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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024099505
(43)【公開日】2024-07-25
(54)【発明の名称】重炭酸イオン受容体
(51)【国際特許分類】
A01K 67/0276 20240101AFI20240718BHJP
C12Q 1/02 20060101ALI20240718BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240718BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20240718BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20240718BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240718BHJP
【ＦＩ】
A01K67/0276 ZNA
C12Q1/02
A61K45/00
A61P25/28
C12N5/10
C12N15/12
【審査請求】未請求
【請求項の数】8
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2024003101
(22)【出願日】2024-01-12
(31)【優先権主張番号】P 2023003294
(32)【優先日】2023-01-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】JP
【国等の委託研究の成果に係る記載事項】（出願人による申告）令和２年度、国立研究開発法人日本医療研究開発機構、「革新的先端研究開発支援事業」「重炭酸イオンがシグナル伝達分子として引き起こす時空間作用 － 脳内微小環境（ＮＶＵ）の修復機構の解明」委託研究開発、産業技術力強化法第１７条の適用を受ける特許出願
(71)【出願人】
【識別番号】502285457
【氏名又は名称】学校法人順天堂
(74)【代理人】
【識別番号】110000084
【氏名又は名称】弁理士法人アルガ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】城 愛理
(72)【発明者】
【氏名】横溝 岳彦
【テーマコード（参考）】
4B063
4B065
4C084
【Ｆターム（参考）】
4B063QA18
4B063QQ08
4B063QQ89
4B063QR50
4B065AA93X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065BD22
4B065CA01
4B065CA60
4C084AA17
4C084NA14
4C084ZA15
4C084ZC42
(57)【要約】
【課題】重炭酸イオンの新たな機能を見出し、新たな医薬開発の可能性を見出すこと。
【解決手段】重炭酸イオン受容体機能欠損非ヒト動物、ＧＲＰ３０発現細胞を用いる細胞内カルシウム濃度調節剤のスクリーニング方法。
【選択図】なし
【解決手段】重炭酸イオン受容体機能欠損非ヒト動物、ＧＲＰ３０発現細胞を用いる細胞内カルシウム濃度調節剤のスクリーニング方法。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
重炭酸イオン受容体機能欠損非ヒト動物。
【請求項2】
重炭酸イオン受容体機能欠損マウス。
【請求項3】
ＧＰＲ３０発現細胞を用いる細胞内カルシウム濃度調節剤のスクリーニング方法。
【請求項4】
ＧＰＲ３０発現細胞を用いる重炭酸イオン受容体拮抗剤のスクリーニング方法。
【請求項5】
ＧＰＲ３０発現細胞を用いる脳梗塞治療剤のスクリーニング方法。
【請求項6】
Ｇｐｒ３０遺伝子導入非ヒト動物を用いる脳梗塞治療剤のスクリーニング方法。
【請求項7】
重炭酸イオン受容体拮抗剤を有効成分として含有する細胞内カルシウム濃度調節剤。
【請求項8】
重炭酸イオン受容体拮抗剤を有効成分として含有する脳梗塞治療剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、生体内における重炭酸イオン受容体及びその応用に関する。
【背景技術】
【0002】
血液、リンパ液などの体液は、ｐＨ７．４付近に保たれており、ｐＨが低くなった状態をアシドーシス、高くなった状態をアルカローシスという。この体液のｐＨは、主に呼吸と代謝によってコントロールされている。ｐＨのアルカリ側への調整は、主に肺からのＣＯ2の放出と、腎臓からの重炭酸イオンの再吸収によって行われる。このように、重炭酸イオンは、生体におけるｐＨ調節因子であると考えられてきた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0003】
しかしながら、重炭酸イオン濃度が高くなった時の病態及び低くなった時の病態を見ると、単にアルカローシスやアシドーシスだけでは説明できない疾患が隠れている可能性がある。
従って、本発明の課題は、重炭酸イオンの新たな機能を見出し、新たな医薬開発の可能性を見出すことにある。
従って、本発明の課題は、重炭酸イオンの新たな機能を見出し、新たな医薬開発の可能性を見出すことにある。
【課題を解決するための手段】
【0004】
そこで本発明者は、重炭酸イオンが体液中のｐＨ調節因子としての機能だけでなく、新たな機能を有するのではないかと考え、重炭酸イオンを種々の細胞に作用させ、その細胞の機能の変化を検討した。その結果、ヒトを含む動物の細胞において、重炭酸イオンがその受容体を介して生体内でシグナル伝達分子として作用していることを見出した。さらに、重炭酸イオン受容体の活性化によって細胞内カルシウム濃度が上昇すること、その受容体機能欠損マウスでは、脳虚血再灌流モデルにおいて梗塞が軽減されることや、虚血再灌流後のアポトーシスが軽減されることを見出し、本発明を完成した。
【0005】
すなわち、本発明は、次の発明［１］～［８］を提供するものである。
［１］重炭酸イオン受容体機能欠損非ヒト動物。
［２］重炭酸イオン受容体機能欠損マウス。
［３］ＧＰＲ３０発現細胞を用いる細胞内カルシウム濃度調節剤のスクリーニング方法。
［４］ＧＰＲ３０発現細胞を用いる重炭酸イオン受容体拮抗剤のスクリーニング方法。
［５］ＧＰＲ３０発現細胞を用いる脳梗塞治療剤のスクリーニング方法。
［６］Ｇｐｒ３０遺伝子導入非ヒト動物を用いる脳梗塞治療剤のスクリーニング方法
［７］重炭酸イオン受容体拮抗剤を有効成分として含有する細胞内カルシウム濃度調節剤。
［８］重炭酸イオン受容体拮抗剤を有効成分として含有する脳梗塞治療剤。
［１］重炭酸イオン受容体機能欠損非ヒト動物。
［２］重炭酸イオン受容体機能欠損マウス。
［３］ＧＰＲ３０発現細胞を用いる細胞内カルシウム濃度調節剤のスクリーニング方法。
［４］ＧＰＲ３０発現細胞を用いる重炭酸イオン受容体拮抗剤のスクリーニング方法。
［５］ＧＰＲ３０発現細胞を用いる脳梗塞治療剤のスクリーニング方法。
［６］Ｇｐｒ３０遺伝子導入非ヒト動物を用いる脳梗塞治療剤のスクリーニング方法
［７］重炭酸イオン受容体拮抗剤を有効成分として含有する細胞内カルシウム濃度調節剤。
［８］重炭酸イオン受容体拮抗剤を有効成分として含有する脳梗塞治療剤。
【発明の効果】
【0006】
本発明により、ヒトを含む動物の細胞には重炭酸イオン受容体が存在し、その受容体は、体液のｐＨ調節因子としての機能だけでなく、細胞内カルシウム濃度の調節、脳梗塞の発生やその治癒に関与していることが判明した。この重炭酸イオン受容体の発見により、脳梗塞治療剤などの新たな治療剤の開発が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【0007】
【図1】ＧＰＲ３０安定発現細胞（ＭＣＦ－ＧＰＲ３０）における重炭酸イオン濃度と細胞内カルシウム応答の関係を示す。
