▶ セルラー ダイナミクス インターナショナル， インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024099563
(43)【公開日】2024-07-25
(54)【発明の名称】眼球細胞の分化方法及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0797 20100101AFI20240718BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0797
【審査請求】有
【請求項の数】1
【出願形態】ＯＬ
【外国語出願】
(21)【出願番号】P 2024061393
(22)【出願日】2024-04-05
(62)【分割の表示】P 2020557896の分割
【原出願日】2019-04-22
(31)【優先権主張番号】62/660,899
(32)【優先日】2018-04-20
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(71)【出願人】
【識別番号】510003830
【氏名又は名称】フジフィルム セルラー ダイナミクス，インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000109
【氏名又は名称】弁理士法人特許事務所サイクス
(72)【発明者】
【氏名】チェイス ルーカス
(72)【発明者】
【氏名】ウォレス カイル
(72)【発明者】
【氏名】メリン ベンジャミン
(72)【発明者】
【氏名】ディアス アンドリュー
(72)【発明者】
【氏名】シェリー ブランドン
(72)【発明者】
【氏名】フェン マリサ
(72)【発明者】
【氏名】フィリップス デブヤーニ
(72)【発明者】
【氏名】スターンフェルド マシュー
(72)【発明者】
【氏名】メイヤー ネイサン
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065BB01
4B065CA44
(57)【要約】 （修正有）
【課題】ヒト神経上皮系細胞（特に光受容体前駆体（ＰＲＰ）細胞）の実質的に純粋な培養物を得るための効率的で信頼性の高い大規模な方法を提供する。
【解決手段】神経網膜前駆細胞（ＮＲＰ）の集団を製造する方法であって、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の出発集団を得ること、このｉＰＳＣを網膜誘導培地（ＲＩＭ）で培養して、この細胞の前部神経外胚葉細胞への分化を開始させること、この細胞を、ＢＭＰ阻害剤を含む第１の網膜分化培地（ＲＤ１）でさらに培養して、この細胞を前部神経外胚葉細胞にさらに分化させること、前部神経外胚葉細胞を、ＢＭＰ阻害剤を本質的に含まない第２の網膜分化培地（ＲＤ２）で培養することにより、この細胞の網膜分化を誘導して、網膜前駆細胞（ＲＰＣ）を形成すること、及びこのＲＰＣを網膜成熟（ＲＭ）培地で培養して、ＮＲＰを製造することを含む方法である。
【選択図】なし
【解決手段】神経網膜前駆細胞（ＮＲＰ）の集団を製造する方法であって、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の出発集団を得ること、このｉＰＳＣを網膜誘導培地（ＲＩＭ）で培養して、この細胞の前部神経外胚葉細胞への分化を開始させること、この細胞を、ＢＭＰ阻害剤を含む第１の網膜分化培地（ＲＤ１）でさらに培養して、この細胞を前部神経外胚葉細胞にさらに分化させること、前部神経外胚葉細胞を、ＢＭＰ阻害剤を本質的に含まない第２の網膜分化培地（ＲＤ２）で培養することにより、この細胞の網膜分化を誘導して、網膜前駆細胞（ＲＰＣ）を形成すること、及びこのＲＰＣを網膜成熟（ＲＭ）培地で培養して、ＮＲＰを製造することを含む方法である。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
神経網膜前駆細胞（ＮＲＰ）の集団を製造する方法であって、
（ａ）ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の出発集団を得ること、
（ｂ）前記細胞を、ＢＭＰ阻害剤を含む第１の網膜分化培地（ＲＤ１）で培養して、前記細胞を前部神経外胚葉細胞にさらに分化させること、
（ｃ）前記前部神経外胚葉細胞を、ＢＭＰ阻害剤を本質的に含まない第２の網膜分化培地（ＲＤ２）で培養することにより、前記細胞の網膜分化を誘導して、網膜前駆細胞（ＲＰＣ）を形成すること、
及び
（ｄ）前記ＲＰＣを網膜成熟（ＲＭ）培地で培養して、ＮＲＰを製造すること
を含む方法。
（ａ）ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の出発集団を得ること、
（ｂ）前記細胞を、ＢＭＰ阻害剤を含む第１の網膜分化培地（ＲＤ１）で培養して、前記細胞を前部神経外胚葉細胞にさらに分化させること、
（ｃ）前記前部神経外胚葉細胞を、ＢＭＰ阻害剤を本質的に含まない第２の網膜分化培地（ＲＤ２）で培養することにより、前記細胞の網膜分化を誘導して、網膜前駆細胞（ＲＰＣ）を形成すること、
及び
（ｄ）前記ＲＰＣを網膜成熟（ＲＭ）培地で培養して、ＮＲＰを製造すること
を含む方法。
【請求項2】
前記細胞をＲＤ１で培養する前に、前記ｉＰＳＣを網膜誘導培地（ＲＩＭ）で培養して、前記細胞の前部神経外胚葉細胞への分化を開始させることをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ＮＲＰの集団を、γ－セクレターゼ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤を含む培地で懸濁凝集体として培養することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記工程（ａ）～（ｄ）の培養することは、付着性２次元培養としてさらに定義される、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記ＲＩＭは、ＢＭＰ阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤、及び／又はＩＧＦ－１を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項6】
前記ＲＩＭは、ＷＮＴ阻害剤をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
ＲＩＭは、ＣＫＩ－７を本質的に含まないか、又は含まない、請求項５に記載の方法。
【請求項8】
前記ＲＩＭは、アクチビンＡを本質的に含まない、請求項２に記載の方法。
【請求項9】
前記ＲＤ１培地は、ＴＧＦβ阻害剤、Ｗｎｔ阻害剤、及びＭＥＫ阻害剤をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記ＲＤ１は、Ｗｎｔ阻害剤をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記ＲＤ１は、Ｗｎｔ阻害剤を本質的に含まない、請求項９に記載の方法。
【請求項12】
前記ＲＤ１は、ＣＫＩ－７を本質的に含まないか、又は含まない、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記ＲＤ２培地は、ＴＧＦβ阻害剤、Ｗｎｔ阻害剤、及びＭＥＫ阻害剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
前記ＲＤ２培地は、ＬＤＮ１９３１８９を本質的に含まない、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記ＲＭ培地は、ニコチンアミド及びアスコルビン酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項16】
前記ＲＭ培地は、ＦＧＦ及びＴＧＦβ阻害剤をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記ＲＭ培地は、γ－セクレターゼ阻害剤をさらに含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項18】
前記前部神経外胚葉細胞のＶＳＸ２発現の増加を検出して分化能を判定することをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項19】
ＲＤ２での培養後に、前記細胞の少なくとも９０％は、ＰＭＥＬ１７を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項20】
ＲＤ２での培養後に、前記細胞の少なくとも３０％は、ＶＳＸ２を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項21】
前記ＲＰＣは、ＰＡＸ６、ＭＩＴＦ、及び／又はＰＭＥＬを発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項22】
前記ＲＰＣは、ＴＲＹＰ１、ＣＲＡＬＢＰ、及び／又はＢＥＳＴ１を発現しないか、又は本質的に発現しない、請求項１又は２１に記載の方法。
【請求項23】
ＲＭでの培養後に、前記細胞の少なくとも７０％は、ＰＡＸ６及びＣＨＸ１０（ＶＳＸ２）を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項24】
前記ＮＲＰは、ＰＡＸ６及びＣＨＸ１０（ＶＳＸ２）を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項25】
前記ＮＲＰは、ＰＡＸ６、ＣＨＸ１０（ＶＳＸ２）、Ｋｉ６７、及びＰＭＥＬからなる群から選択されるマーカーの内の１つ又は複数を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項26】
請求項１に従って製造されたＮＲＰと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項27】
光受容体前駆体細胞（ＰＲＰ）の集団を製造する方法であって、
（ａ）請求項１～２５のいずれか一項に記載のＮＲＰの出発集団を得ること、
（ｂ）前記ＮＲＰを、ＰＲＰの集団を製造するのに十分な期間にわたり、γ－セクレターゼ阻害剤及びＦＧＦを含む光受容体前駆体誘導培地（ＦＤＳＣ）でさらに培養すること
を含む方法。
（ａ）請求項１～２５のいずれか一項に記載のＮＲＰの出発集団を得ること、
（ｂ）前記ＮＲＰを、ＰＲＰの集団を製造するのに十分な期間にわたり、γ－セクレターゼ阻害剤及びＦＧＦを含む光受容体前駆体誘導培地（ＦＤＳＣ）でさらに培養すること
を含む方法。
【請求項28】
前記ＦＤＳＣは、ＴＧＦβ阻害剤及びＷＮＴ阻害剤をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記工程（ａ）及び（ｂ）の培養することは、付着性２次元培養としてさらに定義される、請求項２７に記載の方法。
【請求項30】
前記ＰＲＰの集団を、ニコチンアミドを含むＲＭ培地又は光受容体成熟（ＰＭ）培地で懸濁凝集体として成熟させ、それにより成熟ＰＲＰ凝集体の集団を製造することをさらに含む請求項２７に記載の方法。
【請求項31】
前記成熟ＰＲＰ凝集体を凍結保存することをさらに含む請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記成熟ＰＲＰ凝集体を、ＰＭ培地中で本質的に単一の細胞に解離させることをさらに含む請求項３０に記載の方法。
【請求項33】
前記成熟ＰＲＰを単一細胞として凍結保存することをさらに含む請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
前記ＰＭ培地は、γ－セクレターゼ阻害剤をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項35】
前記ＰＲＰを精製することをさらに含む請求項２７に記載の方法。
【請求項36】
精製することは、ＣＤ１７１に関して陽性である細胞を選択し、それにより精製済ＰＲＰ細胞集団を得ることを含む、請求項２７～３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
精製することは、ＣＤ１７１及び／又はＳＵＳＤ２に関して陽性である細胞を選択し、それにより精製済ＰＲＰ細胞集団を得ることを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項38】
精製することは、ＣＤ１７１、ＳＵＳＤ２、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）、ＣＤ５７（ＬＡＭＰ－３）、ＣＤ８１、ＣＤ１１１（ネクチン１）、ＣＤ１３３、ＣＤ１４７、ＣＤ１８４（ＣＸＣＲ４）、ＣＤ２００、ＣＤ２３０、ＣＤ２７６、ＣＤ２９８、ＣＤ３４４（フリズルド）、ＰＳＡ－ＮＣＡＭ、及び／又はＰＴＫ７に関して陽性である細胞を選択し、それにより精製済ＰＲＰ細胞集団を得ることを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項39】
精製することは、ＣＤ１１１、ＣＤ１３３、ＣＤ２３０、及び／又はＣＤ３４４に関して陽性である細胞を選択し、それにより精製済ＰＲＰ細胞集団を得ることを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項40】
精製することは、ＣＤ３４４に関して陽性である細胞を選択し、それにより精製済ＰＲＰ細胞集団を得ることを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項41】
精製することは、ＣＤ９、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ３４０、ポドプラニン、ＣＤ２９、ＣＤ６３、及びＣＤ２９８からなる群から選択されるマーカーの内の２つ以上に関して陽性の細胞の枯渇を含む、請求項３５～４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項42】
前記細胞の少なくとも９０％は、クラスＩＩＩβ－チューブリン（ＴＵＢＢ３）を発現する、請求項３５～４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項43】
前記細胞の少なくとも７５％は、リカバリン（ＲＣＶＲＮ）を発現する、請求項３５～４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項44】
前記細胞の少なくとも５０％は、ＲＣＶＲＮを発現する、請求項３５～４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項45】
前記細胞の少なくとも７０％は、ＲＣＶＲＮを発現する、請求項３５～４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項46】
前記ＰＲＰは、ＯＴＸ２、ＩＲＢＰ、ＳＵＳＤ２、ＣＲＸ、ＢＬＩＭＰ１、ＮＥＵＲＯＤ１、ＲＣＶＲＮ、ＴＵＢＢ３、及びＣＤ１７１／Ｌ１ＣＡＭからなる群から選択される１つ又は複数のマーカーを発現する、請求項２７に記載の方法。
【請求項47】
前記ＰＲＰは、ＴＲＹＰ１、ＣＲＡＬＢＰ、ＢＥＳＴ１、Ｋｉ６７、ＭＩＴＦ、ＰＭＥＬ１７、ＰＡＸ６、ＣＨＸ１０、及び／又はＯｎｅｃｕｔ１を発現しないか、又は本質的に発現しない、請求項２７に記載の方法。
【請求項48】
前記精製済ＰＲＰ集団中の細胞の１５％、１０％又は５％未満は、ＰＡＸ６を発現する、請求項３５～４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項49】
請求項２７に従って製造されたＰＲＰと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項50】
ＰＲＰの集団を製造する方法であって、
（ａ）請求項１～２４のいずれか一項に記載のＮＲＰの出発集団を得ること、
（ｂ）前記ＮＲＰを、ＲＭ培地で凝集体として培養すること、
及び
（ｃ）前記ＮＲＰを、ＰＲＰの集団を製造するのに十分な期間にわたり、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤をさらに含むＲＭ培地又はＰＲＰ成熟培地（ＰＭ）でさらに培養すること
を含む方法。
（ａ）請求項１～２４のいずれか一項に記載のＮＲＰの出発集団を得ること、
（ｂ）前記ＮＲＰを、ＲＭ培地で凝集体として培養すること、
及び
（ｃ）前記ＮＲＰを、ＰＲＰの集団を製造するのに十分な期間にわたり、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤をさらに含むＲＭ培地又はＰＲＰ成熟培地（ＰＭ）でさらに培養すること
を含む方法。
【請求項51】
前記細胞の少なくとも７０％は、工程（ｂ）の前に、ＰＡＸ６及びＣＨＸ１０に関して陽性である、請求項５０に記載の方法。
【請求項52】
前記ＮＲＰを、γ－セクレターゼ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤の存在下で凝集体として培養する、請求項５０に記載の方法。
【請求項53】
前記ＰＭは、γ－セクレターゼ阻害剤をさらに含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項54】
前記ＰＭは、ＭＥＫ阻害剤をさらに含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項55】
前記ＰＲＰを、ＰＭ培地中で本質的に単一の細胞に解離させることをさらに含む請求項５０に記載の方法。
【請求項56】
前記ＰＲＰを、ＰＭ培地で付着性細胞として培養する、請求項５５に記載の方法。
【請求項57】
ＣＤ１７１、ＳＵＳＤ２、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）、ＣＤ５７（ＬＡＭＰ－３）、ＣＤ８１、ＣＤ１１１（ネクチン１）、ＣＤ１３３、ＣＤ１４７、ＣＤ１８４（ＣＸＣＲ４）、ＣＤ２００、ＣＤ２３０、ＣＤ２７６、ＣＤ２９８、ＣＤ３４４（フリズルド）、ＰＳＡ－ＮＣＡＭ、及び／若しくはＰＴＫ７に関して陽性である細胞を選択することにより、並びに／又はＣＤ９、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ３４０、ポドプラニンＣＤ２９、ＣＤ６３、及び／若しくはＣＤ２９８に関して陽性である細胞を除去することにより、ＰＲＰを富化させることをさらに含む請求項５５に記載の方法。
【請求項58】
前記細胞の少なくとも９０％は、ＴＵＢＢ３に関して陽性であり、及び／又は前記細胞の少なくとも７０％は、ＲＣＶＲＮに関して陽性である、請求項５７に記載の方法。
【請求項59】
請求項５０に従って製造されたＰＲＰと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項60】
眼胞（ＯＶ）の集団を製造する方法であって、
（ａ）請求項５０に記載のＰＲＰの出発集団を得ること、
及び
（ｂ）前記ＰＲＰを、ＯＶの集団を製造するのに十分な期間にわたり、ＲＭ培地又はＰＭ培地で懸濁凝集体としてさらに培養すること
を含む方法。
（ａ）請求項５０に記載のＰＲＰの出発集団を得ること、
及び
（ｂ）前記ＰＲＰを、ＯＶの集団を製造するのに十分な期間にわたり、ＲＭ培地又はＰＭ培地で懸濁凝集体としてさらに培養すること
を含む方法。
【請求項61】
前記ＲＭ培地又はＰＭ培地は、γ－セクレターゼ阻害剤を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項62】
前記ＰＭ培地は、ＣＤＫ４／６阻害剤をさらに含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項63】
前記ＯＶの集団中の細胞の少なくとも５０％は、ＶＳＸ２を発現する、請求項６０に記載の方法。
【請求項64】
前記ＯＶの集団中の細胞の少なくとも２０％は、ＲＣＶＲＮを発現する、請求項６０に記載の方法。
【請求項65】
前記ＯＶは、ガンマ－シヌクレイン（ＳＮＣＧ）、オプシン、ＲＣＶＲＮ、及びロドプシンを発現する、請求項６０に記載の方法。
【請求項66】
請求項６０に従って製造されたＯＶと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項67】
ＮＲＰ集団を含む組成物であって、前記ＮＲＰ集団中の細胞の少なくとも９０％は、ＰＡＸ６を発現し、前記ＮＲＰ集団中の細胞の少なくとも９０％は、ＰＭＥＬ１７を発現し、及び／又は前記ＮＲＰ集団中の細胞の少なくとも７０％は、ＶＳＸ２を発現する、組成物。
【請求項68】
前記ＮＲＰ集団中の細胞の少なくとも９５％は、ＰＡＸ６を発現し、前記ＮＲＰ集団中の細胞の少なくとも９０％は、ＰＭＥＬ１７を発現し、及び／又は前記ＮＲＰ集団中の細胞の少なくとも７５％は、ＶＳＸ２を発現する、請求項６７に記載の組成物。
【請求項69】
前記ＮＲＰ集団中の細胞の少なくとも９５％は、ＰＡＸ６を発現し、前記ＮＲＰ集団中の細胞の少なくとも９０％は、ＰＭＥＬ１７を発現し、及び前記ＮＲＰ集団中の細胞の少なくとも７５％は、ＶＳＸ２を発現する、請求項６７に記載の組成物。
【請求項70】
前記ＮＲＰ集団中の細胞は、Ｋｉ６７をさらに発現する、請求項７１に記載の組成物。
【請求項71】
ＰＲＰ集団を含む組成物であって、前記ＰＲＰ集団中の細胞の少なくとも９０％は、ＴＵＢＢ３を発現し、前記ＰＲＰ細胞集団中の細胞の少なくとも５０％は、ＲＣＶＲＮを発現し、及び／又は前記ＰＲＰ集団中の細胞の１５％未満は、ＰＡＸ６を発現する、組成物。
【請求項72】
前記ＰＲＰ集団中の細胞の少なくとも７０％は、ＲＣＶＲＮを発現する、請求項６７に記載の組成物。
【請求項73】
前記ＰＲＰ集団中の細胞の１０％又は５％未満は、ＰＡＸ６を発現する、請求項６７に記載の組成物。
【請求項74】
前記ＰＲＰ集団中の細胞の少なくとも９０％は、ＴＵＢＢ３を発現し、前記ＰＲＰ細胞集団中の細胞の少なくとも５０％は、ＲＣＶＲＮを発現し、及び前記ＰＲＰ集団中の細胞の１５％未満は、ＰＡＸ６を発現する、請求項６７に記載の組成物。
【請求項75】
前記ＰＲＰ集団中の細胞の少なくとも９０％は、ＴＵＢＢ３を発現し、前記ＰＲＰ細胞集団中の細胞の少なくとも７０％は、ＲＣＶＲＮを発現し、及び／又は前記ＰＲＰ集団中の細胞の５％未満は、ＰＡＸ６を発現する、請求項６７に記載の組成物。
【請求項76】
前記ＰＲＰは、ＯＴＸ２、ＩＲＢＰ、ＳＵＳＤ２、ＣＲＸ、ＢＬＩＭＰ１、ＮＥＵＲＯＤ１、ＲＣＶＲＮ、ＴＵＢＢ３、及びＣＤ１７１／Ｌ１ＣＡＭからなる群から選択される１種又は複数種のマーカーを発現する、請求項６７～７５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項77】
前記ＰＲＰは、ＴＲＹＰ１、ＣＲＡＬＢＰ、ＢＥＳＴ１、Ｋｉ６７、ＭＩＴＦ、及び／又はＰＭＥＬ１７を発現しないか、又は本質的に発現しない、請求項７６に記載の組成物。
【請求項78】
ＯＶの集団を含む組成物であって、前記細胞の少なくとも５０％は、ＶＳＸ２を発現し、及び／又は前記細胞の少なくとも２０％は、ＲＣＶＲＮを発現する、組成物。
【請求項79】
前記細胞の少なくとも６５％は、ＶＳＸ２を発現し、及び／又は前記細胞の少なくとも３０％は、ＲＣＶＲＮを発現する、請求項７８に記載の組成物。
【請求項80】
前記細胞の少なくとも６５％は、ＶＳＸ２を発現し、及び前記細胞の少なくとも３０％は、ＲＣＶＲＮを発現する、請求項７８に記載の組成物。
【請求項81】
対象における網膜ニューロンの損傷又は変性を処置する方法であって、前記対象の目に、請求項４２～７１のいずれか一項に記載の組成物の有効な量を投与することを含む方法。
【請求項82】
前記網膜ニューロンは、光受容体である、請求項８１に記載の方法。
【請求項83】
ＰＲＰ細胞の富化集団を得る方法であって、
ａ）ＰＲＰ細胞を含む出発細胞集団を得ること、
並びに
ｂ）ＣＤ１７１、ＳＵＳＤ２、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）、ＣＤ５７（ＬＡＭＰ－３）、ＣＤ８１、ＣＤ１１１（ネクチン１）、ＣＤ１３３、ＣＤ１４７、ＣＤ１８４（ＣＸＣＲ４）、ＣＤ２００、ＣＤ２３０、ＣＤ２７６、ＣＤ２９８、ＣＤ３４４（フリズルド）、ＰＳＡ－ＮＣＡＭ、及び／若しくはＰＴＫ７に関して陽性である細胞を選択することにより、並びに／又はＣＤ９、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ３４０、ポドプラニン、ＣＤ２９、ＣＤ６３、及び／若しくはＣＤ２９８に関して陽性である細胞をそこから除去することにより、ＰＲＰ細胞に関して前記出発細胞集団を富化させ、それにより、前記出発細胞集団と比較して、ＰＲＰ細胞が富化されているＰＲＰ富化細胞集団を得ること
を含む方法。
ａ）ＰＲＰ細胞を含む出発細胞集団を得ること、
並びに
ｂ）ＣＤ１７１、ＳＵＳＤ２、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）、ＣＤ５７（ＬＡＭＰ－３）、ＣＤ８１、ＣＤ１１１（ネクチン１）、ＣＤ１３３、ＣＤ１４７、ＣＤ１８４（ＣＸＣＲ４）、ＣＤ２００、ＣＤ２３０、ＣＤ２７６、ＣＤ２９８、ＣＤ３４４（フリズルド）、ＰＳＡ－ＮＣＡＭ、及び／若しくはＰＴＫ７に関して陽性である細胞を選択することにより、並びに／又はＣＤ９、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ３４０、ポドプラニン、ＣＤ２９、ＣＤ６３、及び／若しくはＣＤ２９８に関して陽性である細胞をそこから除去することにより、ＰＲＰ細胞に関して前記出発細胞集団を富化させ、それにより、前記出発細胞集団と比較して、ＰＲＰ細胞が富化されているＰＲＰ富化細胞集団を得ること
を含む方法。
【請求項84】
前記ＰＲＰ富化集団中の前記ＰＲＰ細胞の富化のレベルを決定することをさらに含む請求項８３に記載の方法。
【請求項85】
前記富化のレベルを、ＴＵＢＢ３、ＲＣＶＲＮ、ＯＴＸ２、ＩＲＢＰ、ＳＵＳＤ２、ＣＲＸ、ＢＬＩＭＰ１、ＮＥＵＲＯＤ１、及びＣＤ１７１／Ｌ１ＣＡＭからなる群から選択される細胞マーカーの使用により決定する、請求項８４に記載の方法。
【請求項86】
前記ＰＲＰ富化細胞集団は、ＲＣＶＲＮ選別により決定した場合に、前記出発細胞集団と比較してＰＲＰ細胞が富化されている、請求項８３に記載の方法。
【請求項87】
前記ＰＲＰ富化集団は、少なくとも５０％のＰＲＰ細胞である、請求項８６に記載の方法。
【請求項88】
前記ＰＲＰ富化集団は、少なくとも７０％のＰＲＰ細胞である、請求項８６に記載の方法。
【請求項89】
前記ＰＲＰ富化集団は、本質的に純粋なＰＲＰ細胞である、請求項８６に記載の方法。
【請求項90】
前記ＰＲＰ細胞は、ヒトＰＲＰ細胞である、請求項８３に記載の方法。
【請求項91】
前記出発細胞集団は、ｉＰＳＣから調製されている、請求項８３に記載の方法。
【請求項92】
選択すること及び／又は除去することを、磁気ビーズに基づく選別又は蛍光に基づく選別により実施する、請求項８３に記載の方法。
【請求項93】
前記方法は、ＣＤ１７１、ＳＵＳＤ２、ＣＤ１１１、ＣＤ１３３、ＣＤ２３０、及び／又はＣＤ３４４に関して陽性である細胞を選択することを含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項94】
ＮＲＰ細胞製品の製造中に品質管理を実施する方法であって、ＰＡＸ６、ＣＨＸ１０（ＶＳＸ２）、Ｋｉ６７、及びＰＭＥＬからなる群から選択される細胞マーカーの発現を検出することを含む方法。
【請求項95】
前記細胞の少なくとも７０％は、ＰＡＸ６、ＣＨＸ１０（ＶＳＸ２）、Ｋｉ６７、及びＰＭＥＬに関して陽性である、請求項９４に記載の方法。
【請求項96】
前記細胞の少なくとも９０％は、ＰＡＸ６、ＣＨＸ１０（ＶＳＸ２）、Ｋｉ６７、及びＰＭＥＬに関して陽性である、請求項９４に記載の方法。
【請求項97】
ＰＲＰ細胞製品の製造中に品質管理を実施する方法であって、ＰＡＸ６、ＯＮＥＣＵＴ１、ＨＮＣＨＦ６、ＣＨＸ１０、及びＫｉ６７からなる群から選択されるオフターゲット細胞マーカーの発現を検出することを含む方法。
【請求項98】
オフターゲット細胞は、ＰＡＸ６及びＩＳＬ１に関して陽性である、請求項１に記載の方法。
【請求項99】
品質管理を通過するＰＲＰ細胞製品は、１０％又は５％未満のＰＡＸ６陽性細胞を含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項100】
品質管理を通過するＰＲＰ細胞製品は、１０％未満のＰＡＸ６陽性細胞、０．０５％未満のＫｉ６７陽性細胞、３０％未満のＣＨＸ１０陽性細胞、及び／又は２％未満のＯＮＥＣＵＴ１陽性細胞を含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項101】
品質管理を通過するＰＲＰ細胞製品は、５％未満のＰＡＸ６陽性細胞、０．０４％未満のＫｉ６７陽性細胞、１５％未満のＣＨＸ１０陽性細胞、及び／又は１％未満のＯＮＥＣＵＴ１陽性細胞を含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項102】
品質管理を通過するＰＲＰ細胞製品は、５％未満のＰＡＸ６陽性細胞、０．０４％未満のＫｉ６７陽性細胞、１５％未満のＣＨＸ１０陽性細胞、及び１％未満のＯＮＥＣＵＴ１陽性細胞を含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項103】
ＯＶ細胞製品の製造中に品質管理を実施する方法であって、ＲＣＶＲＮ、ＣＨＸ１０、ＰＡＸ６、及びＫｉ６７からなる群から選択される１種又は複数種の細胞マーカーの発現を検出することを含む方法。
【請求項104】
前記細胞マーカーは、ＲＣＶＲＮ及びＣＨＸ１０である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項105】
前記ＯＶ細胞製品中の細胞の少なくとも６０％は、ＲＣＶＲＮに関して陽性であり、前記ＯＶ細胞製品中の細胞の少なくとも３０％は、ＣＨＸ１０に関して陽性である、請求項１０４に記載の方法。
【請求項106】
前記細胞マーカーは、ＰＡＸ６及びＫｉ６７である、請求項１０３に記載の方法。
【請求項107】
ＴＹＲＰ１の非存在を検出することをさらに含む請求項１０３～１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項108】
ＭＩＴＦ、ＣＲＡＬＢＰ、ＢＥＳＴ１、ＯＴＸ２、ＣＲＸ、ＢＬＩＭＰ１、ＮＥＵＲＯＤ１、ＴＵＢＢ３、ＯＮＥＣＵＴ１、及びＣＤ１７１／Ｌ１ＣＡＭからなる群から選択される１種又は複数種のマーカーの発現を検出することをさらに含む請求項１０７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０１８年４月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／６６０，８９９号明細書の利益を主張しており、当該明細書は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本開示は、一般に幹細胞生物学の分野に関する。より具体的には、本開示は、多能性幹細胞を様々な眼球細胞（例えば、光受容体前駆体（ＰＲＰ）細胞）に分化させる方法に関する。
【背景技術】
【0003】
網膜は、目の内面を覆う感光性の組織層である。網膜中の光受容体細胞（杆体又は錐体のいずれか）は、光に直接反応し、化学的な光シグナルを、神経インパルスを引き起こす電気的事象に変換する。光受容体細胞の機能の障害又は完全な喪失は、網膜疾患（例えば、遺伝性網膜変性及び加齢黄斑変性症（ＡＭＤ））での不可逆的失明の原因の一つである。緑内障における網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の死もまた、不可逆的な失明をもたらす。変性した網膜の救出は大きな課題であり、細胞の置き換えは、最も有望なアプローチの一つである（Ｐｅａｒｓｏｎら、２０１２年）。
