５－１）前処理のみの場合、静置後、ＩＬ２を含まない回復培地を添加した。
（５－２）前後処理の場合、静置後、規定のＩＬ２濃度の回復培地を添加した。
（６）ＣＯ２インキュベーターにて４８時間培養した。
（７）フローサイトメーターによりＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数を測定し、ＩＬ２非添加群の結果で標準化した。
（１）６ウェルプレートの各ウェルに細胞を上記個数播種し、ＩＬ２を上記濃度となるように添加した。
（２）ＣＯ２インキュベーターにてプラズマ照射まで培養した。
（３）プラズマ照射の前に培地／上澄みを排除し、１μｇ／μＬに調整したＤＮＡを規定量添加し、３分間静置した。
（４）プラズマ照射処理を行い、３分間静置した。
（５－１）前処理のみの場合、静置後、ＩＬ２を含まない回復培地を添加した。
（５－２）前後処理の場合、静置後、規定のＩＬ２濃度の回復培地を添加した。
（６）ＣＯ２インキュベーターにて４８時間培養した。
（７）フローサイトメーターによりＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数を測定し、ＩＬ２非添加群の結果で標準化した。
【0230】
〈実験結果〉
結果を表３４及び図３６に示す。
結果を表３４及び図３６に示す。
【0231】
【表34】
【0232】
ＩＬ２を添加した実施例３４では、ＩＬ２を添加していない比較例３４と比べて、ＧＦＰ導入効率が優れていた。
【0233】
［実験例３５］
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＴＨＰ－１
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬ
プラズマ照射の２４～３０時間前に播種
ＩＬ２添加量：３．４ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：４０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１４ｍｍ
離間距離：１．０ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＴＨＰ－１
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬ
プラズマ照射の２４～３０時間前に播種
ＩＬ２添加量：３．４ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：４０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１４ｍｍ
離間距離：１．０ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
【0234】
〈実験手順〉
条件を上記のとおり変更した他は実験例３４と同様にして実験を行った。
条件を上記のとおり変更した他は実験例３４と同様にして実験を行った。
【0235】
〈実験結果〉
結果を表３５及び図３７に示す。
結果を表３５及び図３７に示す。
【0236】
【表35】
【0237】
ＩＬ２を添加した実施例３５では、ＩＬ２を添加していない比較例３５と比べて、ＧＦＰ導入効率が優れていた。
【0238】
［実験例３６］
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＴＨＰ－１
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬ
プラズマ照射の２４～３０時間前に播種
ＩＬ２添加量：１．０ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：４０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１４ｍｍ
離間距離：１．０ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＴＨＰ－１
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬ
プラズマ照射の２４～３０時間前に播種
ＩＬ２添加量：１．０ＩＵ／ｍＬ
（プラズマ照射条件）
電極：φ３円環
周波数：５０ｋＨｚ
放電電圧：１６ｋＶ
放電時間：４０ｍｓ
照射回数：８発
ｒ２（照射容器における中心からプラズマ照射箇所の距離）：１４ｍｍ
離間距離：１．０ｍｍ
照射前後静置時間：３分
ＤＮＡ（ＧＦＰ）量：５７．５μｇ
【0239】
〈実験手順〉
条件を上記のとおり変更した他は実験例３４と同様にして実験を行った。
条件を上記のとおり変更した他は実験例３４と同様にして実験を行った。
【0240】
〈実験結果〉
結果を表３６及び図３８に示す。
結果を表３６及び図３８に示す。
【0241】
【表36】
【0242】
ＩＬ４を添加した実施例３６では、ＩＬ４を添加していない比較例３６と比べて、ＧＦＰ導入効率が優れていた。
【0243】
［実験例３７］
【0244】
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＴＨＰ－１
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬ
ＤＮＡ複合体添加の３０時間前に播種
ＩＬ２添加量：３．４ＩＵ／ｍＬ
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＴＨＰ－１
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬ
ＤＮＡ複合体添加の３０時間前に播種
ＩＬ２添加量：３．４ＩＵ／ｍＬ