【図2】ＧＰＲ３０安定発現細胞（ＨＥＫ－ＧＰＲ３０）における重炭酸イオン濃度と細胞内カルシウム応答の関係を示す。
【図3】混合無機溶液から重炭酸ナトリウムを枯渇させたときの、ＧＰＲ３０安定発現細胞（ＭＣＦ－ＧＰＲ３０）における細胞内カルシウム応答を示す。
【図4】ＧＰＲ３０の1アミノ酸置換体を安定発現させたＨＥＫ２９３細胞における重炭酸イオン濃度と細胞内カルシウム応答の関係を示す。
【図5】ＧＰＲ３０安定発現細胞（ＨＥＫ２９３）における重炭酸イオン濃度と細胞内カルシウム応答の関係を示す。
【図6】種々の動物種におけるＧＰＲ３０の重炭酸イオンによる活性化を示す。
【図7】ＧＰＲ３０発現初代培養細胞の重炭酸イオンによる活性化を示す。
【図8】野生型マウスを用いて重炭酸イオン受容体発現細胞が脳ペリサイトであることを示す（抗ｐｄｇｆｒｂ ＲＮＡプローブによるｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）。
【図9】Ｇｐｒ３０遺伝子座ノックインマウスを用いて重炭酸イオン受容体発現細胞が脳ペリサイトであることを示す（抗ＣＤ１３抗体による免疫染色）。
【図10】脳虚血再灌流モデルにおける梗塞巣の大きさを示す。
【図11】脳虚血再灌流モデルにおける血液脳関門の破綻状態を示す。
【図12】脳虚血再灌流後のアポトーシスの変化を示す。
【図13】脳虚血再灌流時の血流の経時変化を示す。
【発明を実施するための形態】
【0008】
本発明者は、候補受容体遺伝子を導入したヒトを含む動物細胞に、重炭酸イオンを作用させ、その細胞の変化を測定することにより、重炭酸イオン受容体が存在することを見出した。重炭酸イオン受容体はＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）の一種であり、その遺伝子を発現する細胞は、後述の実施例１に記載のように、重炭酸イオンに反応して細胞内カルシウムを上昇させる。
【0009】
具体的には、本発明はＧＰＣＲの一種であるＧＰＲ３０が、重炭酸イオン受容体としての機能を有することを見出したことにある。ＧＰＲ３０は従来エストラジオール（Ｅ２）の非ゲノム作用を有することが知られていたが（Ｒｅｖａｎｋａｒ，Ｃ．Ｍ．，Ｃｉｍｉｎｏ，Ｄ．Ｆ．，Ｓｋｌａｒ，Ｌ．Ａ．，Ａｒｔｅｒｂｕｒｎ，Ｊ．Ｂ．＆Ｐｒｏｓｓｎｉｔｚ，Ｅ．Ｒ．Ａ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｒａｐｉｄ ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０７，１６２５－１６３０（２００５）．）、重炭酸イオンによって活性化されることは知られていなかった。また、ＧＰＲ３０の遺伝子は、ヒト、マウス、ラット、ゼブラフィッシュなどで確認されている。
ヒトＧＰＲ３０のＤＮＡ配列は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＣ＿０００００７．１４ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＧＲＣｈ３８．ｐ１４ Ｐｒｉｍａｒｙ Ａｓｓｅｍｂｌｙ、ＲＥＧＩＯＮ：１０８７１１８．．１０９３８１０、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：２８５２、マウスＧＰＲ３０のＤＮＡ配列は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＣ＿００００７１．７ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＧＲＣｍ３９ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、ＲＥＧＩＯＮ：１３９４０８９０５．．１３９４１３５５５、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ： ６８５４、として知られている。
ヒトＧＰＲ３０のＤＮＡ配列は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＣ＿０００００７．１４ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＧＲＣｈ３８．ｐ１４ Ｐｒｉｍａｒｙ Ａｓｓｅｍｂｌｙ、ＲＥＧＩＯＮ：１０８７１１８．．１０９３８１０、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ：２８５２、マウスＧＰＲ３０のＤＮＡ配列は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＣ＿００００７１．７ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＧＲＣｍ３９ Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、ＲＥＧＩＯＮ：１３９４０８９０５．．１３９４１３５５５、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ： ６８５４、として知られている。
【0010】
重炭酸イオン受容体は、ヒトを含む種々の動物細胞に存在し、重炭酸イオンにより活性化し、シグナル伝達分子として機能している。
重炭酸イオン受容体を安定発現させた細胞では、重炭酸イオンを作用させることにより、細胞内カルシウム濃度が上昇することから、重炭酸イオンがこの受容体を介して細胞内のカルシウム濃度を調節していることがわかる。
従って、重炭酸イオン受容体発現細胞を用いれば、細胞内カルシウム濃度調節剤をスクリーニングすることができる。
重炭酸イオン受容体を安定発現させた細胞では、重炭酸イオンを作用させることにより、細胞内カルシウム濃度が上昇することから、重炭酸イオンがこの受容体を介して細胞内のカルシウム濃度を調節していることがわかる。
従って、重炭酸イオン受容体発現細胞を用いれば、細胞内カルシウム濃度調節剤をスクリーニングすることができる。
【0011】
具体的には、被験体を添加したＧＰＲ３０発現細胞に重炭酸イオンを作用させ、細胞内カルシウム濃度の変化を測定すれば、当該被験体の細胞内カルシウム濃度に対する作用を判定することができる。
ＧＰＲ３０発現細胞としては、スクリーニングの感度を上げるため、Ｇｐｒ３０遺伝子を導入するなどしてＧＰＲ３０を発現させたＧＰＲ３０発現細胞が好ましい。ＧＰＲ３０発現細胞は、挿入されたＧｐｒ３０遺伝子が一過的に過剰のＧＰＲ３０を発現するＧＰＲ３０過剰発現細胞でもよく、あるいは挿入されたＧｐｒ３０遺伝子が細胞自身のＤＮＡに組み込まれるなどして、安定的にＧＰＲ３０を発現するＧＰＲ３０安定発現細胞でもよい。導入するＧｐｒ３０遺伝子の動物種は、特に限定するものではないが、ヒト、マウス、ラット、ゼブラフィッシュが好ましく、特にヒトが好ましい。
すなわち、ＧＰＲ３０発現細胞を用いれば、細胞内カルシウム濃度調節剤をスクリーニングすることができる。好ましくは、重炭酸イオン依存性または重炭酸イオンを介した細胞内カルシウム濃度調節剤をスクリーニングすることができる。
また、ＧＰＲ３０発現細胞を用いたスクリーニング方法で見出された細胞内カルシウム濃度調節剤は、重炭酸イオン受容体拮抗剤として有用であるため、重炭酸イオン受容体拮抗剤のスクリーニングとしても有用である。さらに重炭酸イオン受容体拮抗剤は、脳梗塞治療剤としても有用であることから、脳梗塞治療剤のスクリーニングとしても有用である。
ＧＰＲ３０発現細胞を用いる細胞内カルシウム濃度調節剤のスクリーニング方法、ＧＰＲ３０発現細胞を用いる重炭酸イオン受容体拮抗剤のスクリーニング方法、ＧＰＲ３０発現細胞を用いる脳梗塞治療剤のスクリーニング方法は、いずれも（１）ＧＲＰ３０発現細胞に被験体を添加する工程、（２）重炭酸イオンを作用させる工程、（３）細胞内のカルシウム濃度変化を検出する工程を含むことが好ましい。これらの工程は必ずしも決まった順番で行うことに限定されるものではなく、必要に応じて適宜その順番は変更することは可能である。