【0004】
２００６年でのマウス成体の体細胞からの人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の製造は、幹細胞研究、創薬、疾患のモデル、及び細胞治療に重要なブレイクスルーをもたらした（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００６）。ヒトｉＰＳＣは、特殊な細胞型に分化し得、再生医療のための患者特異的な免疫適合細胞の可能性を有する（Ｙｕら、２００７年）。ヒト多能性幹細胞、胚幹（ＥＳ）細胞、及びｉＰＳＣの使用は、ヒト網膜変性疾患の処置に新たな道を開く。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
多能性状態を保持しつつ培養で無制限に増殖する能力を有するヒトＥＳ（ｈＥＳ）細胞及びヒトｉＰＳ（ｈｉＰＳ）細胞は、組織移植のための光受容体細胞の無尽蔵の供給源として使用される可能性がある（Ｃｏｍｙｎら、２０１０年）。胚様体形成後のｈＥＳ細胞の神経網膜への関与の可能性、及び光受容体マーカーを発現する細胞にさらに分化する能力を実証する収束データが相次いでいる（Ｚｈｏｎｇら、２０１４年；Ｍｅｙｅｒら、２００９年）。既に開発されている様々な方法は、実際の進歩ではあるが、多能性幹細胞の高度に特殊な細胞型への分化と一般に関連する欠点を依然として抱えている。ｈＥＳ細胞又はｈｉＰＳ細胞の光受容体指向性分化のためのこれらのプロトコルは、いくつかの工程、いくつかの分子の追加を必要としており、どちらかと言えば非効率的である。光受容体細胞系統への分化のための現在の方法は、胚様体の形成を必要としており、及び／又は培養物からの網膜細胞の手動による選択を必要としている。そのため、当該技術分野では、ある特定のヒト神経上皮系細胞（特に光受容体前駆体（ＰＲＰ）細胞）の実質的に純粋な培養物を得るための効率的で信頼性の高い大規模な方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本実施形態は、眼球細胞を製造するための方法及び組成物、並びにそれらの使用を提供する。第１の実施形態では、神経網膜前駆細胞（ＮＲＰ）の集団を製造する方法であって、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の出発集団を得ること、このｉＰＳＣを網膜誘導培地（ＲＩＭ）で培養して、この細胞の前部神経外胚葉細胞への分化を開始させること、この細胞を、ＢＭＰ阻害剤を含む第１の網膜分化培地（ＲＤ１）でさらに培養して、この細胞を前部神経外胚葉細胞にさらに分化させること、前部神経外胚葉細胞を、ＢＭＰ阻害剤を本質的に含まない第２の網膜分化培地（ＲＤ２）で培養することにより、この細胞の網膜分化を誘導して、網膜前駆細胞（ＲＰＣ）を形成すること、及びこのＲＰＣを網膜成熟（ＲＭ）培地で培養して、ＮＲＰを製造することを含む方法が提供される。さらなる実施形態では、ＮＲＰの集団を製造する方法であって、ヒトｉＰＳＣの出発集団を得ること、この細胞を、ＢＭＰ阻害剤を含むＲＤ１で培養して、この細胞を前部神経外胚葉細胞にさらに分化させること、前部神経外胚葉細胞を、ＢＭＰ阻害剤を本質的に含まないＲＤ２で培養することにより、この細胞の網膜分化を誘導して、ＲＰＣを形成すること、及びこのＲＰＣをＲＭ培地で培養して、ＮＲＰを製造することを含む方法が提供される。特定の態様では、培養することは、付着性２次元培養（ａｄｈｅｒｅｎｔ ２－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ）とさらに定義される。
【0007】
一部の態様では、この方法は、細胞をＲＤ１で培養する前に、ｉＰＳＣを網膜誘導培地（ＲＩＭ）で培養して、この細胞の前部神経外胚葉細胞への分化を開始させることをさらに含む。ある特定の態様では、この方法は、ＮＲＰの集団を、γ－セクレターゼ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤を含む培地で懸濁凝集体として培養することをさらに含む。
【0008】
上記実施形態の一部の態様では、この方法は、ＮＲＰを、ＮＲＰの集団を製造するのに十分な期間にわたり、γ－セクレターゼ阻害剤及びＦＧＦを含むＦＤＳＣ培地で培養することをさらに含む。
【0009】
ある特定の態様では、ＲＩＭは、ＢＭＰ阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤、及び／又はＩＧＦ－１を含む。ある特定の態様では、ＲＩＭは、ＢＭＰ阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤、Ｗｎｔ阻害剤、及び／又はＩＧＦ－１を含む。特定の態様では、ＲＩＭは、アクチビンＡを本質的に含まない。特定の態様では、ＲＩＭは、ＣＫＩ－７等のＷｎｔ阻害剤を本質的に含まない。一部の態様では、ｉＰＳＣをＲＩＭで培養することは、１～３日（例えば、１、２、又は３日）にわたる。
【0010】
一部の態様では、ＲＤ１培地は、ＴＧＦβ阻害剤、Ｗｎｔ阻害剤、ＩＧＦ－１、及びＭＥＫ阻害剤をさらに含む。ある特定の態様では、ＲＤ１培地は、ＴＧＦβ阻害剤、Ｗｎｔ阻害剤、ＩＧＦ－１、及びＭＥＫ阻害剤をさらに含む。ある特定の態様では、ＲＤ１培地は、ＣＫＩ－７を含まない。一部の態様では、ＲＤ１で培養することは、１～３日（例えば、１、２、又は３日）にわたる。
【0011】
一部の態様では、ＲＤ２培地は、ＴＧＦβ阻害剤、Ｗｎｔ阻害剤、ＩＧＦ－１、及びＭＥＫ阻害剤を含む。ある特定の態様では、前部神経外胚葉細胞のＶＳＸ２発現の増加を、分化能のために測定する。特定の態様では、ＲＤ２培地は、ＬＤＮ１９３１８９を本質的に含まない。一部の態様では、ＲＤ２で培養することは、５～９日（例えば、５、６、７、８、又は９日）にわたる。ある特定の態様では、ＲＤ２での培養後に、細胞の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％は、ＰＭＥＬ１７を発現する。ある特定の態様では、ＲＤ２での培養後に、細胞の少なくとも３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％は、ＶＳＸ２を発現する。特定の態様では、ＲＰＣは、ＰＡＸ６、ＭＩＴＦ、及び／又はＰＭＥＬを発現する。一部の態様では、ＲＰＣは、ＴＲＹＰ１、ＣＲＡＬＢＰ、及び／又はＢＥＳＴ１を発現しないか、又は本質的に発現しない。
【0012】
一部の態様では、ｉＰＳＣを得ることからＲＭで培養することまでの培養することは、付着性２次元培養とさらに定義される。一部の態様では、ｉＰＳＣを得ることからＲＭで培養することまでの培養することは、凝集体を本質的に含まない。
【0013】
一部の態様では、ＲＭ培地は、ニコチンアミド及びアスコルビン酸を含む。ある特定の態様では、ＲＭ培地は、ＦＧＦ及びＴＧＦβ阻害剤をさらに含む。一部の態様では、ＲＭ培地は、ＦＧＦ、ＳＢ４３１５４２、ＣＫＩ－７、及びＩＧＦ－１をさらに含む。一部の態様では、ＲＭ培地は、γ－セクレターゼ阻害剤をさらに含む。ある特定の態様では、ＲＭ培地で培養してＮＲＰを製造することは、３～７日にわたる。一部の態様では、ＮＲＰは、ＰＡＸ６及びＶＳＸ２を発現する。ある特定の態様では、ＲＭ培地で培養してＮＲＰを製造した後に、細胞の少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％は、ＰＡＸ６及びＶＳＸ２を発現する。特定の態様では、ＲＰＣは、ＰＡＸ６、ＭＩＴＦ、及び／又はＰＭＥＬを発現する。
【0014】
別の実施形態では、光受容体前駆体細胞（ＰＲＰ）の集団を製造する方法であって、実施形態に係るＮＲＰの出発集団を得ること、及びこのＮＲＰを、ＰＲＰの集団を製造するのに十分な期間にわたり、γ－セクレターゼ阻害剤及びＦＧＦを含む光受容体前駆体誘導培地（ＦＤＳＣ）培地でさらに培養することを含む方法が提供される。一部の態様では、培養することは、付着性２次元培養とさらに定義される。
【0015】
一部の態様では、ＮＲＰを、ＰＲＰの集団を製造するのに十分な期間にわたり、γ－セクレターゼ阻害剤及びＦＧＦを含むＦＤＳＣ培地で培養することは、１０～２０、２０～３０、３０～４０、又は４０～５０日（例えば、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、若しくは１９日、又はより多い）にわたる。ＦＤＳＣは、ＴＧＦβ阻害剤及びＷＮＴ阻害剤をさらに含む。一部の態様では、ＲＭ培地は、ＦＧＦ及びＴＧＦβ阻害剤をさらに含む。
【0016】
一部の態様では、ＰＲＰを製造するための方法は、ＰＲＰの集団を、ニコチンアミドを含むＲＭ培地又は光受容体成熟（ＰＭ）培地で懸濁凝集体として成熟させ、それにより成熟ＰＲＰ凝集体の集団を製造することをさらに含む。一部の態様では、成熟させることは、６～１０日（例えば、６、７、８、９、又は１０日）にわたる。追加の態様では、この方法は、成熟ＰＲＰ凝集体を凍結保存することをさらに含む。一部の態様では、ＰＭ培地は、γ－セクレターゼ阻害剤をさらに含む。
【0017】
ある特定の態様では、ＰＲＰを製造するための方法は、成熟ＰＲＰ凝集体を、ＰＭ培地中で本質的に単一の細胞に解離させることをさらに含む。一部の態様では、この方法は、成熟ＰＲＰを単一の細胞として凍結保存することを含む。
【0018】
一部の態様では、ＰＲＰを、５～１２日（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２日）にわたり、ＰＭ培地で付着細胞として培養する。ある特定の態様では、ＰＭ培地は、γ－セクレターゼ阻害剤をさらに含む。ある特定の態様では、解離した細胞は再凝集している。一部の態様では、ＰＭ培地は、ＣＤＫ阻害剤をさらに含む。特定の態様では、細胞の少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、９０％、９５％、又は１００％は、リカバリン（Recoverin）（ＲＣＶＲＮ）を発現する。
【0019】
一部の態様では、この方法は、ＰＲＰを精製することをさらに含む。ある特定の態様では、精製することは、ＣＤ１７１に関して陽性である細胞を選択し、それにより精製済ＰＲＰ細胞集団を得ることを含む。一部の態様では、精製することは、ＣＤ１７１及び／又はＳＵＳＤ２に関して陽性である細胞を選択し、それにより精製済ＰＲＰ細胞集団を得ることを含む。特定の態様では、精製することは、ＣＤ１７１、ＳＵＳＤ２、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）、ＣＤ５７（ＬＡＭＰ－３）、ＣＤ８１、ＣＤ１１１（ネクチン１）、ＣＤ１３３、ＣＤ１４７、ＣＤ１８４（ＣＸＣＲ４）、ＣＤ２００、ＣＤ２３０、ＣＤ２７６、ＣＤ２９８、ＣＤ３４４（フリズルド（Ｆｒｉｚｚｌｅｄ））、ＰＳＡ－ＮＣＡＭ、及び／又はＰＴＫ７に関して陽性である細胞を選択し、それにより精製済ＰＲＰ細胞集団を得ることを含む。具体的な態様では、精製することは、ＣＤ１１１、ＣＤ１３３、ＣＤ２３０、及び／又はＣＤ３４４に関して陽性である細胞を選択し、それにより精製済ＰＲＰ細胞集団を得ることを含む。一部の態様では、精製することは、ＣＤ３４４に関して陽性である細胞を選択し、それにより精製済ＰＲＰ細胞集団を得ることを含む。一部の態様では、精製することを、６５日目又は７５日目に実施する。ある特定の態様では、精製することは、ＣＤ９、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ３４０、ポドプラニン、ＣＤ２９、ＣＤ６３、及びＣＤ２９８からなる群から選択されるマーカーの内の２つ以上に関して陽性の細胞の枯渇を含む。
【0020】
一部の態様では、精製済ＰＲＰ細胞集団中の細胞の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％は、クラスＩＩＩβ－チューブリン（ＴＵＢＢ３）を発現する。ある特定の態様では、精製済ＰＲＰ細胞集団中の細胞の少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％は、ＲＣＶＲＮを発現する。一部の態様では、精製済ＰＲＰ細胞集団中の細胞の少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％は、ＲＣＶＲＮを発現する。一部の態様では、ＰＲＰは、ＯＴＸ２、ＣＲＸ、ＢＬＩＭＰ１、ＮＥＵＲＯＤ１、ＲＣＶＲＮ、ＴＵＢＢ３、及びＣＤ１７１／Ｌ１ＣＡＭからなる群から選択される１種又は複数種のマーカーを発現する。ある特定の態様では、ＰＲＰは、ＴＲＹＰ１、ＣＲＡＬＢＰ、ＢＥＳＴ１、Ｋｉ６７、ＭＩＴＦ、及び／又はＰＭＥＬ１７を発現しないか、又は本質的に発現しない。一部の態様では、細胞は、ＰＡＸ６、ＣＨＸ１０（本明細書ではＶＳＸ２とも称される；両方の用語は、本明細書では互換的に使用されている）、及び／又はＯｎｅｃｕｔ１の発現が低いか、又は本質的に発現しない。特定の態様では、精製済ＰＲＰ集団中の細胞の１５％、１０％、又は５％未満（例えば、４％、３％、２％、又は１％未満）は、ＰＡＸ６を発現する。
【0021】
さらなる実施形態は、ＰＲＰの集団を製造する方法であって、実施形態に係るＮＲＰの出発集団を得ること、及びＮＲＰを、ＰＲＰの集団を製造するのに十分な期間にわたり、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤を含むＰＲＰ成熟培地（ＰＭ）でさらに培養することを含む方法を提供する。
【0022】
一部の態様では、細胞の少なくとも７０％（例えば、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％）は、ＰＭ培地での培養の前に、ＰＡＸ６及びＣＨＸ１０に関して陽性である。ある特定の態様では、ＮＲＰを、γ－セクレターゼ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤の存在下で凝集体として培養する。一部の態様では、ＰＭは、γ－セクレターゼ阻害剤をさらに含む。特定の態様では、ＰＭは、ＭＥＫ阻害剤をさらに含む。
【0023】
追加の態様では、この方法は、ＰＲＰを、ＰＭ培地中で本質的に単一の細胞に解離させることをさらに含む。一部の態様では、ＰＲＰを、ＰＭ培地で付着細胞として培養する。
【0024】
一部の態様では、この方法は、ＣＤ１７１、ＳＵＳＤ２、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）、ＣＤ５７（ＬＡＭＰ－３）、ＣＤ８１、ＣＤ１１１（ネクチン１）、ＣＤ１３３、ＣＤ１４７、ＣＤ１８４（ＣＸＣＲ４）、ＣＤ２００、ＣＤ２３０、ＣＤ２７６、ＣＤ２９８、ＣＤ３４４（フリズルド）、ＰＳＡ－ＮＣＡＭ、及び／若しくはＰＴＫ７に関して陽性である細胞を選択することにより、並びに／又はＣＤ９、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ３４０、ポドプラニンＣＤ２９、ＣＤ６３、及び／若しくはＣＤ２９８に関して陽性である細胞を除去することにより、ＰＲＰを富化させることをさらに含む。一部の態様では、細胞の少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％）は、ＴＵＢＢ３に関して陽性であり、及び／又は細胞の少なくとも７０％（例えば、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは１００％）は、ＲＣＶＲＮに関して陽性である。
【0025】
さらに別の実施形態では、眼胞（ＯＶ）の集団を製造する方法であって、実施形態に係るＰＲＰの出発集団を得ること、及びこのＰＲＰを、ＯＶの集団を製造するのに十分な期間にわたり、ＲＭ培地又はＰＲＰ成熟（ＰＭ）培地で懸濁凝集体としてさらに培養することを含む方法が提供される。
【0026】
一部の態様では、ＰＲＰを、ＯＶの集団を製造するのに十分な期間にわたり、ＲＭ培地又はＰＲＰ成熟（ＰＭ）培地で懸濁凝集体として培養することは、少なくとも２０日（例えば、少なくとも２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、又はより多くの日数）にわたる。一部の態様では、ＲＭ培地は、γ－セクレターゼ阻害剤をさらに含む。ある特定の態様では、ＲＭ培地は、ＦＧＦ及びＳＢ４３１５４２をさらに含む。一部の態様では、ＯＶの集団中の細胞の少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％は、ＶＳＸ２を発現する。一部の態様では、ＯＶの集団中の細胞の少なくとも１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、又はより多くは、ＲＣＶＲＮを発現する。一部の態様では、ＯＶは、ガンマ－シヌクレイン（ＳＮＣＧ）、オプシン、ＲＣＶＲＮ、及びロドプシンを発現する。ある特定の態様では、ＦＤＳＣは、ＴＧＦβ阻害剤及びＷｎｔ阻害剤をさらに含む。
【0027】
一部の態様では、ＮＲＰを、ＰＲＰの集団を製造するのに十分な期間にわたり、γ－セクレターゼ阻害剤及びＦＧＦを含むＲＭ培地で培養することは、１０～２０日（例えば、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又はより多くの日数）にわたる。一部の態様では、ＰＲＰの集団中の細胞の少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又はより多くは、ＴＵＢＢ３を発現する。一部の態様では、ＰＲＰの集団中の細胞の少なくとも３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％は、ＲＣＶＲＮを発現する。
【0028】
追加の態様では、この方法は、ＮＲＰの集団を、γ－セクレターゼ阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤を含む培地で懸濁凝集体として培養することをさらに含む。一部の態様では、この培地は、アスコルビン酸及びニコチンアミドをさらに含む。ある特定の態様では、ＮＲＰの集団中の細胞の少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％は、ＶＳＸ２を発現する。
【0029】
別の実施形態では、実施形態に従って製造されたＰＲＰ、実施形態に従って製造されたＯＶ、又は実施形態に従って製造されたＮＲＰと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が提供される。
【0030】
さらなる実施形態は、対象における網膜ニューロンの損傷又は変性を処置する方法であって、この対象の目に、実施形態の医薬組成物（例えば、本明細書で製造されたＰＲＰ、ＯＶ、又はＮＲＰ）の有効な量を投与することを含む方法を提供する。一部の態様では、網膜ニューロンは、光受容体である。
【0031】
本明細書の方法により製造された眼球細胞（例えばＰＲＰ細胞）を、光受容体細胞のための当該技術分野で現在知られている任意の方法及び用途で使用することができる。例えば、化合物を評価する方法であって、光受容体細胞へのこの化合物の薬理学的特性又は毒性学的特性をアッセイすることを含む方法を提供することができる。ＰＲＰ細胞への効果に関して化合物を評価する方法であって、ａ）本明細書で提供されているＰＲＰ細胞と、この化合物とを接触させること、及びｂ）このＰＲＰ細胞へのこの化合物の効果をアッセイすることを含む方法も提供することができる。
【0032】
上記実施形態のある特定の態様では、ＲＩＭは、ＬＤＮ１９３１８９、ＳＢ４３１５４２、ＣＫＩ－７、及びＩＧＦ－１を含む。一部の態様では、ＲＤ１培地は、ＴＧＦβ阻害剤、Ｗｎｔ阻害剤、ＩＧＦ－１、及びＭＥＫ阻害剤をさらに含む。ある特定の態様では、ＲＤ２培地は、ＴＧＦβ阻害剤、Ｗｎｔ阻害剤、ＩＧＦ－１、及びＭＥＫ阻害剤を含む。一部の態様では、ＢＭＰ阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９である。一部の態様では、ＴＧＦβは、Ｉ型受容体アクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ５）阻害剤としてさらに定義される。ある特定の態様では、ＴＧＦβ阻害剤は、ＳＢ４３１５４２、６ＳＢ５２５３３４、ＳＢ－５０５１２４、Ｌｅｆｔｙ、Ａ ８３－０１、Ｄ ４４７６、ＧＷ ７８８３８８、ＬＹ ３６４８４７、Ｒ ２６８７１２、又はＲｅｐＳｏｘである。一部の態様では、ＷＮＴ阻害剤は、ＣＫＩ－７、ＩＷＰ２、ＩＷＰ４、ＰＮＵ ７４６５４ ＸＡＶ９３９、ＴＡＫ ７１５、ＤＫＫ１、又はＳＦＲＰ１である。特定の態様では、ＭＥＫ阻害剤は、ＰＤ０３２５９０１である。一部の態様では、ＲＤ２培地は、ＳＢ４３１５４２、ＣＫＩ－７、ＩＧＦ－１、及びＰＤ０３２５９０１を含む。具体的な態様では、ＲＭ培地は、ＦＧＦ、ＳＢ４３１５４２、ＣＫＩ－７、及びＩＧＦ－１をさらに含む。一部の態様では、γ－セクレターゼ阻害剤は、ＤＡＰＴ、ベガスエステイト（Ｂｅｇａｃｅｓｔａｔ）、コンパウンドＷ、ＪＬＫ６、Ｌ－６８５，４８５、フルリザン（Ｆｌｕｒｉｚａｎ）、ＤＢＺ、ＭＲＫ５６０、ＰＦ３０８４０１４臭化水素酸塩、又はＢＭＳ２９９８９７である。一部の態様では、サイクリング依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤は、ＣＤＫ４／６阻害剤であり、例えばＰＤ０３３２２９１（パルボシクリブ）である。
【0033】
別の実施形態では、ＮＲＰ集団を含む組成物であって、このＮＲＰ集団中の細胞の少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）は、ＰＡＸ６を発現し、このＮＲＰ集団中の細胞の少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％）は、ＰＭＥＬ１７を発現し、及び／又はこのＮＲＰ集団中の細胞の少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは１００％は、ＶＳＸ２を発現する、組成物が提供される。一部の態様では、ＮＲＰ集団中の細胞の少なくとも９５％は、ＰＡＸ６を発現し、ＮＲＰ集団中の細胞の少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％）は、ＰＭＥＬ１７を発現し、及び／又はＮＲＰ集団中の細胞の少なくとも７５％は、ＶＳＸ２を発現する。ある特定の態様では、ＮＲＰ集団中の細胞の少なくとも９５％は、ＰＡＸ６を発現し、ＮＲＰ集団中の細胞の少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）は、ＰＭＥＬ１７を発現し、及びＮＲＰ集団中の細胞の少なくとも７５％は、ＶＳＸ２を発現する。一部の態様では、ＮＲＰ集団中の細胞は、Ｋｉ６７をさらに発現する。
【0034】
別の実施形態では、ＰＲＰ集団を含む組成物であって、このＰＲＰ集団中の細胞の少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、若しくは１００％）は、ＴＵＢＢ３を発現し、このＰＲＰ細胞集団中の細胞の少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは１００％は、ＲＣＶＲＮを発現し、及び／又はこのＰＲＰ集団中の細胞の１５％未満は、ＰＡＸ６を発現する、組成物が提供される。一部の態様では、ＰＲＰ集団中の細胞の少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％は、ＲＣＶＲＮを発現する。ある特定の態様では、ＰＲＰ集団中の細胞の１０％又は５％未満は、ＰＡＸ６を発現する。一部の態様では、ＰＲＰ集団中の細胞の少なくとも９０％は、ＴＵＢＢ３を発現し、ＰＲＰ細胞集団中の細胞の少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％は、ＲＣＶＲＮを発現し、及びＰＲＰ集団中の細胞の１５％未満は、ＰＡＸ６を発現する。一部の態様では、ＰＲＰ集団中の細胞の少なくとも９０％は、ＴＵＢＢ３を発現し、ＰＲＰ細胞集団中の細胞の少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは１００％は、ＲＣＶＲＮを発現し、及び／又はＰＲＰ集団中の細胞の５％未満は、ＰＡＸ６を発現する。ある特定の態様では、ＰＲＰは、ＯＴＸ２、ＩＲＢＰ、ＳＵＳＤ２、ＣＲＸ、ＢＬＩＭＰ１、ＮＥＵＲＯＤ１、ＲＣＶＲＮ、ＴＵＢＢ３、及びＣＤ１７１／Ｌ１ＣＡＭからなる群から選択される１種又は複数種のマーカーを発現する。一部の態様では、ＰＲＰは、ＴＲＹＰ１、ＣＲＡＬＢＰ、ＢＥＳＴ１、Ｋｉ６７、ＭＩＴＦ、及び／又はＰＭＥＬ１７を発現しないか、又は本質的に発現しない。
【0035】
さらなる実施形態は、ＯＶの集団を含む組成物であって、この細胞の少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは１００％は、ＶＳＸ２を発現し、及び／又はこの細胞の少なくとも２０％は、ＲＣＶＲＮを発現する、組成物を提供する。一部の態様では、細胞の少なくとも６５％は、ＶＳＸ２を発現し、及び／又は細胞の少なくとも３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、若しくは１００％は、ＲＣＶＲＮを発現する。ある特定の態様では、細胞の少なくとも６５％は、ＶＳＸ２を発現し、細胞の少なくとも３０％は、ＲＣＶＲＮを発現する。
【0036】
別の実施形態は、ＰＲＰ細胞の富化集団を得る方法であって、ＰＲＰ細胞を含む出発細胞集団を得ること、並びにＣＤ１７１、ＳＵＳＤ２、ＣＤ５６（ＮＣＡＭ）、ＣＤ５７（ＬＡＭＰ－３）、ＣＤ８１、ＣＤ１１１（ネクチン１）、ＣＤ１３３、ＣＤ１４７、ＣＤ１８４（ＣＸＣＲ４）、ＣＤ２００、ＣＤ２３０、ＣＤ２７６、ＣＤ２９８、ＣＤ３４４（フリズルド）、ＰＳＡ－ＮＣＡＭ、及び／若しくはＰＴＫ７に関して陽性である細胞を選択することにより、並びに／又はＣＤ９、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ３４０、ポドプラニン、ＣＤ２９、ＣＤ６３、及び／若しくはＣＤ２９８に関して陽性である細胞を除去することにより、ＰＲＰ細胞に関して前記出発細胞集団を富化させ、それにより、この出発細胞集団と比較して、ＰＲＰ細胞が富化されているＰＲＰ富化細胞集団を得ることを含む方法を提供する。一部の態様では、この方法は、前記ＰＲＰ富化集団中のＰＲＰ細胞の富化のレベルを決定することをさらに含む。一部の態様では、富化のレベルを、ＴＵＢＢ３、ＲＣＶＲＮ、ＯＴＸ２、ＩＲＢＰ、ＳＵＳＤ２、ＣＲＸ、ＢＬＩＭＰ１、ＮＥＵＲＯＤ１、及びＣＤ１７１／Ｌ１ＣＡＭからなる群から選択される細胞マーカーの使用により決定する。ある特定の態様では、ＰＲＰ富化細胞集団は、ＲＣＶＲＮ選別により決定した場合に、出発細胞集団と比較してＰＲＰ細胞が富化されている。一部の態様では、ＰＲＰ富化集団は、少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％のＰＲＰ細胞である。ある特定の態様では、ＰＲＰ富化集団は、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％のＰＲＰ細胞である。一部の態様では、ＰＲＰ富化集団は、本質的に純粋なＰＲＰ細胞である。特定の態様では、ＰＲＰ細胞は、ヒトＰＲＰ細胞である。一部の態様では、出発細胞集団は、ｉＰＳＣから調製されている。一部の態様では、選択すること及び／又は除去することを、磁気ビーズに基づく選別又は蛍光に基づく選別により実施する。一部の態様では、この方法は、ＣＤ１７１、ＳＵＳＤ２、ＣＤ１１１、ＣＤ１３３、ＣＤ２３０、及び／又はＣＤ３４４に関して陽性である細胞を選択することを含む。
【0037】
別の実施形態は、ＮＲＰ細胞製品の製造中に品質管理を実施する方法であって、ＰＡＸ６、ＣＨＸ１０（ＶＳＸ２）、Ｋｉ６７、及びＰＭＥＬからなる群から選択される細胞マーカーの発現を検出することを含む方法を提供する。一部の態様では、細胞の少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％は、ＰＡＸ６、ＣＨＸ１０（ＶＳＸ２）、Ｋｉ６７、及びＰＭＥＬに関して陽性である。ある特定の態様では、細胞の少なくとも９０％は、ＰＡＸ６、ＣＨＸ１０（ＶＳＸ２）、Ｋｉ６７、及びＰＭＥＬに関して陽性である。
【0038】
さらなる実施形態では、ＰＲＰ細胞製品の製造中に品質管理を実施する方法であって、ＰＡＸ６、ＯＮＥＣＵＴ１、ＨＮＣＨＦ６、ＣＨＸ１０、及びＫｉ６７からなる群から選択されるオフターゲット細胞マーカーの発現を検出することを含む方法が提供される。一部の態様では、オフターゲット細胞は、ＰＡＸ６及びＩＳＬ１に関して陽性である。一部の態様では、品質管理を通過するＰＲＰ細胞製品は、１０％又は５％未満のＰＡＸ６陽性細胞を含む。ある特定の態様では、品質管理を通過するＰＲＰ細胞製品は、１０％未満のＰＡＸ６陽性細胞、０．０５％未満のＫｉ６７陽性細胞、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％未満のＣＨＸ１０陽性細胞、及び／又は２％未満のＯＮＥＣＵＴ１陽性細胞を含む。一部の態様では、品質管理を通過するＰＲＰ細胞製品は、５％未満のＰＡＸ６陽性細胞、０．０４％未満のＫｉ６７陽性細胞、１５％未満のＣＨＸ１０陽性細胞、及び／又は１％未満のＯＮＥＣＵＴ１陽性細胞を含む。ある特定の態様では、品質管理を通過するＰＲＰ細胞製品は、５％未満のＰＡＸ６陽性細胞、０．０４％未満のＫｉ６７陽性細胞、１５％未満のＣＨＸ１０陽性細胞、及び１％未満のＯＮＥＣＵＴ１陽性細胞を含む。
【0039】
さらなる実施形態は、ＯＶ細胞製品の製造中に品質管理を実施する方法であって、ＲＣＶＲＮ、ＣＨＸ１０、ＰＡＸ６、及びＫｉ６７からなる群から選択される１種又は複数種の細胞マーカーの発現を検出することを含む方法を提供する。ある特定の態様では、細胞マーカーは、ＲＣＶＲＮ及びＣＨＸ１０である。特定の態様では、ＯＶ細胞製品中の細胞の少なくとも６０％は、ＲＣＶＲＮに関して陽性であり、ＯＶ細胞製品中の細胞の少なくとも３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は１００％は、ＣＨＸ１０に関して陽性である。一部の態様では、細胞マーカーは、ＰＡＸ６及びＫｉ６７である。一部の態様では、この方法は、ＴＹＲＰ１の非存在を検出することをさらに含む。一部の態様では、この方法は、ＭＩＴＦ、ＣＲＡＬＢＰ、ＢＥＳＴ１、ＯＴＸ２、ＣＲＸ、ＢＬＩＭＰ１、ＮＥＵＲＯＤ１、ＴＵＢＢ３、ＯＮＥＣＵＴ１、及びＣＤ１７１／Ｌ１ＣＡＭからなる群から選択される１種又は複数種のマーカーの発現を検出することをさらに含む。
【0040】
本開示の他の目的、特徴、及び利点は、下記の詳細な説明から明らかになるだろう。しかしながら、詳細な説明及び具体的な実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しつつ、実例としてのみ与えられていることを理解すべきであり、なぜならば、本発明の趣旨及び範囲内の様々な変更及び改変が、この詳細な説明から当業者に明らかになるからである。
【0041】
下記の図面は、本明細書の一部を形成し、且つ本発明のある特定の態様をさらに示すことが意図されている。本発明は、本明細書で提示されている特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面の内の１つ又は複数を参照することにより、より理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【0042】
【図1】候補の概要。神経網膜前駆細胞（ＮＲＰ）、光受容体前駆体細胞（ＰＲＰ）、及び眼胞（ＯＶ）を含む、ｉＰＳＣ由来の眼球細胞分化の概略。候補１（Ｃ－１）は、付着性２次元（２－Ｄ）条件下で分化したＰＲＰ（２－Ｄ ＰＲＰ）を表す。候補２（Ｃ－２）は、２－Ｄ条件及び懸濁凝集体３次元（３－Ｄ）条件の両方の下で分化したＰＲＰ（ハイブリッドＰＲＰ）を表す。候補３（Ｃ－３）は、２－Ｄ条件及び３－Ｄ条件の両方の下で分化したＯＶ（ハイブリッドＯＶ）を表す。候補４（Ｃ－４）は、２－Ｄ条件下で分化したＮＲＰを表す。
