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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公開特許公報(A)
(11)【公開番号】P2024099931
(43)【公開日】2024-07-26
(54)【発明の名称】Ｔｙｒｏ３断片ペプチド及びその製造方法
(51)【国際特許分類】
C07K 14/705 20060101AFI20240719BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20240719BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240719BHJP
C12N 15/63 20060101ALN20240719BHJP
C12N 1/15 20060101ALN20240719BHJP
C12N 1/19 20060101ALN20240719BHJP
C12N 1/21 20060101ALN20240719BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20240719BHJP
【ＦＩ】
C07K14/705
C12P21/02 C
C12N15/12 ZNA
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
【審査請求】未請求
【請求項の数】4
【出願形態】ＯＬ
(21)【出願番号】P 2023003571
(22)【出願日】2023-01-13
(71)【出願人】
【識別番号】502437894
【氏名又は名称】学校法人大阪医科薬科大学
(74)【代理人】
【識別番号】100121728
【弁理士】
【氏名又は名称】井関 勝守
(74)【代理人】
【識別番号】100165803
【弁理士】
【氏名又は名称】金子 修平
(72)【発明者】
【氏名】福森 亮雄
(72)【発明者】
【氏名】柳田 寛太
(72)【発明者】
【氏名】高嶋 結衣
(72)【発明者】
【氏名】岡田 健
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA13
4B064DA14
4B065AA93X
4B065AA93Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA46
4H045AA10
4H045AA20
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA50
4H045EA50
4H045EA51
4H045FA74
(57)【要約】 （修正有）
【課題】Ｔｙｒｏ３の切断後の分子小断片であるペプチドを特定し、当該ペプチドを製造できるようにする。
【解決手段】Ｔｙｒｏ３断片ペプチドの製造方法は、特定のヌクレオチド配列を含む発現ベクターを該発現ベクターによる遺伝子発現が可能な宿主細胞に導入するステップと、前記宿主細胞を前記遺伝子発現が可能な条件下で培養するステップと、前記宿主細胞から特定のアミノ酸配列を含むＴｙｒｏ３断片ペプチドを回収するステップとを含む。
【選択図】なし
【解決手段】Ｔｙｒｏ３断片ペプチドの製造方法は、特定のヌクレオチド配列を含む発現ベクターを該発現ベクターによる遺伝子発現が可能な宿主細胞に導入するステップと、前記宿主細胞を前記遺伝子発現が可能な条件下で培養するステップと、前記宿主細胞から特定のアミノ酸配列を含むＴｙｒｏ３断片ペプチドを回収するステップとを含む。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号２～４のいずれかのアミノ酸配列を含むＴｙｒｏ３断片ペプチドであって、
配列番号３及び４における最もＮ末端側のグルタミンはピログルタミル化修飾を受けている、Ｔｙｒｏ３断片ペプチド。
配列番号３及び４における最もＮ末端側のグルタミンはピログルタミル化修飾を受けている、Ｔｙｒｏ３断片ペプチド。
【請求項2】
Ｃ末端にタグ分子を含む、請求項１に記載のＴｙｒｏ３断片ペプチド。
【請求項3】
配列番号６のヌクレオチド配列を含む発現ベクターを該発現ベクターによる遺伝子発現が可能な宿主細胞に導入するステップと、
前記宿主細胞を前記遺伝子発現が可能な条件下で培養するステップと、
前記宿主細胞から請求項１又は２に記載のペプチドを回収するステップとを含む、Ｔｙｒｏ３断片ペプチドの製造方法。
前記宿主細胞を前記遺伝子発現が可能な条件下で培養するステップと、
前記宿主細胞から請求項１又は２に記載のペプチドを回収するステップとを含む、Ｔｙｒｏ３断片ペプチドの製造方法。
【請求項4】
前記発現ベクターは、タグ分子をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項３に記載のＴｙｒｏ３断片ペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、Ｔｙｒｏ３断片ペプチド及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【0002】
現在、多くの疾患が知られているが、中でも癌やアルツハイマー病等は生活の質を著しく低下させる疾患として知られている。それらの原因は、生体に不要な腫瘍細胞やアミロイド斑等の蓄積である。従来のコンピュータ断層撮影法（Ｃｏｍｐｕｔｅｄ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ：ＣＴ）、核磁共鳴画像法（Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｉｍａｇｉｎｇ：ＭＲＩ）及び陽電子放出断層撮影法（Ｐｏｓｉｔｒｏｎ Ｅｍｉｓｓｉｏｎ Ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ：ＰＥＴ）等の画像診断技術は、腫瘍やアミロイド等の凝集塊の検出に有効であるものの、それらの蓄積量が少ないときは検出が困難である。そのため、上記のような従来技術によって腫瘍や凝集塊が発見されたとしても、既に病状が進行しており手遅れとなる場合がある。
【0003】
これまでに、腫瘍やアミロイド等の生体に不要な凝集塊の認識や貪食に中心的な役割を果たす分子がいくつか知られており、その中の１つとしてＴＡＭ受容体がある。ＴＡＭ受容体は、Ｔｙｒｏ３、Ａｘｌ及びＭｅｒの３種類の分子からなる１型膜貫通タンパク質の受容体チロシンキナーゼである。ＴＡＭ受容体は、特にアミロイドβタンパク質を認識する受容体として知られており（非特許文献１）、また、Ｔｙｒｏ３が、膵臓癌において発現上昇していることも知られている（非特許文献２）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0004】
【非特許文献1】Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２２，ｐ５８６－５９４（２０２１）．
【非特許文献2】Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔｅｒｓ，４７０，ｐ１４９－１６０（２０２０）．
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
上記事実から、ＴＡＭ受容体分子を指標として癌やアルツハイマー等の疾患の早期診断に利用することが考えられる。例えば、ＴＡＭ受容体分子の１つであるＴｙｒｏ３は、典型的な２段階の切断を受けることが知られており、Ｔｙｒｏ３が腫瘍やアミロイド周辺に存在する量を、血液中への放出が想定される切断後のＴｙｒｏ３の分子小断片の量から推定することで、癌やアミロイドの凝集塊の微量蓄積を検出できる可能性があると考えられる。しかしながら、上記Ｔｙｒｏ３の２段階の切断について、未だその正確な切断部位は不明であり、さらに、この２段階の切断により放出される分子小断片を検出したという報告はない。当該分子小断片を上記腫瘍やアルツハイマー病等の疾患のバイオマーカーとして利用可能にするためには、分子小断片のアミノ酸配列やアミノ酸修飾を特定することが必要であり、それらを特定した上で当該分子小断片を製造することができれば、分子小断片を検出するための抗体等の作製も可能となり得る。
【0006】
