特開 2024-99541 皮膚充填剤としての架橋ＨＡ－コラーゲンヒドロゲル

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024099541

(43)【公開日】2024-07-25

(54)【発明の名称】皮膚充填剤としての架橋ＨＡ－コラーゲンヒドロゲル

(51)【国際特許分類】

   A61L 27/24 20060101AFI20240718BHJP

   A61K 8/02 20060101ALI20240718BHJP

   A61K 8/04 20060101ALI20240718BHJP

   A61K 8/44 20060101ALI20240718BHJP

   A61K 8/65 20060101ALI20240718BHJP

   A61K 8/73 20060101ALI20240718BHJP

   A61K 9/06 20060101ALI20240718BHJP

   A61K 31/167 20060101ALI20240718BHJP

   A61K 47/18 20170101ALI20240718BHJP

   A61K 47/36 20060101ALI20240718BHJP

   A61K 47/42 20170101ALI20240718BHJP

   A61L 27/20 20060101ALI20240718BHJP

   A61L 27/44 20060101ALI20240718BHJP

   A61L 27/52 20060101ALI20240718BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20240718BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240718BHJP

   A61Q 19/00 20060101ALI20240718BHJP

   A61Q 19/08 20060101ALI20240718BHJP

【ＦＩ】

A61L27/24

A61K8/02

A61K8/04

A61K8/44

A61K8/65

A61K8/73

A61K9/06

A61K31/167

A61K47/18

A61K47/36

A61K47/42

A61L27/20

A61L27/44

A61L27/52

A61P17/00

A61P43/00

A61Q19/00

A61Q19/08

【審査請求】有

【請求項の数】20

【出願形態】ＯＬ

【外国語出願】

(21)【出願番号】P 2024060349

(22)【出願日】2024-04-03

(62)【分割の表示】P 2022539263の分割

【原出願日】2020-12-28

(31)【優先権主張番号】62/953,910

(32)【優先日】2019-12-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(71)【出願人】

【識別番号】591018268

【氏名又は名称】アラーガン、インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＡＬＬＥＲＧＡＮ，ＩＮＣＯＲＰＯＲＡＴＥＤ

(74)【代理人】

【識別番号】110000855

【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】トレイナ、クリストファー エイ．

(72)【発明者】

【氏名】クティコフ、アルテム ビー．

(72)【発明者】

【氏名】ユー、シャオジェ

(72)【発明者】

【氏名】ヒー、クリストファー ケイ．

(72)【発明者】

【氏名】メッシーナ、ダリン ジェイ．

(72)【発明者】

【氏名】モレル、ジュリー

(72)【発明者】

【氏名】ドゥリュー、フローラン

(72)【発明者】

【氏名】ゲッタ、オリヴィエ

(72)【発明者】

【氏名】ロカ、マルチネス、ジャン － グザヴィエ

【テーマコード（参考）】

4C076

4C081

4C083

4C206

【Ｆターム（参考）】

4C076AA09

4C076BB31

4C076CC21

4C076DD51

4C076EE37A

4C076EE43A

4C076EE45A

4C081AB19

4C081AB37

4C081CD08

4C081CD12

4C081CE11

4C081DA12

4C083AC581

4C083AC582

4C083AC641

4C083AD331

4C083AD332

4C083AD431

4C083AD432

4C083CC02

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4C083EE12

4C083FF01

4C206AA01

4C206AA02

4C206GA19

4C206GA31

4C206KA01

4C206MA03

4C206MA05

4C206MA83

4C206NA14

4C206ZA89

(57)【要約】      （修正有）

【課題】改善された皮膚充填剤を提供する。
【解決手段】皮膚充填剤をヒトの顔の解剖学的特徴に注入することにより解剖学的特徴の審美性を改善するための皮膚充填剤であって、前記皮膚充填剤が、リジンと、ヒアルロン酸と、コラーゲンとを含む架橋高分子マトリックスを含み、前記ヒアルロン酸が、前記コラーゲン上の少なくとも１つの内因性アミン基及び前記リジン上に存在する少なくとも１つのアミン基によって前記コラーゲンに架橋されている、皮膚充填剤である。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

リジンと、
ヒアルロン酸と、
コラーゲンと
を含む架橋高分子マトリックスであって、
前記ヒアルロン酸が、前記コラーゲン上の少なくとも１つの内因性アミン基及び／又は前記リジン上に存在する少なくとも１つのアミン基によって前記コラーゲンに架橋されている、架橋高分子マトリックス。

【請求項2】

リドカインをさらに含む、請求項１に記載の架橋高分子マトリックス。

【請求項3】

前記リドカインが、前記マトリックス中、約０．１５％（ｗ／ｗ）から約０．４５％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度である、請求項１又は２に記載の架橋高分子マトリックス。

【請求項4】

前記リドカインが、前記マトリックスの約０．１５％（ｗ／ｗ）、約０．１７％（ｗ／ｗ）、約０．１９％（ｗ／ｗ）、約０．２１％（ｗ／ｗ）、約０．２３％（ｗ／ｗ）、約０．２５％（ｗ／ｗ）、約０．２７％（ｗ／ｗ）、約０．２９％（ｗ／ｗ）、約０．３１％（ｗ／ｗ）、約０．３３％（ｗ／ｗ）、約０．３５％（ｗ／ｗ）、約０．３７％（ｗ／ｗ）、約０．３７％（ｗ／ｗ）、約０．３９％（ｗ／ｗ）、約０．４１％（ｗ／ｗ）、約０．４３％（ｗ／ｗ）、若しくは約０．４５％（ｗ／ｗ）の濃度、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の濃度である、請求項１～３のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【請求項5】

前記リドカインが、前記マトリックス中、約０．２７％（ｗ／ｗ）から約０．３３％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度である、請求項１～４のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【請求項6】

前記マトリックスが、非架橋ＨＡをさらに含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【請求項7】

前記非架橋ＨＡが、前記マトリックス中、最大約５％（ｗ／ｗ）の濃度を有する、請求項６に記載の架橋高分子マトリックス。

【請求項8】

前記非架橋ＨＡが、前記マトリックス中、約０％（ｗ／ｗ）、約１％（ｗ／ｗ）、約２％（ｗ／ｗ）、約３％（ｗ／ｗ）、約４％（ｗ／ｗ）若しくは約５％（ｗ／ｗ）の濃度、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の濃度を有する、請求項６又は７に記載の架橋高分子マトリックス。

【請求項9】

前記非架橋ＨＡが、前記マトリックス中、約１％（ｗ／ｗ）の濃度を有する、請求項６～８のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【請求項10】

前記非架橋ＨＡが、前記マトリックス中、約２％（ｗ／ｗ）の濃度を有する、請求項６～８のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【請求項11】

前記非架橋ＨＡが、前記マトリックス中、約５％（ｗ／ｗ）の濃度を有する、請求項６～８のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【請求項12】

前記非架橋ＨＡが、前記高分子マトリックスの押出性を改善する、請求項６～１１のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【請求項13】

約６ヶ月間、約１２ヶ月間、約１８ヶ月間、約２４ヶ月間、約３０ヶ月間若しくは約３６ヶ月間、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の時間にわたって安定である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【請求項14】

約４℃～約２５℃の温度で安定である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【請求項15】

約４℃の温度で安定である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【請求項16】

約２５℃の温度で安定である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【請求項17】

約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約７ヶ月、約８ヶ月、約９ヶ月、約１０ヶ月、約１１ヶ月、約１２ヶ月、約１３ヶ月、約１４ヶ月、約１５ヶ月、約１６ヶ月、約１７ヶ月、約１８ヶ月、約１９ヶ月、約２０ヶ月、約２１ヶ月、約２２ヶ月、約２３ヶ月、約２４ヶ月、約２５ヶ月、約２６ヶ月、約２７ヶ月、約２８ヶ月、約２９ヶ月、約３０ヶ月、約３１ヶ月、約３２ヶ月、約３３ヶ月、約３４ヶ月、約３５ヶ月、約３６ヶ月、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の時点で安定である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【請求項18】

約６ヶ月間、約１２ヶ月間、約１８ヶ月間、約２４ヶ月間、約３０ヶ月間若しくは約３６ヶ月間、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の時間で分解がごくわずかである、請求項１～１７のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【請求項19】

前記マトリックスが、約３０Ｐａから約１０，０００Ｐａの弾性率（Ｇ’）、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の弾性率を有する、請求項１～１８のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【請求項20】

前記マトリックスが、約３０Ｐａ、約４０Ｐａ、約５０Ｐａ、約６０Ｐａ、約７０Ｐａ、約８０Ｐａ、約９０Ｐａ、約１００Ｐａ、約２００Ｐａ、約３００Ｐａ、約４００Ｐａ、約５００Ｐａ、約６００Ｐａ、約７００Ｐａ、約８００Ｐａ、約９００Ｐａ、約１０００Ｐａ、約１１００Ｐａ、約１２００Ｐａ、約１３００Ｐａ、約１４００Ｐａ、約１５００Ｐａ、約１６００Ｐａ、約１７００Ｐａ、約１８００Ｐａ、約１９００Ｐａ、約２０００Ｐａ、約２１００Ｐａ、約２２００Ｐａ、約２３００Ｐａ、約２４００Ｐａ、約２５００Ｐａ、約２６００Ｐａ、約２７００Ｐａ、約２８００Ｐａ、約２９００Ｐａ、約３０００Ｐａ、約３１００Ｐａ、約３２００Ｐａ、約３３００Ｐａ、約３４００Ｐａ、約３５００Ｐａ、約３６００Ｐａ、約３７００Ｐａ、約３８００Ｐａ、約３９００Ｐａ、約４０００Ｐａ、約４１００Ｐａ、約４２００Ｐａ、約４３００Ｐａ、約４４００Ｐａ、約４５００Ｐａ、約４６００Ｐａ、約４７００Ｐａ、約４８００Ｐａ、約４９００Ｐａ、約５０００Ｐａ、約５１００Ｐａ、約５２００Ｐａ、約５３００Ｐａ、約５４００Ｐａ、約５５００Ｐａ、約５６００Ｐａ、約５７００Ｐａ、約５８００Ｐａ、約５９００Ｐａ、約６０００Ｐａ、約６１００Ｐａ、約６２００Ｐａ、約６３００Ｐａ、約６４００Ｐａ、約６５００Ｐａ、約６６００Ｐａ、約６７００Ｐａ、約６８００Ｐａ、約６９００Ｐａ、約７０００Ｐａ、約７１００Ｐａ、約７２００Ｐａ、約７３００Ｐａ、約７４００Ｐａ、約７５００Ｐａ、約７６００Ｐａ、約７７００Ｐａ、約７８００Ｐａ、約７９００Ｐａ、約８０００Ｐａ、約８１００Ｐａ、約８２００Ｐａ、約８３００Ｐａ、約８４００Ｐａ、約８５００Ｐａ、約８６００Ｐａ、約８７００Ｐａ、約８８００Ｐａ、約８９００Ｐａ、約９０００Ｐａ、約９１００Ｐａ、約９２００Ｐａ、約９３００Ｐａ、約９４００Ｐａ、約９５００Ｐａ、約９６００Ｐａ、約９７００Ｐａ、約９８００Ｐａ、約９９００Ｐａ若しくは約１００００Ｐａの弾性率（Ｇ’）、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の弾性率を有する、請求項１～１９のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【請求項21】

前記マトリックスが、約１０ｇｍｆ、約２０ｇｍｆ、約３０ｇｍｆ、約４０ｇｍｆ、約５０ｇｍｆ、約６０ｇｍｆ、約７０ｇｍｆ、約８０ｇｍｆ、約９０ｇｍｆ、約１００ｇｍｆ、約１１０ｇｍｆ、約１２０ｇｍｆ、約１３０ｇｍｆ、約１４０ｇｍｆ、約１５０ｇｍｆ、約１６０ｇｍｆ、約１７０ｇｍｆ、約１８０ｇｍｆ、約１９０ｇｍｆ、約２００ｇｍｆ、約２１０ｇｍｆ、約２２０ｇｍｆ、約２３０ｇｍｆ、約２４０ｇｍｆ、約２５０ｇｍｆ、約２６０ｇｍｆ、約２７０ｇｍｆ、約２８０ｇｍｆ、約２９０ｇｍｆ、約３００ｇｍｆ、約３１０ｇｍｆ、約３２０ｇｍｆ、約３３０ｇｍｆ、約３４０ｇｍｆ、約３５０ｇｍｆ、約３６０ｇｍｆ、約３７０ｇｍｆ、約３８０ｇｍｆ、約３９０ｇｍｆ、約４００ｇｍｆ、約４１０ｇｍｆ、約４２０ｇｍｆ、約４３０ｇｍｆ、約４４０ｇｍｆ、約４５０ｇｍｆ、約４６０ｇｍｆ、約４７０ｇｍｆ、約４８０ｇｍｆ、約４９０ｇｍｆ、約５００ｇｍｆ、約５１０ｇｍｆ、約５２０ｇｍｆ、約５３０ｇｍｆ、約５４０ｇｍｆ、約５５０ｇｍｆ、約５６０ｇｍｆ、約５７０ｇｍｆ、約５８０ｇｍｆ、約５９０ｇｍｆ若しくは約６００ｇｍｆの圧縮力値、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の圧縮力値を有する、請求項１～２０のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【請求項22】

前記マトリックスが、約１００ｇｍｆ、約２００ｇｍｆ、約３００ｇｍｆ、約４００ｇｍｆ、約５００ｇｍｆ若しくは約６００ｇｍｆの圧縮力値、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の圧縮力値を有する、請求項１～２１のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【請求項23】

前記ヒアルロン酸が、約５ｍｇ／ｍｌ、約６ｍｇ／ｍｌ、約８ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ、約１２ｍｇ／ｍｌ、約１４ｍｇ／ｍｌ、約１６ｍｇ／ｍｌ、約１８ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２２ｍｇ／ｍｌ、約２４ｍｇ／ｍｌ、約２６ｍｇ／ｍｌ、約２８ｍｇ／ｍｌ、約３０ｍｇ／ｍｌ、約３２ｍｇ／ｍｌ、約３４ｍｇ／ｍｌ若しくは約３６ｍｇ／ｍｌの濃度、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の濃度である、請求項１～２２のいずれか一項に記載の架橋高分子混合物。

【請求項24】

前記コラーゲンが、Ｉ型コラーゲンを含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【請求項25】

前記コラーゲンが、ＩＩ型コラーゲンを含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【請求項26】

前記コラーゲンが、ＩＩＩ型コラーゲンを含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【請求項27】

前記コラーゲンが、０％から３％のＩＩ型コラーゲンを含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【請求項28】

前記コラーゲンが、１％～３％のＩ型コラーゲンを含む、請求項１～２７のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【請求項29】

前記マトリックスが、約０％から約３％のＩＩＩ型コラーゲンを含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【請求項30】

前記コラーゲンが、約９７％から約９９％のＩ型コラーゲンを含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【請求項31】

前記コラーゲンが、Ｉ型コラーゲンとＩＩＩ型コラーゲンの両方の混合物を含む、請求項１～３０のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【請求項32】

前記コラーゲンが、約１ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌ、約６ｍｇ／ｍｌ、約８ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ、約１２ｍｇ／ｍｌ、約１４ｍｇ／ｍｌの濃度、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の濃度を有する、請求項１～３１のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【請求項33】

塩をさらに含む、請求項１～３２のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【請求項34】

約５０ｍＭから約４００ｍＭの範囲のＮａＣｌを含む、請求項３３に記載の架橋高分子マトリックス。

【請求項35】

ＮａＣｌを含み、前記ＮａＣｌが約５０ｍＭ、約７５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１２５ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１７５ｍＭ、約２００ｍＭ、約２２５ｍＭ、約２５０ｍＭ、約２７５ｍＭ、約３００ｍＭ、約３２５ｍＭ、約３５０ｍＭ、約３７５ｍＭ若しくは約４００ｍＭの濃度、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の濃度を有する、請求項１～３４のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【請求項36】

ＮａＣｌを含み、前記ＮａＣｌが約１５０ｍＭの濃度を有する、請求項１～３５のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【請求項37】

約０．０１Ｍのリン酸緩衝液、約１３７ｍＭのＮａＣｌ、及び約２．７ｍＭの濃度のＫＣｌを含む、請求項１～３５のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【請求項38】

針及び／又はカニューレを用いた注入又は用途のために製剤化される、請求項１～３７のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【請求項39】

前記ヒアルロン酸成分が、約２０，０００ダルトンから約１０，０００，０００ダルトンの平均分子量を有する、請求項１～３８のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【請求項40】

前記ヒアルロン酸成分が、約２０，０００ダルトン、約４０，０００ダルトン、約６０，０００ダルトン、約８０，０００ダルトン、約１００，０００ダルトン、約２００，０００ダルトン、約３００，０００ダルトン、約４００，０００ダルトン、約５００，０００ダルトン、約６００，０００ダルトン、約７００，０００ダルトン、約８００，０００ダルトン、約９００，０００ダルトン、約１，０００，０００ダルトン、約１，１００，０００ダルトン、約１，２００，０００ダルトン、約１，３００，０００ダルトン、約１，４００，０００ダルトン、約１，５００，０００ダルトン、約１，６００，０００ダルトン、約１，７００，０００ダルトン、約１，８００，０００ダルトン、約１，９００，０００ダルトン、約２，０００，０００ダルトン、約２，１００，０００ダルトン、約２，２００，０００ダルトン、約２，３００，０００ダルトン、約２，４００，０００ダルトン、約２，５００，０００ダルトン、約２，６００，０００ダルトン、約２，７００，０００ダルトン、約２，８００，０００ダルトン、約２，９００，０００ダルトン、約３，０００，０００ダルトン、約３，１００，０００ダルトン、約３，２００，０００ダルトン、約３，３００，０００ダルトン、約３，４００，０００ダルトン、約３，５００，０００ダルトン、約３，６００，０００ダルトン、約３，７００，０００ダルトン、約３，８００，０００ダルトン、約３，９００，０００ダルトン、約４，０００，０００ダルトン、約４，１００，０００ダルトン、約４，２００，０００ダルトン、約４，３００，０００ダルトン、約４，４００，０００ダルトン、約４，５００，０００ダルトン、約４，６００，０００ダルトン、約４，７００，０００ダルトン、約４，８００，０００ダルトン、約４，９００，０００ダルトン、約５，０００，０００ダルトン、約５，１００，０００ダルトン、約５，２００，０００ダルトン、約５，３００，０００ダルトン、約５，４００，０００ダルトン、約５，５００，０００ダルトン、約５，６００，０００ダルトン、約５，７００，０００ダルトン、約５，８００，０００ダルトン、約５，９００，０００ダルトン、約６，０００，０００ダルトン、約６，１００，０００ダルトン、約６，２００，０００ダルトン、約６，３００，０００ダルトン、約６，４００，０００ダルトン、約６，５００，０００ダルトン、約６，６００，０００ダルトン、約６，７００，０００ダルトン、約６，８００，０００ダルトン、約６，９００，０００ダルトン、約７，０００，０００ダルトン、約７，１００，０００ダルトン、約７，２００，０００ダルトン、約７，３００，０００ダルトン、約７，４００，０００ダルトン、約７，５００，０００ダルトン、約７，６００，０００ダルトン、約７，７００，０００ダルトン、約７，８００，０００ダルトン、約７，９００，０００ダルトン、約８，０００，０００ダルトン、約８，１００，０００ダルトン、約８，２００，０００ダルトン、約８，３００，０００ダルトン、約８，４００，０００ダルトン、約８，５００，０００ダルトン、約８，６００，０００ダルトン、約８，７００，０００ダルトン、約８，８００，０００ダルトン、約８，９００，０００ダルトン、約９，０００，０００ダルトン、約９，１００，０００ダルトン、約９，２００，０００ダルトン、約９，３００，０００ダルトン、約９，４００，０００ダルトン、約９，５００，０００ダルトン、約９，６００，０００ダルトン、約９，７００，０００ダルトン、約９，８００，０００ダルトン、約９，９００，０００ダルトン若しくは約１０，０００，０００ダルトンの平均分子量、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の分子量を有する、請求項３９に記載の架橋高分子マトリックス。

【請求項41】

前記ヒアルロン酸が、異なる分子量を有するヒアルロン酸成分の混合物を含み、前記混合物が、約２０，０００ダルトン、約４０，０００ダルトン、約６０，０００ダルトン、約８０，０００ダルトン、約１００，０００ダルトン、約２００，０００ダルトン、約３００，０００ダルトン、約４００，０００ダルトン、約５００，０００ダルトン、約６００，０００ダルトン、約７００，０００ダルトン、約８００，０００ダルトン、約９００，０００ダルトン、約１，０００，０００ダルトン、約１，５００，０００ダルトン、約２，０００，０００ダルトン、約２，５００，０００ダルトン、約３，０００，０００ダルトン、約３，５００，０００ダルトン、約４，０００，０００ダルトン、約４，５００，０００ダルトン、約５，０００，０００ダルトン、約５，５００，０００ダルトン、約６，０００，０００ダルトン、約６，５００，０００ダルトン、約７，５００，０００ダルトン、約８，０００，０００ダルトン、約８，５００，０００ダルトン、約９，０００，０００ダルトン、約９，５００，０００ダルトン、ａｎｄ／ｏｒ約１０，０００，０００ダルトンの平均分子量を有するヒアルロン酸、及び／又は前述の任意の２つの値の間の範囲内の分子量を有する任意のヒアルロン酸を含む、請求項１～４０のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【請求項42】

ヒアルロン酸と、
コラーゲンと、
リジンと、
緩衝液と
を含み、水性ヒドロゲルである、
組成物。

【請求項43】

前記ヒアルロン酸が、前記コラーゲン上の少なくとも１つの内因性アミン基及び／又は前記リジン上に存在する少なくとも１つのアミン基によって前記コラーゲンに架橋されている、請求項４２に記載の組成物。

【請求項44】

リドカインをさらに含む、請求項４２又は４３に記載の組成物。

【請求項45】

前記リドカインが、前記マトリックス中、約０．１５％（ｗ／ｗ）から約０．４５％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度である、請求項４４に記載の組成物。

【請求項46】

前記リドカインが、前記組成物の約０．１５％（ｗ／ｗ）、約０．１７％（ｗ／ｗ）、約０．１９％（ｗ／ｗ）、約０．２１％（ｗ／ｗ）、約０．２３％（ｗ／ｗ）、約０．２５％（ｗ／ｗ）、約０．２７％（ｗ／ｗ）、約０．２９％（ｗ／ｗ）、約０．３１％（ｗ／ｗ）、約０．３３％（ｗ／ｗ）、約０．３５％（ｗ／ｗ）、約０．３７％（ｗ／ｗ）、約０．３７％（ｗ／ｗ）、約０．３９％（ｗ／ｗ）、約０．４１％（ｗ／ｗ）、約０．４３％（ｗ／ｗ）若しくは約０．４５％（ｗ／ｗ）の濃度、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の濃度である、請求項４４又は４５に記載の組成物。

【請求項47】

非架橋ＨＡをさらに含む、請求項４２～４６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項48】

前記非架橋架橋ＨＡが、前記組成物中、最大約５％（ｗ／ｗ）の濃度を有する、請求項４７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項49】

前記非架橋ＨＡが、前記組成物中、約０％（ｗ／ｗ）、約１％（ｗ／ｗ）、約２％（ｗ／ｗ）、約３％（ｗ／ｗ）、約４％（ｗ／ｗ）、約５％（ｗ／ｗ）の濃度、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の濃度を有する、請求項４７又は４８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項50】

前記非架橋ＨＡが、前記組成物中、約１％（ｗ／ｗ）の濃度を有する、請求項４７～４９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項51】

前記非架橋ＨＡが、前記組成物中、約２％（ｗ／ｗ）の濃度を有する、請求項４７～４９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項52】

前記非架橋ＨＡが、前記組成物中、約５％（ｗ／ｗ）の濃度を有する、請求項４７～４９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項53】

前記非架橋ＨＡが、前記組成物の押出性を改善する、請求項４７～５２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項54】

前記緩衝液が、リン酸緩衝生理食塩水である、請求項４２～５３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項55】

前記ヒアルロン酸が、約２０，０００ダルトンから約１０，０００，０００ダルトンの平均分子量を有する、請求項４２～５４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項56】

前記ヒアルロン酸が、異なる分子量を有するヒアルロン酸成分の混合物を含み、前記混合物が、約２０，０００ダルトン、約４０，０００ダルトン、約６０，０００ダルトン、約８０，０００ダルトン、約１００，０００ダルトン、約２００，０００ダルトン、約３００，０００ダルトン、約４００，０００ダルトン、約５００，０００ダルトン、約６００，０００ダルトン、約７００，０００ダルトン、約８００，０００ダルトン、約９００，０００ダルトン、約１，０００，０００ダルトン、約１，５００，０００ダルトン、約２，０００，０００ダルトン、約２，５００，０００ダルトン、約３，０００，０００ダルトン、約３，５００，０００ダルトン、約４，０００，０００ダルトン、約４，５００，０００ダルトン、約５，０００，０００ダルトン、約５，５００，０００ダルトン、約６，０００，０００ダルトン、約６，５００，０００ダルトン、約７，５００，０００ダルトン、約８，０００，０００ダルトン、約８，５００，０００ダルトン、約９，０００，０００ダルトン、約９，５００，０００ダルトン及び／又は約１０，０００，０００ダルトンの分子量を有するヒアルロン酸、及び／又は前述の任意の２つの値の間の範囲内の分子量を有する任意のヒアルロン酸を含む、請求項４２～５５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項57】

前記コラーゲンが、Ｉ型コラーゲンを含む、請求項４２～５６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項58】

前記コラーゲンが、ＩＩ型コラーゲンを含む、請求項４２～５７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項59】

前記コラーゲンが、ＩＩＩ型コラーゲンを含む、請求項４２～５８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項60】

約４，０００Ｐａ Ｓ、約４１００Ｐａ Ｓ、約４２００Ｐａ Ｓ、約４３００Ｐａ Ｓ、約４４００Ｐａ Ｓ、約４５００Ｐａ Ｓ、約４６００Ｐａ Ｓ、約４７００Ｐａ Ｓ、約４８００Ｐａ Ｓ、約４９００Ｐａ Ｓ、約５０００Ｐａ Ｓ、約５１００Ｐａ Ｓ、約５２００Ｐａ Ｓ、約５３００Ｐａ Ｓ、約５４００Ｐａ Ｓ、約５５００Ｐａ Ｓ、約５６００Ｐａ Ｓ、約５７００Ｐａ Ｓ、約５８００Ｐａ Ｓ、約５９００Ｐａ Ｓ、約６０００Ｐａ Ｓ、約６１００Ｐａ Ｓ、約６２００Ｐａ Ｓ、約６３００Ｐａ Ｓ、約６４００Ｐａ Ｓ、約６５００Ｐａ Ｓ、約６６００Ｐａ Ｓ、約６７００Ｐａ Ｓ、約６８００Ｐａ Ｓ、約６９００Ｐａ Ｓ、約７０００Ｐａ Ｓ、約７１００Ｐａ Ｓ、約７２００Ｐａ Ｓ、約７３００Ｐａ Ｓ、約７４００Ｐａ Ｓ、約７５００Ｐａ Ｓ、約７６００Ｐａ Ｓ、約７７００Ｐａ Ｓ、約７８００Ｐａ Ｓ、約７９００Ｐａ Ｓ、約８０００Ｐａ Ｓ、約８１００Ｐａ Ｓ、約８２００Ｐａ Ｓ、約８３００Ｐａ Ｓ、約８４００Ｐａ Ｓ、約８５００Ｐａ Ｓ、約８６００Ｐａ Ｓ、約８７００Ｐａ Ｓ、約８８００Ｐａ Ｓ、約８９００Ｐａ Ｓ、約９０００Ｐａ Ｓ、約９１００Ｐａ Ｓ、約９２００Ｐａ Ｓ、約９３００Ｐａ Ｓ、約９４００Ｐａ Ｓ、約９５００Ｐａ Ｓ、約９６００Ｐａ Ｓ、約９７００Ｐａ Ｓ、約９８００Ｐａ Ｓ、約９９００Ｐａ Ｓ若しくは約１０，０００Ｐａ Ｓの粘度、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の粘度を有する、請求項４２～５９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項61】

約０．０１から約０．５のｔａｎデルタパラメータ（Ｇ’’／Ｇ’）を有する、請求項４２～６０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項62】

約０．０１、約０．０５、約０．１０、約０．１５、約０．２０、約０．２５、約０．３０、約０．３５、約０．４０、約０．４５若しくは約０．５０のｔａｎデルタパラメータ（Ｇ’’／Ｇ’）、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意のｔａｎデルタパラメータを有する、請求項４２～６１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項63】

約６ヶ月間、約１２ヶ月間、約１８ヶ月間、約２４ヶ月間、約３０ヶ月間若しくは約３６ヶ月間、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の時間にわたって安定である、請求項４２～６２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項64】

約４℃で安定である、請求項４２～６３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項65】

約２５℃で安定である、請求項４２～６４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項66】

約６ヶ月間、約１２ヶ月間、約１８ヶ月間、約２４ヶ月間、約３０ヶ月間若しくは約３６ヶ月間、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の時間で分解がごくわずかである、請求項４２～６５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項67】