【0043】
【図2】培地相の持続時間を含む２－Ｄ ＰＲＲ分化プロセスの概略。
【0044】
【0045】
【0046】
【図5】ハイブリッドＰＲＰ分化プロセスの概略。
【0047】
【図6】入力ｉＰＳＣ密度最適化。６ウェルプレートの１つのウェル当たり１×１０4（１０Ｋ）～１×１０6（１０００Ｋ）個の細胞の範囲の入力密度による、Ｐａｘ６及びＶｓｘ２に関する１５日目ハイブリッドＰＲＰ分化のフローサイトメトリー分析。
【0048】
【図7】ＲＭ培地最適化。ＦＧＦ２及びＳＢ４３１５４２を添加したか又は添加していないＲＭ培地で増殖した１８日目ＲＰＣのフローサイトメトリー分析。
【0049】
【0050】
【図9】ハイブリッドＰＲＰ ＭＡＣＳ富化。ＭＡＣＳ富化前後の両方での、ＴＵＢＢ３、ネスチン、及びＲＣＶＲＮの発現に関するハイブリッドＰＲＰのフローサイトメトリー分析。
【0051】
【0052】
【図11】ハイブリッドＯＶ分化プロセスの概略。
【0053】
【0054】
【図13】２－Ｄ ＮＲＰ分化プロセスの概略。
【0055】
【0056】
【図15A-15B】表４に対応する表面抗原及びリカバリンの共発現のフロー分析を、リカバリンと、それぞれの表面抗原に対する抗体とによる二重標識後の象限フロープロットを使用して決定した。加えて、リカバリンのみを発現する細胞（ＦＩＴＣ中、ｘ軸）又は表面抗原のみを発現する細胞（ＡＰＣ中、ｙ軸）のパーセント集団を評価した。全てのプロットを、非染色（空）細胞、及び対応するアイソタイプコントロール（ＲＥＡ ＩｇＧ１、ＭｓＩｇＧ１、Ｍｓ ＩｇＧ２ａ、ＭｓＩｇＧ２ｂ、ＭｓＩｇＭ）に対してゲーティングした。
【0057】
【図16】表面抗原による富化後のリカバリン発現の経時変化。リカバリン発現は、ＣＤ３４４富化ＰＲＰに関してはＤ６５で最大である。ＣＤ１１１及びＣＤ２３０による富化でも、富化前（ＭＡＣＳ前）細胞と比較して、リカバリン発現の高い割合が得られる。
【0058】
【図17】Ｄ５５での表面抗原ＣＤ１１１、ＣＤ２３０、及びＣＤ３４４による富化後の、オンターゲットＰＲＰ及びオフターゲット網膜細胞の富化後発現の評価。
【0059】
【図18】Ｄ６５での表面抗原ＣＤ１１１、ＣＤ２３０、及びＣＤ３４４による富化後のオンターゲットＰＲＰ及びオフターゲット網膜細胞の富化後発現の評価。
【0060】
【図19】Ｄ７５での表面抗原ＣＤ１１１、ＣＤ２３０、及びＣＤ３４４による富化後のオンターゲットＰＲＰ及びオフターゲット網膜細胞の富化後発現の評価。
【0061】
【図20】Ｄ７５でのＣＤ１３３による富化後のオンターゲットＰＲＰ及びオフターゲット網膜細胞の富化後発現の評価。
【0062】
【図21】枯渇マーカーのフロー分析。
【0063】
【図22】ＰＲＰ分化の１５日目及び２５日目での、ＣＫＩ－７によるか又はよらないＰＡＸ６及びＣＨＸ１０の発現のフローサイトメトリー分析。
【0064】
【図23】ＰＲＰ分化の１５日目及び２５日目での、ＣＫＩ－７によるか又はよらないＰＡＸ６及びＣＨＸ１０の発現率。
【0065】
【0066】
【0067】
【0068】
【0069】
【0070】
【0071】
【図30】ＲＩＭの存在下での又は非存在でのＤ７５分化におけるオフターゲット網膜細胞マーカーの発現。
【0072】
【0073】
【図32A-32E】分化５５日目～６５日目で、リカバリン（図３２Ａ）及びＳＵＳＤ２（図３２Ｂ）の最大発現を観察しており、リカバリンは、ＳＵＳＤ２の直後にピークに達した。リカバリン及びＳＵＳＤ２の共発現（図３２Ｃ）は、ＳＵＳＤ２単独発現を模倣しており、このことは、ＳＵＳＤ２を発現する細胞はリカバリンも発現するが、全てのリカバリン陽性細胞がＳＵＳＤ２を発現するわけではないことを示唆する。３つのグラフの重ね合わせにより、二重リカバリン／ＳＵＳＤ２対単一ＳＵＳＤ２株の並列発現が明確に示される（図３２Ｄ）。固定後リカバリン標識によるＳＵＳＤ２標識。初期Ｄ５５～後期Ｄ１０５でのリカバリン及びＳＵＳＤ２の共発現の独立した経時変化研究（図３２Ｅ）は、Ｄ６５付近でのピークＳＵＳＤ２発現を支持するが、Ｄ５５での同様に上昇した発現も示す。
【0074】
【図33A-33C】リカバリンの発現率は、Ｄ６５、Ｄ７５、及びＤ８５でのＳＵＳＤ２富化後にさらに増加しており（図３３Ａ）、このことは、初期ピークＳＵＳＤ２及びリカバリンの発現時間にも対応するＤ６５での最も高い発現を示す。Ｄ６５～Ｄ７５～Ｄ８５では、リカバリン陽性細胞集団のパーセントは減少する（Ｂ）が、Ｄ８５では、ＳＵＳＤ２富化は、ＣＤ１７１富化と比較して、リカバリン陽性細胞の割合を依然として高める（図３３Ｂ）。しかしながら、ＳＵＳ２富化の限界は低い細胞出力であり、富化後に回復した初期細胞入力の２５％未満である（図３３Ｃ）。このことは、Ｄ８５でＳＵＳＤ２又はＣＤ１７１のいずれかにより富化された細胞に当てはまり、そのため、総入力細胞のわずか３％がＳＵＳＤ２により富化されており、総入力細胞のわずか１８％でＣＤ１７１により富化されている。フロースルー（ＳＵＳＤ２－及びＣＤ１７１－と標識されている）は、細胞の大部分を含んでいるように見え、このことは、後期分化期で両方の表面マーカーの発現が減少する可能性を示唆する。
【0075】
【図34A-34E】Ｄ６５での、高いＭＡＣＳ前ＳＵＳＤ２及びＭＡＳＣ前後のリカバリン発現、ＣＨＸ１０発現は最低であるが、Ｄ７５及びＤ８５では有意に増加する（図３４Ａ）。リカバリン－ＣＨＸ１０の共発現は、Ｄ６５で３％未満であり、Ｄ７５及びＤ８５それぞれで上昇し及び下降し、このことは、短命の双極細胞集団を示唆する（図３４Ｂ）。ＮｅｕｒｏＤ１発現は、Ｄ７５及びＤ８５と比較して、Ｄ６５での富化前後に最も高く（図３４Ｃ）、ＮｅｕｒｏＤ１共発現はまた、Ｄ６５でも最も高く、ＳＵＳＤ２富化後にさらに増強された（図３４Ｄ）。追加実験（図３４Ｅ）により、Ｄ５５で低いＣＨＸ１０を確認しており、Ｄ７５でのＳＵＳＤ２ ＭＡＣＳ富化後のＣＨＸ１０の大幅な減少も示された。
【発明を実施するための形態】
【0076】
Ｉ．例示的実施形態の説明
ある特定の実施形態では、本開示は、眼球細胞（例えば、光受容体前駆体（ＰＲＰ）細胞集団）を製造する方法を提供する。ＰＲＰ細胞は、胚様体の形成又は細胞のコロニーの選択を必要とすることなく、定義された２Ｄ細胞培養で、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞に由来し得る。或いは、ＰＲＰ細胞を、付着性２－Ｄ及び懸濁凝集体３－Ｄのハイブリッド培養で得てもよい。簡潔に説明すると、ＰＳＣを前部神経外胚葉細胞に分化させ、この前部神経外胚葉細胞を、短期間にわたり、ＢＭＰ阻害剤を含む網膜分化培地で培養し、次いで、ＢＭＰ阻害剤を含まない網膜分化培地でさらに培養することができる。興味深いことに、本発明者らは、ＢＭＰ阻害剤の除去により前部神経外胚葉細胞の神経網膜分化能が増強されることを発見した。次いで、この細胞を、ニコチンアミドの存在下で及びアクチビンＡの非存在下で、網膜前駆細胞（ＲＰＣ）にさらに分化させ、この細胞を、網膜色素上皮細胞等の他の網膜系統ではなく光受容体系統へと導くことができる。最後に、ＲＰＣを、ＴＧＦβ阻害剤、ＷＮＴ阻害剤、塩基性ＦＧＦ、及びγ－セクレターゼ阻害剤の存在下で分化させて、神経網膜前駆細胞（ＮＲＰ）を製造し得、次いで、このＮＲＰを、ＰＲＰ細胞へと分化することができる。そのため、本開示は、ＰＳＣのＰＲＰ細胞への分化の高効率で再現可能な方法を提供する。
ある特定の実施形態では、本開示は、眼球細胞（例えば、光受容体前駆体（ＰＲＰ）細胞集団）を製造する方法を提供する。ＰＲＰ細胞は、胚様体の形成又は細胞のコロニーの選択を必要とすることなく、定義された２Ｄ細胞培養で、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞に由来し得る。或いは、ＰＲＰ細胞を、付着性２－Ｄ及び懸濁凝集体３－Ｄのハイブリッド培養で得てもよい。簡潔に説明すると、ＰＳＣを前部神経外胚葉細胞に分化させ、この前部神経外胚葉細胞を、短期間にわたり、ＢＭＰ阻害剤を含む網膜分化培地で培養し、次いで、ＢＭＰ阻害剤を含まない網膜分化培地でさらに培養することができる。興味深いことに、本発明者らは、ＢＭＰ阻害剤の除去により前部神経外胚葉細胞の神経網膜分化能が増強されることを発見した。次いで、この細胞を、ニコチンアミドの存在下で及びアクチビンＡの非存在下で、網膜前駆細胞（ＲＰＣ）にさらに分化させ、この細胞を、網膜色素上皮細胞等の他の網膜系統ではなく光受容体系統へと導くことができる。最後に、ＲＰＣを、ＴＧＦβ阻害剤、ＷＮＴ阻害剤、塩基性ＦＧＦ、及びγ－セクレターゼ阻害剤の存在下で分化させて、神経網膜前駆細胞（ＮＲＰ）を製造し得、次いで、このＮＲＰを、ＰＲＰ細胞へと分化することができる。そのため、本開示は、ＰＳＣのＰＲＰ細胞への分化の高効率で再現可能な方法を提供する。
【0077】
本開示はまた、２Ｄ凝集体培養及び３Ｄ凝集体培養の組み合わせによるＰＲＰ細胞又は眼胞の製造方法も提供する。ＲＰＣを、一定期間にわたり、アクチビンＡを含まない網膜成熟培地で凝集体として培養してＰＲＰ凝集体を製造し得、次いで、ＰＲＰ凝集体を解離させて単層として培養することができる。或いは、ＲＰＣを、長期間にわたり、アクチビンＡを含まない網膜成熟培地で培養してＰＲＰ凝集体を製造し、最終的には眼胞を製造することができる。
【0078】
本開示のさらなる実施形態は、上記方法により得られるＰＲＰ細胞の集団を精製する方法を提供する。この精製方法は、陽性選択及び／又は陰性選択を含むことができる。例えば、ＣＤ１７１を発現する細胞を、細胞選別により選択することができる。従って、この精製プロセスにより、ＲＰＣからの分化後に得られる集団と比べてＰＲＰ細胞の割合が高いＰＲＰ富化細胞集団が得られる。
【0079】
そのため、本方法は、より時間的に及びコスト的に効率的であり、且つ臨床規模で、再生可能な供給源である幹細胞からの治療法のためのＰＲＰ富化細胞集団の製造を可能にし得る。この方法を使用して、光受容体細胞の発生、分化、維持、生存、及び機能に重要な機序、新規遺伝子、可溶性因子又は膜結合因子を明らかにすることができる。
【0080】
本明細書で提供されるＰＲＰ細胞及び光受容体細胞を、様々なインビボでの方法及びインビトロでの方法で使用することができる。例えば、ＰＲＰ細胞をインビボで使用して、網膜の状態（例えば、限定されないが、黄斑変性症及び網膜色素変性症）を処置することができる。同様に、ＰＲＰ細胞及び光受容体細胞を、スクリーニングアッセイにおいてインビトロで使用して、推定上の治療的処置候補又は予防的処置候補を同定することができる。本開示のさらなる実施形態及び利点を、下記で説明する。
【0081】
Ｉ．定義
「精製済」という用語は、絶対的な純度を必要とするものではなく、むしろ、相対的な用語として意図されている。そのため、細胞の精製済集団は、約９０％超、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％純粋であり、最も好ましくは、他の細胞型を本質的に含まない。
「精製済」という用語は、絶対的な純度を必要とするものではなく、むしろ、相対的な用語として意図されている。そのため、細胞の精製済集団は、約９０％超、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％純粋であり、最も好ましくは、他の細胞型を本質的に含まない。
【0082】
本明細書で使用される場合、特性の成分に関する「本質的に」又は「本質的に含まない」は、本明細書では、この特定の成分が組成物中に意図的に配合されていない及び／又は汚染物質としてのみ存在するか若しくは微量で存在することを意味するために使用される。従って、組成物のあらゆる意図しない汚染によるこの特定の成分の総量は、０．０５％をはるかに下回り、好ましくは０．０１％未満である。最も好ましいのは、この特定の成分の量が標準的な分析方法により検出され得ない組成物である。
【0083】
本明細書で使用される場合、「ａ」又は「ａｎ」は、１つ又は複数を意味することができる。本明細書において特許請求の範囲で使用される場合、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と共に使用される際には、単語「ａ」又は「ａｎ」は、１つ又は複数を意味することができる。
【0084】
特許請求の範囲における「又は」という用語の使用は、本開示が選択肢のみ並びに「及び／又は」を指す定義を支持するが、選択肢のみを指すこと明示的に示されていない限り、又は選択肢が相互に排他的でない限り、「及び／又は」を意味するために使用される。本明細書で使用される場合、「別の」は、少なくても２番目以降を意味することができる。
【0085】
本出願全体を通して、「約」という用語は、ある値が、デバイスの固有の誤差のばらつき、この値を決定するために用いられる方法、又は研究対象の間に存在するばらつきを含むことを示すために使用される。
【0086】
「細胞集団」という用語は、本明細書では、細胞（典型的には共通の型）の群を指すために使用される。細胞集団は、共通の前駆細胞に由来し得るか、又は複数種の細胞型を含んでもよい。「富化」細胞集団は、出発細胞集団に由来する細胞集団（例えば、分画されていない異種細胞集団）であって、特定の細胞型の割合が出発集団中のこの細胞型の割合と比べて高い細胞集団を指す。細胞集団は、１種又は複数種の細胞型が富化され且つ１種又は複数種の細胞型が枯渇され得る。
【0087】
「幹細胞」という用語は、本明細書では、適切な条件下では多様な特定の細胞型に分化することができる、他の適切な条件下では自己複製し且つ本質的には未分化の多能性状態に留まり得る細胞を指す。「幹細胞」という用語はまた、多能性細胞、多分化能細胞、前駆体細胞、及び前駆細胞も包含する。例示的なヒト幹細胞を、骨髄組織から得られる造血幹細胞又は間葉幹細胞、胚組織から得られる胚性幹細胞、又は胎児の生殖器組織から得られる胚性生殖細胞から得ることができる。例示的な多能性幹細胞を、多能性と関連するある特定の転写因子の発現により多能性状態に体細胞をリプログラムすることにより、体細胞からも製造し得、この細胞は、「人工多能性幹細胞」又は「ｉＰＳＣ」と呼ばれる。
【0088】
「多能性」という用語は、胚外細胞又は胎盤細胞を除いて生物の全ての他の細胞型に分化する細胞の性質を指す。多能性幹細胞は、長期の培養後であっても、３つ全ての胚葉の細胞型（例えば、外胚葉、中胚葉、及び内胚葉の細胞型）に分化することができる。ある多能性幹細胞は、胚盤胞の内部細胞塊に由来する胚性幹細胞である。他の実施形態では、多能性幹細胞は、体細胞をリプログラムすることにより得られる人工多能性幹細胞である。
【0089】
「分化」という用語は、未分化の細胞が、構造的特性及び／又は機能的特性の変化を伴って、より分化した型になるプロセスを指す。成熟細胞は、典型的には、変更された細胞構造及び組織特異的タンパク質を有する。
【0090】
本明細書で使用される場合、「未分化」は、未分化細胞の特徴的なマーカー及び形態学的特徴であって、この未分化細胞を、胚起源又は成体起源の末期分化細胞と明確に区別する特徴的なマーカー及び形態学的特徴を示す細胞を指す。
【0091】
「胚様体（ＥＢ）」は、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉の胚葉の細胞への分化を受け得る多能性幹細胞の凝集体である。スフェロイド構造は、多能性幹細胞が非付着性培養条件下で凝集した場合に生じ、そのため、懸濁液中でＥＢを形成する。
【0092】
「単離」細胞は、生物中の又は培養物中の他の細胞から実施的に分離されているか、又は精製されている。単離細胞は、例えば、少なくとも９９％、少なくとも９８％純粋、少なくとも９５％純粋、又は少なくとも９０％純粋であり得る。
【0093】
「胚」は、人工的にリプログラムされた核を有する接合体又は活性化された卵母細胞の１回又は複数回の分裂により得られる細胞塊を指す。
【0094】
「胚性幹（ＥＳ）細胞」は、胚盤胞期での内部細胞塊等の初期段階の胚から得られる未分化多能性細胞であるか、又は人工的な手段（例えば核移植）より製造される未分化多能性細胞であり、生殖細胞（例えば、精子及び卵子）等の胚又は成体のあらゆる分化細胞型を生じることができる。
【0095】
「人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）」は、因子（本明細書では、リプログラミング因子と称される）の組み合わせを発現させることによって、又はこの発現を誘発することによって、体細胞をリプログラミングすることにより、生成される細胞である。ｉＰＳＣを、胎児の、出生後の、新生児の、若年の、又は成体の体細胞を使用して生成することができる。ある特定の実施形態では、体細胞を多能性幹細胞にリプログラムするために使用され得る因子として、例えば、Ｏｃｔ４（Ｏｃｔ ３／４と称される場合もある）、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ、及びＫｌｆ４、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８が挙げられる。一部の実施形態では、少なくても２種のリプログラミング因子、少なくとも３種のリプログラミング因子、又は４種のリプログラミング因子を発現させて、体細胞を多能性幹細胞にリプログラミングすることにより、体細胞をリプログラミングする。
【0096】
「対立遺伝子」は、遺伝子の２つ以上の形態の内の１つを指す。ヒト等の二倍体生物は、各染色体の２つのコピーを含み、そのため、それぞれで１つの対立遺伝子を保有する。
【0097】
「ホモ接合性」という用語は、特定の遺伝子座で同一の対立遺伝子の内の２つを含むと定義される。「ヘテロ接合性」という用語は、特定の遺伝子座で２つの異なる対立遺伝子を含むことを指す。
【0098】
「ハプロタイプ」は、単一の染色体に沿った複数の遺伝子座での対立遺伝子の組み合わせを指す。ハプロタイプは、単一の染色体上の一塩基多型（ＳＮＰ）のセット及び／又は主要組織適合性複合体での対立遺伝子に基づくことができる。
【0099】
本明細書で使用される場合、「ハプロタイプ適合」という用語は、細胞（例えばｉＰＳ細胞）及び処置される対象が１つ又は複数の主要組織適合性遺伝子座ハプロタイプを共有すると定義される。対象のハプロタイプを、当該技術分野で公知のアッセイを使用して容易に決定することができる。ハプロタイプ適合ｉＰＳ細胞は、自家性であり得るか、又は同種であり得る。組織培養で増殖してＰＲＰ細胞に分化した自家細胞は、本質的に対象にハプロタイプが適合している。
【0100】
「実質的に同一のＨＬＡ型」は、ドナーの体細胞に由来するｉＰＳＣの分化を誘発することにより得られている移植細胞が、患者に移植された場合に生着し得る程度まで、ドナーのヒト白血球抗原（ＨＬＡ）型と患者のＨＬＡ型とが一致することを示す。
【0101】
「スーパードナー」は、本明細書では、ある特定のＭＨＣクラスＩ及びＩＩの遺伝子に対してホモ接合性である個体を指す。これらのホモ接合性個体は、スーパードナーとして機能し得、これらの細胞（この細胞を含む組織又は他の物質を含む）を、このハプロタイプに対してホモ接合性であるか又はヘテロ接合性である個体に移植することができる。スーパードナーは、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－ＤＲ、ＨＬＡ－ＤＰ、又はＨＬＡ－ＤＱ遺伝子座／遺伝子座対立遺伝子それぞれに対してホモ接合性であり得る。
【0102】
「フィーダーフリー」又は「フィーダー非依存性」は、本明細書では、フィーダー細胞層の代替としてサイトカイン及び増殖因子（例えば、ＴＧＦβ、ｂＦＧＦ、ＬＩＦ）が補充されている培養物を指すために使用される。そのため、「フィーダーフリー」又はフィーダー非依存性の培養システム及び培地を使用して、未分化の増殖状態で多能性細胞を培養して維持することができる。場合によっては、フィーダーフリー培養物は、動物ベースのマトリックス（例えばＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標））を利用するか、又はフィブロネクチン、コラーゲン、若しくはビトロネクチン等の基材上で増殖する。これらのアプローチにより、ヒト幹細胞を、マウス線維芽細胞「フィーダー層」を必要とすることなく本質的に未分化状態で維持することが可能になる。
【0103】
「フィーダー層」は、本明細書では、例えば培養皿の底部上の細胞のコーティング層として定義される。フィーダー細胞は、培養培地中に栄養素を放出し得、且つ多能性幹細胞等の他の細胞が付着し得る表面を提供することができる。
【0104】
「定義されている」又は「完全に定義されている」という用語は、培地、細胞外マトリックス、又は培養条件との関連で使用される場合には、ほぼ全ての成分の化学組成及び量が既知である培地、細胞外マトリックス、又は培養条件を指す。例えば、定義されている培地は、ウシ胎仔血清、ウシ血清アルブミン、又はヒト血清アルブミン等の定義されていない因子を含まない。一般に、定義されている培地は、組換えアルブミン、化学的に明確な脂質、及び組換えインスリンが補充されている基本培地（例えば、アミノ酸、ビタミン、無機塩、バッファー、抗酸化剤、及びエネルギー源を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｆ１２、又はロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）１６４０）を含む。完全に定義されている培地の一例は、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ８（商標）培地である。
【0105】
ヒト細胞により使用される培地、細胞外マトリックス、又は培養システムに関して、「異種成分（Ｘｅｎｏ）フリー（ＸＦ）」という用語は、使用される物質が非ヒト動物起源ではない状態を指す。
【0106】
「プレコンフルエント」は、細胞培養物であって、細胞で覆われているこの培養物の表面の割合が約６０～８０％である細胞培養物を指す。通常、プレコンフルエントは、培養物であって、この培養物の表面の約７０％が細胞で覆われている培養物を指す。
【0107】
「網膜前駆細胞」という用語は、「網膜前駆体細胞」又は「ＲＰＣ」とも呼ばれ、網膜の全ての細胞型を生成する能力を有する細胞（例えば、神経網膜細胞（例えば、杆体、錐体、光受容体前駆体細胞）、及びＲＰＥに分化し得る細胞）を包含する。
【0108】
「神経網膜前駆細胞」又は「ＮＲＰ」という用語は、神経網膜細胞型への分化能が制限されている細胞を指す。
【0109】
「光受容体前駆体細胞」及び「ＰＲＰ」細胞という用語は、細胞マーカーであるロドプシン又は３種の錐体オプシンのいずれかを発現し且つ杆体又は錐体のｃＧＭＰを所望により発現する光受容体細胞に分化し得る胚性幹細胞又は人工多能性幹細胞から分化した細胞を指す。光受容体は、杆体光受容体及び／又は錐体光受容体であり得る。
【0110】
「眼胞」又は「ＯＶ」という用語は、眼胞構造を含む形態を有する細胞凝集体又はオルガノイド（例えばＰＲＰ細胞凝集体）を指す。
【0111】
「網膜色素上皮」は、血管で満たされている層である脈絡膜と、神経網膜との間の色素細胞の層を指す。
【0112】
「網膜誘導培地（ＲＩＭ）」は、本明細書では、ＷＮＴ経路阻害剤及びＢＭＰ経路阻害剤を含み且つ網膜系統細胞へのＰＳＣの分化をもたらし得る増殖培地を指す。ＲＩＭはまた、ＴＧＦβ経路阻害剤も含み、ＩＧＦ－１及びアスコルビン酸を含んでもよい。
【0113】
「網膜分化培地（ＲＤ）」は、本明細書では、ＷＮＴ阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤、及びＭＥＫ阻害剤を含み且つ前部神経外胚葉細胞を分化させる培地と定義される。ＲＤＭは、ＢＭＰ阻害剤を含んでもよいし（即ちＲＤ１）含まなくてもよく（即ちＲＤ２）、ＩＧＦ－１及びアスコルビン酸を含んでもよい。
【0114】
「網膜成熟培地（ＲＭ）」は、ニコチンアミド及びアスコルビン酸を含む、網膜細胞の培養用の増殖培地と定義される。ＲＭは、好ましくはアクチビンＡを含まない。ＲＭは、γセクレターゼ阻害剤（例えばＤＡＰＴ）又はＴＧＦβ阻害剤（例えばＳＢ４３１５４２）を含んでもよいし（即ちＲＭ１）含まなくてもよく（即ちＲＭ２）、ＩＧＦ－１及びアスコルビン酸を含んでもよい。
【0115】
「ＰＲＰ成熟培地（ＰＭ）」は、本明細書では、ニコチンアミド及びγセクレターゼ阻害剤（例えばＤＡＰＴ）を含む、ＰＲＰ細胞の培養用の増殖培地と称される。ＰＭは、ＣＤＫ阻害剤（例えばＰＤ０３３２２９１）、ＴＧＦ－β経路活性化剤（例えばアクチビンＡ）、又はマイトジェン（例えばレチノイン酸）を含んでもよいし（即ちＰＭ１）含まなくてもよい（即ちＰＭ２）。
【0116】
「光受容体前駆体誘導培地（ＦＤＳＣ）」は、ＴＧＦβ阻害剤、ＷＮＴ阻害剤、及びγ－セクレターゼ阻害剤を含む増殖培地を指す。ＦＤＳＣは、塩基性ＦＧＦ及びアスコルビン酸を含んでもよい。
【0117】
「網膜変性関連疾患」という用語は、生得的な又は出生後の網膜の変性又は異常に起因するあらゆる疾患を指すことが意図されている。網膜変性関連疾患の例として、網膜異形成、網膜変性、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、網膜色素変性症、先天性網膜ジストロフィー、レーバー先天黒内障、網膜剥離、緑内障、視神経症、及び外傷が挙げられる。
【0118】
本明細書で使用される「治療上有効な量」は、疾患又は状態の処置のために対象に投与された場合に、そのような処置に影響を及ぼすのに十分な化合物の量を指す。
【0119】
ＩＩ．多能性幹細胞
Ａ．胚性幹細胞
ＥＳ細胞は、胚盤胞の内部細胞塊に由来しており、且つインビトロでの分化能が高い。発生中の胚の外側の栄養外胚葉層を除去し、次いで、非増殖細胞のフィーダー層上で内部塊細胞を培養することにより、ＥＳ細胞を単離することができる。再播種された細胞は、増殖してＥＳ細胞の新規のコロニーを生じ続け得、このコロニーは、取り出し、解離し、再び再播種し、及び増殖することができる。未分化ＥＳ細胞を「継代培養する」このプロセスを何度も繰り返して、未分化ＥＳ細胞を含む細胞系統を作製することができる（米国特許第５，８４３，７８０号明細書；同第６，２００，８０６号明細書；同第７，０２９，９１３号明細書）。
Ａ．胚性幹細胞
ＥＳ細胞は、胚盤胞の内部細胞塊に由来しており、且つインビトロでの分化能が高い。発生中の胚の外側の栄養外胚葉層を除去し、次いで、非増殖細胞のフィーダー層上で内部塊細胞を培養することにより、ＥＳ細胞を単離することができる。再播種された細胞は、増殖してＥＳ細胞の新規のコロニーを生じ続け得、このコロニーは、取り出し、解離し、再び再播種し、及び増殖することができる。未分化ＥＳ細胞を「継代培養する」このプロセスを何度も繰り返して、未分化ＥＳ細胞を含む細胞系統を作製することができる（米国特許第５，８４３，７８０号明細書；同第６，２００，８０６号明細書；同第７，０２９，９１３号明細書）。
【0120】
マウスＥＳ細胞を製造する方法は公知である。一方法では、マウスの１２９株由来の着床前胚盤胞をマウス抗血清で処理して栄養外胚葉を除去し、内部細胞塊を、ウシ胎仔血清を含む培地中の化学的に不活性化されたマウス胚性線維芽細胞のフィーダー細胞層上で培養する。発生する未分化ＥＳ細胞のコロニーを、ウシ胎仔血清の存在下にてマウス胚性線維芽細胞フィーダー層上で継代培養して、ＥＳ細胞の集団を製造する。一部の方法では、血清含有培養培地にサイトカイン白血病抑制因子（ＬＩＦ）を添加することにより、フィーダー層の非存在下でマウスＥＳ細胞を増殖させることができる（Ｓｍｉｔｈ、２０００年）。他の方法では、骨形成タンパク質及びＬＩＦの存在下にて、血清フリー培地でマウスＥＳ細胞を増殖させることができる（Ｙｉｎｇら、２００３年）。
【0121】
ヒトＥＳ細胞は、既に説明されている方法により胚細胞を製造するために、精子及び卵子細胞の融合、核移植、発病、又はクロマチンのリプログラミング及びそれに続くリプログラムされたクロマチンの原形質膜への組込みにより製造された接合体又は胚盤胞期の哺乳動物胚から製造され得るか、又は由来し得る（Ｔｈｏｍｓｏｎ及びＭａｒｓｈａｌｌ，１９９８年；Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら、２０００年）。一方法では、ヒト胚盤胞を抗ヒト血清に暴露し、栄養外胚葉細胞を溶解させて、マウス胚性線維芽細胞のフィーダー層上で培養されている内部細胞塊から除去する。さらに、内部細胞塊に由来する細胞の凝集塊を、化学的に又は機械的に解離させて再播種し、未分化形態を有するコロニーをマイクロピペットで選択し、解離させて再播種する（米国特許第６，８３３，２６９号明細書）。一部の方法では、塩基性線維芽細胞増殖因子の存在下にて線維芽細胞のフィーダー層上でヒトＥＳ細胞を培養することにより、このＥＳ細胞を血清なしで増殖させることができる（Ａｍｉｔら、２０００年）。他の方法では、塩基性線維芽細胞増殖因子を含む「馴化」培地の存在下にてＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）又はラミニン等のタンパク質マトリックス上でヒトＥＳ細胞を培養することにより、この細胞をフィーダー細胞層なしで増殖させることができる（Ｘｕら、２００１）。
【0122】
ＥＳ細胞はまた、既に説明されている方法（Ｔｈｏｍｓｏｎ，及びＭａｒｓｈａｌｌ，１９９８年；Ｔｈｏｍｓｏｎら、１９９５年；Ｔｈｏｍｓｏｎ及びＯｄｏｒｉｃｏ，２０００年）により、アカゲザル及びマーモセット等の他の生物にも由来し得、並びに確立されているマウス細胞系統及びヒト細胞系統にも由来し得る。例えば、確立されているヒトＥＳ細胞系統として、ＭＡＯＩ、ＭＡ０９、ＡＣＴ－４、ＨＩ、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３、Ｈ１４、及びＡＣＴ３０が挙げられる。さらなる例として、確立されているマウスＥＳ細胞系統として、マウス株１２９胚の内部細胞塊から確立されているＣＧＲ８細胞系統が挙げられ、ＣＧＲ８細胞の培養物を、フィーダー層なしで、ＬＩＦの存在下にて増殖させることができる。
【0123】
ＥＳ幹細胞は、タンパク質マーカー（例えば、転写因子Ｏｃｔ４、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ステージ特異的胚抗原ＳＳＥＡ－１、ステージ特異的胚抗原ＳＳＥＡ－３、ステージ特異的胚抗原ＳＳＥＡ－４、転写因子ＮＡＮＯＧ、腫瘍拒絶抗原１－６０（ＴＲＡ－１－６０）、腫瘍拒絶抗原１－８１（ＴＲＡ－１－８１）、ＳＯＸ２、又はＲＥＸ１）により検出することができる。
【0124】
Ｂ．人工多能性幹細胞
多能性の誘発は、多能性と関連している転写因子の導入により体細胞をリプログラミングすることによって、マウス細胞を使用して２００６年に（Ｙａｍａｎａｋａら、２００６年）、及びヒト細胞を使用して２００７年に（Ｙｕら、２００７年；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００７年）、初めて達成された。多能性幹細胞は未分化状態で維持され得、且つあらゆる成体細胞型に分化することができる。
多能性の誘発は、多能性と関連している転写因子の導入により体細胞をリプログラミングすることによって、マウス細胞を使用して２００６年に（Ｙａｍａｎａｋａら、２００６年）、及びヒト細胞を使用して２００７年に（Ｙｕら、２００７年；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、２００７年）、初めて達成された。多能性幹細胞は未分化状態で維持され得、且つあらゆる成体細胞型に分化することができる。
【0125】