本発明は前記問題に鑑みてなされたものであり、その目的は、Ｔｙｒｏ３の切断後の分子小断片であるペプチドを特定し、当該ペプチドを製造できるようにすることにある。
【課題を解決するための手段】
【0007】
前記の目的を達成するために、本発明者らは、鋭意研究の結果、シェダーゼによる細胞外シェディングにより切断されたＴｙｒｏ３の切断部位を特定し、さらにその切断部位がピログルタミル化されていることを見出して本発明を完成した。
【0008】
具体的に、本発明に係るＴｙｒｏ３断片ペプチドは、配列番号２～４のいずれかのアミノ酸配列を含むＴｙｒｏ３断片ペプチドであり、配列番号３及び４における最もＮ末端側のグルタミンはピログルタミル化修飾を受けていることを特徴とする。
【0009】
本発明に係るＴｙｒｏ３断片ペプチドは、Ｃ末端にタグ分子を含むことが好ましい。
【0010】
また、本発明に係るＴｙｒｏ３断片ペプチドの製造方法は、配列番号６のヌクレオチド配列を含む発現ベクターを該発現ベクターによる遺伝子発現が可能な宿主細胞に導入するステップと、前記宿主細胞を前記遺伝子発現が可能な条件下で培養するステップと、前記宿主細胞から上記のペプチドを回収するステップとを含むことを特徴とする。
【0011】
本発明に係るＴｙｒｏ３断片ペプチドの製造方法において、前記発現ベクターは、タグ分子をコードするヌクレオチド配列をさらに含むことが好ましい。
【発明の効果】
【0012】
本発明に係るＴｙｒｏ３断片ペプチド及びその製造方法によると、癌やアルツハイマー病等の疾患のバイオマーカーとして利用可能なＴｙｒｏ３の切断後の分子小断片を得ることができ、これを利用して分子小断片を検出するための抗体等の作製することができるため、癌やアルツハイマー病等の疾患の診断等に有益となり得る。
【図面の簡単な説明】
【0013】
【発明を実施するための形態】
【0014】
以下、本発明を実施するための形態を説明する。以下の好ましい実施形態の説明は、本質的に例示に過ぎず、本発明、その適用方法或いはその用途を制限することを意図するものではない。
【0015】
本発明の一実施形態は、配列番号２～４のいずれかのアミノ酸配列を含むＴｙｒｏ３断片ペプチドであり、配列番号３及び４における最もＮ末端側のグルタミンはピログルタミル化修飾を受けていることを特徴とするものである。
【0016】
本実施形態において、Ｔｙｒｏ３とは、Ａｘｌ及びＭｅｒとによりＴＡＭ受容体を構成する分子であり、ＴＡＭ受容体は１型膜貫通タンパク質の受容体チロシンキナーゼである。上述の通り、ＴＡＭ受容体は、腫瘍やアミロイド等の生体に不要な凝集塊の認識や貪食に中心的な役割を果たす分子として知られており、アミロイドβタンパク質を認識する受容体として知られている。Ｔｙｒｏ３は、所定の癌において発現上昇していることも知られている。
【0017】
また、上述の通りＴｙｒｏ３は、典型的な２段階の切断を受けることが知られており、具体的には、図１に示すように、まずシェダーゼによりＴｙｒｏ３の細胞外の大部分が切断され、その後に細胞膜上に残るＴｙｒｏ３のＣ末端ペプチド（Ｃ末端断片）がその膜貫通領域、すなわち膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）をγ－セクレターゼ（プレセニリン）により切断される。これらの切断により、放出が想定されるＴｙｒｏ３の細胞外分子小断片であるＴｙｒｏ３βが、腫瘍やアミロイド等の凝集塊を認識する際に、全長型のＴｙｒｏ３分子の発現に伴って、血液中に増加すると考えられる。しかしながら、これまでにＴｙｒｏ３βが検出された報告は無く、第１段階の切断に関わるシェダーゼについても明らかとはなっておらず、当該切断における切断部位も不明である。
【0018】
今回、本発明者らは鋭意研究の結果、後に実施例にて説明する通り、シェダーゼによるＴｙｒｏ３の切断部位を特定した。具体的には、Ｔｙｒｏ３は、そのアミノ酸配列における４１８番目のグアニンと４１９番目のグルタミンとの間、４１９番目のグルタミンと４２０番目のグルタミンとの間、又は４２０番目のグルタミンと４２１番目のグアニンとの間のいずれかで切断される。Ｔｙｒｏ３は、全長が８９０アミノ酸長のタンパク質であり（配列番号１）、従って、Ｔｙｒｏ３のシェダーゼによる切断後のＣ末端断片は、４１９番目のグルタミン、４２０番目のグルタミン又は４２１番目のグアニンから８９０番目のシステインまでのアミノ酸配列を有することとなる。
配列番号１：ＭＡＬＲＲＳＭＧＲＰＧＬＰＰＬＰＬＰＰＰＰＲＬＧＬＬＬＡＡＬＡＳＬＬＬＰＥＳＡＡＡＧＬＫＬＭＧＡＰＶＫＬＴＶＳＱＧＱＰＶＫＬＮＣＳＶＥＧＭＥＥＰＤＩＱＷＶＫＤＧＡＶＶＱＮＬＤＱＬＹＩＰＶＳＥＱＨＷＩＧＦＬＳＬＫＳＶＥＲＳＤＡＧＲＹＷＣＱＶＥＤＧＧＥＴＥＩＳＱＰＶＷＬＴＶＥＧＶＰＦＦＴＶＥＰＫＤＬＡＶＰＰＮＡＰＦＱＬＳＣＥＡＶＧＰＰＥＰＶＴＩＶＷＷＲＧＴＴＫＩＧＧＰＡＰＳＰＳＶＬＮＶＴＧＶＴＱＳＴＭＦＳＣＥＡＨＮＬＫＧＬＡＳＳＲＴＡＴＶＨＬＱＡＬＰＡＡＰＦＮＩＴＶＴＫＬＳＳＳＮＡＳＶＡＷＭＰＧＡＤＧＲＡＬＬＱＳＣＴＶＱＶＴＱＡＰＧＧＷＥＶＬＡＶＶＶＰＶＰＰＦＴＣＬＬＲＤＬＶＰＡＴＮＹＳＬＲＶＲＣＡＮＡＬＧＰＳＰＹＡＤＷＶＰＦＱＴＫＧＬＡＰＡＳＡＰＱＮＬＨＡＩＲＴＤＳＧＬＩＬＥＷＥＥＶＩＰＥＡＰＬＥＧＰＬＧＰＹＫＬＳＷＶＱＤＮＧＴＱＤＥＬＴＶＥＧＴＲＡＮＬＴＧＷＤＰＱＫＤＬＩＶＲＶＣＶＳＮＡＶＧＣＧＰＷＳＱＰＬＶＶＳＳＨＤＲＡＧＱＱＧＰＰＨＳＲＴＳＷＶＰＶＶＬＧＶＬＴＡＬＶＴＡＡＡＬＡＬＩＬＬＲＫＲＲＫＥＴＲＦＧＱＡＦＤＳＶＭＡＲＧＥＰＡＶＨＦＲＡＡＲＳＦＮＲＥＲＰＥＲＩＥＡＴＬＤＳＬＧＩＳＤＥＬＫＥＫＬＥＤＶＬＩＰＥＱＱＦＴＬＧＲＭＬＧＫＧＥＦＧＳＶＲＥＡＱＬＫＱＥＤＧＳＦＶＫＶＡＶＫＭＬＫＡＤＩＩＡＳＳＤＩＥＥＦＬＲＥＡＡＣＭＫＥＦＤＨＰＨＶＡＫＬＶＧＶＳＬＲＳＲＡＫＧＲＬＰＩＰＭＶＩＬＰＦＭＫＨＧＤＬＨＡＦＬＬＡＳＲＩＧＥＮＰＦＮＬＰＬＱＴＬＩＲＦＭＶＤＩＡＣＧＭＥＹＬＳＳＲＮＦＩＨＲＤＬＡＡＲＮＣＭＬＡＥＤＭＴＶＣＶＡＤＦＧＬＳＲＫＩＹＳＧＤＹＹＲＱＧＣＡＳＫＬＰＶＫＷＬＡＬＥＳＬＡＤＮＬＹＴＶＱＳＤＶＷＡＦＧＶＴＭＷＥＩＭＴＲＧＱＴＰＹＡＧＩＥＮＡＥＩＹＮＹＬＩＧＧＮＲＬＫＱＰＰＥＣＭＥＤＶＹＤＬＭＹＱＣＷＳＡＤＰＫＱＲＰＳＦＴＣＬＲＭＥＬＥＮＩＬＧＱＬＳＶＬＳＡＳＱＤＰＬＹＩＮＩＥＲＡＥＥＰＴＡＧＧＳＬＥＬＰＧＲＤＱＰＹＳＧＡＧＤＧＳＧＭＧＡＶＧＧＴＰＳＤＣＲＹＩＬＴＰＧＧＬＡＥＱＰＧＱＡＥＨＱＰＥＳＰＬＮＥＴＱＲＬＬＬＬＱＱＧＬＬＰＨＳＳＣ
配列番号１：ＭＡＬＲＲＳＭＧＲＰＧＬＰＰＬＰＬＰＰＰＰＲＬＧＬＬＬＡＡＬＡＳＬＬＬＰＥＳＡＡＡＧＬＫＬＭＧＡＰＶＫＬＴＶＳＱＧＱＰＶＫＬＮＣＳＶＥＧＭＥＥＰＤＩＱＷＶＫＤＧＡＶＶＱＮＬＤＱＬＹＩＰＶＳＥＱＨＷＩＧＦＬＳＬＫＳＶＥＲＳＤＡＧＲＹＷＣＱＶＥＤＧＧＥＴＥＩＳＱＰＶＷＬＴＶＥＧＶＰＦＦＴＶＥＰＫＤＬＡＶＰＰＮＡＰＦＱＬＳＣＥＡＶＧＰＰＥＰＶＴＩＶＷＷＲＧＴＴＫＩＧＧＰＡＰＳＰＳＶＬＮＶＴＧＶＴＱＳＴＭＦＳＣＥＡＨＮＬＫＧＬＡＳＳＲＴＡＴＶＨＬＱＡＬＰＡＡＰＦＮＩＴＶＴＫＬＳＳＳＮＡＳＶＡＷＭＰＧＡＤＧＲＡＬＬＱＳＣＴＶＱＶＴＱＡＰＧＧＷＥＶＬＡＶＶＶＰＶＰＰＦＴＣＬＬＲＤＬＶＰＡＴＮＹＳＬＲＶＲＣＡＮＡＬＧＰＳＰＹＡＤＷＶＰＦＱＴＫＧＬＡＰＡＳＡＰＱＮＬＨＡＩＲＴＤＳＧＬＩＬＥＷＥＥＶＩＰＥＡＰＬＥＧＰＬＧＰＹＫＬＳＷＶＱＤＮＧＴＱＤＥＬＴＶＥＧＴＲＡＮＬＴＧＷＤＰＱＫＤＬＩＶＲＶＣＶＳＮＡＶＧＣＧＰＷＳＱＰＬＶＶＳＳＨＤＲＡＧＱＱＧＰＰＨＳＲＴＳＷＶＰＶＶＬＧＶＬＴＡＬＶＴＡＡＡＬＡＬＩＬＬＲＫＲＲＫＥＴＲＦＧＱＡＦＤＳＶＭＡＲＧＥＰＡＶＨＦＲＡＡＲＳＦＮＲＥＲＰＥＲＩＥＡＴＬＤＳＬＧＩＳＤＥＬＫＥＫＬＥＤＶＬＩＰＥＱＱＦＴＬＧＲＭＬＧＫＧＥＦＧＳＶＲＥＡＱＬＫＱＥＤＧＳＦＶＫＶＡＶＫＭＬＫＡＤＩＩＡＳＳＤＩＥＥＦＬＲＥＡＡＣＭＫＥＦＤＨＰＨＶＡＫＬＶＧＶＳＬＲＳＲＡＫＧＲＬＰＩＰＭＶＩＬＰＦＭＫＨＧＤＬＨＡＦＬＬＡＳＲＩＧＥＮＰＦＮＬＰＬＱＴＬＩＲＦＭＶＤＩＡＣＧＭＥＹＬＳＳＲＮＦＩＨＲＤＬＡＡＲＮＣＭＬＡＥＤＭＴＶＣＶＡＤＦＧＬＳＲＫＩＹＳＧＤＹＹＲＱＧＣＡＳＫＬＰＶＫＷＬＡＬＥＳＬＡＤＮＬＹＴＶＱＳＤＶＷＡＦＧＶＴＭＷＥＩＭＴＲＧＱＴＰＹＡＧＩＥＮＡＥＩＹＮＹＬＩＧＧＮＲＬＫＱＰＰＥＣＭＥＤＶＹＤＬＭＹＱＣＷＳＡＤＰＫＱＲＰＳＦＴＣＬＲＭＥＬＥＮＩＬＧＱＬＳＶＬＳＡＳＱＤＰＬＹＩＮＩＥＲＡＥＥＰＴＡＧＧＳＬＥＬＰＧＲＤＱＰＹＳＧＡＧＤＧＳＧＭＧＡＶＧＧＴＰＳＤＣＲＹＩＬＴＰＧＧＬＡＥＱＰＧＱＡＥＨＱＰＥＳＰＬＮＥＴＱＲＬＬＬＬＱＱＧＬＬＰＨＳＳＣ
【0019】
