特開 2024-99582 アルブミン遺伝子座からの導入遺伝子発現のための組成物及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公開特許公報(A)

(11)【公開番号】P2024099582

(43)【公開日】2024-07-25

(54)【発明の名称】アルブミン遺伝子座からの導入遺伝子発現のための組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20240718BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240718BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20240718BHJP

   C12N 9/22 20060101ALI20240718BHJP

   C12N 15/861 20060101ALI20240718BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20240718BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20240718BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20240718BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20240718BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240718BHJP

   A61K 9/14 20060101ALI20240718BHJP

   A61K 47/44 20170101ALI20240718BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240718BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240718BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20240718BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 100

C12N5/10 ZNA

C12P21/02 C

C12N9/22

C12N15/861 Z

C12N15/864 100Z

C12N15/867 Z

C12N15/113 Z

A61P1/16

A61P43/00 105

A61K9/14

A61K47/44

A61K35/76

A61K48/00

C12N15/12

【審査請求】有

【請求項の数】1

【出願形態】ＯＬ

(21)【出願番号】P 2024063210

(22)【出願日】2024-04-10

(62)【分割の表示】P 2021521406の分割

【原出願日】2019-10-18

(31)【優先権主張番号】62/747,402

(32)【優先日】2018-10-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】62/840,346

(32)【優先日】2019-04-29

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＰＬＵＲＯＮＩＣ

(71)【出願人】

【識別番号】520107630

【氏名又は名称】インテリア セラピューティクス，インコーポレーテッド

(71)【出願人】

【識別番号】597160510

【氏名又は名称】リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】ＲＥＧＥＮＥＲＯＮ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ， ＩＮＣ．

(74)【代理人】

【識別番号】110002572

【氏名又は名称】弁理士法人平木国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】フィン，ジョナサン ダグラス

(72)【発明者】

【氏名】フアン，ホン－レン

(72)【発明者】

【氏名】ロイ，モイトリ

(72)【発明者】

【氏名】ライ，ケーディー

(72)【発明者】

【氏名】サットラー，レイチェル

(72)【発明者】

【氏名】カイラトサウス，クリストス

(72)【発明者】

【氏名】ワン，チェン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C076

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B064AG01

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B064DA13

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065BD35

4B065CA44

4B065CA46

4C076AA29

4C076BB11

4C076EE51

4C084AA13

4C084MA66

4C084NA14

4C084ZA75

4C084ZB21

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087MA66

4C087ZA75

4C087ZB21

(57)【要約】      （修正有）

【課題】ヒトアルブミン遺伝子（例えば、イントロン１）内での編集、例えば、異種導入遺伝子を導入するための方法を提供する。
【解決手段】ｉ）ｇＲＮＡと、ｉｉ）ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤と、ｉｉｉ）前記異種ポリペプチドをコードする核酸を含む構築物と、を投与することを含み、それにより、宿主細胞または細胞集団のアルブミン遺伝子座に前記異種ポリペプチドをコードする核酸を挿入する方法である。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

宿主細胞または細胞集団のアルブミン遺伝子座に異種ポリペプチドをコードする核酸を挿入する方法であって、
ｉ）ｇＲＮＡであって、
ａ）配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、及び３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列、
ｂ）配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、及び３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチド、
ｃ）配列番号３４、４０、４５、５１、６０、６１、６３、６４、６５、６６、７２、７７、８３、９２、９３、９５、９６、及び９７からなる群から選択される配列、
ｄ）配列番号２～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列、
ｅ）配列番号２～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチド、
ｆ）配列番号３４～９７からなる群から選択される配列、
ｇ）配列番号２～３３について列挙されるゲノム座標の１５個の連続ヌクレオチド±１０個のヌクレオチドに対して相補的である配列、
ｈ）配列番号９８～１１９からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列、
ｉ）配列番号９８～１１９からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチド、ならびに
ｊ）配列番号１２０～１６３からなる群から選択される配列
から選択される配列を含む、前記ｇＲＮＡと、
ｉｉ）ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤と、
ｉｉｉ）前記異種ポリペプチドをコードする核酸を含む構築物と、を投与することを含み、
それにより、前記宿主細胞または細胞集団のアルブミン遺伝子座に前記異種ポリペプチドをコードする核酸を挿入する、
前記方法。

【請求項2】

宿主細胞または細胞集団のアルブミン遺伝子座由来の異種ポリペプチドを発現する方法であって、
ｉ）ｇＲＮＡであって、
ａ）配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、及び３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列、
ｂ）配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、及び３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチド、
ｃ）配列番号３４、４０、４５、５１、６０、６１、６３、６４、６５、６６、７２、７７、８３、９２、９３、９５、９６、及び９７からなる群から選択される配列、
ｄ）配列番号２～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列、
ｅ）配列番号２～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチド、
ｆ）配列番号３４～９７からなる群から選択される配列、ならびに
ｇ）配列番号２～３３について列挙されるゲノム座標の１５個の連続ヌクレオチド±１０個のヌクレオチドを含む配列
から選択される配列を含む、前記ｇＲＮＡと、
ｉｉ）ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤と、
ｉｉｉ）前記異種ポリペプチドのコード配列を含む構築物と、を投与することを含み、 それにより、前記宿主細胞または細胞集団において前記異種ポリペプチドを発現する、前記方法。

【請求項3】

非分裂細胞型または細胞集団において治療用薬剤を発現する方法であって、
ｉ）ｇＲＮＡであって、
ａ）配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、及び３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列、
ｂ）配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、及び３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチド、
ｃ）配列番号３４、４０、４５、５１、６０、６１、６３、６４、６５、６６、７２、７７、８３、９２、９３、９５、９６、及び９７からなる群から選択される配列、
ｄ）配列番号２～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列、
ｅ）配列番号２～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチド、
ｆ）配列番号３４～９７からなる群から選択される配列、ならびに
ｇ）配列番号２～３３について列挙されるゲノム座標の１５個の連続ヌクレオチド±１０個のヌクレオチドを含む配列
から選択される配列を含む、前記ｇＲＮＡと、
ｉｉ）ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤と、
ｉｉｉ）前記異種ポリペプチドのコード配列を含む構築物と、を投与することを含み、 それにより、前記非分裂細胞型または細胞集団において前記治療用薬剤を発現する、
前記方法。

【請求項4】

前記ｇＲＮＡが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、及び配列番号３３からなる群から選択されるガイド配列を含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

前記方法が、インビボで行われる、請求項１～４のいずれかに記載の方法。

【請求項6】

前記方法が、インビトロで行われる、請求項１～４のいずれかに記載の方法。

【請求項7】

前記ｇＲＮＡが、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の上流の領域と結合する、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記ＰＡＭが、ＮＧＧ、ＮＮＧＲＲＴ、ＮＮＧＲＲ（Ｎ）、ＮＮＡＧＡＡＷ、ＮＮＮＮＧ（Ａ／Ｃ）ＴＴ、及びＮＮＮＮＲＹＡＣから選択される、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記ｇＲＮＡが、デュアルｇＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）である、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

前記ｇＲＮＡが、シングルｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項１～８のいずれかに記載の方法。

【請求項11】

前記ｓｇＲＮＡが、１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｃａｓ９またはＣａｓ９をコードする核酸である、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする前記核酸が、ｍＲＮＡである、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記ｍＲＮＡが、修飾ｍＲＮＡである、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｃａｓヌクレアーゼまたは前記Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸である、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項17】

前記Ｃａｓヌクレアーゼが、クラス２のＣａｓヌクレアーゼである、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓヌクレアーゼ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓヌクレアーゼ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉヌクレアーゼ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓヌクレアーゼ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓヌクレアーゼ、及びそれらのバリアントからなる群から選択される、請求項１６または１７に記載の方法。

【請求項19】

前記Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｃａｓ９である、請求項１６～１８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項20】

前記Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記Ｃａｓヌクレアーゼが、部位特異的ＤＮＡ結合活性を有する、請求項１６～２０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項22】

前記Ｃａｓヌクレアーゼが、ニッカーゼである、請求項１６～２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項23】

前記Ｃａｓヌクレアーゼが、クリベースである、請求項１６～２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項24】

前記Ｃａｓヌクレアーゼが、ニッカーゼまたはクリベース活性を有しない、請求項１９～２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項25】

前記核酸構築物が、相同性非依存性ドナー構築物である、請求項１９～２４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項26】

前記構築物が、双方向性核酸構築物である、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項27】

前記構築物が、
ｉ．異種ポリペプチドのコード配列を含む第１のセグメント、及び
ｉｉ．前記異種ポリペプチドのコード配列の逆相補体を含む第２のセグメント
を含む、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記構築物が、ポリアデニル化シグナル配列を含む、請求項１～２７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項29】

前記構築物が、スプライスアクセプター部位を含む、請求項１～２８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項30】

前記構築物が、相同性アームを含まない、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項31】

前記ｇＲＮＡが、ベクター及び／または脂質ナノ粒子で投与される、請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項32】

前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、ベクター及び／または脂質ナノ粒子で投与される、請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項33】

前記異種遺伝子を含む前記構築物が、ベクター及び／または脂質ナノ粒子で投与される、請求項１～３２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項34】

前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項３１～３３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項35】

前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、及びレンチウイルスベクターからなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．３２．３３、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０、及びそれらのハイブリッドからなる群から選択される、請求項３５に記載のベクター。

【請求項37】

前記ｇＲＮＡ、前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、及び前記異種ポリペプチドのコード配列を含む前記構築物が、個々にまたは任意の組み合わせで、同時に投与される、請求項１～３６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項38】

前記ｇＲＮＡ、前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、及び前記異種ポリペプチドのコード配列を含む前記構築物が、任意の順序及び／または任意の組み合わせで逐次的に投与される、請求項１～３６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項39】

前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または組み合わせたＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤及びｇＲＮＡが、前記構築物を提供する前に投与される、請求項１～３６及び３８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項40】

前記異種ポリペプチドのコード配列を含む前記構築物が、前記ｇＲＮＡ及び／またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の前に投与される、請求項１～３６及び３８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項41】

前記双方向性核酸構築物、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、及びｇＲＮＡが、任意の組み合わせで、互いに１時間以内に投与される、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項42】

前記異種ポリペプチドが、分泌ポリペプチドである、請求項１～４１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項43】

前記遺異種ポリペプチドが、細胞内ポリペプチドである、請求項１～４１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項44】

前記細胞が、肝臓細胞である、請求項１～４３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項45】

前記肝臓細胞が、肝細胞である、請求項４４に記載の方法。

【請求項46】

前記宿主細胞における前記異種ポリペプチドの発現が、前記ｇＲＮＡ、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、及び前記異種ポリペプチドのコード配列を含む構築物を投与する前に、前記細胞におけるレベルに対して、少なくとも約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、またはそれ以上増加される、請求項１～４５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項47】

前記ｇＲＮＡが、配列番号３０１または配列番号３０２を含む、請求項１～４６のいずれかに記載の方法。

【請求項48】

前記ｇＲＮＡが、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤による標的特異的切断を媒介し、アルブミン遺伝子のイントロン１内に前記異種ポリペプチドの前記コード配列の挿入をもたらす、請求項１～４７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項49】

前記切断が、前記細胞集団における異種核酸の少なくとも約２％、約５％、または約１０％の挿入速度をもたらす、請求項１～４８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項50】

前記切断が、前記異種ポリペプチドの前記コード配列の約３０～３５％、約３５～４０％、約４０～４５％、約４５～５０％、約５０～５５％、約５５～６０％、約６０～６５％、約６５～７０％、約７０～７５％、約７５～８０％、約８０～８５％、約８５～９０％、約９０～９５％、または約９５～９９％の挿入速度をもたらす、請求項４９に記載の方法。

【請求項51】

ＲＮＡガイドＤＮＡ結合タンパク質が、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項１～５０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項52】

前記ヌクレアーゼが、クリバーゼまたはニッカーゼである、請求項５１に記載の方法。

【請求項53】

前記ｇＲＮＡを含むＬＮＰを投与することをさらに含む、請求項１～５２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項54】

前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするｍＲＮＡを含むＬＮＰを投与することをさらに含む、請求項１～５３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項55】

前記ＬＮＰが、前記ｇＲＮＡと、前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする前記ｍＲＮＡとを含む、請求項５４に記載の方法。

【請求項56】

前記ｇＲＮＡ及び前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合タンパク質が、ＲＮＰとして投与される、請求項１～５５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項57】

前記構築物が、ベクターを介して投与される、請求項５３～５６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項58】

請求項１～５７のいずれか１項に記載の方法によって作製される宿主細胞。

【請求項59】

宿主細胞のアルブミン遺伝子座のイントロン１内に組み込まれた異種ポリペプチドをコードする双方向性核酸構築物を含む宿主細胞。

【請求項60】

前記宿主細胞が、肝臓細胞である、請求項５８または５９に記載の宿主細胞。

【請求項61】

前記肝臓細胞が、肝細胞である、請求項５８～６０のいずれか１項に記載の宿主細胞。

【請求項62】

前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸である、請求項１～６１のいずれか１項に記載の方法または宿主細胞。

【請求項63】

前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｃａｓヌクレアーゼである、請求項１～６２のいずれか１項に記載の方法または宿主細胞。

【請求項64】

前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸である、請求項１～６３のいずれか１項に記載の方法または宿主細胞。

【請求項65】

前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡである、請求項１～６４のいずれか１項に記載の方法または宿主細胞。

【請求項66】

前記ｍＲＮＡが、修飾ｍＲＮＡである、請求項６５に記載の方法または宿主細胞。

【請求項67】

前記Ｃａｓヌクレアーゼが、クラス２のＣａｓヌクレアーゼである、請求項６３～６６のいずれか１項に記載の方法または宿主細胞。

【請求項68】

前記Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｃａｓ９である、請求項６３～６７のいずれか１項に記載の方法または組成物。

【請求項69】

前記Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓヌクレアーゼ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓヌクレアーゼ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉヌクレアーゼ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓヌクレアーゼ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓヌクレアーゼ、及びそれらのバリアントからなる群から選択される、請求項６３～６８のいずれか１項に記載の方法または組成物。

【請求項70】

前記Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはそのバリアントである、請求項６９に記載の方法または組成物。

【請求項71】

前記Ｃａｓヌクレアーゼが、部位特異的ＤＮＡ結合活性を有する、請求項６３～７０のいずれか１項に記載の方法または組成物。

【請求項72】

前記Ｃａｓヌクレアーゼが、ニッカーゼである、請求項６３～７１のいずれか１項に記載の方法または組成物。

【請求項73】

前記Ｃａｓヌクレアーゼが、クリベースである、請求項６３～７２のいずれか１項に記載の方法または組成物。

【請求項74】

前記Ｃａｓヌクレアーゼが、ニッカーゼまたはクリベース活性を有しない、請求項６３～７３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項75】

異種ポリペプチド活性または異種ポリペプチドレベルの正常に対して少なくとも約１％、例えば、正常に対して少なくとも約５％を達成することをさらに含む、請求項１～７４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項76】

前記異種ポリペプチド活性または異種ポリペプチドレベルが、正常に対して約５００％未満である、請求項１～７５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項77】

異種ポリペプチド活性または異種ポリペプチドレベルの正常に対して少なくとも約１％～３００％を達成することをさらに含む、請求項１～７６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項78】

長期的な効果、例えば、個体において少なくとも１ヶ月、２ヶ月、６ヶ月、１年、または２年の効果を達成することをさらに含む、請求項５～７７のいずれか１項に記載のインビボ方法。

【請求項79】

前記個体の循環アルブミンレベルが、前記核酸構築物の投与から少なくとも１ヶ月、２ヶ月、６ヶ月、または１年後に正常である、請求項５～７８のいずれか１項に記載のインビボ方法。

【請求項80】

前記個体の循環アルブミンレベルが、前記双方向性核酸構築物の投与から４週間後で維持される、請求項５～７９のいずれか１項に記載のインビボ方法。

【請求項81】

前記個体の循環アルブミンレベルが一時的に低下し、次いで、正常に戻る、請求項５～８０のいずれか１項に記載のインビボ方法。

【請求項82】

前記ガイドＲＮＡが、配列番号２～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドを含む、請求項１～８１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項83】

前記ガイドＲＮＡが、配列番号２～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列を含む、請求項１～８２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項84】

前記ガイドＲＮＡが、配列番号２～３３からなる群から選択される配列を含む、請求項１～８３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項85】

前記ガイドＲＮＡが、配列番号３０１または３０２を含む、請求項１～８４のいずれか１項に記載の方法または宿主細胞。

【請求項86】

前記ガイドＲＮＡが、配列番号２の核酸配列を含む、請求項１～８５のいずれか１項に記載の方法及び組成物。

【請求項87】

前記ガイドＲＮＡが、配列番号３の核酸配列を含む、請求項１～８６のいずれか１項に記載の方法及び組成物。

【請求項88】

前記ガイドＲＮＡが、配列番号４の核酸配列を含む、請求項１～８７のいずれか１項に記載の方法及び組成物。

【請求項89】

前記ガイドＲＮＡが、配列番号５の核酸配列を含む、請求項１～８８のいずれか１項に記載の方法及び組成物。

【請求項90】

前記ガイドＲＮＡが、配列番号６の核酸配列を含む、請求項１～８９のいずれか１項に記載の方法及び組成物。

【請求項91】

前記ガイドＲＮＡが、配列番号７の核酸配列を含む、請求項１～９０のいずれか１項に記載の方法及び組成物。

【請求項92】

前記ガイドＲＮＡが、配列番号８の核酸配列を含む、請求項１～９１のいずれか１項に記載の方法及び組成物。

【請求項93】

前記ガイドＲＮＡが、配列番号９の核酸配列を含む、請求項１～９２のいずれか１項に記載の方法及び組成物。

【請求項94】

前記ガイドＲＮＡが、配列番号１０の核酸配列を含む、請求項１～９３のいずれか１項に記載の方法及び組成物。

【請求項95】

前記ガイドＲＮＡが、配列番号１１の核酸配列を含む、請求項１～９４のいずれか１項に記載の方法及び組成物。

【請求項96】

前記ガイドＲＮＡが、配列番号１２の核酸配列を含む、請求項１～９５のいずれか１項に記載の方法及び組成物。

【請求項97】

前記ガイドＲＮＡが、配列番号１３の核酸配列を含む、請求項１～９６のいずれか１項に記載の方法及び組成物。

【請求項98】

前記ガイドＲＮＡが、配列番号１４の核酸配列を含む、請求項１～９７のいずれか１項に記載の方法及び組成物。

【請求項99】

前記ガイドＲＮＡが、配列番号１５の核酸配列を含む、請求項１～９８のいずれか１項に記載の方法及び組成物。

【請求項100】

前記ガイドＲＮＡが、配列番号１６の核酸配列を含む、請求項１～９９のいずれか１項に記載の方法及び組成物。

【請求項101】

前記ガイドＲＮＡが、配列番号１７の核酸配列を含む、請求項１～１００のいずれか１項に記載の方法及び組成物。

【請求項102】

前記ガイドＲＮＡが、配列番号１８の核酸配列を含む、請求項１～１０１のいずれか１項に記載の方法及び組成物。

【請求項103】

前記ガイドＲＮＡが、配列番号１９の核酸配列を含む、請求項１～１０２のいずれか１項に記載の方法及び組成物。

【請求項104】

前記ガイドＲＮＡが、配列番号２０の核酸配列を含む、請求項１～１０３のいずれか１項に記載の方法及び組成物。

【請求項105】

前記ガイドＲＮＡが、配列番号２１の核酸配列を含む、請求項１～１０４のいずれか１項に記載の方法及び組成物。

【請求項106】

前記ガイドＲＮＡが、配列番号２２の核酸配列を含む、請求項１～１０５のいずれか１項に記載の方法及び組成物。

【請求項107】

前記ガイドＲＮＡが、配列番号２３の核酸配列を含む、請求項１～１０６のいずれか１項に記載の方法及び組成物。

【請求項108】

前記ガイドＲＮＡが、配列番号２４の核酸配列を含む、請求項１～１０７のいずれか１項に記載の方法及び組成物。

【請求項109】

前記ガイドＲＮＡが、配列番号２５の核酸配列を含む、請求項１～１０８のいずれか１項に記載の方法及び組成物。

【請求項110】

前記ガイドＲＮＡが、配列番号２６の核酸配列を含む、請求項１～１０９のいずれか１項に記載の方法及び組成物。

【請求項111】

前記ガイドＲＮＡが、配列番号２７の核酸配列を含む、請求項１～１１０のいずれか１項に記載の方法及び組成物。

【請求項112】

前記ガイドＲＮＡが、配列番号２８の核酸配列を含む、請求項１～１１１のいずれか１項に記載の方法及び組成物。

【請求項113】

前記ガイドＲＮＡが、配列番号２９の核酸配列を含む、請求項１～１１２のいずれか１項に記載の方法及び組成物。

【請求項114】

前記ガイドＲＮＡが、配列番号３０の核酸配列を含む、請求項１～１１３のいずれか１項に記載の方法及び組成物。

【請求項115】

前記ガイドＲＮＡが、配列番号３１の核酸配列を含む、請求項１～１１４のいずれか１項に記載の方法及び組成物。

【請求項116】

前記ガイドＲＮＡが、配列番号３２の核酸配列を含む、請求項１～１１５のいずれか１項に記載の方法及び組成物。

【請求項117】

前記ガイドＲＮＡが、配列番号３３の核酸配列を含む、請求項１～１１６のいずれか１項に記載の方法及び組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、２０１８年１０月１８日に出願された米国仮出願第６２／７４７，４０２号、及び２０１９年４月２９日に出願された米国仮出願第６２／８４０，３４６号から優先権の利益を主張する。前述の出願の各々の明細書は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【背景技術】

【0002】

遺伝子療法アプローチにおけるゲノム編集は、欠損またはそうでなければ損なわれた遺伝子材料の外因性導入が遺伝子疾患を是正することができるという考えから起こる。遺伝子療法は、開業医がヒト疾患にどのようにアプローチし、治療するかにおけるその非常に大きな可能性について長い間認識されてきた。薬物または手術に依存する代わりに、根底にある遺伝的要因を有する患者は、その根底にある原因を直接標的とすることによって治療され得る。さらに、根底にある遺伝的原因を標的とすることによって、遺伝子療法は、患者を効果的に治癒させる可能性を提供し得る。しかしながら、遺伝子療法のアプローチの臨床応用は、いくつかの側面において改善が依然として必要である。

【0003】

ゲノム遺伝子座、例えば、宿主細胞のセーフハーバー部位内に異種（外因性）遺伝子を挿入及び発現するのに有用な組成物及び方法が本明細書に提供される。ＣＣＲ５、ＨＰＲＴ、ＡＡＶＳ１、Ｒｏｓａ、及びアルブミンを含むいくつかのセーフハーバー遺伝子座が記載されている。本明細書に記載されるように、アルブミン遺伝子座（例えば、イントロン１）における外因性遺伝子の標的化及び挿入は、アルブミンの内因性プロモーターの使用を可能にし、外因性遺伝子のロバストな発現を駆動する。本開示は、アルブミン遺伝子、例えば、アルブミン遺伝子のイントロン１内の部位を特異的に標的とし、かつ外因性遺伝子の効率的な挿入及び／または発現を提供するガイドＲＮＡの同定に部分的に基づく。以下の実施形態が提供される。

【0004】

一態様では、本開示は、宿主細胞または細胞集団のアルブミン遺伝子座に異種ポリペプチドをコードする核酸を挿入する方法を提供し、ｉ）ａ）配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列、ｂ）配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチド、ｃ）配列番号３４、４０、４５、５１、６０、６１、６３、６４、６５、６６、７２、７７、８３、９２、９３、９５、９６、及び９７からなる群から選択される配列、ｄ）配列番号２～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列、ｅ）配列番号２～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチド、ｆ）配列番号３４～９７からなる群から選択される配列、ｇ）配列番号２～３３について列挙されるゲノム座標の１５個の連続ヌクレオチド±１０個のヌクレオチドに対して相補的である配列、ｈ）配列番号９８～１１９からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列、ｉ）配列番号９８～１１９からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチド、ならびにｊ）配列番号１２０～１６３からなる群から選択される配列から選択される配列を含むｇＲＮＡと、ｉｉ）ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤と、ｉｉｉ）異種ポリペプチドをコードする核酸を含む構築物と、を投与することを含み、それにより、宿主細胞または細胞集団のアルブミン遺伝子座に異種ポリペプチドをコードする核酸を挿入する。

【0005】

別の態様では、本開示は、宿主細胞または細胞集団のアルブミン遺伝子座由来の異種ポリペプチドを発現する方法を提供し、ｉ）ａ）配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列、ｂ）配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチド、ｃ）配列番号３４、４０、４５、５１、６０、６１、６３、６４、６５、６６、７２、７７、８３、９２、９３、９５、９６、及び９７からなる群から選択される配列、ｄ）配列番号２～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列、ｅ）配列番号２～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチド、ｆ）配列番号３４～９７からなる群から選択される配列、ならびにｇ）配列番号２～３３について列挙されるゲノム座標の１５個の連続ヌクレオチド±１０個のヌクレオチドを含む配列から選択される配列を含むｇＲＮＡと、ｉｉ）ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤と、ｉｉｉ）異種ポリペプチドのコード配列を含む構築物と、を投与することを含み、それにより、宿主細胞または細胞集団において異種ポリペプチドを発現する。

【0006】

別の態様では、本開示は、非分裂細胞型または細胞集団において治療用薬剤を発現する方法を提供し、ｉ）ａ）配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、３３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列、ｂ）配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチド、ｃ）配列番号３４、４０、４５、５１、６０、６１、６３、６４、６５、６６、７２、７７、８３、９２、９３、９５、９６、及び９７からなる群から選択される配列、ｄ）配列番号２～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列、ｅ）配列番号２～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチド、ｆ）配列番号３４～９７からなる群から選択される配列、ならびにｇ）配列番号２～３３について列挙されるゲノム座標の１５個の連続ヌクレオチド±１０個のヌクレオチドを含む配列から選択される配列を含むｇＲＮＡと、ｉｉ）ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤と、ｉｉｉ）異種ポリペプチドのコード配列を含む構築物と、を投与することを含み、それにより、非分裂細胞型または細胞集団において治療用薬剤を発現する。

【0007】

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、及び配列番号３３からなる群から選択されるガイド配列を含む。

【0008】

いくつかの実施形態では、方法は、インビボで行われる。いくつかの実施形態では、方法は、インビトロで行われる。

【0009】

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、プロポスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の上流の領域と結合する。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、ＮＧＧ、ＮＮＧＲＲＴ、ＮＮＧＲＲ（Ｎ）、ＮＮＡＧＡＡＷ、ＮＮＮＮＧ（Ａ／Ｃ）ＴＴ、及びＮＮＮＮＲＹＡＣから選択される。

【0010】

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、デュアルｇＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、シングルｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、クラス２のＣａｓヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓヌクレアーゼ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓヌクレアーゼ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉヌクレアーゼ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓヌクレアーゼ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓヌクレアーゼ、及びそれらのバリアントからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ニッカーゼである。

【0011】

いくつかの実施形態では、構築物は、双方向性核酸構築物である。いくつかの実施形態では、構築物は、ｉ．異種ポリペプチドのコード配列を含む第１のセグメント、及びｉｉ．異種ポリペプチドのコード配列の逆相補体を含む第２のセグメントを含む。いくつかの実施形態では、構築物は、ポリアデニル化シグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、構築物は、スプライスアクセプター部位を含む。いくつかの実施形態では、構築物は、相同性アームを含まない。

【0012】

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ベクター及び／または脂質ナノ粒子で投与される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、ベクター及び／または脂質ナノ粒子で投与される。いくつかの実施形態では、異種遺伝子を含む構築物は、ベクター及び／または脂質ナノ粒子で投与される。いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、及びレンチウイルスベクターからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．３２．３３、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０、及びそれらのハイブリッドからなる群から選択される。

【0013】

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、及び異種ポリペプチドのコード配列を含む構築物は、個々にまたは任意の組み合わせで、同時に投与される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、及び異種ポリペプチドのコード配列を含む構築物は、任意の順序及び／または任意の組み合わせで逐次的に投与される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または組み合わせたＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤及びｇＲＮＡは、構築物を提供する前に投与される。いくつかの実施形態では、異種ポリペプチドのコード配列を含む構築物は、ｇＲＮＡ及び／またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の前に投与される。

【0014】

いくつかの実施形態では、異種ポリペプチドは、分泌ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、異種ポリペプチドは、細胞内ポリペプチドである。

【0015】

いくつかの実施形態では、細胞は、肝臓細胞である。いくつかの実施形態では、肝臓細胞は、肝細胞である。

【0016】

いくつかの実施形態では、宿主細胞における異種ポリペプチドの発現は、ｇＲＮＡ、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、及び異種ポリペプチドのコード配列を含む構築物を投与する前に、細胞におけるレベルに対して、少なくとも約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、またはそれ以上増加される。

【0017】

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、配列番号３０１を含む。

【0018】

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤による標的特異的切断を媒介し、アルブミン遺伝子のイントロン１内に異種ポリペプチドのコード配列の挿入をもたらす。いくつかの実施形態では、切断は、細胞集団における異種核酸の少なくとも約１０％の挿入速度をもたらす。いくつかの実施形態では、切断は、異種ポリペプチドのコード配列の約３０～３５％、約３５～４０％、約４０～４５％、約４５～５０％、約５０～５５％、約５５～６０％、約６０～６５％、約６５～７０％、約７０～７５％、約７５～８０％、約８０～８５％、約８５～９０％、約９０～９５％、または約９５～９９％の挿入速度をもたらす。

【0019】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合タンパク質は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼは、クリバーゼまたはニッカーゼである。

【0020】

いくつかの実施形態では、方法は、ｇＲＮＡを含むＬＮＰ投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするｍＲＮＡを含むＬＮＰを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、ｇＲＮＡと、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするｍＲＮＡとを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合タンパク質は、ＲＮＰとして投与される。いくつかの実施形態では、構築物は、ベクターを介して投与される。

【0021】

一態様では、本開示は、前述の方法のうちのいずれか１つ以上によって作製される宿主細胞を提供する。

【0022】

一態様では、本開示は、宿主細胞のアルブミン遺伝子座のイントロン１内に組み込まれた異種ポリペプチドをコードする双方向性核酸構築物を含む細胞を提供する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、肝臓細胞である。いくつかの実施形態では、肝臓細胞は、肝細胞である。

【図面の簡単な説明】

【0023】

【図1】ＡＡＶゲノムに表される構築物フォーマットを示す。ＳＡ＝スプライスアクセプター、ｐＡ＝ポリＡシグナル配列、ＨＡ＝相同性アーム、ＬＨＡ＝左相同性アーム、ＲＨＡ＝右相同性アーム。

【図2】相同性アームを有さないベクターが、不死化肝臓細胞株（Ｈｅｐａ１－６）において有効ではないことを示す。２００ｂｐの相同性アームを含むプラスミドＰ００２０４に由来するｓｃＡＡＶは、分裂細胞においてｈＦＩＸの発現をもたらした。Ｐ００１２３（相同性アームを欠くｓｃＡＡＶ）及びＰ００１４７（相同性アームを欠くｓｓＡＡＶ双方向性構築物）に由来するＡＡＶベクターの使用は、ｈＦＩＸの検出可能な発現をもたらさなかった。

【図3】Ａ及びＢは、Ｐ００１２３、Ｐ００１４７、またはＰ００２０４に由来するベクターを使用して相同性アームあり及びなしの挿入テンプレートのインビボ試験の結果を示す。図３Ａは、約６０％のインデル形成によって測定された肝臓編集レベルが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９成分を含むＬＮＰで処置された動物の各群において検出されたことを示す。図３Ｂは、ＬＮＰ処置と組み合わせた相同性アームなしのｓｓＡＡＶベクター（Ｐ００１４７に由来する）を受けている動物が、血清において最高レベルのｈＦＩＸ発現をもたらしたことを示す。

【図4A】相同性アームあり及びなしのｓｓＡＡＶ挿入テンプレートのインビボ試験の結果を示す。標的挿入を、プラスミドＰ００３５０、Ｐ００３５６、Ｐ００３６２（示されるような非対称相同性アームを有する）、及びＰ００１４７（図４Ｂに示されるような双方向性構築物）に由来するベクターと比較する。

【図4B】相同性アームあり及びなしのｓｓＡＡＶ挿入テンプレートのインビボ試験の結果を示す。標的化された第２の部位への挿入を、プラスミドＰ００３５３、Ｐ００３５４（示されるような対称相同性アームを有する）、及びＰ００１４７に由来するベクターと比較する。

【図5A】初代マウス肝細胞における２０個の標的部位にわたる双方向性構築物の標的挿入の結果を示す。試験したベクターの各々の概略図を示す。

【図5B】初代マウス肝細胞における２０個の標的部位にわたる双方向性構築物の標的挿入の結果を示す。試験した各組み合わせにわたる処置群の各々について、インデル形成によって測定された編集を示す。

【図5C】初代マウス肝細胞における２０個の標的部位にわたる双方向性構築物の標的挿入の結果を示す。有意なレベルの編集（特定の標的部位でのインデル形成として）が、必ずしも導入遺伝子のより効率的な挿入または発現をもたらさなかったことを示す。ｈＳＡ＝ヒトＦ９スプライスアクセプター、ｍＳＡ＝マウスアルブミンスプライスアクセプター、ＨｉＢｉｔ＝ルシフェラーゼに基づく検出のためのタグ、ｐＡ＝ポリＡシグナル配列、Ｎｌｕｃ＝ナノルシフェラーゼレポーター、ＧＦＰ＝緑色蛍光レポーター。

【図5D】初代マウス肝細胞における２０個の標的部位にわたる双方向性構築物の標的挿入の結果を示す。有意なレベルの編集（特定の標的部位でのインデル形成として）が、必ずしも導入遺伝子のより効率的な挿入または発現をもたらさなかったことを示す。ｈＳＡ＝ヒトＦ９スプライスアクセプター、ｍＳＡ＝マウスアルブミンスプライスアクセプター、ＨｉＢｉｔ＝ルシフェラーゼに基づく検出のためのタグ、ｐＡ＝ポリＡシグナル配列、Ｎｌｕｃ＝ナノルシフェラーゼレポーター、ＧＦＰ＝緑色蛍光レポーター。

【図6】Ｐ００１４７に由来するｓｓＡＡＶを用いる１０の標的部位にわたる双方向性構築物による標的挿入のインビボスクリーニングの結果を示す。示されるように、著しいレベルのインデル形成は、必ずしも高レベルの導入遺伝子発現をもたらすものではない。

【図7A】Ｐ００１４７に由来するｓｓＡＡＶを使用する２０の標的部位にわたる双方向性構築物のインビボスクリーニングの結果を示す。インデル形成によって測定される様々なレベルの編集が、試験した各ＬＮＰ／ベクターの組み合わせにわたって、処置群の各々について検出されたことを示す。

【図7B】Ｐ００１４７に由来するｓｓＡＡＶを使用する２０の標的部位にわたる双方向性構築物のインビボスクリーニングの結果を示す。対応する標的挿入データを提供する。結果は、インデル形成と双方向性構築物の挿入または発現との間の不十分な相関を示す。

【図7C】Ｐ００１４７に由来するｓｓＡＡＶを使用する２０の標的部位にわたる双方向性構築物のインビボスクリーニングの結果を示す。結果は、インビトロ結果とインビボ結果との間の正の相関を示す。

【図7D】Ｐ００１４７に由来するｓｓＡＡＶを使用する２０の標的部位にわたる双方向性構築物のインビボスクリーニングの結果を示す。結果は、インデル形成と双方向性構築物の挿入または発現との間の不十分な相関を示す。

【図8A】Ａ及びＢは、ｈＦＩＸ導入遺伝子とマウスアルブミンエクソン１配列との間の接合部を検出することができるプローブを使用するｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法を使用して、細胞レベルでの双方向性構築物の挿入を示す（図８Ａ）。循環ｈＦＩＸレベルは、ハイブリッド転写産物に対して陽性であった細胞の数と相関していた（図８Ｂ）。

【図8B】図８Ａの続きである。

【図9】双方向性ｈＦＩＸ構築物を含むｓｓＡＡＶの送達とＬＮＰの送達との間の様々なタイミングの標的挿入に対する効果を示す。

【図10】双方向性ｈＦＩＸ構築物の送達後の、ＬＮＰの繰り返し投与（例えば、１、２、または３投与）の標的挿入に対する効果を示す。

【図11A】インビボでのｈＦＩＸ発現の耐久性を示す。

【図11B】アルブミンのイントロン１からの発現が維持されたことを示す。

【図12A】ＡＡＶまたはＬＮＰ用量を変化させることにより、インビボでのアルブミン遺伝子のイントロン１からのｈＦＩＸの発現の量を調節することができることを示す。

【図12B】ＡＡＶまたはＬＮＰ用量を変化させることにより、インビボでのアルブミン遺伝子のイントロン１からのｈＦＩＸの発現の量を調節することができることを示す。

【図13A】初代カニクイザル肝細胞における標的部位にわたる双方向性構築物をスクリーニングした結果を示す。試料の各々について検出されたインデル形成によって測定された様々なレベルの編集を示す。

【図13B】初代カニクイザル肝細胞における標的部位にわたる双方向性構築物をスクリーニングした結果を示す。著しいレベルのインデル形成が、アルブミン遺伝子のイントロン１への双方向性構築物の挿入または発現について予測的でなかったことを示す。

【図13C】初代カニクイザル肝細胞における標的部位にわたる双方向性構築物をスクリーニングした結果を示す。著しいレベルのインデル形成が、アルブミン遺伝子のイントロン１への双方向性構築物の挿入または発現について予測的でなかったことを示す。

【図14A】初代ヒト肝細胞における標的部位にわたる双方向性構築物をスクリーニングした結果を示す。試料の各々について検出されたインデル形成によって測定された編集を示す。

【図14B】初代ヒト肝細胞における標的部位にわたる双方向性構築物をスクリーニングした結果を示す。著しいレベルのインデル形成が、アルブミン遺伝子のイントロン１への双方向性構築物の挿入または発現について予測的でなかったことを示す。

【図14C】初代ヒト肝細胞における標的部位にわたる双方向性構築物をスクリーニングした結果を示す。著しいレベルのインデル形成が、アルブミン遺伝子のイントロン１への双方向性構築物の挿入または発現について予測的でなかったことを示す。

【図14D】初代ヒト肝細胞における標的部位にわたる双方向性構築物をスクリーニングした結果を示す。著しいレベルのインデル形成が、アルブミン遺伝子のイントロン１への双方向性構築物の挿入または発現について予測的でなかったことを示す。

【図15】非ヒト霊長類が双方向性ｈＦＩＸ挿入テンプレート（Ｐ００１４７に由来する）と共にＬＮＰを投与されたインビボ研究の結果を示す。全身ｈＦＩＸレベルは、ＬＮＰ及びＡＡＶの両方で処置された動物においてのみ達成され、ＡＡＶまたはＬＮＰ単独を使用して検出可能なｈＦＩＸはなかった。

【図16A】注射後６週目の血漿試料中のヒト第ＩＸ因子発現レベルを示す。

【図16B】注射後６週目の血漿試料中のヒト第ＩＸ因子発現レベルを示す。

【図17】各動物の複数の葉にわたる７週目の血清レベル及び陽性細胞％を示す。

【発明を実施するための形態】

【0024】

ここで、本発明の特定の実施形態を詳細に参照し、本発明の実施形態の例は添付の図面で例示される。本教示は様々な実施形態と併せて説明されるが、それは本教示をそれらの実施形態に限定することを意図するものではない。逆に、本教示は、当業者によって理解されるように、様々な代替物、改変物、及び均等物を包含する。

【0025】

本教示を詳細に説明する前に、本開示は、特定の組成物またはプロセスステップに限定されるものではなく、したがって変化し得ると理解されるべきである。本明細書及び添付の請求項で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途指示しない限り、複数の参照物を含めることに留意されたい。したがって、例えば、「複合体（ａ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）」への言及は、複数の複合体を含み、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及は、複数の細胞などを含む。本明細書で使用される「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という用語及びその文法上の変形は、リスト内の項目の列挙が、リストされた項目に置換または追加することができる他の同様の項目を除外しないように、非限定的であることを意図する。

【0026】

数値範囲には、その範囲を定義する数値が含まれる。測定値及び測定可能な値は、有効数字及び測定に関連する誤差を考慮して、おおよその値であると理解される。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、限定することを意図するものではない。上述の概略的な説明と、詳細な説明はいずれも例示であり、単に説明するためのものであり、その教示を限定するものではないことが理解されるべきである。