生殖細胞を除いて、あらゆる体細胞を、ｉＰＳＣの出発点として使用することができる。例えば、細胞型は、ケラチノサイト、線維芽細胞、造血細胞、間葉系細胞、肝細胞、又は胃細胞の可能性がある。リプログラミングのための体細胞の供給源として、Ｔ細胞も使用することができる（米国特許第８，７４１，６４８号明細書）。細胞分化の程度又は細胞を採取する動物の年齢は制限されず、未分化前駆細胞（例えば体性幹細胞）及び最終的に分化した成熟細胞であっても、本明細書で開示されている方法において、体細胞の供給源として使用することができる。一実施形態では、体細胞は、それ自体がＰＲＰ細胞（例えばヒトＰＲＰ細胞）である。このＰＲＰ細胞は、成体ＰＲＰ細胞又は胎児ＰＲＰ細胞であり得る。ｉＰＳＣは、特定の細胞型にヒトＥＳ細胞を分化させることが知られている条件下で増殖することができ、且つヒトＥＳ細胞マーカー（例えば、ＳＳＥＡ－１、ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ－１－６０、及びＴＲＡ－１－８１）を発現することができる。
【0126】
当業者に既知の方法を使用し、体細胞をリプログラミングして人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を製造することができる。当業者は人工多能性幹細胞を容易に製造し得、例えば、米国特許出願公開第２００９０２４６８７５号明細書、同第２０１０／０２１００１４号明細書；同第２０１２０２７６６３６号明細書；米国特許第８，０５８，０６５号明細書；同第８，１２９，１８７号明細書；同第８，２７８，６２０号明細書；ＰＣＴ国際公開第２００７／０６９６６６Ａ１号パンフレット、及び米国特許第８，２６８，６２０号明細書（これらは、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。一般に、核リプログラミング因子を使用して、体細胞から多能性幹細胞を製造する。一部の実施形態では、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８の内の少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は少なくとも４つを利用する。他の実施形態では、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ、及びＫｌｆ４を利用する。
【0127】
この細胞を、核リプログラミング物質で処理し、この核リプログラミング物質は、一般に、体細胞からｉＰＳＣを誘導し得る１種若しくは複数種の因子であるか、又はこれらの物質をコードする核酸（例えば、ベクターに組み込まれている形態）である。この核リプログラミング物質として、一般に、少なくともＯｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、及びＳｏｘ２が挙げられるか、又はこれらの分子をコードする核酸が挙げられる。追加の核リプログラミング物質として、ｐ５３の機能的阻害剤、Ｌ－ｍｙｃ又はＬ－ｍｙｃをコードする核酸、及びＬｉｎ２８若しくはＬｉｎ２８ｂ又はＬｉｎ２８若しくはＬｉｎ２８ｂをコードする核酸を利用することができる。核リプログラミングにＮａｎｏｇも利用することができる。米国特許出願公開第２０１２０１９６３６０号明細書で開示されているように、ｉＰＳＣの製造のための例示的なリプログラミング因子として、下記が挙げられる：（１）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ（Ｓｏｘ２は、Ｓｏｘｌ、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘｌ５、Ｓｏｘｌ７、若しくはＳｏｘｌ８に置き換えられ得、Ｋｌｆ４は、Ｋｌｆｌ、Ｋｌｆ２、若しくはＫｌｆ５に置き換え可能である）；（２）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０大型Ｔ抗原（ＳＶ４０ＬＴ）；（３）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６ Ｅ６；（４）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、ＨＰＶ１６ Ｅ７；（５）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、ＨＰＶ１６ Ｅ６、ＨＰＶ１６ Ｅ７；（６）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、Ｂｍｉｌ；（７）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８；（８）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、ＳＶ４０ＬＴ；（９）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ；（１０）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ、ＳＶ４０ＬＴ；（１１）Ｏｃｔ３／４、Ｅｓｒｒｂ、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ（Ｅｓｒｒｂは、Ｅｓｒｒｇに置き換え可能である）；（１２）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２；（１３）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ；（１４）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＴＥＲＴ、ＨＰ ＶＩ ６ Ｅ６；（１５）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＴＥＲＴ、ＨＰＶ１６ Ｅ７；（１６）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＴＥＲＴ、ＨＰＶ１６ Ｅ６、ＨＰＶ１６ Ｅ７；（１７）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＴＥＲＴ、Ｂｍｉｌ；（１８）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８；（１９）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８、ＳＶ４０ＬＴ；（２０）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ；（２１）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＳＶ４０ＬＴ；又は（２２）Ｏｃｔ３／４、Ｅｓｒｒｂ、Ｓｏｘ２（Ｅｓｒｒｂは、Ｅｓｒｒｇに置き換え可能である）。非限定的な一例では、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、及びｃ－Ｍｙｃを利用する。他の実施形態では、Ｏｃｔ４、Ｎａｎｏｇ、及びＳｏｘ２を利用し、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，６８２，８２８号明細書を参照されたい。この因子として、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、及びＳｏｘ２が挙げられるが、これらに限定されない。他の例では、この因子として、Ｏｃｔ ３／４、Ｋｌｆ４、及びＭｙｃが挙げられるが、これらに限定されない。非限定的な一部の例では、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、及びＳｏｘ２を利用する。非限定的な他の例では、Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、及びＳａｌ ４を利用する。Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｋｌｆ４、又はｃ－Ｍｙｃのような因子は、リプログラミング効率を高め得、且ついくつかの異なる発現ベクターから発現することができる。例えば、ＥＢＶエレメントベースのシステム等の組込みベクターを使用することができる（米国特許第８，５４６，１４０号明細書）。さらなる態様では、リプログラミングタンパク質は、タンパク質形質導入により体細胞に直接導入される可能性がある。リプログラミングは、細胞と、１種又は複数種のシグナル伝達受容体とを接触させることをさらに含み得、このシグナル伝達受容体として、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ－３）阻害剤、マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ（ＭＥＫ）阻害剤、形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ－β）受容体阻害剤又はシグナル伝達阻害剤、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、ｐ５３阻害剤、ＮＦ－カッパＢ阻害剤、又はこれらの組み合わせが挙げられる。この制御因子として、低分子、阻害性ヌクレオチド、発現カセット、又はタンパク質因子が挙げられ。実質的にあらゆるｉＰＳ細胞又は細胞系統を使用できるることが予想される。
【0128】
この核リプログラミング物質のマウスｃＤＮＡ配列及びヒトｃＤＮＡ配列は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００７／０６９６６６号パンフレットで言及されているＮＣＢＩアクセッション番号を参照して入手可能である。１種若しくは複数種のリプログラミング物質又はこのリプログラミング物質をコードする核酸を導入する方法は、当該技術分野で既知であり、例えば、米国特許出願公開第２０１２／０１９６３６０号明細書及び米国特許第８，０７１，３６９号明細書（これらは両方とも、参照により本明細書に組み込まれる）で開示されている。
【0129】
一旦誘導されれば、ｉＰＳＣは、多能性を維持するのに十分な培地で培養することができる。米国特許第７，４４２，５４８号明細書及び米国特許出願公開第２００３／０２１１６０３号明細書で説明されているように、ｉＰＳＣを、多能性幹細胞（より具体的には、胚性幹細胞）を培養するために開発された様々な培地及び技術と共に使用することができる。マウス細胞の場合では、通常の培地に分化抑制因子として白血病抑制因子（ＬＩＦ）を添加して培養を実行する。ヒト細胞の場合では、ＬＩＦの代わりに塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を添加することが望ましい。当業者に既知であるようなｉＰＳＣの培養及び維持のための他の方法を使用してもよい。
【0130】
ある特定の実施形態では、定義されていない条件を使用し得、例えば、未分化状態で幹細胞を維持するために、多能性細胞を、線維芽細胞フィーダー細胞上で又は線維芽細胞フィーダー細胞に暴露されている培地上で培養することができる。一部の実施形態では、この細胞を、フィーダー細胞としての、細胞分裂を終了させるために放射線又は抗生物質で処理したマウス胚性線維芽細胞の共存在下で培養する。或いは、定義されたフィーダー非依存性培養システム（例えば、ＴＥＳＲ（商標）培地（Ｌｕｄｗｉｇら、２００６ａ；Ｌｕｄｗｉｇら、２００６ｂ）又はＥ８（商標）培地（Ｃｈｅｎら、２０１１年））を使用して、多能性細胞を本質的に未分化の状態で培養して維持してもよい。
【0131】
一部の実施形態では、ｉＰＳＣを、外来性核酸を発現するように改変し得、例えば、プロモーターに作動可能に連結されているエンハンサー及び第１のマーカーをコードする核酸配列を含むように改変することができる。適切なプロモーターとして、光受容体細胞中で発現される任意のプロモーター（例えばロドプシンキナーゼプロモーター）が挙げられるが、これに限定されない。この構築物はまた、他のエレメント（例えば、翻訳開始のためのリボソーム結合部位（内部リボソーム結合配列）、及び転写／翻訳ターミネーター）も含み得る。一般に、この構築物で細胞をトランスフェクトすることが有利である。安定したトランスフェクションに適したベクターとして、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、及びＳｅｎｄａｉウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【0132】
一部の実施形態では、マーカーをコードするプラスミドは、下記で構成されている：（１）高コピー数複製起点、（２）カナマイシンによる抗生物質選択のための選択マーカー（例えば、限定されないが、ネオ遺伝子）、（３）転写終結配列（例えば、チロシナーゼエンハンサー）、及び（４）様々な核酸カセットの組込み用のマルチクローニング部位、及び（５）チロシナーゼプロモーターに作動可能に連結されているマーカーをコードする核酸配列。タンパク質をコードする核酸を誘導するための多数のプラスミドベクターが、当技術分野で既知である。これらとして、米国特許第６，１０３，４７０号明細書；同第７，５９８，３６４号明細書；同第７，９８９，４２５号明細書；及び同第６，４１６，９９８号明細書（これらは、参照により本明細書に組み込まれる）で開示されているベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【0133】
ウイルス遺伝子送達システムは、ＲＮＡベースの又はＤＮＡベースのウイルスベクターであり得る。エピソーム遺伝子送達システムは、プラスミド、エプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）ベースのエピソームベクター、酵母ベースのベクター、アデノウイルスベースのベクター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）ベースのエピソームベクター、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）ベースのベクター、又はレンチウイルスベクターであり得る。
【0134】
マーカーとして、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質若しくは赤色蛍光タンパク質）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、若しくはアルカリホスファターゼ、若しくはホタル／ウミシイタケルシフェラーゼ、若しくはナノルック（ｎａｎｏｌｕｃ））、又は他のタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。マーカーは、タンパク質（例えば、分泌された細胞表面タンパク質若しくは内部タンパク質；細胞により合成されたか若しくは取り込まれている）；核酸（例えば、ｍＲＮＡ、若しくは酵素的に活性な核酸分子）、又は多糖類であり得る。含まれるのは、目的の細胞型のマーカーに特異的な抗体、レクチン、プローブ、又は核酸増幅反応により検出可能である任意のそのような細胞成分の決定因子である。マーカーを、遺伝子産物の機能に依存する生化学的アッセイ若しくは酵素アッセイ又は生物学的反応によっても同定することができる。これらのマーカーをコードする核酸配列は、チロシナーゼエンハンサーに作動可能に連結することができる。加えて、他の遺伝子（例えば、ＰＲＰ分化、又は光受容体機能、又は生理、又は病理に対して幹細胞に影響を及ぼし得る遺伝子）が含まれていてもよい。
【0135】
１．ＭＨＣハプロタイプ一致
主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）は、同種臓器移植の免疫拒絶の主な原因である。３つの主要なクラスＩ ＭＨＣハプロタイプ（Ａ、Ｂ、及びＣ）、並びに３つの主要なＭＨＣクラスＩＩハプロタイプ（ＤＲ、ＤＰ、及びＤＱ）が存在する。ＨＬＡ遺伝子座は高度な多型を示し、６番染色体上に４Ｍｂにわたり分布している。この領域内のＨＬＡ遺伝子をハプロタイプ化する能力は臨床上重要であり、なぜならば、この領域は、自己免疫疾患及び感染性疾患と関連しており、且つドナーとレシピエントとの間のＨＬＡハプロタイプの適合性が移植の臨床転帰に影響を及ぼす可能性があるからである。ＭＨＣクラスＩに対応するＨＬＡは、細胞内からペプチドを提示し、ＭＨＣクラスＩＩに対応するＨＬＡは、細胞外からＴリンパ球に抗原を提示する。移植片と宿主との間のＭＨＣハプロタイプの適合性は、移植片に対する免疫反応を誘発して、この移植片の拒絶を引き起こす。そのため、患者を免疫抑制剤で処置して拒絶を予防することができる。ＨＬＡ適合幹細胞系統は、免疫拒絶のリスクを克服する場合がある。
主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）は、同種臓器移植の免疫拒絶の主な原因である。３つの主要なクラスＩ ＭＨＣハプロタイプ（Ａ、Ｂ、及びＣ）、並びに３つの主要なＭＨＣクラスＩＩハプロタイプ（ＤＲ、ＤＰ、及びＤＱ）が存在する。ＨＬＡ遺伝子座は高度な多型を示し、６番染色体上に４Ｍｂにわたり分布している。この領域内のＨＬＡ遺伝子をハプロタイプ化する能力は臨床上重要であり、なぜならば、この領域は、自己免疫疾患及び感染性疾患と関連しており、且つドナーとレシピエントとの間のＨＬＡハプロタイプの適合性が移植の臨床転帰に影響を及ぼす可能性があるからである。ＭＨＣクラスＩに対応するＨＬＡは、細胞内からペプチドを提示し、ＭＨＣクラスＩＩに対応するＨＬＡは、細胞外からＴリンパ球に抗原を提示する。移植片と宿主との間のＭＨＣハプロタイプの適合性は、移植片に対する免疫反応を誘発して、この移植片の拒絶を引き起こす。そのため、患者を免疫抑制剤で処置して拒絶を予防することができる。ＨＬＡ適合幹細胞系統は、免疫拒絶のリスクを克服する場合がある。
【0136】
移植ではＨＬＡが重要であることから、ＨＬＡ遺伝子座は、通常、好ましいドナー－レシピエント対を同定するために、血清学及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により分類される。ＨＬＡクラスＩ及びＩＩの抗原の血清学的検出は、精製されたＴリンパ球又はＢリンパ球による補体媒介性リンパ球毒性試験を使用して達成することができる。この手順は、主に、ＨＬＡ－Ａ遺伝子座及びＨＬＡ－Ｂ遺伝子座を一致させるために使用される。分子に基づく組織適合試験は、血清学的試験と比べて正確であり得ることが多い。ＰＣＲ産物が一連のオリゴヌクレオチドプローブに対して試験される低分解能分子法（例えばＳＳＯＰ（配列特異的オリゴヌクレオチドプローブ）法）を使用してＨＬＡ抗原を同定し得、現在、この方法は、クラスＩＩ－ＨＬＡ分類に使用される最も一般的な方法である。ＰＣＲ増幅に対立遺伝子特異的プライマーを利用する高分解能技術（例えばＳＳＰ（配列特異的プライマー）法）により、特定のＭＨＣ対立遺伝子を同定することができる。
【0137】
ドナー細胞がＨＬＡホモ接合性である（即ち、各抗原提示タンパク質に関して同一の遺伝子座を含む）場合には、ドナーとレシピエントとの間のＭＨＣ適合性は有意に増加する。ほとんどの個体はＭＨＣクラスＩ遺伝子及びＭＨＣクラスＩＩ遺伝子に関してヘテロ接合性であるが、ある特定の個体は、これらの遺伝子に関してホモ接合性である。このホモ接合性個体は、スーパードナーとしての役割を果たし得、この細胞から生成された移植片は、このハプロタイプに関してホモ接合性であるか又はヘテロ接合性である全ての個体で移植することができる。さらに、ホモ接合性ドナー細胞は、ある集団において高頻度で見出されるハプロタイプを有する場合には、この細胞は、多数の個体の移植治療で適用することができる。
【0138】
従って、ｉＰＳＣは、処置される対象の体細胞から製造することができるか、又はこの患者と同一の又は実質的に同一のＨＬＡ型を有する別の対象の体細胞から製造することができる。一例では、ドナーの主要なＨＬＡ（例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、及びＨＬＡ－ＤＲという３つの主要な遺伝子座）は、レシピエントの主要なＨＬＡと同一である。場合によっては、体細胞ドナーはスーパードナーであり得、そのため、ＭＨＣホモ接合性スーパードナーに由来するｉＰＳＣを使用してＰＲＰ細胞を生成することができる。そのため、スーパードナーに由来するｉＰＳＣは、ハプロタイプに関してホモ接合性であるか又はヘテロ接合性である対象で移植することができる。例えば、ｉＰＳＣは、ＨＬＡ－Ａ及びＨＬＡ－Ｂ等の２種のＨＬＡ対立遺伝子でホモ接合性であり得る。従って、スーパードナーから製造されたｉＰＳＣを、本明細書で開示されている方法で使用して、多数の潜在的レシピエントに潜在的に「一致」し得るＰＲＰ細胞を製造することができる。
【0139】
２．エピソームベクター
ある特定の態様では、リプログラミング因子は、１種又は複数種の外来性エピソーム遺伝子エレメントに含まれている発現カセットから発現される（参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１０／０００３７５７号明細書を参照されたい）。そのため、ｉＰＳＣは、外来性遺伝子エレメント（例えば、レトロウイルスベクターエレメント又はレンチウイルスベクターエレメントに由来する）を本質的に含み得ない。このｉＰＳＣは、染色体外複製ベクター（即ちエピソームベクター）の使用により調製され、このベクターは、外来性のベクターエレメント又はウイルスエレメントを本質的に含まないｉＰＳＣを作製するためにエピソーム的に複製し得るベクターである（米国特許第８，５４６，１４０号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）；Ｙｕら、２００９年を参照されたい）。多くのＤＮＡウイルス（例えば、アデノウイルス、サル空胞ウイルス４０（ＳＶ４０）、若しくはウシパピローマウイルス（ＢＰＶ））又は出芽酵母ＡＲＳ（自律複製配列）含有プラスミドは、哺乳動物細胞中で染色体外的に又はエピソーム的に複製する。このエピソームプラスミドは、ベクターの組込みと関連するこれらの欠点全てを本質的に含まない（Ｂｏｄｅら、２００１年）。例えば、上記で定義されているリンパ指向性ヘルペスウイルス（ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｈｉｃ ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ）ベースの包含又はエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）は、染色体外で複製してリプログラミング遺伝子の体細胞への送達を促進することができる。有用なＥＢＶエレメントは、ＯｒｉＰ及びＥＢＮＡ－１であるか、又はこれらのバリアント若しくは機能的等価物である。エピソームベクターのさらなる利点は、外来性エレメントが、細胞に導入された後に時間と共に失われ、このエレメントを本質的に含まない自己持続性ｉＰＳＣがもたらされるということである。
ある特定の態様では、リプログラミング因子は、１種又は複数種の外来性エピソーム遺伝子エレメントに含まれている発現カセットから発現される（参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１０／０００３７５７号明細書を参照されたい）。そのため、ｉＰＳＣは、外来性遺伝子エレメント（例えば、レトロウイルスベクターエレメント又はレンチウイルスベクターエレメントに由来する）を本質的に含み得ない。このｉＰＳＣは、染色体外複製ベクター（即ちエピソームベクター）の使用により調製され、このベクターは、外来性のベクターエレメント又はウイルスエレメントを本質的に含まないｉＰＳＣを作製するためにエピソーム的に複製し得るベクターである（米国特許第８，５４６，１４０号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）；Ｙｕら、２００９年を参照されたい）。多くのＤＮＡウイルス（例えば、アデノウイルス、サル空胞ウイルス４０（ＳＶ４０）、若しくはウシパピローマウイルス（ＢＰＶ））又は出芽酵母ＡＲＳ（自律複製配列）含有プラスミドは、哺乳動物細胞中で染色体外的に又はエピソーム的に複製する。このエピソームプラスミドは、ベクターの組込みと関連するこれらの欠点全てを本質的に含まない（Ｂｏｄｅら、２００１年）。例えば、上記で定義されているリンパ指向性ヘルペスウイルス（ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｈｉｃ ｈｅｒｐｅｓ ｖｉｒｕｓ）ベースの包含又はエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）は、染色体外で複製してリプログラミング遺伝子の体細胞への送達を促進することができる。有用なＥＢＶエレメントは、ＯｒｉＰ及びＥＢＮＡ－１であるか、又はこれらのバリアント若しくは機能的等価物である。エピソームベクターのさらなる利点は、外来性エレメントが、細胞に導入された後に時間と共に失われ、このエレメントを本質的に含まない自己持続性ｉＰＳＣがもたらされるということである。
【0140】
他の染色体外ベクターとして、他のリンパ指向性ヘルペスウイルスベースのベクターが挙げられる。リンパ指向性ヘルペスウイルスは、リンパ芽球（例えばヒトＢリンパ芽球）中で複製し、自然なライフサイクルの一部でプラスミドとなるヘルペスウイルスである。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、「リンパ指向性」ヘルペスウイルスではない。例示的なリンパ指向性ヘルペスウイルスとして、ＥＢＶ、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）；ヘルペスウイルスサイミリ（ＨＳ）、及びマレック病ウイルス（ＭＤＶ）が挙げられるが、これらに限定されない。同様に、エピソームベースのベクターの他の供給源（例えば、酵母ＡＲＳ、アデノウイルス、ＳＶ４０、又はＢＰＶ）が企図される。
【0141】
Ｃ．体細胞核移植
多能性幹細胞を、体細胞核移植の方法により調製することができる。体細胞核移植は、紡錘体フリーの卵母細胞へのドナー核の移植を伴う。一方法では、アカゲザルの皮膚線維芽細胞由来のドナー線維芽細胞核を、電気融合により紡錘体フリーの成熟中期ＩＩアカゲザル卵母細胞の細胞質に導入する（Ｂｙｒｎｅら、２００７年）。融合した卵母細胞を、イオノマイシンへの暴露により活性化させ、次いで胚盤胞期までインキュベートする。次いで、選択した胚盤胞の内部細胞塊を培養して、胚性幹細胞系統を製造する。この胚性幹細胞系統は正常なＥＳ細胞形態を示し、様々なＥＳ細胞マーカーを発現し、且つインビトロ及びインビボの両方で複数の細胞型に分化する。
多能性幹細胞を、体細胞核移植の方法により調製することができる。体細胞核移植は、紡錘体フリーの卵母細胞へのドナー核の移植を伴う。一方法では、アカゲザルの皮膚線維芽細胞由来のドナー線維芽細胞核を、電気融合により紡錘体フリーの成熟中期ＩＩアカゲザル卵母細胞の細胞質に導入する（Ｂｙｒｎｅら、２００７年）。融合した卵母細胞を、イオノマイシンへの暴露により活性化させ、次いで胚盤胞期までインキュベートする。次いで、選択した胚盤胞の内部細胞塊を培養して、胚性幹細胞系統を製造する。この胚性幹細胞系統は正常なＥＳ細胞形態を示し、様々なＥＳ細胞マーカーを発現し、且つインビトロ及びインビボの両方で複数の細胞型に分化する。
【0142】
ＩＩＩ．光受容体前駆体細胞
一部の実施形態では、神経網膜前駆（ＮＲＰ）細胞、光受容体前駆体（ＰＲＰ）細胞、又は眼胞（ＯＶ）を、本明細書で開示されている方法で製造する。網膜中において光に直接反応する細胞は、光受容体細胞である。光受容体は、網膜の外側部分における感光性ニューロンであり、杆体又は錐体のいずれかであり得る。光伝達のプロセスでは、光受容体細胞は、レンズにより集束された入射光エネルギーを電気シグナルに変化し、次いで、この電気シグナルは、視神経を介して脳に送られる。脊椎動物は、２種類の光受容体細胞（例えば、錐体及び杆体）を有する。錐体は、細かいディテール、中心視野及び色覚を検出するように適合されており、明るい光下で良好に機能する。杆体は、周辺視野及び暗所視に関与する。杆体及び錐体からの神経シグナルは、網膜の他のニューロンによる処理を受ける。
一部の実施形態では、神経網膜前駆（ＮＲＰ）細胞、光受容体前駆体（ＰＲＰ）細胞、又は眼胞（ＯＶ）を、本明細書で開示されている方法で製造する。網膜中において光に直接反応する細胞は、光受容体細胞である。光受容体は、網膜の外側部分における感光性ニューロンであり、杆体又は錐体のいずれかであり得る。光伝達のプロセスでは、光受容体細胞は、レンズにより集束された入射光エネルギーを電気シグナルに変化し、次いで、この電気シグナルは、視神経を介して脳に送られる。脊椎動物は、２種類の光受容体細胞（例えば、錐体及び杆体）を有する。錐体は、細かいディテール、中心視野及び色覚を検出するように適合されており、明るい光下で良好に機能する。杆体は、周辺視野及び暗所視に関与する。杆体及び錐体からの神経シグナルは、網膜の他のニューロンによる処理を受ける。
【0143】
ＰＲＰ細胞は、マーカー（例えば、ＯＴＸ２、ＣＲＸ、ＰＲＤＭ１（ＢＬＩＭＰ１）、ＮＥＵＲＯＤ１、ＲＣＶＲＮ、ＴＵＢＢ３、及びＬ１ＣＡＭ（ＣＤ１７１））を発現することができる。ＰＲＰ細胞は、方法論（例えば、免疫細胞化学、ウエスタンブロット分析、フローサイトメトリー、及び酵素結合免疫アッセイ（ＥＬＩＳＡ））の使用による検出のためのマーカーとして機能し得るいくつかのタンパク質を発現する。例えば、一つの特徴的なＰＲＰマーカーは、ＲＣＶＲＮである。ＰＲＰ細胞は、胚性幹細胞マーカーＯＣＴ－４、ＮＡＮＯＧ、又はＲＥＸ－１を（任意の検出可能レベルで）発現しない場合がある。具体的には、これらの遺伝子の発現は、定量的ＲＴ－ＰＣＲにより評価した場合に、ＥＳ細胞中又はｉＰＳＣ細胞中と比べて、ＰＲＰ細胞中で約１００～１０００倍低い。
【0144】
例えば、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）、ノーザンブロット分析、又は公的に入手可能な配列データ（ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標））を使用する標準的な増幅方法で配列特異的プライマーを使用するドットブロットハイブリダイゼーション分析により、ＰＲＰ細胞マーカーをｍＲＮＡレベルで検出することができる。タンパク質レベル又はｍＲＮＡレベルで検出された組織特異的マーカーの発現は、このレベルが、コントロール細胞（例えば、未分化多能性幹細胞又は他の無関係な細胞型）の少なくとも又は約２、３、４、５、６、７、８、又は９倍である場合に、より具体的には１０、２０、３０、４０、５０倍超、又はより高い場合に、陽性と見なされる。
【0145】
光受容体細胞の機能障害、損傷、及び喪失は、多くの眼疾患及び眼障害（例えば、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、ベスト病等の遺伝性黄斑変性症、及び網膜色素変性症）の原因である。そのような疾患の潜在的な処置は、そのような処置が必要なものの網膜へのＰＲＰ又は光受容体細胞の移植である。ＰＲＰ又は光受容体細胞の移植によるこれらの補充により、劣化を遅延させ得るか、停止させ得るか、又は反転させ得、網膜機能を改善させ得、且つそのような状態に起因する失明を予防し得ると推測される。しかしながら、ヒトドナー及びヒト胚からＰＲＰ又は光受容体細胞を直接得ることは困難である。
【0146】
一部の実施形態では、ヒトｉＰＳＣ等のＰＳＣの本質的に単一の細胞の懸濁液からＰＲＰ細胞を製造するための方法が提供される。一部の実施形態では、ＰＳＣをプレコンフルエントまで培養して、いかなる細胞凝集体も予防する。ある特定の態様では、ＰＳＣを、細胞解離溶液又は細胞解離酵素（例えば、ヴェルセン、トリプシン、ＡＣＣＵＴＡＳＥ（商標）、又はＴＲＹＰＬＥ（商標）で例示される）と一緒のインキュベーションにより解離させる。ＰＳＣを、ピペット操作によっても、本質的に単一の細胞の懸濁液に解離させることができる。
【0147】
加えて、ブレビスタチン（例えば約２．５μＭ）を培地に添加して、細胞が培養容器に付着することなく、単一細胞への解離後にＰＳＣ生存率を増加させることができる。或いは、ブレビスタチンの代わりにＲＯＣＫ阻害剤を使用して、単一細胞への解離後にＰＳＣ生存率を増加させることができる。