【0245】
〈実験手順〉
（１）２４ウェル又は６ウェルプレートの各ウェルに細胞を播種し、ＩＬ２を上記濃度となるように添加した。
（２）ＣＯ２インキュベーターにてリポフェクションまで３０時間培養した。
（３－１）前処理のみの場合、各ウェルの細胞を遠心により洗浄し、ＩＬ２を含まない培地で再懸濁した。
（３－２）前後処理の場合、遠心、洗浄を行わず次の操作に移行した。
（４）製造社提供リポフェクションキットのプロトコール通りにＤＮＡ複合体を供した。
（５）ＣＯ２インキュベーターにて２４～４８時間培養した。
（６）フローサイトメーターによりＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数を測定し、ＩＬ２非添加群の結果で標準化した。
（１）２４ウェル又は６ウェルプレートの各ウェルに細胞を播種し、ＩＬ２を上記濃度となるように添加した。
（２）ＣＯ２インキュベーターにてリポフェクションまで３０時間培養した。
（３－１）前処理のみの場合、各ウェルの細胞を遠心により洗浄し、ＩＬ２を含まない培地で再懸濁した。
（３－２）前後処理の場合、遠心、洗浄を行わず次の操作に移行した。
（４）製造社提供リポフェクションキットのプロトコール通りにＤＮＡ複合体を供した。
（５）ＣＯ２インキュベーターにて２４～４８時間培養した。
（６）フローサイトメーターによりＧＦＰの蛍光が陽性を示す細胞数を測定し、ＩＬ２非添加群の結果で標準化した。
【0246】
〈実験結果〉
結果を表３７及び図３９に示す。
結果を表３７及び図３９に示す。
【0247】
【表37】
【0248】
ＩＬ２を添加した実施例３７では、ＩＬ２を添加していない比較例３７と比べて、ＧＦＰ導入効率が優れていた。
【0249】
［実験例３８］
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：Ｊｕｒｋａｔ
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬ
ＤＮＡ複合体添加の３０時間前に播種
ＩＬ２添加量：３．４ＩＵ／ｍＬ
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：Ｊｕｒｋａｔ
（播種条件）
スケール：６ウェルプレート
播種量：２．０×１０６個／ウェル／５ｍＬ
ＤＮＡ複合体添加の３０時間前に播種
ＩＬ２添加量：３．４ＩＵ／ｍＬ
【0250】
〈実験手順〉
条件を上記のとおり変更した他は実験例３７と同様にして実験を行った。
条件を上記のとおり変更した他は実験例３７と同様にして実験を行った。
【0251】
〈実験結果〉
結果を表３８及び図４０に示す。
結果を表３８及び図４０に示す。
【0252】
【表38】
【0253】
ＩＬ２を添加した実施例３８では、ＩＬ２を添加していない比較例３８と比べて、ＧＦＰ導入効率が優れていた。
【0254】
［実験例３９］
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＨｕＴ－７８
（播種条件）
スケール：２４ウェルプレート
播種量：２．０×１０５個／ウェル／０．５ｍＬ
ＤＮＡ複合体添加の３０時間前に播種
ＩＬ３添加量：２ＩＵ／ｍＬ
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＨｕＴ－７８
（播種条件）
スケール：２４ウェルプレート
播種量：２．０×１０５個／ウェル／０．５ｍＬ
ＤＮＡ複合体添加の３０時間前に播種
ＩＬ３添加量：２ＩＵ／ｍＬ
【0255】
〈実験手順〉
条件を上記のとおり変更した他は実験例３７と同様にして実験を行った。
条件を上記のとおり変更した他は実験例３７と同様にして実験を行った。
【0256】
〈実験結果〉
結果を表３９及び図４１に示す。
結果を表３９及び図４１に示す。
【0257】
【表39】
【0258】
ＩＬ３を添加した実施例３９－１及び実施例３９－２では、ＩＬ３を添加していない比較例３９と比べて、ＧＦＰ導入効率が優れていた。
【0259】
［実験例４０］
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＨｕＴ－７８
（播種条件）
スケール：２４ウェルプレート
播種量：２．０×１０５個／ウェル／０．５ｍＬ
ＤＮＡ複合体添加の３０時間前に播種
Ｌ７添加量：０．４ＩＵ／ｍＬ
〈装置及び条件〉
図１に概要を示す分子導入装置を用いた。
細胞：ＨｕＴ－７８
（播種条件）
スケール：２４ウェルプレート
播種量：２．０×１０５個／ウェル／０．５ｍＬ
ＤＮＡ複合体添加の３０時間前に播種
Ｌ７添加量：０．４ＩＵ／ｍＬ
【0260】
〈実験手順〉
条件を上記のとおり変更した他は実験例３７と同様にして実験を行った。
条件を上記のとおり変更した他は実験例３７と同様にして実験を行った。
【0261】
〈実験結果〉
結果を表４０及び図４２に示す。
結果を表４０及び図４２に示す。
【0262】
【表40】
【0263】
ＩＬ７を添加した実施例４０では、ＩＬ７を添加していない比較例４０と比べて、ＧＦＰ導入効率が優れていた。
【0264】
［配列一覧］
本明細書において参照した配列を以下に示す。
本明細書において参照した配列を以下に示す。
【0265】
【表41】
【符号の説明】
【0266】
１ 分子導入装置
１０ 第一電極
１２ 電極本体
１４ 照射体
１６ 壁部
２０ 第二電極
３０ 給電部
４０ 容器
４２ 分子
４４ 標的細胞
Ｏ１ 管軸
θ１ 角度
１０ 第一電極
１２ 電極本体
１４ 照射体
１６ 壁部
２０ 第二電極
３０ 給電部
４０ 容器
４２ 分子
４４ 標的細胞
Ｏ１ 管軸
θ１ 角度
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【配列表】