【0027】

本明細書に特に記載されていない限り、様々な構成要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と列挙する本明細書の実施形態はまた、その列挙された構成要素「からなる」か、またはそれら「から本質的になる」ものであると想定される。様々な構成要素「からなる」と列挙する本明細書の実施形態はまた、その列挙された構成要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」か、またはそれら「から本質的になる」ものであると想定される。様々な構成要素「から本質的になる」と列挙する本明細書の実施形態はまた、その列挙された構成要素「からなる」か、またはそれらを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」ものであると想定される（この互換性は、特許請求の範囲におけるこれらの用語の使用には適用されない）。「または」という用語は、文脈が別途明確に示さない限り、包括的な意味で、すなわち、「及び／または」に等しい意味で使用される。「約」という用語は、リストの前に使用される場合、リストの各要素を修飾する。「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値について許容される誤差を意味し、これは、値がどのように測定または決定されるかに部分的に依存する。

【0028】

「約」という用語は、リストの前に使用される場合、リストの各要素を修飾する。「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値について許容される誤差を意味し、これは、値がどのように測定または決定されるかに部分的に依存する。

【0029】

本明細書で使用される章の見出しは、構成的な目的のみのためであり、所望の主題を決して限定するものとして解釈されるべきではない。参照により組み込まれる任意の資料が、本明細書で定義される任意の用語または本明細書の任意の他の明示的な内容と矛盾する場合、本明細書が優先する。本教示は様々な実施形態と併せて説明されるが、それは本教示をそのような実施形態に限定することを意図するものではない。逆に、本教示は、当業者によって理解されるように、様々な代替物、改変物、及び均等物を包含する。

【0030】

Ｉ．定義
特に明記しない限り、本明細書で使用される以下の用語及び句は、以下の意味を有することを意図する。

【0031】

「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は、骨格に沿って一緒に連結された窒素系複素環式塩基または塩基アナログを有するヌクレオシドまたはヌクレオシドアナログ（従来のＲＮＡ、ＤＮＡ、混合ＲＮＡ－ＤＮＡ、及びそれらのアナログであるポリマーを含む）を含む多量体化合物を指すために本明細書で使用される。核酸「骨格」は、糖ホスホジエステル連結、ペプチド－核酸結合（「ペプチド核酸」またはＰＮＡ、ＰＣＴ第ＷＯ９５／３２３０５号）、ホスホロチオエート連結、メチルホスホネート連結、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む、様々な連結から構成され得る。核酸の糖部分は、リボース、デオキシリボース、または任意の置換、例えば、２’メトキシまたは２’ハロゲン化物置換を有する類似の化合物であり得る。窒素系塩基は、従来の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、そのアナログ（例えば、５－メトキシウリジン、シュードウリジン、もしくはＮ１－メチルシュードウリジンなどの修飾ウリジン、またはその他のもの）、イノシン、プリンもしくはピリミジンの誘導体（例えば、Ｎ^４－メチルデオキシグアノシン、デアザ－もしくはアザ－プリン、デアザ－もしくはアザ－ピリミジン、５位もしくは６位に置換基を有するピリミジン塩基（例えば、５－メチルシトシン）、２、６、もしくは８位に置換基を有するプリン塩基、２－アミノ－６－メチルアミノプリン、Ｏ^６－メチルグアニン、４－チオ－ピリミジン、４－アミノ－ピリミジン、４－ジメチルヒドラジン－ピリミジン、及びＯ^４－アルキル－ピリミジン、米国特許第５，３７８，８２５号及びＰＣＴ第ＷＯ９３／１３１２１号）であってもよい。一般的な考察については、Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ５－３６，Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，１１^ｔｈ ｅｄ．，１９９２を参照されたい）。核酸は、骨格がポリマーの位置（複数可）に窒素系塩基を含まない１つ以上の「脱塩基」残基を含み得る（米国特許第５，５８５，４８１号）。核酸は、従来のＲＮＡもしくはＤＮＡ糖、塩基、及び連結のみを含んでもよく、または従来の構成要素及び置換の両方（例えば、２’メトキシ置換基を有する従来のヌクレオシド、または従来のヌクレオチド及び１つ以上のヌクレオチドアナログの両方を含むポリマー）を含むことができる。核酸は、ＲＮＡ模倣糖構造にロックされた二環式フラノース単位を有し、相補的なＲＮＡ及びＤＮＡ配列に対するハイブリダイゼーション親和性を高める、１つ以上のＬＮＡヌクレオチドモノマーを含有するアナログである「ロックド核酸」（ＬＮＡ）を含む（Ｖｅｓｔｅｒ ａｎｄ Ｗｅｎｇｅｌ，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３（４２）：１３２３３－４１）。ＲＮＡ及びＤＮＡは異なる糖部分を有し、ＲＮＡ内のウラシルもしくはそのアナログ及びＤＮＡ内のチミンもしくはそのアナログの存在によって異なり得る。

【0032】

「ガイドＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ」、及び単に「ガイド」は、ガイド配列、例えば、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡとしても知られる）、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡの組み合わせ（ｔｒａｃｒＲＮＡとしても知られる）のいずれかを含むガイド指すために、本明細書で互換的に使用される。ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡ分子（シングルガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ）として会合し得るか、または例えば、２つの別々のＲＮＡ分子（デュアルガイドＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ）において会合し得る。「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」は、各種類を指す。ｔｒＲＮＡは、天然に存在する配列、または天然に存在する配列と比較して修飾もしくは変異を有するｔｒＲＮＡ配列であり得る。ＳｇＲＮＡまたはｄｇＲＮＡなどのガイドＲＮＡは、本明細書に記載されるような修飾ＲＮＡを含み得る。

【0033】

本明細書で使用される場合、「ガイド配列」は、標的配列に対して相補的であり、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤による結合または修飾（例えば、切断）のための標的配列に対してガイドＲＮＡを指向させるように機能する、ガイドＲＮＡ内の配列を指す。「ガイド配列」は、「標的化配列」または「スペーサー配列」とも称され得る。ガイド配列は、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（すなわち、Ｓｐｙ Ｃａｓ９）及び関連するＣａｓ９ホモログ／オルソログの場合、２０塩基対の長さであり得る。例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチド長のような、より短い配列またはより長い配列もまたガイドとして使用することができる。いくつかの実施形態では、標的配列は、例えば、遺伝子内または染色体上にあり、ガイド配列に対して相補的である。いくつかの実施形態では、ガイド配列とそれに対応する標的配列との間の相補性または同一性の程度は、約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。いくつかの実施形態では、ガイド配列及び標的領域は、１００％相補的または同一であり得る。他の実施形態では、ガイド配列及び標的領域は、少なくとも１個のミスマッチを含んでもよい。例えば、ガイド配列及び標的配列は、１、２、３、または４個のミスマッチを含んでもよく、標的配列の全長は、少なくとも１７、１８、１９、２０個以上の塩基対である。いくつかの実施形態では、ガイド配列及び標的領域は、１～４個のミスマッチを含んでもよく、ガイド配列は、少なくとも１７、１８、１９、２０個以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ガイド配列及び標的配列は、１、２、３、または４個のミスマッチを含んでもよく、ガイド配列は、２０個のヌクレオチドを含む。

【0034】

ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の核酸基質は二本鎖核酸であるので、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の標的配列は、ゲノムＤＮＡのプラス鎖とマイナス鎖（すなわち、与えられる配列と、配列の逆相補体）の両方を含む。したがって、ガイド配列が、「標的配列に対して相補的」であると言われる場合、標的配列のセンス鎖またはアンチセンス鎖（例えば、逆相補体）に結合するようにガイドＲＮＡを指向させ得ると理解されるべきである。したがって、いくつかの実施形態では、ガイド配列が、標的配列の逆相補体に結合する場合、ガイド配列は、ガイド配列におけるＵのＴへの置換を除いて、標的配列の特定のヌクレオチド（例えばＰＡＭを含まない標的配列）と同一である。

【0035】

本明細書で使用される場合、「ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤」は、ＲＮＡ及びＤＮＡ結合活性を有するポリペプチドもしくはポリペプチドの複合体、またはそのような複合体のＤＮＡ結合サブユニットを意味し、ＤＮＡ結合活性は、配列特異的であり、ＲＮＡの配列に依存する。ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤という用語は、そのようなポリペプチドをコードする核酸も含む。例示的なＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤には、Ｃａｓクリベース／ニッカーゼが含まれる。例示的なＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤には、その不活性化形態（「ｄＣａｓ ＤＮＡ結合剤」）が含まれ得る（例えば、これらの薬剤が、例えば、ＦｏｋＩクリベースドメインとの融合を介して、ＤＮＡ切断を可能にするように修飾された場合）。本明細書で使用される「Ｃａｓヌクレアーゼ」は、Ｃａｓクリベース及びＣａｓニッカーゼを包含する。Ｃａｓクリベース及びＣａｓニッカーゼには、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のＣｓｍもしくはＣｍｒ複合体、そのＣａｓ１０、Ｃｓｍ１、またはＣｍｒ２サブユニット、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ系のカスケード複合体、そのＣａｓ３サブユニット、及びクラス２のＣａｓヌクレアーゼが含まれる。本明細書で使用される場合、「クラス２のＣａｓヌクレアーゼ」は、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合活性を有する一本鎖ポリペプチドである。クラス２のＣａｓヌクレアーゼには、ＲＮＡガイドＤＮＡクリベースもしくはニッカーゼ活性をさらに有するクラス２のＣａｓクリベース／ニッカーゼ（例えば、Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ、またはＮ８６３Ａバリアント）、及びクリベース／ニッカーゼ活性が不活性化されたクラス２のｄＣａｓ ＤＮＡ結合剤（それらの薬剤がＤＮＡ切断を可能にするように修飾されている場合）が含まれる。クラス２のＣａｓヌクレアーゼには、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ＨＦ Ｃａｓ９（例えば、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａバリアント）、ＨｙｐａＣａｓ９（例えば、Ｎ６９２Ａ、Ｍ６９４Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｈ６９８Ａバリアント）、ｅＳＰＣａｓ９（１．０）（例えば、Ｋ８１０Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａバリアント）、及びｅＳＰＣａｓ９（１．１）（例えば、Ｋ８４８Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａバリアント）タンパク質、ならびにそれらの修飾が含まれる。Ｃｐｆ１タンパク質（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１６３：１－１３（２０１５））もまた、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含む。ＺｅｔｓｃｈｅのＣｐｆ１配列は、参照によりそれらの全体において組み込まれる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅの表Ｓ１及びＳ３を参照されたい。例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１３（１１）：７２２－３６（２０１５）、Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，６０：３８５－３９７（２０１５）を参照されたい。本明細書で使用する場合、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、またはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ヌクレアーゼ）の送達は、ポリペプチドまたはｍＲＮＡの送達を含む。

【0036】

本明細書で使用される場合、「リボ核タンパク質」（ＲＮＰ）または「ＲＮＰ複合体」は、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓクリベース、Ｃａｓニッカーゼ、Ｃａｓ９クリベース、またはＣａｓ９ニッカーゼと合わせたガイドＲＮＡを指す。いくつかの実施形態では、ガイド配列は、Ｃａｓ９などのＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤を標的配列へと誘導し、ガイドＲＮＡが標的配列とハイブリダイズし、薬剤が標的配列と結合し、結合の後に切断またはニッキングを行うことができる。

【0037】

本明細書で使用する場合、第２の配列に対する第１の配列のアライメントにより、第２の配列の位置の全体でのＸ％以上が第１の配列によって一致することが示される場合、第１の配列は、第２の配列と「少なくともＸ％の同一性を有する配列を含む」とみなされる。例えば、配列ＡＡＧＡは、配列ＡＡＧと１００％同一性を有する配列を含むが、その理由は、アラインメントが、第２の配列の３つの全ての位置において一致があるという点で１００％同一性を与えるからである。ＲＮＡとＤＮＡとの間の差（一般に、チミジンをウリジンに交換すること、またはその逆）、及び修飾ウリジンなどのヌクレオシドアナログの存在は、関連するヌクレオチド（チミジン、ウリジン、または修飾ウリジンなど）が同じ相補体（例えば、チミジン、ウリジン、または修飾ウリジンの全てについてのアデノシン、別の例は、シトシン及び５－メチルシトシンであり、これらの両方が相補体としてグアノシンまたは修飾グアノシンを有する）を有する限り、ポリヌクレオチド間の同一性または相補性の差に寄与しない。したがって、例えば、Ｘがいずれかの修飾ウリジン、例えば、シュードウリジン、Ｎ１－メチルシュードウリジン、または５－メトキシウリジンである配列５’－ＡＸＧは、両方とも同じ配列（５’－ＣＡＵ）に完全に相補的である点において、ＡＵＧと１００％同一であるとみなされる。例示的なアライメントアルゴリズムは、当該技術分野で周知である、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ及びＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムである。当業者は、アライメントされる配列の所与の対について、どのようなアルゴリズム及びパラメータ設定の選択が適切であることを理解するであろう。一般的に類似する長さ及び予想される同一性がアミノ酸については５０％超の配列、またはヌクレオチドについては７５％超の配列に関して、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋウェブサーバでＥＢＩによって提供されるＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムインターフェースのデフォルト設定を用いるＮｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムが一般的に適切である。

【0038】

本明細書で使用される場合、第１の配列は、第１の配列の塩基のＸ％が第２の配列と塩基対合する場合、第２の配列に対して「Ｘ％相補的」であるとみなされる。例えば、第１の配列５’ＡＡＧＡ３’は、第２の配列３’ＴＴＣＴ５’と１００％相補的であり、第２の配列は、第１の配列に対して１００％相補的である。いくつかの実施形態では、第１の配列５’ＡＡＧＡ３’は、第２の配列３’ＴＴＣＴＧＴＧＡ５’と１００％相補的であるが、一方、第２の配列は、第１の配列に対して５０％相補的である。

【0039】

「ｍＲＮＡ」は、ポリペプチドに翻訳することができる（すなわち、リボソーム及びアミノアシル化ｔＲＮＡによる翻訳のための基質として機能することができる）オープンリーディングフレームを含むポリヌクレオチドを指すために本明細書で使用される。ｍＲＮＡは、主にＲＮＡまたは修飾ＲＮＡを含み、それはリボース残基もしくはそのアナログ、例えば、２’－メトキシリボース残基を含む、リン酸糖骨格を含み得る。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡリン酸糖骨格の糖は、リボース残基、２’－メトキシリボース残基、またはそれらの組み合わせから本質的になる。ｍＲＮＡの塩基は、シュードウリジン、Ｎ－１－メチル－シュードウリジン、または他の天然に存在するもしくは非天然に存在する塩基などの修飾塩基であり得る。

【0040】

本明細書に記載される組成物及び方法に有用な例示的なガイド配列を、表１及び本出願全体に示す。

【0041】

本明細書で使用される場合、「インデル」は、標的核酸内の二本鎖切断（ＤＳＢ）の部位において挿入されるか、または欠失するかのいずれかであるいくつかのヌクレオチドからなる挿入／欠失変異を指す。

【0042】

本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」は、野生型タンパク質またはバリアントタンパク質（例えば、変異体、断片、融合、またはそれらの組み合わせ）を指す。バリアントポリペプチドは、野生型ポリペプチドの少なくともまたは約５％、１０％、１５％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の機能活性を有し得る。いくつかの実施形態では、バリアントは、野生型ポリペプチドの配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドは、活動亢進型バリアントであり得る。ある特定の例では、バリアントは、野生型ポリペプチドの機能活性の約８０％～約１２０％、１４０％、１６０％、１８０％、２００％、３００％、４００％、５００％以上を有する。

【0043】

本明細書で使用される場合、「標的配列」は、ｇＲＮＡのガイド配列に対して相補性を有する標的遺伝子内の核酸配列を指す。標的配列とガイド配列との相互作用により、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、標的配列内で結合し、潜在的に（薬剤の活性に応じて）ニッキングまたは切断するように指向される。

【0044】

本明細書で使用される場合、「異種遺伝子」は、宿主細胞ゲノム内の部位（例えば、アルブミンイントロン１部位）への外因性源として導入されている遺伝子を指す。すなわち、導入された遺伝子は、その挿入部位に関して異種である。そのような異種遺伝子から発現されるポリペプチドは、「異種ポリペプチド」と称される。異種遺伝子は、天然に存在するか、または操作されることができ、野生型またはバリアントであり得る。異種遺伝子は、異種ポリペプチド（例えば、内部リボソーム侵入部位）をコードする配列以外のヌクレオチド配列を含み得る。異種遺伝子は、野生型またはバリアント（例えば、変異体）として宿主ゲノム内で天然に存在する遺伝子であり得る。例えば、宿主細胞は（野生型としてまたはバリアントとして）目的の遺伝子を含むが、同じ遺伝子またはそのバリアントは、例えば、高度に発現される遺伝子座での発現のための外因性源として導入され得る。異種遺伝子はまた、宿主ゲノムにおいて天然に存在しない、または宿主ゲノムにおいて天然に存在しない異種ポリペプチドを発現する遺伝子であり得る。「異種遺伝子」、「外因性遺伝子」、及び「導入遺伝子」は、互換的に使用される。いくつかの実施形態では、異種遺伝子または導入遺伝子は、外因性核酸配列を含み、例えば、核酸配列は、レシピエント細胞に対して内因性ではない。いくつかの実施形態では、異種遺伝子または導入遺伝子は、外因性核酸配列、例えば、レシピエント細胞において天然に存在しない核酸配列を含む。例えば、異種遺伝子は、その挿入部位に関して、及びそのレシピエント細胞に関して異種であり得る。

【0045】

異種遺伝子は、例えば、アポトーシス、壊死、及び／または老化を引き起こすことなく、または対照細胞と比較して５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、もしくは４０％を超えるアポトーシス、壊死、及び／または老化を引き起こすことなく、宿主細胞、例えば、肝細胞に対する著しい有害作用なく、ゲノム内のセーフハーバー遺伝子座に挿入され得る。例えば、Ｈｓｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ ｄｅａｔｈ ｉｎ ｌｉｖｅｒ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ｆｉｂｒｏｓｉｓ，ａｎｄ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ，”２０１７を参照されたい。いくつかの実施形態では、セーフハーバー遺伝子座は、例えば、アポトーシス、壊死、及び／または老化を引き起こすことなく、または対照細胞と比較して５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、もしくは４０％を超えるアポトーシス、壊死、及び／または老化を引き起こすことなく、宿主細胞、例えば、肝細胞に対する著しい有害作用なく、外因性遺伝子の過剰発現を可能にする。いくつかの実施形態では、望ましいセーフハーバー遺伝子座は、挿入された遺伝子配列の発現が隣接する遺伝子からのリードスルー発現によって乱されない遺伝子座であり得る。いくつかの実施形態では、セーフハーバー遺伝子座は、例えば、アポトーシス、壊死、及び／または老化を引き起こすことなく、または対照細胞もしくは細胞集団と比較して５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、もしくは４０％を超えるアポトーシス、壊死、及び／または老化を引き起こすことなく、肝細胞または肝臓細胞などの、宿主細胞または細胞集団に対する著しい有害作用なく、外因性遺伝子の発現を可能にする。

【0046】

いくつかの実施形態では、異種遺伝子は、セーフハーバー遺伝子座に挿入され、セーフハーバー遺伝子座の内因性シグナル配列、例えば、エクソン１によってコードされるアルブミンシグナル配列を使用してもよい。例えば、コード配列は、それがヒトアルブミンエキソン１のシグナル配列の下流であり、それと融合するように、ヒトアルブミンイントロン１に挿入され得る。

【0047】

いくつかの実施形態では、遺伝子は、それ自身のシグナル配列を含んでもよく、セーフハーバー遺伝子座に挿入されてもよく、セーフハーバー遺伝子座の内因性シグナル配列をさらに使用してもよい。例えば、その天然シグナル配列を含むコード配列は、それがエキソン１によってコードされるヒトアルブミンのシグナル配列の下流であり、それと融合するように、ヒトアルブミンイントロン１に挿入され得る。

【0048】

いくつかの実施形態では、遺伝子は、それ自身のシグナル配列及び内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含んでもよく、セーフハーバー遺伝子座に挿入されてもよく、セーフハーバー遺伝子座の内因性シグナル配列をさらに使用してもよい。例えば、その天然シグナル配列及びＩＲＥＳ配列を含むコード配列は、それがエキソン１によってコードされるヒトアルブミンのシグナル配列の下流であり、それと融合するように、ヒトアルブミンイントロン１に挿入され得る。

【0049】

いくつかの実施形態では、遺伝子は、それ自身のシグナル配列及びＩＲＥＳを含んでもよく、セーフハーバー遺伝子座に挿入されてもよく、セーフハーバー遺伝子座の内因性シグナル配列を使用しない。例えば、その天然シグナル配列及びＩＲＥＳ配列を含むコード配列は、それがエキソン１によってコードされるヒトアルブミンのシグナル配列と融合しないように、ヒトアルブミンイントロン１に挿入され得る。これらの実施形態では、タンパク質は、ＩＲＥＳ部位から翻訳され、かつキメラ（例えば、異種タンパク質に融合されたアルブミンシグナルペプチド）ではなく、それは、有利に非免疫原性または低免疫原性であり得る。いくつかの実施形態では、タンパク質は、細胞外で分泌及び／または輸送されない。

【0050】

いくつかの実施形態では、遺伝子は、セーフハーバー遺伝子座に挿入されてもよく、ＩＲＥＳを含んでもよく、いかなるシグナル配列も使用しない。例えば、ＩＲＥＳ配列を含み、天然シグナル配列を含まないコード配列は、それがエキソン１によってコードされるヒトアルブミンのシグナル配列と融合しないように、ヒトアルブミンイントロン１に挿入され得る。いくつかの実施形態では、タンパク質は、任意のシグナル配列なしでＩＲＥＳ部位から翻訳される。いくつかの実施形態では、タンパク質は、細胞外で分泌及び／または輸送されない。

【0051】

本明細書で使用される場合、「双方向性核酸構築物」（本明細書では「双方向性構築物」と互換的に称される）は、少なくとも２つの核酸セグメントを含み、一方のセグメント（第１のセグメント）は、目的の薬剤をコードするコード配列（コード配列は、本明細書では「導入遺伝子」または第１の導入遺伝子と称され得る）を含み、他方のセグメント（第２のセグメント）は、配列の相補体が目的の薬剤をコードする配列、または第２の導入遺伝子を含む。

【0052】

一実施形態では、双方向性構築物は、少なくとも２つの核酸セグメントをｃｉｓで含み、一方のセグメント（第１のセグメント）は、コード配列（本明細書において、時に「導入遺伝子」と互換的に称される）を含み、他方のセグメント（第２のセグメント）は、配列の相補体が導入遺伝子をコードする配列を含む。第１の導入遺伝子及び第２の導入遺伝子は、同一であっても異なっていてもよい。双方向性構築物は、少なくとも２つの核酸セグメントをｃｉｓで含み得、一方のセグメント（第１のセグメント）は、一方の配向で異種遺伝子をコードするコード配列を含み、他方のセグメント（第２のセグメント）は、相補体が他方の配向で異種遺伝子をコードする配列を含む。すなわち、第１のセグメントは、第２のセグメントの相補体であり（必ずしも完全な相補体ではない）、第２のセグメントの相補体は、第１のセグメントの逆相補体である（両方とも同じ異種タンパク質をコードするが、必ずしも完全な逆相補体ではない）。双方向性構築物は、スプライスアクセプターに連結した異種遺伝子をコードする第１のコード配列と、相補体が他方の配向で異種遺伝子をコードし、スプライスアクセプターにも連結した２のコード配列とを含み得る。

【0053】

薬剤は、ポリペプチド、機能性ＲＮＡ、ｍＲＮＡなどの治療用薬剤であり得る。導入遺伝子は、ポリペプチド、機能性ＲＮＡ、またはｍＲＮＡなどの薬剤をコードし得る。いくつかの実施形態では、双方向性核酸構築物は、少なくとも２つの核酸セグメントを含み、一方のセグメント（第１のセグメント）は、目的のポリペプチドをコードするコード配列を含み、他方のセグメント（第２のセグメント）は、配列の相補体が目的のポリペプチドをコードする配列、または第２の導入遺伝子を含む。すなわち、少なくとも２つのセグメントは、同一もしくは異なるポリペプチドまたは同一もしくは異なる薬剤をコードすることができる。２つのセグメントが同一のポリペプチドをコードする場合、第１のセグメントのコード配列は、第２のセグメントの配列の相補体と同一である必要はない。いくつかの実施形態では、第２のセグメントの配列は、第１のセグメントのコード配列の逆相補体である。双方向性構築物は、一本鎖または二本鎖であり得る。本明細書に開示される双方向性構築物は、目的の任意のポリペプチドを発現することができる構築物を包含する。双方向性構築物は、導入遺伝子配列のゲノム挿入、特に導入遺伝子の標的挿入に有用である。

【0054】

いくつかの実施形態では、双方向性核酸構築物は、第１のポリペプチドをコードするコード配列（第１の導入遺伝子）を含む第１のセグメントと、配列の相補体が第２のポリペプチドをコードする配列（第２の導入遺伝子）を含む第２のセグメントとを含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のポリペプチドは、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である。いくつかの実施形態では、第１及び第２のポリペプチドは、例えば、５０、１００、２００、５００、１０００以上のアミノ酸残基にわたって、少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0055】

本明細書で使用される場合、「逆相補体」は、参照配列の相補配列である配列を指し、相補配列は、逆方向で書かれている。例えば、仮定配列５’ＣＴＧＧＡＣＣＧＡ３’（配列番号５００）について、「完璧な」相補配列は、３’ＧＡＣＣＴＧＧＣＴ５’（配列番号５０１）であり、「完璧な」逆相補配列は、５’ＴＣＧＧＴＣＣＡＧ３’（配列番号５０２）と書かれている。逆相補配列は、「完璧」である必要はなく、依然として、参照配列と同じポリペプチドまたは類似のポリペプチドをコードし得る。コドン使用頻度の冗長性のため、逆相補体は、同じポリペプチドをコードする参照配列から逸脱し得る。本明細書で使用される場合、「逆相補体」はまた、参照配列の逆相補体配列と、例えば、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含む。

【0056】

ＩＩ．組成物
Ａ．ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む組成物
ゲノム遺伝子座、例えば、宿主細胞のセーフハーバー部位内に異種（外因性）遺伝子を挿入及び発現するのに有用な組成物及び方法が本明細書に提供される。特に、本明細書に例示されるように、アルブミン遺伝子座（例えば、イントロン１）における外因性遺伝子の標的化及び挿入は、アルブミンの内因性プロモーターを使用して、外因性遺伝子のロバストな発現を駆動することを可能にする。本開示は、アルブミン遺伝子のイントロン１内の部位を特異的に標的とし、かつ外因性遺伝子の効率的な挿入及び発現を提供するガイドＲＮＡの同定に部分的に基づく。実施例に示され、本明細書にさらに記載されるように、同定されたｇＲＮＡが、インデル形成活性により測定された高レベルの編集を媒介する能力は、意外に、例えば、導入遺伝子の発現により測定された導入遺伝子の効率的な挿入を媒介するための同じｇＲＮＡの使用と必ずしも相関するものではない。すなわち、著しいレベルのインデル形成を達成することができるある特定のｇＲＮＡは、必ずしも効率的な挿入を媒介することができるわけではなく、逆に、低レベルのインデル形成を達成することが示されるいくつかのｇＲＮＡは、導入遺伝子の効率的な挿入及び発現を媒介し得る。具体的には、実施例のデータは、インデル形成（編集％とも呼ばれる）を効果的に媒介するｇＲＮＡが、挿入編集活性と相関するインデル編集活性を有さなかったことを示す。

【0057】

いくつかの実施形態では、宿主細胞におけるアルブミン遺伝子座のイントロン１内に外因性遺伝子を挿入及び発現するのに有用な組成物及び方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、例えば、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、及び異種核酸（「導入遺伝子」）を含む構築物と共に本明細書に開示されるガイドＲＮＡを使用して、宿主細胞のアルブミン遺伝子座内に異種核酸を導入または挿入するのに有用な組成物及び方法が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、例えば、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤及び異種核酸（「導入遺伝子」）を含む構築物と共に本明細書に開示されるガイドＲＮＡを使用して、宿主細胞のアルブミン遺伝子座で異種ポリペプチドを発現するのに有用な組成物及び方法が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、例えば、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）と共に本明細書に開示されるガイドＲＮＡを使用して、宿主細胞のアルブミン遺伝子内で切断（例えば、二本鎖切断（ＤＳＢ）または一本鎖切断（ニック））を誘導するのに有用な組成物及び方法が本明細書に開示される。組成物及び方法は、インビトロまたはインビボで、例えば、治療目的のために使用され得る。

【0058】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、アルブミン遺伝子座のイントロン内で結合するか、または結合することができるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、ヒトアルブミン遺伝子（配列番号１）のイントロン１の領域内で結合する。ガイド配列の全ての塩基が列挙された領域内で結合しなければならないわけではないことが理解されよう。例えば、いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ配列の１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上の塩基は、列挙された領域と結合する。例えば、いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ配列の１５、１６、１７、１８、１９、２０個以上の連続塩基は、列挙された領域と結合する。

【0059】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、ヒトアルブミンイントロン１（配列番号１）内の部位におけるＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）による標的特異的切断を媒介する。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号１における領域に結合するか、または結合することができるガイド配列を含むことが理解されよう。

【0060】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一であるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号１６４～１９６からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一であるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号９８～１１９からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一であるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、表１から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一であるガイド配列を含む。ｇＲＮＡは、表１に示されるガイド配列のうちの１つ以上を含み得る。ｇＲＮＡは、表１、７、及び９に示される配列のうちの１つ以上を含み得る。ｇＲＮＡは、表２、８、及び１０に示される配列のうちの１つ以上を含み得る。ガイドＲＮＡは、配列番号２～３３のうちの１つ以上を含み得る。ｇＲＮＡは、配列番号１６４～１９６のうちの１つ以上を含み得る。ｇＲＮＡは、配列番号９８～１１９のうちの１つ以上を含み得る。

【0061】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドを有するガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号１６４～１９６からなる群から選択される配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドを有するガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号９８～１１９からなる群から選択される配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドを有するガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、表１から選択される配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドを有するガイド配列を含む。

【0062】

いくつかの実施形態では、ガイドｇＲＮＡは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、及び配列番号３３からなる群から選択される配列を含む。

【0063】

いくつかの実施形態では、アルブミンガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列、ｂ）配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチド、ｃ）配列番号３４、４０、４５、５１、６０、６１、６３、６４、６５、６６、７２、７７、８３、９２、９３、９５、９６、及び９７からなる群から選択される配列、ｄ）配列番号２～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列、ｅ）配列番号２～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチド、ｆ）配列番号３４～９７からなる群から選択される配列、ならびにｇ）配列番号２～３３について列挙されるゲノム座標の１５個の連続ヌクレオチド±１０個のヌクレオチドに対して相補的である配列から選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、アルブミンガイドＲＮＡは、配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、３３からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号４、１３、１７、１９、２７、２８、３０、及び３１からなる群から選択される配列を含む。

【0064】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、プロポスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の上流の領域に結合する。当業者によって理解されるように、ＰＡＭ配列は、標的配列を含む鎖の反対側の鎖上で生じる。すなわち、ＰＡＭ配列は、標的鎖（ガイドＲＮＡが結合する標的配列を含む鎖）の相補鎖上にある。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、ＮＧＧ、ＮＮＧＲＲＴ、ＮＮＧＲＲ（Ｎ）、ＮＮＡＧＡＡＷ、ＮＮＮＮＧ（Ａ／Ｃ）ＴＴ、及びＮＮＮＮＲＹＡＣからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、ＮＧＧである。

【0065】

いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるガイドＲＮＡ配列は、ＰＡＭ配列に隣接する配列に対して相補的である。

【0066】

いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ配列は、ヒト参照ゲノムｈｇ３８内の座標に従って表１から選択されるゲノム領域内の配列に対して相補的である配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ配列は、表１から選択されるゲノム領域内から５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の連続ヌクレオチドを含む配列に対して相補的である配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ配列は、表１から選択されるゲノム領域にわたる５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の連続ヌクレオチドを含む配列に対して相補的である配列を含む。

【0067】

本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、二本鎖切断（ＤＳＢ）をもたらす標的特異的切断を媒介する。本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、一本鎖切断（ＳＳＢまたはニック）をもたらす標的特異的切断を媒介する。

【0068】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、本明細書に開示されるようなＣａｓヌクレアーゼ）による標的特異的切断を媒介し、アルブミン遺伝子のイントロン１内に異種核酸の挿入をもたらす。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ及び／または切断部位での切断は、異種遺伝子の３０～３５％、３５～４０％、４０～４５％、４５～５０％、５０～５５％、５５～６０％、６０～６５％、６５～７０％、７０～７５％、７５～８０％、８０～８５％、８５～９０％、９０～９５％、または９５～９９％の挿入速度をもたらす。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ及び／または切断は、異種核酸の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％の挿入をもたらす。挿入速度は、インビトロまたはインビボで測定することができる。例えば、いくつかの実施形態では、挿入速度は、細胞集団内の挿入された核酸を検出及び測定し、挿入された核酸を含む集団のパーセンテージを計算することによって決定することができる。挿入速度を測定する方法は、当該技術分野で既知であり、利用可能である。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、異種遺伝子の５～１０％、１０～１５％、１５～２０％、２０～２５％、２５～３０％、３０～３５％、３５～４０％、４０～４５％、４５～５０％、５０～５５％、５５～６０％、６０～６５％、６５～７０％、７０～７５％、７５～８０％、８０～８５％、８５～９０％、９０～９５％、９５～９９％、またはそれを超える％増加した発現を可能にする。異種遺伝子の発現の増加は、インビトロまたはインビボで測定することができる。例えば、いくつかの実施形態では、増加した発現は、例えば、細胞を治療する前、または対象への投与の前のポリペプチドレベルを検出及び測定し、レベルをポリペプチドレベルと比較することによって決定され得る。いくつかの実施形態では、増加した発現は、異種ポリペプチドレベルを検出及び測定し、レベルを既知のポリペプチドレベル、例えば、健康対象おけるポリペプチドの正常なレベルと比較することによって決定され得る。

【0069】

表１に示されるガイド配列の各々は、ｃｒＲＮＡを形成するための追加のヌクレオチドをさらに含んでもよく、例えば、その３’末端で、ガイド配列に続く以下の例示的なヌクレオチド配列を有する。５’から３’への配向で、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号３００）。ゲノム座標は、ヒト参照ゲノムｈｇ３８に従う。ｓｇＲＮＡの場合、上述のガイド配列は、ｓｇＲＮＡを形成するための追加のヌクレオチドをさらに含んでもよく、例えば、ガイド配列の３’末端に続く以下の例示的なヌクレオチド配列を有する。５’から３’への配向で、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵ（配列番号３０１）またはＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ（配列番号３０２）。
表１：ヒトガイドＲＮＡ配列及び染色体座標

【0070】

ガイドＲＮＡは、ｔｒＲＮＡをさらに含み得る。本明細書に記載される各組成物及び方法の実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、シングルＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）として会合してもよく、または別個のＲＮＡ上にあってもよい（ｄｇＲＮＡ）。ｓｇＲＮＡの文脈において、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡの構成要素は、例えば、ホスホジエステル結合または他の共有結合を介して共有結合され得る。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ホスホジエステル結合ではないヌクレオチド間の１つ以上の連結を含む。

【0071】

本明細書に記載される組成物、使用、及び方法の実施形態の各々では、ガイドＲＮＡは、「デュアルガイドＲＮＡ」または「ｄｇＲＮＡ」として２つのＲＮＡ分子を含み得る。ｄｇＲＮＡは、例えば、表１に示されるガイド配列を含むｃｒＲＮＡを含む第１のＲＮＡ分子と、ｔｒＲＮＡを含む第２のＲＮＡ分子とを含む。第１のＲＮＡ分子及び第２のＲＮＡ分子は共有結合しなくてもよいが、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡの部分の間の塩基対合を介してＲＮＡ二本鎖を形成してもよい。

【0072】

本明細書に記載される組成物、使用、及び方法の実施形態の各々では、ガイドＲＮＡは、「シングルガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」としてシングルＲＮＡ分子を含み得る。ｓｇＲＮＡは、ｔｒＲＮＡに共有結合した表１に示されるガイド配列を含むｃｒＲＮＡ（またはその一部分）を含み得る。ｓｇＲＮＡは、表１に示されるガイド配列のも１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、リンカーを介して共有結合される。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡの部分の間の塩基対合によって、ステムループ構造を形成する。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、ホスホジエステル結合ではない１つ以上の結合を介して共有結合される。

【0073】

いくつかの実施形態では、ｔｒＲＮＡは、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来のｔｒＲＮＡ配列の全てまたは一部分を含み得る。いくつかの実施形態では、ｔｒＲＮＡは、先端切断または修飾された野生型ｔｒＲＮＡを含む。ｔｒＲＮＡの長さは、使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に依存する。いくつかの実施形態では、ｔｒＲＮＡは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、もしくは１００個より多いヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、ｔｒＲＮＡは、例えば、１つ以上のヘアピン構造もしくはステムループ構造、または１つ以上のバルジ構造などのある特定の二次構造を含み得る。

【0074】

いくつかの実施形態では、標的配列またはヒトアルブミン遺伝子座のイントロン１内の領域（例えば、配列番号１内の領域に対応するヌクレオチド配列）は、ガイドＲＮＡのガイド配列に対して相補的であり得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡのガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性または同一性の程度は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり得る。いくつかの実施形態では、標的配列とｇＲＮＡのガイド配列は、１００％相補的であるか、または同一であり得る。他の実施形態では、標的配列とｇＲＮＡのガイド配列は、少なくとも１個のミスマッチを含んでもよい。例えば、標的配列とｇＲＮＡのガイド配列は、１、２、３、４、または５個のミスマッチを含んでもよく、ガイド配列の全長は、約２０または２０である。いくつかの実施形態において、標的配列とｇＲＮＡのガイド配列は、１～４個のミスマッチを含んでもよく、ガイド配列は、約２０または２０ヌクレオチドである。

【0075】

本明細書に記載及び例示されるように、アルブミンガイドＲＮＡは、アルブミン遺伝子のイントロン１で異種遺伝子（例えば、導入遺伝子）を挿入及び発現するために使用され得る。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓ９）をアルブミン遺伝子内の標的ＤＮＡ配列に導くガイド配列を含む１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む組成物を含む。

【0076】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示の組成物または製剤は、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えば、本明細書に記載のＣａｓヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡを含む。以下に記載されるように、Ｃａｓヌクレアーゼを含むｍＲＮＡは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、例えば、クリベース、ニッカーゼ、及び／または部位特異的ＤＮＡ結合活性を有するＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ヌクレアーゼを含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼをコードするＯＲＦは、「修飾ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤ＯＲＦ」または単に「修飾ＯＲＦ」であり、ＯＲＦが修飾されることを示すための略語として使用される。

【0077】

修飾Ｃａｓ９ ＯＲＦを含むＣａｓ９ ＯＲＦは、本明細書において提供され、当該技術分野で既知である。一例として、Ｃａｓ９ ＯＲＦは、コード配列が１つ以上のアミノ酸の１つ以上の代替コドンを含むように、コドン最適化することができる。本明細書で使用される「代替コドン」は、所与のアミノ酸についてのコドン使用頻度の変形を指し、所与の発現系に好ましいまたは最適化されたコドン（コドン最適化）であってもなくてもよい。好ましいコドン使用頻度、または所与の発現系において良好に耐容されるコドンは、当該技術分野で既知である。ＷＯ２０１３／１７６７７２、ＷＯ２０１４／０６５５９６、ＷＯ２０１６／１０６１２１、及びＷＯ２０１９／０６７９１０のＣａｓ９コード配列、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、及びＣａｓ９タンパク質配列は、参照により本明細書に組み込まれる。特に、ＷＯ２０１９／０６７９１０の段落［０４４９］の表のＯＲＦ及びＣａｓ９アミノ酸配列、ならびにＷＯ２０１９／０６７９１０の段落［０２１４］～［０２３４］のＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びＯＲＦは、参照により本明細書に組み込まれる。

【0078】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えば、ＣａｓヌクレアーゼをコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡが提供されるか、使用されるか、または投与される。

【0079】

Ｂ．修飾ｇＲＮＡ及びｍＲＮＡ
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、化学修飾されている。１つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むｇＲＮＡは、標準的なＡ、Ｇ、Ｃ、及びＵ残基の代わりに、またはそれらに加えて使用される１つ以上の非天然及び／または天然に存在する構成要素または配置の存在を記載するために、「修飾」ｇＲＮＡまたは「化学修飾」ｇＲＮＡと呼ばれる。いくつかの実施形態では、修飾ｇＲＮＡは、非標準的なヌクレオシドまたはヌクレオチドを用いて合成され、本明細書では「修飾された」と呼ばれる。修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドは、（ｉ）ホスホジエステル骨格結合における改変、例えば、非架橋のリン酸酸素の１つもしくは両方、及び／または、架橋リン酸酸素の１つ以上の置き換え（例示的な骨格修飾）、（ｉｉ）リボース糖の成分、例えば、リボース糖の２’ヒドロキシルの改変、例えば、置き換え（例示的な糖修飾）、（ｉｉｉ）リン酸部分の「脱リン酸型」リンカーによる大規模な置き換え（例示的な骨格修飾）、（ｉｖ）非標準的な核酸塩基によるものを含め、天然に存在する核酸塩基の修飾または置き換え（例示的な塩基修飾）、（ｖ）リボースリン酸骨格の置き換えまたは修飾（例示的な骨格修飾）、（ｖｉ）オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の修飾、例えば、末端リン酸基の除去、修飾または置き換え、または部分、キャップ、またはリンカーのコンジュゲーション（そのような３’または５’のキャップ修飾は、糖及び／または骨格の修飾を含み得る）、ならびに（ｖｉｉ）糖の修飾または置き換え（例示的な糖修飾）の１つ以上を含み得る。