【0148】
単一細胞ＰＳＣからＰＲＰ細胞を効率的に分化させるために、入力密度の正確な計数によりＰＲＰ分化効率を増加させることができる。そのため、ＰＳＣの単一細胞懸濁液を、一般には播種前に計数する。例えば、ＰＳＣの単一細胞懸濁液を、血球計数器又は自動細胞カウンタ（例えば、ＶＩＣＥＬＬ（登録商標）又はＴＣ２０）により計数する。この細胞を、約１０，０００～約５００，０００個の細胞／ｍＬ、約５０，０００～約２００，０００個の細胞／ｍＬ、又は約７５，０００～約１５０，０００個の細胞／ｍＬの細胞密度まで希釈することができる。非限定的な例では、ＰＳＣの単一細胞懸濁液を、ＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ８（商標）（Ｅ８（商標））培地等の完全に定義されている培養培地で、約１００，０００個の細胞／ｍＬの密度まで希釈する。
【0149】
ＰＳＣの単一細胞懸濁液を既知の細胞密度で得ると、細胞を、一般には、組織培養プレート（例えば、フラスコ、６ウェルプレート、２４ウェルプレート、又は９６ウェルプレート）等の適切な培養容器に播種する。この細胞を培養するために使用される培養容器として下記が挙げられ得るが、これらに特に限定されない：内部で幹細胞を培養し得る限り、フラスコ、組織培養用のフラスコ、シャーレ、ペトリ皿、組織培養用のシャーレ、マルチシャーレ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、チューブ、トレイ、ＣＥＬＬＳＴＡＣＫ（登録商標）チャンバー、培養バッグ、及びローラーボトル。この細胞を、培養の必要性に応じて、下記の体積で培養し得る：少なくとも又は約０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０ｍｌ、１００ｍｌ、１５０ｍｌ、２００ｍｌ、２５０ｍｌ、３００ｍｌ、３５０ｍｌ、４００ｍｌ、４５０ｍｌ、５００ｍｌ、５５０ｍｌ、６００ｍｌ、８００ｍｌ、１０００ｍｌ、１５００ｍｌ、又はこれらの中で導き出し得る任意の範囲。ある特定の実施形態では、培養容器はバイオリアクタであり得、このバイオリアクタは、細胞を増殖させ得るように生物学的に活性な環境を支持するエクスビボでのあらゆるデバイス又はシステムを指し得る。バイオリアクタは、少なくとも又は約２、４、５、６、８、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、５００リットル、１、２、４、６、８、１０、１５立方メートル、又はこれらの中で導き出し得る任意の範囲の容積でもよい。
【0150】
ある特定の態様では、ｉＰＳＣ等のＰＳＣを、効率的な分化に適した細胞密度で播種する。一般には、この細胞を、約１，０００～約７５，０００個の細胞／ｃｍ2（例えば、約５，０００～約４０，０００個の細胞／ｃｍ2）の細胞密度で播種する。６ウェルプレートでは、この細胞を、１つのウェル当たり約５０，０００～約４００，０００個の細胞の細胞密度で播種することができる。例示的な方法では、この細胞を、１つのウェル当たり約１００，０００、約１５０，０００、約２００，０００、約２５０，０００、約３００，０００、又は約３５０，０００個の細胞（例えば、１つのウェル当たり約２００，０００個の細胞）の細胞密度で播種する。
【0151】
ｉＰＳＣ等のＰＳＣを、一般には、１種又は複数種の細胞付着タンパク質によりコーティングされている培養プレート上で培養して、細胞生存率を維持しつつ細胞付着を促進する。例えば、好ましい細胞付着タンパク質として、細胞外マトリックスタンパク質（例えば、ビトロネクチン、ラミニン、コラーゲン、及び／又はフィブロネクチン）が挙げられ、この細胞外マトリックスタンパク質を使用して、多能性細胞の増殖のための固体支持体を提供する手段として培養表面をコーティングすることができる。「細胞外マトリックス（ＥＣＭ）」という用語は、当該技術分野で認識されている。ＥＣＭの成分として、下記のタンパク質の内の１つ又は複数が挙げられ得るが、これらに限定されない：フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、テネイシン、エンタクチン、トロンボスポンジン、エラスチン、ゼラチン、コラーゲン、フィブリリン、メロシン、アンコリン、コンドロネクチン、結合タンパク質、骨シアロタンパク質、オステオカルシン、オステオポンチン、エピネクチン、ヒアルロネクチン、ウンデュリン（ｕｎｄｕｌｉｎ）、エピリグリン、及びカリニン。他のＥＣＭ成分として、付着用の合成ペプチド（例えば、ＲＧＤモチーフ若しくはＩＫＶＡＶモチーフ）、合成ヒドロゲル（例えば、ＰＥＧ、ＰＬＧＡ等）、又は天然ヒドロゲル（例えばアルギネート）が挙げられ得る。例示的な方法では、ＰＳＣを、ビトロネクチンでコーティングされている培養プレート上で増殖させる。一部の実施形態では、細胞付着タンパク質は、ヒトタンパク質である。
【0152】
細胞外マトリックスタンパク質は、天然起源であり且つヒト若しくは動物の組織から精製されてもよく、或いは、ＥＣＭタンパク質は、遺伝子操作されている組換えタンパク質であってもよいし、天然での合成であってもよい。ＥＣＭタンパク質は、全タンパク質であってもよいし、天然の又は操作されたペプチド断片の形態であってもよい。細胞培養のためにマトリックスで有用であり得るＥＣＭタンパク質の例として、ラミニン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、フィブロネクチン、及びビトロネクチンが挙げられる。一部の実施形態では、マトリックス組成物は異種成分フリーである。例えば、ヒト細胞を培養するための異種成分フリーマトリックスでは、ヒト起源のマトリックス成分を使用し得、あらゆる非ヒト動物成分を除外することができる。
【0153】
一部の態様では、マトリックス組成物中の総タンパク質濃度は、約１ｎｇ／ｍＬ～約１ｍｇ／ｍＬであり得る。一部の好ましい実施形態では、マトリックス組成物中の総タンパク質濃度は、約１μｇ／ｍＬ～約３００μｇ／ｍＬである。より好ましい実施形態では、マトリックス組成物中の総タンパク質濃度は、約５μｇ／ｍＬ～約２００μｇ／ｍＬである。
【0154】
ＰＲＰ細胞又はＰＳＣ等の細胞を、細胞の各特定の集団の増殖を支持するのに必要な栄養素と共に培養することができる。一般に、細胞を、炭素源、窒素源、及びｐＨを維持するためのバッファーを含む増殖培地で培養する。この培地はまた、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化物質、ピルビン酸、緩衝剤、ｐＨ指示薬、及び無機塩も含み得る。例示的な増殖培地は、幹細胞の増殖を増強するために様々な栄養素（例えば、非必須アミノ酸及びビタミン）が補充されている最少必須培地（例えば、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ８（商標）（Ｅ８（商標））培地）を含む。最少必須培地の例として、最少必須培地イーグル（ＭＥＭ）アルファ培地、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ－１６４０培地、１９９培地、及びＦ１２培地が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、最少必須培地は、添加剤（例えば、ウマ、子ウシ、又はウシ胎仔の血清）を補充することができる。或いは、この培地は血清フリーでもよい。他の場合では、増殖培地は、培養中に未分化細胞（例えば幹細胞）を増殖させて維持するのに最適化されている血清フリー製剤と本明細書で称される「ノックアウト血清代替物」を含むことができる。ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）血清代替物は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００２／００７６７４７号明細書で開示されている。好ましくは、ＰＳＣを、完全に定義されており且つフィーダーフリーの培地で培養する。
【0155】
従って、単一細胞ＰＳＣを、一般に、播種後に、完全に定義されている培養培地で培養する。ある特定の態様では、播種の約１８～２４時間後に、培地を吸引し、新鮮な培地（例えばＥ８（商標）培地）を培養物に添加する。ある特定の態様では、単一細胞ＰＳＣを、播種後に約１、２、又は３日にわたり、完全に定義されている培養培地で培養する。好ましくは、単一細胞ＰＳＣを、分化プロセスを進める前に約２日にわたり、完全に定義されている培養培地で培養する。
【0156】
一部の実施形態では、培地は、血清の任意の代替物を含んでもよいし含まなくてもよい。血清の代替物として、アルブミン（例えば、脂質リッチアルブミン、アルブミン代用物（例えば組換えアルブミン）、植物デンプン、デキストラン、及びタンパク質加水分解物）、トランスフェリン（又は他の鉄輸送体）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール、３’－チオグリセロール、又はこれらの等価物を適切に含む物質が挙げられ得る。血清の代替物を、例えば国際公開第９８／３０６７９号パンフレットで開示されている方法により調製することができる。或いは、任意の市販の材料をより便利に使用することができる。市販の材料として、ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）血清代替物（ＫＳＲ）、化学的に定義されている脂質濃縮物（Ｇｉｂｃｏ）、及びＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）（Ｇｉｂｃｏ）が挙げられる。
【0157】
他の培養条件を適切に定義することができる。例えば、培養温度は、約３０～４０℃であり得、例えば、少なくとも又は約３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９℃であり得るが、これらに特に限定されない。一実施形態では、細胞を３７℃で培養する。ＣＯ2濃度は、約１～１０％（例えば約２～５％）であり得るか、又はこれらの中で導き出し得る任意の範囲であり得る。酸素分圧は、少なくとも、最大で、又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０％であり得るか、又はこれらの中で導き出し得る任意の範囲であり得る。
【0158】
Ａ．分化培地
網膜誘導培地
単一細胞ＰＳＣが培養プレートに付着した後、この細胞を、好ましくは、網膜誘導培地（ＲＩＭ）で培養して網膜系統細胞への分化プロセスを開始させる。ＲＩＭはＷＮＴ経路阻害剤を含み、網膜系統細胞へのＰＳＣの分化を引き起こすことができる。ＲＩＭは、ＴＧＦβ経路阻害剤及びＢＭＰ経路阻害剤をさらに含む。例示的な一ＲＩＭ培地を表１に示す。
網膜誘導培地
単一細胞ＰＳＣが培養プレートに付着した後、この細胞を、好ましくは、網膜誘導培地（ＲＩＭ）で培養して網膜系統細胞への分化プロセスを開始させる。ＲＩＭはＷＮＴ経路阻害剤を含み、網膜系統細胞へのＰＳＣの分化を引き起こすことができる。ＲＩＭは、ＴＧＦβ経路阻害剤及びＢＭＰ経路阻害剤をさらに含む。例示的な一ＲＩＭ培地を表１に示す。
【0159】
ＲＩＭは、ＤＭＥＭ及びＦ１２を約１：１の比で含み得る。例示的な方法では、ＷＮＴ経路阻害剤（例えばＣＫＩ－７）がＲＩＭに含まれており、ＢＭＰ経路阻害剤（例えばＬＤＮ１９３１８９）が含まれており、且つＴＧＦβ経路阻害剤（例えばＳＢ４３１５４２）が含まれている。例えば、ＲＩＭは、約５ｎＭ～約５０ｎＭ（例えば約１０ｎＭ）のＬＤＮ１９３１８９、約０．１μＭ～約５μＭ（例えば約０．５μＭ）のＣＫＩ－７、及び約０．５μＭ～約１０μＭ（例えば約１μＭ）のＳＢ４３１５４２を含む。加えて、ＲＩＭは、ノックアウト血清代替物（例えば約１％～約５％）、ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、ピルビン酸ナトリウム、Ｎ－２サプリメント、Ｂ－２７サプリメント、アスコルビン酸、及びインスリン増殖因子１（ＩＧＦ１）を含み得る。好ましくは、ＩＧＦ１は動物フリーＩＧＦ１（ＡＦ－ＩＧＦ１）であり、約０．１ｎｇ／ｍＬ～約１０ｎｇ／ｍＬ（例えば約１ｎｇ／ｍＬ）でＲＩＭに含まれている。培地を毎日吸引して、新鮮なＲＩＭと交換する。細胞を、一般に、約１～約５日（例えば、約１、２、３、４、又は５日、例えば約２日）にわたりＲＩＭで培養して、前部神経外胚葉細胞を製造する。
【0160】
網膜分化培地
次いで、前部神経外胚葉細胞を、さらなる分化のために網膜分化培地（ＲＤ）で培養することができる。ＲＤは、ＷＮＴ経路阻害剤、ＴＧＦβ経路阻害剤、及びＭＥＫ阻害剤を含む。一実施形態では、ＲＤは、ＷＮＴ経路阻害剤（例えばＣＫＩ－７）、所望によりＢＭＰ経路阻害剤（例えばＬＤＮ１９３１８９）、ＴＧＦβ経路阻害剤（例えばＳＢ４３１５４２）、及びＭＥＫ阻害剤（例えばＰＤ０３２５９０１）を含む。一般に、ＷＮＴ経路阻害剤、ＢＭＰ経路阻害剤、及びＴＧＦβ経路阻害剤の濃度は、ＲＩＭと比較してＲＤＭ中で高く、例えば約９～約１１倍高く、例えば約１０倍高い。例示的な方法では、ＲＤは、約５０ｎＭ～約２００ｎＭ（例えば約１００ｎＭ）のＬＤＮ１９３１８９、約１μＭ～約１０μＭ（例えば約５μＭ）のＣＫＩ－７、約１μＭ～約５０μＭ（例えば約１０μＭ）のＳＢ４３１５４２、及び約０．１μＭ～約１０μＭ（例えば、約１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、又は９μＭ）のＰＤ０３２５９０１を含む。例示的なＲＤを表１に示す。
次いで、前部神経外胚葉細胞を、さらなる分化のために網膜分化培地（ＲＤ）で培養することができる。ＲＤは、ＷＮＴ経路阻害剤、ＴＧＦβ経路阻害剤、及びＭＥＫ阻害剤を含む。一実施形態では、ＲＤは、ＷＮＴ経路阻害剤（例えばＣＫＩ－７）、所望によりＢＭＰ経路阻害剤（例えばＬＤＮ１９３１８９）、ＴＧＦβ経路阻害剤（例えばＳＢ４３１５４２）、及びＭＥＫ阻害剤（例えばＰＤ０３２５９０１）を含む。一般に、ＷＮＴ経路阻害剤、ＢＭＰ経路阻害剤、及びＴＧＦβ経路阻害剤の濃度は、ＲＩＭと比較してＲＤＭ中で高く、例えば約９～約１１倍高く、例えば約１０倍高い。例示的な方法では、ＲＤは、約５０ｎＭ～約２００ｎＭ（例えば約１００ｎＭ）のＬＤＮ１９３１８９、約１μＭ～約１０μＭ（例えば約５μＭ）のＣＫＩ－７、約１μＭ～約５０μＭ（例えば約１０μＭ）のＳＢ４３１５４２、及び約０．１μＭ～約１０μＭ（例えば、約１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、又は９μＭ）のＰＤ０３２５９０１を含む。例示的なＲＤを表１に示す。
【0161】
一部の態様では、細胞を、ＢＭＰ阻害剤の非存在下での分化の前に、一定期間にわたり、ＢＭＰ阻害剤（例えばＬＤＮ１９１３１８９）の存在下で最初に分化させることができる。最初に、前部神経外胚葉細胞を、約１～３日（例えば２日）にわたり、ＢＭＰ経路阻害剤（例えばＬＤＮ１９３１８９）を含むＲＤ１で培養する。次に、この細胞を、ＢＭＰ経路阻害剤を含まないＲＤ２で培養する。第２の工程は、前部神経外胚葉細胞の分化を継続するために、約５～１０日（例えば約７日）にわたることができる。この方法による、その後に製造されたＰＲＰ細胞中でのＶＳＸ２の発現の増加を見出した。ＶＳＸ２は、眼胞及び杯状体内の神経ＲＰＣの最初期の特異的マーカーである（Ｒｏｗａｎら、２００４年）。ＶＳＸ２+網膜前駆細胞は、神経網膜の全ての細胞型（錐体、杆体、神経節細胞、アマクリン細胞、双極細胞、水平細胞、及びミュラーグリア）を生じさせることができる。
【0162】
一般に、ＲＤは、約１：１の比でのＤＭＥＭ及びＦ１２、ノックアウト血清代替物（例えば約１％～約５％、例えば約１．５％）、ＭＥＭ ＮＥＡＡ、ピルビン酸ナトリウム、Ｎ－２サプリメント、Ｂ－２７サプリメント、アスコルビン酸、及びＩＧＦ１（例えば約１ｎｇ／ｍＬ～約５０ｎｇ／ｍＬ、例えば約１０ｎｇ／ｍＬ）を含む。特定の方法では、細胞に、前日からの培地の吸引後に毎日新鮮なＲＤを与える。一般に、細胞を、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、又は１６日（例えば約７日）にわたりＲＤＭで培養して、前部神経外胚葉細胞をＲＰＣへと分化させる。
【0163】
網膜成熟培地
次に、前部神経外胚葉細胞を、この細胞を網膜成熟培地（ＲＭ）で培養してＲＰＣを製造することにより、さらに分化させて拡大させることができる。ＲＭは、ニコチンアミドを含み得る。ＲＭは、約１ｍＭ～約５０ｍＭ（例えば約１０ｍＭ）のニコチンアミドを含み得る。ＲＭは、アスコルビン酸（例えば５０～５００μｍ、特に約１００～３００μｍ、例えば約２００μｍ）をさらに含み得る。好ましくは、ＲＭは、アクチビンＡを含まないか、又は本質的に含まない。例示的なＲＭ培地を表１に示す。ＲＭ（例えばＲＭ２）は、γ－セクレターゼ阻害剤（例えば、ＤＡＰＴ、塩基性ＦＧＦ）、及び／又はＴＧＦβ経路阻害剤（例えばＳＢ４３１５４２）をさらに含んでもよい。
次に、前部神経外胚葉細胞を、この細胞を網膜成熟培地（ＲＭ）で培養してＲＰＣを製造することにより、さらに分化させて拡大させることができる。ＲＭは、ニコチンアミドを含み得る。ＲＭは、約１ｍＭ～約５０ｍＭ（例えば約１０ｍＭ）のニコチンアミドを含み得る。ＲＭは、アスコルビン酸（例えば５０～５００μｍ、特に約１００～３００μｍ、例えば約２００μｍ）をさらに含み得る。好ましくは、ＲＭは、アクチビンＡを含まないか、又は本質的に含まない。例示的なＲＭ培地を表１に示す。ＲＭ（例えばＲＭ２）は、γ－セクレターゼ阻害剤（例えば、ＤＡＰＴ、塩基性ＦＧＦ）、及び／又はＴＧＦβ経路阻害剤（例えばＳＢ４３１５４２）をさらに含んでもよい。
【0164】
ＲＭは、約１：１の比でのＤＭＥＭ及びＦ１２、約１％～約５％（例えば約１．５％）でのノックアウト血清代替物、ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、ピルビン酸ナトリウム、Ｎ－２サプリメント、Ｂ－２７サプリメント、及びアスコルビン酸を含み得る。この培地を、室温のＲＭと毎日交換することができる。この細胞を、一般に、約８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７日（例えば約１０日）にわたりＲＭで培養して、拡大されたＲＰＣを誘導する。
【0165】
ＰＲＰ成熟培地（ＰＭ）
ＰＲＰを、ＰＲＰ成熟培地（ＰＭ）で成熟させることができる。例示的なＰＭ培地を表１に示す。ＰＭ培地は、アスコルビン酸、ニコチンアミド、及びγ－セクレターゼ阻害剤（例えばＤＡＰＴ（例えば、約１μＭ～約１０μＭ（例えば約５μＭ）のＤＡＰＴ））を含む。ＰＭ（例えばＰＭ２）はまた、ＣＤＫ阻害剤も含んでもよく、例えばＣＤＫ４／６阻害剤を含んでもよく、例えばＰＤ０３３２９９１（例えば、約１μＭ～約５０μＭ、例えば約１０μＭのＰＤ０３３２９９１）も含んでもよい。
ＰＲＰを、ＰＲＰ成熟培地（ＰＭ）で成熟させることができる。例示的なＰＭ培地を表１に示す。ＰＭ培地は、アスコルビン酸、ニコチンアミド、及びγ－セクレターゼ阻害剤（例えばＤＡＰＴ（例えば、約１μＭ～約１０μＭ（例えば約５μＭ）のＤＡＰＴ））を含む。ＰＭ（例えばＰＭ２）はまた、ＣＤＫ阻害剤も含んでもよく、例えばＣＤＫ４／６阻害剤を含んでもよく、例えばＰＤ０３３２９９１（例えば、約１μＭ～約５０μＭ、例えば約１０μＭのＰＤ０３３２９９１）も含んでもよい。
【0166】
ＰＭ培地は、約１：１の比でのＤＭＥＭ及びＦ１２、約１％～約５％（例えば約１．５％）でのノックアウト血清代替物、ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、ピルビン酸ナトリウム、Ｎ－２サプリメント、Ｂ－２７サプリメント、及びアスコルビン酸を含み得る。この培地を、室温のＰＭ培地と毎日交換し得る。この細胞を、一般に、約４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０日（例えば約１０日）にわたりＲＭ培地で培養して、成熟ＰＲＰ細胞を誘導する。
【0167】
光受容体前駆体誘導培地（ＦＤＳＣ）
ＲＰＣのさらなる分化のために、細胞を、好ましくはＦＤＳＣ培地で培養する。例示的なＦＤＳＣ培地を表１に示す。ＦＤＳＣ培地は、ＷＮＴ経路阻害剤、γ－セクレターゼ阻害剤、及びＴＧＦβ経路阻害剤を含む。一実施形態では、ＦＤＳＣは、ＷＮＴ経路阻害剤（例えばＣＫＩ－７）、ＴＧＦβ経路阻害剤（例えばＳＢ４３１５４２）、及びγ－セクレターゼ阻害剤（例えばＤＡＰＴ）を含む。例示的な方法では、ＦＤＳＣ培地は、約１μＭ～約１０μＭ（例えば約５μＭ）のＣＫＩ－７、約１μＭ～約５０μＭ（例えば約１０μＭ）のＳＢ４３１５４２、及び約１μＭ～約１０μＭ（例えば約５μＭ）のＤＡＰＴを含む。ＦＤＳＣは、塩基性ＦＧＦも含んでもよい。
ＲＰＣのさらなる分化のために、細胞を、好ましくはＦＤＳＣ培地で培養する。例示的なＦＤＳＣ培地を表１に示す。ＦＤＳＣ培地は、ＷＮＴ経路阻害剤、γ－セクレターゼ阻害剤、及びＴＧＦβ経路阻害剤を含む。一実施形態では、ＦＤＳＣは、ＷＮＴ経路阻害剤（例えばＣＫＩ－７）、ＴＧＦβ経路阻害剤（例えばＳＢ４３１５４２）、及びγ－セクレターゼ阻害剤（例えばＤＡＰＴ）を含む。例示的な方法では、ＦＤＳＣ培地は、約１μＭ～約１０μＭ（例えば約５μＭ）のＣＫＩ－７、約１μＭ～約５０μＭ（例えば約１０μＭ）のＳＢ４３１５４２、及び約１μＭ～約１０μＭ（例えば約５μＭ）のＤＡＰＴを含む。ＦＤＳＣは、塩基性ＦＧＦも含んでもよい。
【0168】
ＦＤＳＣ培地は、約１：１の比でのＤＭＥＭ及びＦ１２、約１％～約５％（例えば約１．５％）でのノックアウト血清代替物、ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、ピルビン酸ナトリウム、Ｎ－２サプリメント、Ｂ－２７サプリメント、及びアスコルビン酸を含み得る。加えて、この培地は、塩基性ＦＧＦ（例えば約５ｎｇ／ｍＬ～約１５ｎｇ／ｍＬ（例えば約１０ｎｇ／ｍＬ））を含み得る。この培地を、室温のＦＤＳＣ培地と毎日交換することができる。この細胞を、一般に、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０日（例えば約１５日）にわたりＦＤＳＣで培養して、ＰＲＰ細胞を誘導する。
【表1】
【0169】
加えて、この培地にブレビスタチン（例えば約２．５μＭ）を添加して、凝集体形成を促進することにより、ＰＲＰ生存率を増加させ得、且つ純度を維持することができる。或いは、ブレビスタチンの代わりのＲＯＣＫ阻害剤を使用して、例えばＴＲＹＰＬＥ（商標）を使用することにより、単一細胞への解離後にＰＲＰ生存率を増加させてもよい。
【0170】
ＰＲＰ凝集体を培養して、ハイブリッド光受容体細胞又は眼胞を製造することができる。
【0171】
Ｂ．ＰＲＰ細胞の凍結保存
本明細書で開示されている方法により製造された光受容体前駆体細胞を凍結保存し得、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際公開第２０１２／１４９４８４Ａ２号パンフレットを参照されたい。この細胞を、基材と共に又は基材なしで凍結保存することができる。いくつかの実施形態では、保存温度は、約－５０℃～約－６０℃、約－６０℃～約－７０℃、約－７０℃～約－８０℃、約－８０℃～約－９０℃、約－９０℃～約－１００℃、及びこれらの重複範囲の範囲である。一部の実施形態では、凍結保存された細胞の保存（例えば維持）のために、より低い温度を使用する。いくつかの実施形態では、液体窒素（又は他の同様の冷却液）を使用して細胞を保存する。さらなる実施形態では、この細胞を、約６時間超にわたり保存する。追加の実施形態では、この細胞を約７２時間保存する。いくつかの実施形態では、この細胞を、４８時間から約１週間保存する。さらに他の実施形態では、この細胞を、約１、２、３、４、５、６、７、又は８週間にわたり保存する。さらなる実施形態では、この細胞を、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２ヶ月にわたり保存する。この細胞を、より長い時間にわたっても保存することができる。この細胞は、別々に凍結保存することができ、又は本明細書で開示されている基材のいずれか等の基材上で凍結保存することができる。
本明細書で開示されている方法により製造された光受容体前駆体細胞を凍結保存し得、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際公開第２０１２／１４９４８４Ａ２号パンフレットを参照されたい。この細胞を、基材と共に又は基材なしで凍結保存することができる。いくつかの実施形態では、保存温度は、約－５０℃～約－６０℃、約－６０℃～約－７０℃、約－７０℃～約－８０℃、約－８０℃～約－９０℃、約－９０℃～約－１００℃、及びこれらの重複範囲の範囲である。一部の実施形態では、凍結保存された細胞の保存（例えば維持）のために、より低い温度を使用する。いくつかの実施形態では、液体窒素（又は他の同様の冷却液）を使用して細胞を保存する。さらなる実施形態では、この細胞を、約６時間超にわたり保存する。追加の実施形態では、この細胞を約７２時間保存する。いくつかの実施形態では、この細胞を、４８時間から約１週間保存する。さらに他の実施形態では、この細胞を、約１、２、３、４、５、６、７、又は８週間にわたり保存する。さらなる実施形態では、この細胞を、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２ヶ月にわたり保存する。この細胞を、より長い時間にわたっても保存することができる。この細胞は、別々に凍結保存することができ、又は本明細書で開示されている基材のいずれか等の基材上で凍結保存することができる。
【0172】
一部の実施形態では、追加の抗凍結剤を使用することができる。例えば、この細胞を、１種又は複数種の抗凍結剤（例えば、ＤＭ８０、血清アルブミン（例えばヒト血清アルブミン若しくはウシ血清アルブミン））を含む凍結保存溶液中で凍結保存することができる。ある特定の実施形態では、この溶液は、約１％、約１．５％、約２％、約２．５％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、又は約１０％のＤＭＳＯを含む。他の実施形態では、この溶液は、約１％～約３％、約２％～約４％、約３％～約５％、約４％～約６％、約５％～約７％、約６％～約８％、約７％～約９％、又は約８％～約１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）又はアルブミンを含む。ある特定の実施形態では、この溶液は２．５％のＤＭＳＯを含む。別の特定の実施形態では、この溶液は１０％のＤＭＳＯを含む。
【0173】
細胞を、例えば凍結保存中に約１℃／分で冷却することができる。一部の実施形態では、凍結保存温度は、約－８０℃～約－１８０℃又は約－１２５℃～約－１４０℃である。一部の実施形態では、細胞を、４℃まで冷却した後に、約１℃／分で冷却する。凍結保存された細胞を、使用のために解凍する前に、液体窒素の蒸気相に移すことができる。一部の実施形態では、例えば、この細胞が約－８０℃に達すると、この細胞を液体窒素保存領域に移す。凍結保存を、速度が制御された冷凍庫を使用しても行うことができる。凍結保存された細胞を、例えば約２５℃～約４０℃の温度で、典型的には約３７℃の温度で、解凍することができる。
【0174】
或いは、この細胞を、単一細胞懸濁液に解離させることなく凝集体として凍結保存することができる。例えば、ＰＲＰ富化の後に、単一細胞を、最少培地（ＲＭＮ）で２日にわたり組織培養フラスコ中で再凝集させることができる。凝集体をプールして、細胞計数のためにサンプルアリコートを得ることができる。一連の洗浄の後、凝集体をＣｒｙｏＳＴＯＲ ＣＳ１０ Ｆｒｅｅｚｅ Ｍｅｄｉｕｍに再懸濁させ得、この凝集体懸濁液を、例えば２５×１０＾６個の凝集細胞製品／バイアルで液体窒素保存バイアルに移すことができる。
【0175】
Ｃ．阻害剤
ＷＮＴ経路阻害剤
ＷＮＴは、細胞間相互作用を調節する高度に保存されている分泌シグナル伝達分子のファミリであり、ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）セグメント極性遺伝子ウイングレス（ｗｉｎｇｌｅｓｓ）と関連している。ヒトでは、遺伝子のＷＮＴファミリは、３８～４３ｋＤａのシステインリッチ糖タンパク質をコードする。ＷＮＴタンパク質は、疎水性シグナル配列、保存されているアスパラギン結合オリゴ糖コンセンサス配列（例えば、Ｓｈｉｍｉｚｕら Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ ８：１３４９－１３５８（１９９７）を参照されたい）、及び２２個の保存されているシステイン残基を有する。ＷＮＴタンパク質は、細胞質ベータ－カテニンの安定化を促進する能力のために、転写活性化因子として働いてアポトーシスを阻害することができる。特定のＷＮＴタンパク質の過剰発現は、ある種の癌と関連していることが示されている。
ＷＮＴ経路阻害剤
ＷＮＴは、細胞間相互作用を調節する高度に保存されている分泌シグナル伝達分子のファミリであり、ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）セグメント極性遺伝子ウイングレス（ｗｉｎｇｌｅｓｓ）と関連している。ヒトでは、遺伝子のＷＮＴファミリは、３８～４３ｋＤａのシステインリッチ糖タンパク質をコードする。ＷＮＴタンパク質は、疎水性シグナル配列、保存されているアスパラギン結合オリゴ糖コンセンサス配列（例えば、Ｓｈｉｍｉｚｕら Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ ８：１３４９－１３５８（１９９７）を参照されたい）、及び２２個の保存されているシステイン残基を有する。ＷＮＴタンパク質は、細胞質ベータ－カテニンの安定化を促進する能力のために、転写活性化因子として働いてアポトーシスを阻害することができる。特定のＷＮＴタンパク質の過剰発現は、ある種の癌と関連していることが示されている。
【0176】
本明細書におけるＷＮＴ阻害剤（ＷＮＴ経路阻害剤とも称される）は、一般に、ＷＮＴ阻害剤を指す。そのため、ＷＮＴ阻害剤は、ＷＮＴファミリタンパク質のメンバー（例えば、Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ２ｂ、Ｗｎｔ３、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５Ａ、Ｗｎｔ６、Ｗｎｔ７Ａ、Ｗｎｔ７Ｂ、Ｗｎｔ８Ａ、Ｗｎｔ９Ａ、Ｗｎｔ１０ａ、Ｗｎｔ１１、及びＷｎｔ１６）の任意の阻害剤を指す。本方法のある特定の実施形態は、分化培地中のＷＮＴ阻害剤に関する。当該技術分野で既知である適切なＷＮＴ阻害剤の例として、下記が挙げられる：Ｎ－（２－アミノエチル）－５－クロロイソキノリン－８－スルホンアミド二塩酸塩（ＣＫＩ－７）、Ｎ－（６－メチル－２－ベンゾチアゾリル）－２－［（３，４，６，７－テトラヒドロ－４－オキソ－３－フェニルチエノ［３，２－ｄ］ピリミジン－２－イル）チオ］－アセトアミド（ＩＷＰ２）、Ｎ－（６－メチル－２－ベンゾチアゾリル）－２－［（３，４，６，７－テトラヒドロ－３－（２－メトキシフェニル）－４－オキソチエノ［３，２－ｄ］ピリミジン－２－イル）チオ］－アセトアミド（ＩＷＰ４）、２－フェノキシ安息香酸－［（５－メチル－２－フラニル）メチレン］ヒドラジド（ＰＮＵ７４６５４）２，４－ジアミノ－キナゾリン、ケルセチン、３，５，７，８－テトラヒドロ－２－［４－（トリフルオロメチル）フェニル］－４Ｈ－チオピラノ［４，３－ｄ］ピリミジン－４－オン（ＸＡＶ９３９）、２，５－ジクロロ－Ｎ－（２－メチル－４－ニトロフェニル）ベンゼンスルホンアミド（ＦＨ５３５）、Ｎ－［４－［２－エチル－４－（３－メチルフェニル）－５－チアゾリル］－２－ピリジニル］ベンズアミド（ＴＡＫ７１５）、ジクコフ（Ｄｉｃｋｋｏｐｆ）関連タンパク質１（ＤＫＫ１）、及び分泌フリズルド関連タンパク質（ＳＦＲＰ１）１。加えて、ＷＮＴの阻害剤として、ＷＮＴに対する抗体、ＷＮＴのドミナントネガティブバリアント、並びにＷＮＴの発現を抑制するｓｉＲＮＡ及びアンチセンス核酸が挙げられ得る。ＲＮＡ媒介性干渉（ＲＮＡｉ）を使用しても、ＷＮＴの阻害を達成することができる。