ＧＰＲ３０発現細胞としては、スクリーニングの感度を上げるため、Ｇｐｒ３０遺伝子を導入するなどしてＧＰＲ３０を発現させたＧＰＲ３０発現細胞が好ましい。ＧＰＲ３０発現細胞は、挿入されたＧｐｒ３０遺伝子が一過的に過剰のＧＰＲ３０を発現するＧＰＲ３０過剰発現細胞でもよく、あるいは挿入されたＧｐｒ３０遺伝子が細胞自身のＤＮＡに組み込まれるなどして、安定的にＧＰＲ３０を発現するＧＰＲ３０安定発現細胞でもよい。導入するＧｐｒ３０遺伝子の動物種は、特に限定するものではないが、ヒト、マウス、ラット、ゼブラフィッシュが好ましく、特にヒトが好ましい。
すなわち、ＧＰＲ３０発現細胞を用いれば、細胞内カルシウム濃度調節剤をスクリーニングすることができる。好ましくは、重炭酸イオン依存性または重炭酸イオンを介した細胞内カルシウム濃度調節剤をスクリーニングすることができる。
また、ＧＰＲ３０発現細胞を用いたスクリーニング方法で見出された細胞内カルシウム濃度調節剤は、重炭酸イオン受容体拮抗剤として有用であるため、重炭酸イオン受容体拮抗剤のスクリーニングとしても有用である。さらに重炭酸イオン受容体拮抗剤は、脳梗塞治療剤としても有用であることから、脳梗塞治療剤のスクリーニングとしても有用である。
ＧＰＲ３０発現細胞を用いる細胞内カルシウム濃度調節剤のスクリーニング方法、ＧＰＲ３０発現細胞を用いる重炭酸イオン受容体拮抗剤のスクリーニング方法、ＧＰＲ３０発現細胞を用いる脳梗塞治療剤のスクリーニング方法は、いずれも（１）ＧＲＰ３０発現細胞に被験体を添加する工程、（２）重炭酸イオンを作用させる工程、（３）細胞内のカルシウム濃度変化を検出する工程を含むことが好ましい。これらの工程は必ずしも決まった順番で行うことに限定されるものではなく、必要に応じて適宜その順番は変更することは可能である。
【0012】
重炭酸イオン受容体は、ヒトだけでなく、マウス、ラットなどの哺乳類、魚類などの細胞にも存在し、重炭酸イオンによって活性化される。
また、生体内における重炭酸イオン受容体発現細胞は、主に脳ペリサイトである。
また、生体内における重炭酸イオン受容体発現細胞は、主に脳ペリサイトである。
【0013】
さらに、本発明者は、重炭酸イオン受容体機能欠損非ヒト動物を作製した。重炭酸イオン受容体機能欠損非ヒト動物としては、マウス、ラットなどのげっ歯類が挙げられるが、マウスであるのが好ましい。
重炭酸イオン受容体機能欠損マウスは、染色体上Ｇｐｒ３０遺伝子が不活性型Ｇｐｒ３０遺伝子に置換されたこと、またはＧｐｒ３０遺伝子自体の欠失・欠損により、重炭酸イオン受容体の機能が欠損もしくは減弱したマウスである。ここで、不活性型とは、遺伝子の一部欠損・一部置換、遺伝子のコード領域への他の塩基配列の挿入、遺伝子の発現調節領域内の変異などにより、正常な重炭酸イオン受容体機能を発現できない遺伝子をいう。不活性型Ｇｐｒ３０遺伝子は、ホモでもヘテロでもよいが、ホモであることが好ましい。
重炭酸イオン受容体機能欠損マウスは、公知のジーンターゲティング法により作成することができるが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムにより、遺伝子配列を一部変化させて、本来の重炭酸イオン受容体としての機能が発揮できない配列とすることにより、作成するのが好ましい。例えば、ゲノム編集によりＧＰＲ３０タンパク質をコードするゲノム配列に１塩基が挿入された場合は、フレームシフトにより本来のＧＰＲ３０とは異なるアミノ酸をコードする配列となる。
重炭酸イオン受容体機能欠損マウス作成のためのＧＰＲ３０のアミノ酸配列の変化としては、例えば、Ｈ３０７（３０７番目のヒスチジン）、Ｅ１１５（１１５番目のグルタミン酸）、Ｑ１３８（１３８番目のグルタミン）のいずれかのアミノ酸が他のアミノ酸に置換又は欠失することが挙げられ、特にＨ３０７が他のアミノ酸に置換又は欠失することが好ましい。
重炭酸イオン受容体機能欠損マウス作成のためのＧＰＲ３０のＤＮＡ配列の変化としては、例えば、ＧＰＲ３０のＤＮＡ配列の２７５８番目から２９９７番目のＤＮＡのいずれか一部または全部が欠損することが好ましく、一部の場合は２９８１番目から２９８５番目を含むＤＮＡを欠損することがより好ましく、２９８１番目から２９９７番目のＤＮＡを欠損することが更に好ましい。
重炭酸イオン受容体機能欠損マウスは、染色体上Ｇｐｒ３０遺伝子が不活性型Ｇｐｒ３０遺伝子に置換されたこと、またはＧｐｒ３０遺伝子自体の欠失・欠損により、重炭酸イオン受容体の機能が欠損もしくは減弱したマウスである。ここで、不活性型とは、遺伝子の一部欠損・一部置換、遺伝子のコード領域への他の塩基配列の挿入、遺伝子の発現調節領域内の変異などにより、正常な重炭酸イオン受容体機能を発現できない遺伝子をいう。不活性型Ｇｐｒ３０遺伝子は、ホモでもヘテロでもよいが、ホモであることが好ましい。
重炭酸イオン受容体機能欠損マウスは、公知のジーンターゲティング法により作成することができるが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムにより、遺伝子配列を一部変化させて、本来の重炭酸イオン受容体としての機能が発揮できない配列とすることにより、作成するのが好ましい。例えば、ゲノム編集によりＧＰＲ３０タンパク質をコードするゲノム配列に１塩基が挿入された場合は、フレームシフトにより本来のＧＰＲ３０とは異なるアミノ酸をコードする配列となる。
重炭酸イオン受容体機能欠損マウス作成のためのＧＰＲ３０のアミノ酸配列の変化としては、例えば、Ｈ３０７（３０７番目のヒスチジン）、Ｅ１１５（１１５番目のグルタミン酸）、Ｑ１３８（１３８番目のグルタミン）のいずれかのアミノ酸が他のアミノ酸に置換又は欠失することが挙げられ、特にＨ３０７が他のアミノ酸に置換又は欠失することが好ましい。
重炭酸イオン受容体機能欠損マウス作成のためのＧＰＲ３０のＤＮＡ配列の変化としては、例えば、ＧＰＲ３０のＤＮＡ配列の２７５８番目から２９９７番目のＤＮＡのいずれか一部または全部が欠損することが好ましく、一部の場合は２９８１番目から２９８５番目を含むＤＮＡを欠損することがより好ましく、２９８１番目から２９９７番目のＤＮＡを欠損することが更に好ましい。
【0014】
重炭酸イオン受容体機能欠損非ヒト動物を用いれば、重炭酸イオン受容体が関与する種々の作用を検討することができる。本発明者は、重炭酸イオン受容体が主に脳ペリサイトに発現することから、重炭酸イオン受容体の脳における作用に着目し、重炭酸イオン受容体機能欠損マウスを用いて脳虚血再灌流モデルにおける作用を検討した。その結果、重炭酸イオン受容体機能欠損マウスの脳虚血再潅流モデルでは、梗塞巣の大きさや血液脳関門の破綻が軽減していること、虚血再灌流後のアポトーシスが軽減していること、再灌流後の血流の回復が早いことが判明した。すなわち、重炭酸イオン受容体機能欠損非ヒト動物は、虚血再灌流後の脳梗塞が軽減されるという性質を有する。
従って、この脳虚血再潅流モデルを用いれば、脳梗塞治療剤のスクリーニングや上記ＧＰＲ３０安定発現細胞で見いだされた脳梗塞治療剤のさらなるスクリーニング及び薬理効果の確認することができる。
従って、この脳虚血再潅流モデルを用いれば、脳梗塞治療剤のスクリーニングや上記ＧＰＲ３０安定発現細胞で見いだされた脳梗塞治療剤のさらなるスクリーニング及び薬理効果の確認することができる。
【0015】
さらにＧｐｒ３０遺伝子を導入したＧＰＲ３０発現非ヒト動物を用いれば、重炭酸イオン受容体に拮抗する細胞内カルシウム濃度調節剤及び脳梗塞治療剤のスクリーニング及び薬理効果の確認に使用できる。導入するＧｐｒ３０遺伝子の動物種は特に限定するものではないが、ヒト、マウス、ラット、ゼブラフィッシュが好ましく、特にヒトが好ましい。導入方法も特に限定するものではないが、ノックイン方法が好ましい。その場合、ノックインされた遺伝子はホモでも、ヘテロでもよいが、特にホモであることが好ましい。
ここで、脳虚血再灌流モデルは、特定の脳動脈の血流を一定時間遮断した後に再灌流することによるモデルであり、ヒトの虚血性脳卒中の病態を反映した脳梗塞モデルである。
具体的な脳梗塞治療剤のスクリーニング及び薬理効果の確認は、動物に脳虚血再灌流を施す前に被験体を投与しておくか、施術直後に被験体を投与し、施術後の梗塞巣の大きさ、血液脳関門の状態、アポトーシスの有無、血流の回復などを測定すればよい。これらの状態を、被験体非投与群と対比すればよい。
ここで、脳虚血再灌流モデルは、特定の脳動脈の血流を一定時間遮断した後に再灌流することによるモデルであり、ヒトの虚血性脳卒中の病態を反映した脳梗塞モデルである。
具体的な脳梗塞治療剤のスクリーニング及び薬理効果の確認は、動物に脳虚血再灌流を施す前に被験体を投与しておくか、施術直後に被験体を投与し、施術後の梗塞巣の大きさ、血液脳関門の状態、アポトーシスの有無、血流の回復などを測定すればよい。これらの状態を、被験体非投与群と対比すればよい。
【0016】
また、重炭酸イオン受容体拮抗剤は、脳梗塞治療剤として有用である。
具体的には、重炭酸イオン受容体拮抗剤は、脳梗塞の急性期治療剤、特に再灌流時のｎｏ ｒｅｆｌｏｗ 現象の改善、脳梗塞超急性期の血栓溶解療法の成功率の改善などに有用である。
具体的には、重炭酸イオン受容体拮抗剤は、脳梗塞の急性期治療剤、特に再灌流時のｎｏ ｒｅｆｌｏｗ 現象の改善、脳梗塞超急性期の血栓溶解療法の成功率の改善などに有用である。
【0017】
Ｇｐｒ３０遺伝子導入非ヒト動物を用いる脳梗塞治療剤のスクリーニング方法は、（１）Ｇｐｒ３０遺伝子導入非ヒト動物に被験体を投与する工程、（２）Ｇｐｒ３０遺伝子導入非ヒト動物に脳虚血再灌流の施術を行う工程、（３）梗塞巣の大きさ、血液脳関門の状態、アポトーシスの有無、血流の回復などを測定する工程、を含むことが好ましい。これらの工程は必ずしも決まった順番で行うことに限定されるのではなく、必要に応じて適宜その順番は変更することは可能である。
【0018】
前記重炭酸イオン受容体拮抗剤の例としては、抗重炭酸イオン受容体抗体、ｓｉＲＮＡ、小分子化合物などが挙げられる。
これらの重炭酸イオン受容体拮抗剤は、種々の投与形態に適した医薬組成物とすることができる。例えば、経口投与用組成物、経皮投与用組成物、静脈内投与用組成物等の形態が挙げられる。
これらの組成物とするには、通常用いられる医薬品添加物、例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤、安定化剤、溶解剤などを配合することができる。
これらの重炭酸イオン受容体拮抗剤は、種々の投与形態に適した医薬組成物とすることができる。例えば、経口投与用組成物、経皮投与用組成物、静脈内投与用組成物等の形態が挙げられる。
これらの組成物とするには、通常用いられる医薬品添加物、例えば、賦形剤、結合剤、滑沢剤、安定化剤、溶解剤などを配合することができる。
【実施例0019】
次に実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【0020】
（材料及び方法）
【0021】
１．ベクター構築及びトランスフェクション
ヒトＧｐｒ３０ ｃＤＮＡは、ヒト肝芽腫由来ＨｅｐＧ２細胞から得た。マウスＧｐｒ３０を、マウスｃＤＮＡクローン（＃ＢＣ１３８５９８－ｓｅｑ、ＭＧＣ－Ｐｒｅｍｉｅｒ、ＴＣＭＳ１００４、ＴＯＴ）からのＰＣＲを用いてクローニングし、ラット及びゼブラフィッシュＧｐｒ３０を、ゲノムＤＮＡからのＰＣＲを用いてクローニングした。
ヒト及びゼブラフィッシュＧｐｒ３０のコード配列をＫｐｎＩ部位とＥｃｏＲＩ部位との間で、マウス及びラットＧｐｒ３０のコード配列をＮｏｔＩ部位とＥｃｏＲＩ部位との間で、プラスミドベクターｐＣＸＮ２のマルチクローニングサイトに挿入した。Ｃ末端ＨＡタグ付きＧｐｒ３０を、ＨＡ配列を含むリバースプライマーを用いて増幅した。
ヒトＧＰＲ３０の１つのアミノ酸変異を以下のように生成した。まず、標的アミノ酸を、アジレントによるＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）プライマーデザインプログラムを用いた２ステップＰＣＲ法を用いてアラニン（ＧＣＣ）に変更した（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ／ｓｔｏｒｅ／ｐｒｉｍｅｒＤｅｓｉｇｎＰｒｏｇｒａｍ．ｊｓｐ）。次に、それぞれの変異を有するコード配列を、ＫｐｎＩ部位とＥｃｏＲＩ部位との間のｐＣＸＮ２のマルチクローニング部位に挿入した。生成された変異は、Ｅ１１５Ａ、Ｈ１２０Ａ、Ｑ１３８Ａ、Ｈ２００Ａ、Ｅ２１８Ａ、Ｅ２７５Ａ、Ｈ２８２Ａ、Ｈ３００Ａ、Ｈ３０７Ａ、及びＮ３１０Ａであった。タンパク質レベルでの受容体の検出のためのタグ付きＧｐｒ３０を得るために、変異Ｇｐｒ３０を、ＧＰＲ３０のＣ末端にＨＡタグを付加したリバースプライマーを用いたＰＣＲを用いてクローニングした。これらのベクターを、リポフェクション法を用いてトランスフェクションした。すべての細胞株及び初代培養を３７℃、５％ＣＯ２で維持した。
ヒトＧｐｒ３０ ｃＤＮＡは、ヒト肝芽腫由来ＨｅｐＧ２細胞から得た。マウスＧｐｒ３０を、マウスｃＤＮＡクローン（＃ＢＣ１３８５９８－ｓｅｑ、ＭＧＣ－Ｐｒｅｍｉｅｒ、ＴＣＭＳ１００４、ＴＯＴ）からのＰＣＲを用いてクローニングし、ラット及びゼブラフィッシュＧｐｒ３０を、ゲノムＤＮＡからのＰＣＲを用いてクローニングした。
ヒト及びゼブラフィッシュＧｐｒ３０のコード配列をＫｐｎＩ部位とＥｃｏＲＩ部位との間で、マウス及びラットＧｐｒ３０のコード配列をＮｏｔＩ部位とＥｃｏＲＩ部位との間で、プラスミドベクターｐＣＸＮ２のマルチクローニングサイトに挿入した。Ｃ末端ＨＡタグ付きＧｐｒ３０を、ＨＡ配列を含むリバースプライマーを用いて増幅した。
ヒトＧＰＲ３０の１つのアミノ酸変異を以下のように生成した。まず、標的アミノ酸を、アジレントによるＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）プライマーデザインプログラムを用いた２ステップＰＣＲ法を用いてアラニン（ＧＣＣ）に変更した（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ／ｓｔｏｒｅ／ｐｒｉｍｅｒＤｅｓｉｇｎＰｒｏｇｒａｍ．ｊｓｐ）。次に、それぞれの変異を有するコード配列を、ＫｐｎＩ部位とＥｃｏＲＩ部位との間のｐＣＸＮ２のマルチクローニング部位に挿入した。生成された変異は、Ｅ１１５Ａ、Ｈ１２０Ａ、Ｑ１３８Ａ、Ｈ２００Ａ、Ｅ２１８Ａ、Ｅ２７５Ａ、Ｈ２８２Ａ、Ｈ３００Ａ、Ｈ３０７Ａ、及びＮ３１０Ａであった。タンパク質レベルでの受容体の検出のためのタグ付きＧｐｒ３０を得るために、変異Ｇｐｒ３０を、ＧＰＲ３０のＣ末端にＨＡタグを付加したリバースプライマーを用いたＰＣＲを用いてクローニングした。これらのベクターを、リポフェクション法を用いてトランスフェクションした。すべての細胞株及び初代培養を３７℃、５％ＣＯ２で維持した。
【0022】
２．ＴＧＦαシェディングアッセイ
ＨＥＫ２９３細胞を１２ウェルプレートに１×１０５細胞／ウェルの細胞密度で播種し、２４時間培養した。９０％コンフルエントで、ＧＰＣＲ及びＡＰ－ＴＧＦαを含有するプラスミドベクターの混合物を、一部はＧαサブユニット発現ベクターとともに細胞にトランスフェクトした。さらにインキュベーション後、細胞を０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡで剥離し、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）に懸濁し、９６ウェルプレートに播種した。細胞を、１．１－２２×１０－３Ｍ（最終濃度）のＮａＨＣＯ３、１×１０－１４－１×１０－６ＭのＥ２、１×１０－９－１×１０－６Ｍ のアルドステロン、または１×１０－９－１×１０－５ＭのＧ－１で、３７℃、０．０３％または５％ＣＯ２の条件で１時間刺激した。