上記の通り、Ｔｙｒｏ３は細胞外及びＴＭＤ内において２段階切断を受けるため、細胞内に配置される部分（細胞内ドメイン：ＩＣＤ）については切断部位の検討やβペプチドの生成等のためには不要であるので、そのうちの一部が省略（欠損）されていても構わない。後の実施例においても説明するが、例えば上記配列番号１のアミノ酸配列のうち、５０１番目のセリンよりもＣ末端側部分が欠損されたＴｙｒｏ３ΔＣが用いられてもよい。その場合、シェダーゼによる切断後のＴｙｒｏ３ΔＣのアミノ酸配列は、４１８番目のグアニンと４１９番目のグルタミンとの間で切断された場合は下記配列番号２の配列、４１９番目のグルタミンと４２０番目のグルタミンとの間で切断された場合は下記配列番号３の配列、４２０番目のグルタミンと４２１番目のグアニンとの間で切断された場合は下記配列番号４の配列となる。
配列番号２：ＧＰＰＨＳＲＴＳＷＶＰＶＶＬＧＶＬＴＡＬＶＴＡＡＡＬＡＬＩＬＬＲＫＲＲＫＥＴＲＦＧＱＡＦＤＳＶＭＡＲＧＥＰＡＶＨＦＲＡＡＲＳＦＮＲＥＲＰＥＲＩＥＡＴＬＤＳＬＧＩＳ
配列番号３：ＱＧＰＰＨＳＲＴＳＷＶＰＶＶＬＧＶＬＴＡＬＶＴＡＡＡＬＡＬＩＬＬＲＫＲＲＫＥＴＲＦＧＱＡＦＤＳＶＭＡＲＧＥＰＡＶＨＦＲＡＡＲＳＦＮＲＥＲＰＥＲＩＥＡＴＬＤＳＬＧＩＳ
配列番号４：ＱＱＧＰＰＨＳＲＴＳＷＶＰＶＶＬＧＶＬＴＡＬＶＴＡＡＡＬＡＬＩＬＬＲＫＲＲＫＥＴＲＦＧＱＡＦＤＳＶＭＡＲＧＥＰＡＶＨＦＲＡＡＲＳＦＮＲＥＲＰＥＲＩＥＡＴＬＤＳＬＧＩＳ
配列番号２：ＧＰＰＨＳＲＴＳＷＶＰＶＶＬＧＶＬＴＡＬＶＴＡＡＡＬＡＬＩＬＬＲＫＲＲＫＥＴＲＦＧＱＡＦＤＳＶＭＡＲＧＥＰＡＶＨＦＲＡＡＲＳＦＮＲＥＲＰＥＲＩＥＡＴＬＤＳＬＧＩＳ
配列番号３：ＱＧＰＰＨＳＲＴＳＷＶＰＶＶＬＧＶＬＴＡＬＶＴＡＡＡＬＡＬＩＬＬＲＫＲＲＫＥＴＲＦＧＱＡＦＤＳＶＭＡＲＧＥＰＡＶＨＦＲＡＡＲＳＦＮＲＥＲＰＥＲＩＥＡＴＬＤＳＬＧＩＳ
配列番号４：ＱＱＧＰＰＨＳＲＴＳＷＶＰＶＶＬＧＶＬＴＡＬＶＴＡＡＡＬＡＬＩＬＬＲＫＲＲＫＥＴＲＦＧＱＡＦＤＳＶＭＡＲＧＥＰＡＶＨＦＲＡＡＲＳＦＮＲＥＲＰＥＲＩＥＡＴＬＤＳＬＧＩＳ
【0020】
さらに、本発明者らは、シェダーゼによる切断後のＴｙｒｏ３のＣ末端側断片におけるＮ末端のグルタミン（配列番号３又は４の最もＮ末端側のグルタミン）がピログルタミル化修飾を受けていることを見出した。以上のような、Ｔｙｒｏ３のＣ末端断片のアミノ酸配列や受けている修飾については、これまでに知られておらず、今回初めて明らかとなったものである。シェダーゼによる切断後のＣ末端断片のアミノ酸配列及び修飾と、さらに切断されて生じるＴｙｒｏ３βのＮ末端側のアミノ酸配列及び修飾は同一であるので、Ｔｙｒｏ３βのＮ末端側のアミノ酸配列及び修飾も同様に特定されることとなる。従って、これらの情報に基づいて、例えばＴｙｒｏ３βのＮ末端を認識する抗体等の検出分子を製造することができ、そうすることで、Ｔｙｒｏ３βを癌やアルツハイマー等の疾患を検出するためのバイオマーカーとして利用することができる。
【0021】
本実施形態におけるＴｙｒｏ３断片ペプチドは、実質的には上記の通りのアミノ酸配列で構成されるが、アミノ酸のうちの少なくとも１０個以下、好ましくは５個以下、より好ましくは２個以下の置換、付加又は欠失等の変異を含んでもよい。また、上記Ｎ末端のグルタミンのピログルタミル化修飾以外に、他のアミノ酸が修飾を受けていてもよい。また、本実施形態におけるＴｙｒｏ３断片ペプチドは、例えばＣ末端等の所定の位置に、検出用のタグ分子が付加されていてもよい。用いられるタグ分子は、本技術分野において通常用いられるものであれば特に限定されず、例えばＦｌａｇ（登録商標）タグ、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ及びＭｙｃタグ等を用いることができる。
【0022】
次に、本発明の他の実施形態は、配列番号６のヌクレオチド配列を含む発現ベクターを該発現ベクターによる遺伝子発現が可能な宿主細胞に導入するステップと、前記宿主細胞を前記遺伝子発現が可能な条件下で培養するステップと、前記宿主細胞から上記のペプチドを回収するステップとを含むことを特徴とするＴｙｒｏ３断片ペプチドの製造方法である。
【0023】
本実施形態において、配列番号６のヌクレオチド配列は、Ｔｙｒｏ３の一部をコードするヌクレオチド配列であり、具体的にはＴｙｒｏ３ΔＣをコードするヌクレオチド配列である。また当然に、発現ベクターは、全長型Ｔｙｒｏ３をコードするヌクレオチド配列（配列番号５）を含んでいてもよい。それらの配列は以下の通りである。
配列番号５：ａｔｇｇｃｇｃｔｇａｇｇｃｇｇａｇｃａｔｇｇｇｇｃｇｇｃｃｇｇｇｇｃｔｃｃｃｇｃｃｇｃｔｇｃｃｇｃｔｇｃｃｇｃｃｇｃｃａｃｃｇｃｇｇｃｔｃｇｇｇｃｔｇｃｔｇｃｔｇｇｃｇｇｃｔｃｔｇｇｃｔｔｃｔｃｔｇｃｔｇｃｔｃｃｃｇｇａｇｔｃｃｇｃｃｇｃｃｇｃａｇｇｔｃｔｇａａｇｃｔｃａｔｇｇｇａｇｃｃｃｃｇｇｔｇａａｇｃｔｇａｃａｇｔｇｔｃｔｃａｇｇｇｇｃａｇｃｃｇｇｔｇａａｇｃｔｃａａｃｔｇｃａｇｔｇｔｇｇａｇｇｇｇａｔｇｇａｇｇａｇｃｃｔｇａｃａｔｃｃａｇｔｇｇｇｔｇａａｇｇａｔｇｇｇｇｃｔｇｔｇｇｔｃｃａｇａａｃｔｔｇｇａｃｃａｇｔｔｇｔａｃａｔｃｃｃａｇｔｃａｇｃｇａｇｃａｇｃａｃｔｇｇａｔｃｇｇｃｔｔｃｃｔｃａｇｃｃｔｇａａｇｔｃａｇｔｇｇａｇｃｇｃｔｃｔｇａｃｇｃｃｇｇｃｃｇｇｔａｃｔｇｇｔｇｃｃａｇｇｔｇｇａｇｇａｔｇｇｇｇｇｔｇａａａｃｃｇａｇａｔｃｔｃｃｃａｇｃｃａｇｔｇｔｇｇｃｔｃａｃｇｇｔａｇａａｇｇｔｇｔｇｃｃａｔｔｔｔｔｃａｃａｇｔｇｇａｇｃｃａａａａｇａｔｃｔｇｇｃａｇｔｇｃｃａｃｃｃａａｔｇｃｃｃｃｔｔｔｃｃａａｃｔｇｔｃｔｔｇｔｇａｇｇｃｔｇｔｇｇｇｔｃｃｃｃｃｔｇａａｃｃｔｇｔｔａｃｃａｔｔｇｔｃｔｇｇｔｇｇａｇａｇｇａａｃｔａｃｇａａｇａｔｃｇｇｇｇｇａｃｃｃｇｃｔｃｃｃｔｃｔｃｃａｔｃｔｇｔｔｔｔａａａｔｇｔａａｃａｇｇｇｇｔｇａｃｃｃａｇａｇｃａｃｃａｔｇｔｔｔｔｃｃｔｇｔｇａａｇｃｔｃａｃａａｃｃｔａａａａｇｇｃｃｔｇｇｃｃｔｃｔｔｃｔｃｇｃａｃａｇｃｃａｃｔｇｔｔｃａｃｃｔｔｃａａｇｃａｃｔｇｃｃｔｇｃａｇｃｃｃｃｃｔｔｃａａｃａｔｃａｃｃｇｔｇａｃａａａｇｃｔｔｔｃｃａｇｃａｇｃａａｃｇｃｔａｇｔｇｔｇｇｃｃｔｇｇａｔｇｃｃａｇｇｔｇｃｔｇａｔｇｇｃｃｇａｇｃｔｃｔｇｃｔａｃａｇｔｃｃｔｇｔａｃａｇｔｔｃａｇｇｔｇａｃａｃａｇｇｃｃｃｃａｇｇａｇｇｃｔｇｇｇａａｇｔｃｃｔｇｇｃｔｇｔｔｇｔｇｇｔｃｃｃｔｇｔｇｃｃｃｃｃｃｔｔｔａｃｃｔｇｃｃｔｇｃｔｃｃｇｇｇａｃｃｔｇｇｔｇｃｃｔｇｃｃａｃｃａａｃｔａｃａｇｃｃｔｃａｇｇｇｔｇｃｇｃｔｇｔｇｃｃａａｔｇｃｃｔｔｇｇｇｇｃｃｃｔｃｔｃｃｃｔａｔｇｃｔｇａｃｔｇｇｇｔｇｃｃｃｔｔｔｃａｇａｃｃａａｇｇｇｔｃｔａｇｃｃｃｃａｇｃｃａｇｃｇｃｔｃｃｃｃａａａａｃｃｔｃｃａｔｇｃｃａｔｃｃｇｃａｃａｇａｔｔｃａｇｇｃｃｔｃａｔｃｔｔｇｇａｇｔｇｇｇａａｇａａｇｔｇａｔｃｃｃｃｇａｇｇｃｃｃｃｔｔｔｇｇａａｇｇｃｃｃｃｃｔｇｇｇａｃｃｃｔａｃａａａｃｔｇｔｃｃｔｇｇｇｔｔｃａａｇａｃａａｔｇｇａａｃｃｃａｇｇａｔｇａｇｃｔｇａｃａｇｔｇｇａｇｇｇｇａｃｃａｇｇｇｃｃａａｔｔｔｇａｃａｇｇｃｔｇｇｇａｔｃｃｃｃａａａａｇｇａｃｃｔｇａｔｃｇｔａｃｇｔｇｔｇｔｇｃｇｔｃｔｃｃａａｔｇｃａｇｔｔｇｇｃｔｇｔｇｇａｃｃｃｔｇｇａｇｔｃａｇｃｃａｃｔｇｇｔｇｇｔｃｔｃｔｔｃｔｃａｔｇａｃｃｇｔｇｃａｇｇｃｃａｇｃａｇｇｇｃｃｃｔｃｃｔｃａｃａｇｃｃｇｃａｃａｔｃｃｔｇｇｇｔａｃｃｔｇｔｇｇｔｃｃｔｔｇｇｔｇｔｇｃｔａａｃｇｇｃｃｃｔｇｇｔｇａｃｇｇｃｔｇｃｔｇｃｃｃｔｇｇｃｃｃｔｃａｔｃｃｔｇｃｔｔｃｇａａａｇａｇａｃｇｇａａａｇａｇａｃｇｃｇｇｔｔｔｇｇｇｃａａｇｃｃｔｔｔｇａｃａｇｔｇｔｃａｔｇｇｃｃｃｇｇｇｇａｇａｇｃｃａｇｃｃｇｔｔｃａｃｔｔｃｃｇｇｇｃａｇｃｃｃｇｇｔｃｃｔｔｃａａｔｃｇａｇａａａｇｇｃｃｃｇａｇｃｇｃａｔｃｇａｇｇｃｃａｃａｔｔｇｇａｃａｇｃｔｔｇｇｇｃａｔｃａｇｃｇａｔｇａａｃｔａａａｇｇａａａａａｃｔｇｇａｇｇａｔｇｔｇｃｔｃａｔｃｃｃａｇａｇｃａｇｃａｇｔｔｃａｃｃｃｔｇｇｇｃｃｇｇａｔｇｔｔｇｇｇｃａａａｇｇａｇａｇｔｔｔｇｇｔｔｃａｇｔｇｃｇｇｇａｇｇｃｃｃａｇｃｔｇａａｇｃａａｇａｇｇａｔｇｇｃｔｃｃｔｔｔｇｔｇａａａｇｔｇｇｃｔｇｔｇａａｇａｔｇｃｔｇａａａｇｃｔｇａｃａｔｃａｔｔｇｃｃｔｃａａｇｃｇａｃａｔｔｇａａｇａｇｔｔｃｃｔｃａｇｇｇａａｇｃａｇｃｔｔｇｃａｔｇａａｇｇａｇｔｔｔｇａｃｃａｔｃｃａｃａｃｇｔｇｇｃｃａａａｃｔｔｇｔｔｇｇｇｇｔａａｇｃｃｔｃｃｇｇａｇｃａｇｇｇｃｔａａａｇｇｃｃｇｔｃｔｃｃｃｃａｔｃｃｃｃａｔｇｇｔｃａｔｃｔｔｇｃｃｃｔｔｃａｔｇａａｇｃａｔｇｇｇｇａｃｃｔｇｃａｔｇｃｃｔｔｃｃｔｇｃｔｃｇｃｃｔｃｃｃｇｇａｔｔｇｇｇｇａｇａａｃｃｃｃｔｔｔａａｃｃｔａｃｃｃｃｔｃｃａｇａｃｃｃｔｇａｔｃｃｇｇｔｔｃａｔｇｇｔｇｇａｃａｔｔｇｃｃｔｇｃｇｇｃａｔｇｇａｇｔａｃｃｔｇａｇｃｔｃｔｃｇｇａａｃｔｔｃａｔｃｃａｃｃｇａｇａｃｃｔｇｇｃｔｇｃｔｃｇｇａａｔｔｇｃａｔｇｃｔｇｇｃａｇａｇｇａｃａｔｇａｃａｇｔｇｔｇｔｇｔｇｇｃｔｇａｃｔｔｃｇｇａｃｔｃｔｃｃｃｇｇａａｇａｔｃｔａｃａｇｔｇｇｇｇａｃｔａｃｔａｔｃｇｔｃａａｇｇｃｔｇｔｇｃｃｔｃｃａａａｃｔｇｃｃｔｇｔｃａａｇｔｇｇｃｔｇｇｃｃｃｔｇｇａｇａｇｃｃｔｇｇｃｃｇａｃａａｃｃｔｇｔａｔａｃｔｇｔｇｃａｇａｇｔｇａｃｇｔｇｔｇｇｇｃｇｔｔｃｇｇｇｇｔｇａｃｃａｔｇｔｇｇｇａｇａｔｃａｔｇａｃａｃｇｔｇｇｇｃａｇａｃｇｃｃａｔａｔｇｃｔｇｇｃａｔｃｇａａａａｃｇｃｔｇａｇａｔｔｔａｃａａｃｔａｃｃｔｃａｔｔｇｇｃｇｇｇａａｃｃｇｃｃｔｇａａａｃａｇｃｃｔｃｃｇｇａｇｔｇｔａｔｇｇａｇｇａｃｇｔｇｔａｔｇａｔｃｔｃａｔｇｔａｃｃａｇｔｇｃｔｇｇａｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｃａａｇｃａｇｃｇｃｃｃｇａｇｃｔｔｔａｃｔｔｇｔｃｔｇｃｇａａｔｇｇａａｃｔｇｇａｇａａｃａｔｃｔｔｇｇｇｃｃａｇｃｔｇｔｃｔｇｔｇｃｔａｔｃｔｇｃｃａｇｃｃａｇｇａｃｃｃｃｔｔａｔａｃａｔｃａａｃａｔｃｇａｇａｇａｇｃｔｇａｇｇａｇｃｃｃａｃｔｇｃｇｇｇａｇｇｃａｇｃｃｔｇｇａｇｃｔａｃｃｔｇｇｃａｇｇｇａｔｃａｇｃｃｃｔａｃａｇｔｇｇｇｇｃｔｇｇｇｇａｔｇｇｃａｇｔｇｇｃａｔｇｇｇｇｇｃａｇｔｇｇｇｔｇｇｃａｃｔｃｃｃａｇｔｇａｃｔｇｔｃｇｇｔａｃａｔａｃｔｃａｃｃｃｃｃｇｇａｇｇｇｃｔｇｇｃｔｇａｇｃａｇｃｃａｇｇｇｃａｇｇｃａｇａｇｃａｃｃａｇｃｃａｇａｇａｇｔｃｃｃｃｔｃａａｔｇａｇａｃａｃａｇａｇｇｃｔｔｔｔｇｃｔｇｃｔｇｃａｇｃａａｇｇｇｃｔａｃｔｇｃｃａｃａｃａｇｔａｇｃｔｇｔｔａｇ
配列番号６：ａｔｇｇｃｇｃｔｇａｇｇｃｇｇａｇｃａｔｇｇｇｇｃｇｇｃｃｇｇｇｇｃｔｃｃｃｇｃｃｇｃｔｇｃｃｇｃｔｇｃｃｇｃｃｇｃｃａｃｃｇｃｇｇｃｔｃｇｇｇｃｔｇｃｔｇｃｔｇｇｃｇｇｃｔｃｔｇｇｃｔｔｃｔｃｔｇｃｔｇｃｔｃｃｃｇｇａｇｔｃｃｇｃｃｇｃｃｇｃａｇｇｔｃｔｇａａｇｃｔｃａｔｇｇｇａｇｃｃｃｃｇｇｔｇａａｇｃｔｇａｃａｇｔｇｔｃｔｃａｇｇｇｇｃａｇｃｃｇｇｔｇａａｇｃｔｃａａｃｔｇｃａｇｔｇｔｇｇａｇｇｇｇａｔｇｇａｇｇａｇｃｃｔｇａｃａｔｃｃａｇｔｇｇｇｔｇａａｇｇａｔｇｇｇｇｃｔｇｔｇｇｔｃｃａｇａａｃｔｔｇｇａｃｃａｇｔｔｇｔａｃａｔｃｃｃａｇｔｃａｇｃｇａｇｃａｇｃａｃｔｇｇａｔｃｇｇｃｔｔｃｃｔｃａｇｃｃｔｇａａｇｔｃａｇｔｇｇａｇｃｇｃｔｃｔｇａｃｇｃｃｇｇｃｃｇｇｔａｃｔｇｇｔｇｃｃａｇｇｔｇｇａｇｇａｔｇｇｇｇｇｔｇａａａｃｃｇａｇａｔｃｔｃｃｃａｇｃｃａｇｔｇｔｇｇｃｔｃａｃｇｇｔａｇａａｇｇｔｇｔｇｃｃａｔｔｔｔｔｃａｃａｇｔｇｇａｇｃｃａａａａｇａｔｃｔｇｇｃａｇｔｇｃｃａｃｃｃａａｔｇｃｃｃｃｔｔｔｃｃａａｃｔｇｔｃｔｔｇｔｇａｇｇｃｔｇｔｇｇｇｔｃｃｃｃｃｔｇａａｃｃｔｇｔｔａｃｃａｔｔｇｔｃｔｇｇｔｇｇａｇａｇｇａａｃｔａｃｇａａｇａｔｃｇｇｇｇｇａｃｃｃｇｃｔｃｃｃｔｃｔｃｃａｔｃｔｇｔｔｔｔａａａｔｇｔａａｃａｇｇｇｇｔｇａｃｃｃａｇａｇｃａｃｃａｔｇｔｔｔｔｃｃｔｇｔｇａａｇｃｔｃａｃａａｃｃｔａａａａｇｇｃｃｔｇｇｃｃｔｃｔｔｃｔｃｇｃａｃａｇｃｃａｃｔｇｔｔｃａｃｃｔｔｃａａｇｃａｃｔｇｃｃｔｇｃａｇｃｃｃｃｃｔｔｃａａｃａｔｃａｃｃｇｔｇａｃａａａｇｃｔｔｔｃｃａｇｃａｇｃａａｃｇｃｔａｇｔｇｔｇｇｃｃｔｇｇａｔｇｃｃａｇｇｔｇｃｔｇａｔｇｇｃｃｇａｇｃｔｃｔｇｃｔａｃａｇｔｃｃｔｇｔａｃａｇｔｔｃａｇｇｔｇａｃａｃａｇｇｃｃｃｃａｇｇａｇｇｃｔｇｇｇａａｇｔｃｃｔｇｇｃｔｇｔｔｇｔｇｇｔｃｃｃｔｇｔｇｃｃｃｃｃｃｔｔｔａｃｃｔｇｃｃｔｇｃｔｃｃｇｇｇａｃｃｔｇｇｔｇｃｃｔｇｃｃａｃｃａａｃｔａｃａｇｃｃｔｃａｇｇｇｔｇｃｇｃｔｇｔｇｃｃａａｔｇｃｃｔｔｇｇｇｇｃｃｃｔｃｔｃｃｃｔａｔｇｃｔｇａｃｔｇｇｇｔｇｃｃｃｔｔｔｃａｇａｃｃａａｇｇｇｔｃｔａｇｃｃｃｃａｇｃｃａｇｃｇｃｔｃｃｃｃａａａａｃｃｔｃｃａｔｇｃｃａｔｃｃｇｃａｃａｇａｔｔｃａｇｇｃｃｔｃａｔｃｔｔｇｇａｇｔｇｇｇａａｇａａｇｔｇａｔｃｃｃｃｇａｇｇｃｃｃｃｔｔｔｇｇａａｇｇｃｃｃｃｃｔｇｇｇａｃｃｃｔａｃａａａｃｔｇｔｃｃｔｇｇｇｔｔｃａａｇａｃａａｔｇｇａａｃｃｃａｇｇａｔｇａｇｃｔｇａｃａｇｔｇｇａｇｇｇｇａｃｃａｇｇｇｃｃａａｔｔｔｇａｃａｇｇｃｔｇｇｇａｔｃｃｃｃａａａａｇｇａｃｃｔｇａｔｃｇｔａｃｇｔｇｔｇｔｇｃｇｔｃｔｃｃａａｔｇｃａｇｔｔｇｇｃｔｇｔｇｇａｃｃｃｔｇｇａｇｔｃａｇｃｃａｃｔｇｇｔｇｇｔｃｔｃｔｔｃｔｃａｔｇａｃｃｇｔｇｃａｇｇｃｃａｇｃａｇｇｇｃｃｃｔｃｃｔｃａｃａｇｃｃｇｃａｃａｔｃｃｔｇｇｇｔａｃｃｔｇｔｇｇｔｃｃｔｔｇｇｔｇｔｇｃｔａａｃｇｇｃｃｃｔｇｇｔｇａｃｇｇｃｔｇｃｔｇｃｃｃｔｇｇｃｃｃｔｃａｔｃｃｔｇｃｔｔｃｇａａａｇａｇａｃｇｇａａａｇａｇａｃｇｃｇｇｔｔｔｇｇｇｃａａｇｃｃｔｔｔｇａｃａｇｔｇｔｃａｔｇｇｃｃｃｇｇｇｇａｇａｇｃｃａｇｃｃｇｔｔｃａｃｔｔｃｃｇｇｇｃａｇｃｃｃｇｇｔｃｃｔｔｃａａｔｃｇａｇａａａｇｇｃｃｃｇａｇｃｇｃａｔｃｇａｇｇｃｃａｃａｔｔｇｇａｃａｇｃｔｔｇｇｇｃａｔｃａｇｃ
配列番号５：ａｔｇｇｃｇｃｔｇａｇｇｃｇｇａｇｃａｔｇｇｇｇｃｇｇｃｃｇｇｇｇｃｔｃｃｃｇｃｃｇｃｔｇｃｃｇｃｔｇｃｃｇｃｃｇｃｃａｃｃｇｃｇｇｃｔｃｇｇｇｃｔｇｃｔｇｃｔｇｇｃｇｇｃｔｃｔｇｇｃｔｔｃｔｃｔｇｃｔｇｃｔｃｃｃｇｇａｇｔｃｃｇｃｃｇｃｃｇｃａｇｇｔｃｔｇａａｇｃｔｃａｔｇｇｇａｇｃｃｃｃｇｇｔｇａａｇｃｔｇａｃａｇｔｇｔｃｔｃａｇｇｇｇｃａｇｃｃｇｇｔｇａａｇｃｔｃａａｃｔｇｃａｇｔｇｔｇｇａｇｇｇｇａｔｇｇａｇｇａｇｃｃｔｇａｃａｔｃｃａｇｔｇｇｇｔｇａａｇｇａｔｇｇｇｇｃｔｇｔｇｇｔｃｃａｇａａｃｔｔｇｇａｃｃａｇｔｔｇｔａｃａｔｃｃｃａｇｔｃａｇｃｇａｇｃａｇｃａｃｔｇｇａｔｃｇｇｃｔｔｃｃｔｃａｇｃｃｔｇａａｇｔｃａｇｔｇｇａｇｃｇｃｔｃｔｇａｃｇｃｃｇｇｃｃｇｇｔａｃｔｇｇｔｇｃｃａｇｇｔｇｇａｇｇａｔｇｇｇｇｇｔｇａａａｃｃｇａｇａｔｃｔｃｃｃａｇｃｃａｇｔｇｔｇｇｃｔｃａｃｇｇｔａｇａａｇｇｔｇｔｇｃｃａｔｔｔｔｔｃａｃａｇｔｇｇａｇｃｃａａａａｇａｔｃｔｇｇｃａｇｔｇｃｃａｃｃｃａａｔｇｃｃｃｃｔｔｔｃｃａａｃｔｇｔｃｔｔｇｔｇａｇｇｃｔｇｔｇｇｇｔｃｃｃｃｃｔｇａａｃｃｔｇｔｔａｃｃａｔｔｇｔｃｔｇｇｔｇｇａｇａｇｇａａｃｔａｃｇａａｇａｔｃｇｇｇｇｇａｃｃｃｇｃｔｃｃｃｔｃｔｃｃａｔｃｔｇｔｔｔｔａａａｔｇｔａａｃａｇｇｇｇｔｇａｃｃｃａｇａｇｃａｃｃａｔｇｔｔｔｔｃｃｔｇｔｇａａｇｃｔｃａｃａａｃｃｔａａａａｇｇｃｃｔｇｇｃｃｔｃｔｔｃｔｃｇｃａｃａｇｃｃａｃｔｇｔｔｃａｃｃｔｔｃａａｇｃａｃｔｇｃｃｔｇｃａｇｃｃｃｃｃｔｔｃａａｃａｔｃａｃｃｇｔｇａｃａａａｇｃｔｔｔｃｃａｇｃａｇｃａａｃｇｃｔａｇｔｇｔｇｇｃｃｔｇｇａｔｇｃｃａｇｇｔｇｃｔｇａｔｇｇｃｃｇａｇｃｔｃｔｇｃｔａｃａｇｔｃｃｔｇｔａｃａｇｔｔｃａｇｇｔｇａｃａｃａｇｇｃｃｃｃａｇｇａｇｇｃｔｇｇｇａａｇｔｃｃｔｇｇｃｔｇｔｔｇｔｇｇｔｃｃｃｔｇｔｇｃｃｃｃｃｃｔｔｔａｃｃｔｇｃｃｔｇｃｔｃｃｇｇｇａｃｃｔｇｇｔｇｃｃｔｇｃｃａｃｃａａｃｔａｃａｇｃｃｔｃａｇｇｇｔｇｃｇｃｔｇｔｇｃｃａａｔｇｃｃｔｔｇｇｇｇｃｃｃｔｃｔｃｃｃｔａｔｇｃｔｇａｃｔｇｇｇｔｇｃｃｃｔｔｔｃａｇａｃｃａａｇｇｇｔｃｔａｇｃｃｃｃａｇｃｃａｇｃｇｃｔｃｃｃｃａａａａｃｃｔｃｃａｔｇｃｃａｔｃｃｇｃａｃａｇａｔｔｃａｇｇｃｃｔｃａｔｃｔｔｇｇａｇｔｇｇｇａａｇａａｇｔｇａｔｃｃｃｃｇａｇｇｃｃｃｃｔｔｔｇｇａａｇｇｃｃｃｃｃｔｇｇｇａｃｃｃｔａｃａａａｃｔｇｔｃｃｔｇｇｇｔｔｃａａｇａｃａａｔｇｇａａｃｃｃａｇｇａｔｇａｇｃｔｇａｃａｇｔｇｇａｇｇｇｇａｃｃａｇｇｇｃｃａａｔｔｔｇａｃａｇｇｃｔｇｇｇａｔｃｃｃｃａａａａｇｇａｃｃｔｇａｔｃｇｔａｃｇｔｇｔｇｔｇｃｇｔｃｔｃｃａａｔｇｃａｇｔｔｇｇｃｔｇｔｇｇａｃｃｃｔｇｇａｇｔｃａｇｃｃａｃｔｇｇｔｇｇｔｃｔｃｔｔｃｔｃａｔｇａｃｃｇｔｇｃａｇｇｃｃａｇｃａｇｇｇｃｃｃｔｃｃｔｃａｃａｇｃｃｇｃａｃａｔｃｃｔｇｇｇｔａｃｃｔｇｔｇｇｔｃｃｔｔｇｇｔｇｔｇｃｔａａｃｇｇｃｃｃｔｇｇｔｇａｃｇｇｃｔｇｃｔｇｃｃｃｔｇｇｃｃｃｔｃａｔｃｃｔｇｃｔｔｃｇａａａｇａｇａｃｇｇａａａｇａｇａｃｇｃｇｇｔｔｔｇｇｇｃａａｇｃｃｔｔｔｇａｃａｇｔｇｔｃａｔｇｇｃｃｃｇｇｇｇａｇａｇｃｃａｇｃｃｇｔｔｃａｃｔｔｃｃｇｇｇｃａｇｃｃｃｇｇｔｃｃｔｔｃａａｔｃｇａｇａａａｇｇｃｃｃｇａｇｃｇｃａｔｃｇａｇｇｃｃａｃａｔｔｇｇａｃａｇｃｔｔｇｇｇｃａｔｃａｇｃｇａｔｇａａｃｔａａａｇｇａａａａａｃｔｇｇａｇｇａｔｇｔｇｃｔｃａｔｃｃｃａｇａｇｃａｇｃａｇｔｔｃａｃｃｃｔｇｇｇｃｃｇｇａｔｇｔｔｇｇｇｃａａａｇｇａｇａｇｔｔｔｇｇｔｔｃａｇｔｇｃｇｇｇａｇｇｃｃｃａｇｃｔｇａａｇｃａａｇａｇｇａｔｇｇｃｔｃｃｔｔｔｇｔｇａａａｇｔｇｇｃｔｇｔｇａａｇａｔｇｃｔｇａａａｇｃｔｇａｃａｔｃａｔｔｇｃｃｔｃａａｇｃｇａｃａｔｔｇａａｇａｇｔｔｃｃｔｃａｇｇｇａａｇｃａｇｃｔｔｇｃａｔｇａａｇｇａｇｔｔｔｇａｃｃａｔｃｃａｃａｃｇｔｇｇｃｃａａａｃｔｔｇｔｔｇｇｇｇｔａａｇｃｃｔｃｃｇｇａｇｃａｇｇｇｃｔａａａｇｇｃｃｇｔｃｔｃｃｃｃａｔｃｃｃｃａｔｇｇｔｃａｔｃｔｔｇｃｃｃｔｔｃａｔｇａａｇｃａｔｇｇｇｇａｃｃｔｇｃａｔｇｃｃｔｔｃｃｔｇｃｔｃｇｃｃｔｃｃｃｇｇａｔｔｇｇｇｇａｇａａｃｃｃｃｔｔｔａａｃｃｔａｃｃｃｃｔｃｃａｇａｃｃｃｔｇａｔｃｃｇｇｔｔｃａｔｇｇｔｇｇａｃａｔｔｇｃｃｔｇｃｇｇｃａｔｇｇａｇｔａｃｃｔｇａｇｃｔｃｔｃｇｇａａｃｔｔｃａｔｃｃａｃｃｇａｇａｃｃｔｇｇｃｔｇｃｔｃｇｇａａｔｔｇｃａｔｇｃｔｇｇｃａｇａｇｇａｃａｔｇａｃａｇｔｇｔｇｔｇｔｇｇｃｔｇａｃｔｔｃｇｇａｃｔｃｔｃｃｃｇｇａａｇａｔｃｔａｃａｇｔｇｇｇｇａｃｔａｃｔａｔｃｇｔｃａａｇｇｃｔｇｔｇｃｃｔｃｃａａａｃｔｇｃｃｔｇｔｃａａｇｔｇｇｃｔｇｇｃｃｃｔｇｇａｇａｇｃｃｔｇｇｃｃｇａｃａａｃｃｔｇｔａｔａｃｔｇｔｇｃａｇａｇｔｇａｃｇｔｇｔｇｇｇｃｇｔｔｃｇｇｇｇｔｇａｃｃａｔｇｔｇｇｇａｇａｔｃａｔｇａｃａｃｇｔｇｇｇｃａｇａｃｇｃｃａｔａｔｇｃｔｇｇｃａｔｃｇａａａａｃｇｃｔｇａｇａｔｔｔａｃａａｃｔａｃｃｔｃａｔｔｇｇｃｇｇｇａａｃｃｇｃｃｔｇａａａｃａｇｃｃｔｃｃｇｇａｇｔｇｔａｔｇｇａｇｇａｃｇｔｇｔａｔｇａｔｃｔｃａｔｇｔａｃｃａｇｔｇｃｔｇｇａｇｔｇｃｔｇａｃｃｃｃａａｇｃａｇｃｇｃｃｃｇａｇｃｔｔｔａｃｔｔｇｔｃｔｇｃｇａａｔｇｇａａｃｔｇｇａｇａａｃａｔｃｔｔｇｇｇｃｃａｇｃｔｇｔｃｔｇｔｇｃｔａｔｃｔｇｃｃａｇｃｃａｇｇａｃｃｃｃｔｔａｔａｃａｔｃａａｃａｔｃｇａｇａｇａｇｃｔｇａｇｇａｇｃｃｃａｃｔｇｃｇｇｇａｇｇｃａｇｃｃｔｇｇａｇｃｔａｃｃｔｇｇｃａｇｇｇａｔｃａｇｃｃｃｔａｃａｇｔｇｇｇｇｃｔｇｇｇｇａｔｇｇｃａｇｔｇｇｃａｔｇｇｇｇｇｃａｇｔｇｇｇｔｇｇｃａｃｔｃｃｃａｇｔｇａｃｔｇｔｃｇｇｔａｃａｔａｃｔｃａｃｃｃｃｃｇｇａｇｇｇｃｔｇｇｃｔｇａｇｃａｇｃｃａｇｇｇｃａｇｇｃａｇａｇｃａｃｃａｇｃｃａｇａｇａｇｔｃｃｃｃｔｃａａｔｇａｇａｃａｃａｇａｇｇｃｔｔｔｔｇｃｔｇｃｔｇｃａｇｃａａｇｇｇｃｔａｃｔｇｃｃａｃａｃａｇｔａｇｃｔｇｔｔａｇ
配列番号６：ａｔｇｇｃｇｃｔｇａｇｇｃｇｇａｇｃａｔｇｇｇｇｃｇｇｃｃｇｇｇｇｃｔｃｃｃｇｃｃｇｃｔｇｃｃｇｃｔｇｃｃｇｃｃｇｃｃａｃｃｇｃｇｇｃｔｃｇｇｇｃｔｇｃｔｇｃｔｇｇｃｇｇｃｔｃｔｇｇｃｔｔｃｔｃｔｇｃｔｇｃｔｃｃｃｇｇａｇｔｃｃｇｃｃｇｃｃｇｃａｇｇｔｃｔｇａａｇｃｔｃａｔｇｇｇａｇｃｃｃｃｇｇｔｇａａｇｃｔｇａｃａｇｔｇｔｃｔｃａｇｇｇｇｃａｇｃｃｇｇｔｇａａｇｃｔｃａａｃｔｇｃａｇｔｇｔｇｇａｇｇｇｇａｔｇｇａｇｇａｇｃｃｔｇａｃａｔｃｃａｇｔｇｇｇｔｇａａｇｇａｔｇｇｇｇｃｔｇｔｇｇｔｃｃａｇａａｃｔｔｇｇａｃｃａｇｔｔｇｔａｃａｔｃｃｃａｇｔｃａｇｃｇａｇｃａｇｃａｃｔｇｇａｔｃｇｇｃｔｔｃｃｔｃａｇｃｃｔｇａａｇｔｃａｇｔｇｇａｇｃｇｃｔｃｔｇａｃｇｃｃｇｇｃｃｇｇｔａｃｔｇｇｔｇｃｃａｇｇｔｇｇａｇｇａｔｇｇｇｇｇｔｇａａａｃｃｇａｇａｔｃｔｃｃｃａｇｃｃａｇｔｇｔｇｇｃｔｃａｃｇｇｔａｇａａｇｇｔｇｔｇｃｃａｔｔｔｔｔｃａｃａｇｔｇｇａｇｃｃａａａａｇａｔｃｔｇｇｃａｇｔｇｃｃａｃｃｃａａｔｇｃｃｃｃｔｔｔｃｃａａｃｔｇｔｃｔｔｇｔｇａｇｇｃｔｇｔｇｇｇｔｃｃｃｃｃｔｇａａｃｃｔｇｔｔａｃｃａｔｔｇｔｃｔｇｇｔｇｇａｇａｇｇａａｃｔａｃｇａａｇａｔｃｇｇｇｇｇａｃｃｃｇｃｔｃｃｃｔｃｔｃｃａｔｃｔｇｔｔｔｔａａａｔｇｔａａｃａｇｇｇｇｔｇａｃｃｃａｇａｇｃａｃｃａｔｇｔｔｔｔｃｃｔｇｔｇａａｇｃｔｃａｃａａｃｃｔａａａａｇｇｃｃｔｇｇｃｃｔｃｔｔｃｔｃｇｃａｃａｇｃｃａｃｔｇｔｔｃａｃｃｔｔｃａａｇｃａｃｔｇｃｃｔｇｃａｇｃｃｃｃｃｔｔｃａａｃａｔｃａｃｃｇｔｇａｃａａａｇｃｔｔｔｃｃａｇｃａｇｃａａｃｇｃｔａｇｔｇｔｇｇｃｃｔｇｇａｔｇｃｃａｇｇｔｇｃｔｇａｔｇｇｃｃｇａｇｃｔｃｔｇｃｔａｃａｇｔｃｃｔｇｔａｃａｇｔｔｃａｇｇｔｇａｃａｃａｇｇｃｃｃｃａｇｇａｇｇｃｔｇｇｇａａｇｔｃｃｔｇｇｃｔｇｔｔｇｔｇｇｔｃｃｃｔｇｔｇｃｃｃｃｃｃｔｔｔａｃｃｔｇｃｃｔｇｃｔｃｃｇｇｇａｃｃｔｇｇｔｇｃｃｔｇｃｃａｃｃａａｃｔａｃａｇｃｃｔｃａｇｇｇｔｇｃｇｃｔｇｔｇｃｃａａｔｇｃｃｔｔｇｇｇｇｃｃｃｔｃｔｃｃｃｔａｔｇｃｔｇａｃｔｇｇｇｔｇｃｃｃｔｔｔｃａｇａｃｃａａｇｇｇｔｃｔａｇｃｃｃｃａｇｃｃａｇｃｇｃｔｃｃｃｃａａａａｃｃｔｃｃａｔｇｃｃａｔｃｃｇｃａｃａｇａｔｔｃａｇｇｃｃｔｃａｔｃｔｔｇｇａｇｔｇｇｇａａｇａａｇｔｇａｔｃｃｃｃｇａｇｇｃｃｃｃｔｔｔｇｇａａｇｇｃｃｃｃｃｔｇｇｇａｃｃｃｔａｃａａａｃｔｇｔｃｃｔｇｇｇｔｔｃａａｇａｃａａｔｇｇａａｃｃｃａｇｇａｔｇａｇｃｔｇａｃａｇｔｇｇａｇｇｇｇａｃｃａｇｇｇｃｃａａｔｔｔｇａｃａｇｇｃｔｇｇｇａｔｃｃｃｃａａａａｇｇａｃｃｔｇａｔｃｇｔａｃｇｔｇｔｇｔｇｃｇｔｃｔｃｃａａｔｇｃａｇｔｔｇｇｃｔｇｔｇｇａｃｃｃｔｇｇａｇｔｃａｇｃｃａｃｔｇｇｔｇｇｔｃｔｃｔｔｃｔｃａｔｇａｃｃｇｔｇｃａｇｇｃｃａｇｃａｇｇｇｃｃｃｔｃｃｔｃａｃａｇｃｃｇｃａｃａｔｃｃｔｇｇｇｔａｃｃｔｇｔｇｇｔｃｃｔｔｇｇｔｇｔｇｃｔａａｃｇｇｃｃｃｔｇｇｔｇａｃｇｇｃｔｇｃｔｇｃｃｃｔｇｇｃｃｃｔｃａｔｃｃｔｇｃｔｔｃｇａａａｇａｇａｃｇｇａａａｇａｇａｃｇｃｇｇｔｔｔｇｇｇｃａａｇｃｃｔｔｔｇａｃａｇｔｇｔｃａｔｇｇｃｃｃｇｇｇｇａｇａｇｃｃａｇｃｃｇｔｔｃａｃｔｔｃｃｇｇｇｃａｇｃｃｃｇｇｔｃｃｔｔｃａａｔｃｇａｇａａａｇｇｃｃｃｇａｇｃｇｃａｔｃｇａｇｇｃｃａｃａｔｔｇｇａｃａｇｃｔｔｇｇｇｃａｔｃａｇｃ
【0024】
本実施形態において、発現ベクターは、上記全長型のＴｙｒｏ３をコードするヌクレオチド配列を発現できるベクターであれば特に限定されず、該ベクターが導入される宿主細胞内において、全長型のＴｙｒｏ３を正常に発現するのに適した例えばプロモータ等の制御配列を含み得る。そのような制御配列は、用いる宿主細胞等の条件に従って、当業者であれば適宜選択できる。
【0025】
本実施形態において、該発現ベクターによる遺伝子発現が可能な宿主細胞についても本技術分野において通常用いられている細胞を用いることができ、例えばＨＥＫ２９３細胞等の株化培養細胞を用いることができるがこれに限定されない。
【0026】
本実施形態において、発現ベクターの宿主細胞への導入は、本技術分野において通常用いられているトランスフェクション技術を用いることができる。トランスフェクション技術としては、例えばリポフェクション法やリン酸カルシウム共沈殿法等の化学的手段、アデノウイルス等を利用した生物学的手段、エレクトロポレーション法等の物理的手段を用いることができるがこれらに限定されない。
【0027】
本実施形態において、遺伝子導入後の宿主細胞の培養は、宿主細胞が導入された遺伝子を発現するのに適した条件下で行われる。当該条件は、当業者であれば適宜選択することが可能であり、例えば、ＲＰＭＩ－１６４０培地やダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）などの培地に、必要に応じウシ胎児血清（ＦＢＳ）などの血清成分を添加した培地を用いて、５％ＣＯ２、３７℃の環境下で培養することができる。