【0177】
ＢＭＰ経路阻害剤
骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）は、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）スーパーファミリに属する多機能性増殖因子である。ＢＭＰは、重要な形態形成シグナルの一群を構成すると見なされており、身体全体にわたり構造を組織化する。生理におけるＢＭＰシグナルの重要な機能は、病理プロセスにおけるＢＭＰシグナル伝達の調節不全に関する多数の役割により強調される。
骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）は、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）スーパーファミリに属する多機能性増殖因子である。ＢＭＰは、重要な形態形成シグナルの一群を構成すると見なされており、身体全体にわたり構造を組織化する。生理におけるＢＭＰシグナルの重要な機能は、病理プロセスにおけるＢＭＰシグナル伝達の調節不全に関する多数の役割により強調される。
【0178】
ＢＭＰ経路阻害剤（本明細書ではＢＭＰ阻害剤とも称される）は、一般にはＢＭＰシグナル伝達の阻害剤を含み得るか、又はＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ１０、若しくはＢＭＰ１５に特異的な阻害剤を含み得る。例示的なＢＭＰ阻害剤として、下記が挙げられる：４－（６－（４－（ピペラジン－１－イル）フェニル）ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－イル）キノリン塩酸塩（ＬＤＮ１９３１８９）、６－［４－［２－（１－ピペリジニル）エトキシ］フェニル］－３－（４－ピリジニル）－ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン二塩酸塩（ドルソモルフィン）、４－［６－（４－（１－メチルエトキシ）フェニル］ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－イル］－キノリン（ＤＭＨ１）、４－［６－［４－［２－（４－モルホリニル）エトキシ］フェニル］ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－イル］キノリン（ＤＭＨ－２）、及び５－［６－（４－メトキシフェニル）ピラゾロ［１，５－ａ］ピリミジン－３－イル］キノリン（ＭＬ３４７）。
【0179】
ＴＧＦβ経路阻害剤
トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）は、ほとんどの細胞において、増殖、細胞分化、及び他の機能を制御する分泌タンパク質である。ＴＧＦβは、免疫、癌、気管支喘息、肺線維症、心疾患、糖尿病、及び多発性硬化症で役割を果たすサイトカインの一種である。ＴＧＦ－βには、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、及びＴＧＦ－β３と呼ばれる少なくとも３つのアイソフォームが存在する。ＴＧＦ－βファミリは、トランスフォーミング増殖因子ベータスーパーファミリとして既知のタンパク質のスーパーファミリの一部（例えば、インヒビン、アクチビン、抗ミュラー管ホルモン、骨形成タンパク質、デカペンタプレジック、及びＶｇ－１）である。
トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）は、ほとんどの細胞において、増殖、細胞分化、及び他の機能を制御する分泌タンパク質である。ＴＧＦβは、免疫、癌、気管支喘息、肺線維症、心疾患、糖尿病、及び多発性硬化症で役割を果たすサイトカインの一種である。ＴＧＦ－βには、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、及びＴＧＦ－β３と呼ばれる少なくとも３つのアイソフォームが存在する。ＴＧＦ－βファミリは、トランスフォーミング増殖因子ベータスーパーファミリとして既知のタンパク質のスーパーファミリの一部（例えば、インヒビン、アクチビン、抗ミュラー管ホルモン、骨形成タンパク質、デカペンタプレジック、及びＶｇ－１）である。
【0180】
ＴＧＦβ経路阻害剤（本明細書ではＴＧＦβ阻害剤とも称される）は、一般に、ＴＧＦβシグナル伝達のあらゆる阻害剤を含み得る。例えば、ＴＧＦβ阻害剤は、４－［４－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－５－（２－ピリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］ベンズアミド（ＳＢ４３１５４２）、６－［２－（１，１－ジメチルエチル）－５－（６－メチル－２－ピリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－４－イル］キノキサリン（ＳＢ５２５３３４）、２－（５－ベンゾ［１，３］ジオキソール－５－イル－２－イエリ（ｉｅｒｉ）－ブチル－３Ｈ－イミダゾール－４－イル）－６－メチルピリジン塩酸塩水和物（ＳＢ－５０５１２４）、４－（５－ベンゾール［１，３］ジオキソール－５－イル－４－ピリジン－２－イル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）－ベンズアミド水和物、４－［４－（１，３－ベンゾジオキソール－５－イル）－５－（２－ピリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］－ベンズアミド水和物、左右決定因子（レフティ）、３－（６－メチル－２－ピリジニル）－Ｎ－フェニル－４－（４－キノリニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボチオアミド（Ａ８３－０１）、４－［４－（２，３－ジヒドロ－１，４－ベンゾジオキシン－６－イル）－５－（２－ピリジニル）－１Ｈ－イミダゾール－２－イル］ベンズアミド（Ｄ４４７６）、４－［４－［３－（２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－２－ピリジニル］－Ｎ－（テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－４－イル）－ベンズアミド（ＧＷ７８８３８８）、４－［３－（２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］－キノリン（ＬＹ３６４８４７）、４－［２－フルオロ－５－［３－（６－メチル－２－ピリジニル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル］フェニル］－１Ｈ－ピラゾール－１－エタノール（Ｒ２６８７１２）、又は２－（３－（６－メチルピリジン－２－イル）－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）－１，５－ナフチリジン（ＲｅｐＳｏｘ）である。
【0181】
ＭＥＫ阻害剤
ＭＥＫ阻害剤は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ酵素ＭＥＫ１又はＭＥＫ２を阻害する化学物質又は薬物である。この化学物質及び薬物を使用して、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路に影響を及ぼすことができる。例えば、ＭＥＫ阻害剤として、下記が挙げられる：Ｎ－［（２Ｒ）－２，３－ジヒドロキシプロポキシ］－３，４－ジフルオロ－２－［（２－フルオロ－４－ヨードフェニル）アミノ］－ベンズアミド（ＰＤ０３２５９０１）、Ｎ－［３－［３－シクロプロピル－５－（２－フルオロ－４－ヨードアニリノ）－６，８－ジメチル－２，４，７－トリオキソピリド［４，３－ｄ］ピリミジン－１－イル］フェニル］アセトアミド（ＧＳＫ１１２０２１２）、６－（４－ブロモ－２－フルオロアニリノ）－７－フルオロ－Ｎ－（２－ヒドロキシエトキシ）－３－メチルベンズイミダゾール－５－カルボキサミド（ＭＥＫ１６２）、Ｎ－［３，４－ジフルオロ－２－（２－フルオロ－４－ヨードアニリノ）－６－メトキシフェニル］－１－（２，３－ジヒドロキシプロピル）シクロプロパン－１－スルホンアミド（ＲＤＥＡ１１９）、及び６－（４－ブロモ－２－クロロアニリノ）－７－フルオロ－Ｎ－（２－ヒドロキシエトキシ）－３－メチルベンズイミダゾール－５－カルボキサミド（ＡＺＤ６２４４）。
ＭＥＫ阻害剤は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ酵素ＭＥＫ１又はＭＥＫ２を阻害する化学物質又は薬物である。この化学物質及び薬物を使用して、ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路に影響を及ぼすことができる。例えば、ＭＥＫ阻害剤として、下記が挙げられる：Ｎ－［（２Ｒ）－２，３－ジヒドロキシプロポキシ］－３，４－ジフルオロ－２－［（２－フルオロ－４－ヨードフェニル）アミノ］－ベンズアミド（ＰＤ０３２５９０１）、Ｎ－［３－［３－シクロプロピル－５－（２－フルオロ－４－ヨードアニリノ）－６，８－ジメチル－２，４，７－トリオキソピリド［４，３－ｄ］ピリミジン－１－イル］フェニル］アセトアミド（ＧＳＫ１１２０２１２）、６－（４－ブロモ－２－フルオロアニリノ）－７－フルオロ－Ｎ－（２－ヒドロキシエトキシ）－３－メチルベンズイミダゾール－５－カルボキサミド（ＭＥＫ１６２）、Ｎ－［３，４－ジフルオロ－２－（２－フルオロ－４－ヨードアニリノ）－６－メトキシフェニル］－１－（２，３－ジヒドロキシプロピル）シクロプロパン－１－スルホンアミド（ＲＤＥＡ１１９）、及び６－（４－ブロモ－２－クロロアニリノ）－７－フルオロ－Ｎ－（２－ヒドロキシエトキシ）－３－メチルベンズイミダゾール－５－カルボキサミド（ＡＺＤ６２４４）。
【0182】
ガンマ－セクレターゼ阻害剤
ガンマセクレターゼは、膜貫通ドメイン内の残基でシングルパス膜貫通タンパク質を開裂するマルチサブユニットプロテアーゼ複合体（これ自体が膜内在性タンパク質である）である。このタイプのプロテアーゼは、膜内プロテアーゼとして知られている。ガンマセクレターゼの最も公知の基質は、大きい膜内在性タンパク質であるアミロイド前駆体タンパク質であり、この膜内在性タンパク質は、ガンマセクレターゼ及びベータセクレターゼの両方により開裂されると、アミロイドベータと呼ばれる短いアミノ酸ペプチドを生じ、このアミノ酸ペプチドの異常に折り畳まれたフィブリル形態は、アルツハイマー病患者の脳中で見出されるアミロイド斑の主要な構成要素である。
ガンマセクレターゼは、膜貫通ドメイン内の残基でシングルパス膜貫通タンパク質を開裂するマルチサブユニットプロテアーゼ複合体（これ自体が膜内在性タンパク質である）である。このタイプのプロテアーゼは、膜内プロテアーゼとして知られている。ガンマセクレターゼの最も公知の基質は、大きい膜内在性タンパク質であるアミロイド前駆体タンパク質であり、この膜内在性タンパク質は、ガンマセクレターゼ及びベータセクレターゼの両方により開裂されると、アミロイドベータと呼ばれる短いアミノ酸ペプチドを生じ、このアミノ酸ペプチドの異常に折り畳まれたフィブリル形態は、アルツハイマー病患者の脳中で見出されるアミロイド斑の主要な構成要素である。
【0183】
本明細書のガンマセクレターゼ阻害剤は、一般に、γ－セクレターゼ阻害剤を指す。例えば、γ－セクレターゼ阻害剤として下記が挙げられるが、これらに限定されない：Ｎ－［（３，５－ジフルオロフェニル）アセチル］－Ｌ－アラニル－２－フェニル］グリシン－１，１－ジメチルエチルエステル（ＤＡＰＴ）、５－クロロ－Ｎ－［（１Ｓ）－３，３，３－トリフルオロ－１－（ヒドロキシメチル）－２－（トリフルオロメチル）プロピル］－２－チオフェンスルホンアミド（ベガスエステイト）、ＭＤＬ－２８１７０、３，５－ビス（４－ニトロフェノキシ）安息香酸（コンパウンドＷ）、７－アミノ－４－クロロ－３－メトキシ－１Ｈ－２－ベンゾピラン（ＪＬＫ６）、（５Ｓ）－（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニルアミノ）－６－フェニル－（４Ｒ）－ヒドロキシ－（２Ｒ）－ベンジルヘキサノイル）－Ｌ－ロイシ－Ｌ－フェニルアラニンアミド（Ｌ－６８５，４８５）、（Ｒ）－２－フルオロ－α－メチル［１，１’－ビフェニル］－４－酢酸（（Ｒ）－フルルビプロフェン；フルリザン）、Ｎ－［（１Ｓ）－２－［［（７Ｓ）－６，７－ジヒドロ－５－メチル－６－オキソ－５Ｈ－ジベンゾ［ｂ，ｄ］アゼピン－７－イル］アミノ］－１－メチル－２－オキソエチル］－３，５－ジフルオロベンゼンアセトアミド（ジベンザゼピン；ＤＢＺ）、Ｎ－［ｃｉｓ－４－［（４－クロロフェニル）スルホニル］－４－（２，５－ジフルオロフェニル）シクロヘキシル］－１，１，１－トリフルオロメタンスルホンアミド（ＭＲＫ５６０）、（２Ｓ）－２－［［（２Ｓ）－６，８－ジフルオロ－１，２，３，４－テトラヒドロ－２－ナフタレニル］アミノ］－Ｎ－［１－［２－［（２，２－ジメチルプロピル）アミノ］－１，１－ジメチルエチル］－１Ｈ－イミダゾール－４－イル］ペンタンアミド二臭化水素酸塩（ＰＦ３０８４０１４臭化水素酸塩）、及び２－［（１Ｒ）－１－［［（４－クロロフェニル）スルホニル］（２，５－ジフルオロフェニル）アミノ］エチル－５－フルオロベンゼンブタン酸（ＢＭＳ２９９８９７）。
【0184】
サイクリン依存性キナーゼ阻害剤
サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）は、細胞周期の制御における役割に関して最初に発見された糖キナーゼのファミリである。ＣＤＫはまた、神経細胞の転写、ｍＲＮＡプロセシング、及び分化の制御にも関与している。多くのヒト癌では、ＣＤＫが過剰に活性であるか、又はＣＤＫ阻害タンパク質が機能していない。ＣＤＫ阻害剤は、ＣＤＫ１阻害剤、ＣＤＫ２阻害剤、ＣＤＫ３阻害剤、ＣＤＫ４阻害剤、ＣＤＫ５阻害剤、ＣＤＫ６阻害剤、ＣＤＫ７阻害剤、ＣＤＫ８阻害剤、及び／又はＣＤＫ９阻害剤であり得る。特定の態様では、ＣＤＫ阻害剤は、ＣＤＫ４／６阻害剤である。
サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）は、細胞周期の制御における役割に関して最初に発見された糖キナーゼのファミリである。ＣＤＫはまた、神経細胞の転写、ｍＲＮＡプロセシング、及び分化の制御にも関与している。多くのヒト癌では、ＣＤＫが過剰に活性であるか、又はＣＤＫ阻害タンパク質が機能していない。ＣＤＫ阻害剤は、ＣＤＫ１阻害剤、ＣＤＫ２阻害剤、ＣＤＫ３阻害剤、ＣＤＫ４阻害剤、ＣＤＫ５阻害剤、ＣＤＫ６阻害剤、ＣＤＫ７阻害剤、ＣＤＫ８阻害剤、及び／又はＣＤＫ９阻害剤であり得る。特定の態様では、ＣＤＫ阻害剤は、ＣＤＫ４／６阻害剤である。
【0185】
ＣＤＫ阻害剤として下記が挙げられ得るが、これらに限定されない：パルボシクリブ（ＰＤ－０３３２９９１）ＨＣｌ、ロスコビチン（セリシクリブ、ＣＹＣ２０２）、ＳＮＳ－０３２（ＢＭＳ－３８７０３２）、ディナシクリブ（Ｄｉｎａｃｉｃｌｉｂ）（ＳＣＨ７２７９６５）、フラボピリドール（アルボシジブ）、ＭＳＣ２５３０８１８、ＪＮＪ－７７０６６２１、ＡＺＤ５４３８、ＭＫ－８７７６（ＳＣＨ ９００７７６）、ＰＨＡ－７９３８８７、ＢＳ－１８１ ＨＣｌ、Ａ－６７４５６３、アベマシクリブ（ＬＹ２８３５２１９）、ＢＭＳ－２６５２４６、ＰＨＡ－７６７４９１、又はミルシクリブ（Ｍｉｌｃｉｃｌｉｂ）（ＰＨＡ－８４８１２５）。
【0186】
ＩＶ．光受容体前駆体細胞の使用
ある特定の態様は、多くの重要な研究目的、開発目的、及び商業目的に使用され得るＰＲＰ又はＰＲＰ富化細胞集団を製造する方法を提供する。
ある特定の態様は、多くの重要な研究目的、開発目的、及び商業目的に使用され得るＰＲＰ又はＰＲＰ富化細胞集団を製造する方法を提供する。
【0187】
一部の態様では、本明細書で開示されている方法により、少なくとも又は約５０％（例えば、少なくとも又は約６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又はこれらの中で導き出し得る任意の範囲）のＰＲＰ細胞を含む少なくとも又は約１０6、１０7、１０8、５×１０8、１０9、１０10個の細胞（又はこれらの中で導き出し得る任意の範囲）の細胞集団が得られる。
【0188】
ある特定の態様では、本方法のための出発細胞は、少なくとも又は約１０4、１０5、１０6、１０7、１０8、１０9、１０10、１０11、１０12、１０13個の細胞又はこれらの中で導き出し得る任意の範囲の使用を含み得る。この出発細胞集団は、少なくとも又は約１０1、１０2、１０3、１０4、１０5、１０6、１０7、１０8個の細胞／ｍＬ又はこれらの中で導き出し得る任意の範囲の播種密度を有し得る。
【0189】
本明細書で開示されている方法により製造されたＰＲＰ細胞又は光受容体細胞を、ＰＲＰ又は光受容体細胞に関して当該技術分野で現在知られている任意の方法及び用途で使用することができる。例えば、化合物を評価する方法であって、ＰＲＰ又は光受容体細胞に対するこの化合物の薬理学的特性又は毒性学的特性をアッセイすることを含む方法を提供することができる。ＰＲＰ細胞への効果に関して化合物を評価する方法であって、ａ）本明細書で提供されるＰＲＰ細胞と、この化合物を接触させること、及びｂ）このＰＲＰ細胞へのこの化合物の効果をアッセイすることを含む方法も提供することができる。
【0190】
ＰＲＰ細胞、又はＰＲＰ細胞に由来する細胞を、細胞レスキュー治療又は全組織置換治療等の移植に使用することができる。本実施形態の細胞を、病態生理を研究するための網膜疾患モデルの作製にも使用し得、薬物スクリーニングにも使用することができる。
【0191】
Ａ．試験化合物のスクリーニング
ＰＲＰ細胞を商業的に使用して、そのような細胞及びその様々な後代の特性に影響を及ぼす因子（例えば、溶媒、低分子薬物、ペプチド、オリゴヌクレオチド）又は環境条件（例えば、培養条件又は操作）に関してスクリーニングすることができる。例えば、試験化合物は、化合物、低分子、ポリペプチド、増殖因子、サイトカイン、又は他の生物学的薬剤であり得る。
ＰＲＰ細胞を商業的に使用して、そのような細胞及びその様々な後代の特性に影響を及ぼす因子（例えば、溶媒、低分子薬物、ペプチド、オリゴヌクレオチド）又は環境条件（例えば、培養条件又は操作）に関してスクリーニングすることができる。例えば、試験化合物は、化合物、低分子、ポリペプチド、増殖因子、サイトカイン、又は他の生物学的薬剤であり得る。
【0192】
一実施形態では、方法は、ＰＲＰ細胞と、試験薬剤とを接触させること、及びこの試験薬剤が集団内のＰＲＰ細胞の活性又は機能を調節するかどうかを決定することを含む。一部の用途では、ＰＲＰ細胞の増殖を調節するか、ＰＲＰ細胞の分化を変更するか、又は細胞生存率に影響を及ぼす薬剤の同定に、スクリーニングアッセイを使用する。スクリーニングアッセイを、インビトロ又はインビボで実施することができる。眼用薬剤又はＰＲＰ薬剤をスクリーニングして同定する方法として、ハイスループットスクリーニングに適したものが挙げられる。例えば、ＰＲＰ細胞を、潜在的な治療用分子の同定のために、所望により定義された位置で、培養皿、フラスコ、ローラーボトル、又はプレート（例えば、単一のマルチウェルディッシュ又はディッシュ、例えば、８、１６、３２、６４、９６、３８４、及び１５３６マルチウェルプレート又はディッシュ）の上に配置し得るか、又は設置し得る。スクリーニングし得るライブラリとして、例えば、低分子ライブラリ、ｓｉＲＮＡライブラリ、及びアデノウイルストランスフェクションベクターライブラリが挙げられる。
【0193】
他のスクリーニング用途は、網膜組織の維持又は修復への効果に関する医薬化合物の試験に関する。この化合物が、この細胞に対して薬理学的効果を有するように設計されていることから、又は他の箇所で効果を有するように設計されている化合物が、この組織型の細胞に対して意図されていない副作用を有する場合があることから、スクリーニングが行うことができる。
【0194】
Ｂ．治療及び移植
他の実施形態はまた、必要な任意の状態（例えば、網膜変性又は重大な損傷）に関する眼組織の維持及び修復を増強するためのＰＲＰ細胞の使用も提供することができる。網膜変性は、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、スターガルト黄斑ジストロフィー、網膜色素変性症、緑内障、網膜血管病、眼のウイルス感染、及び他の網膜／眼疾患と関連する場合がある。光受容体前駆体細胞は、培養物中の細胞の少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は約１００％を構成することができる。
他の実施形態はまた、必要な任意の状態（例えば、網膜変性又は重大な損傷）に関する眼組織の維持及び修復を増強するためのＰＲＰ細胞の使用も提供することができる。網膜変性は、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、スターガルト黄斑ジストロフィー、網膜色素変性症、緑内障、網膜血管病、眼のウイルス感染、及び他の網膜／眼疾患と関連する場合がある。光受容体前駆体細胞は、培養物中の細胞の少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、又は約１００％を構成することができる。
【0195】
別の態様では、本開示は、必要な個体の処置の方法であって、前記個体に、光受容体前駆体細胞を含む組成物を投与することを含む方法を提供する。前記組成物を、眼、網膜下腔、又は静脈内に投与することができる。そのような個体は、加齢黄斑変性等の黄斑変性症を有し得、そのような黄斑変性症は、初期段階であってもよいし後期段階であってもよい。そのような個体は、網膜色素変性症、シュタルガルト病、網膜異形成症、網膜変性症、糖尿病性網膜症、先天性網膜ジストロフィー、レーバー先天黒内障、網膜剥離、緑内障、又は神経障害を有し得る。
【0196】
治療的投与に関する細胞組成物の適合性を決定するために、細胞を、適切な動物モデルで最初に試験することができる。一態様では、ＰＲＰ細胞を、その生存する能力に関して及びその表現型を維持する能力に関してインビボで評価する。細胞組成物を、免疫不全動物（例えば、ヌードマウス、又は化学的に若しくは放射線照射により免疫不全にされた動物）に投与する。組織を、増殖期間後に回収し、多能性幹細胞由来の細胞が依然として存在するかどうかを評価する。
【0197】
ＰＲＰ細胞組成物の適合性の試験に、多くの動物が利用可能である。例えば、Ｒｏｙａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｓｕｒｇｅｏｎ’ｓ（ＲＣＳ）ラットは、網膜ジストロフィーの公知のモデルである（Ｌｕｎｄら、２００６年）。加えて、ＰＲＰ細胞の適合性及び生存率を、ＮＯＧマウス等の免疫不全動物でのマトリゲルにおける移植（例えば、皮下又は網膜）により決定することができる（Ｋａｎｅｍｕｒａら、２０１４年）。使用され得る他のモデルとして、網膜変性のＳ３３４ｔｅｒラットモデル、及びＮＩＨ Ｒｏｗｅｔｔヌード（ＲＮＵ）ラットモデルが挙げられるが、これらに限定されない。
【0198】
本明細書で説明されているヒトＰＲＰ細胞、又はこの細胞を含む医薬組成物を、必要な患者の状態を処置するための薬物の製造に使用することができる。ＰＲＰ細胞を、予め冷凍保存することができる。ある特定の態様では、本開示のＰＲＰ細胞はｉＰＳＣに由来しており、そのため、眼疾患を有する患者に「個別化医療」を提供するために使用することができる。一部の実施形態では、患者から得られた体細胞を、疾患を引き起こす変異を修正するために遺伝子操作し、ＰＲＰに分化させ、且つＰＲＰ組織を形成するように操作することができる。このＰＲＰ組織を使用して、同一患者の内因性の変性ＰＲＰを置き換えることができる。或いは、健康なドナー又はＨＬＡホモ接合性「スーパードナー」から生成されたｉＰＳＣを使用することができる。
【0199】
様々な眼の状態を、本明細書で開示されている方法を使用して得られたＰＲＰ細胞の導入により、処置し得るか、又は予防し得る。この状態として、網膜疾患、又は一般に網膜の機能不全若しくは分解、網膜損傷、及び／若しくは網膜色素上皮の喪失と関連する疾患が挙げられる。処置され得る状態として、網膜の変性疾患（例えば、スターガルト黄斑ジストロフィー、網膜色素変性症、黄斑変性症（例えば加齢黄斑変性症）、緑内障、及び糖尿病性網膜症）が挙げられるが、これに限定されない。さらなる状態として、下記が挙げられる：レーバー先天黒内障、遺伝性又は後天性の黄斑変性症、ベスト病、網膜剥離、脳回転状萎縮症、全脈絡膜萎縮、パターンジストロフィー、光受容体細胞の他のジストロフィー、及び光、レーザー、炎症、感染、放射線、血管新生、又は外傷による損傷のいずれか１つにより引き起こされる損傷に起因する網膜損傷。ある特定の実施形態では、網膜変性を特徴とする状態を処置するか又は予防するための方法であって、ＰＲＰ細胞を含む組成物の有効な量を、必要な対象に投与することを含む方法が提供される。この方法は、これらの状態の内の１つ又は複数を有する対象を選択すること、並びにこの状態を処置するのに及び／又はこの状態の症状を寛解させるのに十分なＰＲＰ細胞の治療上有効な量を投与することを含み得る。ＰＲＰ細胞を、様々な形態で移植することができる。例えば、ＰＲＰ細胞を、細胞懸濁液の形態で標的部位に導入してもよいし、単層として、マトリックス、細胞外マトリックス、又は基材（例えば生分解性ポリマー）上に付着させてもよいし、組み合わせであってもよい。また、ＰＲＰ細胞を、網膜色素上皮細胞等の他の網膜細胞と一緒に移植してもよい（共移植）。一部の実施形態では、ＰＲＰ細胞は、処置される対象由来のｉＰＳＣから製造されており、そのため自家性である。他の実施形態では、ＰＲＰ細胞は、ＭＨＣ適合ドナーから製造されている。
【0200】
有利には、本開示の医薬組成物を使用して、光受容体細胞機能の欠如又は低下を補償することができる。本発明の網膜細胞集団及び方法により処置され得る網膜機能障害の例として、下記が挙げられるが、これらに限定されない：光受容体変性（例えば、網膜色素変性症、錐体ジストロフィー、錐体－杆体及び／又は杆体－錐体ジストロフィー、並びに黄斑変性症で起こるもの）；網膜剥離及び網膜外傷；レーザー又は太陽光により引き起こされる光損傷；黄斑円孔；黄斑浮腫；夜盲症及び色覚異常；糖尿病又は血管閉塞により引き起こされた虚血性網膜症；早産児／早産に起因する網膜症；感染性状態、例えば、ＣＭＶ、網膜炎、及びトキソプラズマ症；炎症性状態、例えばぶどう膜炎；腫瘍、例えば網膜芽細胞腫及び眼内黒色腫；並びに眼神経障害（例えば、緑内障、外傷性視神経症、並びに放射線視神経症及び網膜症）に罹患している網膜内ニューロンの置き換え。
【0201】
一態様では、本細胞は、処置が必要な患者の網膜色素変性症の症状を処置することができるか、又は緩和することができる。別の態様では、この細胞は、この処置が必要な患者の黄斑変性症（例えば、加齢黄斑変性症（湿式又は乾式）、シュタルガルト病、近視性の黄斑変性症、又は同類のもの）の症状を処置することができる、又は緩和することができる。これらの処置の全てのために、この細胞は、患者に対して、自家性であり得るか、又は同種であり得る。さらなる態様では、本開示の細胞を、他の処置と組み合わせて投与することができる。
【0202】
一部の実施形態では、ＰＲＰ細胞を、再生医療を受けるのに適した対象に対する自家性ＰＲＰ移植片に使用することができる。ＰＲＰ細胞を、光受容体等の他の網膜細胞と組み合わせて移植することができる。本開示の方法により製造されたＰＲＰ細胞の移植を、当該技術分野で既知の様々な技術により実施することができる。一実施形態によれば、経扁平部硝子体切除術、及びその後の網膜下腔への小さい網膜開口を介した細胞の送達により、又は直接注射により、移植を実施する。ＰＲＰ細胞を、細胞懸濁液、細胞凝集体の形態で標的部位に導入することができるか、細胞外マトリックス等のマトリックス上に付着させることができるか、生分解性ポリマー等の基材上に提供することができる。同様に、ＰＲＰ細胞を、他の細胞と一緒に移植（共移植）することができる（例えば、ＰＲＰ細胞及び網膜色素上皮（ＰＲＥ）細胞）。そのため、本明細書で開示されている方法により得られたＰＲＰ細胞を含む組成物が提供される。
【0203】
ＰＲＰ細胞、及び、所望により、このＰＲＰ細胞から分化した光受容体細胞を使用して、神経感覚網膜構造体を生成することができる。例えば、本開示は、ＲＰＥ細胞及び光受容体細胞（又はＰＲＰ細胞）で構成されている多層細胞構造体の生成を企図する。この構造体を、薬物スクリーニングに使用することができるか、疾患のモデルとして使用することができるか、又は医薬品として若しくは医薬品で使用することができる。後者の場合には、この医薬品はＲＰＥ－光受容体移植片であり得、このＲＰＥ－光受容体移植片は、「パッチ」のように移植し得る生体適合性の固体支持体又はマトリックス（好ましくは、生体適合性のマトリックス又は支持体）上に配置することができる。
【0204】
さらに説明するために、細胞の生体適合性支持体は、網膜前駆体細胞の生分解性合成（例えばポリエステル）フィルム支持体であり得る。生分解性ポリエステルは、網膜前駆体細胞の増殖及び分化を支持する基材又は足場としての使用に適した任意の生分解性ポリエステルであり得る。ポリエステルは、薄膜（好ましくは微細な模様が表面に付いた膜）を形成し得るべきであり、且つ組織又は細胞の移植に使用される場合には生分解性であるべきである。本発明での使用に適した生分解性ポリエステルとして、下記が挙げられる：ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリラクチド、ポリヒドロキシアルカノエート、ホモポリマー及びコポリマーの両方、例えば、ポリヒドロキシブチレート（ＰＨＢ）、ポリヒドロキシブチレートｃｏ－ヒドロキシバリレート（ＰＨＢＶ）、ポリヒドロキシブチレートｃｏ－ヒドロキシヘキサノート（ＰＨＢＨｘ）、ポリヒドロキシブチレートｃｏ－ヒドロキシオクトノアート（ＰＨＢＯ）及びポリヒドロキシブチレートｃｏ－ヒドロキシオクタデカノエート（ＰＨＢＯｄ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリエステルアミド（ＰＥＡ）、脂肪族コポリエステル、例えば、ポリブチレンスクシネート（ＰＢＳ）及びポリブチレンスクシネート／アジペート（ＰＢＳＡ）、芳香族コポリエステル。高分子量ポリエステル及び低分子量ポリエステルの両方、置換ポリエステル及び非置換ポリエステル、ブロック、分枝又はランダム、並びにポリエステルの混合物及びブレンドを使用することができる。好ましくは、生分解性ポリエステルは、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）である。
【0205】
本明細書で開示されている方法により製造されたＰＲＰ細胞の医薬組成物。この組成物は、少なくとも約１×１０3個のＰＲＰ細胞、約１×１０4個のＰＲＰ細胞、約１×１０5個のＰＲＰ細胞、約１×１０6個のＰＲＰ細胞、約１×１０7個のＰＲＰ細胞、約１×１０8個のＰＲＰ細胞、又は約１×１０9個のＰＲＰ細胞を含むことができる。ある特定の実施形態では、この組成物は、本明細書で開示されている方法により製造された分化ＰＲＰ細胞を含む、（非ＰＲＰ細胞に関して）実質的に精製された調製物である。足場（例えば、ポリマー担体及び／又は細胞外マトリックス）、並びに本明細書で開示されている方法により製造されたＰＲＰ細胞の有効な量を含む組成物も提供される。例えば、この細胞は、細胞の単層として提供される。マトリックス材料は、一般には生理学的に許容され、インビボでの用途での使用に適している。例えば、生理学的に許容される材料として、下記が挙げられるが、これらに限定されない：吸収性である及び／又は非吸収性である固体マトリックス材料、例えば、小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）、架橋アルギネート又は非架橋アルギネート、親水コロイド、発泡体、コラーゲンゲル、コラーゲンスポンジ、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）メッシュ、フリース、及び生体接着剤。