ホルボール－１２－ミリステート－１３－酢酸（ＰＭＡ，１００ｎＭ）を陽性コントロールとして使用した。上清（ＣＭ）を別のプレートに移し、８０μｌのアルカリホスファターゼ（ＡＰ）溶液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ９．５、４０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）を両方のプレートに加え、次いで３７℃でインキュベートした。４０５ｎｍでの光学密度（ＯＤ４０５）を、マイクロプレートリーダーを用いて、反応速度に応じて５分、３０分、１時間、及び２時間で測定した。以下の式で遊離ＡＰ－ＴＧＦの割合を計算し、GPCR活性化の指標とした。
ＡＰ活性＝ΔＯＤ４０５（１～０時間）
％ＣＭ（上清）＝ＡＰ活性（上清）／[ＡＰ活性（上清）＋ＡＰ活性（細胞）]
ＨＥＫ２９３細胞を１２ウェルプレートに１×１０５細胞／ウェルの細胞密度で播種し、２４時間培養した。９０％コンフルエントで、ＧＰＣＲ及びＡＰ－ＴＧＦαを含有するプラスミドベクターの混合物を、一部はＧαサブユニット発現ベクターとともに細胞にトランスフェクトした。さらにインキュベーション後、細胞を０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡで剥離し、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）に懸濁し、９６ウェルプレートに播種した。細胞を、１．１－２２×１０－３Ｍ（最終濃度）のＮａＨＣＯ３、１×１０－１４－１×１０－６ＭのＥ２、１×１０－９－１×１０－６Ｍ のアルドステロン、または１×１０－９－１×１０－５ＭのＧ－１で、３７℃、０．０３％または５％ＣＯ２の条件で１時間刺激した。
ホルボール－１２－ミリステート－１３－酢酸（ＰＭＡ，１００ｎＭ）を陽性コントロールとして使用した。上清（ＣＭ）を別のプレートに移し、８０μｌのアルカリホスファターゼ（ＡＰ）溶液（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ９．５、４０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）を両方のプレートに加え、次いで３７℃でインキュベートした。４０５ｎｍでの光学密度（ＯＤ４０５）を、マイクロプレートリーダーを用いて、反応速度に応じて５分、３０分、１時間、及び２時間で測定した。以下の式で遊離ＡＰ－ＴＧＦの割合を計算し、GPCR活性化の指標とした。
ＡＰ活性＝ΔＯＤ４０５（１～０時間）
％ＣＭ（上清）＝ＡＰ活性（上清）／[ＡＰ活性（上清）＋ＡＰ活性（細胞）]
【0023】
３．カルシウムアッセイ
ＨＥＫ２９３またはＭＣＦ－７（ＪＣＲＢ細胞バンク、ＪＣＲＢ１３４）細胞（２×１０４細胞／ウェル）を、アッセイの２４～４８時間前に９６ウェルプレートに播種した。９０～１００％コンフルエントの細胞を、１０μＭ Ｆｌｕｏ－８ＡＭを含有するＨＥＰＥＳ緩衝液（１×ＨＢＳＳ、２．５ｍＭプロベネシド、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）と共に、３７℃、５％ＣＯ２で６０分間インキュベートした。細胞をＨＥＰＥＳ緩衝液で２回洗浄した。細胞を各濃度のリガンドで刺激し、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｅｘ／Ｅｍ＝４９０／５２５ｎｍ）を用いて蛍光強度を分析した。必要に応じて、細胞をＰＴＸ（１００ｎｇ／ｍｌ）で１６時間処理、あるいはＹＭ－２５４８９０（１μＭ；Ｄｒ．Ｊ．Ｔａｋａｓａｋｉから授受）で４５分間処理した後、アッセイを行った。
ＨＥＫ２９３またはＭＣＦ－７（ＪＣＲＢ細胞バンク、ＪＣＲＢ１３４）細胞（２×１０４細胞／ウェル）を、アッセイの２４～４８時間前に９６ウェルプレートに播種した。９０～１００％コンフルエントの細胞を、１０μＭ Ｆｌｕｏ－８ＡＭを含有するＨＥＰＥＳ緩衝液（１×ＨＢＳＳ、２．５ｍＭプロベネシド、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）と共に、３７℃、５％ＣＯ２で６０分間インキュベートした。細胞をＨＥＰＥＳ緩衝液で２回洗浄した。細胞を各濃度のリガンドで刺激し、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｅｘ／Ｅｍ＝４９０／５２５ｎｍ）を用いて蛍光強度を分析した。必要に応じて、細胞をＰＴＸ（１００ｎｇ／ｍｌ）で１６時間処理、あるいはＹＭ－２５４８９０（１μＭ；Ｄｒ．Ｊ．Ｔａｋａｓａｋｉから授受）で４５分間処理した後、アッセイを行った。
【0024】
４．ＧＰＲ３０の重炭酸イオン認識及び／または下流シグナルのためのＧＰＲ３０に必須の鍵となるアミノ酸の選択
重炭酸イオンを認識するのに必要な候補アミノ酸を、パブリックホモロジーモデル（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｐｃｒｄｂ．ｏｒｇ／）に基づいて選択した。オルソステリックポケットの深いところには多くの負に荷電したアミノ酸残基があるため、重炭酸イオンがアミノ酸と相互作用する可能性が低いと推定された。推定オルソステリックポケットの外周部の正に荷電した残基のうち、ヒトからゼブラフィッシュまでの保存されたアミノ酸を最初に調査した。保存されたアミノ酸にはＨ２００、Ｈ３００、及びＨ３０７が含まれ、その中で、Ｈ３０７のアラニン置換によって重炭酸塩によるｈＧＰＲ３０の活性化が完全に抑制されたため、Ｈ３０７は重炭酸イオンの認識のための潜在的アミノ酸残基として選択した。次に、Ｈ３０７と協働して重炭酸イオンと相互作用する可能性があるオルソステリックポケットに位置する親水性アミノ酸を候補とした。
重炭酸イオンを認識するのに必要な候補アミノ酸を、パブリックホモロジーモデル（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｐｃｒｄｂ．ｏｒｇ／）に基づいて選択した。オルソステリックポケットの深いところには多くの負に荷電したアミノ酸残基があるため、重炭酸イオンがアミノ酸と相互作用する可能性が低いと推定された。推定オルソステリックポケットの外周部の正に荷電した残基のうち、ヒトからゼブラフィッシュまでの保存されたアミノ酸を最初に調査した。保存されたアミノ酸にはＨ２００、Ｈ３００、及びＨ３０７が含まれ、その中で、Ｈ３０７のアラニン置換によって重炭酸塩によるｈＧＰＲ３０の活性化が完全に抑制されたため、Ｈ３０７は重炭酸イオンの認識のための潜在的アミノ酸残基として選択した。次に、Ｈ３０７と協働して重炭酸イオンと相互作用する可能性があるオルソステリックポケットに位置する親水性アミノ酸を候補とした。
【0025】
５．カルシウムイメージング
Ｃ２Ｃ１２細胞（３～６×１０５細胞／ディッシュ）を、アッセイの７２時間前に、コラーゲンでコーティングされた３５ｍｍガラスベースディッシュに播種した。次いで、細胞を、２．５μＭ Ｆｕｒａ－２ ＡＭを含有するＨＢＳＳ中、３７℃でインキュベートした。ディッシュをＨＢＳＳで２回洗浄した。ペリスタポンプを使用して１．５ｍｌ／分の流速で灌流した。重炭酸イオンを含むリガンド溶液で、４分間隔で１５秒間、細胞を刺激した。初代培養周皮細胞をコラーゲンコート３５ｍｍガラスボトムディッシュに播種し、３～７日間培養した。細胞を、増殖培地中、１０μＭ Ｆｕｒａ－２ ＡＭと共に３０分間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。記録皿をＨＢＳＳで２回洗浄して、蛍光比（３４０ｎｍ／３８０ｎｍ）を安定化させた。リガンド溶液を、７分間の間隔でそれぞれ３分間、細胞に連続的に適用した。条件的ＧＣａＭＰノックインマウスから新たに単離したＳＭＣ及び周皮細胞を、コラーゲンコート３５ｍｍガラスボトムディッシュに播種し、室温で１０分間インキュベートした。細胞を付着させるために、ディッシュを４００×ｇで２分間遠心分離した。ＨＢＳＳで２回洗浄し、リガンド溶液を５分間隔で３分間、細胞に順次適用した。細胞内カルシウムレベルを、ＡＱＵＡ ＣＯＳＭＯＳ Ｃａ２＋イメージングシステム（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ）を用いてモニターした。