【0028】
本実施形態において、上記発現ベクターが導入された宿主細胞からＴｙｒｏ３ペプチドを回収する方法は、本技術分野において通常用いられる細胞から所望のタンパク質を回収する手段を利用することができる。特に、Ｔｙｒｏ３のＣ末端ペプチドは、細胞膜に存在するため、細胞膜からタンパク質を回収する手段を利用することができる。例えば、宿主細胞をチューブ等に回収後に、所定の溶解液を用いて細胞膜を可溶化処理し、タンパク質を回収することができる。ここで、Ｔｙｒｏ３のみを分離して回収できるようにするために、例えば上記発現ベクターにおいて、全長型Ｔｙｒｏ３のＣ末端にタグ分子が結合されたタンパク質を発現するように設計することが好ましい。タグ分子としては、上述した通り、例えばＦｌａｇ（登録商標）タグ、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ及びＭｙｃタグ等を用いることができる。このようなタグ分子が結合されたＴｙｒｏ３を宿主細胞が発現することにより、当該タグ分子に特異的に結合する抗体等の結合分子を用いて、Ｔｙｒｏ３のみを分離回収することができる。このとき、細胞内においてＴｙｒｏ３は２段階切断を受けるため、全長型Ｔｙｒｏ３、そのＣ末端断片、及び該Ｃ末端断片からＴｙｒｏ３βが切断された分子のそれぞれが回収されることとなるが、それらは分子量がそれぞれ異なるため、例えばＳＤＳ－ＰＡＧＥ等を利用することにより、容易にそれぞれを分離することができる。このため、容易にＴｙｒｏ３のＣ末端断片のみを回収することができる。以上のようにしてＴｙｒｏ３断片ペプチドを製造することが可能となる。
【実施例0029】
以下に、本発明に係るＴｙｒｏ３断片ペプチド及びその製造方法について詳細に説明するための実施例を示す。
【0030】
（Ｔｙｒｏ３発現用細胞の準備）
まず、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％のペニシリン－ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）において、ＨＥＫ２９３細胞及びプレセニリノックアウト（ＰＳＫＯ）ＨＥＫ２９３細胞を３７℃、５％ＣＯ２の雰囲気下で培養した。その後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）し、トリプシン／ＥＤＴＡを用いて細胞を１５ｍＬチューブに回収した。回収した細胞を５０００ｒｐｍで３分間遠心分離して沈殿させた後、上清を吸引して取り除き６．７ｍＬの上記ＤＭＥＭを加えてサスペンドし、各細胞を１０ｍＬのＤＭＥＭの入った１０ｃｍディッシュ６枚に１ｍＬずつ播種して３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。
まず、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び１％のペニシリン－ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）において、ＨＥＫ２９３細胞及びプレセニリノックアウト（ＰＳＫＯ）ＨＥＫ２９３細胞を３７℃、５％ＣＯ２の雰囲気下で培養した。その後、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）し、トリプシン／ＥＤＴＡを用いて細胞を１５ｍＬチューブに回収した。回収した細胞を５０００ｒｐｍで３分間遠心分離して沈殿させた後、上清を吸引して取り除き６．７ｍＬの上記ＤＭＥＭを加えてサスペンドし、各細胞を１０ｍＬのＤＭＥＭの入った１０ｃｍディッシュ６枚に１ｍＬずつ播種して３７℃、５％ＣＯ２雰囲気下で培養した。
【0031】
なお、ＰＳＫＯのＨＥＫ２９３細胞は、Ｒａｎ ＦＡ， Ｈｓｕ ＰＤ， Ｗｒｉｇｈｔ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３；８（１１）：２２８１－３０８．を参照し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集を利用して作製した。特に、プレセニリン１（ＰＳ１）の欠失は、（Ｔａｇａｍｉ ｅｔ ａｌ ｃｅｌｌ ｒｅｐｏｒｔ ２０１７；ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｌ．ｃｏｍ／ｃｅｌｌ－ｒｅｐｏｒｔｓ／ｐｄｆ／Ｓ２２１１－１２４７（１７）３１３０７－４．ｐｄｆ）にて用いられたコンストラクトを用いた。簡単に説明すると、エクソン４の次の配列を標的ｇＲＮＡとしてＣＣＣＴＧＡＧＣＣＡＴＴＡＴＣＴＡＡＴＧＧＡＣ Ｐｘ３３０にクローニングして、それを用いて下記の方法で作成した。一方、ヒトプレセニリン２（ＰＳ２）を標的とする３つの２０塩基のガイド配列は、ＣＲＩＳＰＲデザインツール（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｄｂｃｌｓ．ｊｐ／）を用いて設計した。ＰＳ２の３つのガイドＲＮＡ配列は、Ｆｅｎｇ Ｚｈａｎｇから供与を受けたｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）－２Ａ－Ｐｕｒｏ（ｐＸ４５９）Ｖ２．０ にクローニングした（Ａｄｄｇｅｎｅ ｐｌａｓｍｉｄ＃６２９８８；ｈｔｔｐ：／／ｎ２ｔ．ｎｅｔ／ａｄｄｇｅｎｅ：６２９８８；ＲＲＩＤ：Ａｄｄｇｅｎｅ６２９８８）以下のプライマーを用いた。
ｈＰＳ２ ６０５－６２７－ｆ：ｃａｃｃｇＣＣＡＣＴＡＣＡＧＡＣＡＴＡＧＣＧＧＴＣ（配列番号７）
ｈＰＳ２ ６０５－６２７－ｒ：ａａａｃＧＡＣＣＧＣＴＡＴＧＴＣＴＧＴＡＧＴＧＧｃ（配列番号８）
ｈＰＳ２ ７０９－７３１－ｆ：ｃａｃｃｇＴＧＴＣＡＣＴＣＴＧＴＧＣＡＴＧＡＴＣＧ（配列番号９）
ｈＰＳ２ ７０９－７３１－ｒ：ａａａｃＣＧＡＴＣＡＴＧＣＡＣＡＧＡＧＴＧＡＣＡｃ（配列番号１０）
ｈＰＳ２ １１６４－１１８６－ｆ：ｃａｃｃｇＡＣＣＴＣＣＣＡＧＡＧＴＧＧＴＣＣＧＣＧ（配列番号１１）
ｈＰＳ２ １１６４－１１８６－ｒ：ａａａｃＣＧＣＧＧＡＣＣＡＣＴＣＴＧＧＧＡＧＧＴｃ（配列番号１２）
ｈＰＳ２ ６０５－６２７－ｆ：ｃａｃｃｇＣＣＡＣＴＡＣＡＧＡＣＡＴＡＧＣＧＧＴＣ（配列番号７）
ｈＰＳ２ ６０５－６２７－ｒ：ａａａｃＧＡＣＣＧＣＴＡＴＧＴＣＴＧＴＡＧＴＧＧｃ（配列番号８）
ｈＰＳ２ ７０９－７３１－ｆ：ｃａｃｃｇＴＧＴＣＡＣＴＣＴＧＴＧＣＡＴＧＡＴＣＧ（配列番号９）
ｈＰＳ２ ７０９－７３１－ｒ：ａａａｃＣＧＡＴＣＡＴＧＣＡＣＡＧＡＧＴＧＡＣＡｃ（配列番号１０）
ｈＰＳ２ １１６４－１１８６－ｆ：ｃａｃｃｇＡＣＣＴＣＣＣＡＧＡＧＴＧＧＴＣＣＧＣＧ（配列番号１１）
ｈＰＳ２ １１６４－１１８６－ｒ：ａａａｃＣＧＣＧＧＡＣＣＡＣＴＣＴＧＧＧＡＧＧＴｃ（配列番号１２）
【0032】
ＰＳＫＯ細胞の作製のために、まず、ＰＳ１ＫＯ細胞を作製し、次に、そのＰＳ１ＫＯ細胞のＰＳ２をノックアウトした。具体的には、ｐＸ３３０又はｐＸ４５９ベクター（１μｇ）中の１つ又は３つのガイドＲＮＡをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いてＨＥＫ２９３細胞へ共導入した。共導入の２４時間後、細胞を１μｇ／ｍｌのピューロマイシン（ナカライテスク、２９４５５－１２）でさらに２４時間処理した。その後、細胞を９６ウェルプレートに制限希釈法で播種し、１ウェルに１細胞ずつ分離した。単一クローンを拡大し、イムノブロット分析によりＰＳ１の発現をスクリーニングした。検証されたＰＳ１／２ＫＯ ＨＥＫ２９３細胞（ＰＳＫＯ）は、１０％ウシ胎児血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ペニシリン－ストレプトマイシン混合液 ナカライ ０９３６７－３４）を含むＤＭＥＭで維持した。
【0033】
（Ｔｙｒｏ３発現ベクターの導入）