【0206】
適切なポリマー担体として、合成ポリマー又は天然ポリマー、及びポリマー溶液で形成された多孔質のメッシュ又はスポンジも挙げられる。例えば、マトリックスは、ポリマーのメッシュ若しくはスポンジであるか、又は高分子ヒドロゲルである。使用され得る天然ポリマーとして、タンパク質、例えば、コラーゲン、アルブミン、及びフィブリン；並びに多糖類、例えば、アルギン酸塩、及びヒアルロン酸のポリマーが挙げられる。合成ポリマーとして、生分解性ポリマー及び非生分解性ポリマーの両方が挙げられる。例えば、生分解性ポリマーとしてヒドロキシ酸のポリマーが挙げられ、例えば、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、及びポリ乳酸－グリコール酸（ＰＧＬＡ）、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリホスファゼン、及びこれらの組み合わせが挙げられる。非生分解性ポリマーとして、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、エチレンビニルアセテート、及びポリビニルアルコールが挙げられる。
【0207】
可鍛性であるイオン的に又は共有結合的に架橋されたヒドロゲルを形成し得るポリマーを使用することができる。ヒドロゲルは、有機ポリマー（天然又は合成）が、共有結合、イオン結合、又は水素結合を介して架橋されて、水分子を捕捉してゲルを形成する三次元開格子構造を作る際に形成される物質である。ヒドロゲルを形成するために使用され得る材料の例として、イオン的に架橋されている多糖類（例えば、アルギネート、ポリホスファゼン、及びポリアクリレート）、又はブロックコポリマー（例えば、ＰＬＵＲＯＮ１ＣＳ（商標）若しくはＴＥＴＲＯＮ１ＣＳ（商標）、温度若しくはＨそれぞれにより架橋されているポリエチレンオキシド－ポリプロピレングリコールブロックコポリマー）が挙げられる。他の材料として、フィブリン等のタンパク質、ポリビニルピロリドン等のポリマー、ヒアルロン酸、及びコラーゲンが挙げられる。
【0208】
本医薬組成物を、所望の目的（例えば、網膜組織の疾患又は異常を改善するためのＰＲＰ細胞機能の再構成）のための書面による指示と共に、適切な容器に所望により包装することができる。一部の実施形態では、本開示の方法により製造されたＰＲＰ細胞を使用して、必要な対象の変性光受容体細胞を置き換えることができる。
【0209】
Ｃ．商業目的、治療目的、及び研究目的のための流通
一部の実施形態では、製造、流通、又は使用のいずれでも存在するＰＲＰ又はＰＲＰ富化細胞集団を含む細胞のセット又は組み合わせを含む試薬システムが提供される。この細胞セットは、本明細書で説明されている細胞集団と、未分化多能性幹細胞又は他の分化細胞型との任意の組み合わせを含み、同一ゲノムを共有していることが多い。各細胞型を、同一の実体の制御下において、又はビジネス関係を共有する異なる実体の制御下において、同時に又は異なる時間で、同一の施設内にて又は異なる場所にて、一緒に又は別々の容器で包装することができる。
一部の実施形態では、製造、流通、又は使用のいずれでも存在するＰＲＰ又はＰＲＰ富化細胞集団を含む細胞のセット又は組み合わせを含む試薬システムが提供される。この細胞セットは、本明細書で説明されている細胞集団と、未分化多能性幹細胞又は他の分化細胞型との任意の組み合わせを含み、同一ゲノムを共有していることが多い。各細胞型を、同一の実体の制御下において、又はビジネス関係を共有する異なる実体の制御下において、同時に又は異なる時間で、同一の施設内にて又は異なる場所にて、一緒に又は別々の容器で包装することができる。
【0210】
医薬組成物を、所望の目的（例えば、眼組織の疾患又は損傷を改善するためのＰＲＰ細胞機能の再構成）のための書面による指示と共に、適切な容器に所望により包装することができる。
【0211】
Ｖ．キット
一部の実施形態では、例えば、ＰＲＰ細胞を製造するための１種又は複数種の培地及び成分を含み得るキットが提供される。そのような製剤は、光受容体前駆体又は光受容体細胞と組み合わせるのに適した形態で、網膜分化因子及び／又は栄養因子のカクテルを含み得る。この試薬システムは、必要に応じて、水性媒体で凍結乾燥の形態で包装することができる。このキットの容器手段は、一般に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、又は他の容器手段を含み、この中に成分が入れられ得、好ましくは適切に分注することができる。このキットに複数種の成分が含まれる場合には、このキットはまた、一般に、第２、第３、又は他の追加の容器を含み、これらの中に追加の成分を別々に入れることができる。しかしながら、１つのバイアルに、成分の様々な組み合わせが含まれてもよい。このキットの成分は、乾燥粉末として提供することができる。試薬及び／又は成分が乾燥粉末として提供される場合には、この粉末を、適切な溶媒の添加により再構成することができる。この溶媒を別の容器手段で提供し得ることも想定される。このキットはまた、典型的には、商用販売のための厳重な閉じ込めでキット成分を含むための手段を含む。そのような容器として、所望のバイアルが保持される射出成形プラスチック容器又はブロー成形プラスチック容器が挙げられ得る。このキットはまた、例えば印刷形式又はデジタル形式等の電子形式の使用説明書も含み得る。
一部の実施形態では、例えば、ＰＲＰ細胞を製造するための１種又は複数種の培地及び成分を含み得るキットが提供される。そのような製剤は、光受容体前駆体又は光受容体細胞と組み合わせるのに適した形態で、網膜分化因子及び／又は栄養因子のカクテルを含み得る。この試薬システムは、必要に応じて、水性媒体で凍結乾燥の形態で包装することができる。このキットの容器手段は、一般に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジ、又は他の容器手段を含み、この中に成分が入れられ得、好ましくは適切に分注することができる。このキットに複数種の成分が含まれる場合には、このキットはまた、一般に、第２、第３、又は他の追加の容器を含み、これらの中に追加の成分を別々に入れることができる。しかしながら、１つのバイアルに、成分の様々な組み合わせが含まれてもよい。このキットの成分は、乾燥粉末として提供することができる。試薬及び／又は成分が乾燥粉末として提供される場合には、この粉末を、適切な溶媒の添加により再構成することができる。この溶媒を別の容器手段で提供し得ることも想定される。このキットはまた、典型的には、商用販売のための厳重な閉じ込めでキット成分を含むための手段を含む。そのような容器として、所望のバイアルが保持される射出成形プラスチック容器又はブロー成形プラスチック容器が挙げられ得る。このキットはまた、例えば印刷形式又はデジタル形式等の電子形式の使用説明書も含み得る。
【実施例0212】
ＶＩ．実施例
下記の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれている。下記の実施例で開示されている技術が、本発明の実施において良好に機能するように本発明者らにより発見されている技術を表し、そのため、本発明の実施のための好ましいモデルを構成すると見なされ得ることを当業者は認識すべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、開示されている具体的な実施形態において多くの変更がなされて類似の又は同様の結果が依然として得られ得ることを認識すべきである。
下記の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれている。下記の実施例で開示されている技術が、本発明の実施において良好に機能するように本発明者らにより発見されている技術を表し、そのため、本発明の実施のための好ましいモデルを構成すると見なされ得ることを当業者は認識すべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、開示されている具体的な実施形態において多くの変更がなされて類似の又は同様の結果が依然として得られ得ることを認識すべきである。
【0213】
実施例１－出発多能性幹細胞集団の調製
光受容体前駆体（ＰＲＰ）の様々なステージへのｉＳＰＣの分化のための方法を開発した（図１）。簡潔に説明すると、網膜前駆体細胞（ＲＰＣ）の集団はｉＰＳＣに由来しており、次いで神経網膜前駆細胞（ＮＲＰ）へとさらに分化させ、次いでＰＲＰ細胞に分化させる。
光受容体前駆体（ＰＲＰ）の様々なステージへのｉＳＰＣの分化のための方法を開発した（図１）。簡潔に説明すると、網膜前駆体細胞（ＲＰＣ）の集団はｉＰＳＣに由来しており、次いで神経網膜前駆細胞（ＮＲＰ）へとさらに分化させ、次いでＰＲＰ細胞に分化させる。
【0214】
最初に、ｉＰＳＣを、ビトロネクチンでコーティングしたプレート上の完全に定義された培養培地（例えばＥＳＳＥＮＴＩＡＬ ８（商標）（Ｅ８（商標））培地）で、マウス又はヒトのフィーダー層を使用することなく増殖させた。ビトロネクチンストックを、カルシウム又はマグネシウムを含まないＤＰＢＳで１：２００に希釈し、この希釈されたビトロネクチン溶液で培養プレートをコーティングし、約１時間にわたり室温でインキュベートした。ｉＰＳＣを、このｉＰＳＣがプレコンフルエントである場合に分割して過剰に増殖させず、不健康な及び／又は分化した細胞を予防した。
【0215】
ＲＰＣを得るために、ｉＰＳＣを単一細胞懸濁液へと最初に解離させた。単一細胞懸濁液を得るために、この細胞をＤＰＢＳ（カルシウム及びマグネシウムを含まない）で洗浄し、３７℃で約１０分にわたり細胞解離酵素（例えばＴＲＹＰＬＥ（商標））中でインキュベートした。次いで、この細胞を、血清学的ピペットによるピペッティングにより剥離させ、細胞懸濁液をコニカルチューブに集めた。穏やかなピペッティングにより細胞が剥離しなかった場合には、培養物をより長く（例えばさらに２～３分間）インキュベートした。全ての細胞を回収するために、培養容器を室温のＥ８（商標）培地で洗浄し、次いで、この培地を、細胞懸濁液を含むチューブに入れた。加えて、細胞が培養容器に付着することなく、単一細胞への解離後のＰＳＣ生存率を増加させるために、Ｅ８（商標）培地にブレビスタチン（例えば２．５μＭ）を添加した。細胞を回収するために、約５分にわたり４００×ｇで遠心分離し、上清を吸引して、細胞を適切な体積のＥ８（商標）培地に再懸濁させた。
【0216】
単一細胞ｉＰＳＣからＰＲＰ細胞を効率的に分化させるために、単一細胞ｉＰＳＣの入力密度を、ＶＩＣＥＬＬ（商標）等の自動細胞カウンタで正確に計数し、室温のＥ８（商標）培地で約１×１０5個の細胞／ｍＬの細胞懸濁液に希釈した。ｉＰＳＣの単一細胞懸濁液を（例えば血球計数器により）既知の細胞密度で得ると、この細胞を、ビトロネクチンでコーティングした６ウェルプレート等の適切な培養容器に播種した。この細胞を、１つのウェル当たり約２００，０００個の細胞の細胞密度で播種し、５％ＣＯ2及び３７℃の加湿インキュベータに入れた。約１８～２４時間後、培地を吸引し、培養物に新鮮なＥ８（商標）培地を添加した。細胞を、適切な付着及びｉＰＳＣ拡大のために、播種後約２日にわたりＥ８（商標）培地で培養した。
【0217】
実施例２－ＲＰＣへのｉＳＰＣの分化
適切な細胞密度で播種した単一細胞ｉＰＳＣを、実施例１のように約２日にわたり培養すると、ＲＰＣを得るための様々な分化培地で培養した。Ｅ８（商標）培地を吸引し、室温の網膜誘導培地（ＲＩＭ）（例えば表１）を添加した。簡潔に説明すると、ＲＩＭは、約１：１の比でのＤＭＥＭ及びＦ１２、ノックアウト血清代替物、ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、ピルビン酸ナトリウム、Ｎ－２サプリメント、Ｂ－２７サプリメント、及びアスコルビン酸を含んだ。加えて、ＲＩＭは、ＷＮＴ経路阻害剤、ＢＭＰ経路阻害剤、ＴＧＦβ経路阻害剤、及びインスリン増殖因子１（ＩＧＦ１）を含んだ。毎日、培地を吸引して、細胞に新鮮なＲＩＭを添加した。この細胞を、約２日にわたりＲＩＭで培養して、前部神経外胚葉細胞を生成した。
適切な細胞密度で播種した単一細胞ｉＰＳＣを、実施例１のように約２日にわたり培養すると、ＲＰＣを得るための様々な分化培地で培養した。Ｅ８（商標）培地を吸引し、室温の網膜誘導培地（ＲＩＭ）（例えば表１）を添加した。簡潔に説明すると、ＲＩＭは、約１：１の比でのＤＭＥＭ及びＦ１２、ノックアウト血清代替物、ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、ピルビン酸ナトリウム、Ｎ－２サプリメント、Ｂ－２７サプリメント、及びアスコルビン酸を含んだ。加えて、ＲＩＭは、ＷＮＴ経路阻害剤、ＢＭＰ経路阻害剤、ＴＧＦβ経路阻害剤、及びインスリン増殖因子１（ＩＧＦ１）を含んだ。毎日、培地を吸引して、細胞に新鮮なＲＩＭを添加した。この細胞を、約２日にわたりＲＩＭで培養して、前部神経外胚葉細胞を生成した。
【0218】
次いで、この細胞を、約１～４日（特に約２日）にわたり網膜分化培地１（ＲＤ１）で培養した。簡潔に説明すると、ＲＤ１（表１）は、約１：１の比でのＤＭＥＭ及びＦ１２、ノックアウト血清代替物、ＭＥＭ ＮＥＡＡ、ピルビン酸ナトリウム、Ｎ－２サプリメント、Ｂ－２７サプリメント、及びアスコルビン酸を含んだ。加えて、ＲＤ１は、ＷＮＴ経路阻害剤（例えばＣＫＩ－７）、ＢＭＰ経路阻害剤（例えばＬＤＮ１９３１８９）、ＴＧＦβ経路阻害剤（例えばＳＢ４３１５４２）、及びＭＥＫ阻害剤（例えばＰＤ３２５９０１）、及びＩＧＦ－１を含んだ。ＷＮＴ経路阻害剤、ＢＭＰ経路阻害剤、及びＴＧＦβ経路阻害剤の濃度は、ＲＩＭと比較して、ＲＤＭでは１０倍高かった。毎日、培地を吸引し、細胞に室温のＲＤ１を添加して、分化網膜細胞を製造した。特に、最初の数日後（例えば２日後）にＢＭＰ阻害剤を除去して、ＰＲＰ細胞中でのＶＳＸ２の発現を増強してもよい。ＲＤＭ１培地を、ＢＭＰ阻害剤（例えばＬＤＮ１９３１８９）を含まないＲＤ２（表１）に置き換えてもよい。細胞を、約５～１０日（例えば約７日）にわたりＲＤ２で培養してもよい。
【0219】
ＮＲＰ細胞を得るために、次いで、細胞を、約５日にわたり網膜成熟培地（ＲＭ１又はＲＭ２）（表１）で培養して、ＲＰＣ細胞をＮＲＰに分化させた。ＲＭ１は、約１：１の比でのＤＭＥＭ及びＦ１２、ノックアウト血清代替物、ＭＥＭ ＮＥＡＡ、ピルビン酸ナトリウム、Ｎ－２サプリメント、Ｂ－２７サプリメント、及びアスコルビン酸を含んだ。加えて、ＲＭ１は、ニコチンアミドを含んだが、ＲＰＥ細胞への分化を防止するためにアクチビンＡを含まなかった。ＲＭ１培地は、γ－セクレターゼ阻害剤（例えばＤＡＰＴ）をさらに含んでもよい。ＲＭ２は、ＴＧＦβ阻害剤（例えばＳＢ４３１５４２）、及び／又はｂＦＧＦをさらに含んでもよい。この培地を、室温のＲＭ１と毎日交換した。次いで、ＲＰＣを、１５～１８日目に光受容体前駆体誘導培地（ＦＤＳＣ）培地で培養して、ＮＲＰ細胞を製造した。ＮＲＰ細胞を分析するために、ＮＲＰ細胞を解凍後培地に解凍し、ＰＡＸ６及びＶＳＸ２の発現に関してアッセイした（図１４）。ＮＲＰ細胞は、ＰＡＸ６に関してほぼ１００％陽性であり、ＰＭＥＬ１７に関して約９０％陽性であり、且つＶＳＸ２に関して約８０％陽性であることが分かった（図１４）。
【0220】
実施例３－ＲＰＣのＰＲＰ細胞への分化
ＰＲＰ細胞への分化プロセスを完了するために、実施例２のＲＰＣ細胞をＦＤＳＣ培地（表１）で培養した。簡潔に説明すると、ＦＤＳＣ培地は、約１：１の比でのＤＭＥＭ及びＦ１２、ノックアウト血清代替物、ＭＥＭ ＮＥＡＡ、ピルビン酸ナトリウム、Ｎ－２サプリメント、Ｂ－２７サプリメント、及びアスコルビン酸を含む。加えて、ＦＤＳＣ培地は、ＮＲＰをＰＲＰ細胞に分化させるために、塩基性ＦＧＦ、ＤＡＰＴ、ＳＢ４３１５４２、及びＣＫＩ－７を含んでもよい。この細胞を、約１０～２０日（特に１５日）にわたりＦＤＳＣ培地で培養した。ＰＲＰ細胞を、マーカーＴｕｊ１／ネスチン及びＲＣＶＲＮの発現に関して分析した（図４Ａ～４Ｃ）。
ＰＲＰ細胞への分化プロセスを完了するために、実施例２のＲＰＣ細胞をＦＤＳＣ培地（表１）で培養した。簡潔に説明すると、ＦＤＳＣ培地は、約１：１の比でのＤＭＥＭ及びＦ１２、ノックアウト血清代替物、ＭＥＭ ＮＥＡＡ、ピルビン酸ナトリウム、Ｎ－２サプリメント、Ｂ－２７サプリメント、及びアスコルビン酸を含む。加えて、ＦＤＳＣ培地は、ＮＲＰをＰＲＰ細胞に分化させるために、塩基性ＦＧＦ、ＤＡＰＴ、ＳＢ４３１５４２、及びＣＫＩ－７を含んでもよい。この細胞を、約１０～２０日（特に１５日）にわたりＦＤＳＣ培地で培養した。ＰＲＰ細胞を、マーカーＴｕｊ１／ネスチン及びＲＣＶＲＮの発現に関して分析した（図４Ａ～４Ｃ）。
【0221】
この段階で、得られたＰＲＰ細胞を、ＴＲＹＰＬＥ（商標）を使用して解離させて、異種成分フリーＣＳ１０培地中で凍結保存することができる。或いは、得られたＰＲＰ細胞を、１～５日（例えば３日）にわたりＲＯＣＫ阻害剤又はブレビスタチンを含む培地で培養して凝集体形成を促進させ、より良好な細胞の生存率及び移植を促進することができる。そのため、本開示の方法は、臨床応用のために大規模で一貫して再現され得る多能性細胞由来のＰＲＰ細胞を提供する。
【0222】
実施例４－眼胞の製造
実施例２のＲＰＣ細胞を、長時間にわたりＲＭ１培地又はＲＭ２培地で凝集体として培養して、眼胞を製造した。ブレビスタチンを使用して、凝集体形成を促進させた。ＲＭ１培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ノックアウト血清代替物、ピルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸、及びニコチンアミドを含んだ。この眼胞を、３０日目、４０日目、５０日目、及び６０日目に、マーカー発現に関して評価した。４０日目の３．３％から７８日目の３０％超まで、ＲＣＶＲＮ発現が増加していた（図１２Ｄ）。
実施例２のＲＰＣ細胞を、長時間にわたりＲＭ１培地又はＲＭ２培地で凝集体として培養して、眼胞を製造した。ブレビスタチンを使用して、凝集体形成を促進させた。ＲＭ１培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ノックアウト血清代替物、ピルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸、及びニコチンアミドを含んだ。この眼胞を、３０日目、４０日目、５０日目、及び６０日目に、マーカー発現に関して評価した。４０日目の３．３％から７８日目の３０％超まで、ＲＣＶＲＮ発現が増加していた（図１２Ｄ）。
【0223】
実施例５－ＰＲＰ細胞の製造の代替方法
実施例２のＲＰＣ細胞を、約４０～７０日にわたりＲＭ１培地又はＲＭ２培地（表１）で凝集体として培養した。凝集体形成の最中にブレビスタチンを使用した。ＲＭ２培地は、ＲＭ１培地の成分に加えてＤＡＰＴを含む。細胞は、約６８日目まで凝集体のままであり、この時点で細胞を解離させ、ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）で処理し、ＲＭ２培地に７日にわたり播種して、ハイブリッドＰＲＰ細胞を生成した。このハイブリッドＰＲＰ細胞は、実施例３のＰＲＰ細胞と同様の表現型を示した。磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）精製の後、ハイブリッドＰＲＰ細胞集団は、ＴＵＢＢ３に関して９７％超陽性であったが、ネスチンに関して陰性（＜３％）であり、ＲＣＶＲＮに関してほぼ８０％陽性であった（図１０）。
実施例２のＲＰＣ細胞を、約４０～７０日にわたりＲＭ１培地又はＲＭ２培地（表１）で凝集体として培養した。凝集体形成の最中にブレビスタチンを使用した。ＲＭ２培地は、ＲＭ１培地の成分に加えてＤＡＰＴを含む。細胞は、約６８日目まで凝集体のままであり、この時点で細胞を解離させ、ＢＥＮＺＯＮＡＳＥ（登録商標）で処理し、ＲＭ２培地に７日にわたり播種して、ハイブリッドＰＲＰ細胞を生成した。このハイブリッドＰＲＰ細胞は、実施例３のＰＲＰ細胞と同様の表現型を示した。磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）精製の後、ハイブリッドＰＲＰ細胞集団は、ＴＵＢＢ３に関して９７％超陽性であったが、ネスチンに関して陰性（＜３％）であり、ＲＣＶＲＮに関してほぼ８０％陽性であった（図１０）。
【0224】
実施例６－ＮＲＰ又はＰＲＰの凍結保存
分化したＮＲＰ又はＰＲＰの凍結保存のために、培地を吸引し、細胞を、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で洗浄した。次いで、この細胞を細胞解離酵素と共にインキュベートし、細胞懸濁液を、ピペットでコニカルチューブに入れた。この細胞を遠心分離し、上清を吸引し、細胞を室温の培地に再懸濁させた。次いで、細胞懸濁液をＳＴＥＲＩＦＬＩＰ（登録商標）細胞ストレーナ（２０μｍ）に通して濾過し、細胞を計数した。次に、この細胞を遠心分離し、冷ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０に適切な密度（例えば１×１０7個の細胞／ｍＬ）で再懸濁させた。細胞懸濁液を、予め標識したクライオバイアルに分配し、冷凍容器に入れて、１２～２４時間にわたり－８０℃の冷凍庫に移した。次いで、このバイアルを、保存のために液体窒素に移した。
分化したＮＲＰ又はＰＲＰの凍結保存のために、培地を吸引し、細胞を、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で洗浄した。次いで、この細胞を細胞解離酵素と共にインキュベートし、細胞懸濁液を、ピペットでコニカルチューブに入れた。この細胞を遠心分離し、上清を吸引し、細胞を室温の培地に再懸濁させた。次いで、細胞懸濁液をＳＴＥＲＩＦＬＩＰ（登録商標）細胞ストレーナ（２０μｍ）に通して濾過し、細胞を計数した。次に、この細胞を遠心分離し、冷ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０に適切な密度（例えば１×１０7個の細胞／ｍＬ）で再懸濁させた。細胞懸濁液を、予め標識したクライオバイアルに分配し、冷凍容器に入れて、１２～２４時間にわたり－８０℃の冷凍庫に移した。次いで、このバイアルを、保存のために液体窒素に移した。
【0225】
或いは、この細胞を、単一細胞懸濁液への解離の代わりに凝集体として凍結保存してもよい。例えば、Ｄ７５ ＰＲＰのＣｌｉｎｉＭＡＣＳ富化の後、単一細胞を、最少培地（ＲＭＮ）で２日にわたり組織培養フラスコ中で再凝集させた。凝集体をＤ７７でプールし、サンプルアリコートを、細胞計数のために得た。一連の洗浄の後、凝集体をＣｒｙｏＳＴＯＲ ＣＳ１０凍結培地に再懸濁させ、凝集体懸濁液１ｍｌを、２５×１０＾６個の凝集細胞製品／バイアルで液体窒素保存バイアルに移した。
【0226】
形態学上、培養物中に残っていた、解凍した凝集体は、解凍後２日の単一細胞から形成された凝集体と変わらなかった。解凍した凝集体は、細胞生存率が、解凍した単一細胞の場合の３７％と比較して６７％であった。下記の４つの条件を、ＲＣＶＲＮ（オンターゲットＰＲＰマーカー）、ＣＨＸ１０（初期眼野細胞（ｅａｒｌｙ ｅｙｅ ｆｉｅｌｄ ｃｅｌｌ））、ＲＣＶＲＮ＋、ＣＨＸ１０（オフターゲット双極細胞）、Ｋｉ６７（オフターゲット増殖細胞）、及びＰａｘ６（オフターゲット神経外胚葉／初期眼野）の発現に関して試験した：凍結保存された単一細胞を解凍し、ＲＭＮ培地で２日にわたり再凝集させた（ＳＣ Ｄ７７ ２ｄ解凍後凝集体）；富化後の単一細胞を、凍結保存することなくＲＭＮで２日わたり凝集させた（Ｄ７７凍結保存前培養凝集体）；凍結保存された凝集体の解凍直後（解凍時のＤ７７凝集体）；及び凍結保存された凝集体を解凍し、ＲＭＮ培地で２日間培養した（Ｄ７９解凍凝集体培養２ｄ）。これら４つの条件の間に、ＲＣＶＲＮ発現の差違はなかった。初期眼野に関するオフターゲットマーカー（ＣＨＸ１０＋及びＰａｘ６＋）は、全ての条件で低いままであり、増殖細胞（Ｋｉ６７＋）は無視できるほどであった。
【0227】
【表2】
【0228】
そのため、凝集体を成功裏に凍結保存し得るだけでなく、富化されたＰＲＰが凍結保存段階又は解凍段階の間に損なわれないことが示された。このことは、オンターゲットＰＲＰマーカーであるリカバリンの同様の高発現により明らかであった。同様に、オフターゲットマーカー及び増殖細胞マーカーは、全ての条件にわたり同様に低いままであった。凝集体を凍結保存することにより、製品が、手渡しの「間」が最小で研究室から患者へと送られることが可能になり、なぜならば、移植される製品は凝集体の形態だからである。培養ステップの「間」の２日間を省略することにより、夾雑及び細胞の喪失の懸念が最小限に抑えられる。
【0229】
実施例７－ＰＲＰ細胞のＭＡＣＳ精製
ＰＲＰ細胞の集団は、ＰＲＥ細胞又は他の非ニューロン型等の残留夾雑非ＰＲＰ細胞（「夾雑細胞」と総称される）を有する可能性があり、この夾雑細胞の全てを分離して除去し、ＰＲＰ富化細胞集団を得ることができる。この夾雑細胞を、様々な方法論（例えば、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ（登録商標））、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、又は陽性選択及び／若しくは陰性選択による単一細胞選別）により、培養物から除去することができる。表面抗原に応じて様々な細胞集団を分離することが当該技術分野で知られているＭＡＣＳ（登録商標）方法論を使用して、所望のＰＲＰ細胞から夾雑細胞を分離した。
ＰＲＰ細胞の集団は、ＰＲＥ細胞又は他の非ニューロン型等の残留夾雑非ＰＲＰ細胞（「夾雑細胞」と総称される）を有する可能性があり、この夾雑細胞の全てを分離して除去し、ＰＲＰ富化細胞集団を得ることができる。この夾雑細胞を、様々な方法論（例えば、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ（登録商標））、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、又は陽性選択及び／若しくは陰性選択による単一細胞選別）により、培養物から除去することができる。表面抗原に応じて様々な細胞集団を分離することが当該技術分野で知られているＭＡＣＳ（登録商標）方法論を使用して、所望のＰＲＰ細胞から夾雑細胞を分離した。
【0230】
ＰＲＰ細胞に関する陽性ＭＡＣＳ選択は、ニューロンマーカーＣＤ１７１を発現する細胞の単離を含み得る。ＰＲＰ細胞に関する陽性ＭＡＣＳ選択を実行するために、実施例３又は６からのＰＲＰ細胞の全集団を、単一細胞懸濁液に解離させた。培地を吸引し、細胞をＤＰＢＳで洗浄し、ＴＲＹＰＬＥ（商標）を添加して細胞を解離させた。次いで、細胞を集めて遠心分離した。細胞を、ＰＲＰ培地で洗浄し、２０μｍ ｓｔｅｒｉｆｌｉｐ細胞ストレーナを使用して濾過した。ＶｉＣｅｌｌを使用して細胞懸濁液を計数し、この細胞懸濁液にＭＡＣＳバッファーを１×１０7個の細胞／ｍＬで添加した。次に、この細胞懸濁液を、１：２５の希釈にて一次抗体ＣＤ１７１－ビオチン（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）で染色した。インキュベーション後、ＭＡＣＳバッファー２０ｍＬを添加し、細胞を５分にわたり４００×ｇで遠心分離した。細胞ペレットをＭＡＣＳバッファー２０ｍＬに再懸濁させ、激しく混合し、５分にわたり４００×ｇで遠心分離して、あらゆる非結合抗体を除去した。細胞ペレットを、ＭＡＣＳバッファーに（例えば１．１１×１０8個の細胞／ｍＬで）再懸濁させ、希釈した（１：１０）二次抗体（例えば抗ビオチン）でコーティングされたマイクロビーズを添加し、細胞を２０分にわたり４℃でインキュベートした。インキュベーション後、細胞をＭＡＣＳバッファーで洗浄して非結合マイクロビーズを除去し、最大１．２５×１０8個の細胞をＭＡＣＳバッファー５００μＬに再懸濁させた。細胞懸濁液を、強地場中に置いたＬＳカラムに移し、マイクロビーズに付着している、抗原ＣＤ１７１を発現する細胞は、このカラム中に残存した。このＬＳカラムを、ＭＡＣＳバッファーで２回洗浄した。次いで、このＬＳカラムから富化細胞集団を洗い流し、選別後純度分析に関して評価した。ＲＣＶＲＮに関する細胞染色の画像を、ＭＡＣＳ富化がＰＲＰ細胞の有意な富化をもたらすことを示す図３及び図９に示す。
【0231】
さらなる研究を実施して、ＰＲＰ細胞の富化のための追加の表面タンパク質を同定した。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｍａｒｋｅｒ Ｓｃｒｅｅｎプレートを使用した表面タンパク質評価により、光受容体前駆体（ＰＲＰ）製品を富化するための表面タンパク質標的として、ＳＵＳＤ２を同定した。Ｓｕｓｈｉドメイン含有タンパク質－２（ＳＵＳＤ２）は、細胞－細胞付着及び細胞－マトリックス付着を促進するＩ型膜貫通タンパク質である。ＳＵＳＤ２の過剰発現が癌細胞で観測されており、ＳＵＳＤ２は、様々な間葉系幹細胞の確立された富化マーカーである。表面タンパク質に関してＤ７５ ＰＲＰ ２．３ ＣＢＰをアッセイすることにより、主に光受容体で発現されるニューロン特異的カルシウム結合タンパク質であるリカバリンに関して陽性に標識されている細胞上でのＳＵＳＤ２発現の上昇が明らかになった。この発見により、ＳＵＳＤ２を、富化マーカーとしての使用に関して試験した。
【0232】
ＳＵＳＤ２は、光受容体になる運命にある細胞により発現されるマーカーであるリカバリンとの高い共発現を有した。加えて、ＳＵＳＤ２は、ＣＤ１７１富化後の約８３％のリカバリン陽性細胞と比較して、約９５％のリカバリン陽性－陽性細胞で富化された（図３１）。ＤＡＰＴで予め処理し、次いでＤＡＰＴの存在下でＰＤ０３３を含むＬＮ５２１に播種した細胞に対して、研究を実施した。初期の神経網膜前駆細胞に対して高度の選択的な転写因子であるＣＨＸ１０と結合したリカバリンは、（錐体）双極細胞の顕著な特徴付けマーカーと見なすことができる（図３４）。双極細胞は、光受容体及び神経節細胞と相互に連結されてシグナル伝達を促進する、後期に生じた網膜ニューロンである。ＣＨＸ１０陽性（リカバリン陰性）細胞は、ミュラーグリア細胞のサブセットでも発現される場合がある。
【0233】
ＳＵＳＤ２発現を、ＭＡＣＳ富化の前に、Ｄ５５～Ｄ１０５の分化エンドポイントに関して、ＲＣＶＲＮ発現と同時に調べた（図３２）。ＳＵＳＤ２がＰＲＰのみを標的として他の網膜ニューロンを標的としない精度は、最終製品の純度に重要であった。ＳＵＳＤ２富化後の低い細胞収量にもかかわらず、ＳＵＳＤ２マーカーは、調べた各時点でリカバリン発現細胞を富化しており（表３）、このことは、ＳＵＳＤ２が、リカバリン陽性の可能性があるＰＲＰの高度に特異的なマーカーであることを示唆する。図３３は、ＳＵＳＤ２標的特異性をさらに示す。
【0234】
既に論じたように、ＣＨＸ１０及びリカバリンは、（錐体）双極細胞の顕著な特徴付けマーカーである。ＣＨＸ１０は、網膜前駆細胞中で初期に発現され、有糸分裂後のＰＲＰでは発現を下方制御するが、有糸分裂後の双極細胞及び一部のミュラーグリア細胞では高度に発現されたままである。この研究から、ＣＨＸ１０は、ＳＵＳＤ２ ＭＡＣＳ富化前後の両方において、より早い（Ｄ６５）タイムポイントでは低いことが分かった。加えて、リカバリン－ＣＨＸ１０発現は、この時点では無視できるほどであり、このことは、この時点では、ＳＵＳＤ２富化後の製品中に双極細胞が存在しないことを示唆する。
【0235】
逆に、リカバリンと、光受容体の最終分化において役割を果たす一時的に発現される転写因子であるニューロン分化因子１（ＮｅｕｒｏＤ１、ＮＤ１）との共標識により、Ｄ６５のＳＵＳＤ２ ＭＡＣＳ富化前後での高い発現レベルが示された。Ｄ６５を過ぎると、ＲＣＶＲＮ－ＣＨＸ１０を発現する双極細胞（及び／又は場合によりＣＨＸ１０を発現する一部のミュラーグリア細胞）を観測した。ＲＣＶＲＮ－ＮＤ１発現は徐々に下方制御され、この組み合わせは、Ｄ６５及びＤ７５と比較して富化Ｄ８５細胞の半分未満で発現されており、ＮＤ１の一過性の発現と一致する可能性がある。