【0080】

上に列挙されるものなどの化学修飾を組み合わせて、２、３、４以上の修飾を有し得るヌクレオシド及びヌクレオチド（まとめて「残基」）を含む修飾ｇＲＮＡ及び／またはｍＲＮＡを提供することができる。例えば、修飾残基は、修飾糖及び修飾核酸塩基を有し得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡの各々の塩基は修飾され、例えば、全ての塩基がホスホロチオエート基などの修飾リン酸基を有する。ある特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子のリン酸基の全て、または実質的に全てがホスホロチオエート基によって置き換えられる。いくつかの実施形態では、修飾ｇＲＮＡは、ＲＮＡの５’末端において、またはその近傍において少なくとも１つの修飾残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ｇＲＮＡは、ＲＮＡの３’末端において、またはその近傍において少なくとも１つの修飾残基を含む。ある特定のｇＲＮＡは、ＲＮＡの５’末端及び３’末端において、またはその近傍において少なくとも１つの修飾残基を含む。

【0081】

いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、１、２、３以上の修飾残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ｇＲＮＡ内の位置の少なくとも５％（例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％）は、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドである。

【0082】

非修飾核酸は、例えば、細胞内ヌクレアーゼまたは血清中に見られるものによる分解を受けやすい場合がある。例えば、ヌクレアーゼは、核酸のホスホジエステル結合を加水分解し得る。したがって、一態様では、本明細書に記載されるｇＲＮＡは、例えば、細胞内または血清に由来するヌクレアーゼに対する安定性を導入するために、１つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾ｇＲＮＡ分子は、インビボ及びエクスビボの両方において細胞集団に導入されるとき、低減した自然免疫応答を示し得る。「自然免疫応答」という用語は、サイトカイン（特にインターフェロン）発現及び放出の誘導ならびに細胞死を含む、一本鎖核酸を含む外因性核酸に対する細胞応答を含む。

【0083】

骨格修飾のいくつかの実施形態では、修飾残基のリン酸基は、１つ以上の酸素を異なる置換基によって置き換えることによって修飾され得る。さらに、修飾残基、例えば、修飾核酸中に存在する修飾残基は、本明細書において記載されるように、非修飾リン酸部分の修飾リン酸基による大規模な置き換えを含み得る。いくつかの実施形態では、リン酸骨格の骨格修飾は、帯電していないリンカーまたは非対称な電荷分布を有する帯電したリンカーのいずれかをもたらす改変を含み得る。

【0084】

修飾リン酸基の例には、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノリン酸、ボラノリン酸エステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネート、及びホスホトリエステルが含まれる。非修飾リン酸基中のリン酸原子は、アキラルである。しかしながら、非架橋酸素のうちの１つの、上述の原子または原子群のうちの１つによる置き換えは、リン原子をキラルにすることができる。立体リン原子は、「Ｒ」配置（本明細書においてＲｐ）または「Ｓ」配置（本明細書においてＳｐ）のいずれかを有し得る。骨格はまた、架橋酸素（すなわち、リン酸をヌクレオシドに連結する酸素）の、窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）、及び炭素（架橋メチレンホスホネート）による置き換えによっても修飾され得る。置き換えは、いずれかの架橋酸素または両方の架橋酸素において生じ得る。

【0085】

リン酸基は、ある特定の骨格修飾において、非リン含有連結基によって置き換えることができる。いくつかの実施形態では、帯電したリン酸基は、中性部分によって置き換えることができる。リン酸基を置き換えることのできる部分の例には、限定されないが、例えば、メチルホスホン酸、ヒドロキシルアミノ、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｈｙｄｒａｚｏ）、メチレンジメチルヒドラゾ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉｍｅｔｈｙｌｈｙｄｒａｚｏ）、メチレンオキシメチルイミノ（ｍｅｔｈｙｌｅｎｅｏｘｙｍｅｔｈｙｌｉｍｉｎｏ）が挙げられ得る。

【0086】

核酸を模倣し得る足場もまた構築することができ、リン酸リンカー及びリボース糖はヌクレアーゼ耐性ヌクレオシドまたはヌクレオチドの代替物によって置き換えられる。そのような修飾は、骨格及び糖修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、核酸塩基は、代替骨格によって係留され得る。例には、限定されないが、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジン、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオシド代替物が挙げられ得る。

【0087】

修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオチドは、糖基に対する１つ以上の修飾、すなわち、糖修飾を含み得る。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、修飾されてもよく、例えば、多くの異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基によって置き換えることができる。いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基に対する修飾は、ヒドロキシルが２’－アルコキシドイオンを形成するようにさらに脱プロトン化されることがもはや起こり得ないため、核酸の安定性を増強し得る。

【0088】

２’ヒドロキシル基修飾の例には、アルコキシまたはアリールオキシ（ＯＲ、式中、「Ｒ」は、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖であり得る）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＣＨ_２ＣＨ_２ＯＲが挙げられ得、式中、Ｒは、例えば、Ｈまたは任意に置換されたアルキルであり得、ｎは、０～２０の整数であり得る（例えば、０～４、０～８、０～１０、０～１６、１～４、１～８、１～１０、１～１６、１～２０、２～４、２～８、２～１０、２～１６、２～２０、４～８、４～１０、４～１６、及び４～２０）。いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基修飾は、２’－Ｏ－Ｍｅであり得る。いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基修飾は、２’－ヒドロキシル基をフッ素で置き換える２’－フルオロ修飾であり得る。いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基修飾は、２’－ヒドロキシル基を水素で置き換える２’－Ｈであり得る。いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基修飾は、２’ヒドロキシルが、例えばＣ_１－６アルキレンまたはＣ_１－６ヘテロアルキレン架橋を介して同一のリボース糖の４’炭素へと接続し得る「ロックド」核酸（ＬＮＡ）を含んでもよく、例示的な架橋としては、メチレン、プロピレン、エーテル、またはアミノ架橋、Ｏ－アミノ（アミノは、例えば、ＮＨ_２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、もしくはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、もしくはポリアミノであり得る）、及びアミノアルコキシ、Ｏ（ＣＨ_２）_ｎ－アミノ（アミノは、例えば、ＮＨ_２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、もしくはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、もしくはポリアミノであり得る）を含み得る。いくつかの実施形態では、２’ヒドロキシル基修飾は、リボース環がＣ２’－Ｃ３’結合を欠失する「アンロックド（ｕｎｌｏｃｋｅｄ）」核酸（ＵＮＡ）を含み得る。いくつかの実施形態において、２’ヒドロキシル基修飾は、メトキシエチル基（ＭＯＥ）、（ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、例えば、ＰＥＧ誘導体）を含み得る。

【0089】

「デオキシ」２’修飾は、水素（すなわち、デオキシリボース糖、例えば、部分的なｄｓＲＮＡの突出部分）、ハロ（例えば、ブロモ、クロロ、フルオロ、またはヨード）、アミノ（アミノは、例えば、ＮＨ_２、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸であり得る）、ＮＨ（ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ）_ｎＣＨ２ＣＨ_２－アミノ（式中、アミノは、例えば、本明細書において記載されるようなものである）、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（Ｒは、例えば、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖であり得る）、シアノ、メルカプト、アルキル－チオ－アルキル、チオアルコキシ、ならびにアルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニル及びアルキニルを含み得、任意に、例えば、本明細書に記載されるようなアミノで置換されてもよい。

【0090】

糖修飾は、リボースにおける対応する炭素のものとは反対の立体化学配置を有する１つ以上の炭素を含む糖基を含み得る。したがって、修飾核酸は、糖として、例えば、アラビノースを含むヌクレオチドを含み得る。修飾核酸はまた、脱塩基糖をも含み得る。これらの脱塩基糖はまた、構成要素の糖原子の１つ以上においてさらに修飾され得る。修飾核酸はまた、Ｌ型である１つ以上の糖、例えば、Ｌ－ヌクレオシドを含み得る。

【0091】

修飾核酸に組み込むことができる本明細書に記載される修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオチドは、核酸塩基とも呼ばれる修飾塩基を含み得る。核酸塩基の例は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）を含むが、これらに限定されない。これらの核酸塩基は、修飾されて、または完全に置き換えられて、修飾核酸に組み込むことができる修飾残基をもたらすことができる。ヌクレオチドの核酸塩基は独立して、プリン、ピリミジン、プリンアナログ、またはピリミジンアナログから選択することができる。いくつかの実施形態では、核酸塩基は、例えば、天然に存在する塩基、及び塩基の合成誘導体を含み得る。

【0092】

デュアルガイドＲＮＡを用いる実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの各々は、修飾を含み得る。このような修飾は、ｃｒＲＮＡ及び／またはｔｒａｃｒＲＮＡＡの一方または両方の末端に存在してもよい。ｓｇＲＮＡを含む実施形態では、ｓｇＲＮＡの一方または両方の末端における１つ以上の残基は、化学修飾されてもよく、及び／または内部ヌクレオシドが修飾されてもよく、及び／またはｓｇＲＮＡ全体が化学修飾されてもよい。ある特定の実施形態は、５’末端修飾を含む。ある特定の実施形態は、３’末端修飾を含む。

【0093】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、２０１７年１２月８日に出願された「Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｇｕｉｄｅ ＲＮＡｓ」という発明の名称のＷＯ２０１８／１０７０２８Ａ１に開示された修飾パターンのうちの１つを含み、その内容は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、ＵＳ２０１７０１１４３３４に開示された構造／修飾パターンのうちの１つを含み、その内容は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡはＷＯ２０１７／１３６７９４に開示された構造／修飾パターンのうちの１つを含み、その内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0094】

いくつかの実施形態では、本開示のｓｇＲＮＡは、以下の表２に示される修飾パターンを含む。表２の「完全配列」は、表１に列挙されたガイドの各々のｓｇＲＮＡ配列を指す。「完全配列修飾」は、各ｓｇＲＮＡの修飾パターンを示す。
表２：ｓｇＲＮＡ及びヒトアルブミンガイド配列のｓｇＲＮＡへの修飾パターン

【0095】

いくつかの実施形態では、修飾ｓｇＲＮＡは、以下の配列：ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＧｍＡｍＡｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ（配列番号３５０）を含み、「Ｎ」は、任意の天然または非天然ヌクレオチドであってもよく、Ｎの全体は、表１に記載されるアルブミンイントロン１ガイド配列を含む。例えば、配列番号３５０が本明細書に包含され、Ｎは配列番号３５０から省略されるが、ｇＲＮＡの修飾保存部分を含む。

【0096】

以下に記載される修飾のうちのいずれも、本明細書に記載されるｇＲＮＡ及びｍＲＮＡ内に存在し得る。

【0097】

「ｍＡ」、「ｍＣ」、「ｍＵ」、または「ｍＧ」という用語は、２’－Ｏ－Ｍｅによって修飾されているヌクレオチドを表すために使用され得る。

【0098】

２’－Ｏ－メチルの修飾は、以下のように描写され得る。

【0099】

ヌクレオチド糖環に影響することが示されている別の化学修飾は、ハロゲン置換である。例えば、ヌクレオチド糖環上の２’－フルオロ（２’－Ｆ）置換は、オリゴヌクレオチド結合親和性及びヌクレアーゼ安定性を増加させることができる。

【0100】

本出願において、「ｆＡ」、「ｆＣ」、「ｆＵ」、または「ｆＧ」という用語は、２’－Ｆで置換されているヌクレオチドを表すために使用され得る。

【0101】

２’－Ｆの置換は、以下のように描写され得る。

【0102】

ホスホロチオエート（ＰＳ）連結または結合は、硫黄が、ホスホジエステル連結、例えば、ヌクレオチド塩基間の結合中の１つの非架橋リン酸酸素に置き換えられる結合を指す。ホスホロチオエートを使用してオリゴヌクレオチドを生成する場合、修飾オリゴヌクレオチドは、Ｓ－オリゴとも称され得る。

【0103】

ＰＳ修飾を示すために、「＊」が使用され得る。本出願では、Ａ＊、Ｃ＊、Ｕ＊、またはＧ＊という用語を使用して、ＰＳ結合で次の（例えば３’）ヌクレオチドに連結されるヌクレオチドを示すことができる。

【0104】

本出願では、用語「ｍＡ＊」、「ｍＣ＊」、「ｍＵ＊」、または「ｍＧ＊」を使用して、２’－Ｏ－Ｍｅで置換され、かつＰＳ結合で次の（例えば、３’）ヌクレオチドに連結されるヌクレオチドを示すことができる。

【0105】

以下の図は、非架橋リン酸酸素へのＳ－の置換を示し、ホスホジエステル結合の代わりにＰＳ結合を生じる。

【0106】

脱塩基ヌクレオチドは、窒素系塩基を欠くものを指す。以下の図は、塩基を欠く脱塩基（脱プリンとしても知られる）部位を有するオリゴヌクレオチドを描写する。

【0107】

反転した塩基は、通常の５’から３’への連結とは反転した連結を有するものを指す（すなわち、５’から５’への連結または３’から３’への連結のいずれか）。例えば、

【0108】

脱塩基ヌクレオチドは、反転した連結と接続することができる。例えば、脱塩基ヌクレオチドは、５’から５’への連結を介して末端部の５’ヌクレオチドに接続してもよく、または脱塩基ヌクレオチドは、３’から３’への連結を介して末端部の３’ヌクレオチドに接続してもよい。末端部の５’または３’ヌクレオチドのいずれかにおける反転した脱塩基ヌクレオチドはまた、反転した脱塩基末端キャップと称され得る。

【0109】

いくつかの実施形態では、５’末端部における最初の３、４、または５個のヌクレオチドのうちの１つ以上、及び３’末端部における最後の３、４、または５個のヌクレオチドのうちの１つ以上が修飾される。いくつかの実施形態では、修飾は、２’－Ｏ－Ｍｅ、２’－Ｆ、反転した脱塩基ヌクレオチド、ＰＳ結合、または安定性及び／または性能を増加させることが当該技術分野で既知の他のヌクレオチド修飾である。

【0110】

いくつかの実施形態では、５’末端部における最初の４個のヌクレオチド、及び３’末端部における最後の４個のヌクレオチドは、ホスホロチオエート（ＰＳ）結合を用いて連結される。

【0111】

いくつかの実施形態では、５’末端部における最初の３個のヌクレオチド、及び３’末端部における最後の３個のヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、５’末端部における最初の３個のヌクレオチド、及び３’末端部における最後の３個のヌクレオチドは、２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、５’末端部における最初の３個のヌクレオチド、及び３’末端部における最後の３個のヌクレオチドは、反転した脱塩基ヌクレオチドを含む。

【0112】

いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、修飾ｓｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、配列番号３５０に示される修飾パターンを含み、Ｎは、任意の天然または非天然ヌクレオチドであり、Ｎの全体は、ヒトアルブミンイントロン１内の標的配列に対してヌクレアーゼを指向させるガイド配列（例えば、表１に示されるような）を含む。

【0113】

いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号３４～９７または１２０～１６３のうちのいずれか１つに示されるｓｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号１９７～２２９のうちのいずれか１つに示されるｓｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２～３３または９８～１１９のガイド配列、及び配列番号３０１のヌクレオチドのうちのいずれ１つを含むｓｇＲＮＡを含み、配列番号３０１のヌクレオチドは、ガイド配列の３’末端にあり、ｓｇＲＮＡは、表２または配列番号３５０に示されるように修飾され得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２～３３または１９７～２２９のガイド配列のうちのいずれか１つと、配列番号３０１のヌクレオチドとを含むｓｇＲＮＡを含み、配列番号３０１のヌクレオチドは、ガイド配列の３’末端にあり、ｓｇＲＮＡは、例えば、表２または配列番号３５０に示されるように修飾され得る。

【0114】

上述のように、いくつかの実施形態では、本明細書に開示の組成物または製剤は、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えば、本明細書に記載のＣａｓヌクレアーゼをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えば、ＣａｓヌクレアーゼをコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡが提供されるか、使用されるか、または投与される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼをコードするＯＲＦは、「修飾ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤ＯＲＦ」または単に「修飾ＯＲＦ」であり、ＯＲＦが修飾されることを示すための略語として使用される。

【0115】

いくつかの実施形態では、修飾ＯＲＦは、少なくとも１つ、複数、または全てのウリジン位置に、修飾ウリジンを含み得る。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、例えば、ハロゲン、メチル、またはエチルで、５位で修飾されたウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、例えば、ハロゲン、メチル、またはエチルで、１位で修飾されたシュードウリジンである。修飾ウリジンは、例えば、シュードウリジン、Ｎ１－メチル－シュードウリジン、５－メトキシウリジン、５－ヨードウリジン、またはそれらの組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、５－メトキシウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、５－ヨードウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、シュードウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、Ｎ１－メチル－シュードウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、シュードウリジン及びＮ１－メチル－シュードウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、シュードウリジン及び５－メトキシウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、Ｎ１－メチルシュードウリジン及び５－メトキシウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、５－ヨードウリジン及びＮ１－メチル－シュードウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、シュードウリジン及び５－ヨードウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、５－ヨードウリジン及び５－メトキシウリジンの組み合わせである。

【0116】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｍＲＮＡは、５’キャップ、例えば、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、またはＣａｐ２を含む。５’キャップは、一般に、ｍＲＮＡの５’－３’鎖の第１のヌクレオチド（すなわち、第１のキャップ近位のヌクレオチド）の５’位に対して５’－トリホスフェートを介して連結した７－メチルグアニンリボヌクレオチド（例えば、ＡＲＣＡに関して、以下で考察されるようにさらに修飾されてもよい）である。Ｃａｐ０において、ｍＲＮＡの第１及び第２のキャップ近位のヌクレオチドのリボースは、両方とも、２’－ヒドロキシルを含む。Ｃａｐ１において、ｍＲＮＡの第１及び第２の転写ヌクレオチドのリボースは、それぞれ、２’－メトキシ及び２’－ヒドロキシルを含む。Ｃａｐ２において、ｍＲＮＡの第１及び第２のキャップ近位のヌクレオチドのリボースは、両方とも、２’－メトキシを含む。例えば、Ｋａｔｉｂａｈ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１１（３３）：１２０２５－３０、Ａｂｂａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１４（１１）：Ｅ２１０６－Ｅ２１１５を参照されたい。ヒトｍＲＮＡなどの哺乳動物ｍＲＮＡを含む、ほとんどの内因性の高級真核生物ｍＲＮＡは、Ｃａｐ１またはＣａｐ２を含む。Ｃａｐ０ならびにＣａｐ１及びＣａｐ２とは異なる他のキャップ構造は、ＩＦＩＴ－１及びＩＦＩＴ－５などの自然免疫系の構成要素によって「非自己」として認識されるため、ヒトなどの哺乳動物において免疫原性である場合があり、Ｉ型インターフェロンを含むサイトカインレベルの上昇を引き起こし得る。ＩＦＩＴ－１及びＩＦＩＴ－５などの自然免疫系の構成要素はまた、Ｃａｐ１またはＣａｐ２以外のキャップとのｍＲＮＡの結合についてｅＩＦ４Ｅと競合する場合があり、ｍＲＮＡの翻訳を潜在的に阻害する。

【0117】

キャップは、共転写的に含めることができる。例えば、ＡＲＣＡ（抗逆キャップアナログ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号ＡＭ８０４５）は、グアニンリボヌクレオチドの５’位に連結する７－メチルグアニン３’－メトキシ－５’－トリホスフェートを含むキャップアナログであり、開始時にインビトロで転写物に組み込むことができる。ＡＲＣＡは、第１のキャップ近位のヌクレオチドの２’位がヒドロキシルであるＣａｐ０キャップをもたらす。例えば、Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，（２００１）“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｍＲＮＡｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ ’ａｎｔｉ－ｒｅｖｅｒｓｅ’ ｃａｐ ａｎａｌｏｇｓ ７－ｍｅｔｈｙｌ（３’－Ｏ－ｍｅｔｈｙｌ）ＧｐｐｐＧ ａｎｄ ７－ｍｅｔｈｙｌ（３’ｄｅｏｘｙ）ＧｐｐｐＧ，”ＲＮＡ ７：１４８６－１４９５を参照されたい。ＡＲＣＡの構造を以下に示す。

【0118】

ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧ（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧ、ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号Ｎ－７１１３）またはＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＧＧ（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＧ）ｐＧ、ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号Ｎ－７１３３）を使用して、Ｃａｐ１構造を共転写的に提供することができる。ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧ及びＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＧＧの３’－Ｏ－メチル化態様も、それぞれ、カタログ番号Ｎ－７４１３及びＮ－７４３３としてＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから利用可能である。ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧの構造を以下に示す。

【0119】

あるいは、転写後に、キャップをＲＮＡに付加することができる。例えば、Ｖａｃｃｉｎｉａキャッピング酵素は市販されており（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログ番号Ｍ２０８０Ｓ）、そのＤ１サブユニットによって提供されるＲＮＡトリホスファターゼ及びグアニリルトランスフェラーゼ活性と、そのＤ１２サブユニットによって提供されるグアニンメチルトランスフェラーゼとを有する。したがって、Ｓ－アデノシルメチオニン及びＧＴＰの存在下で、Ｃａｐ０を与えるように、７－メチルグアニンをＲＮＡに付加することができる。例えば、Ｇｕｏ，Ｐ．ａｎｄ Ｍｏｓｓ，Ｂ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，４０２３－４０２７、Ｍａｏ，Ｘ．ａｎｄ Ｓｈｕｍａｎ，Ｓ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２４４７２－２４４７９を参照されたい。

【0120】

いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ポリアデニル化（ポリ－Ａ）テールをさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリ－Ａテールは、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００個のアデニンを含み、任意に、３００個までのアデニンを含む。いくつかの実施形態では、ポリ－Ａテールは、９５、９６、９７、９８、９９、または１００個のアデニンヌクレオチドを含む。

【0121】

Ｃ．ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤
本明細書に記載されるように、本開示のガイドＲＮＡは、宿主細胞の、セーフハーバー部位などのゲノム遺伝子座内に異種（外因性）遺伝子を挿入及び発現するためのＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤と組み合わせて使用される。ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、タンパク質、またはｍＲＮＡなどのタンパク質をコードする核酸であり得る。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、表１からのガイド配列と、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）などのヌクレアーゼとを含むガイドＲＮＡを含み、リボ核タンパク質複合体を形成する組成物の使用を含む。

【0122】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼなどのＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、クリベース活性を有し、これは二本鎖エンドヌクレアーゼ活性とも称され得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼなどのＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、ニッカーゼ活性を有し、これは一本鎖エンドヌクレアーゼ活性とも称され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓヌクレアーゼを含む。Ｃａｓヌクレアーゼの例としては、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、及び他の原核生物のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のもの（例えば、次の段落のリストを参照されたい）、ならびにそれらのバリアントまたは変異体（例えば、操作型、非天然型、天然型、または他のバリアント）のバージョンが挙げられる。例えば、ＵＳ２０１６／０３１２１９８Ａ１、ＵＳ２０１６／０３１２１９９Ａ１を参照されたい。

【0123】

Ｃａｓヌクレアーゼの由来となり得る非限定的な例示的な種としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ、Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ細菌、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ細菌ＮＤ２００６、及びＡｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａが挙げられる。

【0124】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ細菌ＮＤ２００６由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。さらなる実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ細菌、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ細菌、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ細菌、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ、またはＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅ由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。ある特定の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓまたはＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。

【0125】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤と合わせたｇＲＮＡは、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）と呼ばれる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼと合わせたｇＲＮＡは、Ｃａｓ ＲＮＰと呼ばれる。いくつかの実施形態では、ＲＮＰは、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型の構成要素を含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来のＣａｓ９タンパク質である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９と合わせたｇＲＮＡは、Ｃａｓ９ ＲＮＰと呼ばれる。

【0126】

野生型Ｃａｓ９は、２つのヌクレアーゼドメイン：ＲｕｖＣ及びＨＮＨを有する。ＲｕｖＣドメインは、非標的ＤＮＡ鎖を切断し、ＨＮＨドメインはＤＮＡの標的鎖を切断する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、１つを超えるＲｕｖＣドメイン及び／または１つを超えるＨＮＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、野生型Ｃａｓ９である。組成物、使用、及び方法の実施形態の各々では、Ｃａｓは、標的ＤＮＡにおける二本鎖切断を誘導する。

【0127】

いくつかの実施形態では、キメラＣａｓヌクレアーゼが使用され、タンパク質の１つのドメインまたは領域が、異なるタンパク質の一部分によって置き換えられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼドメインは、Ｆｏｋ１等の異なるヌクレアーゼ由来のドメインで置き換えられてもよい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、修飾ヌクレアーゼであってもよい。

【0128】

他の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来であり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のカスケード複合体の構成要素であり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ３タンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来であり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＲＮＡ切断活性を有し得る。

【0129】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、一本鎖ニッカーゼ活性を有し、すなわち、１つのＤＮＡ鎖を切断して一本鎖切断（「ニック」としても知られる）を生成することができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓニッカーゼを含む。ニッカーゼは、ｄｓＤＮＡ内でニックを作成する酵素であり、すなわち、ＤＮＡ二重らせんの一方の鎖を切断するが、他方の鎖を切断しない。いくつかの実施形態では、Ｃａｓニッカーゼは、例えば、触媒ドメイン内の１つ以上の改変（例えば、点変異）によって、エンドヌクレオチド分解活性部位が不活性化されたＣａｓヌクレアーゼ（例えば、上で考察されたＣａｓヌクレアーゼ）の一態様である。例えば、Ｃａｓニッカーゼ及び例示的な触媒ドメイン改変の考察については、米国特許第８，８８９，３５６号を参照されたい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼなどのＣａｓニッカーゼは、不活性化されたＲｕｖＣまたはＨＮＨドメインを有する。

【0130】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、１つの機能的ヌクレアーゼドメインのみを含むように修飾される。例えば、薬剤タンパク質は、核酸切断活性を低下させるために、ヌクレアーゼドメインの１つが突然変異されるか、または完全もしくは部分的に欠失するように修飾されてもよい。いくつかの実施形態では、活性が低下したＲｕｖＣドメインを有するニッカーゼが使用される。いくつかの実施形態では、不活性なＲｕｖＣドメインを有するニッカーゼが使用される。いくつかの実施形態では、活性が低下したＨＮＨドメインを有するニッカーゼが使用される。いくつかの実施形態では、不活性なＨＮＨドメインを有するニッカーゼが使用される。

【0131】

いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質ヌクレアーゼドメイン内の保存アミノ酸は、ヌクレアーゼ活性を低下させるか、または変化させるように置換される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン内にアミノ酸置換を含み得る。ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインにおける例示的なアミノ酸置換としては、Ｄ１０Ａ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質に基づく）が挙げられる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ Ｏｃｔ ２２：１６３（３）：７５９－７７１を参照されたい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＨＮＨまたはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメイン内にアミノ酸置換を含み得る。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインにおける例示的なアミノ酸置換としては、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８３Ａ、及びＤ９８６Ａ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９タンパク質に基づく）が挙げられる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）を参照されたい。さらなる例示的なアミノ酸置換としては、Ｄ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、及びＤ１２５５Ａ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２ Ｃｐｆ１（ＦｎＣｐＨ）配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ａ０Ｑ７Ｑ２（ＣＰＦ１＿ＦＲＡＴＮ）に基づく）が挙げられる。

【0132】

いくつかの実施形態では、ニッカーゼは、それぞれ、標的配列のセンス鎖及びアンチセンス鎖に対して相補的な一対のガイドＲＮＡと組み合わせて提供される。この実施形態では、ガイドＲＮＡは、標的配列の反対側の鎖にニックを生成することによって（すなわち、二重ニッキング）、ニッカーゼを標的配列に指向させ、ＤＳＢを導入する。いくつかの実施形態では、ニッカーゼは、ＤＮＡの反対側の鎖を標的とする２つの別個のガイドＲＮＡと共に使用され、標的ＤＮＡ内に二重ニックを生成する。いくつかの実施形態では、ニッカーゼは、ごく接近した位置にあるように選択された２つの別個のガイドＲＮＡと共に使用され、標的ＤＮＡ内に二重ニックを生成する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、１つ以上の異種機能ドメインを含む（例えば、融合ポリペプチドであるか、または融合ポリペプチドを含む）。

【0133】

いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の細胞核への輸送を促進し得る。例えば、異種機能ドメインは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）であり得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、１～１０個のＮＬＳ（複数可）と融合され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、１～５個のＮＬＳ（複数可）と融合され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、１個のＮＬＳと融合され得る。１個のＮＬＳが使用される場合、ＮＬＳは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の配列のＮ末端部またはＣ末端部で連結され得る。これをＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の配列内に挿入することもできる。他の実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、１個より多いＮＬＳと融合され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、２、３、４、または５個のＮＬＳと融合され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、２個のＮＬＳと融合され得る。特定の状況では、２個のＮＬＳは、同じ（例えば、２個のＳＶ４０ ＮＬＳ）であってもよく、または異なってもよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、カルボキシ末端部で連結された２個のＳＶ４０ ＮＬＳの配列に融合される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、２個のＮＬＳと融合してもよく、１つはＮ末端部に連結しており、１つはＣ末端部に連結している。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、３個のＮＬＳと融合され得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、ＮＬＳなしで融合され得る。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、単節型配列、例えば、ＳＶ４０ ＮＬＳ、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号６００）またはＰＫＫＫＲＲＶ（配列番号６０１）であってもよい。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、双節型配列、例えば、ヌクレオプラスミンのＮＬＳであるＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号６０２）であってもよい。特定の実施形態では、単一のＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号６００）ＮＬＳは、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤のＣ末端部で連結され得る。１つ以上のリンカーは、任意に、融合部位に含まれる。

【0134】

Ｄ．ドナー構築物／配列
本明細書に記載の組成物及び方法は、本開示のガイドＲＮＡ及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤によって作成される切断部位に挿入される異種遺伝子をコードする配列を含む核酸構築物の使用を含む。本明細書で使用される場合、そのような構築物は、時に、「ドナー構築物／テンプレート」と称される。構築物は、任意の発現される核酸（すなわち、発現され得る核酸）、例えば、ＤＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、機能性ＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、長鎖非コードＲＮＡ、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドをコードし得る。

【0135】

本明細書に記載される組成物及び方法は、例えば、単一導入遺伝子をコードする、ｃｉｓで２つの導入遺伝子をコードするなど、非双方向性または単一方向性構築物の使用を含む。単一方向性構築物は、スプライスアクセプターに連結したコード配列を含み得る。

【0136】

本明細書に記載される組成物及び方法は、少なくとも２つの核酸セグメントをｃｉｓで含む本明細書に記載される双方向性構築物の使用を含み、一方のセグメント（第１のセグメント）は、コード配列または導入遺伝子を含み、他方のセグメント（第２のセグメント）は、配列の相補体が導入遺伝子をコードする配列を含む。双方向性構築物は、スプライスアクセプターに連結した異種遺伝子をコードする第１のコード配列と、相補体が他方の配向で異種遺伝子をコードし、スプライスアクセプターにも連結した２のコード配列とを含み得る。

【0137】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される構築物は、構築物のいずれかまたは両方の末端、例えば、第１及び／または第２のセグメントにおけるオープンリーディングフレームの５’、または一方もしくは両方の導入遺伝子配列の５’上にスプライスアクセプター部位を含む。いくつかの実施形態では、スプライスアクセプター部位は、ＮＡＧを含む。さらなる実施形態では、スプライスアクセプター部位は、ＮＡＧからなる。いくつかの実施形態では、スプライスアクセプターは、アルブミンスプライスアクセプター、例えば、アルブミンのエクソン１及び２の一緒のスプライシングで使用されるアルブミンスプライスアクセプターである。いくつかの実施形態では、スプライスアクセプターは、ヒトアルブミン遺伝子由来である。いくつかの実施形態では、スプライスアクセプターは、マウスアルブミン遺伝子由来である。いくつかの実施形態では、スプライスアクセプターは、Ｆ９（または「ＦＩＸ」）スプライスアクセプターであり、例えば、Ｆ９のエクソン１及び２の一緒のスプライシングで使用されるＦ９スプライスアクセプターである。いくつかの実施形態では、スプライスアクセプターは、ヒトＦ９遺伝子由来である。いくつかの実施形態では、スプライスアクセプターは、マウスＦ９遺伝子由来である。人工スプライスアクセプターを含む、真核生物において有用な追加の好適なスプライスアクセプター部位が既知であり、当該技術分野に由来し得る。例えば、Ｓｈａｐｉｒｏ，ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１５，７１５５－７１７４、Ｂｕｒｓｅｔ，ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２９，２５５－２５９を参照されたい。

【0138】

いくつかの実施形態では、ポリアデニル化テール配列は、第１及び／または第２のセグメントの３’末端で、例えば、「ポリ－Ａ」ストレッチとしてコードされる。いくつかの実施形態では、ポリアデニル化テール配列は、第１及び／または第２のセグメントの３’末端で、またはその近傍においてコードされるポリアデニル化シグナル配列の結果として共転写的に提供される。好適なポリアデニル化テール配列及び／またはポリアデニル化シグナル配列を設計する方法は、当該技術分野で周知である。マウスアルブミン及びヒトＦＩＸスプライスアクセプター部位を含む、好適なスプライスアクセプター配列が本明細書に開示され、例示される。いくつかの実施形態では、ＵＡＵＡＡＡ（配列番号８０１）またはＡＵ／ＧＵＡＡＡ（配列番号８０２）などのバリアントが同定されているが、ポリアデニル化シグナル配列ＡＡＵＡＡＡ（配列番号８００）は、哺乳動物系で一般的に使用される。例えば、ＮＪ Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｇｅｎｅｓ＆Ｄｅｖ．２５（１７）：１７７０－８２，２０１１を参照されたい。いくつかの実施形態では、ポリＡテール配列が含まれる。構築物の長さは、挿入される遺伝子のサイズに応じて変化することができ、例えば、２００塩基対（ｂｐ）～約５０００ｂｐ、例えば、約２００ｂｐ～約２０００ｂｐなど、約５００ｂｐ～約１５００ｂｐなどであり得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡドナーテンプレートの長さは、約２００ｂｐであるか、または約５００ｂｐであるか、または約８００ｂｐであるか、または約１０００塩基対であるか、または約１５００塩基対である。他の実施形態では、ドナーテンプレートの長さは、少なくとも２００ｂｐであるか、または少なくとも５００ｂｐであるか、または少なくとも８００ｂｐであるか、または少なくとも１０００ｂｐであるか、または少なくとも１５００ｂｐである。

【0139】

構築物は、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、一本鎖、二本鎖、または部分的に一本鎖及び部分的に二本鎖であり得、直鎖または環状（例えば、ミニサークル）形態で宿主細胞に導入され得る。例えば、米国特許公開第２０１０／００４７８０５号、第２０１１／０２８１３６１号、第２０１１／０２０７２２１号を参照されたい。直鎖形態で導入される場合、ドナー配列の末端は、当業者に既知の方法によって（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）保護され得る。例えば、１つ以上のジデオキシヌクレオチド残基は、直鎖分子の３’末端に添加され、及び／または自己相補性オリゴヌクレオチドは、一方または両方の末端にライゲーションされる。例えば、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：４９５９－４９６３、Ｎｅｈｌｓ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７２：８８６－８８９を参照されたい。外因性ポリヌクレオチドを分解から保護するための追加の方法は、限定されないが、末端アミノ基（複数可）の添加、ならびに例えば、ホスホロチオエート、ホスホラミデート、及びＯ－メチルリボースまたはデオキシリボース残基などの修飾ヌクレオチド間連結の使用を含む。構築物は、例えば、複製起源、プロモーター、及び抗生物質耐性をコードする遺伝子などの追加の配列を有するベクター分子の一部として細胞内に導入され得る。構築物は、ウイルス要素を取り除き得る。さらに、ドナー構築物は、裸の核酸として、リポソームもしくはポロキサマーなどの薬剤と複合体化した核酸として導入され得るか、またはウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス）によって送達され得る。

【0140】

いくつかの実施形態では、発現には必要ではないが、本明細書に開示される構築物はまた、転写または翻訳制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インシュレーター、内部リボソーム侵入部位、ペプチドをコードする配列、及び／またはポリアデニル化シグナルを含み得る。

【0141】

いくつかの実施形態では、目的のポリペプチドのコード配列を含む構築物は、以下の修飾：コドン最適化（例えば、ヒトコドンへ）及び／または１つ以上のグリコシル化部位の追加のうちの１つ以上を含み得る。例えば、ＭｃＩｎｔｏｓｈ ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｂｌｏｏｄ（１７）：３３３５－４４を参照されたい。

【0142】

いくつかの実施形態では、構築物は、その発現が挿入部位における内因性プロモーター（例えば、ドナーが宿主細胞のアルブミン遺伝子座に組み込まれるときの内因性アルブミンプロモーター）によって駆動されるように挿入され得る。そのような場合、導入遺伝子は、その発現を駆動する制御エレメント（例えば、プロモーター及び／またはエンハンサー）を欠いていてもよい（例えば、プロモーターレス構築物）。それにもかかわらず、他の場合において、構築物は、プロモーター及び／またはエンハンサー、例えば、組み込み時に機能性タンパク質の発現を駆動する構成的プロモーター、または誘導性もしくは組織特異的（例えば、肝臓または血小板特異的）プロモーターを含み得ることが明らかであろう。構築物は、シグナルペプチド、例えば、アルブミンシグナルペプチド、肝細胞分泌タンパク質からのシグナルペプチドをコードするシグナル配列の下流にある異種タンパク質をコードする配列を含み得、シグナルペプチド、例えば、アルブミンシグナルペプチド、肝細胞分泌タンパク質からのシグナルペプチドをコードするシグナル配列に作動可能に連結され得る。構築物は、異種タンパク質からのシグナルペプチドをコードするシグナル配列の下流にある異種タンパク質をコードする配列を含み得、異種タンパク質からのシグナルペプチドをコードするシグナル配列に作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、核酸構築物は、導入遺伝子タンパク質をコードする核酸の相同性非依存挿入において作用する。いくつかの実施形態では、核酸構築物は、非分裂細胞、例えば、ＨＲではなくＮＨＥＪが、二本鎖ＤＮＡ切断が修復される一次機序である細胞において作用する。核酸は、相同性非依存性ドナー構築物であり得る。

【0143】

構築物は、少なくとも２つの核酸セグメントを含む双方向性核酸構築物であり得、一方のセグメント（第１のセグメント）は、目的の薬剤をコードするコード配列（コード配列は、本明細書では「導入遺伝子」または第１の導入遺伝子と称され得る）を含み、他方のセグメント（第２のセグメント）は、配列の相補体が目的の薬剤をコードする配列、または第２の導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、コード配列は、ポリペプチド、機能性ＲＮＡ、またはエンハンサーなどの治療用薬剤をコードする。少なくとも２つのセグメントは、同一もしくは異なるポリペプチドまたは同一もしくは異なる薬剤をコードすることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される双方向性構築物は、少なくとも２つの核酸セグメントを含み、一方のセグメント（第１のセグメント）は、目的のポリペプチドをコードするコード配列を含み、他方のセグメント（第２のセグメント）は、配列の相補体が目的のポリペプチドをコードする配列を含む。本明細書に記載の遺伝子編集系と組み合わせて使用した場合、核酸構築物の双方向性は、構築物を標的挿入部位内のいずれの方向でも（１つの方向への挿入に限定されずに）挿入することを可能にし、本明細書に例示されるように、ａ）１つのセグメントのコード配列（例えば、図１の左上のｓｓＡＡＶ構築物の「ヒトＦ９」をコードする左側セグメント）、または２）他のセグメントの相補体（例えば、図１の左上のｓｓＡＡＶ構築物において逆さまに示される「ヒトＦ９」をコードする右側セグメントの相補体）のいずれかからでも目的のポリペプチドの発現を可能にし、それによって、挿入及び発現効率を向上させる。遺伝子編集系による標的切断は、構築物組み込み及び／または導入遺伝子発現を促進し得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）系、または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）系を含む部位特異的ＤＮＡ切断系を含む、様々な既知の遺伝子編集系が本開示の実施において使用され得る。