上記培養の次の日に、各細胞にＴｙｒｏ３発現ベクター又はＴｙｒｏ３ΔＣ発現ベクターを導入した。Ｔｙｒｏ３発現ベクターは、ｐＤＯＮＲ２２３－ＴＹＲＯ３（ａｄｄｇｅｎｅ：Ｐｌａｓｍｉｄ＃２３９１６）をｐｃＤＮＡｈｙｇｒｏ（ａｄｄｇｅｎｅ）にＦｌａｇタグと共に移して作製した。また、Ｔｙｒｏ３ΔＣ発現ベクターは、欠失したい領域を除く領域をプライマーで挟んでＰＣＲし、ＰＣＲ産物をＴ４ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ（ＴａＫａＲａ ＃２０２１Ａ）とＡＴＰでリン酸化、ＤＰｎＩ（ＢｉｏＬａｂｓ ＃Ｒ０１７６Ｌ）でテンプレートＤＮＡを分解後にライゲーション（Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ ＴａＫａＲａ ＃２０１１Ａ）して大腸菌（ＤＨ５α）に形質転換し、２００ｍＬＬＢ培地で一晩培養して、大腸菌ペレットを回収し、Ｍｉｄｉ Ｐｒｅｐによって得られた。なお、ここでは、Ｔｙｒｏ３の細胞内領域において細胞膜に近い５０アミノ酸を残して欠失させた（配列番号６）。
上記培養の次の日に、各細胞にＴｙｒｏ３発現ベクター又はＴｙｒｏ３ΔＣ発現ベクターを導入した。Ｔｙｒｏ３発現ベクターは、ｐＤＯＮＲ２２３－ＴＹＲＯ３（ａｄｄｇｅｎｅ：Ｐｌａｓｍｉｄ＃２３９１６）をｐｃＤＮＡｈｙｇｒｏ（ａｄｄｇｅｎｅ）にＦｌａｇタグと共に移して作製した。また、Ｔｙｒｏ３ΔＣ発現ベクターは、欠失したい領域を除く領域をプライマーで挟んでＰＣＲし、ＰＣＲ産物をＴ４ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｋｉｎａｓｅ（ＴａＫａＲａ ＃２０２１Ａ）とＡＴＰでリン酸化、ＤＰｎＩ（ＢｉｏＬａｂｓ ＃Ｒ０１７６Ｌ）でテンプレートＤＮＡを分解後にライゲーション（Ｔ４ ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ ＴａＫａＲａ ＃２０１１Ａ）して大腸菌（ＤＨ５α）に形質転換し、２００ｍＬＬＢ培地で一晩培養して、大腸菌ペレットを回収し、Ｍｉｄｉ Ｐｒｅｐによって得られた。なお、ここでは、Ｔｙｒｏ３の細胞内領域において細胞膜に近い５０アミノ酸を残して欠失させた（配列番号６）。
【0034】
上記各ベクターの導入は以下の通り行った。まず、１．８ｍＬのＰＢＳにＴｙｒｏ３発現ベクター又はＴｙｒｏ３ΔＣ発現ベクターを６μＬ（１０．２μｇ）加え、この遺伝子希釈液にＰＥＩストックを６６μＬ加えて混合して室温で１５分間静置した。なお、ＰＥＩストックは、ＰＥＩ ＭＡＸ－Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｇｒａｄｅ Ｌｉｎｅａｒ Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＭＷ ４０，０００）（コスモバイオ ２４７６５－１）を１ｍｇ／ｍｌになるように溶解し、ＮａＯＨでｐＨが７．２～７．４になるように調整した後、０．２２μｍのフィルターで濾過滅菌して調製されたものである。その後、４０～８０％コンフルエントに調整された上記各細胞を含む培地（１０ｃｍディッシュ、１０ｍＬのＤＭＥＭ）中に上記混合液をドロップワイズにて加えた。その次の日に、培地を交換した。
【0035】
（Ｔｙｒｏ３を過剰発現させたＨＥＫ２９３サンプルのイムノブロット）
次に、Ｔｙｒｏ３におけるプレセニリンの存在の有無の影響について検討するために、まず、上記ＨＥＫ２９３細胞及びＰＳＫＯＨＥＫ２９３細胞について、それぞれ６ウェルプレートに播種した。その後、それぞれの細胞に上記方法に従って、Ｔｙｒｏ３発現ベクターを導入した。なお、コントロール（－）にはＤＭＳＯを用いた。トランスフェクションの２４時間後に培地交換を行い、さらに２４時間後に常法にて細胞を回収し、ＳＴＥＮ－溶解バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．６、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０）によって溶解し、タンパク質定量（proteinアッセイＢＣＡキット、ナカライ、０６３８５－００）を行い、各サンプルのタンパク質濃度が同じになるように調整した。その後、各サンプルを２×Ｕｒｅａサンプルバッファーに溶解後、１２．５μＬの溶解液を１０～２０％トリシンゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にロードし、電気泳動を行った。その後、電気泳動後のゲルを常法にてニトロセルロース膜に転写し、抗Ｆｌａｇ抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いてイムノブロットを行った。その結果を図２に示す。
次に、Ｔｙｒｏ３におけるプレセニリンの存在の有無の影響について検討するために、まず、上記ＨＥＫ２９３細胞及びＰＳＫＯＨＥＫ２９３細胞について、それぞれ６ウェルプレートに播種した。その後、それぞれの細胞に上記方法に従って、Ｔｙｒｏ３発現ベクターを導入した。なお、コントロール（－）にはＤＭＳＯを用いた。トランスフェクションの２４時間後に培地交換を行い、さらに２４時間後に常法にて細胞を回収し、ＳＴＥＮ－溶解バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ７．６、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＮｏｎｉｄｅｔ Ｐ－４０）によって溶解し、タンパク質定量（proteinアッセイＢＣＡキット、ナカライ、０６３８５－００）を行い、各サンプルのタンパク質濃度が同じになるように調整した。その後、各サンプルを２×Ｕｒｅａサンプルバッファーに溶解後、１２．５μＬの溶解液を１０～２０％トリシンゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にロードし、電気泳動を行った。その後、電気泳動後のゲルを常法にてニトロセルロース膜に転写し、抗Ｆｌａｇ抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いてイムノブロットを行った。その結果を図２に示す。
【0036】
図２に示すように、Ｔｙｒｏ３を発現させた細胞（ＴＹＲＯ３）では、発現させていない細胞（－）と比較して、１０５ｋＤａ付近で極めて強いバンドが検出され、これがＴｙｒｏ３であると考えられる。さらに、Ｔｙｒｏ３を発現させた細胞において、プレセニリンをノックアウトさせた細胞（ＰＳＫＯ）では、ノックアウトさせていない細胞（ＨＥＫ）と比較して５５ｋＤａ付近のバンドが強く検出され、逆に当該バンドの下に検出されたバンドはプレセニリンをノックアウトさせた細胞の方が弱く検出された。従って、これらはそれぞれＴｙｒｏ３のＣ末端断片及び細胞内ドメインであると考えられる。
【0037】
（Ｔｙｒｏ３又はＴｙｒｏ３ΔＣを過剰発現させたＨＥＫ２９３サンプルのイムノブロット）
次に、Ｔｙｒｏ３発現ベクターと同様に、上記Ｔｙｒｏ３ΔＣ発現ベクターも用いてイムノブロットを行った、具体的には、上記と同様に、ＨＥＫ２９３細胞及びＰＳＫＯ ＨＥＫ２９３細胞について、Ｔｙｒｏ３発現ベクター又はＴｙｒｏ３ΔＣ発現ベクターを導入した。トランスフェクションの２４時間後に培地交換を行い、その２４時間後に常法にて細胞を回収した。回収した細胞について、上記と同様の方法にて、細胞を溶解し、サンプル中のタンパク質量を合わせ、１０～２０％トリシンゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にロードし、電気泳動を行った。その後、電気泳動後のゲルを常法にてニトロセルロース膜に転写し、抗Ｆｌａｇ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｆ７４２５－２ＭＧ）を用いてイムノブロットを行った。なお、ここでは、プレセニリン１及び２の発現量、並びにロードされたタンパク量を対比するためのアクチン量を評価するために、それらを認識する抗体も用いた（抗プレセニリン１抗体：ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、８２３４０１、マウス。抗プレセニリン２：Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃２１９２、ラビット。抗β－アクチン（Ｃ４）：ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ、Ｓｃ－４７７７８、マウス。）。ここでは、二次抗体として、抗マウス抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｗ４０２Ｂ）又は抗ラビット抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｗ４０１Ｂ）を用いた。その結果を図３及び４に示す。