Ｃ２Ｃ１２細胞（３～６×１０５細胞／ディッシュ）を、アッセイの７２時間前に、コラーゲンでコーティングされた３５ｍｍガラスベースディッシュに播種した。次いで、細胞を、２．５μＭ Ｆｕｒａ－２ ＡＭを含有するＨＢＳＳ中、３７℃でインキュベートした。ディッシュをＨＢＳＳで２回洗浄した。ペリスタポンプを使用して１．５ｍｌ／分の流速で灌流した。重炭酸イオンを含むリガンド溶液で、４分間隔で１５秒間、細胞を刺激した。初代培養周皮細胞をコラーゲンコート３５ｍｍガラスボトムディッシュに播種し、３～７日間培養した。細胞を、増殖培地中、１０μＭ Ｆｕｒａ－２ ＡＭと共に３０分間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。記録皿をＨＢＳＳで２回洗浄して、蛍光比（３４０ｎｍ／３８０ｎｍ）を安定化させた。リガンド溶液を、７分間の間隔でそれぞれ３分間、細胞に連続的に適用した。条件的ＧＣａＭＰノックインマウスから新たに単離したＳＭＣ及び周皮細胞を、コラーゲンコート３５ｍｍガラスボトムディッシュに播種し、室温で１０分間インキュベートした。細胞を付着させるために、ディッシュを４００×ｇで２分間遠心分離した。ＨＢＳＳで２回洗浄し、リガンド溶液を５分間隔で３分間、細胞に順次適用した。細胞内カルシウムレベルを、ＡＱＵＡ ＣＯＳＭＯＳ Ｃａ２＋イメージングシステム（Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ）を用いてモニターした。
【0026】
６．遺伝子改変マウスの作製
Ｇｐｒ３０ノックアウトマウスを、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）バックグラウンド上でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて２種類のノックアウトマウスを作製した（Ｌｉｎｅ１０６：２７５８－２９９７を削除（配列番号１）、Ｌｉｎｅ３０４：２９８１－２９８５を削除（配列番号２））。Ｇｐｒ３０－Ｖｅｎｕｓノックイン（Ｇｐｒ３０－Ｖｅｎｕｓ－ＫＩ）マウスを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて、筑波大学でＣ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドで作製した（Ｍｉｚｕｎｏ－Ｉｉｊｉｍａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｋｎｏｃｋ－ｉｎ ｍｉｃｅ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｃａｓ９－ｍｏｕｓｅ Ｃｄｔ１ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｚｙｇｏｔｅｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １９１，２３－３１（２０２１）．）。Ｖｅｎｕｓ配列をＧｐｒ３０の翻訳領域（２７５３－３８８０）削除後に挿入し、Ｇｐｒ３０プロモーターの下でＶｅｎｕｓを発現させた。Ｖｅｎｕｓの発現は、共焦点顕微鏡を用いて１０μｍ凍結切片を分析することによって検証した。 Ｇｐｒ３０－／Ｖｅｎｕｓマウスは、Ｇｐｒ３０ノックアウトマウス及びＧｐｒ３０－Ｖｅｎｕｓ－ＫＩマウスを交配することによって作製した。３～４ヶ月齢の雄同腹仔を全ての実験に用いた。マウスを１２時間～１２時間の明暗サイクルで飼育した。全ての実験は、サイクルの明期の間に行った。
Ｇｐｒ３０ノックアウトマウスを、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）バックグラウンド上でＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて２種類のノックアウトマウスを作製した（Ｌｉｎｅ１０６：２７５８－２９９７を削除（配列番号１）、Ｌｉｎｅ３０４：２９８１－２９８５を削除（配列番号２））。Ｇｐｒ３０－Ｖｅｎｕｓノックイン（Ｇｐｒ３０－Ｖｅｎｕｓ－ＫＩ）マウスを、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて、筑波大学でＣ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドで作製した（Ｍｉｚｕｎｏ－Ｉｉｊｉｍａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｌａｒｇｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｋｎｏｃｋ－ｉｎ ｍｉｃｅ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｗｉｔｈ Ｃａｓ９－ｍｏｕｓｅ Ｃｄｔ１ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｚｙｇｏｔｅｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １９１，２３－３１（２０２１）．）。Ｖｅｎｕｓ配列をＧｐｒ３０の翻訳領域（２７５３－３８８０）削除後に挿入し、Ｇｐｒ３０プロモーターの下でＶｅｎｕｓを発現させた。Ｖｅｎｕｓの発現は、共焦点顕微鏡を用いて１０μｍ凍結切片を分析することによって検証した。 Ｇｐｒ３０－／Ｖｅｎｕｓマウスは、Ｇｐｒ３０ノックアウトマウス及びＧｐｒ３０－Ｖｅｎｕｓ－ＫＩマウスを交配することによって作製した。３～４ヶ月齢の雄同腹仔を全ての実験に用いた。マウスを１２時間～１２時間の明暗サイクルで飼育した。全ての実験は、サイクルの明期の間に行った。
【0027】
７．ｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーションアッセイ
ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイは、ＲＮＡｓｃｏｐｅ技術を用いて行った。
５μｍ厚のホルマリン固定パラフィン包埋切片を、内因性ペルオキシダーゼブロッキング、抗原賦活化及びプロテアーゼ処理の後、切片を標的プローブ（ＲＮＡｓｃｏｐｅ Ｐｒｏｂｅ－Ｍｍ－Ｇｐｒ３０、＃３１８１９１；ＲＮＡｓｃｏｐｅ ＰｒｏｂｅＭｍ－Ａｃｔａ２－Ｃ２、ＲＮＡｓｃｏｐｅ Ｐｒｏｂｅ－Ｍｍ－Ｐｅｃａｍ１－Ｃ２、＃３１６７２１－Ｃ２；ＲＮＡｓｃｏｐｅ Ｐｒｏｂｅ －Ｍｍ－Ｐｄｇｆｒｂ－Ｃ３、＃４１１３８１－Ｃ３）と４２℃で２時間ハイブリダイズさせた。シグナル増幅、現像、及び対比染色は、プロトコルに従って行った。
ＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイは、ＲＮＡｓｃｏｐｅ技術を用いて行った。
５μｍ厚のホルマリン固定パラフィン包埋切片を、内因性ペルオキシダーゼブロッキング、抗原賦活化及びプロテアーゼ処理の後、切片を標的プローブ（ＲＮＡｓｃｏｐｅ Ｐｒｏｂｅ－Ｍｍ－Ｇｐｒ３０、＃３１８１９１；ＲＮＡｓｃｏｐｅ ＰｒｏｂｅＭｍ－Ａｃｔａ２－Ｃ２、ＲＮＡｓｃｏｐｅ Ｐｒｏｂｅ－Ｍｍ－Ｐｅｃａｍ１－Ｃ２、＃３１６７２１－Ｃ２；ＲＮＡｓｃｏｐｅ Ｐｒｏｂｅ －Ｍｍ－Ｐｄｇｆｒｂ－Ｃ３、＃４１１３８１－Ｃ３）と４２℃で２時間ハイブリダイズさせた。シグナル増幅、現像、及び対比染色は、プロトコルに従って行った。
【0028】
８．マウス脳血管細胞の単離及び初代培養