【0144】

いくつかの実施形態では、双方向性核酸構築物は、薬剤またはポリペプチドの発現を駆動するプロモーターを含まない。例えば、ポリペプチドの発現は、宿主細胞のプロモーター（例えば、導入遺伝子が宿主細胞のアルブミン遺伝子座に組み込まれるときの内因性アルブミンプロモーター）によって駆動される。いくつかの実施形態では、双方向性核酸構築物は、各々が導入遺伝子の上流にスプライスアクセプターを有する第１のセグメント及び第２のセグメントを含む。ある特定の実施形態では、スプライスアクセプターは、宿主細胞のセーフハーバー部位のスプライスドナー配列、例えば、ヒトアルブミン遺伝子のイントロン１のスプライスドナーと適合性である。

【0145】

いくつかの実施形態では、双方向性核酸構築物は、ポリペプチドのコード配列を含む第１のセグメント、及びポリペプチドのコード配列の逆相補体を含む第２のセグメントを含む。非ポリペプチド薬剤についても同様である。したがって、第１のセグメントにおけるコード配列は、ポリペプチドを発現することがき、第２のセグメントにおける逆相補体の相補体もまたポリペプチドを発現することができる。本明細書で使用される場合、逆相補配列を含む第２のセグメントを指す場合、「コード配列」は、第２のセグメントの相補的（コード）鎖（すなわち、第２のセグメントにおける逆相補配列の相補的コード配列）を指す。

【0146】

いくつかの実施形態では、第１のセグメントにおけるポリペプチドＡをコードするコード配列は、同じくポリペプチドＡをコードするコード配列の逆相補体に対して１００％未満相補的である。すなわち、いくつかの実施形態では、第１のセグメントは、ポリペプチドＡのコード配列（１）を含み、第２のセグメントは、ポリペプチドＡのコード配列（２）の逆相補体であり、コード配列（１）は、コード配列（２）と同一ではない。例えば、ポリペプチドＡをコードするコード配列（１）及び／またはコード配列（２）は、異なるコドンを利用し得る。いくつかの実施形態では、コード配列（１）とコード配列（２）の逆相補体が１００％または１００％未満の相補性を有するように、コドン最適化され得る。いくつかの実施形態では、第２のセグメントのコード配列は、第１のセグメントにおけるコード配列によってコードされる同じポリペプチドの１つ以上のアミノ酸のための１つ以上の代替コドンを使用して、ポリペプチドをコードする。本明細書で使用される「代替コドン」は、所与のアミノ酸についてのコドン使用頻度の変形を指し、所与の発現系に好ましいまたは最適化されたコドン（コドン最適化）であってもなくてもよい。好ましいコドン使用頻度、または所与の発現系において良好に耐容されるコドンは、当該技術分野で既知である。

【0147】

いくつかの実施形態では、第２のセグメントは、ヘアピン形成を低減するために、第１のセグメントのコード配列とは異なるコドン使用頻度を採用する逆相補配列を含む。そのような逆相補体は、第１のセグメントにおけるコード配列の全てのヌクレオチドよりも少ない塩基対を形成するが、依然として、任意に同じポリペプチドをコードする。そのような場合では、例えば、ポリペプチドＡの、第１のセグメントのコード配列は、例えば、ポリペプチドＡの、双方向性構築物の後半のコード配列と相同であり得るが、同一ではない。いくつかの実施形態では、第２のセグメントは、第１のセグメントにおけるコード配列に対して実質的に相補的ではない（例えば、７０％以下相補的である）逆相補配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のセグメントは、第１のセグメントにおけるコード配列に対して高度に相補的（例えば、少なくとも９０％相補的）である逆相補配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のセグメントは、第１のセグメントにおけるコード配列に対して少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、または約９９％相補性を有する逆相補配列を含む。

【0148】

いくつかの実施形態では、第２のセグメントは、第１のセグメントにおけるコード配列に対して１００％相補性を有する逆相補配列を含む。すなわち、第２のセグメント内の配列は、第１のセグメントにおけるコード配列の完全な逆相補体である。例として、第１のセグメントは、仮定配列５’ＣＴＧＧＡＣＣＧＡ３’（配列番号５００）を含み、第２のセグメントは、配列番号１の逆相補体、すなわち、５’ＴＣＧＧＴＣＣＡＧ３’（配列番号５０２）を含む。

【0149】

いくつかの実施形態では、双方向性核酸構築物は、ポリペプチドまたは薬剤（例えば、第１のポリペプチド）のコード配列を含む第１のセグメント、及びポリペプチドまたは薬剤（例えば、第２のポリペプチド）のコード配列の逆相補体を含む第２のセグメントを含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは、上に記載されるように、同じである。いくつかの実施形態では、第１の治療用薬剤及び第２の治療用薬剤は、上に記載されるように、同じである。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドは、異なる。いくつかの実施形態では、第１の治療用薬剤及び第２の治療用薬剤は、異なる。例えば、第１のポリペプチドは、ポリペプチドＡであり、第２のポリペプチドは、ポリペプチドＢである。さらなる例として、第１のポリペプチドは、ポリペプチドＡであり、第２のポリペプチドは、ポリペプチドＡのバリアント（例えば、断片（機能性断片など）、変異体、融合体（ポリペプチド末端でわずか１つのアミノ酸の付加を含む）、またはそれらの組み合わせ）である。ポリペプチドをコードするコード配列は、任意に、ポリペプチドに連結されたシグナル配列、標識配列（例えば、ＨｉＢｉｔ）、または異種機能配列（例えば、核局在化配列（ＮＬＳ）または自己切断ペプチド）などのアミノ末端またはカルボキシ末端アミノ酸配列をコードする配列など１つ以上の追加の配列を含み得る。ポリペプチドをコードするコード配列は、任意に、１つ以上のアミノ末端シグナルペプチド配列をコードする配列を含み得る。これらの追加の配列の各々は、構築物の第１のセグメント及び第２のセグメントにおいて同じまたは異なってもよい。

【0150】

本明細書に記載される双方向性構築物を使用して、本明細書に開示される方法に従って任意のポリペプチドを発現することができる。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、分泌ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、その機能が分泌ポリペプチドとして通常作用する（例えば、機能的に活性である）ものである。本明細書で使用される「分泌ポリペプチド」は、細胞によって分泌され、及び／または可溶性細胞外タンパク質として機能的に活性であるタンパク質を指す。

【0151】

いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、細胞内ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、その機能が細胞内で通常作用する（例えば、機能的に活性である）ものである。本明細書で使用される「細胞内ポリペプチド」は、可溶性細胞溶質ポリペプチドを含む、細胞によって分泌されないタンパク質を指す。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、野生型ポリペプチドである。

【0152】

いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、肝臓タンパク質またはそのバリアントである。本明細書で使用される場合、「肝臓タンパク質」は、例えば、肝臓において内因性で生成され、及び／または肝臓において機能的に活性であるタンパク質である。いくつかの実施形態では、肝臓タンパク質は、肝臓またはそのバリアントによって生成される循環タンパク質である。いくつかの実施形態では、肝臓タンパク質は、肝臓において機能的に活性であるタンパク質またはそのバリアントである。いくつかの実施形態では、肝臓タンパク質は、１つ以上の他の組織型と比較して、肝臓において上昇した発現を呈する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、非肝臓タンパク質である。

【0153】

いくつかの実施形態では、双方向性核酸構築物は、直鎖状である。例えば、第１及び第２のセグメントは、リンカー配列を通して直鎖様式で結合される。いくつかの実施形態では、逆相補配列を含む第２のセグメントの５’末端は、第１のセグメントの３’末端に連結される。いくつかの実施形態では、第１のセグメントの５’末端は、逆相補配列を含む第２のセグメントの３’末端に連結される。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、５００、１０００、１５００、２０００以上のヌクレオチド長である。当業者によって理解されるように、リンカー配列に加えて、またはリンカー配列の代わりに他の構造要素が、第１のセグメントと第２のセグメントとの間に挿入され得る。

【0154】

本明細書に開示される構築物は、任意の特定の使用に必要な、及び／または１つ以上の所望の機能を付与する任意の好適な構造特徴を含むように修飾され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される双方向性核酸構築物は、相同性アームを含まない。いくつかの実施形態では、構築物、例えば、双方向性核酸構築物は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によってゲノム遺伝子座に挿入することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される構築物は、相同性非依存性ドナー構築物である。いくつかの実施形態では、核酸構築物の双方向性機能に部分的に起因して、双方向性構築物は、目的のポリペプチドの効率的な挿入及び／または発現を可能にするために、本明細書に記載のいずれの方向（配向）でもゲノム遺伝子座に挿入され得る。

【0155】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物は、１つ以上の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含む。ピコルナウイルスＲＮＡの特徴として最初に特定されたＩＲＥＳは、５’キャップ構造の不在下でタンパク質合成を開始する上で重要な役割を果たす。ＩＲＥＳは、唯一のリボソーム結合部位として作用し得るか、またはポリヌクレオチドの複数のリボソーム結合部位の１つとして作用し得る。１つを超える機能性リボソーム結合部位を含む構築物は、リボソームによって独立して翻訳されるいくつかのペプチドまたはポリペプチド（「マルチシストロン核酸分子」）をコードし得る。あるいは、構築物は、内因性ポリペプチド（すなわち、アルブミンシグナルペプチド）に融合されていない異種タンパク質を発現するためにＩＲＥＳを含み得る。利用され得るＩＲＥＳ配列の例には、限定されないが、ピコルナウイルス（例えば、ＦＭＤＶ）、害虫ウイルス（ＣＦＦＶ）、ポリオウイルス（ＰＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、古典的なブタ熱ウイルス（ＣＳＦＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、またはクリケット麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）由来のものが挙げられる。

【0156】

いくつかの実施形態では、核酸構築物は、２Ａ配列または２Ａ様配列などの自己切断ペプチドをコードする配列を含む。自己切断ペプチドは、Ｐ２Ａペプチド、Ｔ２Ａペプチドなどであり得る。いくつかの実施形態では、自己切断ペプチドは、目的のポリペプチドの上流に位置する。一実施形態では、２Ａペプチドをコードする配列を使用して、目的の２つ以上のポリペプチドのコード領域を分離することができる。別の実施形態では、この配列を使用して、コード配列を構築物から分離し、コード配列を内因性遺伝子座（すなわち、内因性アルブミンシグナル配列）から分離することができる。非限定的な例として、２Ａペプチドをコードする配列は、領域Ａと領域Ｂとの間（Ａ－２Ａ－Ｂ）にあり得る。２Ａペプチドの存在は、１つの長いタンパク質のプロテインＡ、プロテインＢ、及び２Ａペプチドへの切断をもたらす。プロテインＡ及びプロテインＢは、目的の同一または異なるポリペプチドであり得る。

【0157】

いくつかの実施形態では、第１及び第２のセグメントの一方または両方は、オープンリーディングフレームの下流にポリアデニル化テール配列及び／またはポリアデニル化シグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリアデニル化テール配列は、第１及び／または第２のセグメントの３’末端で、例えば、「ポリ－Ａ」ストレッチとしてコードされる。

【0158】

ＩＩＩ．送達方法
本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、当該技術分野で利用可能な様々な既知の好適な方法を使用して、宿主細胞または対象に、インビボまたはエクスビボで送達され得る。ガイドＲＮＡは、本明細書に記載されるように、ＣａｓまたはＣａｓ９をコードする核酸（例えば、Ｃａｓ９またはＣａｓ９をコードする核酸）などのＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、ならびに本開示のガイドＲＮＡによって作成される切断部位に挿入される異種遺伝子をコードする配列を含む構築物と一緒に（個々にまたは組み合わせて）送達され得る。

【0159】

従来のウイルス及び非ウイルスベースの遺伝子送達方法を使用して、本明細書に開示されるガイドＲＮＡ、ならびに細胞（例えば、哺乳動物細胞）及び標的組織内にＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤及びドナー構築物を導入することができる。本明細書でさらに提供されるように、非ウイルスベクター、プラスミドベクターなどの非ウイルスベクター送達系核酸、ならびに例えば、裸の核酸、及びリポソーム、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、またはポロキサマーなどの送達ビヒクルと複合体化した核酸。ウイルスベクター送達系には、ＤＮＡ及びＲＮＡウイルスが含まれる。

【0160】

核酸の非ウイルス送達のための方法及び組成物には、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、ウイルソソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ＬＮＰ、ポリカチオンまたは脂質：核酸複合体、裸の核酸（例えば、裸のＤＮＡ／ＲＮＡ）、人工ビリオン、及びＤＮＡの薬剤強化取り込みが含まれる。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ ２０００系（Ｒｉｃｈ－Ｍａｒ）を使用するソノポレーションもまた、核酸の送達に使用され得る。

【0161】

さらなる例示的な核酸送達系としては、ＡｍａｘａＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）、ＢＴＸ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，Ｍａ．）、及びＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．（例えば、米国特許第６，００８，３３６号を参照されたい）により提供されるものが挙げられる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、第４，９４６，７８７号、及び第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。免疫脂質複合体などの標的リポソームを含む、脂質：核酸複合体の調製は、当該技術分野で周知であり、本明細書に記載される通りである。

【0162】

ガイドＲＮＡ、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、及びドナー構築物を含む様々な送達系（例えば、ベクター、リポソーム、ＬＮＰ）はまた、単独でまたは組み合わせて、インビボで細胞に送達するための生物に投与され得るか、またはエクスビボで細胞もしくは細胞培養物に投与され得る。投与は、限定されないが、注射、注入、局所適用、及びエレクトロポレーションを含む、血液、液体、または細胞との最終的な接触に分子を導入するために通常使用される経路のうちのいずれかによるものである。そのような核酸を投与する好適な方法が利用可能であり、当業者に周知である。

【0163】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるガイドＲＮＡ組成物は、単独でまたは１つ以上のベクターにコードされて、脂質ナノ粒子で製剤化されるか、または脂質ナノ粒子を介して投与され、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２４９７３を参照されたく、その内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。ヌクレオチドを対象に送達することができることが当業者に既知の任意の脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤は、本明細書に記載されるガイドＲＮＡ、ならびにＣａｓもしくはＣａｓ９などのＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするｍＲＮＡ、またはＣａｓもしくはＣａｓ９タンパク質などのＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤自体と共に利用され得る。

【0164】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、宿主細胞に（インビトロまたはインビボで）送達、ＬＮＰを介して送達され得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ／ＬＮＰはまた、Ｃａｓ９などのＲＮＡガイドＲＮＡ結合剤またはＣａｓ９などのＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするｍＲＮＡと会合する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ／ＬＮＰはまた、本明細書に記載されるようにドナー構築物と会合する。

【0165】

いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるｇＲＮＡを、インビトロで細胞に送達する方法を含み、ｇＲＮＡは、ＬＮＰを介して送達される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ＡＡＶ系を介してなど、非ＬＮＰ手段によって送達され、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓ９）もしくはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするｍＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９）、及び／またはドナー構築物は、ＬＮＰによって送達される。

【0166】

いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に開示されるｇＲＮＡのうちのいずれか１つを含む組成物及びＬＮＰを提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、Ｃａｓ９もしくはＣａｓ９をコードするｍＲＮＡ、または本明細書に記載される別のＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載されるようにドナー構築物をさらに含む。

【0167】

いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、生分解性陽イオン性脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰは、３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノエート）とも呼ばれる、（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノエート、または別のイオン性脂質を含む。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５３５５９（２０１８年９月２８日出願）、ＷＯ／２０１７／１７３０５４、ＷＯ２０１５／０９５３４０、及びＷＯ２０１４／１３６０８６の脂質、ならびにそこに提供される参照文献を参照されたい。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ脂質の文脈において、陽イオン性及びイオン化可能という用語は、互換的であり、例えば、イオン性脂質は、ｐＨに応じて陽イオン性である。

【0168】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるガイドＲＮＡ、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、及び／または本明細書に開示されるドナー構築物（例えば、双方向性構築物）のうちのいずれかは、単独でまたは組み合わせて、裸でまたはベクターの一部として、脂質ナノ粒子に製剤化されるか、または脂質ナノ粒子を介して投与され、例えば、ＷＯ／２０１７／１７３０５４を参照されたく、その内容は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。

【0169】

電気穿孔法はまた、カーゴの送達のための周知の手段であり、任意の電気穿孔法方法論は、本明細書に開示されるｇＲＮＡのうちのいずれの送達にも使用され得る。いくつかの実施形態では、電気穿孔法を使用して、本明細書に開示されるｇＲＮＡのうちのいずれをも送達することができ、任意に、同じまたは異なる手段によってＣａｓ９などのＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤またはＣａｓ９などのＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするｍＲＮＡを共に送達することができる。いくつかの実施形態では、電気穿孔法は、本明細書に開示されるｇＲＮＡのうちのいずれか１つ及び本明細書に開示されるようなドナー構築物を送達するために使用され得る。

【0170】

ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるガイド配列のうちのいずれか１つ以上を含むガイドＲＮＡのうちのいずれかをコードするＤＮＡまたはＲＮＡベクターを提供する。ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるガイド配列のうちのいずれか１つ以上をコードするＤＮＡまたはＲＮＡベクターを含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ配列に加えて、ベクターは、ガイドＲＮＡをコードしない核酸をさらに含む。ガイドＲＮＡをコードしない核酸には、限定されないが、プロモーター、エンハンサー、制御配列、Ｃａｓ９などのヌクレアーゼであり得るＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸、及び異種遺伝子を含むドナー構築物が含まれる。いくつかの実施形態では、ベクターは、本明細書に開示されるように、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列（複数可）を含む。

【0171】

いくつかの実施形態では、ベクターは、ｓｇＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列（複数可）と、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするｍＲＮＡとを含み、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１などのＣａｓタンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列（複数可）と、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするｍＲＮＡとを含み、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、Ｃａｓ９またはＣｐｆ１などのＣａｓタンパク質であり得る。一実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来である（すなわち、Ｓｐｙ Ｃａｓ９）。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡ（ｓｇＲＮＡであり得る）をコードするヌクレオチド配列は、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来の反復配列の全てまたは一部分が隣接するガイド配列を含むか、またはそれらからなる。ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡを含むか、またはそれらからなる核酸は、ベクター配列を含み得、ベクター配列は、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡと共に自然に見出されない核酸配列を含むか、またはそれらからなる。

【0172】

いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、１つのベクター内の非連続核酸によってコードされる。他の実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、連続核酸によってコードされ得る。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、単一の核酸の反対側の鎖によってコードされる。他の実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、単一の核酸の同一の鎖によってコードされる。

【0173】

いくつかの実施形態では、ベクターは、環状であってもよい。他の実施形態では、ベクターは、直鎖状であってもよい。いくつかの実施形態では、ベクターは、脂質ナノ粒子、リポソーム、非脂質ナノ粒子、またはウイルスカプシドを介して送達され得る。非限定的な例示的なベクターは、プラスミド、ファージミド、コスミド、人工染色体、ミニ染色体、トランスポゾン、ウイルスベクター、及び発現ベクターを含む。

【0174】

いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターであってもよい。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、その野生型の対応物から遺伝子組換えされてもよい。例えば、ウイルスベクターは、クローニングを促進するため、またはベクターの１つ以上の特性を変更するようにするため、１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含み得る。このような特性は、パッケージング能力、形質導入効率、免疫原性、ゲノム組み込み、複製、転写、及び翻訳を含み得る。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムの一部分は、ウイルスがより大きなサイズを有する外来性配列をパッケージングすることができるように、削除され得る。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、増強した形質導入効率を有し得る。いくつかの実施形態では、宿主におけるウイルスによって誘発される免疫応答は低減され得る。いくつかの実施形態では、宿主ゲノムへのウイルス配列の組み込みを促進するウイルス遺伝子（例えば、インテグレースなど）は、ウイルスが非組み込み性になるように変異され得る。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、複製欠損であってもよい。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、ベクター上のコード配列の発現を駆動する外来性の転写または翻訳の制御配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ヘルパー依存性であってもよい。例えば、ベクターを増幅し、ウイルス粒子にパッケージングするのに必要とされるウイルスの構成要素（例えば、ウイルスタンパク質など）を供給するための１つ以上のヘルパーウイルスを必要とし得る。このような場合、ウイルス構成要素をコードする１つ以上のベクターを含む１つ以上のヘルパー構成要素は、本明細書に記載されるベクター系と共に宿主細胞に導入され得る。いくつかの実施形態では、ウイルスは、ヘルパーフリーであってもよい。例えば、ウイルスは、ヘルパーウイルスなしでベクターを増幅及びパッケージングすることが可能であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるベクター系はまた、ウイルス増幅及びパッケージングに必要なウイルスの構成要素をコードし得る。

【0175】

非限定的な例示的なウイルスベクターには、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルパー依存性アデノウイルスベクター（ＨＤＡｄ）、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ－１）ベクター、バクテリオファージＴ４、バキュロウイルスベクター、及びレトロウイルスベクターが含まれる。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、ＡＡＶベクターであってもよい。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターであってもよい。

【0176】

いくつかの実施形態では、「ＡＡＶ」は、全ての血清型、サブタイプ、及び天然に存在するＡＡＶ、ならびに組換えＡＡＶを指す。「ＡＡＶ」は、ウイルス自体またはその誘導体を指すために使用され得る。「ＡＡＶ」という用語は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．３２．３３、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０、及びそれらのハイブリッド、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、及びヒツジＡＡＶを含む。ＡＡＶの様々な血清型のゲノム配列、ならびに天然末端反復（ＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質、及びキャプシドサブユニットの配列は、当該技術分野で既知である。そのような配列は、文献またはＧｅｎＢａｎｋなどの公開データベースに見出され得る。本明細書で使用される「ＡＡＶベクター」は、ＡＡＶ起源ではない異種配列（すなわち、ＡＡＶに対して異種の核酸配列）を含むＡＡＶベクターを指し、典型的には、目的の異種ポリペプチドをコードする配列を含む。構築物は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．３２．３３、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０、及びそれらのハイブリッド、鳥類ＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、及びヒツジＡＡＶキャプシド配列を含み得る。一般に、異種核酸配列（導入遺伝子）は、少なくとも１つ、及び一般に２つのＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）に隣接している。ＡＡＶベクターは、一本鎖（ｓｓＡＡＶ）または自己相補的（ｓｃＡＡＶ）のいずれかであってもよい。

【0177】

いくつかの実施形態では、レンチウイルスは、非組み込み性であってもよい。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターであってもよい。いくつかの実施形態では、アデノウイルスは、全てのコードウイルス領域が、５’及び３’の末端逆位配列（ＩＴＲ）から離れており、パッケージングシグナル（「Ｉ」）がウイルスから削除されてそのパッケージング能力が増加している、高クローニング能、または「ガットレス」アデノウイルスであってもよい。さらに他の実施形態では、ウイルスベクターは、ＨＳＶ－１ベクターであってもよい。いくつかの実施形態では、ＨＳＶ－１に基づいたベクターは、ヘルパー依存性であり、他の実施形態では、それはベクター非依存性である。例えば、パッケージング配列のみを保持するアンプリコンベクターは、パッケージングのために構造的な構成要素を有するヘルパーウイルスを必要とし、一方で、非必須のウイルス機能を除去した３０ｋｂ欠失ＨＳＶ－１ベクターは、ヘルパーウイルスを必要としない。さらなる実施形態では、ウイルスベクターは、バクテリオファージＴ４であってもよい。いくつかの実施形態では、バクテリオファージＴ４は、ウイルスの頭部が空であるとき、任意の直鎖状または環状ＤＮＡまたはＲＮＡ分子をパッケージングすることができる。さらなる実施形態では、ウイルスベクターは、バキュロウイルスベクターであってもよい。なおもさらなる実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターであってもよい。より小さいクローニング能力を有するＡＡＶまたはレンチウイルスベクターを使用する実施形態では、本明細書に開示されるようなベクター系の全ての構成要素を送達するために１つを超えるベクターを使用する必要がある場合がある。例えば、１つのＡＡＶベクターは、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）などのＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする配列を含み得、一方で、第２のＡＡＶベクターは、１つ以上のガイド配列を含み得る。

【0178】

いくつかの実施形態では、ベクターは、細胞内で１つ以上のコード配列の発現を駆動することができる場合がある。いくつかの実施形態では、細胞は、酵母、植物、昆虫、または哺乳動物細胞などの真核生物細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、真核生物細胞は、哺乳動物細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、真核生物細胞は、げっ歯類細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、真核生物細胞は、ヒト細胞であってもよい。異なる種類の細胞における発現を駆動するための好適なプロモーターは、当該技術分野で既知である。いくつかの実施形態では、プロモーターは、野生型であってもよい。他の実施形態では、プロモーターは、より効率的または効果的な発現のために修飾されてもよい。さらに他の実施形態では、プロモーターは短縮されているが、依然としてその機能を維持し得る。例えば、プロモーターは、ウイルスへのベクターの適切なパッケージングに好適な通常のサイズまたは低減されたサイズを有し得る。

【0179】

いくつかの実施形態では、ベクターは、本明細書に記載されるＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）などのＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ベクターによってコードされるヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質であってもよい。いくつかの実施形態では、ベクター系は、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の１つのコピーを含み得る。他の実施形態において、ベクター系は、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の１つを超えるコピーを含み得る。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも１つの転写または翻訳の制御配列へと作動可能に連結されてもよい。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも１つプロモーターへと作動可能に連結されてもよい。

【0180】

いくつかの実施形態では、ベクターは、本明細書に記載される異種遺伝子を含む構築物のうちのいずれか１つ以上を含み得る。いくつかの実施形態では、異種遺伝子は、少なくとも１つの転写または翻訳の制御配列へと作動可能に連結されてもよい。いくつかの実施形態では、異種遺伝子は、少なくとも１つのプロモーターへと作動可能に連結されてもよい。いくつかの実施形態では、異種遺伝子は、異種遺伝子の発現を駆動するプロモーターに連結されていない。

【0181】

いくつかの実施形態では、プロモーターは、構成的、誘導性、または組織特異的であってもよい。いくつかの実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターであってもよい。非限定的な例示的な構成的プロモーターには、サイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＣＭＶ）、シミアンウイルス（ＳＶ４０）プロモーター、アデノウイルス主要後期（ＭＬＰ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ホスホグリゼリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、伸長因子アルファ（ＥＦ１ａ）プロモーター、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、チューブリンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、それらの機能性断片、または先行するもののいずれかの組み合わせが含まれる。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＣＭＶプロモーターであってもよい。いくつかの実施形態では、プロモーターは、短縮型ＣＭＶプロモーターであってもよい。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＥＦ１ａプロモーターであってもよい。いくつかの実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターであってもよい。非限定的な例示的な誘導性プロモーターは、熱ショック、光、化学物質、ペプチド、金属、ステロイド、抗生物質、またはアルコールによって誘導可能なものを含む。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、Ｔｅｔ－Ｏｎ（登録商標）プロモーター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）などの、低い基底（非誘導）発現レベルを有するものであってよい。

【0182】

いくつかの実施形態では、プロモーターは、組織特異的プロモーター、例えば、肝臓内での発現に特異的なプロモーターであってもよい。

【0183】

ベクターは、本明細書に記載されるガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、ガイドＲＮＡの１つのコピーを含む。他の実施形態では、ベクターは、ガイドＲＮＡの１つを超えるコピーを含む。１つを超えるガイドＲＮＡを有する実施形態では、ガイドＲＮＡは、それらが非同一であり、異なる標的配列を標的化するようであってもよく、それらが同一の標的配列を標的化する点において同一であってもよい。いくつかの実施形態では、ベクターが、１つを超えるガイドＲＮＡを含む場合、各ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ ＲＮＰ複合体などのＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼとの複合体内の活性または安定性などの他の異なる特性を有し得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、プロモーター、３’ＵＴＲ、または５’ＵＴＲなどの少なくとも１つの転写または翻訳の制御配列に作動可能に連結されてもよい。一実施形態では、プロモーターは、ｔＲＮＡプロモーター、例えば、ｔＲＮＡ^Ｌｙｓ３、またはｔＲＮＡキメラであってもよい。Ｍｅｆｆｅｒｄ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ．２０１５ ２１：１６８３－９、Ｓｃｈｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００７ ３５：２６２０－２６２８を参照されたい。いくつかの実施形態では、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ＰｏｌＩＩＩ）によって認識され得る。ＰｏｌＩＩＩプロモーターの非限定的な例は、Ｕ６及びＨ１プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、マウスまたはヒトのＵ６プロモーターに作動可能に連結され得る。他の実施形態では、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、マウスまたはヒトのＨ１プロモーターへと作動可能に連結され得る。１つを超えるガイドＲＮＡを有する実施形態では、発現を駆動するために使用されるプロモーターは、同一または異なってもよい。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡをコードするヌクレオチド及びガイドＲＮＡのｔｒＲＮＡをコードするヌクレオチドは、同一のベクター上に提供され得る。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡをコードするヌクレオチド及びｔｒＲＮＡをコードするヌクレオチドは、同一のプロモーターによって駆動され得る。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、単一の転写産物へと転写され得る。例えば、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、二重分子ガイドＲＮＡを形成するように単一の転写産物から加工され得る。代替的に、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、単一分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）へと転写され得る。他の実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、同一のベクター上のそれらの対応するプロモーターによって駆動され得る。さらに他の実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡは、異なるベクターによってコードされ得る。

【0184】

いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、Ｃａｓタンパク質などのＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするヌクレオチド配列を含む同一のベクター上に配置され得る。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡ及びＣａｓタンパク質などのＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の発現は、それら自体の対応するプロモーターによって駆動され得る。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡの発現は、Ｃａｓタンパク質などのＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の発現を駆動する同一のプロモーターによって駆動され得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ及びＣａｓタンパク質転写産物などのＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、単一の転写産物内に含まれ得る。例えば、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓタンパク質転写産物などのＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の非翻訳領域（ＵＴＲ）内にあってもよい。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、転写産物の５’ＵＴＲ内にあってもよい。他の実施形態では、ガイドＲＮＡは、転写産物の３’ＵＴＲ内にあってもよい。いくつかの実施形態では、転写産物の細胞内半減期は、その３’ＵＴＲ内にガイドＲＮＡを含み、それによって３’ＵＴＲの長さを短縮することによって低減することができる。さらなる実施形態では、ガイドＲＮＡは、転写産物のイントロン内にあってもよい。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡが転写産物から適切にスプライシング除去されるように、ガイドＲＮＡが内部に位置するイントロンにおいて、好適なスプライス部位が追加され得る。

【0185】

いくつかの実施形態では、組成物は、ベクター系を含む。いくつかの実施形態では、ベクター系は、１つの単一のベクターを含み得る。他の実施形態では、ベクター系は、２つのベクターを含み得る。さらなる実施形態では、ベクター系は、３つのベクターを含み得る。異なるガイドＲＮＡが多重化のために使用されるとき、またはガイドＲＮＡの複数のコピーが使用されるとき、ベクター系は、３つを超えるベクターを含み得る。いくつかの実施形態では、ベクター系は、本明細書に記載されるようにドナー構築物をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ベクター系は、ヌクレアーゼをコードする核酸をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ベクター系は、ガイドＲＮＡをコードする核酸、及び／またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（Ｃａｓ９などのＣａｓ９タンパク質であり得る）をコードする核酸をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡをコードする核酸及び／またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤もしくはヌクレアーゼをコードする核酸は、本明細書に開示されるドナー構築物を含むベクターとは別個のベクター上に各々または両方にある。実施形態のうちのいずれにおいても、ベクター系は、本明細書に記載されるように、限定されないが、プロモーター、エンハンサー、制御配列を含む他の配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ベクター系内のプロモーターは、ドナー構築物（例えば、双方向性構築物）の導入遺伝子の発現を駆動しない。いくつかの実施形態では、ベクター系は、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列（複数可）を含む。いくつかの実施形態では、ベクター系は、ｓｇＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列（複数可）と、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするｍＲＮＡとを含み、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼは、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）であり得る。いくつかの実施形態では、ベクター系は、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列（複数可）と、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするｍＲＮＡとを含み、ＲＮＡガイドＤＮＡヌクレアーゼは、Ｃａｓ９などのＣａｓヌクレアーゼであり得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来である（すなわち、Ｓｐｙ Ｃａｓ９）。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡ（ｓｇＲＮＡであり得る）をコードするヌクレオチド配列は、天然に存在するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来の反復配列の全てまたは一部分が隣接するガイド配列を含むか、またはそれらからなる。ベクター系は、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡを含むか、またはそれらからなる核酸を含んでもよく、ベクター系は、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、またはｃｒＲＮＡ及びｔｒＲＮＡと共に自然に見出されない核酸を含むか、またはそれらからなる。

【0186】

いくつかの実施形態では、ベクター系は、それが標的細胞に送達した後にのみ発現を開始するために、誘導性プロモーターを含み得る。非限定的な例示的な誘導性プロモーターは、熱ショック、光、化学物質、ペプチド、金属、ステロイド、抗生物質、またはアルコールによって誘導可能なものを含む。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、Ｔｅｔ－Ｏｎ（登録商標）プロモーター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）などの、低い基底（非誘導）発現レベルを有するものであってよい。

【0187】

さらなる実施形態では、ベクター系は、それが特異的な組織に送達した後にのみ発現を開始するために、組織特異的プロモーターを含み得る。

【0188】

ベクターまたはベクター系は、リポソーム、ナノ粒子、エクソソーム、または微小胞によって送達され得る。ベクターはまた、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）によって送達され得る。１つ以上のガイドＲＮＡ、ＲＮＡ結合ＤＮＡ結合剤（例えば、ｍＲＮＡ）、または異種タンパク質をコードする配列を含むドナー構築物は、個別にまたは任意の組み合わせで、リポソーム、ナノ粒子、エクソソーム、または微小胞によって送達され得る。１つ以上のガイドＲＮＡ、ＲＮＡ結合ＤＮＡ結合剤（例えば、ｍＲＮＡ）、または異種タンパク質をコードする配列を含むドナー構築物は、個別にまたは任意の組み合わせで、ＬＮＰによって送達され得る。本明細書に記載のＬＮＰ及びＬＮＰ製剤のうちのいずれも、ガイド、Ｃａｓヌクレアーゼ（またはＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ）、それらの組み合わせ、及び／または異種遺伝子を含む構築物の送達に好適である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ成分及び脂質成分を含むＬＮＰ組成物が包含され、脂質成分は、生分解性イオン性脂質などのアミン脂質を含み、ＲＮＡ成分は、ガイドＲＮＡ及び／またはＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む。いくつかの例では、脂質成分は、生分解性、イオン性脂質、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ－ＤＭＧを含む。

【0189】

本明細書に開示されるガイドＲＮＡ、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、ＣａｓヌクレアーゼまたはＣａｓヌクレアーゼをコードする核酸）、及びドナー構築物は、同じまたは異なる系を使用して送達され得ることが明らかであろう。例えば、ガイドＲＮＡ、Ｃａｓヌクレアーゼ、及び構築物は、同じベクター（例えば、ＡＡＶ）によって担持され得る。あるいは、Ｃａｓヌクレアーゼ（タンパク質またはｍＲＮＡとして）及び／またはｇＲＮＡは、プラスミドまたはＬＮＰによって担持され得、一方、構築物は、ベクターによって担持され得る。さらに、異なる送達系は、同じまたは異なる経路によって投与され得る。

【0190】

いくつかの実施形態では、方法は、ガイドＲＮＡ及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなど）をＬＮＰで投与することを含む。さらなる実施形態では、方法は、双方向性構築物などの導入遺伝子タンパク質をコードするＡＡＶ核酸構築物を投与することを含む。ガイドＲＮＡとＣａｓ９をコードするｍＲＮＡとを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＬＮＰを静脈内投与することができる。ＡＡＶドナー構築物を静脈内投与することができる。

【0191】

異なる送達系は、インビトロまたはインビボで、同時にまたは任意の逐次的順序で送達することができる。いくつかの実施形態では、ドナー構築物、ガイドＲＮＡ、及びＣａｓヌクレアーゼは、インビトロまたはインビボで、同時に、例えば、１つのベクター、２つのベクター、個々のベクター、１つのＬＮＰ、２つのＬＮＰ、個々のＬＮＰ、またはそれらの組み合わせで送達され得る。いくつかの実施形態では、ドナー構築物は、ガイドＲＮＡ及び／またはＣａｓヌクレアーゼをベクターとして及び／または単独でＬＮＰと会合してまたは合わせてリボ核酸タンパク質（ＲＮＰ）として送達する（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日以上）前に、ベクターとして及び／またはＬＮＰと会合してインビボまたはインビトロで送達され得る。いくつかの実施形態では、ドナー構築物は、例えば、毎日、２日毎、３日毎、４日毎、毎週、２週間毎、３週間毎、または４週間毎に、複数回投与で送達され得る。いくつかの実施形態では、ドナー構築物は、例えば、１週目、２週目、及び３週目などの１週間間隔で送達され得る。さらなる例として、ガイドＲＮＡ及びＣａｓヌクレアーゼは、ベクターとして、及び／または単独でＬＮＰと会合してまたは合わせてリボ核酸タンパク質（ＲＮＰ）として、構築物をベクターとして及び／またはＬＮＰと会合して送達する（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日以上）前に、インビボまたはインビトロで送達され得る。いくつかの実施形態では、アルブミンガイドＲＮＡは、例えば、毎日、２日毎、３日毎、４日毎、毎週、２週間毎、３週間毎、または４週間毎に、複数回投与で送達され得る。いくつかの実施形態では、アルブミンガイドＲＮＡは、例えば、１週目、２週目、及び３週目などの１週間間隔で送達され得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、複数回投与で送達され得、例えば、毎日、２日毎、３日毎、４日毎、毎週、２週間毎、３週間毎、または４週間毎に送達され得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、例えば、１週目、２週目、及び３週目などの１週間間隔で送達され得る。

【0192】

ＩＶ．使用方法
本明細書に開示されるｇＲＮＡならびに関連方法及び組成物は、宿主細胞のヒトアルブミン遺伝子座のイントロン１内に異種（外因性）遺伝子を効率的に挿入するのに有用である。いくつかの実施形態では、本開示は、宿主細胞のヒトアルブミン遺伝子座のイントロン１内に異種遺伝子を挿入する方法を提供し、本明細書に記載されるガイドＲＮＡ（配列番号２～３３のうちのいずれか１つ）、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、本明細書に記載されるＣａｓヌクレアーゼ）、及び目的の異種ポリペプチドをコードする配列を含むドナー構築物を宿主細胞に（インビボまたはインビトロで）投与することを含む。

【0193】

本明細書に開示されるｇＲＮＡならびに関連方法及び組成物は、宿主細胞のヒトアルブミン遺伝子座のイントロン１内に異種（外因性）遺伝子を発現するのに有用である。いくつかの実施形態では、本開示は、宿主細胞のヒトアルブミン遺伝子座のイントロン１内に異種遺伝子を発現する方法を提供し、本明細書に記載されるガイドＲＮＡ（配列番号２～３３のうちのいずれか１つ）、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、本明細書に記載されるＣａｓヌクレアーゼ）、及び目的の異種ポリペプチドをコードする配列を含むドナー構築物を宿主細胞に（インビボまたはインビトロで）投与することを含む。

【0194】

本明細書に開示されるｇＲＮＡならびに関連方法及び組成物は、本明細書に記載されるように、対象における肝臓関連障害を治療するのに有用である。いくつかの実施形態では、本開示は、肝臓関連障害を治療する方法を提供し、本明細書に記載されるガイドＲＮＡ（配列番号２～３３のうちのいずれか１つ）、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、本明細書に記載されるＣａｓヌクレアーゼ）、及び目的のポリペプチドをコードする配列を含むドナー構築物を宿主細胞に（インビボまたはインビトロで）投与することを含む。

【0195】

本開示の組成物及び方法は、有用であり、様々な宿主細胞に適用可能である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、肝臓細胞、ニューロン細胞、または筋肉細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、任意の好適な非分裂細胞である。本明細書で使用される場合、「非分裂細胞」は、末端分化され、分裂しない細胞、ならびに分裂しないが、細胞分裂及び増殖に再び入る能力を保持する静止細胞を指す。例えば、肝臓細胞は、（例えば、傷害または切除されたときに）分裂する能力を保持するが、典型的には分裂しない。有糸分裂細胞分裂中、相同組換えは、ゲノムが保護され、二本鎖切断が修復される機序である。いくつかの実施形態では、「非分裂」細胞は、相同組換え（ＨＲ）が、例えば、対照分裂細胞と比較して、細胞内で二本鎖ＤＮＡ切断が修復される一次機序ではない細胞を指す。いくつかの実施形態では、「非分裂」細胞は、非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）が、例えば、対照分裂細胞と比較して、細胞内で二本鎖ＤＮＡ切断が修復される一次機序である細胞を指す。非分裂細胞型は、文献に記載されており、例えば、活性ＮＨＥＪ二本鎖ＤＮＡ切断修復機序により記載されている。例えば、Ｉｙａｍａ，ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ（Ａｍｓｔ．）２０１３，１２（８）：６２０－６３６を参照されたい。いくつかの実施形態では、宿主細胞には、限定されないが、肝臓細胞、筋肉細胞、またはニューロン細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、マウス、カニクイザル、またはヒト肝細胞などの肝細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、マウス、カニクイザル、またはヒト筋細胞などの筋細胞である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される双方向性構築物を含む、上に記載される宿主細胞が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、本明細書に開示される双方向性構築物によってコードされる導入遺伝子ポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法によって作製される宿主細胞が本明細書に提供される。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、本明細書に記載される双方向性核酸構築物、及びＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系などの遺伝子編集系を宿主細胞に投与または送達することによって作製される。

【0196】

いくつかの実施形態では、方法は、長期的な効果、例えば、少なくとも１ヶ月、２ヶ月、６ヶ月、１年、または２年の効果を達成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、長期的かつ持続的な様式で、例えば、少なくとも１ヶ月、２ヶ月、６ヶ月、１年、または２年の効果で治療効果を達成することをさらに含む。いくつかの実施形態では、循環第ＩＸ因子活性及び／またはレベルのレベルは、少なくとも１ヶ月、２ヶ月、６ヶ月、１年以上安定する。いくつかの実施形態では、ＦＩＸタンパク質の定常状態活性及び／またはレベルは、少なくとも７日、少なくとも１４日、または少なくとも２８日までに達成される。さらなる実施形態では、方法は、単回投与後、少なくとも１、２、４、もしくは６ヶ月、または少なくとも１、２、３、４、もしくは５年間、第ＩＸ因子活性及び／またはレベルを維持することを含む。

【0197】

アルブミン遺伝子座への挿入を伴うさらなる実施形態では、個体の循環アルブミンレベルは、正常である。方法は、個体の循環アルブミンレベルを、正常な循環アルブミンレベルに対して±５％、±１０％、±１５％、±２０％、または±５０％以内に維持することを含み得る。ある特定の実施形態では、個体のアルブミンレベルは、少なくとも４週目、８週目、１２週目、または２０週目までに、未治療の個体のアルブミンレベルと比較して変化していない。ある特定の実施形態では、個体のアルブミンレベルは、一時的に低下し、次いで、正常レベルに戻る。特に、方法は、血漿アルブミンのレベルにおける有意な変化を検出しないことを含み得る。

【0198】

いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ、ドナー構築物（例えば、第ＩＸ因子をコードする配列を含む双方向性構築物）、及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）のうちのいずれか１つ以上を、宿主細胞または宿主細胞集団に投与または送達することを含む、ヒトアルブミン遺伝子などのアルブミン遺伝子を修飾する（例えば、二本鎖切断を作成する）方法または使用を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ、ドナー構築物（例えば、第ＩＸ因子をコードする配列を含む双方向性構築物）、及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）のうちのいずれか１つ以上を、宿主細胞または宿主細胞集団に投与または送達することを含む、ヒトアルブミンイントロン１などのアルブミンイントロン１領域を修飾する（例えば、二本鎖切断を作成する）方法または使用を含む。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ、ドナー構築物（例えば、第ＩＸ因子をコードする配列を含む双方向性構築物）、及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）のうちのいずれか１つ以上を、宿主細胞または宿主細胞集団に投与または送達することを含む、肝臓細胞または肝細胞宿主細胞などのセーフハーバー部位などのヒトゲノム遺伝子座を修飾する（例えば、二本鎖切断を作成する）方法または使用を含む。アルブミン遺伝子座セーフハーバー部位（例えば、イントロン１）などの、セーフハーバー部位などのゲノム遺伝子座内への挿入は、肝細胞または肝臓細胞などの宿主細胞または細胞集団に著しい有害な影響を与えることなく、第ＩＸ因子遺伝子の過剰発現を可能にする。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ、ドナー構築物（例えば、第ＩＸ因子をコードする配列を含む双方向性構築物）、及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）のうちのいずれか１つ以上を、宿主細胞または宿主細胞集団に投与または送達することを含む、ヒトアルブミン遺伝子座のイントロン１を修飾する（例えば、二本鎖切断を作成する）方法または使用を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、ヒトアルブミン遺伝子座（配列番号１）のイントロン１内で結合する少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドを含むガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、３３からなる群から選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドであるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号３４、４０、４５、５１、６０、６１、６３、６４、６５、６６、７２、７７、８３、９２、９３、９５、９６、及び９７からなる群から選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一であるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドであるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号３４～９７からなる群から選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、方法は、インビトロで行われる。いくつかの実施形態では、方法は、インビボで行われる。いくつかの実施形態では、ドナー構築物は、第ＩＸ因子をコードする配列を含む双方向性構築物である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、肝臓細胞などである。さらなる実施形態では、肝臓細胞は、肝細胞である。

【0199】

いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ、ドナー構築物（例えば、第ＩＸ因子をコードする配列を含む双方向性構築物）、及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）のうちのいずれか１つ以上を投与または送達することを含む、第ＩＸ因子核酸を宿主細胞または宿主細胞集団に導入する方法または使用を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、ヒトアルブミン遺伝子座（配列番号１）のイントロン１内の領域に結合することができる少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドを含むガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、３３からなる群から選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドであるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号３４、４０、４５、５１、６０、６１、６３、６４、６５、６６、７２、７７、８３、９２、９３、９５、９６、及び９７からなる群から選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一であるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドであるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号３４～９７からなる群から選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、方法は、インビトロである。いくつかの実施形態では、方法は、インビボである。いくつかの実施形態では、ドナー構築物は、第ＩＸ因子をコードする配列を含む双方向性構築物である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、肝臓細胞であるか、または宿主細胞集団は、肝細胞などの肝臓細胞である。

【0200】

いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ、ドナー構築物（例えば、第ＩＸ因子をコードする配列を含む双方向性構築物）、及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）のうちのいずれか１つ以上を投与または送達することを含む、宿主細胞または宿主細胞集団において第ＩＸ因子を発現する方法または使用を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、ヒトアルブミン遺伝子座（配列番号１）のイントロン１内の領域に結合することができる少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドを含むガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、３３からなる群から選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドであるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号３４、４０、４５、５１、６０、６１、６３、６４、６５、６６、７２、７７、８３、９２、９３、９５、９６、及び９７からなる群から選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一であるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドであるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号３４～９７からなる群から選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、方法は、インビトロである。いくつかの実施形態では、方法は、インビボである。いくつかの実施形態では、ドナー構築物は、第ＩＸ因子をコードする配列を含む双方向性構築物である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、肝臓細胞であるか、または宿主細胞集団は、肝細胞などの肝臓細胞である。

【0201】

いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるｇＲＮＡ、ドナー構築物（例えば、第ＩＸ因子をコードする配列を含む双方向性構築物）、及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ）のうちのいずれか１つ以上を、それを必要とする対象に投与または送達することを含む、血友病（例えば、血友病Ａまたは血友病Ｂ）を治療する方法または使用を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、ヒトアルブミン遺伝子座（配列番号１）のイントロン１内の領域に結合することができる少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドを含むガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、配列番号２～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、３３からなる群から選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドであるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号３４、４０、４５、５１、６０、６１、６３、６４、６５、６６、７２、７７、８３、９２、９３、９５、９６、及び９７からなる群から選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一であるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号２～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドであるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるガイドＲＮＡは、配列番号３４～９７からなる群から選択されるガイド配列を含む。いくつかの実施形態では、ドナー構築物は、異種ポリペプチドをコードする配列を含む双方向性構築物である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、肝臓細胞であるか、または宿主細胞集団は、肝細胞などの肝臓細胞である。

【0202】

本明細書で使用される場合、「血友病」は、喪失または欠損第ＩＸ因子遺伝子またはポリペプチドによって引き起こされる障害を指す。血友病はまた、喪失または欠損第ＶＩＩＩ因子遺伝子またはポリペプチドによって引き起こされる障害を指す。障害は、遺伝性及び／または後天性（例えば、遺伝子における自発的変異によって引き起こされる）状態を含み、血友病Ａ及び血友病Ｂを含む。血友病Ａは、第ＶＩＩＩ因子欠乏症によって引き起こされる。血友病Ｂは、第ＩＸ因子欠乏症によって引き起こされる。いくつかの実施形態では、欠損第ＩＸ因子遺伝子またはポリペプチドは、血漿中の第ＩＸ因子レベルの低下及び／または第ＩＸ因子の凝固活性の低下をもたらす。本明細書で使用される場合、血友病は、軽度、中等度、及び重度の血友病を含む。例えば、約１％未満の活性因子を有する個体は、重度の血友病を有するとして分類され、約１～５％の活性因子を有する個体は、中等度の血友病を有し、軽度の血友病を有する個体は、活性凝固因子の正常レベルに対して約５～４０％を有するとして分類される。

【0203】

いくつかの実施形態では、ドナー構築物は、第ＩＸ因子をコードする配列を含み、第ＩＸ因子配列は、野生型第ＩＸ因子である。いくつかの実施形態では、配列は、第ＩＸ因子のバリアントをコードする。例えば、バリアントは、野生型第ＩＸ因子よりも増加された凝固活性を有し得る。例えば、バリアント第ＩＸ因子は、野生型第ＩＸ因子に対して、Ｒ３３８位（例えば、Ｒ３３８Ｌ）にアミノ酸置換などの１つ以上の変異を含み得る。いくつかの実施形態では、配列は、野生型第ＩＸ因子と８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９７％、９９％同一であり、野生型第ＩＸ因子と比較して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％、１００％以上の活性を有する第ＩＸ因子バリアントをコードする。いくつかの実施形態では、配列は、第ＩＸ因子の断片をコードし、断片は、野生型第ＩＸ因子と比較して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％、１００％以上の活性を有する。

【0204】

いくつかの実施形態では、ドナー構築物は、第ＩＸ因子バリアントをコードする配列を含み、第ＩＸ因子バリアントは、その補因子である第ＶＩＩＩ因子の不在下で凝固を活性化する（発現は、治療的に関連するＦＶＩＩＩ模倣活性をもたらす）。そのような第ＩＸ因子バリアントは、野生型第ＩＸ因子の活性をさらに維持することができる。例えば、そのような第ＩＸ因子バリアントは、野生型第ＩＸ因子に対して（例えば、配列番号７０１に対して）Ｌ６位、Ｖ１８１位、Ｋ２６５位、Ｉ３８３位、Ｅ１８５位、またはそれらの組み合わせにアミノ酸置換基を含み得る。例えば、そのような第ＩＸ因子バリアントは、野生型第ＩＸ因子に対して、Ｌ６Ｆ変異、Ｖ１８１Ｉ変異、Ｋ２６５Ａ変異、Ｉ３８３Ｖ変異、Ｅ１８５Ｄ変異、またはそれらの組み合わせを含み得る。

【0205】

本開示の組成物及び方法は、目的の異種遺伝子の効率的な挿入及び異種ポリペプチド（例えば、治療用ポリペプチド）の安全な発現に有用である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、分泌ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、その機能が分泌ポリペプチドとして通常作用する（例えば、機能的に活性である）ものである。本明細書で使用される「分泌ポリペプチド」は、細胞によって分泌され、及び／または可溶性細胞外タンパク質として機能的に活性であるタンパク質を指す。

【0206】

いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、細胞内ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、その機能が細胞内で通常作用する（例えば、機能的に活性である）ものである。本明細書で使用される「細胞内ポリペプチド」は、可溶性細胞溶質ポリペプチドを含む、細胞によって分泌されないタンパク質を指す。１つ以上のＩＲＥＳ及び／または自己切断ペプチド配列は、細胞内ポリペプチド、例えば、ポリペプチドのアミノ末端などのポリペプチドの末端またはその近くに隣接し得る。

【0207】

いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、野生型ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、バリアント（例えば、変異体）ポリペプチド（例えば、野生型ポリペプチドの活動亢進型変異体）である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、肝臓タンパク質である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、非肝臓タンパク質である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、第ＩＸ因子、またはそのバリアントである。いくつかの実施形態では、肝臓ポリペプチドは、例えば、限定されないが、チロシン血症、ウィルソン病、テイ・サックス病、高ビリルビン血症（クリグラー・ナジャール）、急性間欠性ポルフィリン症、１型シトルリン血症、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症、またはメープルシロップ尿症などの肝臓障害に対処するためのポリペプチドである。

【0208】

いくつかの実施形態では、宿主細胞によるポリペプチドの発現（インビトロまたはインビボにかかわらず）は、本明細書に開示される組成物を提供する前に宿主細胞により発現されるレベルに対して、少なくとも２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、またはそれ以上増加される。さらなる実施形態では、異種ポリペプチドの発現は、少なくとも検出可能なレベルまたは治療上有効なレベルまで増加され得る。

【0209】

いくつかの実施形態では、宿主細胞によるポリペプチドの発現（インビトロまたはインビボにかかわらず）は、既知の正常レベル（例えば、健康な対象におけるポリペプチドのレベル）の少なくとも２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、またはそれ以上まで増加される。

【0210】

いくつかの実施形態では、宿主細胞によるポリペプチドの発現（インビトロまたはインビボにかかわらず）は、例えば、対象の細胞、血漿、及び／または血清中で決定される場合、少なくとも約１０μｇ／ｍｌ、１５μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、３０μｇ／ｍｌ、３５μｇ／ｍｌ、４０μｇ／ｍｌ、４５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、５５μｇ／ｍｌ、６０μｇ／ｍｌ、６５μｇ／ｍｌ、７０μｇ／ｍｌ、７５μｇ／ｍｌ、８０μｇ／ｍｌ、８５μｇ／ｍｌ、９０μｇ／ｍｌ、９５μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、１２０μｇ／ｍｌ、１４０μｇ／ｍｌ、１６０μｇ／ｍｌ、１８０μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、２２５μｇ／ｍｌ、２５０μｇ／ｍｌ、２７５μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、３２５μｇ／ｍｌ、３５０μｇ／ｍｌ、４００μｇ／ｍｌ、４５０μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、５５０μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、６５０μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、７５０μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌ、８５０μｇ／ｍｌ、９００μｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍｌ、１１００μｇ／ｍｌ、１２００μｇ／ｍｌ、１３００μｇ／ｍｌ、１４００μｇ／ｍｌ、１５００μｇ／ｍｌ、１６００μｇ／ｍｌ、１７００μｇ／ｍｌ、１８００μｇ／ｍｌ、１９００μｇ／ｍｌ、２０００μｇ／ｍｌ、またはそれ以上まで増加される。様々な試料におけるポリペプチドを検出及び測定する方法は、当該技術分野で周知である。

【0211】

いくつかの実施形態では、本開示の組成物及び方法は、肝臓関連疾患を治療するのに有用である。本明細書で使用される場合、「肝臓関連障害」は、肝臓組織に対する損傷を直接的に引き起こす疾患、肝臓組織に対する損傷から生じる疾患、及び／または肝臓における欠損から生じた非肝臓器官もしくは組織の障害を指す。肝臓関連疾患の例には、限定されないが、チロシン血症、ウィルソン病、テイ・サックス病、高ビリルビン血症（クリグラー・ナジャール）、急性間欠性ポルフィリン症、１型シトルリン血症、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症、及びメープルシロップ尿症が挙げられる。

【0212】

本明細書に記載されるように、本明細書に開示されるガイドＲＮＡ、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、及びドナー構築物のうちの１つ以上のいずれも、当該技術分野で既知の任意の好適な送達系及び方法を使用して送達され得る。組成物は、インビトロまたはインビボで、同時にまたは任意の逐次的順序で送達することができる。いくつかの実施形態では、ドナー構築物、ガイドＲＮＡ、及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、インビトロまたはインビボで、同時に、例えば、１つのベクター、２つのベクター、個々のベクター、１つのＬＮＰ、２つのＬＮＰ、個々のＬＮＰ、またはそれらの組み合わせで送達され得る。いくつかの実施形態では、ドナー構築物は、ガイドＲＮＡ及び／またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をベクターとして及び／または単独でＬＮＰと会合してまたは合わせてリボ核酸タンパク質（ＲＮＰ）として送達する（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日以上）前に、ベクターとして及び／またはＬＮＰと会合してインビボまたはインビトロで送達され得る。さらなる例として、ガイドＲＮＡ及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、ベクターとして、及び／または単独でＬＮＰと会合してまたは合わせてリボ核酸タンパク質（ＲＮＰ）として、構築物をベクターとして及び／またはＬＮＰと会合して送達する（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日以上）前に、インビボまたはインビトロで送達され得る。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤は、ＬＮＰと会合し、ドナー構築物を送達する前に宿主細胞に送達される。

【0213】

いくつかの実施形態では、ドナー構築物は、第ＩＸ因子をコードする配列、またはそのバリアントを含む。例えば、バリアントは、野生型ポリペプチドよりも増加した活性を有する。いくつかの実施形態では、配列は、野生型ポリペプチド配列と８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９７％、９９％同一であるポリペプチドバリアントをコードし、野生型ポリペプチドと比較して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％、１００％、またはそれ以上の活性を有する。いくつかの実施形態では、配列は、野生型ポリペプチドの断片をコードし、断片は、野生型第ＩＸ因子と比較して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、９９％、１００％、またはそれ以上の活性を有する。

【0214】

いくつかの実施形態では、異種遺伝子を含むドナー構築物、ガイドＲＮＡ、及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の単回投与は、目的のポリペプチドの発現を望ましいレベルに増加させるのに十分である。他の実施形態では、異種遺伝子を含むドナー構築物、ガイドＲＮＡ、及びＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤を含む組成物の１回を超える投与は、治療効果を最大化するのに有益であり得る。

【0215】

いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、及びドナー構築物は、個別に、または任意の組み合わせで、静脈内投与される。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡ、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、及びドナー構築物は、個別に、または任意の組み合わせで、肝循環に投与される。

【0216】

いくつかの実施形態では、宿主または対象は、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、宿主または対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、宿主または対象は、げっ歯類（例えば、マウス）である。

【0217】

この説明及び例示的な実施形態は、限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書及び添付の請求項の目的について、特に明記しない限り、本明細書及び請求項で使用される量、パーセンテージ、または割合、及び他の数値を表す全ての数字は、どの場合においても「約」という用語によって、まだそれほど修飾されていない程度まで修飾されていると理解されるべきである。したがって、そうでないことが示されない限り、以下の明細書及び添付の請求項に示される数値パラメータは、得ようとする所望の特性に応じて変化し得る近似値である。非常に少なくとも、及び均等論の適用を請求項の範囲に限定する試みとしてではなく、各数値パラメータは、報告された有効数字の数を考慮して、通常の丸め手法を適用することにより、少なくとも解釈されるべきである。
本発明はまた、以下に関する。
［項目１］
宿主細胞または細胞集団のアルブミン遺伝子座に異種ポリペプチドをコードする核酸を挿入する方法であって、
ｉ）ｇＲＮＡであって、
ａ）配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、及び３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列、
ｂ）配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、及び３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチド、
ｃ）配列番号３４、４０、４５、５１、６０、６１、６３、６４、６５、６６、７２、７７、８３、９２、９３、９５、９６、及び９７からなる群から選択される配列、
ｄ）配列番号２～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列、
ｅ）配列番号２～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチド、
ｆ）配列番号３４～９７からなる群から選択される配列、
ｇ）配列番号２～３３について列挙されるゲノム座標の１５個の連続ヌクレオチド±１０個のヌクレオチドに対して相補的である配列、
ｈ）配列番号９８～１１９からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列、
ｉ）配列番号９８～１１９からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチド、ならびに
ｊ）配列番号１２０～１６３からなる群から選択される配列
から選択される配列を含む、前記ｇＲＮＡと、
ｉｉ）ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤と、
ｉｉｉ）前記異種ポリペプチドをコードする核酸を含む構築物と、を投与することを含み、
それにより、前記宿主細胞または細胞集団のアルブミン遺伝子座に前記異種ポリペプチドをコードする核酸を挿入する、
前記方法。
［項目２］
宿主細胞または細胞集団のアルブミン遺伝子座由来の異種ポリペプチドを発現する方法であって、
ｉ）ｇＲＮＡであって、
ａ）配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、及び３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列、
ｂ）配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、及び３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチド、
ｃ）配列番号３４、４０、４５、５１、６０、６１、６３、６４、６５、６６、７２、７７、８３、９２、９３、９５、９６、及び９７からなる群から選択される配列、
ｄ）配列番号２～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列、
ｅ）配列番号２～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチド、
ｆ）配列番号３４～９７からなる群から選択される配列、ならびに
ｇ）配列番号２～３３について列挙されるゲノム座標の１５個の連続ヌクレオチド±１０個のヌクレオチドを含む配列
から選択される配列を含む、前記ｇＲＮＡと、
ｉｉ）ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤と、
ｉｉｉ）前記異種ポリペプチドのコード配列を含む構築物と、を投与することを含み、 それにより、前記宿主細胞または細胞集団において前記異種ポリペプチドを発現する、前記方法。
［項目３］
非分裂細胞型または細胞集団において治療用薬剤を発現する方法であって、
ｉ）ｇＲＮＡであって、
ａ）配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、及び３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列、
ｂ）配列番号２、８、１３、１９、２８、２９、３１、３２、及び３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチド、
ｃ）配列番号３４、４０、４５、５１、６０、６１、６３、６４、６５、６６、７２、７７、８３、９２、９３、９５、９６、及び９７からなる群から選択される配列、
ｄ）配列番号２～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列、
ｅ）配列番号２～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチド、
ｆ）配列番号３４～９７からなる群から選択される配列、ならびに
ｇ）配列番号２～３３について列挙されるゲノム座標の１５個の連続ヌクレオチド±１０個のヌクレオチドを含む配列
から選択される配列を含む、前記ｇＲＮＡと、
ｉｉ）ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤と、
ｉｉｉ）前記異種ポリペプチドのコード配列を含む構築物と、を投与することを含み、 それにより、前記非分裂細胞型または細胞集団において前記治療用薬剤を発現する、
前記方法。
［項目４］
前記ｇＲＮＡが、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、及び配列番号３３からなる群から選択されるガイド配列を含む、項目１～３のいずれか１項に記載の方法。
［項目５］
前記方法が、インビボで行われる、項目１～４のいずれかに記載の方法。
［項目６］
前記方法が、インビトロで行われる、項目１～４のいずれかに記載の方法。
［項目７］
前記ｇＲＮＡが、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の上流の領域と結合する、項目１～６のいずれか１項に記載の方法。
［項目８］
前記ＰＡＭが、ＮＧＧ、ＮＮＧＲＲＴ、ＮＮＧＲＲ（Ｎ）、ＮＮＡＧＡＡＷ、ＮＮＮＮＧ（Ａ／Ｃ）ＴＴ、及びＮＮＮＮＲＹＡＣから選択される、項目７に記載の方法。
［項目９］
前記ｇＲＮＡが、デュアルｇＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）である、項目１～８のいずれか１項に記載の方法。
［項目１０］
前記ｇＲＮＡが、シングルｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、項目１～８のいずれかに記載の方法。
［項目１１］
前記ｓｇＲＮＡが、１つ以上の修飾ヌクレオシドを含む、項目１０に記載の方法。
［項目１２］
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｃａｓ９またはＣａｓ９をコードする核酸である、項目１～１１のいずれか１項に記載の方法。
［項目１３］
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸である、項目１～１２のいずれか１項に記載の方法。
［項目１４］
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする前記核酸が、ｍＲＮＡである、項目１３に記載の方法。
［項目１５］
前記ｍＲＮＡが、修飾ｍＲＮＡである、項目１４に記載の方法。
［項目１６］
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｃａｓヌクレアーゼまたは前記Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸である、項目１～１５のいずれか１項に記載の方法。
［項目１７］
前記Ｃａｓヌクレアーゼが、クラス２のＣａｓヌクレアーゼである、項目１６に記載の方法。
［項目１８］
前記Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓヌクレアーゼ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓヌクレアーゼ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉヌクレアーゼ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓヌクレアーゼ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓヌクレアーゼ、及びそれらのバリアントからなる群から選択される、項目１６または１７に記載の方法。
［項目１９］
前記Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｃａｓ９である、項目１６～１８のいずれか１項に記載の方法。
［項目２０］
前記Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、項目１９に記載の方法。
［項目２１］
前記Ｃａｓヌクレアーゼが、部位特異的ＤＮＡ結合活性を有する、項目１６～２０のいずれか１項に記載の方法。
［項目２２］
前記Ｃａｓヌクレアーゼが、ニッカーゼである、項目１６～２１のいずれか１項に記載の方法。
［項目２３］
前記Ｃａｓヌクレアーゼが、クリベースである、項目１６～２１のいずれか１項に記載の方法。
［項目２４］
前記Ｃａｓヌクレアーゼが、ニッカーゼまたはクリベース活性を有しない、項目１９～２１のいずれか１項に記載の方法。
［項目２５］
前記核酸構築物が、相同性非依存性ドナー構築物である、項目１９～２４のいずれか１項に記載の方法。
［項目２６］
前記構築物が、双方向性核酸構築物である、項目１～２５のいずれか１項に記載の方法。
［項目２７］
前記構築物が、
ｉ．異種ポリペプチドのコード配列を含む第１のセグメント、及び
ｉｉ．前記異種ポリペプチドのコード配列の逆相補体を含む第２のセグメント
を含む、項目２６に記載の方法。
［項目２８］
前記構築物が、ポリアデニル化シグナル配列を含む、項目１～２７のいずれか１項に記載の方法。
［項目２９］
前記構築物が、スプライスアクセプター部位を含む、項目１～２８のいずれか１項に記載の方法。
［項目３０］
前記構築物が、相同性アームを含まない、項目１～２９のいずれか１項に記載の方法。［項目３１］
前記ｇＲＮＡが、ベクター及び／または脂質ナノ粒子で投与される、項目１～３０のいずれか１項に記載の方法。
［項目３２］
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、ベクター及び／または脂質ナノ粒子で投与される、項目１～３１のいずれか１項に記載の方法。
［項目３３］
前記異種遺伝子を含む前記構築物が、ベクター及び／または脂質ナノ粒子で投与される、項目１～３２のいずれか１項に記載の方法。
［項目３４］
前記ベクターが、ウイルスベクターである、項目３１～３３のいずれか１項に記載の方法。
［項目３５］
前記ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、及びレンチウイルスベクターからなる群から選択される、項目３４に記載の方法。
［項目３６］
前記ＡＡＶベクターが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．３２．３３、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ｒｈ１０、及びそれらのハイブリッドからなる群から選択される、項目３５に記載のベクター。［項目３７］
前記ｇＲＮＡ、前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、及び前記異種ポリペプチドのコード配列を含む前記構築物が、個々にまたは任意の組み合わせで、同時に投与される、項目１～３６のいずれか１項に記載の方法。
［項目３８］
前記ｇＲＮＡ、前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、及び前記異種ポリペプチドのコード配列を含む前記構築物が、任意の順序及び／または任意の組み合わせで逐次的に投与される、項目１～３６のいずれか１項に記載の方法。
［項目３９］
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、または組み合わせたＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤及びｇＲＮＡが、前記構築物を提供する前に投与される、項目１～３６及び３８のいずれか１項に記載の方法。
［項目４０］
前記異種ポリペプチドのコード配列を含む前記構築物が、前記ｇＲＮＡ及び／またはＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤の前に投与される、項目１～３６及び３８のいずれか１項に記載の方法。
［項目４１］
前記双方向性核酸構築物、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、及びｇＲＮＡが、任意の組み合わせで、互いに１時間以内に投与される、項目１～４０のいずれか１項に記載の方法。
［項目４２］
前記異種ポリペプチドが、分泌ポリペプチドである、項目１～４１のいずれか１項に記載の方法。
［項目４３］
前記遺異種ポリペプチドが、細胞内ポリペプチドである、項目１～４１のいずれか１項に記載の方法。
［項目４４］
前記細胞が、肝臓細胞である、項目１～４３のいずれか１項に記載の方法。
［項目４５］
前記肝臓細胞が、肝細胞である、項目４４に記載の方法。
［項目４６］
前記宿主細胞における前記異種ポリペプチドの発現が、前記ｇＲＮＡ、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤、及び前記異種ポリペプチドのコード配列を含む構築物を投与する前に、前記細胞におけるレベルに対して、少なくとも約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、またはそれ以上増加される、項目１～４５のいずれか１項に記載の方法。
［項目４７］
前記ｇＲＮＡが、配列番号３０１または配列番号３０２を含む、項目１～４６のいずれかに記載の方法。
［項目４８］
前記ｇＲＮＡが、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤による標的特異的切断を媒介し、アルブミン遺伝子のイントロン１内に前記異種ポリペプチドの前記コード配列の挿入をもたらす、項目１～４７のいずれか１項に記載の方法。
［項目４９］
前記切断が、前記細胞集団における異種核酸の少なくとも約２％、約５％、または約１０％の挿入速度をもたらす、項目１～４８のいずれか１項に記載の方法。
［項目５０］
前記切断が、前記異種ポリペプチドの前記コード配列の約３０～３５％、約３５～４０％、約４０～４５％、約４５～５０％、約５０～５５％、約５５～６０％、約６０～６５％、約６５～７０％、約７０～７５％、約７５～８０％、約８０～８５％、約８５～９０％、約９０～９５％、または約９５～９９％の挿入速度をもたらす、項目４９に記載の方法。
［項目５１］
ＲＮＡガイドＤＮＡ結合タンパク質が、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、項目１～５０のいずれか１項に記載の方法。
［項目５２］
前記ヌクレアーゼが、クリバーゼまたはニッカーゼである、項目５１に記載の方法。
［項目５３］
前記ｇＲＮＡを含むＬＮＰを投与することをさらに含む、項目１～５２のいずれか１項に記載の方法。
［項目５４］
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードするｍＲＮＡを含むＬＮＰを投与することをさらに含む、項目１～５３のいずれか１項に記載の方法。
［項目５５］
前記ＬＮＰが、前記ｇＲＮＡと、前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする前記ｍＲＮＡとを含む、項目５４に記載の方法。
［項目５６］
前記ｇＲＮＡ及び前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合タンパク質が、ＲＮＰとして投与される、項目１～５５のいずれか１項に記載の方法。
［項目５７］
前記構築物が、ベクターを介して投与される、項目５３～５６のいずれか１項に記載の方法。
［項目５８］
項目１～５７のいずれか１項に記載の方法によって作製される宿主細胞。
［項目５９］
宿主細胞のアルブミン遺伝子座のイントロン１内に組み込まれた異種ポリペプチドをコードする双方向性核酸構築物を含む宿主細胞。
［項目６０］
前記宿主細胞が、肝臓細胞である、項目５８または５９に記載の宿主細胞。
［項目６１］
前記肝臓細胞が、肝細胞である、項目５８～６０のいずれか１項に記載の宿主細胞。
［項目６２］
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤をコードする核酸である、項目１～６１のいずれか１項に記載の方法または宿主細胞。
［項目６３］
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｃａｓヌクレアーゼである、項目１～６２のいずれか１項に記載の方法または宿主細胞。
［項目６４］
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、Ｃａｓヌクレアーゼをコードする核酸である、項目１～６３のいずれか１項に記載の方法または宿主細胞。
［項目６５］
前記ＲＮＡガイドＤＮＡ結合剤が、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡである、項目１～６４のいずれか１項に記載の方法または宿主細胞。
［項目６６］
前記ｍＲＮＡが、修飾ｍＲＮＡである、項目６５に記載の方法または宿主細胞。
［項目６７］
前記Ｃａｓヌクレアーゼが、クラス２のＣａｓヌクレアーゼである、項目６３～６６のいずれか１項に記載の方法または宿主細胞。
［項目６８］
前記Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｃａｓ９である、項目６３～６７のいずれか１項に記載の方法または組成物。
［項目６９］
前記Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓヌクレアーゼ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓヌクレアーゼ、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉヌクレアーゼ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓヌクレアーゼ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓヌクレアーゼ、及びそれらのバリアントからなる群から選択される、項目６３～６８のいずれか１項に記載の方法または組成物。
［項目７０］
前記Ｃａｓヌクレアーゼが、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはそのバリアントである、項目６９に記載の方法または組成物。
［項目７１］
前記Ｃａｓヌクレアーゼが、部位特異的ＤＮＡ結合活性を有する、項目６３～７０のいずれか１項に記載の方法または組成物。
［項目７２］
前記Ｃａｓヌクレアーゼが、ニッカーゼである、項目６３～７１のいずれか１項に記載の方法または組成物。
［項目７３］
前記Ｃａｓヌクレアーゼが、クリベースである、項目６３～７２のいずれか１項に記載の方法または組成物。
［項目７４］
前記Ｃａｓヌクレアーゼが、ニッカーゼまたはクリベース活性を有しない、項目６３～７３のいずれか１項に記載の方法。
［項目７５］
異種ポリペプチド活性または異種ポリペプチドレベルの正常に対して少なくとも約１％、例えば、正常に対して少なくとも約５％を達成することをさらに含む、項目１～７４のいずれか１項に記載の方法。
［項目７６］
前記異種ポリペプチド活性または異種ポリペプチドレベルが、正常に対して約５００％未満である、項目１～７５のいずれか１項に記載の方法。
［項目７７］
異種ポリペプチド活性または異種ポリペプチドレベルの正常に対して少なくとも約１％～３００％を達成することをさらに含む、項目１～７６のいずれか１項に記載の方法。
［項目７８］
長期的な効果、例えば、個体において少なくとも１ヶ月、２ヶ月、６ヶ月、１年、または２年の効果を達成することをさらに含む、項目５～７７のいずれか１項に記載のインビボ方法。
［項目７９］
前記個体の循環アルブミンレベルが、前記核酸構築物の投与から少なくとも１ヶ月、２ヶ月、６ヶ月、または１年後に正常である、項目５～７８のいずれか１項に記載のインビボ方法。
［項目８０］
前記個体の循環アルブミンレベルが、前記双方向性核酸構築物の投与から４週間後で維持される、項目５～７９のいずれか１項に記載のインビボ方法。
［項目８１］
前記個体の循環アルブミンレベルが一時的に低下し、次いで、正常に戻る、項目５～８０のいずれか１項に記載のインビボ方法。
［項目８２］
前記ガイドＲＮＡが、配列番号２～３３からなる群から選択される配列の少なくとも１７、１８、１９、または２０個の連続ヌクレオチドを含む、項目１～８１のいずれか１項に記載の方法。
［項目８３］
前記ガイドＲＮＡが、配列番号２～３３からなる群から選択される配列と少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、または７５％同一である配列を含む、項目１～８２のいずれか１項に記載の方法。
［項目８４］
前記ガイドＲＮＡが、配列番号２～３３からなる群から選択される配列を含む、項目１～８３のいずれか１項に記載の方法。
［項目８５］
前記ガイドＲＮＡが、配列番号３０１または３０２を含む、項目１～８４のいずれか１項に記載の方法または宿主細胞。
［項目８６］
前記ガイドＲＮＡが、配列番号２の核酸配列を含む、項目１～８５のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
［項目８７］
前記ガイドＲＮＡが、配列番号３の核酸配列を含む、項目１～８６のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
［項目８８］
前記ガイドＲＮＡが、配列番号４の核酸配列を含む、項目１～８７のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
［項目８９］
前記ガイドＲＮＡが、配列番号５の核酸配列を含む、項目１～８８のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
［項目９０］
前記ガイドＲＮＡが、配列番号６の核酸配列を含む、項目１～８９のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
［項目９１］
前記ガイドＲＮＡが、配列番号７の核酸配列を含む、項目１～９０のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
［項目９２］
前記ガイドＲＮＡが、配列番号８の核酸配列を含む、項目１～９１のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
［項目９３］
前記ガイドＲＮＡが、配列番号９の核酸配列を含む、項目１～９２のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
［項目９４］
前記ガイドＲＮＡが、配列番号１０の核酸配列を含む、項目１～９３のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
［項目９５］
前記ガイドＲＮＡが、配列番号１１の核酸配列を含む、項目１～９４のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
［項目９６］
前記ガイドＲＮＡが、配列番号１２の核酸配列を含む、項目１～９５のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
［項目９７］
前記ガイドＲＮＡが、配列番号１３の核酸配列を含む、項目１～９６のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
［項目９８］
前記ガイドＲＮＡが、配列番号１４の核酸配列を含む、項目１～９７のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
［項目９９］
前記ガイドＲＮＡが、配列番号１５の核酸配列を含む、項目１～９８のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
［項目１００］
前記ガイドＲＮＡが、配列番号１６の核酸配列を含む、項目１～９９のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
［項目１０１］
前記ガイドＲＮＡが、配列番号１７の核酸配列を含む、項目１～１００のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
［項目１０２］
前記ガイドＲＮＡが、配列番号１８の核酸配列を含む、項目１～１０１のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
［項目１０３］
前記ガイドＲＮＡが、配列番号１９の核酸配列を含む、項目１～１０２のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
［項目１０４］
前記ガイドＲＮＡが、配列番号２０の核酸配列を含む、項目１～１０３のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
［項目１０５］
前記ガイドＲＮＡが、配列番号２１の核酸配列を含む、項目１～１０４のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
［項目１０６］
前記ガイドＲＮＡが、配列番号２２の核酸配列を含む、項目１～１０５のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
［項目１０７］
前記ガイドＲＮＡが、配列番号２３の核酸配列を含む、項目１～１０６のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
［項目１０８］
前記ガイドＲＮＡが、配列番号２４の核酸配列を含む、項目１～１０７のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
［項目１０９］
前記ガイドＲＮＡが、配列番号２５の核酸配列を含む、項目１～１０８のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
［項目１１０］
前記ガイドＲＮＡが、配列番号２６の核酸配列を含む、項目１～１０９のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
［項目１１１］
前記ガイドＲＮＡが、配列番号２７の核酸配列を含む、項目１～１１０のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
［項目１１２］
前記ガイドＲＮＡが、配列番号２８の核酸配列を含む、項目１～１１１のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
［項目１１３］
前記ガイドＲＮＡが、配列番号２９の核酸配列を含む、項目１～１１２のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
［項目１１４］
前記ガイドＲＮＡが、配列番号３０の核酸配列を含む、項目１～１１３のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
［項目１１５］
前記ガイドＲＮＡが、配列番号３１の核酸配列を含む、項目１～１１４のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
［項目１１６］
前記ガイドＲＮＡが、配列番号３２の核酸配列を含む、項目１～１１５のいずれか１項に記載の方法及び組成物。
［項目１１７］
前記ガイドＲＮＡが、配列番号３３の核酸配列を含む、項目１～１１６のいずれか１項に記載の方法及び組成物。

【実施例0218】

以下の実施例は、ある特定の開示された実施形態を例示するために提供され、本開示の範囲を決して限定するものとして解釈されるべきではない。

【0219】

実施例１－材料及び方法
クローニング及びプラスミド調製
ＡＡＶ２ ＩＴＲに隣接する双方向性挿入構築物を合成し、商業的ベンダーによってｐＵＣ５７－Ｋａｎにクローニングした。得られた構築物（Ｐ００１４７）を、他のベクターの親クローニングベクターとして使用した。他の挿入構築物（ＩＴＲを含まない）も商業的に合成し、ｐＵＣ５７にクローニングした。精製したプラスミドをＢｇｌＩＩ制限酵素（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ、カタログ番号Ｒ０１４４Ｓ）で消化し、挿入構築物を親ベクターにクローニングした。プラスミドをＳｔｂｌ３（商標）Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｃ７３７３０３）中で増殖させた。

【0220】

ＡＡＶ生成
ＨＥＫ２９３細胞におけるトリプルトランスフェクションを使用して、ＡＡＶ８及びＡＡＶ－ＤＪ生成のための目的の構築物と共にゲノムをパッケージングし、得られたベクターを、イオジキサノール勾配超遠心分離法により溶解細胞及び培養培地の両方から精製した（例えば、Ｌｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１０ Ｏｃｔ；２１（１０）：１２５９－７１を参照されたい）。目的の構築物を有するゲノムを含んだトリプルトランスフェクションで使用されるプラスミドは、実施例において「ＰＸＸＸＸ」数で参照され、例えば、表９も参照されたい。単離したＡＡＶを貯蔵緩衝液（０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８を含むＰＢＳ）中で透析した。ＩＴＲ領域内に位置するプライマー／プローブを使用して、ｑＰＣＲによってＡＡＶ力価を決定した。

【0221】

ヌクレアーゼｍＲＮＡのインビトロ転写（「ＩＶＴ」）
Ｎ１－メチルプソイド－Ｕを含むキャップされたポリアデニル化Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（「Ｓｐｙ」）Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを、直鎖状化プラスミドＤＮＡテンプレート及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用してインビトロ転写によって生成した。一般に、Ｔ７プロモーター及び１００ｎｔポリ（Ａ／Ｔ）領域を含むプラスミドＤＮＡを、３７℃でＸｂａＩと共にインキュベートし、消化を完了させ、続いて、６５℃でＸｂａＩの熱不活性化を完了させることによって直鎖状化した。直鎖状化プラスミドを、酵素及び緩衝塩から精製した。Ｃａｓ９修飾ｍＲＮＡを生成するためのＩＶＴ反応物を、３７℃で４時間、以下の条件でインキュベートした：５０ｎｇ／μＬの直鎖状化プラスミド、各２ｍＭのＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、及びＮ１－メチルシュードＵＴＰ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）、１０ｍＭのＡＲＣＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）、５Ｕ／μＬのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）、１Ｕ／μＬのマウスＲｎａｓｅ阻害剤（ＮＥＢ）、０．００４Ｕ／μＬの無機Ｅ．ｃｏｌｉピロホスファターゼ（ＮＥＢ、ならびに１倍反応緩衝液。ＴＵＲＢＯ Ｄｎａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を、最終濃度が０．０１Ｕ／μＬになるように添加し、反応物をさらに３０分間インキュベートしてＤＮＡテンプレートを除去した。ＭｅｇａＣｌｅａｒ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｌｅａｎ－ｕｐキットを使用し、製造者のプロトコル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に従って、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡを精製した。あるいは、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡをＬｉＣｌ沈殿、酢酸アンモニウム沈殿、及び酢酸ナトリウム沈殿を使用して、またはＬｉＣｌ沈殿法を使用して精製し、続いて、タンジェント流濾過によりさらなる精製を行った。転写物濃度を、２６０ｎｍでの光吸光度を測定することによって決定し（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）、転写物をＢｉｏａｎｌａｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）によるキャピラリー電気泳動によって分析した。

【0222】

以下のＣａｓ９ ｍＲＮＡは、Ｃａｓ９ ＯＲＦ配列番号７０３もしくは配列番号７０４、またはＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０５３４２３（参照により本明細書に組み込まれる）の表２４の配列を含む。

【0223】

Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡの送達のための脂質製剤
Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを、３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエノエート）とも呼ばれる、イオン性脂質（（９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノエート、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧを含む脂質製剤を利用して、細胞及び動物に送達した。

【0224】

予め混合された脂質製剤（本明細書では「脂質パケット」と称される）を利用する実験について、本明細書にさらに記載されるように、構成要素を、約６．０の脂質アミン対ＲＮＡリンホスフェート（Ｎ：Ｐ）モル比でＲＮＡカーゴ（例えばＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡ）と混合される前に、５０：３８：９：３のイオン性脂質：コレステロール：ＤＳＰＣ：ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧのモル比で、１００％エタノール中で再構成した。

【0225】

脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として製剤化された構成要素を利用する実験について、構成要素を、様々なモル比で、１００％エタノール中に希釈した。ＲＮＡカーゴ（例えば、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡ）を２５ｍＭのクエン酸塩、１００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．０）に溶解して、約０．４５ｍｇ／ｍＬのＲＮＡカーゴ濃度を得た。

【0226】

実施例２に記載される実験について、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（商標）Ｂｅｎｃｈｔｏｐ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを使用し、製造者のプロトコルに従って、脂質及びＲＮＡ溶液をマイクロ流体混合することによって、ＬＮＰを形成した。差動流量を使用して、混合中、水性溶媒対有機溶媒の２：１の比を維持した。混合後、ＬＮＰを収集し、水中に希釈し（約１：１ｖ／ｖ）、室温で１時間保持し、さらに水で希釈した（約１：１ｖ／ｖ）後、最終緩衝液交換を行った。５０ｍＭのＴｒｉｓ、４５ｍＭのＮａＣｌ、５％（ｗ／ｖ）のスクロース、ｐＨ７．５（ＴＳＳ）への最終緩衝液交換を、ＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ）を用いて完了した。必要な場合、Ａｍｉｃｏｎ １００ｋＤａ遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で遠心分離することによって、製剤を濃縮した。次いで、得られた混合物を０．２μｍの滅菌フィルターを使用して濾過した。最終ＬＮＰを、さらなる使用まで－８０℃で保存した。ＬＮＰを、約４．５の脂質アミン対ＲＮＡホスフェート（Ｎ：Ｐ）モル比、及び１：１のｇＲＮＡ対ｍＲＮＡの重量比で、４５：４４：９：２のイオン性脂質：コレステロール：ＤＳＰＣ：ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧのモル比で製剤化した。

【0227】

他の実施例に記載される実験について、クロスフロー技術を使用し、エタノール中の脂質を２体積のＲＮＡ溶液及び１体積の水と衝突噴流混合することによって、ＬＮＰを調製した。エタノール中の脂質を、混合交差部（ｍｉｘｉｎｇ ｃｒｏｓｓ）により、２体積のＲＮＡ溶液と混合した。第４の水の流れを、ライン内のティーを通る交差部の出口流と混合した（ＷＯ２０１６０１０８４０の図２を参照されたい）。ＬＮＰを室温で１時間保持し、さらに水で希釈した（約１：１ｖ／ｖ）。希釈したＬＮＰを、フラットシートカートリッジ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、１００ｋＤ ＭＷＣＯ）上でタンジェント流濾過を使用して濃縮し、次いで、透析濾過により、５０ｍＭのＴｒｉｓ、４５ｍＭのＮａＣｌ、５％（ｗ／ｖ）のスクロース、ｐＨ７．５（ＴＳＳ）へと緩衝液交換した。あるいは、ＴＳＳへの最終緩衝液交換をＰＤ－１０脱塩カラム（ＧＥ）を用いて完了した。必要な場合、Ａｍｉｃｏｎ １００ｋＤａ遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で遠心分離することによって、製剤を濃縮した。次いで、得られた混合物を０．２μｍの滅菌フィルターを使用して濾過した。最終ＬＮＰを、さらなる使用まで４℃または－８０℃で保存した。ＬＮＰを、約６．０の脂質アミン対ＲＮＡホスフェート（Ｎ：Ｐ）モル比、及び１：１のｇＲＮＡ対ｍＲＮＡの重量比で、５０：３８：９：３のイオン性脂質：コレステロール：ＤＳＰＣ：ＰＥＧ２ｋ－ＤＭＧのモル比で製剤化した。

【0228】

Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、及び挿入構築物の細胞培養及びインビトロ送達
Ｈｅｐａ１－６細胞
Ｈｅｐａ１－６細胞を、９６ウェルプレート中に１０，０００細胞／ウェルの密度で播種した。２４時間後、細胞をＬＮＰ及びＡＡＶで処理した。処理前に、培地をウェルから吸引した。ＬＮＰを、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地中で４ｎｇ／ｕｌに希釈し、さらに、１０％ＦＢＳ（ＤＭＥＭ中）中で２ｎｇ／ｕｌに希釈し、３７℃で１０分間（５％ＦＢＳの最終濃度で）インキュベートした。ＡＡＶの標的ＭＯＩは１ｅ６であり、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地中で希釈した。２ｎｇ／ｕｌで５０μｌの上記希釈ＬＮＰを細胞に添加し（合計１００ｎｇのＲＮＡカーゴを送達する）、続いて、５０μｌのＡＡＶを添加した。ＬＮＰ及びＡＡＶの処理は、数分間隔であった。細胞中の培地の総体積は１００μｌであった。処理後７２時間及び処理後３０日後、これらの処理した細胞からの上清を、以下に記載されるように、ヒトＦＩＸ ＥＬＩＳＡ分析のために収集した。

【0229】

初代肝細胞
初代マウス肝細胞（ＰＭＨ）、初代カニクイザル肝細胞（ＰＣＨ）、及び初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）を解凍し、追加物質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含む肝細胞解凍培地に再懸濁させ、続いて、遠心分離した。上清を廃棄し、ペレット化細胞を肝細胞播種培地及びサプリメントパック（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に再懸濁した。細胞を計数し、ＰＨＨについては３３，０００細胞／ウェル、ＰＣＨについては５０，０００細胞／ウェル、及びＰＭＨについては１５，０００細胞／ウェルの密度でＢｉｏ－ｃｏａｔ ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｉでコーティングした９６ウェルプレート上に播種した。播種した細胞を、３７℃及び５％ＣＯ_２雰囲気での組織培養インキュベーター中で５時間放置し、接着させた。インキュベーション後、細胞を単層形成について調べ、肝細胞維持で３回洗浄し、３７℃でインキュベートした。

【0230】

脂質パケット送達を利用する実験では、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを各々、維持培地中で２ｍｇ／ｍｌに別々に希釈し、各々の２．９μｌを、１２．５μｌの５０ｍＭクエン酸ナトリウム、２００ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ５）、及び６．９μｌの水を含むウェル（９６ウェルのＥｐｐｅｎｄｏｒｆプレート中）に添加した。次いで、１２．５μｌの脂質パケット製剤、続いて１２．５μｌの水、及び１５０μｌのＴＳＳを添加した。各ウェルを、肝細胞維持培地を使用して２０ｎｇ／μｌ（総ＲＮＡ含有量に関して）に希釈し、次いで、６％の新鮮なマウス血清で１０ｎｇ／μｌ（総ＲＮＡ含有量に関して）に希釈した。培地をトランスフェクションの前に細胞から吸引し、４０μｌの脂質パケット／ＲＮＡ混合物を細胞に添加し、続いて、ＡＡＶ（維持培地中で希釈した）を１ｅ５のＭＯＩで添加した。培地を、本明細書に記載されるように、分析のために処理後７２時間に収集し、細胞をさらなる分析のために採取した。

【0231】

ルシフェラーゼアッセイ
細胞培地におけるＮａｎｏＬｕｃ検出を伴う実験では、１体積のＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ基質を、５０体積のＮａｎｏ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイ緩衝液と組み合わせた。試料の１：１０希釈（５０μｌの試薬＋４０μｌの水＋１０μｌの細胞培地）を使用して、０．５秒の積分時間でＰｒｏｍｅｇａ Ｇｌｏｍａｘランナー上でアッセイを実行した。

【0232】

細胞培地中のＨｉＢｉｔタグの検出を伴う実験では、ＬｇＢｉＴタンパク質及びＮａｎｏ－ＧｌｏＲ ＨｉＢｉＴ細胞外基質を、室温のＮａｎｏ－ＧｌｏＲ ＨｉＢｉＴ細胞外緩衝液中で、それぞれ１：１００及び１：５０に希釈した。試料の１：１０希釈（５０μｌの試薬＋４０μｌの水＋１０μｌの細胞培地）を使用して、１．０秒の積分時間でＰｒｏｍｅｇａ Ｇｌｏｍａｘランナー上でアッセイを実行した。

【0233】

ＬＮＰ及び／またはＡＡＶのインビボ送達
マウスに、ＡＡＶ、ＬＮＰ、ＡＡＶ及びＬＮＰの両方、またはビヒクル（ＡＡＶビヒクルについてはＰＢＳ＋０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、ＬＮＰビヒクルについてはＴＳＳ）を、外側尾静脈を介して投与した。ＡＡＶを、本明細書に記載される量（ベクターゲノム／マウス、「ｖｇ／ｍｓ」）で、１匹あたり０．１ｍＬの体積で投与した。ＬＮＰをＴＳＳ中で希釈し、本明細書に示される量で、約５μｌ／グラム体重で投与した。典型的には、マウスに、まずＡＡＶを注射し、次いで、適用可能な場合、ＬＮＰを注射した。治療後の様々な時点で、以下にさらに説明されるように、ある特定の分析のために血清及び／または肝臓組織を収集した。

【0234】

ヒト第ＩＸ因子（ｈＦＩＸ）ＥＬＩＳＡ分析
インビトロ研究では、細胞培地中に分泌される総ヒト第ＩＸ因子レベルを、製造者のプロトコルに従って、ヒト第ＩＸ因子ＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ１８８３９３）を使用して決定した。分泌ｈＦＩＸレベルを、４パラメータロジスティックフィットを使用して標準曲線から定量化し、ｎｇ／ｍｌの培地として表した。

【0235】

インビボ研究では、血液を収集し、示されるようにして血清または血漿を単離した。総ヒト第ＩＸ因子レベルを、製造者のプロトコルに従って、ヒト第ＩＸ因子ＥＬＩＳＡキット（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ１８８３９３）を使用して決定した。血清または血漿ｈＦＩＸレベルを、４パラメータロジスティックフィットを使用して標準曲線から定量化し、μｇ／ｍＬの血清として表した。

【0236】

次世代シーケンシング（「ＮＧＳ」）及びオンターゲット切断効率の分析
ディープシーケンシングを利用して、遺伝子編集によって導入された挿入及び欠失（例えば、アルブミンのイントロン１内）の存在を同定した。標的部位の周りのＰＣＲプライマーを設計し、目的のゲノム領域を増幅した。プライマー配列設計は、この分野で標準的に行われているように実施した。

【0237】

シーケンシングのために必要な化学的性質を付加するために製造者のプロトコル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に従って追加のＰＣＲを行った。アンプリコンをＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ装置でシーケンシングした。低品質スコアを有する読み取り値を除去した後に、読み取り値を参照ゲノムにアラインメントした。読み取り値を含む得られたファイルを、参照ゲノムに対してマッピングし（ＢＡＭファイル）、目的の標的領域と重なり合った読み取り値を選択し、野生型の読み取り値の数対挿入または欠失（「インデル」）を含む読み取り値の数を計算した。

【0238】

編集パーセンテージ（例えば、「編集効率」または「編集率」）は、野生型を含む配列読み取り値の総数に対する、挿入または欠失（「インデル」）を含む配列読み取り値の総数として定義される。

【0239】

ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析
ＢａｓｅＳｃｏｐｅ（ＡＣＤｂｉｏ、Ｎｅｗａｒｋ，ＣＡ）は、例えば、挿入導入遺伝子（ｈＦＩＸ）及び挿入部位からのコード配列（アルブミンのエクソン１）を含むハイブリッドｍＲＮＡ転写産物において、エクソン接合部の特異的検出を提供することができる、特殊なＲＮＡ ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技術である。ＢａｓｅＳｃｏｐｅを使用して、ハイブリッドｍＲＮＡを発現する肝臓細胞のパーセンテージを測定した。

【0240】

ハイブリッドｍＲＮＡを検出するために、双方向性構築物の挿入後に生じ得るハイブリッドｍＲＮＡに対する２つのプローブを、ＡＣＤｂｉｏ（Ｎｅｗａｒｋ，ＣＡ）によって設計した。一方のプローブは、一方の配向での構築物の挿入から生じるハイブリッドｍＲＮＡを検出するように設計され、他方のプローブは、他方の配向での構築物の挿入から生じるハイブリッドｍＲＮＡを検出するように設計された。マウスの異なる群の肝臓を収集し、新鮮凍結して切片化した。製造者のプロトコルに従って、単一のプローブまたはプールされたプローブを使用して、ＢａｓｅＳｃｏｐｅアッセイを行った。スライドをスキャンし、ＨＡＬＯソフトウェアによって分析した。このアッセイの背景（生理食塩水処理群）は０．５８％であった。

【0241】

実施例２－相同性アームのあり及びなしのアルブミンのイントロン１の挿入テンプレートのインビトロ試験
この実施例では、Ｈｅｐａ１－６細胞を培養し、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びＧ０００５５１を送達するＬＮＰの存在下または不在下で、例えば、実施例１（ｎ＝３）に記載されるように、様々な形態のＡＡＶを有する挿入テンプレート（例えば、一本鎖ゲノム（「ｓｓＡＡＶ」）または自己相補性ゲノム（「ｓｃＡＡＶ」）のいずれかを有する）で処理した。ＡＡＶ及びＬＮＰを実施例１に記載されるように調製した。処理後、実施例１に記載されるように、培地をヒト第ＩＸ因子レベルについて収集した。

【0242】

Ｈｅｐａ１－６細胞は、培養物中で分裂し続ける不死化マウス肝臓細胞株である。図２（治療後７２時間の時点）に示されるように、２００ｂｐの相同性アームを含むベクター（プラスミドＰ００２０４に由来するｓｃＡＡＶ）は、例えば、周期細胞におけるアルブミンのイントロン１への挿入後に、ｈＦＩＸの検出可能な発現をもたらした。Ｐ００１２３（相同性アームを欠くｓｃＡＡＶ）及びＰ００１４７（相同性アームを欠くｓｓＡＡＶ双方向性構築物）に由来するＡＡＶベクターの使用は、この実験でｈＦＩＸの検出可能な発現をもたらさなかった。細胞を培養中に維持し、これらの結果は、処理後３０日で再アッセイしたときに確認された（データには示さず）。

【0243】

実施例３－相同性アームのあり及びなしのアルブミンのイントロン１の挿入テンプレートのインビボ試験
この実施例では、マウスを、実施例２でインビトロで試験されるのと同じプラスミド（Ｐ００１２３、Ｐ００２０４、及びＰ００１４７）に由来するＡＡＶで処置した。投与物質を調製し、実施例１に記載されるように投与した。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、各々、３ｅ１１ベクターゲノム（ｖｇ／ｍｓ）、続いてＧ０００５５１（「Ｇ５５１」）を含むＬＮＰを４ｍｇ／ｋｇの用量（総ＲＮＡカーゴ含有量に関して）で投与した（各群についてｎ＝５）。投与後４週間で、動物を安楽死させ、それぞれ、編集及びｈＦＩＸ発現のために、肝臓組織及び血清を収集した。

【0244】

図３Ａ及び表１２に示されるように、マウスアルブミンのイントロン１を標的とするｇＲＮＡを含むＬＮＰで処置した動物の各群において、約６０％の肝臓編集レベルを検出した。しかしながら、各処置群においてロバストで一貫したレベルの編集にもかかわらず、ＬＮＰ処置と組み合わせた相同性アームなしのｓｓＡＡＶベクター（Ｐ００１４７に由来するベクター）を受けている動物は、血清中で最高レベルのｈＦＩＸ発現をもたらした（図３Ｂ及び表１３）。
表１２：インデル％

表１３：第ＩＸ因子レベル（ｕｇ／ｍＬ）

【0245】

実施例４－相同性アームのあり及びなしのアルブミンのイントロン１のｓｓＡＡＶ挿入テンプレートのインビボ試験
この実施例に記載される実験では、インビボで相同性アームをｓｓＡＡＶベクターに組み込む効果を調査した。

【0246】

この実験で使用された投与物質を調製し、実施例１に記載されるように投与した。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、３ｅ１１ｖｇ／ｍｓ、続いてＧ０００６６６（「Ｇ６６６」）またはＧ０００５５１（「Ｇ５５１」）を含むＬＮＰを０．５ｍｇ／ｋｇの用量（総ＲＮＡカーゴ含有量に関して）で投与した（各群についてｎ＝５）。投与後４週間で、ｈＦＩＸ発現のために動物血清を収集した。

【0247】

図４Ａ及び表１４に示されるように、Ｇ５５１によって標的化されるアルブミンイントロン１部位への挿入のための、非対称相同性アーム（それぞれ、プラスミドＰ００３５０、Ｐ００３５６、及びＰ００３６２に由来するベクターについては、３００／６００ｂｐアーム、３００／２０００ｂｐアーム、及び３００／１５００ｂｐアーム）を有するｓｓＡＡＶベクターの使用により、アッセイのための検出下限を下回った循環ｈＦＩＸのレベルが得られた。しかしながら、相同性アームなしで、かつ２つのｈＦＩＸオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を双方向配向で有するｓｓＡＡＶベクター（Ｐ００１４７に由来する）の使用により、各動物における循環ｈＦＩＸの検出可能なレベルが得られた。

【0248】

同様に、Ｇ６６６によって標的化されるアルブミンイントロン１部位への挿入のための、対称相同性アームを有するｓｓＡＡＶベクター（それぞれ、プラスミドＰ００３５３及びＰ００３５４に由来する）の使用により、相同性アームなしの双方向性ベクター（Ｐ００１４７に由来する）の使用と比較して、より低いが検出可能なレベルが得られた（図４Ｂ及び表１５を参照されたい）。
表１４：ｈＦＩＸ

表１５：ｈＦＩＸ血清レベル

【0249】

実施例５－初代マウス肝細胞におけるアルブミンのイントロン１での２０個の標的部位にわたる双方向性構築物のインビトロスクリーニング
相同性アームを欠く双方向性構築物が、アルブミンのイントロン１への挿入について他の配置を有するベクターを上回ることを実証したことにより、この実施例に記載される実験は、スプライスアクセプターを改変する効果を調査した。これらの多様な双方向性構築物を、初代マウス肝細胞（ＰＭＨ）におけるマウスアルブミンのイントロン１を標的とする２０個の異なるｇＲＮＡを利用して、標的部位のパネルにわたって試験した。

【0250】

この実施例で試験したｓｓＡＡＶ及び脂質パケット送達物質を調製し、実施例１に記載されるようにＰＭＨに送達し、１ｅ５のＭＯＩでＡＡＶと共に行った。処理後、単離されたゲノムＤＮＡ及び細胞培地を、それぞれ編集及び導入遺伝子発現分析のために収集した。ベクターの各々は、実施例１に記載されるように、ルシフェラーゼに基づく蛍光検出により測定することができるレポーターを含み、図５Ｃに相対ルシフェラーゼユニット（「ＲＬＵ」）としてプロットした。例えば、ｈＦＩＸ ＯＲＦを含むＡＡＶベクターは、それらの３’末端で融合したＨｉＢｉｔペプチドを含み、レポーター遺伝子のみを含むＡＡＶベクターは、ＮａｎｏＬｕｃ ＯＲＦを含んでいた（ＧＦＰに加えて）。試験したベクターの各々の概略図を図５Ａに提供する。試験したｇＲＮＡを、表５に列挙されるものについて短縮された数を使用して、図５Ｂ及び図５Ｃに示す（例えば、先頭のゼロが省略されている、例えば、「Ｇ５５１」は表５の「Ｇ０００５５１」に対応する）。

【0251】

図５Ｂ及び表１６に示されるように、試験した各組み合わせにわたって、処置群の各々について、一貫しているが様々なレベルの編集を検出した。テンプレート及びガイドＲＮＡの様々な組み合わせを使用する導入遺伝子発現を図５Ｃに示す。図５Ｄに示されるように、有意なレベルのインデル形成は、必ずしも導入遺伝子のより効率的な発現をもたらすものではなかった。著しいインデルで生成したすべてのガイドが、相対ルシフェラーゼ活性によって測定したものと同じ挿入テンプレートを有する高レベルのタンパク質をもたらしたわけではない。Ｐ００４１１由来テンプレート及びＰ００４１８由来テンプレートを使用して、１０％未満の編集を含むガイドが含まれない場合、Ｒ^２値は、それぞれインデルとルシフェラーゼ活性との間で０．５４及び０．３７であった（図５Ｄ）。興味深いことに、異なるＯＲＦ及びスプライスアクセプターにもかかわらず、ＲＬＵで測定される相対的な発現レベルは、試験された３つのベクター間で一貫しており、例えば、アルブミンのイントロン１への目的の導入遺伝子の挿入における使用のための、双方向性構築物系のロバスト性、再現性、及びモジュール性を実証した（図５Ｃ及び表１７を参照されたい）。マウスアルブミンスプライスアクセプター及びヒトＦＩＸスプライスアクセプターは、各々、有効な導入遺伝子発現をもたらした。
表１６：インデル％

表１７：ルシフェラーゼ発現

【0252】

実施例６－アルブミンイントロン１標的部位にわたる双方向性構築物のインビボスクリーニング
この実施例で試験したｓｓＡＡＶ及びＬＮＰを調製し、実施例１に記載されるようにＣ５７Ｂｌ／６マウスに送達して、インビボで標的部位にわたる双方向性構築物の性能を評価した。投与後４週間で、動物を安楽死させ、それぞれ、編集及びｈＦＩＸ発現のために、肝臓組織及び血清を収集した。

【0253】

初期実験では、アルブミンのイントロン１を標的とする１０個の異なるｇＲＮＡを含む１０個の異なるＬＮＰ製剤を、Ｐ００１４７に由来するｓｓＡＡＶと共にマウスに送達した。ＡＡＶ及びＬＮＰを、それぞれ、３ｅ１１ｖｇ／ｍｓ及び４ｍｇ／ｋｇ（総ＲＮＡカーゴ含有量に関して）で送達した（各群についてｎ＝５）。この実験で試験したｇＲＮＡを図６に示す。図６及び表１８に示され、インビトロで観察されるように、有意なレベルのインデル形成は、導入遺伝子の挿入または発現について予測的でなかった。
表１８：ｈＦＩＸ血清レベル及びインデル％

【0254】

別の実験では、実施例５においてインビトロ試験した２０個の異なる標的部位を標的とする２０個のｇＲＮＡのパネルをインビボで試験した。この目的のために、アルブミンのイントロン１を標的とする２０個のｇＲＮＡを含むＬＮＰ製剤を、Ｐ００１４７に由来するｓｓＡＡＶと共にマウスに送達した。ＡＡＶ及びＬＮＰを、それぞれ、３ｅ１１ｖｇ／ｍｓ及び１ｍｇ／ｋｇ（総ＲＮＡカーゴ含有量に関して）で送達した。この実験で試験したｇＲＮＡを図７Ａ及び図７Ｂに示す。
表１９ 肝臓における編集

表２０：血清ｈＦＩＸレベル

【0255】

図７Ａ及び表１９に示されるように、試験した各ＬＮＰ／ベクターの組み合わせにわたって、処置群の各々について、様々なレベルの編集を検出した。しかしながら、図７Ｂに示され、実施例５に記載されるインビトロデータと一致するように、より高いレベルの編集は、必ずしもインビボで導入遺伝子のより高いレベルの発現をもたらしたわけではなく、双方向性構築物の編集と挿入／発現との間の相関性の欠如を示す。実際、達成された編集の量と、図７Ｄ及び表２０に提供されるプロットで見られるｈＦＩＸ発現の量との間には、ほとんど相関が存在しない。特に、１０％未満の編集を達成するｇＲＮＡが分析から除去されるとき、この実験の編集データセットと発現データセットとの間で０．３４のみのＲ^２値を計算する。興味深いことに、図７Ｃに示されるように、実施例５のインビトロ実験からＲＬＵで測定される発現のレベルを、この実験で検出されたインビボでの導入遺伝子発現レベルと比較する相関プロットが提供され、Ｒ^２値は０．７０であり、初代細胞スクリーニングとインビボ治療との間の正の相関を実証する。

【0256】

細胞レベルでの双方向性構築物の挿入を評価するために、処置された動物由来の肝臓組織を、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法（ＢａｓｅＳｃｏｐｅ）を使用して、例えば、実施例１に記載されるようにアッセイした。このアッセイは、ｈＦＩＸ導入遺伝子とマウスアルブミンエクソン１配列との間の接合部を検出することができるプローブをハイブリッド転写産物として利用した。図８Ａに示されるように、ハイブリッド転写産物に対して陽性の細胞を、ＡＡＶ及びＬＮＰの両方を受けた動物において検出した。具体的には、ＡＡＶのみを投与する場合、１．０％未満の細胞がハイブリッド転写産物に対して陽性であった。Ｇ０１１７２３、Ｇ０００５５１、またはＧ０００６６６を含むＬＮＰの投与では、４．９％、１９．８％、または５２．３％の細胞がハイブリッド転写産物に対して陽性であった。さらに、図８Ｂに示されるように、循環ｈＦＩＸレベルは、ハイブリッド転写産物に対して陽性であった細胞の数と相関していた。最後に、アッセイは、いずれかの配向での双方向性ｈＦＩＸ構築物の挿入を検出することができるプールされたプローブを利用した。しかしながら、単一の配向のみを検出する単一のプローブを使用した場合、ハイブリッド転写産物に対して陽性であった細胞の量は、プールされたプローブを使用して検出された細胞の約半分であり（一実施例では、４．４６％対９．６８％）、双方向性構築物がいずれの配向でもアルブミンのイントロン１へ挿入することが実際に可能であり、タンパク質レベルでの導入遺伝子発現の量と相関する発現されたハイブリッド転写産物をもたらすことを示唆している。これらのデータは、達成された循環タンパク質レベルが挿入に使用されるガイドに依存していることを示す。

【0257】

実施例７－インビボでのＡＡＶ及びＬＮＰ送達のタイミング
この実施例では、アルブミンのイントロン１への標的挿入のための双方向性ｈＦＩＸ構築物を含むｓｓＡＡＶの送達とＬＮＰの送達との間のタイミングを調査した。

【0258】

この実施例で試験したｓｓＡＡＶ及びＬＮＰを調製し、実施例１に記載されるようにマウスに送達した。ＬＮＰ製剤は、Ｇ０００５５１を含み、双方向性テンプレートは、Ｐ００１４７に由来するｓｓＡＡＶとして送達した。ＡＡＶ及びＬＮＰを、それぞれ、３ｅ１１ｖｇ／ｍｓ及び４ｍｇ／ｋｇ（総ＲＮＡカーゴ含有量に関して）で送達した（各群についてｎ＝５）。「テンプレートのみ」コホートはＡＡＶのみを受け、「ＰＢＳ」コホートはＡＡＶまたはＬＮＰを受けなかった。１つのコホートは、０日目にＡＡＶ及びＬＮＰを順次（数分間隔で）受け（「テンプレート＋ＬＮＰ ０日目」）、別のコホートは、０日目にＡＡＶを受け、１日目にＬＮＰを受け（「テンプレート＋ＬＮＰ １日目」）、最終コホートは、０日目にＡＡＶを受け、７日目にＬＮＰを受けた（「テンプレート＋ＬＮＰ ７日目」）。１週間、２週間、及び６週間で、ｈＦＩＸ発現分析のために血漿を収集した。

【0259】

図９に示されるように、ｈＦＩＸは、ＡＡＶ送達後１週目に同じ日にＬＮＰを受けたコホートの１週間の時点を除いて、アッセイされた各時間に各コホートにおいて検出された。

【0260】

実施例８－ＡＡＶの送達後のＬＮＰの複数回投与
この実施例では、アルブミンのイントロン１への標的挿入のためのｓｓＡＡＶの投与後のＬＮＰの反復投与の効果を調査した。

【0261】

この実施例で試験したｓｓＡＡＶ及びＬＮＰを調製し、実施例１に記載されるようにＣ５７Ｂｌ／６マウスに送達した。ＬＮＰ製剤は、Ｇ０００５５１を含み、ｓｓＡＡＶは、Ｐ００１４７に由来した。ＡＡＶ及びＬＮＰを、それぞれ、３ｅ１１ｖｇ／ｍｓ及び０．５ｍｇ／ｋｇ（総ＲＮＡカーゴ含有量に関して）で送達した（各群についてｎ＝５）。「テンプレートのみ」コホートはＡＡＶのみを受け、「ＰＢＳ」コホートはＡＡＶまたはＬＮＰを受けなかった。１つのコホートは、さらなる処置なしで０日目にＡＡＶ及びＬＮＰを順次（数分間隔で）受け（図１０では「テンプレート＋ＬＮＰ（１回）」）、別のコホートは、０日目にＡＡＶ及びＬＮＰを順次（数分間隔で）受け、７日目に２回目の用量を受け（図１０では「テンプレート＋ＬＮＰ（２回）」）、最終コホートは、０日目にＡＡＶ及びＬＮＰを順次（数分間隔で）受け、７日目にＬＮＰの２回目の用量及び１４日目にＬＮＰの３回目の用量を受けた（図１０では「テンプレート＋ＬＮＰ（３回）」）。ＡＡＶの投与後１、２、４、及び６週間で、ｈＦＩＸ発現分析のために血漿を収集した。

【0262】

図１０に示されるように、ｈＦＩＸは、アッセイされた各時間に各コホートにおいて検出され、複数の後続用量のＬＮＰは、ｈＦＩＸ発現の量を著しく増加させなかった。

【0263】

実施例９－インビボでのｈＦＩＸ発現の耐久性
この実施例では、処置された動物における経時的なアルブミンのイントロン１への標的挿入後のｈＦＩＸ発現の耐久性を評価した。この目的のために、１年間の耐久性研究の一部として、処置された動物の血清においてｈＦＩＸを測定した。

【0264】

この実施例で試験したｓｓＡＡＶ及びＬＮＰを調製し、実施例１に記載されるようにＣ５７Ｂｌ／６マウスに送達した。ＬＮＰ製剤は、Ｇ０００５５１を含み、ｓｓＡＡＶは、Ｐ００１４７に由来した。ＡＡＶを３ｅ１１ｖｇ／ｍｓで送達し、ＬＮＰを０．２５または１．０ｍｇ／ｋｇ（総ＲＮＡカーゴ含有量に関して）のいずれかで送達した（各群についてｎ＝５）。

【0265】

図１１Ａ及び図１１Ｂならびに表２１及び２２に示されるように、アルブミンのイントロン１からのｈＦＩＸ発現を、両群について評価した各時点で１２週間まで維持した。８週間で観察されるレベルの低下は、ＥＬＩＳＡアッセイの変動性に起因すると考えられる。ＥＬＩＳＡにより２週目及び４１週目に血清アルブミンレベルを測定し、研究全体にわたって循環アルブミンレベルが維持されることを示した。
表２１：ＦＩＸレベル

表２２：ｈＦＩＸレベル

【0266】

実施例１０－インビボでｈＦＩＸ発現を調節するための様々な用量のＡＡＶ及びＬＮＰの効果
この実施例では、アルブミンのイントロン１への標的挿入後のｈＦＩＸの発現を調節するためのＡＡＶ及びＬＮＰの両方の用量を変化させる効果をＣ５７Ｂｌ／６マウスにおいて評価した。

【0267】

この実施例で試験したｓｓＡＡＶ及びＬＮＰを調製し、実施例１に記載されるようにマウスに送達した。ＬＮＰ製剤は、Ｇ０００５５３を含み、ｓｓＡＡＶは、Ｐ００１４７に由来した。ＡＡＶを１ｅ１１、３ｅ１１、１ｅ１２、または３ｅ１２ｖｇ／ｍｓで送達し、ＬＮＰを０．１、０．３、または１．０ｍｇ／ｋｇ（総ＲＮＡカーゴ含有量に関して）で送達した（各群についてｎ＝５）。投与後２週間で、動物を安楽死させ、血清をｈＦＩＸ発現分析のために収集した。

【0268】

図１２Ａ（１週間）及び図１２Ｂ（２週間）ならびに表２３に示されるように、ＡＡＶまたはＬＮＰのいずれかの用量を変化させることにより、インビボでのアルブミンのイントロン１からのｈＦＩＸの発現の量を調節することができる。
表２３：血清ｈＦＩＸ

【0269】

実施例１１－初代カニクイザル及び初代ヒト肝細胞における標的部位にわたる双方向性構築物のインビトロスクリーニング
この実施例では、双方向性構築物を含むｓｓＡＡＶベクターを、それぞれ、初代カニクイザル（ＰＣＨ）及び初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）におけるカニクイザル（「ｃｙｎｏ」）及びヒトアルブミンのイントロン１を標的とするｇＲＮＡを利用して、標的部位のパネルにわたって試験した。

【0270】

この実施例で試験したｓｓＡＡＶ及び脂質パケット送達物質を調製し、実施例１に記載されるようにＰＣＨ及びＰＨＨに送達した。処理後、単離されたゲノムＤＮＡ及び細胞培地を、それぞれ編集及び導入遺伝子発現分析のために収集した。ベクターの各々は、実施例１に記載されるように、ルシフェラーゼに基づく蛍光検出により測定することができるレポーターを含み（プラスミドＰ００４１５に由来）、図１３Ｂ及び図１４Ｂに相対ルシフェラーゼユニット（「ＲＬＵ」）としてプロットした。図１３Ｂ及び１４Ｂに図表で示されるＲＬＵデータは、以下の表３及び表４に数値的に再現される。例えば、ＡＡＶベクターは、ＮａｎｏＬｕｃ ＯＲＦを含んでいた（ＧＦＰに加えて）。試験したベクターの概略図を図１３Ｂ及び図１４Ｂに提供する。試験したｇＲＮＡを、表１及び表３に列挙されるものについて短縮した数を使用して図の各々に示す。

【0271】

ＰＣＨについては図１３Ａ、及びＰＨＨについては図１４Ａに示されるように、試験した組み合わせの各々について様々なレベルの編集を検出した（ＰＣＨ実験で試験したいくつかの組み合わせについての編集データは、アンプリコンに基づくシーケンシングに使用したある特定のプライマー対の不良に起因して図１３Ａ及び表３に報告されない）。図１３Ａ及び１４Ａに図表で示される編集データは、以下の表３及び表４に数値的に再現される。しかしながら、図１３Ｂ、図１３Ｃ、ならびに図１４Ｂ及び図１４Ｃに示されるように、導入遺伝子の挿入または発現について有意なレベルのインデル形成は予測的ではなく、それぞれ、ＰＣＨ及びＰＨＨにおける双方向性構築物の編集と挿入／発現との間の相関がほとんどないことを示している。一尺度として、図１３Ｃで算出したＲ^２値は０．１３であり、図１４ＤのＲ^２値は０．２２である。
表３：初代カニクイザル肝細胞に送達されたｓｇＲＮＡについてのアルブミンイントロン１編集及び導入遺伝子発現データ

表４：初代ヒト肝細胞に送達されたｓｇＲＮＡについてのアルブミンイントロン１編集及び導入遺伝子発現データ

【0272】

加えて、双方向性構築物を含むｓｓＡＡＶベクターを、初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）におけるヒトアルブミンのイントロン１を標的とする単一ガイドＲＮＡを利用して、標的部位のパネルにわたって試験した。

【0273】

ｓｓＡＡＶ及びＬＮＰ物質を調製し、実施例１に記載されるようにＰＨＨに送達した。処理後、単離されたゲノムＤＮＡ及び細胞培地を、それぞれ編集及び導入遺伝子発現分析のために収集した。ベクターの各々は、実施例１に記載されるように、ルシフェラーゼに基づく蛍光検出により測定することができるレポーターを含み（プラスミドＰ００４１５に由来）、図１４Ｄにプロットし、表２４に相対ルシフェラーゼユニット（「ＲＬＵ」）として示した。例えば、ＡＡＶベクターは、ＮａｎｏＬｕｃ ＯＲＦを含んでいた（ＧＦＰに加えて）。試験したベクターの概略図を図１３Ｂ及び図１４Ｂに提供する。試験したｇＲＮＡを、表１及び表７に列挙されるものについて短縮した数を使用して図１４Ｄに示す。
表２４：初代カニクイザル肝細胞に送達されたｓｇＲＮＡについてのアルブミンイントロン１導入遺伝子発現データ

【0274】

実施例１２－非ヒト霊長類におけるヒト第９因子遺伝子挿入のインビボ試験
この実施例では、様々なガイドを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）及び／または脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の投与によるカニクイザルにおけるヒト第９因子遺伝子挿入及びｈＦＩＸタンパク質発現を評価するために、８週間の研究を行った。この研究は、上述のように調製されたＬＮＰ製剤及びＡＡＶ製剤で実施された。各ＬＮＰ製剤は、２：１のｍＲＮＡ：ｇＲＮＡの重量比で、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含んでいた。ｓｓＡＡＶは、Ｐ００１４７に由来した。

【0275】

雄のカニクイザルをｎ＝３のコホートで処置した。動物に、表５に記載される用量でのゆっくりとしたボーラス注射または注入によってＡＡＶを投与した。ＡＡＶ処置後、動物は、ゆっくりとしたボーラスまたは注入によって、表５に記載されるように緩衝液またはＬＮＰを受けた。

【0276】

投与後２週間で、単一の超音波ガイド下経皮生検により肝臓検体を収集した。各生検検体を液体窒素中でフラッシュ凍結し、－８６～－６０℃で保存した。前述のように、肝臓検体の編集分析をＮＧＳシーケンシングによって行った。

【0277】

第ＩＸ因子ＥＬＩＳＡ分析のために、投与後７日目、１４日目、２８日目、及び５６日目に動物から血液試料を収集した。採血後、血液試料を収集し、血漿に処理し、分析まで－８６～－６０℃で保存した。

【0278】

ＥＬＩＳＡにより、全ヒト第ＩＸ因子レベルを血漿試料から決定した。簡潔には、Ｒｅａｃｔｉ－Ｂｉｎｄ９６ウェルマイクロプレート（ＶＷＲカタログ番号ＰＩ１５０４１）を、１μｇ／ｍｌの濃度で捕捉抗体（ヒト第ＩＸ因子抗体に対するマウスｍＡＢ（ＨＴＩ、カタログ番号ＡＨＩＸ－５０４１））でコーティングし、次いで、５％ウシ血清アルブミンを含む１倍ＰＢＳを使用してブロックした。次に、カニクイザル血漿中で希釈した精製ヒト第ＩＸ因子タンパク質（ＥＲＬ、カタログ番号ＨＦＩＸ１００９、ロット番号ＨＦＩＸ４８４０）の試験試料または標準物を、個々のウェル中でインキュベートした。検出抗体（ヒツジ抗ヒト第９因子ポリクローナル抗体、Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ１２８０４８）を１００ｎｇ／ｍｌの濃度で吸着した。二次抗体（ＨＲＰを有するロバ抗ヒツジＩｇＧ ｐＡｂ、Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ９７１２５）を１００ｎｇ／ｍＬで使用した。ＴＭＢ基質試薬セット（ＢＤ ＯｐｔＥＩＡカタログ番号５５５２１４）を使用してプレートを現像した。光学密度を、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ ｉ３システム）上で、４５０ｎｍで分光光度的に評価し、ＳｏｆｔＭａｘ ｐｒｏ ６．４を使用して分析した。