ヒアルロン酸とコラーゲンとを架橋する方法であって、
コラーゲンと、ヒアルロン酸と、リジンとを水溶液に溶解して反応前水溶液を形成すること、ここで、前記反応前水溶液が約４～約６のｐＨを有する、及び、
水溶性カルボジイミドと、
Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド又はＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミドと
を含む第２の溶液を調製すること、及び、
前記第２の溶液を前記反応前水溶液に加えて架橋反応混合物を形成すること、及び、
前記ヒアルロン酸と前記コラーゲンとをリジンで架橋することにより前記架橋反応混合物を反応させること、
を含み、
前記ヒアルロン酸が前記コラーゲン上の少なくとも１つの内因性アミン基及び／又は前記リジン上に存在する少なくとも１つのアミン基によって前記コラーゲンに架橋され、
前記ＨＡ及び前記コラーゲンがごくわずかに分解し、前記ＨＡ及び前記コラーゲンの構造が無傷のままであり、それによって架橋高分子マトリックスを形成する、方法。

【請求項68】

前記反応前水溶液が、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５若しくは約６．０のｐＨ、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意のｐＨを有する、請求項６７に記載の方法。

【請求項69】

リドカインを前記架橋高分子マトリックスに加えることをさらに含む、請求項６７又は６８に記載の方法。

【請求項70】

前記リドカインが、前記架橋高分子マトリックス中、約０．１５％（ｗ／ｗ）から約０．４５％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度に至るまで加えられる、請求項６９に記載の方法。

【請求項71】

前記リドカインが、前記マトリックスの約０．１５％（ｗ／ｗ）、約０．１７％（ｗ／ｗ）、約０．１９％（ｗ／ｗ）、約０．２１％（ｗ／ｗ）、約０．２３％（ｗ／ｗ）、約０．２５％（ｗ／ｗ）、約０．２７％（ｗ／ｗ）、約０．２９％（ｗ／ｗ）、約０．３１％（ｗ／ｗ）、約０．３３％（ｗ／ｗ）、約０．３５％（ｗ／ｗ）、約０．３７％（ｗ／ｗ）、約０．３７％（ｗ／ｗ）、約０．３９％（ｗ／ｗ）、約０．４１％（ｗ／ｗ）、約０．４３％（ｗ／ｗ）若しくは約０．４５％（ｗ／ｗ）の濃度、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の濃度である、請求項６９又は７０に記載の方法。

【請求項72】

トリアゾール、フッ素化フェノール、スクシンイミド、又はスルホスクシンイミドを含む活性化剤を付与することをさらに含む、請求項６７～７１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項73】

約２℃、約４℃、約６℃、約８℃、約１０℃、約１２℃、約１４℃、約１６℃、約１８℃、約２０℃、約２２℃、約２４℃、約２６℃、約２８℃、約３０℃、約３２℃、約３４℃若しくは約３６℃の温度、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の温度で行う、請求項６７～７２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項74】

前記反応工程を、約４～約３５℃で行う、請求項６７～７３のいずれか一項請求項に記載の方法。

【請求項75】

前記反応工程を、約４℃又は約２２℃で行う、請求項６７～７４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項76】

前記架橋高分子マトリックスを精製することをさらに含み、前記精製工程を透析を用いて行う、請求項６７～７５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項77】

前記精製工程を、２℃～３０℃で行う、請求項７６に記載の方法。

【請求項78】

前記透析を、約２℃、約３℃、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の温度で行う、請求項７６又は７７に記載の方法。

【請求項79】

前記精製工程を、約２℃又は約８℃で行う、請求項７６～７８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項80】

前記架橋反応を、約２℃から約３５℃で行う、請求項６７～７９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項81】

前記架橋反応を、約２℃から約８℃で行う、請求項６７～８０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項82】

室温未満で行われる、請求項６７～８１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項83】

前記架橋反応混合物のｐＨが、約４．０から約６．０である、請求項６７～８２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項84】

前記反応前溶液が塩を含み、前記塩が、前記架橋反応混合物中、約５０ｍＭ、約７５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１２５ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１７５ｍＭ、約２００ｍＭ、約２２５ｍＭ、約２５０ｍＭ、約２７５ｍＭ、約３００ｍＭ、３２５ｍＭ、約３５０ｍＭ、約３７５ｍＭ若しくは約４００ｍＭの濃度、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の濃度で塩化ナトリウムを含む、請求項６７～８３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項85】

前記水溶性カルボジイミドが、前記架橋反応混合物中、約２０ｍＭから約２００ｍＭの濃度の１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドである、請求項６７～８４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項86】

前記水溶性カルボジイミドが、約２０ｍＭ、約４０ｍＭ、約６０ｍＭ、約８０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１６０ｍＭ、約１８０ｍＭ若しくは約２００ｍＭの濃度、又は前述の任意の値によって定義される範囲の間の任意の濃度の１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドである、請求項８５に記載の方法。

【請求項87】

前記水溶性カルボジイミド及び前記ヒアルロン酸の、水溶性カルボジイミドの繰り返し単位：ヒアルロン酸の繰り返し単位のモル対モル比が約０．５から約２．０である、請求項６７～８６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項88】

前記水溶性カルボジイミド及び前記ヒアルロン酸の、水溶性カルボジイミドの繰り返し単位：ヒアルロン酸の繰り返し単位のモル対モル比が、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９又は約２．０である、請求項８７に記載の方法。

【請求項89】

前記リジン及び前記ヒアルロン酸のモル：モル（リジンの繰り返し単位：ＨＡの繰り返し単位）比が、約０．０１から約０．６である、請求項６７～８８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項90】

前記リジン及び前記ヒアルロン酸のモル：モル（リジンの繰り返し単位：ＨＡの繰り返し単位）比が、約０．０１、約０．０２、約０．０３、約０．０４、約０．０５、約０．０６、約０．０７、約０．０８、約０．０９、約０．１０、約０．１１、約０．１２、約０．１３、約０．１４、約０．１５、約０．１６、約０．１７、約０．１８、約０．１９、約０．２、約０．２１、約０．２２、約０．２３、約０．２４、約０．２５、約０．２６、約０．２７、約０．２８、約０．２９、約０．３、約０．３１、約０．３２、約０．３３、約０．３４、約０．３５、約０．３６、約０．３７、約０．３８、約０．３９、約０．４、約０．４１、約０．４２、約０．４３、約０．４４、約０．４５、約０．４６、約０．４７、約０．４８、約０．４９、約０．５、約０．５１、約０．５２、約０．５３、約０．５４、約０．５５、約０．５６、約０．５７、約０．５８、約０．５９又は約０．６である、請求項８９に記載の方法。

【請求項91】

非架橋ＨＡを前記架橋高分子マトリックスに加えることをさらに含む、請求項６７～９０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項92】

前記非架橋ＨＡを、前記架橋高分子マトリックス中、最大５％ｗ／ｗの濃度に至るまで加える、請求項９１に記載の方法。

【請求項93】

前記非架橋ＨＡを、前記マトリックス中、約０％（ｗ／ｗ）、約１％（ｗ／ｗ）、約２％（ｗ／ｗ）、約３％（ｗ／ｗ）、約４％（ｗ／ｗ）若しくは約５％（ｗ／ｗ）の濃度、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の濃度に至るまで加える、請求項９１又は９２に記載の方法。

【請求項94】

前記非架橋ＨＡを、前記マトリックス中、約１％（ｗ／ｗ）の濃度に至るまで加える、請求項９１～９３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項95】

前記非架橋ＨＡを、前記マトリックス中、約３％（ｗ／ｗ）の濃度に至るまで加える、請求項９１～９３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項96】

前記非架橋ＨＡを、前記マトリックス中、約５％（ｗ／ｗ）の濃度に至るまで加える、請求項９１～９３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項97】

前記架橋高分子マトリックスを滅菌することをさらに含み、
蒸気滅菌のために前記架橋高分子マトリックスを容器に移すこと、及び
前記ヒドロゲルを蒸気滅菌によって滅菌すること、
を含む、請求項６７～９６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項98】

前記容器がシリンジである、請求項９７に記載の方法。

【請求項99】

前記架橋高分子マトリックスを透析することをさらに含み、前記透析を約１０００ダルトンから約１００，０００ダルトンの分子量カットオフを有する膜を介して行い、前記透析を滅菌前に行う、請求項６７～９８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項100】

前記透析をリン酸緩衝生理食塩水で行う、請求項９９に記載の方法。

【請求項101】

前記反応前溶液中の前記ヒアルロン酸を、前記第２の溶液を加える前に少なくとも約６０分間水和する、請求項６７～１００のいずれか一項に記載の方法。

【請求項102】

前記架橋反応混合物を約１６時間から約２４時間行う、請求項６７～１０１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項103】

請求項６７～１０２のいずれか一項に記載のプロセスによって調製された架橋高分子マトリックス。

【請求項104】

人間の解剖学的特徴の審美性を改善する方法であって、
人間の組織に組成物を注入し、それによって前記解剖学的特徴の前記審美性を改善すること
を含み、
前記組成物が、
ヒアルロン酸と、
リジンと、
コラーゲンと
を含む架橋高分子マトリックスを含み、
前記ヒアルロン酸が、前記コラーゲン上の少なくとも１つの内因性アミン基及び／又は前記リジン上に存在する少なくとも１つのアミン基によって前記コラーゲンに架橋されている、方法。

【請求項105】

前記架橋高分子マトリックスが、リドカインをさらに含む、請求項１０４に記載の方法。

【請求項106】

前記架橋高分子マトリックスが、非架橋ＨＡをさらに含む、請求項１０４又は１０５に記載の方法。

【請求項107】

前記ヒアルロン酸成分が、約２０，０００ダルトン、約４０，０００ダルトン、約６０，０００ダルトン、約８０，０００ダルトン、約１００，０００ダルトン、約２００，０００ダルトン、約３００，０００ダルトン、約４００，０００ダルトン、約５００，０００ダルトン、約６００，０００ダルトン、約７００，０００ダルトン、約８００，０００ダルトン、約９００，０００ダルトン、約１，０００，０００ダルトン、約１，１００，０００ダルトン、約１，２００，０００ダルトン、約１，３００，０００ダルトン、約１，４００，０００ダルトン、約１，５００，０００ダルトン、約１，６００，０００ダルトン、約１，７００，０００ダルトン、約１，８００，０００ダルトン、約１，９００，０００ダルトン、約２，０００，０００ダルトン、約２，１００，０００ダルトン、約２，２００，０００ダルトン、約２，３００，０００ダルトン、約２，４００，０００ダルトン、約２，５００，０００ダルトン、約２，６００，０００ダルトン、約２，７００，０００ダルトン、約２，８００，０００ダルトン、約２，９００，０００ダルトン、約３，０００，０００ダルトン、約３，１００，０００ダルトン、約３，２００，０００ダルトン、約３，３００，０００ダルトン、約３，４００，０００ダルトン、約３，５００，０００ダルトン、約３，６００，０００ダルトン、約３，７００，０００ダルトン、約３，８００，０００ダルトン、約３，９００，０００ダルトン、約４，０００，０００ダルトン、約４，１００，０００ダルトン、約４，２００，０００ダルトン、約４，３００，０００ダルトン、約４，４００，０００ダルトン、約４，５００，０００ダルトン、約４，６００，０００ダルトン、約４，７００，０００ダルトン、約４，８００，０００ダルトン、約４，９００，０００ダルトン、約５，０００，０００ダルトン、約５，１００，０００ダルトン、約５，２００，０００ダルトン、約５，３００，０００ダルトン、約５，４００，０００ダルトン、約５，５００，０００ダルトン、約５，６００，０００ダルトン、約５，７００，０００ダルトン、約５，８００，０００ダルトン、約５，９００，０００ダルトン、約６，０００，０００ダルトン、約６，１００，０００ダルトン、約６，２００，０００ダルトン、約６，３００，０００ダルトン、約６，４００，０００ダルトン、約６，５００，０００ダルトン、約６，６００，０００ダルトン、約６，７００，０００ダルトン、約６，８００，０００ダルトン、約６，９００，０００ダルトン、約７，０００，０００ダルトン、約７，１００，０００ダルトン、約７，２００，０００ダルトン、約７，３００，０００ダルトン、約７，４００，０００ダルトン、約７，５００，０００ダルトン、約７，６００，０００ダルトン、約７，７００，０００ダルトン、約７，８００，０００ダルトン、約７，９００，０００ダルトン、約８，０００，０００ダルトン、約８，１００，０００ダルトン、約８，２００，０００ダルトン、約８，３００，０００ダルトン、約８，４００，０００ダルトン、約８，５００，０００ダルトン、約８，６００，０００ダルトン、約８，７００，０００ダルトン、約８，８００，０００ダルトン、約８，９００，０００ダルトン、約９，０００，０００ダルトン、約９，１００，０００ダルトン、約９，２００，０００ダルトン、約９，３００，０００ダルトン、約９，４００，０００ダルトン、約９，５００，０００ダルトン、約９，６００，０００ダルトン、約９，７００，０００ダルトン、約９，８００，０００ダルトン、約９，９００，０００ダルトン若しくは約１０，０００，０００ダルトンの平均分子量、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の分子量を有する、請求項１０４～１０６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項108】

前記ヒアルロン酸が、異なる分子量を有するヒアルロン酸成分の混合物を含み、前記混合物が、約２０，０００ダルトン、約４０，０００ダルトン、約６０，０００ダルトン、約８０，０００ダルトン、約１００，０００ダルトン、約２００，０００ダルトン、約３００，０００ダルトン、約４００，０００ダルトン、約５００，０００ダルトン、約６００，０００ダルトン、約７００，０００ダルトン、約８００，０００ダルトン、約９００，０００ダルトン、約１，０００，０００ダルトン、約１，５００，０００ダルトン、約２，０００，０００ダルトン、約２，５００，０００ダルトン、約３，０００，０００ダルトン、約３，５００，０００ダルトン、約４，０００，０００ダルトン、約４，５００，０００ダルトン、約５，０００，０００ダルトン、約５，５００，０００ダルトン、約６，０００，０００ダルトン、約６，５００，０００ダルトン、約７，５００，０００ダルトン、約８，０００，０００ダルトン、約８，５００，０００ダルトン、約９，０００，０００ダルトン、約９，５００，０００ダルトン及び／又は約１，０００，０００ダルトンの平均分子量を有するヒアルロン酸、及び／又は前述の任意の２つの値の間の範囲内の分子量を有する任意のヒアルロン酸を含む、請求項１０４～１０７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項109】

前記コラーゲンが、Ｉ型コラーゲン及び／又はＩＩＩ型コラーゲンを含む、請求項１０４～１０８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項110】

個体の外観を改善する方法であって、
注入部位で前記個体の組織に組成物を注入し、それによって解剖学的特徴の審美性を改善すること、ここで、前記組織からの浸潤細胞が前記注入部位内の前記組成物に一体化されるものである、前記組成物内に新しいコラーゲンを堆積させることを含み、ここで、前記組成物が、
ヒアルロン酸と、
リジンと、
コラーゲンと
を含む架橋高分子マトリックスを含み、
前記ヒアルロン酸が、前記コラーゲン上の少なくとも１つの内因性アミン基及び／又は前記リジン上に存在する少なくとも１つのアミン基によって前記コラーゲンに架橋されており、前記組成物が注入された前記組織が、組織の一体化及びコラーゲンの堆積並びに血管形成を有することが示される、方法。

【請求項111】

前記組成物が、リドカインをさらに含む、請求項１１０に記載の方法。

【請求項112】

前記組成物が、非架橋ＨＡをさらに含む、請求項１１０又は１１１に記載の方法。

【請求項113】

前記組成物を、顎先、顎ライン、唇、又はホウレイ線に注入する、請求項１１０～１１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項114】

顔の特徴間の対称性を改善する、請求項１１０～１１３に記載の方法。

【請求項115】

顔の特徴に対してボリュームを増大及び復元する、請求項１１０～１１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項116】

顎先、顎ライン、又はホウレイ線のボリュームを増大させ、補正し、復元し、又は与える、請求項１１５に記載の方法。

【請求項117】

前記組成物を、前記個体の涙液トラフに注入する、請求項１１０～１１２、１１４又は１１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項118】

前記組成物を、皮膚の萎縮及び／又は脂肪体の萎縮を含む領域に注入する、請求項１１０～１１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項119】

前記注入を受ける前記組織に自然な見た目、感触、及び動きを与え、前記組成物が、前記注入部位の周囲の組織からのコラーゲンの浸潤の増加をもたらす、請求項１１０～１１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項120】

前記注入部位への組織の一体化の結果として前記組成物の持続時間が延長される、請求項１１９に記載の方法。

【請求項121】

前記注入部位の周囲の皮膚の水和及び弾性を改善する、請求項１０４～１２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項122】

組織へのコラーゲンの浸潤を増加させる方法であって、
個体の前記組織に組成物を注入し、それによって前記組成物を含む皮膚充填剤のデポーを作り出すことを含み、ここで、前記組成物が、
ヒアルロン酸と、リジンと、コラーゲンと
を含む架橋高分子マトリックスを含み、前記ヒアルロン酸が、前記コラーゲン上の少なくとも１つの内因性アミン基及び／又は前記リジン上に存在する少なくとも１つのアミン基によって前記コラーゲンに架橋されており、前記皮膚充填剤のデポーの周囲の前記組織からの細胞が前記組成物を含む前記皮膚充填剤のデポーに浸潤し、前記細胞が前記組成物に一体化して新しいコラーゲンを前記組成物に堆積させ、それによって前記組成物内に浸潤組織を作り出し、血管が前記組成物内の前記浸潤組織を前記個体の身体の血液供給源に接続する、方法。

【請求項123】

前記マトリックスが、リドカインをさらに含む、請求項１２２に記載の方法。

【請求項124】

前記組成物が、非架橋ＨＡをさらに含む、請求項１２２又は１２３に記載の方法。

【請求項125】

前記ヒアルロン酸が、約２０，０００ダルトン、約４０，０００ダルトン、約６０，０００ダルトン、約８０，０００ダルトン、約１００，０００ダルトン、約２００，０００ダルトン、約３００，０００ダルトン、約４００，０００ダルトン、約５００，０００ダルトン、約６００，０００ダルトン、約７００，０００ダルトン、約８００，０００ダルトン、約９００，０００ダルトン、約１，０００，０００ダルトン、約１，１００，０００ダルトン、約１，２００，０００ダルトン、約１，３００，０００ダルトン、約１，４００，０００ダルトン、約１，５００，０００ダルトン、約１，６００，０００ダルトン、約１，７００，０００ダルトン、約１，８００，０００ダルトン、約１，９００，０００ダルトン、約２，０００，０００ダルトン、約２，１００，０００ダルトン、約２，２００，０００ダルトン、約２，３００，０００ダルトン、約２，４００，０００ダルトン、約２，５００，０００ダルトン、約２，６００，０００ダルトン、約２，７００，０００ダルトン、約２，８００，０００ダルトン、約２，９００，０００ダルトン、約３，０００，０００ダルトン、約３，１００，０００ダルトン、約３，２００，０００ダルトン、約３，３００，０００ダルトン、約３，４００，０００ダルトン、約３，５００，０００ダルトン、約３，６００，０００ダルトン、約３，７００，０００ダルトン、約３，８００，０００ダルトン、約３，９００，０００ダルトン、約４，０００，０００ダルトン、約４，１００，０００ダルトン、約４，２００，０００ダルトン、約４，３００，０００ダルトン、約４，４００，０００ダルトン、約４，５００，０００ダルトン、約４，６００，０００ダルトン、約４，７００，０００ダルトン、約４，８００，０００ダルトン、約４，９００，０００ダルトン、約５，０００，０００ダルトン、約５，１００，０００ダルトン、約５，２００，０００ダルトン、約５，３００，０００ダルトン、約５，４００，０００ダルトン、約５，５００，０００ダルトン、約５，６００，０００ダルトン、約５，７００，０００ダルトン、約５，８００，０００ダルトン、約５，９００，０００ダルトン、約６，０００，０００ダルトン、約６，１００，０００ダルトン、約６，２００，０００ダルトン、約６，３００，０００ダルトン、約６，４００，０００ダルトン、約６，５００，０００ダルトン、約６，６００，０００ダルトン、約６，７００，０００ダルトン、約６，８００，０００ダルトン、約６，９００，０００ダルトン、約７，０００，０００ダルトン、約７，１００，０００ダルトン、約７，２００，０００ダルトン、約７，３００，０００ダルトン、約７，４００，０００ダルトン、約７，５００，０００ダルトン、約７，６００，０００ダルトン、約７，７００，０００ダルトン、約７，８００，０００ダルトン、約７，９００，０００ダルトン、約８，０００，０００ダルトン、約８，１００，０００ダルトン、約８，２００，０００ダルトン、約８，３００，０００ダルトン、約８，４００，０００ダルトン、約８，５００，０００ダルトン、約８，６００，０００ダルトン、約８，７００，０００ダルトン、約８，８００，０００ダルトン、約８，９００，０００ダルトン、約９，０００，０００ダルトン、約９，１００，０００ダルトン、約９，２００，０００ダルトン、約９，３００，０００ダルトン、約９，４００，０００ダルトン、約９，５００，０００ダルトン、約９，６００，０００ダルトン、約９，７００，０００ダルトン、約９，８００，０００ダルトン、約９，９００，０００ダルトン若しくは約１０，０００，０００ダルトンの平均分子量、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の他の分子量を有する、請求項１２２～１２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項126】

前記ヒアルロン酸が、異なる分子量を有するヒアルロン酸成分の混合物を含み、前記混合物が、約２０，０００ダルトン、約４０，０００ダルトン、約６０，０００ダルトン、約８０，０００ダルトン、約１００，０００ダルトン、約２００，０００ダルトン、約３００，０００ダルトン、約４００，０００ダルトン、約５００，０００ダルトン、約６００，０００ダルトン、約７００，０００ダルトン、約８００，０００ダルトン、約９００，０００ダルトン、約１，０００，０００ダルトン、約１，５００，０００ダルトン、約２，０００，０００ダルトン、約２，５００，０００ダルトン、約３，０００，０００ダルトン、約３，５００，０００ダルトン、約４，０００，０００ダルトン、約４，５００，０００ダルトン、約５，０００，０００ダルトン、約５，５００，０００ダルトン、約６，０００，０００ダルトン、約６，５００，０００ダルトン、約７，５００，０００ダルトン、約８，０００，０００ダルトン、約８，５００，０００ダルトン、約９，０００，０００ダルトン、約９，５００，０００ダルトン及び／又は約１０，０００，０００ダルトンの平均分子量を有するヒアルロン酸、及び／又は前述の任意の２つの値の間の範囲内の分子量を有する任意のヒアルロン酸を含む、請求項１２２～１２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項127】

前記コラーゲンが、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン及び／又はＩＩＩ型コラーゲンを含む、請求項１２２～１２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項128】

前記組成物が、約１３ｍｇ／ｍｌのヒアルロン酸を含む、請求項１２２～１２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項129】

前記組成物が、約２０ｍｇ／ｍｌのヒアルロン酸、約２２ｍｇ／ｍｌのヒアルロン酸、約２４ｍｇ／ｍｌ、約２６ｍｇ／ｍｌのヒアルロン酸、約２８ｍｇ／ｍｌのヒアルロン酸又は約３０ｍｇ／ｍｌのヒアルロン酸を含む、請求項１２２～１２７のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１２月２６日に出願された米国特許出願第６２／９５３，９１０号の優先権の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本開示は、ヒアルロン酸、コラーゲン及びリジンを含む架橋高分子マトリックスに関する。かかる組成物は、組織の一体化が強化された組織充填剤として使用され得る。

【背景技術】

【0003】

老化は、遺伝学的特徴及び生活様式の要因（レクリエーショナルドラッグ、アルコールの乱用、タバコ、ＵＶＡ／ＵＶＢ暴露、食事）の影響を受け得る、経時的に起こる自然なプロセスである。顔の皮膚老化の特徴としては、例えば、筋肉及び脂肪の萎縮、皮膚の弛緩、シミ、たるみ、及び太りが挙げられる。皮下組織の弛みは、過剰な皮膚及び下垂をもたらし、垂れ下がった頬及び眼瞼の外観をもたらし得る。太りは、顔及び首の下部の膨張による過剰な体重の増加を指す。これらの変化は、乾燥、弾性の喪失、及び粗い質感に関連し得る。

【0004】

皮膚充填剤は、老化した皮膚の外観を改善するために使用されてきた。様々な種類の皮膚充填剤が開発され、身体上の不完全性、例えば、加齢の影響による皺及びボリューム損失の治療又は改善／矯正に使用されてきた。最初に、ウシコラーゲンを含む皮膚充填剤組成物が１９７０年に市場に参入した。ヒト由来コラーゲンは２００３年にＦＤＡによって承認されたが、これは患者におけるアレルギー反応の可能性を有するウシ由来コラーゲンよりも有利であった。しかしながら、ヒト由来コラーゲン組成物は、皮膚組織内の酵素のために３から６ヶ月以内に急速に分解した。その結果、これらの初期の組成物を使用する患者は、所望の矯正審美的外観を維持するために頻繁な手順を必要とした。

【0005】

ヒアルロナン又はヒアルロン酸（ＨＡ）系充填剤は、コラーゲン系皮膚充填剤の代替物として１９９０年に導入された。ＨＡは、天然に存在する水溶性多糖、具体的にはグリコサミノグリカンであり、細胞外マトリックスの主要成分であって、動物組織に広く分布している。ＨＡは優れた生体適合性を有し、患者に移植された場合にアレルギー反応を引き起こさない。さらに、ＨＡは大量の水に結合する能力を有し、軟組織の優れたボリューム形成剤となる。ＨＡは、皮膚内の内因性酵素によっても分解され得ることから、コラーゲンに類似している。例えば、非架橋ＨＡは、皺充填剤として作用するのに十分な期間又は物理的特性を有さず、それゆえ、架橋ＨＡが皮膚組織におけるそれらの寿命を最大化するために使用されてきた。したがって、改善された皮膚充填剤が必要とされている。

【発明の概要】

【0006】

本明細書の実施形態は、ヒアルロン酸、コラーゲン及びリジンを含む架橋高分子マトリックスを含む方法及び組成物（例えば、ヒドロゲル又は皮膚充填剤）を包含し、ここで、ヒアルロン酸は、コラーゲン上の少なくとも１つの内因性アミン基及び／又はリジン上に存在する少なくとも１つのアミン基によってコラーゲンに架橋されている。

【0007】

上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、架橋高分子マトリックスは、リドカインをさらに含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、リドカインは、マトリックス中、約０．１５％（ｗ／ｗ）から約０．４５％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度である。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、リドカインは、マトリックス中で約０．２７％（ｗ／ｗ）から約０．３３％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度である。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、リドカインは、マトリックスの約０．１５％（ｗ／ｗ）、約０．１７％（ｗ／ｗ）、約０．１９％（ｗ／ｗ）、約０．２１％（ｗ／ｗ）、約０．２３％（ｗ／ｗ）、約０．２５％（ｗ／ｗ）、約０．２７％（ｗ／ｗ）、約０．２９％（ｗ／ｗ）、約０．３１％（ｗ／ｗ）、約０．３３％（ｗ／ｗ）、約０．３５％（ｗ／ｗ）、約０．３７％（ｗ／ｗ）、約０．３９％（ｗ／ｗ）、約０．４１％（ｗ／ｗ）、約０．４３％（ｗ／ｗ）若しくは約０．４５％（ｗ／ｗ）の濃度、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の濃度である。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、リドカインは、マトリックス中、約０．３％（ｗ／ｗ）の濃度である。

【0008】

上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、架橋高分子マトリックスは、非架橋ＨＡをさらに含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、非架橋ＨＡは、マトリックス中、最大約５％（ｗ／ｗ）の濃度を有する。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、非架橋ＨＡは、マトリックス中、０％（ｗ／ｗ）、約１％（ｗ／ｗ）、約２％（ｗ／ｗ）、約３％（ｗ／ｗ）、約４％（ｗ／ｗ）若しくは約５％（ｗ／ｗ）の濃度、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の濃度を有する。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、非架橋ＨＡは、マトリックス中、約１％（ｗ／ｗ）の濃度を有する。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、非架橋ＨＡは、マトリックス中、約２％（ｗ／ｗ）の濃度を有する。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、非架橋ＨＡは、マトリックス中、約５％（ｗ／ｗ）の濃度を有する。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、非架橋ＨＡは、高分子マトリックスの押出性を改善する。

【0009】

上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、架橋高分子マトリックスは、少なくとも約６ヶ月間、約１２ヶ月間、約１８ヶ月間、約２４ヶ月間、約３０ヶ月間若しくは約３６ヶ月間、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の時間にわたって安定である。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、架橋高分子マトリックスは、約４℃～約２５℃の温度で安定である。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、架橋高分子マトリックスは、約４℃で安定である。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、架橋高分子マトリックスは、約２５℃で安定である。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、架橋高分子マトリックスは、約３ヶ月間、約４ヶ月間、約５ヶ月間、約６ヶ月間、約７ヶ月間、約８ヶ月間、約９ヶ月間、約１０ヶ月間、約１１ヶ月間、約１２ヶ月間、約１３ヶ月間、約１４ヶ月間、約１５ヶ月間、約１６ヶ月間、約１７ヶ月間、約１８ヶ月間、約１９ヶ月間、約２０ヶ月間、約２１ヶ月間、約２２、約２３ヶ月間、約２４ヶ月間、約２５ヶ月間、約２６ヶ月間、約２７ヶ月間、約２８ヶ月間、約２９ヶ月間、約３０ヶ月間、約３１ヶ月間、約３２ヶ月間、約３３ヶ月間、約３４ヶ月間、約３５ヶ月間、約３６ヶ月間、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の時点で安定である。