脳周皮細胞は、ＦＡＣＳを用いてＣＤ４５－ＣＤ４１－ＣＤ３１－ＣＤ１３＋細胞として単離した。具体的には、全脳皮質をメスで細断し、コラゲナーゼ／ディスパーゼ（３．３ｍｇ／ｍｌ）で３７℃、３０分間消化した。Ｐｅｒｃｏｌｌ（１８％）を用いて、５６０×ｇ, ４℃で１０分間遠心し、ミエリン及びデブリを除去した。Ｇｐｒ３０－ ヘテロ接合ＧＰＲ３０－Ｖｅｎｕｓ－ＫＩマウス（ＧＰＲ３０＋／Ｖｅｎｕｓ）からＦＡＣＳを用いてＶｅｎｕｓ陽性脳血管細胞をＶｅｎｕｓ陽性細胞として単離し、同じ手順を用いて回収した。
脳周皮細胞は、ＦＡＣＳを用いてＣＤ４５－ＣＤ４１－ＣＤ３１－ＣＤ１３＋細胞として単離した。具体的には、全脳皮質をメスで細断し、コラゲナーゼ／ディスパーゼ（３．３ｍｇ／ｍｌ）で３７℃、３０分間消化した。Ｐｅｒｃｏｌｌ（１８％）を用いて、５６０×ｇ, ４℃で１０分間遠心し、ミエリン及びデブリを除去した。Ｇｐｒ３０－ ヘテロ接合ＧＰＲ３０－Ｖｅｎｕｓ－ＫＩマウス（ＧＰＲ３０＋／Ｖｅｎｕｓ）からＦＡＣＳを用いてＶｅｎｕｓ陽性脳血管細胞をＶｅｎｕｓ陽性細胞として単離し、同じ手順を用いて回収した。
【0029】
９．ＭＣＡＯモデリング
マウスを５．０％イソフルランで麻酔導入し、小動物麻酔システムを用いて７０％Ｎ２Ｏ及び３０％Ｏ２中２．０％イソフルランで維持した。一過性脳限局性虚血（ＭＣＡＯ）は、管腔内フィラメント法を用いて誘発した（Ｎａｇａｓａｗａ，Ｈ．＆Ｋｏｇｕｒｅ，Ｋ．Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｆｌｏｗ ａｎｄ ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ａ ｎｅｗ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｍｉｄｄｌｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｒｔｅｒｙ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ．Ｓｔｒｏｋｅ ２０，１０３－１０４３（１９８９）．）。シリコン被膜ナイロンモノフィラメント（コーティング先端直径０．１８ｍｍ、長さ８～９ｍｍの自作フィラメント、Ｄｏｃｃｏｌ、６０２０４５ＰＫ１０、又は６０２２５６Ｒｅ）を、左ＭＣＡの６０分間閉塞に使用した。虚血症状の評価にはｍＮＳＳを用い、０（正常）～１８（最大欠損）のスケールで神経学的重症度を評価した（Ｃｈｅｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｂｅｎｅｆｉｔ ｏｆ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｓｔｒｏｋｅ ３２，１００５－１０１１（２００１）．）。
マウスを５．０％イソフルランで麻酔導入し、小動物麻酔システムを用いて７０％Ｎ２Ｏ及び３０％Ｏ２中２．０％イソフルランで維持した。一過性脳限局性虚血（ＭＣＡＯ）は、管腔内フィラメント法を用いて誘発した（Ｎａｇａｓａｗａ，Ｈ．＆Ｋｏｇｕｒｅ，Ｋ．Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｆｌｏｗ ａｎｄ ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ａ ｎｅｗ ｒａｔ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｍｉｄｄｌｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｒｔｅｒｙ ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ．Ｓｔｒｏｋｅ ２０，１０３－１０４３（１９８９）．）。シリコン被膜ナイロンモノフィラメント（コーティング先端直径０．１８ｍｍ、長さ８～９ｍｍの自作フィラメント、Ｄｏｃｃｏｌ、６０２０４５ＰＫ１０、又は６０２２５６Ｒｅ）を、左ＭＣＡの６０分間閉塞に使用した。虚血症状の評価にはｍＮＳＳを用い、０（正常）～１８（最大欠損）のスケールで神経学的重症度を評価した（Ｃｈｅｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｂｅｎｅｆｉｔ ｏｆ ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｏｎｅ ｍａｒｒｏｗ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ ｃｅｒｅｂｒａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ ｉｎ ｒａｔｓ．Ｓｔｒｏｋｅ ３２，１００５－１０１１（２００１）．）。
【0030】
１０．ＩｇＧ染色
ＭＣＡＯの３または７日後、脳を潅流固定し、４％パラホルムアルデヒドで一晩固定した。固定した脳を、クライオスタットを用いて２０μｍ厚の切片にスライスした。脳切片をブロッキング溶液で処理した（ＰＢＳ中の１０％ウマ血清）２０～２５℃で１時間、ＰＢＳＴ中の１０％ウマ血清中、ビオチン化抗マウスＩｇＧ（ｈ＋Ｌ）と共に４℃で一晩インキュベートした。シグナル増強のためABC法を使用し、ＤＡＢ発色を行った。デジタル顕微鏡を用いて画像の撮影と連結を行った。ＩｇＧ染色は、各マウスからの１２個の切片の強度値を積分することによって定量化した。
ＭＣＡＯの３または７日後、脳を潅流固定し、４％パラホルムアルデヒドで一晩固定した。固定した脳を、クライオスタットを用いて２０μｍ厚の切片にスライスした。脳切片をブロッキング溶液で処理した（ＰＢＳ中の１０％ウマ血清）２０～２５℃で１時間、ＰＢＳＴ中の１０％ウマ血清中、ビオチン化抗マウスＩｇＧ（ｈ＋Ｌ）と共に４℃で一晩インキュベートした。シグナル増強のためABC法を使用し、ＤＡＢ発色を行った。デジタル顕微鏡を用いて画像の撮影と連結を行った。ＩｇＧ染色は、各マウスからの１２個の切片の強度値を積分することによって定量化した。
【0031】
１１．クレジルバイオレット
染色ＭＣＡＯの３または７日後、脳を潅流固定し、４％パラホルムアルデヒドで一晩固定した。固定した脳を、クライオスタットを用いて２０μｍ厚の切片にスライスした。脳切片をクレシルバイオレット染色溶液（０．１５％酢酸を含む０．１％クレシルバイオレット溶液）中、３７℃で８分間インキュベートし、続いて１００％ＥｔＯＨで示差染色した。デジタル顕微鏡を用いて、画像撮影と連結を行った。クレシルバイオレット染色を、各マウスからの１２切片のクレシルバイオレット陰性領域の積分によって定量化した。
染色ＭＣＡＯの３または７日後、脳を潅流固定し、４％パラホルムアルデヒドで一晩固定した。固定した脳を、クライオスタットを用いて２０μｍ厚の切片にスライスした。脳切片をクレシルバイオレット染色溶液（０．１５％酢酸を含む０．１％クレシルバイオレット溶液）中、３７℃で８分間インキュベートし、続いて１００％ＥｔＯＨで示差染色した。デジタル顕微鏡を用いて、画像撮影と連結を行った。クレシルバイオレット染色を、各マウスからの１２切片のクレシルバイオレット陰性領域の積分によって定量化した。
【0032】
１２．ＴＵＮＥＬ ａｓｓａｙ
ＴＵＮＥＬ染色を２０μｍ厚の凍結脳切片を用いて行った。続いて、デジタル顕微鏡を使用して１～４μｍ厚のｚスタック画像を取得し、再構成した。ＴＵＮＥＬ陽性細胞の定量化には、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を用いた。
ＴＵＮＥＬ染色を２０μｍ厚の凍結脳切片を用いて行った。続いて、デジタル顕微鏡を使用して１～４μｍ厚のｚスタック画像を取得し、再構成した。ＴＵＮＥＬ陽性細胞の定量化には、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ）を用いた。
【0033】
１３．レーザードップラー流量計
レーザードップラー流量計を使用して、ＭＣＡ閉塞前及び閉塞中、及び再灌流２０分後の脳血流の変化を継続的にモニタリングした。レーザードップラープローブは、手術前にブレグマの後方１．０ｍｍ、側方５．０ｍｍの点で頭蓋骨の左側の表面に接着された。脳血流は、ＭＣＡＯ手術前（基礎血流）、総頚動脈（ＣＣＡ）閉塞中、ＭＣＡＯ、及び再灌流中に継続的にモニタリングされた。脳血流量は基礎血流量に対する比率として正規化した。