次に、Ｔｙｒｏ３発現ベクターと同様に、上記Ｔｙｒｏ３ΔＣ発現ベクターも用いてイムノブロットを行った、具体的には、上記と同様に、ＨＥＫ２９３細胞及びＰＳＫＯ ＨＥＫ２９３細胞について、Ｔｙｒｏ３発現ベクター又はＴｙｒｏ３ΔＣ発現ベクターを導入した。トランスフェクションの２４時間後に培地交換を行い、その２４時間後に常法にて細胞を回収した。回収した細胞について、上記と同様の方法にて、細胞を溶解し、サンプル中のタンパク質量を合わせ、１０～２０％トリシンゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にロードし、電気泳動を行った。その後、電気泳動後のゲルを常法にてニトロセルロース膜に転写し、抗Ｆｌａｇ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｆ７４２５－２ＭＧ）を用いてイムノブロットを行った。なお、ここでは、プレセニリン１及び２の発現量、並びにロードされたタンパク量を対比するためのアクチン量を評価するために、それらを認識する抗体も用いた（抗プレセニリン１抗体：ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、８２３４０１、マウス。抗プレセニリン２：Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃２１９２、ラビット。抗β－アクチン（Ｃ４）：ｓａｎｔａ ｃｒｕｚ、Ｓｃ－４７７７８、マウス。）。ここでは、二次抗体として、抗マウス抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｗ４０２Ｂ）又は抗ラビット抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｗ４０１Ｂ）を用いた。その結果を図３及び４に示す。
【0038】
まず、図３に示すように、Ｔｙｒｏ３を発現させた細胞（ＴＹＲＯ３）では、図２の結果と同様に、発現させていない細胞（－）と比較して、１０５ｋＤａ付近で極めて強いバンドが検出され、図２の結果と合わせて、当該バンドは全長型のＴｙｒｏ３であるといえる（ＴＹＲＯ３ Ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ）。また、Ｔｙｒｏ３を発現させた細胞において、プレセニリン１及び２をノックアウトさせた細胞（ＰＳＫＯ）では、これも図２の結果と同様に、ノックアウトさせていない細胞（ＨＥＫ）と比較して、５５ｋＤａ付近のバンドが強く検出された（ＴＹＲＯ３ ＣＴＦ）。従って、図２の結果と合わせて、当該バンドはＴｙｒｏ３のシェダーゼによる切断後のＣ末端断片であるといえる。なお、ＰＳＫＯ細胞では、ＰＳ１及びＰＳ２のいずれもバンドは確認されず、ＰＳ１及びＰＳ２がノックアウトされていることが確認できた。また、アクチンのバンド（ＴＹＲＯ３ Ａｃｔｉｎ）の比較から、いずれのサンプルも同等のタンパク質がロードされていることが確認できた。一方、Ｔｙｒｏ３ΔＣを発現させた細胞においても、図４に示すように図３と同様の結果が得られた。
【0039】
（質量分析）
以上の通り、シェダーゼによる切断により約５５ｋＤａのＴｙｒｏ３のＣ末端断片が得られることがわかったが、具体的にシェダーゼによる切断部位を特定するために質量分析を行った。その方法及び結果を以下に示す。
以上の通り、シェダーゼによる切断により約５５ｋＤａのＴｙｒｏ３のＣ末端断片が得られることがわかったが、具体的にシェダーゼによる切断部位を特定するために質量分析を行った。その方法及び結果を以下に示す。
【0040】
まず、上記Ｔｙｒｏ３ΔＣ発現ベクターをトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞及びＰＳＫＯ ＨＥＫ２９３細胞を準備し、トランスフェクションの翌日の培地交換の際に、予め作製しておいたピログルタミル化阻害剤である１０ｍＭのＰＢＤ１５０（ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ、＃ＨＹ－１１９１７３）を培地量の１／１０００量加えた（１０ｍＬの培地に対して１０μＬ）。その後、各細胞をＰＢＳで洗浄した後、さらにＰＢＳを加えてピペットを用いて懸濁し、１０ｃｍディッシュ中の細胞を５０ｍＬチューブに回収した。その後、５０００ｒｐｍで３分間遠心して細胞を沈殿させた。沈殿した細胞に、５ｍＬの低浸透圧緩衝液（１５ｍＭのクエン酸ナトリウム、１０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１×ｃＯｍｐｌｅｔ（ロシュ社））を加えて懸濁した。その懸濁液を含む５０ｍＬチューブを液体窒素中に入れて凍結させた後、常温の水を含むウォーターバスに当該チューブを入れて解凍した。その後、チューブを２５００×ｇで２０分間遠心し、上清を１５ｍＬチューブに移し、６５％グリセロールを４５０μｌ加えて転倒混和した。その混合液を超遠心チューブ（１．５ｍＬ、ベックマンコールター社）に９２０μＬずつ入れ、５５０００ｒｐｍで１時間遠心し、上清を除去して細胞膜を回収した。
【0041】
上記回収した細胞膜を含む１．５ｍＬ超遠心チューブのそれぞれに１００μＬの溶解バッファー（１％ＤＤＭ（ｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシド）、１×プロテアーゼインヒビター（ｃＯｍｐｌｅｔ、ロシュ社））を加え、氷上でボルテックスを用いて撹拌した。その後、２１０００×ｇで１０分間、４℃において遠心し、上清を超遠心チューブにまとめて、さらに５５０００ｒｐｍで１時間、４℃において超遠心した。
【0042】
次に、１．５ｍＬチューブに移し、１０μＬのＭ２アガロース（抗ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２抗体アフィニティーゲル、メルク社）と共に１時間混和した後、１５０００ｒｐｍで１分間遠心して上清を除去した。上清除去後のチューブに１ｍＬのミリＱ水を入れて転倒混和した後に、１５０００ｒｐｍで１分間遠心し、上清を除去し、さらに注射器を用いて水分を完全に除去した。
【0043】
上記免疫沈降後のサンプルについて質量分析を行った。具体的には、まず、ＴＷＡ（５０％アセトニトリル、２．５％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸））を室温で解凍し、５００μＬのＴＷＡに過飽和となるようにＣＨＣＡ（α－シアノ－４－ヒドロキシケイ皮酸）を加え、３７℃で１０分間振盪しながらインキュベートした。その後、１２μＬのＣＨＣＡ／ＴＷＡを上記免疫沈降したチューブに加えてボルテックスした後、１５０００ｒｐｍで１分間遠心した。遠心後のサンプルを、ＭＡＬＤＩ Ｔａｒｇｅｔプレート（ＭＳＰ９６ Ｔａｒｇｅｔ ｇｒｏｕｎｄ ｓｔｅｅｌ ＢＣ（ブルカー社））に１μＬずつスポットし、乾燥後にさらにスポットし、合計３回スポットした。完全に乾燥後、マトリックス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）ＴＯＦ ＭＳによって解析を行った。その結果を図５に示す。
【0044】
図５（ｂ）に示すように、質量分析の結果、１００００ｍ／ｚ付近に３つのピーク（１～３の▽で示す）が見られ、それらのピークは図５（ａ）の１～３の▽で示す部分で切断されたＴｙｒｏ３のＣ末端断片にそれぞれ対応し、すなわち、Ｔｙｒｏ３のＣ末端断片は、そのＮ末端がグルタミン（４１９番目）、グルタミン（４２０番目）、グアニン（４２１番目）の部分で切断されていることがわかった。また、図５の結果を拡大した図６の上段のグラフにおいて、Ｎ末端がグルタミンであるＣ末端断片に対応する２か所のピーク（１及び２の▽）において１７ｍ／ｚ低いピークが観察された。図６の下段のグラフに示すように、これらのピークはピログルタミル化阻害剤であるＰＢＤ１５０によって処理されたサンプルでは抑制された。、ピログルタミル化されていることが明らかになった。従って、Ｔｙｒｏ３におけるシェダーゼによる切断には、切断部位が複数あり、さらにピログルタミル化修飾が関係していることが明らかになった。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【配列表】