【0010】

上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、架橋高分子マトリックスは、約６ヶ月、約１２ヶ月、約１８ヶ月、約２４ヶ月、約３０ヶ月若しくは約３６ヶ月、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の時間で分解がごくわずかである。

【0011】

上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、架橋高分子マトリックスは、約３０Ｐａから約１０，０００Ｐａの弾性率（Ｇ’）を有する。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、マトリックスは、約３０Ｐａ、約４０Ｐａ、約５０Ｐａ、約６０Ｐａ、約７０Ｐａ、約８０Ｐａ、約９０Ｐａ、約１００Ｐａ、約２００Ｐａ、約３００Ｐａ、約４００Ｐａ、約５００Ｐａ、約６００Ｐａ、約７００Ｐａ、約８００Ｐａ、約９００Ｐａ、約１０００Ｐａ、約１１００Ｐａ、約１２００Ｐａ、約１３００Ｐａ、約１４００Ｐａ、約１５００Ｐａ、約１６００Ｐａ、約１７００Ｐａ、約１８００Ｐａ、約１９００Ｐａ、約２０００Ｐａ、約２１００Ｐａ、約２２００Ｐａ、約２３００Ｐａ、約２４００Ｐａ、約２５００Ｐａ、約２６００Ｐａ、約２７００Ｐａ、約２８００Ｐａ、約２９００Ｐａ、約３０００Ｐａ、約３１００Ｐａ、約３２００Ｐａ、約３３００Ｐａ、約３４００Ｐａ、約３５００Ｐａ、約３６００Ｐａ、約３７００Ｐａ、約３８００Ｐａ、約３９００Ｐａ、約４０００Ｐａ、約４１００Ｐａ、約４２００Ｐａ、約４３００Ｐａ、約４４００Ｐａ、約４５００Ｐａ、約４６００Ｐａ、約４７００Ｐａ、約４８００Ｐａ、約４９００Ｐａ、約５０００Ｐａ、約５１００Ｐａ、約５２００Ｐａ、約５３００Ｐａ、約５４００Ｐａ、約５５００Ｐａ、約５６００Ｐａ、約５７００Ｐａ、約５８００Ｐａ、約５９００Ｐａ、約６０００Ｐａ、約６１００Ｐａ、約６２００Ｐａ、約６３００Ｐａ、約６４００Ｐａ、約６５００Ｐａ、約６６００Ｐａ、約６７００Ｐａ、約６８００Ｐａ、約６９００Ｐａ、約７０００Ｐａ、約７１００Ｐａ、約７２００Ｐａ、約７３００Ｐａ、約７４００Ｐａ、約７５００Ｐａ、約７６００Ｐａ、約７７００Ｐａ、約７８００Ｐａ、約７９００Ｐａ、約８０００Ｐａ、約８１００Ｐａ、約８２００Ｐａ、約８３００Ｐａ、約８４００Ｐａ、約８５００Ｐａ、約８６００Ｐａ、約８７００Ｐａ、約８８００Ｐａ、約８９００Ｐａ、約９０００Ｐａ、約９１００Ｐａ、約９２００Ｐａ、約９３００Ｐａ、約９４００Ｐａ、約９５００Ｐａ、約９６００Ｐａ、約９７００Ｐａ、約９８００Ｐａ、約９９００Ｐａ若しくは約１００００Ｐａの弾性率（Ｇ’）、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の弾性率を有する。

【0012】

上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、架橋高分子マトリックスは、約１０ｇｍｆ、約２０ｇｍｆ、約３０ｇｍｆ、約４０ｇｍｆ、約５０ｇｍｆ、約６０ｇｍｆ、約７０ｇｍｆ、約８０ｇｍｆ、約９０ｇｍｆ、約１００ｇｍｆ、約１１０ｇｍｆ、約１２０ｇｍｆ、約１３０ｇｍｆ、約１４０ｇｍｆ、約１５０ｇｍｆ、約１６０ｇｍｆ、約１７０ｇｍｆ、約１８０ｇｍｆ、約１９０ｇｍｆ、約２００ｇｍｆ、約２１０ｇｍｆ、約２２０ｇｍｆ、約２３０ｇｍｆ、約２４０ｇｍｆ、約２５０ｇｍｆ、約２６０ｇｍｆ、約２７０ｇｍｆ、約２８０ｇｍｆ、約２９０ｇｍｆ、約３００ｇｍｆ、約３１０ｇｍｆ、約３２０ｇｍｆ、約３３０ｇｍｆ、約３４０ｇｍｆ、約３５０ｇｍｆ、約３６０ｇｍｆ、約３７０ｇｍｆ、約３８０ｇｍｆ、約３９０ｇｍｆ、約４００ｇｍｆ、約４１０ｇｍｆ、約４２０ｇｍｆ、約４３０ｇｍｆ、約４４０ｇｍｆ、約４５０ｇｍｆ、約４６０ｇｍｆ、約４７０ｇｍｆ、約４８０ｇｍｆ、約４９０ｇｍｆ、約５００ｇｍｆ、約５１０ｇｍｆ、約５２０ｇｍｆ、約５３０ｇｍｆ、約５４０ｇｍｆ、約５５０ｇｍｆ、約５６０ｇｍｆ、約５７０ｇｍｆ、約５８０ｇｍｆ、約５９０ｇｍｆ若しくは約６００ｇｍｆの圧縮力値、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の圧縮力値を有する。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、架橋高分子マトリックスは、約１００ｇｍｆ、約２００ｇｍｆ、約３００ｇｍｆ、約４００ｇｍｆ、約５００ｇｍｆ若しくは約６００ｇｍｆの圧縮力値、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の圧縮力値を有する。

【0013】

上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、ヒアルロン酸は、約５ｍｇ／ｍｌ、約６ｍｇ／ｍｌ、約８ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ、約１２ｍｇ／ｍｌ、約１４ｍｇ／ｍｌ、約１６ｍｇ／ｍｌ、約１８ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２２ｍｇ／ｍｌ、約２４ｍｇ／ｍｌ、約２６ｍｇ／ｍｌ、約２８ｍｇ／ｍｌ、約３０ｍｇ／ｍｌ、約３２ｍｇ／ｍｌ、約３４ｍｇ／ｍｌ若しくは約３６ｍｇ／ｍｌの濃度、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の濃度である。

【0014】

上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、コラーゲンは、Ｉ型コラーゲンを含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、コラーゲンは、ＩＩ型コラーゲンを含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、コラーゲンは、ＩＩＩ型コラーゲンを含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、コラーゲンは、約１～３％のＩ型又はＩＩＩ型コラーゲンを含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、コラーゲンは、約０％から約３％のＩＩ型コラーゲンを含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、コラーゲンは、約９７％から約９９％のＩ型コラーゲンを含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、コラーゲンは、Ｉ型コラーゲンとＩＩＩ型コラーゲンの両方の混合物を含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、マトリックスは、約０％から約３％のＩＩＩ型コラーゲンを含む。

【0015】

上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、架橋高分子マトリックスは、針及び／又はカニューレを用いた注入又は用途のために製剤化される。

【0016】

上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、コラーゲンは、約１ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌ、約６ｍｇ／ｍｌ、約８ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ、約１２ｍｇ／ｍｌ、約１４ｍｇ／ｍｌの濃度、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の濃度を有する。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、コラーゲンは、約３ｍｇ／ｍｌの濃度を有する。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、コラーゲンは、約６ｍｇ／ｍｌの濃度を有する。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、コラーゲンは、約１０ｍｇ／ｍｌの濃度を有する。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、コラーゲンは、約１２ｍｇ／ｍｌの濃度を有する。

【0017】

上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、架橋高分子マトリックスは、塩をさらに含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、架橋高分子マトリックスは、約５０ｍＭ～約４００ｍＭの範囲のＮａＣｌを含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、架橋高分子マトリックスは、ＮａＣｌを含み、ＮａＣｌは、約５０ｍＭ、約７５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１２５ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１７５ｍＭ、約２００ｍＭ、約２２５ｍＭ、約２５０ｍＭ、約２７５ｍＭ、約３００ｍＭ、約３２５ｍＭ、約３５０ｍＭ、約３７５ｍＭ若しくは約４００ｍＭの濃度、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の濃度を有する。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、架橋高分子マトリックスは、約１５０ｍＭのＮａＣｌを含む。特定の実施形態では、架橋高分子マトリックスは塩を含まない。

【0018】

上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、架橋高分子マトリックスは、約０．０１Ｍのリン酸緩衝液、約１３７ｍＭのＮａＣｌ及び約２．７ｍＭの濃度のＫＣｌを含む。

【0019】

上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、ヒアルロン酸は、約２０，０００ダルトンから約１０，０００，０００ダルトンの平均分子量を有する。上記又は下記の態様のそれぞれ又はいずれかのいくつかの態様において、ヒアルロン酸は、約２０，０００ダルトン、約４０，０００ダルトン、約６０，０００ダルトン、約８０，０００ダルトン、約１００，０００ダルトン、約２００，０００ダルトン、約３００，０００ダルトン、約４００，０００ダルトン、約５００，０００ダルトン、約６００，０００ダルトン、約７００，０００ダルトン、約８００，０００ダルトン、約９００，０００ダルトン、約１，０００，０００ダルトン、約１，５００，０００ダルトン、約２，０００，０００ダルトン、約２，５００，０００ダルトン、約３，０００，０００ダルトン、約３，５００，０００ダルトン、約４，０００，０００ダルトン、約４，５００，０００ダルトン、約５，０００，０００ダルトン、約５，５００，０００ダルトン、約６，０００，０００ダルトン、約６，５００，０００ダルトン、約７，５００，０００ダルトン、約８，０００，０００ダルトン、約８，５００，０００ダルトン、約９，０００，０００ダルトン、約９，５００，０００ダルトン及び／又は約１，０００，０００ダルトンの平均分子量、又は任意の前述の２つの値によって定義される範囲の間の平均分子量を有する。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかの組成物のいくつかの実施形態では、ヒアルロン酸は、約２０，０００ダルトンから約１０，０００，０００ダルトンの平均分子量を有する。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、ヒアルロン酸は、異なる分子量を有するヒアルロン酸成分の混合物を含み、その混合物は、約２０，０００ダルトン、約４０，０００ダルトン、約６０，０００ダルトン、約８０，０００ダルトン、約１００，０００ダルトン、約２００，０００ダルトン、約３００，０００ダルトン、約４００，０００ダルトン、約５００，０００ダルトン、約６００，０００ダルトン、約７００，０００ダルトン、約８００，０００ダルトン、約９００，０００ダルトン、約１，０００，０００ダルトン、約１，５００，０００ダルトン、約２，０００，０００ダルトン、約２，５００，０００ダルトン、約３，０００，０００ダルトン、約３，５００，０００ダルトン、約４，０００，０００ダルトン、約４，５００，０００ダルトン、約５，０００，０００ダルトン、約５，５００，０００ダルトン、約６，０００，０００ダルトン、約６，５００，０００ダルトン、約７，５００，０００ダルトン、約８，０００，０００ダルトン、約８，５００，０００ダルトン、約９，０００，０００ダルトン、約９，５００，０００ダルトン及び／又は約１０，０００，０００ダルトンの分子量を有するヒアルロン酸、及び／又は前述の任意の２つの値の間の範囲内の分子量を有する任意のヒアルロン酸を含む。

【0020】

本開示はまた、ヒアルロン酸、コラーゲン、リジン、及び緩衝液を含む組成物を提供し、この組成物は水性ヒドロゲルである。

【0021】

上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、ヒアルロン酸は、コラーゲン上の少なくとも１つの内因性アミン基及び／又はリジン上に存在する少なくとも１つのアミン基によってコラーゲンに架橋される。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、本組成物は、リドカインをさらに含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、リドカインは、マトリックス中、約０．１５％（ｗ／ｗ）から約０．４５％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度である。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、リドカインは、本組成物中、約０．２７％（ｗ／ｗ）から約０．３３％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度である。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、リドカインは、本組成物の約０．１５％（ｗ／ｗ）、約０．１７％（ｗ／ｗ）、約０．１９％（ｗ／ｗ）、約０．２１％（ｗ／ｗ）、約０．２３％（ｗ／ｗ）、約０．２５％（ｗ／ｗ）、約０．２７％（ｗ／ｗ）、約０．２９％（ｗ／ｗ）、約０．３１％（ｗ／ｗ）、約０．３３％（ｗ／ｗ）、約０．３５％（ｗ／ｗ）、約０．３７％（ｗ／ｗ）、約０．３９％（ｗ／ｗ）、約０．４１％（ｗ／ｗ）、約０．４３％（ｗ／ｗ）若しくは約０．４５％（ｗ／ｗ）の濃度、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の濃度である。

【0022】

上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、本組成物は、非架橋ＨＡをさらに含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、非架橋ＨＡは、本組成物中、最大約５％（ｗ／ｗ）の濃度を有する。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、非架橋ＨＡは、本組成物中、約０％（ｗ／ｗ）、約１％（ｗ／ｗ）、約２％（ｗ／ｗ）、約３％（ｗ／ｗ）、約４％（ｗ／ｗ）若しくは約５％（ｗ／ｗ）の濃度、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の濃度を有する。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、非架橋ＨＡは、本組成物の約１％（ｗ／ｗ）の濃度を有する。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、非架橋ＨＡは、本組成物の約２％（ｗ／ｗ）の濃度を有する。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、非架橋ＨＡは、本組成物の約５％（ｗ／ｗ）の濃度を有する。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、非架橋ＨＡは、本組成物の押出性を改善する。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水である。

【0023】

上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、本組成物のヒアルロン酸は、約２０，０００ダルトン～約１０，０００，０００ダルトンの平均分子量を有する。

【0024】

上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、ヒアルロン酸は、異なる分子量を有するヒアルロン酸成分の混合物を含み、その混合物は、約２０，０００ダルトン、約４０，０００ダルトン、約６０，０００ダルトン、約８０，０００ダルトン、約１００，０００ダルトン、約２００，０００ダルトン、約３００，０００ダルトン、約４００，０００ダルトン、約５００，０００ダルトン、約６００，０００ダルトン、約７００，０００ダルトン、約８００，０００ダルトン、約９００，０００ダルトン、約１，０００，０００ダルトン、約１，５００，０００ダルトン、約２，０００，０００ダルトン、約２，５００，０００ダルトン、約３，０００，０００ダルトン、約３，５００，０００ダルトン、約４，０００，０００ダルトン、約４，５００，０００ダルトン、約５，０００，０００ダルトン、約５，５００，０００ダルトン、約６，０００，０００ダルトン、約６，５００，０００ダルトン、約７，５００，０００ダルトン、約８，０００，０００ダルトン、約８，５００，０００ダルトン、約９，０００，０００ダルトン、約９，５００，０００ダルトン及び／又は約１０，０００，０００ダルトンの分子量を有するヒアルロン酸、及び／又は前述の任意の２つの値の間の範囲内の分子量を有する任意のヒアルロン酸を含む。

【0025】

上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、本組成物のコラーゲンは、Ｉ型コラーゲンを含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、コラーゲンは、ＩＩ型コラーゲンを含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、コラーゲンは、ＩＩＩ型コラーゲンを含む。

【0026】

上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、本組成物は、約６ヶ月間、約１２ヶ月間、約１８ヶ月間、約２４ヶ月間、約３０ヶ月間若しくは約３６ヶ月間、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の時間にわたって安定である。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、本組成物は、約４℃で安定である。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、本組成物は、約２５℃で安定である。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、本組成物は、約６ヶ月、約１２ヶ月、約１８ヶ月、約２４ヶ月、約３０ヶ月若しくは約３６ヶ月、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の時間で分解がごくわずかである。

【0027】

上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、本組成物は、非架橋ＨＡをさらに含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、非架橋ＨＡは、本組成物中、最大約５％（ｗ／ｗ）の濃度を有する。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、非架橋ＨＡは、本組成物の押出性を改善する。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、本組成物は、約６ヶ月間、約１２ヶ月間、約１８ヶ月間、約２４ヶ月間、約３０ヶ月間若しくは約３６ヶ月間、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の時間にわたって安定である。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、本組成物は４℃で安定である。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、本組成物は２５℃で安定である。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、本組成物は、６ヶ月、１２ヶ月、１８ヶ月、２４ヶ月、３０ヶ月若しくは３６ヶ月、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の時間で分解がごくわずかである。

【0028】

上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、本組成物は、約４，０００Ｐａ Ｓ、約４１００Ｐａ Ｓ、約４２００Ｐａ Ｓ、約４３００Ｐａ Ｓ、約４４００Ｐａ Ｓ、約４５００Ｐａ Ｓ、約４６００Ｐａ Ｓ、約４７００Ｐａ Ｓ、約４８００Ｐａ Ｓ、約４９００Ｐａ Ｓ、約５０００Ｐａ Ｓ、約５１００Ｐａ Ｓ、約５２００Ｐａ Ｓ、約５３００Ｐａ Ｓ、約５４００Ｐａ Ｓ、約５５００Ｐａ Ｓ、約５６００Ｐａ Ｓ、約５７００Ｐａ Ｓ、約５８００Ｐａ Ｓ、約５９００Ｐａ Ｓ、約６０００Ｐａ Ｓ、約６１００Ｐａ Ｓ、約６２００Ｐａ Ｓ、約６３００Ｐａ Ｓ、約６４００Ｐａ Ｓ、約６５００Ｐａ Ｓ、約６６００Ｐａ Ｓ、約６７００Ｐａ Ｓ、約６８００Ｐａ Ｓ、約６９００Ｐａ Ｓ、約７０００Ｐａ Ｓ、約７１００Ｐａ Ｓ、約７２００Ｐａ Ｓ、約７３００Ｐａ Ｓ、約７４００Ｐａ Ｓ、約７５００Ｐａ Ｓ、約７６００Ｐａ Ｓ、約７７００Ｐａ Ｓ、約７８００Ｐａ Ｓ、約７９００Ｐａ Ｓ、約８０００Ｐａ Ｓ、約８１００Ｐａ Ｓ、約８２００Ｐａ Ｓ、約８３００Ｐａ Ｓ、約８４００Ｐａ Ｓ、約８５００Ｐａ Ｓ、約８６００Ｐａ Ｓ、約８７００Ｐａ Ｓ、約８８００Ｐａ Ｓ、約８９００Ｐａ Ｓ、約９０００Ｐａ Ｓ、約９１００Ｐａ，約９２００Ｐａ Ｓ、約９３００Ｐａ Ｓ、約９４００Ｐａ Ｓ、約９５００Ｐａ Ｓ、約９６００Ｐａ Ｓ、約９７００Ｐａ Ｓ、約９８００Ｐａ Ｓ、約９９００Ｐａ Ｓ若しくは約１０，０００Ｐａ Ｓの粘度、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の粘度を有する。

【0029】

上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、本組成物は、約０．０１から約０．５のｔａｎデルタパラメータ（Ｇ’’／Ｇ’）を有する。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、本組成物は、約０．０１、約０．０５、約０．１０、約０．１５、約０．２０、約０．２５、約０．３０、約０．３５、約０．４０、約０．４５若しくは約０．５０のｔａｎデルタパラメータ（Ｇ’’／Ｇ’）、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意のｔａｎデルタパラメータを有する。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかの組成物のいくつかの実施形態では、緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水を含む。

【0030】

本開示はまた、ヒアルロン酸とコラーゲンとを架橋する方法を提供する。この方法は、コラーゲン、ヒアルロン酸及びリジンを水溶液に溶解して反応前水溶液を形成することであって、反応前水溶液が４～６のｐＨを有する、反応前水溶液を形成すること、及び、水溶性カルボジイミドと、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド又はＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミドとを含む第２の溶液を調製すること、及び、第２の溶液を反応前水溶液に加えて架橋反応混合物を形成すること、及び、ヒアルロン酸とコラーゲンとをリジンで架橋することにより架橋反応混合物を反応させること、を含み、ヒアルロン酸がコラーゲン上の少なくとも１つの内因性アミン基及び／又はリジン上に存在する少なくとも１つのアミン基によってコラーゲンに架橋され、ＨＡ及びコラーゲンがごくわずかに分解され、ＨＡ及びコラーゲンの構造が無傷のままであり、それによって架橋高分子マトリックスを形成する。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、反応前水溶液は、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５若しくは約６のｐＨ、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意のｐＨを含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、本方法は、トリアゾール、フッ素化フェノール、スクシンイミド又はスルホスクシンイミドを含む活性化剤を付与することをさらに含む。

【0031】

上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、本方法は、架橋高分子マトリックスにリドカインを加えることをさらに含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、リドカインは、マトリックス中、約０．１５％（ｗ／ｗ）から約０．４５％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度である。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、リドカインは、マトリックス中で約０．２７％（ｗ／ｗ）から約０．３３％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度である。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、リドカインは、マトリックスの約０．１５％（ｗ／ｗ）、約０．１７％（ｗ／ｗ）、約０．１９％（ｗ／ｗ）、約０．２１％（ｗ／ｗ）、約０．２３％（ｗ／ｗ）、約０．２５％（ｗ／ｗ）、約０．２７％（ｗ／ｗ）、約０．２９％（ｗ／ｗ）、約０．３１％（ｗ／ｗ）、約０．３３％（ｗ／ｗ）、約０．３５％（ｗ／ｗ）、約０．３７％（ｗ／ｗ）、約０．３７％（ｗ／ｗ）、約０．３９％（ｗ／ｗ）、約０．４１％（ｗ／ｗ）、約０．４３％（ｗ／ｗ）若しくは約０．４５％（ｗ／ｗ）の濃度、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の濃度である。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、リドカインは、マトリックス中、約０．３％（ｗ／ｗ）の濃度である。

【0032】

上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、本方法は、非架橋ＨＡを架橋高分子マトリックスに加えることをさらに含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、非架橋ＨＡは、架橋高分子マトリックス中、最大約５％ｗ／ｗの濃度を有する。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、非架橋ＨＡを、マトリックス中、約０％（ｗ／ｗ）、約１％（ｗ／ｗ）、約２％（ｗ／ｗ）、約３％（ｗ／ｗ）、約４％（ｗ／ｗ）若しくは約５％（ｗ／ｗ）の濃度、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の濃度に至るまで加える。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、非架橋ＨＡを、マトリックス中、約１％（ｗ／ｗ）の濃度に至るまで加える。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、非架橋ＨＡを、マトリックス中、約３％（ｗ／ｗ）の濃度に至るまで加える。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、非架橋ＨＡを、マトリックス中、約５％（ｗ／ｗ）の濃度に至るまで加える。

【0033】

上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、反応工程は、約４℃～約３５℃で行われる。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、反応工程は、約４℃、約５℃、約７℃、約９℃、約１１℃、約１３℃、約１５℃、約１７℃、約１９℃、約２１℃、約２３℃、約２５℃、約２７℃、約２９℃、約３１℃、約３３℃、約３５℃、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の温度で行われる。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、反応工程は、約４℃又は約２２℃で行われる。

【0034】

上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、本方法は、架橋高分子マトリックスを精製することをさらに含み、精製工程は、透析精製を用いて行われる。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、透析は、約２℃～約３０℃で行われる。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、透析は、約２℃、約３℃、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、若しくは約３０℃、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の温度で行われる。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、精製工程は、約２℃～約８℃で行われる。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、精製工程は、約２℃、約４℃、約６℃、約８℃、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の温度で行われる。

【0035】

上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、本方法は、室温未満で行われる。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、本方法は、約２℃、約４℃、約６℃、約８℃、約１０℃、約１２℃、約１４℃、約１６℃、約１８℃、約２０℃、約２２℃、約２４℃、約２６℃、約２８℃、約３０℃、約３２℃、約３４℃若しくは約３６℃の温度、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の温度で行われる。

【0036】

上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、架橋反応混合物のｐＨは、約４～約６．０である。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、架橋反応混合物のｐＨは、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５若しくは約６．０、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意のｐＨである。

【0037】

上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、反応前溶液は、約５０ｍＭ、約７５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１２５ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１７５ｍＭ、約２００ｍＭ、約２２５ｍＭ、約２５０ｍＭ、約２７５ｍＭ、約３００ｍＭ、３２５ｍＭ、約３５０ｍＭ、約３７５ｍＭ若しくは約４００ｍＭの濃度、又は架橋反応混合物中の前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の濃度の塩化ナトリウムを含む塩を含む。

【0038】

上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、水溶性カルボジイミドは、架橋反応混合物中、約２０ｍＭから約２００ｍＭの濃度の１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドである。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、水溶性カルボジイミドは、約２０ｍＭ、約４０ｍＭ、約６０ｍＭ、約８０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１６０ｍＭ、約１８０ｍＭ若しくは約２００ｍＭの濃度、又は任意の前述の値によって定義される範囲の間の任意の濃度の１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドである。

【0039】

上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかの方法のいくつかの実施形態では、水溶性カルボジイミド及びヒアルロン酸の、水溶性カルボジイミドの繰り返し単位：ヒアルロン酸の繰り返し単位のモル対モル比が約０．５から約２．０である。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、水溶性カルボジイミド及びヒアルロン酸の、水溶性カルボジイミドの繰り返し単位：ヒアルロン酸の繰り返し単位のモル対モル比が、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９又は約２．０である。

【0040】

上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、リジン及びヒアルロン酸のモル：モル（リジンの繰り返し単位：ＨＡの繰り返し単位）比が、約０．０１～約０．６である。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、リジン及びヒアルロン酸のモル：モル（リジンの繰り返し単位：ＨＡの繰り返し単位）比が、約０．０１、約０．０２、約０．０３、約０．０４、約０．０５、約０．０６、約０．０７、約０．０８、約０．０９、約０．１０、約０．１１、約０．１２、約０．１３、約０．１４、約０．１５、約０．１６、約０．１７、約０．１８、約０．１９、約０．２、約０．２１、約０．２２、約０．２３、約０．２４、約０．２５、約０．２６、約０．２７、約０．２８、約０．２９、約０．３、約０．３１、約０．３２、約０．３３、約０．３４、約０．３５、約０．３６、約０．３７、約０．３８、約０．３９、約０．４、約０．４１、約０．４２、約０．４３、約０．４４、約０．４５、約０．４６、約０．４７、約０．４８、約０．４９、約０．５、約０．５１、約０．５２、約０．５３、約０．５４、約０．５５、約０．５６、約０．５７、約０．５８、約０．５９又は約０．６である。

【0041】

上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、方法は、架橋高分子マトリックスを滅菌することをさらに含み、本方法は、蒸気滅菌のために架橋高分子マトリックスを容器に移すこと、及びヒドロゲルを蒸気滅菌によって滅菌すること、を含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、容器はシリンジである。

【0042】

上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、方法は、架橋高分子マトリックスを透析することをさらに含み、透析が約１０００ダルトンから約１００，０００ダルトンの分子量カットオフを有する膜を介して行われ、透析が滅菌前に行われる。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、透析は、リン酸緩衝生理食塩水で行われる。

【0043】

上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、反応前溶液中のヒアルロン酸は、第２の溶液を加える前に少なくとも６０分間水和する。

【0044】

上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、架橋反応混合物は、約１６時間から約２４時間にわたって行われる。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、架橋反応混合物は、約１６時間、約１８時間、約２０時間、約２２時間若しくは約２４時間、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の時間にわたって行われる。

【0045】

上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、架橋反応は、約２℃から約３５℃で行われる。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、架橋反応は、約２℃、約３℃、約４℃、約５℃、約７℃、約９℃、約１１℃、約１３℃、約１５℃、約１７℃、約１９℃、約２１℃、約２３℃、約２５℃、約２７℃、約２９℃、約３１℃、約３３℃、約３５℃、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲内の任意の温度で行われる。

【0046】

上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、架橋反応は、約２℃から約８℃で行われる。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、架橋反応は、約２℃、約４℃、約６℃又は約８℃、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲内の任意の温度で行われる。

【0047】

本開示はまた、上記又は下記の実施形態のいずれか１つの方法によって調製された架橋高分子マトリックスを提供する。

【0048】

さらに、本開示は、人間の解剖学的特徴の審美性を改善する方法を提供する。本方法は、人間の組織に組成物を注入し、それによって解剖学的特徴の審美性を改善することを含み、本組成物は、ヒアルロン酸と、リジンと、コラーゲンとを含む架橋高分子マトリックスを含み、ヒアルロン酸が、コラーゲン上の少なくとも１つの内因性アミン基及び／又はリジン上に存在する少なくとも１つのアミン基によってコラーゲンに架橋されている。

【0049】

本開示はまた、個体の外観を改善する方法を提供する。本方法は、注入部位で個体の組織に組成物を注入し、それによって解剖学的特徴の審美性を改善することであって、組織からの浸潤細胞が注入部位内の組成物に一体化される、組成物を注入すること、この組成物内に新しいコラーゲンを堆積させることであって、組成物が、ヒアルロン酸と、リジンと、コラーゲンとを含む架橋高分子マトリックスを含み、ヒアルロン酸が、コラーゲン上の少なくとも１つの内因性アミン基及び／又はリジン上に存在する少なくとも１つのアミン基によってコラーゲンに架橋されている、新しいコラーゲンを堆積させること、を含み、本組成物が注入された組織は、組織の一体化及びコラーゲンの堆積並びに血管形成を有することが示される。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、本組成物は、ホウレイ線に注入される。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、本方法は、顔の特徴間の対称性を改善する。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、本方法は、顔の特徴に対してボリュームを増大及び復元する。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、本方法は、頬／又はこめかみにボリュームを復元する。いくつかの実施形態では、本方法は、顎先、顎ライン、又はホウレイ線のボリュームを増大させ、補正し、復元し、又は与える。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、本組成物は、個体の涙液トラフに注入される。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、本組成物は、皮膚の萎縮及び／又は脂肪体の萎縮を含む領域に注入される。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、本方法は、注入を受ける組織に自然な見た目、感触、及び動きを与え、本組成物は、注入部位の周囲の組織からのコラーゲンの浸潤の増加をもたらす。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、注入部位への組織の一体化の結果として、本組成物の持続時間が延長される。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、本方法は、注入部位の周囲の皮膚の水和及び弾性を改善する。

【0050】

本開示はまた、コラーゲンの堆積による皮膚充填剤の移植片における組織浸潤を増加させる方法を提供する。この方法は、個体の組織に組成物を注入し、それによってその組成物を含む皮膚充填剤のデポーを作り出すことであって、組成物が、ヒアルロン酸と、リジンと、コラーゲンとを含む架橋高分子マトリックスを含み、ヒアルロン酸が、コラーゲン上の少なくとも１つの内因性アミン基及び／又はリジン上に存在する少なくとも１つのアミン基によってコラーゲンに架橋されている、個体の組織に組成物を注入することを含み、皮膚充填剤のデポーの周囲の組織からの細胞が組成物を含む皮膚充填剤のデポーに浸潤し、細胞が組成物に一体化して新しいコラーゲンを組成物に堆積させ、それによって組成物内に浸潤組織を作り出し、血管が組成物内の浸潤組織を個体の身体の血液供給源に接続する。

【0051】

上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、コラーゲンは、Ｉ型コラーゲン及び／又はＩＩＩ型コラーゲンを含む。

【0052】

上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、本組成物は、約１８ｍｇ／ｍｌのヒアルロン酸、約２０ｍｇ／ｍＬのヒアルロン酸、約２２ｍｇ／ｍｌのヒアルロン酸、約２４ｍｇ／ｍｌのヒアルロン酸、約２６ｍｇ／ｍｌのヒアルロン酸、約２８ｍｇ／ｍｌのヒアルロン酸又は約３０ｍｇ／ｍｌのヒアルロン酸を含み、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の濃度を有する。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、本組成物は、約１３ｍｇ／ｍｌのヒアルロン酸を含む。

【0053】

上記又は下記の方法の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、本組成物又は高分子マトリックスは、リドカインをさらに含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、リドカインは、マトリックス中、０．１５％（ｗ／ｗ）～０．４５％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度である。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、リドカインは、マトリックス中、０．２７％（ｗ／ｗ）～０．３３％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度である。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、リドカインは、マトリックスの約０．１５％（ｗ／ｗ）、約０．１７％（ｗ／ｗ）、約０．１９％（ｗ／ｗ）、約０．２１％（ｗ／ｗ）、約０．２３％（ｗ／ｗ）、約０．２５％（ｗ／ｗ）、約０．２７％（ｗ／ｗ）、約０．２９％（ｗ／ｗ）、約０．３１％（ｗ／ｗ）、約０．３３％（ｗ／ｗ）、約０．３５％（ｗ／ｗ）、約０．３７％（ｗ／ｗ）、約０．３７％（ｗ／ｗ）、約０．３９％（ｗ／ｗ）、約０．４１％（ｗ／ｗ）、約０．４３％（ｗ／ｗ）若しくは約０．４５％（ｗ／ｗ）の濃度、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の濃度である。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、リドカインは、マトリックス中、約０．３％（ｗ／ｗ）の濃度である。

【0054】

本方法の上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、本組成物又は高分子マトリックスは、非架橋ＨＡをさらに含む。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、非架橋ＨＡは、本組成物又はマトリックス中、最大約５％（ｗ／ｗ）の濃度を有する。本方法の上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、非架橋ＨＡは、本組成物又はマトリックス中、約０％（ｗ／ｗ）、約１％（ｗ／ｗ）、約２％（ｗ／ｗ）、約３％（ｗ／ｗ）、約４％（ｗ／ｗ）若しくは約５％（ｗ／ｗ）の濃度、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の濃度を有する。本方法の上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、非架橋ＨＡは、本組成物又はマトリックス中、約１％（ｗ／ｗ）の濃度を有する。本方法の上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、非架橋ＨＡは、本組成物又はマトリックス中、約２％（ｗ／ｗ）の濃度を有する。本方法の上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、非架橋ＨＡは、本組成物又はマトリックス中、約５％（ｗ／ｗ）の濃度を有する。

【図面の簡単な説明】

【0055】

【図1】図１は、ＨＡ／コラーゲン架橋ヒドロゲル製剤と密接に接触したインビトロ細胞活性細胞を示す。

【0056】

【図2A-2D】図２は、ＨＡのみのヒドロゲル又はＨＡ／コラーゲン架橋ヒドロゲル上で培養した線維芽細胞のアクチンフィラメントアライメント指数（２Ａ）、細胞長対幅比（２Ｂ）及び凸包対細胞面積比（２Ｃ）を示す。５℃の水和温度で製剤化されたＨＡ－コラーゲンヒドロゲル（２４：６ ＨＡ：コラーゲン）（製剤Ｘ）は、２２℃の水和温度で製剤化された同様のヒドロゲル（製剤ＶＩ）よりも有意に高いアクチンフィラメントアライメント指数、細胞長対幅比、及び凸包対細胞面積比を示す。テューキー事後分析を用いたＡＮＯＶＡにより＊ｐ＜０．０５。５℃の水和温度で製剤化された２０：６ ＨＡ：コラーゲンを有するＨＡ－コラーゲンヒドロゲルは、ＨＡのみのゲル（製剤ＸＩＸ）と比較した場合、特に高いアクチンフィラメントアライメント指数、細胞長対幅比、及び凸包対細胞面積比を示す。テューキー事後分析を用いたＡＮＯＶＡにより＊ｐ＜０．０５。図２Ｄは、ＨＡのみのヒドロゲルから得られたユークリッド距離（アクチンフィラメントアライメント指数、細胞長対幅比、及び凸包対細胞面積比を含む３次元空間）の関数としてのＨＡ－コラーゲンヒドロゲルのランキングを示す。ユークリッド距離の増加は、低付着性ＨＡのみのゲルと比較して、細胞の拡延性及び付着性の改善を示す。全体として、５℃の水和温度で製剤化されたヒドロゲルは、ＨＡのみのゲルより大きなユークリッド距離を示す。

【0057】

【図3】図３は、製剤Ｉ対製剤ＩＩ対製剤ＩＩＩ（平均＋／－ＳＥＭ）のリフトプロファイルを示す。

【0058】

【図4】図４は、製剤ＸＶ対製剤ＩＩＩ（平均＋／－ＳＥＭ）のリフトプロファイルを示す。

【0059】

【図5】図５は、製剤ＩＩ対製剤ＸＶ対製剤ＸＶＩ（平均＋／－ＳＥＭ）のリフトプロファイルを示す。

【0060】

【図6】図６は、４ｍｇ／ｍＬのコラーゲンで、ＨＡ濃度を増加させた場合のヒドロゲルの組織の一体化を示す。（６Ａ）Ｈ＆Ｅ、（６Ｂ）コラーゲン１ａ、（６Ｃ）ビメンチン、（６Ｄ）プロコラーゲン１、（６Ｅ）ＣＤ３１。Ｈ＆Ｅ染色によって、ＨＡ濃度の増加に伴う組織内増殖の減少を実証する。示されるように、１３ｍｇ／ｍＬのＨＡ製剤（製剤Ｉ）では濃いコラーゲン１ａの染色が観察される。２０ｍｇ／ｍＬのＨＡ製剤はコラーゲン１ａの充填物の減少を示し、２５ｍｇ／ｍＬのＨＡ製剤はコラーゲン１ａの堆積のない広い領域を示す。ビメンチン陽性線維芽細胞／線維細胞浸潤がすべての製剤で観察され、浸潤の程度はＨＡ濃度の増加と共に減少した。プロコラーゲンＩの染色は、低ＨＡ製剤（製剤Ｉ）では、２０ｍｇ／ｍＬ及び２５ｍｇ／ｍＬのＨＡ製剤と比較して減少したように見えた。２０ｍｇ／ｍＬ及び２５ｍｇ／ｍＬのＨＡ製剤においてプロコラーゲンＩの染色があることは、時間の経過と共にコラーゲンの堆積が継続していることを示している可能性がある。ヒドロゲルボーラス内の血管増生は、陽性ＣＤ３１の染色によって示されるように、２０ｍｇ／ｍＬ及び２５ｍｇ／ｍＬのＨＡ製剤で観察された。ＣＤ３１の染色は、１３ｍｇ／ｍＬのＨＡ製剤では行わなかった。

【0061】

【図7】図７は、高分子量ＨＡよりも高い割合の低分子量ＨＡを用いて調製されたヒドロゲルの組織の一体化を示す。（Ａ）コロイド鉄、（Ｂ）コラーゲン１ａ、（Ｃ）ビメンチン、（Ｄ）プロコラーゲン１、（Ｅ）ＣＤ３１。コロイド鉄染色は、製剤ＸＶヒドロゲルの周縁部での組織の一体化及び製剤ＸＶＩゲルボーラス全体にわたる堅牢な組織の一体化を実証する。製剤ＸＶボーラスの背面に高密度なコラーゲン１ａの堆積が観察されたが、この堆積によってゲルは完全に充填されなかった。製剤ＸＶＩヒドロゲル全体を通して、コラーゲン１ａ陽性組織の微細鎖が観察される。ビメンチン陽性線維芽細胞／線維細胞浸潤がすべての製剤において観察された。製剤ＸＶＩボーラスの大部分にビメンチン陽性細胞を浸潤させた。製剤ＸＶ及び製剤ＸＶＩゲルの両方において、プロコラーゲンＩの染色があった。プロコラーゲンＩの染色があることは、時間の経過と共にコラーゲンの堆積が継続していることを示している可能性がある。ヒドロゲルボーラス内の血管増生は、両方の製剤（矢じり）で観察された。製剤ＸＶＩ製剤は、ボーラス全体にわたって最も堅牢な血管新生を示した。

【0062】

【図8】図８は、室温（製剤ＶＩ）及び５℃（製剤Ｘ）の水和温度で調製した、２４ｍｇ／ｍＬのＨＡ及び６ｍｇ／ｍＬのコラーゲンを含有するヒドロゲルの組織の一体化を示す。コラーゲン１ａの染色は、製剤ＶＩヒドロゲルの周囲に微細なコラーゲンが分布していることを示し、ヒドロゲルの粒子の周囲の堆積は限られている。製剤Ｘゲルのコラーゲン１ａの染色は、ヒドロゲルの周囲に強固なコラーゲンが堆積していることを示し、ヒドロゲルの粒子の周囲に高密度のコラーゲンが堆積していることを示す。

【0063】

【図9】図９は、ラットへの皮下注入１２週間後のヒドロゲル外植片のヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）並びに免疫組織化学（ＩＨＣ）染色を示す。Ｈ＆Ｅ染色が、製剤ＸＩＸ中のヒドロゲル粒子と密接に関連した組織の堆積を示す一方で、ＨＡのみのヒドロゲル中の大きなヒドロゲルの堆積物の周囲にはまばらな組織の堆積が観察される。ビメンチン染色は、ＨＡのみのゲルよりも製剤ＸＩＸヒドロゲルボーラスへのより広範な線維細胞／線維芽細胞浸潤を示す。製剤ＸＩＸボーラスはまた、広範なＣＤ３１陽性標識によって示されるように、ＨＡのみのボーラスよりも高度に血管新生されている。製剤ＸＩＸボーラスの細胞浸潤及び血管新生の増強により、コラーゲンＩの標識によって示されるように、ボーラス内の組織のより高密度で均一な堆積が可能になる。

【0064】

【図10】図１０は、陽性染色領域の免疫組織化学的（ＩＨＣ）定量化によって、ＨＡのみのヒドロゲルと比較して、ラットへの１２週間の皮下移植後の製剤ＸＩＸヒドロゲルのボーラス中のビメンチン（線維芽細胞）、コラーゲンＩ及びＣＤ３１（血管）のレベルの増加が示されていることを示す。

【0065】

【図11】図１１は、ラットの皮下注入モデルにおけるリフト能力を示す。製剤ＸＩＸは、２４ｍｇ／ｍＬのＨＭＷ ＨＡのみのゲルと同様のリフト能力を４週間から１２週間示す。示されるように、この製剤は、ＨＡのみのゲルと同様のリフト能力を保持しながら、組織の一体化の向上を示す。

【0066】

【図12】図１２は、架橋ＨＡ－コラーゲンゲルの２８週のリフト能力データを示す。ＨＡのみのゲルのリフト能力は、経時的に着実に減少している。ＨＡ－コラーゲンゲルのリフト能力は１２から２８週間安定したままであった。本開示を限定するものではないが、これは、ＨＡ－コラーゲンゲルがＨＡのみのゲルよりも治療効果の持続時間が長いことを示している可能性がある。持続時間の延長は、より良好な一体化及び組織内殖の結果であり得る。示されるように、製剤ＸＩＸは、特に、ＨＡのみのゲルよりも有意に良好な組織内殖を有する。

【0067】

【図13】図１３は、２４：６のＨＡ対コラーゲンゲルでオートクレーブ処理前後に観察された差を示す。２４：６のＨＡ対コラーゲンゲル（試料１及び試料２として重複して実行）は、全体的に細胞生存率が低かった。しかしながら、オートクレーブ製剤及び非オートクレーブ製剤はすべて、ＨＡのみのゲルよりも高い細胞生存率を示している。示されるように、オートクレーブ処理の前（Ｂ）及び後（ＢＡ）に、２４：６のＨＡ対コラーゲンを含有するゲルの複製（試料１及び試料２）で行われた実験である。試料１では細胞生存率にわずかだが有意な差が観察されたが、オートクレーブ処理後の試料２では有意な差は観察されなかった。

【0068】

【図14】図１４は、ラットモデルにおける４週間の皮下移植後のゲル充填剤ボーラスのＨ＆Ｅ染色を示す。製剤ＸＸＩＩ（Ａ；２０ｍｇのＨＡ：４ｍｇのコラーゲン、５℃で水和）は、製剤ＸＩＸ（Ｂ；２０ｍｇのＨＡ：６ｍｇのコラーゲン、５℃で水和）と同様又はより良好な組織の一体化を示す。病理学者による盲検スコアリングは、製剤ＸＩＸのスコアが１．８３であるのに対して、スコアが２．３３である製剤ＸＸＩＩの一体化が向上していることをさらに実証している。より高いスコアは、より良好な組織の一体化を示す。対照的に、製剤ＸＸ（Ｃ；２０ｍｇのＨＡ：１０ｍｇのコラーゲン、２５℃で合成）は、製剤ＸＸＩＩ及び製剤ＸＩＸよりも劣った組織の一体化を示している。製剤ＸＸの組織の一体化のスコアは１．１３である。この結果は、組織の一体化がコラーゲン濃度の線形トレンドに従わないことをさらに実証している。代わりに、組織応答の増強を達成する最適な合成条件及びコラーゲン濃度が存在する。

【0069】

【図15】図１５は、ＨＡのみのコラーゲン及びＨＡ－コラーゲン（製剤ＸＸＩＩ及び製剤ＸＸＩＩＩ）のゲルと共に培養したヒト皮膚線維芽細胞のインビトロ細胞生存率を示す。

【0070】

【図16】図１６は、ＨＡのみのコラーゲン又はＨＡ－コラーゲンゲル（製剤ＸＸＩＩ及び製剤ＸＸＩＩＩ）と共に培養したヒト皮膚線維芽細胞の長さ対幅の比の画像分析を示す。

【0071】

【図17】図１７は、ラットにおける製剤ＸＸＩＩ及び製剤ＸＸＩＩＩ又はＨＡのみの対照の４週間の皮下移植後のゲルボーラスの組織の一体化のスコアリングを示す図である。

【0072】

【図18】図１８は、ＨＡのみのゲルと比較した、製剤ＸＸＩＩ及び製剤ＸＸＩＩＩの組織の一体化のコラーゲン１ａの染色を示す。

【0073】

【図19】図１９は、製剤ＸＸＩＩのラットへの４週間の皮下移植後のヒドロゲルボーラス内のコラーゲン１ａの染色の陽性面積パーセントの定量化を示す。

【0074】

【図20】図２０は、ＨＡのみ、製剤ＸＸＩＩ又は製剤ＸＸＩＩＩのゲル上で４８時間培養したヒト皮膚線維芽細胞の共焦点顕微鏡写真を示す。試料を、ＨＡ結合タンパク質、Ｈｏｅｃｈｓｔ及び小麦胚芽凝集素（細胞膜）について染色した。

【0075】

【図21】図２１は、ラットへの４週間の皮下移植後のＨＡのみ及びＨＡ－コラーゲンヒドロゲル（製剤ＸＸＩＩ及び製剤ＸＸＩＩＩ）に対する組織応答の免疫組織化学分析を示す。

【0076】

【図22】図２２は、ＨＡのみのゲルと比較した製剤ＸＸＩＩの５２週のリフト能力データを示す。

【0077】

【図23】図２３は、ＨＡのみのゲルと比較した製剤ＸＸＩＩＩの２６週のリフト能力データを示す。

【0078】

【図24】図２４は、ＨＡのみ、製剤ＸＸＶＩ又は製剤ＸＸＶのゲル上で４８時間培養したヒト皮膚線維芽細胞の共焦点顕微鏡写真を示す。試料を、ＨＡ結合タンパク質、Ｈｏｅｃｈｓｔ及び小麦胚芽凝集素（細胞膜）について染色した。

【0079】

【図25】図２５は、１２週間後にＨＡのみ、製剤ＸＸＶ又は製剤ＸＸＩＩＩの皮下ボーラス注入で処置したラットにおける第二高調波発生シグナル（白色）及び組織自己蛍光（緑色）の二光子イメージングを示す。

【0080】

【図26】図２６は、ラットにおける４週間の皮下移植後の製剤ＸＸＶに対する組織応答の免疫組織化学分析を示す。

【0081】

【図27】図２７は、ラットにおける４週間の皮下移植後の製剤ＸＸＶＩに対する組織応答の免疫組織化学分析を示す。

【0082】

【図28】図２８は、ＨＡのみのゲルと比較した製剤ＸＸＶ及び製剤ＸＸＶＩの３０週のリフト能力データを示す。

【発明を実施するための形態】

【0083】

本明細書で使用されるセクションの見出しは、構成上の目的のためのものに過ぎず、記載された主題を限定するものと解釈されるべきではない。

【0084】

本明細書で使用される用語の定義が、その用語の一般的に使用される意味から逸脱する場合、出願人は、具体的に示されない限り、本明細書で提示される定義を利用することを意図している。

【0085】

架橋高分子マトリックス、架橋高分子マトリックスを含む組成物、架橋高分子マトリックスを作製する方法及び個体の外観を改善する方法が本明細書に開示される。本実施形態に記載の架橋高分子マトリックスを含む充填剤は、注入後の即時の充填性及びリフティング性を有し、これに注入部位への組織の一体化が続き得、このことが長期的かつ自然な効果をもたらし得る。

【0086】

有利には、架橋方法は、様々な充填特性及びリフティング特性を生じる調整可能な物理的特性を有するＨＡ／コラーゲン材料を提供し、その結果、そのような材料を、組織の様々な深さに、顔面の様々な領域に、そして様々な目的（ボリューム形成、重度の皺、小皺など）のために、注入することを可能にする。さらに、この合成方法は、架橋ヒドロゲルへのコラーゲンの共有結合性の取り込みを通して、周囲組織から注入されたボーラスへの細胞浸潤の制御を可能にする。さらに、この架橋はまた、コラーゲンを変性から保護することができる。リフティング特性と組織の一体化の特性との組み合わせは、自然な感触、外観、及び動きによって優れた顔の審美的向上をもたらすことが期待される。本明細書に記載されるように、以前のコラーゲン充填剤及び現在のＨＡ充填剤を凌駕し得る優れたハイブリッド材料をもたらす充填剤の品質を改善する方法である。

【0087】

他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。

【0088】

本発明を説明する文脈で（特に以下の特許請求の範囲の文脈で）使用される用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」及び同様の指示対象は、本明細書で特に指示されない限り、又は文脈と明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含すると解釈されるべきである。測定可能な値に言及するときに本明細書で使用される「約」は、指定された値から＋２０％又は＋１０％、より好ましくは＋５％、さらにより好ましくは＋１％、さらにより好ましくは＋０．１％の変動を包含することを意味する。

【0089】

本明細書で使用される場合、文脈がそうでないことを要求する場合を除いて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語、並びに「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」などの用語の変形は、さらなる添加物、構成要素、整数又は工程を排除することを意図しない。

【0090】

「架橋高分子マトリックス」は、ＨＡとコラーゲンとを架橋することによって形成されたマトリックスを指す。ＨＡとコラーゲンとは、ＨＡ及びコラーゲンの天然カルボン酸部分を、かかる部分がコラーゲン上に存在する内因性アミン基と反応することができるように活性化することによって架橋され得る。さらに、ＨＡとコラーゲンとの架橋をさらに促進するために、リジンをカルボン酸／ジアミン架橋剤として加えてもよい。このようにリジンを加えることによって、得られるヒドロゲルの物理的特性を調整することが可能になる。架橋高分子マトリックスは、医療審美性のための組成物又は製剤に（例えば、審美的充填剤又は皮膚充填剤として）使用することができる。

【0091】

本明細書に記載の「ヒアルロン酸」又は「ヒアルロナン」は、結合組織、上皮組織及び神経組織において人体全体に広く分布する非硫酸化グリコサミノグリカンを指す。ヒアルロナンは、皮膚の様々な層に豊富に存在し、例えば、良好な水和を確実にする、細胞外マトリックスの組織化を補助する、充填剤材料として作用するなどの複数の機能を有し、組織の修復機構に関与している。

【0092】

本明細書に記載の「コラーゲン」は、体内の様々な結合組織における細胞外空間の主要な構造タンパク質である。コラーゲンは、引張荷重を支える原線維及びシートを形成する。コラーゲンはまた、細胞付着性のための特異的なインテグリン結合部位を有し、細胞の付着、遊走及び増殖を促進することが知られている。コラーゲンは、アルギニン、リジン、ヒドロキシリジンなどの塩基性アミノ酸残基の含有量が高いため、正に帯電している場合がある。人体のコラーゲンの９０％以上がＩ型コラーゲンである。ＩＩＩ型コラーゲンは、網状線維の主成分であり、一般にＩ型コラーゲンと一緒に見出され得る。当業者は、コラーゲンが商業的供給源から提供され得ることを理解するであろう。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、提供されるコラーゲン材料は、約９７％から約９９％のＩ型コラーゲンと、約１％から３％のＩＩＩ型コラーゲンである残りのコラーゲンとの混合物を有し得る。

【0093】

上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、コラーゲンは、架橋コラーゲンである。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、コラーゲンは、非架橋コラーゲンである。

【0094】

上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、ＨＡはアミンに架橋され、コラーゲン又はＨＡのいずれかの上のリジンを介して、又は別のアミン基によって２つ以上の架橋を有し得る。

【0095】

「弾性率」は、弾性係数としても知られており、応力が加えられたときに弾性的（すなわち、非恒久的に）に変形する物体又は物質の抵抗を測定する量を指す。

【0096】

本明細書に記載の「圧縮力」は、物体を圧迫、圧潰、又は圧縮させる、物体に対する力、圧力、又は労作の印加を指す。

【0097】

本明細書に記載の「滅菌」は、材料中の微生物の死をもたらし得る滅菌プロセスへの材料の提出を指す。消毒及び滅菌のための方法は、物理的、化学的及び物理化学的手段によるものであり得る。

【0098】

ヒドロゲルなどの材料の場合、滅菌は、あまり激しくない条件、例えば、滅菌のためのより短い時間、より低い温度及びより低い用量曝露で達成され得る。

【0099】

限定するものではないが、滅菌は、蒸気熱、乾熱、及び／又は電離放射線を含み得る。

【0100】

滅菌プロセスに供された結果、ヒドロゲルなどの滅菌製品が形成され得る。そのような滅菌プロセスは、Ｃｈｉｔｒｅら（米国特許出願公開第２０１４／００１１９８０号）、Ｃｈｉｔｒｅら（米国特許出願公開第２０１８／０１４７３０７号）及びＣｈｉｔｒｅら（米国特許出願公開第２０１６／０１０１２００号）に見出すことができる。

【0101】

一実施形態では、本組成物又はマトリックスは麻酔薬を含む。限定するものではないが、麻酔薬としては、ベンゾカイン、クロロプロカイン、プロカイン、プロパラカイン、テトラカイン、アミロカイン、オキシブプロカイン、アルチカイン、ブピバカイン、ジブカイン、エチドカイン、レボブピバカイン、リドカイン、メピバカイン、プリロカイン、ロピバカイン、サメリジン、トニカイン、シンコカインが挙げられる。

【0102】

方法
ヒアルロン酸及びコラーゲンは、１－エチル－３－（Ｎ，Ｎ’－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）及びＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いて共架橋されて、ＨＡ及びコラーゲン上に存在する天然のカルボン酸部分を、コラーゲン上に存在する内因性アミン基との反応に向けて活性化し得る。一実施形態では、ＨＡ及びコラーゲンの化学修飾をさらに強化し、得られるヒドロゲルの物理的特性を調整するために、リジンが追加のジアミン架橋剤として加えられる。

【0103】

リジンを加えることによって、架橋の独立した調整を可能にし得、ＨＡ：コラーゲンの組成又は活性化試薬の量を変化させることなくヒドロゲルの物理的特性を調節し得る。一実施形態では、架橋反応は、ＨＡ皮膚充填剤において標準であるＢＤＤＥ架橋に必要なより高いｐＨ及び温度ではなく、穏やかなｐＨ及び温度条件下（ｐＨ５．５及び４～２５℃）で行われる。この方法を使用すると、驚くべきことに、ＨＡ及び傷つきやすいコラーゲンタンパク質成分は、例に示されるように、架橋中にごくわずかに分解されることが示され、それらの構造はほとんど無傷の状態に維持される。

【0104】

一実施形態では、ヒアルロン酸を、コラーゲンとの架橋工程の前に少なくとも６０分間水和する。さらなる実施形態では、ヒアルロン酸を、室温より低い温度で水和する。なおさらなる実施形態では、ヒアルロン酸を、約２℃、約４℃、約６℃、約８℃、約１０℃、約１２℃、約１４℃、約１６℃、約２０℃、約２２℃、約２４℃の温度、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の温度で水和する。一実施形態では、ヒアルロン酸を、室温より高い温度で水和する。したがって、ヒドロゲルを作製する方法は、例えば、ｔａｎ ｄｅｌ（タンデル）パラメータ（Ｇ’’／Ｇ’）などのヒドロゲル特性を調整するために調整することができる。

【0105】

一実施形態では、コラーゲンは溶液の形で提供されてもよく、この溶液は酸性ｐＨを有し、コラーゲンは可溶性である。

【0106】

一実施形態では、コラーゲンは、線維化前コラーゲンとして提供され、コラーゲンは架橋前に処理される。一実施形態では、線維化前コラーゲンは塩基性溶液内に存在する。一実施形態では、コラーゲンは可溶性コラーゲンとして提供され、コラーゲンは酸性溶液内に存在する。一実施形態では、線維化前コラーゲンは溶液内にあり、この溶液は中性ｐＨを有する。

【0107】

一実施形態では、架橋反応は、４．０、５．０、５．５、６．０、６．５若しくは７．０のｐＨ、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意のｐＨで行われる。

【0108】

ヒドロゲルの物理的特性は、ＨＡ及びコラーゲンの濃度、ＨＡの分子量、ＥＤＣの濃度、ＥＤＣ／ＮＨＳ比、温度、ｐＨ、塩／緩衝液濃度、及びリジンの濃度に依存し得る。一実施形態では、３０Ｐａからほぼ１０，０００Ｐａの範囲の弾性率（Ｇ’）値が得られる。一実施形態では、弾性率は製剤化及び合成のパラメータに依存する。製剤化及び合成のパラメータは、調整することができる。一実施形態では、圧縮力値は２０ｇｍｆから５００ｇｍｆ超の範囲であり、ヒドロゲルの膨潤は元のゲル体積の１．５倍から５倍の範囲であり得る。得られた物理的特性の広いスペクトルに基づいて、様々なＨＡ／コラーゲンの構成は、様々なフェイシャルアプリケーション用の皮膚充填剤としての用途を見出すことができる。