【0279】

インデル形成が検出され、編集が生じたことを確認した。ＮＧＳデータは、効果的なインデル形成を示した。ＮＨＰにおけるアルブミン遺伝子座からのｈＦＩＸの発現を、ＥＬＩＳＡによって測定し、表６及び図１５に示す。ｈＦＩＸの血漿レベルは、治療的に有効であると以前に記載されたレベルに達した（Ｇｅｏｒｇｅ，ｅｔ ａｌ．，ＮＥＪＭ ３７７（２３），２２１５－２７，２０１７）。

【0280】

測定されるように、循環ｈＦＩＸタンパク質レベルを、８週間の研究にわたって維持し（それぞれ、７日目、１４日目、２８日目、及び５６日目の約１３５、約１４０、約１５０、及び約１１０ｎｇ／ｍＬの平均レベルを示す図１５を参照されたい）、約７５ｎｇ／ｍＬ～約２５０ｎｇ／ｍＬの範囲のタンパク質レベルを達成した。Ｒ３３８Ｌ機能亢進型ｈＦＩＸバリアントについて約８倍高い特異的活性を使用して、血漿ｈＦＩＸレベルを計算した（Ｓｉｍｉｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，ＮＥＪＭ ３６１（１７），１６７１－７５，２００９）（１ミリグラムあたり３９０±２８ＵのｈＦＩＸ－Ｒ３３８Ｌのタンパク質特異的活性及び１ミリグラムあたり４５±２．４Ｕの野生型第ＩＸ因子に対するタンパク質特異的活性を報告する）。この実施例で試験した機能亢進型第ＩＸ因子バリアントの機能的に正規化された第ＩＸ因子活性を計算すると、実験は、野生型第ＩＸ因子活性の約２０～４０％に対応する８週間の研究にわたるＮＨＰにおける安定したレベルのヒト第ＩＸ因子タンパク質を達成した（野生型第ＩＸ因子活性の１２～６７％に及ぶ範囲）。
表５：肝臓における編集

表６：ｈＦＩＸ発現

【0281】

実施例１３ 非ヒト霊長類における第９因子挿入のインビボ試験
この実施例では、Ｐ００１４７に由来するｓｓＡＡＶ及び／またはＧ００９８６０を含む様々なガイド及び様々なＬＮＰ成分を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の投与後の、カニクイザルにおける第９因子遺伝子挿入及びｈＦＩＸタンパク質発現を評価するための研究を行った。

【0282】

インデル形成をＮＧＳによって測定し、編集が生じたことを確認した。実施例１２に記載されるように、ヒト第ＩＸ因子抗体（ＨＴＩ、カタログ番号ＡＨＩＸ－５０４１）、ヒツジ抗ヒト第９因子ポリクローナル抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ１２８０４８）、及びＨＲＰを有するロバ抗ヒツジＩｇＧ ｐＡｂ（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ９７１２５）に対するマウスｍＡＢを使用して、ＥＬＩＳＡによって、総ヒト第ＩＸ因子レベルを血漿試料から決定した。実施例１２の実験で達成されたものよりも３倍超高いヒトＦＩＸタンパク質レベルを、代替のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ＬＮＰを使用して双方向性テンプレートから得た。この研究では、ＥＬＩＳＡアッセイ結果は、ヒトＦＩＸレベルの正常範囲（３～５ｕｇ／ｍＬ、Ａｍｉｒａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３０（９），１５１２－１６，１９８４）以上の循環ｈＦＩＸタンパク質レベルが、少なくとも１４日目及び２８日目の時点までにＮＨＰ中でＧ００９８６０を使用して達成されたことを示す。初期データは、単回用量後１４日目に約３～４μｇ／ｍＬの循環ヒトＦＩＸタンパク質レベルを示し、レベル（約３～５μｇ／ｍＬ）が研究の最初の２８日にわたって維持される。ヒトＦＩＸレベルを、同一方法によって研究の終了時に測定し、データを表２５に表す。
表２５：実施例１３の血清ヒト第ＩＸ因子タンパク質レベル－ＥＬＩＳＡ方法

【0283】

ＥＬＩＳＡにより循環アルブミンレベルを測定し、ベースラインのアルブミンレベルが２８日の時点で維持されることを示した。研究において、未処置動物における試験されたアルブミンレベルは、±約１５％変化した。処置された動物において、循環アルブミンレベルはわずかに変化し、正常範囲から落ちることなく、レベルは１ヶ月以内にベースラインに回復した。

【0284】

また、より大きなダイナミックレンジを有するサンドイッチ免疫アッセイによって、循環ヒトＦＩＸタンパク質レベルを決定した。簡潔には、ＭＳＤ ＧＯＬＤ ９６ウェルＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ＳＥＣＴＯＲ Ｐｌａｔｅ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、カタログ番号Ｌ１５ＳＡ－１）を、１％ＥＣＬブロッキング剤（Ｓｉｇｍａ、ＧＥＲＰＮ２１２５）でブロッキングした。ブロッキング溶液をタッピングして除いた後、ビオチン化捕捉抗体（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１１５０３－Ｒ０４４）をプレート上に固定した。組換えヒトＦＩＸタンパク質（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＨＦＩＸ１００９）を使用して、０．５％ＥＣＬブロッキング剤中の較正標準物質を調製した。洗浄後、較正標準物質及び血漿試料をプレートに添加し、インキュベートした。洗浄後、スルホタグ標識と複合体化した検出抗体（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＡＨＩＸ－５０４１）をウェルに添加し、インキュベートした。あらゆる非結合検出抗体を洗い流した後、リードバッファーＴをウェルに適用した。いかなる追加のインキュベーションもなく、プレートをＭＳＤ Ｑｕｉｃｋ Ｐｌｅｘ ＳＱ１２０機器で撮像し、データをＤｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ ４．０ソフトウェアパッケージ（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）で分析した。濃度は、平均計算濃度としてｕｇ／ｍで表される。試料については、アスタリスクで示されない限り、Ｎ＝３であり、アスタリスクで示される場合はＮ＝２である。ＭＳＤ ＥＬＩＳＡによって測定した場合の、処置した研究群におけるアルブミン遺伝子座からのｈＦＩＸの発現を表２６に示す。
表２６：血清ヒト第ＩＸ因子タンパク質レベル

【0285】

実施例１４ アルブミンヒトガイドのオフターゲット分析
生化学的方法（例えば、Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ．６，６００－６０６；２０１７を参照されたい）を使用して、アルブミンを標的とするＣａｓ９によって切断される潜在的なオフターゲットゲノム部位を決定した。この実験では、ヒトアルブミンを標的とする１３個のｓｇＲＮＡと、既知のオフターゲットプロファイルを有する２個の対照ガイドを、単離されたＨＥＫ２９３ゲノムＤＮＡを使用してスクリーニングした。生化学アッセイにおいて１６ｎＭのガイド濃度を使用して検出される潜在的なオフターゲット部位の数を表２７に示した。このアッセイは、試験したｓｇＲＮＡについての潜在的なオフターゲット部位を特定した。
表２７：オフターゲット分析

【0286】

上記で使用される生化学的方法などの既知のオフターゲット検出アッセイでは、多くの潜在的なオフターゲット部位は、典型的には、設計によって、他の状況、例えば、目的の初代細胞において検証され得る潜在的な部位について「広範囲のネットをキャストする」ように回収される。例えば、生化学的方法は、典型的には、アッセイが、細胞環境を含まない精製された高分子量ゲノムＤＮＡを利用し、かつ使用されるＣａｓ９ ＲＮＰの用量に依存するため、潜在的なオフターゲット部位の数を過剰に表す。したがって、この方法によって特定された潜在的なオフターゲット部位は、特定された潜在的なオフターゲット部位の標的シーケンシングを使用して検証される。

【0287】

実施例１５ 分泌タンパク質または非分泌タンパク質の発現のための構築物の構築
双方向性構築物などの構築物は、それらが分泌タンパク質または非分泌タンパク質を発現するように設計され得る。分泌タンパク質の生成のために、構築物は、ポリペプチドをＥＲ内腔に転座するのを補助するシグナル配列を含み得る。あるいは、構築物は、宿主細胞の内因性シグナル配列（例えば、導入遺伝子が宿主細胞のアルブミン遺伝子座に組み込まれるときの内因性アルブミンシグナル配列）を利用し得る。

【0288】

対照的に、非分泌タンパク質の発現のための構築物は、それらがシグナル配列を含まないように、かつそれらが宿主細胞の内因性シグナル配列を利用しないように設計され得る。これが達成され得るいくつかの方法は、構築物における内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列の組み込みを含む。ＥＭＣＶ ＩＲＥＳなどのＩＲＥＳ配列は、ＩＲＥＳが位置する場所からすぐ下流のｍＲＮＡ内の任意の位置からの翻訳の開始を可能にする。これにより、上流にシグナル配列を含む挿入部位からの宿主細胞の内因性シグナル配列を欠くタンパク質の発現が可能になる（例えば、アルブミン遺伝子座のエクソン１に見出されるシグナル配列は、発現タンパク質に含まれない）。シグナル配列の不在下では、タンパク質は分泌されない。構築物で使用され得るＩＲＥＳ配列の例には、ピコルナウイルス（例えば、ＦＭＤＶ）、害虫ウイルス（ＣＦＦＶ）、ポリオウイルス（ＰＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、古典的なブタ熱ウイルス（ＣＳＦＶ）、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、またはクリケット麻痺ウイルス（ＣｒＰＶ）由来のものが挙げられる。

【0289】

非分泌タンパク質を発現するための代替的なアプローチは、構築物中の目的のポリペプチドの上流に１つ以上の自己切断ペプチドを含むことである。２Ａまたは２Ａ様配列などの自己切断ペプチドは、単一のｍＲＮＡ転写産物から複数の個々のタンパク質を生成するためのリボソームスキッピングシグナルとして機能する。表１１からのプラスミドＩＤ Ｐ００４１５に示されるように、自己切断ペプチド（例えば、Ｐ２Ａ）を使用して、２つの導入遺伝子（例えば、ナノルシフェラーゼ及びＧＦＰ）を発現するバイシストロニック（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）ベクターを生成することができる。あるいは、自己切断ペプチドを使用して、宿主細胞の内因性シグナル配列を欠くタンパク質を発現することができる（例えば、目的のタンパク質の上流に位置する２Ａ配列は、内因性アルブミンシグナル配列と目的のタンパク質との間の切断をもたらす）。利用することができ得る代表的な２Ａペプチドを表２８に示す。加えて、（ＧＳＧ）残基は、表１２に示されるように、切断効率を改善するために、ペプチドの５’末端に添加されてもよい。

【0290】

実施例１６．インビボでのヒトＦ９挿入のためのガイドＲＮＡをスクリーニングするためのヒト化アルブミンマウスの使用
ヒトアルブミン遺伝子座へのｈＦ９挿入のための効果的なガイドＲＮＡを同定することを目的とした。この目的のために、マウスアルブミン遺伝子座が第１のイントロンを含む対応するヒトアルブミンゲノム配列で置き換えられたマウスを利用した（ＡＬＢ^{ｈｕ／ｈｕ}マウス）。これにより、インビボでの成人肝臓の状況におけるヒトアルブミンの第１のイントロンを標的とするガイドＲＮＡの挿入効率を試験することが可能になった。ＡＬＢ^{ｈｕ／ｈｕ}マウスを使用して、合計１１個のガイドＲＮＡをスクリーニングするために、各々がヒトアルブミン遺伝子座の第１のイントロンを標的とする、２個の別々のマウス実験を設定した。全てのマウスを体重測定し、実験の０日目に尾静脈を介して注射した。１週目、３週目、４週目、及び６週目に尾部出血を介して血液を収集し、血漿を分離した。マウスを７週目に屠殺した。大静脈を介して血液を収集し、血漿を分離した。肝臓及び脾臓も解剖した。

【0291】

第１の実験では、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及び以下のガイドを含む６個のＬＮＰを、実施例１のように調製し、試験した：Ｇ００９８５２、Ｇ００９８５９、Ｇ００９８６０、Ｇ００９８６４、Ｇ００９８７４、及びＧ０１２７６４。ＬＮＰを０．３ｍｇ／ｋｇに希釈し（平均重量３０グラムを使用して）、マウスあたり３Ｅ１１ウイルスゲノムの用量で双方向性ｈＦ９挿入テンプレートでパッケージングしたＡＡＶ８と同時注射した。群あたり、１２～１４週齢の５匹のＡＬＢ^{ｈｕ／ｈｕ}雄マウスに注射した。同じコホートの５匹のマウスに、ｈＦ９に作動可能に連結されたＣＡＧＧプロモーターをパッケージングしたＡＡＶ８を注射し、これは、ｈＦ９のエピソーム発現をもたらす（マウスあたり３Ｅ１１ウイルスゲノムで）。緩衝液単独、双方向性ｈＦ９挿入テンプレートでパッケージングしたＡＡＶ８単独、またはＬＮＰ－Ｇ００９８７４単独を注射された群あたり３匹のマウスを含む３つの陰性対照群が存在した。

【0292】

実験では、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ及び以下のガイドを含む以下のＬＮＰを、実施例１のように調製し、試験した：Ｇ００９８６０、Ｇ０１２７６４、Ｇ００９８４４、Ｇ００９８５７、Ｇ０１２７５２、Ｇ０１２７５３、及びＧ０１２７６１。全てを０．３ｍｇ／ｋｇに希釈し（平均重量４０グラムを使用して）、マウスあたり３Ｅ１１ウイルスゲノムの用量で双方向性ｈＦ９挿入テンプレートでパッケージングしたＡＡＶ８と同時注射した。群あたり５匹の３０週齢のＡＬＢ^{ｈｕ／ｈｕ}雄マウスに注射した。同じコホートの５匹のマウスに、ｈＦ９に作動可能に連結されたＣＡＧＧプロモーターをパッケージングしたＡＡＶ８を注射し、これは、ｈＦ９のエピソーム発現をもたらす（マウスあたり３Ｅ１１ウイルスゲノムで）。緩衝液単独、双方向性ｈＦ９挿入テンプレートでパッケージングしたＡＡＶ８単独、またはＬＮＰ－Ｇ００９８７４単独を注射された群あたり３匹のマウスを含む３つの陰性対照群が存在した。

【0293】

分析について、各時点でマウスにおけるｈＦＩＸ循環のレベルを測定するためにＥＬＩＳＡを行った。この目的のためにヒト第ＩＸ因子ＥＬＩＳＡキット（ａｂ１８８３９３）を使用し、全てのプレートを陽性アッセイ対照としてＧｅｏｒｇｅ Ｋｉｎｇ Ｂｉｏ－Ｍｅｄｉｃａｌのヒトプール正常血漿で実行した。注射後６週目の各群における血漿試料中のヒト第ＩＸ因子発現レベルを、図１６Ａ及び図１６Ｂに示す。インビトロ挿入データと一貫して、ガイドＲＮＡ Ｇ００９８５２を使用した場合、検出された第ＩＸ因子血清レベルは低レベルから全くなしであった。ヒトアルブミン中の隣接ＰＡＭ配列の欠如と一貫して、ガイドＲＮＡ Ｇ００９８６４を使用した場合、第ＩＸ因子血清レベルは検出不可であった。ガイドＲＮＡ Ｇ００９８５９、Ｇ００９８６０、Ｇ００９８７４、及びＧ０１２７６４を使用して、群について肝臓における編集を観察した（データには示さず）。

【0294】

脾臓及び全ての肝臓の左外側葉の一部分を、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）分析のために提出した。ＮＧＳを使用して、ＡＡＶ－ｈＦ９ドナー及びＬＮＰ－ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を注射した後の７週目のヒト化アルブミン遺伝子座における挿入／欠失（インデル）を有する肝臓細胞のパーセンテージを評価した。ヒトアルブミン中の隣接ＰＡＭ配列の欠如と一貫して、ガイドＲＮＡ Ｇ００９８６４を使用した場合、肝臓において編集は検出不可であった。ガイドＲＮＡ Ｇ００９８５９、Ｇ００９８６０、Ｇ００９８７４、及びＧ０１２７６４（データには示さず）を使用して、群について肝臓における編集を観察した。

【0295】

残りの肝臓を１０％中性緩衝ホルマリン中で２４時間固定し、次いで、７０％エタノールに移した。別個の葉由来の４～５個の試料を切断し、ＨｉｓｔｏＷｉｓｚに送り、処理され、パラフィンブロックに埋め込まれた。次いで、各パラフィンブロックから５ミクロン切片を切断し、一般的なＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）手順及びＡｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓによる試薬、ならびに成功した組み込み及び転写が達成されたときにＡＬＢ^{ｈｕ／ｈｕ}アルブミン遺伝子座の第１のイントロンからのヒトアルブミンシグナル配列と、ｈＦ９導入遺伝子との間に形成される固有のｍＲＮＡ接合部を標的とするカスタム設計プローブを使用して、Ｖｅｎｔａｎａ Ｕｌｔｒａ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（Ｒｏｃｈｅ）上でＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）を行った。次いで、ＨＡＬＯイメージングソフトウェア（Ｉｎｄｉｃａ Ｌａｂｓ）を使用して、各試料中の陽性細胞のパーセンテージを定量化した。次いで、各動物の複数の葉にわたる陽性細胞のパーセンテージの平均を、７週目の血清中のｈＦＩＸレベルと相関させた。結果を図１７及び表２９に示す。ｈＡＬＢ－ｈＦＩＸ ｍＲＮＡの７週目の血清レベル及び陽性細胞％は、強く相関していた（ｒ＝０．８９、Ｒ^２＝０．７９）。
表２９．７週目のｈＦＩＸ及びＢＡＳＥＳＣＯＰＥ（商標）データ。

ヒトアルブミンイントロン１：（配列番号１）
ＧＴＡＡＧＡＡＡＴＣＣＡＴＴＴＴＴＣＴＡＴＴＧＴＴＣＡＡＣＴＴＴＴＡＴＴＣＴＡＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＡＡＡＡＴＡＡＡＧＴＴＴＴＡＧＴＡＡＡＣＴＣＴＧＣＡＴＣＴＴＴＡＡＡＧＡＡＴＴＡＴＴＴＴＧＧＣＡＴＴＴＡＴＴＴＣＴＡＡＡＡＴＧＧＣＡＴＡＧＴＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＧＴＧＡＡＧＴＣＴＴＡＣＡＡＧＧＴＴＡＴＣＴＴＡＴＴＡＡＴＡＡＡＡＴＴＣＡＡＡＣＡＴＣＣＴＡＧＧＴＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＧＧＴＣＡＧＡＡＴＴＧＴＴＴＡＧＴＧＡＣＴＧＴＡＡＴＴＴＴＣＴＴＴＴＧＣＧＣＡＣＴＡＡＧＧＡＡＡＧＴＧＣＡＡＡＧＴＡＡＣＴＴＡＧＡＧＴＧＡＣＴＧＡＡＡＣＴＴＣＡＣＡＧＡＡＴＡＧＧＧＴＴＧＡＡＧＡＴＴＧＡＡＴＴＣＡＴＡＡＣＴＡＴＣＣＣＡＡＡＧＡＣＣＴＡＴＣＣＡＴＴＧＣＡＣＴＡＴＧＣＴＴＴＡＴＴＴＡＡＡＡＡＣＣＡＣＡＡＡＡＣＣＴＧＴＧＣＴＧＴＴＧＡＴＣＴＣＡＴＡＡＡＴＡＧＡＡＣＴＴＧＴＡＴＴＴＡＴＡＴＴＴＡＴＴＴＴＣＡＴＴＴＴＡＧＴＣＴＧＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＴＧＣＴＧＴＴＧＡＴＡＧＡＣＡＣＴＡＡＡＡＧＡＧＴＡＴＴＡＧＡＴＡＴＴＡＴＣＴＡＡＧＴＴＴＧＡＡＴＡＴＡＡＧＧＣＴＡＴＡＡＡＴＡＴＴＴＡＡＴＡＡＴＴＴＴＴＡＡＡＡＴＡＧＴＡＴＴＣＴＴＧＧＴＡＡＴＴＧＡＡＴＴＡＴＴＣＴＴＣＴＧＴＴＴＡＡＡＧＧＣＡＧＡＡＧＡＡＡＴＡＡＴＴＧＡＡＣＡＴＣＡＴＣＣＴＧＡＧＴＴＴＴＴＣＴＧＴＡＧＧＡＡＴＣＡＧＡＧＣＣＣＡＡＴＡＴＴＴＴＧＡＡＡＣＡＡＡＴＧＣＡＴＡＡＴＣＴＡＡＧＴＣＡＡＡＴＧＧＡＡＡＧＡＡＡＴＡＴＡＡＡＡＡＧＴＡＡＣＡＴＴＡＴＴＡＣＴＴＣＴＴＧＴＴＴＴＣＴＴＣＡＧＴＡＴＴＴＡＡＣＡＡＴＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＣＴＴＣＣＣＴＴＧＣＣＣＡＧ
表７．マウスアルブミンガイドＲＮＡ