レーザードップラー流量計を使用して、ＭＣＡ閉塞前及び閉塞中、及び再灌流２０分後の脳血流の変化を継続的にモニタリングした。レーザードップラープローブは、手術前にブレグマの後方１．０ｍｍ、側方５．０ｍｍの点で頭蓋骨の左側の表面に接着された。脳血流は、ＭＣＡＯ手術前（基礎血流）、総頚動脈（ＣＣＡ）閉塞中、ＭＣＡＯ、及び再灌流中に継続的にモニタリングされた。脳血流量は基礎血流量に対する比率として正規化した。
【0034】
実施例１（重炭酸イオン受容体の存在の発見及び重炭酸イオン受容体遺伝子の特定１）
ＧＰＲ３０を安定発現させたＭＣＦ細胞（ＭＣＦ－ＧＰＲ３０）及びＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ－ＧＰＲ３０）に重炭酸ナトリウム又は重炭酸カリウムを添加したところ、細胞内カルシウムが上昇した（図１及び図２）。また、混合無機酸溶液から重炭酸ナトリウムを除いて添加すると、ＭＣＦ－ＧＰＲ３０細胞における細胞内カルシウムレベルの上昇が見られなくなった（図３）。
ＧＰＲ３０を安定発現させたＭＣＦ細胞（ＭＣＦ－ＧＰＲ３０）及びＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ－ＧＰＲ３０）に重炭酸ナトリウム又は重炭酸カリウムを添加したところ、細胞内カルシウムが上昇した（図１及び図２）。また、混合無機酸溶液から重炭酸ナトリウムを除いて添加すると、ＭＣＦ－ＧＰＲ３０細胞における細胞内カルシウムレベルの上昇が見られなくなった（図３）。
【0035】
実施例２（重炭酸イオン受容体遺伝子の特定２）
ＧＰＲ３０をコードする配列のみを除いた空ベクターをＨＥＫ２９３細胞に安定発現させてｍｏｃｋ細胞を作成した。また、重炭酸イオン受容体の1アミノ酸置換変異体をＨＥＫ２９３細胞に安定発現させた。重炭酸ナトリウムを添加した。
その結果、ｍｏｃｋ細胞及び1アミノ酸置換体では重炭酸ナトリウム添加による細胞内カルシウムの上昇が検出されなかった（図４）ことから、本受容体の当該アミノ酸が細胞内カルシウムの上昇に重要であることがわかった。
ＧＰＲ３０をコードする配列のみを除いた空ベクターをＨＥＫ２９３細胞に安定発現させてｍｏｃｋ細胞を作成した。また、重炭酸イオン受容体の1アミノ酸置換変異体をＨＥＫ２９３細胞に安定発現させた。重炭酸ナトリウムを添加した。
その結果、ｍｏｃｋ細胞及び1アミノ酸置換体では重炭酸ナトリウム添加による細胞内カルシウムの上昇が検出されなかった（図４）ことから、本受容体の当該アミノ酸が細胞内カルシウムの上昇に重要であることがわかった。
【0036】
実施例３（重炭酸イオン受容体安定発現細胞の作製）
ＧＰＲ３０の翻訳領域をコードするＤＮＡ配列をプラスミドベクターに組み込み、発現ベクターを作成した。この発現ベクターをトランスフェクトし、薬剤耐性によって安定発現細胞を選択した。
結果を、図５に示す。
図５から明らかなように、ＧＰＲ３０安定発現細胞では、重炭酸イオンにより細胞内カルシウム濃度が上昇することがわかる。
ＧＰＲ３０の翻訳領域をコードするＤＮＡ配列をプラスミドベクターに組み込み、発現ベクターを作成した。この発現ベクターをトランスフェクトし、薬剤耐性によって安定発現細胞を選択した。
結果を、図５に示す。
図５から明らかなように、ＧＰＲ３０安定発現細胞では、重炭酸イオンにより細胞内カルシウム濃度が上昇することがわかる。
【0037】
実施例４（種々の動物種の重炭酸イオン受容体の重炭酸イオンによる活性化）
ヒト、マウス、ラット、ゼブラフィッシュの重炭酸イオン受容体の発現ベクターを作成し、ＨＥＫ２９３細胞にＧＰＲ３０を過剰発現させてＧＰＣＲ活性化を検出した。
その結果、図６に示すように、ヒト細胞だけでなく、ラット、マウス、ゼブラフィッシュのＧＰＲ３０も重炭酸イオンによって活性化されることがわかる。
ヒト、マウス、ラット、ゼブラフィッシュの重炭酸イオン受容体の発現ベクターを作成し、ＨＥＫ２９３細胞にＧＰＲ３０を過剰発現させてＧＰＣＲ活性化を検出した。
その結果、図６に示すように、ヒト細胞だけでなく、ラット、マウス、ゼブラフィッシュのＧＰＲ３０も重炭酸イオンによって活性化されることがわかる。
【0038】
実施例５（初代培養細胞の重炭酸イオンによる活性化）
初代培養を脳から単離培養し、プローブを用いて細胞内カルシウムを測定した。
その結果、図７より、ＧＰＲ３０を発現する初代培養細胞は、重炭酸ナトリウムによって活性化されることがわかる。
初代培養を脳から単離培養し、プローブを用いて細胞内カルシウムを測定した。
その結果、図７より、ＧＰＲ３０を発現する初代培養細胞は、重炭酸ナトリウムによって活性化されることがわかる。
【0039】
実施例６（重炭酸イオン受容体発現細胞の生体内分布）
Ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎにより、ＧＰＲ３０とペリサイトマーカーであるｐｄｇｆｒｂを検出した。
また、ＧＰＲ３０を蛍光タンパク質Ｖｅｎｕｓに置き換えたマウスを作成し、脳切片を用いてペリサイトマーカーであるＣＤ１３の免疫染色を行った。
その結果、図８及び図９より、生体内の脳ペリサイトで重炭酸イオン受容体が発現していることがわかる。
Ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎにより、ＧＰＲ３０とペリサイトマーカーであるｐｄｇｆｒｂを検出した。
また、ＧＰＲ３０を蛍光タンパク質Ｖｅｎｕｓに置き換えたマウスを作成し、脳切片を用いてペリサイトマーカーであるＣＤ１３の免疫染色を行った。
その結果、図８及び図９より、生体内の脳ペリサイトで重炭酸イオン受容体が発現していることがわかる。
【0040】
実施例７（重炭酸イオン受容体遺伝子欠損モデルの作成）
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムにより、Ｇｐｒ３０遺伝子の配列を一部変化させて、本来のＧＰＲ３０ができない配列とすることにより、作成した。
重炭酸イオン受容体機能欠損マウスを樹立した。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムにより、Ｇｐｒ３０遺伝子の配列を一部変化させて、本来のＧＰＲ３０ができない配列とすることにより、作成した。
重炭酸イオン受容体機能欠損マウスを樹立した。
【0041】
実施例８（脳虚血・再灌流モデル）
麻酔下に、左頸動脈から塞栓糸を入れ、左中大脳動脈の分岐部を閉塞させ、虚血を誘導した。１時間の虚血ののち、塞栓糸を引き抜き再灌流した。
図１０～図１３に示すように、重炭酸イオン受容体機能欠損マウスでは、脳虚血再灌流における梗塞巣の大きさ及び血液脳関門の破綻が軽減されており、虚血再灌流後のアポトーシスが軽減されており、血流の回復が早くなることがわかった。グラフは、Ｌｉｎｅ１０６のデータを示すが、Ｌｉｎｅ３０４も同様の結果であった。
麻酔下に、左頸動脈から塞栓糸を入れ、左中大脳動脈の分岐部を閉塞させ、虚血を誘導した。１時間の虚血ののち、塞栓糸を引き抜き再灌流した。
図１０～図１３に示すように、重炭酸イオン受容体機能欠損マウスでは、脳虚血再灌流における梗塞巣の大きさ及び血液脳関門の破綻が軽減されており、虚血再灌流後のアポトーシスが軽減されており、血流の回復が早くなることがわかった。グラフは、Ｌｉｎｅ１０６のデータを示すが、Ｌｉｎｅ３０４も同様の結果であった。
【0042】
Ｌｉｎｅ１０６：削除配列（２７５８－２９９７）
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【0043】
Ｌｉｎｅ３０４：削除配列（２９８１－２９８５）
ＡＡＣＡＴ
ＡＡＣＡＴ
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】