【0109】

架橋反応の一実施形態では、本方法は、架橋工程を停止することを含む。

【0110】

本明細書の実施形態に記載されているように、Ｇ’及び圧縮力値が低く、膨潤が最小である製剤は、ごく表面にできた小皺の充填剤又は注入可能な皮膚の質向上剤に適用することができる一方で、Ｇ’及び圧縮力が高く、膨潤が大きいより堅牢な構成は、中程度から重度の皺の矯正及び顔のボリューム形成／輪郭形成に使用することができる。

【0111】

一実施形態では、小皺を充填する方法は、低いＧ’及び圧縮力値を有する組成物を必要とする患者に供給する工程を含む。一実施形態では、中程度から重度の皺の矯正及び顔のボリューム形成／輪郭形成の処置を行う方法が提供され、必要とする患者に組成物を提供することを含むこの方法は、より高いＧ’及び圧縮力を有する。

【0112】

架橋高分子マトリックスのＨＡ濃度を増加させることが企図される。ＨＡ濃度を増加させると、例えば、より高いＧ’、より高い圧縮力値及びより高い不透明度を有するヒドロゲルを得ることができる。不透明度の増加はまた、チンダル効果による注入部位の青色変色の可能性を減少させることができる。強い架橋高分子マトリックスは、組織を持ち上げし、その後の変形に抵抗するために必要な力をもたらすことができ、これは所望の矯正及び外観をもたらすことができる。このように、高いリフティング能力は、マトリックスの高い強度を必要とし得る。弾性率（Ｇ’）は、マトリックスの剛性及びマトリックスの押出の容易さを表すことができる。

【0113】

弾性率は、ヒアルロン酸の濃度の関数であり得る。一実施形態では、ＨＡ濃度は１３ｍｇ／ｍｌ～２８ｍｇ／ｍｌの範囲の間である。一実施形態では、本組成物は、約３０Ｐａ、約４０Ｐａ、約５０Ｐａ、約６０Ｐａ、約７０Ｐａ、約８０Ｐａ、約９０Ｐａ、約１００Ｐａ、約２００Ｐａ、約３００Ｐａ、約４００Ｐａ、約５００Ｐａ、約６００Ｐａ、約７００Ｐａ、約８００Ｐａ、約９００Ｐａ、約１０００Ｐａ、約１１００Ｐａ、約１２００Ｐａ、約１３００Ｐａ、約１４００Ｐａ、約１５００Ｐａ、約１６００Ｐａ、約１７００Ｐａ、約１８００Ｐａ、約１９００Ｐａ、約２０００Ｐａ、約２１００Ｐａ、約２２００Ｐａ、約２３００Ｐａ、約２４００Ｐａ、約２５００Ｐａ、約２６００Ｐａ、約２７００Ｐａ、約２８００Ｐａ、約２９００Ｐａ、約３０００Ｐａ、約３１００Ｐａ、約３２００Ｐａ、約３３００Ｐａ、約３４００Ｐａ、約３５００Ｐａ、約３６００Ｐａ、約３７００Ｐａ、約３８００Ｐａ、約３９００Ｐａ、約４０００Ｐａ、約４１００Ｐａ、約４２００Ｐａ、約４３００Ｐａ、約４４００Ｐａ、約４５００Ｐａ、約４６００Ｐａ、約４７００Ｐａ、約４８００Ｐａ、約４９００Ｐａ、約５０００Ｐａ、約５１００Ｐａ、約５２００Ｐａ、約５３００Ｐａ、約５４００Ｐａ、約５５００Ｐａ、約５６００Ｐａ、約５７００Ｐａ、約５８００Ｐａ、約５９００Ｐａ、約６０００Ｐａ、約６１００Ｐａ、約６２００Ｐａ、約６３００Ｐａ、約６４００Ｐａ、約６５００Ｐａ、約６６００Ｐａ、約６７００Ｐａ、約６８００Ｐａ、約６９００Ｐａ、約７０００Ｐａ、約７１００Ｐａ、約７２００Ｐａ、約７３００Ｐａ、約７４００Ｐａ、約７５００Ｐａ、約７６００Ｐａ、約７７００Ｐａ、約７８００Ｐａ、約７９００Ｐａ、約８０００Ｐａ、約８１００Ｐａ、約８２００Ｐａ、約８３００Ｐａ、約８４００Ｐａ、約８５００Ｐａ、約８６００Ｐａ、約８７００Ｐａ、約８８００Ｐａ、約８９００Ｐａ、約９０００Ｐａ、約９１００Ｐａ、約９２００Ｐａ、約９３００Ｐａ、約９４００Ｐａ、約９５００Ｐａ、約９６００Ｐａ、約９７００Ｐａ、約９８００Ｐａ、約９９００Ｐａ若しくは約１００００ＰａのＧ’、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の弾性率を有する。

【0114】

一実施形態では、より高いＧ’値が望ましい。より高いＧ’値はまた、ＥＤＣ：ＨＡの比又はＥＤＣ：ＮＨＳの比を増加させることによっても得ることができる。異なる分子量を有するヒアルロン酸成分の混合物が企図され、これは、Ｇ’及び圧縮力値に影響を及ぼし得る。例えば、ＨＡ：コラーゲンの製剤化において、水和温度の低下は、より高いＧ’値、より低い膨潤、及び不透明度の低下（透光性の増加）をもたらし得る。これらの合成パラメータ及び結果を使用して、所望の物理的特性を有するＨＡ－コラーゲンの製剤を目指して、合成することができる。

【0115】

コラーゲン濃度もまた物理的特性に影響を及ぼし得る。所与の水和温度では、コラーゲン濃度の増加は、不透明度の増加、Ｇ’の上昇、及び膨潤の減少をもたらし得る。不透明度の増加は、充填剤のチンダル効果の減少をもたらし得る。ＨＡ－コラーゲンヒドロゲルの物理的及び光学的特性は、合成工程においてコラーゲンが可溶性である程度に依存する。温度、ｐＨ及び塩濃度などの合成パラメータは、コラーゲンの溶解度に影響を及ぼす。コラーゲンの溶解度は、温度、ｐＨ及び塩濃度の上昇によって低下し得、合成中のコラーゲンの溶解度の低下は、Ｇ’がより低く、膨潤がより高く、押出力が増加したゲルをもたらす。ＨＡはまた、田口及び共同研究者が記載するように、コラーゲンと相互作用してコラーゲンの溶解度を低下させ得る（Ｔａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００２，６１（２）、３３０－３３６、参照により本明細書に組み込まれる）。塩濃度を調節することによって、ＨＡとコラーゲンとの間の相互作用を変化させ、それによりコラーゲン溶解度を調整し、物理的特性を変化させることができる。一実施形態では、本組成物は、５０ｍＭ～４００ｍＭの濃度を有する塩を含む。一実施形態では、組成物は、約１５０ｍＭのＮａＣｌ濃度を有する。したがって、水和温度を低下させ、塩／緩衝液濃度を最適化することによって、合成中の所与のＨＡ濃度に対する最大のコラーゲン溶解度と共に、最大Ｇ’及び最小膨潤値を得ることができる。

【0116】

一実施形態では、本組成物は透明である。一実施形態では、本組成物は半透明である。一実施形態では、ＨＡ濃度、水和温度、塩濃度及び／又はコラーゲンの濃度は、本組成物の不透明度に影響を及ぼす。不透明度の増加は、チンダル効果である、注入部位で見られ得る青色の変色を減少させ得る。当業者であれば、本組成物の不透明度を測定する方法を理解するであろう。

【0117】

一実施形態では、これらの材料及び組成物に対する生物学的特性及び組織応答がキャラクタライズされている。一実施形態では、この製剤は、ＨＡのみの材料と比較して増強された細胞活性を示す。活性レベルは、コラーゲン濃度に依存するが、ＨＡ濃度及び合成手順にも依存する。一実施形態では、より低いＨＡ濃度（１３ｍｇ／ｍＬ）を有する製剤は、所与のコラーゲン濃度に対してより高いＨＡ濃度（２０～２８ｍｇ／ｍＬ）を有する製剤よりも増強されたインビトロ応答を与えることが見出された。一実施形態では、より高いコラーゲン濃度を有するヒドロゲルなど、同様のＨＡ濃度を有する組成物は、より大きなインビトロ応答を示した。さらに、一実施形態では、室温未満の温度で水和した製剤は、室温で水和した類似の製剤よりも高い細胞活性を刺激した。特定の充填剤を適応するために、特定の細胞活性レベルが求められる場合があり、製剤化及び合成のパラメータを選択することによって、好ましい活性レベルを達成することができた。

【0118】

一実施形態では、ＨＡ／コラーゲンの製剤を組織の一体化モデルにおける組織応答についても評価した。ＨＡ－コラーゲン材料の移植片から得られた組織切片は、周囲組織からの細胞浸潤、並びに、注入された充填剤ボーラス内の新しいコラーゲンの堆積及び血管形成を示した。浸潤及び組織の一体化の程度は、異なる製剤間で異なっていた。本明細書中に記載される製剤のいくつかの実施形態では、コラーゲン構造及び架橋は、驚くべきことに、浸潤及び組織の一体化の程度において重要である。一実施形態では、コラーゲン構造及び架橋は、組織の一体化及び浸潤において重要であり得る（例えば、図１４を参照されたい）。本明細書に記載される製剤のいくつかの実施形態では、組織の一体化は、ＨＡ濃度の増加と共に減少する。本明細書に記載される製剤である、組織に注入された低ＨＡ濃度（１３ｍｇ／ｍｌ）を有する製剤のいくつかの実施形態では、周囲組織が４週間までにゲルボーラスに浸潤することが分かった。これらの実施形態では、細胞核及び新たに堆積したコラーゲンがゲルの間に散在していることが分かった。このことは、製剤Ｉを使用した例７（図６Ｂ及び図６Ｃ）において見ることができる。このように、これらの製剤は、ゲルボーラスへの組織浸潤について驚くべき結果をもたらした。

【0119】

いくつかの実施形態では、より高いＨＡ濃度（２０～２５ｍｇ／ｍＬ）を有する製剤もまた強い組織の一体化を示したが、組織は、より低いＨＡ濃度を有する製剤のようにボーラス全体に浸潤しなかった。

【0120】

いくつかの実施形態では、ＨＡの分子量及び／又はゲル粒子の特性もまた周囲の組織の一体化に影響を及ぼす。

【0121】

しかしながら、別の驚くべき結果は、構造／架橋が組成物中のコラーゲン濃度よりも重要であり得ることを示した。この驚くべき発見の一例は、５℃で水和したＨＡを有する２０：６のＨＡ：コラーゲンを有するゲルが、室温で水和した２０：１０のＨＡ：コラーゲンを有するゲル（スコア＝０．５）よりも良好な組織の一体化のスコア（スコア＝２．０）を示したことである。組織の一体化のスコアリングは、盲検の組織病理医によって実施され、試験内部対照（ＨＡのみのゲル）に対して正規化された。より高いスコアは、より良好な組織の一体化を示す。

【0122】

驚くべきことに、混合ゲルの構造が異なる組成物において、結果の違いが見られた。コラーゲンが混合された組成物は、ゲルが５℃でＨＡに架橋されたコラーゲンを有する組成物とは異なる応答を有した。

【0123】

５℃で水和したＨＡを用いて合成された製剤ＸＩＸは、インビトロ及びインビボ性能の改善、並びに、本明細書の実施形態に示される最良の組織の一体化を実証した。

【0124】

コラーゲン濃度を除いて、組成物のレベル又は架橋及び構造は、等しい重要性を示した。例えば、低温で生成されたゲル製剤などの組成物は、改善されたインビトロ及びインビボ性能、例えば改善された組織の一体化をもたらした。これは、２０：６のＨＡ：コラーゲン比及び約５℃の水和温度を有する製剤ＸＩＸについて見ることができる。製剤の調製はまた、インビトロ及びインビボ性能の改善などの驚くべき結果をもたらした。いくつかの実施形態では、水和のための低温での、例えば５℃でのゲル製剤の調製は、改善されたインビトロ及びインビボ性能を有するゲル製剤をもたらした。いくつかの実施形態では、ゲル製剤は、注入した製剤の部位への組織の一体化を実証した。

【0125】

２０：６及び２０：４のＨＡ：コラーゲン比及び約５℃の水和温度を有する製剤はまた、インビトロ及びインビボ性能の改善などの驚くべき結果をもたらした。

【0126】

いくつかの実施形態では、組織へのコラーゲンの浸潤を増加させる製剤が提供される。製剤は、１３ｍｇ／ｍｌのヒアルロン酸を含む。いくつかの実施形態では、製剤を組織に注入し、その結果、製剤を含むデポーを作り出し、デポーの周囲の組織からの細胞がデポーに堆積する。一実施形態では、製剤によって注入された組織は、組織の一体化及びコラーゲンの堆積並びに血管形成を有することが示される。一実施形態では、製剤は、２０：６のＨＡ：コラーゲン比及び約５℃の水和温度を有する。一実施形態では、製剤は、２０：４のＨＡ：コラーゲン比及び約５℃の水和温度を有する。

【0127】

皮膚充填剤の主な機能は、皺を充填し、その下に注入された皮膚充填剤を覆う組織を支持することである。必要なリフト量は、具体的な顔の適応症に依存する。適応症のボリューム形成をすることを目的として、皮膚の下のより深いところに入れられる製品は、より多くの構造及びより大きな持ち上げ力を示す必要がある。表面的な留置を伴う小皺用の製剤は、それほど大きな持ち上げ力を示す必要はないが、より滑らかであって、既存の組織に一体化する必要がある。したがって、動物のリフト能力モデルでＨＡ／コラーゲン製剤を評価してリフト能力を決定した。同様の方法で架橋された製剤の場合、リフト能力はＨＡ濃度に依存し、より高いＨＡ濃度ではリフトが増加した。

【0128】

いくつかの実施形態では、リジンを加えた架橋ＨＡ：コラーゲン製剤は、ＨＡ濃度が１３ｍｇ／ｍＬから、２０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬと増加するにつれて持ち上げ力の増加を示した。いくつかの実施形態では、ＨＡの分子量は持ち上げ力にも影響する。いくつかの実施形態では、２５ｍｇ／ｍＬの高分子量ＨＡを含有する製剤は、２５ｍｇ／ｍＬの低分子量ＨＡと高分子量ＨＡの混合物で構成される製剤よりも大きな持ち上げ力を示した。このように、最適な合成パラメータ、ＨＡ濃度、及びＨＡの分子量比を選択することによって、所望の持ち上げ力を達成することができる。上記又は下記の実施形態のそれぞれ又はいずれかのいくつかの実施形態では、本製剤は、異なる分子量を有するヒアルロン酸成分の混合物を含み、その混合物は、約２０，０００ダルトン、約４０，０００ダルトン、約６０，０００ダルトン、約８０，０００ダルトン、約１００，０００ダルトン、約２００，０００ダルトン、約３００，０００ダルトン、約４００，０００ダルトン、約５００，０００ダルトン、約６００，０００ダルトン、約７００，０００ダルトン、約８００，０００ダルトン、約９００，０００ダルトン、約１，０００，０００ダルトン、約１，５００，０００ダルトン、約２，０００，０００ダルトン、約２，５００，０００ダルトン、約３，０００，０００ダルトン、約３，５００，０００ダルトン、約４，０００，０００ダルトン、約４，５００，０００ダルトン、約５，０００，０００ダルトン、約５，５００，０００ダルトン、約６，０００，０００ダルトン、約６，５００，０００ダルトン、約７，５００，０００ダルトン、約８，０００，０００ダルトン、約８，５００，０００ダルトン、約９，０００，０００ダルトン、約９，５００，０００ダルトン及び／又は約１０，０００，０００ダルトンの平均分子量を有するヒアルロン酸、及び／又は前述の任意の２つの値の間の範囲内の分子量を有する任意のヒアルロン酸を含む。

【0129】

リジン架橋ＨＡ－コラーゲンヒドロゲルの合成方法
本開示は、コラーゲン溶液を提供すること、及び、コラーゲン溶液を、リジン・ＨＣｌ、高分子量ＨＡ、ＭＥＳ緩衝液、ＮａＣｌ及びＮａＯＨを含む第２の溶液に加えること、を含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは、約２４：１２、約２８：２、約２０：４、約２５：４、約２２：６、約２２：４、約２４：６、約２０：６、又は約１３：４のヒアルロン酸とコラーゲンの重量比を有する。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは、約６ｍｇ／ｍｌのコラーゲン濃度を有する。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは、均質化のために撹拌される。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは、室温未満で水和する。一実施形態では、ＨＡは、２℃～３５℃の温度で水和する。一実施形態では、ＨＡは、２℃、３℃、５℃、７℃、９℃、１１℃、１３℃、１５℃、１７℃、１９℃、２１℃、２３℃、２５℃、２７℃、２９℃、３１℃、３３℃、３５℃で、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の温度で水和する。一実施形態では、ＨＡは、２℃～１９℃の温度で水和する。一実施形態では、ＨＡは、２℃、３℃、５℃、７℃、９℃、１１℃、１３℃、１５℃、１７℃若しくは１９℃の温度、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の温度で水和する。一実施形態では、ＨＡは、室温で少なくとも６０分間水和する。一実施形態では、ＨＡは、室温より高い温度で水和する。一実施形態では、ＨＡは、少なくとも３５℃の温度で水和する。いくつかの実施形態では、別の水和工程を少なくとも６０分間行う。いくつかの実施形態では、水和は、約ｐＨ５．５のＭＥＳ緩衝液中で行われる。混合物は、１つのシリンジに入れてもよく、２つのシリンジ間でシリンジ間で少なくとも５０回通してもよい。ＥＤＣ／ＮＨＳの溶液を混合物に加えてもよい。混合は、溶液を２つのシリンジ間で渡すことによって行うことができる。ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液を加えた後、混合物を２～８℃の温度で少なくとも１６時間反応させる。いくつかの実施形態では、溶液のｐＨは、ＮａＯＨを使用して７．４に調整され、透析を用いて精製される。形成されたヒドロゲルの特性は、レオメーターを使用して得ることができる。当業者は、例えば、圧縮力、膨潤特性、及び押出力などのいくつかのパラメータについて組成物を測定することができる。

【0130】

一実施形態では、高分子マトリックスは、注入を容易にし、押出力を減少させるために使用され得る非架橋ＨＡをさらに含む。

【0131】

一実施形態では、リジン：ＨＡの比は、架橋効率を最大化するように最適化される。一実施形態では、リジン：ＨＡの比は約０．０～０．５であり、より効率的な架橋を可能にし得る。リジンを用いない架橋は、架橋のためのアミンを供給するためにコラーゲンに依存し得、ＨＡ鎖間のエステル架橋をより水に不安にし得る。高いリジン：ＨＡの比での架橋は、ＨＡ鎖上の活性化されたカルボン酸を飽和させることができ、鎖間を架橋するのではなくＨＡ鎖の片側のみに結合したペンダントリジン分子をもたらし得る。所与の適応症に対して最適なリジン：ＨＡの比を選択することによって、得られるヒドロゲルの物理的特性を調整することができ、所望の特性を達成することができる。いくつかの実施形態では、最適なリジン：ＨＡの比は組成依存性であり得る。

【0132】

組成物の滅菌
開発された生体材料は、ヒト患者への注入又は移植による組成物の投与前に、滅菌、又は病原体、細菌の微生物などの望ましくない生物学的材料の破壊を必要とする場合がある。これらの組成物は、本明細書に記載の実施形態を含み、例えば、架橋高分子マトリックスなどの材料を含む。これらの材料中のタンパク質、多糖類及び炭水化物は、オートクレーブなどの従来の加熱滅菌手順にさらされた場合、又はガンマ線などの電離放射線にさらされた場合に、分子破壊を受けやすい可能性がある。従来、これらのエネルギーに敏感な生体材料の多くは、本組成物から微生物を物理的に除去することを目的した精密濾過プロセスによってバルクで滅菌される。次いで、濾過された組成物は、医師による使用のためにシリンジ及び／又はバイアルにパッケージ化しなければならない。

【0133】

一実施形態では、架橋高分子マトリックスは無菌である。一実施形態では、架橋高分子マトリックスを作製する方法は、架橋高分子マトリックスを滅菌する工程をさらに含む。

【0134】

一実施形態では、本方法は、本組成物又は架橋高分子マトリックスを、病原体、微生物及び他の微生物を不活性化するのに有効な線量の広帯域スペクトル放射線に曝す工程をさらに含む。

【0135】

一実施形態では、本方法は、組成物又は架橋高分子マトリックスを、広帯域スペクトル放射を含むパルス放射線（本明細書において以下、パルス光という場合がある）に曝す工程をさらに含む。広帯域スペクトル放射線は、約１００ｎｍから約１１００ｎｍ波長の帯域範囲を有し得る。広帯域スペクトル放射線は、紫外範囲、可視光範囲、及び赤外範囲の波長を含む。いくつかの実施形態では、約５４％のＵＶ波長、２６％の可視波長及び約２０％の赤外波長の波長分布を有する。この形態の放射線は、キセノンランプによって供給することができる。

【0136】

一実施形態では、パルス光は、本組成物全体にわたって、本組成物の著しい劣化を引き起こすことなく、また本組成物のレオロジーの著しい変化を引き起こすことなく、本組成物中の微生物及び微生物を不活性化する。

【0137】

一実施形態では、パルス光は、２５４ｎｍのＵＶフルエンスによって定義される、約１００ｍＪ／ｓｑｃｍ～約２０００ｍＪ／ｓｑｃｍのエネルギーを有する。一実施形態では、パルス光は、２５４ｎｍのＵＶフルエンスによって定義される、約３００ｍＪ／ｓｑｃｍ～約１８００ｍＪ／ｓｑｃｍのエネルギーを有する。

【0138】

一実施形態では、パルス光は、２５４ｎｍのＵＶフルエンスによって定義される、約７００ｍＪ／ｓｑｃｍ～約８００ｍＪ／ｓｑｃｍのエネルギーを有する。一実施形態では、パルス光は、２５４ｎｍのＵＶフルエンスによって定義される、約１４００ｍＪ／ｓｑｃｍ～約１６００ｍＪ／ｓｑｃｍのエネルギーを有する。

【0139】

一実施形態では、パルス光は、約１パルス／秒～約１０パルス／秒、例えば、約３パルス／秒のパルス周波数を有する。

【0140】

一実施形態では、本組成物は、２４０秒以下の期間にわたってパルス光に曝される。一実施形態では、本組成物は、１２０秒以下の期間にわたってパルス光に曝される。一実施形態では、本組成物は、４０秒以下の期間にわたってパルス光に曝される。一実施形態では、本組成物は、３０秒以下の期間にわたってパルス光に曝される。一実施形態では、本組成物は、２０秒以下の期間にわたってパルス光に曝される。一実施形態では、本組成物は、１０秒間にわたってパルス光に曝される。

【0141】

一実施形態では、本組成物は、５秒間にわたってパルス光に曝される。一実施形態では、本組成物は、１秒以下の期間にわたってパルス光に曝される。

【0142】

一実施形態では、パルス光は、本組成物の温度を９０℃より高くすることなく本組成物を滅菌するのに有効である。一実施形態では、パルス光は、本組成物の温度を２０℃より高くすることなく本組成物を滅菌するのに有効である。一実施形態では、その線量は、本組成物の温度を１５℃より高く、例えば１０℃より高く、例えば５℃より高くすることなく本組成物を滅菌するのに有効である。

【0143】

一実施形態では、パルス光は、約１０％未満、又は約８％未満、又は約５％未満のレオロジー損失（Ｇ’／Ｇ’’）で本組成物を滅菌するのに有効である。

【0144】

一実施形態では、パルス光は、著しい劣化を引き起こすことなく、例えば、本組成物のレオロジー特性に著しい変化を引き起こすことなく、本組成物を滅菌する、すなわち、本組成物中の病原体、微生物及び他の微生物を不活性化するのに有効である。

【0145】

一実施形態では、放射線の有効滅菌線量は、ヒドロゲルのレオロジーを保持する。一実施形態では、本方法は、約１０％未満、又は約８％未満、又は約５％未満のレオロジー損失（Ｇ’／Ｇ’’）でヒドロゲルを滅菌するのに有効である。

【0146】

例
実施された実験及び達成された結果を含む以下の例は、例示のみを目的として提供されており、本開示を限定するものと解釈されるべきではない。

【0147】

例１－リジン架橋ＨＡ－コラーゲンヒドロゲルの合成
０．０１ＭのＨＣｌに４．９６ｍｇ／ｍＬのコラーゲンを溶解した溶液を、リジン・ＨＣｌ、ＨＭＷ ＨＡ、ＭＥＳ緩衝液／ＮａＣｌ固体及び１ＭのＮａＯＨと共に３０ｍＬのＨＳＷ Ｎｏｒｍ－Ｊｅｃｔシリンジに加えた。それに応じて濃度を調整して、例えば、ＨＡ：コラーゲンの比が、１３：４ ｍｇ／ｍｌ（製剤Ｉ）、２０：４ ｍｇ／ｍｌ（製剤ＩＩ）及び２５：４（製剤ＩＩＩ）のヒドロゲルを作製した。この混合物を撹拌して溶液を均質化し、ＨＡを室温で約６０分間水和させた。約６０分から約９０分後、この混合物をシリンジ間で通して、再び約３０分から約６０分間にわたって水和させた。２回目の水和後、この混合物をシリンジ間で数回通した。水、ＮＨＳ及びＥＤＣを加えることによって、ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液を第３の３０ｍＬシリンジで調製し、振盪して混合した。ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液をＨＡ／コラーゲン混合物に加え、２つのシリンジ間で通した後、ガラスバイアルに移し、これを２～８℃で反応させた。いくつかの実施形態では、反応時間は、約１６時間、約１８時間、約２０時間、約２２時間、約２４時間、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の時間である。この後、ゲルをシリンジに移し、再び２つのシリンジの間で通した。２ＭのＮａＯＨを使用してゲルのｐＨを約７．４０に調整し、ＰＢＳを使用して最終体積を調整した。ゲル製剤をＰＢＳに対して２～８℃で約７０時間透析し、その間に数回緩衝液を交換してＥＤＣ／ＮＨＳを除去した。次いで、ゲルを透析膜からシリンジに移し、ステンレス鋼メッシュ（６０μｍの細孔－１０４μｍの細孔）に通し、２つのシリンジ間で通した。このゲルを１ｍＬシリンジに移し、シリンジを蒸気滅菌した。得られた滅菌ヒドロゲルを、レオロジー、圧縮力測定値、押出力測定値、及び膨潤を用いてキャラクタライズした。

【0148】

製剤ＸＸＶＩについては、架橋中にＮａＣｌを省略した。

【0149】

製剤ＸＸＶ及び製剤ＸＸＶＩの場合、非架橋ＨＭＷ ＨＡ（全組成物に対して２％（ｗ／ｗ））及びリドカインＨＣｌ（全組成物に対して０．３％（ｗ／ｗ））をシリンジ充填及び滅菌の前に加える。

【0150】

例２－６ｍｇ／ｍＬの最終コラーゲン濃度を有するリジン架橋ＨＡ－コラーゲンヒドロゲルの合成
０．０１ＭのＨＣｌに７．１６ｍｇ／ｍＬのコラーゲンを溶解した溶液を、リジン・ＨＣｌ、ＨＭＷ及び／又はＬＭＷ ＨＡ及びＭＥＳ緩衝液／ＮａＣｌ固体と共に３０ｍＬのＨＳＷ Ｎｏｒｍ－Ｊｅｃｔシリンジに加えた。ｐＨを１ＭのＮａＯＨで調整した。この混合物を撹拌して均質化し、ＨＡを指定温度で約６０分間水和させた。約６０～９０分後、この混合物を２つのシリンジ間で数回通して、再び少なくとも３０分間水和させた。２回目の水和工程の後、この混合物を再び２つのシリンジ間で数回通した。水、ＮＨＳ及びＥＤＣを加えることによって、ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液を第３の３０ｍＬシリンジで調製し、振盪して混合した。水和は、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃の温度、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の温度で行うことができる。ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液をＨＡ／コラーゲン混合物に加え、２つのシリンジ間で数回通した後、Ｔｈｉｎｋｙ Ｍｉｘｅｒ反応容器に移し、これを２～８℃で少なくとも１６時間反応させた。この後、ゲルを、Ｔｈｉｎｋｙ Ｍｉｘｅｒを使用して均質化した。２ＭのＮａＯＨを使用してゲルのｐＨを約７．４０に調整し、ＰＢＳを使用して最終体積を調整した。ゲル製剤をＰＢＳに対して２～８℃で約７０時間透析し、その間に数回緩衝液を交換した。次いで、ゲルを透析膜からシリンジに移し、ステンレス鋼メッシュ（１０４μｍの細孔）に通し、Ｔｈｉｎｋｙ Ｍｉｘｅｒを使用して均質化した。このゲルを１ｍＬシリンジに移し、シリンジを蒸気滅菌した。得られた滅菌ヒドロゲルを、上記の例に記載したようにキャラクタライズした。

【0151】

いくつかの実施形態では、ゲルは２０ｍｇ／ｍｌのヒアルロン酸を含む。いくつかの実施形態では、ゲルは６ｍｇ／ｍｌのコラーゲンを含む。ゲルを作製する方法のいくつかの実施形態では、ヒアルロン酸は、５℃の温度で水和する。