表８．マウスアルブミンｓｇＲＮＡ及び修飾パターン

表９．カニクイザルアルブミンガイドＲＮＡ

表１０：カニクイザルｓｇＲＮＡ及び修飾パターン

表１１：ベクター成分及び配列

５’ＩＴＲ配列（配列番号２６３）：
ＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴ
マウスアルブミンスプライスアクセプター（第１の配向）（配列番号２６４）：
ＴＡＧＧＴＣＡＧＴＧＡＡＧＡＧＡＡＧＡＡＣＡＡＡＡＡＧＣＡＧＣＡＴＡＴＴＡＣＡＧＴＴＡＧＴＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＡＡＴＣＴＴＴＡＡＡＴＡＴＧＴＴＧＴＧＴＧＧＴＴＴＴＴＣＴＣＴＣＣＣＴＧＴＴＴＣＣＡＣＡＧ
ヒト第ＩＸ因子（Ｒ３３８Ｌ）、第１の配向（配列番号２６５）：
ＴＴＴＣＴＴＧＡＴＣＡＴＧＡＡＡＡＣＧＣＣＡＡＣＡＡＡＡＴＴＣＴＧＡＡＴＣＧＧＣＣＡＡＡＧＡＧＧＴＡＴＡＡＴＴＣＡＧＧＴＡＡＡＴＴＧＧＡＡＧＡＧＴＴＴＧＴＴＣＡＡＧＧＧＡＡＣＣＴＴＧＡＧＡＧＡＧＡＡＴＧＴＡＴＧＧＡＡＧＡＡＡＡＧＴＧＴＡＧＴＴＴＴＧＡＡＧＡＡＧＣＡＣＧＡＧＡＡＧＴＴＴＴＴＧＡＡＡＡＣＡＣＴＧＡＡＡＧＡＡＣＡＡＣＴＧＡＡＴＴＴＴＧＧＡＡＧＣＡＧＴＡＴＧＴＴＧＡＴＧＧＡＧＡＴＣＡＧＴＧＴＧＡＧＴＣＣＡＡＴＣＣＡＴＧＴＴＴＡＡＡＴＧＧＣＧＧＣＡＧＴＴＧＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＡＴＴＡＡＴＴＣＣＴＡＴＧＡＡＴＧＴＴＧＧＴＧＴＣＣＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＧＡＡＧＧＡＡＡＧＡＡＣＴＧＴＧＡＡＴＴＡＧＡＴＧＴＡＡＣＡＴＧＴＡＡＣＡＴＴＡＡＧＡＡＴＧＧＣＡＧＡＴＧＣＧＡＧＣＡＧＴＴＴＴＧＴＡＡＡＡＡＴＡＧＴＧＣＴＧＡＴＡＡＣＡＡＧＧＴＧＧＴＴＴＧＣＴＣＣＴＧＴＡＣＴＧＡＧＧＧＡＴＡＴＣＧＡＣＴＴＧＣＡＧＡＡＡＡＣＣＡＧＡＡＧＴＣＣＴＧＴＧＡＡＣＣＡＧＣＡＧＴＧＣＣＡＴＴＴＣＣＡＴＧＴＧＧＡＡＧＡＧＴＴＴＣＴＧＴＴＴＣＡＣＡＡＡＣＴＴＣＴＡＡＧＣＴＣＡＣＣＣＧＴＧＣＴＧＡＧＡＣＴＧＴＴＴＴＴＣＣＴＧＡＴＧＴＧＧＡＣＴＡＴＧＴＡＡＡＴＴＣＴＡＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＡＡＣＣＡＴＴＴＴＧＧＡＴＡＡＣＡＴＣＡＣＴＣＡＡＡＧＣＡＣＣＣＡＡＴＣＡＴＴＴＡＡＴＧＡＣＴＴＣＡＣＴＣＧＧＧＴＴＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＴＧＣＣＡＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＡＴＴＣＣＣＴＴＧＧＣＡＧＧＴＴＧＴＴＴＴＧＡＡＴＧＧＴＡＡＡＧＴＴＧＡＴＧＣＡＴＴＣＴＧＴＧＧＡＧＧＣＴＣＴＡＴＣＧＴＴＡＡＴＧＡＡＡＡＡＴＧＧＡＴＴＧＴＡＡＣＴＧＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＴＧＴＴＧＡＡＡＣＴＧＧＴＧＴＴＡＡＡＡＴＴＡＣＡＧＴＴＧＴＣＧＣＡＧＧＴＧＡＡＣＡＴＡＡＴＡＴＴＧＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＡＣＡＴＡＣＡＧＡＧＣＡＡＡＡＧＣＧＡＡＡＴＧＴＧＡＴＴＣＧＡＡＴＴＡＴＴＣＣＴＣＡＣＣＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＴＧＣＡＧＣＴＡＴＴＡＡＴＡＡＧＴＡＣＡＡＣＣＡＴＧＡＣＡＴＴＧＣＣＣＴＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＣＧＡＡＣＣＣＴＴＡＧＴＧＣＴＡＡＡＣＡＧＣＴＡＣＧＴＴＡＣＡＣＣＴＡＴＴＴＧＣＡＴＴＧＣＴＧＡＣＡＡＧＧＡＡＴＡＣＡＣＧＡＡＣＡＴＣＴＴＣＣＴＣＡＡＡＴＴＴＧＧＡＴＣＴＧＧＣＴＡＴＧＴＡＡＧＴＧＧＣＴＧＧＧＧＡＡＧＡＧＴＣＴＴＣＣＡＣＡＡＡＧＧＧＡＧＡＴＣＡＧＣＴＴＴＡＧＴＴＣＴＴＣＡＧＴＡＣＣＴＴＡＧＡＧＴＴＣＣＡＣＴＴＧＴＴＧＡＣＣＧＡＧＣＣＡＣＡＴＧＴＣＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＡＡＡＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＡＴＡＡＣＡＡＣＡＴＧＴＴＣＴＧＴＧＣＴＧＧＣＴＴＣＣＡＴＧＡＡＧＧＡＧＧＴＡＧＡＧＡＴＴＣＡＴＧＴＣＡＡＧＧＡＧＡＴＡＧＴＧＧＧＧＧＡＣＣＣＣＡＴＧＴＴＡＣＴＧＡＡＧＴＧＧＡＡＧＧＧＡＣＣＡＧＴＴＴＣＴＴＡＡＣＴＧＧＡＡＴＴＡＴＴＡＧＣＴＧＧＧＧＴＧＡＡＧＡＧＴＧＴＧＣＡＡＴＧＡＡＡＧＧＣＡＡＡＴＡＴＧＧＡＡＴＡＴＡＴＡＣＣＡＡＧＧＴＡＴＣＣＣＧＧＴＡＴＧＴＣＡＡＣＴＧＧＡＴＴＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＣＡＡＡＧＣＴＣＡＣＴＴＡＡ
ポリＡ（第１の配向）（配列番号２６６）：
ＣＣＴＣＧＡＣＴＧＴＧＣＣＴＴＣＴＡＧＴＴＧＣＣＡＧＣＣＡＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＧＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＧＴＧＣＣＴＴＣＣＴＴＧＡＣＣＣＴＧＧＡＡＧＧＴＧＣＣＡＣＴＣＣＣＡＣＴＧＴＣＣＴＴＴＣＣＴＡＡＴＡＡＡＡＴＧＡＧＧＡＡＡＴＴＧＣＡＴＣＧＣＡＴＴＧＴＣＴＧＡＧＴＡＧＧＴＧＴＣＡＴＴＣＴＡＴＴＣＴＧＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＴＧＧＧＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＧＧＧＡＧＧＡＴＴＧＧＧＡＡＧＡＣＡＡＴＡＧＣＡＧＧＣＡＴＧＣＴＧＧＧＧＡＴＧＣＧＧＴＧＧＧＣＴＣＴＡＴＧＧＣＴＴＣＴＧＡＧＧＣＧＧＡＡＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＧＧＧＧＣＴＣＴＡＧＧＧＧＧＴＡＴＣＣＣＣ
ポリＡ（第２の配向）（配列番号２６７）：
ＡＡＡＡＡＡＣＣＴＣＣＣＡＣＡＣＣＴＣＣＣＣＣＴＧＡＡＣＣＴＧＡＡＡＣＡＴＡＡＡＡＴＧＡＡＴＧＣＡＡＴＴＧＴＴＧＴＴＧＴＴＡＡＣＴＴＧＴＴＴＡＴＴＧＣＡＧＣＴＴＡＴＡＡＴＧＧＴＴＡＣＡＡＡＴＡＡＡＧＣＡＡＴＡＧＣＡＴＣＡＣＡＡＡＴＴＴＣＡＣＡＡＡＴＡＡＡＧＣＡＴＴＴＴＴＴＴＣＡＣＴＧＣＡＴＴＣＴＡＧＴＴＧＴＧＧＴＴＴＧＴＣＣＡＡＡＣＴＣＡＴＣＡＡＴＧＴＡＴＣＴＴＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧ
ヒト第ＩＸ因子（Ｒ３３８Ｌ）、第２の配向（配列番号２６８）：
ＴＴＡＧＧＴＧＡＧＣＴＴＡＧＴＣＴＴＴＴＣＴＴＴＴＡＴＣＣＡＡＴＴＣＡＣＧＴＡＧＣＧＡＧＡＧＡＣＣＴＴＣＧＴＡＴＡＧＡＴＧＣＣＡＴＡＴＴＴＣＣＣＣＴＴＣＡＴＣＧＣＡＣＡＴＴＣＣＴＣＣＣＣＣＣＡＡＣＴＴＡＴＴＡＴＣＣＣＧＧＴＣＡＡＧＡＡＡＣＴＴＧＴＴＣＣＴＴＣＧＡＣＴＴＣＡＧＴＧＡＣＧＴＧＴＧＧＴＣＣＡＣＣＴＧＡＡＴＣＡＣＣＴＴＧＧＣＡＴＧＡＧＴＣＧＣＧＡＣＣＧＣＣＣＴＣＧＴＧＡＡＡＣＣＣＡＧＣＡＣＡＡＡＡＣＡＴＧＴＴＡＴＴＧＴＡＡＡＴＣＧＴＡＡＡＴＴＴＣＧＴＧＧＡＣＡＧＡＡＧＡＣＡＧＧＴＣＧＣＴＣＴＡＴＣＧＡＣＣＡＡＣＧＧＧＡＣＧＣＧＣＡＡＡＴＡＴＴＧＣＡＧＡＡＣＧＡＧＧＧＣＴＧＡＴＣＧＡＣＣＴＴＴＧＴＧＧＡＡＧＡＣＣＣＧＣＣＣＣＣＡＣＣＣＡＣＴＣＡＣＡＴＡＴＣＣＧＣＴＣＣＣＡＡＡＴＴＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＡＴＴＴＧＴＡＴＡＴＴＣＴＴＴＡＴＣＧＧＣＴＡＴＡＣＡＡＡＴＣＧＧＧＧＴＡＡＣＡＴＡＧＧＡＧＴＴＡＡＧＴＡＣＧＡＧＴＧＧＣＴＣＧＴＣＣＡＧＣＴＣＣＡＧＧＡＧＧＧＣＴＡＴＡＴＣＡＴＧＧＴＴＧＴＡＣＴＴＧＴＴＴＡＴＡＧＣＧＧＣＡＴＴＡＴＡＡＴＴＧＴＧＡＴＧＧＧＧＴＡＴＧＡＴＣＣＴＧＡＴＡＡＣＡＴＴＣＣＴＴＴＴＣＴＧＴＴＣＡＧＴＡＴＧＣＴＣＡＧＴＴＴＣＴＴＣＡＡＴＧＴＴＧＴＧＴＴＣＧＣＣＡＧＣＣＡＣＧＡＣＣＧＴＡＡＴＣＴＴＡＡＣＣＣＣＣＧＴＣＴＣＧＡＣＡＣＡＧＴＧＴＧＣＧＧＣＣＧＴＴＡＣＡＡＴＣＣＡＣＴＴＴＴＣＡＴＴＧＡＣＴＡＴＧＧＡＧＣＣＣＣＣＡＣＡＡＡＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＴＴＴＴＣＣＧＴＴＧＡＧＣＡＣＣＡＣＣＴＧＣＣＡＴＧＧＡＡＡＴＴＧＧＣＣＡＧＧＴＴＴＡＧＣＧＴＣＣＴＣＧＣＣＣＣＣＧＡＣＡＡＣＣＣＴＡＧＴＡＡＡＧＴＣＡＴＴＡＡＡＴＧＡＣＴＧＴＧＴＧＧＡＴＴＧＴＧＴＴＡＴＡＴＴＡＴＣＡＡＧＡＡＴＣＧＴＴＴＣＧＧＣＴＴＣＡＧＴＡＧＡＧＴＴＡＡＣＧＴＡＧＴＣＣＡＣＡＴＣＧＧＧＡＡＡＡＡＣＴＧＴＣＴＣＧＧＣＣＣＴＴＧＴＣＡＡＣＴＴＴＧＡＴＧＴＣＴＧＧＧＡＣＡＣＡＣＴＴＡＣＣＣＧＡＣＣＧＣＡＣＧＧＧＡＡＧＧＧＣＡＣＣＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＡＧＣＴＣＴＴＴＴＧＡＴＴＣＴＣＡＧＣＧＡＧＣＣＧＧＴＡＧＣＣＣＴＣＡＧＴＧＣＡＡＣＴＡＣＡＣＡＣＡＡＣＴＴＴＧＴＴＧＴＣＧＧＣＧＧＡＡＴＴＴＴＴＡＣＡＧＡＡＴＴＧＣＴＣＧＣＡＴＣＧＴＣＣＡＴＴＴＴＴＡＡＴＧＴＴＧＣＡＧＧＴＧＡＣＧＴＣＣＡＡＣＴＣＧＣＡＧＴＴＴＴＴＴＣＣＴＴＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＡＧＧＧＣＡＣＣＡＡＣＡＣＴＣＧＴＡＧＧＡＡＴＴＴＡＴＡＴＣＧＴＣＴＴＴＡＣＡＡＣＴＣＣＣＣＣＣＡＴＴＣＡＧＡＣＡＴＧＧＡＴＴＡＧＡＴＴＣＧＣＡＴＴＧＧＴＣＣＣＣＡＴＣＧＡＣＡＴＡＴＴＧＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＴＣＡＧＴＧＧＴＣＣＧＴＴＣＴＧＴＡＴＴＣＴＣＡＡＡＣＡＣＣＴＣＧＣＧＣＧＣＴＴＣＴＴＣＡＡＡＡＣＴＧＣＡＴＴＴＴＴＣＣＴＣＣＡＴＡＣＡＣＴＣＴＣＧＣＴＣＣＡＡＧＴＴＣＣＣＴＴＧＣＡＣＧＡＡＴＴＣＴＴＣＡＡＧＣＴＴＴＣＣＴＧＡＧＴＴＡＴＡＣＣＴＴＴＴＡＧＧＣＣＧＧＴＴＡＡＧＴＡＴＣＴＴＡＴＴＣＧＣＧＴＴＴＴＣＧＴＧＧＴＣＣＡＧＡＡＡ
マウスアルブミンスプライスアクセプター（第２の配向）（配列番号２６９）：
ＣＴＧＴＧＧＡＡＡＣＡＧＧＧＡＧＡＧＡＡＡＡＡＣＣＡＣＡＣＡＡＣＡＴＡＴＴＴＡＡＡＧＡＴＴＧＡＴＧＡＡＧＡＣＡＡＣＴＡＡＣＴＧＴＡＡＴＡＴＧＣＴＧＣＴＴＴＴＴＧＴＴＣＴＴＣＴＣＴＴＣＡＣＴＧＡＣＣＴＡ
３’ＩＴＲ配列（配列番号２７０）：
ＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡ
ヒト第ＩＸ因子スプライスアクセプター（第１の配向）（配列番号２７１）：
ＧＡＴＴＡＴＴＴＧＧＡＴＴＡＡＡＡＡＣＡＡＡＧＡＣＴＴＴＣＴＴＡＡＧＡＧＡＴＧＴＡＡＡＡＴＴＴＴＣＡＴＧＡＴＧＴＴＴＴＣＴＴＴＴＴＴＧＣＴＡＡＡＡＣＴＡＡＡＧＡＡＴＴＡＴＴＣＴＴＴＴＡＣＡＴＴＴＣＡＧ
ヒト第ＩＸ因子（Ｒ３３８Ｌ）－ＨｉＢｉｔ（第１の配向）（配列番号２７２）：
ＴＴＴＣＴＴＧＡＴＣＡＴＧＡＡＡＡＣＧＣＣＡＡＣＡＡＡＡＴＴＣＴＧＡＡＴＣＧＧＣＣＡＡＡＧＡＧＧＴＡＴＡＡＴＴＣＡＧＧＴＡＡＡＴＴＧＧＡＡＧＡＧＴＴＴＧＴＴＣＡＡＧＧＧＡＡＣＣＴＴＧＡＧＡＧＡＧＡＡＴＧＴＡＴＧＧＡＡＧＡＡＡＡＧＴＧＴＡＧＴＴＴＴＧＡＡＧＡＡＧＣＡＣＧＡＧＡＡＧＴＴＴＴＴＧＡＡＡＡＣＡＣＴＧＡＡＡＧＡＡＣＡＡＣＴＧＡＡＴＴＴＴＧＧＡＡＧＣＡＧＴＡＴＧＴＴＧＡＴＧＧＡＧＡＴＣＡＧＴＧＴＧＡＧＴＣＣＡＡＴＣＣＡＴＧＴＴＴＡＡＡＴＧＧＣＧＧＣＡＧＴＴＧＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＡＴＴＡＡＴＴＣＣＴＡＴＧＡＡＴＧＴＴＧＧＴＧＴＣＣＣＴＴＴＧＧＡＴＴＴＧＡＡＧＧＡＡＡＧＡＡＣＴＧＴＧＡＡＴＴＡＧＡＴＧＴＡＡＣＡＴＧＴＡＡＣＡＴＴＡＡＧＡＡＴＧＧＣＡＧＡＴＧＣＧＡＧＣＡＧＴＴＴＴＧＴＡＡＡＡＡＴＡＧＴＧＣＴＧＡＴＡＡＣＡＡＧＧＴＧＧＴＴＴＧＣＴＣＣＴＧＴＡＣＴＧＡＧＧＧＡＴＡＴＣＧＡＣＴＴＧＣＡＧＡＡＡＡＣＣＡＧＡＡＧＴＣＣＴＧＴＧＡＡＣＣＡＧＣＡＧＴＧＣＣＡＴＴＴＣＣＡＴＧＴＧＧＡＡＧＡＧＴＴＴＣＴＧＴＴＴＣＡＣＡＡＡＣＴＴＣＴＡＡＧＣＴＣＡＣＣＣＧＴＧＣＴＧＡＧＡＣＴＧＴＴＴＴＴＣＣＴＧＡＴＧＴＧＧＡＣＴＡＴＧＴＡＡＡＴＴＣＴＡＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＡＡＣＣＡＴＴＴＴＧＧＡＴＡＡＣＡＴＣＡＣＴＣＡＡＡＧＣＡＣＣＣＡＡＴＣＡＴＴＴＡＡＴＧＡＣＴＴＣＡＣＴＣＧＧＧＴＴＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＴＧＣＣＡＡＡＣＣＡＧＧＴＣＡＡＴＴＣＣＣＴＴＧＧＣＡＧＧＴＴＧＴＴＴＴＧＡＡＴＧＧＴＡＡＡＧＴＴＧＡＴＧＣＡＴＴＣＴＧＴＧＧＡＧＧＣＴＣＴＡＴＣＧＴＴＡＡＴＧＡＡＡＡＡＴＧＧＡＴＴＧＴＡＡＣＴＧＣＴＧＣＣＣＡＣＴＧＴＧＴＴＧＡＡＡＣＴＧＧＴＧＴＴＡＡＡＡＴＴＡＣＡＧＴＴＧＴＣＧＣＡＧＧＴＧＡＡＣＡＴＡＡＴＡＴＴＧＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＡＣＡＴＡＣＡＧＡＧＣＡＡＡＡＧＣＧＡＡＡＴＧＴＧＡＴＴＣＧＡＡＴＴＡＴＴＣＣＴＣＡＣＣＡＣＡＡＣＴＡＣＡＡＴＧＣＡＧＣＴＡＴＴＡＡＴＡＡＧＴＡＣＡＡＣＣＡＴＧＡＣＡＴＴＧＣＣＣＴＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＡＣＧＡＡＣＣＣＴＴＡＧＴＧＣＴＡＡＡＣＡＧＣＴＡＣＧＴＴＡＣＡＣＣＴＡＴＴＴＧＣＡＴＴＧＣＴＧＡＣＡＡＧＧＡＡＴＡＣＡＣＧＡＡＣＡＴＣＴＴＣＣＴＣＡＡＡＴＴＴＧＧＡＴＣＴＧＧＣＴＡＴＧＴＡＡＧＴＧＧＣＴＧＧＧＧＡＡＧＡＧＴＣＴＴＣＣＡＣＡＡＡＧＧＧＡＧＡＴＣＡＧＣＴＴＴＡＧＴＴＣＴＴＣＡＧＴＡＣＣＴＴＡＧＡＧＴＴＣＣＡＣＴＴＧＴＴＧＡＣＣＧＡＧＣＣＡＣＡＴＧＴＣＴＴＣＴＡＴＣＴＡＣＡＡＡＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＡＴＡＡＣＡＡＣＡＴＧＴＴＣＴＧＴＧＣＴＧＧＣＴＴＣＣＡＴＧＡＡＧＧＡＧＧＴＡＧＡＧＡＴＴＣＡＴＧＴＣＡＡＧＧＡＧＡＴＡＧＴＧＧＧＧＧＡＣＣＣＣＡＴＧＴＴＡＣＴＧＡＡＧＴＧＧＡＡＧＧＧＡＣＣＡＧＴＴＴＣＴＴＡＡＣＴＧＧＡＡＴＴＡＴＴＡＧＣＴＧＧＧＧＴＧＡＡＧＡＧＴＧＴＧＣＡＡＴＧＡＡＡＧＧＣＡＡＡＴＡＴＧＧＡＡＴＡＴＡＴＡＣＣＡＡＧＧＴＣＴＣＣＣＧＧＴＡＴＧＴＣＡＡＣＴＧＧＡＴＴＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＣＡＡＡＧＣＴＣＡＣＴＧＴＣＡＧＣＧＧＡＴＧＧＡＧＡＣＴＧＴＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＣＡＧＣＴＡＡ
ヒト第ＩＸ因子（Ｒ３３８Ｌ）－ＨｉＢｉｔ（第２の配向）（配列番号２７３）：
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ヒト第ＩＸ因子スプライスアクセプター（第２の配向）（配列番号２７４）：
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Ｎｌｕｃ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（第１の配向）（配列番号２７５）：
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Ｎｌｕｃ－Ｐ２Ａ－ＧＦＰ（第２の配向）（配列番号２７６）：
ＴＴＡＣＡＣＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＧＧＧＣＴＧＣＣＧＣＣＧＣＣＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣＣＣＡＧＧＧＴＧＡＴＧＣＣＧＧＣＧＧＣＧＧＴＣＡＣＧＡＡＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＡＴＧＴＧＧＴＣＣＣＴＣＴＴＣＴＣＧＴＴＧＧＧＧＴＣＣＴＴＧＣＴＣＡＧＧＧＣＧＣＴＣＴＧＧＧＴＧＣＴＣＡＧＧＴＡＧＴＧＧＴＴＧＴＣＧＧＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＧＧＧＧＣＣＧＴＣＧＣＣＧＡＴＧＧＧＧＧＴＧＴＴＣＴＧＣＴＧＧＴＡＧＴＧＧＴＣＧＧＣＣＡＧＣＴＧＣＡＣＧＣＴＧＣＣＧＴＣＣＴＣＧＡＴＧＴＴＧＴＧＣＣＴＧＡＴＣＴＴＧＡＡＧＴＴＣＡＣＣＴＴＧＡＴＧＣＣＧＴＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧＴＣＧＧＣＣＡＴＧＡＴＧＴＡＣＡＣＧＴＴＧＴＧＧＣＴＧＴＴＧＴＡＧＴＴＧＴＡＣＴＣＣＡＧＣＴＴＧＴＧＧＣＣＣＡＧＧＡＴＧＴＴＧＣＣＧＴＣＣＴＣＣＴＴＧＡＡＧＴＣＧＡＴＧＣＣＣＴＴＣＡＧＣＴＣＧＡＴＣＣＴＧＴＴＣＡＣＣＡＧＧＧＴＧＴＣＧＣＣＣＴＣＧＡＡＣＴＴＣＡＣＣＴＣＧＧＣＣＣＴＧＧＴＣＴＴＧＴＡＧＴＴＧＣＣＧＴＣＧＴＣＣＴＴＧＡＡＧＡＡＧＡＴＧＧＴＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＣＧＴＡＧＣＣＣＴＣＧＧＧＣＡＴＧＧＣＧＣＴＣＴＴＧＡＡＧＡＡＧＴＣＧＴＧＣＴＧＣＴＴＣＡＴＧＴＧＧＴＣＧＧＧＧＴＡＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＡＣＴＧＣＡＣＧＣＣＧＴＡＧＧＴＣＡＧＧＧＴＧＧＴＣＡＣＣＡＧＧＧＴＧＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＣＧＧＧＣＡＧＣＴＴＧＣＣＧＧＴＧＧＴＧＣＡＧＡＴＧＡＡＣＴＴＣＡＧＧＧＴＣＡＧＣＴＴＧＣＣＧＴＡＧＧＴＧＧＣＧＴＣＧＣＣＣＴＣＧＣＣＣＴＣＧＣＣＧＣＴＣＡＣＧＣＴＧＡＡＣＴＴＧＴＧＧＣＣＧＴＴＣＡＣＧＴＣＧＣＣＧＴＣＣＡＧＣＴＣＣＡＣＣＡＧＧＡＴＧＧＧＣＡＣＣＡＣＧＣＣＧＧＴＧＡＡＣＡＧＣＴＣＣＴＣＧＣＣＣＴＴＧＣＴＣＡＣＧＧＧＧＣＣＧＧＧＧＴＴＣＴＣＣＴＣＣＡＣＧＴＣＧＣＣＧＧＣＣＴＧＣＴＴＣＡＧＣＡＧＧＣＴＧＡＡＧＴＴＧＧＴＧＧＣＣＡＧＧＡＴＣＣＴＣＴＣＧＣＡＣＡＧＣＣＴＣＣＡＧＣＣＧＧＴＣＡＣＧＣＣＧＴＴＧＡＴＧＧＴＣＡＣＣＣＴＧＡＡＣＡＧＣＡＧＧＣＴＧＣＣＧＴＣＧＧＧＧＴＴＧＡＴＣＡＧＣＣＴＣＴＣＧＴＣＧＡＴＧＡＴＣＴＴＧＴＴＧＣＣＧＴＴＣＣＡＣＡＧＧＧＴＧＣＣＧＧＴＣＡＣＧＧＴＧＡＴＣＴＴＣＴＴＧＣＣＧＴＣＧＡＡＣＡＣＧＧＣＧＡＴＧＣＣＣＴＣＧＴＡＧＧＧＣＣＴＧＣＣＧＡＡＧＴＡＧＴＣＧＡＴＣＡＴＧＴＴＧＧＧＧＧＴＣＡＣＧＣＣＧＴＣＧＡＴＣＡＣＣＡＧＧＧＴＧＣＣＧＴＡＧＴＧＣＡＧＧＡＴＣＡＣＣＴＴＧＡＡＧＴＧＧＴＧＧＴＣＧＴＣＣＡＣＧＧＧＧＴＡＣＡＣＣＡＣＣＴＴＧＡＡＡＡＴＣＴＴＣＴＣＧＡＴＣＴＧＧＣＣＣＡＴＣＴＧＧＴＣＧＣＣＧＣＴＣＡＧＧＣＣＣＴＣＧＴＡＧＧＧＧＡＴＧＡＴＣＡＣＧＴＧＧＡＴＧＴＣＧＡＴＣＴＴＣＡＧＧＣＣＧＴＴＣＴＣＧＣＣＧＣＴＣＡＧＣＡＣＧＡＴＣＣＴＣＴＧＧＡＴＧＧＧＧＧＴＣＡＣＧＣＴＣＡＣＧＣＣＣＡＧＧＴＴＣＴＧＧＡＡＣＡＧＧＣＴＧＣＴＣＡＣＧＣＣＧＣＣＣＴＧＣＴＣＣＡＧＣＡＣＣＴＧＧＴＣＣＡＧＧＴＴＧＴＡＧＣＣＧＧＣＧＧＴＣＴＧＣＣＴＣＣＡＧＴＣＧＣＣＣＡＣＧＡＡＧＴＣＣＴＣＣＡＧＧＧＴＧＡＡＣＡＣＧＧＣＣＴＣＣＴＣＧＡＡＧＣＴＧＣＡＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＡＴＧＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＣＡＧＧＴＴＧＣＣＣＴＧＣＡＣＧＡＡＣＴＣＣＴＣＣＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＴＧＴＴＧＴＡＣＣＴＣＴＴＧＧＧＣＣＴＧＴＴＣＡＧＧＡＴＣＴＴＧＴＴＧＧＣＧＴＴＣＴＣＧＴＧＧＴＣＣＡＧＧＡＡ
Ｐ００１４７完全配列（ＩＴＲからＩＴＲ）：（配列番号２７７）
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Ｐ００４１１完全配列（ＩＴＲからＩＴＲ）：（配列番号２７８）
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Ｐ００４１５完全配列（ＩＴＲからＩＴＲ）：（配列番号２７９）
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Ｐ００４１８完全配列（ＩＴＲからＩＴＲ）：（配列番号２８０）
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Ｐ００１２３完全配列（ＩＴＲからＩＴＲ）：（配列番号２８１）
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Ｐ００２０４完全配列（ＩＴＲからＩＴＲ）：（配列番号２８２）
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Ｐ００３５３完全配列（ＩＴＲからＩＴＲ）：（配列番号２８３）
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Ｐ００３５４完全配列（ＩＴＲからＩＴＲ）：（配列番号２８４）
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Ｐ００３５０：３００／６００ｂｐのＨＡ Ｆ９構築物（Ｇ５５１について）（配列番号２８５）
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Ｐ００３６２：３００／１５００ｂｐのＨＡ Ｆ９構築物（Ｇ５５１について）（配列番号２８７）
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Ｃａｓ９ ＯＲＦ（配列番号７０３）
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Ｕ ｄｅｐ Ｃａｓ９（配列番号７０５）を含むｍＲＮＡ
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ＧＡＵＣＡＵＣＡＡＧＧＡＣＡＡＧＧＡＣＵＵＣＣＵＧＧＡＣＡＡＣＧＡＡＧＡＡＡＡＣＧＡＡＧＡＣＡＵＣＣＵＧＧＡＡＧＡＣＡＵＣＧＵＣＣＵＧＡＣＡＣＵＧＡＣＡＣＵＧＵＵＣＧＡＡＧＡＣＡＧＡＧＡＡＡＵＧＡＵＣＧＡＡＧＡＡＡＧＡＣＵＧＡＡＧＡＣＡＵＡＣＧＣＡＣＡＣＣＵＧＵＵＣＧＡＣＧＡＣＡＡＧＧＵＣＡＵＧＡＡＧＣＡＧＣＵＧＡＡＧＡＧＡＡＧＡＡＧＡＵＡＣＡＣＡＧＧＡＵＧＧＧＧＡＡＧＡＣＵＧＡＧＣＡＧＡＡＡＧＣＵＧＡＵＣＡＡＣＧＧＡＡＵＣＡＧＡＧＡＣＡＡＧＣＡＧＡＧＣＧＧＡＡＡＧＡＣＡＡＵＣＣＵＧＧＡＣＵＵＣＣＵＧＡＡＧＡＧＣＧＡＣＧＧＡＵＵＣＧＣＡＡＡＣＡＧＡＡＡＣＵＵＣＡＵＧＣＡＧＣＵＧＡＵＣＣＡＣＧＡＣＧＡＣＡＧＣＣＵＧＡＣＡＵＵＣＡＡＧＧＡＡＧＡＣＡＵＣＣＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＧＵＣＡＧＣＧＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＣＡＧＣＣＵＧＣＡＣＧＡＡＣＡＣＡＵＣＧＣＡＡＡＣＣＵＧＧＣＡＧＧＡＡＧＣＣＣＧＧＣＡＡＵＣＡＡＧＡＡＧＧＧＡＡＵＣＣＵＧＣＡＧＡＣＡＧＵＣＡＡＧＧＵＣＧＵＣＧＡＣＧＡＡＣＵＧＧＵＣＡＡＧＧＵＣＡＵＧＧＧＡＡＧＡＣＡＣＡＡＧＣＣＧＧＡＡＡＡＣＡＵＣＧＵＣＡＵＣＧＡＡＡＵＧＧＣＡＡＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＧＡＣＡＡＣＡＣＡＧＡＡＧＧＧＡＣＡＧＡＡＧＡＡＣＡＧＣＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＵＧＡＡＧＡＧＡＡＵＣＧＡＡＧＡＡＧＧＡＡＵＣＡＡＧＧＡＡＣＵＧＧＧＡＡＧＣＣＡＧＡＵＣＣＵＧＡＡＧＧＡＡＣＡＣＣＣＧＧＵＣＧＡＡＡＡＣＡＣＡＣＡＧＣＵＧＣＡＧＡＡＣＧＡＡＡＡＧＣＵＧＵＡＣＣＵＧＵＡＣＵＡＣＣＵＧＣＡＧＡＡＣＧＧＡＡＧＡＧＡＣＡＵＧＵＡＣＧＵＣＧＡＣＣＡＧＧＡＡＣＵＧＧＡＣＡＵＣＡＡＣＡＧＡＣＵＧＡＧＣＧＡＣＵＡＣＧＡＣＧＵＣＧＡＣＣＡＣＡＵＣＧＵＣＣＣＧＣＡＧＡＧＣＵＵＣＣＵＧＡＡＧＧＡＣＧＡＣＡＧＣＡＵＣＧＡＣＡＡＣＡＡＧＧＵＣＣＵＧＡＣＡＡＧＡＡＧＣＧＡＣＡＡＧＡＡＣＡＧＡＧＧＡＡＡＧＡＧＣＧＡＣＡＡＣＧＵＣＣＣＧＡＧＣＧＡＡＧＡＡＧＵＣＧＵＣＡＡＧＡＡＧＡＵＧＡＡＧＡＡＣＵＡＣＵＧＧＡＧＡＣＡＧＣＵＧＣＵＧＡＡＣＧＣＡＡＡＧＣＵＧＡＵＣＡＣＡＣＡＧＡＧＡＡＡＧＵＵＣＧＡＣＡＡＣＣＵＧＡＣＡＡＡＧＧＣＡＧＡＧＡＧＡＧＧＡＧＧＡＣＵＧＡＧＣＧＡＡＣＵＧＧＡＣＡＡＧＧＣＡＧＧＡＵＵＣＡＵＣＡＡＧＡＧＡＣＡＧＣＵＧＧＵＣＧＡＡＡＣＡＡＧＡＣＡＧＡＵＣＡＣＡＡＡＧＣＡＣＧＵＣＧＣＡＣＡＧＡＵＣＣＵＧＧＡＣＡＧＣＡＧＡＡＵＧＡＡＣＡＣＡＡＡＧＵＡＣＧＡＣＧＡＡＡＡＣＧＡＣＡＡＧＣＵＧＡＵＣＡＧＡＧＡＡＧＵＣＡＡＧＧＵＣＡＵＣＡＣＡＣＵＧＡＡＧＡＧＣＡＡＧＣＵＧＧＵＣＡＧＣＧＡＣＵＵＣＡＧＡＡＡＧＧＡＣＵＵＣＣＡＧＵＵＣＵＡＣＡＡＧＧＵＣＡＧＡＧＡＡＡＵＣＡＡＣＡＡＣＵＡＣＣＡＣＣＡＣＧＣＡＣＡＣＧＡＣＧＣＡＵＡＣＣＵＧＡＡＣＧＣＡＧＵＣＧＵＣＧＧＡＡＣＡＧＣＡＣＵＧＡＵＣＡＡＧＡＡＧＵＡＣＣＣＧＡＡＧＣＵＧＧＡＡＡＧＣＧＡＡＵＵＣＧＵＣＵＡＣＧＧＡＧＡＣＵＡＣＡＡＧＧＵＣＵＡＣＧＡＣＧＵＣＡＧＡＡＡＧＡＵＧＡＵＣＧＣＡＡＡＧＡＧＣＧＡＡＣＡＧＧＡＡＡＵＣＧＧＡＡＡＧＧＣＡＡＣＡＧＣＡＡＡＧＵＡＣＵＵＣＵＵＣＵＡＣＡＧＣＡＡＣＡＵＣＡＵＧＡＡＣＵＵＣＵＵＣＡＡＧＡＣＡＧＡＡＡＵＣＡＣＡＣＵＧＧＣＡＡＡＣＧＧＡＧＡＡＡＵＣＡＧＡＡＡＧＡＧＡＣＣＧＣＵＧＡＵＣＧＡＡＡＣＡＡＡＣＧＧＡＧＡＡＡＣＡＧＧＡＧＡＡＡＵＣＧＵＣＵＧＧＧＡＣＡＡＧＧＧＡＡＧＡＧＡＣＵＵＣＧＣＡＡＣＡＧＵＣＡＧＡＡＡＧＧＵＣＣＵＧＡＧＣＡＵＧＣＣＧＣＡＧＧＵＣＡＡＣＡＵＣＧＵＣＡＡＧＡＡＧＡＣＡＧＡＡＧＵＣＣＡＧＡＣＡＧＧＡＧＧＡＵＵＣＡＧＣＡＡＧＧＡＡＡＧＣＡＵＣＣＵＧＣＣＧＡＡＧＡＧＡＡＡＣＡＧＣＧＡＣＡＡＧＣＵＧＡＵＣＧＣＡＡＧＡＡＡＧＡＡＧＧＡＣＵＧＧＧＡＣＣＣＧＡＡＧＡＡＧＵＡＣＧＧＡＧＧＡＵＵＣＧＡＣＡＧＣＣＣＧＡＣＡＧＵＣＧＣＡＵＡＣＡＧＣＧＵＣＣＵＧＧＵＣＧＵＣＧＣＡＡＡＧＧＵＣＧＡＡＡＡＧＧＧＡＡＡＧＡＧＣＡＡＧＡＡＧＣＵＧＡＡＧＡＧＣＧＵＣＡＡＧＧＡＡＣＵＧＣＵＧＧＧＡＡＵＣＡＣＡＡＵＣＡＵＧＧＡＡＡＧＡＡＧＣＡＧＣＵＵＣＧＡＡＡＡＧＡＡＣＣＣＧＡＵＣＧＡＣＵＵＣＣＵＧＧＡＡＧＣＡＡＡＧＧＧＡＵＡＣＡＡＧＧＡＡＧＵＣＡＡＧＡＡＧＧＡＣＣＵＧＡＵＣＡＵＣＡＡＧＣＵＧＣＣＧＡＡＧＵＡＣＡＧＣＣＵＧＵＵＣＧＡＡＣＵＧＧＡＡＡＡＣＧＧＡＡＧＡＡＡＧＡＧＡＡＵＧＣＵＧＧＣＡＡＧＣＧＣＡＧＧＡＧＡＡＣＵＧＣＡＧＡＡＧＧＧＡＡＡＣＧＡＡＣＵＧＧＣＡＣＵＧＣＣＧＡＧＣＡＡＧＵＡＣＧＵＣＡＡＣＵＵＣＣＵ
ＧＵＡＣＣＵＧＧＣＡＡＧＣＣＡＣＵＡＣＧＡＡＡＡＧＣＵＧＡＡＧＧＧＡＡＧＣＣＣＧＧＡＡＧＡＣＡＡＣＧＡＡＣＡＧＡＡＧＣＡＧＣＵＧＵＵＣＧＵＣＧＡＡＣＡＧＣＡＣＡＡＧＣＡＣＵＡＣＣＵＧＧＡＣＧＡＡＡＵＣＡＵＣＧＡＡＣＡＧＡＵＣＡＧＣＧＡＡＵＵＣＡＧＣＡＡＧＡＧＡＧＵＣＡＵＣＣＵＧＧＣＡＧＡＣＧＣＡＡＡＣＣＵＧＧＡＣＡＡＧＧＵＣＣＵＧＡＧＣＧＣＡＵＡＣＡＡＣＡＡＧＣＡＣＡＧＡＧＡＣＡＡＧＣＣＧＡＵＣＡＧＡＧＡＡＣＡＧＧＣＡＧＡＡＡＡＣＡＵＣＡＵＣＣＡＣＣＵＧＵＵＣＡＣＡＣＵＧＡＣＡＡＡＣＣＵＧＧＧＡＧＣＡＣＣＧＧＣＡＧＣＡＵＵＣＡＡＧＵＡＣＵＵＣＧＡＣＡＣＡＡＣＡＡＵＣＧＡＣＡＧＡＡＡＧＡＧＡＵＡＣＡＣＡＡＧＣＡＣＡＡＡＧＧＡＡＧＵＣＣＵＧＧＡＣＧＣＡＡＣＡＣＵＧＡＵＣＣＡＣＣＡＧＡＧＣＡＵＣＡＣＡＧＧＡＣＵＧＵＡＣＧＡＡＡＣＡＡＧＡＡＵＣＧＡＣＣＵＧＡＧＣＣＡＧＣＵＧＧＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＣＣＣＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＡＡＡＧＧＵＣＵＡＧＣＵＡＧＣＣＡＵＣＡＣＡＵＵＵＡＡＡＡＧＣＡＵＣＵＣＡＧＣＣＵＡＣＣＡＵＧＡＧＡＡＵＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＵＧＡＡＧＡＵＣＡＡＵＡＧＣＵＵＡＵＵＣＡＵＣＵＣＵＵＵＵＵＣＵＵＵＵＵＣＧＵＵＧＧＵＧＵＡＡＡＧＣＣＡＡＣＡＣＣＣＵＧＵＣＵＡＡＡＡＡＡＣＡＵＡＡＡＵＵＵＣＵＵＵＡＡＵＣＡＵＵＵＵＧＣＣＵＣＵＵＵＵＣＵＣＵＧＵＧＣＵＵＣＡＡＵＵＡＡＵＡＡＡＡＡＡＵＧＧＡＡＡＧＡＡＣＣＵＣＧＡＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ
［配列表］

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REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.

<120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR TRANSGENE EXPRESSION FROM AN ALBUMIN
LOCUS

<130> PA24-188

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<151> 2019-04-29

<150> US 62/747,402
<151> 2018-10-18

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gtgcaaagta acttagagtg actgaaactt cacagaatag ggttgaagat tgaattcata 300

actatcccaa agacctatcc attgcactat gctttattta aaaaccacaa aacctgtgct 360

gttgatctca taaatagaac ttgtatttat atttattttc attttagtct gtcttcttgg 420

ttgctgttga tagacactaa aagagtatta gatattatct aagtttgaat ataaggctat 480

aaatatttaa taatttttaa aatagtattc ttggtaattg aattattctt ctgtttaaag 540

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tgaaacaaat gcataatcta agtcaaatgg aaagaaatat aaaaagtaac attattactt 660

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cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100


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ugcauuuguu ucaaaauauu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100


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cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100


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cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100


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cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100


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cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100


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cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100


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accuuuuuuu uuuuuuaccu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

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guaaauaucu acuaagacaa guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100


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<212> RNA
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uuuuucuagu aauggaagcc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100


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uuauauuauu gauauauuuu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100


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cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100


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cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100


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uacuaaaacu uuauuuuacu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100


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aaaguugaac aauagaaaaa guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100


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aaugcauaau cuaagucaaa guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

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gccaactcca tcactagggg ttcct 145


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taggtcagtg aagagaagaa caaaaagcag catattacag ttagttgtct tcatcaatct 60

ttaaatatgt tgtgtggttt ttctctccct gtttccacag 100


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tttcttgatc atgaaaacgc caacaaaatt ctgaatcggc caaagaggta taattcaggt 60

aaattggaag agtttgttca agggaacctt gagagagaat gtatggaaga aaagtgtagt 120

tttgaagaag cacgagaagt ttttgaaaac actgaaagaa caactgaatt ttggaagcag 180

tatgttgatg gagatcagtg tgagtccaat ccatgtttaa atggcggcag ttgcaaggat 240

gacattaatt cctatgaatg ttggtgtccc tttggatttg aaggaaagaa ctgtgaatta 300

gatgtaacat gtaacattaa gaatggcaga tgcgagcagt tttgtaaaaa tagtgctgat 360

aacaaggtgg tttgctcctg tactgaggga tatcgacttg cagaaaacca gaagtcctgt 420

gaaccagcag tgccatttcc atgtggaaga gtttctgttt cacaaacttc taagctcacc 480

cgtgctgaga ctgtttttcc tgatgtggac tatgtaaatt ctactgaagc tgaaaccatt 540

ttggataaca tcactcaaag cacccaatca tttaatgact tcactcgggt tgttggtgga 600

gaagatgcca aaccaggtca attcccttgg caggttgttt tgaatggtaa agttgatgca 660

ttctgtggag gctctatcgt taatgaaaaa tggattgtaa ctgctgccca ctgtgttgaa 720

actggtgtta aaattacagt tgtcgcaggt gaacataata ttgaggagac agaacataca 780

gagcaaaagc gaaatgtgat tcgaattatt cctcaccaca actacaatgc agctattaat 840

aagtacaacc atgacattgc ccttctggaa ctggacgaac ccttagtgct aaacagctac 900

gttacaccta tttgcattgc tgacaaggaa tacacgaaca tcttcctcaa atttggatct 960

ggctatgtaa gtggctgggg aagagtcttc cacaaaggga gatcagcttt agttcttcag 1020

taccttagag ttccacttgt tgaccgagcc acatgtcttc tatctacaaa gttcaccatc 1080

tataacaaca tgttctgtgc tggcttccat gaaggaggta gagattcatg tcaaggagat 1140

agtgggggac cccatgttac tgaagtggaa gggaccagtt tcttaactgg aattattagc 1200

tggggtgaag agtgtgcaat gaaaggcaaa tatggaatat ataccaaggt atcccggtat 1260

gtcaactgga ttaaggaaaa aacaaagctc acttaa 1296


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aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt gggctctatg gcttctgagg 240

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ttatcatgtc tg 192


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ggtgaacata atattgagga gacagaacat acagagcaaa agcgaaatgt gattcgaatt 1260

attcctcacc acaactacaa tgcagctatt aataagtaca accatgacat tgcccttctg 1320

gaactggacg aacccttagt gctaaacagc tacgttacac ctatttgcat tgctgacaag 1380

gaatacacga acatcttcct caaatttgga tctggctatg taagtggctg gggaagagtc 1440

ttccacaaag ggagatcagc tttagttctt cagtacctta gagttccact tgttgaccga 1500

gccacatgtc ttctatctac aaagttcacc atctataaca acatgttctg tgctggcttc 1560

catgaaggag gtagagattc atgtcaagga gatagtgggg gaccccatgt tactgaagtg 1620

gaagggacca gtttcttaac tggaattatt agctggggtg aagagtgtgc aatgaaaggc 1680

aaatatggaa tatataccaa ggtatcccgg tatgtcaact ggattaagga aaaaacaaag 1740

ctcacttaac ctcgactgtg ccttctagtt gccagccatc tgttgtttgc ccctcccccg 1800

tgccttcctt gaccctggaa ggtgccactc ccactgtcct ttcctaataa aatgaggaaa 1860

ttgcatcgca ttgtctgagt aggtgtcatt ctattctggg gggtggggtg gggcaggaca 1920

gcaaggggga ggattgggaa gacaatagca ggcatgctgg ggatgcggtg ggctctatgg 1980

cttctgaggc ggaaagaacc agctggggct ctagggggta tcccccttag gtggttatat 2040

tattgatata tttttggtat ctttgatgac aataatgggg gattttgaaa gcttagcttt 2100

aaatttcttt taattaaaaa aaaatgctag gcagaatgac tcaaattacg ttggatacag 2160

ttgaatttat tacggtctca tagggcctgc ctgctcgacc atgctatact aaaaattaaa 2220

agtgtgtgtt actaatttta taaatggagt ttccatttat atttaccttt atttcttatt 2280

taccattgtc ttagtagata tttacaaaca tgacagaaac actaaatctt gagtttgaat 2340

gcacagatat aaacacttaa cgggttttaa aaataataat gttggtgaaa aaatataact 2400

ttgagtgtag cagagaggaa ccattgccac cttcagattt tcctgtaacg atcgggaact 2460

ggcatcttca gggagtagct taggtcagtg aagagaagaa caaaaagcag catattacag 2520

ttagttgtct tcatcaatct ttaaatatgt tgtgtggttt ttctctccct gtttccacag 2580

acaagagtga gatcgcccat cggtataatg atttgggaga acaacatttc aaaggcctgt 2640

aagttataat gctgaaagcc cacttaatat ttctggtagt attagttaaa gttttaaaac 2700

acctttttcc accttgagtg tgagaattgt agagcagtgc tgtccagtag aaatgtgtgc 2760

attgacagaa agactgtgga tctgtgctga gcaatgtggc agccagagat cacaaggcta 2820

tcaagcactt tgcacatggc aagtgtaact gagaagcaca cattcaaata atagttaatt 2880

ttaattgaat gtatctagcc atgtgtggct agtagctcct ttcctggaga gagaatctgg 2940

agcccacatc taacttgtta agtctggaat cttatttttt atttctggaa aggtctatga 3000

actatagttt tgggggcagc tcacttacta acttttaatg caataagatc catggtatct 3060

tgagaacatt attttgtctc tttgtagtac tgaaacctta tacatgtgaa gtaaggggtc 3120

tatacttaag tcacatctcc aaccttagta atgttttaat gtagtaaaaa aatgagtaat 3180

taatttattt ttagaaggtc aatagtatca tgtattccaa ataacagagg tatatggtta 3240

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gagtagtttg cctgtttgcc tcatgttcat aaatctattg acacatatgt gcatctgcac 3360

ttcagcatgg tagaagtcca tattcctttg cttggaaagg caggtgttcc cattacgcct 3420

cagagaatag ctgacgggaa gaggctttct agatagttgt atgaaagata tacaaaatct 3480

cgcaggtata cacaggcatg atttgctggt tgggagagcc acttagatct aggaacccct 3540

agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgcccgggc 3600

aaagcccggg cgtcgggcga cctttggtcg cccggcctca gtgagcgagc gagcgcgcag 3660

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oligonucleotide"

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guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60

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<213> Artificial Sequence

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<213> Artificial Sequence

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tcggtccag 9


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<213> Unknown

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<221> source
<223> /note="Description of Unknown:
Nucleoplasmin bipartite NLS sequence"

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<212> DNA
<213> Artificial Sequence

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<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
polynucleotide"

<400> 703
atggataaga agtactcaat cgggctggat atcggaacta attccgtggg ttgggcagtg 60

atcacggatg aatacaaagt gccgtccaag aagttcaagg tcctggggaa caccgataga 120

cacagcatca agaaaaatct catcggagcc ctgctgtttg actccggcga aaccgcagaa 180

gcgacccggc tcaaacgtac cgcgaggcga cgctacaccc ggcggaagaa tcgcatctgc 240

tatctgcaag agatcttttc gaacgaaatg gcaaaggtcg acgacagctt cttccaccgc 300

ctggaagaat ctttcctggt ggaggaggac aagaagcatg aacggcatcc tatctttgga 360

aacatcgtcg acgaagtggc gtaccacgaa aagtacccga ccatctacca tctgcggaag 420

aagttggttg actcaactga caaggccgac ctcagattga tctacttggc cctcgcccat 480

atgatcaaat tccgcggaca cttcctgatc gaaggcgatc tgaaccctga taactccgac 540

gtggataagc ttttcattca actggtgcag acctacaacc aactgttcga agaaaaccca 600

atcaatgcta gcggcgtcga tgccaaggcc atcctgtccg cccggctgtc gaagtcgcgg 660

cgcctcgaaa acctgatcgc acagctgccg ggagagaaaa agaacggact tttcggcaac 720

ttgatcgctc tctcactggg actcactccc aatttcaagt ccaattttga cctggccgag 780

gacgcgaagc tgcaactctc aaaggacacc tacgacgacg acttggacaa tttgctggca 840

caaattggcg atcagtacgc ggatctgttc cttgccgcta agaacctttc ggacgcaatc 900

ttgctgtccg atatcctgcg cgtgaacacc gaaataacca aagcgccgct tagcgcctcg 960

atgattaagc ggtacgacga gcatcaccag gatctcacgc tgctcaaagc gctcgtgaga 1020

cagcaactgc ctgaaaagta caaggagatc ttcttcgacc agtccaagaa tgggtacgca 1080

gggtacatcg atggaggcgc tagccaggaa gagttctata agttcatcaa gccaatcctg 1140

gaaaagatgg acggaaccga agaactgctg gtcaagctga acagggagga tctgctccgg 1200

aaacagagaa cctttgacaa cggatccatt ccccaccaga tccatctggg tgagctgcac 1260

gccatcttgc ggcgccagga ggacttttac ccattcctca aggacaaccg ggaaaagatc 1320

gagaaaattc tgacgttccg catcccgtat tacgtgggcc cactggcgcg cggcaattcg 1380

cgcttcgcgt ggatgactag aaaatcagag gaaaccatca ctccttggaa tttcgaggaa 1440

gttgtggata agggagcttc ggcacaaagc ttcatcgaac gaatgaccaa cttcgacaag 1500

aatctcccaa acgagaaggt gcttcctaag cacagcctcc tttacgaata cttcactgtc 1560

tacaacgaac tgactaaagt gaaatacgtt actgaaggaa tgaggaagcc ggcctttctg 1620

tccggagaac agaagaaagc aattgtcgat ctgctgttca agaccaaccg caaggtgacc 1680

gtcaagcagc ttaaagagga ctacttcaag aagatcgagt gtttcgactc agtggaaatc 1740

agcggggtgg aggacagatt caacgcttcg ctgggaacct atcatgatct cctgaagatc 1800

atcaaggaca aggacttcct tgacaacgag gagaacgagg acatcctgga agatatcgtc 1860

ctgaccttga cccttttcga ggatcgcgag atgatcgagg agaggcttaa gacctacgct 1920

catctcttcg acgataaggt catgaaacaa ctcaagcgcc gccggtacac tggttggggc 1980

cgcctctccc gcaagctgat caacggtatt cgcgataaac agagcggtaa aactatcctg 2040

gatttcctca aatcggatgg cttcgctaat cgtaacttca tgcaattgat ccacgacgac 2100

agcctgacct ttaaggagga catccaaaaa gcacaagtgt ccggacaggg agactcactc 2160

catgaacaca tcgcgaatct ggccggttcg ccggcgatta agaagggaat tctgcaaact 2220

gtgaaggtgg tcgacgagct ggtgaaggtc atgggacggc acaaaccgga gaatatcgtg 2280

attgaaatgg cccgagaaaa ccagactacc cagaagggcc agaaaaactc ccgcgaaagg 2340

atgaagcgga tcgaagaagg aatcaaggag ctgggcagcc agatcctgaa agagcacccg 2400

gtggaaaaca cgcagctgca gaacgagaag ctctacctgt actatttgca aaatggacgg 2460

gacatgtacg tggaccaaga gctggacatc aatcggttgt ctgattacga cgtggaccac 2520

atcgttccac agtcctttct gaaggatgac tcgatcgata acaaggtgtt gactcgcagc 2580

gacaagaaca gagggaagtc agataatgtg ccatcggagg aggtcgtgaa gaagatgaag 2640

aattactggc ggcagctcct gaatgcgaag ctgattaccc agagaaagtt tgacaatctc 2700

actaaagccg agcgcggcgg actctcagag ctggataagg ctggattcat caaacggcag 2760

ctggtcgaga ctcggcagat taccaagcac gtggcgcaga tcttggactc ccgcatgaac 2820

actaaatacg acgagaacga taagctcatc cgggaagtga aggtgattac cctgaaaagc 2880

aaacttgtgt cggactttcg gaaggacttt cagttttaca aagtgagaga aatcaacaac 2940

taccatcacg cgcatgacgc atacctcaac gctgtggtcg gtaccgccct gatcaaaaag 3000

taccctaaac ttgaatcgga gtttgtgtac ggagactaca aggtctacga cgtgaggaag 3060

atgatagcca agtccgaaca ggaaatcggg aaagcaactg cgaaatactt cttttactca 3120

aacatcatga actttttcaa gactgaaatt acgctggcca atggagaaat caggaagagg 3180

ccactgatcg aaactaacgg agaaacgggc gaaatcgtgt gggacaaggg cagggacttc 3240

gcaactgttc gcaaagtgct ctctatgccg caagtcaata ttgtgaagaa aaccgaagtg 3300

caaaccggcg gattttcaaa ggaatcgatc ctcccaaaga gaaatagcga caagctcatt 3360

gcacgcaaga aagactggga cccgaagaag tacggaggat tcgattcgcc gactgtcgca 3420

tactccgtcc tcgtggtggc caaggtggag aagggaaaga gcaaaaagct caaatccgtc 3480

aaagagctgc tggggattac catcatggaa cgatcctcgt tcgagaagaa cccgattgat 3540

ttcctcgagg cgaagggtta caaggaggtg aagaaggatc tgatcatcaa actccccaag 3600

tactcactgt tcgaactgga aaatggtcgg aagcgcatgc tggcttcggc cggagaactc 3660

caaaaaggaa atgagctggc cttgcctagc aagtacgtca acttcctcta tcttgcttcg 3720

cactacgaaa aactcaaagg gtcaccggaa gataacgaac agaagcagct tttcgtggag 3780

cagcacaagc attatctgga tgaaatcatc gaacaaatct ccgagttttc aaagcgcgtg 3840

atcctcgccg acgccaacct cgacaaagtc ctgtcggcct acaataagca tagagataag 3900

ccgatcagag aacaggccga gaacattatc cacttgttca ccctgactaa cctgggagcc 3960

ccagccgcct tcaagtactt cgatactact atcgatcgca aaagatacac gtccaccaag 4020

gaagttctgg acgcgaccct gatccaccaa agcatcactg gactctacga aactaggatc 4080

gatctgtcgc agctgggtgg cgat 4104


<210> 704
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polynucleotide"

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tacccgaagc tggaaagcga attcgtctac ggagactaca aggtctacga cgtcagaaag 3060

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ccgatcagag aacaggcaga aaacatcatc cacctgttca cactgacaaa cctgggagca 3960

ccggcagcat tcaagtactt cgacacaaca atcgacagaa agagatacac aagcacaaag 4020

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<212> RNA
<213> Artificial Sequence

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<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
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gggucccgca gucggcgucc agcggcucug cuuguucgug ugugugucgu ugcaggccuu 60

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cgaauacuuc acagucuaca acgaacugac aaaggucaag uacgucacag aaggaaugag 1680

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acagggagac agccugcacg aacacaucgc aaaccuggca ggaagcccgg caaucaagaa 2280

gggaauccug cagacaguca aggucgucga cgaacugguc aaggucaugg gaagacacaa 2340

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<212> RNA
<213> Artificial Sequence

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oligonucleotide"

<400> 1130
gacccccucc accccgccuc 20


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peptide"

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Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15


Gly Pro



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<212> PRT
<213> Artificial Sequence

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<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"

<400> 1132
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15


Pro Gly Pro



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<212> PRT
<213> Artificial Sequence

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<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"

<400> 1133
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15


Asn Pro Gly Pro
20


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<212> PRT
<213> Artificial Sequence

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<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"

<400> 1134
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15


Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20


<210> 1135
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<221> source
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peptide"

<400> 1135
Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
1 5 10 15


Glu Asn Pro Gly Pro
20


<210> 1136
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

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<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"

<400> 1136
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15


Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20


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<212> PRT
<213> Artificial Sequence

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<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"

<400> 1137
Gly Ser Gly Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp
1 5 10 15


Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20


<210> 1138
<211> 25
<212> PRT
<213> Artificial Sequence

<220>
<221> source
<223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic
peptide"

<400> 1138
Gly Ser Gly Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala
1 5 10 15


Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20 25

【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図7D】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【図10】

【図11A】

【図11B】

【図12A】

【図12B】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図14D】

【図15】

【図16A】

【図16B】

【図17】

【手続補正書】

【提出日】2024-05-09

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【請求項1】

明細書に記載のシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）。

【手続補正2】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】追加

【補正の内容】

【配列表】

2024099582000001.xml