【0236】
【表3】
【0237】
これらの研究は、ピークＳＵＳＤ２発現時間と相まって、ＳＵＳＤ２は、Ｄ６５等の初期の時点での良好な富化マーカーであることを示唆した。さらに、Ｄ６５では、ＳＵＳＤ２は、ＲＣＶＲＮ発現細胞及びＮＤ１発現細胞に対して高度の選択性を示したが、ＣＨＸ１０発現（オフターゲット又は前駆）細胞に対しては選択性を示さなかった。ＳＵＳＤ２の選択的性質は、富化後の細胞収率がわずかな場合であっても、高度にリカバリン陽性の純粋集団の富化により強調された。全体として、ＳＵＳＤ２は、ＳＵＳＤ２発現が高い初期の時点（例えばＤ５５及びＤ６５）で最終製品が製造されるという条件で、ＰＲＰ富化の有用な標的マーカーである。
【0238】
ＳＵＳＤ２及びＣＤ１７１に加えて、代替の潜在的ＰＲＰ富化マーカーを特定した。この表面マーカーはまた、程度がより小さいが、光受容体及び錐体双極細胞で主に発現されるニューロン特異的カルシウム結合タンパク質であるリカバリンとも共局在化した（Ｇｕｎｈａｎら、２００３年；Ｈａｖｅｒｋａｍｐら、２００３年）。表４は、ＣＤ１７１及びＳＵＳＤ２を除く１５種の追加の潜在的ＰＲＰ富化マーカーを列挙する。
【0239】
【表4】
【0240】
これらの表面分子に対する研究は、成長中の又は成体の網膜内での細胞の発現及び／又は機能に主に焦点を当てた。表４は、表面抗原とリカバリンとを共発現した細胞集団、又はオフターゲット分化細胞上でのみ表面抗原を発現した細胞集団それぞれの割合を列挙する。両方のマーカーのいずれかを発現するパーセント集団を、二重染色Ｄ７５ ＰＲＰ製品のフローサイトメトリー分析により決定した（図１５）。加えて、リカバリンのみを発現する細胞（ＦＩＴＣ中、ｘ軸）又は表面抗原のみを発現する細胞（ＡＰＣ中、ｙ軸）のパーセント集団を評価した。全てのプロットを、非染色（空）細胞、及び対応するアイソタイプコントロール（ＲＥＡ ＩｇＧ１、ＭｓＩｇＧ１、Ｍｓ ＩｇＧ２ａ、ＭｓＩｇＧ２ｂ、ＭｓＩｇＭ）に対してゲーティングした。リカバリン共発現が高いがオフターゲット発現が低い（＜２０％）表面分子として、ＣＤ１１、ＣＤ１３３、ＣＤ２３０、及びＣＤ３４４が挙げられる。
【0241】
このタイプのフローサイトメトリープロファイルは、抗原がより多くのＰＲＰ細胞上で発現され且つより少ないオフターゲット細胞上で発現される可能性を高める。これが本当にそうであるかどうかを決定するために、ＣＤ１１１表面抗原、ＣＤ２３０表面抗原、ＣＤ３４４表面抗原、及びＣＤ１３３表面抗原に対する抗体を使用して、複数の実験からの分化細胞をＰＲＰに関して富化させた。図１６は、Ｄ５５、Ｄ６５、及びＤ７５でのリカバリン発現を示す。リカバリン発現は、ＭＡＣＳ前（ＣＤ１３３富化をＤ７５ ＰＲＰに対してのみ実施した、単一時点、菱形）等の全ての条件でＤ６５にてピークに達し、次いでＤ７５までに低下した。このデータは、これらの特異的表面抗原（ＣＤ１３３を除く）によるＰＲＰ富化にはＤ６５が最適な時点であり得ることを示唆する。
【0242】
図１７～２２は、リカバリン（オンターゲットＰＲＰマーカー）と、オフターゲット細胞マーカーＰａｘ６（網膜前駆細胞－ＲＰＣ、アマクリン細胞－ＡＣ、及び網膜神経節細胞－ＲＧＣにより発現される）、Ｏｎｅｃｕｔ１（ＲＰＣ及び水平細胞により発現される）、Ｋｉ６７（増殖細胞により発現される）、並びにＣＨＸ１０（ＲＰＣにより発現され、双極細胞上でリカバリンと共に共発現される）とのパーセント発現の表及びグラフを示す。最も高いリカバリン発現は、ＣＤ３４４富化と共に起きた。各富化物の溶出画分は、一部のリカバリン陽性細胞を示したが、全体的には、富化部分と比べて低い画分を示し、一方では、オフターゲットマーカーＯｎｅｃｕｔ１のより高い割合を示した。評価された細胞集団では、増殖細胞又はＣＨＸ１０＋ＲＰＣ／双極オフターゲット細胞が本質的には存在しなかった。再び、ＣＤ３４４富化細胞は、リカバリン陽性発現の最も高い割合、並びに低いＰａｘ６及びＯｎｅｃｕｔ１を示した。この細胞集団では、増殖細胞が存在しなかった。
【0243】
Ｄ７５までにオンターゲット細胞及びオフターゲット細胞の全体的な減少が見出されており、このことは、この時点までに標的マーカーの発現が有意に減少している可能性があることを示唆する。興味深いことに、ＣＨＸ１０発現は高く、可能性のある双極オフターゲット細胞及び／又は可能性のある前駆細胞の第二波を示唆する。
【0244】
全ての研究に関して、リカバリン発現は、ＣＤ３４４富化後に最も高く、次いでＣＤ２３０富化後に高かった。ＣＤ３４４富化はまた、ＭＡＣＳ前と比較して、Ｐａｘ６陽性及びＣＨＸ１０陽性のオフターゲット細胞マーカーを減少させた。３つ全ての富化の溶出液又はフロースルーは、Ｐａｘ６+細胞及びＣＨＸ１０+細胞の大部分を含んでいるように思われ、このことは、富化が、リカバリン+ＰＲＰを標的としており、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）及びアマクリン細胞（ＡＣ）（これらは両方ともＰａｘ６を発現する）等のオフターゲット細胞を標的としないことを示唆する。富化部分は７５日目に中程度のレベルのＣＨＸ１０を発現したことから、リカバリン標識細胞の一部もＣＨＸ１０標識細胞上で共局在化し得、このことは、富化画分中に双極細胞（ＢＰ）の集団が存在していたことを示唆する。
【0245】
ＣＤ１３３を使用する富化を別の細胞系統（３１５３８．１０２）に対して行なって、この系統がＰＲＰに分化するかどうかを試験した。ＣＤ１３３はリカバリン+細胞を富化させ、ＭＡＣＳ前と比較して、富化後のオフターゲット細胞マーカー発現が全体的に減少した。Ｋｉ６７は、富化後にも減少したが、ＰＤ０３３２９９１処理により、富化画分中に存在するあらゆる残余の増殖細胞を除去した。
【0246】
そのため、マーカーＣＤ７１、ＳＵＳＤ２、ＣＤ１１１、ＣＤ１３３、ＣＤ２３０、及びＣＤ３４４を、ＰＲＰ細胞集団の富化及びオフターゲット細胞の除去に使用し得た。
【0247】
実施例８－ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）を使用するＰＲＰ富化
さらなる研究を、例えばＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）機器を使用して実行し、より高いスループットスケールでのＰＲＰ富化の実現可能性を評価した。Ｃ－１細胞又はＣ－２細胞を、ＬＳチューブと共にＣＤ３４．２又はＥｎｒｉｃｈｍｅｎｔ １．１プログラムを使用して機器に入力するＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）機器を使用して、ＣＤＣ１７１マーカーを使用するＰＲＰ富化を試験した。次いで、ＰＲＰ富化細胞を、ＴＵＢＢ３／ネスチン及びＲＣＶＲＮに関して評価した。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳハイスループット法は、出力細胞の９０％超がニューロンであり、この細胞の５０％超がＲＣＶＲＮに関して陽性であるＬＳカラム法と比較して、同様の出力純度を有した（図３及び図９）。
さらなる研究を、例えばＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）機器を使用して実行し、より高いスループットスケールでのＰＲＰ富化の実現可能性を評価した。Ｃ－１細胞又はＣ－２細胞を、ＬＳチューブと共にＣＤ３４．２又はＥｎｒｉｃｈｍｅｎｔ １．１プログラムを使用して機器に入力するＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）機器を使用して、ＣＤＣ１７１マーカーを使用するＰＲＰ富化を試験した。次いで、ＰＲＰ富化細胞を、ＴＵＢＢ３／ネスチン及びＲＣＶＲＮに関して評価した。ＣｌｉｎｉＭＡＣＳハイスループット法は、出力細胞の９０％超がニューロンであり、この細胞の５０％超がＲＣＶＲＮに関して陽性であるＬＳカラム法と比較して、同様の出力純度を有した（図３及び図９）。
【0248】
実施例９－材料及び方法
ＦＢＳ又はヒト血清アルブミン２０ｍＬをＤＰＢＳ（即ち、カルシウム及びマグネシウムを含まない）１０００ｍＬに添加することにより、フローサイトメトリー洗浄バッファーを調製した。このバッファーをフィルタ滅菌し、最大４週にわたり４℃で保存することができる。
ＦＢＳ又はヒト血清アルブミン２０ｍＬをＤＰＢＳ（即ち、カルシウム及びマグネシウムを含まない）１０００ｍＬに添加することにより、フローサイトメトリー洗浄バッファーを調製した。このバッファーをフィルタ滅菌し、最大４週にわたり４℃で保存することができる。
【0249】
ＦＢＳ ２０ｍＬをＤＰＢＳ（即ち、カルシウム及びマグネシウムを含まない）１０００ｍＬに添加することにより、フローサイトメトリー透過化バッファーを調製した。サポニン １グラムを添加してよく混合した。このバッファーをフィルタ滅菌し、最大４週にわたり４℃で保存することができる。
【0250】
Ｌｉｖｅ－Ｄｅａｄ ＳｔａｉｎをＤＰＢＳ（即ち、カルシウム及びマグネシウムを含まない）で１：１０００に希釈することにより、フローサイトメトリーＬｉｖｅ－Ｄｅａｄ Ｒｅｄ染色剤を調製した。アッセイする２×１０6個の細胞当たり、この染色剤１ｍＬを調製した。この染色剤を、使用前に新たに調製した。
【0251】
３６．５％ホルムアルデヒド１１０μＬをＤＰＢＳ（即ち、カルシウム及びマグネシウムを含まない）８８０μＬに添加することにより、フローサイトメトリー固定バッファーを調製した。アッセイする２×１０6個の細胞当たり、染色剤１ｍＬを調製した。このバッファーを、使用前に新たに調製した。
【0252】
実施例１０－ＰＲＰ富化の枯渇マーカー
加えて、ＰＲＰ細胞集団を逆に富化させるための枯渇マーカーとして使用され得る表面分子を同定した。この分子は、リカバリンとの共発現を示さなかったが、オフターゲット細胞を標識しており、それにより不要な細胞型の良好な枯渇マーカーであった。表５は、リカバリンとの非常に少ない共発現（＜１５％）を示すが他の細胞型を標識する（＞３０％）４種の可能な枯渇候補を列挙する。枯渇抗体に対するリカバリンの発現プロファイルを、フロー分析により評価した。図２１は、リカバリンとの枯渇候補表面抗原の共発現の低発現又はほぼ非存在を示す。
加えて、ＰＲＰ細胞集団を逆に富化させるための枯渇マーカーとして使用され得る表面分子を同定した。この分子は、リカバリンとの共発現を示さなかったが、オフターゲット細胞を標識しており、それにより不要な細胞型の良好な枯渇マーカーであった。表５は、リカバリンとの非常に少ない共発現（＜１５％）を示すが他の細胞型を標識する（＞３０％）４種の可能な枯渇候補を列挙する。枯渇抗体に対するリカバリンの発現プロファイルを、フロー分析により評価した。図２１は、リカバリンとの枯渇候補表面抗原の共発現の低発現又はほぼ非存在を示す。
【0253】
【表5】
【0254】
実施例１１－ＰＲＰ分化の最適化
ＰＲＰ分化方法を、０日目及び１日目に、ＣＫＩ－７等のＷｎｔ活性化剤の使用に関してさらに評価した。細胞を、ＣＫＩ－７の非存在下で分化させ、分化プロセスの１５日目及び２５日目に、ＰＡＸ６、ＣＨＸ１０、Ｋｉ６７、及びＰＭＥＬの発現に関して特徴付けた。０日目及び１日目にＣＫＩ－７を使用することなく、細胞集団は、１５日目及び２５日目にＰＡＸ６、ＣＨＸ１０、Ｋｉ６７、及びＰＭＥＬの同様の発現を有することが分かった（図２２～２５）。そのため、ＰＲＰ細胞を、０日目及び１日目に、ＣＫＩ－７の非存在下で分化させることができる。
ＰＲＰ分化方法を、０日目及び１日目に、ＣＫＩ－７等のＷｎｔ活性化剤の使用に関してさらに評価した。細胞を、ＣＫＩ－７の非存在下で分化させ、分化プロセスの１５日目及び２５日目に、ＰＡＸ６、ＣＨＸ１０、Ｋｉ６７、及びＰＭＥＬの発現に関して特徴付けた。０日目及び１日目にＣＫＩ－７を使用することなく、細胞集団は、１５日目及び２５日目にＰＡＸ６、ＣＨＸ１０、Ｋｉ６７、及びＰＭＥＬの同様の発現を有することが分かった（図２２～２５）。そのため、ＰＲＰ細胞を、０日目及び１日目に、ＣＫＩ－７の非存在下で分化させることができる。
【0255】
或いは、この分化方法を、ＲＩＭを使用することなく実施した。代わりに、細胞を、０～１日目にわたり、ＬＤＮ１９３１８９を補充したＲＤ１培地で培養し、次いで、ＬＤＮ１９３１８９を含まないＲＤ２培地で培養した（図２６～３０）。
【0256】
実施例１～３の方法を、ＲＩＭ培地での２日間の培養を取り除くように変更し、初期の神経網膜分化を評価した。細胞を、０～１日目にわたり、ＬＤＮ１９３１８９、ＳＢ４３１５４２、及びＣＫＩ－７の濃度が高いＲＤ１培地で直接培養し、続いて、２～１０日目にわたり、ＬＤＮ１９３１８９を含まないＲＤ２培地で培養した。細胞を１５日目に凝集させ、凝集時に、３０日目の中間プロセスの進行時に、及び７５日目の最終プロセスの進行時に、サンプルを、フロー分析用に処理した。
【0257】
Ｄ１５インプロセスフロー分析から、初期ヒト神経外胚葉の運命決定因子であるＰＡＸ６の発現は、ＣＢＰ ２．３（ＲＩＭによる）条件対ＣＢＰ ２．５（ＲＩＭなし）条件で類似しているが、初期眼野マーカーＣＨＸ１０の発現はＲＩＭ条件で低いことが分かった（図２６）。ＬＤＮを含むＲＤ１によるＲＩＭ工程の除去により、ＣＨＸ１０発現が増加することを観察した。同様に、ＲＩＭの除去により、ＲＰＥマーカーＴｙｒｐ１の発現は、ＲＩＭを含む条件と比較して５０％近く減少した（図２７及び図２８）。
【0258】
複数の細胞系統を試験して、様々な系統にわたりＲＩＭの除去がＰＲＰ分化を促進するかどうかを決定した。系統３１５３６．１０２、３１５３８．１０１、及び３１５３８．１０２は、Ｄ１５でのインプロセス分析でＣＨＸ１０を一貫して低く発現する系統であったが、両方の系統でのＣＨＸ１０発現は、ＲＩＭ工程を除去した場合には有意に増加した（図２７）。図２７は、ＲＩＭの存在下での（ＣＢＰ）又は非存在下での（－ＲＩＭ）４種の系統にわたり、神経外胚葉マーカーＰａｘ６、眼野マーカーＣＨＸ１０、並びにＲＰＥマーカーＴｙｒｐ１及びＰＭＥＬの発現を比較する。系統にわたり、Ｐａｘの発現は、ＲＩＭ存在下で又は非存在下で類似していた。ＣＨＸ１０発現は、ＲＩＭが除去された場合に系統にわたり増加したが、系統８．１０１及び８．１０２では、両方の系統において約８０％も劇的に改善された。同時に、Ｔｙｒｐ１発現は、ＲＩＭの除去後に減少した。
【0259】
色素細胞特異的タンパク質（ＰＭＥＬ）は、一般に、ＲＰＥ色素沈着と関連している。本分化系では、ＰＭＥＬ発現はＤ１５で高いままであり、Ｄ１５での低いＰＭＥＬ発現は、通常、乏しいＰＲＰ分化をもたらすことが分かった。ＲＩＭの除去により、系統６．１０２又は系統ＡのいずれにおいてもＰＭＥＬ発現は破壊されないが、系統８．１０１及び８．１０２ではＰＭＥＬ発現が顕著に増加する。このことから、ＲＩＭの除去は、ＰＲＰ発生プロセスを妨げないが、ＰＲＰの発生に向けて余分な後押しを必要とする系統にとっては有益であることが実証された。まとめると、データは、ＲＩＭの除去により、Ｄ１５での細胞がＲＰＥに分化する可能性が減少し得るが、ＰＲＰへの分化の可能性が増加することを示唆する。
【0260】
過去のデータに基づくと、中間段階（インプロセス）ＰＲＰ発生（約Ｄ３０）の間に、ＰＡＸ６及びＣＨＸ１０の発現はピークに達するが、ＴＹＲＰ１及びＰＭＥＬの発現はさらに減少する。発生プロセスは、タンパク質発現でのこれらの変化を自然に駆動するが、分化の初期段階でのＲＩＭの除去は、ＰＲＰ分化を許容できないとこれまで見なされていた系統においいて追加のサポートを提供する。ＲＩＭの初期除去は、ＰＡＸ６及びＣＨＸ１０の発現レベルを上昇させ且つＴＲＹＰ１及びＰＭＥＬの発現レベルを低下させることにより、系統８．１０１及び８．１０２でのＤ３０中期ＰＲＰ発生に影響を及ぼす。
【0261】
網膜が発生するにつれて、網膜細胞の異種集団が時系列的に誕生し、この細胞集団の特徴付けは、オフターゲット細胞型により発現される抗原を標的とする抗体の特異的なパネルに基づく。オンターゲットＰＲＰ細胞を同定するための現在のパネルは、ＮｅｕｒｏＤ１（ニューロン分化因子１、ＮＤ１；図２９Ａ）又はＣＨＸ１０（図２９Ｂ）のいずれかと結合したリカバリン（ＲＣＶＲＮ）を含む。リカバリンは、光受容体で主に発現されるニューロン特異的カルシウム結合タンパク質であり、ＮｅｕｒｏＤ１は、光受容体の最終分化において役割を果たす一時的に発現される転写因子である。ＲＣＶＲＮと結合したＣＨＸ１０は、（錐体）双極細胞の顕著な特徴付けマーカーである。ＣＨＸ１０は、網膜前駆細胞中で初期に発現され、有糸分裂後のＰＲＰでは発現を下方制御するが、有糸分裂後の双極細胞及び一部のミュラーグリア細胞では高度に発現されたままである。双極細胞はＣＨＸ１０及びＲＣＶＲＮの両方を発現するが、ＰＲＰは、ＲＣＶＲＮ＋のみ（陽性）及びＣＨＸ１０－のみ（陰性）である。従って、ＲＣＶＲＮ及びＣＨＸ１０による二重標識を使用して、細胞集団における双極細胞の非存在又は低い存在を検証し、ＲＣＶＲＮ＋細胞がＰＲＰに主に分化されることを実証した。
【0262】
Ｄ７５ ＰＲＰへのＲＩＭなしの効果は系統Ａで最も顕著であり、ＲＣＶＲＮ及びＮＤ１の発現は、ＲＩＭの除去により増加した。このデータから、ＲＩＭの除去がＰＲＰの発生に影響を及ぼすことが分かった。さらに、ＣＨＸ１０発現は、ＲＩＭの除去により、系統にわたり、減少するか、又は１０％以下のままであり、ＲＣＶＲＮ＋／ＣＨＸ１０＋二重陽性細胞も減少した。
【0263】
オフターゲット細胞マーカーとして、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）に関するＰａｘ６－Ｉｓｌ１二重陽性、水平細胞に関するＮＨＦ６、及び全増殖細胞（ｐａｎ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｃｅｌｌ）マーカーであるＫｉ６７が挙げられる。Ｐａｘ６は、下記で説明するように、他の成熟網膜細胞上でも発現される（図３０）。Ｐａｘ６は、神経誘導に関する信頼性の高いマーカーであるが、網膜では、いくつかの有糸分裂後のオフターゲット細胞がＰａｘ６を発現する（例えば、ＲＧＣ、ミュラーグリア、及びアマクリン細胞のサブセット）。同様に、Ｉｓｌ１はまた、複数の成熟オフターゲット網膜細胞（例えば、ＯＮ双極細胞、ＲＧＣ、及びアマクリン細胞のサブセット）によっても発現される。この発生段階では、ＲＩＭなしの条件は、オフターゲットマーカー発現がわずかに減少した以外は、大した影響はなかった。二重陽性Ｉｓｌ１／Ｐａｘ６集団は、培地条件に関係なく、残っているＲＧＣ又はアマクリン細胞のサブセットのわずかな割合（≦１０％）を表した。加えて、系統及び条件にわたり、存在するＨＮＦ６+水平細胞は無視できるほどであり、且つ増殖細胞は実質的には存在しなかった。
【0264】
そのため、本研究から、分化に使用する培地順序からＲＩＭを除去することは、特に初期の発生段階において、ＰＲＰの分化及び発生に有意に影響を及ぼすことが分かった。ＲＩＭの存在により、Ｄ３０での一部の系統において、全ての系統にわたりＤ１５でＣＨＸ１０発現が弱まった。ＲＩＭを除去することは、減少したＣＨＸ１０発現を「救出する」ように思われ、Ｄ１５及びＤ３０での系統にわたり、系統８．１０１及び８．１０２で有意な改善を観測した。最も重要なことに、ＲＩＭを除去することにより、いくつかの場合においてＲＣＶＲＮ及びＮＤ１の発現レベルが上昇し且つＣＨＸ１０レベルが低下したが、観測したいずれの時点でも悪影響はなかった。
【0265】
本明細書で開示されており且つ特許請求されている全ての方法は、本開示を考慮して、過度の実験を行なうことなく組み立てられて実行され得る。本発明の組成物及び方法は、好ましい実施形態に関して説明されているが、本発明の概念、趣旨、及び範囲から逸脱することなく、本明細書で説明されている方法に変更を適用し得ること、及びこの方法の工程又は工程の順序で変更を適用し得ることが、当業者が明らかであるだろう。より具体的には、同一の又は類似の結果が達成されるであろう限りにおいて、本明細書で説明されている薬剤を、化学的及び生理学的の双方に関連するある特定の薬剤に置き換え得ることが明らかであるだろう。当業者に明らかな全てのそのような類似の置き換え及び改変は、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の趣旨、範囲、及び概念の範囲内であると見なされる。
参照文献
下記の参照文献は、本明細書に記載されたものを補足する例示的な手順の又は他の詳細を提供する限りにおいて、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
Ａｍｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏ．，２２７：２７１－２７８，２０００．
Ｂｕｃｈｈｏｌｚ ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２７：２４２７－２４３４，２００９．
Ｂｙｒｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４５０（７１６９）：４９７－５０２，２００７．
Ｃｏｍｙｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．１，４－９，２０１０．
Ｇｕｎｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２３（４）１３８３－１３８９，２００３．
Ｈａｖｅｒｋａｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｏｍｐ Ｎｅｕｒｏｌ．４５５（４）：４６３－４７６，２００３．
Ｈｉｒａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ．，４８：１２６－１３１，２００９．
Ｋａｎｅｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，９，２０１４．
Ｌｕｄｗｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２４：１８５－１８７，２００６ｂ．
Ｌｕｄｗｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３：６３７－６４６，２００６ａ．
Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，１０６（３９）：１６６９８－１６７０３，２００９．
ＰＣＴ国際公開第２００７／０６９６６６Ａ１号パンフレット
ＰＣＴ国際公開第２０１４／１２１０７７号パンフレット
Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４８５，９９－１０３，２０１２．
Ｓｍｉｔｈ，Ｉｎ：Ｏｒｉｇｉｎｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２０００．
Ｓｔｒａｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，８５：８４５－８８１，２００５．
Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１２６，６６３－６７６，２００６．
Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１３１，８６１－８７２，２００７．
Ｔｈｏｍｓｏｎ ａｎｄ Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，３８：１３３－１６５，１９９８．
Ｔｈｏｍｓｏｎ ａｎｄ Ｏｄｏｒｉｃｏ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８（２）：５３－５７，２０００．
Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅ．ＵＳＡ，９２：７８４４－７８４８，１９９５．
米国特許出願公開第２００２／００７６７４７号明細書
米国特許出願公開第２００９／０２４６８７５号明細書
米国特許出願公開第２０１０／０２１００１４号明細書
米国特許出願公開第２０１２／０１９６３６０号明細書
米国特許出願公開第２０１２／０２７６６３６号明細書
米国特許第５，８４３，７８０号明細書
米国特許第６，１０３，４７０号明細書
米国特許第６，２００，８０６号明細書
米国特許第６，４１６，９９８号明細書
米国特許第６，８３３，２６９号明細書
米国特許第７，０２９，９１３号明細書
米国特許第７，４４２，５４８号明細書
米国特許第７，５９８，３６４号明細書
米国特許第７，６８２，８２８号明細書
米国特許第７，９８９，４２５号明細書
米国特許第８，０５８，０６５号明細書
米国特許第８，０７１，３６９号明細書
米国特許第８，１２９，１８７号明細書
米国特許第８，２６８，６２０号明細書
米国特許第８，２７８，６２０号明細書
米国特許第８，５４６，１４０号明細書
米国特許第８，５４６，１４０号明細書
米国特許第８，７４１，６４８号明細書
米国特許公開第２００３／０２１１６０３号明細書
米国特許公開第２０１０／０００３７５７号明細書
Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９：９７１－９７４，２００１．
Ｙｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１１５：２８１－２９２，２００３．
Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８：１９１７－１９２０，２００７．
Ｚｈｏｎｇ ｅｔ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，５：４０４７，２０１４．
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Ａｍｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏ．，２２７：２７１－２７８，２０００．
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Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，１０６（３９）：１６６９８－１６７０３，２００９．
ＰＣＴ国際公開第２００７／０６９６６６Ａ１号パンフレット
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Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ４８５，９９－１０３，２０１２．
Ｓｍｉｔｈ，Ｉｎ：Ｏｒｉｇｉｎｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２０００．
Ｓｔｒａｕｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ，８５：８４５－８８１，２００５．
Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１２６，６６３－６７６，２００６．
Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１３１，８６１－８７２，２００７．
Ｔｈｏｍｓｏｎ ａｎｄ Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，３８：１３３－１６５，１９９８．
Ｔｈｏｍｓｏｎ ａｎｄ Ｏｄｏｒｉｃｏ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８（２）：５３－５７，２０００．
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米国特許出願公開第２００２／００７６７４７号明細書
米国特許出願公開第２００９／０２４６８７５号明細書
米国特許出願公開第２０１０／０２１００１４号明細書
米国特許出願公開第２０１２／０１９６３６０号明細書
米国特許出願公開第２０１２／０２７６６３６号明細書
米国特許第５，８４３，７８０号明細書
米国特許第６，１０３，４７０号明細書
米国特許第６，２００，８０６号明細書
米国特許第６，４１６，９９８号明細書
米国特許第６，８３３，２６９号明細書
米国特許第７，０２９，９１３号明細書
米国特許第７，４４２，５４８号明細書
米国特許第７，５９８，３６４号明細書
米国特許第７，６８２，８２８号明細書
米国特許第７，９８９，４２５号明細書
米国特許第８，０５８，０６５号明細書
米国特許第８，０７１，３６９号明細書
米国特許第８，１２９，１８７号明細書
米国特許第８，２６８，６２０号明細書
米国特許第８，２７８，６２０号明細書
米国特許第８，５４６，１４０号明細書
米国特許第８，５４６，１４０号明細書
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Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９：９７１－９７４，２００１．
Ｙｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１１５：２８１－２９２，２００３．
Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１８：１９１７－１９２０，２００７．
Ｚｈｏｎｇ ｅｔ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，５：４０４７，２０１４．
【図1】
【図2】
【図3A-3C】
【図4A-4C】
【図4D】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A-8B】
【図9】
【図10A-10C】
【図10D】
【図11】
【図12A-12B】
【図12C】
【図12D】
【図13】
【図14A-14C】
【図15A】
【図15B】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24A】
【図24B】
【図25A】
【図25B】
【図26A-26B】
【図27A-27D】
【図28A-28D】
【図29A-29B】
【図30】
【図31A-31B】
【図32A-32E】
【図33A-33C】
【図34A-34E】
【手続補正書】
【提出日】2024-04-30
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
神経網膜前駆細胞（ＮＲＰ）の集団を製造する方法であって、
（ａ）ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の出発集団を得ること、
（ｂ）前記細胞を、ＢＭＰ阻害剤を含む第１の網膜分化培地（ＲＤ１）で培養して、前記細胞を前部神経外胚葉細胞にさらに分化させること、
（ｃ）前記前部神経外胚葉細胞を、ＢＭＰ阻害剤を本質的に含まない第２の網膜分化培地（ＲＤ２）で培養することにより、前記細胞の網膜分化を誘導して、網膜前駆細胞（ＲＰＣ）を形成すること、
及び
（ｄ）前記ＲＰＣを網膜成熟（ＲＭ）培地で培養して、ＮＲＰを製造すること
を含む方法。
（ａ）ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の出発集団を得ること、
（ｂ）前記細胞を、ＢＭＰ阻害剤を含む第１の網膜分化培地（ＲＤ１）で培養して、前記細胞を前部神経外胚葉細胞にさらに分化させること、
（ｃ）前記前部神経外胚葉細胞を、ＢＭＰ阻害剤を本質的に含まない第２の網膜分化培地（ＲＤ２）で培養することにより、前記細胞の網膜分化を誘導して、網膜前駆細胞（ＲＰＣ）を形成すること、
及び
（ｄ）前記ＲＰＣを網膜成熟（ＲＭ）培地で培養して、ＮＲＰを製造すること
を含む方法。
【外国語明細書】