【0152】

例３－２８：２ ｍｇ／ｍＬのＨＡ：コラーゲンの濃度を有するリジン架橋ＨＡ－コラーゲンヒドロゲルの合成（製剤ＸＶＩ）。
０．０１ＭのＨＣｌに３．２０ｍｇ／ｍＬのコラーゲンを溶解した溶液を、０．０１ＭのＨＣｌ、リジン・ＨＣｌ、ＨＭＷ ＨＡ、ＬＭＷ ＨＡ及びＭＥＳ緩衝液／ＮａＣｌ固体と共に３０ｍＬ ＨＳＷ Ｎｏｒｍ－Ｊｅｃｔシリンジに加えた。ＮａＯＨを用いてｐＨを調整した。この混合物を撹拌して均質化し、ＨＡを室温で約９０分間水和させた。９０分後、この混合物をシリンジ間で数回通して、再び約３０分間水和させた。２回目の水和工程の後、この混合物をシリンジ間で数回通した。水、ＮＨＳ及びＥＤＣを加えることによって、ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液を第３の３０ｍＬシリンジで調製し、振盪して混合した。ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液をＨＡ／コラーゲン混合物に加え、シリンジ間を数回通した後、ガラスバイアルに移し、これを２～８℃で少なくとも１６時間反応させた。この後、ゲルをシリンジに移し、シリンジ間で通した。２ＭのＮａＯＨを使用してゲルのｐＨを約７．４０に調整し、ＰＢＳを使用して最終体積を調整した。ゲル製剤をＰＢＳに対して２～８℃で約７０時間透析し、その間に数回緩衝液を交換した。次いで、ゲルを透析膜からシリンジに移し、ステンレス鋼メッシュ（１０４μｍの孔）に通し、シリンジ間で通して均質化した。このゲルを１ｍＬシリンジに移し、シリンジを蒸気滅菌した。得られた滅菌ヒドロゲルを、上記の例に記載したようにキャラクタライズした。

【0153】

例４－最終濃度の１．２５倍で調製した、２５：４ｍｇ／ｍＬのＨＡ：コラーゲンの濃度を有するリジン架橋ＨＡ－コラーゲンヒドロゲルの合成（－製剤ＸＶ）
０．０１ＭのＨＣｌに５．６７ｍｇ／ｍＬのコラーゲンを溶解した溶液を、リジン・ＨＣｌ、ＨＭＷ ＨＡ、ＬＭＷ ＨＡ及びＭＥＳ緩衝液／ＮａＣｌ固体と共に３０ｍＬ ＨＳＷ Ｎｏｒｍ－Ｊｅｃｔシリンジに加えた。ｐＨを１ＭのＮａＯＨで調整した。この混合物を撹拌して均質化し、ＨＡを室温で約９０分間水和させた。次いで、この混合物をシリンジ間で数回通して、再び３０分間水和させた。２回目の水和工程の後、この混合物を再びシリンジ間で通した。水、ＮＨＳ及びＥＤＣを加えることによって、ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液を第３の３０ｍＬシリンジで調製し、振盪して混合した。ＥＤＣ／ＮＨＳ溶液をＨＡ／コラーゲン混合物に加え、シリンジ間で数回通した後、ガラスバイアルに移し、これを２～８℃で少なくとも１６時間反応させた。この後、ゲルをシリンジに移し、シリンジ間で通した。２ＭのＮａＯＨを使用してゲルのｐＨを約７．４０に調整し、ＰＢＳを使用して最終体積を調整した。ゲル製剤をＰＢＳに対して２～８℃で約７０時間透析し、その間に数回緩衝液を交換した。次いで、ゲルを透析膜からシリンジに移し、ステンレス鋼メッシュ（１０４μｍの孔）に通し、シリンジ間で通して均質化した。このゲルを１ｍＬシリンジに移し、シリンジを蒸気滅菌した。得られた滅菌ヒドロゲルを、上記の例に記載したようにキャラクタライズした。

【0154】

例５－ヒドロゲルの物理的特性
２５ｍｍの平行平板形状測定ツールを備えたＡｎｔｏｎ－Ｐａａｒ ＭＣＲ３０１／３０２レオメーターを使用してレオロジー特性を得た。周波数掃引（１０Ｈｚ～０．１Ｈｚ、歪み１％）及び振幅掃引（０．３％～３００％歪み、５Ｈｚ周波数）の測定値を両方用いて、１ｍｍのギャップ高さで試料を分析した。圧縮力は、ギャップ高さ２．５ｍｍ及び垂直圧縮の同じ機器を使用して測定した。ギャップ高さは２．５ｍｍに確立され、５分間そこに留まり、次いで１３．３３μｍ／ｓの速度で２．５ｍｍから０．８９ｍｍに圧縮された。ヒドロゲル膨潤は、ゲル試料を過剰のリン酸緩衝液と混合し、平衡後のゲルの体積を求めることによって測定した。膨潤ゲルの体積を、緩衝液を加える前に加えた元のゲルの体積と比較した。膨潤は、追加の流体の取り込みとして、元のゲル体積のパーセンテージの形で表される。ゲルの押出力は、５０ｍｍ／分の速度に設定したテクスチャーアナライザーを使用して、１／２インチの２７Ｇ ＴＳＫ針（特に明記しない限り）を取り付けた１ｍＬのＣＯＣシリンジ中のゲル製剤について測定した。

【表1】

【0155】

表１：ヒドロゲル製剤の合成パラメータ及び物理的特性１当量は、０．９％のＮａＣｌを含む０．１ＭのＭＥＳ緩衝液濃度に相当する。

【0156】

表１に示すように、一定のコラーゲン濃度でＨＡ濃度が１３ｍｇ／ｍＬから、２０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬと増加するにつれて（製剤Ｉ対製剤ＩＩ対製剤ＩＩＩ）、圧縮力（４７ｇｍｆ→１８０ｇｍｆ→３１０ｇｍｆ）及び押出力（１３．８Ｎ（３０Ｇ）→２８．０Ｎ→５１．７Ｎ）と共に、Ｇ’値が増加する（３８０Ｐａ→６４５Ｐａ→１３７０Ｐａ）一方で、Ｇ’’／Ｇ’比はＨＡ濃度の増加と共に減少する（０．１２３→０．１０３→０．０５６）。

【0157】

同じＨＡ及びコラーゲンの濃度（製剤ＶＩ対製剤ＶＩＩ対製剤ＶＩＩＩ）でＨＭＷ／ＬＭＷ ＨＡ比が１００／０から、６５／３５、３５／６５と減少するにつれて、圧縮力（２９２→２２６→１６３ｇｍｆ）及び押出力（６３．６→２９．２→２０．０Ｎ）と共に、Ｇ’値が減少する（１３６０Ｐａ→１１８０Ｐａ→９３２Ｐａ）一方で、ＨＭＷ／ＬＭＷ比が減少するにつれて、Ｇ’’／Ｇ’比は増加する（０．０５５→０．０６８→０．０８５）。

【0158】

一定のＨＡ及びコラーゲン濃度（製剤ＸＩ対製剤ＶＩ対製剤ＩＸ対製剤Ｘ）で合成水和温度を３５から２２から１５から５℃に低下させると、Ｇ’値は増加する（８７６→１３６０→３１４５→４７５０Ｐａ）が、ヒドロゲル膨潤は押出力（５６．１～６３．６→３３．８→２０．１Ｎ）と共に減少する（２５７％→２３８％→１５９％→１２７％）。圧縮力は、より高い水和温度（３５℃対その他）を除いて、水和温度の変化の影響を受けない。合成中の水和温度を調節すると、コラーゲンの溶解度が変化し、その結果、得られるヒドロゲルの物理的特性が変化する。

【0159】

塩／緩衝液濃度を２／３に低下させることにより、低い塩／緩衝液濃度で２２℃で水和した製剤と、元の塩／緩衝液濃度で５℃で水和した製剤（製剤ＸＩＩＩ対製剤Ｘ）とについて、同様のＧ’値（５４７０Ｐａ対４７５０Ｐａ）、膨潤（１０８％対１２７％）、及び押出力（２０．５Ｎ対２０．１Ｎ）が、得られる。さらに、低い塩／緩衝液濃度を使用する合成は、元の塩／緩衝液濃度を使用する合成ほど２２℃対５℃の水和温度に敏感ではない。水和温度が２２℃及び５℃の低い塩／緩衝液濃度を使用して合成された製剤（製剤ＸＩＩＩ対製剤ＸＩＩ）では、Ｇ’、膨潤力及び押出力の値は大きく異ならない一方で、元の塩／緩衝液濃度を使用して合成された同様の製剤では、これらの物理的特性は大きく異なる（製剤ＶＩ対製剤Ｘ）。

【0160】

２８：２ｍｇ／ｍＬのＨＡ：コラーゲン濃度で合成した類似の製剤を比較することによって、加えられたリジンの効果が見て取れる（製剤ＸＶＩＩＩ対製剤ＸＶＩ対製剤ＸＶＩＩ）。最適なリジン：ＨＡの比は、架橋効率を最大化するのに役立ち、その正確な比は、ＨＡの分子量、活性化試薬の濃度、及び合成条件に依存する。例えば、リジン：ＨＡの比は、２８：２ ｍｇ／ｍＬのＨＡ：コラーゲン濃度で合成した一連の製剤（製剤ＸＶＩＩＩ対製剤ＸＶＩ対製剤ＸＶＩＩ）について増加した（０→０．３３３→０．５）。Ｇ’及び圧縮力などの物理的特性は、０．３３３のリジン：ＨＡの比で調製された製剤で最大化されたが、その同じ製剤で膨潤及びＧ’’／Ｇ’値は最小化された。より高いＧ’及びより低い膨潤は、一般に、より高度に架橋されたヒドロゲルに関連している。０～０．５のリジン：ＨＡの比は、より効率的な架橋を可能にする。リジンを用いない架橋は、架橋のためのアミンを供給するためにコラーゲンに依存し得、ＨＡ鎖間のエステル架橋をより水に不安にし得る。高いリジン：ＨＡの比での架橋は、ＨＡ鎖上の活性化されたカルボン酸を飽和させることができ、鎖間を架橋するのではなくＨＡ鎖の片側のみに結合したペンダントリジン分子をもたらし得る。非常に低い又は高いリジン：ＨＡの比を有するこれらのシナリオは、非効率的な架橋及び最適以下のゲル特性をもたらし得る。所与の適応症に対して最適なリジン：ＨＡの比を選択することによって、得られるヒドロゲルの物理的特性を調整され、所望の特性を達成することができる。

【0161】

例６－ヒドロゲルのインビトロ試験
インビトロでの細胞増殖及び生存率
ＨＡ－コラーゲンヒドロゲルと密接に接触している線維芽細胞の生存率及び増殖を、ＸＴＴアッセイを使用して定量化した。１００μＬのヒドロゲル（ｎ＝３）を、低付着性表面コーティングを有する２４ウェル細胞培養プレートの底部に積層し、３７℃の加湿インキュベータ内に３０分間置いた。５００μＬの細胞培養培地中の５０，０００個の成体ヒト皮膚線維芽細胞をヒドロゲル床の上に加え、３７℃でインキュベートした。４８時間インキュベートした後、各ウェルにＸＴＴ試薬２５０μＬを加え、３７℃で４時間インキュベートした。次いで、プレートを３００ｘｇで５分間回転させ、各ウェルから得られた２００μＬの上清を２０μｍメッシュの９６ウェルフィルタープレートのウェルに移した。ＸＴＴの上清を含むフィルタープレートを３００ｘｇで５分間回転させた。各ウェルから得られた１００μＬの濾過上清を清浄な９６ウェルプレート（黒壁、透明底）に移し、上清の吸光度をマイクロプレートリーダーで読み取った（６３０ｎｍバックグラウンド補正で４５０ｎｍ）。陽性対照の組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）上で培養した線維芽細胞のＸＴＴ細胞生存率に対してデータを正規化した。

【0162】

細胞生存率及び増殖は、同じコラーゲン濃度及びより高いＨＡ濃度を有する同様に架橋された製剤よりも、より低いＨＡ濃度を有する製剤の方が高いことが見出された。例えば、ＨＭＷ ＨＡ及び４ｍｇ／ｍＬのコラーゲンを用い、ただし、ＨＡ濃度を、１３ｍｇ／ｍＬ（製剤Ｉ）、２０ｍｇ／ｍＬ（製剤ＩＩ）、及び２５ｍｇ／ｍＬ（製剤ＩＩＩ）と増加させて合成したヒドロゲルは、ＴＣＰＳ陽性対照と比較して５３％、３０％、及び２０％の増殖値を示した。（図１）ＨＡのみの陰性対照ゲルは、ＴＣＰＳ対照と比較して１２％の増殖値を示した。

【0163】

さらに、同じＨＡ濃度及びコラーゲン濃度を有する同様に架橋された製剤の細胞生存率及び増殖に対して、合成手順中の水和温度の影響が認められる。２４：６ ｍｇ／ｍＬのＨＡ：コラーゲンの濃度を有するヒドロゲルの場合、５℃で水和したそれらの製剤（製剤Ｘ）は、２２℃（製剤ＶＩ）又は３５℃（製剤ＸＩ）で水和したそれらの製剤よりも高い細胞増殖を示し、それぞれ３９％、２７％、及び１９％の値であった。（図１）

【0164】

細胞の生存率及び増殖はまた、ヒドロゲル合成中の塩及び緩衝液の濃度によっても影響を受ける。５℃で行われた合成では、塩／緩衝液濃度を低下させた場合に、細胞応答の変化は明らかではなかった（製剤Ｘ（１当量）対製剤ＸＩＩ（０．３３当量））。しかし、２２℃又は３５℃で水和した製剤では、塩／緩衝液の濃度を低下させて調製した製剤（製剤ＸＩＩＩ、２２℃、及び製剤ＸＩＶ、３５℃）では、１当量の塩／緩衝液で調製した製剤（製剤ＶＩ、２２℃、及び製剤ＸＩ、３５℃）よりも細胞生存率及び増殖の有意な増加が観察された。（図１）

【0165】

製剤ＸＩＸを、５℃で２０ｍｇ／ｍＬのＨＡ及び６ｍｇ／ｍＬのコラーゲンを用いて調製する。この製剤は、２０ｍｇ／ｍＬ以上のＨＡ濃度を有する他のゲルと比較して、より高い細胞生存率及び増殖を示した。（図１）

【0166】

２０：４のＨＡ：コラーゲン比を有する製剤はまた、インビトロでの細胞応答を増強することが示された（図１５、製剤ＸＸＩＩ）。

【0167】

さらに、製剤ＸＩＸは、オートクレーブ処理後に一貫した安定性及び性能を有することが示された。

【0168】

インビトロ細胞の形態
細胞の形態を分析して、細胞サイズ、形状及び細胞骨格組織化に対するヒドロゲル製剤の効果を評価した。ＨＡのみ又はＨＡ／コラーゲン架橋ヒドロゲル上で培養した線維芽細胞のアクチンフィラメントアライメント指数及び形態を画像化し、定量化した。アクチンフィラメントアライメントの増加は、細胞の基質への付着性の増加と相関し得る。長さ対幅の比の増加は、基質上の細胞の拡延性の増加と相関する。凸包と細胞面積の比は、細胞の形状の測定値であり、１．０は均一な形状の細胞を示し、１を超える値はより不規則な形状の細胞を示す。マトリックスと複数回接触し、伸長／移動している細胞は、より不規則な細胞形状及びより高い凸包対細胞面積比の値を示す。アクチンフィラメントアライメント指数、長さ対幅比、及び凸包対細胞面積比は、３次元ユークリッド空間で一緒に分析することができる。陰性対照から得られたヒドロゲル（この場合は非付着性ＨＡのみのゲル）のユークリッド距離は、充填剤に対する細胞応答全体のランク付けを可能にする。ＨＡのみの対照から得られたより大きなユークリッド距離は、ヒドロゲル上での細胞の付着性及び拡延性の増強を示す。より大きな細胞の付着性及び拡延性を支援するヒドロゲルは、より多くのゲルへの細胞浸潤を誘導すると予想され、それらの細胞はゲルマトリックス内にＥＣＭを堆積させる。細胞浸潤及びＥＣＭ堆積の増加は、ヒドロゲルデポーへのインビボ組織の一体化において有益であり得る。逆に、より低い細胞の付着性及び拡延性の値をもたらす製剤は、より不活性に挙動し、組織浸潤及び一体化がより少なくなる。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルを作製する方法は、オートクレーブ処理工程をさらに含み、このオートクレーブはヒドロゲルの特性を変化させない。（図１３を参照のこと）。

【0169】

典型的な手順では、細胞培養培地中のヒドロゲル（ｎ＝３）及びヒト皮膚線維芽細胞を、低付着性の表面コーティングを有する９６ウェル細胞培養プレートに加えた。４８時間のインキュベーション後、細胞をホルマリンで固定し、Ｈｏｅｃｈｓｔ、ＷＧＡ－４８８及びＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－Ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎで染色した。ウェルを共焦点顕微鏡で画像化し、アクチンフィラメントアラインメント（ファロイジン）及び細胞形態（ＷＧＡ－４８８）を画像解析ソフトウェアを用いて解析した。

【0170】

同じＨＡ濃度及びコラーゲン濃度を有する同様に架橋された製剤の細胞の付着性及び拡延性に対して、合成手順中の水和温度の影響が認められる。２４：６のＨＡ：コラーゲン濃度を有するヒドロゲルの場合、５℃で水和した製剤（製剤Ｘ）は、２２℃で水和した製剤（製剤ＶＩ）よりも高い細胞付着性（アクチンフィラメントアライメント指数）を示し、それぞれ０．０５４及び０．０１５の値であった（図２）。５℃で水和した製剤（製剤Ｘ）は、２２℃で水和した製剤（製剤ＶＩ）よりも細胞の拡延性（細胞長対幅比）の増加を示し、それぞれ２．５２及び１．４０の値であった。５℃で水和した製剤（３２５＿Ｂ）はまた、２２℃で水和した製剤（製剤ＶＩ）よりも高い凸包対細胞面積比を示し、それぞれ１．３４及び１．０７の値であった。２２℃で水和した製剤（製剤ＶＩ）のアクチンフィラメントアライメント指数、細胞長対幅比、及び凸包対細胞面積比は、ＨＡのみの対照と同様であった。最適化された製剤（２０：６ ＨＡ：コラーゲン、５℃水和、製剤ＸＩＸ）は、ＨＡのみのゲルよりも有意に高いアクチンフィラメントアライメント指数、長さ対幅比及び凸包対細胞面積比を示す。ＨＡのみのゲルから得られたユークリッド距離を使用してヒドロゲルをランク付けすると、最適化された製剤が他のＨＡ－コラーゲンヒドロゲルよりも高い性能を示すことが明らかになる。

【0171】

活性アッセイにおいて製剤ＶＩよりも高い活性を示した製剤Ｘが、形態アッセイにおいても細胞の付着性及び拡延性を増大させる証拠を示したという点で、細胞形態分析はＸＴＴ細胞活性アッセイとよく相関する。製剤ＸＩＸはまた、他のＨＡ－コラーゲン製剤及びＨＡのみのゲルよりも高い活性を示す。細胞の拡延性及び付着性はより高い細胞活性に関連しており、それゆえに、各アッセイの結果は互いに良好に一致している（図２Ａ～図２Ｄ）。

【0172】

製剤ＸＸＩＩ及び製剤ＸＸＩＩＩを用いて培養した線維芽細胞は、ＨＡのみのゲルを用いて培養した線維芽細胞よりも有意に大きい細胞の長さ対幅の比を示す。（図１６）

【0173】

例７－ヒドロゲルのインビボ試験
リフト能力
組織の隆起を支持するヒドロゲルの能力（持ち上げ力）を、ラットの皮下移植モデルを用いてインビボで評価した。１２５μＬのヒドロゲル（ｎ＝１０）を頭蓋骨の上に皮下ボーラスとして注入した。臨床３Ｄイメージングシステム（Ｃａｎｆｉｅｌｄ Ｖｅｃｔｒａ）を使用して、１２週間にわたってボーラスの３Ｄ再構成を生成した。ボーラスの平均高さは、医療撮像ソフトウェア（Ｃａｎｆｉｅｌｄ Ｍｉｒｒｏｒ）を使用して分析した。

【0174】

４週間～１２週間の間に測定された、同じコラーゲン濃度（４ｍｇ／ｍＬ）及びＨＭＷ／ＬＭＷ ＨＡ比（１００／０）を有する一連のＨＡ－コラーゲン製剤のインビボでのリフト能力は、ＨＡ濃度と正の相関を示す。２５ｍｇ／ｍＬのＨＡを含む製剤（製剤ＩＩＩ）は、２０ｍｇ／ｍＬ（製剤ＩＩ）又は１３ｍｇ／ｍＬ（製剤Ｉ）の製剤よりも多くの隆起を示した（図３）。圧縮力はこれらの製剤のＨＡ濃度と共に増加するので、４～１２週間のインビボでの隆起は圧縮力と正の相関を示す。インビボでの持ち上げ力はまた、ゲルの合成条件に依存する。２つの製剤（製剤ＩＩＩ対製剤ＸＶ）は、２５：４ ｍｇ／ｍＬの同じＨＡ：コラーゲン濃度を含有するが、異なるＨＭＷ／ＬＭＷ ＨＡ比及び異なる架橋条件下で合成され、４～１２週間で異なるリフトプロファイルを生じた。１倍の合成濃度で高ＭＷ ＨＡを用いて合成した製剤は、１．２５倍の合成濃度で１０／９０のＨＭＷ／ＬＭＷ ＨＡを用いて調製した製剤よりも優れた持ち上げ力を示した（図４）。さらに、異なるＨＡ／コラーゲン濃度及び合成条件を有するが、同様の圧縮力値（１６６～１８０）を有するヒドロゲル製剤（製剤ＩＩ、製剤ＸＶ、製剤ＸＶＩ）は、４週間～１２週間の間に同様のインビボでのリフトプロファイルを示した（図５）。このように、最適な組成及び合成条件を選択することによって、所与の用途のための所望のリフトプロファイルを得ることができる。

【0175】

また、製剤ＸＩＸ及びＨＡのみの製剤を用いてリフト能力を試験した（図１１及び図１２）。示されるように、製剤ＸＩＸは、２４ｍｇ／ｍｌのＨＭＷ ＨＡのみのゲルと同様のリフト能力を４週間～２８週間示した。

【0176】

製剤ＸＸＩＩの長期（５２週間）のリフト能力データを試験した。ＨＡのみの対照のリフト能力は経時的に着実に減少した。対照的に、ＨＡ－コラーゲンゲル（製剤ＸＸＩＩ）のリフト能力は、３０から５２週間安定したままである。（図２２）この驚くべき結果は、これらのＨＡ－コラーゲンゲル製剤がＨＡのみのゲルよりも長いリフト持続時間が可能であることを示している。このことは、ＨＡのみのゲルよりも良好な組織内殖と相関する（下記を参照のこと）。

【0177】

製剤ＸＸＩＩの長期（２６週間）のリフト能力データを試験した。製剤ＸＸＩＩＩ及びＨＡのみの比較物は、２６週間にわたって同様のリフト能力を示す（図２３）。製剤ＸＸＩＩＩの組織の一体化の増強は、驚くべきことに、リフト能力の持続時間の延長及び全体的な効果に対する他の利点をもたらす。例えば、新しく生じた組織は、皮膚の質、リフト能力、及び皺矯正を維持する。

【0178】

製剤ＸＸＶの長期（３０週間）のリフト能力データを試験した。ＨＡのみのゲルのリフト能力は、経時的に着実に減少している。（図２８）対照的に、ＨＡ－コラーゲンゲル（製剤ＸＸＶ及びＸＸＶＩ）のリフト能力は、１８から３０週間安定したままであった。（図２８）この驚くべき結果は、これらのＨＡ－コラーゲンゲル製剤がＨＡのみのゲルよりも長いリフト持続時間が可能であることを示している。このことは、ＨＡのみのゲルよりも良好な組織内殖と相関する（下記を参照のこと）。

【0179】

インビボでの組織の一体化
ラットの皮下移植モデルを使用して、一連の製剤のインビボでの組織の一体化を評価した。典型的な手順では、１２５μＬのヒドロゲルをラットの背側面に皮下ボーラスとして送達した。４週間後、ボーラスを外植し、ホルマリンで固定し、組織学のためにパラフィンに包埋した。組織切片をヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）及びコロイド鉄について染色した。併せて、Ｉ型コラーゲン、ビメンチン、ＣＤ３１及びＩ型プロコラーゲンの免疫組織化学染色を行った。

【0180】

組織の一体化は、ＨＭＷ ＨＡ及び４ｍｇ／ｍＬのコラーゲンを用いて同様に調製した製剤に関して、ＨＡ濃度と負の相関を示す。周囲組織付近に堆積したコラーゲンの密度は、１３ｍｇ／ｍＬのＨＡを含む製剤（製剤Ｉ）の方が、２０ｍｇ／ｍＬのＨＡで調製したもの（製剤ＩＩ）又は２５ｍｇ／ｍＬで調製したもの（製剤ＩＩＩ）よりも高く、ＨＡ濃度に依存している（図６Ａ～図６Ｅ）。さらに、１３ｍｇ／ｍＬのＨＡ製剤では、２０ｍｇ／ｍＬ又は２５ｍｇ／ｍＬのＨＡを含む材料よりも組織を欠く注入ボーラスの領域が少ない。ＨＡ濃度に加えて、一体化は主にコラーゲン濃度に依存すると予想される。しかしながら、他の要因がボーラスへの組織浸潤に強く影響している可能性があると思われる。例えば、高ＨＡ濃度（２８ｍｇ／ｍＬ）及び低コラーゲン濃度（２ｍｇ／ｍＬ）を有する製剤（製剤ＸＶＩ）は、コラーゲンの堆積がボーラス全体にわたり、組織を欠く領域がほとんどないこと実証する。

【0181】

製剤ＸＶＩは、ＨＭＷ ＨＡを用いて調製された前述の製剤とは異なり、主にＬＭＷ ＨＡを用いて調製した。しかしながら、２５：４ ｍｇ／ｍＬのＨＡ：コラーゲン濃度を有する第２の製剤（製剤ＸＶ）を主にＬＭＷ ＨＡを用いて調製したが、ボーラス全体を通して同じ強い一体化を示さないことからして（図７）、ＨＡの分子量もまた唯一の寄与因子ではない。合成中の水和温度は、インビトロでの細胞応答に影響を及ぼすことが先に示されており、その後の研究を通して、インビボでの細胞浸潤及び組織の一体化に影響を及ぼすことも示されている。２４：６ ｍｇ／ｍＬのＨＡ：コラーゲン濃度で調製し、ただし、５℃（製剤Ｘ）及び２２℃（製剤ＶＩ）の異なる水和温度で調製した２つの同様の製剤は、ボーラスの周囲のコラーゲンの堆積の密度が異なり、５℃で調製された製剤から得られた応答がより高いことを示す（図８）。１つのパラメータではなく、ＨＡ濃度、ＨＡ分子量比、コラーゲン濃度、及び合成条件を含む因子の組み合わせが組織の一体化の程度に影響を及ぼす。これらの材料では様々な組織応答が達成されており、したがって、この組織の一体化及び浸潤は、前述の合成パラメータを最適化することによって特定の充填剤の用途に合わせて調整することができる。

【0182】

製剤ＸＸＩＩ及び製剤ＸＸＩＩＩは、ＨＡのみのゲルと比較して、組織の一体化が増強されたことを示す。（図１７）コラーゲン１ａの染色は、ＨＡ－コラーゲン製剤中のゲル粒子の周りに微細なコラーゲンが分布していること、及びＨＡのみのゲル中のコラーゲン１ａの堆積が限定的であることを示している（図１８）。ラットにおける４週間の皮下移植後のヒドロゲルボーラス内のコラーゲン１ａの染色の陽性面積パーセントの定量化は、製剤ＸＸＩＩが、ＨＡのみのヒドロゲルよりも多くのコラーゲン１ａの陽性組織を生成することを実証している（図１９）。

【0183】

図２０は、ＨＡのみ、製剤ＸＸＩＩ又は製剤ＸＸＩＩＩのゲル上で４８時間培養したヒト皮膚線維芽細胞の共焦点顕微鏡写真を示す。試料をＨＡ結合タンパク質、Ｈｏｅｃｈｓｔ及び細胞膜について染色した。作製されたゲルは、ＨＡのみの架橋生成物と比較した場合に、細胞の付着性の顕著な改善を示し、ひいては、ゲルが組織の一体化及びコラーゲンの堆積のための足場として機能する可能性を示す。

【0184】

製剤ＸＩＸもまた、ビメンチン（線維芽細胞）、コラーゲンＩ及びＣＤ３１のレベルを増加させるその能力について試験した。図９及び図１０に示すように、製剤ＸＩＸは、ＨＡのみのヒドロゲルと比較して、ラットに１２週間皮下移植した後、製剤ＸＩＸヒドロゲルのボーラス中のビメンチン（線維芽細胞）、コラーゲンＩ及びＣＤ３１（血管）のレベルを増加させることができた。このことは、製剤ＸＩＸの細胞の拡延性及び付着性が改善されていることによって裏付けられている。同様に、製剤ＸＸＩＩ及び製剤ＸＸＩＩＩは、ＨＡのみの対照と比較して、線維芽細胞のより大きな浸潤（ビメンチン染色）及び血管新生（ＣＤ３１染色、矢印）を促進している（図２１）。これは、ヒドロゲルボーラスにおいて内因性組織と一致する形態を有する組織が再生していることを示している。

【0185】

図２４は、ＨＡのみ、製剤ＸＸＶＩ又は製剤ＸＸＶのゲル上で４８時間培養したヒト皮膚線維芽細胞の共焦点顕微鏡写真を示す。試料をＨＡ結合タンパク質、Ｈｏｅｃｈｓｔ及び細胞膜について染色した。製剤ＸＸＶＩ及び製剤ＸＸＶゲルは、ＨＡのみの架橋生成物と比較した場合に、細胞の付着性の驚くべき改善を示し、ひいては、ゲルが組織の一体化及びコラーゲンの堆積のための足場として機能する可能性を実証する。

【0186】

図２５は、１２週間後にＨＡのみ、製剤ＸＸＶ又は製剤ＸＸＩＩＩの皮下ボーラス注入で処置したラットにおける第二高調波発生シグナル（白色）及び組織自己蛍光（緑色）の二光子イメージングを示す。第二高調波発生（白色）の存在は、ＨＡ－コラーゲンで処置した移植片における完全に集合した原線維コラーゲンの形成を示している。ＨＡのみのゲルでは、第二高調波発生が限定的であることが見て取れる。

【0187】

図２６は、ラットにおける４週間の皮下移植後の製剤ＸＸＶに対する組織応答の免疫組織化学分析を示す。製剤ＸＸＶは、組織の一体化（Ｈ＆Ｅ染色）、線維芽細胞の浸潤（ビメンチン）、限定されたマクロファージ応答（ＣＤ６８）、コラーゲンＩの堆積、限定されたコラーゲンＩＩＩ、及び血管新生（ＣＤ３１）を促進する。これは、ヒドロゲルボーラスにおいて自然に組織が再生していることを示している可能性がある。さらに、製剤ＸＸＶは、ＨＡのみの対照（０．６７）と比較して、より高い組織の一体化の病理スコア（４．６７）をもたらした。

【0188】

図２７は、ラットにおける４週間の皮下移植後の製剤ＸＸＶＩに対する組織応答の免疫組織化学分析を示す。製剤ＸＸＶＩは、組織の一体化（Ｈ＆Ｅ染色）、線維芽細胞の浸潤（ビメンチン）、限定されたマクロファージ応答（ＣＤ６８）、コラーゲンＩの堆積、限定されたコラーゲンＩＩＩ、及び血管新生（ＣＤ３１）を促進する。これは、ヒドロゲルボーラスにおいて自然に組織が再生していることを示している可能性がある。さらに、製剤ＸＸＶＩは、ＨＡのみの対照（０．６７）と比較して、より高い組織の一体化の病理スコア（４．１７）をもたらした。

【0189】

条項の形での主題技術の説明
本開示の態様の様々な例を、便宜上、番号付きの条項（１、２、３など）の形で記載する。これらは例として提示するものであり、主題技術を限定するものではない。図面及び参照番号の特定は、単に例として、また例示を目的として以下に提示されており、条項はそれらの特定によって限定されない。

【0190】

第１項．リジン、ヒアルロン酸及びコラーゲンを含む架橋高分子マトリックスであって、ヒアルロン酸が、コラーゲン上の少なくとも１つの内因性アミン基及び／又はリジン上に存在する少なくとも１つのアミン基によってコラーゲンに架橋されている、架橋高分子マトリックス。

【0191】

第２項．リドカインをさらに含む、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【0192】

第３項．リドカインが、マトリックス中、約０．１５％（ｗ／ｗ）から約０．４５％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度である、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【0193】

第４項．リドカインが、マトリックスの約０．１５％（ｗ／ｗ）、約０．１７％（ｗ／ｗ）、約０．１９％（ｗ／ｗ）、約０．２１％（ｗ／ｗ）、約０．２３％（ｗ／ｗ）、約０．２５％（ｗ／ｗ）、約０．２７％（ｗ／ｗ）、約０．２９％（ｗ／ｗ）、約０．３１％（ｗ／ｗ）、約０．３３％（ｗ／ｗ）、約０．３５％（ｗ／ｗ）、約０．３７％（ｗ／ｗ）、約０．３７％（ｗ／ｗ）、約０．３９％（ｗ／ｗ）、約０．４１％（ｗ／ｗ）、約０．４３％（ｗ／ｗ）、若しくは約０．４５％（ｗ／ｗ）の濃度、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の濃度である、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【0194】

第５項．リドカインが、マトリックス中、約０．２７％（ｗ／ｗ）から約０．３３％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度である、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【0195】

第６項．マトリックスが、非架橋ＨＡをさらに含む、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【0196】

第７項．非架橋ＨＡが、マトリックス中、最大約５％（ｗ／ｗ）の濃度を有する、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【0197】

第８項．非架橋ＨＡが、マトリックス中、約０％（ｗ／ｗ）、約１％（ｗ／ｗ）、約２％（ｗ／ｗ）、約３％（ｗ／ｗ）、約４％（ｗ／ｗ）若しくは約５％（ｗ／ｗ）の濃度、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の濃度を有する、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【0198】

第９項．非架橋ＨＡが、マトリックス中、約１％（ｗ／ｗ）の濃度を有する、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【0199】

第１０項．非架橋ＨＡが、マトリックス中、約２％（ｗ／ｗ）の濃度を有する、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【0200】

第１１項．非架橋ＨＡが、マトリックス中、約５％（ｗ／ｗ）の濃度を有する、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【0201】

第１２項．非架橋ＨＡが、高分子マトリックスの押出性を改善する、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【0202】

第１３項．約６ヶ月間、約１２ヶ月間、約１８ヶ月間、約２４ヶ月間、約３０ヶ月間若しくは約３６ヶ月間、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の時間にわたって安定である、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【0203】

第１４項．約４℃～約２５℃の温度で安定である、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【0204】

第１５項．約４℃で安定である、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【0205】

第１６項．約２５℃で安定である、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【0206】

第１７項．約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約７ヶ月、約８ヶ月、約９ヶ月、約１０ヶ月、約１１ヶ月、約１２ヶ月、約１３ヶ月、約１４ヶ月、約１５ヶ月、約１６ヶ月、約１７ヶ月、約１８ヶ月、約１９ヶ月、約２０ヶ月、約２１ヶ月、約２２ヶ月、約２３ヶ月、約２４ヶ月、約２５ヶ月、約２６ヶ月、約２７ヶ月、約２８ヶ月、約２９ヶ月、約３０ヶ月、約３１ヶ月、約３２ヶ月、約３３ヶ月、約３４ヶ月、約３５ヶ月、約３６ヶ月、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の時点で安定である、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【0207】

第１８項．約６ヶ月、約１２ヶ月、約１８ヶ月、約２４ヶ月、約３０ヶ月若しくは約３６ヶ月、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の時間で分解がごくわずかである、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【0208】

第１９項．マトリックスが、約３０Ｐａから約１０，０００Ｐａの弾性率（Ｇ’）、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の弾性率を有する、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【0209】

第２０項．マトリックスが、約３０Ｐａ、約４０Ｐａ、約５０Ｐａ、約６０Ｐａ、約７０Ｐａ、約８０Ｐａ、約９０Ｐａ、約１００Ｐａ、約２００Ｐａ、約３００Ｐａ、約４００Ｐａ、約５００Ｐａ、約６００Ｐａ、約７００Ｐａ、約８００Ｐａ、約９００Ｐａ、約１０００Ｐａ、約１１００Ｐａ、約１２００Ｐａ、約１３００Ｐａ、約１４００Ｐａ、約１５００Ｐａ、約１６００Ｐａ、約１７００Ｐａ、約１８００Ｐａ、約１９００Ｐａ、約２０００Ｐａ、約２１００Ｐａ、約２２００Ｐａ、約２３００Ｐａ、約２４００Ｐａ、約２５００Ｐａ、約２６００Ｐａ、約２７００Ｐａ、約２８００Ｐａ、約２９００Ｐａ、約３０００Ｐａ、約３１００Ｐａ、約３２００Ｐａ、約３３００Ｐａ、約３４００Ｐａ、約３５００Ｐａ、約３６００Ｐａ、約３７００Ｐａ、約３８００Ｐａ、約３９００Ｐａ、約４０００Ｐａ、約４１００Ｐａ、約４２００Ｐａ、約４３００Ｐａ、約４４００Ｐａ、約４５００Ｐａ、約４６００Ｐａ、約４７００Ｐａ、約４８００Ｐａ、約４９００Ｐａ、約５０００Ｐａ、約５１００Ｐａ、約５２００Ｐａ、約５３００Ｐａ、約５４００Ｐａ、約５５００Ｐａ、約５６００Ｐａ、約５７００Ｐａ、約５８００Ｐａ、約５９００Ｐａ、約６０００Ｐａ、約６１００Ｐａ、約６２００Ｐａ、約６３００Ｐａ、約６４００Ｐａ、約６５００Ｐａ、約６６００Ｐａ、約６７００Ｐａ、約６８００Ｐａ、約６９００Ｐａ、約７０００Ｐａ、約７１００Ｐａ、約７２００Ｐａ、約７３００Ｐａ、約７４００Ｐａ、約７５００Ｐａ、約７６００Ｐａ、約７７００Ｐａ、約７８００Ｐａ、約７９００Ｐａ、約８０００Ｐａ、約８１００Ｐａ、約８２００Ｐａ、約８３００Ｐａ、約８４００Ｐａ、約８５００Ｐａ、約８６００Ｐａ、約８７００Ｐａ、約８８００Ｐａ、約８９００Ｐａ、約９０００Ｐａ、約９１００Ｐａ、約９２００Ｐａ、約９３００Ｐａ、約９４００Ｐａ、約９５００Ｐａ、約９６００Ｐａ、約９７００Ｐａ、約９８００Ｐａ、約９９００Ｐａ若しくは約１００００Ｐａの弾性率（Ｇ’）、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の弾性率を有する、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【0210】

第２１項．マトリックスが、約１０ｇｍｆ、約２０ｇｍｆ、約３０ｇｍｆ、約４０ｇｍｆ、約５０ｇｍｆ、約６０ｇｍｆ、約７０ｇｍｆ、約８０ｇｍｆ、約９０ｇｍｆ、約１００ｇｍｆ、約１１０ｇｍｆ、約１２０ｇｍｆ、約１３０ｇｍｆ、約１４０ｇｍｆ、約１５０ｇｍｆ、約１６０ｇｍｆ、約１７０ｇｍｆ、約１８０ｇｍｆ、約１９０ｇｍｆ、約２００ｇｍｆ、約２１０ｇｍｆ、約２２０ｇｍｆ、約２３０ｇｍｆ、約２４０ｇｍｆ、約２５０ｇｍｆ、約２６０ｇｍｆ、約２７０ｇｍｆ、約２８０ｇｍｆ、約２９０ｇｍｆ、約３００ｇｍｆ、約３１０ｇｍｆ、約３２０ｇｍｆ、約３３０ｇｍｆ、約３４０ｇｍｆ、約３５０ｇｍｆ、約３６０ｇｍｆ、約３７０ｇｍｆ、約３８０ｇｍｆ、約３９０ｇｍｆ、約４００ｇｍｆ、約４１０ｇｍｆ、約４２０ｇｍｆ、約４３０ｇｍｆ、約４４０ｇｍｆ、約４５０ｇｍｆ、約４６０ｇｍｆ、約４７０ｇｍｆ、約４８０ｇｍｆ、約４９０ｇｍｆ、約５００ｇｍｆ、約５１０ｇｍｆ、約５２０ｇｍｆ、約５３０ｇｍｆ、約５４０ｇｍｆ、約５５０ｇｍｆ、約５６０ｇｍｆ、約５７０ｇｍｆ、約５８０ｇｍｆ、約５９０ｇｍｆ若しくは約６００ｇｍｆの圧縮力値、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の圧縮力値を有する、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【0211】

第２２項．マトリックスが、約１００ｇｍｆ、約２００ｇｍｆ、約３００ｇｍｆ、約４００ｇｍｆ、約５００ｇｍｆ若しくは約６００ｇｍｆの圧縮力値、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の圧縮力値を有する、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【0212】

第２３項．ヒアルロン酸が、約５ｍｇ／ｍｌ、約６ｍｇ／ｍｌ、約８ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ、約１２ｍｇ／ｍｌ、約１４ｍｇ／ｍｌ、約１６ｍｇ／ｍｌ、約１８ｍｇ／ｍｌ、約２０ｍｇ／ｍｌ、約２２ｍｇ／ｍｌ、約２４ｍｇ／ｍｌ、約２６ｍｇ／ｍｌ、約２８ｍｇ／ｍｌ、約３０ｍｇ／ｍｌ、約３２ｍｇ／ｍｌ、約３４ｍｇ／ｍｌ若しくは約３６ｍｇ／ｍｌの濃度、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の濃度である、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【0213】

第２４項．コラーゲンが、Ｉ型コラーゲンを含む、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【0214】

第２５項．コラーゲンが、ＩＩ型コラーゲンを含む、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【0215】

第２６項．コラーゲンが、ＩＩＩ型コラーゲンを含む、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【0216】

第２７項．コラーゲンが、０％から３％のＩＩ型コラーゲンを含む、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【0217】

第２８項．コラーゲンが、１％～３％のＩ型コラーゲンを含む、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【0218】

第２９項．マトリックスが、約０％から約３％のＩＩＩ型コラーゲンを含む、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【0219】

第３０項．コラーゲンが、約９７％から約９９％のＩ型コラーゲンを含む、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【0220】

第３１項．コラーゲンが、Ｉ型コラーゲンとＩＩＩ型コラーゲンの両方の混合物を含む、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【0221】

第３２項．コラーゲンが、約１ｍｇ／ｍｌ、約２ｍｇ／ｍｌ、約４ｍｇ／ｍｌ、約６ｍｇ／ｍｌ、約８ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ、約１２ｍｇ／ｍｌ、約１４ｍｇ／ｍｌの濃度、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の濃度を有する、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【0222】

第３３項．塩をさらに含む、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【0223】

第３４項．約５０ｍＭから約４００ｍＭの範囲のＮａＣｌを含む、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【0224】

第３５項．ＮａＣｌを含み、ＮａＣｌが約５０ｍＭ、約７５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１２５ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１７５ｍＭ、約２００ｍＭ、約２２５ｍＭ、約２５０ｍＭ、約２７５ｍＭ、約３００ｍＭ、約３２５ｍＭ、約３５０ｍＭ、約３７５ｍＭ若しくは約４００ｍＭの濃度、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の濃度を有する、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【0225】

第３６項．ＮａＣｌを含み、ＮａＣｌが約１５０ｍＭの濃度を有する、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【0226】

第３７項．約０．０１Ｍのリン酸緩衝液、約１３７ｍＭのＮａＣｌ、及び約２．７ｍＭの濃度のＫＣｌを含む、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【0227】

第３８項．針及び／又はカニューレを用いた注入又は用途のために製剤化される、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【0228】

第３９項．ヒアルロン酸成分が、約２０，０００ダルトンから約１０，０００，０００ダルトンの平均分子量を有する、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【0229】

第４０項．ヒアルロン酸成分が、約２０，０００ダルトン、約４０，０００ダルトン、約６０，０００ダルトン、約８０，０００ダルトン、約１００，０００ダルトン、約２００，０００ダルトン、約３００，０００ダルトン、約４００，０００ダルトン、約５００，０００ダルトン、約６００，０００ダルトン、約７００，０００ダルトン、約８００，０００ダルトン、約９００，０００ダルトン、約１，０００，０００ダルトン、約１，１００，０００ダルトン、約１，２００，０００ダルトン、約１，３００，０００ダルトン、約１，４００，０００ダルトン、約１，５００，０００ダルトン、約１，６００，０００ダルトン、約１，７００，０００ダルトン、約１，８００，０００ダルトン、約１，９００，０００ダルトン、約２，０００，０００ダルトン、約２，１００，０００ダルトン、約２，２００，０００ダルトン、約２，３００，０００ダルトン、約２，４００，０００ダルトン、約２，５００，０００ダルトン、約２，６００，０００ダルトン、約２，７００，０００ダルトン、約２，８００，０００ダルトン、約２，９００，０００ダルトン、約３，０００，０００ダルトン、約３，１００，０００ダルトン、約３，２００，０００ダルトン、約３，３００，０００ダルトン、約３，４００，０００ダルトン、約３，５００，０００ダルトン、約３，６００，０００ダルトン、約３，７００，０００ダルトン、約３，８００，０００ダルトン、約３，９００，０００ダルトン、約４，０００，０００ダルトン、約４，１００，０００ダルトン、約４，２００，０００ダルトン、約４，３００，０００ダルトン、約４，４００，０００ダルトン、約４，５００，０００ダルトン、約４，６００，０００ダルトン、約４，７００，０００ダルトン、約４，８００，０００ダルトン、約４，９００，０００ダルトン、約５，０００，０００ダルトン、約５，１００，０００ダルトン、約５，２００，０００ダルトン、約５，３００，０００ダルトン、約５，４００，０００ダルトン、約５，５００，０００ダルトン、約５，６００，０００ダルトン、約５，７００，０００ダルトン、約５，８００，０００ダルトン、約５，９００，０００ダルトン、約６，０００，０００ダルトン、約６，１００，０００ダルトン、約６，２００，０００ダルトン、約６，３００，０００ダルトン、約６，４００，０００ダルトン、約６，５００，０００ダルトン、約６，６００，０００ダルトン、約６，７００，０００ダルトン、約６，８００，０００ダルトン、約６，９００，０００ダルトン、約７，０００，０００ダルトン、約７，１００，０００ダルトン、約７，２００，０００ダルトン、約７，３００，０００ダルトン、約７，４００，０００ダルトン、約７，５００，０００ダルトン、約７，６００，０００ダルトン、約７，７００，０００ダルトン、約７，８００，０００ダルトン、約７，９００，０００ダルトン、約８，０００，０００ダルトン、約８，１００，０００ダルトン、約８，２００，０００ダルトン、約８，３００，０００ダルトン、約８，４００，０００ダルトン、約８，５００，０００ダルトン、約８，６００，０００ダルトン、約８，７００，０００ダルトン、約８，８００，０００ダルトン、約８，９００，０００ダルトン、約９，０００，０００ダルトン、約９，１００，０００ダルトン、約９，２００，０００ダルトン、約９，３００，０００ダルトン、約９，４００，０００ダルトン、約９，５００，０００ダルトン、約９，６００，０００ダルトン、約９，７００，０００ダルトン、約９，８００，０００ダルトン、約９，９００，０００ダルトン若しくは約１０，０００，０００ダルトンの平均分子量、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の分子量を有する、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【0230】

第４１項．ヒアルロン酸が、異なる分子量を有するヒアルロン酸成分の混合物を含み、混合物が、約２０，０００ダルトン、約４０，０００ダルトン、約６０，０００ダルトン、約８０，０００ダルトン、約１００，０００ダルトン、約２００，０００ダルトン、約３００，０００ダルトン、約４００，０００ダルトン、約５００，０００ダルトン、約６００，０００ダルトン、約７００，０００ダルトン、約８００，０００ダルトン、約９００，０００ダルトン、約１，０００，０００ダルトン、約１，５００，０００ダルトン、約２，０００，０００ダルトン、約２，５００，０００ダルトン、約３，０００，０００ダルトン、約３，５００，０００ダルトン、約４，０００，０００ダルトン、約４，５００，０００ダルトン、約５，０００，０００ダルトン、約５，５００，０００ダルトン、約６，０００，０００ダルトン、約６，５００，０００ダルトン、約７，５００，０００ダルトン、約８，０００，０００ダルトン、約８，５００，０００ダルトン、約９，０００，０００ダルトン、約９，５００，０００ダルトン、ａｎｄ／ｏｒ約１０，０００，０００ダルトンの平均分子量を有するヒアルロン酸、及び／又は前述の任意の２つの値の間の範囲内の分子量を有する任意のヒアルロン酸を含む、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の架橋高分子マトリックス。

【0231】

第４２項．ヒアルロン酸と、コラーゲンと、リジンと、緩衝液とを含み、水性ヒドロゲルである、組成物。

【0232】

第４３項．ヒアルロン酸が、コラーゲン上の少なくとも１つの内因性アミン基及び／又はリジン上に存在する少なくとも１つのアミン基によってコラーゲンに架橋されている、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の組成物。

【0233】

第４４項．リドカインをさらに含む、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の組成物。

【0234】

第４５項．リドカインが、マトリックス中、約０．１５％（ｗ／ｗ）から約０．４５％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度である、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の組成物。

【0235】

第４６項．リドカインが、組成物の約０．１５％（ｗ／ｗ）、約０．１７％（ｗ／ｗ）、約０．１９％（ｗ／ｗ）、約０．２１％（ｗ／ｗ）、約０．２３％（ｗ／ｗ）、約０．２５％（ｗ／ｗ）、約０．２７％（ｗ／ｗ）、約０．２９％（ｗ／ｗ）、約０．３１％（ｗ／ｗ）、約０．３３％（ｗ／ｗ）、約０．３５％（ｗ／ｗ）、約０．３７％（ｗ／ｗ）、約０．３７％（ｗ／ｗ）、約０．３９％（ｗ／ｗ）、約０．４１％（ｗ／ｗ）、約０．４３％（ｗ／ｗ）若しくは約０．４５％（ｗ／ｗ）の濃度、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の濃度である、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の組成物。

【0236】

第４７項．非架橋ＨＡをさらに含む、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の組成物。

【0237】

第４８項．非架橋架橋ＨＡが、組成物中、最大約５％（ｗ／ｗ）の濃度を有する、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の組成物。

【0238】

第４９項．非架橋ＨＡが、組成物中、約０％（ｗ／ｗ）、約１％（ｗ／ｗ）、約２％（ｗ／ｗ）、約３％（ｗ／ｗ）、約４％（ｗ／ｗ）、約５％（ｗ／ｗ）の濃度、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の濃度を有する、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の組成物。

【0239】

第５０項．非架橋ＨＡが、組成物中、約１％（ｗ／ｗ）の濃度を有する、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の組成物。

【0240】

第５１項．非架橋ＨＡが、組成物中、約２％（ｗ／ｗ）の濃度を有する、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の組成物。

【0241】

第５２項．非架橋ＨＡが、組成物中、約５％（ｗ／ｗ）の濃度を有する、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の組成物。

【0242】

第５３項．非架橋ＨＡが、組成物の押出性を改善する、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の組成物。

【0243】

第５４項．緩衝液が、リン酸緩衝生理食塩水である、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の組成物。

【0244】

第５５項．ヒアルロン酸が、約２０，０００ダルトンから約１０，０００，０００ダルトンの平均分子量を有する、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の組成物。

【0245】

第５６項．ヒアルロン酸が、異なる分子量を有するヒアルロン酸成分の混合物を含み、その混合物が、約２０，０００ダルトン、約４０，０００ダルトン、約６０，０００ダルトン、約８０，０００ダルトン、約１００，０００ダルトン、約２００，０００ダルトン、約３００，０００ダルトン、約４００，０００ダルトン、約５００，０００ダルトン、約６００，０００ダルトン、約７００，０００ダルトン、約８００，０００ダルトン、約９００，０００ダルトン、約１，０００，０００ダルトン、約１，５００，０００ダルトン、約２，０００，０００ダルトン、約２，５００，０００ダルトン、約３，０００，０００ダルトン、約３，５００，０００ダルトン、約４，０００，０００ダルトン、約４，５００，０００ダルトン、約５，０００，０００ダルトン、約５，５００，０００ダルトン、約６，０００，０００ダルトン、約６，５００，０００ダルトン、約７，５００，０００ダルトン、約８，０００，０００ダルトン、約８，５００，０００ダルトン、約９，０００，０００ダルトン、約９，５００，０００ダルトン及び／又は約１０，０００，０００ダルトンの分子量を有するヒアルロン酸、及び／又は前述の任意の２つの値の間の範囲内の分子量を有する任意のヒアルロン酸を含む、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の組成物。

【0246】

第５７項．コラーゲンが、Ｉ型コラーゲンを含む、上記又は下記第項のいずれか一項に記載の組成物。

【0247】

第５８項．コラーゲンが、ＩＩ型コラーゲンを含む、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の組成物。

【0248】

第５９項．コラーゲンが、ＩＩＩ型コラーゲンを含む、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の組成物。

【0249】

第６０項．約４，０００Ｐａ Ｓ、約４１００Ｐａ Ｓ、約４２００Ｐａ Ｓ、約４３００Ｐａ Ｓ、約４４００Ｐａ Ｓ、約４５００Ｐａ Ｓ、約４６００Ｐａ Ｓ、約４７００Ｐａ Ｓ、約４８００Ｐａ Ｓ、約４９００Ｐａ Ｓ、約５０００Ｐａ Ｓ、約５１００Ｐａ Ｓ、約５２００Ｐａ Ｓ、約５３００Ｐａ Ｓ、約５４００Ｐａ Ｓ、約５５００Ｐａ Ｓ、約５６００Ｐａ Ｓ、約５７００Ｐａ Ｓ、約５８００Ｐａ Ｓ、約５９００Ｐａ Ｓ、約６０００Ｐａ Ｓ、約６１００Ｐａ Ｓ、約６２００Ｐａ Ｓ、約６３００Ｐａ Ｓ、約６４００Ｐａ Ｓ、約６５００Ｐａ Ｓ、約６６００Ｐａ Ｓ、約６７００Ｐａ Ｓ、約６８００Ｐａ Ｓ、約６９００Ｐａ Ｓ、約７０００Ｐａ Ｓ、約７１００Ｐａ Ｓ、約７２００Ｐａ Ｓ、約７３００Ｐａ Ｓ、約７４００Ｐａ Ｓ、約７５００Ｐａ Ｓ、約７６００Ｐａ Ｓ、約７７００Ｐａ Ｓ、約７８００Ｐａ Ｓ、約７９００Ｐａ Ｓ、約８０００Ｐａ Ｓ、約８１００Ｐａ Ｓ、約８２００Ｐａ Ｓ、約８３００Ｐａ Ｓ、約８４００Ｐａ Ｓ、約８５００Ｐａ Ｓ、約８６００Ｐａ Ｓ、約８７００Ｐａ Ｓ、約８８００Ｐａ Ｓ、約８９００Ｐａ Ｓ、約９０００Ｐａ Ｓ、約９１００Ｐａ，約９２００Ｐａ Ｓ、約９３００Ｐａ Ｓ、約９４００Ｐａ Ｓ、約９５００Ｐａ Ｓ、約９６００Ｐａ Ｓ、約９７００Ｐａ Ｓ、約９８００Ｐａ Ｓ、約９９００Ｐａ Ｓ若しくは約１０，０００Ｐａ Ｓの粘度、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の粘度を有する、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の組成物。

【0250】

第６１項．約０．０１から約０．５のｔａｎデルタパラメータ（Ｇ’’／Ｇ’）を有する、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の組成物。

【0251】

第６２項．約０．０１、約０．０５、約０．１０、約０．１５、約０．２０、約０．２５、約０．３０、約０．３５、約０．４０、約０．４５若しくは約０．５０のｔａｎデルタパラメータ（Ｇ’’／Ｇ’）、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意のｔａｎデルタパラメータを有する、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の組成物。

【0252】

第６３項．約６ヶ月間、約１２ヶ月間、約１８ヶ月間、約２４ヶ月間、約３０ヶ月間若しくは約３６ヶ月間、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の時間にわたって安定である、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の組成物。

【0253】

第６４項．約４℃で安定である、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の組成物。

【0254】

第６５項．約２５℃で安定である、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の組成物。

【0255】

第６６項．約６ヶ月、約１２ヶ月、約１８ヶ月、約２４ヶ月、約３０ヶ月若しくは約３６ヶ月、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の時間で分解がごくわずかである、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の組成物。

【0256】

第６７項．ヒアルロン酸とコラーゲンとを架橋する方法であって、コラーゲン、ヒアルロン酸及びリジンを水溶液に溶解して反応前水溶液を形成することであって、反応前水溶液が約４～約６のｐＨを有する、反応前水溶液を形成すること、及び、水溶性カルボジイミドと、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド又はＮ－ヒドロキシスルホスクシンイミドとを含む第２の溶液を調製すること、及び、第２の溶液を反応前水溶液に加えて架橋反応混合物を形成すること、及び、ヒアルロン酸とコラーゲンとをリジンで架橋することにより架橋反応混合物を反応させること、を含み、ヒアルロン酸がコラーゲン上の少なくとも１つの内因性アミン基及び／又はリジン上に存在する少なくとも１つのアミン基によってコラーゲンに架橋され、ＨＡ及びコラーゲンがごくわずかに分解し、ＨＡ及びコラーゲンの構造が無傷のままであり、それによって架橋高分子マトリックスを形成する、方法。

【0257】

第６８項．反応前水溶液が、約４．０、約４．５、約５．０、約５．５若しくは約６．０のｐＨ、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意のｐＨを有する、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0258】

第６９項．リドカインを架橋高分子マトリックスに加えることをさらに含む、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0259】

第７０項．リドカインが、架橋高分子マトリックス中、約０．１５％（ｗ／ｗ）から約０．４５％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度に至るまで加えられる、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0260】

第７１項．リドカインが、マトリックスの約０．１５％（ｗ／ｗ）、約０．１７％（ｗ／ｗ）、約０．１９％（ｗ／ｗ）、約０．２１％（ｗ／ｗ）、約０．２３％（ｗ／ｗ）、約０．２５％（ｗ／ｗ）、約０．２７％（ｗ／ｗ）、約０．２９％（ｗ／ｗ）、約０．３１％（ｗ／ｗ）、約０．３３％（ｗ／ｗ）、約０．３５％（ｗ／ｗ）、約０．３７％（ｗ／ｗ）、約０．３７％（ｗ／ｗ）、約０．３９％（ｗ／ｗ）、約０．４１％（ｗ／ｗ）、約０．４３％（ｗ／ｗ）若しくは約０．４５％（ｗ／ｗ）の濃度、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の濃度である、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0261】

第７２項．トリアゾール、フッ素化フェノール、スクシンイミド、又はスルホスクシンイミドを含む活性化剤を付与することをさらに含む、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0262】

第７３項．約２℃、約４℃、約６℃、約８℃、約１０℃、約１２℃、約１４℃、約１６℃、約１８℃、約２０℃、約２２℃、約２４℃、約２６℃、約２８℃、約３０℃、約３２℃、約３４℃若しくは約３６℃の温度、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の温度で行う、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0263】

第７４項．反応工程を、約４～約３５℃で行う、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0264】

第７５項．反応工程を、約４℃又は約２２℃で行う、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0265】

第７６項．架橋高分子マトリックスを精製することをさらに含み、精製工程を透析を用いて行う、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0266】

第７７項．精製工程を２℃～３０℃で行う、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0267】

第７８項．透析を、約２℃、約３℃、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の温度で行う、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0268】

第７９項．精製工程を約２℃から約８℃で行う、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0269】

第８０項．架橋反応を約２℃から約３５℃で行う、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0270】

第８１項．架橋反応を約２℃から約８℃で行う、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0271】

第８２項．室温未満で行う、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0272】

第８３項．架橋反応混合物のｐＨが約４．０から約６．０である、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0273】

第８４項．反応前溶液が塩を含み、塩が、架橋反応混合物中、約５０ｍＭ、約７５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１２５ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１７５ｍＭ、約２００ｍＭ、約２２５ｍＭ、約２５０ｍＭ、約２７５ｍＭ、約３００ｍＭ、３２５ｍＭ、約３５０ｍＭ、約３７５ｍＭ若しくは約４００ｍＭの濃度、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の濃度で塩化ナトリウムを含む、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0274】

第８５項．水溶性カルボジイミドが、架橋反応混合物中、約２０ｍＭから約２００ｍＭの濃度の１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドである、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0275】

第８６項．水溶性カルボジイミドが、約２０ｍＭ、約４０ｍＭ、約６０ｍＭ、約８０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１６０ｍＭ、約１８０ｍＭ若しくは約２００ｍＭの濃度、又は前述の任意の値によって定義される範囲の間の任意の濃度の１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドである、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0276】

第８７項．水溶性カルボジイミド及びヒアルロン酸の、水溶性カルボジイミドの繰り返し単位：ヒアルロン酸の繰り返し単位のモル対モル比が約０．５から約２．０である、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0277】

第８８項．水溶性カルボジイミド及びヒアルロン酸の、水溶性カルボジイミドの繰り返し単位：ヒアルロン酸の繰り返し単位のモル対モル比が、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９又は約２．０である、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0278】

第８９項．リジン及びヒアルロン酸のモル：モル（リジンの繰り返し単位：ＨＡの繰り返し単位）比が、約０．０１から約０．６である、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0279】

第９０項．リジン及びヒアルロン酸のモル：モル（リジンの繰り返し単位：ＨＡの繰り返し単位）比が、約０．０１、約０．０２、約０．０３、約０．０４、約０．０５、約０．０６、約０．０７、約０．０８、約０．０９、約０．１０、約０．１１、約０．１２、約０．１３、約０．１４、約０．１５、約０．１６、約０．１７、約０．１８、約０．１９、約０．２、約０．２１、約０．２２、約０．２３、約０．２４、約０．２５、約０．２６、約０．２７、約０．２８、約０．２９、約０．３、約０．３１、約０．３２、約０．３３、約０．３４、約０．３５、約０．３６、約０．３７、約０．３８、約０．３９、約０．４、約０．４１、約０．４２、約０．４３、約０．４４、約０．４５、約０．４６、約０．４７、約０．４８、約０．４９、約０．５、約０．５１、約０．５２、約０．５３、約０．５４、約０．５５、約０．５６、約０．５７、約０．５８、約０．５９又は約０．６である、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0280】

第９１項．非架橋ＨＡを架橋高分子マトリックスに加えることをさらに含む、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0281】

第９２項．非架橋ＨＡを、架橋高分子マトリックス中、最大５％ｗ／ｗの濃度に至るまで加える、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0282】

第９３項．非架橋ＨＡを、マトリックス中、約０％（ｗ／ｗ）、約１％（ｗ／ｗ）、約２％（ｗ／ｗ）、約３％（ｗ／ｗ）、約４％（ｗ／ｗ）若しくは約５％（ｗ／ｗ）の濃度、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の濃度に至るまで加える、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0283】

第９４項．非架橋ＨＡを、マトリックス中、約１％（ｗ／ｗ）の濃度に至るまで加える、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0284】

第９５項．非架橋ＨＡを、マトリックス中、約３％（ｗ／ｗ）の濃度に至るまで加える、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0285】

第９６項．非架橋ＨＡを、マトリックス中、約５％（ｗ／ｗ）の濃度に至るまで加える、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0286】

第９７項．架橋高分子マトリックスを滅菌することをさらに含み、蒸気滅菌のために架橋高分子マトリックスを容器に移すこと、及びヒドロゲルを蒸気滅菌によって滅菌すること、を含む、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0287】

第９８項．容器がシリンジである、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0288】

第９９項．架橋高分子マトリックスを透析することをさらに含み、透析を約１０００ダルトンから約１００，０００ダルトンの分子量カットオフを有する膜を介して行い、透析を滅菌前に行う、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0289】

第１００項．透析をリン酸緩衝生理食塩水で行う、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0290】

第１０１項．反応前溶液中のヒアルロン酸を、第２の溶液を加える前に少なくとも約６０分間水和する、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0291】

第１０２項．架橋反応混合物を約１６時間から約２４時間行う、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0292】

第１０３項．上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法のプロセスによって調製された架橋高分子マトリックス。

【0293】

第１０４項．人間の解剖学的特徴の審美性を改善する方法であって、人間の組織に組成物を注入し、それによって解剖学的特徴の審美性を改善することを含み、組成物が、ヒアルロン酸と、リジンと、コラーゲンとを含む架橋高分子マトリックスを含み、ヒアルロン酸が、コラーゲン上の少なくとも１つの内因性アミン基及び／又はリジン上に存在する少なくとも１つのアミン基によってコラーゲンに架橋されている、方法。

【0294】

第１０５項．架橋高分子マトリックスが、リドカインをさらに含む、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0295】

第１０６項．架橋高分子マトリックスが、非架橋ＨＡをさらに含む、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0296】

第１０７項．ヒアルロン酸成分が、約２０，０００ダルトン、約４０，０００ダルトン、約６０，０００ダルトン、約８０，０００ダルトン、約１００，０００ダルトン、約２００，０００ダルトン、約３００，０００ダルトン、約４００，０００ダルトン、約５００，０００ダルトン、約６００，０００ダルトン、約７００，０００ダルトン、約８００，０００ダルトン、約９００，０００ダルトン、約１，０００，０００ダルトン、約１，１００，０００ダルトン、約１，２００，０００ダルトン、約１，３００，０００ダルトン、約１，４００，０００ダルトン、約１，５００，０００ダルトン、約１，６００，０００ダルトン、約１，７００，０００ダルトン、約１，８００，０００ダルトン、約１，９００，０００ダルトン、約２，０００，０００ダルトン、約２，１００，０００ダルトン、約２，２００，０００ダルトン、約２，３００，０００ダルトン、約２，４００，０００ダルトン、約２，５００，０００ダルトン、約２，６００，０００ダルトン、約２，７００，０００ダルトン、約２，８００，０００ダルトン、約２，９００，０００ダルトン、約３，０００，０００ダルトン、約３，１００，０００ダルトン、約３，２００，０００ダルトン、約３，３００，０００ダルトン、約３，４００，０００ダルトン、約３，５００，０００ダルトン、約３，６００，０００ダルトン、約３，７００，０００ダルトン、約３，８００，０００ダルトン、約３，９００，０００ダルトン、約４，０００，０００ダルトン、約４，１００，０００ダルトン、約４，２００，０００ダルトン、約４，３００，０００ダルトン、約４，４００，０００ダルトン、約４，５００，０００ダルトン、約４，６００，０００ダルトン、約４，７００，０００ダルトン、約４，８００，０００ダルトン、約４，９００，０００ダルトン、約５，０００，０００ダルトン、約５，１００，０００ダルトン、約５，２００，０００ダルトン、約５，３００，０００ダルトン、約５，４００，０００ダルトン、約５，５００，０００ダルトン、約５，６００，０００ダルトン、約５，７００，０００ダルトン、約５，８００，０００ダルトン、約５，９００，０００ダルトン、約６，０００，０００ダルトン、約６，１００，０００ダルトン、約６，２００，０００ダルトン、約６，３００，０００ダルトン、約６，４００，０００ダルトン、約６，５００，０００ダルトン、約６，６００，０００ダルトン、約６，７００，０００ダルトン、約６，８００，０００ダルトン、約６，９００，０００ダルトン、約７，０００，０００ダルトン、約７，１００，０００ダルトン、約７，２００，０００ダルトン、約７，３００，０００ダルトン、約７，４００，０００ダルトン、約７，５００，０００ダルトン、約７，６００，０００ダルトン、約７，７００，０００ダルトン、約７，８００，０００ダルトン、約７，９００，０００ダルトン、約８，０００，０００ダルトン、約８，１００，０００ダルトン、約８，２００，０００ダルトン、約８，３００，０００ダルトン、約８，４００，０００ダルトン、約８，５００，０００ダルトン、約８，６００，０００ダルトン、約８，７００，０００ダルトン、約８，８００，０００ダルトン、約８，９００，０００ダルトン、約９，０００，０００ダルトン、約９，１００，０００ダルトン、約９，２００，０００ダルトン、約９，３００，０００ダルトン、約９，４００，０００ダルトン、約９，５００，０００ダルトン、約９，６００，０００ダルトン、約９，７００，０００ダルトン、約９，８００，０００ダルトン、約９，９００，０００ダルトン若しくは約１０，０００，０００ダルトンの平均分子量、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の分子量を有する、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0297】

第１０８項．ヒアルロン酸が、異なる分子量を有するヒアルロン酸成分の混合物を含み、混合物が、約２０，０００ダルトン、約４０，０００ダルトン、約６０，０００ダルトン、約８０，０００ダルトン、約１００，０００ダルトン、約２００，０００ダルトン、約３００，０００ダルトン、約４００，０００ダルトン、約５００，０００ダルトン、約６００，０００ダルトン、約７００，０００ダルトン、約８００，０００ダルトン、約９００，０００ダルトン、約１，０００，０００ダルトン、約１，５００，０００ダルトン、約２，０００，０００ダルトン、約２，５００，０００ダルトン、約３，０００，０００ダルトン、約３，５００，０００ダルトン、約４，０００，０００ダルトン、約４，５００，０００ダルトン、約５，０００，０００ダルトン、約５，５００，０００ダルトン、約６，０００，０００ダルトン、約６，５００，０００ダルトン、約７，５００，０００ダルトン、約８，０００，０００ダルトン、約８，５００，０００ダルトン、約９，０００，０００ダルトン、約９，５００，０００ダルトン及び／又は約１，０００，０００ダルトンの平均分子量を有するヒアルロン酸、及び／又は前述の任意の２つの値の間の範囲内の分子量を有する任意のヒアルロン酸を含む、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0298】

第１０９項．コラーゲンが、Ｉ型コラーゲン及び／又はＩＩＩ型コラーゲンを含む、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0299】

第１１０項．個体の外観を改善する方法であって、注入部位で個体の組織に組成物を注入し、それによって解剖学的特徴の審美性を改善することであって、組織からの浸潤細胞が注入部位内の組成物に一体化される、組成物を注入すること、組成物内に新しいコラーゲンを堆積させることであって、組成物が、ヒアルロン酸と、リジンと、コラーゲンとを含む架橋高分子マトリックスを含み、ヒアルロン酸が、コラーゲン上の少なくとも１つの内因性アミン基及び／又はリジン上に存在する少なくとも１つのアミン基によってコラーゲンに架橋されている、新しいコラーゲンを堆積させること、を含み、組成物が注入された組織が、組織の一体化及びコラーゲンの堆積並びに血管形成を有することが示される、方法。

【0300】

第１１１項．組成物がリドカインをさらに含む、上記又は下記第項のいずれか一項記載の方法。

【0301】

第１１２項．組成物が非架橋ＨＡをさらに含む、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0302】

第１１３項．組成物を、顎先、顎ライン、唇、又はホウレイ線に注入する、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0303】

第１１４項．顔の特徴間の対称性を改善する、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0304】

第１１５項．顔の特徴に対してボリュームを増大及び復元する、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0305】

第１１６項．顎先、唇、顎ライン、又はホウレイ線のボリュームを増大させ、補正し、復元し、又は与える、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0306】

第１１７項．組成物を、個体の涙液トラフに注入する、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0307】

第１１８項．組成物を、皮膚の萎縮及び／又は脂肪体の萎縮を含む領域に注入する、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0308】

第１１９項．注入を受ける組織に自然な見た目、感触、及び動きを与え、組成物が、注入部位の周囲の組織からのコラーゲンの浸潤の増加をもたらす、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0309】

第１２０項．注入部位への組織の一体化の結果として組成物の持続時間が延長される、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0310】

第１２１項．注入部位の周囲の皮膚の水和及び弾性を改善する、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0311】

第１２２項．組織へのコラーゲンの浸潤を増加させる方法であって、個体の組織に組成物を注入し、それによって組成物を含む皮膚充填剤のデポーを作り出すことであって、組成物が、ヒアルロン酸と、リジンと、コラーゲンとを含む架橋高分子マトリックスを含み、ヒアルロン酸が、コラーゲン上の少なくとも１つの内因性アミン基及び／又はリジン上に存在する少なくとも１つのアミン基によってコラーゲンに架橋されている、個体の組織に組成物を注入することを含み、皮膚充填剤のデポーの周囲の組織からの細胞が組成物を含む皮膚充填剤のデポーに浸潤し、細胞が組成物に一体化して新しいコラーゲンを組成物に堆積させ、それによって組成物内に浸潤組織を作り出し、血管が組成物内の浸潤組織を個体の身体の血液供給源に接続する、方法。

【0312】

第１２３項．マトリックスがリドカインをさらに含む、上記又は下記の項のいずれか一項記載の方法。

【0313】

第１２４項．組成物が非架橋ＨＡをさらに含む、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0314】

第１２５項．ヒアルロン酸が、約２０，０００ダルトン、約４０，０００ダルトン、約６０，０００ダルトン、約８０，０００ダルトン、約１００，０００ダルトン、約２００，０００ダルトン、約３００，０００ダルトン、約４００，０００ダルトン、約５００，０００ダルトン、約６００，０００ダルトン、約７００，０００ダルトン、約８００，０００ダルトン、約９００，０００ダルトン、約１，０００，０００ダルトン、約１，１００，０００ダルトン、約１，２００，０００ダルトン、約１，３００，０００ダルトン、約１，４００，０００ダルトン、約１，５００，０００ダルトン、約１，６００，０００ダルトン、約１，７００，０００ダルトン、約１，８００，０００ダルトン、約１，９００，０００ダルトン、約２，０００，０００ダルトン、約２，１００，０００ダルトン、約２，２００，０００ダルトン、約２，３００，０００ダルトン、約２，４００，０００ダルトン、約２，５００，０００ダルトン、約２，６００，０００ダルトン、約２，７００，０００ダルトン、約２，８００，０００ダルトン、約２，９００，０００ダルトン、約３，０００，０００ダルトン、約３，１００，０００ダルトン、約３，２００，０００ダルトン、約３，３００，０００ダルトン、約３，４００，０００ダルトン、約３，５００，０００ダルトン、約３，６００，０００ダルトン、約３，７００，０００ダルトン、約３，８００，０００ダルトン、約３，９００，０００ダルトン、約４，０００，０００ダルトン、約４，１００，０００ダルトン、約４，２００，０００ダルトン、約４，３００，０００ダルトン、約４，４００，０００ダルトン、約４，５００，０００ダルトン、約４，６００，０００ダルトン、約４，７００，０００ダルトン、約４，８００，０００ダルトン、約４，９００，０００ダルトン、約５，０００，０００ダルトン、約５，１００，０００ダルトン、約５，２００，０００ダルトン、約５，３００，０００ダルトン、約５，４００，０００ダルトン、約５，５００，０００ダルトン、約５，６００，０００ダルトン、約５，７００，０００ダルトン、約５，８００，０００ダルトン、約５，９００，０００ダルトン、約６，０００，０００ダルトン、約６，１００，０００ダルトン、約６，２００，０００ダルトン、約６，３００，０００ダルトン、約６，４００，０００ダルトン、約６，５００，０００ダルトン、約６，６００，０００ダルトン、約６，７００，０００ダルトン、約６，８００，０００ダルトン、約６，９００，０００ダルトン、約７，０００，０００ダルトン、約７，１００，０００ダルトン、約７，２００，０００ダルトン、約７，３００，０００ダルトン、約７，４００，０００ダルトン、約７，５００，０００ダルトン、約７，６００，０００ダルトン、約７，７００，０００ダルトン、約７，８００，０００ダルトン、約７，９００，０００ダルトン、約８，０００，０００ダルトン、約８，１００，０００ダルトン、約８，２００，０００ダルトン、約８，３００，０００ダルトン、約８，４００，０００ダルトン、約８，５００，０００ダルトン、約８，６００，０００ダルトン、約８，７００，０００ダルトン、約８，８００，０００ダルトン、約８，９００，０００ダルトン、約９，０００，０００ダルトン、約９，１００，０００ダルトン、約９，２００，０００ダルトン、約９，３００，０００ダルトン、約９，４００，０００ダルトン、約９，５００，０００ダルトン、約９，６００，０００ダルトン、約９，７００，０００ダルトン、約９，８００，０００ダルトン、約９，９００，０００ダルトン若しくは約１０，０００，０００ダルトンの平均分子量、又は前述の任意の２つの値によって定義される範囲の間の任意の他の分子量を有する、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0315】

第１２６項．ヒアルロン酸が、異なる分子量を有するヒアルロン酸成分の混合物を含み、混合物が、約２０，０００ダルトン、約４０，０００ダルトン、約６０，０００ダルトン、約８０，０００ダルトン、約１００，０００ダルトン、約２００，０００ダルトン、約３００，０００ダルトン、約４００，０００ダルトン、約５００，０００ダルトン、約６００，０００ダルトン、約７００，０００ダルトン、約８００，０００ダルトン、約９００，０００ダルトン、約１，０００，０００ダルトン、約１，５００，０００ダルトン、約２，０００，０００ダルトン、約２，５００，０００ダルトン、約３，０００，０００ダルトン、約３，５００，０００ダルトン、約４，０００，０００ダルトン、約４，５００，０００ダルトン、約５，０００，０００ダルトン、約５，５００，０００ダルトン、約６，０００，０００ダルトン、約６，５００，０００ダルトン、約７，５００，０００ダルトン、約８，０００，０００ダルトン、約８，５００，０００ダルトン、約９，０００，０００ダルトン、約９，５００，０００ダルトン及び／又は約１０，０００，０００ダルトンの平均分子量を有するヒアルロン酸、及び／又は前述の任意の２つの値の間の範囲内の分子量を有する任意のヒアルロン酸を含む、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0316】

第１２７項．コラーゲンが、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン及び／又はＩＩＩ型コラーゲンを含む、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0317】

第１２８項．組成物が約１３ｍｇ／ｍｌのヒアルロン酸を含む、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0318】

第１２９項．組成物が、約２０ｍｇ／ｍｌのヒアルロン酸、約２２ｍｇ／ｍｌのヒアルロン酸、約２４ｍｇ／ｍｌ、約２６ｍｇ／ｍｌのヒアルロン酸、約２８ｍｇ／ｍｌのヒアルロン酸又は約３０ｍｇ／ｍｌのヒアルロン酸を含む、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0319】

第１３０項．皮膚の質、小皺、又は粗さを改善するために、製品を真皮表層に注入する、上記又は下記の項のいずれか一項に記載の方法。

【0320】

いくつかの実施形態では、本明細書の条項のいずれかは、独立項のいずれか１つ又は従属項のいずれか１つに依存し得る。一態様では、条項（例えば、従属項又は独立項）のいずれかは、任意の他の１つ以上の条項（例えば、従属項又は独立項）と組み合わせることができる。一態様では、請求項は、節、文、句又は段落に記載された単語（例えば、工程、動作、手段又は構成要素）の一部又は全部を含み得る。一態様では、請求項は、１つ以上の節、文、句又は段落に記載された単語の一部又は全部を含み得る。一態様では、各節、文、句又は段落の単語の一部が削除され得る。一態様では、追加の単語又は要素が、節、文、句又は段落に追加され得る。一態様では、主題技術は、本明細書に記載された構成要素、要素、機能又は動作のいくつかを利用することなく実装され得る。一態様では、主題技術は、追加の構成要素、要素、機能又は動作を利用して実装され得る。

【0321】

本発明を説明する文脈で（特に以下の特許請求の範囲の文脈で）使用される用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」及び同様の指示対象は、本明細書で特に指示されない限り、又は文脈と明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含すると解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の記載は、単に、その範囲内に入る各別個の値を個別に参照する簡略方法として役立つことを意図している。本明細書に別段の指示がない限り、各個々の値は、本明細書に個別に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書に記載のすべての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、又は文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実行することができる。本明細書で提供されるありとあらゆる例又は例示的な言語（例えば、「など」）の使用は、単に本発明をよりよく明らかにすることを意図しており、特許請求される本発明の範囲を限定するものではない。本明細書におけるいかなる言語も、本発明の実施に不可欠な特許請求されていない要素を示すと解釈されるべきではない。

【0322】

本明細書に開示される発明の代替的な要素又は実施形態のグループ化は、限定として解釈されるべきではない。各グループのメンバーは、個々に、又はグループの他のメンバー若しくは本明細書に見られる他の要素と任意に組み合わせて、参照され、特許請求され得る。グループの１つ以上のメンバーは、便宜上及び／又は特許性の理由から、グループに含まれ得るか、又はグループから削除され得ることが予想される。そのような包含又は削除が生じる場合、本明細書は、改変されたグループを含み、したがって添付の特許請求の範囲で使用されるすべてのマーカッシュ群の記載を満たすと見なされる。

【0323】

本発明者らに知られている本発明を実施するための最良の形態を含む、本発明の特定の実施形態を本明細書に記載する。当然ながら、前述の説明を読めば、これらの記載された実施形態の変形形態が当業者には明らかになるであろう。本発明者は、当業者がそのような変形を適切に使用することを期待しており、本発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載されている以外の方法で実施されることを意図している。したがって、本発明は、適用法によって許容される形で、添付の特許請求の範囲に記載された主題のすべての改変及び均等物を含む。さらに、本明細書に別段の指示がない限り、又は文脈と明らかに矛盾しない限り、そのすべての可能な変形における上述の要素の任意の組み合わせが本発明に包含される。

【0324】

本明細書に開示される特定の実施形態は、言語からなること、又は本質的に言語からなることを生かす特許請求の範囲においてさらに限定され得る。特許請求の範囲で使用される場合、出願時又は補正によって追加されたかどうかにかかわらず、「からなる」という移行用語は、特許請求の範囲で指定されていない要素、工程、又は成分を除外する。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という移行用語は、請求項の範囲を特定の材料又は工程と、基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさないものとに限定する。そのように特許請求される本発明の実施形態は、本明細書において、本質的に又は明示的に記載され、可能になる。

【0325】

さらに、本明細書全体を通して、特許及び印刷された刊行物が多数参照されている。上記で引用された参考文献及び印刷された刊行物のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に個々に組み込まれる。

【0326】

最後に、本明細書に開示される発明の実施形態は、本発明の原理の例示であることを理解されたい。採用し得る他の改変は、本発明の範囲内にある。したがって、限定ではなく例として、本明細書の教示に従って本発明の代替構成を利用することができる。したがって、本発明は、詳細に図示及び説明されたものに限定されない。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【手続補正書】

【提出日】2024-05-02

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

皮膚充填剤をヒトの顔の解剖学的特徴に注入することにより前記解剖学的特徴の審美性を改善するための皮膚充填剤であって、前記皮膚充填剤が、リジンと、ヒアルロン酸と、コラーゲンとを含む架橋高分子マトリックスを含み、前記ヒアルロン酸が、前記コラーゲン上の少なくとも１つの内因性アミン基及び前記リジン上に存在する少なくとも１つのアミン基によって前記コラーゲンに架橋されている、上記皮膚充填剤。

【請求項2】

前記解剖学的特徴の審美性を改善することが、前記解剖学的特徴にボリュームを増大及び復元することである、請求項１に記載の皮膚充填剤。

【請求項3】

前記解剖学的特徴が顎先、顎ライン、唇、又はホウレイ線である、請求項１又は２に記載の皮膚充填剤。

【請求項4】

前記解剖学的特徴の審美性を改善することが、顎先、唇、顎ライン、又はホウレイ線にボリュームを増大させ、補正し、復元し、又は与えることである、請求項１に記載の皮膚充填剤。

【請求項5】

ヒトの顔の皮膚に皮膚充填剤を注入することにより前記皮膚の水和及び弾性を改善するための皮膚充填剤であって、前記皮膚充填剤が、リジンと、ヒアルロン酸と、コラーゲンとを含む架橋高分子マトリックスを含み、前記ヒアルロン酸が、前記コラーゲン上の少なくとも１つの内因性アミン基及び前記リジン上に存在する少なくとも１つのアミン基によって前記コラーゲンに架橋されている、上記皮膚充填剤。

【請求項6】

組織へのコラーゲンの浸潤を増加させるための皮膚充填剤であって、前記皮膚充填剤が、リジンと、ヒアルロン酸と、コラーゲンとを含む架橋高分子マトリックスを含み、前記ヒアルロン酸が、前記コラーゲン上の少なくとも１つの内因性アミン基及び前記リジン上に存在する少なくとも１つのアミン基によって前記コラーゲンに架橋されている、上記皮膚充填剤。

【請求項7】

前記皮膚充填剤が、涙液トラフ、皮膚萎縮の領域、脂肪体萎縮の領域、又はそれらの２つ以上の組合せに注入される、請求項１～６のいずれか一項に記載の皮膚充填剤。

【請求項8】

前記ヒアルロン酸が５ｍｇ／ｍｌ～３６ｍｇ／ｍｌの濃度である、請求項１～７のいずれか一項に記載の皮膚充填剤。

【請求項9】

前記ヒアルロン酸が１６ｍｇ／ｍｌ～２２ｍｇ／ｍｌの濃度である、請求項８に記載の皮膚充填剤。

【請求項10】

前記コラーゲンが、Ｉ型コラーゲン、ＩＩ型コラーゲン及びＩＩＩ型コラーゲンのうちの１つ以上を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の皮膚充填剤。

【請求項11】

前記コラーゲンが、９７％から９９％のＩ型コラーゲンを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の皮膚充填剤。

【請求項12】

前記コラーゲンが、１ｍｇ／ｍｌから１４ｍｇ／ｍｌの濃度である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の皮膚充填剤。

【請求項13】

前記コラーゲンが、２ｍｇ／ｍｌから６ｍｇ／ｍｌの濃度である、請求項１２に記載の皮膚充填剤。

【請求項14】

前記リジン及びヒアルロン酸が０．０１から０．６のモル：モル比である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の皮膚充填剤。

【請求項15】

前記架橋高分子マトリックスがリドカインをさらに含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の皮膚充填剤。

【請求項16】

前記架橋高分子マトリックスが非架橋ヒアルロン酸をさらに含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の皮膚充填剤。

【請求項17】

前記非架橋ヒアルロン酸が、前記マトリックス中、５％（ｗ／ｗ）までの濃度である、請求項１６に記載の皮膚充填剤。

【請求項18】

前記架橋高分子マトリックスが、３０Ｐａ～１００００Ｐａの弾性率（Ｇ’）を有する、請求項１～１７のいずれか一項に記載の皮膚充填剤。

【請求項19】

前記架橋高分子マトリックスが、１００ｇｍｆ～６００ｇｍｆの圧縮力値を有する、請求項１～１８のいずれか一項に記載の皮膚充填剤。

【請求項20】

前記架橋高分子マトリックスが、０．０１から０．５のｔａｎデルタパラメータ（Ｇ’’／Ｇ’）を有する、請求項１～１９のいずれか一項に記載の皮膚充填剤。

【外国語明細書】